CN116693674B - 一种与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体及其方法与应用 - Google Patents
一种与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体及其方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种与SARS和SARS‑CoV‑2广谱性结合的纳米抗体及其方法与应用,包含重链可变区,所述重链可变区包含以下CDR:氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2,氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。本发明的ZF‑E8纳米抗体广谱性结合SARS和SARS‑CoV‑2相关蛋白,有着预防、治疗和/或检测SARS和SARS‑CoV‑2感染的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域,涉及一种与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体及其方法与应用。
背景技术
SARS和SARS-CoV-2冠状病毒是具有包膜的单链正链且具有包膜的RNA病毒,能感染多种宿主生物,其主要以RNA为遗传物质,通过将RNA反转录为DNA后,利用宿主细胞完成病毒的复制生产出子代病毒,进一步感染其他细胞。治疗药物的开发靶点贯穿整个的生命周期,从宿主细胞进入开始至出胞复制结束。近年来,随着抗体工程技术的不断发展,抗体药物广泛应用在肿瘤、自身免疫性疾病和传染病等的治疗。纳米抗体是一类天然存在于大羊驼和骆驼等动物体内的单一重链抗体,其抗原结合部位的分子量仅为免疫球蛋白(ImmunoglobulinG,IgG)抗体的10%。由于纳米抗体结构简单,易于针对抗原(尤其是多聚体蛋白)的相同表位或不同表位设计二价或多价纳米抗体,形成强效的阻断剂,进而获得更加广谱且强效的抗病毒药物分子。因此,针对SARS和SARS-CoV-2筛选广谱纳米抗体具有非常重要的意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段。
在本发明的第一方面提供了一种与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段,其包含重链可变区,所述重链可变区包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3,其中,
CDR1的氨基酸序列为SEQ ID NO:1(即,ESVMG),
CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2(即,AKDGSTYYPESV),
CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3(即,DWMGTVVASPRGLCGY)。
进一步,所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4,所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列。
进一步,所述FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4(即,EVRLVESGGGSVQAGETLRLSCSASGFTFD)、SEQ ID NO:5(即,WYRQAPGNKCNLVTNI)、SEQ ID NO:6(即,KGRFTVSRDDAENTLYLQMSSLKPEDTAVYYCAA)、SEQ ID NO:7(即,WGQGTQVTVSS)所示。
进一步,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示:
EVRLVESGGGSVQAGETLRLSCSASGFTFDESVMGWYRQAPGNKCNLVTNIAKDGSTYYPESVKGRFTVSRDDAENTLYLQMSSLKPEDTAVYYCAADWMGTVVASPRGLCGYWGQGTQVTVSS,其中,下划线部分分别为重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3,未标下划线的部分分别为框架区的FR1-4。
根据本发明具体实施方式,所述纳米抗体一般是指单域抗原结合片段。根据本发明具体实施方式,所述纳米抗体是来源于天然存在的抗体重链的单个可变域。纳米抗体通常来源于骆驼科动物中见到的只有重链(不含轻链)的抗体(Hamers-Casterman等人,1993,自然杂志(Nature)363:446-448;Desmyter等人,1996,自然结构生物学杂志(Nat .Struct.Biol .)803-811),因此,通常称为VHH抗体或VHH序列。骆驼科动物包括旧世界的骆驼科动物(双峰驼和单峰驼)和新世界的骆驼科动物(例如,羊驼、大羊驼、原驼和瘦驼)。骆驼科动物的非限制性实施例包括单峰骆驼、双峰骆驼、野生双峰骆驼、美洲驼、羊驼、小羊驼和红褐色美洲驼。根据具体实施方式,骆驼科动物是双峰骆驼。
根据本发明具体实施方式,所述纳米抗体及其抗原结合片段能够结合完整分子结合的抗原的表位的完整分子或其功能片段,所述完整分子或其功能片段是指包含4个骨架区域和3个互补决定区域的分子。
根据具体实施方式,纳米抗体是完整的纳米抗体。
根据具体实施方式,纳米抗体是纳米抗体片段。
进一步,所述纳米抗体可以是单特异性的(能够识别一个表位或蛋白质)、双特异性的(能够结合两个表位或蛋白质)或多特异性的(能够识别多个表位或蛋白质)。
在本发明的具体实施方式中,所述纳米抗体是单特异性纳米抗体。
根据具体实施方式,纳米抗体是多特异性的,例如双特异性的、三特异性的、四特异性的。
用于测试结合的测定是本领域公知的,包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、流式细胞术(flow cytometry)、分子互作分析(BiaCore)、生物膜干涉技术、高效液相色谱法。
根据具体的实施方式,所述纳米抗体包括与SEQ ID NO:8的氨基酸序列具有如下同一性的氨基酸序列:至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%,每种可能性代表本公开的一个单独的实施方式。
根据具体实施方式,纳米抗体是裸纳米抗体。
根据具体实施方式,纳米抗体包含异源效应部分,例如毒素部分、可检测部分。效应部分可以是蛋白质或非蛋白质(例如小分子化合物);后者通常使用纳米主体和缀合体上的官能团产生。
因此,例如,各种类型的可检测或报告部分可与本公开的纳米抗体缀合(conjugate)。这些包括但不限于放射性同位素(例如[125]碘)、磷光化学品、化学发光化学品、荧光化学品或多肽 (例如藻红蛋白(P E) 、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-chrome、罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝荧光蛋白(BFP)、德克萨斯红、酶 (例如,辣根过氧化物酶(HPR)、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶(AP))、亲和标记物(例如,可由相应抗体(例如,地高辛(DIG),其由抗DIG抗体识别)识别的抗原)或对标记物(例如链霉亲和素和生物素)具有高亲和力的分子),以及可通过正电子发射断层扫描(PET)或磁共振成像(MRI)检测到的分子(造影剂)。
根据具体实施方式,纳米抗体包括毒素。
毒素部分的非限制性实施例包括δ-内毒素(例如:Cry1A、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry2A、Cry7B、Cry8D、Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、Cry15A、Cry22A、Cry32A、Cry51A、Cyt1A),大肠菌素(如大肠菌素E1、大肠菌素la、大肠菌素A、大肠菌素N),放线菌素,ClyA家族毒素(例如:溶细胞素A、非溶血毒素基因、溶血素BL)、溶血素(例如:α-溶血素、γ-溶血素、杀白细胞素、坏死性肠炎毒素B、δ-毒素、霍乱弧菌溶细胞素、创伤弧菌溶血素)、气溶素家族毒素(例如:气溶素、α-毒素、水解素、ε-毒素、肠毒素、溶血凝集素、kysenin)、胆甾醇依赖性细胞溶素(例如:裂解素、溶血素、中间链球菌溶素、李斯特菌溶素O、凝集素溶素、人溶素、不耐氧链球菌溶血素)、膜攻击复合物组分/穿孔素、重复子毒素、HlyA、双功能溶血素-腺苷酸环化酶毒素、MARTX、蜘蛛毒素、蝎子毒素、马铃薯糖蛋白、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆菌杀虫蛋白、侧孢性杆菌杀虫蛋白、蚕腐病芽孢杆菌杀虫蛋白、球形芽孢杆菌杀虫蛋白和昆虫防控双链RNA。
根据上下文、应用和目的,效应部分,例如毒素部分、可检测部分,可以各种方式连接或缀合到本公开的纳米抗体。
效应部分可以直接或间接 (例如当包含在载体中时)偶联到纳米抗体。偶联可以是共价或非共价结合。
本发明的第二方面还提供了一种物质,所述物质包括:
A、一种核酸分子,所述核酸分子编码本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段;
进一步,所述核酸分子为DNA或mRNA。
根据具体实施方式,本文公开的多核苷酸和核酸序列中的任一个可包含保守的核酸取代。保守修饰的多核苷酸是指编码相同或基本相同氨基酸序列的那些核酸,或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下,指基本相同或相关(例如,天然连续的)序列。由于遗传密码的简并性,大量功能相同的核酸编码大多数蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在由密码子指定丙氨酸的每个位置处,密码子可以被改变为所描述的对应密码子中的另一个,而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”,是保守修饰的多核苷酸中的一种。根据具体实施方式,本文所述的编码多肽的任何多核苷酸和核酸序列也描述了核酸的沉默变异。本领域技术人员将认识到,在某些情况下,核酸中的每个密码子(除了通常是蛋氨酸(methionine)的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸(tryptophan)的唯一密码子的TGG之外)可被修饰以产生功能相同的分子。因此,编码多肽的多核苷酸的沉默变异隐含在相对于表达产物的所述序列中。
B、一种核酸构建体,所述核酸构建体包含本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段或本发明第二方面中A所述的核酸分子;
进一步,所述核酸构建体包括所述核酸分子可操作地连接的至少一个表达调控元件。如组氨酸标签、终止密码子等。
C、一种载体,所述载体包括本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面中A所述的核酸分子,或本发明第二方面所述中B所述的核酸构建体;
进一步,所述载体包括:病毒载体,如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体;非病毒载体,如质粒、转座子载体。
进一步,所述载体包括质粒载体。
进一步,所述载体包括pComb3XTT质粒载体。
D、一种转化的细胞,所述转化的细胞包括本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面中A所述的核酸分子、本发明第二方面中B所述的核酸构建体,或本发明第三方面中C所述的载体;
E、一种药物组合物,所述药物组合物包括本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面中A所述的核酸分子、本发明第二方面中B所述的核酸构建体、本发明第二方面中C所述的载体,或本发明第二方面中D所述的转化的细胞;
进一步,所述组合物包括药学上可接受的载体或赋形剂。
进一步,所述药物组合物为鼻喷剂、口服制剂、栓剂或胃肠外制剂的形式。
进一步,所述鼻喷剂选自气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。
进一步,所述口服制剂选自片剂、粉末剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、软/硬胶囊剂、薄膜包衣剂、小丸剂、舌下片和膏剂。
进一步,所述胃肠外制剂为经皮剂、软膏剂、硬膏剂、外用液剂、可注射或可推注制剂。
F、一种产品,所述产品包括本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面中A所述的核酸分子、本发明第二方面中B所述的核酸构建体、本发明第二方面中C所述的载体,或本发明第二方面中D所述的转化的细胞。
进一步,所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、芯片、系统、或装置。
本发明第三方面还提供了一种用于生产本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)将本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述中A所述的核酸分子、本发明第二方面中B所述的核酸构建体、本发明第二方面中C所述的载体转化进入细胞中;
(ii)培养步骤(i)中的细胞或直接培养本发明第二方面中D所述的转化的细胞;
(iii)回收表达的所述与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段。
根据本发明的一些实施方式,所述方法包括分离所述纳米抗体或其抗原结合片段。
本发明的第四方面提供了一种用于生产表达本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段的重组细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)将本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面中A所述的核酸分子、本发明第二方面中B所述的核酸构建体、本发明第二方面中C所述的载体导入到宿主细胞;
(ii)在体外或离体培养获得宿主细胞;
(iii)筛选得到可表达和/或分泌所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段的细胞。
本发明的第五方面提供了一种体外抑制SARS和SARS-CoV-2相关蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)将本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面中A所述的核酸分子、本发明第二方面中B所述的核酸构建体、本发明第二方面中C所述的载体导入到生物体细胞;
(ii)表达本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段抑制SARS和SARS-CoV-2相关蛋白的活性。
本发明的第六方面提供了一种非诊断与治疗目的地检测样品中SARS和SARS-CoV-2蛋白或编码蛋白的多核苷酸的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)将本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段与样品接触;
(ii)检测SARS和SARS-CoV-2蛋白或编码蛋白的多核苷酸与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段是否有复合物形成。
本发明的第七方面提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法,所述方法包括施用治疗有效量的本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段。
本发明的药物组合物的有效成分的给药量,根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法等不同而存在差异,可以考虑剂型的种类、给药方法、患者的年龄和体重、患者的症状等,根据医生的判断来确定。
本发明第八方面提供了本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段广谱性检测SARS和SARS-CoV-2相关蛋白或编码蛋白的多核苷酸中的应用。
本发明第九方面提供了本发明第二方面中A所述的核酸分子在广谱性检测SARS和SARS-CoV-2相关蛋白或编码蛋白的多核苷酸中的应用。
本发明第十方面提供了本发明第二方面中B所述的核酸构建体在广谱性检测SARS和SARS-CoV-2相关蛋白或编码蛋白的多核苷酸中的应用。
本发明第十一方面提供了本发明第二方面中C所述的载体在广谱性检测SARS和SARS-CoV-2相关蛋白或编码蛋白的多核苷酸中的应用。
本发明第十二方面提供了本发明第二方面中D所述的转化的细胞在广谱性检测SARS和SARS-CoV-2相关蛋白或编码蛋白的多核苷酸中的应用。
本发明第十三方面提供了本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的产品中的应用。
本发明第十四方面提供了本发明第二方面中A所述的核酸分子在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的产品中的应用。
本发明第十五方面提供了本发明第二方面中B所述的核酸构建体在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的产品中的应用。
本发明第十六方面提供了本发明第二方面中C所述的载体在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的产品中的应用。
本发明第十七方面提供了本发明第二方面中D所述的转化的细胞在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的产品中的应用。
进一步,所述产品包括能够辅助检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的试剂。在一些具体的实施方案中,所述产品包括试剂盒、芯片、层析试纸条、核酸膜条等。在一些实施方案中,所述产品可以检测SARS和SARS-CoV-2病毒类型中的各种亚型的存在。
进一步,所述产品中包括收取受试者样本的用具。
进一步,所述受试者包括人或非人哺乳动物。
进一步,所述受试者是人。
进一步,所述样本包括血液或血液级分、唾液、尿液、粪便、脑脊液、精液、阴道分泌物、痰液、汗液、母乳、滑液、粘液(包括发炎性分泌物)、泪液、胆汁、胃液、组织间液、组织的活检或上皮细胞(其是自然脱落的或特意从身体收集的(例如脸颊细胞刮屑)、房水、羊水、胸膜液或受试者的呼气。
本发明第十八方面提供了本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段在制备预防或治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的药物中的应用。
本发明第十九方面提供了本发明第二方面中A所述的核酸分子在制备预防或治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的药物中的应用。
本发明第二十方面提供了本发明第二方面中B所述的核酸构建体在制备预防或治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的药物中的应用。
本发明第二十一方面提供了本发明第二方面中C所述的载体在制备预防或治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的药物中的应用。
本发明第二十二方面提供了本发明第二方面中D所述的转化的细胞在制备预防或治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的药物中的应用。
进一步,所述药物包括治疗/预防有效量的前面所述的纳米抗体或其抗原结合片段。
进一步,所述治疗/预防包括纳米抗体或其抗原结合片段与SARS和SARS-CoV-2病毒蛋白的结合以及灭活。
本发明第二十三方面提供了本发明第一方面所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体或其抗原结合片段在制备调节SARS和SARS-CoV-2蛋白活性或水平的药物中的应用。
本发明第二十四方面提供了本发明第二方面中A所述的核酸分子在制备调节SARS和SARS-CoV-2蛋白活性或水平的药物中的应用。
本发明第二十五方面提供了本发明第二方面中B所述的核酸构建体在制备调节SARS和SARS-CoV-2蛋白活性或水平的药物中的应用。
本发明第二十六方面提供了本发明第二方面中C所述的载体在制备调节SARS和SARS-CoV-2蛋白活性或水平的药物中的应用。
本发明第二十七方面提供了本发明第二方面中D所述的转化的细胞在制备调节SARS和SARS-CoV-2蛋白活性或水平的药物中的应用。
定义
除非上下文另外明确规定,否则如在本发明中所用,单数形式“一个/种”和“所述”包括复数个提及物。例如,术语“细胞”包括复数个细胞,包括其混合物。
术语“约”在涉及诸如量、百分比等的可测量值时,意在涵盖相对于所述可测量值的±20%、±10%、±5%或±1%的变化。
术语“施用(Administration)”或“施用(administering)”包括向受试者引入或递送剂的任何途径。施用可通过任何合适的途径,包括口服、静脉内、腹膜内、鼻内、吸入等进行。施用包括自我施用和由另外的人施用。
术语“抗体”在本文中以广义使用并且包括多克隆抗体、单克隆抗体和双特异性抗体。除了完整免疫球蛋白分子之外,术语“抗体”还包括那些免疫球蛋白分子的片段或聚合物,以及免疫球蛋白分子或其片段的人形式或人源化形式。抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每条重链在一端具有可变结构域(VH),接着是多个恒定结构域。每条轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在另一端具有恒定结构域。
术语“纳米抗体”还包括纳米抗体的天然或合成类似物、同源物、突变体和变体。
术语“抗原决定簇”和“抗原结合片段”在本文中也可互换使用,是指抗原结合分子(如本发明的纳米抗体)所识别的抗原或靶标上的位置。可由通过蛋白质的三级折叠来并置的连续氨基酸(“线性表位”)或不连续氨基酸形成表位。
术语“抗原结合位点”、“结合位点”和“结合片段”是指结合抗原决定簇或表位的多肽(如纳米抗体)的特定元件、部分或氨基酸残基。
术语“CDR”和“互补决定区”可互换使用,并且是指抗体的参与结合至抗原的可变链的一部分。因此,CDR是“抗原结合位点”的一部分或者是“抗原结合位点”。在一些实施方案中,纳米抗体包含共同形成抗原结合位点的三个CDR。“CDR”可指由本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的CDR。
术语“包含”与术语“包括”同义,使用并且是开放的非限制性术语。
“组合物”是指具有有益生物效应的任何剂。有益生物效应包括治疗效应(例如,治疗病症或其它非期望的生理疾患)和预防效应(例如,预防病症或其它非期望的生理疾患)两者。所述术语还涵盖本文具体提及的有益剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物,包括但不限于细菌、载体、多核苷酸、细胞、盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“组合物”时,或者当具体鉴定特定组合物时,则应理解所述术语包括组合物本身以及药学上可接受的药理学活性的载体、多核苷酸、盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
术语“有效量”涵盖但不限于可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学疾患或病症(例如,癌症)的症状或病征的量。除非另外明确地或通过上下文来规定,否则“有效量”不限于足以改善疾患的最小量。疾病或病症的严重性以及治疗预防、治疗或减轻疾病或病症的能力可通过生物标志物或通过临床参数来测量,而不暗示任何限制。在一些实施方案中,术语“重组纳米抗体的有效量”是指足以预防、治疗或减轻癌症的重组纳米抗体的量。
术语“片段”或“功能性片段”可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选定修饰,条件是与未修饰的肽或蛋白质相比,片段的活性不会显著改变或受损。这些修饰可提供一些额外的性质,如除去或添加能够二硫化物结合的氨基酸,以增加其生物寿命,改变其分泌特性等。在任何情况下,功能性片段必须具有生物活性。
术语“纳米抗体”和“单结构域抗体”被无差别地使用,并且表示在没有任何轻链的骆驼科中发现的类型的抗体的单一重链的可变结构域。
术语“裸纳米抗体”是指不包含异源效应部分(例如,毒素部分,可检测部分)的纳米抗体。
术语“可操作地连接”是指多肽区段在单个多肽链内的排列,其中单独多肽区段可以是但不限于蛋白质、其片段、连接肽和/或信号肽。术语可操作地连接可指不同单独多肽在单一多肽或其片段内直接融合,其中不同区段之间没有插入氨基酸,以及当单独多肽通过包含一个或多个插入氨基酸的“接头”彼此连接时。
术语“受试者”在本文定义为包括动物如哺乳动物,包括但不限于灵长类动物(例如,人)、奶牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在一些实施方案中,受试者是人。
附图说明
图1是纳米抗体VHH基因钓取示意图;
图2是骆驼免疫血清的滴度及交叉结合活性的测定图,其中,A为骆驼免疫血清滴度图,B为与S蛋白交叉结合活性图;
图3是驼源纳米抗体库 DNA 钓取凝胶电泳图,其中,第1列:CH2和CH3片段钓取,第2列:Marker,第3列:Marker,第4列:VHH的扩增;
图4是驼源纳米抗体噬菌体库建库测序的多序列比对结果图;
图5是3轮噬菌体淘洗的富集情况图;
图6是ELISA测定第3轮阳性噬菌体上清的结合活性图;
图7是50条序列的进化树分析结果及CDR3序列图;
图8是50个候选分子与Delta、Omicron及其变异株的结合活性图;
图9是50个候选分子的Beta和BA.2假病毒中和活性图;
图10是13个候选纳米抗体与S蛋白的交叉结合活性图;
图11是13个候选纳米抗体的广谱中和活性图;
图12是候选纳米抗体的空间理论结构图;
图13是ELISA验证候选纳米抗体的特异性图;
图14是ELISA测定候选纳米抗体的结合活性图,其中,A为ZF-E8与SARS、SARS-CoV-2及前4种变异株的结合活性图,B为ZF-E8与Omicron及亚谱系变异株的结合活性图,C为S309与SARS、SARS-CoV-2及前4种变异株的结合活性图,D为S309与Omicron及亚谱系变异株的结合活性图;
图15是竞争ELISA测定候选分子竞争阻断与ACE2的结合活性图,其中,A为纳米抗体对Omicron及其亚谱系变异株S蛋白与ACE2结合的影响图,B为纳米抗体对SARS、SARS-CoV-2及前4种VOC变异株S蛋白与ACE2结合的影响图;
图16是候选纳米抗体的HIV假病毒中和活性图,其中,A为ZF-E8的假病毒中和活性图,B为S309的假病毒中和活性图;
图17是候选纳米抗体对可复制型SARS-CoV-2假病毒感染的抑制活性图;
图18是候选纳米抗体对可复制型Delta假病毒感染的抑制活性图;
图19是候选纳米抗体对可复制型Omicron假病毒感染的抑制活性图;
图20是候选纳米抗体的体内Omicron假病毒感染模型预防保护效果图,其中,A为可复制型VSV-nLuc-Omicron假病毒感染叙利亚金黄地鼠的生物发光拍照图,B为血清纳米荧光素酶活性测定结果图,给药浓度为 10 mg/kg,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,n=5,mean±SEC;
图21是候选纳米抗体对真病毒进入细胞的抑制活性图。
具体实施方式
参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是,应理解,以下实施例仅用于举例说明目的,而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1抗SARS和SARS-CoV-2纳米抗体ZF-E8的筛选
一、实验方法
1、骆驼免疫方案
委托骆驼养殖合作社选取1只6个月内未经其他疫苗或蛋白免疫的1周龄的双峰骆驼,共免疫6次,抗原为最初的Omicron的RBD蛋白,具体按双峰骆驼免疫方案操作,操作步骤见表1。
表1双峰骆驼免疫计划表
(1)免疫前采集血样
在血清分离胶管中收集4mL血样,室温,12000r/min,离心5min,吸取上层获得免疫血清,储存于-20℃,用以测量血清滴度。
(2)免疫抗原的制备
第1和2次:抗原(500μL)+弗式完全佐剂(500μL),离心乳化;第3次:抗原(500μL)+不弗式完全佐剂(500μL),离心乳化;第4次:抗原(500μL)+不弗式完全佐剂(500μL),不混合制备乳剂;第5次:同第3次;第6次:同第4次。
2、结合ELISA测定免疫血清结合活性及血清效价
(1)包被:Omicron RBD蛋白(5μg/mL起,倍比稀释6个梯度),100μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。(2)封闭:4%脱脂牛奶,200μL/孔,37℃,1h,PBST洗3次。(3)加样品:免疫血清(1:500起,倍比稀释8个梯度),100μL/孔,37℃,1h,PBST洗3次。(4)加检测抗体:兔抗骆驼-HRP,100μL/孔,37℃,30min,PBST洗3次。(5)显色:TMB,100μL/孔,90s。(6)终止:2NH2SO4,100μL/孔。(7)数据获取:MolecularDevicesSpectraMax190酶标仪读取OD450nm数值,保存数据。
3、骆驼外周血淋巴细胞的分离与制备
按骆驼外周血淋巴细胞分离液使用说明书进行操作。
4、总RNA的提取及cDNA的合成
按RNAEasyFast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒和FastKingRTKit(WithgDNase)使用说明书进行总RNA的提取和cDNA的合成工作。
5、免疫纳米抗体库的基因钓取及扩增
利用巢式PCR的方法钓取和扩增VHH基因片段:第一次PCR共产生两种片段:一是来源于常规抗体的重链(含有CH1片段),第二种来源于HCAb的重链(不含CH1片段),因此,能通过DNA凝胶电泳分离,回收长度为600bp的较短片段能有效地去除常规抗体的VH序列,完成选择性的PCR扩增。第二次PCR,仅设计在VHH前后填加酶切位点(SfiI)的巢式引物,用以克隆到展示载体,示意图如图1所示。设计VHH钓取引物如表2所示:
表2 VHH钓取引物
6、噬菌体展示骆驼免疫纳米抗体库的构建
(1)骆驼免疫纳米抗体库的分子构建
基于计算机辅助药物设计获得的纳米抗体虚拟文库,考虑密码子偏好性、RNA二级结构特征优化核苷酸序列,5'端添加信号肽序列,3'端添加终止密码,两端分别设计酶切位点和保护碱基,委托金斯瑞生物科技股份有限公司开展纳米抗体库的基因合成工作,要求突变位点氨基酸出现频率均等且将氨基酸序列翻译为大肠杆菌最优密码子基因序列,借助酶切位点“SfiI”将其克隆至pComb3XTT噬菌体展示质粒中。
(2)噬菌体展示骆驼免疫纳米抗体库的构建
将-80℃保存的TG1电击感受态细胞置于冰上5min,将5μL的连接产物加至感受态中,转移至电转杯,立即插回冰中。设置电转仪的参数为:C=25μF,PC=200Ω,V=1.8kV,将电击杯迅速放入电转槽中,电击完成后立即放回冰中,2min后从冰中取出电击杯,将电转产物转移到50mL离心管,并补加10mL无抗性S.O.C.培养基,37℃,200r/min,恢复培养60min。然后,分别取10mL中的0.1μL、1μL和10μL进行滴定涂板,4000r/min,离心15min,弃去上清,弹匀后将沉淀涂于2-YT固体培养基(2%葡萄糖+100μg/mLAmp),37℃,过夜培养扩增,依据滴定涂板菌落计数情况,判定电转效率。
(3)噬菌体展示骆驼免疫纳米抗体库的扩增和制备
1)将200μL本实验室保存的天然噬菌体库菌液接种于50mL的2-YT抗性培养基(100μg/mLAmp+2%葡萄糖),此时培养液的OD600nm读数约为0.1。2)37℃,220r/min培养3h,当培养液的OD600nm读数为0.8左右时,将1mL的M13KO7加至培养瓶中,37℃,静置孵育0.5h。3)将培养液转移至50mL离心管中,20℃,4000r/min离心15min,弃去上清,收集菌体。4)将菌体重悬至800mL的2-YT抗性培养基(含100μg/mLAmp和70μg/mLKana)培养基中,28℃,220r/min过夜培养。
(4)噬菌体展示骆驼免疫纳米抗体库的分离浓缩
1)将过夜培养的菌液转移至离心管中,4℃,6000r/min离心15min,以去除菌体。(2)向上清中加入200mL的PEG/NaCl溶液,冰浴,1h,然后,4℃,6000r/min离心15min。(3)轻轻弃去上清,将沉淀重悬于20mL的PBS中,再次向上清中加入4mL的PEG/NaCl溶液,冰浴,20min。(4)将上述混合物转移至离心管中,4℃,6000r/min离心15min。(5)将沉淀重悬于20%甘油中并分装,储存于-80℃冰箱。
(5)噬菌体展示骆驼免疫纳米抗体库的质量评价
1)测序及结果分析
随机挑取300个克隆并测序,然后,利用ExPASy-Translatetool(https://web.expasy.org/translate/)翻译比对抗冠状病毒纳米抗体合成库的测序结果,除去测序失败、套峰、移码、碱基的缺失和插入以及由于PCR过程中引入的非目的碱基突变等错误序列,统计分析正确的测序结果。
(2)突变位点氨基酸频率分布分析
借助The European Bioinformatics Institute网站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/nucleotide.html)多序列分析模块分析比较所得序列的多样性。利用http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi网站分析突变位点关键氨基酸出现的理论频率和实际频率。
7、骆驼免疫纳米抗体噬菌体库的淘洗
(1)包被:将500µL的20µgSARS-CoV-2S蛋白包被于Immuno管,4℃,过夜。(2)封闭:分别用1mL4%的脱脂牛奶同时封闭Immuno管和驼源纳米抗体噬菌体库,室温,1h,弃去Immuno管中的牛奶,PBS清洗1次。(3)孵育:向封闭后的Immuno管中投入合成纳米抗体噬菌体库,室温,1h,弃去Immuno管中的驼源纳米抗体噬菌体库。(4)淘洗:使用0.1%的PBST(吐温-20,v/v%)洗15次,PBS洗10次,每次1min。(5)洗脱:1mLGly-HCl(0.1M,pH2.2),室温,10min,并加入66.6μLTris-HCl(1M,pH9.2)中和洗脱的噬菌体。(6)取500μL的洗脱噬菌体感染处于对数生长期的TG1感受态细胞并进行扩增和噬菌体沉淀,以备后续筛选。
共进行3轮淘洗和富集特异性结合的阳性噬菌体,3轮淘洗的实验条件,详见表3。然后,挑取384个第3轮产出的阳性噬菌体克隆,扩增培养4h,吸取50μL菌液以备测序后,制备阳性克隆噬菌体上清液,以进行下一步的噬菌体ELISA的测定。
表3骆驼纳米抗体噬菌体淘洗策略
8、噬菌体ELISA
(1)包被:1μg/mLOmicronRBD蛋白,100μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。(2)封闭:4%脱脂牛奶,200μL/孔,37℃,1h,PBST洗3次。(3)加样品:吸取克隆的噬菌体上清,100μL/孔,37℃,1h,PBST洗3次。(4)加检测抗体:anti-M13-HRP,100μL/孔,室温,45min,PBST洗3次。(5)显色:TMB,100μL/孔,90s。(6)终止:2NH2SO4,100μL/孔。(7)数据获取:酶标仪读取OD450nm数值,保存数据。(8)挑取交叉结合活性较好的阳性克隆,委托公司进行测序并返还质粒。
9、候选纳米抗体的真核表达质粒的构建
首先,设计并合成真核表达引物,N端添加Kozak序列和信号肽,C端添加His-tag和终止密码子,然后在前后两端添加保护碱基和酶切位点,将测序返回163个候选纳米抗体质粒进行PCR扩增,然后将其克隆至真核表达载体PB513B-1中,以构建获得纳米抗体与人IgG1Fc融合的双价抗体。
10、候选纳米抗体的鉴定
(1)结合ELISA
①包被:1μg/mLOmicronRBD蛋白,100μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。②封闭:4%脱脂牛奶,200μL/孔,37℃,1h,PBST洗3次。③加样品:骆驼免疫纳米抗体表达上清,100μL/孔,37℃,1h,PBST洗3次。④加检测抗体:GAH-HRP,100μL/孔,37℃,30min,PBST洗3次。④显色:TMB,100μL/孔,90s。⑤终止:2NH2SO4,100μL/孔。⑥数据获取:酶标仪读取OD450nm数值,保存数据。
(2)竞争ELISA
①包被:BA.2RBD蛋白和BA.5RBD蛋白,1μg/mL,100μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。②封闭:4%脱脂牛奶,200μL/孔,37℃,1h,PBST洗3次。③加样品:50μL/孔ACE2-biotin(2μg/mL)溶液与候选骆驼免疫纳米抗体表达上清按1:1混合,37℃,1h,PBST洗3次。④加检测抗体:Streptavidin-HRP,100μL/孔,37℃,30min,PBST洗3次。⑤显色:TMB,100μL/孔,90s。⑥终止:2NH2SO4,100μL/孔。⑦数据读取:酶标仪读取OD450nm值,保存数据。⑧数据处理:分析结合情况。
(3)假病毒中和活性的测定
①细胞复苏②将2种假病毒(Beta和BA.2)置于冰上融化,按1:1的比例与候选合成纳米抗体孵育,37℃,1h,设置3个复孔。③将用胰酶消化后的ACE2-OE细胞的密度调整为4×105个/mL,50μL/孔加至步骤②中的假病毒与瞬时表达上清的混合液中。④将样品板放置于细胞孵育箱中,37℃,培养48h。⑤弃去细胞上清,然后,利用Bright-Lumi™II萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒测定细胞的RLU值。
二、实验结果
1、骆驼免疫血清滴度的测定
按免疫计划表进行骆驼免疫,在第6次免疫后的第三天,分离并制备血清样品,测定骆驼免疫血清的滴度。由图2可知,骆驼免疫血清经1:6400稀释时仍保持与OmicronRBD的结合活性,此外,由交叉结合ELISA测定结果可知,经多次免疫后,免疫血清能与多种新冠变异株S蛋白的较好的结合,且具有浓度依赖效应,其中与Beta变异株S蛋白的结合活性较弱。因此,我们认为OmicronRBD蛋白免疫双峰骆驼可用于下一步噬菌体文库的构建和筛选。
2、驼源纳米抗体噬菌体库的建立
为建立驼源纳米抗体分子库,首先,提取骆驼外周血淋巴细胞RNA,经反转为cDNA后进行巢式PCR以钓取骆驼纳米抗体基因,两轮的DNA凝胶电泳结果如图3所示,最终获得的DNA片段大小约为400bp,接着,我们将其克隆至pComb3XTT载体,获得pComb3XTT-驼源纳米抗体重组质粒,即为驼源纳米抗体噬菌体展示质粒。将其电转TG1感受态细胞,获得驼源纳米抗体的噬菌体库,挑取300个克隆进行测序。由测序结果可知:共获得231个序列均不相同的正确克隆,正确率为77%,计算噬菌体库的实际库容量约为3×1010,图4展示了多序列比对的部分结果,进一步证明骆驼免疫噬菌体展示库质粒构建成功。
3、驼源纳米抗体噬菌体库的筛选
首先,利用骆驼免疫噬菌体展示库质粒制备和扩增驼源纳米抗体噬菌体颗粒,共经3轮的生物淘选,图5为3轮噬菌体淘洗的富集情况分析,第3轮生物淘洗的阳性率显著增加,说明阳性噬菌体得到了有效的富集,可用于进一步的候选分子的筛选。从第3轮淘洗的阳性克隆挑取480个克隆,并制备噬菌体上清,图6展示了部分噬菌体上清与OmicronRBD蛋白和DeltaRBD蛋白的结合活性结果,并对结合活性较强的进行突出显示。对阳性克隆进行测序后,共获得163条序列,聚类分析将其分为50类,对50类序列进行进化树分析和CDR3区的结果如图7所示。
4、驼源候选纳米抗体的鉴定
我们制备了50个Fc融合表达的纳米抗体,然后,借助结合ELISA测定候选分子的结合活性,最后,利用假病毒中和试验测定候选分子的生物学功能。结合ELISA的结果(图8)表明90%(45/50)的候选分子均能与6种RBD蛋白(Delta、Omicron及其变异株)结合。
由前期免疫血清与SARS-CoV-2变异株S蛋白的交叉活性的结果提示,免疫血清与Beta变异株S蛋白的结合较弱,为鉴定具有广谱中和活性的候选分子,我们首先选择了BA.2和Beta假病毒测定候选分子的中和活性,图9所示的结果表明,在50个待测分子中,13个候选分子的表达上清具有较好的中和活性,其中ZF-E8对Beta和BA.2假病毒的中和活性最强。
为最终确定13个候选分子是否具有广谱性,通过蛋白纯化后,获得13种纯化蛋白,借助结合ELISA测定了10nM的候选纳米抗体与SARS、SARS-CoV-2及其变异株S蛋白的结合活性,如图10所示,除2-B2、ZF-G12以及ZF-E8之外,其它10个候选分子与17种S蛋白均具有较好的结合活性。其次,利用8种SARS-CoV-2变异株测试了13种纳米抗体的中和活性。由图11所示的结果可知,ZF-E8在Alpha、Beta、Gamma、Omicron及BA.2的中和活性最强,而其它3种变异株则明显减弱甚至失效,而其它11种纳米抗体中和假病毒能力较差。综合以上结果,考虑OmicronS蛋白累积的大量突变,最终选定ZF-E8作为候选纳米抗体,用于后续功能活性评价。
实施例2候选纳米抗体的生物活性评价
一、实验方法
1、候选纳米抗体的分子模拟
针对获得的纳米抗体ZF-E8可变区氨基酸序列,选择蛋白质结构数据库经序列比对分析BlastP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定3株纳米抗体的最佳结构模板。通过在线模拟软件swissModel(https://www.expasy.ch)搭建抗体ZF-E8的空间结构。在CVFF力场下,选择Discovery Studio 2000软件包中的Discover程序对抗体ZF-E8的空间结构进行最小化处理。
2、间接ELISA测定候选纳米抗体的抗体特异性
(1)包被:2 μg/mL蛋白(分别为:PD-1、PD-L1、h-FGL1、ROR1、CD27、ACE2、Her2、CGRP、PCSK9、αvβ8、Siglec15、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-229E、TNF-α、SEB、CD20、EBOV-sGp和SARS-CoV-2),100 μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。(2)封闭:4%脱脂牛奶,200 μL/孔,37℃,1 h,PBST洗3次。(3)加样品:候选纳米抗体(ZF-E8),2 μg/mL,100 μL/孔,37℃,1 h,PBST洗3次。(4)加检测抗体:GAH-HRP,100 μL/孔,37℃,30 min,PBST洗3次。(5)显色:TMB,100 μL/孔,90 s。(6)终止:2N H2SO4,100 μL/孔。(7)数据获取:酶标仪读取OD450nm数值,保存数据。
3、间接ELISA测定候选纳米抗体与S蛋白的结合活性
(1)分别包被SARS、SARS-CoV-2及变异株S或RBD蛋白(1 μg/mL),100 μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。(2)封闭:4%脱脂牛奶,200 μL/孔,37℃,1 h,PBST洗3次。(3)加样品:将候选纳米抗体稀释至初始浓度为100 nM,设置S309为对照抗体,3倍稀释,12个梯度,100 μL/孔,37℃,1 h,PBST洗3次。(4)加检测抗体:GAH-HRP,100μL/孔,室温,45 min,PBST洗3次。(5)显色:TMB,100 μL/孔,90 s。(6)终止:2N H2SO4,100 μL/孔。(7)数据读取:酶标仪读取OD450nm数值,保存数据。(8)数据处理:借助GraphPad Prism 9分析和拟合数据。
4、BLI测定候选纳米抗体与S蛋白结合的亲和力
将待测分子用运行缓冲液稀释至10 μg/mL,Protein A探针分别捕获候选纳米抗体及对照抗体(ZF-E8、S309和ACE2-Fc),时间设置为90 s;分析物SARS、SARS-CoV-2及其变异株S或RBD蛋白同样用运行缓冲液梯度稀释至一定的浓度(100 nM、50 nM、25 nM、12.5nM、6.25 nM、3.125 nM和1.56 nM),设置待测分子与分析物结合时间180 s,解离时间240s;探针的再生:10 mM甘氨酸 HCl(pH=1.7)溶液,脉冲5 s,重复3次。将测定数据拟合成1:1结合模型,并计算平衡解离常数KD。
5、竞争ELISA测定候选分子与ACE2竞争活性的测定
(1)分别包被SARS、SARS-CoV-2及变异株S蛋白,1 μg/mL,100 μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。(2)封闭:4%脱脂牛奶,200 μL/孔,37℃,1 h,PBST 洗3次。(3)样品稀释:将候选纳米抗体稀释至初始浓度为500 nM,3倍稀释,12个梯度。
(4)加样品:50 μL/孔ACE2-biotin(2 μg/mL)溶液与候选纳米抗体按1:1混合,37℃,1 h,PBST洗3次。(5)加检测抗体:Streptavidin-HRP,100 μL/孔,37℃,30 min,PBST洗3次。(6)显色:TMB,100 μL/孔,90 s。(7)终止:2N H2SO4,100 μL/孔。(8)数据读取:酶标仪读取OD450nm数值,保存数据。借助GraphPad Prism 9分析结合情况。
6、候选纳米抗体的HIV假病毒中和活性测定
将候选纳米抗体稀释不同的起始浓度后,进行4倍稀释9个梯度,参照实施例1实验方法第10点。
7、候选纳米抗体的可复制型VSV假病毒中和活性测定
(1)细胞培养:将Vero-E6细胞培养至对数生长期,以1×104个/孔铺于96孔细胞培养板,培养18-20 h。(2)样品稀释:将候选纳米抗体和对照抗体 S309 稀释5个浓度,依次为15 μg/mL,5 μg/mL,0.5 μg/mL,0.1 μg/mL和0.01 μg/mL。(3)预孵育:将步骤(1)中的样品与可复制型VSV假病毒混合后,37℃,孵育1 h。(4)弃去Vero-E6细胞培养上清,将步骤(3)中的样品加至细胞中。(5)36 h后,倒置荧光显微镜拍照,并保存图片。
8、候选纳米抗体的可复制型VSV假病毒感染的预防效果评价
(1)将叙利亚金黄地鼠于SPF级动物房饲养7-10天,记录体重并观察有无脱毛等异常,以适应饲养环境,待叙利亚金黄地鼠体重约为100 g时,根据体重大小,利用随机数表法进行随机分组。(2)分组方案:PBS组、S309(10 mg/kg)组、ZF-E8(10 mg/kg)组和无关对照组,每组5只。(3)给药及测量方案:将待测样品用PBS稀释成对应的浓度,腹腔注射,12 h后,感染VSV可复制型假病毒(Delta或Omicron),12 h(Omicron)或24 h(Delta)后第一次采取血样测定纳米荧光素酶活性,并将小鼠麻醉后进行荧光成像拍照,而后每隔24 h采样,第7天时,将老鼠安乐死。利用GraphPad Prism 9软件分析数据,采用的统计学方法为One-wayANOVA。
9、候选纳米抗体的真病毒中和活性的测定
(1)细胞培养与铺板:将Vero-E6细胞培养至对数生长期,以1×104个/孔铺至96孔细胞培养板中,培养18-20h,待其长至约80%时备用。(2)样品稀释:首先将样品的初始浓度稀释至4000 nM,然后,按照4倍倍比稀释获得8个稀释梯度,依次为4000 nM、1000 nM、250nM、62.5 nM、15.63 nM、3.91nM、0.98 nM、0.24 nM,IgG同型对照仅设置最高浓度(4000nM)。(3)将每个稀释度样品100 μL分别与100 μL滴度为103×TCID50的病毒(SARS-CoV-2、Delta或BA.2)混匀,此时,样品终浓度为2000 nM、500 nM、125 nM、31.25 nM、7.82 nM、1.96nM、0.49 nM和0.12 nM,5% CO2,37℃,孵育1 h。(4)DMEM培养基洗2次,弃去上清液。(5)将100 μL步骤(4)中各稀释度的混合液加入到96孔板中,补加100 μL含4% FBS DMEM培养基,设置3个复孔,同时设立阳性和阴性对照以及IgG同型对照。(6)5% CO2,37℃培养72 h,显微镜下观察致细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)并拍照。
10、竞争ELISA测定候选分子的识别表位
(1)包被:SARS、SARS-CoV-2及其变异株S或RBD蛋白,1 μg/mL,100 μL/孔,4℃,过夜,PBST洗3次。(2)封闭:4%脱脂牛奶,200 μL/孔,37℃,1 h,PBST洗3次。(3)加样品:50 μL/孔的生物素化的ZF-B11分别与候选纳米抗体按1:1混合,37℃,1 h,PBST洗3次。(4)加检测抗体:Streptavidin-HRP,100 μL/孔,37℃,30 min,PBST洗3次;(5)显色:TMB,100 μL/孔,90 s。(6)终止:2N H2SO4,100 μL/孔。(7)数据读取:酶标仪读取OD450nm数值,保存数据。(8)数据处理:借助GraphPad Prism 9分析结合情况。
二、实验结果
1、候选纳米抗体的空间理论结构及潜在的评估分析
通过与PDB数据库的序列比对,确定了与获得的纳米抗体ZF-E8的最佳结构模板为6ZWK,其序列相似性为64.52%。经计算机辅助同源建模及力学优化获得的稳定构象如图12所示,纳米抗体ZF-E8除了CDR1与CDR3正常的1对二硫键外,为了构象的稳定性,在FR2与CDR3末端形成1对二硫键,这对二硫键的形成使得CDR3区构象弯曲到CDR1与CDR2间,同时ZF-E8在CDR3区的半胱氨酸的位置不同导致CDR3区构象的弯曲程度存在差异,ZF-E8中CDR3区构象弯曲更为明显,与CDR1、CDR2构象互相存在分子内相互作用,可能会影响其与RBD的作用。
2、候选纳米抗体的特异性分析
抗体的特异性是指抗体只能与其靶标抗原结合的专一性能。为验证候选纳米抗体的特异性,我们利用间接ELISA测定候选纳米抗体与非SARS、SARS-CoV-2及其变异株S蛋白的18种其他靶标蛋白的结合活性,包括EBOV表面蛋白、SEB、10种人体细胞表面蛋白、3种其他冠状病毒和3种体内其他分子蛋白。从结果图13可以看出,候选纳米抗体仅与SARS-CoV-2RBD蛋白结合,而与18种其他靶标蛋白均不结合。在一定程度上提示候选纳米抗体与其他蛋白(包括β冠状病毒属的其他3种蛋白:HCoV-229E、HCoV-HKU1和HCoV-NL63)不存在明显的交叉,证明了ZF-E8与SARS、SARS-CoV-2及其变异株的识别具有特异性。
3、候选纳米抗体与SARS、SARS-CoV-2S蛋白的结合活性
利用间接ELISA评价候选纳米抗体与SARS、SARS-CoV-2及主要变异株S蛋白的结合活性。由于Omicron变异株累积大量突变,与前期变异株明显不同,所以,按Omicron出现前后来展示实验结果。图14所示的结果表明,阳性对照抗体S309仅能与Omicron出现之前的变异株结合,却丧失了与Omicron及其亚谱系变异株的结合活性。与S309相比,候选纳米抗体表现出更广谱的结合活性, ZF-E8能特异结合8种S蛋白,EC50值在0.2-2nM之间(BQ.1.1除外),显著优于S309,但其不能与Delta、BA.4及其后出现的变异株S蛋白结合,各个候选纳米抗体结合活性的EC50值见表4。
表4候选纳米抗体结合活性的EC50值(nM)
4、候选纳米抗体与SARS、SARS-CoV-2S蛋白的亲和力
借助BLI测定抗原-抗体结合后在探针表面反射干涉光谱的信号改变,以计算抗体的亲和力常数,并采用GatorPrime非标记生物分析系统来测定候选纳米抗体与8种突变株RBD蛋白的亲和力。BLI测定的结果表明,与ELISA结合活性测定所得结果相似,候选分子与RBD蛋白的亲和力如表5所示,ZF-E8与SARS-CoV-2、Omicron及BA.2有较强的亲和力,而对其他5种变异株的亲和力降低约10-40倍。
表5候选纳米抗体与 S 蛋白结合的亲和力常数(nM)
5、候选纳米抗体竞争性阻断ACE2与S蛋白相互作用
为明确候选纳米抗体是否通过阻断SARS、SARS-CoV-2及变异株S蛋白与ACE2的结合来发挥生物学功能,我们利用竞争ELISA测定了候选纳米抗体的竞争阻断活性。图15所示的结果表明,在Omicron之前的变异株(共6种)方面,ZF-E8能有效的抑制除Delta外的变异株6种S蛋白与ACE2的结合。在Omicron及其亚谱系变异株方面,ZF-E8则能有效抑制Omicron和BA.2与ACE2的结合,而对BA.4及其后的变异株丧失了竞争性阻断S蛋白与ACE2结合的活性。由以上结果可知ZF-E8是通过竞争性阻断ACE2与S蛋白相互作用而发挥功能,且由于Omicron相较于SARS-CoV-2发生的突变较多,对ACE2与S蛋白结合的影响存在显著的差异。
6、候选纳米抗体的HIV假病毒中和活性
我们已建立了18种HIV骨架的荧光素酶报告基因的假病毒系统,用于评价候选纳米抗体的中和活性。由图16所示的结果可知,ZF-E8对10种假病毒均具有较强的中和活性,IC50值在0.1nM左右,但丧失了对Delta和BA.4之后出现的变异株的中和活性。上述结果证明候ZF-E8不能完全覆盖18种变异株,但是其对10种变异株具有较强的中和效应。
7、候选纳米抗体的广谱可复制型VSV假病毒中和活性
为更加直观地检测纳米抗体抑制病毒感染细胞的过程,我们获得了基于VSV骨架的可复制型假病毒系统(不仅能够感染细胞,其基因组能够借助宿主细胞复制并释放假病毒颗粒),该系统在感染细胞后会通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达活性来反应病毒感染的强弱,主要包括SARS-CoV-2、Delta和Omicron。由荧光显微镜拍照的结果可知,候选纳米抗体抗病毒活性与HIV假病毒系统测定的基本一致,具体而言,在SARS-CoV-2假病毒评价(图17)中,包括对照抗体S309在内的抗体均表现出一定的中和活性,且浓度为15μg/mL时中和效应较为明显,由强到弱依次为:ZF-E8 > S309。
抑制可复制型Delta假病毒进入细胞方面(图18),ZF-E8不与Delta结合)。候选纳米抗体抑制Omicron假病毒进入细胞的中和活性结果(图19)表明,ZF-E8中和效应最强,抗体浓度低至0.5μg/mL时仍能有效中和约80%假病毒的感染,相比之下,对照抗体S309在15μg/mL浓度下抑制假病毒感染细胞的效果不明显。
8、候选纳米抗体的可复制型VSV假病毒的预防和治疗效果
为评估候选纳米抗体的体内中和活性,由于前期的实验结果证明了ZF-E8不具有中和Delta的能力,所以未进行VSV-Luc-Delta假病毒保护效果的验证。图20A所示的实验结果表明:10mg/kg的ZF-E8能有效保护叙利亚金黄地鼠感染VSV-nLuc-Omicron假病毒,S309则丧失了对VSV-nLuc-Omicron假病毒感染的抑制作用。同样的,我们也检测了不同时间点叙利亚金黄地鼠的血清纳米荧光素酶活性,结果如图20B所示,相较于VSV-Luc-Delta假病毒,感染VSV-nLuc-Omicron假病毒的血清纳米荧光素酶的峰值出现较早,即24h时达到感染峰值,ZE-E8组的血清纳米荧光素酶水平,在所有测定的时间点均显著低于空白组(P<0.01),而对照抗体S309与空白对照组相比没有显著的抑制效果,这也与荧光成像的结果一致。
9、候选纳米抗体的真病毒中和活性
理论上,假病毒中和活性的强弱能在一定程度上反应候选纳米抗体对真病毒的中和效果,但二者表面S蛋白的数量差异且真病毒在宿主不断复制和释放,因此,开展纳米抗体真病毒中和活性的研究是十分必要的。我们进一步在BSL-3实验条件下验证了候选纳米抗体的真病毒中和活性,主要包括SARS-CoV-2、Delta和BA.2。真病毒的对细胞感染程度依据CPE评价病毒感染导致的细胞损伤程度,并拍照记录。如图21所示的结果可知,ZF-E8的浓度低至3.19nM对BA.2仍具有保护效应,250nM时能有效中和SARS-CoV-2,与前期结果一致,ZF-E8不能有效中和Delta,详见表6。
表6 候选纳米抗体对真病毒感染的CPE的影响
注:“++++”代表 CPE 严重,“+++”代表 CPE 中等,“++”代表 CPE 轻度,“+”代表CPE 较轻微,“--”代表无 CPE
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (19)
1.一种与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体,其特征在于,其包含重链可变区,所述重链可变区包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3,其中,CDR1的氨基酸序列为SEQ IDNO:1,CDR2的氨基酸序列为SEQ ID NO:2,CDR3的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.根据权利要求1所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体,其特征在于,所述重链可变区还包括4个框架区FR1-4,所述FR1-4与所述CDR1、CDR2和CDR3按顺序交错排列,所述FR1-4的序列分别如SEQ ID NO:4、5、6、7所示。
3.根据权利要求1或2所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体,其特征在于,所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
4.一种核酸分子,所述核酸分子编码权利要求1-3任一项所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体。
5.一种核酸构建体,所述核酸构建体包含权利要求4所述的核酸分子。
6.一种载体,所述载体包括权利要求4所述的核酸分子,或权利要求5所述的核酸构建体。
7.一种转化的细胞,所述转化的细胞包括权利要求1-3任一项所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的核酸构建体,或权利要求6所述的载体。
8.一种药物组合物,所述药物组合物包括权利要求1-3任一项所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的核酸构建体、权利要求6所述的载体,或权利要求7所述的转化的细胞。
9.一种非诊断与治疗目的的检测样品中SARS和SARS-CoV-2蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)将权利要求1-3任一项所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体与样品接触;
(ii)检测SARS和SARS-CoV-2蛋白与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体是否有复合物形成。
10.权利要求1-3任一项所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染的产品中的应用。
11.权利要求1-3任一项所述的与SARS和SARS-CoV-2广谱性结合的纳米抗体在制备治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。
12.权利要求4所述的核酸分子在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染的产品中的应用。
13.权利要求4所述的核酸分子在制备治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。
14.权利要求5所述的核酸构建体在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染的产品中的应用。
15.权利要求5所述的核酸构建体在制备治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。
16.权利要求6所述的载体在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染的产品中的应用。
17.权利要求6所述的载体在制备治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。
18.权利要求7所述的转化的细胞在制备广谱性检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染的产品中的应用。
19.权利要求7所述的转化的细胞在制备治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。
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