CN107406500B - 抗甲状腺素运载蛋白抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性结合甲状腺素运载蛋白(TTR)的抗体。所述抗体可用于治疗或实现预防与TTR积累或TTR沉积物积累相关的疾病或病症(例如，TTR淀粉样变性)。除了其他应用之外，所述抗体还可用于诊断TTR淀粉样变性以及抑制或减少TTR的聚集。

Description

抗甲状腺素运载蛋白抗体
相关申请的交叉引用
本申请涉及2015年1月28日提交的美国临时申请号62/109,004和2015年12月11日提交的美国临时申请号62/266,555，所述临时申请中的每个均出于所有目的以引用的方式整体并入。
序列表引用
本专利申请包括2016年1月28日创建的名为473366_SEQLST.TXT并含有49,257字节的文件中的电子序列表，所述电子序列表特此出于所有目的以引用的方式整体并入。
背景
许多疾病被认为是由疾病特异性蛋白质的异常折叠和聚集引起的。这些蛋白质可以积累成被称为淀粉样蛋白的病理诊断性积累物，其通过某些组织染色来可视化。淀粉样蛋白被认为引发炎症应答，并对所涉及的组织具有多重负面后果。此外，较小的异常折叠蛋白质聚集体可能存在，并且发挥细胞毒作用。
甲状腺素运载蛋白(TTR)是已知错误折叠并聚集(例如，经历淀粉样蛋白生成)的许多蛋白质之一。淀粉样蛋白相关淀粉样变性涵盖两种疾病形式：由突变或变体TTR错误折叠引起的家族性疾病，以及由野生型TTR的错误聚集引起的散发性非遗传性疾病。TTR淀粉样蛋白生成的过程可能引起神经系统和/或心脏以及其他组织的病理。
要求保护的本发明的概述
在一个方面，本发明提供特异性结合甲状腺素运载蛋白的抗体，所述抗体包含基本上来自抗体5A1的三个重链CDR和三个轻链CDR。一些此类抗体包含抗体5A1的三个Kabat重链CDR(分别为SEQ ID NO:6-8)和三个轻链CDR(分别为SEQ ID NO:14、15和17)。在一些抗体中，重链CDR-H1为复合Kabat-Chothia CDR-H1(SEQ ID NO:52)。一些此类抗体为单克隆抗体。一些此类抗体为嵌合抗体、人源化抗体、贴面化抗体或人抗体。一些此类抗体具有人IgG1同种型。一些此类抗体具有人IgG2或IgG4同种型。
一些此类抗体为特异性结合到甲状腺素运载蛋白的人源化5A1抗体或嵌合5A1抗体，其中5A1为特征在于SEQ ID NO:1的成熟重链可变区和SEQ ID NO:9的成熟轻链可变区的小鼠抗体。
在一些抗体中，人源化成熟重链可变区包含5A1的三个重链CDR，并且人源化成熟轻链可变区包含5A1的三个轻链CDR，不同之处在于位置L55可为C或S。在一些抗体中，人源化成熟重链可变区包含5A1的三个Kabat重链CDR(SEQ ID NO:6-8)，并且人源化成熟轻链可变区包含5A1的三个Kabat轻链CDR(SEQ ID NO:14、15和17)，不同之处在于位置L55可为C或S。
一些此类抗体包含人源化成熟重链可变区和人源化成熟轻链可变区，所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4或5至少90％相同的氨基酸序列，所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:12或13至少90％相同的氨基酸序列。
在一些此类抗体中，以下位置中的至少一个被如所指定的所述氨基酸占据：位置H29被F占据，位置H93被V占据，位置L55被S占据，并且位置L85被V占据。在一些此类抗体中，以下位置中的至少两个被如所指定的所述氨基酸占据：位置H29被F占据，位置H93被V占据，位置L55被S占据，并且位置L85被V占据。在一些此类抗体中，以下位置中的至少三个被如所指定的所述氨基酸占据：位置H29被F占据，位置H93被V占据，位置L55被S占据，并且位置L85被V占据。在一些此类抗体中，以下位置中的所有被如所指定的所述氨基酸占据：位置H29被F占据，位置H93被V占据，位置L55被S占据，并且位置L85被V占据。
一些抗体包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4或5至少95％相同的氨基酸序列，所述成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:12或13至少95％相同的氨基酸序列。一些抗体包含成熟重链可变区和成熟轻链可变区，所述成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4或5至少98％相同的氨基酸序列，所述成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:12或13至少98％相同的氨基酸序列。
一些此类抗体包含SEQ ID NO:4的成熟重链可变区和SEQ ID NO:12的成熟轻链可变区。一些此类抗体包含SEQ ID NO:4的成熟重链可变区和SEQ ID NO:13的成熟轻链可变区。一些此类抗体包含SEQ ID NO:5的成熟重链可变区和SEQ ID NO:12的成熟轻链可变区。一些此类抗体包含SEQ ID NO:5的成熟重链可变区和SEQ ID NO:13的成熟轻链可变区。
在一些抗体中，抗体为完整抗体。在一些抗体中，抗体为结合片段。在一些此类抗体中，结合片段为单链抗体、Fab或Fab’2片段。
在一些抗体中，成熟轻链可变区与轻链恒定区融合，并且成熟重链可变区与重链恒定区融合。在一些此类抗体中，重链恒定区为天然人重链恒定区的突变形式，所述突变形式与Fcγ受体的结合相对于所述天然人重链恒定区减少。在一些此类抗体中，重链恒定区具有IgG1同种型。在一些此类抗体中，成熟重链可变区与具有SEQ ID NO:23的序列的重链恒定区融合，并且/或者成熟轻链可变区与具有SEQ ID NO:25的序列的轻链恒定区融合。
在一些抗体中，分别来自SEQ ID NO:1和9的成熟重链可变区和成熟轻链可变区的CDR的任何差异位于位置H60-H65。
在另一方面，本发明提供包含任何以上提及的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一方面，本发明提供编码任何以上提及的抗体的重链和/或轻链的核酸。在另一方面，本发明提供包含这种核酸的重组表达载体。在另一方面，本发明提供用这种重组表达载体转化的宿主细胞。
另一方面，本发明提供使抗体人源化的方法，所述方法包括：
(a)选择受体抗体；
(b)鉴定待保留的小鼠抗体的氨基酸残基；
(c)合成编码包含所述小鼠抗体重链CDR的人源化重链的核酸，和编码包含所述小鼠抗体轻链CDR的人源化轻链的核酸；以及
(d)在宿主细胞中表达所述核酸以产生人源化抗体；
其中所述小鼠抗体包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区，以及具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的轻链可变区
另一方面，本发明提供产生人源化抗体、嵌合抗体或贴面化抗体的方法，所述方法包括：
(a)培养用编码所述抗体的重链和轻链的核酸转化的细胞，使得所述细胞分泌所述抗体；以及
(b)纯化来自细胞培养基的所述抗体；
其中所述抗体为5A1的人源化形式、嵌合形式或贴面化形式。
另一方面，本发明提供产生细胞系的方法啊，所述细胞系产生人源化抗体、嵌合抗体或贴面化抗体法，所述方法包括：
(a)将编码抗体重链和轻链和可选择标记的载体引入细胞中；
(b)在选择具有增加的所述载体的拷贝数的细胞的条件下繁殖所述细胞；
(c)从所选细胞中分离单细胞；以及
(d)将由基于抗体产量选择的单细胞克隆的细胞入库；
其中所述抗体为5A1的人源化形式、嵌合形式或贴面化形式。
一些此类方法还包括在选择性条件下繁殖所述细胞，以及筛选天然表达并分泌至少100mg/L/106个细胞/24h的细胞系。
在另一方法，本发明提供抑制或减少甲状腺素运载蛋白在受试者中的聚集的方法，所述受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或处于发展甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的风险中，所述方法包括向所述受试者施用以上提及的抗体中的任一种的有效方案，从而抑制或减少甲状腺素运载蛋白在所述受试者中的聚集。
在另一方面，本发明提供抑制或减少受试者中的甲状腺素运载蛋白原纤维形成的方法，所述受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或处于发展甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的风险中，所述方法包括向所述受试者施用以上提及的抗体中的任一种的有效方案，从而抑制或减少所述受试者中的甲状腺素运载蛋白积累。
在另一方面，本发明提供减少受试者中的甲状腺素运载蛋白沉积物的方法，所述受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或处于发展甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的风险中，所述方法包括向所述受试者施用以上提及的抗体中的任一种的有效方案，从而减少所述受试者中的甲状腺素运载蛋白沉积物。
在另一方面，本发明提供清除受试者中的聚集的甲状腺素运载蛋白的方法，所述受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或处于发展甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的风险中，所述方法包括向所述受试者施用以上提及的抗体中的任一种的有效方案，从而相对于未接受所述抗体的患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或处于发展甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的风险中的受试者，将聚集的甲状腺素运载蛋白从所述受试者中清除。
在另一方面，本发明提供使受试者中的甲状腺素运载蛋白的无毒性构象稳定的方法，所述受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或处于发展甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的风险中，所述方法包括向所述受试者施用以上提及的抗体中的任一种的有效方案，从而使所述受试者中的甲状腺素运载蛋白的无毒性构象稳定。
在另一方面，本发明提供治疗或实现预防受试者中的甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的方法，所述方法包括向所述受试者施用以上提及的抗体中的任一种的有效方案。
在另一方面，本发明提供延迟受试者中的甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的发作的方法，所述方法包括向所述受试者施用以上提及的抗体中的任一种的有效方案。
在另一方面，本发明提供诊断受试者中的甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的方法，其包括使来自所述受试者的生物样品与有效量的以上提及的抗体中的任一种接触。一些此类方法还包括检测抗体与甲状腺素运载蛋白的结合，其中结合抗体的存在指示受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性。一些此类方法还包括将所述抗体与所述生物样品的结合与所述抗体与对照样品的结合进行比较，由此所述抗体与所述生物样品的结合相对于所述对照样品的增加指示受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性。
在一些此类方法中，生物样品和对照样品包含相同组织来源的细胞。在一些此类方法中，生物样品和/或对照样品为血液、血清、血浆或实体组织。在一些此类方法中，实体组织来自心脏、周围神经系统、自主神经系统、肾、眼睛或胃肠道。
在一些方法中，甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性为家族性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性或散发性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性。在一些此类方法中，家族性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性为家族性淀粉样心肌病(FAC)、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)或中枢神经系统选择性淀粉样变性(CNSA)。在一些此类方法中，散发性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性为老年全身性淀粉样变性(SSA)或老年心脏淀粉样变性(SCA)。
在一些方法中，甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性与所述受试者的心脏、周围神经系统、自主神经系统、肾、眼睛或胃肠道中的淀粉样蛋白积累相关。
在另一方面，本发明提供检测受试者中的甲状腺素运载蛋白沉积物的存在或不存在的方法，其包括使来自所述受试者的疑似包含淀粉样蛋白积累的生物样品与有效量的以上提及的抗体中的任一种接触。一些此类方法还包括检测抗体与甲状腺素运载蛋白的结合，其中结合抗体的检测指示甲状腺素运载蛋白沉积物的存在。一些此类方法还包括将所述抗体与所述生物样品的结合与所述抗体与对照样品的结合进行比较，由此所述抗体与所述生物样品的结合相对于所述对照样品的增加指示受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性。在一些此类方法中，生物样品和对照样品包含相同组织来源的细胞。在一些此类方法中，生物样品和/或对照样品为血液、血清、血浆或实体组织。在一些此类方法中，实体组织来自心脏、周围神经系统、自主神经系统、肾、眼睛或胃肠道。
在另一方面，本发明提供测定受试者中的甲状腺素运载蛋白沉积物的水平的方法，其包括施用以上提及的抗体中的任一种，以及检测所述受试者中的结合抗体的存在。在一些此类方法中，结合抗体的存在通过正电子发射断层摄影术(PET)来确定。
附图简述
图1示出小鼠5A1抗体、小鼠模型抗体、人受体抗体和5A1抗体人源化版本的重链可变区的比对。如由Kabat定义的CDR包封在框中，不同之处在于第一包封框为Chothia CDR-H1和Kabat CDR-H1的复合物，Kabat CDR-H1加有下划线且为粗体。
图2示出小鼠5A1抗体、小鼠模型抗体、人受体抗体和5A1抗体人源化版本的轻链可变区的比对。包封如由Kabat所定义的CDR
图3A和3B：图3A示出鼠5A1、6C1、9D5和14G8抗体与ph4处理的TTR的结合曲线。图3B示出鼠5A1、6C1、9D5和14G8抗体与ph4处理的TTR或天然TTR的结合曲线
图4A、4B及4C：图4A示出由mis-TTR抗体进行的TTR-Y78F纤维形成的抑制。图4B示出由14G8进行的TTR-V122I纤维形成的抑制。图4C示出由对照抗体进行的TTR-V122I纤维形成的抑制。
图5A和5B：图5A示出使用9D5 mis-TTR抗体进行的来自确认为V30M ATTR的患者的血浆样品(样品#21、#22、#23、#24、#25、#27)和来自正常受试者的样品(样品#11、#12、#15、#18、#19和#20)的蛋白质印迹分析的密度测定术分析。图5B示出使用5A1 mis-TTR抗体进行的相同样品的蛋白质印迹分析的密度测定术分析。
图6示出使用6C1抗体进行的来自确认为V30M ATTR的患者的血浆样品(样品#21、#22、#23、#24、#25、#27)和来自正常受试者的样品(#11、#12、#15、#18、#19、#20)的MesoScaleDiscovery(MSD)板测定。
图7A和7B：图7A示出抗体14G8对由THP-1细胞进行的F87M/L110M TTR摄取的影响。图7B示出每个mis-TTR抗体对由THP-1细胞进行的V30M TTR摄取的影响。
序列简述
SEQ ID NO:1列出小鼠5A1抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2列出小鼠重链可变区结构模板的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3列出重链可变受体登录号AGP01680的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4列出人源化5A1抗体版本1(Hu5A1VHv1)的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5列出人源化5A1抗体版本2(Hu5A1VHv2)的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6列出小鼠5A1抗体的Kabat CDRH1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:7列出小鼠5A1抗体的Kabat CDRH2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:8列出小鼠5A1抗体的Kabat CDRH3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9列出小鼠5A1抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10列出小鼠轻链可变区结构模板的氨基酸序列。
SEQ ID NO:11列出轻链可变受体登录号BAH04766的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12列出人源化5A1抗体版本1(Hu5A1VLv1)的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:13列出人源化5A1抗体版本2(Hu5A1VLv2)的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14列出小鼠5A1抗体的Kabat CDRL1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15列出小鼠5A1抗体的Kabat CDRL2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:16列出人源化小鼠5A1抗体的Kabat CDRL2版本2的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17列出小鼠5A1抗体的Kabat CDRL3的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18列出具有信号肽的小鼠5A1抗体的重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:19列出具有信号肽的小鼠5A1抗体的重链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20列出具有信号肽的小鼠5A1抗体的轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:21列出具有信号肽的小鼠5A1抗体的轻链可变区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:22列出示例性IgG1重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:23列出示例性IgG1 G1m3重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24列出示例性IgG1 G1m3重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:25列出具有N端精氨酸的示例性轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:26列出没有N端精氨酸的示例性轻链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27列出人源化5A1抗体版本1的重链区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28列出人源化5A1抗体版本2的重链区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29列出人源化5A1抗体版本1的轻链区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:30列出人源化5A1抗体版本2的轻链区的氨基酸序列。
SEQ ID NO:31列出登录号P02766.1(UniProt)中列出的人甲状腺素运载蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:32列出登录号AAB35639.1(GenBank)中列出的人甲状腺素运载蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:33列出登录号AAB35640.1(GenBank)中列出的人甲状腺素运载蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:34列出登录号和ABI63351.1(GenBank)中列出的人甲状腺素运载蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:35列出人甲状腺素运载蛋白表位残基89-97的氨基酸序列。
SEQ ID NO:36列出潜在甲状腺素运载蛋白免疫原的氨基酸序列。
SEQ ID NO:37列出潜在甲状腺素运载蛋白免疫原的氨基酸序列。
SEQ ID NO:38列出潜在甲状腺素运载蛋白免疫原的氨基酸序列。
SEQ ID NO:39列出编码示例性IgG1 G1m3重链恒定区的核酸序列。
SEQ ID NO:40列出编码具有N端精氨酸的示例性轻链恒定区的核酸序列。
SEQ ID NO:41列出编码没有N端精氨酸的示例性轻链恒定区的核酸序列。
SEQ ID NO:42列出重链恒定区信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:43列出编码重链恒定区信号肽的核酸序列。
SEQ ID NO:44列出轻链恒定区信号肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO:45列出编码轻链恒定区信号肽的核酸序列。
SEQ ID NO:46列出编码小鼠5A1可变轻链区的核酸序列。
SEQ ID NO:47列出编码小鼠5A1可变重链区的核酸序列。
SEQ ID NO:48列出编码人源化5A1抗体版本1(Hu5A1VHv1)的重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:49列出编码人源化5A1抗体版本2(Hu5A1VHv2)的重链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:50列出编码人源化5A1抗体版本1(Hu5A1VLv1)的轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:51列出编码人源化5A1抗体版本2(Hu5A1VLv2)的轻链可变区的核酸序列。
SEQ ID NO:52列出小鼠5A1抗体的复合CDR-H1(残基26-35)的氨基酸序列。
定义
单克隆抗体或其他生物实体通常以分离的形式提供。这意味着抗体或其他生物实体的纯度通常为至少50％w/w，具有由其生产或纯化产生的干扰蛋白质和其他污染物，但不排除以下可能性：单克隆抗体与过量的药学上可接受的载体或旨在促进其使用的其他媒介物组合。有时，单克隆抗体的纯度为至少60％、70％、80％、90％、95％或99％w/w，具有来自生产或纯化的干扰蛋白质和污染物。通常，分离的单克隆抗体或其他生物实体为其纯化后剩余的主要大分子物质。
抗体与其靶抗原的特异性结合意指至少106、107、108、109或1010M-1的亲和力。特异性结合的量级可检测到较高，并且可与对至少一个无关靶标发生的非特异性结合区分开来。特异性结合的原因可为特定官能团之间的键或特定空间配合(例如，锁和钥匙型)的形成，而非特异性结合的原因通常为范德瓦耳斯力。然而，特异性结合不一定暗示抗体结合一个且仅结合一个靶标。
碱性抗体结构单元为亚基的四聚体。每个四聚体包括两对相同的多肽链，每一对具有一个“轻”(约25kDa)链和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的具有约100至110个或更多个氨基酸的可变区。此可变区最初表达连接至可切割信号肽。没有信号肽的可变区有时被称为成熟可变区。因此，例如，轻链成熟可变区意指没有轻链信号肽的轻链可变区。每条链的羧基端部分限定了主要负责效应功能的恒定区。
轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并分别将抗体的同种型定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过具有约12个或更多个氨基酸的“J”区连接，其中重链还包括具有约10个或更多个氨基酸的“D”区。大体上参见，Fundamental Immunology，Paul，W.编,第2版Raven Press，N.Y.，1989,第7章(出于所有目的以引用的方式整体并入)。
免疫球蛋白轻链或重链可变区(本文中还分别被称为“轻链可变结构域”(“VL结构域”)或“重链可变结构域”(“VH结构域”))由被三个“互补决定区”或“CDR”中断的“框架”区组成。框架区用于排列用于与抗原的表位特异性结合的CDR。CDR包含主要负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。从氨基端至羧基端，VL和VH结构域均包含以下框架(FR)和CDR区：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。VL结构域的CDR1、2和3在本文中分别被称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3；VH结构域的CDR 1、2和3在本文中分别被称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。
氨基酸至每个VL和VH结构域的分配符合CDR的任何常规定义。常规定义包括Kabat定义(Kabat，Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)、Chothia定义(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917，1987；Chothia等，Nature 342:878-883，1989)；CDR-H1为Chothia和Kabat CDR的复合物的Chothia Kabat CDR复合物；牛津分子抗体建模软件所用的AbM定义；以及Martin等(bioinfo.org.uk/abs)的接触定义(参见表1)。Kabat提供广泛使用的编号惯例(Kabat编号)，在所述编号惯例中不同重链之间或不同轻链之间的相应残基被分配相同的数字。当据称抗体包括某种CDR定义(例如Kabat)的CDR时，所述定义指定抗体中存在的CDR残基(即，Kabat CDR)的最小数目。不排除也存在处于另一常规CDR定义内但处于指定定义之外的其他残基。例如，除了其他可能性之外，包含由Kabat定义的CDR的抗体包括：CDR含有Kabat CDR残基且不含其他CDR残基的抗体，以及CDR H1为复合Chothia-KabatCDR H1并且其他CDR含有Kabat CDR残基且不含基于其他定义的另外CDR残基的抗体。
表1
使用Kabat编号的常规CDR定义
Figure GDA0002857898730000151
*Chothia的CDR-H1可在H32、H33或H34处结束(取决于环的长度)。这是因为Kabat编号方案将额外残基置于35A和35B插入处，而Chothia编号将它们置于31A和31B处。如果H35A和H35B(Kabat编号)均不存在，则Chothia CDR-H1环在H32处结束。如果仅存在H35A，则在H33处结束。如果H35A和H35B均存在，则在H34处结束。
术语“抗体”包括完整抗体及其结合片段。通常，片段与其所来源的完整抗体竞争与靶标的特异性结合，所述靶标包括单独重链、轻链Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab)c、Dab、纳米抗体和Fv。片段可通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离来产生。术语“抗体”还包括双特异性抗体和/或人源化抗体。双特异性或双功能抗体是具有两个不同重/轻链对和两个不同结合位点的人工杂交抗体(参见，例如，Songsivilai和Lachmann，Clin.Exp.Immunol.，79:315-321(1990)；Kostelny等，J.Immunol.，148:1547-53(1992))。在一些双特异性抗体中，两个不同的重/轻链对包括人源化5A1重链/轻链对和对被5A1所结合的甲状腺素运载蛋白的不同表位特异性的重链/轻链对。
在一些双特异性抗体中，一个重链/轻链对是如以下所进一步公开的人源化5A1抗体，并且另一个重链/轻链对来自结合到血脑屏障上表达的受体的抗体，所述受体诸如胰岛素受体、胰岛素样生长因子(IGF)受体、瘦蛋白受体或脂蛋白受体或转铁蛋白受体(Friden等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4771-4775，1991；Friden等，Science 259:373-377，1993)。这种双特异性抗体可通过受体介导的转胞吞作用来转移穿过血脑屏障。双特异性抗体的脑摄取可通过工程化双特异性抗体以降低其与血脑屏障受体的亲和力来进一步增强。对受体的亲和力降低导致大脑中的分布更广(参见，例如，Atwal等，Sci.Trans.Med.3，84ra43，2011；Yu等，Sci.Trans.Med.3，84ra44，2011)。
示例性双特异性抗体还可为：(1)双重可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有通过短肽键串联的两个可变结构域(Antibody Engineering，Springer BerlinHeidelberg(2010)中：Wu等，Generation and Characterization of a Dual VariableDomain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule)；(2)Tandab，其为两个单链双抗体的融合物，产生具有每个靶抗原的两个结合位点的四价双特异性抗体；(3)柔性抗体(flexibody)，其为scFv与产生多价分子的双抗体的组合；(4)基于蛋白激酶A中的“二聚化和停靠结构域”的所谓“停靠和锁定”分子，其在应用于Fab时可产生三价双特异性结合蛋白，所述三价双特异性结合蛋白由连接到不同Fab片段的两个相同Fab片段组成；或(5)所谓的蝎子分子，其包含例如与人Fc区两端融合的两个scFv。用于制备双特异性抗体的平台的实例包括BiTE(Micromet)、DART(MacroGenics)、Fcab和Mab2(F-star)、Fc工程化IgG1(Xencor)或DuoBody(基于Fab臂交换，Genmab)。
术语“表位”是指抗原上抗体所结合的位点。表位可由通过一种多种蛋白质的三级折叠来并置的连续氨基酸或不连续氨基酸来形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂时得以保持，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在用变性溶剂处理时失去。表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如，Methods in Molecular Biology,第66卷，Glenn E.Morris编(1996)中的表位作图方案。表位可为线性的，诸如具有来自SEQ ID NO:31的例如2-5、3-5、3-9或5-9个连续氨基酸的表位。表位也可为构象表位，包括例如SEQ ID NO:31的残基89-97内的两个或多个非连续的氨基酸区段。如果据称抗体结合到甲状腺素运载蛋白(TTR)的氨基酸89-97内的表位，例如，意指表位处于所列举的氨基酸范围内，包括定义范围外部界限的那些范围。不一定意指范围内的每个氨基酸构成表位的一部分。因此，例如，除了SEQ ID NO:35的其他线性区段之外，或在构象表位的情况下，除了SEQ ID NO:35的其他非连续氨基酸区段之外，TTR的氨基酸89-97内的表位还可以由氨基酸89-97、89-96、90-96、91-96、92-96、93-96、94-96、89-96、89-95、89-94、89-93、89-92或89-93组成。
识别相同表位或重叠表位的抗体可以在简单的免疫测定来鉴定，所述免疫测定示出一种抗体与另一种抗体竞争结合到靶抗原的能力。抗体的表位还可由结合到其抗原以鉴定接触残基的抗体的X射线晶体学定义。可替代地，如果抗原中的减少或消除一种抗体的结合的所有氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有相同表位。如果减少或消除一种抗体的结合的一些氨基酸突变减少或消除另一种抗体的结合，那么两种抗体具有重叠表位。
抗体之间的竞争通过以下测定来测定，在所述测定中所测试的抗体抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合(参见，例如，Junghans等，Cancer Res.50:1495，1990)。如果过量的测试抗体(例如，至少2x、5x、10x、20x或100x)如在竞争性结合测定中所测量将参考抗体的结合抑制至少50％，则测试抗体与参考抗体竞争。一些测试抗体将参考抗体的结合抑制至少75％、90％或99％。由竞争测定鉴定的抗体(竞争性抗体)包括结合到与参考抗体所结合的表位相同的表位的抗体，以及结合到相邻表位的抗体，其所述相邻表位足够邻近由参考抗体结合的表位以发生位阻。
关于结构甲状腺素运载蛋白(TTR)的术语“天然”是指处于正常功能状态的TTR(即，TTR四聚体)的正常折叠结构。因为TTR是呈天然折叠形式的四聚体，所以TTR的非天然形式包括例如错误折叠TTR四聚体、TTR单体、TTR的聚集形式和TTR的原纤维形式。TTR的非天然形式可包括包含野生型TTR氨基酸序列或突变的分子。
关于TTR的术语“错误折叠”是指TTR多肽单体或多聚体的二级结构和三级结构，并且指示多肽已经采用对于处于正常功能状态的所述蛋白质不正常的构象。虽然TTR错误折叠可由蛋白质突变(例如缺失、置换或添加)引起，但野生型TTR蛋白还可能在疾病中错误折叠，暴露特定表位。
术语“药学上可接受的”意指载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂与制剂的其他成分相容，并且对其接受者基本无害。
术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人和其他哺乳动物受试者。
如果受试者具有至少一种已知的风险因素(例如遗传、生物化学、家族史和情境暴露)，则个体处于增加的疾病风险中，与没有所述风险因素的个体相比，使具有所述风险因素的个体处于发展所述疾病统的统计学上显著更大的风险中。
术语“生物样品”是指在生物来源(例如人或哺乳动物受试者)内或可从所述生物来源获得的生物材料样品。此类样品可为器官、细胞器、组织、组织切片、体液、外周血、血浆、血清、细胞、诸如蛋白质和肽的分子以及来源于其的任何部分或组合。术语生物样品还可以涵盖由处理样品而获得的任何材料。获得的材料可以包括细胞或其后代。生物样品的处理可以涉及过滤、蒸馏、提取、浓缩、固定、干扰成分的失活等中的一种或多种。
术语“对照样品”是指已知或疑似不包含单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的甲状腺素运载蛋白(TTR)(诸如呈TTR淀粉样蛋白沉积物)的生物样品。对照样品可从未患有TTR淀粉样变性或特定选择的TTR淀粉样变性类型的个体获得。可替代地，对照样品可自患有TTR淀粉样变性或特定选择的TTR淀粉样变性类型的患者获得。此类样品可与被认为包含TTR淀粉样变性的生物样品在相同的时机时或在不同的时机时获得。生物样品和对照样品均可自相同组织(例如，含有TTR淀粉样蛋白沉积物和周围正常组织的组织切片)获得。优选地，对照样品基本上或完全由不含TTR淀粉样蛋白沉积物的组织组成，并且可用于与被认为包含TTR淀粉样蛋白沉积物的生物样品进行比较。优选地，对照样品中的组织与生物样品中的组织(例如心脏中的心肌细胞)为相同类型。
术语“疾病”是指损害生理功能的任何异常病状。所述术语广泛地用于涵盖生理功能受损的任何病症、疾病、异常、病理、病患、病状或综合征，而与病因性质无关。
术语“症状”是指由受试者感知到的疾病的主观证据，诸如改变的步态。“体征”是指由医师观察到的疾病的客观证据。
出于将氨基酸置换分类为保守性或非保守性的目的，氨基酸分组如下：I组(疏水侧链)：met、ala、val、leu、ile；II组(中性亲水性侧链)：cys、ser、thr；III组(酸性侧链)：asp、glu；IV组(碱性侧链)：asn、gln、his、lys、arg；V组(影响链取向的残基)：gly、pro；以及VI组(芳族侧链)：trp、tyr、phe。保守性置换涉及相同类别氨基酸之间的置换。非保守性置换构成这些类别中的一种的成员与另一种的成员的交换。
序列同一性百分比用通过Kabat编号惯例最大程度上对齐的抗体序列来测定。对齐后，如果将主题抗体区(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区比较，则主题抗体区与参考抗体区之间的序列同一性百分比为被主题抗体区和参考抗体区中相同氨基酸占据的位置数除以两个区的对齐位置的总数(缺口未进行计数)乘以100以转化为百分比。
“包含”或“包括”一个或多个所列举要素的组合物或方法可包括未具体列举的其他要素。例如，“包含(comprise)”或“包含(include)”抗体的组合物可含有单独的抗体或与其他成分组合的抗体。
值范围的指定包括范围内或限定范围的所有整数以及由范围内的整数所限定的所有子范围。
除非从上下文中另外显而易见，否则术语“约”涵盖处于所述值的测量误差(例如SEM)的标准边界内的值。
统计学显著性意指p≤0.05。
除非上下文另外清楚地说明，否则物品的单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
详述
I.总则
本发明提供特异性结合到甲状腺素运载蛋白(TTR)的残基89-97的抗体。所述抗体具有结合到单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的能力。所述抗体可用于治疗或实现预防与TTR积累或TTR沉积物积累相关的疾病或病症(例如，TTR淀粉样变性)。除了其他应用之外，所述抗体还可用于诊断TTR淀粉样变性以及抑制或减少TTR的聚集。
II.靶分子
甲状腺素运载蛋白(TTR)为主要由肝脏合成的127-氨基酸、55kDa的血清和脑脊液运输蛋白。它也一直被称为前白蛋白、甲状腺素结合前白蛋白、ATTR和TBPA。在其天然状态下，TTR作为四聚体存在。在纯合子中，四聚体包含相同的127-氨基酸的富含β折叠的亚基。在杂合子中，TTR四聚体由变体和/或野生型亚基组成，通常以统计学方式组合。
确立的血液中TTR的功能是运输全视黄醇结合蛋白。虽然TTR是啮齿类动物血液中利用与用于全视黄醇结合蛋白的那些结合位点正交的结合位点的甲状腺素(T4)的主要载体，但是T4结合位点在人中未被有效占据。
TTR是至少三十种不同的人蛋白质之一，其细胞外错误折叠和/或组装(淀粉样蛋白生成)成聚集体结构谱被认为引起称为淀粉样蛋白病的退行性疾病。TTR经历构象变化，以便成为淀粉样蛋白生成性的。部分去折叠暴露了伸展构象中大部分不带电的疏水性残基的延伸，有效地错误组装成大部分非结构化的球形聚集体，所述大部分非结构化的球形聚集体最终经历构象转化成交叉β片层淀粉样蛋白结构。
除非从上下文中另外显而易见，否则对甲状腺素运载蛋白(TTR)或其片段或结构域的提及包括天然人氨基酸序列，所述天然人氨基酸序列包括其同工型、突变体和等位基因突变体。示例性TTR多肽序列由登录号P02766.1(UniProt)(SEQ ID NO:31)、AAB35639.1(GenBank)(SEQ ID NO:32)、AAB35640.1(GenBank)(SEQ ID NO:33)和ABI63351.1(GenBank)(SEQ ID NO:34)定名。残基根据Swiss Prot P02766.1来编号，成熟蛋白质(即不包括20个氨基酸信号序列)的第一个氨基酸被定名为残基1。在任何其他TTR蛋白中，残基根据P02766.1中的相应残基在最大对齐上来编号。
III.甲状腺素运载蛋白淀粉样变性
淀粉样变性蛋白(TTR)淀粉样变性是一种全身性病症，其特征在于致病性、错误折叠的TTR和由TTR组成的淀粉样蛋白原纤维的细胞外沉积。TTR淀粉样变性通常由天然TTR四聚体形式的不稳定引起(归因于环境或遗传条件)，导致TTR解离、错误折叠并聚集成淀粉样蛋白原纤维，所述淀粉样蛋白原纤维积累在各种器官和组织中，引起进行性功能障碍。参见，例如，Almeida和Saraiva，FEBS Letters 586:2891-2896(2012)；Ando等.，OrphanetJournal of Rare Diseases 8:31(2013)。
在人中，野生型TTR四聚体以及由突变型和野生型亚基组成的混合四聚体均可解离、错误折叠并聚集，淀粉样蛋白生成的过程导致后有丝分裂组织的退化。因此，TTR淀粉样变性涵盖由起因于TTR突变或起因于非突变的错误折叠的TTR的致病性错误折叠的TTR引起的疾病。
例如，老年全身性淀粉样变性(SSA)和老年心脏淀粉样变性(SCA)是由心脏心肌细胞之外和之内的野生型TTR淀粉样蛋白沉积引起的年龄相关的淀粉样变性类型。TTR淀粉样变性还是由使TTR蛋白不稳定的突变引起的最常见的遗传性(家族性)淀粉样变性形式。与TTR基因的点突变相关的TTR淀粉样变性包括家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)和罕见的中枢神经系统选择性淀粉样变性(CNSA)。遗传性(家族性)TTR淀粉样变性患者几乎总是杂合子，意指TTR四聚体由通常在统计学上分布的突变型和/或野生型TTR亚基组成。TTR淀粉样变性的遗传性(家族性)版本通常是常染色体显性的，并且通常比散发性疾病(SSA和SCA)较早发作。
在编码TTR的基因中有超过100个一直涉及常染色体显性病症FAP和FAC的突变。参见，例如，US 2014/0056904；Saraiva，Hum.Mutat.17(6):493-503(2001)；Damas和Saraiva，J.Struct.Biol.130:290-299；Dwulet和Benson，Biochem.Biophys.Res.Commun.114:657-662(1983)。这些引起淀粉样蛋白的突变分布在整个TTR分子中。通常，突变型亚基对TTR四聚体结构越不稳定，淀粉样蛋白病发作越早。TTR变体的致病潜力通常由其不稳定性及其细胞分泌效率的组合来确定。由一些TTR变体引起的初始病理来自TTR变体对心脏组织的选择性破坏，而来自其他TTR变体的病理来自损害周围和自主神经系统。由TTR淀粉样蛋白生成引起的组织损伤似乎主要来源于小的、可扩散TTR聚集体的毒性，尽管细胞外淀粉样蛋白的积累可能有助于并且几乎必定损害TTR淀粉样变性晚期的器官结构。
TTR淀粉样变性以许多不同形式呈现，在个体和地理位置间具有相当多的表型变异。例如，TTR淀粉样变性可呈现为进行性轴索突感觉自主和运动神经病。TTR淀粉样变性还可呈现为浸润性心肌病。
疾病相关症状的发作年龄在生命的第二个和第九个十年期之间变化，不同人群间的变化很大。TTR淀粉样变性的多系统参与是其诊断的线索。例如，当存在以下中的一种或几种时，考虑TTR淀粉样变性诊断：(1)神经病家族史，特别是与心衰竭相关的家族史；(2)未知病因的神经性疼痛或进行性感觉障碍；(3)无明显原因的腕管综合征，特别是如果它为双侧性的并需要手术释放的情况；(4)未知病因的胃肠运动障碍或自主神经功能障碍(例如，勃起功能障碍、直立性低血压、神经原性膀胱功能障碍(neurogenic gladder))；(5)特征在于在不存在高血压的情况下的心室壁增厚的心脏病；(6)未知来源的晚期房室阻塞，特别是在伴有心脏增厚时；以及(6)具有棉绒(cotton-wool)型的玻璃体内含物。参见，Ando等，Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)。其他症状可包括例如多发性神经病、感觉缺失、疼痛、下肢虚弱、出汗障碍、腹泻、便秘、体重损失和尿失禁/尿潴留。
TTR淀粉样变性的诊断通常依赖于靶器官活检，随后用淀粉样蛋白特异性染料刚果红对所切除组织进行组织学染色。如果观察到淀粉样蛋白的阳性测试，随后进行TTR的免疫组织化学染色以确保造成淀粉样蛋白形成的前体蛋白确实是TTR。对于家族性疾病形式，然后需要证实编码TTR的基因的突变，之后可进行诊断。这可例如通过等电聚焦电泳、聚合酶链式反应或激光解剖/液相色谱串联质谱来实现。参见，例如，US 2014/0056904；Ruberg和Berk，Circulation 126:1286-1300(2012)；Ando等，Orphanet Journal of RareDiseases 8:31(2013)。
IV.抗体
A.结合特异性和功能特性
本发明提供结合到甲状腺素运载蛋白(TTR)蛋白，更具体地结合到TTR的氨基酸残基89-97(SEQ ID NO:35)内的表位的单克隆抗体。此类表位在天然TTR四聚体中掩埋，并且在单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR中暴露。
定名为5A1的抗体为这种示例性小鼠抗体。这种抗体特异性结合在TTR的氨基酸残基89-97(SEQ ID NO:35)内。这种抗体的进一步特征在于其结合到单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR但不结合到天然四聚体形式的TTR的能力。此外，这种抗体的特征在于其对TTR介导的淀粉样变性心脏组织而非对健康心脏组织的免疫反应性。结合到特定蛋白质或其片段的能力可使用实施例中提供的示例性测定形式来证实。
一些抗体与定名为5A1的抗体结合到相同或重叠的表位。5A1的重链和轻链成熟可变区的序列分别被定名为SEQ ID NO:1和9。具有这种结合特异性的其他抗体可通过以下方式来产生：用TTR或其包括所需表位(例如SEQ ID NO:35)的部分免疫小鼠，并筛选所得抗体与单体TTR或包含SEQ ID NO:35的肽的结合，所述肽任选地与具有小鼠5A1(IgG1，κ)的可变区的抗体竞争。包含所需表位的TTR片段可连接到有助于引发对片段的抗体应答的载体和/或与有助于引发这种应答的佐剂组合。可筛选此类抗体相比于特定残基的突变体与野生型单体形式的TTR或其片段(例如，SEQ ID NO:31)的差别结合。针对此类突变体的筛选更精确地定义了结合特异性，以允许鉴定结合被特定残基的诱变抑制并且可能共享其他例证的抗体的功能特性的抗体。所述突变可为用丙氨酸(或丝氨酸，如果丙氨酸已经存在)一次一个残基或更广泛隔开的间隔在整个靶标或其表位已知位于的整个部分中进行的全身性替代置换。如果相同突变组显著降低两种抗体的结合，则两种抗体结合相同的表位。
具有所选鼠抗体(例如5A1)的结合特异性的抗体还可使用噬菌体展示法的变体来产生。参见，Winter，WO 92/20791。此方法特别适于生产人抗体。在此方法中，所选鼠抗体的重链可变区或轻链可变区用作起始材料。如果例如选择轻链可变区作为起始材料，则构建成员显示相同轻链可变区(即，鼠起始材料)和不同重链可变区的噬菌体文库。重链可变区可例如获自重排的人重链可变区的文库。选择对单体TTR或其片段(例如，氨基酸残基89-97)显示强特异性结合(例如，至少108，并且优选为至少109M-1)的噬菌体。来自此噬菌体的重链可变区然后用作用于构建另外噬菌体文库的起始材料。在此文库中，每个噬菌体显示相同的重链可变区(即，由第一显示文库鉴别的区)和不同的轻链可变区。轻链可变区可例如获自重排的人可变轻链区的文库。再次，选择对单体TTR或其片段(例如氨基酸残基89-97)显示强特异性结合的噬菌体。所得抗体通常与鼠起始材料具有相同或相似表位特异性。
其他抗体可通过诱变编码示例性抗体诸如5A1的重链和轻链的cDNA来获得。与5A1的成熟重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同并且维持其功能特性的单克隆抗体，和/或与各个抗体的区别在于少数功能上无关紧要的氨基酸置换(例如，保守性置换)、缺失或插入的单克隆抗体也包括在本发明中。还包括如由常规定义(但优选Kabat)所定义具有至少一个或所有六个CDR的单克隆抗体，所述单克隆抗体与5A1的相应CDR 90％、95％、99％或100％相同。
本发明还提供具有完全或基本上来自5A1的一些或所有(例如，3、4、5和6个)CDR的抗体。此类抗体可包括具有完全或基本上来自5A1的重链可变区的至少两个(且通常为全部三个)CDR的重链可变区，和/或具有完全或基本上来自5A1的轻链可变区的至少两个(且通常为全部三个)CDR的轻链可变区。抗体可包括重链和轻链。当CDR含有不多于4、3、2或1个置换、插入或缺失时，其基本上来自相应的5A1 CDR，不同之处在于CDRH2(当由Kabat定义时)可具有不多于6、5、4、3、2或1个置换、插入或缺失。此类抗体可与5A1的成熟重链可变区和/或轻链可变区的氨基酸序列具有至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性并且维持其功能特性，并且/或者与5A1的区别在于少数功能上无关紧要的氨基酸置换(例如，保守性置换)、缺失或插入。
由此类测定鉴定的一些抗体可结合到单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR，但不结合到如实施例或其他方式所述的天然四聚体形式的TTR。同样，一些抗体对TTR介导的淀粉样变性组织是免疫反应性的，但对健康组织不是免疫反应性的。
一些抗体可在动物模型或临床试验中抑制或减少TTR的聚集、抑制或减少TTR原纤维形成、减少或清除TTR沉积物或聚集的TTR或使TTR的无毒性构象稳定。如动物模型或临床试验所示，一些抗体可治疗、预防或延迟TTR淀粉样变性的发作。用于测试针对TTR淀粉样变性的活性的示例性动物模型包括在Kohno等，Am.J.Path.150(4):1497-1508(1997)；Teng等，Laboratory Investigations 81:385-396(2001)；Wakasugi等，Proc.Japan Acad.63B:344-347(1987)；Shimada等，Mol.Biol.Med.6:333-343(1989)；Nagata等，J.Biochem.117:169-175(1995)；Sousa等，Am.J.Path.161:1935-1948(2002)；以及Santos等，Neurobiologyof Aging 31:280-289(2010)中所述的那些动物模型。
B.非人抗体
针对单体TTR或其片段(例如，氨基酸残基89-97)进行的其他非人抗体(例如鼠、豚鼠、灵长类动物、兔或大鼠)的生产可通过例如用TTR或其片段免疫动物来实现。参见，Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(CSHP NY，1988)(处于所有目的通过引用的方式并入)。这种免疫原可自天然来源、由肽合成或重组表达来获得。任选地，免疫原可与载体蛋白融合或以其他方式复合施用。任选地，免疫原可与佐剂一起施用。几种类型的佐剂可如下所述来使用。对于实验室动物的免疫，优选完全弗氏佐剂，随后为不完全佐剂。兔或豚鼠通常用于制备多克隆抗体。小鼠通常用于制备单克隆抗体。筛选抗体与单体TTR或TTR内的表位(例如，包含氨基酸残基89-97中的一个或多个的表位)的特异性结合。此类筛选可通过确定抗体与单体TTR变体(诸如含有氨基酸残基89-97或这些残基内的突变的TTR变体)的结合以及确定哪些TTR变体结合到抗体来实现。结合可例如通过蛋白质印迹、FACS或ELISA来评估。
C.人源化抗体
人源化抗体是遗传工程化抗体，在所述遗传工程化抗体中来自非人“供体”抗体的CDR被移植到人“受体”抗体序列中(参见，例如，Queen，US 5,530,101和5,585,089；Winter，US 5,225,539；Carter，US 6,407,213；Adair，US 5,859,205；以及Foote，US 6,881,557)。受体抗体序列可为例如成熟人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。因此，人源化抗体为具有完全或基本上来自供体抗体的至少三个、四个、五个或全部CDR以及完全或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个和通常全部三个CDR，以及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个和通常全部三个CDR，以及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在)。不同于纳米抗体和dAb，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当相应残基(如由任何常规定义所定义，但优选由Kabat定义所定义)中的至少85％、90％、95％或100％在各个CDR之间相同时，人源化抗体中的CDR基本上来自非人抗体中的相应CDR。当由任何常规定义所定义但优选由Kabat所定义的相应残基中的至少85％、90％、95％或100％相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。
虽然人源化抗体通常并入来自小鼠抗体的所有六个CDR(优选如由Kabat所定义)，但还可由少于来自小鼠抗体的所有CDR(例如至少3、4或5个CDR)制备(例如，Pascalis等，J.Immunol.169:3076，2002；Vajdos等，J.of Mol.Biol.，320:415-428，2002；Iwahashi等，Mol.Immunol.36:1079-1091，1999；Tamura等，J.Immunol.，164:1432-1441，2000)。
在一些抗体中，仅需要一部分CDR(即结合所需的CDR残基的亚基，称为SDR)来保留人源化抗体中的结合。未接触抗原并且未处于SDR中的CDR残基可基于先前的研究(例如，通常不需要CDR H2中的残基H60-H65)由位于Chothia高变环外的Kabat CDR区(Chothia，J.Mol.Biol.196:901，1987)通过分子模拟和/或凭经验或如Gonzales等，Mol.Immunol.41:863，2004中所述来鉴定。在不存在一个或多个供体CDR残基或省略整个供体CDR的位置处的此类人源化抗体中，占据所述位置的氨基酸可为占据受体抗体序列中相应位置(由Kabat编号)的氨基酸。CDR中供体氨基酸的受体的这种置换数目反映竞争考虑的平衡。此类置换在减少人源化抗体中的小鼠氨基酸的数目以及因此降低潜在免疫原性方面是潜在有利的。然而，置换还可引起亲和力的变化，并且优选避免亲和力的显著降低。CDR和氨基酸内用于置换的置换位置也可凭经验来选择。
人受体抗体序列可任选地选自许多已知的人抗体序列，以在人受体序列可变区框架与供体抗体链的相应可变区框架之间提供高度的序列同一性(例如，65-85％同一性)。
重链的受体序列的实例为人成熟重链可变区AGP01689(SEQ ID NO:3)或其他人重链亚组1。SEQ ID NO:3受体序列包括与小鼠5A1重链具有相同标准形式的两个CDR。轻链受体序列的实例为具有NCBI登录代码BAH04766(SEQ ID NO:11)的人成熟轻链可变区和人κ亚组2的其他轻链可变区。
来自人可变区框架残基的某些氨基酸可基于它们对CDR构象和/或与抗原结合的可能影响来选择以进行置换。此类可能影响的研究是通过建模、特定位置处氨基酸特征的检查或特定氨基酸的置换或诱变的效应的经验观察来进行。
例如，当鼠可变区框架残基与所选人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，当合理预期氨基酸的以下特征时人框架氨基酸可被来自小鼠抗体的等同框架氨基酸置换：
(1)直接非共价结合抗原；
(2)与CDR区相邻或处于由Chothia而非Kabat定义的CDR内；
(3)以其他方式与CDR区(例如，处于CDR区的约6
Figure GDA0002857898730000291
内)相互作用(例如通过对同源已知免疫球蛋白链的解析结构上的轻链或重链进行建模来鉴定)；或
(4)为参与VL-VH界面的残基。
来自如由Queen，US 5,530,101所定义的类别(1)至(3)的框架残基有时被可替代地称为标准残基和微调残基。有助于定义CDR环构象的框架残基有时被称为标准残基(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Thornton和Martin，J.Mol.Biol.263:800-815(1996))。支持抗原结合环构象并在微调抗体与抗原的适合中发挥作用的框架残基有时被称为微调残基(Foote和Winter，J.Mol.Biol 224:487-499(1992))。
作为置换的候选者的其他框架残基为产生潜在糖基化位点的残基。置换的另一些候选者为在所述位置对于人免疫球蛋白不寻常的受体人框架氨基酸。这些氨基酸可被来自小鼠供体抗体的等同位置或更典型的人免疫球蛋白的等同位置的氨基酸置换。
示例性人源化抗体为小鼠5A1抗体的人源化形式。小鼠抗体包含具有分别包含SEQID NO:1和SEQ ID NO:9的氨基酸序列的成熟重链可变区和轻链可变区。本发明提供两个例证的人源化成熟重链可变区：Hu5A1VHv1和Hu5A1VHv2(SEQ ID NO:4和5)。本发明还提供两个例证的人成熟轻链可变区：Hu5A1VLv1和Hu5A1VLv2(SEQ ID NO:12和13)。
图1和2分别示出5A1、小鼠模型抗体、人受体抗体和5A1的人源化抗体版本的重链可变区和轻链可变区的比对。图还示出CDR的位置、标准残基、微调残基和界面残基。小鼠与人受体序列之间标准残基、微调残基或界面残基有所不同的位置为置换的候选者。然而，此处图示出小鼠受体序列与人受体序列之间不同的很少的此类残基。考虑置换重链位置29和93，因为这些位置处的人和小鼠残基不同。位置29处于Chothia CDRH1区内，并且位置93是有助于VH-VL界面的残基。基于占据直链CDR移植物中的这些位置的残基对于人抗体中所述位置是不寻常的，考虑置换轻链位置85(可变区框架内)和55(在CDRL2内)。在位置85处，人受体T残基被小鼠V残基替代。在位置55处，小鼠半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代。丝氨酸不存在于人类受体中，所以这种置换既不是回复突变也不是正向突变。小鼠和人受体残基有所不同的三个其他可变区框架微调位置为H49、H75和L69。这些位置可以任选地回复突变(分别为S49A、K75R和T69A)。
此处，与其他地方一样，第一提及的残基为通过在CDR-H1的情况下将Kabat CDR或复合Chothia Kabat CDR移植到人受体框架中形成的人源化抗体的残基，并且第二提及的残基为考虑用于替代所述残基的残基。因此，在可变区框架内，第一提及的残基为人(T85V、V29F和A93H)，并且在CDR内，第一提及的残基为小鼠(C55S)。
例证的抗体包括例证的成熟重链可变区和轻链可变区的任何排列或组合(例如，VHv1/VLv1或H1L1、VHv1/VLv2或H1L2、VHv2/VLv1或H2L1，和VHv2/VLv2或H2L2)。本发明提供人源化抗体的变体，在所述变体中人源化成熟重链可变区与SEQ ID NO:4或5显示至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且人源化成熟轻链可变区与SEQ ID NO:12或13显示至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些此类抗体中，保留了SEQ IDNO:4、5、12或13中任一个中存在的突变中的至少1、2、3或全部4个。在一些抗体中，VH位置29和93中的一者或两者分别被F和V占据。在一些抗体中，VL位置55和85中的一者或两者分别被S和V占据。此类人源化抗体的CDR区可与5A1小鼠供体抗体的CDR区相同或基本相同。CDR区可由任何常规定义(例如Chothia，或Chothia和Kabat的复合)来定义，但优选如由Kabat所定义。
除非另有说明，否则可变区框架职位符合Kabat编号。其他的此类变体与例证的Hu5A1重链和轻链的序列的区别通常在于少数(例如，通常不多于1、2、3、5、10或15个)替代、缺失或插入。此类差异通常处于框架中，但还可能发生在CDR中。
人源化5A1变体中另外变异的可能性是可变区框架中的另外回复突变。许多不与人源化mAb中的CDR接触的框架残基可适应来自供体小鼠mAb或其他小鼠或人抗体的相应位置的氨基酸置换，并且甚至许多潜在CDR接触残基也可适于置换。即使CDR内的氨基酸也可例如用在用于供应可变区框架的人受体序列的相应位置处发现的残基来改变。此外，替代性人受体序列可用于例如重链和/或轻链。如果使用不同的受体序列，则可能不会进行以上推荐的一个或多个回复突变，因为相应供体和受体残基在没有回复突变的情况下已经相同。
优选地，Hu5A1变体(无论是否保守)中的替代或回复突变对人源化mAb的结合亲和力或效价没有显著影响，所述人源化mAb的结合亲和力或效价即其结合到单体TTR的能力(例如，变体人源化5A1抗体的本实例中描述的一些或所有测定中的效价与鼠5A1的效价基本相同，即在实验误差内)。
D.嵌合抗体和贴面化抗体
本发明还提供嵌合形式和贴面化形式的非人抗体，特别是实施例的5A1抗体。
嵌合抗体为非人抗体(例如小鼠)的轻链和重链的成熟可变区与人轻链和重链恒定区组合的抗体。此类抗体基本上或完全保留小鼠抗体的结合特异性，并且为约三分之二的人序列。
贴面化抗体是一种类型的人源化抗体，其保留非人抗体的一些且通常所有CDR以及一些非人可变区框架残基，但以来自人抗体序列的相应位置的残基替代可能有助于B细胞或T细胞表位的其他可变区框架残基，例如暴露的残基(Padlan，Mol.Immunol.28:489，1991)。结果是CDR完全或基本上来自非人抗体并且通过置换使非人抗体的可变区框架变得更人样的抗体。在本发明中包括贴面化形式的5A1抗体。
E.人抗体
针对单体TTR或其片段的人抗体(例如，TTR的氨基酸残基89-97(SEQ ID NO:35))通过以下描述的各种技术来提供。一些人抗体通过竞争性结合实验、通过以上Winter的噬菌体展示法或以其他方式来选择，以与特定小鼠抗体(诸如实例中描述的小鼠单克隆抗体中的一种)具有相同的表位特异性。还可通过仅使用TTR的片段(诸如仅含有TTR的氨基酸残基89-97的TTR变体)作为靶抗原和/或通过筛选针对TTR变体(诸如含有TTR的氨基酸残基89-97内的各种突变的TTR变体)的集合的抗体来筛选人抗体的特定表位特异性。
用于产生人抗体的方法包括：Oestberg等，Hybridoma 2:361-367(1983)；Oestberg,美国专利号4,634,664；以及Engleman等,美国专利4,634,666中的三源杂交瘤法、包含人免疫球蛋白基因的转基因小鼠的用途(参见，例如，Lonberg等，WO93/12227(1993)；US 5,877,397；US 5,874,299；US 5,814,318；US 5,789,650；US 5,770,429；US 5,661,016；US 5,633,425；US 5,625,126；US 5,569,825；US 5,545,806；Neuberger，Nat.Biotechnol.14:826(1996)；以及Kucherlapati，WO 91/10741(1991))以及噬菌体展示法(参见，例如，Dower等，WO 91/17271；McCafferty等，WO 92/01047；US 5,877,218；US 5,871,907；US 5,858,657；US 5,837,242；US 5,733,743；以及US 5,565,332)。
F.恒定区的选择
嵌合抗体、贴面化抗体或人源化抗体的重链可变区和轻链可变区可连接到人恒定区的至少一部分。恒定区的选择部分取决于是否需要抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用和/或补体依赖性细胞毒性。例如，人同位素IgG1和IgG3具有补体依赖性细胞毒性，并且人同种型IgG2和IgG4不具有。与人IgG2和IgG4相比，人IgG1和IgG3还诱导更强的细胞介导的效应物功能。轻链恒定区可为λ或κ。
轻链和/或重链的氨基端或羧基端处的一个或几个氨基酸(诸如重链的C端赖氨酸)可能在一定比例或全部分子中丢失或衍生。置换可在恒定区中进行以减少或增加效应物功能，诸如补体介导的细胞毒性或ADCC(参见，例如，Winter等,美国专利号5,624,821；Tso等,美国专利号5,834,597；以及Lazar等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:4005，2006)，或者在人中延长半衰期(参见，例如，Hinton等，J.Biol.Chem.279:6213，2004)。示例性置换包括位置250处的Gln和/或位置428处的Leu(EU编号在本段中用于恒定区)以增加抗体半衰期。位置234、235、236和/或237中的任一个或所有处的置换降低对Fcγ受体，特别是FcγRI受体的亲和力(参见，例如，US 6,624,821)。人IgG1的位置234、235和237处的丙氨酸置换可用于减少效应物功能。一些抗体具有人IgG1的位置234、235和237处的丙氨酸置换，以减少效应物功能。任选地，人IgG2中位置234、236和/或237被丙氨酸置换，并且位置235被谷氨酰胺置换(参见，例如，US 5,624,821)。在一些抗体中，使用通过EU编号的人IgG1的位置241、264、265、270、296、297、322、329和331中的一个或多个处的突变。在一些抗体中，使用通过EU编号的人IgG1的位置318、320和322中的一个或多个处的突变。在一些抗体中，位置234和/或235被丙氨酸置换，并且/或者位置329被甘氨酸置换。在一些抗体中，诸如在SEQ IDNO:24中，位置234和235被丙氨酸置换。在一些抗体中，同种型为人IgG2或IgG4。
示例性人轻链κ恒定区具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列。SEQ ID NO:25的N端精氨酸可被省略，在所述情况下，轻链κ恒定区具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列。示例性人IgG1重链恒定区具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列(具有或没有C端赖氨酸)。抗体可表达为含有两条轻链和两条重链的四聚体、单独重链、轻链，Fab、Fab'、F(ab')2和Fv或单链抗体，在所述单链抗体中重链和轻链成熟可变结构域通过间隔区来连接。
人恒定区在不同个体之间显示出同种异型变异和同族同种异型变异(isoallotypic variation)，即恒定区可在不同个体中在一个或多个多态位置处不同。同族同种异型(Isoallotype)与同种异型的区别在于识别同族同种异型的血清结合到一个或多个其他同种型的非多态性区。因此，例如，另一个重链恒定区具有IgG1 G1m3同种异型，并且具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列。IgG1 G1m3同种异型的另一个重链恒定区具有SEQ IDNO:24的氨基酸序列(具有或没有C端赖氨酸)。对人恒定区的引用包括具有任何天然同种异型或占据天然同种异型中位置的残基的任何排列的恒定区。
G.重组抗体的表达
已知用于使用抗体表达细胞系(例如杂交瘤)产生嵌合抗体和人源化抗体的许多方法。例如，抗体的免疫球蛋白可变区可使用熟知方法来克隆和测序。在一种方法中，重链可变VH区通过RT-PCR使用由杂交瘤细胞制备的mRNA来克隆。共有引物用于涵盖翻译起始密码子的VH区前导肽作为5'引物和g2b恒定区特异性3'引物。示例性引物在Schenk等的美国专利公布US 2005/0009150(下文中的“Schenk”)中有所描述。可比较来自多个独立来源的克隆的序列，以确保未在扩增过程中引入变化。VH区的序列还可通过对通过5'RACE RT-PCR方法和3'g2b特异性引物获得的VH片段进行测序来测定或确认。
轻链可变VL区可以类似方式克隆。在一种方法中，共有引物组使用设计来与涵盖翻译起始密码子的VL区杂交的5’引物和对V-J连接区下游的Ck区特异性的3'引物来设计用于扩增VL区。在第二种方法中，5'RACE RT-PCR方法用于克隆编码VL的cDNA。示例性引物在Schenk中有所描述，同上。克隆的序列然后与编码人(或其他非人物种)恒定区的序列组合。编码人恒定区的示例性序列包括：SEQ ID NO:39，所述SEQ ID NO:39编码人IgG1恒定区；以及SEQ ID NO:40和41，所述SEQ ID NO:40和41编码人κ轻链恒定区。
在一种方法中，重链和轻链可变区被重新工程化以编码各个VDJ或VJ接点下游的剪接供体序列，并且被克隆到哺乳动物表达载体(诸如用于重链的pCMV-hγ1和用于轻链的pCMV-Mcl)中。这些载体将人γ1和Ck恒定区编码为插入的可变区盒下游的外显子片段。在序列验证之后，重链和轻链表达载体可共转染到CHO细胞中以产生嵌合抗体。条件培养基在转染后48小时收集，并通过蛋白质印迹分析来测定抗体产生或通过ELISA来测定抗原结合。嵌合抗体如上所述来进行人源化。
嵌合抗体、贴面化抗体、人源化抗体和人抗体通常通过重组表达来产生。重组多核苷酸构建体通常包括可操作地连接到抗体链的编码序列的表达控制序列，包括天然相关表达控制元件或异源表达控制元件，诸如启动子。表达控制序列可为能够转化或转染真核或原核宿主细胞的载体中的启动子系统。一旦已经将载体并入适当宿主中，就将宿主保持在适于核苷酸序列的高水平表达以及交叉反应抗体的收集和纯化的条件下。
这些表达载体通常可在宿主有机体中作为游离基因体或宿主染色体DNA的整体部分复制。通常，表达载体含有选择标记(例如氨苄青霉素抗性或潮霉素抗性)以允许检测用所需DNA序列转化的那些细胞。
大肠杆菌(E.coli)是一种用于表达抗体，特别是抗体片段的原核宿主。微生物诸如酵母也可用于表达。酵母菌属(Saccharomyces)是具有合适载体的酵母宿主，所述合适载体根据需要具有表达控制序列、复制起点、终止序列等。典型启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他解糖酶。在其他事项中，可诱导酵母启动子包括来自乙醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
哺乳动物细胞可用于表达编码免疫球蛋白或其片段的核苷酸区段。参见，Winnacker，From Genes to Clones，(VCH Publishers，NY，1987)。许多能够分泌完整异源蛋白质的合适的宿主细胞系已有所开发，并且包括CHO细胞系、各种COS细胞系、HeLa细胞、HEK293细胞、L细胞和非抗体产生骨髓瘤，包括Sp2/0和NS0。细胞可能是非人的。用于这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，诸如复制起点、启动子、增强子(Queen等，Immunol.Rev.89:49(1986))以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。表达控制序列可包括来源于内源基因、巨细胞病毒、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒等的启动子。参见，Co等，J.Immunol.148:1149(1992)。
可替代地，抗体编码序列可并入转基因中以引入转基因动物的基因组中，随后在转基因动物的乳汁中表达(参见，例如，美国专利号5,741,957；美国专利号5,304,489；以及美国专利号5,849,992)。合适的转基因包括与来自乳腺特异性基因诸如酪蛋白或β乳球蛋白的启动子和增强子可操作地连接的轻链和/或重链编码序列。
含有目标DNA区段的载体可通过取决于细胞宿主类型的方法来转移到宿主细胞中。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、基因枪或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了产生转基因动物，转基因可被显微注射到受精的卵母细胞中，或者可并入胚胎干细胞的基因组中，并且此类细胞的核被转移到去核卵母细胞中。
使编码抗体重链和轻链的载体引入细胞培养物中，可以筛选细胞库在无血清培养基中的生长生产率和产物质量。然后可使最高生产的细胞库进行基于FACS的单细胞克隆以产生单克隆系。可使用对应于大于7.5g/L培养物的产物滴度的高于50pg或100pg/细胞/天的特定生产率。还可测试由单细胞克隆产生的抗体的浊度、过滤特性、PAGE、IEF、UV扫描、HP-SEC、碳水化合物-寡糖作图、质谱和结合测定，诸如ELISA或Biacore。所选克隆然后可在多个小瓶中入库并冷冻储存，以便进行随后的使用。
一旦表达，抗体可根据本领域的标准程序纯化，所述标准程序包括蛋白A捕获、HPLC纯化、柱色谱、凝胶电泳等(通常参见，Scopes，Protein Purification(Springer-Verlag，NY，1982))。
可使用用于抗体的商业生产的方法，包括密码子优化、启动子的选择、转录元件的选择、终止子的选择、无血清单细胞克隆、细胞库、用于扩增拷贝数的选择标记的使用、CHO终止子或蛋白质滴度的改善(参见，例如，US 5,786,464；US 6,114,148；US 6,063,598；US7,569,339；W02004/050884；W02008/012142；W02008/012142；W02005/019442；W02008/107388；W02009/027471；以及US 5,888,809)。
H.抗体筛选测定
抗体可进行数个筛选，包括结合测定、功能筛选、具有与TTR沉积相关的疾病的动物模型中的筛选以及临床试验。结合测定测试特异性结合以及任选地对单体TTR或其片段的亲和力和表位特异性。例如，结合测定可筛选结合到TTR的氨基酸残基89-97(SEQ ID NO:35)的抗体，所述氨基酸残基89-97是在天然TTR四聚体中掩埋并在单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR中暴露的表位。还可筛选抗体结合TTR的前原纤维的非天然构象和TTR淀粉样蛋白原纤维而非天然TTR构象的能力。例如，可筛选抗体结合到由天然四聚体TTR解离或解聚产生的单体形式的TTR的能力，并且可如实例中所述或以其他方式针对天然四聚体TTR对抗体进行反筛选。同样，还可筛选抗体对TTR介导的淀粉样变性组织而非健康组织的免疫反应性。此类筛选有时与示例性抗体相竞争地加以进行，所述示例性抗体诸如具有5A1的可变区的抗体或IgG1κ同种型。任选地，在所述测定中，将抗体或TTR靶固定化。
功能测定可在细胞模型中进行，所述细胞模型包括天然表达TTR或用编码TTR或其片段的DNA转染的细胞。合适的细胞包括来源于受TTR淀粉样蛋白生成影响的心脏组织或其他组织的细胞。可筛选细胞的单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的降低的水平(例如，通过对细胞提取物或上清液进行的蛋白质印迹或免疫沉淀)或归因于单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的降低的毒性。例如，可测试抗体抑制或减少TTR聚集、抑制或减少TTR原纤维形成、减少TTR沉积物、清除聚集的TTR或使TTR的无毒性构象稳定的能力。
其他功能测定可在溶液中进行，诸如当溶液中的单体TTR或错误折叠的TTR中间体与抗体接触时，测试抗体是否能够破坏或减少TTR原纤维形成。原纤维形成的程度可通过浊度测量例如在配备有温度控制单元的UV可见分光光度计上在400nm处来探测。硫磺素-T也可用于评估淀粉样蛋白原纤维形成的程度。例如，将5倍摩尔过量的硫磺素-T加入TTR样品中，并在室温下放置30分钟，之后进行测量。硫磺素-T荧光可使用分光荧光计来监测。参见，US 2014/0056904。
动物模型筛选测试抗体治疗性地或预防性地治疗模拟与TTR或TTR沉积物积累相关的人疾病的动物模型的体征或症状的能力。此类疾病包括TTR淀粉样变性类型，诸如老年全身性淀粉样变性(SSA)、老年心脏淀粉样变性(SCA)、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)、家族性淀粉样心肌病(FAC)和中枢神经系统选择性淀粉样变性(CNSA)。可监测的合适体征或症状包括淀粉样沉积物在各种组织诸如胃肠道或心脏中的存在和程度。淀粉样蛋白沉积物的减少程度可通过与适当对照比较来确定，所述适当对照诸如已经接受对照抗体(例如，同种型匹配的对照抗体)、安慰剂或完全未接受治疗的对照动物中TTR淀粉样蛋白沉积物的水平。用于测试针对TTR淀粉样变性的活性的示例性动物模型为在内源性小鼠Ttr基因座处携带无效突变以及携带包含与家族性淀粉样变性多发性神经病相关的V30M突变的人突变体TTR基因的小鼠模型。参见，例如，Kohno等，Am.J.Path.150(4):1497-1508(1997)；Cardoso和Saraiva，FASEB J 20(2):234-239(2006)。还存在类似模型，包括其他的家族性TTR淀粉样变性版本的模型和散发性TTR淀粉样变性版本的模型。参见，例如，Teng等，Lab.Invest.81(3):385-396(2001)；Recent Advances in Transthyretin Evolution，Structure，and Biological Functions,第261-280页(2009)中Ito和Maeda，Mouse Modelsof Transthyretin Amyloidosis(Springer Berlin Heidelberg)。转基因动物可包括人TTR转基因，诸如具有与TTR淀粉样变性相关的突变的TTR转基因或野生型TTR转基因。为了便于在动物模型中进行测试，可使用具有适于动物模型的恒定区的嵌合抗体(例如，小鼠-大鼠嵌合体可用于测试大鼠中的抗体)。可得出结论，如果相应小鼠抗体或嵌合抗体在适当动物模型中有效并且人源化抗体具有相似结合亲和力(例如，在实验误差内，诸如乘1.5、2或3的系数)，则人源化版本的抗体将是有效的。
临床试验测试在患有与TTR淀粉样变性相关的疾病的人中的安全性和功效。
I.核酸
本发明还提供编码以上所述重链和轻链中的任一个的核酸(例如，SEQ ID NO:4、5、12和13)。任选地，此类核酸还编码信号肽，并且可与连接到恒定区的信号肽(例如，具有可分别由SEQ ID NO:43(重链)以及分别由45(轻链)编码的SEQ ID NO:42(重链)和44(轻链)的氨基酸序列的信号肽)一起表达。核酸的编码序列可与调控序列可操作地连接以确保编码序列的表达，所述调控序列诸如启动子、增强子、核糖体结合位点、转录终止信号等。编码重链和轻链的核酸可以分离形式存在或可克隆到一个或多个载体中。核酸可以通过例如重叠寡核苷酸的固相合成或PCR来合成。编码重链和轻链的核酸可例如在表达载体内连接成一个连续的核酸，或者可为单独的，例如各自克隆到其自身表达载体中。
J.缀合抗体
特异性结合到在致病性形式的TTR中暴露但不在天然四聚体形式的TTR中暴露的抗原(诸如TTR的氨基酸残基89-97(SEQ ID NO:35))的缀合抗体可用于检测单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在；监测和评估用于治疗诊断为TTR淀粉样变性的患者的治疗剂的功效；抑制或减少TTR聚集；抑制或减少TTR原纤维形成；减少或清除TTR沉积物；使TTR的无毒性构象稳定；或治疗或实现预防患者的TTR淀粉样变性。例如，此类抗体可与其他治疗部分、其他蛋白质、其他抗体和/或可检测标签缀合。参见，WO 03/057838；US 8,455,622。
缀合的治疗部分可为可用于治疗、防治、减轻、预防或改善患者中的不良病状或疾病(诸如TTR淀粉样变性)的任何药剂。治疗部分可以包括例如免疫调节剂或促进或增强抗体活性的任何生物活性剂。免疫调节剂可为刺激或抑制免疫应答的发展或维持的任何药剂。如果此类治疗部分偶联到对单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR具有特异性的抗体，诸如本文所述的抗体，则偶联的治疗部分将优于对天然四聚体形式的TTR而对非天然、致病形式的TTR具有特异性亲和力。因此，缀合抗体的施用直接靶向包含致病形式的TTR的组织，而对周围正常的健康组织具有最小损伤。这对于毒性太大而不能自身施用的治疗部分特别有用。此外，可使用较少量的治疗部分。
合适的治疗部分的实例包括降低TTR水平、使TTR的天然四聚体结构稳定、抑制TTR聚集、破坏TTR原纤维或淀粉样蛋白形成或中和细胞毒性的药物。参见，例如，Almeida和Saraiva，FEBS Letters 586:2891-2896(2012)；Saraiva，FEBS Letters 498:201-203(2001)；Ando等，Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)；Ruberg和Berk，Circulation 126:1286-1300(2012)；以及Johnson等，J.Mol.Biol.421(2-3):185-203(2012)。例如，抗体可缀合到抗体可缀合到他发米帝司(tafamidis)、二氟尼柳(diflunisal)、ALN-TTR01、ALNTTR02、ISIS-TTRRx、多西环素(doxycycline)(doxy)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、Doxy-TUDCA、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、姜黄素或白藜芦醇(3,5,4’-三羟基芪)。其他代表性治疗部分包括已知可用于治疗、管理或减轻TTR淀粉样变性或TTR淀粉样变性症状的其他药剂。参见，例如，Ando等，Orphanet Journal of RareDiseases 8:31(2013)的TTR淀粉样变性的常见临床症状和用于治疗这些症状的典型药剂。
抗体还可与其他蛋白质偶联。例如，抗体可与Fynomer偶联。Fynomer是来源于人Fyn SH3结构域的小结合蛋白(例如，7kDa)。它们可为稳定和可溶的，并且它们可缺乏半胱氨酸残基和二硫键。Fynomer可经工程化以结合到与抗体具有相同亲和力和特异性的靶分子。它们适于产生基于抗体的多特异性融合蛋白。例如，Fynomer可与抗体的N端和/或C端融合以产生具有不同构造的双特异性和三特异性FynomAb。Fynomer可使用Fynomer文库通过筛选技术使用FACS、Biacore和基于细胞的测定来选择，所述筛选技术允许有效选择具有最佳特性的Fynomer。Fynomer的实例在Grabulovski等，J.Biol.Chem.282:3196-3204(2007)；Bertschinger等，Protein Eng.Des.Sel.20:57-68(2007)；Schlatter等，MAbs.4:497-508(2011)；Banner等，Acta.Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.69(Pt6):1124-1137(2013)；以及Brack等，Mol.Cancer Ther.13:2030-2039(2014)中有所公开。
本文公开的抗体还可偶联或缀合到一种或多种其他抗体(例如，以形成抗体异源缀合物)。此类其他抗体可结合到TTR或其部分内的不同表位或者可结合到不同靶抗原。
抗体还可与可检测标签偶联。此类抗体可用于例如诊断TTR淀粉样变性、监测TTR淀粉样变性的进展和/或评估治疗的功效。此类抗体特别可用于在患有或易感TTR淀粉样变性的受试者中或在自此类受试者获得的适当生物样品中进行此类测定。可偶联或连接到人源化5A1抗体的代表性可检测标签包括各种酶，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，诸如链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光材料，诸如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料，诸如鲁米诺；生物发光材料，诸如荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；放射性材料，诸如钇90(90Y)、放射性银-111、放射性银-199、铋213、碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(5S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；使用各种正电子发射断层摄影术的正电子发射金属；非放射性顺磁性金属离子；以及经放射性标记或缀合到特定放射性同位素的分子。
放射性同位素与抗体的键联可用常规双功能螯合物进行。对于放射性银-111和放射性银-199键联，可使用基于硫的接头。参见，Hazra等，Cell Biophys.24-25:1-7(1994)。银放射性同位素的键联可能涉及用抗坏血酸还原免疫球蛋白。对于放射性同位素，诸如111In和90Y，可使用替伊莫单抗，并且替伊莫单抗将与此类同位素反应，以分别形成111In-替伊莫单抗和90Y-替伊莫单抗。参见，Witzig，Cancer Chemother.Pharmacol.,第48增刊1:S91-S95(2001)。
治疗部分、其他蛋白质、其他抗体和/或可检测标签可使用本领域已知的技术直接地或通过中间体(例如接头)间接地偶联或缀合到鼠5A1抗体、嵌合5A1抗体、贴面化5A1抗体或人源化5A1抗体。参见，例如，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等(编),第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)中的Arnon等，"Monoclonal Antibodies ForImmunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,"；Controlled Drug Delivery(第2版)，Robinson等(编),第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)中的Hellstrom等，"AntibodiesFor Drug Delivery,"；Monoclonal Antibodies 84:Biological And ClinicalApplications，Pinchera等(编),第475-506页(1985)中的Thorpe，"Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review,"；Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy，Baldwin等(编),第303-16页(Academic Press 1985)中的"Analysis，Results，And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy,"；以及Thorpe等，Immunol.Rev.，62:119-58(1982)。合适的接头包括例如可切割接头和不可切割接头。可采用在酸性或还原条件下在暴露于特定蛋白酶时或在其他限定条件下释放偶联的治疗部分、蛋白质、抗体和/或可检测标签的不同接头。
V.治疗应用
以上抗体可用于治疗或实现预防患有至少部分由甲状腺素运载蛋白(TTR)介导并且特别是由单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR介导的疾病或处于所述疾病的风险中的患者的疾病。虽然实践不需要对机制的理解，但是据信以下机制中的任一种或全部可能有助于使用以上抗体治疗TTR淀粉样变性：抗体介导的TTR聚集和原纤维形成的抑制、抗体介导的TTR的无毒性构象(例如，四聚体形式)的稳定或抗体介导的聚集TTR、寡聚TTR或单体TTR的清除。抗体-药物缀合物可具有由缀合部分确定的另外作用机制。
抗体以有效方案施用，所述有效方案意指延迟发作、降低严重性、抑制进一步恶化和/或减轻所治疗的病症的至少一种体征或症状的剂量、施用途径和施用频率。如果患者已经患有病症，则所述方案可被称为治疗有效方案。如果相对于一般群体，患者处于升高的病症风险中但尚未经历症状，则所述方案可被称为预防有效方案。在一些情况下，相对于历史对照或相同患者的过去经验，可在单独患者中观察到治疗功效或预防功效。在其他情况下，相对于未治疗的患者的对照群体，可在治疗患者群体中在临床前或临床试验中证实治疗功效或预防功效。
施用频率取决于抗体在循环中的半衰期、患者病状和施用途径以及其他因素。响应于患者病状的变化或所治疗病症的进展，频率可为每日一次、每周一次、每月一次、每季度一次或按不规则的时间间隔。静脉内施用的示例性频率在连续疗程内处于每周一次与每季度一次之间，尽管或多或少的频繁给药也是可能的。对于皮下施用，示例性给药频率为每日至每月，尽管或多或少的频繁给药也是可能的。
施用的剂量数目取决于病症是急性还是慢性疾病以及病症对治疗的应答。对于急性病症或慢性病症的急性加重，1与10个之间的剂量通常是足够的。有时，任选地呈分开形式的单次推注剂量足以用于急性病症或慢性病症的急性加重。对于急性病症或急性加重的复发，可将治疗重复。对于慢性病症，抗体可以规律间隔(例如每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次、每六个月一次)施用，持续至少1、5或10年或患者的终生。
VI.药物组合物和使用方法
本文提供几种诊断、监测、治疗或实现预防至少部分由甲状腺素运载蛋白(TTR)介导并且特别是由单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR(例如，TTR淀粉样变性)介导的疾病或病状的方法。此类疾病的实例包括家族性TTR淀粉样变性，诸如家族性淀粉样心肌病(FAC)、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)或中枢神经系统选择性淀粉样变性(CNSA)以及散发性TTR淀粉样变性，诸如老年全身性淀粉样变性(SSA)或老年心脏淀粉样变性(SCA)。上述抗体可并入用于此类方法的药物组合物中。通常，向有需要的受试者施用抗体或含有抗体的药物组合物。适于治疗的患者包括处于TTR淀粉样变性的风险中但未显示出症状的个体，以及目前显示出症状的患者。一些患者可在TTR淀粉样变性的前驱阶段治疗。
可向具有有已知TTR淀粉样变性遗传风险的个体预防性地施用药物组合物。此类个体包括具有已经受这种疾病的亲属的那些个体以及由遗传或生物化学标记(例如，与TTR淀粉样变性相关的TTR突变)的分析确定风险的那些个体，所述分析包括使用本文所提供的诊断方法。例如，在编码TTR的基因中有超过100个一直涉及TTR淀粉样变性的突变。参见，例如，US 2014/0056904；Saraiva，Hum.Mutat.17(6):493-503(2001)；Damas和Saraiva，J.Struct.Biol.130:290-299；Dwulet和Benson，Biochem.Biophys.Res.Commun.114:657-662(1983)。
患有TTR淀粉样变性的个体有时可从TTR淀粉样变性的临床表现中识别，所述临床表现包括以下中的一种或多种：(1)神经病家族史，特别是与心衰竭相关的家族史；(2)未知病因的神经性疼痛或进行性感觉障碍；(3)无明显原因的腕管综合征，特别是如果它为双侧性的并需要手术释放的情况；(4)未知病因的胃肠运动障碍或自主神经功能障碍(例如，勃起功能障碍、直立性低血压、神经原性膀胱功能障碍)；(5)特征在于在不存在高血压的情况下的心室壁增厚的心脏病；(6)未知来源的晚期房室阻塞，特别是在伴有心脏增厚时；以及(6)具有棉绒型的玻璃体内含物。参见，Ando等，Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)。然而，TTR淀粉样变性的明确诊断通常依赖于靶器官活检，随后用淀粉样蛋白特异性染料刚果红对所切除组织进行组织学染色。如果观察到淀粉样蛋白的阳性测试，随后进行TTR的免疫组织化学染色以确保造成淀粉样蛋白形成的前体蛋白确实是TTR。对于家族性疾病形式，然后需要证实编码TTR的基因的突变，之后可进行明确诊断。
受试者的鉴定可发生在临床环境或其他地方中，诸如例如通过受试者自己使用自我测试试剂盒来发生在所述受试者的家中。例如，可基于诸如周围神经病(感觉和运动)、自主神经病、胃肠损伤、心肌病、肾病或眼部沉积的各种症状来鉴定受试者。参见，Ando等，Orphanet Journal of Rare Diseases 8:31(2013)。如实例中所公开，还可通过与对照样品相比来自受试者的血浆样品中非天然形式的TTR的水平的增加来鉴定受试者。
如TTR淀粉样变性的家族史、遗传测试或医疗筛选所保证，治疗可在任何年龄(例如20、30、40、50、60或70岁)时开始。治疗通常在一段时间内需要多个剂量，并且可通过测定抗体或活化T细胞或B细胞随时间推移对治疗剂(例如，包含氨基酸残基89-97的截短形式的TTR)的应答来监测。如果应答下降，则指示加强剂量。
在预防应用中，以有效降低风险、减轻严重性或延迟疾病(例如，TTR淀粉样变性)的至少一种体征或症状发作的方案(施用的剂量、频率和途径)向易感所述疾病或以其他方式处于所述疾病风险中的受试者施用抗体或其药物组合物。在治疗应用中，以有效减轻或至少抑制疾病(例如，TTR淀粉样变性)的至少一种体征或症状进一步恶化的方案(施用的剂量、频率和途径)向疑似或已经患有所述疾病的受试者施用抗体或诱导抗体的免疫原。
如果与未由本文公开的方法治疗的可比较受试者的对照群体中的平均结果相比，单独治疗的受试者取得更有利结果，或者如果与对照临床试验(例如，II期、II/III期或III期试验)中的对照受试者或处于p<0.05或0.01或甚至0.001水平下的动物模型相比，在所治疗受试者中证实了方案的更有利结果，则所述方案被认为是治疗或预防有效的。
抗体的有效方案可用于例如抑制或减少患有与TTR积累相关的病状或处于所述病状的风险中的受试者中的TTR聚集；抑制或减少患有与TTR积累相关的病状或处于所述病状的风险中的受试者中的TTR原纤维形成；抑制或减少患有与TTR积累相关的病状或处于所述病状的风险中的受试者中的TTR沉积物或聚集的TTR；使患有与TTR积累相关的病状或处于所述病状的风险中的受试者中的TTR的无毒性构象稳定；抑制患有与TTR积累相关的病状或处于所述病状的风险中的受试者中TTR聚集体、原纤维或沉积物的毒性作用；诊断疑似包含淀粉样蛋白积累的组织中TTR淀粉样蛋白积累的存在或不存在；通过检测施用抗体后的受试者中结合抗体的存在来确定受试者中TTR沉积物的水平；检测受试者中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在；监测和评估用于治疗诊断为TTR淀粉样变性的患者的治疗剂的功效；在受试者种诱导包含TTR的抗体的免疫应答；延迟与受试者中TTR淀粉样蛋白积累相关的病状的发作；或治疗或实现预防患者的TTR淀粉样变性。
有效剂量根据许多不同因素而变化，所述许多不同因素诸如施用手段、靶位点、受试者的生理状态、受试者是人还是动物、所施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。
抗体的示例性剂量范围可为约0.1-20或0.5-5mg/kg体重(例如，0.5、1、2、3、4或5mg/kg)或作为固定剂量的10-1500mg。剂量取决于患者的病状和对先前治疗的应答(如果有的话)、治疗是预防性还是治疗性的以及病症是急性还是慢性的，以及其他因素。
抗体可每日一次、在交替数天时、每周一次、每两周一次、每月一次、每季度一次或根据由经验分析确定的任何其他时程来以所述剂量施用。示例性治疗需要以多剂量经过例如至少6个月的延长时期来施用。另外的示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。
抗体可通过外周途径来施用。施用途径包括局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、鞘内、腹膜内、鼻内或肌内。抗体的施用途径可为静脉内或皮下。静脉内施用可例如通过输注在诸如30-90分钟的时期内进行。这种类型的注射最通常在手臂或腿部肌肉中进行。在一些方法中，将药剂直接注射到已积累沉积物的特定组织中，例如颅内注射。
用于胃肠外施用的药物组合物可为无菌且基本上等渗的(250-350mOsm/kg水)，并且在GMP条件下制备。药物组合物可以单位剂型(即，单次施用的剂量)提供。药物组合物可使用一种或多种生理上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或辅助剂来配制。制剂取决于所选的施用途径。对于注射，抗体可在水溶液中配制，例如在生理学上相容的缓冲液例如汉克斯氏溶液、林格氏溶液或生理盐水或乙酸盐缓冲液中配制(以减少注射部位处的不适)。所述溶液可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，抗体可以冻干形式用于在使用之前用适合的媒介物(例如，无菌的无热原水)复原。
所述方案可与有效治疗或预防所治疗疾病的另一种药剂组合施用。此类药剂可包括抑制TTR表达的siRNA或Vyndaqel，其为TTR在四聚体形成中的稳定剂。
治疗后，可评估受试者的病状以确定所述治疗的进展或功效。此类方法优选测试TTR淀粉样蛋白水平的变化或非天然形式TTR的水平。例如，可评估TTR淀粉样蛋白水平以确定在治疗之前在可比较的情况下相对于受试者的TTR淀粉样蛋白水平的改善。受试者的TTR淀粉样蛋白水平还可在可比较的情况下与对照群体进行比较。对照群体可为类似受折磨、未治疗的受试者或正常未治疗的受试者(以及其他对照受试者)。相对于接近或达到未治疗的正常受试者中水平的类似受折磨、未治疗的受试者或水平的改善指示对治疗的阳性应答。
TTR淀粉样蛋白水平可通过许多方法测量，所述许多方法包括成像技术。合适的成像技术的实例包括用放射性标记的TTR或其片段、TTR抗体或其片段、基于刚果红的淀粉样蛋白成像剂例如像PIB(US 2011/0008255)、淀粉样蛋白成像肽p31(淀粉样蛋白成像肽p31的生物分布与基于刚果红组织染色的淀粉样蛋白定量相关，Wall等,文摘号1573，2011ISNM年会)以及其他PET标签进行的PET扫描。非天然形式的TTR的水平可例如通过以下方式来测量：用本文公开的抗体对来自受试者的血浆样品或活检样品进行进行SDS-PAGE/蛋白质印迹或Meso Scale Discovery板测定，并且如实例中所述测量与对照样品进行比较。
A.诊断方法和监测方法
还提供检测患有或易感与TTR沉积或致病形式的TTR(例如，单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR)相关的疾病的患者中针对TTR的免疫应答的方法。所述方法可用于监测用本文提供的药剂进行的治疗性和预防性治疗的过程。被动免疫后的抗体谱通常显示抗体浓度的即时峰值，随后显示指数衰减。在没有另外剂量的情况下，衰减在数天至数月的时期内接近治疗前水平，这取决于所施用的抗体的半衰期。例如，一些人抗体的半衰期为约20天。
在一些方法中，在施用前进行受试者中TTR抗体的基线测量，此后进行第二测量以确定峰值抗体水平，并且间隔进行一次或多次另外测量以监测抗体水平的衰减。当抗体水平已经下降到基线或减去基线的峰值的预定百分比(例如，50％、25％或10％)时，施用另外剂量的抗体。在一些方法中，将减去背景的峰值或随后测量水平与先前经确定来构成其他受试者的有益的预防性或治疗性治疗方案的参考水平进行比较。如果测量的抗体水平显著小于参考水平(例如，小于平均值减去1或优选地为，受益于治疗的受试者群体中的参考值的两个标准偏差)，则指示另外剂量的抗体的施用。
还提供例如通过测量来自受试者的样品中TTR淀粉样蛋白或致病形式的TTR(例如单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR)或通过对受试者中的TTR进行体内成像来检测受试者中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的方法。此类方法可用于诊断或确诊与此类致病形式的TTR(例如，TTR淀粉样变性)相关的疾病或其易感性。所述方法还可用于无症状受试者。单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在指示对未来症状性疾病的易感性。所述方法还可用于监测以前已诊断为TTR淀粉样变性的受试者的疾病进展和/或对治疗的应答。
自患有、疑似患有TTR淀粉样变性或处于患有TTR淀粉样变性的风险中的受试者获得的生物样品可与本文所公开的抗体接触以评估单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在。例如，此类受试者中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的水平可与健康受试者中存在的那些水平进行比较。可替代地，接受疾病治疗的此类受试者中TTR淀粉样蛋白或致病形式的TTR(例如，单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR)的水平可与未对TTR淀粉样变性进行治疗的受试者的那些水平进行比较。一些此类测试涉及获自此类受试者的组织的活检。ELISA测定也可为例如用于评估流体样品中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的水平的有用方法。一些此类ELISA测定涉及抗TTR抗体，所述抗TTR抗体相对于正常四聚体形式的TTR而优先结合单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR。
体内成像法可通过以下方式来运作：施用试剂，诸如结合到受试者中的单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的抗体，然后在所述试剂已经结合后检测所述试剂。此类抗体通常结合到TTR残基89-97内的表位。如果需要，清除应答可通过使用缺乏全长恒定区的抗体片段(诸如Fab)来避免。在一些方法中，相同抗体可以用作治疗试剂和诊断试剂。
诊断试剂可通过静脉内注射来向受试者体内施用，或通过视为合理的其他途径来施用。试剂的剂量应处于与治疗方法的剂量相同的范围内。通常，试剂被标记，尽管在一些方法中，对单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR具有亲和力的第一试剂未被标记，并且第二标记用于结合到第一试剂。标签的选择取决于检测手段。例如，荧光标签适于光学检测。顺磁性标签的使用适于在没有手术干预的情况下进行断层摄影检测。还可使用PET或SPECT来检测放射性标签。
诊断通过将标记的位点的数目、大小和/或强度与相应基线值比较来进行。基线值可代表未患病个体的群体的平均水平。基线值还可代表相同受试者中确定的先前水平。例如，基线值可在开始治疗之前在受试者中测定，并且此后测量值与基线值进行比较。值相对于基线的减少通常表示对治疗的阳性应答。
IX.试剂盒
本发明还提供包含本文所公开的人源化5A1抗体和相关材料诸如使用说明书(例如包装插页)的试剂盒(例如，容器)。使用说明可含有例如用于施用抗体和任选的一种或多种另外的药剂的说明书。抗体的容器可为单位剂量、大量(bulk)包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。
包装插页是指习惯上包括于治疗产品的商业包装中的说明书，所述说明书含有关于指征、用法、剂量、施用、禁忌症和/或涉及所述治疗产品使用的警告的信息
试剂盒还可包括包含药学上可接受的缓冲液的第二容器，所述药学上可接受的缓冲剂诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可还包含从商业和使用者立场来看希望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针以及注射器。
X.其他应用
在临床诊断或治疗或研究的情况下，抗体可用于检测单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的甲状腺素运载蛋白(TTR)或其片段。例如，抗体可用于检测生物样品中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在，所述存在作为生物样品包含TTR淀粉样沉积物的指示。抗体与生物样品的结合可与抗体与对照样品的结合进行比较。对照样品和生物样品可包含相同组织来源的细胞。对照样品和生物样品可自相同个体或不同个体获得，并且在相同时机或不同时机时获得。如果需要，在多个时机时评估多个生物样品和多个对照样品，以防止独立于样品之间差异的随机变化。然后可在生物样品与对照样品之间进行直接比较，以确定抗体与生物样品的结合(即单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在)相对于抗体与对照样品的结合是否增加、减少或相同。抗体与生物样品的结合相对于对照样品的增加指示生物样品中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在。在一些情况下，增加的抗体结合为统计学上显著的。任选地，抗体与生物样品的结合比抗体与对照样品的结合高至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍或100倍。
此外，抗体可用于检测生物样品中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在，以监测和评估用于治疗诊断为TTR淀粉样变性的患者的治疗剂的功效。评估来自诊断为TTR淀粉样变性的患者的生物样品以建立抗体与样品的结合的基线(即，样品中单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在的基线)，之后开始用治疗剂进行的疗法。在一些情况下，来自患者的多个生物样品在多个时机时进行评估，以建立独立于治疗的随机变化的基线和量度。然后在一个方案中施用治疗剂。所述方案可包括在一段时间内多次施用所述药剂。任选地，在来自患者的多个生物样品中在多个时机时评估抗体的结合(即，单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在)，以建立随机变化的量度并且显示对免疫疗法的应答的趋势。然后比较抗体与生物样品的结合的各种评估。如果仅进行两次评估，则可在两次评估之间进行直接比较，以确定抗体结合(即，单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在)在两次评估之间是否增加、减少或保持相同。如果进行多于两次的测量，则可将测量值分析为在用治疗剂治疗前开始并且贯穿疗程进行的时间过程。在抗体与生物样品的结合已减少(单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的存在)的患者中，可得出结论，治疗剂有效治疗患者的TTR淀粉样变性。抗体结合的减少可为统计学上显著的。任选地，结合减少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。可协同评估TTR淀粉样变性的其他体征和症状来进行抗体结合的评估。
抗体还可用作检测单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR或其片段的实验室研究的研究试剂。在此类用途中，抗体可用荧光分子、自旋标记分子、酶或放射性同位素来标记，并且可以具有进行检测测定的所有必需试剂的试剂盒形式来提供。抗体还可用于例如通过亲和色谱来纯化单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR或单体、错误折叠、聚集或原纤维形式的TTR的结合配偶体。
抗体还可用于在生物样品中抑制或减少TTR聚集、抑制或减少TTR原纤维形成、减少或清除TTR沉积物或TTR聚集体或使TTR的无毒性构象稳定。生物样品可包括例如血液、血清、血浆或组织(例如，来自心脏、周围神经系统、自主神经系统、肾、眼睛或胃肠道的组织)。在一些情况下，TTR聚集、TTR原纤维形成或TTR沉积物被抑制或减少至少10％、20％、25％、30％、40％、50％或75％(例如，10％-75％或30％-70％)。用于检测原纤维形成的测定在本文其他地方有所描述。另参见，US 2014/0056904。
以上或以下所引用的所有专利申请、网站、其他出版物、登录号等均在犹如每个单独项目均具体地且单独地指示为以引用方式如此并入一样的相同程度上出于所有目的以引用的方式整体并入。如果不同的序列版本与不同时间时的登录号相关，则与本申请的有效提交日期时的登录号相关的版本是有意义的。有效提交日期意指实际提交日期的较早时间或参考登录号(如果适用)的优先权申请的提交日期。同样，除非另有说明，否则如果不同版本的出版物、网站等在不同时间公布，则最近在申请的有效申请日期公布的版本是有意义的。除非另有具体说明，否则本发明的任何特征、步骤、元件、实施方案或方面均可与任何其他组合使用。尽管出于清楚和理解的目的已经通过说明和实例详细描述了本发明，但将显而易见的是，可在所附权利要求的范围内进行某些变化和修改。
实施例
实施例1.mis-TTR单克隆抗体的鉴定
如材料和方法(a-d)所述，产生、筛选、表达和纯化针对单体、错误折叠、原纤维或聚集形式的TTR(mis-TTR)的构象特异性单克隆抗体。为了产生mis-TTR单克隆抗体，检查人四聚体TTR的晶体结构以发现蛋白质的在四聚体中掩埋但在四聚体解离成其单体亚基时暴露的区。所鉴定的区是位于TTR的F链内并隔绝在四聚体蛋白质的二聚体界面处的残基89-97(EHAEVVFTA)(SEQ ID NO:35)。蛋白质数据库的BLAST搜索未揭示具有此序列的任何其他人蛋白质。
将包含此序列的肽(ggEHAEVVFTAggkg)(SEQ ID NO:36)合成。大写字母代表TTR的残基89-97。小写字母代表添加来增加抗原肽的溶解度并将9氨基酸片段建立为内部序列的另外的接头残基。这种肽与聚赖氨酸树状核心连接，产生多抗原肽免疫原(TTR-MAP)，其包含具有连接到TTR 89-97肽的多个分支的赖氨酸残基核心。产生表2中列出的针对TTR-MAP的抗体。
除了这种多抗原肽之外，通过将相似的TTR 89-97肽(Ac-cggEHAEVVFTA-酰胺(SEQID NO:37)和Ac-EHAEVVFTAcgg-酰胺)(SEQ ID NO:38)经由N端和C端半胱氨酸残基共价连接到钥孔血蓝蛋白来产生含有相同TTR片段的两个其他免疫原(TTR89-97-N-KLH和TTR89-97-C-KLH)。
如表2所示，在抗体产生、筛选、表达和纯化后，通过表面等离振子共振(SPR)测定引导(lead)mis-TTR抗体的详细结合动力学参数(缔合速率(ka)、解离速率(kd)和结合亲和力常数(KD))以重组人TTR F87M/L110M。将抗小鼠IgG(GE Healthcare)按照GE Healthcare抗小鼠试剂盒中提供的说明通过胺偶联固定在传感器芯片C5(缺乏葡聚糖链)上，并将mis-TTR mAb捕获到确保30-50RU的最大分析物结合的水平。将各种浓度的分析物(重组人TTRF87M/L110M)在3倍稀释度的运行缓冲液(HBS+0.05％P-20、1mg/mL BSA)中以30μl/分钟通过捕获的配体。对于每种浓度，反应进行一定时间范围，允许较高的分析物浓度在缔合过程中达到平衡，以及至少10％的信号在解离过程中衰减。将至少一种浓度(不是最高或最低)以一式两份进行。基于初步实验将分析物的浓度范围的跨度选择成高于KD至少10倍至低于KD 10倍。
引导mis-TTR mAb的SPR分析结果示于下表2中。
表2
引导mis-TTR抗体与人TTR(F87M/L110M)的结合的SPR分析
mAb k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M) R<sub>最大</sub>
9D5 2.715E+4 4.930E-4 1.816E-8 31.55
14G8 2.880E+4 5.358E-4 1.861E-8 27.13
5A1 6.107E+4 4.693E-4 7.684E-9 30.98
6C1 4.607E+4 4.151E-4 9.010E-9 26.32
实施例2.mis-TTR抗体与TTR抗原的结合
使用pH4.0处理的TTR(pH4-TTR)和天然TTR作为包被抗原，在0.31至2.5μg/ml的浓度范围下通过ELISA测定四种引导mis-TTR mAb(9D5、14G8、6C1和5A1)。TTR抗原制备和ELISA方案在材料和方法(e-g)中的其他地方有所描述。
所得结合曲线和列表显示的Kd和B最大值示于以下图3和表3中。图3中的结果在y轴上以任意单位(a.u.)呈现。所有mAb显示与pH4-TTR的显著结合，Kd值范围为16nM(6C1)至282nM(9D5)。与pH4-TTR的结合的B最大值范围为低值0.65a.u.(14G8)至高值2.02(9D5)。同与pH4-TTR的结合相反，没有抗体显示出与天然TTR的显著结合，指示所产生的所有TTR抗体对于非天然形式的TTR是特异性的。
表3
引导mis-TTR抗体与pH4-TTR的结合的ELISA分析
mAb K<sub>d</sub>(nM) B<sub>最大</sub>(a.u.)
9D5 282 2.02
14G8 108 0.65
6C1 16 1.07
5A1 23 1.61
实施例3.通过SDS-PAGE和天然PAGE分析mis-TTR抗体
通过SDS-PAGE/蛋白质印迹分析9D5和14G8，以证实相对于天然非变性TTR，与单体/变性形式的TTR的结合的特异性。SDS-PAGE、天然PAGE和蛋白质印迹方案在方法和材料(h-j)中的其他地方有所描述。
将非变性TTR或pH4-TTR与热变性TTR和热变性pH4-TTR一起在SDS-PAGE凝胶上运行。电泳后，将凝胶通过蛋白质印迹印迹到硝酸纤维素上，并用TTR mAb 9D5和14G8染色。当在pH4下处理时或者当在SDS-PAGE之前首先将TTR或pH4-TTR热变性时，这两种抗体仅识别TTR。因此，这些9D5和14G8显示出对于通过将TTR变性或通过在pH4下处理TTR产生的TTR构象异构体的特异性。
还将6C1和5A1连同总TTR mAb(7G7、8C3)和可商购获得的Sigma多克隆抗体一起通过SDS-PAGE/蛋白质印迹来分析。每个印迹含有染色的分子量标记、非变性TTR和pH4-TTR。
染色的SDS-PAGE凝胶显示非变性TTR样品中存在的主要物质为约38kDa二聚体。相比之下，存在于pH4-TTR样品中的主要组分作为约35kDa二聚体运行，少量二聚体具有约15kDa单体。这种二聚体作为比非变性TTR样品中存在的二聚体稍微小的蛋白质运行，指示这两种TTR二聚体物质之间的构象差异。
使用四种mis-TTR抗体进行的TTR和pH4-TTR蛋白质印迹显示这些mAb不识别非变性TTR，但是确实结合到pH4-TTR样品中存在的变性单体和二聚体。因此，当通过SDS-PAGE/蛋白质印迹分析时，四种mis-TTR mAb(9D5、14G8、6C1和5A1)显示对于TTR的非天然构象的相似特异性。
同四种mis-TTR mAb相反，通过用完整TTR免疫小鼠而产生的两种TTR对照mAb(7G7和8C3)识别出TTR和pH4-TTR样品中存在的所有TTR物质，包括四聚体TTR物质。因此，与mis-TTR mAb不同，这些对照mAb结合TTR，但没有构象特异性。Sigma多克隆抗体的行为与7G7和8C3对照mAb类似。
还将TTR和pH4-TTR在天然凝胶上运行，以观察四种mis-TTR mAb是否能够在非变性凝胶条件下显示构象特异性。在染色的天然PAGE凝胶上，TTR作为约35kDa天然二聚体运行，少量为四聚体。相比之下，pH4-TTR主要作为高分子量成片条带运行，为痕量的约35kDa二聚体。非特异性Sigma多克隆抗体识别TTR和pH4-TTR样品中存在的所有TTR物质。相比之下，9D5仅识别pH4-TTR样品中存在的高分子量TTR物质。如SDS-PAGE/蛋白质印迹研究中所观察到的，9D5不识别任何天然TTR物质。
随后通过天然PAGE/蛋白质印迹分析所有四种mis-TTR mAb。如所预期的且类似于9D5，其他mis-TTR mAb、14G8、6C1和5A1特异性结合到pH4-TTR样品中存在的高分子量非天然形式的TTR。这些抗体均未识别约35kDa天然TTR二聚体。这些结果指示四种mis-TTR mAb的行为类似，并且仅识别在构象上与天然TTR不同的非天然TTR物质。
实施例4.通过mis-TTR抗体抑制TTR纤维形成
TTR-Y78F是TTR变体，其在蛋白质序列中的位置78处含有使TTR四聚体不稳定的点突变。随着时间和温和的酸性条件，此TTR变体解离成其单体亚基，然后可以将所述单体亚基聚集并形成能够结合到硫黄素-T的纤维。因此可以通过测量480nm处的硫黄素-T荧光来监测纤维形成的程度。引入对解离的TTR单体或聚集体特异性的mis-TTR抗体将阻止TTR纤维组装，相对于无抗体对照反应导致硫黄素-T荧光降低。用于检查TTR纤维形成的抑制的方案在材料和方法(k)中的其他地方有所描述。
所有四种mis-TTR抗体相对于同种型对照强烈地抑制硫黄素-T反应性TTR-Y78F纤维的形成(结果示于图4中，并在y轴上以任意单位(a.u.)呈现)。Mis-TTR抗体5A1几乎完全抑制纤维形成。这些结果与以下概念一致：mis-TTR抗体结合单体和/或聚集形式的TTR，从而阻止TTR纤维形成。
表4概述获得的对非天然形式的TTR显示出良好构象选择性的4种mis-TTR抗体(9D5、14G8、6C1和5A1)组的表征数据。这些抗体对pH4-TTR的亲和力(KD)的范围为14.5nM(6C1)至257nM(9D5)，且B最大值的范围为0.65a.u.(14G8)至2.02(9D5)。这些抗体均未识别天然TTR，但确实结合到SDS-PAGE/蛋白质印迹上的pH4-TTR，并且结合到天然PAGE/蛋白质印迹上的高分子量TTR聚集体。这些抗体还在使用Thio-T作为读出的原纤维形成测定中抑制TTR原纤维的形成。
表4
mis-TTR-Y78F mAb表征概述表
Figure GDA0002857898730000591
TTR-V122I是TTR变体，其在位置122处含有使四聚体不稳定的单个点突变。纤维形成与ThT荧光的增加相关，增加14G8 mAb浓度引起ThT荧光单调递减，指示TTR原纤维形成的亚化学计量抑制(IC50＝0.028±0.009mg/mL；n＝3；图4B和表4a)。同种型对照mAb不引起TTR原纤维形成的抑制(图4C)，因此证实14G8介导的抑制的特异性。
确定的5A1和6C1的可比较亚化学计量IC50值(表4a)表明这些mis-TTR mAb中的每一种的原纤维抑制机制类似。相比之下，意外地，9D5未能抑制TTR-V122I原纤维形成，尽管对非天然TTR显示出相似的特异性和亲和力。9D5是否对所用测定条件更为敏感仍有待探究。
表4a
mis-TTR-V122I mAb表征概述表
抗体 IC<sub>50</sub>±SD(mg/mL)
9D5 无抑制
14G8 0.028±0.009
6C1 0.048±0.059
5A1 0.015±0.02
EG 27/1 无抑制
实施例5.使用mis-TTR mAb进行ATTR组织的免疫组织化学(IHC)表征
将针对甲状腺素运载蛋白的TTR 89-97片段产生的引导mis-TTR mAb对来自确认为TTR心脏淀粉样变性患者的新鲜冷冻和石蜡处理组织进行免疫组织化学测试。在材料和方法(1-o)中的其他地方提供了用于获得和制备心脏组织样品、免疫组化(IHC)和图像分析的方案。用于IHC的抗体在表5中有所描述。
表5
用于免疫组织化学表征的抗体
Figure GDA0002857898730000601
Figure GDA0002857898730000611
心脏组织样本获自确诊为ATTR突变的患者。以免疫组织化学方式检查的病例的人口统计学数据如下且概述于表6中：FAC＝家族性淀粉样心肌病；FAP＝家族性淀粉样多发性神经病；1°AL＝轻链淀粉样变性；ATTR＝甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性；Unk＝未知
表6
用mis-TTR抗体进行心脏组织样品的免疫组织化学染色
Figure GDA0002857898730000612
将针对甲状腺素运载蛋白的89-97片段产生的小鼠单克隆抗体(mis-TTR mAb)对来自确认为TTR心脏淀粉样变性患者的新鲜冷冻和石蜡处理组织进行免疫组织化学测试。每个mis-TTR抗体对ATTR心脏组织显示出免疫反应性。在整个心肌和脉管系统的沉积物中观察到暗染色。当将免疫反应性与用具有硫黄素-T的刚果红进行的染色比较时，组织中大部分免疫反应性显示与刚果红双折射和硫磺素T阳性染色的高度一致。这确认了沉积在此组织中的TTR淀粉样蛋白的β折叠片层性质。这些mis-TTR抗体还检测前淀粉样蛋白TTR，所述前淀粉样蛋白TTR局限于TTR免疫阳性但刚果红或硫黄素-T阴性的心肌区域。IgG同种型对照抗体和一级抗体遗漏切片对所测试的所有组织中的染色呈阴性。对其他淀粉样蛋白生成性蛋白质(λ和κ轻链或淀粉样蛋白A)有反应的抗体对此分析中所用的ATTR心脏组织无反应，指示沉积物本质上具体地为TTR。
将mis-TTR抗体的染色模式与用良好表征的商业TTR参考抗体(前白蛋白，A0002；Dako；Carpinteria，CA)获得的染色模式进行比较。DAKO参考抗体与mis-TTR抗体将相同区域中的患病心肌染色，但产生更扩散的染色模式。DAKO参考抗体未像mis-TTR抗体一样强烈地染色存在于脉管系统上的亲刚果红性(congophillic)TTR淀粉样蛋白沉积物。
mis-TTR抗体未将正常的未患病组织染色。此外，如所预期的，用同种型对照抗体6F10进行的染色也是阴性的。
为了确定mis-TTR抗体的反应性对TTR沉积物是否是特异性的，检测了这些抗体对来源于诊断为原发性AL淀粉样变性的患者的心脏组织的交叉反应性。如所预期的，未观察到AL淀粉样蛋白组织的染色，确认了TTR抗体对ATTR患病组织发生特异性反应。
还将来自确诊为老年全身性淀粉样变性患者或患有确认的由TTR基因中点突变引起的FAC或FAP的患者的心脏组织用14G8、9D5、6C1和5A1染色为阳性。这些结果指示，无论ATTR基因型如何，mis-TTR抗体都具有识别心脏组织中TTR沉积物的能力。
还检测了已知表达TTR的其他非心脏组织由14G8、9D5、6C1和5A1进行的染色，并与使用DAKO参考抗体获得的染色比较。如所预期的，使用Dako参考抗体将肝脏、胰腺和脉络丛全部染色为TTR阳性。相比之下，mis-TTR抗体仅将位于胰岛中的胰腺α细胞和脉络丛染色，表明局限于这些器官的一些TTR与肝脏中表达的TTR在构象上不同。肝脏中mis-TTR mAb免疫反应性的缺乏表明，肝脏中表达的大量TTR主要是四聚体天然TTR，并且不具有暴露的mis-TTR表位。
实施例6.通过SDS-PAGE/蛋白质印迹和Meso Scale Discovery(MSD)板测定分析ATTR与正常人血浆
来自确认为V30M ATTR的患者的六个血浆样品(样品#21、#22、#23、#24、#25、#27)和来自正常受试者的6个样品(#11、#12、#15、#18、#19、#20)获自M.Saraiva(PortoUniversity，Portugal)。样品#C6是获自商业来源(BioreclamationIVT)的正常人血清样品。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹或MesoScale Discovery(MSD)板测定分析样品。用于这些测定的方案在材料和方法(p-r)中的其他地方有所描述。使用6C1产生MSD板测定的标准曲线。
在使用9D5或5A1 mis-TTR mAb进行的所得蛋白质印迹中，正常血浆样品与TTR-V30M患病血浆样品之间的差异明显。所有血浆样品均含有与pH4-TTR参考样品中存在的非天然TTR单体共迁移的约14kDa TTR带。一般来说，来源于TTR-V30M患者的血浆样品(#21、22、23、24、25和27)具有较多的这种mis-TTR物质。此外，来源于V30M患者的血浆样品还含有与参考样品中存在的非天然TTR二聚体共迁移的约30kDa带。除了样品#12和#18之外，来源于正常个体的血浆样品具有较少的这种二聚体物质。
扫描所得到的蛋白质印迹，并绘制每个样品的组合的9D5或5A1反应性TTR二聚体和单体条带的强度(结果示于图5A(9D5)和5B(5A1)中，并在y轴上以任意单位(a.u.)呈现)。除了血浆样品#15和#18之外，来源于正常个体的血浆样品(11、12、19和20)比获自V30M患者的样品(21-25和27)含有较少的9D5反应性二聚体和单体。
还通过MSD板测定使用6C1作为mis-TTR捕获抗体且使用Dako-SulfoTag抗体作为检测抗体分析通过9D5和5A1蛋白质印迹分析的12个血清样品。这些MSD测定的结果示于图6中，并在y轴上以任意单位(a.u.)呈现。样品11、12、15、18、19和20代表正常血浆。样品21-25和27代表V30M患病血浆。除了血浆样品#15和#18之外，来源于正常个体的血浆样品中存在的6C1反应性TTR的量低于来源于TTR-V30M患病个体的血浆中观察到的量。通过MSD测定测量的6C1反应性水平与以上通过SDS-PAGE/蛋白质印迹观察到的9D5反应性二聚体和单体的量非常好地相关。
为了确定血浆样品中存在的反应性TTR物质的浓度，使用6C1作为捕获抗体并且使用8C3-SulfoTag作为检测抗体来重新测定相同样品。使用以上产生的TTR F87M/L110M标准曲线将MSD信号转化为反应性TTR物质的ng/ml浓度。基于此分析，对照样品中存在的6C1反应性TTR的平均浓度为271+/-185ng/ml。相比之下，V30M患病血浆样品中存在的反应性TTR的平均浓度较高，为331+/-95ng/ml。总之，这些MSD结果表明mis-TTR抗体能够将ATTR疾病与正常血浆区分开来。这保证进一步开发用于ATTR疾病的诊断测定的mis-TTR抗体。
实施例7.人源化5A1抗体的设计
用于人源化的起始点或供体抗体为小鼠抗体5A1。将成熟m5A1的重链可变氨基酸序列作为SEQ ID NO:1提供。将成熟m5A1的轻链可变氨基酸序列作为SEQ ID NO:9提供。将重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别作为SEQ ID NO:6、7和8(如由Kabat所定义)提供。将轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列分别作为SEQ ID NO:14、15和17(如由Kabat所定义)提供。在整个此实施例中使用Kabat编号。
m5A1的可变κ(Vk)属于小鼠Kabat亚组1，这对应于人Kabat亚组4。m5A1的可变重链(Vh)属于小鼠Kabat亚组3d，这对应于Kabat亚组3。参见，Kabat等Sequences of Proteinsof Immunological Interest,第5版NIH出版号91-3242，1991。11个残基的CDR-L1属于标准类别2，7个残基的CDR-L2属于标准类别1，并且9个残基的CDR-L3属于Vk中的标准类别1。参见，Martin和Thornton，J.Mol.Biol.263:800-15，1996。10个残基的CDR-H1(Chothia和Kabat CDR-H1的复合，表7的残基26-35)属于标准类别1，并且17个残基的CDR-H2属于标准类别1。参见，Martin和Thornton，J Mol.Biol.263:800-15，1996。CDR-H3不具有标准类别。
Vk和Vh结构域之间的界面处的残基是通常发现的残基，不同之处在于重量中的93V通常为丙氨酸。
对PDB数据库中的蛋白质序列进行了搜索(Deshpande等，Nucleic Acids Res.33:D233-7，2005)，以找到将提供5A1的粗略结构模型的结构。将抗体fab(pdb代码3IU4)的晶体结构(Talavera等，2002)用于Vk结构，因为它具有良好的分辨率(1.75A)、与5A1 Vk的整体序列相似性，并保留与5A1相同的环的标准结构。将二聚体抗体(pdb code 3LS4)(Niemi等，2003)用于Vh结构，因为它具有良好的相似性和分辨率(2.0A)，并且与5A1 VH含有相同的CDR-H1和CDR-H2的标准结构。将BioLuminate软件(由Schrodinger Inc.许可)用于对5A1的粗略结构进行模型化。
从NCBI搜索非冗余蛋白质序列数据库允许选择合适的人框架，以将鼠CDR移植到所述人框架中。对于Vh，选择人Ig重链AGP01680.1(GI:519674190)(SEQ ID NO:3)(Bowers等，2013)。它共享5A1的标准形式。对于Vk，选择具有NCBI登录代码BAH04766(GI:219566573)的人κ轻链(SEQ ID NO:11)(Kurosawa等，2007)。它与亲本Vk具有相同的CDR-L1和L2的标准类别。
构建含有不同置换排列(Hu5A1VHv1-2(分别为SEQ ID NO:4和5)和Hu5A1VLv1-2(分别为SEQ ID NO:12和13))的两种人源化重链可变区变体和两种人源化轻链可变区变体(表7和8)。示例性人源化Vh和Vk设计以及基于所选人框架的回复突变和其他突变分别示于表7和表8中。表7和8中第一列中的灰色阴影区域指示如由Chothia所定义的CDR，并且表7和8中剩余列中的灰色阴影区域指示如由Kabat所定义的CDR。SEQ ID NO:4、5、12和13含有如表9所示的回复突变和其他突变。Hu5A1VHv1-2和Hu5A1VLv1-2中的位置L55、L85、H29和H93处的氨基酸列于表10中。
表7
人源化5A1 Vh区
Figure GDA0002857898730000661
表7
人源化5A1 Vh区
Figure GDA0002857898730000671
表7
人源化5A1 Vh区
Figure GDA0002857898730000681
表7
人源化5A1 Vh区
Figure GDA0002857898730000691
表7
人源化5A1 Vh区
Figure GDA0002857898730000701
表8
人源化5A1 Vk区
Figure GDA0002857898730000702
表8
人源化5A1 Vk区
Figure GDA0002857898730000711
表8
人源化5A1 Vk区
Figure GDA0002857898730000721
表8
人源化5A1 Vk区
Figure GDA0002857898730000731
表8
人源化5A1 Vk区
Figure GDA0002857898730000741
表9
VH、VL回复突变和其他突变
Figure GDA0002857898730000742
表10
用于人源化5A1抗体中的回复突变和其他突变的框架和Kabat CDR残基的Kabat编号
Figure GDA0002857898730000751
鼠5A1 Vh序列(SEQ ID NO:1)与小鼠模型序列(3LS4_H_St.pro；SEQ ID NO:2)、人受体序列(AGP01680；SEQ ID NO:3)以及Hu5A1VHv1和Hu5A1VHv2序列(分别为SEQ ID NO:4和5)的比对示于图1中。如由Kabat所定义的CDR区是阴影的。小鼠与人受体序列之间标准残基、微调残基或界面残基有所不同的位置为置换的候选者。微调/CDR基础残基的实例包括表7中的Kabat残基2、49、69、71、75、78和94。标准/CDR相互作用残基的实例包括表7中的Kabat残基24、48和73。界面/包装(VH+VL)残基的实例包括表7中的Kabat残基37、39、45、47、91、93和103。
鼠5A1 Vk序列(SEQ ID NO:9)与小鼠模型序列(3IU4_L_St.pro；SEQ ID NO:10)、人受体序列(BAH04766；SEQ ID NO:11)以及Hu5A1VLv1和Hu5A1VLv2序列(分别为SEQ IDNO:12和13)的比对示于图2中。如由Kabat所定义的CDR区是阴影的。小鼠与人受体序列之间标准残基、微调残基或界面残基有所不同的位置为置换的候选者。微调/CDR基础残基的实例包括表8中的Kabat残基4、35、46、49、66、68和69。标准/CDR相互作用残基的实例包括表8中的Kabat残基2、48、64和71。界面/包装(VH+VL)残基的实例包括表8中的Kabat残基39、44、47、87和98。
用于以上位置作为置换的候选者的原理如下。
C55S：在人抗体中此位置处的Cys是不寻常的。Ser可保留结合亲和力，而免疫原性的潜力降低。这种置换不是回复突变，而是在一个位置处用罕见人残基置换较常见的残基。
T85V：虽然预期位置85对于结合是不重要的，但是在人抗体中此位置处的Thr不比小鼠残基Val常见，因此用T置换V应降低免疫原性的潜力，而不影响结合。
V29F：对此残基进行回复突变，因为其残留于Chothia CDR中。
A93V：此残基有助于VH-VL界面。因为此位置的受体和供体残基有所不同，所以在人源化设计VHv1中进行A至V回复突变。
两个人源化轻链可变区变体和两个人源化重链可变区变体如下：
Hu5A1VL版本1(T85V置换以小写字母表示)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTTVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRCTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAvYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:12)
Hu5A1VL版本2(C55S和T85V置换以小写字母表示)：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTTVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRsTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAvYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:13)
Hu5A1VH版本1(V29F和A93V回复突变以小写字母表示)：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTfSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCvRYYYGQYFDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:4)
Hu5A1VH版本2(V29F回复突变以小写字母表示)：
EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTfSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYYYGQYFDFWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:5)
实施例8.人源化5A1抗体的结合动力学分析
将包含选自版本2的重链和选自版本2的轻链的人源化5A1抗体的结合动力学通过Biacore来表征。
mAb k<sub>a</sub>(1/Ms) k<sub>d</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M) R<sub>最大</sub>
Hu-5A1-H2L2 3.766E+5 3.522E-4 9.352E-10 37.69
实施例9.材料和方法
a.抗体产生方案
每周用RIBI佐剂中或每月用TiterMax佐剂中的抗原肽TTR-MAP、TTR89-97-N-KLH或TTR89-97-C-KLH免疫小鼠。在融合前3至4天，将所选小鼠用盐溶液中的免疫原给予最终IV加强。将脾匀浆以制备脾细胞并使用标准电融合方案与SP2/0骨髓瘤细胞融合。将选择培养基中的融合细胞铺在96孔板中并在7-10天后筛选。
b.抗体筛选方案
杂交瘤选择是基于以下ELISA筛选：将96孔ELISA板用鸡抗His、1μg/mL PBS包被，并孵育1小时。将板用200uL/孔的1％BSA/PBS溶液封闭15分钟，然后加入50μL/孔的0.5μg/mL pH4-TTR并孵育1小时。pH4-TTR是进行低pH(50mM乙酸钠，pH 4.0)处理的TTR，以便解离/聚集TTR，暴露TTR89-97表位。将板用TBS-T洗涤两次。加入50μL/孔的来自融合板的上清液，并孵育1小时。将板用TBS-T洗涤两次。加入50μL/孔的以1:5,000在0.5％BSA/PBS/TBS-T中稀释的检测抗体山羊抗小鼠(IgG1、2a、2b、3特异性)HRP，并孵育1小时。最终，将板用TBS-T洗涤5次，并加入100μL/孔的TMB底物。15分钟后，用50μL/孔的2N硫酸停止底物显影。在450nm处读板。选择O.D.>1.0的孔，并将细胞转移到24孔板。在3天生长后，用以上测定对克隆进行反筛选以确认结合，并用天然TTR代替pH4-TTR作为阴性反筛选，允许选择产生对非天然形式的TTR特异性的TTR mAb的克隆。
c.抗体表达方案
将携带人源化单克隆抗体序列的CMV驱动的轻链和重链质粒转染到CHO-S1细胞(Life Technology)中。应用双重选择来确定所选库。测定条件培养基的滴度、结合，并且通过SDS-PAGE/蛋白质印迹分析。使用Clonepix系统(Molecular Devices)将所选库用于克隆产生。基于抗体滴度对克隆进行分级。将所选克隆扩增并分级。
将最高生产的克隆在摇瓶中扩增，并将培养物用于接种10-25L Wave袋培养物。将补充有Glutamax(来自Life Technology的培养基和Glutamax)的FreeStyle-CHO、CDOptiCHO和FreeStyle F17表达培养基的混合物用于摇瓶以及Wave袋培养物。在37℃、7％CO2下在恒定搅拌下，使用Wave生物反应器(GE Healthcare)进行分批培养。定期抽取样品以监测细胞数目、活力和抗体产生。如果需要，则可补充Cell Boost(HyClone)。当细胞活力开始下降到低于90％时(5-7天)，收获分批培养物。
d.抗体纯化方案
在首先使悬浮液中的细胞在4℃下通过重力沉降到Wave袋的底部后，收获细胞培养物。将所收获的培养基通过深度过滤器(Millistak Pod COHC，Millipore)澄清，通过切向流过滤(Pelicon 2PLC 30K，Millipore)浓缩10倍，并通过0.2μm过滤器(Opticap XL，Millipore)进行无菌过滤。然后将浓缩的条件培养基加载到使用FPLC(Akta Avant，GELifesciences)在pH 7.4的1xPBS中预平衡的Protein G Sepharose Fast Flow柱(GELifesciences)上。将未结合蛋白质用5-10柱体积的1xPBS(pH 7.4)从柱上洗涤掉直到OD280达到基线。将结合抗体用2柱体积的IgG洗脱缓冲液(Thermo Scientific)从柱上洗脱。收集洗脱级分，并用pH 9.0的2M Tris(每1ml洗脱液60μL)进行pH中和。
将含有抗体的级分汇集，并在4℃下用pH 7.4的1xPBS透析过夜。然后将透析的样品通过超滤穿过0.2μm PES过滤器来灭菌，并在4℃下储存。通过二辛可宁酸(BCA)使用牛丙种球蛋白作为蛋白质标准物(Thermo Scientific)测定最终蛋白质浓度。
e.重组TTR表达和纯化方案
将大肠杆菌(BL21-A1)细胞用含有TTR插入物(Met-hTTR-(His)6或含有F87M/L110M双突变的TTR变体的pET21a(+)质粒转化。使细胞在含有100μg/ml氨苄青霉素的2YT肉汤中生长。在1mM IPTG和005％阿拉伯糖存在下，在20℃下诱导TTR的表达过夜。
将细胞通过以4000x g离心10分钟收集，并在-80℃下储存直到使用。10-15g细胞团解冻，并通过LV-1高剪切加工机(Microfluidics，Inc.)处理来在50ml缓冲液A(含有500mM NaCl、20mM咪唑的1xPBS)中裂解。将裂解的细胞以12,000x g离心15分钟，通过0.2μmPES过滤器过滤，之后在His-Trap HP柱(GE Lifesciences)上纯化。加载后，将柱用10c.v.缓冲液A洗涤，并用缓冲液B(具有500mM NaCl、500mM咪唑的1xPBS)洗脱。收集对应于TTR的峰值级分，用1xPBS透析并在-80℃下储存直到使用。
f.TTR抗原制备
通过将重组TTR-6His的浓缩储备液在1x PBS中稀释至2.5μg/ml的终浓度来制备天然TTR抗原。通过在室温下在pH 3.95的50mM乙酸钠中将浓度为0.2mg/ml的重组TTR孵育72小时来产生pH4处理的TTR。在这些条件下，TTR解离成TTR单体和结构上与天然TTR有所不同的聚集形式的混合物。然后将pH4-TTR在1xPBS中稀释至2.5μg/ml的终浓度，之后立即用于测定。将96孔板(Costar#3690)在室温下用50μl/孔的1.0μg/ml鸡抗his多克隆抗体(Abcam#Ab9107)在1xPBS中包被1h。将包被溶液弃去，并将板用250μl/孔体积的在1xPBS(G-Biosciences#786-193)中稀释的含有1x BSA的封闭缓冲液封闭1h。
g.ELISA方案
将包被和封闭的96孔板在室温下用50μl/孔的2.5μg/ml TTR抗原(天然TTR或pH4-TTR)处理1h。然后将板用250μl/孔的洗涤缓冲液(含有0.05％Tween-20的1x Tris缓冲盐水)洗涤两次。然后将洗涤的板用50μl/孔的浓度范围为0.31至2.5μg/ml的适当抗TTR单克隆抗体处理1h。
将处理的板用250μl/孔洗涤缓冲液洗涤3次。洗涤后，将板处理用50μl/孔的包含1xPBS中1:5,000稀释度的过氧化物缀合的山羊抗小鼠(Jackson ImmunoResearch#115-035-164)的检测抗体处理1h。然后将板洗涤3次，之后加入100μl/孔TMB底物(Rockland)。使HRP反应在室温下进行15分钟，之后用50μl/孔体积的1N H2SO4淬灭。在450nm的波长处测量光谱吸光度。
h.SDS-PAGE
如下在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将1xLDS样品缓冲液(LifeTechnologies)中的0.1-1μg TTR或pH 4.0-TTR加载到10％NuPAGE bis-tris凝胶上，并在MES缓冲液中在恒定的90V下进行电泳105分钟。电泳后，将凝胶在Instant Blue(Expedeon)中染色，或转移到硝酸纤维素过滤器以进行蛋白质印迹分析。
i.天然PAGE
如下在天然Tris-甘氨酸凝胶上进行电泳。将1xTris-甘氨酸样品缓冲液(LifeTechnologies)中的0.1-1μg TTR或pH 4.0-TTR加载到10-20％Tris-甘氨酸凝胶上，并在1x天然Tris-甘氨酸运行缓冲液中恒定的120V下进行电泳105分钟。电泳后，将凝胶在InstantBlue(Expedeon)中染色，或转移到硝酸纤维素过滤器以进行蛋白质印迹分析。
j.蛋白质印迹
将SDS-或天然PAGE凝胶印迹到硝酸纤维素滤纸(iBlot，P7Program)上，并用封闭缓冲液(Licor)封闭30分钟。然后将过滤器在封闭缓冲液中在0.5μg/ml一级抗体中在室温下孵育1小时(或在4℃下过夜)，随后用1xTBS进行10分钟的洗涤三次。将过滤器置于以1:20,000在封闭缓冲液中稀释的IRDye 800CW缀合的山羊抗小鼠二级抗体中。在将过滤器在室温下在二级抗体溶液中孵育1小时后，将过滤器洗涤并在Odyssey CLx红外成像仪(Licor)上进行成像。
k.TTR纤维形成测定方案
在1.4μM(0.2mg/ml)mis-TTR抗体或同种型对照的存在下，将3.6μM(0.2mg/ml)TTR-Y78F在50mM乙酸钠(pH 4.8)中的溶液在37℃下孵育72小时。孵育后，将5X摩尔过量的硫磺素-T加入混合物中，并使其结合30分钟。在设定在440nm处的激发波长的情况下，在480nm的发射波长处测量荧光测量。将0％抑制设定为在存在同种型对照抗体的情况下的荧光强度(83a.u.)，并将100％抑制点设定为在不存在TTR-Y78F蛋白质的情况下的荧光(38a.u.)。
l.心脏组织样品
自印第安纳大学的Merrill Benson博士获得确诊为ATTR突变的心脏组织的新鲜冷冻和石蜡加工块。样品包括8个新鲜冷冻样品和6个FFPE样品，并且每个样品被诊断为ATTR或一些其他心脏淀粉样变性。在Prothena通过用κ和λ轻链和淀粉样蛋白A的抗体进行的IHC染色进一步确认组织的诊断，之后用TTR抗体进行表征。
m.免疫组织化学
对轻度多聚甲醛固定的10μm载玻片安装的冷冻切片和5μm石蜡切片上进行免疫组织化学。免疫过氧化物酶法是使用Bond Polymer Refine Detection试剂盒(DS980，LeicaBiosystems)在Leica Bond Rx(Leica Biosystems，Buffalo Grove，IL)上进行的主要检测系统。将一级抗体孵育1小时(根据表2.的浓度)，随后用抗小鼠和抗兔聚合性HRP接头抗体缀合物进行孵育。用DAB色原将染色可视化，所述DAB色原产生棕色沉积物。将载玻片用苏木精进行复染，在上升的递增系列的醇中脱水，在二甲苯中清洗，并用CytoSeal 60(RichardAllen Scientific；Kalamazoo，MI)盖上盖玻片。阴性对照包括用非免疫IgG同种型对照或一级抗体的遗漏对相邻切片进行整个免疫组织化学程序。
n.淀粉样蛋白的证实：刚果红和硫磺素T染色
使用来自American MasterTech(Lodi，California)的试剂盒进行刚果红染色以证实组织中的TTR淀粉样蛋白。根据制造商的程序进行染色。将载玻片在刚果红溶液中染色1小时，随后在1％氢氧化钠中分化约15秒。然后将载玻片在流动水中漂洗，通过浓度增加的醇系列脱水，并通过三次更换二甲苯进行清洗，并用CytoSeal 60盖上盖玻片。
采用改良的硫磺素T染色方案(Schmidt等1995.)来确定组织中TTR淀粉样蛋白的存在。简言之，将载玻片用Mayers苏木精复染，在流动水中漂洗，并用0.015％硫磺素T(T3516-25G；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)在50％乙醇中的过滤溶液染色10分钟。然后将载玻片在流动水中漂洗，并在1％(v/v)乙酸中分化10分钟，并在水中漂洗3次。使载玻片风干，之后用ProLong Gold(Life Technologies)盖上盖玻片。
o.图像分析
用Olympus BX61显微镜、Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT数字载玻片扫描仪或Leica SPE光谱共焦系统对载玻片进行成像。收集图像并储存为TIFF文件。
p.通过SDS-PAGE/蛋白质印迹分析人血浆样品
来自确认为V30M ATTR的患者的六个血浆样品(样品#21、#22、#23、#24、#25、#27)和来自正常受试者的6个样品(#11、#12、#15、#18、#19、#20)获自M.Saraiva(PortoUniversity，Portugal)。样品#C6是获自商业来源(Bioreclamation IVT)的正常人血清样品。将这些血浆样品通过SDS-PAGE分离，并如下用9D5进行蛋白质印迹。在不存在还原剂(Life Technologies)的情况下，将1.4μl体积的血浆以1:8稀释到1xLDS样品缓冲液中。将样品进行SDS-PAGE分离，并如前所述用0.5μg/ml 9D5进行蛋白质印迹。
q.通过MesoScale Discovery(MSD)板测定分析人血浆样品
将96孔MSD板用PBS中的浓度为4μg/mL的单克隆抗体6C1包被，并在室温下振荡孵育2小时，或在4℃下孵育过夜。将板用1xTBST洗涤三次，之后用150μL/孔的3％MSD BlockerA溶液封闭，振荡1小时。将30μl/孔体积的以1:10在含有0.6％无球蛋白牛血清白蛋白、1.5mM磷酸二氢钠、8mM磷酸氢二钠、145mM氯化钠、0.05％Triton X-405和0.05％硫柳汞的样品缓冲液中稀释的人血浆样品加入封闭的MSD板中1小时。将板用1xTBST洗涤3次。将50μl/孔体积的样品缓冲液中的1μg/ml磺基标记检测抗体(Dako多克隆抗体的8C3总TTR抗体)在室温下在振荡下加入1h。将板用1xTBST洗涤三次，随后加入每孔150μl/孔的1X ReadBuffer T溶液(Meso Scale Discovery)。然后在MSD Sector成像器中读取板。
r.MSD标准曲线的产生
为了定量人血浆样品中存在的非天然6C1反应性TTR蛋白质的量，使用重组TTR-F87M/L110M作为6C1反应性TTR标准物产生MSD标准曲线。此TTR变体含有可阻止四聚体形成并保持蛋白质处于单体状态的两个氨基酸置换(Jiang等(2001)Biochemistry 40，11442-11452)。因此，此TTR变体被所有mis-TTR mAb识别，且因此非常适于用作MSD测定中的参考标准物。
为了产生标准曲线，将96孔MSD板用PBS中的浓度为4μg/mL的mis-TTR抗体6C1包被，并在室温下振荡孵育2小时，或在4℃下孵育过夜。将板用1xTBST洗涤三次，之后用150μL/孔的3％MSD Blocker A溶液封闭，振荡1小时。然后将封闭的板用50μl/孔的25μg/mLTTR-F87M/L110M(以1:5连续稀释，最后一次稀释为缓冲液空白)处理1小时。将板用1xTBST洗涤3次，之后在室温下在振荡下加入50μl/孔体积的1μg/ml SulfoTag检测抗体(8C3-SulfoTag或Dako pAb-SulfoTag)1小时。将8C3 mAb和Dako抗体偶联到SulfoTag，并且可用作检测抗体，因为它们结合到总TTR结合并且不是构象特异性的。
用检测抗体处理后，将板用150μl/孔体积的1xTBST洗涤三次，随后加入150μl/孔的1x Read Buffer T(MSD)。在MSD Sector成像仪中读板，并产生所得TTR F87M/L110M校准曲线。
实施例10.在转基因小鼠模型中评估mis-TTR抗体
在人源化转基因小鼠模型V30M hTTR中进行体内研究(Inoue等，(2008)Specificpathogen free conditions prevent transthyretin amyloidosis in mousemodels.Transgenic Research 17:817-826)以评估抗TTR抗体在结合和去除聚集的hTTR方面的功效。
使用标准程序饲养转基因小鼠，并通过ELISA评估其循环hTTR水平。将hTTR血清水平为200-400μg/ml的小鼠用于随后的功效研究。第一组研究检查hTTR在转基因小鼠中的自然沉积。hTTR沉积物的检测开始于12个月龄，并且此后每3-6个月重复一次。一旦在转基因小鼠中观察到可接受的聚集体水平，则起始功效研究。将动物分为三个治疗组(n＝10/组)，并每周用IP剂量的媒介物、对照抗体(同种型对照，10mpk)或抗hTRR抗体(10mpk)治疗，持续四周。最后一次治疗后一周，将小鼠安乐死，收集组织并处理，然后染色以评估剩余TTR沉积物的数目和大小。采用定量方法和统计学来确定组间所观察到的清除程度。
在可替代性方法中，在体外制备hTTR聚集体，然后将其注射到转基因小鼠的肾中以形成新聚集体沉积。申请人已经确定注射这些制剂可以可预测的方式加快新聚集体的沉积。基于这些发现，将动物镇静，将左肾暴露并将预聚集的hTTR材料注入肾皮质中。在合适的恢复期后，将小鼠分为三个治疗组(n＝10/组)，并每周用IP剂量的媒介物、对照抗体(同种型对照，10mpk)或抗hTRR抗体(10mpk)治疗，持续四至八周。最后一次治疗后一周，将小鼠安乐死，收集肾并处理，然后染色以评估TTR沉积物的数目和大小。采用定量方法和统计学来确定组间所观察到的变化程度。
实施例11.在基质胶植入物模型中评估mis-TTR抗体
申请人已经确定可将预聚集的hTTR悬浮在基质胶(BD Bioscience，目录号354263)中，使其固化，然后以皮下方式置于小鼠中。在植入后四周，基质胶植入物维持其结构，并且聚集的hTTR仍然存在于植入物内。此外，植入物被小鼠耐受良好，并且抗hTTR抗体能够穿透并结合到悬浮在基质胶中的聚集体。基于这些发现，进行抗体功效研究。将动物镇静，并将含有悬浮在基质胶中的预聚集的hTTR的植入物以皮下方式置于小鼠中。在合适的恢复期后，将小鼠分为三个治疗组(n＝10/组)，并每周用IP剂量的媒介物、对照抗体(同种型对照，10mpk)或抗hTRR抗体(10mpk)治疗，持续二至四周。最后一次治疗后，将小鼠安乐死，收集含有植入物的皮肤并处理，然后使用组织学和/或生物化学方法评估剩余的TTR沉积物的量。采用定量分析和统计学来确定组间所观察到的清除程度。
序列表
<110> Prothena Biosciences Limited
University Health Network
<120> 抗甲状腺素运载蛋白抗体
<130> 057450/473366
<150> 62/109,004
<151> 2015-01-28
<150> 62/266,555
<151> 2015-12-11
<160> 52
<170> 用于Windows系统的FastSEQ 4.0 版
<210> 1
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly
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Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr
20 25 30
Val Met Val Trp Leu Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Gly Thr Thr Ile Val Ala Gly Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
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Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gln Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gln Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Asn Tyr Ala Met Ser
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Tyr Tyr Tyr Gly Gln Tyr Phe Asp Phe
1 5
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Glu Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
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85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr Val Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr
1 5
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<220>
<223> 合成的
<400> 17
Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1 5
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<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
atgaactttg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgtgaa 60
gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaggcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtaac tatgccatgt cttgggttcg ccagactcca 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcatccatt agtagtggtg gtagcaccta ctatccagac 240
agtgtgaagg gccgattcac catctccaga gataatgcca ggaacatcct gtacctgcaa 300
atgagcagtc tgaggtctga ggacacggcc atgtattact gtgtaagata ttactacggc 360
cagtactttg acttctgggg ccaaggcacc gctctcacag tctcctca 408
<210> 19
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp
65 70 75 80
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile
85 90 95
Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr
100 105 110
Tyr Cys Val Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gln Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
atggagtcac atactcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120
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ggacaatctc ctgaactact gatttactcg gcatcctacc ggtgcactgg agtccctgat 240
cgcttcactg gcagtggatc tggggcggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgctcac gttcggtgct 360
gggaccaagc tggagctgaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420
tccaccccgg gatccaag 438
<210> 21
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Met Glu Ser His Thr Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Thr Thr Val Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser
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Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Pro Gly
130 135 140
Ser Lys
145
<210> 22
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Val Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 23
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 24
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gln Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gln Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 29
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Cys Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 30
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Thr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Ser Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 31
<211> 147
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe
1 5 10 15
Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu
20 25 30
Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val
35 40 45
Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe
50 55 60
Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr
65 70 75 80
Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu
100 105 110
Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala
115 120 125
Ala Leu Leu Ser Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn
130 135 140
Pro Lys Glu
145
<210> 32
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val
1 5 10 15
Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val
20 25 30
Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr
85 90 95
Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser
100 105 110
Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu
115 120 125
<210> 33
<211> 127
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu Met Val Lys Val
1 5 10 15
Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val Ala Val His Val
20 25 30
Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe Ala Ser Gly Lys
35 40 45
Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr Glu Glu Gln Phe
50 55 60
Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys Ser Tyr Trp Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr
85 90 95
Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Thr Ile Ala Ala Leu Leu Ser
100 105 110
Pro Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu
115 120 125
<210> 34
<211> 138
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Ala Ser His Arg Leu Leu Leu Leu Cys Leu Ala Gly Leu Val Phe
1 5 10 15
Val Ser Glu Ala Gly Pro Thr Gly Thr Gly Glu Ser Lys Cys Pro Leu
20 25 30
Met Val Lys Val Leu Asp Ala Val Arg Gly Ser Pro Ala Ile Asn Val
35 40 45
Ala Val His Val Phe Arg Lys Ala Ala Asp Asp Thr Trp Glu Pro Phe
50 55 60
Ala Ser Gly Lys Thr Ser Glu Ser Gly Glu Leu His Gly Leu Thr Thr
65 70 75 80
Glu Glu Glu Phe Val Glu Gly Ile Tyr Lys Val Glu Ile Asp Thr Lys
85 90 95
Ser Tyr Trp Lys Ala Leu Gly Ile Ser Pro Phe His Glu His Ala Glu
100 105 110
Val Val Phe Thr Ala Asn Asp Ser Gly Pro Arg Arg Tyr Ser Tyr Ser
115 120 125
Thr Thr Ala Val Val Thr Asn Pro Lys Glu
130 135
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala
1 5
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Gly Gly Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Gly Gly Lys Gly
1 5 10 15
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Cys Gly Gly Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Glu His Ala Glu Val Val Phe Thr Ala Cys Gly Gly
1 5 10
<210> 39
<211> 990
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
gcctccacca agggtccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 990
<210> 40
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg t 321
<210> 41
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60
actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120
aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180
aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240
cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300
ttcaacaggg gagagtgt 318
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 43
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
atgaactttg ggctcagctt gattttcctt gtccttgttt taaaaggtgt ccagtgt 57
<210> 44
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Met Glu Ser His Thr Gln Val Phe Val Phe Val Phe Leu Trp Leu Ser
1 5 10 15
Gly Val Asp Gly
20
<210> 45
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
atggagtcac atactcaggt ctttgtattc gtgtttctct ggttgtctgg tgttgacgga 60
<210> 46
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actactgtag cctggtatcg acagaaacca 120
ggacaatctc ctgaactact gatttactcg gcatcctacc ggtgcactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tggggcggat ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatagta ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa a 321
<210> 47
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
gaagtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcatcc attagtagtg gtggtagcac ctactatcca 180
gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagataatg ccaggaacat cctgtacctg 240
caaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgtaag atattactac 300
ggccagtact ttgacttctg gggccaaggc accgctctca cagtctcctc a 351
<210> 48
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctgatccagc ccggcggctc cctgcgcctg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgtcctcc atctcctccg gcggctccac ctactacccc 180
gactccgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgtgcg ctactactac 300
ggccagtact tcgacttctg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc a 351
<210> 49
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctgatccagc ccggcggctc cctgcgcctg 60
tcctgcgccg cctccggctt caccttctcc aactacgcca tgtcctgggt gcgccaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtgtcctcc atctcctccg gcggctccac ctactacccc 180
gactccgtga agggccgctt caccatctcc cgcgacaact ccaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg ctactactac 300
ggccagtact tcgacttctg gggccagggc accctggtga ccgtgtcctc a 351
<210> 50
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
gacatcgtga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgca aggcctccca ggacgtgtcc accaccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactcc gcctcctacc gctgcaccgg cgtgccctcc 180
cgcttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cactactcca cccccctgac cttcggcggc 300
ggcaccaaag tggagatcaa a 321
<210> 51
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
gacatcgtga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60
atcacctgca aggcctccca ggacgtgtcc accaccgtgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctactcc gcctcctacc gctccaccgg cgtgccctcc 180
cgcttctccg gctccggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cactactcca cccccctgac cttcggcggc 300
ggcaccaaag tggagatcaa a 321
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser
1 5 10

Claims (53)

1.一种特异性结合甲状腺素运载蛋白的抗体，其包含三个Kabat重链CDR：SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3；和三个Kabat轻链CDR：SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示或SEQ ID NO:16所示的CDR-L2和SEQID NO:17所示的CDR-L3。
2.如权利要求1所述的抗体，其包含三个Kabat重链CDR：SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3；和三个Kabat轻链CDR：SEQ IDNO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3。
3. 如权利要求1所述的抗体，其包含三个Kabat重链CDR：SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3；和三个Kabat轻链CDR：SEQ IDNO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:16所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其中重链CDR-H1为SEQ ID NO:52所示的复合Kabat-Chothia CDR-H1。
5.如权利要求1所述的抗体，其为单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的抗体，其为嵌合抗体、人源化抗体或贴面化抗体。
7.如权利要求1所述的抗体，其具有人IgG1同种型。
8.如权利要求1所述的抗体，其具有人IgG2或IgG4同种型。
9.如权利要求1-3中任一项所述的抗体，其为人源化抗体或嵌合抗体。
10.如权利要求9所述的抗体，其为人源化抗体，所述人源化抗体包括人源化成熟重链可变区和人源化成熟轻链可变区。
11. 如权利要求10所述的抗体，其中所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4至少90%相同的氨基酸序列，和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12至少90%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是 SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，并且三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:5至少90%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:12至少90%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4至少90%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少90%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:16所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；或所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:5至少90%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少90%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ IDNO:16所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3。
12. 如权利要求10所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4至少95%相同的氨基酸序列，和所述成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12至少95%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQID NO:8所示的CDR-H3，并且三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ IDNO:5至少95%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:12至少95% 相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是 SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4至少95%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少95%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是 SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:16所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；或所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:5至少95%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少95%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:16所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3。
13. 如权利要求10所述的抗体，其中所述成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4至少98%相同的氨基酸序列，和所述成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12至少98%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQID NO:8所示的CDR-H3，并且三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ IDNO:5至少98%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:12至少98%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是 SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:15所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:4至少98%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少98%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是 SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:16所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3；或所述人源化成熟重链可变区具有与SEQ ID NO:5至少98%相同的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有与SEQ ID NO:13至少98%相同的氨基酸序列，其中三个Kabat重链CDR是SEQ ID NO:6所示的CDR-H1、SEQ ID NO:7所示的CDR-H2和SEQ ID NO:8所示的CDR-H3，以及三个Kabat轻链CDR是SEQ ID NO:14所示的CDR-L1、SEQ ID NO:16所示的CDR-L2和SEQ ID NO:17所示的CDR-L3。
14. 如权利要求10所述的抗体，其中所述人源化成熟重链可变区具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列和所述人源化成熟轻链可变区具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
15.如权利要求1所述的抗体，其为完整抗体。
16.如权利要求1所述的抗体，为其抗原结合片段。
17.如权利要求16所述的抗体，其中所述结合片段为单链抗体、Fab或F(ab’)2片段。
18.如权利要求10所述的抗体，其中所述人源化成熟轻链可变区与轻链恒定区融合，并且所述人源化成熟重链可变区与重链恒定区融合。
19.如权利要求18所述的抗体，其中所述重链恒定区为天然人重链恒定区的突变形式，所述突变形式与Fcγ受体的结合相对于所述天然人重链恒定区减少。
20.如权利要求18或19所述的抗体，其中所述重链恒定区具有IgG1同种型。
21. 如权利要求20所述的抗体，其中所述人源化成熟重链可变区与具有SEQ ID NO:23的序列并具有或没有C端赖氨酸的重链恒定区融合，并且/或者所述人源化成熟轻链可变区与具有SEQ ID NO:25的序列的轻链恒定区融合。
22.一种药物组合物，其包含如权利要求1-21中任何一项所述的抗体和药学上可接受的载体。
23.一种核酸，其编码如权利要求1-21中任何一项所述的抗体。
24.一种重组表达载体，其包含如权利要求23所述的核酸。
25.一种用如权利要求24所述的重组表达载体转化的宿主细胞。
26.一种使小鼠抗体人源化的方法，所述方法包括：
(a) 选择一种或多种受体抗体序列；
(b) 鉴定待保留的小鼠抗体的氨基酸残基；
(c) 合成编码包含所述小鼠抗体重链CDR的人源化重链的核酸，和编码包含所述小鼠抗体轻链CDR的人源化轻链的核酸；以及
(d) 在宿主细胞中表达所述核酸以产生人源化抗体；
其中所述小鼠抗体包含SEQ ID NO:1的成熟重链可变区，以及SEQ ID NO:9的成熟轻链可变区。
27. 一种生产人源化抗体、嵌合抗体或贴面化抗体的方法，所述方法包括：
(a) 培养用编码所述抗体的重链和轻链的核酸转化的细胞，使得所述细胞分泌所述抗体；以及
(b) 纯化来自细胞培养基的所述抗体；
其中所述抗体为包含SEQ ID NO:1的成熟重链可变区和SEQ ID NO:9的成熟轻链可变区的抗体的人源化形式、嵌合形式或贴面化形式。
28.一种产生细胞系的方法，所述细胞系产生人源化抗体、嵌合抗体或贴面化抗体，所述方法包括：
(a) 将编码抗体重链和轻链和可选择标记的载体引入细胞中；
(b) 在选择具有增加的所述载体的拷贝数的细胞的条件下繁殖所述细胞；
(c) 从所选细胞中分离单细胞；以及
(d) 将由基于抗体产量选择的单细胞克隆的细胞入库；
其中所述抗体为包含SEQ ID NO:1的成熟重链可变区和SEQ ID NO:9的成熟轻链可变区的抗体的人源化形式、嵌合形式或贴面化形式。
29. 如权利要求28所述的方法，其还包括在选择性条件下繁殖所述细胞，以及筛选天然表达并分泌至少100 mg/L/106个细胞/24 h的细胞系。
30.如权利要求1-21中任一项所述的抗体在制备用于抑制或减少受试者中的甲状腺素运载蛋白原纤维形成的药物中的用途，所述受试者患有甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性或处于发展甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的风险中。
31.如权利要求1-21中任一项所述的抗体在制备用于治疗或实现预防受试者中的甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性的药物中的用途。
32.如权利要求30或31所述的用途，其中所述甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性为家族性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性或散发性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性。
33.如权利要求32所述的用途，其中所述家族性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性为家族性淀粉样心肌病(FAC)、家族性淀粉样多发性神经病(FAP)或中枢神经系统选择性淀粉样变性(CNSA)。
34.如权利要求32所述的用途，其中所述散发性甲状腺素运载蛋白淀粉样变性为老年全身性淀粉样变性(SSA)或老年心脏淀粉样变性(SCA)。
35.如权利要求30或31所述的用途，其中所述甲状腺素运载蛋白介导的淀粉样变性与所述受试者的心脏、周围神经系统、自主神经系统、肾、眼睛或胃肠道中的淀粉样蛋白积累相关。
36.如权利要求1-21中任一项所述的抗体在制备用于检测受试者中的错误折叠的甲状腺素运载蛋白的药物中的用途，其包括使生物样品与所述的抗体接触。
37.如权利要求36所述的用途，其还包括检测抗体与甲状腺素运载蛋白的结合。
38.如权利要求36或37所述的用途，其还包括将所述抗体与所述生物样品的结合与所述抗体与对照样品的结合进行比较。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述生物样品和所述对照样品包含相同组织来源的细胞。
40.如权利要求36所述的用途，其中所述生物样品为血液、血清、血浆或实体组织。
41.如权利要求38所述的用途，其中所述对照样品为血液、血清、血浆或实体组织。
42.如权利要求38所述的用途，其中所述生物样品和所述对照样品为血液、血清、血浆或实体组织。
43.如权利要求40-42中任一项所述的用途，其中所述实体组织来自心脏、周围神经系统、自主神经系统、肾、眼睛或胃肠道。
44.如权利要求1-21中任一项所述的抗体在制备用于检测生物样品中错误折叠的甲状腺素运载蛋白的存在或不存在的药物中的用途，其包括使疑似包含错误折叠的甲状腺素运载蛋白的生物样品与所述的抗体接触。
45.如权利要求44所述的用途，其还包括检测抗体与甲状腺素运载蛋白的结合。
46.如权利要求44-45中任一项所述的用途，其还包括将所述抗体与所述生物样品的结合与所述抗体与对照样品的结合进行比较。
47.如权利要求46所述的用途，其中所述生物样品和所述对照样品包含相同组织来源的细胞。
48.如权利要求44所述的用途，其中所述生物样品为血液、血清、血浆或实体组织。
49.如权利要求46所述的用途，其中所述对照样品为血液、血清、血浆或实体组织。
50.如权利要求46所述的用途，其中所述生物样品和所述对照样品为血液、血清、血浆或实体组织。
51.如权利要求48-50中任一项所述的用途，其中所述实体组织来自心脏、周围神经系统、自主神经系统、肾、眼睛或胃肠道。
52.如权利要求1-21中任一项所述的抗体在制备用于测定受试者中的甲状腺素运载蛋白沉积物的水平的药物中的用途，所述测定是通过施用所述的抗体，以及检测所述受试者中的结合抗体的存在。
53.如权利要求52所述的用途，其中结合抗体的存在通过正电子发射断层摄影术(PET)来确定。
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