MX2007011160A

MX2007011160A - Conjugados de alergenos de gato y usos de los mismos.

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Publication number: MX2007011160A
Application number: MX2007011160A
Authority: MX
Inventors: Martin Bachmann; Monika Bauer; Klaus Dietmeier; Nicole Schmitz; Stephan Utzinger
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2007-11-13
Also published as: WO2006097530A2; CN103203016A; PT1868642E; RU2007138265A; CN101141979A; PL1868642T3; IL185103A0; RU2414239C2; US20090175896A1; JP2013155176A; JP2008535800A; US20110045013A1; CY1114171T1; US20130344098A1; WO2006097530A3; CA2599218A1; AU2006224529B2; EP1868642A2; US7767212B2; BRPI0608455A2

Abstract

La presente invencion esta en los campos de medicina, salud publica, inmunologia, biologia molecular y virologia. La invencion proporciona composiciones que comprenden una particula tipo virus (VLP) o una particula de virus y al menos un antigeno, particularmente por lo menos un antigeno felino, y mas particularmente por lo menos un antigeno felino que es un alergeno humano. En ciertas modalidades, el antigeno es un antigeno Fel d1 o un fragmento del mismo, enlazado covalentemente a la VLP. La invencion proporciona tambien metodos para producir las composiciones. Las composiciones de la invencion inducen respuestas inmunes eficientes, en particular respuestas de anticuerpos, en mamiferos, particularmente humanos. Las composiciones y metodos de la invencion son utiles en la produccion de vacunas, en particular para el tratamiento y/o prevencion de alergias a escamas de piel de gato y a otros antigenos y alergenos de gato.

Description

CONJUGADOS DE ALÉRGENOS DE GATO Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la invención La presente invención está en los campos de medicina, salud pública, inmunología, biología molecular y virología. La invención proporciona composiciones que comprenden una partícula tipo virus (VLP, por sus siglas en inglés) o una partícula de virus y al menos un antígeno, particularmente por lo menos un antígeno felino, y más particularmente por lo menos un antígeno felino que es un alérgeno humano. En ciertas modalidades, el antígeno es un antígeno Fel di o un fragmento del mismo, enlazado covalentemente a la VLP. La invención proporciona también métodos para producir las composiciones. Las composiciones de la invención inducen respuestas inmunes eficientes, en particular respuestas de anticuerpos, en mamíferos, particularmente humanos. Las composiciones y métodos de la invención son útiles en la producción de vacunas, en particular para el tratamiento y/o prevención de alergias a escamas de piel de gato y a otros antígenos y alérgenos de gato. Antecedentes de la invención El gato doméstico ( Felis domestí cus) es una fuente importante de alérgenos en interiores (Lau, S., et al . , (2000) Lancet 356, 1392-1397) . De hecho, los gatos se REF. : 185194 encuentran en aproximadamente 25% de los hogares en los países occidentales y la alergia a gatos se encuentra en gran parte de la población. La severidad de los síntomas varían de rinitis relativamente leve y conjuntivitis a exacerbación asmática potencialmente amenazadora de la vida. Aunque los pacientes son ocasionalmente sensibilizados a varias moléculas diferentes en escamas de piel y pieles de gatos, el principal alérgeno es Fel di (es decir, alérgeno 1 de Felis domes ti cus ; antiguamente Cat 1, es decir, alérgeno 1 de gato) . La importancia de este alérgeno ha sido enfatizada en numerosos estudios. De hecho más de 80% de los pacientes alérgicos a los gatos exhiben anticuerpos IgE a este potente alérgeno (van Ree, R. , et al . , (1999) J. Allergy Clin Immunol . 104, 1223-1230) . Fel di es una glicoproteína acida de 35-39 kDa que contiene 10-20% de carbohidratos N-enlazados y se encuentra en la piel, saliva y glándulas lagrimales de los gatos. Se forma por dos heterodímeros enlazados no covalentemente . Cada heterodímero consiste en un péptido de 70 residuos (conocido como "cadena 1") y un péptido de 78, 85, 90 ó 92 residuos (conocido como "cadena 2") los cuales son codificados por genes separados (véase, Duffort, 0. A., et al. (1991) Mol Immunol 28, 301-309; Morgenstern, J. P., et al; (1991) Proc Nati Acad Sci USA 88, 9690-9694 y Griffith, I. J., et al. (1992) Gene 113, 263-268).

El tratamiento de pacientes alérgicos a los gatos es actualmente afectado por terapia de desensibilización que incluye inyecciones repetidas con dosis cada vez más altas ya sea de un extracto crudo de escamas de piel de gato o péptidos cortos derivados de Fel di. Lilja et al y Hedlin et al han descrito un programa de desensibilización en el curso en el cual extractos crudos de escamas de piel de gato han sido dados a pacientes alérgicos a los gatos (Lilja, Q, et al. (1989) J Allergy Clin Immunol 83, 37-44 y Hedlin, et al. (1991) J Allergy Clin Immunol 87, 955-964). Este programa tardó por lo menos de dos a tres años y los pacientes después de cada tratamiento de tres años aún tuvieron síntomas sistémicos. Usando péptidos cortos derivados de Fel di para la desensibilización dio como resultado una diferencia no significativa entre el grupo de péptidos y el grupo de placebo (Oldfield, . L. , et al. (2002) Lancet 360, 47-53). La eficacia sólo se observó cuando grandes cantidades (750 µg) del péptido corto fueron dadas a los pacientes (Norman, P. S., et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 154, 1623-1628) . Los efectos secundarios alérgicos, tales como reacciones asmáticas tardías, se han reportado tanto en el tratamiento con extracto crudo de escamas de piel de gato como en el tratamiento con péptidos cortos. Por lo tanto, el choque anafiláctico debido al alérgeno inyectado es una preocupación de gran seguridad para cualquier programa de desensibilización. Evitar este efecto al reducir la cantidad inyectada de alérgeno, sin embargo, o reduce la eficacia del tratamiento o prolonga el tratamiento. Así, existe una gran necesidad en el campo del tratamiento de alergias a los gatos por regímenes de desensibilización alternativos, y de esta manera en particular para regímenes de desensibilización que sean capaces de reducir síntomas alérgicos, pero no desencadenar una reacción secundaria alérgica. Breve descripción de la invención Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente ahora que las composiciones y vacunas de la invención, respectivamente, que comprenden por lo menos un antígeno Fel di o fragmento del mismo de la invención, no sólo son capaces de inducir respuestas inmunes contra Fel di, y de esta manera en particular respuestas de anticuerpos, sino que, además, son capaces de desensibilizar un paciente que sufra de alergia a los gatos, y en particular, dentro de un corto periodo de tiempo, indicando la alta eficacia de las composiciones y vacunas de la invención, respectivamente, además, se ha encontrado sorprendentemente que Fel di de la invención, cuando se enlaza covalentemente a la VLP de acuerdo con la invención, ha reducido dramáticamente la actividad anafiláctica en comparación con Fel di de la invención no enlazado covalentemente a VLP en tanto que conserva un alto grado de antigenicidad e inmunogenicidad. Esto es de gran ventaja sobre los tratamientos para alergias de gatos de la técnica anterior debido a que las composiciones y vacunas de la invención, respectivamente, reducen dramáticamente el riesgo de causar choque anafiláctico en animales y humanos que serán inmunizados. Más aún, las composiciones y vacunas de la invención, respectivamente, permiten que el antígeno sea dado en una dosis mucho más alta en comparación con los tratamientos para alergia contra gatos de la técnica anterior, los cuales pueden a su vez mejorar la eficacia y/o acortar el programa de desensibilización completo. Así, las composiciones y vacunas de la invención, respectivamente, inducen potentes respuestas inmunes anti-Fel di pero no desencadenan una reacción alérgica. De esta manera, en el primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende (a) una partícula nuclear con al menos un primer sitio de fijación, en donde la partícula nuclear es una partícula tipo virus (VLP) o una partícula de virus y (b) por lo menos un antígeno con al menos un segundo sitio de fijación, en donde el por lo menos un antígeno es proteína Fel di o un fragmento de Fel di y en donde (a) y (b) son enlazados covalentemente a través del por lo menos un primero y el por lo menos un segundo sitio de fijación, de preferencia para formar una disposición de antígenos ordenada y repetitiva. En otro aspecto, la invención proporciona una composición de vacuna. Además, la presente invención proporciona un método para administrar la composición de vacuna a un humano o a un mamífero no humano, tal como un perro el cual sea alérgico a gatos, de preferencia a Fel di de gato. En una modalidad preferida, la composición de vacuna comprende además por lo menos un adyuvante . La composición de vacuna de la invención es, sin embargo, capaz de inducir fuertes respuestas inmunes, en particular respuestas de anticuerpos, sin la presencia de al menos un adyuvante. De esta manera, en una modalidad preferida, la vacuna está libre de un adyuvante. Al evitar usar adyuvantes se puede reducir una posible ocurrencia de efectos secundarios relacionados con el uso de adyuvantes. En una modalidad preferida, la VLP comprendida por la composición y la composición de vacuna, respectivamente, se reproduce recombinantemente en un huésped y la VLP está esencialmente libre de ARN del huésped, de preferencia de ácidos nucleicos del huésped. Es adecuado reducir, o de preferencia limitar, la cantidad de huésped, de preferencia libre de ácidos nucleicos huéspedes, para evitar respuestas de células T no deseadas así como otros efectos secundarios no deseados, tales como fiebre. En una modalidad preferida, la composición de la invención comprende además por lo menos una sustancia inmunoestimuladora, de preferencia por lo menos un ácido nucleico inmunoestimulador . En una modalidad preferida más, el ácido nucleico inmunoestimulador está empacado dentro de la VLP de la invención. La inclusión de sustancias inmunoestimuladoras, de preferencia ácidos nucleicos inmunoestimuladores, en la composición de la invención puede conducir las respuestas inmunes hacia respuestas Thl y de esta manera suprimir las respuestas Th2 y por consiguiente suprimir la producción de IgE. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar alergia a gatos al administrar una composición o vacuna de la invención, respectivamente, a un objeto alérgico a gatos, de preferencia un humano. En un aspecto más, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la composición de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable . De nuevo en otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para producir la composición de la invención, que comprende (a) una partícula nuclear con al menos un primer sitio de fijación, en donde la partícula nuclear es una partícula tipo virus (VLP) o una partícula de virus; (b) por lo menos un antígeno con al menos un segundo sitio de fijación, en donde el antígeno es proteína Fel di o un fragmento de Fel di y (c) combinar la partícula nuclear y el por lo menos un antígeno para producir la composición, en donde el por lo menos un antígeno y la partícula nuclear se enlazan a través del primero y del por lo menos un segundo sitios de fijación. En un aspecto, la invención proporciona una proteína de fusión Fel di que comprende la cadena 1 de Fel di y cadena 2 de Fel di fusionadas mediante un separador de aminoácidos, el cual enlaza el término N de una cadena con el término C de otra cadena, en donde el separador de aminoácidos consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 10-30 residuos de aminoácido, y en donde la proteína de fusión se produce en E . coli o en donde la proteína de fusión no es glicosilada. Breve descripción de las figuras La figura 1 muestra las proteínas de fusión Fel di purificadas y renaturalizadas teñidas con Coomassie sobre gel no reductor SDS-PAGE. Las muestras en la línea 1 tuvieron DTT como agente reductor. Las muestras en la línea 2 no tuvieron DTT. La figura 2 muestra la desgranulación de basófilos ya sea por las proteínas de fusión Fel di solas o por las proteínas de fusión Fel di acopladas a Qß . El eje X representa la concentración de la proteína Fel di correspondiente. El eje Y representa el porcentaje de basófilos que han sido desgranulados. La figura 3 muestra los resultados de pinchazo de piel de un voluntario alérgico a gatos quien recibió Qß Fel di el día 0, 7 y 14 y las pruebas también se llevaron a cabo el día de 0, 14 y 21. La figura 4A muestra la puntuación en la escalada de dosis nasal y la puntuación general nasal (figura 4B) de un voluntario alérgico a gatos quien recibió Qß-FELD 1 el día 0, 7 y 14 y las pruebas también se llevaron a cabo el día 0, 14 y 21. Descripción detallada de la invención A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por alguien de capacidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Adyuvante: el término "adyuvante" según se usa en la presente se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta inmune o a sustancias que permiten la generación de un depósito en el huésped que cuando se combina con la vacuna y composición farmacéutica, respectivamente, de la presente invención pueden proporcionar una respuesta inmune incrementada todavía más . Una variedad de adyuvantes pueden usarse. Ejemplos incluyen adyuvante de Freund completo e incompleto, hidróxido de aluminio y dipéptido de muramilo modificado. Los adyuvantes adicionales son geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa en forma de cerradura, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette Guerin) y Corinebacteri um parvum . Estos adyuvantes también se conocen bien en la técnica. Los adyuvantes adicionales que pueden administrarse con las composiciones de la invención incluyen, pero no están limitados a, inmunomodul dor de lípido de monofosforilo, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio (alumbre), MF-59, OM-174, OM- 197, OM-294 y tecnología adyuvante virosómica. Los adyuvantes también pueden comprender una mezcla de estas sustancias. La VLP ha sido descrita generalmente como un adyuvante. Sin embargo, el término "adyuvante" según se usa en el contexto de esta solicitud, se refiere a un adyuvante que no es la VLP fusionada para las composiciones de la invención, más bien además de la VLP. Antígeno: según se usa en la presente, el término "antígeno" se refiere a una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo o un receptor de células T (TCR) si se presenta por moléculas MHC. El término "antígeno", según se usa en la presente, también abarca epítopes de células T. Un antígeno es capaz además de ser reconocido por el sistema inmunológico y/o siendo capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o respuesta inmune celular que lleve a la activación de linfocitos B y/o T. Sin embargo, esto podría requerir que al menos en ciertos casos, el antígeno contenga o esté enlazado a un epítope de células Th y se dé en adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopes (epítopes B y T) . La reacción específica mencionada arriba intenta indicar que el antígeno de preferencia reaccionará, típicamente de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo o TCR correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos o TCRs que pudieran ser evocados por otros antígenos. Los antígenos según se usa en la presente pueden ser también mezclas de varios antígenos individuales . Sitio antigénico: el término "sitio antigénico" y el término "epítope antigénico", los cuales se usan en la presente indistintamente, se refieren a porciones continuas o discontinuas de un polipéptido, el cual puede unirse inmunoespecíficamente por un anticuerpo o por un receptor de células T dentro del contexto de una molécula MHC. La unión inmunoespecífica excluye la unión no específica pero no necesariamente excluye la reactividad cruzada. El sitio antigénico comprende típicamente 5-10 aminoácidos en una conformación espacial la cual es única para el sitio antigénico. Asociado: el término "asociado" (o su sustantivo asociación) según se usa en la presente se refiere a todas las formas posibles, de preferencia interacciones químicas, mediante las cuales dos moléculas se unen juntas. Las interacciones químicas incluyen interacciones covalentes y no covalentes. Ejemplos típicos de interacciones no covalentes son interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas o enlaces de hidrógeno, mientras que las interacciones covalentes se basan, a manera de ejemplo, en enlaces covalentes tales como éster, éter, fosfoéster, amida, péptidos, enlaces carbono- fósforo, enlaces carbono-azufre tales como tioéter o enlaces de imida. Sitio de fijación, primero: según se usa en la presente, la frase "primer sitio de fijación" se refiere a un elemento que ocurre naturalmente con la VLP o que se agrega artificialmente a la VLP, y al cual se le puede enlazar el segundo sitio de fijación. El primer sitio de fijación puede ser una proteína, un polipéptido, un aminoácido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digooxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo) , o un grupo químicamente reactivo tal como un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo, un grupo guanidilo, un grupo histidinilo o una combinación de los mismos. Una modalidad preferida de un grupo químicamente reactivo que es el primer sitio de fijación es el grupo amino de un aminoácido tal como lisina. El primer sitio de fijación se ubica, típicamente sobre la superficie, y de preferencia sobre la superficie exterior de la VLP. Varios primeros sitios de fijación están presentes sobre la superficie, de preferencia sobre la superficie exterior de la partícula tipo virus, típicamente en una configuración repetitiva. En una modalidad preferida el primer sitio de fijación está asociado con la VLP, a través de la menos un enlace covalente, de preferencia a través de al menos un enlace péptido. En una modalidad preferida más el primer sitio de fijación ocurre naturalmente con la VLP. Como alternativa, en una modalidad preferida el primer sitio de fijación es añadido artificialmente a la VLP. Sitio de fijación, segundo: según se usa en la presente, la frase "segundo sitio de fijación" se refiere a un elemento que ocurre naturalmente con o el cual se añade artificialmente a Fel di de la invención y al cual se puede enlazar el primer sitio de fijación. El segundo sitio de fijación de Fel di puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un compuesto o metabolito secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de polifenilmetilsulfonilo) , o un grupo químicamente reactivo tal como un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo, un grupo guanidilo, un grupo histidinilo o una combinación de los mismos. Una modalidad preferida de un grupo químicamente reactivo que sea el segundo sitio de fijación es el grupo sulfhidrilo, de preferencia de un aminoácido cisteína. Los términos "Fel di de la invención con al menos un segundo sitio de fijación" se refiere, por lo tanto, a una construcción que comprende el Fel di de la invención y al menos un segundo sitio de fijación. Sin embargo, en particular para un segundo sitio de fijación, el cual no ocurre naturalmente con el Fel di de la invención, esta construcción típicamente y de preferencia comprende además un "enlazador" . En otra modalidad preferida el segundo sitio de fijación está asociado con el Fel di de la invención a través de al menos un enlace covalente, de preferencia a través de por lo menos un enlace péptido. En una modalidad más, el segundo sitio de fijación ocurre naturalmente dentro del Fel di de la invención. En otra modalidad preferida más, el segundo sitio de fijación se añade artificialmente al Fel di de la invención a través de un enlazador, en donde el enlazador comprende o consiste alternativamente en una cisteína. De preferencia, el enlazador se fusiona al Fel di de la invención por un enlace péptido. Proteína de cápside: el término "proteína de recubrimiento" y el término usado indistintamente "proteína de cápside" dentro de esta solicitud, se refiere a una proteína viral, de preferencia una subunidad de una cápside natural de un virus, de preferencia de ARN-fago la cual es capaz de ser incorporada en una cápside de virus o un VLP. Fel di de la invención: el término "Fel di de la invención", según se usa en la presente, se refiere a por lo menos una proteína Fel di o por lo menos un fragmento de Fel di. Cadena 1 de Fel di: El término "cadena 1 de Fel di", según se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende o consiste alternativamente en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 22 o una secuencia homologa de la misma. El término "secuencia homologa de SEQ ID NO: 22", según se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad a SEQ ID NO: 22 que es mayor que 70%, de preferencia mayor que 80%, muy preferiblemente más de 90% y aún más preferiblemente más de 95%. El término "cadena 1 de Fel di", según se usa en la presente, también debe referirse a un polipéptido que abarque por lo menos una modificación post-traduccional, incluyendo pero no limitada a al menos un sitio de glicosilación, de la cadena de Fel di, como se definió en la presente. De preferencia, la cadena 1 de Fel di, como la definida en la presente, consiste en cuando mucho 130, todavía muy preferiblemente al menos 100 aminoácidos en total.

La cadena 2 de Fel di: el término "cadena 2 de Fel di", según se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende o consiste alternativamente en una secuencia de aminoácidos como la mostrada en SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26, o una secuencia homologa de la misma. El término secuencia homologa de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26", según se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad con SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26 que es mayor que 70%, de preferencia mayor que 80%, muy preferiblemente mayor que 90% y todavía más preferiblemente mayor de 95%. El término "cadena 2 de Fel di", según se usa en la presente, también se debe referir a un polipéptido que abarque al menos una modificación post-traduccional, incluyendo pero no limitada a por lo menos una glicosilación, de la cadena 2 de Fel di, como se definió en la presente. De preferencia, la cadena 2 de Fel di, como la definida en la presente, consiste en cuando mucho 150, preferiblemente cuando mucho 130, muy preferiblemente cuando mucho 100 aminoácidos en total. Proteína Fel di: el término "proteína Fel di" según se usa en la presente, se refiere a una proteína que comprende o consiste alternativamente en la cadena 1 de Fel di y cadena 2 de Fel di. De preferencia, la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di son enlazadas covalentemente. En una modalidad preferida, la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di son enlazadas por medio de al menos un enlace de disulfuro. En otra modalidad preferida, la cadena 1 y cadena 2 se fusionan ya sea directamente o por medio de un separador, en cuyo caso la proteína Fel di comprende además o consiste alternativamente en un separador. De preferencia, la proteína Fel di, como la descrita en la presente, consiste en cuando mucho 300, muy preferiblemente cuando mucho 200 aminoácidos en total. Típicamente, y de preferencia, la proteína Fel di de acuerdo con la invención, es capaz de inducir in vivo la producción de anticuerpos que se unan específicamente ya sea a la Fel di que ocurre naturalmente o a la Fel di recombinante como el producido de acuerdo con el ejemplo 5 de la presente invención. Fragmento de Fel di: El término "fragmento de Fel di", según se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende o que alternativamente consiste en por lo menos un sito antigénico de Fel di. Típicamente, y de preferencia el término "fragmento de Fel di" según se usa en la presente, se refiere a un polipéptido que comprende o que alternativamente consiste en por lo menos dos sitios antigénicos de Fel di. De preferencia, los sitios antigénicos están unidos covalentemente, muy preferiblemente los sitios antigénicos están enlazados al menos por un enlace péptido, en cuyo caso un separador entre los sitios antigénicos puede necesitarse. De preferencia, los por lo menos dos sitios antigénicos derivan tanto de la cadena 1 de Fel di como de la cadena 2 de Fel di. De preferencia, el fragmento Fel di, como el definido en la presente, consiste en cuando mucho 130, muy preferiblemente cuando mucho 100, más preferiblemente 60 aminoácidos en total. Típicamente, y de preferencia, el fragmento Fel di es capaz de inducir in vivo la producción de anticuerpos que se unan específicamente ya sea al Fel di que ocurre naturalmente o al Fel di recombinante como el producido de acuerdo con el ejemplo 5 de la presente invención. Enlazado: el término "enlazado" (o su sustantivo: enlace) según se usa en la presente, se refiere a todas las formas posibles de preferencia interacciones químicas, mediante las cuales por lo menos un primer sitio de fijación y el segundo por lo menos un sitio de fijación se unen juntos. Las interacciones químicas incluyen interacciones covalentes y no covalentes. Ejemplos típicos de interacciones no covalentes son interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas o enlaces de hidrógeno, en donde las interacciones covalentes se basan, a manera de ejemplo, en enlaces covalentes tales como éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, enlaces carbono-fósforo, enlaces carbono-azufre tales como tioéter o enlaces de imida. En ciertas modalidades preferidas el primer sitio de fijación y el segundo sitio de fijación se enlazan a través de al menos un enlace covalente, de preferencia a través de por lo menos un enlace no péptido, y aún más preferiblemente a través de enlaces exclusivamente no péptidos. El término "enlazado" según se usa en la presente, sin embargo, no sólo deberá abarcar un enlace directo del por lo menos un primer sitio de fijación y el por lo menos un segundo sitio de fijación sino que también, como alternativa y de preferencia, un enlace indirecto de por lo menos un primer sitio de fijación y el segundo sitio de fijación a través de moléculas intermedias, y de esta manera típicamente y de preferencia al usar por lo menos uno, de preferencia un enlazador heterobifuncional . Enlazador: un "enlazador", según se usa en la presente, asocia el segundo sitio de fijación con Fel di de la invención o comprende fácilmente, consiste esencialmente en, o consiste en el segundo sitio de fijación. De preferencia, un "enlazador" según se usa en la presente, ya comprende el segundo sitio de fijación, típicamente y preferiblemente, pero no necesariamente, como un residuo de aminoácido, de preferencia un residuo de cisteína. Un "enlazador" según se usa en la presente también es llamado "enlazador de aminoácido" en particular con un enlazador de acuerdo con la invención contiene por lo menos un residuo de aminoácido. Así, los términos "enlazador" y "enlazador de aminoácidos" se usan indistintamente en la presente. Sin embargo, esto no implica que este enlazador consiste exclusivamente en residuos de aminoácido, incluso si un enlazador que consiste en residuos de aminoácido es una modalidad preferida de la presente invención. Los residuos de aminoácido del enlazador son, de preferencia, compuestos de aminoácidos que ocurren naturalmente o aminoácido no naturales conocidos en la técnica, todo-L o todo-D o mezclas de los mismos. Modalidades preferidas adicionales de un enlazador de acuerdo con esta invención son moléculas que comprende un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína y estas moléculas están, por lo tanto, abarcadas también dentro de esta invención. Los enlazadores adicionales y útiles para la presente invención son moléculas que comprenden una porción alquilo de C1-C6, cicloalquilo tal como una porción ciclopropilo o ciciohexilo o ciclopentilo, cicloalquenilo, arilo o heteroarilo. Además, los enlazadores que comprenden de preferencia una porción alquilo de C1-C6, y cicloalquilo (C5, C6) , arilo o heteroarilo y aminoácidos adicionales también se pueden usar como enlazadores para la presente invención y deberán ser abarcados dentro del alcance de la misma. La asociación del enlazador con el Fel di de la invención se lleva a cabo de preferencia a manera de al menos de un enlace covalente, muy preferiblemente por medio de al menos un enlace de péptido. Disposición de antígenos ordenada y repetitiva: según se usa en la presente, el término "disposición de antígenos ordenada y repetitiva" se refiere generalmente a un patrón de repetición de antígenos, o caracterizado por un orden de uniformidad típicamente y preferiblemente más alto en la disposición espacial de los antígenos con respecto a las partículas tipo virus, respectivamente. En una modalidad de la invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Ciertas modalidades de la invención, tales como antígenos acoplados a la VLP de fagos de ARN, son ejemplos típicos y preferidos de disposiciones de antígenos ordenadas y repetitivas adecuadas que incluyen, además, ordenes para cristalinos de antígenos repetitivos estrictamente, de preferencia con separaciones de 1 a 30 nanómetros, preferiblemente 2 a 15 nanómetros, muy preferiblemente 2 a 10 nanómetros, más preferiblemente 2 a 8 nanómetros y aún más preferiblemente 1.6 a 7 nanómetros. Empacado: el término "empacado", según se usa en la presente, se refiere al estado de una macromolécula polinaniónica o sustancias inmunoestimuladoras en relación con la VLP. El término "empacado" según se usa en la presente, incluye unión que puede ser covalente, por ejemplo, mediante acoplamiento químico, o no covalente, por ejemplo, interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, etc. El término también incluye el encierro o encierro parcial de una macromolécula polianiónica. Así, la macromolécula polianiónica o sustancias inmunoestimuladoras pueden encerrarse por la VLP sin la existencia de una unión real, en particular de una unión covalente. En modalidades preferidas, la por lo menos una macromolécula polianiónica o sustancias inmunoestimuladoras se empaca dentro de la VLP, muy preferiblemente de una manera no covalente. Separador: el término "separador" así como su término equivalentemente usado "separador de aminoácidos", según se usa en la presente, se refiere a un tramo de secuencia de aminoácidos, el cual no tiene más de 30 aminoácidos y el cual enlaza el término L de una cadena con el término C de otra cadena de Fel di. Partícula de virus : el término "partícula de virus" según se usa en la presente, se refiere a la forma morfológica de un virus . En algunos tipos de virus comprende un genoma rodeado por una cápside de proteína; otros tienen estructuras adicionales (por ejemplo, envolturas, colas, etc. ) . Partícula tipo virus (VLP) , según se usa en la presente, se refiere a una proteína de virus no replicativa o no infecciosa, de preferencia una partícula de virus no replicativa y no infecciosa, o se refiere a una estructura que simula una partícula de virus no replicativa o no infecciosa, de preferencia una estructura que simule una partícula de virus no replicativa y no infecciosa, de preferencia una cápside de un virus. El término "no replicativo" según se usa en la presente, se refiere a que es incapaz de replicarse el genoma comprendido por la VLP. El término "no infeccioso", según se usa en la presente, se refiere a ser incapaz de entrar en la célula huésped. De preferencia, una partícula de virus de acuerdo con la invención no es replicativa y no es infecciosa toda vez que carece de todo o parte del genoma viral o función genómica. En una modalidad, una partícula tipo virus es una partícula de virus, en la cual el genoma viral ha sido física o químicamente inactivado. Típicamente y más preferiblemente, una partícula tipo virus carece de todo o parte de los componentes replicativos e infecciosos del genoma viral. Una partícula tipo virus de acuerdo con la invención puede contener ácido nucleico que sea diferente al de su genoma. Una modalidad típica y preferida de una partícula tipo virus de acuerdo con la presente invención es una cápside viral tal como la cápside viral del virus correspondiente, bacteriófago, fago de preferencia fago de ARN. Los términos "cápside viral" o "cápside", se refieren a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteínas virales. Típicamente, hay 60, 120, 180, 240, 300, 360 y más de 360 subunidades de proteínas virales . Típicamente y de preferencia, las interacciones de estas subunidades llevan a la formación de la cápside viral o estructura tipo cápside viral con una organización repetitiva inherente, en la que esa estructura es, típicamente, esférica o tubular. Por ejemplo, las cápsides de fagos de ARN o HBcAgs tienen una forma esférica de simetría icosaédrica. El término "estructura tipo cápside" según se usa en la presente, se refiere a un ensamble macromolecular compuesto de subunidades de proteínas virales que simulan la morfología de la cápside en el sentido definido arriba pero desviándose del ensamble simétrico típico mientras mantiene un grado de orden y repetitividad suficiente. Una característica común de esta partícula de virus y partícula tipo virus es su disposición altamente ordenada y repetitiva de sus subunidades. Partícula tipo virus de un fago de ARN: según se usa en la presente, el término "partícula tipo virus de un fago de ARN" se refiere a una partícula tipo virus que comprende, o de preferencia consiste esencialmente en o consiste en proteínas de cápside, mutantes o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN. Además, la partícula tipo virus de un fago de ARN que simula la estructura de un fago de ARN, que no es replicativo y/o no infeccioso, y que carece al menos del gen o genes que codifican para la maquinaria de replicación del fago de ARN, y típicamente que carece también del gen o genes que codifican para la proteína o proteínas responsables de la fijación viral o de la entrada en la célula huésped. Esta definición debe sin embargo, abarcar también partículas tipo virus de fago de ARN en las cuales el gen o genes mencionados anteriormente aún estén presentes pero inactivos, y, por lo tanto, lleven también a partículas tipo virus no replicativas y/o no infecciosas de un fago de ARN. Las VLPs preferidas derivadas de fagos de ARN exhiben simetría icosaédrica y consisten en 180 subunidades. Dentro de esta presente descripción el término "subunidad" y "monómero" se usan de manera indistinta y equivalente, dentro de este contexto. En esta solicitud, el término "fago de ARN" y el término "bacteriófago de ARN" se usan indistintamente. Los métodos preferidos para hacer una partícula tipo virus de un fago de ARN no replicativa y/o no infecciosa es mediante la activación física, química, tal como radiación UV, tratamiento con formaldehído, típicamente y de preferencia mediante manipulación genética. Un, uno o una: cuando los términos "un", "uno" o "una" se usan en esta descripción significan "por lo menos uno" o "uno o más" a menos que se indique lo contrario. La identidad de secuencia de aminoácidos de polipéptidos puede determinarse convencionalmente usando programas de computadora conocidos tales como el programa Bestfit. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias, de preferencia usando Bestfit, para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, los parámetros se establecen de tal manera que el porcentaje de identidad se calcule sobre la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de referencia y esos espacios en homología de hasta 5% del número total de residuos de aminoácido en la secuencia de aminoácidos de referencia se permiten. Este método mencionado anteriormente para determinar el porcentaje de identidad entre polipéptidos es aplicable a todas las proteínas, polipéptidos o un fragmento de las mismas descrito en esta invención. En esta solicitud, los anticuerpos se definen como de unión específica si se unen al antígeno con una afinidad de unión (Ka) de 10s M"1 o más, de preferencia 107 M"1 o más, muy preferiblemente 108 M"1 o más y más preferiblemente 109 M"1 o más. La afinidad de un anticuerpo puede determinarse fácilmente por alguien de capacidad ordinaria en la técnica (por ejemplo, mediante análisis de Scatchard) . Esta invención proporciona composiciones de la invención que comprenden: (a) una partícula nuclear con por lo menos un primer sitio de fijación, en donde la partícula nuclear es una partícula tipo virus (VLP) o una partícula de virus y (b) al menos un antígeno con por lo menos un segundo sitio de fijación, en donde el por lo menos un antígeno es una proteína Fel di o un fragmento de Fel di y en donde (a) e (b) son enlazados covalentemente a través del por lo menos un primero y el por lo menos un segundo sitio de fijación. De preferencia, una proteína Fel di o un fragmento de Fel di es enlazada a la partícula nuclear, para formar así una disposición de antígeno VLP ordenada y repetitiva. En modalidades preferidas de la invención, al menos 20, de preferencia al menos 30, muy preferiblemente al menos 60, más preferiblemente al menos 120 y todavía más preferiblemente por lo menos 180 de una proteína Fel di o un fragmento de Fel di es enlazado a la partícula nuclear. Cualquier virus conocido en la técnica que tenga una estructura ordenada y repetitiva puede seleccionarse como una VLP o una partícula de virus de la invención. Los virus de ADN o ARN ilustrativos, la proteína de recubrimiento o cápside de los cuales puede usarse para la preparación de VLPs, han sido descritos en WO 2004/009124 en la página 25, renglones 20-21 y páginas 26, renglones 11-28 y en la página 82, renglón 4 a página 31, renglón 4. Estas descripciones se incorporan en la presente a manera de referencia. El virus o partícula tipo virus pueden producirse o purificarse a partir de un cultivo de células infectadas con virus. El virus o partícula tipo virus resultante para propósitos de vacuna debe de preferencia no ser replicativo o no infeccioso muy preferiblemente no replicativo y no infeccioso. Irradiación UV, tratamiento químico, como con formaldehído o cloroformo, son los métodos generales conocidos por la persona capacitada en la técnica para inactivar virus . En una modalidad preferida, la partícula nuclear es una partícula de virus y en donde la partícula de virus es una partícula de virus de un bacteriófago, y en donde además de preferencia dicho bacteriófago es un fago de ARN, y en donde de manera todavía más preferiblemente el fago de ARN es un fago de ARN seleccionado de Qß, fr, GA o AP205. En una modalidad preferida, la partícula nuclear es una VLP. En una modalidad preferida más, la VLP es una VLP recombinante. Casi todos los virus comúnmente conocidos han sido secuenciados y están fácilmente disponibles para el público. El gen que codifica para la proteína de cápside puede identificarse fácilmente por una persona capacitada. La preparación de VLPs mediante expresión recombinante de la proteína de cápside en un huésped está dentro del conocimiento común de una persona capacitada. En una modalidad preferida, la partícula tipo virus comprende, o como alternativa consiste en, proteínas recombinantes, mutantes o fragmentos de los mismos, de un virus seleccionado el grupo que consiste en: a) fagos de ARN; b) bacteriófagos; c) virus de la hepatitis B, de preferencia su proteína de cápside (Ulrich, et al, Virus Res. 50:141-182 (1998) ) o su proteína de superficie (WO 92/11291) ; d) virus del sarampión (Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)); e) virus Sindbis; f) rotavirus (US 5,071,651 y US 5,374,426); g) virus de la fiebre aftosa (Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995)); h) virus de Norwalk (Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991)); i) Alfavirus; j) retrovirus, de preferencia su proteína GAG (WO 96/30523) ; k) retrotransposón Ty, de preferencia la proteína pl; 1) virus del papiloma humano (WO 98/15631) ; m) virus del Polioma; n) virus del mosaico del Tabaco y o) virus de Flock House. En una modalidad preferida, la VLP comprende, o consiste en, más de una secuencia de aminoácidos, de preferencia dos secuencia de aminoácidos de la proteínas recombinantes, mutantes o fragmento de las mismas. La VLP comprende o consiste en más de una secuencia de aminoácidos es referida en esta aplicación, como VLP de mosaico. El término "fragmento de una proteína recombinante" o el término "fragmento de una proteína de cápside" según se usan en la presente, se definen como un polipéptido, el cual tiene al menos 70%, de preferencia por lo menos 80%, muy preferiblemente por lo menos 90%, todavía más preferiblemente por lo menos 95% de la longitud de la proteína recombinante tipo silvestre, o proteína de cápside, respectivamente y el cual retiene de preferencia la capacidad de formar VLP. De preferencia, el fragmento se obtiene al menos por una supresión interna, al menos un truncado o por lo menos una combinación de los mismos. El término "fragmento de una proteína recombinante" o "fragmento de una proteína de cápside" deberá abarcar además polipéptido, el cual sea al menos 80%, de preferencia 90%, todavía más preferiblemente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el "fragmento de una proteína recombinante" o "fragmento de una proteína de cápside", respectivamente, como los definidos arriba y el cual sea de preferencia capaz de ensamblarse en una partícula tipo virus. El término "proteína recombinante mutante" o el término "mutante de una proteína recombinante" se usan indistintamente en esta invención, o el término "proteína de cápside mutante" o "mutante de proteína de cápside" se usan indistintamente en esta invención, y se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la proteína recombinante tipo silvestre, o proteína de cápside, respectivamente, en donde la secuencia de aminoácidos es al menos 80%, de preferencia al menos 85%, 90%, 95%, 97% o 99% idéntica a la secuencia tipo silvestre y de preferencia conserva la capacidad de ensamblarse en una VLP . En una modalidad preferida, la partícula tipo virus de la invención es del virus de la hepatitis B. La preparación de partículas tipo virus de la hepatitis B ha sido descrita, entre otros, en WO 00/32227, WO 01/85208 y en WO 02/056905. Todos estos tres documentos están expresados explícitamente en la presente a manera de referencia. Otras variantes de HBcAg adecuadas para usarse en la práctica de la presente invención han sido descritas en las páginas 34-39 de WO 02/056905. En modalidades preferidas adicionales de la invención, un residuo de lisina es introducido en el polipéptido HBcAg, para mediar el enlace de Fel di de la invención a la VLP de HBcAg. En modalidades preferidas, las VLPs y composiciones de la invención se preparan usando una HBcAg que comprende, o alternativamente que consiste en, los aminoácidos 144 ó 1-149, 1-185 de SEQ ID NO:20, la cual se modifica de tal manera que los aminoácidos en las posiciones 79 y 80 sean reemplazados con un péptido que tenga la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly . Esta modificación cambia la SEQ ID NO: 20 a SEQ ID NO: 21. En modalidades preferidas adicionales, los residuos de cisteína en las posiciones 48 y 110 de SEQ ID NO: 21, o sus fragmentos correspondientes, de preferencia 1-144 ó 1-149, son mutados a serina. La invención incluye además composiciones que comprenden proteína nuclear de la hepatitis B y mutantes que tienen alteraciones de aminoácidos correspondientes mencionadas arriba. La invención incluye además composiciones y vacunas, respectivamente, que comprenden polipéptido HBcAg que comprenden, o alternativamente consisten en, secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 2 85%, 90%, 95%, 97% ó 99% idénticas a SEQ ID NO:21. En una modalidad preferida de la invención, la partícula tipo virus de la invención, comprende, consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en, proteína de cápside recombinantes, mutantes o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN. De preferencia, el fago de ARN se selecciona del grupo que consiste en a) bacteriófago Qß; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago Mil; h) bacteriófago MXl; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2; 1) bacteriófago PP7 y m) bacteriófago AP205. En una modalidad preferida de la invención, la composición comprende proteína de cápside, mutantes o fragmentos de la misma, de fagos de ARN, en donde la proteína de cápside tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 1 en referencia a Qß CP; (b) una mezcla de SEQ ID NO:l y SEQ ID NO:2.(en referencia a proteína Qß Al); (c) SEQ ID NO:3; (d) SEQ ID NO.-4; (e) SEQ ID NO : 5 ; (f) SEQ ID NO : 6 , (g) una mezcla de SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO : 7 ; (h) SEQ ID NO: 8; (i) SEQ ID NO : 9 ; G) SEQ ID NO: 10; (k) SEQ ID NO: 11; (1) SEQ ID NO: 12; (m) SEQ ID NO: 13; y (n) SEQ ID NO: 14. En una modalidad preferida de la invención, la VLP es una VLP de mosaico que comprende, o alternativamente que consiste en más de una secuencia de aminoácidos, de preferencia dos secuencias de aminoácidos, de proteínas de cápside, mutantes o fragmento de las mismas de un fago de ARN. En una modalidad muy preferida, la VLP comprende, o alternativamente consiste en dos proteínas de cápside diferentes de un fago de ARN, las dos proteínas de cápside han sido una secuencia de aminoácidos como la descrita en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o de SEQ ID NO : 6 y SEQ ID NO : 7. En modalidades preferidas de la presente invención, la partícula tipo virus de la invención comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, proteínas de cápside recombinantes, mutantes o fragmentos de las mismas, del bacteriófago de ARN Qß, fr, AP205 o GA. En una modalidad preferida, la VLP es de un bacteriófago de ARN, de preferencia de un bacteriófago de ARN Qß, fr, AP205 o GA. En una modalidad preferida, la VLP de la invención es una VLP de fago de ARN Qß . La cápside o partícula tipo virus de Qß mostró una estructura de cápside tipo fago icosaédrica con un diámetro de 25 nm y T=3 cuasi simetría. La cápside contiene 180 copias de la proteína de cápside, las cuales son enlazadas en pentámeros y hexámeros covalentes mediante puentes de disulfuro (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-5554 (1996)), llevando una notoria estabilidad de la cápside de Qß . Las cápsides o VLPs hechas a partir de proteína de cápside Qß recombinante pueden contener, sin embargo, subunidades no enlazadas por medio de enlaces de disulfuro a otras subunidades dentro de la cápside, o incompletamente enlazadas. La cápside o VLP de Qß muestra resistencia inusual a solventes orgánicos y agentes de desnaturalización. Sorprendentemente, se han descubierto que DMSO y concentraciones de acetonitrilo tan altas como 30%, y concentraciones de guanidinio tan altas como de 1 M no afectan la estabilidad de la cápside. La alta estabilidad de la cápside o VLP de Qß es una característica adecuada, en particular, para su uso en la inmunización y vacunación de mamíferos y humanos de acuerdo con la invención. Partículas tipo virus preferidas más de los fagos de ARN, en particular de Qß y fr de acuerdo con esta invención se describen en WO 02/056905, cuya descripción completa se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad. Un ejemplo particular 18 de WO 02/056905 dio la descripción detallada de la preparación de partículas de VLP a partir de Qß . En otra modalidad preferida, la VLP de la invención es una VLP de fago de ARN AP205. Formas mutantes y competentes en ensamble de AP205 VLPs, incluyendo una proteína de cápside AP205 con la sustitución de prolina en el aminoácido 5 por treonina, también se puede usar en la práctica de la invención y lleva a otras modalidades preferidas de la misma. WO 2004/007538 describe, en particular en el ejemplo 1 y ejemplo 2, cómo obtener VLP que comprende proteínas de cápside AP205, y de esta manera en particular la expresión y la purificación de las mismas. WO 2004/007538 se incorpora en la presente a manera de referencia. VLPs AP205 son altamente inmunogénicas, y pueden enlazarse con la Fel di de la invención para típica y de preferencia generar construcciones de vacuna que desplieguen la Fel di de la invención orientado de una manera repetitiva. Un alto título de anticuerpos se desarrolla contra la Fel di de la invención desplegada de esta manera, demostrando que la Fel di enlazada de la invención es accesible para interactuar con moléculas de anticuerpo y es inmunogénica. En una modalidad preferida, la VLP de la invención comprende o consiste en una proteína de cápside mutante de un virus, de preferencia un fago de ARN, en donde la proteína de cápside mutante ha sido modificada mediante la remoción de al menos un residuo de lisina a manera de sustitución y/o a manera de supresión. En otra modalidad preferida, la VLP de la invención comprende o consiste en una proteína de cápside mutante de un virus, de preferencia un fago de ARN, en donde la proteína de cápside mutante ha sido modificada mediante la adición de al menos un residuo de lisina a manera de sustitución y/o a manera de inserción. La supresión, sustitución o adición de al menos un residuo de lisina permite variar el grado de acoplamiento, es decir, la cantidad de Fel di de la invención por subunidades de la VLP de un virus, de preferencia de un fago de ARN, en particular, para igualar y diseñar los requerimientos de la vacuna. En una modalidad preferida, las composiciones y vacunas de la invención tienen una densidad de antígenos que es de 0.5 a 4.0. El término "densidad de antígenos", según se usa en la presente, se refiere al número promedio de la Fel di de la invención que es enlazada por subunidad, de preferencia por proteína de cápside de la VLP, y de esta manera de preferencia de la VLP de un fago de ARN. Así, este valor se calcula como un promedio sobre todas las subunidades o monómeros de la VLP, de preferencia de la VLP del ARN- fago en la composición o vacunas de la invención. VLPs o cápsides de la proteína de cápside Qß presentan un número definido de residuos de lisina sobre su superficie, con una topología definida con tres residuos de lisina apuntando hacia el interior de la cápside e interactuando con el ARN, y otros cuatro residuos de lisina expuestos al exterior de la cápside. De preferencia, el por lo menos un primer sitio de fijación es un residuo de lisina que apunta a o que está sobre el exterior de la VLP. Los mutantes Qß, de los cuales los residuos de lisina expuestos son reemplazados por arginina pueden usarse para la presente invención. Así, en otra modalidad preferida de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, consiste esencialmente en o como alternativa consiste en proteínas de cápside Qß mutantes. De preferencia, estas proteínas de cápside mutantes comprenden o como alternativa consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de a) Qß-240 (SEQ ID NO: 15, Lysl3-Arg de SEQ ID NO: 1) b) Qß-243 (SEQ ID NO: 16, AsnlO-Lys de SEQ ID N0:1); c) Qß-250 (SEQ ID NO: 17, Lys2-Arg de SEQ ID NO:l) d) Qß-251 (SEQ ID NO: 18, Lysl6-Arg de SEQ ID NO:l); y e) Qß-259" (SEQ ID NO:19, Lys2-Arg, Lysl6-Arg de SEQ ID NO:l). La construcción, expresión y purificación de las proteínas de cápside mutantes Qß VLPs de proteínas de cápside Qß mutante y cápsides indicadas arriba, respectivamente, se describen en WO 02/056905. En particular se refiere la presente al ejemplo 18 de la solicitud mencionada arriba. En otra modalidad preferida de la presente invención, la partícula tipo virus comprende, o como alternativa consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteína de cápside mutante de Qß, o mutantes o fragmentos de la misma, y la proteína Al correspondiente. En una modalidad preferida más, la partícula tipo virus comprende, o alternativamente consiste esencialmente en, o como alternativa consiste en proteína de cápside mutante con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, ó 19 y la proteína Al correspondiente. Proteínas de cápside de fago de ARN adicionales también han mostradas auto-ensamblarse después de su expresión en un huésped bacteriano (Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238- 242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). En particular, se han descrito las propiedades biológicas y bioquímicas de GA (Ni, CZ . , et al., Protein Sci. 5:2485-2493 (1996), Tars, K et al . , J. MoLBiol . 271:759-773(1997)) y de fr (Pushko P. et al., Prot . Eng. 6:883-891 (1993), Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290, (1994)) . La estructura de cristal de varios bacteriófagos de ARN ha sido determinada (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). Usando esta información, los residuos expuestos en la superficie pueden ser identificados y, así, las proteínas de cápside de fago de ARN pueden modificarse de tal manera que uno o más residuos de aminoácido reactivos pueden insertarse a manera de inserción o sustitución. Otra ventaja de las VLPs derivadas de fagos de ARN es su alto rendimiento de expresión en bacterias que permite la producción de grandes cantidades de material a un costo asequible. En una modalidad preferida, la composición de la invención comprende al menos un antígeno, en donde el por lo menos un antígeno es una proteína Fel di. En una modalidad preferida, la proteína Fel di comprende o como alternativa consiste en una Fel di que ocurre naturalmente. La estructura primaria de la cadena 1 es la secuencia de SEQ ID NO 22. Las variantes reportadas de la cadena 1 son Lys29-Arg o Asn, Val33-Ser, Val60-Leu. La estructura primaria de la cadena 2 es la secuencia de SEQ ID NO 23, 25 ó 26. Las variantes reportadas de la cadena 2 son Cys7-Phe, Phel5-Thr, Asnl9-Ser, Gly20-Leu, Ile55-Val, Arg57-Lys, Val58-Phe de SEQ ID NO: 23, 25 ó 26. Las variantes adicionales de la cadena 2 son Glu69-Val, Tyr70-Asp, Met72-Thr, Gln-77-Glu y Asn86-Lys de SEQ ID NO: 25; Met74-Thr, Gln79-Glu y Asn88-Lys de SEQ ID NO: 23. (Griffith IJ. et al, Gene 113:263-268 (1992); Morgenstern J.P. et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 88:9690-9694 (1991). Duffort O.A., et al Mol. Immunol . 28:301-309 (1991); Leitermann K. , et al, J. Allergy Clin. Im unol . 74:147-153 (1984); Kristensen, A. K, et al. (1997) Biol Chem 378, 899-908). Fel di que ocurre naturalmente se obtiene al purificar por ejemplo, de saliva de gato, escamas de piel de gato, polvo doméstico de una casa en donde viva un gato, etc. En una modalidad preferida, el Fel di de la invención es una proteína Fel di recombinante o un fragmento de Fel di recombinante. La proteína Fel di recombinante o fragmento de Fel di, según se usa en la presente, se refiere a una proteína Fel di o a un fragmento de Fel di que se obtiene mediante un proceso que comprende al menos una etapa de tecnología de ADN recombinante. Los términos "proteína Fel di recombinante o fragmento de Fel di recombinante" y "proteína Fel di producida recombinantemente o fragmento de Fel di producido recombinantemente" se usan indistintamente en la presente y deben tener el significado idéntico. La proteína Fel di recombinante o fragmento puede producirse ya sea en sistemas de expresión procarióticos, tales como E . coli (WO 2004/094639) o en sistemas de expresión eucarióticos, tales como baculovirus (WO 00/2032). Seppálá et al describieron la expresión de la cadena 1 y cadena 2 de Fel di simultáneamente mediante un promotor dicistrónico en baculovirus (J. Biol. Chem. Nov, 2004). La proteína Fel di producida recombinantemente o fragmento puede glicosilarse y no glicosilarse, dependiendo de la célula huésped usada para producir la proteína recombinante. En una modalidad, la proteína Fel di recombinante comprende, o alternativamente consiste en la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di, en donde la cadena 1 de Fel di está asociada con la cadena 2 de Fel di exclusivamente por enlace no covalente, tal como interacciones hidrofóbicas. En una modalidad preferida, la proteína Fel di recombinante comprende, o alternativamente consiste en la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di, en donde la cadena 1 de Fel di está asociada con la cadena 2 de Fel di al menos por un enlace covalente. En una modalidad preferida, el por lo menos un enlace covalente es una enlace no péptido, en donde el no péptido es un enlace de disulfuro y en donde de preferencia el no péptido es un enlace de disulfuro. Por ejemplo, la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di pueden ser expresadas por separado y luego combinarse bajo condiciones que permitan la formación correcta de enlaces de disulfuro, tal como el método de reclasificación. Como alternativa, la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di pueden expresarse simultáneamente en un huésped, por ejemplo, al clonar los genes que codifican para la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di, respectivamente, bajo dos promotores en un plásmido. En un sistema de expresión eucariótico, la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di pueden transcribirse en el ARNm y traducirse por separado mediante un sitio de entrada de ribosomas internos (IRES) . En una modalidad preferida, la proteína Fel di comprende, o como alternativa consiste en una proteína de fusión, en donde la proteína de fusión comprende la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di. En una modalidad preferida, la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di se fusionan directamente mediante un enlace péptido, el cual enlaza el término N de una cadena con el término C de otra cadena. En otra modalidad preferida, la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di se fusionan mediante un separador, el cual enlaza el término N de una cadena con el término C de otra cadena. De preferencia el separador tiene 1 a 30, de preferencia 1-25, preferiblemente 1-20, de preferencia 1-15, preferiblemente 1-9, de preferencia 1-5, preferiblemente 1-3 aminoácidos. Como alternativa, el separador tiene de 10-30, preferiblemente 10-25, muy preferiblemente 10-20, muy preferiblemente 13-20, muy preferiblemente 15-20, muy preferiblemente 13-17, muy preferiblemente 15-17 aminoácidos. De preferencia, el separador consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 residuos de aminoácido. En una modalidad preferida, el separador tiene 15 aminoácidos. En una modalidad preferida más, el separador es (GGGGS)3. En una modalidad preferida, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (a) SEQ ID NO: 24; (b) SEQ ID NO: 54; (c) SEQ ID NO: 55; (d) SEQ ID NO: 56; y (e) SEQ ID NO: 57. En una modalidad preferida, la cadena 2 de Fel di se fusiona por medio de su término C al término N de la cadena 1 de Fel di ya sea directamente o por medio de un separador. En una modalidad preferida más, la proteína Fel di comprende o como alternativa consiste en la secuencia de aminoácidos como la de SEQ ID NO: 24. WO 2004/094639 describe una Fel di doblada recombinante con propiedades moleculares y biológicas similares a las de su contraparte natural y específicamente un gen sintético que codifica para una fusión directa de la cadena 2 de Fel di N-terminalmente a la cadena 1. La expresión en E . coli dio como resultado un homodímero asociado no covalentemente con un peso molecular aparente de 30 kDa definido por cromatografía de exclusión de tamaño, cada subunidad de 19177 Da desplegó un patrón de disulfuro idéntico a aquel encontrado en la Fel di natural, y tiene un doblez idéntico al de Fel di natural y recombinante. El Fel di recombinante reaccionó similarmente a IgE a partir de sueros de pacientes alérgicos a gatos que el Fel di natural. Así, esta proteína de fusión Fel di imita la antigenicidad de Fel di natural . En una modalidad preferida, la cadena 1 de Fel di es fusionada por medio de su término C al término N de la cadena 2 de Fel di ya sea directamente o por medio de un separador. En una modalidad preferida, la cadena 1 de Fel di comprende, o como alternativa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 22 o una secuencia homologa de la misma, en donde la secuencia homologa tiene una identidad a SEQ ID NO: 22 de más de 80%, de preferencia más de 90%, o todavía más preferiblemente más de 95%. En una modalidad preferida, la cadena 2 de Fel di comprende, o como alternativa consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26, o una secuencia homologa de la misma, en donde la secuencia homologa tiene una identidad para SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26 de más del 80%, de preferencia más del 90% y muy preferiblemente más del 95%. En una modalidad preferida, la proteína Fel di es una proteína Fel di recombinante, en la que por lo menos un puente de disulfuro es interrumpido, de preferencia mediante mutación, muy preferiblemente mediante sustitución conservadora, tal como Cys a Ser. Tres puentes de disulfuro entre cadenas que enlazan los dos péptidos en Fel di nativo han sido identificados, es decir, Cys3 (1) -Cys73 (2) , Cys44(l)-48Cys(2) y Cys70 (1) -Cys7 (2) , sugiriendo una orientación antiparalela de péptidos Fel di (Kristensen, A. K. , et al. (1997) Biol Chem 378, 899-908) . En una modalidad preferida, uno de estos enlaces de disulfuro de la proteína Fel di es roto. En una modalidad preferida más, dos de estos enlaces de disulfuro de la proteína Fel di son rotos. En una modalidad preferida todavía más, todos los tres enlaces de disulfuro de la proteína Fel di son rotos. En una modalidad preferida, Cys 70 de la cadena 1 es ya sea suprimido o mutado. En otra modalidad preferida más, Cys 73 de la cadena es suprimido o mutado. En una modalidad preferida, la proteína Fel di es una proteína de fusión que comprende la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di fusionadas ya sea directamente o por medio de un separador, en donde todas los tres de estos enlaces de disulfuro son rotos. En una modalidad preferida más, la proteína Fel di que comprende o como alternativa consiste en la secuencia de aminoácidos como la de SEQ ID NO: 24, 55 ó 57, en la cual por lo menos una, de preferencia al menos tres, todavía más preferiblemente al menos cinco cisteínas son removidas por sustitución o por supresión. En una modalidad preferida, el antígeno de la invención comprende o consiste alternativamente en un fragmento de Fel di. Se conoce que la posesión de inmunogenicidad no usualmente requiere la longitud completa de una proteína y usualmente una proteína contiene más de un epítope antigénico, es decir, sitio antigénico. Un fragmento o un péptido corto puede ser suficiente para contener al menos un sitio antigénico que puede unirse inmunoespecíficamente por un anticuerpo o por un receptor de células T dentro del contexto de una molécula MHC. El sitio o sitios antigénicos pueden determinarse por un número de técnicas que se conocen generalmente por las personas capacitadas en la técnica. Se puede hacer mediante alineación de secuencias y predicción de estructuras. A manera de ejemplo, se pueden predecir posibles hélices a, vueltas, enlaces de disulfuro entre e intra cadenas, etc., usando un programa tal como Rasmol . Se pueden predecir además secuencias que estén enterradas dentro de la molécula o secuencias que estén expuestas sobre la superficie de la molécula. Es más probable que las secuencias expuestas sobre la superficie de la molécula comprendan sitios antigénicos naturales, y de esta manera sean útiles para inducir anticuerpos terapéuticos . Después de que una secuencia de péptidos de superficie ha sido determinada, el sitio antigénico dentro de esta secuencia puede definirse más por, por ejemplo, método de mutagénesis exhaustivo (tal como mutagénesis de barrido de alanina, Cunningham BC, Wells JA. Science 1989 Jun 2; 244(4908): 1081-5). Brevemente, los aminoácidos dentro de esta secuencia son mutados a alanina uno por uno y los aminoácidos cuyas mutaciones de alanina muestren una unión reducida respectivamente a un anticuerpo (desarrollado contra la secuencia tipo silvestre) o pierdan totalmente la unión son probablemente componente del sitio antigénico. Otro método para determinar sitios antigénicos es el de generar péptidos superpuestos que cubran la secuencia de longitud completa de Fel di (Geysen, PNAS Vol 81: 3998-4002, (1984) y Slootstra, J. W. et al, (1996) Mol. Divers . 1, 87-96) . En una modalidad preferida, el antígeno de la invención comprende o como alternativa consiste en al menos uno, de preferencia al menos dos epítopes de Fel di, muy preferiblemente al menos un epítope se deriva de la cadena 1 de Fel di y al menos un epítope se deriva de la cadena 2 de Fel di.

Los epítopes reactivos con células T de Fel di han sido mapeados a lo largo de la proteína Fel di y se han descrito en técnicas anteriores, tal como en US 6120769, el cuarto párrafo de la columna 14, en la columna 130 y 131 de US6025162 y estas descripciones se incorporan en la presente a manera de referencia. En una modalidad preferida, un epítope de células T de Fel di se selecciona de un grupo que consiste en; SEQ ID NO: 27-32. La presente invención proporciona un método para producir la composición de la invención, que comprende (a) proporcionar una VLP al menos con un primer sitio de fijación; (b) proporcionar al menos un antígeno, en donde el antígeno es una proteína Fel di o un fragmento de Fel di, al menos con un segundo sitio de fijación y (c) combinar la VLP y el por lo menos un antígeno para producir la composición, en donde el por lo menos un antígeno y la VLP son enlazados a través del primero y segundo sitios de fijación. En una modalidad preferida, la provisión del por lo menos un antígeno, es decir, una proteína Fel di o un fragmento de Fel di, con el por lo menos un segundo sitio de fijación es a manera de expresión, de preferencia a manera de expresión en un sistema bacteriano, de preferencia en E. coli . Normalmente un marcador, tal como un marcador His, marcador Myc se añade para facilitar el proceso de purificación. En otro enfoque particularmente los fragmentos de Fel di con no más de 50 aminoácido pueden sintetizarse químicamente. En una modalidad preferida de la invención, la VLP con al menos un primer sitio de fijación es enlazada a la Fel di de la invención al menos con un segundo sitio de fijación por medio de al menos un enlace péptido. El gen que codifica para Fel di de la invención, de preferencia fragmento de Fel di, muy preferiblemente un fragmento no más largo que 50 aminoácidos, más preferiblemente de menos de 30 aminoácidos, es ligado en cuadro, ya sea internamente o de preferencia al término N o C al gen que codifica para la proteína de cápside de la VLP. Las modalidades que usan antígeno de la invención para la proteína de cápside, mutantes o fragmento de las mismas, a una proteína de cápside de un virus han sido descritas en WO 2004/009124 página 62, renglón 20 a página 68, renglón 17 y incorporadas en la presente a manera de referencia. En una modalidad preferida, un fragmento de Fel di se fusiona ya sea al término N o C de una proteína de cápside, mutantes o fragmentos de la misma, del fago de ARN AP205. En una modalidad preferida más, la proteína de fusión comprende además un separador, en donde el separador se fusiona a la proteína de cápside, fragmentos o mutantes de la misma, de AP205 y un fragmento de Fel di. En una modalidad preferida de la presente invención, la composición comprende, o como alternativa consiste esencialmente en una partícula tipo virus con por lo menos un primer sitio de fijación enlazado a una Fel di de la invención con al menos un segundo sitio de fijación mediante por lo menos un enlace covalente, de preferencia el enlace covalente es un enlace no péptido. En una modalidad preferida de la presente invención, el primer sitio de fijación comprende, o es de preferencia, un grupo amino, de preferencia el grupo amino de un residuo de lisina. En otra modalidad preferida de la presente invención, el segundo sitio de fijación comprende, o de preferencia es, un grupo sulfhidrilo, de preferencia un grupo sulfhidrilo de una cisteína. En una modalidad muy preferida de la invención, el por lo menos un primer sitio de fijación es un grupo amino, de preferencia un grupo amino de un residuo de lisina y el por lo menos un segundo sitio de fijación es un grupo sulfhidrilo, de preferencia un grupo sulfhidrilo de una cisteína. En una modalidad preferida de la invención, la Fel di de la invención es enlazada a la VLP por medio de un entrelazamiento químico, típicamente y de preferencia usando un entrelazador heterobifuncional . En modalidades preferidas, el entrelazador heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con los primeros sitios de fijación preferidos, de preferencia con el grupo amino, muy preferiblemente los grupos aminos de residuos de lisina de la VLP, y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con el segundo sitio de fijación preferido, es decir, un grupo sulfhidrilo, de residuos de cisteína inherentes de, o añadidos artificialmente a la Fel di de la invención, y opcionalmente también hecho disponible para su reacción por reducción. Se conocen en la técnica varios entrelazadores heterobifuncionales . Estos incluyen los entrelazadores preferidos SMPH (Pierce) , Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros entrelazadores disponibles por ejemplo de Pierce Chemical Company, y que tienen un grupo funcional reactivo hacia grupos amino y un grupo funcional hacia grupo sulfhidrilo. Los entrelazadores mencionados arriba llevan todos a la formación de un enlace de amida después de la reacción con el grupo amino y un enlace de tioéter con los grupos sulfhidrilo. Otra clase de entrelazadores adecuados en la práctica de la invención se caracteriza por la introducción de un enlace de disulfuro entre la Fel di de la invención y la VLP después del acoplamiento. Los entrelazadores que se prefieren y que pertenecen a esta clase incluyen, por ejemplo, SPDP y Sulfo- LC-SPDP (Pierce) . En una modalidad preferida, la composición de la invención comprende además un enlazador. La manipulación de un segundo sitio de fijación en la Fel di de la invención se logra por la asociación de un enlazador que contiene de preferencia al menos un aminoácido adecuado como segundo sitio de fijación de acuerdo con las descripciones de esta invención. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la presente invención, un enlazador está asociado a la Fel di de la invención por medio de al menos un enlace covalente, de preferencia mediante por lo menos uno, típicamente un enlace péptido. De preferencia, el enlazador comprende, o como alternativa consiste en el segundo sitio de fijación. En una modalidad preferida más, el enlazador comprende un grupo sulfhidrilo, de preferencia de un residuo de cisteína. En otra modalidad preferida, el enlazador de aminoácidos es un residuo de cisteína. La selección de un enlazador dependerá de la naturaleza de la Fel di de la invención, de sus propiedades bioquímicas, tales como Pl, distribución de carga y glicosilación. En general, son favorecidos los enlazadores de aminoácidos flexibles. En una modalidad preferida más de la presente invención, el enlazador consiste en aminoácidos, en donde además de preferencia el enlazador consiste cuando mucho en 25, de preferencia cuando mucho 20, muy preferiblemente cuando mucho 15 aminoácidos. De nuevo en una modalidad preferida de la invención, el enlazador de aminoácidos contiene no más de 10 aminoácidos. Las modalidades preferidas del enlazador se seleccionan del grupo que consiste en: (a) CGG; (b) enlazador gamma 1 N-terminal (por ejemplo CGDKTHTSPP, SEQ ID NO:58); (c) enlazador gamma 3 N-terminal (por ejemplo CGGPKPSTPPGSSGGAP, SEQ ID NO:69); (d) regiones de pivote Ig; (e) enlazador de glicina N-terminales (por ejemplo GCGGGG, SEQ ID NO:59); (f) (G)kC(G)n con n=0-12 y k=0-5; (g) enlazadores de glicina-serina N-terminales ((GGGGS)n, n=l-3 con una cisteína más, (por ejemplo SEQ ID NO: 60, que corresponde a una modalidad en donde n=l) ; (h) (G)kC(G)m(S) l(GGGGS)n con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2 (por ejemplo SEQ ID NO: 61, que corresponde a una modalidad en donde n=l, k=l, 1=1 y m=l) ; (i) GGC; (k) GGC- NH2 ; (1) enlazador gamma 1 C-terminal (por ejemplo DKTHTSPPCG, SEQ ID NO: 62 ) ; (m) enlazador gamma 3 C-terminal (por ejemplo PKPSTPPGSSGGAPGGCG, SEQ ID NO: 63); (n) enlazadores de glicina C-terminales (GGGGCG, SEQ ID NO:64); (o) (G)nC(G)k con n=0-12 y k=0-5; (p) enlazadores de glicina-serina C-terminales ((SGGGG)n n=l-3 con una cisteína más, (por ejemplo SEQ ID NO: 65, que corresponde a una modalidad en donde n=l) ) ; (q) (G)m(S) 1 (GGGGS)n(G)oC(G)k con n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2, y o=0-8 (por ejemplo SEQ ID NO: 66, que corresponde a una modalidad en la que n=l, k=l, 1=1, o=l y m=l) . En una modalidad preferida más, el enlazador se añade al término N de Fel di de la invención. En otra modalidad preferida de la invención, el enlazador se añade al término C de Fel di de la invención.

Los enlazadores que se prefieren de acuerdo con esta invención son enlazadores de glicina (G)n que contienen además un residuo de cisteína como segundo sitio de fijación, tales como el enlazador de glicina N-terminal (GCGGGG) y el enlazador de glicina C-terminal (GGGGCG) . Modalidades preferidas adicionales son enlazador de glicina-lisina C-terminal (GGKKGC, SEQ ID NO: 67) y enlazador de glicina-lisina N-terminal (CGKKGG, SEQ ID NO: 68), GGCG a GGC o GGC-NH2 ("NH2" indica amidación) enlazadores en el término C del péptido o CGG en su término N. En general, los residuos de glicina serán insertados entre aminoácidos voluminosos y la cisteína que se usará como segundo sitio de fijación, para evitar impedimento estérico potencial del aminoácido más voluminoso en la reacción de acoplamiento. En una modalidad preferida, el enlazador se fusiona al término N de proteína Fel di o fragmento de Fel di. En una modalidad preferida más, el enlazador es GCGG. En otra modalidad preferida, el enlazador se fusiona al término C de proteína Fel di o fragmento de Fel di. En una modalidad preferida más, el enlazador es GGC. En caso de la proteína Fel di o fragmento de Fel di que consiste en dos cadenas de polipéptidos, esta proteína Fel di o fragmento de Fel di tiene dos términos N y dos términos C. El enlazador puede fusionarse a ambos de los dos términos N o ambos de los términos C. De preferencia, el enlazador se fusiona sólo a uno de los dos términos N o sólo uno de los dos términos C. El enlazamiento del Fel di de la invención a la VLP mediante el uso de un entrelazador hetero-bifuncional de acuerdo con los métodos preferidos descritos arriba, permite el acoplamiento de la Fel di de la invención a la VLP de una forma orientada. Otros métodos para enlazar la Fel di de la invención a la VLP incluyen métodos en los que la Fel di de la invención es entrelazada a la VLP usando la EDC carbodiimida y NHS. La Fel di de la invención también puede tiolarse primero a través de reacción, por ejemplo con SATA, SATP o iminotiolano. La Fel di de la invención, después de la desprotección si requiere, puede ser después acoplada a la VLP como sigue. Después de la separación del exceso de reactivo de tiolación, la Fel di de la invención se hace reaccionar con la VLP, activada previamente con un entrelazador heterobifuncional que comprende una porción reactiva con cisteína, y por lo tanto despliega al menos uno o varios grupos funcionales reactivos hacia residuos de cisteína, a los cuales la Fel di tiolada de la invención puede reaccionar, tal como se describió arriba. Opcionalmente, bajas cantidades de un agente reductor se incluyen en la mezcla de reacción. En métodos adicionales, la Fel di de la invención se une a la VLP usando entrelazador homo-bifuncional tal como glutaraldehído, DSG, BM[PEO]4, BS, (Pierce) u otros entrelazadores homo-bifuncionales conocidos con grupos funcionales reactivos hacia grupos amina o grupos carboxilo de la VLP. En otras modalidades de la presente invención, la composición comprende, o como alternativa consiste esencialmente en un partícula tipo virus enlazada a Fel di de la invención mediante interacciones químicas, en donde al menos una de estas interacciones no es un enlace covalente. Por ejemplo, el enlace de la VLP a la Fel di de la invención puede llevarse a cabo al biotinilar la VLP y expresar la Fel di de la invención como una proteína de fusión a estreptavidina . Una o varias moléculas de antígeno, es decir, Fel di de la invención, pueden unirse a una subunidad del VLP, de preferencia de proteínas de cápside de fago de ARN, preferiblemente a través de los residuos de lisina expuestos de las proteínas de cápside de VLP de fago de ARN, si es estéricamente permisible. Una característica específica de las VLPs de fago de ARN y en particular de la VLP de proteína de cápside Qß es de esta manera la posibilidad de acoplar varios antígenos por subunidad. Esto permite la generación de una densa disposición de antígenos. En modalidades muy preferidas de la invención, la Fel di de la invención es enlazada mediante un residuo de cisteína, que ha sido añadido ya sea al término N o término C de la Fel di de la invención, o un residuo de cisteína natural dentro de la Fel di de la invención, a residuos de lisina de proteína de cápside de las VLPs de fago de ARN, y en particular a la proteína de cápside de Qß. Como se describió arriba, cuatro residuos de lisina son expuestos sobre la superficie de la VLP de proteína de cápside Qß . Típicamente y de preferencia estos residuos son derivados luego de la reacción con una molécula entrelazadora. En caso de que no todos los residuos de lisina expuestos puedan ser acoplados a un antígeno, los residuos de lisina que hayan reaccionado con el entrelazador se dejan con una molécula entrelazadora unida al grupo e-amino después de la etapa de derivación. Esto lleva a la desaparición de una o varias cargas positivas, lo cual puede ser dañino para la solubilidad y estabilidad de la VLP. Al reemplazar algunos de los residuos de lisina con argininas, como en los mutantes de proteína de cápside Qß descritos, se evita la excesiva desaparición de cargas positivas toda vez que los residuos de arginina no reaccionan con los entrelazadores preferidos. Más aún, el reemplazo de residuos de lisina por residuos de arginina puede llevar a disposiciones de antígenos más definidas, ya que menos sitios están disponibles para la reacción al antígeno. En consecuencia, los residuos de lisina expuestos fueron reemplazados por argininas en los siguientes mutantes de proteína de cápside Qß : Qß-240 (Lysl3-Arg; SEQ ID NO:15), Qß-250 (Lys 2-Arg, Lysl3-Arg; SEQ ID NO: 17), Qß-259 (Lys 2-Arg, Lysl6-Arg; SEQ ID NO: 19) y Qß-251; (Lysl6-Arg, SEQ ID NO: 18) . En una modalidad más, se describe una proteína de cápside mutante Qß con un residuo de lisina adicional Qß-243 (Asn 10-Lys; SEQ ID NO: 16), adecuadas para obtener disposiciones de antígenos de densidad todavía más alta. En una modalidad preferida de la invención, la VLP de la invención se produce recombinantemente por un huésped y en donde la VLP está esencialmente libre de ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped. En una modalidad preferida más, la composición comprende además por lo menos una macromolécula polianiónica unida a, de preferencia empacada dentro o encerrada en, la VLP. En una modalidad preferida más, la macromolécula polianiónica es ácido poliglutámico y/o ácido poliaspártico. Esencialmente libre de ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped: El término "esencialmente libre de ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped" según se usa en la presente, se refiere a la cantidad de ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped comprendida por la VLP, cantidad que típicamente y de preferencia es menor que 30 µg, de preferencia menos de 20 µg, muy preferiblemente menos de 10 µg, aún más preferiblemente menos de 8 µg, todavía más preferiblemente menos de 6 µg, definitivamente preferiblemente menos de 4 µg, de manera extremadamente preferible menos de 2 µg, por mg de la VLP. Huésped, según se usa dentro del contexto mencionado arriba, se refiere al huésped en el cual la VLP se produce recombinantemente. Los métodos convencionales para determinar la cantidad de ARN, de preferencia ácidos nucleicos, se conocen por la persona capacitada en la técnica. El método típico y preferido para determinar la cantidad de ARN, de preferencia ácidos nucleicos, de acuerdo con la presente invención se describen en el ejemplo 17 de PCT/EP2005/055009 presentada el 5 de octubre de 2005 por el mismo cesionario. Condiciones idénticas, similares o análogas son, típicamente y de preferencia, usadas para la determinación de la cantidad de ARN, de preferencia ácidos nucleicos, para las composiciones de la invención que comprende VLPs que no sean Qß . Las modificaciones de las condiciones requeridas eventualmente están dentro del conocimiento de la persona capacitada en la técnica. El valor numérico de las cantidades determinadas debe típicamente y de preferencia entenderse como comprendiendo valores que tengan una desviación de ± 10%, que tengan de preferencia una desviación de ±5% del valor numérico indicado . Macromolécula polianiónica: el término "macromolécula polianiónica", según se usa en la presente, se refiere a una molécula de alta masa molecular relativa que comprende grupos repetitivos de carga negativa, cuya estructura comprende esencialmente la repetición múltiple de unidades derivadas, realmente o conceptualmente, de moléculas de baja masa molecular relativa. Una macromolécula polianiónica debe tener un peso molecular de por lo menos 2,000 Daltons, muy preferiblemente de al menos 3,000 Daltons y todavía más preferiblemente de al menos 5,000 Daltons. El término "macromolécula polianiónica" según se usa en la presente, típicamente y de preferencia se refiere a una molécula que no es capaz de activar receptores tipo Toll. Así, el término "macromolécula polianiónica" típicamente y de preferencia excluye ligandos de receptores tipo Toll, y todavía más preferiblemente excluye además sustancias inmunoestimuladoras tales como ligandos receptores tipo Toll, ácidos nucleicos inmunoestimuladores y lipopolisacáridos (LPS) . Muy preferiblemente el término "macromolécula polianiónica" según se usa en la presente, se refiere a una molécula que no es capaz de incluir producción de citocinas.

Todavía más preferiblemente el término "macromolécula polianiónica" excluye sustancias inmunoestimuladoras. El término "sustancia inmunoestimuladora" , según se usa en la presente, se refiere a una molécula que es capaz de inducir y/o incrementar la respuesta inmune específicamente contra el antígeno comprendido en la presente invención. ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped: el término "ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped" o el término " ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped, con estructuras secundaria", según se usa en la presente, se refiere al ARN, o de preferencia ácidos nucleicos, que son sintetizados originalmente por el huésped. El ARN, de preferencia ácidos nucleicos, puede, sin embargo, sufrir cambios químicos y/o físicos durante el procedimiento de reducir o eliminar la cantidad de ARN, de preferencia ácidos nucleicos, típicamente y de preferencia a manera de los métodos de la invención, por ejemplo, el tamaño del ARN, de preferencia ácidos nucleicos, puede ser acortado o la estructura secundaria del mismo puede ser alterada. Sin embargo, incluso este ARN o ácidos nucleicos resultantes se consideran aún como ARN huésped, o ácidos nucleicos huésped. Los métodos para determinar la cantidad de ARN y para reducir la cantidad de ARN comprendida por la VLP se describen en PCT/EP2005/055009 presentada por el mismo cesionario el 5 de octubre de 2005 y de esta manera la solicitud completa se incorpora en la presente a manera de referencia. Reducir o eliminar la cantidad de ARN huésped, de preferencia ácido nucleico huésped, minimiza o reduce las respuestas a células T no deseadas, tales como respuestas de células T inflamatoria y respuesta de células T citotóxica, y otros efectos secundarios no deseados, tales como fiebre, mientras se conserva una fuerte respuesta de anticuerpo específicamente contra Fel di. En una modalidad preferida, esta invención proporciona un método para preparar las composiciones de la invención y VLP de un bacteriófago de ARN - Fel di de la invención, en donde la VLP se produce recombinantemente por un huésped y en donde la VLP está esencialmente libre de ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped, que comprenden las etapas de: a) producir en forma recombinante una partícula tipo virus (VLP) con al menos un primer sitio de fijación por un huésped, en donde la VLP comprende proteínas de cápside, variantes o fragmentos de las mismas de un ARN-bacteriófago; b) desensamblar la partícula tipo virus a las proteínas de cápside, variantes o fragmentos de las mismas, del ARN-bacteriófago; c) purificar las proteínas de cápside, variantes o fragmento de las mismas; d) reensamblar las proteínas de cápside, variantes o fragmento de las mismas, purificadas del ARN-bacteriófago a una partícula tipo virus, en donde la partícula tipo virus esté esencialmente libre de ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped y e) enlazar al menos una antígeno de la invención con por lo menos un segundo sitio de fijación a la VLP obtenida de la etapa d) . En una modalidad preferida más, el reensamble de las proteínas de cápside purificadas, variantes o fragmento de las mismas se lleva a cabo en presencia de al menos una macromolécula polianiónica.

En una modalidad preferida, la composición de la invención comprende además al menos una sustancia inmunoestimuladora capaz de inducir y/o incrementar una respuesta inmune. De preferencia, la sustancia inmunoestimuladora es un ligando de receptor tipo Toll, seleccionado de preferencia del grupo que consiste en: (a) ácidos nucleicos inmunoestimuladores; (b) péptido glucanos; (c) lipopolisacáridos; (d) ácidos lipoteicónicos; (e) compuestos d imidazoquinolina; (f) flagelinas; (g) lipoproteínas; (h) moléculas orgánicas inmunoestimuladoras; (i) oligonucleótidos que contienen CpG no metilados y (j) cualquier mezcla de sustancias de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f), (g), (h) e (i) . En una modalidad preferida más, el ácido nucleico inmunoestimulador se selecciona de preferencia del grupo que consiste en: (a) un ácido nucleico de origen bacteriano; (b) un ácido nucleico de origen viral; (c) un ácido nucleico que comprende un motivo CpG no metilado; (d) un ARN de doble hebra; (e) un ARN de una sola hebra y (g) un ácido nucleico libre de motivo CpG no metilado. Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores que no contienen motivos CpG no metilado han sido descritos en la técnica anterior, por ejemplo en WO01/22972. El término "ácido nucleico", según se usa en la presente, se refiere a una molécula compuesta de monómeros enlazados covalentemente en forma lineal (nucleótidos) .

Indica una cadena molecular de nucleótidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Así, los oligonucleótidos están incluidos dentro de la definición de ácido nucleico. El enlace entre los nucleótidos es típicamente y de preferencia enlace de fosfodiéster . Los ácidos nucleicos que comprenden modificaciones de enlaces, por ejemplo, enlace de fósforotioato, también son abarcados por la presente invención. En una modalidad preferida, la sustancia inmunoestimuladora se mezcla con la VLP recombinante. En otra modalidad preferida, la sustancia inmunoestimuladora se une a, de preferencia se empaca dentro, la VLP de la invención. Descripciones detalladas de sustancia inmunoestimuladora, particularmente ácido nucleico inmunoestimulador, más particularmente oligonucleótidos que comprenden CpG no metilada han sido descritas en WO 03/024480, 03/024481 y PCT/EP/04/003165. Los métodos para mezclar las sustancias inmunoestimuladoras con el VLP-antígeno han sido descritos en WO 03/024480. Los métodos para empacar las sustancias inmunoestimuladoras dentro de la VLP han sido descritos en WO 03/024481. Las solicitudes completas de WO 03/024480, 03/024481 y PCT/EP/04/003165 están por lo tanto incorporadas en la presente a manera de referencia. VLP puede inducir y/o incrementar generalmente el sistema inmunológico. Sin embargo, el término " sustancia inmunoestimuladora" , según se usa dentro del contexto de esta solicitud, se refiere a una sustancia inmunoestimuladora que no es la VLP usada para las composiciones de la invención, en lugar de además de la VLP. La inclusión de sustancias inmunoestimuladoras, de preferencia ácidos nucleicos inmunoestimuladores en la composición de la invención puede conducir las respuestas inmunes hacia respuestas Thl y de esta manera suprimir las respuestas Th2. En un aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende la composición de la invención. En un aspecto, la invención proporciona una vacuna que comprende la composición de la invención y un regulador de pH adecuado. En una modalidad preferida, la composición de vacuna comprende además al menos un adyuvante. La administración del por lo menos un adyuvante puede en la presente ocurrir antes de, contemporáneamente o después de la administración de la composición de la invención. El término "adyuvante", según se usa en la presente, se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta inmune o a sustancias que permiten la generación de un depósito en el huésped las cuales cuando se combinan con la vacuna y composición farmacéutica, respectivamente, de la presente invención pueden proporcionar una respuesta inmune mejorada todavía mas. En otra modalidad preferida, la composición de vacuna está libre de adyuvante. Una característica adecuada de la presente invención es la alta inmunogenicidad de la composición, incluso en ausencia de adyuvantes. El evitar adyuvante puede reducir la aparición posible de efectos secundarios que se refieran al uso de adyuvantes. Así, la administración de la vacuna de la invención a un paciente ocurrirá de preferencia sin administrar por lo menos un adyuvante al mismo paciente antes de, junto con o después de la administración de la vacuna. La invención describe además un método de inmunización que comprende administrar la vacuna de la presente invención a un humano y a un mamífero no humano, tal como un perro o gato. Sin la intención de limitar la presente invención por teoría, la inyección de la composición de vacuna de la invención a un gato puede neutralizar Fel di y por lo tanto reducir la cantidad de Fel di en saliva de gato. La vacuna puede administrarse mediante varios métodos .conocidos en la técnica, pero normalmente se administrará por inyección, infusión, inhalación, administración oral u otros métodos físicos adecuados. Los conjugados pueden, como alternativa administrarse intramuscularmente, intravenosamente, transmucosalmente, transdérmicamente, intranasalmente, intraperitonealmente o subcutáneamente. Los componentes de conjugados para administración incluyen soluciones y suspensiones acuosas estériles (por ejemplo, solución salina fisiológica) o no acuosas. Ejemplos de solventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos o vendajes oclusivos pueden usarse para incrementar la permeabilidad de la piel e incrementar la absorción de antígenos. Se dice que las vacunas de la invención son "farmacéuticamente aceptables" si su administración puede tolerarse por un individuo receptor. Además, las vacunas de la invención se administraran en una "cantidad terapéuticamente efectiva" (es decir, una cantidad que produzca un efecto fisiológico deseado) . La naturaleza o tipo de respuesta inmune no es un factor limitativo de esta descripción. Si la intención de limitar la presente invención por la siguiente explicación de mecanismo, la vacuna de la invención puede inducir anticuerpos, presumiblemente subtipos de IgG, que se unen a Fel di y de esta manera previenen que Fel di se observe por IgE unida a células cebadas y basófilos. Como alternativa o simultáneamente, la composición de la invención conduce las respuestas inmunes hacia respuestas Thl, suprimiendo el desarrollo de respuestas Th2 y por consiguiente la producción de anticuerpo igE, un componente principal en reacciones alérgicas . En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la composición como la mostrada en la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Cuando la vacuna de la invención se administra a un individuo, puede estar en una forma que contenga sales, reguladores de pH, adyuvantes u otras sustancias que sean deseables para mejorar la eficacia del conjugado. Ejemplos de materiales adecuados para usarse en la preparación de composiciones farmacéuticas se proporcionan en numerosas fuentes que incluyen REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990) ) . La invención muestra un proceso para producir la composición de la invención que comprende las etapas de: (a) proporcionar una particular nuclear con al menos un primer sitio de fijación, en donde la partícula nuclear es una partícula tipo virus o una partícula de virus; (b) proporcionar al menos un antígeno con al menos un segundo sitio de fijación, en donde el por lo menos un antígeno es proteína Fel di o un fragmento de Fel di y (c) combinar la partícula nuclear y el por lo menos un antígeno para producir una composición, en donde el por lo menos un antígeno y la partícula nuclear se enlazan a través del primero y segundo sitios de fijación. En una modalidad preferida más, la etapa de proporcionar partícula nuclear con al menos un primer sitio de fijación comprende etapas adicionales: (a) desensamblar la partícula nuclear a proteínas de cápside, mutantes o fragmentos de las mismas, de la partícula nuclear; (b) purificar las proteínas de cápside, mutantes o fragmentos de las mismas; (c) reensamblar las proteínas de cápside, mutantes o fragmentos de las mismas purificados, de la proteína nuclear, en donde la partícula nuclear está esencialmente de ARN huésped, de preferencia ácidos nucleicos huésped. En una modalidad preferida más, el reensamble de las proteínas de cápside purificadas se lleva a cabo en presencia de al menos una macromolécula polianiónica de por lo menos un ácido nucleico inmunoestimulador. En un aspecto, la invención proporciona un método para usar las composiciones de la invención para prevenir y/o tratar alergia a gatos en un mamífero, en donde de preferencia el mamífero es un humano o un perro. En un aspecto, la invención enseña el uso de la composición de la invención como un medicamento. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de la composición de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una alergia a gatos en un mamífero, en donde de preferencia el mamífero es un humano o un perro. En un aspecto, esta invención proporciona una proteína de fusión Fel di que comprende cadena 1 de Fel di y cadena 2 de Fel di fusionadas por medio de un separador de aminoácidos, el cual enlaza el término N de una cadena con el término C de otra cadena, en donde el separador de aminoácidos consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 10-30, de preferencia 10-25, preferiblemente 10-20, de preferencia 13-20, preferiblemente 15-20, de preferencia 13-17, preferiblemente 15-17 residuos de aminoácido, y en donde la proteína de fusión no es una proteína de fusión que comprende cadena 1 de SEQ ID NO: 22 fusionada a través de (GGGGS)3 al término N de la cadena 2 de SEQ ID NO: 23, 25 ó 26 y en donde la proteína de fusión liberada se expresa en sistema de expresión de baculovirus. WO2004094639 describe proteína de fusión Fel di al enlazar cadena 1 y cadena 2 con un enlazador seleccionado de un enlace carbono-nitrógeno y un péptido corto, es decir, que tiene de 1 a 9, de preferencia 1 a 5, particularmente preferible 1 a 3 aminoácidos . Indica además que sorprendentemente un enlace o un péptido corto no induce restricciones significativas o desdoblamiento. Sin embargo, W02004094639 no describe un enlazador de más de 9 aminoácidos . WO 00/20032 describe el Fel di recombinante expresado con baculovirus que comprende cadena 1 y cadena 2 expresadas en serie y enlazadas juntas por un enlazador glicina/serina (GGGGS)3. WO 00/20032 también reportó que la inmunorreactividad de rFel di para IgG y anticuerpo IgE es mejorada dramáticamente al expresar el alérgeno en baculovirus, en comparación con el alérgeno expresado en E . coli . La proteína de fusión Fel di de la invención puede producirse ya sea en un sistema de expresión procariótico o en un sistema de expresión eucariótico, tale como un sistema de baculovirus. En una modalidad preferida, la proteína de fusión Fel di de la invención se produce de E . col i . En una modalidad preferida, el separador comprendido por la proteína de fusión Fel di de la invención consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 residuos de aminoácido. En una modalidad preferida, el separador comprendido por la proteína de fusión Fel di que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 2, 3 ó 4 veces de la repetición GGGGS. En una modalidad preferida, la cadena 2 de Fel di está en el término N de la proteína de fusión de la invención.

En otra modalidad preferida, la cadena 1 de Fel di está en el término N de la proteína de fusión de la invención. En una modalidad preferida más, la proteína de fusión se produce de E. coli . En una modalidad muy preferida, la proteína de fusión Fel di de la invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 54; (b) SEQ ID NO: 55; y (c) SEQ ID NO: 57. La invención proporciona además secuencias de nucleótidos que codifican para la proteína de fusión Fel di de la invención. En una modalidad preferida, la invención proporciona secuencias de nucleótidos que codifican para una proteína de fusión de la invención seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 54; (b) SEQ ID NO: 55; y (c) SEQ ID NO: 57. En una modalidad preferida más, la proteína de fusión Fel di de la invención se produce en E . col i . En una modalidad preferida más, la proteína de fusión Fel di de la invención comprende, o como alternativa consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, en donde la proteína de fusión de la invención se produce en E . col i . En un aspecto, la invención proporciona el uso de la proteína de fusión Fel di de la invención para el diagnóstico y tratamiento de alergia a gatos .

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de VLPs Qß de la invención mediante desensamble/reensamble en presencia de diferentes macromoléculas polianiónicas que resultan en q que resultan en Qß VLPs reensambladas (A) Desensamble de Qß VLP de la técnica anterior 45 mg de Qß VLP de la técnica anterior (2.5 mg/mL, determinados por el análisis de Bradford) en PBS (20 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, pH 7.5) purificado de lisado de E. coli se redujeron con 10 mM de DTT durante 15 min a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación. Después se añadió cloruro de magnesio a una 0.7 M concentración final y la incubación se continuó durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo condiciones de agitación, lo cual llevó a la precipitación del ARN de célula huésped encapsulado. La solución se centrifugó durante 10 minutos a 4000 rpm a 4°C (Eppendorf 5810 R, en un rotor de ángulo fijo A-4-62 usado en todas las etapas siguientes) para remover el ARN precipitado de la solución. El sobrenadante, que contenía la proteína de cápside Qß dimérica liberada, se usó para las etapas de purificación cromatográfica. (B) Purificación de la proteína de cápside de Qß mediante cromatografía de intercambio catiónico y mediante cromatografía de exclusión de tamaño El sobrenadante de la reacción de desensamble que contiene la proteína de cápside dimérica, proteínas de células huésped y ARN de células huésped residual, se diluyó 1:15 en agua para ajustar la conductividad debajo de 10 mS/cm y se cargó en una columna SP-Sepharose FF (xk 16/20, 6 mi, Amersham Bioscience) . La columna se equilibró de antemano con 20 mM de regulador de pH de fosfato de sodio pH 7. La elusión de la proteína de cápside unida se logró por la gradiente de etapas a 20 mM de fosfato de sodio / 500 mM de cloruro de sodio y la proteína se recogió en un volumen de fracción de alrededor de 25 mL. La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 5 ml/min y la absorbancia se monitoreó a 260 nm y 280 nm. En la segunda etapa, la proteína de cápside Qß aislada (la fracción eluída de la columna de intercambio catiónico) se cargó (en dos corridas) sobre una columna Sphacryl S-100 HR ((xk26/60, 320 mi, Amersham Bioscience), equilibrada con 20 mM de fosfato de sodio / 250 mM de cloruro de sodio; pH 6.5. La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 2.5 ml/min y la absorbancia se monitoreó a 260 nm y 280 nm. Las fracciones de 5 mL se colectaron. (Cl) Reensamble de la Qß VLP por diálisis Proteína de cápside Qß purificada (2.2 mg/mL en 20 mM de fosfato de sodio pH 6.5) una macromolécula polianiónica (2 mg/mL en agua), urea (7.2 M en agua) y DTT (0.5 M en agua) se mezclaron hasta las concentraciones finales de 1.4 mg/mL de proteína de cápside, 0.14 mg/mL de la macromolécula polianiónica respectiva, urea 1M y 2.5 mM de DTT. Las mezclas (1 mL cada una) fueron dializadas durante dos días a 5°C en 20 mM de TrisHCl, 150 mM de NaCl pH 8, usando membranas con un límite de 3.5 kDa. Las macromoléculas polianiónicas fueron: ácido poligalacturónico (25000- 50000, Fluka) , sulfato de dextrano (MW 5000 y 10000, Sigma), ácido poli-L-aspártico (MW 11000 y 33400, Sigma), ácido poli-L-glutámico (MW 3000, 13600 y 84600, Sigma) y moléculas de ARNt de levadura de repostería y germen de trigo . (C2) Reensamble de la Qß VLP mediante diafiltración 33 mL de proteína de cápside Qß purificada (1.5 mg/ml en 20 mM fosfato de sodio pH 6.5, 250 mM de NaCl) se mezclaron con agua y urea (7.2 M en agua), NaCl (5 M en agua) y ácido poli-L-glutámico (2 mg/ml en agua, MW: 84600) . El volumen de la mezcla fue de 50 mi y las concentraciones finales de los componentes fueron de 1 mg/ml de proteína de cápside, 300 mM de NaCl, urea 1.0 M y 0.2 mg/ml de ácido poli-L-glutámico. La mezcla se diafiltró después a temperatura ambiente, contra 500 mi de 20 mM de TrisHCl pH 8, 50 mM de NaCl, aplicando una velocidad de flujo cruzado 10 ml/min y una velocidad de flujo permeado de 2.5 ml/min, en un aparato de filtración de flujo tangencial usando un cartucho de membrana Pellicon XL (Biomax 5K, Millipore) . Ejemplo 2 Ensamble in vztro de AP205 VLPs (A) Purificación de la proteína de cápside AP205 Desensamble: 20 mL de solución AP205 VLP (1.6 mg/ml en PBS, purificado de extracto de E. coli) se mezclaron con 0.2 mi de DTT 0.5 M y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente . Se añadieron 5 mi de NaCl 5 M y la mezcla se incubó después durante 15 min a 60 °C, causando la precipitación de las proteínas de cápside reducidas por DTT. La mezcla turbia se centrifugó (rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 min, 20°C) y el sobrenadante fue descartado y la pella se dispersó en 20 mi de Ureal M /20mM de citrato de sodio, pH 3.2. Después de agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente, la dispersión se ajustó a pH 6.5 mediante la adición de Na2HP04 1.5 M y luego se centrifugó (rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 min, 20°C) para obtener sobrenadante que contenía proteína de cápside dimérica. Cromatografía de intercambio catiónico: el sobrenadante (véase arriba) fue destilado con 20 mL de agua para ajustar una conductividad de aproximadamente 5 mS/cm. La solución resultante se cargó en una columna de 6 mL de SP Sepharose FF (Amersham Bioscience) que fue equilibrada previamente con 20 mM de regulador de pH de fosfato de sodio, pH 6.5. Después de cargar, la columna se lavó con 48 mL de regulador de pH de fosfato de sodio, pH 6.5 seguida por la elusión de la proteína de cápside unida por una gradiente lineal a NaCl 1 M sobre 20 volúmenes de columna. Las fracciones del pico principal se agruparon y se analizaron mediante SDS-PAGE y espectroscopia UV. De acuerdo con SDS-PAGE, la proteína de cápside aislada estaba esencialmente pura de otras contaminaciones de proteínas. De acuerdo con la espectroscopia UV, la concentración de proteínas fue de 0.6 mg/mL (cantidad total 12 mg) , tomando esa unidad 1 A280 refleja 1.01 mg/mL de proteína de cápside AP205. Además, el valor de A280 (0.5999) sobre el valor de A260 (0.291) es 2, indicando que la preparación está esencialmente libre de ácidos nucleicos. (B) Ensamble de AP205 VLPs Ensamble en ausencia de cualquier macromolécula polianiónica: La fracción de proteínas eluída de arriba se diafiltró y se concentró mediante TFF hasta una concentración de proteínas de 1 mg/mL en 20 mM de fosfato de sodio, pH 6.5. 500 µl de esta solución se mezclaron con 50 µl de solución NaCl 5M y se incubaron durante 48 horas a temperatura ambiente. La formación de VLPs reensambladas en la mezcla fue demostrada por SDS-PAGE no reductora y mediante HPLC de exclusión de tamaño. Una columna TSKgel G5000 PWXL (Tosoh Bioscience) , equilibrada con 200 mM de fosfato de sodio 150 mM de NaCl, pH 7.2, se usó para el análisis HPLC.

Ensamble en presencia de ácido poliglutámico: 375 µl de proteína de cápside AP205 purificada (1 mg/ml en fosfato de sodio 20 mM pH 6.5) se mezcló con 50 µl de solución de abastecimiento NaCl (5 M en agua) , 50 µl de solución de abastecimiento de ácido poliglutámico (2 mg/ml en agua, MW: 86400, Sigma) y 25 µl de agua. La mezcla se incubó durante 48 horas a temperatura ambiente. La formación de VLP reensamblada en la mezcla fue mostrada mediante SDS-PAGE no reductora y por HPLC de exclusión de tamaño. La proteína de cápside en la mezcla se incorporó casi completamente en las VLPs, mostrando una eficiencia de ensamble más alta que la de la proteína de cápside AP205 ensamblada en ausencia de cualquier macromolécula polianiónica. Ejemplo 3 Clonación de proteínas de fusión Fel di Genes que codificaban para cadena 1 y cadena 2 de Fel di, respectivamente, se hicieron mediante amplificación por PCR usando cebadores de ADN sobrepuestos como se muestra abajo. Los cebadores hacia adelante (F) y hacia atrás (R) están indicados. Los fragmentos fueron ligados en vector pCRII-TOPO (Invitrogen) y se transformaron en XLl-Blue. Los insertos de cadena 1 y cadena 2 de Fel di fueron verificados en secuencia. Secuencia Cebadora IF: SEQ ID NO: 34; Secuencia Cebadora 2R: SEQ ID NO: 35 Secuencia Cebadora 3F: SEQ ID NO: 36 Secuencia Cebadora 4R: SEQ ID NO: 37 Secuencia Cebadora 5F: SEQ ID NO: 38 Secuencia Cebadora 6R: SEQ ID NO: 39 Secuencia Cebadora 7F: SEQ ID NO: 40 Secuencia Cebadora 8R: SEQ ID NO: 41 Secuencia Cebadora 9F: SEQ ID NO: 42 Secuencia Cebadora 10R: SEQ ID NO: 43 Construcciones de fusión Fel di: FELD1 se refiere a la proteína con cadena 2 en el término N fusionada directamente con cadena 1. Las secuencias de nucleótidos que codifican para FELD 1 se crearon mediante PCR de extensión de traslape de empalme (SOE) usando el enlazador de 11 cebadores (SEQ ID NO: 44) . FD12 se refiere a la proteína con cadena 1 en el término N fusionada directamente con cadena 2. La secuencia de nucleótidos que codifica para FD12 se creó mediante PCR de extensión de traslape de empalme (SOE) usando cebadores 12-1 (SEQ ID NO:45), 12-3 (SEQ ID NO:46) y 12-2-1 (SEQ ID NO:47). [00145] FELDl-lOaa y FELDl-15aa se refieren a proteínas con cadena 2 en el término N fusionadas por medio de un separador de 10 (GGGGS)2 o 15 (GGGGS)3 aminoácidos, respectivamente, la cadena 1 en el término C. Plásmido que contenía la secuencia de nucleótidos que codifica para FELD 1 se usó como plantilla para crear el separador de 10 aminoácidos o 15 aminoácidos mediante mutagénesis por PCR inversa (IPCRM) . Para el separador de 1-15 se usaron dos cebadores (cebador l-10aa, SEQ ID NO:48 y cebador 2-5aa SEQ ID NO:49). Para el separador de 1-10 se usaron dos cebadores (cebador l-5aa, SEQ ID NO: 50 y cebador 2-5aa) . El fragmento de PCR resultante fue circulado por ligación. Es resistente a digestión por Dpn I, la cual sólo reconoce una secuencia que contiene adenina metilada, mientras que la plantilla de plásmido se digirió por Dpn I. FD12-10aa y FD12-15aa se refieren a proteínas con cadena 1 en el término N fusionadas por medio de un separador de 10 (GGGGS)2 o 15 (GGGGS)3 aminoácidos, respectivamente, con la cadena 2 en el término C. FD12-10aa y FD12-15aa de fusión fueron producidas similarmente como se describió arriba. Se usaron el cebador separador de 15 aminoácidos FD2-10aa (SEQ ID NO: 51) y cebador FDl-5aa (SEQ ID NO: 52) . Se usaron el cebador separador FDl-5aa y FD2-5 aa (SEQ ID NO: 53) para 10 aminoácidos . Ejemplo 4 Expresión y purificación bacteriana de proteina de fusión Fel di marcadas con His Las secuencias de nucleótidos que codifican para varias construcciones de fusión Fel di como las descritas en el ejemplo 3 fueron subclonadas en un sistema de expresión a base de T7 pET-42T(+), modificado del plásmido pET-42a (+) (Novagen). El término C de las construcciones de fusión se fusionó a una secuencia His-tag seguida por GGC, un enlazador de aminoácidos que contiene cisteína como el segundo sitio de fijación. Las construcciones resultantes fueron nombradas en consecuencia al agregar "-HC" al final. FELD1-HC, FELDl-lOaa-HC y FELD1 - 15aa-HC y FD12-15aa-HC se expresaron y purificaron como lo siguiente: el plásmido fue transformado en BL21(DE3) . La expresión se indujo al añadir 1 mM de IPTG al cultivo a OD600 de aproximadamente 1. El cultivo se llevó a cabo durante 20 horas adicionales a 20°C, se cosechó y se liso por sonificación en regulador de pH de lisis nativo (50 mM de NaH2P04, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol pH 8.0) . El lisado bacteriano aclarado se llevó a 50 mL con regulador de pH de lisis nativo. Se añadieron 5 mL de agarosa de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) (Qiagen) y el lisado se incubó al invertir de 1 hora a 4°C. Las proteínas unidas no específicamente se removieron por lavado cuatro veces en regulador de pH de lisis nativo. La proteína unida fue eluída mediante resuspensión de la agarosa Ni-NTA en 2 mL de regulador de pH de elusión (50 mM de NaH2P04, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol pH 8.0) .

Ejemplo 5 Enlaces de disulfuro de doblez oxidante en proteina de fusión Fel di purificadas FELD1-HC purificado por afinidad a Ni2+ consiste de una variedad de especies puenteadas por disulfuro mixtas de 15 kD a 20 kD. El doblez nativo de FELD1-HC se logró mediante la reclasificación intramolecular de enlaces de disulfuro con glutationa oxidada (GSSG, Applichem) y glutationa reducida (GSH, Applichem) a una relación molar de 1:1. La reacción se llevó a cabo durante 24 horas inmediatamente después de la elusión de FELD1 en regulador de pH de elusión al añadir 2.5 mM de GSSG y 2.5 mM de GSH a temperatura ambiente. FELD1-HC redoblada mostró una sola banda a un peso molecular de 15 kD bajo una condición no reductora (figura 1, el primer panel, línea 2) . Los grupos sulfhidrilo libres potenciales de FELD1-HC fueron alquilados usando yodoacetamida (Sigma) . Se trataron las sondas con 5mm de yodoacetamida en 20 mM de bicarbonato de amonio a pH 8.0 durante 15 minutos a temperatura ambiente. FELDl-HC redoblada se purificó más hasta homogeneidad mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) (Superdex 75 pg, Amersham Pharmacia Biosciences) equilibrado en PBS. FELDl-lOaa-HC y FELDl-15aa-HC fueron renaturalizados sustancialmente mediante el mismo método que el descrito arriba (figura 1, los dos paneles medios) . El doblez negativo de FD12-15aa-HC se logró similarmente por la reclasificación de los puentes de disulfuro con glutation oxidada y glutationa reducida a una relación molar de 10:1. Después de la elución FD12-15aa se diluyó veinte veces en regulador de pH de doblez de FD12-15aa (50 mM de Tris-Cl pH 8.5, 240 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 1 mM de EDTA, 0.05% de PEG 3,550, 1 mM de GSH, 0.1 mM de GSSH) y se incubó a 4°C durante 24 horas. FD12-15aa redoblado mostró una banda a un peso molecular de 20 kD en comparación con la forma reducida que corría a 23 kD (figura 1, último panel) . Ejemplo 6 Proteínas de fusión Fel di son reconocidas por anticuerpos monoclonales específicos para epítopes La unión de proteínas de fusión Fel di en comparación con Fel di natural (nFel di) a anticuerpos monoclonales (mAB) específicos de epítopes se midió por una ELISA de sandwich usando el equipo para ELISA Fel di (6F9/3E4) de Indoor biotechnologies (Cardiff , UK) . Brevemente, el anticuerpo monoclonal 6F9 anti-Fel di suministrado como una solución de abastecimiento 2 mg/mL se diluyó 1:1,000 en 50 mM de regulador de pH de carbonato-bicarbonato pH 9.6. Pocilios de microtitulación fueron recubiertos con 100 µl del mAB 6F9 diluido por pocilio a 4°C durante la noche. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS-0.05% de Tween 20 (PBS-T) y después bloqueadas con 100 µl de regulador de pH de bloqueo (1% de BSA (Sigma) en PBS-T) . Después los pocilios de microtitulación se incubaron durante 1 hora con 100 µl de proteína de fusión de Fel di o nFel di estándar (Indoors Technologies; UK) usando diluciones dobles de 80-0.16 ng/mL. La referencia nFel di se sub-estandarizó a partir de la referencia de caspa de gatos CBER E10, la cual coniene 13.47 U/mL de Fel di (1 unidad = 4 mg de proteína) . Las placas fueron después lavadas y 100 µl de anticuerpo mAB 3E4 anti-Fel di biotilinado y diluido (1:1,000 en 1% de BSA/PBS-T) se añadieron e incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS-T usando 100 µl de estreptavidina-peroxidasa diluida (1:1,000 en 1% de BSA/PBS-T) (Sigma S5512, 0.25 mg reconstituida en 1 mL de agua destilada) . Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente los pocilios se lavaron tres veces con PBS-T. La detección se llevó a cabo con solución de substrato OPD y 5% de H2S04 como solución de paro. La absorbancia se midió usando lector ELISA (BioRad) a 450 nM y para el cálculo de la media aritmética y para el error estándar de la media (SEM) se usó software EXCEL (MS Office; Microsoft) . Los resultados se muestran en la tabla 1. De esta manera, el reconocimiento de las proteínas de fusión Fel di y nFel di por mABs específicos de epítope refleja la alta similitud de antigenicidad de ambas proteínas.

Tabla 1 Ejemplo 7 Acoplamiento de proteínas de fusión Fel di a VLPs derivadas de Qß Una solución de 143 µM de VLP Qß en regulador de pH HEPES (20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7.2) se hizo reaccionar con un exceso molar de 5 veces (715 µM) de SMPH (Pierce) durante 30 minutos a 25 °C con agitación. SMPH se tomó de una solución de abastecimiento de 50 mM disuelta en sulfóxido de dimetilo. Los productos de reacción fueron dializados contra dos cambios de PBS usando una unidad de diálisis con un límite de peso molecular de 10,000 Da (Slide-A-Lyzer, Pierce). La diálisis se llevó a cabo a 4°C a temperatura ambiente en un exceso menor que 1,000 veces de regulador de pH a mezclar de reacción. Antes del acoplamiento las proteínas de fusión Fel di a VLP Qß, FELD1, FELDl-lOaa, FELDl-15aa y DF12-15aa derivadas por SMPH, respectivamente, obtenidas del ejemplo 5 se incubaron con TCEP (Pierce, Perbio Science) en cantidades equimolares durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las proteínas de fusión Fel di se añadieron en un exceso molar de 5 veces a una solución de 143 µM de VLPs Qß derivadas por SMPH. El volumen de la reacción fue 650 µl y varias reacciones se llevaron a cabo en paralelo. Las reacciones fueron incubadas durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación. Después del acoplamiento, las alícuotas se centrifugaron a 16,000 x g durante 3 minutos a 4°C para granular el material insoluble. Los sobrenadantes se agruparon en tubos frescos. El acoplamiento de las proteínas de fusión Fel di a VLP Qß fue evaluado por SDS-PAGE reductora. El acoplamiento de las proteínas de fusión Fel di a la VLP Qß reensamblada (obtenida del ejemplo 1) es sustancialmente igual al descrito arriba. Ejemplo 8 Acoplamiento de FELD1 , FELDl-15aa y FD12-15aa a HBcAgl-185- Lys La construcción de HBcAgl-185-Lys, su expresión y purificación han sido descritas sustancialmente en el ejemplo 2-5 de WO 03/040164. Una solución de 120 de µM de HBcAgl- 185 -Lys VLP en 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7.2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce) , diluido a partir de una solución de abastecimiento en DMSO, a 25 °C en un agitador giratorio. La solución de reacción se dializa posteriormente dos veces durante 2 horas contra 1L de 20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7.2 a 4°C. La mezcla de reacción HBcAgl-185-Lys dializada se hace reaccionar después con el Fel di recombinante obtenido en el ejemplo 5. En la reacción de acoplamiento las FELDl, FELDl-15aa y FD12-15aa, respectivamente, están en un exceso molar de dos veces sobre el HBcAgl-185-Lys VLP derivado. La reacción de acoplamiento procede durante 4 horas a 25°C en un agitador giratorio. Ejemplo 9 Acoplamiento de FELDl, FELDl-15aa y FD12-I5aa a VLPs derivadas de AP205 La preparación de AP205 VLPs se describió en el ejemplo 1 y 2 en WO 2004/007538. La derivación de AP205 VLP es sustancialmente igual a la descrita en el ejemplo 7 para Qß VLP. Antes del acoplamiento de las proteína de fusión Fel di a AP205 VLP, FELDl, FELDl- 15aa y FD12-15aa derivadas por SMPH obtenidas del ejemplo 5, respectivamente, se incuban con TCEP (Pierce, Perbio Science) en cantidades equimolares durante 30 minutos a temperatura ambiente. Proteínas de fusión Fel di se añaden en un exceso molar de cinco veces a la solución de 143 µM de AP205 VLPs derivadas de SMPH. Las reacciones se incuban durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación. El acoplamiento de las proteína de fusión Fel di a la AP205 VLP reensamblada (obtenida del ejemplo 2) es sustancialmente igual al descrito arriba. Ejemplo 10 Producción de la composición inventiva a base de bacteriófago 2ß Un cultivo de 60 1 de E. coli AB259 (5xl07 células/mL) se llevó a cabo durante 2-3 horas a 37°C bajo aireación intensa (1 volumen de aire/ volumen de cultivo » minuto) para obtener un cultivo de alrededor de 2-4xl09 células/mL. Lisado de fago Qß aclarado fue inoculado a una multiplicidad de infección de 5, y se añadió CaCl2 hasta una concentración final de 2.2 mM. Después de una fase de absorción de 5 minutos, la aireación se intensificó (1.5 volúmenes de aire/ volumen de cultivo por minuto) . Las células se cultivaron más durante 3 horas, hasta que la OD650 nM alcanzara un valor estable, produciendo 4-6xl012 partículas de fago en el cultivo. Éstos fueron purificados como sigue. E. coli se liso al añadir 10 mL de CHC13/1 cultivo, 0.1 mg de lisozima/ 1 cultivo y EDTA hasta una concentración final de 20 mM. El lisado fue aclarado mediante centrifugación en una centrifuga de paso de flujo enfriada, las partículas de fago sedimentadas del lisado mediante precipitación con sulfato de amonio (500 g/l, produciendo alrededor de 66% de saturación). La suspensión se decantó primero, y el precipitado se aisló mediante centrifugación durante 30 minutos usando una centrífuga Janetzki K26 con rotor W.R. 6x500 mL a 6,000 rpm, o en una centrífuga Beckman J21 C usando un rotor JA-10. La pella fue resolubilizada en regulador de pH NT (NaCl 0.15 M, 0.% de Tripton) y se aclaró mediante centrifugación. El sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio (500 g/l añadidos, aproximadamente 66% de saturación) . El precipitado se aisló mediante centrifugación, fue resolubilizado el regulador de pH NT y aclarado de nuevo mediante centrifugación. Las partículas de fago se aislaron del sobrenadante resultante mediante ultracentrifugación durante 3.5 horas, usando un rotor tipo Beckman 35 a 32,000 rpm. Los fagos sedimentados fueron resuspendidos en regulador de pH NT y purificados mediante ultracentrifugación durante un gradiente de CsCl continuo convencional. La centrifugación se llevó a cabo usando un rotor Beckman Ti-70 (8x38.5), a 55,000 rpm durante 20 horas. Las partículas de fago fueron dializadas subsecuentemente contra 20 mM de HEPES, 150 mM de NaCl, pH 7.4, regulador de pH que fue usado en etapas de entrelazamiento químico como las descritas en el ejemplo 7. Ejemplo 11 Preparación de la composición inventiva a base de fago GA Un cultivo de 12 1 de E. coli Q 13 Hfr RNASsa I" cultivo en medio M9 que contenía 2% de hidrolisado dé caseína, 0.5% de extracto de levadura, 0.2% de glucosa se cultivó hasta un OD540 nM de 0.6-0.7, que corresponde a aproximadamente a 2xl08 células/mL, y se infecto con fago GA a una multiplicidad de infección de 10-20. El cultivo se llevó a cabo durante 2.5-3 horas más a 37°C produciendo aproximadamente 1011 partículas de fago en el cultivo total. Las células fueron lisadas al añadir 1-2% v/v de CHC13 e incubando el cultivo durante 15 minutos. El lisado se aclaró mediante centrifugación durante 30 minutos a 5,000 rpm en un rotor Janetzki K26. Las partículas de fago se precipitaron con sulfato de amonio (60% de saturación) de los medios de cultivo durante varios días a 4°C. La suspensión se decantó primero, y el precipitado se aisló mediante centrifugación durante 30 minutos a 6, 000 rpm en un rotor Janetzki K26. La pella se resuspendió en regulador de pH de NET (20 mM de Tris pH 7.8, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA), y las partículas se extrajeron mediante varios ciclos de centrifugación y resuspensión en porciones pequeñas de regulador de pH NET. Las porciones que contenían cápsides fueron agrupadas, y precipitadas con 60% de sulfato de amonio. Las partículas resuspendidas en regulador de pH NET se purificaron tres veces sobre una columna Sepharose 4B, y posteriormente sobre dos gradientes de sucrosa. Brevemente, un gradiente se preparó con 7 mL de 50%, 7 mi de 43%, 7 mi de 36%, 7 mi de 29% y 7 mi de 22% p/p de sucrosa en regulador de pH NET en tubos centrífugos. La solución de fagos (en regulador de pH NET) fue estratificada sobre el gradiente, y se centrifugó durante 17 horas en un rotor Beckman SW 28 a 25,000 rpm. Las fracciones que contenían cápsides fueron agrupadas, y separadas de sucrosa mediante filtración en gel sobre una columna Sepharose 4B. Las partículas de fago fueron posteriormente dializadas contra agua y liofilizadas para uso adicional. La condición de acoplamiento de proteínas de fusión Fel di al bacteriófago Qß o GA es sustancialmente igual a la condición de acoplamiento de la VLP de Qß como la descrita en el ejemplo 7. Ejemplo 12 Las proteínas de fusión Qß-Fel di son altamente inmunogénicas en ratones Ratones BALB/c fueron inmunizados se con 50 µg de Qß-Fel di obtenido del ejemplo 7 o 50 µg de Qß mezclado con Fel di recombinante (obtenida del ejemplo 5) en días 0, 14 y 21 y se tomó sangre los días 0, 21 y 28. Los anticuerpos específicos contra Fel di se midieron mediante ELISA usando Fel di para recubrimiento (10 µg/mL) . Brevemente, fueron usados F96 de 96 pocilios que fue pre-recubierta a 4°C durante la noche con 10 µg/mL de FELDl en NaHC03 0.1 M pH 9.6. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS-Tween 20 y el fondo se redujo al incubar las placas 2 horas a 37°C en regulador de pH de bloqueo (2% de BSA, (Sigma) en PBS-Tween20) . El suero se diluyó en regulador de pH de dilución de suero (2% de BSA, 1% de FCS en PBS-Tween20) . Se llevaron a cabo etapas de dilución dos veces y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador de placa ELISA. Las placas se lavaron cinco veces y anticuerpo de detección diluido 1:1,000 (IgG HRPO acoplado anti-ratón (Sigma)) se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente . Las placas se lavaron cinco veces con PBS-Tween20 y la detección se llevó a cabo usando solución de substrato OPD (0.066 M Na2HP04, 0.035 M de ácido cítrico pH 5.0 que contenía 10 mg de OPD (Fluka) y 8 µl de 30% de H202 (Fluka) por 25ml) y 5% de H2S04 en H20 como solución de paro. La absorbancia se midió usando lector de ELISA a 450 nM y para el cálculo de la media aritmética y el error estándar de la media (SEM) se usó software EXCEL (MS Office; Microsoft) . Los ratones inmunizados con Qß-FELDl mostraron una absorción máxima media de 120,000 y 75,000 en día 21 y día 28, respectivamente. En contraste, los ratones inmunizados con una mezcla de Qß/FELDl no entrelazada tuvieron un título más bajo de 7,000 y 6,000 el día 21 y día 28, respectivamente. Ejemplo 13 Inmunización de ratones como alumbre como adyuvante Ratones Balb/c hembras de 7-8 semanas de edad fueron vacunados tres veces (día 0, 14 y 28) con 50 µg de QßVLP-FELDl-HC de la técnica anterior. Las vacunas se diluyeron en 200 µl de PBS estéril o 100 µl de PBS y 100 µl de AluGel-S (Serva) , respectivamente, y se inyectaron subcutáneamente en la región inguinal izquierda y derecha. Se recolectaron sueros el día 14, 21, 28, 42, 56, 84 y 112. Los anticuerpos específicos contra el Fel di, FELD-HC y Qß VLP naturales fueron determinados por ELISA. Placas de microtitulación fueron recubiertas durante la noche con 1 µg/mL de Fel di natural (nFel di, Indoors biotechnologies) , 10 mg/mL de FELD1-HC y 10 mg/mL de Qß VLP, respectivamente. Después del lavado (0.05% de Tween 20/PBS) y el bloqueo con 2% de BSA en PBS, se añadieron sueros a diferentes diluciones en 2% de BSA/1% de FCS/PBS. Posteriormente el ELISA se llevó a cabo mediante un método estándar. Vacunas Qß vllp-FELDl-HC indujeron una respuesta de anticuerpo específico para Fel di alta de larga duración hacia natural y FELDl . El título anticuerpos fue más alto en presencia de alumbre que sin alumbre (tabla 2) . Tabla 2 Ejemplo 14 FELDl acoplado a Qß tiene potencial alérgico in vitro reducido drásticamente Para probar la capacidad de Qß-FELDl-HC para desencadenar una reacción alérgica i n vi t ro , se aislaron basófilos de la sangre de tres donadores alérgicos a gatos. En un individuo alérgico a gatos, tres basófilos son recubiertos con IgE específica de Fel di y responden con la sobre regulación de CD63 a estimulación alergénica. De esta manera, los basófilos del individuo alérgico fueron estimulados con cantidades graduadas de Qß-FELDl-HC o FELD1-HC solas y la sobre regulación de CD63 se evaluó mediante citometría de flujo. Aunque FELD1-HC (obtenida del ejemplo 5) desencadenó una fuerte sobre regulación de CD63 a la dilución más baja probada (alrededor de 0.2 ng/mL), Qß-FELDl-HC (obtenida del ejemplo 7) exhibió un potencial alérgico drásticamente reducido y requirió de cantidades 100- 1,000 veces más altas (aproximadamente 70 ng/mL) de FELD1-HC para que los basófilos respondieran.

Similarmente, esta prueba se repitió para las proteínas de fusión FELD-15aa-HC y FD12-15aa-HC ya sea solas o acopladas a Qß . Los resultados se muestran en la figura 2. Estas proteínas de fusión Fel di, cuando fueron acopladas a Qß, exhibieron todas un potencial alérgico drásticamente reducido. Ejemplo 15 FELDl acoplado a Qß es incapaz de desencadenar una reacción de pinchazo de piel en un individuo alérgico Si los alérgenos se introducen por pinchazo en la piel de un individuo alérgico un edema local se genera aproximadamente a los 20 minutos debido a la activación de células cebadas residentes en la piel. Aquí, la prueba de la piel se empleó para determinar el potencial alérgico de Qß-FELDl-HC (obtenida del ejemplo 7) . Las cantidades graduadas de Qß-FELDl-HC o cantidades correspondientes de FELD1-HC (obtenida del ejemplo 5) fueron introducidas en la piel de un individuo alérgico a gatos y la reacción de la piel se evaluó 20 minutos más tarde. Qß-FELDl-HC fue incapaz de desencadenar una reacción en la piel mientras que FELD1-HC fue activo a más de 100 veces concentraciones más bajas (tabla 3) .

Tabla 3 Cantidades correspondientes de FELDl-HC estuvieron presentes en ambas preparaciones Ejemplo 16 La inmunización de un individuo alérgico con Qß-FELDl-HC reduce la reactividad de la prueba de pinchazo de piel Para poder probar la capacidad de Qß-FELDl-HC para reducir síntomas clínicos, un paciente que sufría de alergia a gatos fue vacunado con 17 µg de Qß-FELDl-HC (obtenida del ejemplo 7) en día 0 (3 inyección de 2, 5 y 10 µg) , 40 µg el día 7 (3 inyecciones de 10, 10 y 20 µg) y 50 µg el día 14 (2 inyecciones de 10 y 40 µg) . Se llevaron a cabo pruebas de pinchazo de piel con un extracto de gato estandarizado los días 0, 14 y 21 y los diámetros de la reacción de hinchazón central se cuantificaron (figura 3) . A las 3 semanas, concentraciones de alérgeno 1000 veces más altas fueron requeridas para inducir síntomas clínicos en la prueba de pinchazo de piel que la cantidad inicial suficiente para inducir síntomas en la prueba de pinchazo.

Ejemplo 17 La inmunización de un individuo alérgico con Qß-FELDl-HC reduce síntomas alérgicos en la prueba de provocación nasal Para probar la capacidad de Qß-FELDl-HC para reducir síntomas clínicos, un paciente que sufría de alergia a gatos fue vacunado con 17 µg de Qß-FELDl-HC (obtenida del ejemplo 7) el día 0 (3 inyección de 2 , 5 y 10 µg) , 40 µg el día 7 (3 inyecciones de 10, 10 y 20 µg) y 50 µg el día 14 (2 inyecciones de 10 y 40 µg) . Se llevaron a cabo pruebas de provocación nasal con un extracto de gato estandarizado los días 0, 14 y 21 y los síntomas clínicos se evaluaron a cada nivel de escalada de dosis (figura 4A) y la graduación alérgica total se hizo de acuerdo con la figura 4B. Después de 3 semanas, concentraciones de alérgeno 100-1000 veces más altas se requirieron para inducir síntomas clínicos y la graduación alérgica general se redujo ampliamente. Ejemplo 18 Empaque de ácidos nucleicos inmunoestimuladores en Qß VLP Proteína de cápside Qß desensamblada y purificada se obtuvo como se describió en el ejemplo 1 (A) y (B) . Reensamble : se añadió ß-mecaptoetanol a la fracción de dímero de 10 mL hasta una concentración final de 10%, y 300 µl de una solución de (CpG)2oOpA oligodesoxinucleótido, que contenía 12.3 nmoles de oligonucleótido, fueron añadidos. La mezcla de reensambles se dializó primero contra 30 mL de regulador de pH NET (20 mM de Tris-HCl, pH 7.8 con 5mM de EDTA y 150 mM de NaCl) que contenía 10% de beta-mercaptoetanol durante 2 horas a 4°C, y después se dializó en un modo continuo, con un flujo de regulador de pH NET de 8 mL/hora durante 4 días a 4°C. La mezcla de reensamble se desalificó después contra agua mediante diálisis, con 6 intercambios de regulador de pH (4 x 100 mL, 2 X 1 litro) . El acoplamiento de las proteínas de fusión Fel di a la Qß VLP con CpG empacado dentro se lleva a cabo sustancialmente de la misma manera que la descrita en el ejemplo 7. Ejemplo 19 Suero especifico de Fel di inhibió la desgran?lación de basófilos in vitro inducida por proteína de fusión Fel di Para probar la capacidad de IgG específica para anti-Fel di para inhibir la desgranulación, basófilos de un individuo alérgico se estimularon con una cantidad definida de FELD1-HC o FELDl-15aa-HC pre- incubados con una serie de diluciones de cantidades cada vez más bajas de IgGs aisladas de conejos inmunizados con Qß-FELDl-HC. La sobre regulación de CD63 se evaluó mediante citometría de flujo. IgG anti-Fel di bloqueó la desgranulación inducida por Fel di en todas las concentraciones probadas mientras que IgG de control no mostró ningún efecto (tabla 4) .

Tabla 4 Ejemplo 20 Inmunización de ratones alérgicos a Fel di con Qß-FELDl-HC Un modelo de asma experimental de inflamación de vía aérea alérgica en ratones se usó para evaluar los efectos de la vacunación contra el alérgeno natural Fel di en la respuesta al anticuerpo IgG en suero y BAl (lavado bronqueo alveolar) de ratones BALB/c. Cinco ratones por grupo se sensibilizaron peritonealmente con 1 µg de Fel di natural en AlumGel-S el día 0. Los ratones fueron vacunados subcutáneamente el día 35 y 49 ya sea con 50 µg de Qß solo o con 50 µg de Qß-FELDl-HC antes de dos ataques intranasales subsecuentes el día 63 y día 70. Cinco días después del último ataque intranasal, los ratones fueron sacrificados para recolectar el suero y BALF (fluido de lavado bronqueo alveolar) para el análisis de la respuesta inmune humoral (títulos de subclase IgG) mediante ELISA. Placas de ELISA fueron recubiertas con un anticuerpo monoclonal anti-IgE de rata (2 µg/mL) diluido en regulador de pH Carbonat durante la noche a 4°C. Después del bloqueo de las placas con PBS/5% de BSA durante 2 horas, las placas se incubaron durante otras dos horas más ya sea con suero (primer pocilio 1:100 pre-diluido, después dilución 1:3 durante 8 etapas) o BAL (primer pocilio puro BAL luego dilución 1:3 durante 8 etapas) de ratones sensibilizados, vacunados y atacados con antígeno. Después de dos horas de incubación de muestra, suero y BAL-IgE se detectaron con un anticuerpo marcado con IgE-HRP anti-ratón de rata antes de la detección con el OPD de substrato.

Tabla 5 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición caracterizada porque comprende: (a) una partícula nuclear con al menos un primer sitio de fijación, en donde la partícula nuclear es una partícula tipo virus (VLP) o una partícula de virus, (b) por lo menos un antígeno con al menos un segundo sitio de fijación, en donde el por lo menos un antígeno es una proteína Fel di o un fragmento de Fel di, y en donde (a) y (b) son enlazados covalentemente a través del por lo menos un primero y el por lo menos un segundo sitio de fijación. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína Fel di comprende la cadena 1 de Fel di y cadena 2 de Fel di, en donde la cadena 1 de Fel di está asociada con la cadena 2 de Fel di al menos por un enlace covalente. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque la proteína Fel di es una proteína de fusión Fel di que comprende la cadena 1 de Fel di y cadena 2 de Fel di, en donde la cadena 1 de Fel di y cadena 2 de Fel di son fusionadas ya sea directamente por un enlace péptido o por medio de un separador, el cual enlaza el término N de una cadena con el término C de otra cadena. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la cadena 2 de Fel di es fusionada por medio de su término C al término N de la cadena 1 de Fel di ya sea directamente o por medio de un separador. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la cadena 1 de Fel di es fusionada por medio de su término C al término N de la cadena 2 de Fel di ya sea directamente o por medio de un separador . 6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizada porque el separador consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 1-20 residuos de aminoácido. 7. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-6, caracterizada porque la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 24; (b) SEQ ID NO: 54; (c) SEQ ID NO: 55; (d) SEQ ID NO: 56 y (e) SEQ ID NO: 57. 8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-6, caracterizada porque la cadena 1 de Fel di comprende una secuencia de SEQ ID NO: 22 o una secuencia homologa de la misma, en donde la secuencia homologa tiene una identidad con SEQ ID NO: 22 de más de 80%, preferiblemente más de 90% o aún más preferiblemente más de 95%. 9. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-6, caracterizada porque la cadena 2 de Fel di comprende una secuencia de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26, o una secuencia homologa de la misma, en donde la secuencia homologa tiene una identidad con SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26 de más de 80%, preferiblemente más de 90% o aún más preferiblemente más de 95%. 10. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la partícula nuclear es una partícula de virus, y en donde preferiblemente la partícula de virus es una partícula de virus de un bacteriófago de ARN. 11. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizada porque la partícula nuclear es una partícula tipo virus, y en donde preferiblemente la partícula tipo virus es una partícula tipo virus de un bacteriófago de ADN. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque el bacteriófago de ARN se selecciona de Qß, fr, GA o AP205. 13. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el primer sitio de fijación comprende, o de preferencia es, un grupo amino, preferiblemente un grupo amino de una lisina. 14. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el segundo sitio de fijación comprende, o de preferencia es, un grupo sulfhidrilo, preferiblemente un grupo sulfhidrilo de una cisteína. 15. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende además un enlazador. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el enlazador es fusionado al término C de la proteína Fel di o al término C del fragmento de Fel di. 17. Una vacuna caracterizada porque comprende la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16. 18. La vacuna de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque comprende además al menos un adyuvante . 19. Una composición farmacéutica caracterizada 5 porque comprende : (a) la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. 20. Un método para producir la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una partícula nuclear con al menos un primer sitio de fijación, en donde la partícula nuclear es una partícula tipo virus (VLP) o una partícula de virus; (b) proporcionar al menos un antígeno con por lo menos un segundo sitio de fijación, en donde el antígeno es una proteína Fel di o un fragmento de Fel di, y (c) enlazar la partícula nuclear y el por lo menos un antígeno para producir la composición, en donde el por lo menos un antígeno y la partícula nuclear se enlazan a través del por lo menos un primero y del por lo menos un segundo sitios de fijación. 21. Uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de alergia a gatos. 22. Un método para tratar alergia a gatos, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-18 a un humano o a un mamífero no humano, en donde de preferencia el mamífero no humano es un perro, o un gato. 23. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o la vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-18, caracterizada porque es para usarse en un método para tratar alergia a gatos que comprende administrar la composición o la vacuna a un humano o a un mamífero no humano, en donde de preferencia el mamífero no humano es un perro, o un gato. 24. Una proteína de fusión Fel di caracterizada porque comprende la cadena 1 de Fel di y la cadena 2 de Fel di fusionadas por medio de un separador de aminoácidos, el cual enlaza el término N de una cadena con el término C de otra cadena, en donde el separador de aminoácidos consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 10-30, residuos de aminoácido, y en donde la proteína de fusión no es una proteína de fusión que comprende la cadena 1 de SEQ ID NO: 22 fusionada a través de (GGGGS)3 al término N de la cadena 2 de SEQ ID NO: 23, 25 ó 26, y en donde la proteína de fusión deslindada se expresa en un sistema de expresión de baculovirus . 25. La proteína de fusión Fel di de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el separador consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 2, 3 ó 4 veces la repetición GGGGS . 26. La proteína de fusión Fel di de conformidad con la reivindicación 24 ó 25, caracterizada porque se produce en E. coli . 27. La proteína de fusión Fel di de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26, caracterizada porque la cadena 2 de Fel di está en el término N de la proteína de fusión. 28. La proteína de fusión Fel di de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-26, caracterizada porque la cadena 1 de Fel di está en el término N de la proteína de fusión. 29. La proteína de fusión Fel di de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-28, caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (a) SEQ ID NO: 24; (b) SEQ ID NO: 55 y (c) SEQ ID NO: 57. 30. Una proteína de fusión Fel di caracterizada porque comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, en donde la proteína Fel di se produce en E . coli .