CN101951943A

CN101951943A - 神经生长因子偶联物及其用途

Info

Publication number: CN101951943A
Application number: CN2008801216167A
Authority: CN
Inventors: M·巴克曼; G·詹宁斯; T·罗恩
Original assignee: Cytos Biotechnology AG
Current assignee: Cytos Biotechnology AG
Priority date: 2007-12-20
Filing date: 2008-12-22
Publication date: 2011-01-19
Also published as: AU2008339904A1; KR20100111273A; WO2009080823A2; BRPI0821383A2; RU2010129538A; CA2710141A1; MX2010006610A; JP2011506582A; EP2231179A2; US20110212122A1; WO2009080823A3

Abstract

本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供包含与至少一种抗原连接的病毒样颗粒(VLP)的组合物，其中所述抗原是NGF抗原。本发明也提供制备所述组合物的方法。本发明的组合物可以用于生产疫苗，特别是用于治疗疼痛。而且，本发明的组合物能诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答。

Description

神经生长因子偶联物及其用途

技术领域

本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供包含与至少一种抗原连接的病毒样颗粒(VLP)的组合物，其中所述抗原是NGF抗原。本发明还提供制备所述组合物的方法。本发明的组合物和方法可以用于生产疫苗，特别是用于治疗慢性疼痛。而且，本发明的组合物能够诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答。

背景技术

神经生长因子(NGF)也被称为NGFβ，是一种神经营养因子和神经营养蛋白家族的成员，除NGF以外，该家族还包括脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白3和神经营养蛋白4/5(Pezet和McMahon，Annu.Rev.Neurosci.29：507-38(2006))。如同所有神经营养蛋白一样，NGF表达为大约27kDa的蛋白原，并且被切割为大约14kDa的成熟形式(Edwards等人，J Biol Chem.263(14)：6810-5(1988)；Seidah等人，Biochem J.314：951-60(1996))。这种成熟形式通过结合两种受体发挥其生物功能：共同受体p75^NTR，该受体以低亲和力结合所有神经营养蛋白，和高亲和力原肌球蛋白受体激酶A(trkA)受体。TrkA是受体酪氨酸激酶，它在配体结合时二聚化，并且激活不同的信号途径(Patapontian和Reichardt，Curr Opin Neurobiol.11(3)：272-802001))。在早期发育过程中，被NGF-trkA相互作用激活的这些信号途径阻断细胞凋亡并且促进伤害感受系统的感觉神经元的存活和神经生长(Patel等人，Neuron 25(2)：345-57(2000))。在出生后，这些神经元的存活对NGF的依赖性降低，但是在出生后时期NGF继续对伤害性感受器发挥深刻的生物学效应。它调节神经递质、受体和电压门控性离子通道的表达，由此控制伤害性感受器的响应性。NGF的另一功能上重要的作用是通过翻译后控制使伤害性感受器响应敏感，这导致瞬时感受器电位香草酸受体1(TRPV1)离子通道的响应性增强(Pezet和McMahon，Annu.Rev.Neurosci.29：507-38(2006))。

NGF由于其在调节成人中伤害性感受器响应性中的作用，参与动物和人的痛觉的介导。皮下或肌肉注射少量NGF导致持续数日的疼痛和压痛(Pezet和McMahon，Annu.Rev.Neurosci.29：507-38(2006))。在人体中，NGF水平与疼痛强度之间的相关性可在大量疼痛条件如慢性前列腺炎(Miller等人，Urology，2002.59(4)：603-8(2002))、间质性膀胱炎(Lowe等人，Br J Urol.79(4)：572-7(1997))等中进行评估。基本上，可以区别两种类型的疼痛：伤害性疼痛和神经性疼痛。伤害性疼痛由组织损伤引起的伤害性感受器的刺激引起，例如在炎症过程中、损伤或手术切口后，而神经性疼痛来源于神经系统本身的病理，例如在神经受压迫或创伤后，或在影响感觉神经元的感染或自身免疫后。

在炎症过程中，NGF作为产生疼痛的炎症介质起作用。它是由外周的大量不同细胞型产生的，如角质形成细胞、上皮细胞、平滑肌细胞和许旺细胞，以及在炎症过程中，特别是由肥大细胞和巨噬细胞产生的。NGF水平在动物和人的炎症和慢性疼痛状况下显著升高。已经在大量啮齿类动物伤害性疼痛模型中证明，NGF的阻断显著降低疼痛敏感性。例如，它降低皮下注射CFA后的热和机械痛觉过敏(Woolf等人，Br.J.Pharmacol.121(3)：417-24(1997)并且抑制关节炎相关的疼痛(Shelton等人，Pain 116(1-2)：8-16(2005))和骨癌痛(Sevcik等人，Pain115(1-2)：128-41(2005))。尽管NGF在神经性疼痛中的作用没有在炎症疼痛中的作用那么确定，但是一些研究小组也已经表明在啮齿类动物神经性疼痛模型中成功进行了抗NGF治疗(Ramer等人，Neurosci.Lett.251(1)：53-6(1998)，Ramer等人，Eur.J.Neurosci.11(3)：837-46(1999))。

美国专利5,147,294请求保护NGF拮抗剂，尤其是NGF单克隆抗体，用于治疗疼痛的用途。自此以后，已申请了大量的专利来请求保护抗NGF单克隆抗体在治疗慢性疼痛中的用途。

慢性疼痛是严重的健康问题，影响到欧洲和美国人群的大约20％。只有不到30％的慢性疼痛患者使用当前的治疗能够获得足够的缓解(Pezet和McMahon，Annu.Rev.Neurosci.29：507-38(2006)。而且，现有的用于治疗慢性疼痛的药物，主要是阿片类药物和非甾体抗炎药(NSAID)，如果使用较长的一段时间，将伴随有严重的副作用。

发明内容

此处公开的新的治疗策略是基于针对NGFβ的主动免疫。公开了诱导患者的免疫系统产生NGF-中和抗体的组合物。主动免疫可以导致NGFβ的持久中和，因此可以减少对每日药物摄取的需要。我们现在惊奇地发现，分别包含至少一种NGF抗原的本发明的组合物和疫苗能够诱导免疫应答，特别是抗体应答，导致针对NGF的高抗体效价。而且，我们已经惊奇地发现，分别包含至少一种NGF抗原的本发明的组合物和疫苗能够在慢性疼痛动物模型中减轻疼痛。这表明本发明的组合物和疫苗分别产生的免疫应答，特别是抗体，能够在体内特异性结合NGF，并且中和及抑制其功能。

因此，本发明的一个方面是一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是NGF抗原，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。NGFβ是具有生物活性的受体配体，当施用于动物时，该生物活性可以导致不希望的副作用。本发明因此提供组合物，其中所述NGF蛋白是NGF突变蛋白，并且其中所述NGF突变蛋白具有降低的生物活性或没有生物活性，而同时保持诱导NGFβ中和抗体的能力。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述NGF抗原是NGF突变蛋白。

通常，非常不希望的副作用可能与抗NGFβ疫苗诱导T细胞应答有关。然而，本发明的组合物特别可用于有效诱导针对特定环境内的NGF抗原的强抗体应答，同时降低或消除不希望的T细胞应答。在一个优选实施方案中，本发明的组合物因此进一步包含至少一种聚阴离子大分子，其中所述聚阴离子大分子包装于所述VLP内，并且其中优选地所述聚阴离子大分子是聚阴离子多肽，并且其中优选地所述聚阴离子多肽是聚谷氨酸或聚天冬氨酸，最优选聚谷氨酸。

本发明的另一个方面是包含治疗有效量的本发明组合物的疫苗组合物。

本发明的另一方面是包含(a)本发明的组合物和(b)药学可接受的载体的药物组合物。

本发明的另一方面是免疫方法，优选针对NGFβ的免疫方法，所述方法包括给动物，优选地给人施用本发明的组合物、本发明的疫苗组合物或本发明的药物组合物。

本发明的另一方面是用作药物的本发明的组合物、本发明的疫苗组合物或本发明的药物组合物。

本发明的另一方面是本发明的组合物或本发明的疫苗组合物用于制备治疗疼痛，优选治疗慢性疼痛的药物中的用途。

本发明的另一方面是用于治疗疼痛，优选治疗慢性疼痛的本发明的组合物或本发明的疫苗组合物或本发明的药物组合物。

本发明的另一方面是一种生产本发明的组合物的方法，所述方法包括：(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种NGF抗原；和(c)将所述VLP与所述NGF抗原连接，产生所述组合物，其中所述NGF抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。

附图说明

图1：免疫小鼠的纯化总IgG对mNGFβ的体外中和。TF-1细胞响应于mNGFβ的增殖通过BrdU掺入法进行测定。在10μg/ml来自Qβ免疫动物的总IgG存在下响应于10ng/ml mNGFβ的增殖设定为100％，响应于所有其它条件的TF-1增殖相对于该值进行计算。圆形代表与来自Qβ免疫动物的IgG预温育后获得的值，正方形代表与来自Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫动物的IgG预温育后获得的值。给出了重复三次的平均值+/-SD。

图2：CIA小鼠中临床评分和平均体重的发展。小鼠在第0、10、20天免疫，并在第27和48天诱导CIA。A)用Qβ(实心正方形)或Qβ-mNGFβ-His-GGC(空心圆形)免疫的小鼠的临床关节炎评分。数值作为每只小鼠全部四肢和组(n＝8)的平均得分+/-SEM给出。B)用Qβ(实心正方形)或Qβ-mNGFβ-His-GGC(空心圆形)免疫的小鼠的平均体重。数值作为平均体重(n＝8)+/-SEM给出。

图3：酵母聚糖A诱导的炎性痛的热超敏性和机械异常性疼痛。小鼠在第0、10、20天免疫，并且在第31天通过向左后足爪注射酵母聚糖A诱导炎性痛。A)用Qβ(实心正方形)或Qβ-mNGFβ-His-GGC(空心圆形)免疫的小鼠的热超敏性，以爪回缩时间确定。数值作为平均值(n＝4)+/-SEM给出。B)用Qβ(实心正方形)或Qβ-mNGFβ-His-GGC(空心圆形)免疫的小鼠的机械异常性疼痛，以导致爪回缩的施加的压力确定。数值作为平均值(n＝4)+/-SEM给出。

图4：在Qβ-(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC免疫的小鼠中用酵母聚糖A诱导的炎性痛的热超敏性和机械异常性疼痛。小鼠在第0、14、28、42天免疫，并且在第62天通过向左后足爪注射酵母聚糖A诱导炎性痛。A)用Qβ(PolyGlu)(实心正方形)、Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC(实心三角形)或Qβ-mNGFβ-His-GGC(空心圆形)免疫的小鼠的热超敏性，以爪回缩时间确定。数值作为平均值(n＝4)+/-SEM给出。B)用Qβ(PolyGlu)(实心正方形)、Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC(灰色实心圆形)或Qβ-mNGFβ-His-GGC(空心圆形)免疫的小鼠的机械异常性疼痛，以导致爪回缩的施加的压力确定。数值作为平均值(n＝4)+/-SEM给出。

发明详述

除非另有定义，本文使用的所有技术和科技术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。

抗原：本文所用的术语“抗原”指如果被MHC分子呈递，则能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。本文所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有Th细胞表位或者连接于Th细胞表位上，并且包含于佐剂中。一个抗原可能具有一个或多个表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应表示抗原优选地一般以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。本文所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。在一个非常优选的实施方案中，所述抗原是NGF抗原。

表位：术语“表位”是指多肽的连续或不连续部分，它可以被抗体或被MHC分子环境内的T细胞受体免疫特异性地结合。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定不包括交叉反应性。一个表位在该表位独特的空间构象中一般包含5-10个氨基酸。

联接的(associated)：本文所用的术语“联接的”(或其名词：联接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，两个分子联接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。

第一附着位点：本文所用的短语“第一附着位点”是指VLP(优选RNA噬菌体的VLP)中天然存在的或者人工添加到VLP(优选RNA噬菌体的VLP)中的一种元件，第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应基如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一附着位点的化学反应基的一个优选的实施方案是氨基酸(如赖氨酸)的氨基。在一个优选的实施方案中，所述第一附着位点是赖氨酸残基的氨基，其中优选地所述赖氨酸残基是天然存在于所述VLP、优选地存在于RNA噬菌体的所述VLP的赖氨酸残基。

第一附着位点一般位于VLP、优选RNA噬菌体的VLP、最优选RNA噬菌体Qβ的VLP的表面上，优选外表面上。多个第一附着位点典型且优选地以重复构型存在于病毒样颗粒、优选RNA噬菌体的VLP、最优选RNA噬菌体Qβ的VLP的表面上，优选外表面上。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键联接。在进一步优选的实施方案中，第一附着位点天然存在于VLP中。可替代地，在另一个优选的实施方案中，第一附着位点被人工添加到VLP上。在一个优选实施方案中，第一附着位点与所述VLP通过至少一个共价键、优选地通过至少一个肽键联接，其中所述VLP是RNA噬菌体的VLP，优选RNA噬菌体Qβ的VLP。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是赖氨酸残基的氨基，其中所述赖氨酸残基是外壳蛋白的赖氨酸残基，优选RNA噬菌体的外壳蛋白的赖氨酸残基，最优选RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白的赖氨酸残基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是RNA噬菌体的外壳蛋白的赖氨酸残基的氨基，其中优选地所述外壳蛋白包含或者优选地由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是赖氨酸残基，其中优选地所述赖氨酸残基是外壳蛋白的赖氨酸残基，优选RNA噬菌体的外壳蛋白的赖氨酸残基，最优选RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白的赖氨酸残基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白的赖氨酸残基。

第二附着位点：本文使用的短语“第二附着位点”是指天然存在于或者人工添加到NGF抗原上的一种元件，第一附着位点可以与之连接。NGF抗原的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应基例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基、或其组合。作为第二附着位点的化学反应基的一个优选的实施方案是巯基。在进一步优选的实施方案中，所述第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。本文使用的术语“具有至少一个第二附着位点的抗原”和可互换使用的术语“具有至少一个第二附着位点的NGF抗原”是指包含NGF抗原和至少一个第二附着位点的构建体。在一个优选实施方案中，第二附着位点天然存在于NGF抗原中。在另外一个优选的实施方案中，第二附着位点被人工添加到NGF抗原上。在一个优选实施方案中，第二附着位点与NGF抗原通过至少一个共价键，优选地通过至少一个肽键联接。在一个优选实施方案中，具有至少一个第二附着位点的NGF抗原进一步包含连接体，其中优选地所述连接体包含至少一个第二附着位点，其中进一步优选地所述连接体与NGF抗原通过肽键融合。

外壳蛋白：术语“外壳蛋白”是指能够掺入病毒衣壳或VLP内的病毒蛋白质，优选病毒(优选RNA噬菌体)的天然衣壳的亚单位。外壳蛋白也被称为衣壳蛋白。

连接的：本文所用的术语“连接的”(或其名词：连接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键连接，更优选只通过非肽键连接。然而，本文所用的术语“连接”应当不仅包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且可替代地并且优选地，包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子的间接连接，典型且优选地通过使用至少一个、优选一个异双功能交联剂进行连接。因此，在一个优选实施方案中，所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点通过至少一个、优选恰好一个异双功能交联剂共价连接，其中优选地所述第一附着位点是赖氨酸残基的氨基，其中进一步优选地所述第二附着位点是半胱氨酸残基的巯基。

连接体：本文所用的“连接体”将第二附着位点与NGF抗原联接，或者已经包含第二附着位点、基本由、或者由第二附着位点组成。优选地，本文所用的“连接体”已经包含第二附着位点，典型且优选地-但不是必需地-是一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。在一个优选实施方案中，所述连接体是氨基酸连接体。在一个非常优选的实施方案中，所述连接体由恰好一个半胱氨酸残基组成。在进一步优选的实施方案中，所述连接体包含或由恰好一个半胱氨酸残基组成，且所述第二附着位点是所述恰好一个半胱氨酸残基的巯基。可用于本发明的其他连接体有包含C1-C6烷基-、环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。而且，优选包含C1-C6烷基-、环烷基-(C5，C6)、芳基-或杂芳基-部分和另外的氨基酸的连接体也可以用作本发明的连接体，并且包括在本发明的范围内。连接体与NGF抗原的联接优选地通过至少一个共价键，更优选地通过至少一个肽键。在非天然存在于NGF抗原中的第二附着位点的情况下，连接体与至少一个第二附着位点例如半胱氨酸优选地通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键联接。

氨基酸连接体：术语“氨基酸连接体”是指包含至少一个氨基酸残基的连接体。通常，术语“氨基酸连接体”并不意味着所述氨基酸连接体仅由氨基酸残基组成。然而，在一个优选实施方案中，所述氨基酸连接体仅由氨基酸残基组成。连接体的氨基酸残基优选包含本领域已知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸，全L型或全D型或其混合物，最优选全L型。本发明的连接体的进一步优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，因此这些分子也包括在本发明内。

NGF抗原：本文使用的术语“NGF抗原”是指NGF蛋白、NGF片段或NGF突变蛋白。非常优选地，所述NGF抗原是NGF突变蛋白。本文使用的术语“NGF抗原”还包括翻译后修饰，包括但不限于如上定义的NGF抗原的糖基化、乙酰化、磷酸化。典型且优选地，但是不是必须地，所述NGF抗原被单克隆和/或多克隆抗NGFβ抗体特异性结合。

NGF蛋白：本文使用的术语“NGF蛋白”应当包括任何如下多肽：该多肽包含或者可替代地或优选地由SEQ ID NO：22的人NGF、SEQID NO：24的小鼠NGF或来自任何其它动物的相应直向同源物(ortholog)组成。来自各种动物物种的非常优选的NGF直向同源物是SEQ IDNO：32-39的多肽。NGF蛋白一般但是不是必须包含生物活性，优选地在细胞增殖试验中。而且，本文使用的术语“NGF蛋白”应当也包括任何如下多肽：该多肽包含或者可替代地或优选地由任何天然或遗传工程变体组成，该变体具有与SEQ ID NO：22的人NGF、SEQ IDNO：24的小鼠NGF或来自任何其它动物的相应直向同源物高于70％，优选地高于80％，优选地高于85％，更优选地高于90％，更优选地高于95％，最优选地高于97％的氨基酸序列同一性。本文使用的术语“NGF蛋白”应当还包括翻译后修饰，包括但不限于如本文定义的NGF蛋白的糖基化、乙酰化、磷酸化。优选地，本文定义的NGF蛋白由长度最多200个氨基酸、甚至更优选地长度最多150个氨基酸、更优选地长度最多130个氨基酸组成。典型且优选地，所述NGF蛋白被单克隆和/或多克隆抗NGFβ抗体特异性结合。此外，可用于本发明的目的的NGF蛋白典型且优选地当以免疫原性偶联物的形式、优选地以含有噬菌体Qβ的VLP的偶联物的形式施用于所述动物时，能够诱导在动物中形成抗NGF抗体。最优选的是当以免疫原性偶联物的形式、优选地以含有噬菌体Qβ的VLP的偶联物的形式施用于所述动物时能够诱导在动物中形成抗NGF抗体的NGF蛋白，其中所述抗NGF抗体在体外和/或体内试验中能够中和NGF蛋白的生物活性，优选地如本文所述(参见实施例9至12和15)。本领域技术人员应当明白，典型且优选地，用含有特定物种的NGF蛋白的本发明组合物诱导的抗体能够特异性结合和/或中和所述物种的NGF蛋白。

NGF片段：本文使用的术语“NGF片段”包括：包含、基本由或者可替代地或优选地由NGF蛋白的至少8个，优选地至少12个，更优选地至少20个，更优选地至少30个相邻氨基酸组成的任何多肽，以及包含、基本由或者可替代地或优选地由本文定义的NGF蛋白的最多60个，更优选地最多50个，更优选地最多45个，更优选地最多40个相邻氨基酸组成的相同的多肽，以及与它们具有高于70％，更优选地高于80％，更优选地高于90％，甚至更优选地高于95％的氨基酸序列同一性的任何多肽。在一个优选实施方案中，所述NGF片段包含、基本由或优选地由选自以下的多肽组成：(a)由本文定义的NGF蛋白(优选SEQ ID NO：22)的8-60个、优选12-60个、更优选20-60个、更优选30-60个相邻氨基酸组成的多肽，和(b)具有与(a)的多肽高于70％、优选地高于80％、更优选地高于90％、甚至更优选地高于95％的氨基酸序列同一性的多肽。优选地，本文使用的术语“NGF片段”包括：包含、基本由或可替代地或优选地由SEQ ID NO：22的NGF蛋白的至少12个相邻氨基酸组成的任何多肽，以及包含、基本由或可替代地或优选地由SEQ ID NO：22的NGF蛋白的最多45个，更优选地最多40个相邻氨基酸组成的相同的多肽。本文使用的术语“NGF片段”应当还包括翻译后修饰，包括但不限于如本文定义的NGF片段的糖基化、乙酰化、磷酸化。NGF片段一般但不是必须包含生物活性，优选地在细胞增殖试验中。典型且优选地，所述NGF片段被单克隆和/或多克隆抗NGFβ抗体特异性结合。此外，可用于本发明的目的的NGF片段典型且优选地当以免疫原性偶联物的形式，优选地以含有噬菌体Qβ的VLP的偶联物的形式施用于所述动物时，能够诱导在动物中形成抗NGF抗体。最优选的是当以免疫原性偶联物的形式，优选地以含有噬菌体Qβ的VLP的偶联物的形式施用于所述动物时能够诱导在动物中形成抗NGF抗体的NGF片段，其中所述抗NGF抗体在体外和/或体内试验中能够中和NGF蛋白的生物活性，优选地如本文所述(参见实施例9至12和15)。本领域技术人员应当明白，典型且优选地，用含有特定物种的NGF片段的本发明组合物诱导的抗体能够特异性结合和/或中和所述物种的NGF蛋白。

NGF突变蛋白：本文使用的术语“NGF突变蛋白”包括包含或可替代地或优选地由突变的氨基酸序列组成的任何多肽，其中将要突变的氨基酸序列是NGF蛋白，优选人NGF蛋白，最优选SEQ ID NO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少一个且最多20个、优选地至少一个且最多10个、更优选地至少一个且最多5个位置处加以改变，其中所述位置中的氨基酸残基通过置换、缺失、插入或其任何组合改变。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白是突变的氨基酸序列，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少一个且最多4个位置处通过置换、缺失或其任何组合加以改变，其中优选地所述位置处的氨基酸残基通过置换进行改变。典型地，但不是必须地，所述NGF突变蛋白被单克隆和/或多克隆抗NGFβ抗体特异性结合。NGF突变蛋白包括与所述将要突变的氨基酸序列相比降低的生物活性。最优选地，所述NGF突变蛋白不包括可检测到的生物活性。此外，可用于本发明的目的的NGF突变蛋白典型且优选地当以免疫原性偶联物的形式，优选地以含有噬菌体Qβ的VLP的偶联物的形式施用于所述动物时，能够诱导在动物中形成抗NGF抗体。最优选的是当以免疫原性偶联物的形式，优选地以含有噬菌体Qβ的VLP的偶联物的形式施用于所述动物时能够诱导在动物中形成抗NGF抗体的NGF突变蛋白，其中所述抗NGF抗体在体外和/或体内试验中能够中和NGF蛋白的生物活性，优选地如本文所述(参见实施例9至12)。本领域技术人员应当明白，典型且优选地，用含有NGF突变蛋白的本发明组合物诱导的抗体(其中所述将要突变的氨基酸序列是特定物种的序列)能够特异性结合和/或中和所述物种的NGF蛋白。

在本申请中，抗体(优选单克隆抗体或多克隆抗体)与抗原的特异性结合是指特征为亲和力(Ka)为10⁶M^-1或更高，优选10⁷M^-1或更高，更优选10⁸M^-1或更高，最优选10⁹M^-1或更高的结合。抗体的亲和力可以由本领域技术人员容易地测定(例如，通过Scatchard分析、基于Biacore或基于ELISA的方法)。最优选地，单克隆和/或多克隆抗NGF抗体与NGF抗原的特异性结合通过ELISA进行测定，最优选地在基本如本申请实施例5所述的条件下测定。

生物活性：本文使用的术语“生物活性”是指细胞增殖试验中抗原的活性，优选NGF抗原的活性，最优选NGF蛋白、NGF片段和/或NGF突变蛋白的活性，其中优选地所述细胞增殖试验是基于NGF依赖的人红白血病(erythroleukemic)TF-1细胞系，其中更进一步优选地所述细胞增殖试验是在基本如本申请实施例6所述的条件下进行的。如果NGF抗原能够诱导可检测水平的细胞增殖，则认为它具有生物活性。典型且优选地，如果NGF抗原能够诱导使用适当标准达到的最大增殖的至少20％、优选至少50％、更优选至少80％的细胞增殖，则NGF抗原具有生物活性。如果NGF抗原(优选NGF突变蛋白)不诱导可检测水平的细胞增殖，则它不具有生物活性。典型且优选地，如果NGF抗原诱导使用适当标准达到的最大增殖的最多20％、优选最多15％、更优选最多10％、更优选最多5％的细胞增殖，则它不具有生物活性。如果NGF突变蛋白诱导的细胞增殖与包含所述将要突变的氨基酸序列的多肽相比低于100％、优选低于80％、更优选低于60％、更优选低于40％、更优选低于20％，则认为该NGF突变蛋白具有降低的生物活性。

在本发明上下文中，NGF抗原，特别是NGF蛋白、NGF片段和NGF突变蛋白，如果当以免疫原性偶联物的形式施用于测试动物时诱导抗体应答，其中在所述抗体应答中产生的抗体特异性结合所述NGF抗原，则被认为“能够诱导抗体”。典型且优选地，所述NGF蛋白以包含病毒样颗粒的偶联物的形式，最优选地以包含RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒的偶联物的形式施用于所述测试动物。最优选地，所述NGF抗原以本文公开的组合物、疫苗组合物或药物组合物的形式施用于所述测试动物。非常优选地，NGF抗原诱导抗体的能力在基本如实施例8所述的条件下检测。

在本发明上下文中，如果NGF抗原，特别是NGF蛋白、NGF片段和NGF突变蛋白，当以免疫原性偶联物的形式施用于测试动物时诱导抗体应答，其中所述抗体应答产生的抗体能够中和NGF蛋白，则被认为“能够诱导中和抗体”。抗体中和NGF蛋白的能力在使用细胞增殖试验的体外分析中进行测定，其中优选地所述细胞增殖试验是基于NGF依赖的人红白血病TF-1细胞系，其中进一步优选地所述细胞增殖试验在基本如本申请实施例6和9所述的条件下进行。当一种抗体在所述细胞增殖试验中降低或消除所述NGF蛋白的生物活性时，认为该抗体能够中和NGF蛋白。可替代地，抗体中和NGF蛋白的能力在体内试验中测定，优选地在疼痛动物模型中测定，其中所述抗体中和NGF蛋白的能力最终被检测为所述动物模型中疼痛的好转。优选的疼痛动物模型是在小鼠中用胶原诱导的关节炎、小鼠中用酵母聚糖A诱导的炎性痛、紫杉醇诱导的神经性疼痛，其中优选地所述试验基本在如实施例10、11或15中公开的条件下进行。

有序且重复的抗原阵列：本文所用的术语“有序且重复的抗原阵列”通常是指抗原的重复模式，或者其特征在于抗原相对于病毒样颗粒的空间排列具有典型且优选地高度的均一性。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是几何模式。本发明的某些实施方案，例如RNA噬菌体的VLP，是合适的有序且重复的抗原阵列的典型且优选的实例，其具有严格重复的类晶体抗原排列，优选间隔1-30纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步更优选1.6-7纳米。

多肽：本文所用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，而不是指特定长度的产物。因此，多肽的定义内包括肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质。该术语也包括多肽的翻译后修饰，例如.：糖基化、乙酰化、磷酸化等。

多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序等已知计算机程序常规确定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序，优选使用Bestfit来确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5％的同源性缺口。上述确定多肽之间百分同一性的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多肽或其片段。

如技术人员所理解的，保守氨基酸置换包括电子等排置换，即其中氨基酸的带电、极性、芳香族、脂肪族或疏水性质得以保持的置换。典型的保守氨基酸置换是下组之一内的氨基酸之间的置换：(a)Gly，Ala；Val，Ile和Leu；(b)Asp，Glu；Asn，Gln；Ser，Thr，Cys；Lys和Arg；和(c)Phe和Tyr。

病毒颗粒：在此使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。在某些病毒类型中，它包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；另外一些具有额外的结构(例如被膜、尾等)。

病毒样颗粒(VLP)：在此使用的病毒样颗粒是指非复制性或非传染性的，优选非复制性且非传染性的病毒颗粒，或者非复制性或非传染性的，优选非复制性且非传染性的类似于病毒颗粒(优选病毒衣壳)的结构。这里使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所含的基因组。这里使用的术语“非传染性”是指不能进入宿主细胞。优选地，本发明的病毒样颗粒是非复制性和/或非传染性的，因为它由于物理、化学灭活或者由于遗传操作而缺乏全部或部分的病毒基因组或基因组功能。典型且优选地，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部或部分复制性和传染性部分。本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体(优选RNA噬菌体)的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。典型地，有60、120、180、240、300、360个和360个以上的病毒蛋白亚单位。一般且优选地，这些亚单位的相互作用导致形成具有固有重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构，其中所述结构一般是球形或管状。

重组VLP：本文使用的术语“重组VLP”是指通过包括重组DNA技术的至少一个步骤的方法获得的VLP。

包装的：本文所用的术语“包装的”是指聚阴离子大分子相对于VLP的状态。本文所用的术语“包装”包括结合，该结合可以是共价的，例如通过化学偶联，也可以是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。在一个优选实施方案中，术语“包装的”是指聚阴离子大分子被VLP包封或部分包封。因此，聚阴离子大分子可以被VLP包封，而不需存在实际上的结合，特别是共价结合。在优选的实施方案中，至少一种聚阴离子大分子被包装在VLP内，最优选地以非共价的方式包装。将聚阴离子大分子如聚谷氨酸包装于VLP内、特别是RNA噬菌体的VLP内的方法在WO2006/037787中公开。特别参考WO2006/037787的实施例4。

聚阴离子大分子：本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指包含重复负电荷基团的高相对分子量的分子，其结构基本包括实际上或概念上来源于低相对分子量的分子的多个重复单位。本文所用的术语“聚阴离子大分子”典型且优选地指不能活化toll-样受体的分子。因此术语“聚阴离子大分子”典型且优选地不包括Toll-样受体配体，不包括能够诱导和/或增强免疫应答的物质，如Toll-样受体配体，能够诱导和/或增强免疫应答的核酸，和脂多糖(LPS)。更优选地，本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指不能诱导细胞因子产生的分子。优选地，聚阴离子大分子是聚阴离子多肽或阴离子葡聚糖。在一个优选实施方案中，所述聚阴离子大分子是聚阴离子多肽，其中优选地所述聚阴离子多肽选自：(a)聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d)(a)至(c)的任意化学修饰。化学修饰的例子包括但不限于糖基化、乙酰化和磷酸化。在进一步优选的实施方案中，所述聚阴离子大分子是阴离子葡聚糖，所述阴离子葡聚糖选自：(a)硫酸葡聚糖；(b)羧甲基葡聚糖；(c)磺丙基葡聚糖；(d)磺酸甲酯葡聚糖(methyl sulfonatedextran)；和(e)磷酸葡聚糖。

聚天冬氨酸：本文使用的术语“聚天冬氨酸”应当是指一种多肽，在所述多肽包含的氨基酸总数中包含至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少99％，更优选100％的天冬氨酸残基。所述多肽的天冬氨酸残基因此是全L-、全D-或L-和D-天冬氨酸的混合物。最优选地，所述多肽只包含L-天冬氨酸残基。

聚谷氨酸：本文使用的术语“聚谷氨酸”是指一种多肽，在所述多肽包含的氨基酸总数中包含至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少99％，最优选100％的谷氨酸残基。所述多肽的谷氨酸残基因此是全L-、全D-或L-和D-天冬氨酸的混合物。最优选地，所述多肽只包含L-谷氨酸残基。

聚(GluAsp)：本文使用的术语“聚(GluAsp)”是指一种多肽，在所述多肽包含的氨基酸总数中包含至少50％，优选至少70％，更优选至少90％，更优选至少95％，更优选至少99％，最优选100％的谷氨酸残基和天冬氨酸残基。所述谷氨酸分子和天冬氨酸分子因此是全L-、全D-或其混合物。最优选地，所述多肽只包含L-谷氨酸残基和L-天冬氨酸残基。

疼痛：疼痛起因于疼痛感受器的刺激(伤害性疼痛)，例如由于损伤，或者是由神经系统的障碍引起的，导致疼痛信号被传送到大脑，而没有明显的物理原因(神经性疼痛)。疼痛包括，例如，骨关节痛、类风湿性关节炎痛、癌症痛、内脏痛、慢性腰背痛和慢性头痛、纤维肌痛、糖尿病神经病变、幻肢痛和疱疹后神经痛。

伤害性疼痛：本文使用的术语“伤害性疼痛”是指由疼痛感受器的刺激引起的疼痛，该刺激是由于损伤、手术或影响组织的疾病，如关节炎和癌症。伤害性疼痛也包括慢性疼痛。优选的伤害性疼痛类型是骨关节痛、类风湿性关节炎痛、癌症痛、内脏痛、慢性腰背痛和慢性头痛。

神经性疼痛：本文使用的术语“神经性疼痛”是指神经系统的障碍引起的疼痛，导致疼痛信号被传送到大脑，而没有明显的物理原因，如糖尿病神经病变、幻肢痛和疱疹后神经痛。

病毒颗粒和病毒样颗粒的一个共同特征是其高度有序且重复的亚单位排列。

RNA噬菌体的病毒样颗粒：本文使用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段或者优选地基本由其组成或者由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构。此外，RNA噬菌体的病毒样颗粒是非复制性和非传染性的。典型且优选地，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”进一步指RNA噬菌体的病毒样颗粒，该RNA噬菌体缺少编码RNA噬菌体的复制机制的至少一个基因，优选缺少所有基因，典型且进一步优选地，甚至缺少编码负责病毒附着或进入宿主的一种或多种蛋白质的至少一个基因，优选缺少所有基因。然而，该定义应当也包括上述一种或多种基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体的病毒样颗粒，因此产生非复制性和非传染性的RNA噬菌体的病毒样颗粒。在其最广的定义中，术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”因此也包括RNA噬菌体的病毒样颗粒，其基因组已通过物理或化学或遗传方法灭活，使得该病毒颗粒是非复制性和/或非传染性的。优选的RNA噬菌体的VLP显示二十面体对称，并且由180个亚单位组成。

一种或一个：术语“一种”或“一个”在本申请中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。

本发明提供用于增强动物或人体中对NGF的免疫应答的组合物和方法。本发明的组合物包含：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是NGF抗原，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地，NGF抗原与VLP连接，从而形成有序且重复的抗原-VLP阵列。在本发明的优选实施方案中，至少20个，优选至少30个，更优选至少60个，更优选至少120个，最优选至少180个NGF抗原与VLP连接。

可以选择本领域公知的任何具有有序且重复的结构的病毒作为本发明的VLP。其外壳蛋白能够用于制备VLP的示例性的DNA或RNA病毒已经在WO 2004/009124的第25页第10-21行，第26页的第11-28行，和第28页的第4行到第31页的第4行公开。这些公开的内容通过参考在此引入。

病毒或病毒样颗粒可以从病毒感染的细胞培养物中生产和纯化。为了接种的目的，获得的病毒或病毒样颗粒需要不含毒力。除了遗传工程以外，可以使用化学或物理方法灭活病毒基因组功能，例如紫外线照射、甲醛处理。

在一个优选实施方案中，VLP是一种重组VLP。几乎所有公知的病毒都已经被测序，并且可以容易地被公众获得。本领域技术人员能够容易地确定编码外壳蛋白的基因。通过在宿主中重组表达外壳蛋白来制备VLP是本领域技术人员的公知常识。

在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含选自下组的病毒的重组蛋白、其突变体或片段或者由其组成：a)RNA噬菌体；b)噬菌体；c)乙型肝炎病毒，优选其外壳蛋白(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))或其表面蛋白(WO 92/11291)；d)麻疹病毒(Warnes等人，Gene160：173-178(1995))；e)辛德毕斯病毒；f)轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)；g)口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))；h)诺瓦克病毒(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))；i)甲病毒；j)逆转录病毒，优选其GAG蛋白(WO 96/30523)；k)逆转录转座子Ty，优选蛋白p1；1)人乳头瘤病毒(WO 98/15631)；m)多瘤病毒；n)烟草花叶病毒；和o)禽兽棚病毒。

在一个优选实施方案中，VLP包含重组蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列(优选两种氨基酸序列)或者由该氨基酸序列组成。在一个进一步优选的实施方案中，VLP包含至少一个第一多肽和至少一个第二多肽或者由这些多肽组成，其中所述第一多肽和所述第二多肽包含外壳蛋白或其突变体或片段的氨基酸序列，其中所述第一多肽和所述第二多肽的氨基酸序列不同。在一个进一步优选的实施方案中，所述第一多肽包含第一外壳蛋白或其突变体或片段的氨基酸序列，所述第二多肽包含第二外壳蛋白或其突变体或片段的氨基酸序列，其中所述第一外壳蛋白和所述第二外壳蛋白是相同病毒的外壳蛋白，并且其中优选地所述病毒是RNA噬菌体。包含一种以上的多肽种类或由其组成的VLP被称为嵌合VLP。

本文使用的术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”被定义为分别为野生型重组蛋白或外壳蛋白长度的至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，并且优选地保留形成VLP的能力的多肽。优选地，该片段通过至少一个内部缺失、至少一个截短或至少一个其组合而获得。进一步优选地，该片段通过最多5、4、3或2个内部缺失、最多2个截短或恰好一个其组合而获得。

术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”还包括与以上定义的“重组蛋白的片段”或“外壳蛋白的片段”分别具有至少80％，优选90％，最优选95％的氨基酸序列同一性并且优选地能够装配为病毒样颗粒的多肽。

在本发明中可以交换使用的术语“突变重组蛋白”或术语“重组蛋白突变体”，或者在本发明中可以交换使用的术语“突变外壳蛋白”或术语“外壳蛋白突变体”，分别是指具有来源于野生型重组蛋白或外壳蛋白的氨基酸序列的多肽，其中该氨基酸序列与野生型序列至少80％，优选至少85％，至少90％，至少95％，至少97％或至少99％相同，并且其中优选地所述多肽保留装配为VLP的能力。

在一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒是乙型肝炎病毒的病毒样颗粒。乙型肝炎病毒样颗粒的制备尤其在WO00/32227、WO01/85208和WO02/056905中公开，所有三篇文献都通过参考引入本文。适合在本发明的实施中使用的HBcAg的其他变体在WO01/056905中，特别是在其中的第34-39页公开。

在本发明的进一步优选的实施方案中，将赖氨酸残基导入HBcAg多肽中，来介导NGF抗原与HBcAg的VLP的连接。在优选的实施方案中，利用包含、或由SEQ ID NO：20的氨基酸1-144、或1-149、1-185组成的HBcAg制备本发明的VLP和组合物，其中该氨基酸被修饰使得第79和80位的氨基酸被替代为具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽。这个修饰将SEQ ID NO：20改变为SEQ ID NO：21。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO：21的第48和110位的半胱氨酸残基，或其相应片段，优选1-144或1-149，被突变为丝氨酸。本发明进一步包括包含具有上述相应氨基酸改变的乙型肝炎核心蛋白突变体的组合物。本发明进一步包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗，该HBcAg多肽包含与SEQ ID NO：21至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，或由该氨基酸序列组成。

在本发明的一个优选实施方案中，病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒，其中优选地所述RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1)噬菌体PP7；和m)噬菌体AP205。在一个非常优选的实施方案中，所述病毒样颗粒是RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒。

在进一步优选的实施方案中，所述病毒样颗粒包含、基本由、或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成，其中优选地所述RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1)噬菌体PP7；和m)噬菌体AP205。在进一步优选的实施方案中，所述病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成，其中所述RNA噬菌体选自Qβ、fr、AP205或GA。在一个非常优选的实施方案中，所述病毒样颗粒包含、基本由、或者由RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中优选地所述外壳蛋白包含选自以下序列的氨基酸序列或者优选地由该氨基酸序列组成：(a)SEQ IDNO：1；涉及QβCP；(b)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的混合物(涉及QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO：3；(d)SEQ ID NO：4；(e)SEQ IDNO：5；(f)SEQ ID NO：6；(g)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的混合物；(h)SEQ ID NO：8；(i)SEQ ID NO：9；(j)SEQ ID NO：10；(k)SEQID NO：11；(l)SEQ ID NO：12；(m)SEQ ID NO：13；(n)SEQ IDNO：14；(o)SEQ ID NO：40；(p)SEQ ID NO：41；和(q)SEQ IDNO：42。

在进一步优选的实施方案中，所述病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。在进一步优选的实施方案中，所述病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。其中所述外壳蛋白包含或者优选地由选自以下序列的氨基酸序列组成：(a)SEQ IDNO：1；涉及QβCP；(b)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的混合物(涉及QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO：3；(d)SEQ ID NO：4；(e)SEQ IDNO：5；(f)SEQ ID NO：6；(g)SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的混合物；(h)SEQ ID NO：8；(i)SEQ ID NO：9；(j)SEQ ID NO：10；(k)SEQID NO：11；(l)SEQ ID NO：12；(m)SEQ ID NO：13；(n)SEQ IDNO：14；(o)SEQ ID NO：40；(p)SEQ ID NO：41；和(q)SEQ IDNO：42。

在进一步优选的实施方案中，所述病毒样颗粒包含重组外壳蛋白、或者基本由、或者由重组外壳蛋白组成，其中所述重组外壳蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO：1或者优选地由该序列组成。

在本发明的一个优选实施方案中，VLP是嵌合VLP，包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列(优选两种氨基酸序列)或者由该序列组成。在一个非常优选的实施方案中，VLP包含RNA噬菌体的两种不同的外壳蛋白或者由该外壳蛋白组成，其中所述两种外壳蛋白分别包含SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2，或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列，或者优选地该氨基酸序列组成。

在一个优选实施方案中，所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。Qβ的衣壳或病毒样颗粒显示为二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T＝3半对称。该衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，它们通过二硫键连接为共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure4：543-5554(1996))，使Qβ衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有不通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接的或不完全连接的亚单位。Qβ的衣壳或VLP显示对有机溶剂和变性剂具有不平常的抗性。我们惊奇地发现，高至30％的DMSO和乙腈浓度和高至1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ的衣壳或VLP的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途而言。

根据本发明进一步优选的RNA噬菌体的病毒样颗粒，特别是RNA噬菌体Qβ和RNA噬菌体fr的病毒样颗粒，已经在WO02/056905中公开，其公开内容在此引入作为参考。具体地，WO02/056905的实施例18给出了制备RNA噬菌体Qβ的VLP的详细描述。

在另一个优选实施方案中，所述VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。在本发明的实践中也可以使用AP205VLP的能够装配的突变形式，包括氨基酸第5位的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白，或氨基酸第14位的天冬酰胺被置换为天冬氨酸的AP205外壳蛋白，导致本发明的其他优选的实施方案。WO2004/007538，特别是在实施例1和实施例2中，描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP，以及特别是其表达和纯化。WO2004/007538在此引入作为参考。AP205VLP具有高度免疫原性，并且能够与抗原连接，以典型且优选地产生以定向和重复方式展示抗原的疫苗构建体。产生了针对这样展示的抗原的高抗体效价，这表明连接的抗原能够与免疫系统的细胞相互作用，典型且优选地与B细胞相互作用，并且因此具有免疫原性。

在本发明的一个优选的实施方案中，所述VLP包含病毒(优选RNA噬菌体)的突变外壳蛋白或者由该突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过删除而除去至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在另一个优选实施方案中，本发明的VLP包含病毒(优选RNA噬菌体)的突变外壳蛋白或者由该突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过插入而添加至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。至少一个赖氨酸残基的缺失、置换或添加可以改变偶联程度，即允许改变VLP每个亚单位上，优选RNA噬菌体的VLP的每个亚单位上抗原的量。因此，可以满足设计特定疫苗的要求。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和疫苗具有0.5到4.0的抗原密度。本文使用的术语“抗原密度”是指VLP每个亚单位上，优选RNA噬菌体的VLP的每个亚单位上，优选每个外壳蛋白上连接的抗原分子的平均数。因此，该值可以计算为在本发明的组合物或疫苗中所述VLP的所有亚单位上，优选RNA噬菌体的所述VLP的所有亚单位上的平均数。

Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在它们的表面展示数目确定的赖氨酸残基，具有3个赖氨酸残基指向衣壳内部并与RNA相互作用，而另外4个赖氨酸残基暴露于衣壳外部的确定的拓扑学。优选地，至少一个第一附着位点是赖氨酸残基，指向或位于VLP的外部。更优选地，至少一个第一附着位点是指向或位于VLP外部的赖氨酸残基的氨基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白的赖氨酸残基的氨基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是SEQ ID NO：1的赖氨酸残基的氨基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是SEQ ID NO：1第2、13、16、46、60、63和67位赖氨酸残基中任一个的氨基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点是暴露于衣壳外部的任一个赖氨酸残基的氨基。

其中暴露的赖氨酸残基被精氨酸置换的Qβ突变体可以用于本发明。因此，在本发明另一个优选的实施方案中，该病毒样颗粒包含突变Qβ外壳蛋白、或者基本由或由突变Qβ外壳蛋白组成。优选地，这些突变外壳蛋白包含选自下组的氨基酸序列或由该序列组成：(a)Qβ-240(SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：1的Lys13-Arg)；(b)Qβ-243(SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：1的Asn10-Lys)；(c)Qβ-250(SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：1的Lys2-Arg)；(d)Qβ-251(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：1的Lys16-Arg)；和(e)Qβ-259(SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：1的Lys2-Arg，Lys 16-Arg)。上述Qβ突变外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO 02/056905中进行了描述。特别是WO 02/056905的实施例18。

在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由Qβ的突变外壳蛋白、或其突变体或片段和相应的A1蛋白组成。在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由突变外壳蛋白和相应的A1蛋白组成，其中所述突变外壳蛋白选自SEQ ID NO：15、16、17、18和19中的任一个。

其它一些RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达时也显示自装配(Kastelein，RA.等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology170：238-242(1989)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。特别是已经公开了GA(Ni，CZ，等人，Protein Sci.5：2485-2493(1996)，Tars，K等人，J.Mol.Biol.271：759-773(1997))和fr(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993)，Liljas，L等人.J Mol.Biol.244：279-290，(1994))的生物学和生化性质。几种RNA噬菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，能够确定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA噬菌体的外壳蛋白，以便能够通过插入或置换插入一个或多个反应性氨基酸残基。来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达产量，这允许以可承受的成本产生大量的物质。

在一个优选实施方案中，NGF抗原是NGF蛋白。在一个优选实施方案中，NGF蛋白选自：(a)人NGF蛋白；(b)狗NGF蛋白；(c)猫NGF蛋白；(d)小鼠NGF蛋白，和(e)马NGF蛋白。在一个进一步优选的实施方案中，NGF蛋白是人或其它动物的NGF，优选哺乳动物的NGF，其中进一步优选地所述NGF蛋白选自SEQ ID NO：22-25和32-39中的任一个。

在一个优选实施方案中，NGF蛋白是人NGF。在一个进一步优选的实施方案中，人NGF包含或者优选地由SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列组成。在另一个优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，该氨基酸序列与SEQ ID NO：22至少80％，或优选地至少85％，更优选地至少90％，或最优选地至少95％相同。

在一个优选实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，在该氨基酸序列中，SEQ ID NO：22通过置换和/或缺失和/或插入或其组合改变了至少1个且最多20个，优选至少1个且最多10个，更优选至少1个且最多5个氨基酸。

在进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少1个且最多20个，优选地在至少1个且最多10个、更优选地至少1个且最多5个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基通过置换、缺失、插入或其任意组合发生改变。

在一个优选实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，在该氨基酸序列中，SEQ ID NO：22通过缺失改变至少1个且最多20个，优选地最多10个、优选地最多5个氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，在该氨基酸序列中，SEQ ID NO：22通过1、2或3个氨基酸缺失发生改变。

在进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列中缺失最多10、9、8、7、6、5或4个氨基酸残基。在一个非常优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列中缺失3、2或优选地1个氨基酸残基。

在一个优选实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO：22通过插入改变了至少1个且最多20个，优选地至少1个且最多10个，更优选地至少1个且最多5个氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO：22通过1、2或3个氨基酸插入发生改变。

在进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中最多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个氨基酸残基插入所述将要突变的氨基酸序列中。在一个非常优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中3、2或优选地1个氨基酸残基插入所述将要突变的氨基酸序列中。

在一个优选实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO：22通过置换，优选地通过保守置换，改变至少1个且最多20个，优选地至少1个且最多10个，更优选地至少1个且最多5个氨基酸。

在一个进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO：22通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸置换，优选地通过保守置换发生改变。在一个进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，其中SEQ ID NO：22通过1、2或3个氨基酸置换，优选地通过保守置换发生改变。

在进一步优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列的最多20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5或4个氨基酸残基通过氨基酸置换进行更换，其中优选地所述氨基酸置换是保守氨基酸置换。在一个非常优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列的3个、2个或优选地1个氨基酸残基通过氨基酸置换进行更换，其中优选地所述氨基酸置换是保守氨基酸置换。

在一个优选实施方案中，NGF蛋白是人NGF前体。在一个进一步优选的实施方案中，人NGF前体包含或者优选地由SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列组成。在另一个优选的实施方案中，NGF蛋白包含或者优选地由一种氨基酸序列组成，该序列与SEQ ID NO：23至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，最优选地至少95％相同。

在一个优选实施方案中，NGF抗原是NGF片段，其中所述NGF片段包含或者可替代地由至少一个表位组成。确定蛋白质的表位的方法是本领域技术人员已知的。PCT/EP2005/004980从第26页第一段至第27页第四段已经详述了一些这样的方法，这些具体公开内容通过参考引入本文。应当指出，这些方法通常适用于其它多肽抗原，因此不限于PCT/EP2005/004980中公开的IL-23p19。

在本发明的一个优选实施方案中，NGF抗原是NGF片段。在进一步优选的实施方案中，所述NGF片段包含或者可替代地或优选地由SEQ ID NO：22的人NGF的至少8个、优选地至少12个、更优选地至少20个、更优选地至少30个相邻氨基酸组成。在进一步优选的实施方案中，所述NGF片段由SEQ ID NO：22的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个相邻氨基酸组成，其中优选地所述NGF片段由SEQ ID NO：22的10个相邻氨基酸组成，其中进一步优选地所述NGF片段由SEQ ID NO：22的10个N末端氨基酸组成。因此，在一个非常优选的实施方案中，所述NGF片段由氨基酸序列SEQ ID NO：44组成。

在一个优选实施方案中，NGF抗原是NGF突变蛋白，其中优选地所述NGF突变蛋白具有降低的生物活性，并且其中进一步优选地所述NGF突变蛋白当以免疫原性偶联物的形式施用于动物时能够诱导中和抗体。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白不具有生物活性，并且所述NGF突变蛋白当以免疫原性偶联物的形式施用于动物时能够诱导中和抗体。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少1个且最多9个，优选地至少1个且最多3个，更优选地至少1个且最多2个位置处，最优选地在恰好一个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基通过置换或通过缺失发生改变，最优选地通过置换发生改变。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ ID NO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少1个且最多9个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基从SEQ ID NO：22中缺失，并且其中优选地所述缺失的氨基酸残基选自SEQ ID NO：22的氨基酸残基1-9，并且其中进一步优选地所述缺失的氨基酸残基选自SEQ ID NO：22的氨基酸残基4H、5P、7F或8H中的任一个(Kullander等人J Biol Chem，1997.272(14)：p.9300-7；Woo，S.B.和K.E.Neet J Biol Chem，1996.271(40)：p.24433-41；和Beglova，N.，等人J Biol Chem，1998.273(37)：p.23652-8)。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白由SEQID NO：45组成。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少1个且最多3个，优选地至少1个且最多2个，最优选地恰好1个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基通过置换发生改变。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少1个且最多3个，优选地至少1个且最多2个，最优选地恰好1个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基通过置换发生改变，其中置换的氨基酸残基选自SEQ ID NO：22的氨基酸残基4H、5P、7F或8H中的任一个(Kullander等人J Biol Chem，1997.272(14)：p.9300-7；Woo，S.B.和K.E.Neet J Biol Chem，1996.271(40)：p.24433-41；和Beglova，N.，等人J Biol Chem，1998.273(37)：p.23652-8.)。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白由SEQ ID NO：46-52中的任一个组成。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少1个且最多3个，优选地至少1个且最多2个，最优选地恰好1个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基通过置换发生改变，其中置换的氨基酸残基选自SEQ ID NO：22的氨基酸残基43-45、48和49中的任一个(Kullander等人J Biol Chem，1997.272(14)：p.9300-7；Beglova，N.，等人J Biol Chem，1998.273(37)：p.23652-8，和Xie，Y.，等人J Biol Chem，2000.275(38)：p.29868-74.)。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白由SEQ ID NO：53-60中的任一个组成。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在至少1个且最多3个，优选地至少1个且最多2个，最优选地恰好1个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基通过置换发生改变，其中置换的氨基酸残基选自SEQ ID NO：22的氨基酸残基94G、95K和96Q中的任一个(Kullander等人J Biol Chem，1997.272(14)：p.9300-7；Beglova，N.，等人J Biol Chem，1998.273(37)：p.23652-8，和Xie，Y.，等人J BiolChem，2000.275(38)：p.29868-74)。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白由SEQ ID NO：61-66中的任一个组成。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在恰好一个位置处通过置换发生改变，其中置换的氨基酸残基选自氨基酸残基75H、84H、100R、111V、112L、114R、115K、113S中的任一个(Kullander，K.等人J Biol Chem，1997.272(14)：p.9300-7；Larsson，E.等人Neurobiol Dis，2008，Kruttgen，A.，等人J Biol Chem，1997.272(46)：p.29222-8)。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白由SEQID NO：67-74中的任一个组成。

在进一步优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白包含或者优选地由突变的氨基酸序列组成，其中将要突变的氨基酸序列是SEQ IDNO：22，并且其中所述将要突变的氨基酸序列在正好2个位置处发生改变，其中所述位置的氨基酸残基通过置换发生改变，其中置换的氨基酸残基是75H和84H(Kullander等人.J Biol Chem，1997.272(14)：p.9300-7)。在一个非常优选的实施方案中，所述NGF突变蛋白由SEQID NO：75组成。

在一个优选实施方案中，组合物包含或者基本由或者由以下成分组成：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是NGF抗原；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述连接是通过至少一个肽键，优选地只通过肽键。在进一步优选的实施方案中，所述具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒和所述至少一种抗原通过基因融合连接。编码NGF抗原的基因符合读框地内部连接或者优选地连接至编码VLP的外壳蛋白的基因的N端或C端。也可以通过将NGF抗原的序列插入部分外壳蛋白序列已经缺失的外壳蛋白突变体(其进一步称为截短突变体)中实现融合。截短突变体可以具有外壳蛋白的部分序列的N末端或C末端缺失或者内部缺失。该融合蛋白优选保留了在表达时装配为VLP的能力，这可以通过电子显微镜进行检查。

可向NGF抗原中加入侧翼氨基酸残基来增加外壳蛋白和NGF抗原之间的距离。甘氨酸和丝氨酸残基是用于侧翼序列的特别有利的氨基酸。这种侧翼序列赋予融合构建体额外的柔性。这可减少外源序列融合进入VLP亚单位序列时可能的去稳定效应，并且因此可减少外源序列对VLP装配的干扰。

在其它实施方案中，NGF抗原能够与大量其它病毒外壳蛋白融合，例如，与Qβ的A1蛋白的截短形式的C末端融合(Kozlovska，T.M.，等人，Intervirology 39：9-15(1996))。或者，NGF抗原可以插入CP延伸的位点72和73之间。例如，Kozlovska等人(Intervirology，39：9-15(1996))描述了QβA1融合蛋白，其中表位在第19位处截短的QβCP延伸的C末端融合。作为另一个实例，NGF抗原可以插入fr CP的氨基酸2和3之间(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993))。此外，NGF抗原可以与RNA噬菌体MS-2的外壳蛋白的N末端突出β-发夹融合(WO 92/13081)。此外，NGF抗原也可以与乳头瘤病毒外壳蛋白融合，优选与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要外壳蛋白L1融合(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：2373-2378(1999)，WO 00/23955)。将BPV-1L1的氨基酸130-136置换为NGF抗原也是本发明的实施方案。将NGF抗原与病毒的外壳蛋白、或其突变体或片段融合的实施方案已经在WO 2004/009124的第62页第20行至第68页第17行公开，在此引入作为参考。

在另一个优选实施方案中，NGF抗原与RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端融合，其中优选地所述外壳蛋白或其突变体或片段包含或者优选地由选自SEQ ID NO：14和40至42中任一个、最优选SEQ ID NO：41的氨基酸序列组成。

在一个进一步优选的实施方案中，融合蛋白进一步包含间隔区，其中所述间隔区位于RNA噬菌体AP205的所述外壳蛋白或其突变体或片段与所述NGF抗原之间。优选地，所述间隔区由不到20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6或5个氨基酸组成。非常优选地，所述间隔区由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸组成。

在一个优选实施方案中，组合物包含或者基本由或者由以下成分组成：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是NGF抗原；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述连接是通过至少一个非肽共价键，并且其中优选地所述第一附着位点不包含或者不是巯基，并且其中更优选地所述第一附着位点不包含或者不是半胱氨酸的巯基。

在一个优选实施方案中，第一附着位点包含或者优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点包含或者优选地是赖氨酸残基的氨基，其中所述赖氨酸残基是所述VLP包含的重组外壳蛋白的赖氨酸残基。在进一步优选的实施方案中，所述第一附着位点包含或者优选地是赖氨酸残基的氨基，其中所述赖氨酸残基是所述VLP包含的RNA噬菌体的重组外壳蛋白的赖氨酸残基。

在进一步优选的实施方案中，所述具有所述至少一个第一附着位点的病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒，优选RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，并且所述第一附着位点包含或者优选地是赖氨酸残基的氨基，其中优选地所述赖氨酸残基是重组外壳蛋白的赖氨酸残基，优选RNA噬菌体Qβ的重组外壳蛋白的赖氨酸残基，其中所述重组外壳蛋白被RNA噬菌体的所述病毒样颗粒包含。

在进一步优选的实施方案中，所述具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA噬菌体(优选RNA噬菌体Qβ)的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成，并且所述第一附着位点包含或者优选地是赖氨酸残基的氨基，其中优选地所述赖氨酸残基是所述RNA噬菌体(优选RNA噬菌体Qβ)的所述重组外壳蛋白、其突变体或片段所包含的赖氨酸残基。

在进一步优选的实施方案中，所述具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒包含、基本由、或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白组成，其中所述重组外壳蛋白包含或者优选地由氨基酸序列SEQ ID NO：1组成；并且其中所述第一附着位点包含或者优选地是SEQ ID NO：1的赖氨酸残基的氨基。

在本发明的另一个优选实施方案中，第二附着位点包含或者优选地是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在本发明的一个非常优选的实施方案中，至少一个第一附着位点是氨基，优选赖氨酸残基的氨基，并且至少一个第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。

在本发明的一个优选实施方案中，NGF抗原通过化学交联，典型且优选地通过使用异双功能交联剂与VLP连接。在优选的实施方案中，所述异双功能交联剂含有能够与VLP的优选的第一附着位点(优选氨基，更优选赖氨酸残基的氨基)反应的一个官能团，和能够与NGF抗原上固有的或人工添加的优选的第二附着位点(即巯基，优选半胱氨酸残基的巯基)反应的另一个官能团，任选地也可通过还原用于反应。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可从PierceChemical Company获得的、具有一个氨基反应性官能团和一个巯基反应性官能团的其它交联剂。上述交联剂均导致在与氨基反应后形成酰胺键和与巯基反应后形成硫醚键。适用于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶联时在NGF抗原与VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。

在一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含连接体。根据本发明的公开内容，通过连接优选包含至少一个适合作为第二附着位点的氨基酸的连接体，实现向NGF抗原上构建第二附着位点。因此，在本发明的一个优选实施方案中，连接体通过至少一个共价键、优选通过至少一个、通常一个肽键与NGF抗原连接。优选地，连接体包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，连接体包含巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在另一个优选的实施方案中，氨基酸连接体是半胱氨酸残基。在进一步优选的实施方案中，氨基酸连接体是CGG-或GCG-连接体，优选CGG-连接体。适用于本发明的目的的连接体在WO2005/108425A1第32-33页公开，其通过引入并入本文。

根据上述优选方法利用异双功能交联剂连接NGF抗原与VLP，允许NGF抗原以定向方式与VLP偶联。连接NGF抗原和VLP的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS交联NGF抗原和VLP的方法。NGF抗原也可以首先通过反应，例如与SATA、SATP或亚氨硫醇(iminothiolane)反应而硫醇化。必要时，在去保护之后，NGF抗原可以与VLP如下所述偶联。在分离过量的硫醇化试剂之后，NGF抗原与预先用含有半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化的VLP反应，该活化的VLP展示至少一个或几个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团，如上所述的硫醇化的NGF抗原能够与该官能团反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]₄、BS3(Pierce)或含有对VLP的氨基或羧基有反应性的官能团的其它已知同型双功能交联剂，使NGF抗原与VLP连接。

在本发明的其他实施方案中，所述组合物包含或者基本由通过化学相互作用连接到NGF抗原的病毒样颗粒组成，其中这些化学相互作用中的至少一个不是共价键。这些相互作用包括但不限于抗原-抗体相互作用、受体-配体相互作用。VLP与NGF抗原的连接可以通过将VLP生物素化并将NGF抗原表达为链霉抗生物素蛋白-融合蛋白而实现。

一种或几种抗原分子，即NGF抗原，如果空间允许，可以优选地通过RNA噬菌体VLP外壳蛋白上暴露的赖氨酸残基连接到VLP(优选RNA噬菌体外壳蛋白)的一个亚单元上。因此，RNA噬菌体的VLP，特别是RNA噬菌体Qβ的VLP的一个具体特征是每个亚单元有偶联数个抗原的可能性。这样就允许产生密集的抗原阵列。

在本发明非常优选的实施方案中，NGF抗原通过已添加到NGF抗原的N末端或C末端上的半胱氨酸残基，或NGF抗原内的天然半胱氨酸残基，与RNA噬菌体VLP的外壳蛋白的赖氨酸残基连接，特别是与RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白的赖氨酸残基连接。

如上所述，4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP的表面。典型且优选地，这些残基在与交联剂分子反应时被衍生化。当不是所有的暴露赖氨酸残基都能与抗原偶联时，已与交联剂反应的赖氨酸残基使得交联剂分子在衍生化步骤后附着到ε-氨基上。这就使可能对VLP的溶解性和稳定性不利的一个或几个正电荷消失。通过例如公开的Qβ外壳蛋白突变体中那样用精氨酸取代某些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过度消失，因为精氨酸残基并不能与优选的交联剂反应。此外，用精氨酸残基取代赖氨酸残基会产生更确定的抗原阵列，因为只有较少的位点可与抗原反应。

因此，在下列Qβ外壳蛋白突变体中，暴露的赖氨酸残基被置换为精氨酸：Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO：15)、Qβ-250(Lys 2-Arg，Lys 13-Arg；SEQ ID NO：17)、Qβ-259(Lys 2-Arg，Lys 16-Arg；SEQ IDNO：19)和Qβ-251(Lys 16-Arg，SEQ ID NO：18)。在进一步的实施方案中，我们公开了具有一个额外的赖氨酸残基的RNA噬菌体Qβ的突变外壳蛋白Qβ-243(Asn 10-Lys；SEQ ID NO：16)，它适合于获得比RNA噬菌体Qβ的野生型外壳蛋白(SEQ ID NO：1)密度更高的抗原阵列。

在本发明的一个优选实施方案中，所述病毒样颗粒由宿主重组产生，并且其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA，并且其中优选地所述病毒样颗粒基本不含宿主核酸，其中优选地所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒。在一个进一步优选的实施方案中，所述组合物还包含至少一种与VLP结合、优选包装或包封于VLP内部的聚阴离子大分子。

在一个优选实施方案中，所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒，优选RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，其中所述RNA噬菌体的病毒样颗粒，优选所述RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，由宿主重组产生，并且其中所述RNA噬菌体的病毒样颗粒，优选所述RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒，基本不含宿主RNA，并且其中所述组合物还包含至少一种聚阴离子大分子，其中所述至少一种聚阴离子大分子包装于所述RNA噬菌体的病毒样颗粒内，优选地包装于所述RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒内。在一个进一步优选的实施方案中，所述聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，优选聚谷氨酸。

在上下文中，术语“基本不含宿主RNA，优选宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、优选宿主核酸的量，该量典型且优选地为每mgVLP不到30μg，优选不到20μg，更优选不到10μg，甚至更优选不到8μg，甚至更优选不到6μg，甚至更优选不到4μg，最优选不到2μg。更优选地，所述VLP和/或所述本发明组合物所含的宿主RNA、优选宿主核酸低于检测限度。在上述内容中使用的宿主是指在其中重组产生VLP的宿主，其中所述宿主典型且优选地是大肠杆菌。测定RNA、优选核酸的量的常规方法是本领域技术人员公知的。根据本发明测定RNA、优选核酸的量的典型且优选的方法WO2006/037787A2的实施例17中描述。对于含有Qβ以外的VLP的本发明的组合物，测定RNA、优选核酸的量典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。确定的量的数值应当典型且优选地被理解为包括指定数值±10％、优选±5％偏差的数值。

宿主RNA，优选宿主核酸：术语“宿主RNA，优选宿主核酸”是指由宿主原始合成的RNA或优选核酸。但是，RNA，优选核酸，在减少或消除RNA、优选核酸的量的过程中经历化学和/或物理改变，典型且优选地通过本发明的方法进行，例如，RNA、优选核酸的大小可以缩短，或者其二级结构可以改变。术语宿主RNA或核酸也包括这些降解产物。

减少或消除宿主RNA、优选宿主核酸的量最小化或减少了不希望的T细胞应答，如炎性T细胞应答和细胞毒性T细胞应答，以及其它不希望的副作用，如发热，而同时保持针对抗原的强抗体应答。

一方面，本发明涉及一种生产本发明的组合物的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种NGF抗原；和(c)将所述VLP与所述NGF抗原组合，以产生组合物，其中所述NGF抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。在进一步优选的实施方案中，提供所述具有至少一个第一附着位点的VLP的步骤还包括以下步骤：(a)将所述病毒样颗粒、优选RNA噬菌体的所述病毒样颗粒解装配为所述外壳蛋白、其突变体或片段，(b)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)将所述纯化的外壳蛋白、其突变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中优选地所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA、优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述纯化的外壳蛋白的重装配在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。在至少一种聚阴离子大分子的存在下重装配RNA噬菌体的外壳蛋白的方法例如在WO2006/037787A2中公开。

一方面，本发明提供包含本发明的组合物的疫苗组合物。

另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含或者由治疗有效量的本发明的任一种组合物组成。

在一个优选实施方案中，所述疫苗组合物进一步包含至少一种佐剂。所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后进行。本文使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生一种储库(depot)的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物结合时能够产生更强的免疫应答。至少一种佐剂的例子包括且优选地由以下成分组成：完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。其它佐剂包括：矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔蝛血蓝蛋白、二硝基酚，以及潜在的可用于人的佐剂，如BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂也是本领域公知的。能够与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于：单磷酰脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。其它佐剂包括免疫刺激性核酸，优选在骨架中含有一个或多个修饰(优选硫代磷酸修饰)的免疫刺激性核酸。这种修饰将稳定核酸免于降解。

在另一个优选实施方案中，所述疫苗组合物不含佐剂。本发明的一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时依然如此。因此，优选地给患者施用本发明的疫苗组合物而不需在施用该疫苗组合物之前、同时或之后给同一名患者施用至少一种佐剂。VLP通常被描述为佐剂。然而，术语“佐剂”在本申请上下文中使用时，是指不是用于本发明的组合物的VLP的佐剂，而是除所述VLP以外的佐剂。

如果接受个体能够耐受本发明的疫苗组合物的施用，则认为该疫苗组合物是“药学可接受的”。进而，本发明的疫苗组合物将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效应的量)施用。在本发明的上下文中，希望的生理学效应典型且优选地是疼痛的抑制或减轻。

一方面，本发明提供一种药物组合物，其中所述药物组合物包含本发明的组合物或疫苗组合物以及药学可接受的载体。在一个优选实施方案中，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的组合物。当给个体施用组合物或疫苗组合物时，它可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他改善偶联物的效果所需的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多资料中提供，包括Remington’sPharmaceutical Sciences(Osol，A，ed.，Mack Publishing Co.，(1990))。药物组合物的其它成分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬浮液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油、和可注射的有机酯类例如油酸乙酯。可以使用载体或封闭敷料来增强皮肤渗透性和增强抗原吸收。

本发明进一步公开了一种免疫方法，优选地针对NGF抗原的免疫方法，所述方法包括给动物，优选地给人，施用组合物、疫苗组合物或药物组合物。所述动物优选为哺乳动物，如小鼠、猴、黑猩猩、狗、猫、马，特别是人。组合物、疫苗组合物或药物组合物可以用本领域所知的各种方法给所述动物、优选地给所述人施用。典型且优选地，组合物、疫苗组合物或药物组合物通过注射、输注、吸入或口服给所述动物、优选地给所述人施用。进一步优选地，组合物、疫苗组合物或药物组合物经肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内或皮下施用。

一方面，本发明提供一种预防或者特别是治疗疼痛的方法，其中所述方法包括给动物，优选地给人施用所述组合物、所述疫苗组合物或所述药物组合物，其中典型且优选地所述动物和优选地所述人患有疼痛。在一个优选实施方案中，所述疼痛是伤害性疼痛。在一个非常优选的实施方案中，所述疼痛是慢性炎性痛。在进一步优选的实施方案中，所述伤害性疼痛是骨关节痛、类风湿性关节炎痛、癌症痛、内脏痛、慢性腰背痛或慢性头痛、胰腺炎痛、膀胱炎痛或前列腺炎痛。在一个非常优选的实施方案中，所述疼痛是骨癌痛。在一个优选实施方案中，所述疼痛是由损伤引起的。

在一个优选实施方案中，所述疼痛是神经性疼痛，它可以由例如以下原因引起：损伤引起的神经压迫/神经创伤，神经细胞感染，如疱疹后神经痛，引起神经细胞损伤的状况，如中风或退行性神经性障碍或幻肢痛。

本发明的另一方面是所述组合物、所述疫苗组合物或所述药物组合物作为药物的应用。

另一方面，本发明提供所述组合物或所述疫苗组合物在制备用于治疗动物(优选人)的疼痛的药物中的用途，其中优选地所述疼痛是伤害性疼痛或神经性疼痛。在一个非常优选的实施方案中，所述疼痛是慢性炎性痛。在进一步优选的实施方案中，所述疼痛是骨关节痛、类风湿性关节炎痛、癌症痛、内脏痛、慢性腰背痛或慢性头痛、胰腺炎痛、膀胱炎痛或前列腺炎痛。在一个非常优选的实施方案中，所述疼痛是骨癌痛。在一个优选实施方案中，所述疼痛是由损伤引起的。

另一方面，本发明提供此处所述的用于治疗动物(优选人)的疼痛的如此处所述的组合物、疫苗组合物或药物组合物，其中进一步优选地所述组合物、所述疫苗或所述药物组合物将要对所述动物、优选地对所述人施用，并且其中再进一步优选地所述疼痛是伤害性疼痛或神经性疼痛。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含、基本由或优选地由以下成分组成：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含NGF蛋白和连接体，并且其中优选地所述NGF蛋白由SEQ ID NO：22组成；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述第一附着位点是RNA噬菌体Qβ的所述VLP的赖氨酸残基的氨基，并且其中所述第二附着位点被所述连接体包含，并且其中所述连接体通过肽键融合到所述NGF蛋白上，并且其中所述第二附着位点是半胱氨酸的巯基；并且其中优选地所述第一附着位点和所述第二附着位点通过异双功能交联剂连接，优选地通过SMPH连接。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含、基本由或优选地由以下成分组成：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含NGF片段和连接体，并且其中优选地所述NGF片段由SEQ ID NO：44组成；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述第一附着位点是RNA噬菌体Qβ的所述VLP的赖氨酸残基的氨基，并且其中所述第二附着位点被所述连接体包含，并且其中所述连接体通过肽键融合到所述NGF蛋白上，并且其中所述第二附着位点是半胱氨酸的巯基；并且其中优选地所述第一附着位点和所述第二附着位点通过异双功能交联剂连接，优选地通过SMPH连接。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含、基本由或优选地由以下成分组成：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含NGF突变蛋白和连接体，并且其中优选地所述NGF突变蛋白由SEQID NO：45-75中的任一个组成；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述第一附着位点是RNA噬菌体Qβ的所述VLP的赖氨酸残基的氨基，并且其中所述第二附着位点被所述连接体包含，并且其中所述连接体通过肽键融合到所述NGF蛋白上，并且其中所述第二附着位点是半胱氨酸的巯基；并且其中优选地所述第一附着位点和所述第二附着位点通过异双功能交联剂连接，优选地通过SMPH连接。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含、基本由或优选地由以下成分组成：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含或者优选地由SEQ ID NO：1组成，和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含NGF抗原和连接体，并且其中所述NGF抗原选自：(i)NGF蛋白，优选SEQ ID NO：22；(ii)NGF片段，优选SEQ ID NO：44；和(iii)NGF突变蛋白，优选SEQ ID NO：45-75中的任一个；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述第一附着位点是所述SEQ ID NO：1的赖氨酸残基的氨基，并且其中所述第二附着位点被所述连接体包含，并且其中所述连接体通过肽键融合到所述NGF抗原上，并且其中所述第二附着位点是半胱氨酸的巯基；并且其中优选地所述第一附着位点和所述第二附着位点通过异双功能交联剂连接，优选地通过SMPH连接。

在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，该组合物包含、基本由或优选地由以下成分组成：(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP，和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原包含NGF抗原和连接体，并且其中所述NGF抗原选自：(i)NGF蛋白，优选SEQ ID NO：22；(ii)NGF片段，优选SEQ ID NO：44；和(iii)NGF突变蛋白，优选SEQ ID NO：45-75中的任一个；并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接，并且其中所述第一附着位点是RNA噬菌体Qβ的所述VLP的赖氨酸残基的氨基，并且其中所述第二附着位点被所述连接体包含，并且其中所述连接体通过肽键融合到所述NGF抗原上，并且其中所述第二附着位点是半胱氨酸的巯基；并且其中优选地所述第一附着位点和所述第二附着位点通过异双功能交联剂连接，优选地通过SMPH连接，其中所述组合物进一步包含至少一种聚阴离子大分子，其中所述聚阴离子大分子包装于所述VLP内，并且其中优选地所述聚阴离子大分子是聚谷氨酸。

实施例

实施例1

mproNGFβcDNA向原核表达载体中的克隆

使用以下引物通过PCR从鼠胚脑组织的cDNA文库扩增小鼠proNGFβ：Nde-proNGF-F(SEQ ID NO：26)和proNGF-Xho-R(SEQ IDNO：27)。PCR产物用NdeI和XhoI消化，并且连接到pM-His-GGC载体中。得到的质粒被命名为pM-proNGF-HisGGC，它编码包含小鼠NGFβ、His6标签和含有两个甘氨酸及随后的C末端半胱氨酸的连接体的融合蛋白。

实施例2

pCB28_proNGFβ-His-GGC真核表达载体的构建

使用以下两条引物通过PCR从pM-proNGF-HisGGC载体扩增mproNGFβ序列：mproNGFeuk_var1_f(SEQ ID NO：28)和mproNGFeuk_var1_r(SEQ ID NO：29)。将PCR产物连接到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)。用PacI和XhoI消化pCRII-TOPO载体，并将得到的mproNGFβ-HisGGC片段连接到pCB28载体中。得到的质粒被命名为pCB28_mproNGF_His_C，其编码来源于pSECTag2/HygroA，B，C载体(Invitrogen)的γ免疫球蛋白κ轻链的信号序列，随后是mproNGFβ序列、His₆标签和含有两个甘氨酸及随后的C末端半胱氨酸的连接体。

实施例3

pCB28-proNGFβ-His-GGC在293T HEK细胞中的表达

1μg含有嘌呤霉素抗性基因的pCB28_proNGF_His_C表达载体与200μl Opti-MEM(Invitrogen)和7.5μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)混合，并转染到1.5*10⁶HEK 293T细胞中。4小时后，再向细胞补充含有10％FCS和1％非必需氨基酸(Invitrogen)的D-MEM培养基。24小时后，向培养基中加入1mg/l嘌呤霉素(Invitrogen)，以允许对嘌呤霉素抗性进行选择。嘌呤霉素抗性细胞在聚-L-赖氨酸包被的中在不含FCS、含有10mg/l还原型谷胱甘肽(Fluka)、161mg/l N-乙酰基-L-半胱氨酸(Fluka)、1％非必需氨基酸、1％青霉素/链霉素(Invitrogen)和1mg/l嘌呤霉素的D-MEM培养基中生长。

收集嘌呤霉素抗性细胞的上清液，并通过Amicon超速离心过滤装置(Millipore)浓缩5倍，在还原条件下在12％NUPAGE Bis/Tris凝胶(Invitrogen)上电泳。通过使用抗五组氨酸特异性抗体(Qiagen)进行免疫印迹分析显示NGF的表达。显示的大约15kDa的条带证明了表达，该条带对应于含有His标签和连接体的成熟mNGFβ(SEQ IDNO：30)的14.7kDa的预期大小。从表达mproNGFβ-His-GGC的HEK293T细胞释放到上清液中的成熟mNGFβ-HisGGC的正确加工通过Edman降解得到证实，并且显示SSTHP为成熟mNGFβ的五个N末端氨基酸。这对应于成熟mNGFβ的五个预期的氨基酸并且证实mproNGFβ-His-GGC被HEK 293T细胞正确地表达和加工为mNGFβ-His-GGC。

实施例4

mNGFβ-His-GGC的纯化

通过Ni²⁺-亲和力纯化从HEK 293T上清液纯化mNGFβ-His-GGC。简言之，上清液中补充1/10体积的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)-结合缓冲液(500mM NaH₂PO₄，1.5M NaCl，100mM Imidazol，100mMβ-巯基乙醇，pH8)，然后使用蠕动泵在4℃下泵送流经填充到柱中的平衡的Ni-NTA超流珠(Qiagen)16小时。结合后，将柱连接到AEKTAPurifier FPLC系统，并且用四倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，20mM imidazol，pH8)洗涤Ni-NTA超流珠，以减少非特异性结合的杂质的量。随后用从洗涤到洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，500mM imidazol，pH8)的2倍柱体积的梯度洗脱mNGFβ。洗脱的蛋白质在还原条件下在12％NUPAGE Bis/Tris凝胶上电泳，以检查纯化质量。这样可以得到高纯度的mNGFβ-His-GGC，并且用于如实施例7所述进一步产生Qβ-mNGFβ-His-GGC。

实施例5

单克隆抗体对mNGFβ-His-GGC的识别

与从小鼠颌下腺纯化的不含天然标签和连接体的mNGFβ相比，mNGFβ-His-GGC的结合通过夹心ELISA测定，其中使用用于捕获的单克隆抗NGFβ抗体(Chemicon International)和用于检测的多克隆绵羊抗mNGFβ抗体(Chemicon International)。简言之，单克隆抗mNGFβ抗体在碳酸盐缓冲液(0.1M NaHCO₃，pH 9.6)中稀释至0.85μg/ml，并且在微量滴定板孔上4℃包被过夜。然后用PBS-0.05％Tween20(PBS-T)洗板3次，之后在37℃下用含有2％BSA的PBS-T封闭2小时。然后将板在室温下与浓度逐渐提高的在含有1％BSA的PBS-T中稀释的从颌下腺分离的0.2至200ng/ml的mNGFβ-His-GGC或mNGFβ温育2小时。然后用PBS-T洗板6次，并且与10μg/ml绵羊抗mNGFβ抗体在室温下温育1小时。用PBS-T洗涤6次后，将板在室温下与60μg/ml过氧化物酶偶联的兔抗绵羊抗体(Chemicon International)温育30分钟。使用PBS-T进行最后6次洗涤步骤后，通过向所有孔中添加由在25ml柠檬酸缓冲液(66mM NaH2PO4，35mM柠檬酸，pH5)中的10mg OPD底物(Fluka)和8μl H₂O₂(30％)组成的100μl溶液开始酶反应。用5％H₂SO₄终止颜色反应，使用ELISA读数仪(BioRad)在450nm测量吸光度。ELISA显示重组表达的mNGFβ-His-GGC和mNGFβ被同样识别，表明mNGFβ-His-GGC正确表达并且以正确的三级构象折叠。

实施例6

mNGFβ-His-GGC的生物活性

mNGFβ-His-GGC的生物活性在体外细胞增殖试验中进行检测，该试验使用mNGFβ响应性因子依赖的人红白血病TF-1细胞系(ATCC)作为读出系统，如其他人(R&D NGFβ产品表)所述。简言之，将10⁴TF-1细胞接种于96孔平底板每孔中的100μl DMEM培养基(补充有10％FCS，10mM HEPES，1％青霉素/链霉素和1％Glutamax)中。向细胞中添加从颌下腺纯化的浓度逐渐提高的0.8至100ng/ml mNGFβ-HisGGC或mNGFβ。48小时后，将细胞用将要掺入增殖的细胞中的BrdU标记试剂(Roche Diagnostics)标记。24小时后，固定细胞，随后与过氧化物酶偶联的抗BrdU单克隆抗体(Roche Diagnostics)温育。充分洗涤后，向每孔加入100μl四苄基-联苯胺底物溶液。用5％H₂SO₄终止颜色反应，并且使用ELISA读数仪(BioRad)在450nm测量吸光度。来自颌下腺的mNGFβ-His-GGC和mNGFβ都以类似的方式刺激增殖，表明mNGFβ-His-GGC具有生物活性。

实施例7

mNGFβ-His-GGC与Qβ-VLP的偶联

Qβ-VLP(2mg/ml)与5倍摩尔过量的异双功能交联剂琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚氨基丙酰胺基)己酸酯(SMPH，Pierce)在室温下反应30分钟。SMPH从溶解于二甲亚砜的50mM贮存液获得。使用10kDa的分子量截断值(Slide-A-Lyzer，Pierce)，更换两次偶联缓冲液(20mMMES，300mM NaCl，10％甘油，pH6)，透析反应产物。透析在室温下进行。以这种方式衍生化的Qβ-VLP然后用于偶联靶蛋白质。

偶联前，如实施例4所述获得的纯化的mNGFβ-His-GGC在偶联缓冲液中透析，并且在室温(RT)下用5倍摩尔过量的TCEP还原1小时。还原的mNGFβ-His-GGC(0.25mg/ml)与衍生化的Qβ(0.25mg/ml)在总体积100μl中4℃温育4小时。反应完成后，离心反应管以除去可能的沉淀。通过将偶联产物在还原条件下在12％NuPAGE Bis/Tris凝胶上进行电泳并使用抗五His抗体进行免疫印迹分析来分析偶联反应，显示mNGFβ与Qβ-VLP有效偶联。蛋白质浓度通过Bradford进行测定。

实施例8

Qβ-mNGFβ-His-GGC的免疫原性

在第0、10、20天在不含佐剂的情况下，用50μg从实施例7获得的与mNGFβ-His-GGC偶联的QβVLP皮下免疫雄性DBA/1小鼠。作为阴性对照的小鼠只用Qβ-VLP免疫。在第10、20、30天采血。通过以10,000g在血清管(Mirotainer，BD Biosciences)中离心血液样品10分钟制备血清。血清样品中mNGFβ特异性抗体的检测通过ELISA进行，其中使用从小鼠颌下腺纯化的不含标签和连接体的mNGFβ进行包被。简言之，将mNGFβ在碳酸盐缓冲液(0.1M NaHCO₃，pH 9.6)中稀释至浓度为2.5μg/ml，并且在4℃在微量滴定孔上包被过夜。然后用PBS-0.05％Tween20(PBS-T)洗板三次，之后用含有2％BSA的PBS-T在37℃封闭2小时。然后板与在PBS-T+2％BSA中稀释的血清样品在室温下温育2小时，其中使用3倍稀释步骤，并且开始于1∶200的初始稀释度。然后用PBS-T洗板6次，并且与1∶1000稀释的过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG-Fc抗体(Jackson ImmunoResearchLaboratories)在室温下温育1小时。洗涤6次后，通过向所有孔中添加由在25ml柠檬酸缓冲液(66mM NaH2PO4，35mM柠檬酸，pH5)中的10mg OPD底物和8μl H₂O₂(30％)组成的100μl溶液启动酶反应。用5％H₂SO₄终止颜色反应，使用ELISA读数仪(BioRad)在450nm测量吸光度。ELISA显示使用上述免疫方案，Qβ-mNGFβ-His-GGC可以诱导针对mNGFβ的强自身抗体应答。

实施例9

抗Qβ-mNGFβ-His-GGC抗体的中和活性

如实施例6所述在体外细胞增殖试验中检测Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫产生的抗体的体外中和活性。简言之，如实施例8所述用Qβ或Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫小鼠。收集免疫动物的血清，通过蛋白G纯化从血清中分离总IgG部分。然后在TF-1细胞增殖试验中检测从Qβ或Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫的小鼠中纯化的总IgG中和mNGFβ生物活性的能力。简言之，将10⁴TF-1细胞接种于96孔平底板每孔中的100μl DMEM培养基(补充有10％FCS，10mM HEPES，1％青霉素/链霉素和1％Glutamax)中。从颌下腺纯化的浓度逐渐提高的0.2至10ng/ml mNGFβ与从Qβ或Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫小鼠的血清中纯化的总IgG在室温下预温育30分钟，然后向细胞中添加。48小时后，将细胞用将要掺入增殖的细胞中的BrdU标记试剂(Roche Diagnostics)标记。24小时后，固定细胞，随后与过氧化物酶偶联的抗BrdU单克隆抗体(Roche Diagnostics)温育。充分洗涤后，向每孔加入100μl四苄基-联苯胺底物溶液。用5％H₂SO₄终止颜色反应，并且使用ELISA读数仪(BioRad)在450nm测量吸光度。用与来自Qβ免疫的小鼠的10μg/ml或50μg/ml总IgG预温育的浓度逐渐增高的mNGFβ刺激的细胞显示没有增殖抑制。另一方面，用与来自Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫的小鼠的10μg/ml或50μg/ml总IgG预温育的浓度逐渐增高的mNGFβ刺激的细胞显示增殖速率显著降低，证明Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫产生的抗体具有NGF中和活性(图1)。

实施例10

Qβ-mNGF-His-GGC接种在胶原诱导的小鼠关节炎中抑制恶病质的效能

在小鼠类风湿性关节炎(RA)模型，即所谓的胶原诱导的关节炎(CIA)中，评价了Qβ-mNGF-His-GGC疫苗减轻自身免疫关节炎中恶病质的能力。在该模型中，通过真皮内注射完全弗氏佐剂(CFA)中的2型胶原(MD Biosciences)，然后在21天后真皮内注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的II型胶原，来诱导RA。炎症稳定进展，并且最终达到关节强直和永久性关节损坏伴体重减轻。雄性DBA/1小鼠(n＝8)在第-35天、第-21天和第-7天用50μgQβmNGF-His-GGC免疫，阴性对照小鼠只用Qβ免疫。三次免疫后，在第0天诱导RA。在7-9周中监测炎症过程，并根据以下定义给每肢赋予临床得分：0正常，1轻度红斑和/或脚趾/爪肿胀，2红斑且肿胀延伸到整个爪/关节，3爪/关节严重肿胀、变形，具有关节强直。图2A显示Qβ和Qβ-mNGF-His-GGC免疫的动物中的关节炎进展。两组中关节炎进展至非常类似的程度。在相同时期，每日称量小鼠体重(图2B)，显示特别是在发病后，两组之间平均体重具有显著偏差，表明Qβ-mNGF-His-GGC免疫小鼠中自身免疫性相关的恶病质得到抑制。

实施例11

在酵母聚糖A诱导的小鼠炎性痛模型中，Qβ-mNGFβ-His-GGC接种在抑制炎性痛方面的效能

向雄性BL/6小鼠的后足跖侧注射酵母提取物酵母聚糖A(Sigma)可引起热和机械刺激，Qβ-mNGF-His-GGC疫苗减轻这种刺激引起的炎症超敏性的能力通过以下方式进行评价：雄性BL/6小鼠(n＝4)在第0、10和20天用50μg Qβ-mNGFβ-His-GGC或单独的Qβ进行免疫。在每个时间点，测定两个后足的跖侧响应于热和机械刺激的热超敏性。为了测定热敏感性，确定在用特定强度的热源(红外光束)刺激后足回缩的潜伏期。使用电子控制的仪器(Plantartest，Ugo Basile)确定潜伏期。调节热源强度，使得对于未处理的动物，潜伏期大约为16秒。对于每个后足，进行6次测量，并且计算平均值。为了测定机械敏感性，测量对使用所谓的Von Frey丝的刺激的响应。Von Frey丝是校准的塑料丝，使用它可以向小鼠足的跖侧施加逐渐增大的压力。使用电子控制的仪器(IITC，Woodland Hills，USA)，测量施加的导致足回缩的压力。每足进行6次测量，并计算平均值。第31天，通过向左后足跖侧注射20μl 3mg/ml酵母聚糖A溶液诱导炎性痛。诱导炎性痛2小时、4小时、6小时、8小时、1天、2天、3天、4天和7天后，如上所述根据爪回缩测定酵母聚糖A诱导的炎症发病后立即产生的响应于热和机械刺激的超敏性。如图3所证明的，与只用Qβ免疫的动物相比，用Qβ-mNGF-His-GGC免疫的动物在热刺激(图3A)和机械刺激(图3B)后显示显著降低的超敏性。

实施例12

在慢性压迫性损伤诱导的小鼠神经性疼痛模型中，NGF-His-GGC抑制神经性疼痛的效能

雄性BL/6小鼠(n＝6)在第0、14和28天用50μg Qβ-mNGFβ-His-GGC或单独的Qβ免疫。在每个时间点如实施例11所述确定两个后足的跖侧响应于热和机械刺激的热超敏性。在第42天通过结扎坐骨神经诱导慢性压迫性损伤(CCI)或者不进行操作(假手术对照组)。坐骨神经的结扎导致各肢在14天内发展超敏性，并且在下降前持续另外2-3周。CCI是建立的啮齿动物神经性疼痛模型。CCI手术后，如实施例11所述每隔一天测定响应于热和机械刺激的敏感性。

实施例13

人NGFβ的克隆、表达、纯化以及与Qβ-VLP的偶联

通过PCR从人胎脑组织cDNA文库扩增人proNGFβ，并且将PCR产物连接到pCB28表达载体中。得到的质粒被命名为pCB28_huproNGF_His_C，其编码来自于γ免疫球蛋白的κ轻链的信号序列，随后是huproNGFβ序列、His₆标签和含有两个甘氨酸及随后的C末端半胱氨酸的连接体。基本如实施例3所述将真核表达载体pCB28_huproNGF_His_C转染到HEK 293T细胞中，并且收集含有成熟huNGFβ-His-GGC的上清液用于基本如实施例4所述通过Ni-NTA纯化。纯化的蛋白质具有SEQ ID NO：31所示的序列。根据实施例7所述的方案，将纯化的huNGFβ-His-GGC与SMPH衍生的Qb-VLP进行偶联。

实施例14

接种与含有聚阴离子大分子聚谷氨酸的Qβ-颗粒偶联的mNGFβ-His-GGC的效能

含有聚阴离子大分子聚谷氨酸的Qβ-颗粒，后面被称为Qβ(PolyGlu)，如WO 06/037787的实施例4所述产生。如前面实施例7所述将mNGFβ-His-GGC与Qβ(PolyGlu)偶联。Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC的免疫原性如下测定：雌性BL6小鼠(每组n＝4只)在第0、14、28和42天使用与作为佐剂的0.33％Alhydrogel混合的50ug Qβ(PolyGlu)、Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC或Qβ-mNGFβ-His-GGC皮下免疫。在第0、14、28、42和56天采血。制备血清，如实施例8所述通过ELISA测定mNGFβ特异性抗体。通过Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC免疫诱导的抗mNGFβ特异性抗体的效价显著低于使用Qβ-mNGFβ-His-GGC诱导的效价，并且显示Th2 IgG同种型模式，如IgG2a效价降低但IgG1效价升高所表明的(表1)。

表1：Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC或Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫后mNGFβ特异性抗体的诱导。小鼠在第0、14、28和42天用Qβ(PolyGlu)、Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC或Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫。在第0、14、28、42和56天采血，产生血清，并通过ELISA分析血清样品中mNGFβ特异性总IgG、IgG1同种型和IgG2a同种型的效价。

通过用Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC免疫诱导的抗-mNGFβ特异性自身抗体在酵母聚糖A诱导的炎性痛模型中抑制伤害性疼痛的能力以如下方式进行评估：雌性BL6小鼠(每组n＝4)在第0、14、28、42天用混合有作为佐剂的0.33％Alhydrogel的50μg Qβ(PolyGlu)、Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC或Qβ-mNGFβ-His-GGC皮下免疫。在第62天，通过向左后足的跖侧注射20μl 3mg/ml酵母聚糖A溶液诱导炎性痛。疫苗降低响应于热和机械刺激的超敏性的能力如实施例11所述进行评估。如图4所示，通过接种Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC诱导的抗mNGFβ自身抗体水平足以降低热和机械刺激后的超敏性。这种降低类似于在用Qβ-mNGFβ-His-GGC免疫后观察到的降低。

实施例15

Qβ-mNGFβ-His-GGC对神经性疼痛的抑制；在紫杉醇诱导的大鼠神经性疼痛模型中的效能

成年雄性Sprague-Dawley大鼠在第0、14、28天用500μgQβ-mNGFβ-His-GGC或单独的Qβ进行免疫。在第35天，通过4次隔天(35、37、39、41)腹膜内注射2mg/kg紫杉醇(paclitaxel)诱导神经性疼痛。从最后一次注射紫杉醇后三天开始，并持续连续4天，基本如实施例11对于小鼠所述，通过检测后爪跖面上的热痛觉过敏和机械异常性疼痛，每隔一天对改变的疼痛敏感性进行检测。

实施例16

作为可能与Qβ-VLP偶联的抗原的NGF突变蛋白的评价

如上所述具有序列修饰的NGF突变蛋白(SEQ ID NO：45-75)如实施例1-4所述重组表达并纯化。产生的突变蛋白的生物活性在基本如实施例4所述的体外生物活性分析中进行检测。选择在体外分析中具有低生物活性到无生物活性的突变蛋白，并基本如实施例7所述与QβVLP进行偶联。与QβVLP偶联的突变蛋白的免疫原性和诱导的抗体的中和活性基本如实施例8和9所述进行测定。选择显示低生物活性到无生物活性但在与QβVLP偶联时仍诱导中和抗体的突变蛋白。诱导的抗体抑制疼痛和恶病质的体外效能在如实施例10-15所述的体内模型中进行检测。

实施例17

mNGFβ-His-GGC和Flag肽抗原与AP205VLP的偶联，以及用与AP205VLP偶联的mNGFβ-His-GGC对小鼠的免疫

A.mNGFβ-His-GGC肽和Flag肽与重组AP205VLP的偶联

肽mNGFβ-His-GGC(SEQ ID NO：31)和Flag(SEQ ID NO：43)按照已知的方法化学合成。AP205VLP(SEQ ID NO：14)如PCT/EP2003/007572的实施例1和2(第75-79页)所述表达和纯化，并且溶解于20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.4缓冲液(HBS缓冲液)。溶解的AP205 VLP然后以2mg/ml的浓度(以Bradford分析确定)与2.85mM SMPH(Pierce)在室温(RT)下反应30分钟。反应混合物然后用HBS缓冲液透析，并与在来自50mM DMSO贮存液的反应混合物中稀释的0.714mM mNGFβ-His-GGC或FLAG反应。偶联反应于15℃继续2小时，反应混合物针对1000倍体积的HBS透析2X2小时，并在液氮中以等份快速冷冻，贮存于-80℃，直到进一步使用。融化一个等份，抗原与AP205亚单位的偶联通过SDS-PAGE进行评估，并且通过Bradford分析进行确定蛋白质浓度。在用交联剂衍生化AP205VLP后，除了亚单位的单体形式以外，交联产生的二聚体、三聚体、四聚体、五聚体和六聚体在SDS-PAGE中进行检测。

B.用与重组AP205VLP偶联的mNGFβ-His-GGC肽对小鼠的免疫，免疫应答的分析和IgG亚型确定

在第0、14天给小鼠(每次3只小鼠)皮下注射与mNGFβ-His-GGC肽偶联的AP205VLP。每只小鼠用在PBS中稀释到200μl的10μg疫苗免疫。小鼠在第20天眼眶后采血，并且在针对mNGFβ-His-GGC肽的ELISA中测定mNGFβ-His-GGC肽特异性抗体的效价。使用化学交联剂磺基-SPDP将mNGFβ-His-GGC与牛RNAse A偶联。ELISA板用浓度为10μg/ml的偶联的RNAse制品包被。封闭平板，然后与系列稀释的小鼠血清一起温育。结合的抗体用酶标记的相应亚型特异性的抗小鼠IgG抗体进行检测。作为对照，也检测了同一小鼠的免疫前血清。

实施例18

mNGFβ片段与AP205VLP的融合，用与AP205VLP融合的mNGFβ片段对小鼠的免疫

含有与mNGFβ1-10肽的N端或C端部分融合的AP205的构建体通过PCT/EP2005/054721的实施例1公开的方法获得。表达的融合蛋白的纯化方法与PCT/EP2005/054721的实施例2公开的方法基本相同。PAP405和pAP283的构建和序列分别在PCT/EP2005/054721和WO2004/007538A2中描述。成年雌性C57BL/6小鼠(每组5只)接种C端融合至mNGFβ1-10肽(SEQ ID NO：44)的AP205。50μg透析的疫苗在PBS中稀释至体积为200μl，并且在第0、14、28和42天皮下注射(两腹侧100μl)。疫苗施用时不使用佐剂。作为对照，一组小鼠注射PBS或单独的AP205VLP。小鼠在第0、14、28、42、56和70天眼眶后采血，并且通过ELISA分析其血清。

序列表

SEQ ID NO：1噬菌体Q-beta

AKLETVTLGN IGKDGKQTLV LNPRGVNPTN GVASLSQAGA VPALEKRVTV SVSQPSRNRK 60

NYKVQVKIQN PTACTANGSC DPSVTRQAYA DVTFSFTQYS TDEERAFVRT ELAALLASPL 120

LIDAIDQLNP AY 132

SEQ ID NO：2噬菌体Q-beta

MAKLETVTLG NIGKDGKQTL VLNPRGVNPT NGVASLSQAG AVPALEKRVT VSVSQPSRNR 60

KNYKVQVKIQ NPTACTANGS CDPSVTRQAY ADVTFSFTQY STDEERAFVR TELAALLASP 120

LLIDAIDQLN PAYWTLLIAG GGSGSKPDPV IPDPPIDPPP GTGKYTCPFA IWSLEEVYEP 180

PTKNRPWPIY NAVELQPREF DVALKDLLGN TKWRDWDSRL SYTTFRGCRG NGYIDLDATY 240

LATDQAMRDQ KYDIREGKKP GAFGNIERFI YLKSINAYCS LSDIAAYHAD GVIVGFWRDP 300

SSGGAIPFDF TKFDKTKCPI QAVIVVPRA 329

SEQ ID NO：3噬菌体R17

ASNFTQFVLV NDGGTGNVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI 60

KVEVPKVATQ TVGGVELPVA AWRSYLNMEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS 120

AIAANSGIY 129

SEQ ID NO：4噬菌体fr

MASNFEEFVL VDNGGTGDVK VAPSNFANGV AEWISSNSRS QAYKVTCSVR QSSANNRKYT 60

VKVEVPKVAT QVQGGVELPV AAWRSYMNME LTIPVFATND DCALIVKALQ GTFKTGNPIA 120

TAIAANSGIY 130

SEQ ID NO：5噬菌体GA

MATLRSFVLV DNGGTGNVTV VPVSNANGVA EWLSNNSRSQ AYRVTASYRA SGADKRKYAI 60

KLEVPKIVTQ VVNGVELPGS AWKAYASIDL TIPIFAATDD VTVISKSLAG LFKVGNPIAE 120

AISSQSGFYA 130

SEQ ID NO：6噬菌体SP

MAKLNQVTLS KIGKNGDQTL TLTPRGVNPT NGVASLSEAG AVPALEKRVT VSVAQPSRNR 60

KNFKVQIKLQ NPTACTRDAC DPSVTRSAFA DVTLSFTSYS TDEERALIRT ELAALLADPL 120

IVDAIDNLNP AY 132

SEQ ID NO：7噬菌体SP

AKLNQVTLSK IGKNGDQTLT LTPRGVNPTN GVASLSEAGA VPALEKRVTV SVAQPSRNRK 60

NFKVQIKLQN PTACTRDACD PSVTRSAFAD VTLSFTSYST DEERALIRTE LAALLADPLI 120

VDAIDNLNPA YWAALLVASS GGGDNPSDPD VPVVPDVKPP DGTGRYKCPF ACYRLGSIYE 180

VGKEGSPDIY ERGDEVSVTF DYALEDFLGN TNWRNWDQRL SDYDIANRRR CRGNGYIDLD 240

ATAMQSDDFV LSGRYGVRKV KFPGAFGSIK YLLNIQGDAW LDLSEVTAYR SYGMVIGFWT 300

DSKSPQLPTD FTQFNSANCP VQTVIIIPS 329

SEQ ID NO：8噬菌体MS2

MASNFTQFVL VDNGGTGDVT VAPSNFANGV AEWISSNSRS QAYKVTCSVR QSSAQNRKYT 60

IKVEVPKVAT QTVGGVELPV AAWRSYLNME LTIPIFATNS DCELIVKAMQ GLLKDGNPIP 120

SAIAANSGIY 130

SEQ ID NO：9噬菌体M11

MAKLQAITLS GIGKKGDVTL DLNPRGVNPT NGVAALSEAG AVPALEKRVT ISVSQPSRNR 60

KNYKVQVKIQ NPTSCTASGT CDPSVTRSAY SDVTFSFTQY STVEERALVR TELQALLADP 120

MLVNAIDNLN PAY 133

SEQ ID NO：10噬菌体MX1

MAKLQAITLS GIGKNGDVTL NLNPRGVNPT NGVAALSEAG AVPALEKRVT ISVSQPSRNR 60

KNYKVQVKIQ NPTSCTASGT CDPSVTRSAY ADVTFSFTQY STDEERALVR TELKALLADP 120

MLIDAIDNLN PAY 133

SEQ ID NO：11噬菌体NL95

MAKLNKVTLT GIGKAGNQTL TLTPRGVNPT NGVASLSEAG AVPALEKRVT VSVAQPSRNR 60

KNYKVQIKLQ NPTACTKDAC DPSVTRSGSR DVTLSFTSYS TERERALIRT ELAALLKDDL 120

IVDAIDNLNP AYWAALLAAS PGGGNNPYPG VPDSPNVKPP GGTGTYRCPF ACYRRGELIT 180

EAKDGACALY ACGSEALVEF EYALEDFLGN EFWRNWDGRL SKYDIETHRR CRGNGYVDLD 240

ASVMQSDEYV LSGAYDVVKM QPPGTFDSPR YYLHLMDGIY VDLAEVTAYR SYGMVIGFWT 300

DSKSPQLPTD FTRFNRHNCP VQTVIVIPSL 330

SEQ ID NO：12噬菌体f2

ASNFTQFVLV NDGGTGNVTV APSNFANGVA EWISSNSRSQ AYKVTCSVRQ SSAQNRKYTI 60

KVEVPKVATQ TVGGVELPVA AWRSYLNLEL TIPIFATNSD CELIVKAMQG LLKDGNPIPS 120

AIAANSGIY 129

SEQ ID NO：13噬菌体PP7

MSKTIVLSVG EATRTLTEIQ STADRQIFEE KVGPLVGRLR LTASLRQNGA KTAYRVNLKL 60

DQADVVDCST SVCGELPKVR YTQVWSHDVT IVANSTEASR KSLYDLTKSL VATSQVEDLV 120

VNLVPLGR 128

SEQ ID NO：14噬菌体AP205

MANKPMQPIT STANKIVWSD PTRLSTTFSA SLLRQRVKVG IAELNNVSGQ YVSVYKRPAP 60

KPEGCADACV IMPNENQSIR TVISGSAENL ATLKAEWETH KRNVDTLFAS GNAGLGFLDP 120

TAAIVSSDTT A 131

SEQ ID NO：15噬菌体Qbeta 240突变体

AKLETVTLGN IGRDGKQTLV LNPRGVNPTN GVASLSQAGA VPALEKRVTV SVSQPSRNRK 60

NYKVQVKIQN PTACTANGSC DPSVTRQKYA DVTFSFTQYS TDEERAFVRT ELAALLASPL 120

LIDAIDQLNP AY 132

SEQ ID NO：16噬菌体Q-beta 243突变体

AKLETVTLGK IGKDGKQTLV LNPRGVNPTN GVASLSQAGA VPALEKRVTV SVSQPSRNRK 60

NYKVQVKIQN PTACTANGSC DPSVTRQKYA DVTFSFTQYS TDEERAFVRT ELAALLASPL 120

LIDAIDQLNP AY 132

SEQ ID NO：17噬菌体Q-beta 250突变体

ARLETVTLGN IGRDGKQTLV LNPRGVNPTN GVASLSQAGA VPALEKRVTV SVSQPSRNRK 60

NYKVQVKIQN PTACTANGSC DPSVTRQKYA DVTFSFTQYS TDEERAFVRT ELAALLASPL 120

LIDAIDQLNP AY 132

SEQ ID NO：18噬菌体Q-beta 251突变体

AKLETVTLGN IGKDGRQTLV LNPRGVNPTN GVASLSQAGA VPALEKRVTV SVSQPSRNRK 60

NYKVQVKIQN PTACTANGSC DPSVTRQKYA DVTFSFTQYS TDEERAFVRT ELAALLASPL 120

LIDAIDQLNP AY 132

SEQ ID NO：19噬菌体Q-beta 259突变体

ARLETVTLGN IGKDGRQTLV LNPRGVNPTN GVASLSQAGA VPALEKRVTV SVSQPSRNRK 60

NYKVQVKIQN PTACTANGSC DPSVTRQKYA DVTFSFTQYS TDEERAFVRT ELAALLASPL 120

LIDAIDQLNP AY 132

SEQ ID NO：20乙型肝炎病毒

MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTASALYRE ALESPEHCSP HHTALRQAIL 60

CWGELMTLAT WVGNNLEDPA SRDLVVNYVN TNMGLKIRQL LWFHISCLTF GRETVLEYLV 120

SFGVWIRTPP AYRPPNAPIL STLPETTVVR RRDRGRSPRR RTPSPRRRRS QSPRRRRSQS 180

RESQC 185

SEQ ID NO：21乙型肝炎病毒

MDIDPYKEFG ATVELLSFLP SDFFPSVRDL LDTAAALYRD ALESPEHCSP HHTALRQAIL 60

CWGDLMTLAT WVGTNLEDGG KGGSRDLVVS YVNTNVGLKF RQLLWFHISC LTFGRETVLE 120

YLVSFGVWIR TPPAYRPPNA PILSTLPETT VVRRRDRGRS PRRRTPSPRR RRSQSPRRRR 180

SQSRESQC 188

SEQ ID NO：22成熟人NGF蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：23人NGF前体

MSMLFYTLIT AFLIGIQAEP HSESNVPAGH TIPQAHWTKL QHSLDTALRR ARSAPAAAIA 60

ARVAGQTRNI TVDPRLFKKR RLRSPRVLFS TQPPREAADT QDLDFEVGGA APFNRTHRSK 120

RSSSHPIFHR GEFSVCDSVS VWVGDKTTAT DIKGKEVMVL GEVNINNSVF KQYFFETKCR 180

DPNPVDSGCR GIDSKHWNSY CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACV CVLSRKAVRR 240

A 241

SEQ ID NO：24小鼠NGF蛋白

SSTHPVFHMG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVTVLA EVNINNSVFR QYFFETKCRA 60

SNPVESGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TTDEKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKATRRG 120

SEQ ID NO：25小鼠

MSMLFYTLIT AFLIGVQAEP YTDSNVPEGD SVPEAHWTKL QHSLDTALRR ARSAPTAPIA 60

ARVTGQTRNI TVDPRLFKKR RLHSPRVLFS TQPPPTSSDT LDLDFQAHGT IPFNRTHRSK 120

RSSTHPVFHM GEFSVCDSVS VWVGDKTTAT DIKGKEVTVL AEVNINNSVF RQYFFETKCR 180

ASNPVESGCR GIDSKHWNSY CTTTHTFVKA LTTDEKQAAW RFIRIDTACV CVLSRKATRR 240

G 241

SEQ ID NO：26Nde-proNGF-F

ggaattccat atggaaccgt acacagatag c 31

SEQ ID NO：27proNGF-Xho-R

cccgctcgag gcctcttctt gtagccttc 29

SEQ ID NO：28mproNGFeuk_var1_f

tagattaatt aaggaaccgt acacagatag caat 34

SEQ ID NO：29mproNGFeuk_var1_r

taggcctcga ggcctcttct tgtagccttc ct 32

SEQ ID NO：30小鼠NGF，具有his标签和GGC连接体

SSTHPVFHMG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVTVLA EVNINNSVFR QYFFETKCRA 60

SNPVESGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TTDEKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKATRRG 120

LEHHHHHHGG C 131

SEQ ID NO：31人NGF，具有his标签和GGC

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

LEHHHHHHGG C 131

SEQ ID NO：32牛NGF蛋白

SSSHPVFHRG EFSVCDSISV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDAKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKTGQRA 120

SEQ ID NO：33狗NGF蛋白

SSPHPVFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PTPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAGRRA 120

SEQ ID NO：34马NGF蛋白

SSSHPVFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKTGRKA 120

SEQ ID NO：35豚鼠NGF蛋白

SSTHPVFHMG EFSVCDSVSV WVADKTTATD IKGKEVTVLA EVNVNNNVFK QYFFETKCRD 60

PSPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TTANKQAAWR FIRIDTACVC VLNRKAARRG 120

SEQ ID NO：36黑猩猩NGF蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：37猪NGF蛋白

SSSHPVFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAGRRA 120

SEQ ID NO：38大猩猩NGF蛋白(低地母大猩猩)

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：39红毛猩猩NGF蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：40AP205的外壳蛋白的突变蛋白

MANKPMQPIT STADKIVWSD PTRLSTTFSA SLLRQRVKVG IAELNNVSGQ YVSVYKRPAP 60

KPEGCADACV IMPNENQSIR TVISGSAENL ATLKAEWETH KRNVDTLFAS GNAGLGFLDP 120

TAAIVSSDTT A 131

SEQ ID NO：41噬菌体AP205的SEQ ID NO：14的de Met

ANKPMQPITS TANKIVWSDP TRLSTTFSAS LLRQRVKVGI AELNNVSGQY VSVYKRPAPK 60

PEGCADACVI MPNENQSIRT VISGSAENLA TLKAEWETHK RNVDTLFASG NAGLGFLDPT 120

AAIVSSDTTA 130

SEQ ID NO：42噬菌体AP205的SEQ ID NO：40的de Met

ANKPMQPITS TADKIVWSDP TRLSTTFSAS LLRQRVKVGI AELNNVSGQY VSVYKRPAPK 60

PEGCADACVI MPNENQSIRT VISGSAENLA TLKAEWETHK RNVDTLFASG NAGLGFLDPT 120

AAIVSSDTTA 130

SEQ ID NO：43Flag

CGGDYKDDDD K 11

SEQ ID NO：44NGF片段(1-10)

SSSHPIFHRG 10

SEQ ID NO：45NGF突变蛋白

GEFSVCDSVS VWVGDKTTAT DIKGKEVMVL GEVNINNSVF KQYFFETKCR DPNPVDSGCR 60

GIDSKHWNSY CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACV CVLSRKAVRR A 111

SEQ ID NO：46NGF突变蛋白

SSSAPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：47NGF突变蛋白

SSSDPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：48NGF突变蛋白

SSSHPIFARG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：49NGF突变蛋白

SSSAPIFARG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：50NGF突变蛋白

SSSAPIFAAG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：51NGF突变蛋白

SSSHAIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：52NGF突变蛋白

SSSHPIAHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：53NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVAAANSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：54NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVAINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：55NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNANNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：56NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNIANSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：57NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSAFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：58NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSPFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：59NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVAK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：60NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSAAK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：61NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDAKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：62NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGAQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：63NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKAAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：64NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDAAQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：65NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGAAAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：66NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDAAAAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：67NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWW FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：68NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC TLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：69NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VASRKAVRRA 120

SEQ ID NO：70NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSSKAVRRA 120

SEQ ID NO：71NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRSAVRRA 120

SEQ ID NO：72NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLTRKAVRRA 120

SEQ ID NO：73NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKAWNSYC TTTHTFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：74NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKHWNSYC TTTATFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

SEQ ID NO：75NGF突变蛋白

SSSHPIFHRG EFSVCDSVSV WVGDKTTATD IKGKEVMVLG EVNINNSVFK QYFFETKCRD 60

PNPVDSGCRG IDSKAWNSYC TTTATFVKAL TMDGKQAAWR FIRIDTACVC VLSRKAVRRA 120

Claims

1.一种组合物，包含：

(a)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)；和

(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，

其中所述至少一种抗原是NGF抗原；

并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。

2.前述权利要求的组合物，其中所述至少一种抗原是NGF蛋白、NGF片段或NGF突变蛋白。

3.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种抗原是NGF蛋白，其中所述NGF蛋白由一种氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列包含与氨基酸序列SEQ ID NO：22至少90％的序列同一性，并且其中优选地所述NGF蛋白由氨基酸序列SEQ ID NO：22组成。

4.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种抗原是NGF片段，其中优选地所述NGF片段由SEQ ID NO：44组成。

5.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种抗原是NGF突变蛋白，其中优选地所述NGF突变蛋白具有降低的生物活性，并且其中最优选地所述NGF突变蛋白不具有生物活性。

6.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述至少一种抗原是NGF突变蛋白，并且其中所述NGF突变蛋白由选自SEQ ID NO：45-75的任一的氨基酸序列组成。

7.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述VLP是RNA噬菌体的VLP，其中优选地所述RNA噬菌体选自：

(a)噬菌体Qβ；

(b)噬菌体R17；

(c)噬菌体fr；

(d)噬菌体GA；

(e)噬菌体SP；

(f)噬菌体MS2；

(g)噬菌体M11；

(h)噬菌体MX1；

(i)噬菌体NL95；

(k)噬菌体f2；

(l)噬菌体PP7，和

(m)噬菌体AP205。

8.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述VLP包含RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段，其中优选地所述外壳蛋白包含SEQ ID NO：1或者优选地由SEQ ID NO：1组成。

9.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一附着位点与所述第二附着位点通过至少一个共价键连接。

10.权利要求9的组合物，其中所述共价键是非肽键。

11.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一附着位点包含或者优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。

12.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第二附着位点包含或优选地是巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。

13.权利要求9的组合物，其中所述至少一个共价键是肽键，并且其中优选地所述VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。

14.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述VLP是重组VLP，并且其中所述重组VLP基本不含宿主RNA。

15.权利要求14的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种聚阴离子大分子，其中所述聚阴离子大分子包装到所述VLP内，并且其中优选地所述聚阴离子大分子是聚阴离子多肽或阴离子葡聚糖。

16.权利要求15的组合物，其中所述聚阴离子大分子是选自下组的聚阴离子多肽：(a)聚谷氨酸；(b)聚天冬氨酸；(c)聚(GluAsp)；和(d)(a)至(c)的任何化学修饰，并且其中优选地所述聚阴离子多肽是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸，并且其中更优选地所述聚阴离子多肽是聚谷氨酸。

17.权利要求15的组合物，其中所述聚阴离子大分子是阴离子葡聚糖，并且其中优选地所述阴离子葡聚糖选自：

(a)硫酸葡聚糖；

(b)羧甲基葡聚糖；

(c)磺丙基葡聚糖；

(d)磺酸甲酯葡聚糖；和

(e)磷酸葡聚糖。

18.一种疫苗组合物，包含治疗有效量的前述权利要求中任一项的组合物，其中优选地所述疫苗组合物还包含佐剂。

19.一种药物组合物，包含：

(a)权利要求1-17中任一项的组合物；和

(b)药学可接受的载体。

20.一种免疫方法，包括给动物，优选地给人施用权利要求1-17中任一项的组合物、权利要求18的疫苗组合物或权利要求19的药物组合物。

21.用作药物的权利要求1-17中任一项的组合物、权利要求18的疫苗组合物或权利要求19的药物组合物。

22.权利要求1-17中任一项的组合物或权利要求18的疫苗组合物在制备用于治疗疼痛、优选慢性疼痛、最优选类风湿性关节炎疼痛的药物中的用途。

23.用于治疗疼痛、优选慢性疼痛、最优选类风湿性关节炎疼痛的权利要求1-17中任一项的组合物、权利要求18的疫苗组合物或权利要求19的药物组合物。

24.一种生产权利要求1-17中任一项的组合物的方法，所述方法包括：

(a)提供具有至少一个第一附着位点的VLP；

(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种NGF抗原；和

(c)将所述VLP与所述NGF抗原连接，以产生所述组合物，其中所述NGF抗原和所述VLP通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。