CN110869386A

CN110869386A - 重组神经生长因子的组合物和方法

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Publication number: CN110869386A
Application number: CN201880024281.0A
Authority: CN
Inventors: 温静
Original assignee: Vivebaba
Current assignee: Vivebaba
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2020-03-06
Also published as: US20180236031A1; JP2023040155A; CA3053267A1; JP2020507350A; US20220339251A1; WO2018148507A1

Abstract

本申请提供了具有改进的体内稳定性的神经生长因子(NGF)变体、产生和纯化NGF变体的方法以及潜在的治疗应用。

Description

重组神经生长因子的组合物和方法

相关申请

本申请要求2017年2月10日提交的美国临时专利申请序列号62/457,499的优先权的权益，其通过引用以其整体并入本文。

发明背景

在1953年，神经生长因子(NGF)首次被诺贝尔奖获得者Rita Levi-Montalcini从小鼠肉瘤中分离，并且是第一个被发现的神经营养因子。NGF主要调控来自神经嵴的交感神经元和感觉神经的存活、分化和增殖。它还在神经再生过程和神经学功能的恢复中发挥重要作用。

NGF被发现在多种来源中是丰富的，和小鼠的下颌下腺是研究得最深入的NGF来源之一。其他来源包含蛇毒、公牛的精囊、豚鼠前列腺和人的胎盘。在这些来源中，小鼠的NGF基因序列与人的NGF基因序列最高度同源(>90％)，并且因此从下颌下腺分离的小鼠NGF和从胎盘分离的人NGF已用于临床应用，主要用于治疗视神经损伤。对用NGF治疗有响应的另外的病况包含毒性神经病变、外周神经病变、面部神经病变等等。

目前，小鼠NGF通过肌肉内注射给予。由于小鼠NGF的半衰期短，因此需要每日注射（30μg小鼠NGF），持续4周的疗程。主要的副作用包含在治疗过程中由多次注射引起的局部疼痛。初步的药物代谢动力学数据已显示，人NGF与小鼠NGF表现出相似的体内半衰期，并因此在临床使用中可能需要相似的药物给药频率，即每日注射。但是，每日注射是非常不方便的并且使患者不舒服。

因此，需要人NGF (NGF)的改进的治疗形式，其可以更方便地给药。

发明概述

本发明部分地涉及在患者中具有更长半衰期的长效重组人神经生长因子(rhNGF)。具体地，与未改变的rhNGF相比，长效神经生长因子表现出相似的生物学活性，但体内半衰期显著更长，如动物研究中证明的。本文描述的NGF变体多肽除NGF部分外还包含另外的多肽部分。在一些实施方案中，另外的多肽部分增加了NGF部分的体内稳定性（例如半衰期）。在一些实施方案中，这样的另外的多肽包含人绒毛膜促性腺激素(hCG)或其生物学活性片段。在一些优选的实施方案中，这样的另外的多肽至少包含hCG的羧基末端部分(CTP)。

在一个方面，本发明提供了一种多肽，其包含

i）包含全长的神经生长因子(NGF)多肽序列或其生物学活性片段的第一个部分；和

ii）包含增加所述NGF多肽序列或其生物学活性片段的半衰期的另外的多肽的第二个部分。

在一些实施方案中，本文描述的多肽的第一个部分包含全长的NGF多肽序列。在其他实施方案中，本文描述的多肽的第一个部分包含NGF的生物学活性片段。

本文描述的多肽可具有哺乳动物来源。例如，这种多肽或其第一个部分和/或其第二个部分包含哺乳动物序列，诸如人或小鼠序列。在一些实施方案中，本文描述的多肽的第一个部分包含人NGF序列。这种人NGF序列可以与SEQ ID NO: 5有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在一些实施方案中，人NGF序列与SEQ ID NO: 5有至少70％的同一性。在一些实施方案中，人NGF序列与SEQ ID NO: 5有至少80％的同一性。在一些实施方案中，人NGF序列与SEQ ID NO: 5有至少90％的同一性。在一些实施方案中，人NGF序列与SEQ ID NO: 5有至少95％的同一性。在一些实施方案中，人NGF序列与SEQ ID NO: 5有至少99％的同一性。在一些实施方案中，人NGF序列是SEQ ID NO: 5。在一些实施方案中，人NGF序列由在严格的条件下与编码具有与SEQ ID NO: 5互补的序列的多肽的多核苷酸特异性杂交的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，本文描述的多肽的第一个部分能够与NGF的至少一种结合配偶体结合，任选地其中所述NGF的至少一种结合配偶体是原肌球蛋白受体激酶A (TrkA)或低亲和力NGF受体(LNGFR/p75NTR)。在一些实施方案中，本文描述的多肽的第一个部分包含NGF的生物学活性片段，其中这种生物学活性通过其与至少一种NGF结合配偶体（诸如TrkA和LNGFR/p75NTR）的相互作用来测量。在一些实施方案中，本文描述的多肽的第一个部分包含SEQ ID NO: 5的从位置122到位置241的氨基酸残基。

在一些实施方案中，本文描述的多肽的第二个部分包含全长的人绒毛膜促性腺激素(HCG)或其生物学活性片段。

在一些实施方案中，本文描述的多肽的第二个部分包含人HCG序列，诸如SEQ IDNo: 10-12中的一个。在一些实施方案中，第二个部分包含HCG的羧基末端部分(CTP)。在一些实施方案中，本文描述的多肽的第二个部分包含与SEQ ID NO: 13有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性。在一些实施方案中，第二个部分与SEQ ID NO: 13有至少70％的同一性。在一些实施方案中，第二个部分与SEQ ID NO: 13有至少75％的同一性。在一些实施方案中，第二个部分与SEQID NO: 13有至少80％的同一性。在一些实施方案中，第二个部分与SEQ ID NO: 13有至少90％的同一性。在一些实施方案中，第二个部分与SEQ ID NO: 13有至少95％的同一性。在一些实施方案中，第二个部分与SEQ ID NO: 13有至少99％的同一性。在一些实施方案中，第二个部分包含SEQ ID NO: 13。在一些实施方案中，第二个部分由在严格的条件下与编码具有与SEQ ID NO: 13互补的序列的多肽的多核苷酸特异性杂交的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，本文描述的多肽的第二个部分包含至少一个糖基化位点。

在一些实施方案中，本文描述的多肽是融合蛋白。例如，多肽的第一个部分和第二个部分可以使用或不使用接头（例如肽接头）融合在一起。第一个部分可以融合至第二个部分的N末端或第二个部分的C末端。第一个部分和/或第二个部分的多个拷贝可以融合在一起。

在一些实施方案中，本文描述的多肽包含与SEQ ID NO: 2或3有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO: 2或3有至少70％的同一性。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO: 2或3有至少75％的同一性。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO: 2或3有至少80％的同一性。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO:2或3有至少90％的同一性。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO: 2或3有至少95％的同一性。在一些实施方案中，多肽序列与SEQ ID NO: 2或3有至少99％的同一性。在一些实施方案中，多肽序列包含SEQ ID NO: 2或3。在一些实施方案中，多肽由在严格的条件下与编码具有与SEQ ID NO: 2或3互补的序列的多肽的多核苷酸特异性杂交的多核苷酸编码。

在一些实施方案中，本文描述的多肽相对于其第一个部分在体内表现出增加的半衰期。例如，多肽的体内半衰期可以至少是单独其第一个部分（即NGF多肽序列）的体内半衰期的1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0或更多倍（例如在人中）。在一些实施方案中，多肽的体内半衰期至少是单独NGF多肽序列的体内半衰期的2.5倍。

在一些实施方案中，本文描述的多肽或其第一个或第二个部分进一步包含标记，诸如纯化标记和/或标签（例如GST、FLAG、六组氨酸(His6)等）和/或荧光标签。

在另一个方面，本发明提供了编码本文描述的多肽的多核苷酸。例如，这种多核苷酸可包含与SEQ ID NO: 1有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性的核酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列与SEQ ID NO: 1有至少70％的同一性。在一些实施方案中，多核苷酸序列与SEQ ID NO:1有至少80％的同一性。在一些实施方案中，多核苷酸序列与SEQ ID NO: 1有至少90％的同一性。在一些实施方案中，多核苷酸序列与SEQ ID NO: 1有至少95％的同一性。在一些实施方案中，多核苷酸序列与SEQ ID NO: 1有至少99％的同一性。在一些实施方案中，多核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1。在一些实施方案中，多核苷酸序列在严格的条件下特异性杂交至与SEQ ID NO: 1互补的序列。在一些实施方案中，本文描述的多核苷酸进一步包含检测标记，诸如纯化标记和/或标签（例如GST、FLAG、六组氨酸(His6)等）和/或荧光标签。在一些实施方案中，严格的条件包含在50％v/v甲酰胺、5 x SSC、2％w/v封闭试剂、0.1％ N-月桂酰肌氨酸、0.3％ SDS中在65°C杂交过夜，并在5 x SSC中在约65°C洗涤。

在另一个方面，本发明提供了一种表达载体，其能够表达本文描述的多肽和/或多核苷酸。这种表达载体可以是有或没有遗传修饰的质粒、粘粒、病毒载体等。

在另一个方面，本发明提供了包含本文描述的表达载体、多肽或多核苷酸的宿主细胞。这种宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、鸡细胞或哺乳动物细胞（诸如CHO、Hela、HT293或其他细胞）。在一些实施方案中，本文描述的宿主细胞是永生化的。

在另一个方面，本发明提供了一种方法，其包含

i）在细胞培养基中培养本文描述的宿主细胞；和

ii）表达本文描述的多肽。

在一些实施方案中，该方法进一步包含

iii）从细胞培养基中纯化本文描述的多肽。

通过这些示例性的方法，可以产生、分离并最终纯化本文描述的多肽用于进一步使用。

在另一个方面，本发明还提供了包含本文描述的多肽、多核苷酸、表达载体和/或宿主细胞的组合物。在某些这样的实施方案中，该组合物是进一步包含药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗与神经生长因子(NGF)不充足和/或有缺陷有关的疾病或病症的方法，其包含向受试者给予本文描述的多肽、组合物或药物组合物。这样的疾病或病症可以是本文描述的神经元病症中的任何一种，诸如神经元变性。在一些实施方案中，该方法进一步包含向受试者给予另外的药剂和/或疗法以治疗该疾病或病症。

在另一个方面，本发明提供了一种促进神经元的生长和/或增殖的方法，其包含向受试者给予本文描述的多肽、组合物或药物组合物。

在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如非人类哺乳动物（例如小鼠、狗、猫等）或人。在优选的实施方案中，受试者是人。

附图简述

图1描述了pCI-neo/NGF-CTP质粒的结构的示意图。

图2描述了纯化的rhNGF-CTP蛋白质的凝胶电泳。

图3显示了在静脉内注射后，在药物代谢动力学研究中rhNGF和rhNGF-CTP的大鼠血浆浓度分布图。

发明详述

本发明部分地涉及神经生长因子(NGF)变体（尤其是包含全长的NGF序列或其生物学活性片段以及另一种多肽的NGF变体）的发现。这样的NGF变体在体外、离体和/或体内可能比野生型NFG蛋白质更稳定（例如具有更长的半衰期）。

因此，提供了NGF变体的多肽、多核苷酸和组合物，其维持了至少一部分或全部的野生型NGF活性。在一些实施方案中，NGF变体包含全长的NGF序列，或其生物学活性片段。在一些实施方案中，NGF变体包含另一种多肽（优选异源的多肽）例如以形成融合蛋白。例如，本文描述的NGF变体的NGF部分和异源的多肽部分可以使用或不使用接头融合在一起。在一些实施方案中，NGF部分融合至异源的多肽的N-末端。在其他实施方案中，NGF部分融合至异源的多肽的C-末端。本文描述的NGF变体的NGF部分的氨基酸序列可以来源于野生型NGF序列，或通过亲本NGF氨基酸序列（诸如野生型NGF序列）的一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失来获得。NGF变体可以保持与其所来源的野生型NGF分子或亲本NGF分子至少70%氨基酸序列同一性。有用数量的这些NGF变体可以使用重组DNA技术制备。

本发明的另一个方面提供了编码NGF变体的重组核酸，和包含这些核酸的表达载体和宿主细胞。

本发明的另一个方面提供了产生NGF变体的方法，诸如使用本发明的核酸、载体和宿主细胞的方法。在一些实施方案中，培养用包含编码NGF变体的核酸的表达载体转化的宿主细胞，来允许核酸的表达以产生重组NGF变体。

此外，提供了使用本文描述的NGF变体和相关疗法治疗受试者的神经退行性疾病或病症（例如神经元病症（诸如神经元变性））的方法和组合物。

本发明的其他优点和方面将从以下详细的描述、附图和权利要求中变得显而易见。

I. 定义

本文使用的冠词“a”和“an”是指一个或多于一个（即至少一个）冠词语法对象。举例来说，“元件”意味着一个元件或多于一个元件。

术语“给予”旨在包含允许药剂（诸如本文描述的多肽和/或组合物）完成其预期功能的给药途径。可以使用的治疗身体的给药途径的实例包含注射（皮下注射、静脉内注射、胃肠道外注射、腹膜内注射、鞘内注射等）、口服、吸入和经皮的途径。注射可以是推注或者可以是连续的输注。取决于给药途径，药剂可以涂有选择的材料或用选择的材料处理以保护其免受自然环境影响（所述自然环境可能对药剂完成其预期功能的能力产生有害影响）。药剂可以单独给予，或与药学上可接受的载体一起给予。药剂也可以作为在体内转变成其活性形式的前体药物给予。在一些实施方案中，药剂经口服给予。在其他实施方案中，药剂通过本文描述的注射途径给予。

术语“增加/减少的量”或“增加/减少的水平”是指与在先前时间的相同受试者中和/或在正常和/或对照受试者中相同分子的量和/或值相比，在受试者中的分子（例如NGF）的绝对和/或相对的量和/或值增加或减少。

如果受试者中的分子（例如NGF）的量分别大于或小于正常水平超过用于评估量的试验的标准误差的量，并且优选地该量的至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、300％、350％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％或更多，则该分子的量“显著地”大于或小于分子的正常量。或者，如果受试者中的分子的量分别是分子的正常量的至少约两倍，并且优选地至少约三倍、四倍或五倍，或者是分子的正常量的至多约1/2，并且优选地至多约1/3、1/4或1/5，该量可以被认为“显著地”大于或小于正常量。这样的“显著性”也可以应用于本文描述的任何其他测量的参数，诸如对于表达、抑制、细胞毒性、细胞生长等。

术语“编码区”是指包含密码子的核苷酸序列的区域，所述密码子被翻译成氨基酸残基，而术语“非编码区”是指不翻译成氨基酸的核苷酸序列的区域（例如5'和3'非翻译区）。

术语“互补的”是指两条核酸链的区域之间或同一核酸链的两个区域之间的序列互补性的广义概念。已知的是如果第二个核酸区域的残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第一个核酸区域的腺嘌呤残基能够和与第一个区域反平行的第二个核酸区域的残基形成特定的氢键（“碱基配对”）。类似地，已知的是如果第二条核酸链的残基是鸟嘌呤，则第一条核酸链的胞嘧啶残基能够和与第一条链反平行的第二条核酸链的残基进行碱基配对。如果当两个区域以反平行方式排列时，核酸的第一个区域的至少一个核苷酸残基能够与相同或不同的核酸的第二个区域的残基进行碱基配对，则第一个区域与第二个区域是互补的。优选地，第一个区域包含第一个部分以及第二个区域包含第二个部分，借此，当第一个部分和第二个部分以反平行方式排列时，第一个部分的至少约50％、和优选地至少约75％、至少约90％、或至少约95％的核苷酸残基能够与第二个部分中的核苷酸残基进行碱基配对。更优选地，第一个部分的所有核苷酸残基能够与第二个部分中的核苷酸残基进行碱基配对。

本文使用的术语“同源的”是指同一核酸链的两个区域之间或两个不同核酸链的区域之间的核苷酸序列的相似性。当两个区域中的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据时，那么所述区域在该位置是同源的。如果每个区域的至少一个核苷酸残基位置被相同的残基占据，则第一个区域与第二个区域是同源的。两个区域之间的同源性根据被相同核苷酸残基占据的两个区域的核苷酸残基位置的比例来表示。举例来说，具有核苷酸序列5'-ATTGCC-3'的区域和具有核苷酸序列5'-TATGGC-3'的区域共享50％的同源性。优选地，第一个区域包含第一个部分以及第二个区域包含第二个部分，借此，每一个部分的至少约50％、和优选地至少约75％、至少约90％、或至少约95％的核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。更优选地，每一个部分的所有核苷酸残基位置被相同的核苷酸残基占据。

术语“宿主细胞”旨在指其中已引入本发明的核酸（诸如本发明的重组表达载体）的细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，这样的术语不仅指特定的主题细胞，还指这种细胞的后代或潜在的后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在随后的传代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包含在本文使用的该术语的范围内。在一些实施方案中，本文描述的宿主细胞是哺乳动物细胞（诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞等）。在一些实施方案中，宿主细胞是永生化的。

当提及两个分子（例如，NGF变体及其结合配偶体）之间的相互作用时，本文使用的术语“相互作用”是指分子彼此的物理接触（例如结合）。通常，这种相互作用导致了所述分子之一或两者的活性（其产生生物学效应）。所述活性可以是所述分子之一或两者的直接活性。或者，可以防止相互作用中的一种或两种分子结合其配体，并因此在配体结合活性（例如结合其配体并触发或抑制免疫应答）方面保持无活性。抑制这种相互作用导致相互作用涉及的一种或多种分子的活性的破坏。增强这种相互作用将延长或增加所述物理接触的可能性，并延长或增加所述活性的可能性。

本文使用的“分离的蛋白质”是指下述蛋白质（例如NGF变体多肽），其当从细胞中分离或通过重组DNA技术产生时基本上不含其他蛋白质、细胞材料、分离介质和培养基，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物学活性部分基本上不含来自细胞或组织源的细胞材料或其他污染蛋白质（抗体、多肽、肽或融合蛋白来源于所述细胞或组织源），或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含细胞材料”包括这样的制剂，在其中本发明的组合物与细胞的细胞组分分离，本发明的组合物是从所述细胞中分离或重组产生的。在一个实施方案中，术语“基本上不含细胞材料”包括具有少于约30％、20％、10％或5％（干重）的细胞材料的制剂。当重组产生抗体、多肽、肽或融合蛋白或其片段（例如其生物学活性片段）时，也优选基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制剂体积的小于约20％、更优选小于约10％和最优选小于约5％。

在一些实施方案中，包含本文描述的NGF变体多肽的治疗组合物用于治疗受试者的疾病或病症。这样的疾病或病症可包含例如任何与内源性NGF基因、mRNA和/或蛋白质的量、水平和/或活性的缺乏相关的疾病，诸如神经元病症（例如神经元变性）等。在一些实施方案中，本文描述的治疗组合物进一步地包含能够治疗本文描述的疾病或病症的其它药剂。

在一些实施方案中，本文描述的受试者患有神经元病症（诸如神经元变性）。本文描述的NGF变体被认为可用于促进体外和体内神经元的发育、维持或再生，所述神经元包含中枢神经元（脑和脊髓）、外周神经元（交感神经元、副交感神经元、感觉神经元和肠神经元）和运动神经元。因此，本文描述的NGF变体可用于治疗多种神经学疾病和病症的方法中。在优选的实施方案中，将本发明的制剂向患者给予以治疗一种或多种神经病症或病况。本文通过“神经病症”指与神经元变性或损伤相关的中枢神经系统和/或外周神经系统的病症。除了治疗由于创伤、烧伤、肾功能紊乱、损伤和用于治疗癌症和AIDS的化疗剂的毒性作用而受损的神经之外，神经病症的具体实例还包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病、中风、ALS、外周神经病变以及以神经元（无论是中枢神经元、外周神经元还是运动神经元）坏死或丧失为特征的其他病况。例如，可以使用本发明的制剂治疗与某些病况相关的外周神经病变，诸如与糖尿病、AIDS或化疗相关的神经病变。所述化合物和组合物还可用于培养基中，以在体外或离体培养神经细胞。

在本发明的各种实施方案中，NGF变体可以向其神经系统已被创伤、手术、中风、缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏、恶性肿瘤或毒性试剂损伤的患者给予，以促进神经元的存活或生长，或向在任何情况下可用NGF、NT-3、BDNF或NT4-5治疗的患者给予。没有限制地，治疗或效果随着NGF变体中存在的一种或多种特定的trk结合功能而变化。例如，本文描述的NGF变体可用于促进由创伤或手术损伤的运动神经元的存活或生长。此外，本文描述的NGF变体可用于治疗运动神经元病症，诸如肌萎缩性侧索硬化症（Lou Gehrig氏病）、贝尔氏麻痹和涉及脊髓性肌萎缩或麻痹的各种病况。本文描述的NGF变体可用于治疗人神经退行性病症，诸如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、癫痫、多发性硬化、亨廷顿氏舞蹈病、唐氏综合征、神经性耳聋和美尼尔氏病。

本文描述的NGF变体可用作认知增强剂，例如用于增强学习（包含在患有痴呆或创伤的患者中）。已被National Institutes of Aging确定为占老年人中痴呆的50％以上的阿尔茨海默氏病，也是65岁以上美国人死亡的第四或第五个主要原因。四百万美国人，40％的85岁以上的美国人（美国人口增长最快的部分）患有阿尔茨海默氏病。所有帕金森氏病患者的25％也患有阿尔茨海默氏病样痴呆。以及在约15％的痴呆患者中，阿尔茨海默氏病和多发梗塞性痴呆并存。在阿尔茨海默氏病和血管性痴呆之后，痴呆的第三个最常见原因是由于直接与酒精中毒有关的器质性脑病的认知损伤，其在大约10％的酗酒者中发生。然而，阿尔茨海默氏病以及血管性痴呆和由于与酒精中毒有关的器质性脑病的认知损伤的最一致的异常，是从基底前脑(BF)到codex和海马两者产生的胆碱能系统变性（Bigl等人，inBrain Cholinergic Systemsr, M.Steriade和D.Biesold, eds., Oxford UniversityPress, Oxford, pp.364-386(1990)）。并且有多种其他神经递质系统受阿尔茨海默氏病的影响(Davies Med. Res. Rev.3:221(1983))。然而，与例如胆碱能神经递质系统的变性相关的认知损伤不限于患有痴呆的个体。在其他健康的老年人和大鼠中也已观察到。将在老年大鼠中学习的损伤程度与皮质脑血流减少的程度进行比较的研究显示出良好的相关性（Berman等人，Neurobiol. Aging 9:691(1988)）。在慢性的酒精中毒中，产生的器质性脑病（如阿尔茨海默氏病和正常衰老）的特征还在于胆碱能神经元出现（基底前脑）及其投射（大脑皮质）的那些脑区域中皮质脑血流的弥散性减少（Lofti等人，Cerebrovasc. and BrainMetab. Rev 1:2(1989)）。可通过给予本文描述的NGF变体来治疗这样的痴呆。

进一步地，本文描述的NGF变体可用于治疗神经病变，并且尤其是外周神经病变。“外周神经病变”是指影响外周神经系统的病症，最常表现为运动神经、感觉神经、感觉运动神经或自主神经功能紊乱中的一种或组合。外周神经病变所表现出的各种各样的形态各自可以独特地归因于同样多种原因。例如，外周神经病变可以是遗传获得的，可以由全身疾病引起或者可以由毒性试剂诱导。实例包含但不限于糖尿病性外周神经病变、远端感觉运动神经病变或自主神经病变，诸如胃肠道运动性降低或膀胱的张力缺乏。与全身疾病相关的神经病变的实例包含脊髓灰质炎后综合征或AIDS相关的神经病变；遗传性神经病变的实例包含Charcot-Marie-Tooth病、Refsum氏病、无β脂蛋白血症、Tangier病、Krabbe氏病、异染性脑白质营养不良、Fabry氏病和Dejerine-Sottas综合征；以及由毒性试剂引起的神经病变的实例包含用化疗剂（诸如长春新碱、顺铂、甲氨蝶呤或3'-叠氮基-3'-脱氧胸苷）治疗引起的那些神经病变。

因此，提供了一种治疗哺乳动物中神经病症的方法，包含向哺乳动物给予本文描述的NGF变体。优选地，所述神经病症是外周神经病变，更优选地是糖尿病性外周神经病变、化疗引起的外周神经病变或HIV相关的神经病变。优选地，外周神经病变影响运动神经元。

本文使用的术语“神经生长因子”或“NGF”是指一组主要涉及某些目标神经元(尤其是传递疼痛、温度和触觉的感觉的那些（感觉神经元）)的生长、维持、增殖和存活的调控的神经营养因子和神经肽。除非另有说明，本文描述的术语“NGF”包含来自本文描述的任何物种的野生型和任何突变的、取代的和/或修饰的NGF β链(NGFβ)，包含表1中例示的那些。它可能是原型生长因子，因为它是最先被描述的之一。自1956年被诺贝尔奖获得者RitaLevi-Montalcini和Stanley Cohen首次分离以来，已经确定了许多涉及NGF的生物学过程，其中两个是胰腺β细胞的存活和免疫系统的调控。在表达时NGF最初是在3种蛋白质（α-NGF、β-NGF和γ-NGF（2:1:2比例））的7S、130-kDa复合物中。这种形式的NGF也称为proNGF（NGF前体）。该复合物的γ亚基担当丝氨酸蛋白酶，并切割β亚基的N-末端，从而将蛋白质激活成功能性NGF。人NGF的β亚基包含241个氨基酸，约26959Da (Gene Bank ID: NP_002497.2)，由如Gene Bank ID: NM_002506.2中阐述的核酸序列编码。它的结构域结构在UniProt IDno. P01138中也是众所周知的。具体地，对于如SEQ ID NO: 5所示的人NGF序列，从位置1到位置18的氨基酸残基代表信号肽，后面是从位置19到位置121的前肽区域和范围从位置122到位置241的NGF成熟多肽(SEQ ID NO: 6)。已知的氨基酸修饰包含在SEQ ID NO: 5的位置69和114的N-连接糖基化位点和位置136和201、179和229以及189和231之间的二硫键。其他生物体中的NGFβ同源物也是本领域众所周知的，包含黑猩猩NGFβ（NM_001012437.1和NP_001012439.1）、恒河猴NGFβ（XM_015148902.1和XP_015004388.1以及XM_015148898.1和XP_015004384.1）、狗NGFβ（NM_001194950.1和NP_001181879.1）、牛NGFβ（NM_001099362.1和NP_001092832.1）、小鼠NGFβ（NM_001112698.2和NP_001106168.1以及NM_013609.3和NP_038637.1）、大鼠NGFβ（NM_001277055.1和NP_001263984.1）、鸡NGFβ（NM_001293108.1和NP_001280037.1以及NM_001293109.1和NP_001280038.1）以及热带爪蟾NGFβ（NM_001129924.1和NP_001123396.1）。对于小鼠NGFβ，NM_013609.3是指较长的转录变体1并编码较长的同种型A (NP_038637.1)，而NM_001112698.2是指变体2，其与变体1相比包含不同的5' UTR并且缺少5'编码区的框内部分。得到的同种型B (NP_001106168.1)与同种型A相比具有更短的N-末端。NGF至少与原肌球蛋白受体激酶A (TrkA)和低亲和力NGF受体(LNGFR/p75NTR)结合。本文描述的NGF部分可包含全长NGF的任何片段。在一些实施方案中，NGF部分至少包含NGF用来与TrkA或LNGFR相互作用的结构域。例如，NGF部分可包含SEQ ID NO: 5的从位置122到位置241的氨基酸残基。本文描述的NGF部分可包含包含取代、突变、修饰和/或缺失的NGF序列。一些示例性的NGF序列列于表1中。例如，如美国专利号6,333,310和7,452,863中描述的NGF序列也包含在本发明的范围内。

本文描述的NGF变体多肽包含NGF部分，所述NGF部分包含全长NGF多肽（NGF前体多肽或成熟NGF多肽）或其生物学活性片段。术语“生物学活性片段”是指任何物种的野生型NGF多肽的一部分，其包含任何可能的取代、突变、缺失、插入、融合和/或其他修饰方法，同时维持野生型NGF多肽的至少一种生物学功能。术语NGF的“生物学功能”通常是指其促进神经元和轴突的生长、维持和存活的能力，包含促进髓鞘修复和其他相关功能。具体地，术语NGF的“生物学功能”还可以指其通过其与TrkA和/或p75NTR结合来进行的信号传导功能。这些一般性和特定的功能的多种测试在本领域中是已知的。

NGF具有多个可在修饰时影响NGF特异性的结构域。NGF的N-末端氨基酸是NGF中负责trkA结合的主要区域。用纯化的人和小鼠NGF同源二聚体（其代表在氨基和羧基末端进行修饰的同源截断形式）观察到生物学活性和受体结合的显著损失。包含109个氨基酸的截断的成熟NGF种类(10-118)hNGF（由于纯化的重组人成熟NGF的N末端的前9个残基和从C末端的最后两个残基的丢失而产生）与(1-118)hNGF相比，从人trkA受体中置换小鼠¹²⁵I-NGF的效率是1/300。与(1-118)hNGF相比，其在背根神经节和交感神经节的存活中的活性是1/50到1/100。10-氨基酸-N-末端区域的修饰可导致TrkA结合的降低或消除。例如，美国专利号6,333,310描述了NGF的7-末端氨基酸(SSSHPIF)的缺失或被NT-3的N-末端氨基酸(YAEHKS)取代，其导致NGF变体具有降低或缺失的trkA结合活性。此外，PCT公开号WO 95/33829公开了缺乏NGF活性的NGF变体。在本公开中，NGF变体多肽的NGF部分可包含具有完整的、增加的或降低的对Trk A和/或p75NTR的结合能力的NGF多肽。在一些实施方案中，NGF多肽具有至少与野生型NGF相同的对Trk A和/或p75NTR的结合亲和力。在一些实施方案中，相对于野生型NGF，NGF多肽具有对Trk A和/或p75NTR更高的结合亲和力。在一些其他实施方案中，相对于野生型NGF，NGF多肽具有对Trk A和/或p75NTR更弱的结合亲和力。在一些实施方案中，募集trkB的修饰可以与减少trkA的修饰组合以产生结合trkC和trkB两者但不结合trkA的变体。

除NGF部分外，本文描述的NGF变体多肽还包含另外的多肽。在一些实施方案中，该另外的多肽增加了NGF部分在体内的稳定性（例如半衰期）。这种另外的多肽可以是具有这种功能的任何多肽。例如，这种另外的多肽可以是免疫球蛋白或其生物学活性片段。在一些实施方案中，这种另外的多肽包含任何类型的IgG的Fc（可结晶片段）区域。在一些实施方案中，这种另外的多肽包含人绒毛膜促性腺激素(hCG)或其生物学活性片段。在一些优选的实施方案中，这种另外的多肽至少包含hCG的羧基末端部分(CTP)。

本文使用的术语“人绒毛膜促性腺激素”或“hCG”是指着床后由胎盘产生的一组激素。hCG的存在在一些妊娠试验（hCG妊娠条试验）中被检测。一些癌性肿瘤产生这种激素；因此，当患者未怀孕时测量到的升高水平可导致癌症诊断，并且如果足够高则可导致副肿瘤综合征的诊断。然而，仍不清楚这种产生是癌发生的促成原因还是其效果。被称为促黄体激素(LH)的hCG的垂体类似物，在所有年龄的男性和女性的垂体腺中产生。就hCG的内源形式而言，有多种方法将它们进行分类和测量，包含总hCG、C-末端肽总hCG、完整hCG、游离β-亚基hCG、β-核心片段hCG、高糖基化hCG、有缺口的hCG、α hCG和垂体hCG。就来自动物或合成来源的hCG的药物制剂而言，有许多促性腺激素制剂，其中的一些在医学上是合理的，而其中的另一些具有欺骗性质。自2011年12月6日起，United States Food and DrugAdministration已禁止销售“顺势疗法”和非处方hCG饮食产品，并宣布它们是欺诈性的和非法的。人绒毛膜促性腺激素是包含具有25.7 kDa的分子量的237个氨基酸的糖蛋白。它是异源二聚体，具有与促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)的α亚基相同的α亚基和hCG特有的β亚基。α亚基有92个氨基酸长。hCG促性腺激素同种型的β-亚基(β-hCG)包含145个氨基酸，由六个高度同源的基因密码，这些基因在染色体19q13.3上以串联的形式排列并反向配对。这两个亚基创造一个小的疏水核心，该疏水核心被高表面积与体积比（球体的表面积与体积比的2.8倍）包围。绝大多数外部氨基酸是亲水的。hCG的3D结构被Wu等人(1994) Structure 2:545-558教导。hCG的β亚基的一些示例性的氨基酸序列作为SEQ ID No: 10-12列于表1中。对于hCG的α链和β链两者序列的报道，参见Bahl等人(1972)Biochem. Biophys. Res. Commun. 48:416-422。人绒毛膜促性腺激素与卵巢的LHCG受体相互作用，并在妊娠开始期间促进黄体的维持。这使黄体能够在第一个三个月期间分泌激素黄体酮。黄体酮以血管和毛细血管的厚内衬丰富子宫，以使其可以维持生长的胎儿。hCG的检测可以通过任何方法进行，诸如使用单克隆抗体，其例如特异地与hCG的β亚基结合，能够区分hCG与LH和FSH。这样的抗体在本领域是众所周知的，其包含来自OriGene(Rockville, MD)的那些抗体（例如TA313616）。

hCG的羧基末端部分(CTP)可以与治疗性蛋白质融合，以延长半衰期（Fares等人(2010) Endocrinology 151:4410-4417）。CTP是指来源于人绒毛膜促性腺激素(HCG)的糖基化的氨基酸序列（28-mer, SEQ ID NO: 13）。CTP的高生物相容性、低免疫原性以及其显著地延长治疗性蛋白质半衰期的能力已被充分研究。例如，Furuhashi等人(1995 MolEndocrinol. 9:54-63)教导了hCG β亚基包含带有四个丝氨酸连接的寡糖的羧基末端延伸（即羧基末端肽(CTP)），这对于维持与其他糖蛋白激素相比其更长的半衰期是重要的。实际上，O-糖基化全部的信号主要包含在CTP序列中，并且不依赖于受体蛋白的侧翼区域。由ELONVA®代表，由Merck开发并由European Commission于2010年批准的CTP融合促卵泡激素(FSH)在临床上用于在女性不孕症治疗中帮助实现妊娠。ELONVA®被这样设计：对患者单次注射可以代替一整周的每日FSH注射。本文描述的hCG多肽和/或CTP部分可包含任何包含取代、突变、修饰和/或缺失的hCG/CTP变体。表1（下划线）中列出了一些示例性的变体。例如，如美国专利号6,225,449中描述的CTP变体也包含在本发明的范围内。

除了本文描述的两个部分之外，本文描述的NGF变体多肽可进一步地包含第三个部分。这种第三个部分可包含能够提高NGF部分的功能和/或稳定性的融合结构域。这种融合结构域的众所周知的实例包含但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、麦芽糖结合蛋白(MBP)或人血清白蛋白。可以选择融合结构域以便赋予所需的性质。例如，一些融合结构域特别用于通过亲和色谱进行融合蛋白的分离。出于亲和纯化的目的，使用用于亲和色谱的相关基质，诸如谷胱甘肽-、淀粉酶-和镍-或钴-缀合的树脂。许多这样的基质可以“试剂盒”形式获得，诸如Pharmacia GST纯化系统和对(HIS₆)融合配偶体有效的QIAexpress^TM系统（Qiagen）。作为另一个实例，可以选择融合结构域以便促进ALK1 ECD多肽的检测。这样的检测结构域的实例包含多种荧光蛋白（例如GFP）以及“表位标签”，其通常是特异性抗体对其有效的短肽序列。特异性单克隆抗体易于对其有效的众所周知的表位标签包含FLAG、流感病毒血细胞凝集素(HA)和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有蛋白酶切割位点（诸如对于Xa因子或凝血酶），其允许相关蛋白酶对融合蛋白进行部分消化，并从而从其中释放重组蛋白。然后可以通过随后的色谱分离从融合结构域中分离所述被释放的蛋白质。在某些优选的实施方案中，NGF变体多肽与在体内使NGF多肽稳定的结构域（“稳定剂”结构域）融合。所述“稳定”是指增加血清半衰期的任何方面，无论这是因为破坏减少，被肾脏清除减少，还是其他药物代谢动力学效应。已知与免疫球蛋白的Fc部分融合可在广泛的蛋白质中赋予所需的药物代谢动力学特性。同样地，与人血清白蛋白的融合可以赋予所需的性质。可以选择的其他类型的融合结构域包含多聚（例如二聚、四聚）结构域和功能性结构域。此外，可以添加定位序列以帮助NGF变体定位于特定的细胞、组织或器官。例如，本领域已知多种序列将蛋白质定位于神经系统或其他组织。通过这样的序列，可以将重组NGF变体特异性地传递至定向的细胞、组织或器官，以获得更好的功能和更小的潜在副作用。

本文描述的NGF变体的不同部分可以作为融合蛋白融合在一起（使用或不使用接头）。这种接头可以是天然接头或化学接头中的任何一种。例如，Priyanka等人(2013)Protein Sci. 22:153-167教导的多Gly接头和富Gly接头。

遗传密码的一个重要且众所周知的特征是其冗余性，借此对于用于组成蛋白质的大多数氨基酸，可以使用多于一种编码核苷酸三联体。因此，多种不同的核苷酸序列可以编码给定的氨基酸序列。这样的核苷酸序列被认为是在功能上等同的，因为它们导致在所有生物体中产生相同的氨基酸序列（尽管某些生物体翻译一些序列可比它们翻译其他序列更有效）。此外，偶尔可以在给定的核苷酸序列中发现嘌呤或嘧啶的甲基化变体。这样的甲基化不影响三核苷酸密码子和相应氨基酸之间的编码关系。

鉴于上述情况，编码本发明的融合蛋白或多肽（或其任何部分）的DNA或RNA的核苷酸序列可以使用遗传密码翻译DNA或RNA成为氨基酸序列，用于得到所述融合蛋白或多肽的氨基酸序列。同样地，对于融合蛋白或多肽的氨基酸序列，可以从遗传密码推导可编码所述融合蛋白或多肽的相应核苷酸序列（由于遗传密码的冗余性，这将为任何给定的氨基酸序列产生多个核酸序列）。因此，本文对编码融合蛋白或多肽的核苷酸序列的描述和/或公开应当被认为还包含由该核苷酸序列编码的氨基酸序列的描述和/或公开。类似地，本文中融合蛋白或多肽的氨基酸序列的描述和/或公开应当被认为还包含可编码该氨基酸序列的所有可能核苷酸序列的描述和/或公开。

最后，本发明的基因座和生物标志物（例如表2和实施例中列出的生物标志物）的核酸和氨基酸序列信息是本领域众所周知的，并且可容易地在可公开获得的数据库上获得，诸如National Center for Biotechnology Information (NCBI)。例如，下面提供了来源于可公开获得的序列数据库的示例性的核酸和氨基酸序列。

表1：示例性的NGFβ核酸和氨基酸序列

SEQ ID NO: 1 人NGF-CTP DNA序列

atgtccatgttgttctacactctgatcacagcttttctgatcggcatacaggcggaaccacactcagagagcaatgtccctgcaggacacaccatcccccaagcccactggactaaacttcagcattcccttgacactgcccttcgcagagcccgcagcgccccggcagcggcgatagctgcacgcgtggcggggcagacccgcaacattactgtggaccccaggctgtttaaaaagcggcgactccgttcaccccgtgtgctgtttagcacccagcctccccgtgaagctgcagacactcaggatctggacttcgaggtcggtggtgctgcccccttcaacaggactcacaggagcaagcggtcatcatcccatcccatcttccacaggggcgaattctcggtgtgtgacagtgtcagcgtgtgggttggggataagaccaccgccacagacatcaagggcaaggaggtgatggtgttgggagaggtgaacattaacaacagtgtattcaaacagtacttttttgagaccaagtgccgggacccaaatcccgttgacagcgggtgccggggcattgactcaaagcactggaactcatattgtaccacgactcacacctttgtcaaggcgctgaccatggatggcaagcaggctgcctggcggtttatccggatagatacggcctgtgtgtgtgtgctcagcaggaaggctgtgagaagagcctctagctcttccaaggctccacccccctcactcccatctcctagtaggctccccggaccatccgacacgcctattctgccccagtag

SEQ ID NO: 2 人NGF-CTP氨基酸序列（有下划线的序列代表来自hCG的CTP部分）

MSMLFYTLITAFLIGIQAEPHSESNVPAGHTIPQAHWTKLQHSLDTALRRARSAPAAAIAARVAGQTRNITVDPRLFKKRRLRSPRVLFSTQPPREAADTQDLDFEVGGAAPFNRTHRSKRSSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

SEQ ID NO: 3 成熟NGF-CTP氨基酸序列（有下划线的部分代表CTP部分）

SSSHPIFHRGEFSVCDSVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSGCRGIDSKHWNSYCTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTACVCVLSRKAVRRASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ

SEQ ID NO: 4 人NGFβ cDNA序列（NM_002506.2，CDS从位置170到895）

1 agagagcgct gggagccgga ggggagcgca gcgagttttg gccagtggtc gtgcagtcca

61 aggggctgga tggcatgctg gacccaagct cagctcagcg tccggaccca ataacagttt

121 taccaaggga gcagctttct atcctggcca cactgaggtg catagcgtaa tgtccatgtt

181 gttctacact ctgatcacag cttttctgat cggcatacag gcggaaccac actcagagag

241 caatgtccct gcaggacaca ccatccccca agcccactgg actaaacttc agcattccct

301 tgacactgcc cttcgcagag cccgcagcgc cccggcagcg gcgatagctg cacgcgtggc

361 ggggcagacc cgcaacatta ctgtggaccc caggctgttt aaaaagcggc gactccgttc

421 accccgtgtg ctgtttagca cccagcctcc ccgtgaagct gcagacactc aggatctgga

481 cttcgaggtc ggtggtgctg cccccttcaa caggactcac aggagcaagc ggtcatcatc

541 ccatcccatc ttccacaggg gcgaattctc ggtgtgtgac agtgtcagcg tgtgggttgg

601 ggataagacc accgccacag acatcaaggg caaggaggtg atggtgttgg gagaggtgaa

661 cattaacaac agtgtattca aacagtactt ttttgagacc aagtgccggg acccaaatcc

721 cgttgacagc gggtgccggg gcattgactc aaagcactgg aactcatatt gtaccacgac

781 tcacaccttt gtcaaggcgc tgaccatgga tggcaagcag gctgcctggc ggtttatccg

841 gatagatacg gcctgtgtgt gtgtgctcag caggaaggct gtgagaagag cctgacctgc

901 cgacacgctc cctccccctg ccccttctac actctcctgg gcccctccct acctcaacct

961 gtaaattatt ttaaattata aggactgcat ggtaatttat agtttataca gttttaaaga

1021 atcattattt attaaatttt tggaagcata aa

SEQ ID NO: 5 人NGFβ氨基酸序列（NP_002497.2）

1 msmlfytlit afligiqaep hsesnvpagh tipqahwtkl qhsldtalrr arsapaaaia

61 arvagqtrni tvdprlfkkr rlrsprvlfs tqppreaadt qdldfevgga apfnrthrsk

121 rssshpifhr gefsvcdsvs vwvgdkttat dikgkevmvl gevninnsvf kqyffetkcr

181 dpnpvdsgcr gidskhwnsy cttthtfvka ltmdgkqaaw rfiridtacv cvlsrkavrr

241 a

SEQ ID NO: 6 小鼠NGFβ cDNA序列变体1（NM_013609.3，CDS从位置108到1031）

1 cagcacggca gagagcgcct ggagccggag gggagcgcat cgagtgactt tggagctggc

61 cttatatttg gatctcccgg gcagcttttt ggaaactcct agtgaacatg ctgtgcctca

121 agccagtgaa attaggctcc ctggaggtgg gacacgggca gcatggtgga gttttggcct

181 gtggtcgtgc agtccagggg gctggatggc atgctggacc caagctcacc tcagtgtctg

241 ggcccaataa aggttttgcc aaggacgcag ctttctatac tggccgcagt gaggtgcata

301 gcgtaatgtc catgttgttc tacactctga tcactgcgtt tttgatcggc gtacaggcag

361 aaccgtacac agatagcaat gtcccagaag gagactctgt ccctgaagcc cactggacta

421 aacttcagca ttcccttgac acagccctcc gcagagcccg cagtgcccct actgcaccaa

481 tagctgcccg agtgacaggg cagacccgca acatcactgt agaccccaga ctgtttaaga

541 aacggagact ccactcaccc cgtgtgctgt tcagcaccca gcctccaccc acctcttcag

601 acactctgga tctagacttc caggcccatg gtacaatccc tttcaacagg actcaccgga

661 gcaagcgctc atccacccac ccagtcttcc acatggggga gttctcagtg tgtgacagtg

721 tcagtgtgtg ggttggagat aagaccacag ccacagacat caagggcaag gaggtgacag

781 tgctggccga ggtgaacatt aacaacagtg tattcagaca gtactttttt gagaccaagt

841 gccgagcctc caatcctgtt gagagtgggt gccggggcat cgactccaaa cactggaact

901 catactgcac cacgactcac accttcgtca aggcgttgac aacagatgag aagcaggctg

961 cctggaggtt catccggata gacacagcct gtgtgtgtgt gctcagcagg aaggctacaa

1021 gaagaggctg acttgcctgc agcccccttc cccacctgcc ccctccacac tctcctgggc

1081 ccctccctac ctcagcctgt aaattatttt aaattataag gactgcatga taatttatcg

1141 tttatacaat tttaaagaca ttatttatta aattttcaaa gcatcctgta taccga

SEQ ID NO: 7 小鼠NGFβ氨基酸序列同种型A (NP_038637.1)

1 mlclkpvklg slevghgqhg gvlacgravq gagwhagpkl tsvsgpnkgf akdaafytgr

61 sevhsvmsml fytlitafli gvqaepytds nvpegdsvpe ahwtklqhsl dtalrrarsa

121 ptapiaarvt gqtrnitvdp rlfkkrrlhs prvlfstqpp ptssdtldld fqahgtipfn

181 rthrskrsst hpvfhmgefs vcdsvsvwvg dkttatdikg kevtvlaevn innsvfrqyf

241 fetkcrasnp vesgcrgids khwnsycttt htfvkalttd ekqaawrfir idtacvcvls

301 rkatrrg

SEQ ID NO: 8 小鼠NGFβ cDNA序列变体2（NM_001112698.2，CDS从位置179到904）

1 cagcacggca gagagcgcct ggagccggag gggagcgcat cgagttttgg cctgtggtcg

61 tgcagtccag ggggctggat ggcatgctgg acccaagctc acctcagtgt ctgggcccaa

121 taaaggtttt gccaaggacg cagctttcta tactggccgc agtgaggtgc atagcgtaat

181 gtccatgttg ttctacactc tgatcactgc gtttttgatc ggcgtacagg cagaaccgta

241 cacagatagc aatgtcccag aaggagactc tgtccctgaa gcccactgga ctaaacttca

301 gcattccctt gacacagccc tccgcagagc ccgcagtgcc cctactgcac caatagctgc

361 ccgagtgaca gggcagaccc gcaacatcac tgtagacccc agactgttta agaaacggag

421 actccactca ccccgtgtgc tgttcagcac ccagcctcca cccacctctt cagacactct

481 ggatctagac ttccaggccc atggtacaat ccctttcaac aggactcacc ggagcaagcg

541 ctcatccacc cacccagtct tccacatggg ggagttctca gtgtgtgaca gtgtcagtgt

601 gtgggttgga gataagacca cagccacaga catcaagggc aaggaggtga cagtgctggc

661 cgaggtgaac attaacaaca gtgtattcag acagtacttt tttgagacca agtgccgagc

721 ctccaatcct gttgagagtg ggtgccgggg catcgactcc aaacactgga actcatactg

781 caccacgact cacaccttcg tcaaggcgtt gacaacagat gagaagcagg ctgcctggag

841 gttcatccgg atagacacag cctgtgtgtg tgtgctcagc aggaaggcta caagaagagg

901 ctgacttgcc tgcagccccc ttccccacct gccccctcca cactctcctg ggcccctccc

961 tacctcagcc tgtaaattat tttaaattat aaggactgca tgataattta tcgtttatac

1021 aattttaaag acattattta ttaaattttc aaagcatcct gtataccga

SEQ ID NO: 9 小鼠NGFβ氨基酸序列同种型B (NP_001106168.1)

1 msmlfytlit afligvqaep ytdsnvpegd svpeahwtkl qhsldtalrr arsaptapia

61 arvtgqtrni tvdprlfkkr rlhsprvlfs tqppptssdt ldldfqahgt ipfnrthrsk

121 rssthpvfhm gefsvcdsvs vwvgdkttat dikgkevtvl aevninnsvf rqyffetkcr

181 asnpvesgcr gidskhwnsy cttthtfvka lttdekqaaw rfiridtacv cvlsrkatrr

241 g

SEQ ID NO: 10 人hCG氨基酸序列同种型2 (NP_001305994)

1 mggtwaskep lrprcrpina tlavekegcp vcitvnttic agycptmtrv lqgvlpalpq

61 vvcnyrdvrf esirlpgcpr gvnpvvsyav alscqcalcr rsttdcggpk dhpltcddpr

121 fqasssskap ppslpspsrl pgpsdtpilp q

SEQ ID NO: 11 人hCG氨基酸序列同种型1 (NP_203696)

1 mskgllllll lsmggtwask eplrprcrpi natlavekeg cpvcitvntt icagycptmt

61 rvlqgvlpal pqvvcnyrdv rfesirlpgc prgvnpvvsy avalscqcal crrsttdcgg

121 pkdhpltcdd prfqassssk apppslpsps rlpgpsdtpi lpq

SEQ ID NO: 12 人hCG氨基酸序列同种型3 (NP_000728)

1 memfqgllll lllsmggtwa skeplrprcr pinatlavek egcpvcitvn tticagycpt

61 mtrvlqgvlp alpqvvcnyr dvrfesirlp gcprgvnpvv syavalscqc alcrrsttdc

121 ggpkdhpltc ddprfqdsss skapppslps psrlpgpsdt pilpq

SEQ ID NO: 13 人hCG氨基酸序列的CTP

1 sssskapppsl pspsrlpgp sdtpilpq

表1中包含了核酸分子，其包含在其全长上与表1中列出的SEQ ID NO: 1、4、6和/或8的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多同一性的核酸序列。这样的核酸分子可编码具有本文描述的NGF功能的多肽。

表1中包含了多肽分子，其包含在其全长上与表1中列出的SEQ ID NO: 2、3、5、7和/或9的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更多同一性的氨基酸序列。这样的多肽优选具有本文描述的NGF功能。

本文描述的治疗组合物可以通过任何合适的途径单独或与治疗上可接受的载体组合向受试者给予。这种给予可以是全身性的（例如IV）或局部的（例如向神经或向脑脊液）。优选的给药途径是胃肠道外的（例如静脉内或注射）。没有限制地，本文描述的NGF变体的给予可以多种方式进行，例如对于特定适应症已知的那些途径，包含但不限于皮下、静脉内、脑内、鼻内、经皮、腹膜内、肌肉内、肺内、阴道、直肠、动脉内、病灶内、鞘内、脑室内或眼内。NGF变体可以使用任何可获得的技术（诸如泵或植入），通过输注到CNS的贮液库中连续给予，尽管推注是可接受的。在一些情况下，例如在伤口的治疗中，NGF变体可以作为溶液或喷雾剂直接应用。可以使用持续释放系统。通常在病症允许的情况下，应该配制和给予NGF变体用于位点特异性传递。给予可以是连续的或定期的。可以通过恒定流或可编程流的可植入泵或通过定期的注射来完成给予。

本文使用的“预防”病症或病况的治疗剂是指在统计样本中相对于未治疗的对照样本减少治疗样本中病症或病况的发生，或相对于未治疗的对照样本延迟病症或病况的一种或多种症状的发作或降低病症或病况的一种或多种症状的严重程度的化合物。

术语“治疗”包含预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域公认的，并包含向宿主进行一种或多种主题组合物的给药。如果其在临床表现出不想要的病况（例如宿主动物的疾病或其他不想要的状态）之前给药，那么该治疗是预防性的（即它保护宿主免于不想要的病况的发展），而如果其在表现出不想要的病况之后给药，那么该治疗是治疗性的（即其旨在减少、改善或稳定现有的不想要的病况或其副作用）。

术语“治疗效果”是指由药理学活性物质引起的动物（特别是哺乳动物，和更特别是人）的局部或全身作用。因此，该术语是指旨在用于在动物或人中诊断、治愈、缓解、治疗或预防疾病或增强所需的身体或心理发育和条件的任何物质。短语“治疗有效量”是指这样的物质的量，其在可适用于任何治疗的合理的效益/风险比下产生一些所需的局部或全身作用。在某些实施方案中，化合物的治疗有效量将取决于其治疗指数、溶解度等。例如，通过本发明的方法发现的某些化合物可以以足够的量给药以产生可适用于这种治疗的合理的效益/风险比。

在一些实施方案中，进一步提供了载体和/或宿主细胞。本发明的一个方面涉及载体（优选表达载体）的使用，其包含编码在表2中列出的生物标志物的核酸，或其部分或直向同源物。本文使用的术语“载体”是指能够转运已与其连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以将另外的DNA片段连接到其中的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体）。其他载体（例如非游离型哺乳动物载体）在引入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，并从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“表达载体”。通常，在重组DNA技术中有效的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包含这样的其他形式的具有相同功能的表达载体，诸如病毒载体（例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒）。在一个实施方案中，使用包含生物标志物核酸分子的腺病毒载体。

本发明的重组表达载体包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包含一个或多个调控序列（基于将要用于表达的宿主细胞选择），其可操作地与将要表达的核酸序列连接。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达（例如，在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中）的方式与一个或多个调控序列连接。术语“调控序列”旨在包含启动子、增强子和其他表达控制元件（例如多腺苷酸化信号）。这样的调控序列例如，在Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA(1990)中被描述。调控序列包含在多种类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成型表达的那些和仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的那些（例如组织特异性调控序列）。本领域技术人员将理解，表达载体的设计可取决于诸如将要转化的宿主细胞的选择、所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞中，以从而产生如本文描述的核酸编码的蛋白质或肽（包含融合蛋白或融合肽）。

可以设计本发明的重组表达载体，用于在原核或真核细胞中表达所需的多肽。例如NGF变体多肽可以在细菌细胞诸如大肠杆菌、昆虫细胞（使用杆状病毒表达载体）、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中进一步讨论。或者，重组表达载体可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调控序列和T7聚合酶。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包含pTrc（Amann等人，(1988) Gene 69:301-315）和pET l1d（Studier等人，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89）。合适的酵母表达载体的实例包含pYepSec1（Baldari等人，(1987) EMBO J. 6:229-234）、pMFa（Kurjan和Herskowitz，(1982) Cell 30:933-943）、pJRY88（Schultz等人，(1987) Gene 54:113-123）和pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA)。用于昆虫细胞宿主的合适的杆状病毒表达载体的实例包含pAc系列（Smith等人(1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165）和pVL系列（Lucklow和Summers (1989) Virology 170:31-39）。合适的哺乳动物表达载体的实例包含pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840)和pMT2PC（Kaufman等人 (1987)EMBO J. 6:187-195）。

在另一个实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导在特定细胞类型中核酸的优先表达（例如将组织特异性调控元件用于表达核酸）。组织特异性调控元件是本领域已知的。用于促进脊椎动物神经系统和神经组织中的基因表达的合适的组织特异性启动子和/或调控序列的非限制性实例是本领域众所周知的（参见，例如Timmusk等人(1993) Neuron10(3):475-489; Kaneko和Sueoka (1993) Proc Natl Acad Sci U S A. 90(10): 4698–4702; Twyman和Jones (1995) J. Neurogenetics 10:67-101）。

本发明进一步提供了重组表达载体，其包含以反义方向克隆到表达载体中的本发明的核酸分子。也就是说，DNA分子以允许表达（通过DNA分子的转录）与本文描述的生物标志物mRNA反义的RNA分子的方式可操作地与调控序列连接。可选择可操作地与以反义方向克隆的核酸连接的调控序列，其指导反义RNA分子在多种细胞类型中的连续表达，例如病毒启动子和/或增强子，或可选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调控序列。反义表达载体可以是重组质粒、噬菌粒或减毒病毒的形式，其中反义核酸在高效调控区的控制下产生，其活性可由载体被引入的细胞类型决定。

本发明的另一方面涉及已引入了本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应理解，这样的术语不仅指特定的主题细胞，还指这种细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在随后的传代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲代细胞不同，但仍包含在本文使用的该术语的范围内。

宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，生物标志物蛋白可以在细菌细胞（诸如大肠杆菌）、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞（诸如Fao肝癌细胞、原代肝细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞）中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。

可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在指用于将外来核酸（例如DNA）引入宿主细胞的多种本领域公认的技术，包含磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人(Molecular Cloning: A LaboratoryManual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)和其他实验室手册中找到。

细胞培养物包含宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养物的合适的培养基是本领域众所周知的。生物标志物多肽或其片段可以经分泌并从含有该多肽的培养基和细胞的混合物中分离。或者，可以将生物标志物多肽或其片段保持在细胞质中，并将细胞收获，裂解，并分离蛋白质或蛋白质复合物。生物标志物多肽或其片段可以从细胞培养基、宿主细胞或两者中，使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术（包含离子交换色谱、凝胶过滤色谱、超滤、电泳和用对生物标志物或其片段的特定表位特异的抗体的免疫亲和纯化）分离。在其他实施方案中，根据本领域已知的标准方法，异源标签可用于纯化目的（例如表位标签和FC融合标签）。

因此，编码生物标志物多肽的全部或选定部分的核苷酸序列可用于通过微生物或真核细胞过程产生重组形式的蛋白质。将序列连接到多核苷酸构建体（诸如表达载体）中，并转化或转染到宿主（真核（酵母、禽、昆虫或哺乳动物）或原核（细菌细胞））中是标准程序。可以采用相似的程序或其改良，根据本发明通过微生物方法或组织培养技术来制备重组生物标志物多肽或其片段。

本发明的宿主细胞（诸如培养物中的原核或真核宿主细胞）可用于产生（即表达）生物标志物蛋白。因此，本发明进一步提供了使用本发明的宿主细胞产生生物标志物蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包含在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞（在其中已引入了编码生物标志物的重组表达载体），直到产生生物标志物蛋白。在另一个实施方案中，该方法进一步包含从培养基或宿主细胞中分离生物标志物蛋白。

II. 受试者

在某些实施方案中，适用于本文公开的组合物和方法的受试者是哺乳动物（例如小鼠、大鼠、灵长类动物、非人哺乳动物、家畜，诸如狗、猫、牛、马等），并且优选是人。在其他实施方案中，受试者是代谢紊乱或不耐受的动物模型。

在本发明的方法的其他实施方案中，受试者未经历对疾病或病症的治疗。在还其他实施方案中，受试者已经历对疾病或病症的治疗。

本发明的方法可用于在受试者（诸如本文描述的那些）中治疗和/或确定对本文描述的组合物(单独或与其他疗法组合以实现重量减轻)的响应性。

III. 药物组合物

本发明提供了本文公开的组合物的药学上可接受的组合物。如下面详细描述的，本发明的药物组合物可以特别配制，用于以固体或液体形式给药，这包含适用于以下的那些：（1）口服给药，例如顿服剂（水性或非水性溶液或悬浮液）、片剂、大丸剂、散剂、颗粒剂、糊剂；（2）胃肠道外给药，例如通过皮下注射、肌肉内注射或静脉内注射，作为例如无菌溶液或悬浮液；（3）局部应用，例如作为乳膏、软膏、滴眼剂或喷雾剂，应用于皮肤或眼部给药；(4)阴道内或直肠内，例如作为子宫托、乳膏或泡沫；或（5）气雾剂，例如作为水性气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒。

短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人和动物的组织接触，没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的效益/风险比相当的那些药剂、材料、组合物和/或剂型。

本文使用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介，诸如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其涉及将主题化学物质从一个器官或身体的部分运送或运输到另一个器官或身体的部分。从与制剂的其他成分相容并且对受试者无害的意义上说，每种载体必须是“可接受的”。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包含：（1）糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；（2）淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；（3）纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；（4）粉状黄芪胶；（5）麦芽；（6）明胶；（7）滑石粉；（8）赋形剂，诸如可可脂和栓剂蜡；（9）油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；（10）二醇，诸如丙二醇；（11）多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；（12）酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；（13）琼脂；（14）缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；（15）海藻酸；（16）无热原水；（17）等渗盐水；（18）Ringer氏溶液；（19）乙醇；（20）磷酸盐缓冲溶液；和（21）药物制剂中使用的其他无毒相容物质。

药物组合物（制剂）可以通过多种给药途径的任何一种对受试者进行给药，包含例如口服（例如，如作为在水性或非水性溶液或悬浮液中的顿服剂、片剂、胶囊（包含散置胶囊和明胶胶囊）、大丸剂、散剂、颗粒剂、应用于舌的糊剂）；通过口腔粘膜（例如舌下）吸收；肛门、直肠或阴道（例如作为子宫托、乳膏或泡沫）；胃肠道外（包含肌肉内、静脉内、皮下或鞘内，作为例如无菌溶液或悬浮液）；鼻；腹膜内；皮下；经皮（例如作为应用在皮肤的贴剂）；和局部（例如作为应用在皮肤的乳膏、软膏或喷雾剂，或作为滴眼剂）。该化合物也可配制用于吸入。在某些实施方案中，化合物可以简单地溶解或悬浮在无菌水中。适当的给药途径和适合于它的组合物的细节可以在例如美国专利号6,110,973、5,763,493、5,731,000、5,541,231、5,427,798、5,358,970和4,172,896，以及其中引用的专利中找到。

制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主、特定的给药方式而变化。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。通常，从百分之百里面，该量为从约1％至约99％的活性成分的范围，优选从约5％至约70％，最优选从约10％至约30％。

制备这些制剂或组合物的方法包含使得活性化合物（诸如本发明的化合物）与载体和任选一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，通过使得本发明化合物与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后如果需要，使产品成形，来制备制剂。

或者或另外地，可以配制组合物用于经由导管、支架、线或其他腔内装置传递。通过这样的装置传递可能对于传递至膀胱、尿道、输尿管、直肠或肠特别有用。

眼用制剂、眼用软膏、溶液等，也预期包含在本发明的范围内。示例性的眼用制剂描述于美国公开号2005/0080056、2005/0059744、2005/0031697和2005/004074以及美国专利号6,583,124中，其内容通过引用并入本文。如果需要，液体眼用制剂具有与泪液、眼房水或玻璃体液的性质相似的性质或与这样的液体相容。眼部给药的优选途径是局部(local)给药（例如局部(topical)给药，诸如滴眼剂，或通过植入物给药）。

本文使用的短语“胃肠道外给药”和“胃肠道外给予”是指除肠内和局部给药以外的给药方式，通常通过注射，并没有限制地包含静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。适于胃肠道外给药的药物组合物包含一种或多种活性化合物与以下的组合：一种或多种药学上可接受的无菌等渗的水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，或可在紧接使用前使其重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌散剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期的接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂、或增稠剂。

可用于本发明的药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包含水、乙醇、多元醇（诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）及其合适的混合物、植物油（诸如橄榄油）和可注射的有机酯（诸如油酸乙酯）。例如，通过使用包衣材料诸如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。

通过在可生物降解的聚合物（诸如聚丙交酯-聚乙交酯）中形成主题药剂的微囊化基质来制备可注射的长效制剂形式。根据药物与聚合物的比例，以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他可生物降解的聚合物的实例包含聚（原酸酯）和聚（酸酐）。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备可注射的长效制剂。

为了用于本发明的方法，可以提供活性化合物本身，或者作为药物组合物提供，所述药物组合物含有例如0.1至99.5％（更优选0.5至90％）的活性成分与药学上可接受的载体的组合。

给药方法还可包含可再填装或可生物降解的装置。近年来，已经在体内开发并测试了多种缓释聚合物装置用于药物(包含蛋白质生物药物)的受控传递。多种生物相容性聚合物（包含水凝胶），其包含可生物降解和不可降解的两种聚合物，可用于形成用于在特定目标位点持续释放化合物的植入物。

药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得对于特定的患者、组合物和给药方式有效实现所需治疗反应的活性成分的量，而不会对患者是有毒的。

在某些实施方案中，本发明的NGF变体可以单独使用或与另一种类型的治疗剂共同给药。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包含：（1）水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；（2）油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基茴香醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；（3）金属螯合试剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、山梨醇、酒石酸、磷酸等。

在某些实施方案中，本发明还提供用于体内产生本文描述的NGF变体的基因疗法。这种疗法通过将编码本文描述的NGF变体的核酸引入具有如上述所列病症的细胞或组织中而实现其治疗效果。使用重组表达载体诸如嵌合病毒或胶体分散体系可以实现本文描述的核酸的传递。定向的脂质体也可用于治疗性传递本文描述的NGF变体。

如本文所教导的可用于基因疗法的多种病毒载体包含腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒，或优选地RNA病毒，诸如逆转录病毒。优选地，该逆转录病毒载体是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。可以插入单个外源基因的逆转录病毒载体的实例包含但不限于：Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)和Rous肉瘤病毒(RSV)。许多其他的逆转录病毒载体可以加入有多个基因。所有这些载体都可以转移或加入有可选择标志物的基因，从而可以鉴定和产生转导的细胞。逆转录病毒载体可以通过附着例如糖、糖脂或蛋白质而制成目标特异性的。优选的定向通过使用抗体完成。本领域技术人员将认识到，可以将特定的多核苷酸序列插入逆转录病毒基因组中或附着于病毒包膜，以允许目标特异性传递含有本文描述的NGF变体的逆转录病毒载体。在优选的实施方案中，载体定向至神经系统或任何细胞、组织或器官，其具有不充足的野生型NGF水平和/或缺陷型NGF突变体。

或者，可以通过常规的磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因gag、pol和env的质粒直接转染培养的细胞。然后可以用含有感兴趣的基因的载体质粒转染这些细胞。得到的细胞将逆转录病毒载体释放到培养基中。

实施例

实施例1：制备长效重组人神经生长因子(rhNGF)

NGF-CTP的克隆

NGF（238个氨基酸）最初是α-NGF、β-NGF和γ-NGF的复合物，并且γ亚基切割β亚基的N-末端，从而将蛋白质激活成功能性NGF（120个氨基酸）。使用具有全长人NGF基因的质粒，使用5'-ATCTC GAGCA CCATG TCCAT GTTGT TCTAC ACTCT GA-3' (SEQ ID NO: 14)作为正向引物(U1)和5'-TGGAG CCTTG GAAGA GCTAG AGGCT CTTCT CACAG CCTT-3' (SEQ ID NO:15)作为反向引物(R1)扩增全长NGF基因(714-bp)。来自人HCG的CTP基因由Sangon Biotech(Shanghai) Co., Ltd.合成，以及设计用于扩增该基因的正向（U2）和反向（R2）引物分别是5'-AAGGC TGTGA GAA GA GCCTC TAGCT CTTCC AAGGC TCCA-3' (SEQ ID NO: 16)和5'-TTTGC GGCCG CTTACT ACTGG GGCAG AATA -3' (SEQ ID NO: 17)。因此扩增NGF序列和CTP序列并用凝胶电泳分析，然后通过凝胶提取以获得PCR产物。使用NGF（1μL）和HCG CTP（1μL）的PCR产物作为模板进行PCR重叠延伸，并且分别用U1和R2作为正向和反向引物。PCR扩增包含初始化步骤（94℃，3分钟）、变性步骤（94℃，30秒）、退火步骤（58℃，30秒）和延伸步骤（72℃，1分钟）进行30个循环，然后进行最终的延伸步骤（72℃，7分钟）。用凝胶电泳分析PCR产物，然后提取。将来自凝胶提取的基因连接到pMC-18T载体上，然后筛选并选择阳性克隆用于进一步的基因测序。保存具有正确序列的克隆用于进一步的构建。基因序列显示在SEQID NO: 1中，以及氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 2中（表1）。

NGF-CTP表达载体的构建

通过用XhoI和NotI（New England Biolabs Ltd.）作为限制酶切割pMC-18T/NGF-CTP质粒来得到NGF-CTP片段。然后将该片段连接到pCI-neo载体上，该载体用XhoI和NotI预处理。在16℃下连接反应过夜后，将产物转化到DH5α感受态细胞中，并在含有氨苄青霉素的LB-琼脂平板上筛选。首先通过PCR验证阳性克隆，并通过基因测序进一步评估。PCI-neo/NGF-CTP质粒的构建如图1所示。

构建用于rhNGF-CTP的哺乳动物细胞表达系统

使用Gene Pulser XcellTM电穿孔系统(Bio-Rad Laboratories, Inc.)在160V下通过电穿孔150ms将PCI-neo/NGF-CTP质粒引入CHO-S细胞(Invitrogen Co.)。将经电穿孔的细胞转移到35mm组织培养皿中并在其上培养，培养皿中有补充有10％胎牛血清(FBS)的DMEM-F12培养基。两天后，将G418 (Sigma-Aldrich Co. LLC.)加入培养基中至终浓度为600μgmL^-1，以增强抗性基因的选择。将G418处理后剩余的单克隆细胞转移到96孔平板中，通过斑点印迹进一步分析蛋白质表达水平。选择具有高表达水平的细胞用于随后的悬浮培养。

悬浮培养后，将具有最高表达水平的细胞转移到组织培养瓶(40mL, CorningInc.)中，以另外选择在无血清条件下具有生产力的细胞。在37℃下用CD CHO培养基(Invitrogen Co.)培养细胞，并评估细胞生长和通过ELISA (R＆D Systems, Inc.)测定的重组蛋白的表达水平。使用另外的亚克隆来确认重组1B2细胞是rhNGF-CTP产生的原型细胞系。在开发主细胞库和工作细胞库用于rhNGF-CTP表达之前，对该细胞系进行了无菌和污染物（例如细菌和支原体）的广泛测试。

rhNGF-CTP的纯化

恢复工作细胞库以在WAVE生物反应器(10L, GE Healthcare)中用无血清培养基产生rhNGF-CTP。在收获之前，将细胞在分批进料模式下在生物反应器中培养12天。收集上清液，用离心过滤器浓缩，并在AKTA纯化器(GE Healthcare)上用蛋白质色谱法纯化。首先将样品施加到Sepharose Fastflow (GE Healthcare)上，用含氯化钠(1 mol L^-1)的缓冲液洗脱。然后使用Phenyl Fastflow (GE Healthcare)和Superdex 75 (GE Healthcare)进行进一步纯化。如SDS-PAGE凝胶电泳（图2）中所示，重组蛋白的纯度超过95％。

rhNGF-CTP及其生物学活性的表征

纯化的rhNGF-CTP的N-末端测序与人NGF的基因序列比对良好，具有相同的前5个氨基酸(SSSHP)，这表明α-NGF的正确切割。rhNGF-CTP的序列（148个氨基酸）显示在SEQ ID No.3中。非糖基化rhNGF-CTP的计算的分子量为16273Da，和通过质谱测量的纯化的rhNGF-CTP的分子量为18605Da。分子量的差异归因于CTP上的糖基化。

然后通过两种细胞测定研究rhNGF-CTP的生物活性。首先，TF-1细胞增殖测定用于评估由NGF诱导的TF-1细胞生长的剂量依赖性刺激，NGF通过与TF-1细胞表面上的高亲和力TrkA受体结合发挥作用。通过受刺激的TF-1细胞的细胞增殖速率（MTT测定）计算NGF的生物活性。rhNGF标准是来自英国National Institute for Biological Standards andControl (NIBSC)的NGF样品，具有1×10⁶ AU mg^-1的比活性。在TF-1细胞增殖测定中rhNGF-CTP和NGF标准的比活性分别为1.2×10⁶ AU mg^-1和1.8×10⁶ AU mg^-1，没有观察到显著的差异。第二种半定量地测量NGF活性的方法是鸡胚背根神经节(DRG)的萌发。来自NationalInstitutes for Food and Drug Control of China的小鼠NGF在此用作标准样品。rhNGF-CTP和NGF标准的比活性分别为≥1.7×10⁵ AU mg^-1和≥5×10⁵ AU mg^-1。观察到rhNGF-CTP的生物活性略有下降。

在大鼠内rhNGF-CTP的药物代谢动力学研究

对Sprague Dawley^®大鼠进行rhNGF-CTP的药物代谢动力学研究。将6只大鼠（体重300~400 g）分成两组，用rhNGF或rhNGF-CTP处理。用戊巴比妥(1％)麻醉大鼠，并通过肌内注射以30μg kg^-1体重给予rhNGF或rhNGF-CTP。在注射后0.5、1、2、4、6、8、12和24小时从尾部收集血样。用ELISA测定血浆NGF浓度，如图3所示。计算出在大鼠中rhNGF的半衰期为3.9小时，然而rhNGF-CTP的半衰期延长至10.0小时，这表明2.5倍增加。

通过引用并入

本文提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文，正如每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地和单独地指出通过引用并入。在冲突的情况下，以本申请（包含本文中的任何定义）为准。

通过引用以其整体并入的还有任何多核苷酸和多肽序列，其参考与公共数据库中的条目相关的登录号，所述数据库诸如万维网上在tigr.org上由The Institute forGenomic Research (TIGR)和/或万维网上在ncbi.nlm.nih.gov上由National Center forBiotechnology Information (NCBI)维护的那些。

等同物

本领域技术人员将认识到，或能够使用不超出常规实验确定，本文描述的本发明的特定的实施方案的许多等同物。这样的等同物被认为由随附的权利要求所包括。

Claims

1.一种多肽，其包含：

ii）包含在人的血流中增加所述NGF多肽序列或其生物学活性片段的半衰期的另外的多肽的第二个部分。

2.权利要求1所述的多肽，其中所述第一个部分包含全长的NGF多肽序列。

3.权利要求1所述的多肽，其中所述第一个部分包含NGF的生物学活性片段。

4.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述第一个部分包含人NGF序列。

5.权利要求4所述的多肽，其中所述人NGF序列与SEQ ID NO: 5具有至少70％同一性。

6.权利要求5所述的多肽，其中所述人NGF序列与SEQ ID NO: 5具有至少80％同一性。

7.权利要求6所述的多肽，其中所述人NGF序列与SEQ ID NO: 5具有至少90％同一性。

8.权利要求7所述的多肽，其中所述人NGF序列与SEQ ID NO: 5具有至少95％同一性。

9.权利要求8所述的多肽，其中所述人NGF序列与SEQ ID NO: 5具有至少99％同一性。

10.权利要求9所述的多肽，其中所述人NGF序列包含SEQ ID NO: 5。

11.权利要求3所述的多肽，其中所述第一个部分能够与NGF的至少一种结合配偶体结合，任选地其中所述NGF的至少一种结合配偶体是原肌球蛋白受体激酶A (TrkA)或低亲和力NGF受体(LNGFR/p75NTR)。

12.权利要求11所述的多肽，其中所述第一个部分包含SEQ ID NO: 5的从位置122到位置241的氨基酸残基。

13.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述第二个部分包含全长的人绒毛膜促性腺激素(HCG)或其生物学活性片段。

14.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述人绒毛膜促性腺激素(HCG)包含选自SEQ ID NO: 10-12的氨基酸序列。

15.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述第二个部分包含HCG的羧基末端部分(CTP)。

16.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述第二个部分包含与SEQ ID NO: 13具有至少70％同一性的氨基酸序列，任选地其中所述第二个部分包含与SEQ ID NO: 13具有至少75％、80％、90％、95％、99％或更高同一性的氨基酸序列。

17.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述第二个部分包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列。

18.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述第二个部分包含至少一个糖基化位点。

19.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述第一个部分和所述第二个部分使用或不使用接头融合在一起。

20.权利要求19所述的多肽，其中所述第一个部分与所述第二个部分的N末端融合。

21.权利要求19所述的多肽，其中所述第一个部分与所述第二个部分的C末端融合。

22.权利要求1至20中任一项所述的多肽，其包含与SEQ ID NO: 2或3具有至少70％同一性，任选地与SEQ ID NO: 2或3具有至少75％、80％、90％、95%、99％或100％同一性的氨基酸序列。

23.前述权利要求的任一项所述的多肽，其中所述多肽的体内半衰期是单独所述NGF多肽序列的体内半衰期的至少2.5倍。

24.前述权利要求的任一项所述的多肽，其进一步包含标记，诸如纯化标记和/或荧光标签。

25.前述权利要求的任一项所述的多肽，其进一步包含第三个部分，所述第三个部分包含在人的血流中增加所述NGF多肽序列或其生物学活性片段的功能和/或稳定性的融合结构域。

26.编码前述权利要求的任一项所述的多肽的多核苷酸。

27.权利要求26所述的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少70％同一性的核酸序列。

28.权利要求26或27所述的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少80％同一性的核酸序列。

29.权利要求26至28中任一项所述的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少90％同一性的核酸序列。

30.权利要求26至29中任一项所述的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少95％同一性的核酸序列。

31.权利要求26至30中任一项所述的多核苷酸，其包含与SEQ ID NO: 1具有至少99％同一性的核酸序列。

32.权利要求26至31中任一项所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO: 1的核酸序列。

33.权利要求26至32中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸能够在严格的条件下杂交至与SEQ ID NO: 1互补的核酸序列，任选地，所述严格的条件包含在50％v/v甲酰胺、5 x SSC、2％w/v封闭试剂、0.1％ N-月桂酰肌氨酸、0.3％ SDS中在65°C杂交过夜，并在5 x SSC中在约65°C洗涤。

34.权利要求26至33中任一项所述的多核苷酸，其进一步包含标记，诸如纯化标记和/或荧光标签。

35.能够表达权利要求1至25中任一项所述的多肽的表达载体和/或包含权利要求26至34中任一项所述的多核苷酸的表达载体。

36.权利要求35所述的表达载体，其中所述表达载体是质粒、粘粒、病毒载体、重组表达载体或定向的脂质体。

37.权利要求36所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体；以及所述病毒载体是腺病毒载体、疱疹病毒载体、牛痘病毒载体、嵌合病毒、胶体分散体系或RNA载体。

38.权利要求37所述的表达载体，其中所述RNA载体是逆转录病毒载体。

39.权利要求38所述的表达载体，其中所述逆转录病毒载体是鼠逆转录病毒或其衍生物。

40.权利要求38所述的表达载体，其中所述逆转录病毒载体是禽逆转录病毒或其衍生物。

41.一种宿主细胞，其包含权利要求35至40中任一项所述的表达载体。

42.一种方法，其包含：

i）在细胞培养基中培养权利要求41所述的宿主细胞；和

ii）表达权利要求1至25中任一项所述的多肽。

43.权利要求42所述的方法，其进一步包括

iii）从所述细胞培养基中纯化权利要求1至25中任一项所述的多肽。

44.一种组合物，其包含权利要求1至25中任一项所述的多肽、权利要求26至34中任一项所述的多核苷酸、权利要求35至40中任一项所述的表达载体或权利要求41所述的宿主细胞。

45.一种药物组合物，其包含权利要求44所述的组合物和药学上可接受的载体。

46.权利要求45所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是胶体分散体系或定向的脂质体。

47.权利要求45或46所述的药物组合物，其中配制所述组合物用于以固体或液体形式给药。

48.权利要求45至47中任一项所述的药物组合物，其中配制所述组合物用于动脉内、脑内、病灶内、肌肉内、鼻内、眼内、腹膜内、肺内、直肠内、鞘内、阴道内、静脉内、脑室内、口服、胃肠道外、皮下或局部给药。

49.权利要求45至48中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物为水性悬浮液或溶液、非水性悬浮液或溶液、无菌溶液、片剂、大丸剂、散剂、颗粒剂、糊剂、乳膏、软膏、滴眼剂、局部喷雾剂、子宫托、泡沫、气雾剂、脂质体制剂或固体颗粒的形式。

50.权利要求45至49中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是连续给药的。

51.一种治疗与神经生长因子(NGF)不充足和/或有缺陷有关的疾病或病症的方法，其包含向对其有需要的受试者给予治疗有效量的权利要求1至25中任一项所述的多肽、权利要求26至34中任一项所述的多核苷酸、权利要求44所述的组合物或权利要求45至50中任一项所述的药物组合物。

52.权利要求51所述的方法，其进一步包含向所述受试者给予另外的药剂和/或疗法以治疗所述疾病或病症。

53.权利要求51或52所述的方法，其中所述疾病或病症是神经元病症。

54.权利要求53所述的方法，其中所述神经元病症是肌萎缩性侧索硬化症(Lou Gehrig氏病)、阿尔茨海默氏病、贝尔氏麻痹、痴呆、唐氏综合征、癫痫、亨廷顿氏舞蹈病、美尼尔氏病、多发性硬化、神经性耳聋、中风、缺氧缺血性脑病、脑瘫、麻痹、帕金森氏病、外周神经病变、视神经病变或脊髓性肌萎缩。

55.权利要求54所述的方法，其中所述神经元病症是外周神经病变；以及所述外周神经病变为多神经病变或单一神经病变。

56.权利要求54所述的方法，其中所述神经元病症是视神经病变；以及所述视神经病变是前眼或后眼退行性疾病、眼表面的慢性过敏性炎性病症、外伤性视神经病变、青光眼、神经营养性角膜病变、单纯疱疹性角膜炎或角膜愈合。

57.权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述神经元病症由中枢神经元、外周神经元、运动神经元或感觉神经元的坏死或丧失，创伤，肾功能紊乱，损伤，手术，缺血，感染，代谢性疾病，营养缺乏，恶性肿瘤，毒性试剂或化疗引起。

58.权利要求51至57中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。

59.一种在对其有需要的受试者中促进神经元的生长和/或增殖的方法，其包括向所述受试者给予有效量的权利要求1至25中任一项所述的多肽、权利要求44所述的组合物或权利要求45至50中任一项所述的药物组合物。

60.权利要求59所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。