KR20100111273A - 신경성장인자 콘쥬게이트 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 의학, 공중 보건학, 면역학, 분자생물학 및 바이러스학 분야에 속하는 것이다. 본 발명은 하나 이상의 NGF 항원에 연결된 바이러스-유사 입자 (VLP)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 특히 만성 통증 치료용 백신의 제조에 유용하다. 특히 본 발명의 조성물은 효율적인 면역반응, 특히 항체 반응을 유도한다.

Description

신경성장인자 콘쥬게이트 및 그 용도{NERVE GROWTH FACTOR CONJUGATES AND USES THEREOF}
본 발명은 의학, 공중 보건학, 면역학, 분자생물학 및 바이러스학 분야에 속하는 것이다. 본 발명은 하나 이상의 NGF 항원에 연결된 바이러스-유사 입자 (Virus-like particle; VLP)를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 특히 만성 통증 치료용 백신의 제조에 유용하다. 특히 본 발명의 조성물은 효율적인 면역반응, 특히 항체 반응을 유도한다.
신경 성장 인자(NGF)는 향신경 인자(neurotrophic factor)로서 NGFβ로도 알려져 있으며, NGF이외에 뇌유도 향신경인자(BDNF), 뉴로트로핀 3 및 뉴로트로핀 4/5으로 구성되는 뉴로트로핀 패밀리의 기초 구성원이다(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006)). 다른 모든 뉴로트로핀과 마찬가지로, NGF는 약 27 kDa의 프로-단백질로 발현된 후, 절단되어 약 14 kDa의 성숙형으로 된다(Edwards et al, J Biol Chem. 263(14): 6810-5(1988); Seidah et al, Biochem J. 314: 951-60 (1996)). 이러한 성숙형은 두 수용체 즉 모든 뉴로트로핀들에 낮은 친화성으로 결합하는 공통 수용체 p75NTR 및 고친화성 트로포미오신 수용체 키나제(trkA) 수용체에 결합하여 그 생물학적 작용을 나타낸다. TrkA는 리간드와 결합시 이합체로 되어 상이한 신호 경로를 활성화시키는 티로신 키나제 수용체이다(Patapontian and Reichardt, Curr Opin Neurobiol. 11(3): 272-80 2001)). NGF-trkA 상호작용에 의해 활성화되는 이들 신호경로는 초기 발달 과정에서 통각수용기시스템의 감각 뉴런의 아폽토시스를 차단하고, 생존 및 신경 성장을 촉진한다(Patel et al., Neuron 25(2): 345-57 (2000)). 출생후 이들 뉴런들은 생존을 위해 NGF에 대한 의존성을 상실하게 되나, NGF는 출생후 기간내에도 계속적으로 통각수용기에 상당한 생물학적 효과를 나타낸다. NGF는 신경전달물질, 수용체 및 전압작동 이온 채널의 발현을 조절함으로써 통각수용기의 반응성을 조절한다. NGF의 또 다른 기능적으로 중요한 작용은 번역후 조절을 통해 통각수용기 반응을 감작하는 것이며 이는 일시적인 수용체 전위 바닐로이드 1(TRPVl) 이온 채널의 반응성을 증강시킨다 (Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006)).
NGF는 성체에서 통각수용기 반응성을 조절하는 역할로 인해, 동물 및 인간에서 통증 인지의 매개에 관여한다. 소량의 NGF를 피하 또는 근육주사시 통증과 압통이 발생하며 이는 수일간 지속된다(Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006)). 인간에서 NGF 농도와 통증 강도간의 관계는 만성 전립선염 (Miller et al, Urology, 2002. 59(4): 603-8 (2002)), 간질성 방광염 (Lowe et al, Br J Urol. 79(4) : 572-7 (1997)) 등과 같은 수많은 통증 상태에서 평가될 수 있었다. 본질적으로, 통증은 두 형태로 구분된다: 침해성 통증(Nociceptive pain) 및 신경병변성 통증(neuropathic pain). 침해성 통증은 예를 들어 부상 또는 외과적 절개 후 염증 반응 중에 조직 손상에 의해 유발되는 통각수용기의 자극에서 생기는 반면, 신경병변성 통증은 예컨대 감각 뉴런에 침범하는 자가면역 또는 감염후 또는 신경압박 또는 트라우머 이후와 같이 신경계 그 자체의 병변에서 기인된다.
염증 반응 동안 NGF는 통증 유발성 염증 매개자로서 역할한다. NGF는 케라티노사이트, 상피세포, 평활근, 및 슈반세포와 같은 말초의 다양한 형태의 수많은 세포들에 의해 그리고 특히 비만세포나 마크로파지에 의해 염증 반응 동안 생성된다. NGF 농도는 동물이나 인간에서 염증 반응 및 만성 통증 상태에서 상당히 높게 상승한다. NGF 차단은 수많은 침해성 쥐 통증 모델에서 통증 민감성을 상당히 감소시키는 것으로 나타났으며, 예를 들면 CFA 피하주사후 열적 및 기계적 통각과민을 감소시키고 (Woolf et al., Br. J. Pharmacol. 121(3):417-24 (1997), 관절염에 수반되는 통증을 억제하며 (Shelton et al., Pain 116(1-2): 8-16 (2005)), 골암의 통증을 감소시켰다(Sevcik et al., Pain 115(1-2): 128-41(2005)). 신경병변성 통증에서 NGF의 역할은 염증성 통증에서보다는 덜 확립되어 있지만, 다수의 연구 그룹에서 항-NGF 처치가 쥐 신경병변 통증 모델에서 성공적인 것으로 나타났다(Ramer et al., Neurosci. Lett. 251(1): 53-6 (1998), Ramer et al., Eur. J. Neurosci. 11(3): 837-46 (1999)).
미국 특허 제 5,147,294호는 통증 치료에의 NGF 길항제- 이들 중 NGF 단클론 항체-의 용도를 청구하고 있다. 이후 만성 통증 치료를 위해 NGF에 대항하는 단클론 항체를 사용하는 것을 청구하는 수많은 발명이 특허출원되었다.
만성 통증은 유럽 및 미국 인구의 약 20 %에서 발병하는 심각한 건강상 문제이다. 만성 통증으로 고통받고 있는 환자 중 불과 30 % 미만의 환자들만이 적절한 통증 경감 치료를 받고 있다 (Pezet and McMahon, Annu. Rev. Neurosci. 29: 507-38 (2006). 더욱이 만성 통증의 치료에 사용되고 있는 기존의 약물은 대부분 마약류나 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)로서 이들은 장기간 복용시 심각한 부작용을 나타낸다.
NGFβ에 대한 능동 면역을 유발하여 통증을 경감시킬 수 있는 새로운 조성물 및 백신을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 신규한 치료적 전략은 NGFβ에 대한 능동 면역에 기초한다. 본 발명은 환자의 면역 체계에 의해 NGF-중화 항체의 생성을 유도하는 조성물을 개시한다. 능동 면역은 NGFβ의 지속적인 중화를 결과하며, 따라서 매일 약을 복용해야하는 필요를 경감시킨다. 우리는 놀랍게도 하나 이상의 NGF 항원을 함유하고 있는 본 발명의 조성물 및 백신이 각각 면역반응, 특히 NGF에 대한 고 항체 역가를 일으키는 항체반응을 유도할 수 있음을 발견하였다. 또한 놀랍게도 하나 이상의 NGF 항원을 함유하는 본 발명의 조성물 및 백신은 만성 통증 동물 모델에서 통증을 경감시킬 수 있음을 발견하였다. 이는 면역 반응, 특히 본 발명의 조성물 및 백신에 의해 생성된 항체가 생체 내에서 NGF와 특이적으로 결합하여, 중화하고 그 기능을 저해할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 일 측면은 (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP); 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원;을 포함하는 조성물로서, 상기 하나 이상의 항원이 NGF 항원이며; 상기 (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되어 있는 조성물에 관한 것이다. NGFβ는 동물에 투여되었을 때 원하지 않은 부작용을 초래할 수 있는 생물학적 활성을 포함하는 수용체 리간드이다. 따라서 본 발명은 상기 NGF 단백질이 NGF 뮤테인(mutein)이고, 이 GF 뮤테인은 NGFβ 중화 항체를 유도할 수 있는 능력은 그대로 보유하면서도 그 생물학적 활성은 감소되거나 없는 조성물을 제공한다. 따라서 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 항원은 NGF 뮤테인이다.
일반적으로 항 NGFβ백신에 의한 T 세포 반응의 유도는 매우 바람직하지 못한 부작용이 수반될 수 있다. 그러나 본 발명의 조성물은, 원하지 않는 T 세포 반응을 경감하거나 또는 제거하면서, 지시된 내용으로 NGF 항원에 대한 강력한 항체 반응을 효율적으로 유발시키는데 매우 유용하다. 따라서 바람직한 일 실시형태의 본 발명 조성물은 하나 이상의 폴리음이온성 매크로 분자(polyanionic macromolecule)를 더 포함하며, 상기 폴리음이온성 매크로 분자는 상기 VLP내로 패키징되며, 바람직하게 상기 폴리음이온성 매크로분자는 폴리음이온성 폴리펩타이드이며, 바람직하게 상기 폴리음이온성 폴리펩타이드는 폴리글루탐산 또는 폴리아스파르트산, 가장 바람직하게는 폴리글루탐산이다.
본 발명의 추가적인 면은 본 발명의 조성물을 치료적 유효량으로 포함하는 백신 조성물이다.
본 발명의 추가적인 면은 (a) 본 발명의 조성물; 및 (b) 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이다.
본 발명의 추가적인 면은 바람직하게 NGFβ에 대한 면역방법으로서, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 본 발명의 백신조성물, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 동물, 바람직하게 인간에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가적인 일면은 의약품으로서 사용되기 위한 본 발명의 조성물, 본 발명의 백신조성물, 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 일면은 본 발명의 조성물, 본 발명의 백신조성물, 또는 본 발명의 약학적 조성물을 통증, 바람직하게는 만성 통증 치료용 의약품의 제조에 사용하는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 일면은 통증, 바람직하게는 만성 통증의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 조성물, 본 발명의 백신조성물, 또는 본 발명의 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추가적인 일면은 본 발명 조성물을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 제1부착 부위를 갖는 VLP를 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 제2부착 부위를 갖는 하나 이상의 NGF 항원을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 VLP 및 NGF 항원을 연결하여 조성물을 제조하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 NGF 항원 및 VLP는 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결된다.
도 1은 면역 마우스의 정제된 전체 IgGs에 의한 mNGFβ의 생체외 중화를 도시한 것으로, mNGFβ에 반응하여 일어나는 TF-1 세포의 증식은 BrdU 삽입으로 측정되었다. Qβ로 면역된 동물의 전체 IgGs 10 μg/ml 존재하 10 ng/ml mNGFβ에 대한 증식을 100 %로 하고, 다른 모든 조건에 대한 TF-1 증식을 이값과 관련하여 산출하였다. 원은 Qβ-면역 동물로부터의 IgGs와 전-인큐베이션한 후 유도된 값을 나타낸 것이고, 네모는 Qβ-mNGFβ-His-GGC-면역 동물로부터의 IgGs와 전-인큐베이션한 후 유도된 값을 나타낸 것이다. 주어진 값은 세번의 시험값의 평균+/- SD 이다.
도 2는 CIA 마우스에서의 임상 점수 및 평균 체중의 전개를 나타낸 것이다. 마우스들은 0일, 10일 및 20일에 면역시키고, CIA는 27일 및 48일에 유발되었다. A) Qβ(■) 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC(○)로 면역된 마우스의 관절염 임상 점수. 각 값들은 마우스의 모든 4개의 사지 및 그룹(n=8)의 평균값 +/- SEMs로 주어진다. B) Qβ(■) 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC (○)로 면역된 마우스의 평균 체중. 각 값들은 평균체중 (n=8) +/- SEMs로 주어진다.
도 3은 지모산 A로 유발된 염증성 통증에서의 열 과민성 및 기계적 이질통증을 도시한 것이다. 마우스는 0일, 10일 및 20일에 면역시키고, 31일에 지모산 A를 마우스의 왼쪽 뒷발에 주사하여 염증성 통증을 유발시켰다. A) 발 회피 시간으로 측정되는 Qβ (■) 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC (○)로 면역된 마우스의 열적 과민성. 각 값들은 평균 (n=4) +/- SEMs로 주어진다. B) 발 회피를 일으키는데 적용된 압력으로 측정한 Qβ (■) 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC (○)로 면역된 마우스의 기계적 이질통증. 각 값들은 평균 (n=4) +/- SEMs로 주어진다.
도 4는 Qβ-(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC 면역 마우스에서의, 지모산 A로 유발된 염증성 통증에서의 열 과민성 및 기계적 이질통증을 도시한 것이다. 마우스는 0일, 14일, 28일 및 42일에 면역시키고, 62일에 지모산 A를 마우스의 왼쪽 뒷발에 주사하여 염증성 통증을 유발시켰다. A) 발 회피 시간으로 측정되는 Qβ (PolyGlu) (■), Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC (▲) 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC (○)로 면역된 마우스의 열적 과민성. 각 값들은 평균 (n=4) +/- SEMs로 주어진다. B) 발 회피를 일으키는데 적용된 힘으로 측정한 Qβ (PolyGlu) (■), Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC (▲) 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC (○)로 면역된 마우스의 기계적 이질통증. 각 값들은 평균 (n=4) +/- SEMs로 주어진다.
특별히 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 이용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야에서 숙련자에 의하여 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
항원: 본 명세서에서, "항원"은 항체, 또는 MHC 분자로 제시되는 경우 T 세포 수용체(TCR)에 의해 결합될 수 있는 분자를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "항원"은 T 세포 에피토프를 포함한다. 항원은 면역 시스템에 의해 부가적으로 인식될 수 있고/있거나 체액 면역 반응 및/또는 B- 및/또는 T-림포사이트를 활성화하는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 그러나 최소한 특정 경우에서는 항원이 Th 세포 에피토프를 포함하거나 이에 연결되어 있고 어쥬번트(adjuvant)가 주어질 것이 요구된다. 항원은 하나 이상의 에피토프(B- 및 T- 에피토프)를 가질 수 있다. 상기에서 지칭된 특이적 반응은 항원이 바람직하게, 통상은 높은 선택적인 방식으로 그 상응하는 항체 또는 TCR과 반응하나, 다른 다수의 항체들이나 다른 항원에 의해 발생될 수 있는 TCRs과는 반응하지 않는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 항원은 수개의 개별적인 항원의 혼합물일 수 있다. 매우 바람직한 실시형태에서, 항원은 NGF 항원이다.
에피토프(Epitope): "에피토프"는 항체 또는 MHC 분자의 맥락에서 T-세포 수용체에 의해 면역특이적으로 결합될 수 있는, 폴리펩타이드의 연속 또는 비연속 부분을 지칭한다. 면역특이적 결합은 비-특이적 결합은 배제하나 반드시 교차-반응성이 배제되어야 하는 것은 아니다. 에피토프는 전형적으로 에피토프 고유의 공간배열로 존재하는 5-10 아미노산을 포함한다.
연결되는(Associated): 본 명세서에서 "연결되는" (또는 그 명사형 연결)은 두 분자가 함께 결합되는 모든 가능한 방법, 바람직하게는 화학적 상호결합을 지칭한다. 화학적 상호결합은 공유 및 비-공유 상호결합을 포함한다. 비-공유 상호결합에 대한 전형적인 예시로는 이온 결합, 소수성 결합 또는 수소 결합을 들 수 있으며, 공유 상호결합은 예시적으로, 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 아마이드, 펩타이드, 탄소-인 결합, 탄소-황 결합, 예건대 티오 에테르, 또는 이미드 결합과 같은 공유 결합에 기초한다.
제1 부착부위(Attachment Site, First): 본 명세서에서, "제1 부착부위"는 VLP, 바람직하게는 RNA-박테리오파지의 VLP에 자연적으로 존재하거나 인공적으로 부가된 요소로서, 제2 부착부위가 이 요소에 연결될 수 있다. 제1 부착부위는 단백질, 폴리펩타이드, 아미노산, 펩타이드, 당, 폴리뉴클레오타이드, 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사체 또는 화합물(비오틴, 플루오레세인, 레티놀, 디곡시제닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드), 또는 아미노기, 카복실기, 설프하이드릴기, 하이드록실기, 구아니디닐기, 히스티디닐기와 같은 화학적 반응성 기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 제1 부착부위로서 바람직한 실시형태의 화학적 반응성 기로는 라이신과 같은 아미노산의 아미노기이다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 제1 부착부위는 라이신잔기의 아미노기이며, 바람직하게 상기 라이신 잔기는 상기 VLP, 바람직하게는 RNA-박테리오파지의 VLP에 자연적으로 존재하는 라이신 잔기이다.
제1 부착부위는 전형적으로 VLP, 바람직하게는 RNA-박테리오파지, 가장 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP 표면에, 더욱 바람직하게는 외부 표면에 존재한다. 복수의 제1 부착부위가 VLP, 바람직하게는 RNA-박테리오파지, 가장 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP 표면에, 더욱 바람직하게는 외부 표면에, 전형적이고 바람직하게 반복적인 형상으로 존재한다. 바람직한 일 실시형태에서, 제1 부착부위는 하나 이상의 공유 결합, 바람직하게는 하나 이상의 펩타이드 결합을 통해 VLP와 연결된다. 더욱 바람직한 실시형태에서 제1 부착부위는 VLP에 자연발생적으로 존재한다. 또는 다른 바람직한 일 실시형태에서 제1 부착부위는 인공적으로 VLP에 부가되어 있다. 바람직한 일 실시형태에서 제1 부착부위는 상기 VLP와 하나 이상의 공유 결합, 바람직하게는 하나 이상의 펩타이드 결합을 통해 연결되며, VLP는 RNA-박테리오파지, 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP이다. 더욱 바람직한 실시형태에서 상기 제1 부착부위는 라이신 잔기의 아미노기이며, 상기 라이신 잔기는 피막 단백질(coat protein), 바람직하게는 RNA-박테리오파지, 가장 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 피막 단백질의 라이신 잔기이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서 상기 제1 부착 부위는 RNA-박테리오파지의 피막 단백질의 라이신 잔기의 아미노기이고, 바람직한 상기 피막 단백질은 서열: 1의 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게는 이 서열로 이루어진다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서 제1 부착부위는 라이신 잔기이며, 바람직한 라이신 잔기로는 피막 단백질, 바람직하게는 RNA-박테리오파지, 가장 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 피막 단백질의 라이신 잔기이다. 더욱 바람직한 실시형태에서 상기 제1 부착부위는 RNA-박테리오파지 Qβ의 피막 단백질의 라이신 잔기이다.
제2 부착부위(Attachment Site, Second): 본 명세서에서, "제2 부착부위"는 NGF 항원에 자연적으로 존재하거나 또는 이에 인공적으로 부가된 요소로서, 제1 부착부위가 이 요소에 연결될 수 있다. NGF 항원의 제2 부착 부위는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 아미노산, 당, 폴리뉴클레오타이드, 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사체 또는 화합물(비오틴, 플루오레세인, 레티놀, 디곡시제닌, 금속 이온, 페닐메틸설포닐플루오라이드), 또는 아미노기, 카복실기, 설프하이드릴기, 하이드록실기, 구아니디닐기, 히스티디닐기와 같은 화학적 반응성 기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 제2 부착부위로서 바람직한 실시형태의 화학적 반응성 기로는 설프하이드릴기이다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 제2 부착부위는 설프하이드릴기, 바람직하게 시스테인 잔기의 설프하이드릴기이다. "하나 이상의 제2 부착부위를 갖는 항원" 및 상호 호환적으로 사용되는 용어 "하나 이상의 제2 부착부위를 갖는 NGF 항원"은 NGF 항원 및 하나 이상의 제2 부착부위를 포함하는 구조체(construct)를 지칭한다. 바람직한 일 실시형태에서, 제2 부착부위는 NGF 항원에 자연적으로 존재한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 제2 부착부위는 인공적으로 NGF 항원에 부가된다. 바람직한 일 실시형태에서, 제2 부착부위는 하나 이상의 공유결합, 바람직하게는 하나 이상의 펩타이드 결합을 통해 NGF 항원과 연결된다. 바람직한 일 실시형태에서, 하나 이상의 제2 부착부위를 갖는 NGF 항원은 링커를 더 포함하며, 바람직하게 링커는 하나 이상의 제2 부착부위를 포함하며, 더욱 바람직하게 링커는 펩타이드 결합에 의해 NGF 항원에 융합된다.
피막 단백질(Coat protein): "피막 단백질"은, 바이러스 단백질, 바람직하게는 바이러스, 특히 RNA-박테리오파지의 천연 캡시드의 서브유니트를 지칭하며, 이들은 바이러스 캡시드 또는 VLP 에 삽입될 수 있다.
연결되는(Linked): 본 명세서에서 "연결되는" (또는 그 명사형 연결)은 하나 이상의 제1 부착부위 및 하나 이상의 제2 부착부위가 함께 결합되는 모든 가능한 방법, 바람직하게는 화학적 상호결합을 지칭한다. 화학적 상호결합은 공유 및 비-공유 상호결합을 포함한다. 비-공유 상호결합에 대한 전형적은 예시로는 이온 결합, 소수성 결합 또는 수소 결합을 들 수 있으며, 공유 상호결합은 예시적으로, 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 아마이드, 펩타이드, 탄소-인 결합, 탄소-황 결합, 예컨대 티오 에테르, 또는 이미드 결합과 같은 공유 결합에 기초한다. 바람직한 실시형태에서 제1 부착부위 및 제2 부착부위는 하나 이상의 공유 결합, 바람직하게는 하나 이상의 비-펩타이드 결합을 통해 연결되며, 더욱 바람직하게는 전적으로 비-펩타이드 결합을 통해 연결된다. 그러나 본 명세서에서 "연결"은 하나 이상의 제1 부착부위 및 제2 부착부위가 직접 연결되는 것을 포함할 뿐 아니라 바람직하게 하나 이상의 제1 부착부위 및 제2 부착부위가 중간 물질을 통해, 통상적이며 바람직하게 하나 이상의, 바람직하게는 하나의 헤테로이작용기성 크로스-링커(heterobifunctional cross-linker)를 통해 간접적으로 연결되는 것도 포함한다. 따라서 바람직한 일 실시형태에서 하나 이상의 제1 부착부위 및 제2 부착부위는 하나 이상의 바람직하게는 정확하게 하나의 헤테로이작용기성 크로스-링커를 통해 공유적으로 결합되며, 바람직한 제1 부착부위는 라이신잔기의 아미노기이고, 더욱 바람직하게 제2 부착부위는 시스테인 잔기의 설프하이드릴기이다.
링커(Linker): 본 명세서에서 "링커"는 제2 부착부위를 NGF 항원에 연결하거나 또는 제2 부착부위를 포함하거나, 거의 제2 부착부위로 이루어져 있거나 또는 제2 부착부위로 이루어져 있다. 바람직하게 "링커"는 제2 부착부위를, 바람직하게 통상적으로 하나의 아미노산 잔기, 바람직하게 시스테인 잔기로서 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서 링커는 아미노산 링커이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서 링커는 정확하게 하나의 시스테인 잔기로 이루어진다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서 링커는 정확히 하나의 시스테인 잔기를 포함하거나 이것으로 이루어져 있고 제2 부착부위는 상기 정확히 하나의 시스테인 잔기의 설프하이드릴기이다. 본 발명에서 유용한 다른 링커는 C1-C6 알킬-, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실과 같은 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 아릴 또는 헤테로아릴 부분을 포함하는 분자들이다. 또한 바람직하게 C1-C6 알킬-, 사이클로알킬-(C5, C6), 아릴- 또는 헤테로아릴- 부분 및 부가적인 아미노산을 포함하는 링커들이 본 발명에서 사용될 수 있으며 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 링커들과 NGF 항원과의 연결은 바람직하게 하나 이상의 공유 결합, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 펩타이드 결합으로 이루어진다. 제2 부착부위가 NGF 항원에 자연적으로 존재하지 않는 것인 경우, 링커는 하나 이상의 제2 부착부위, 예를 들면, 시스테인에, 바람직하게 하나 이상의 공유결합, 더욱 바람직하게는 하나 이상의 펩타이드 결합을 통해 연결된다.
아미노산 링커(Amino acid linker): "아미노산 링커"는 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 링커를 지칭한다. 일반적으로 "아미노산 링커"는 아미노산 잔기만으로 이루어진 것을 내포하지 않는다. 그러나 바람직한 실시형태에서 상기 아미노산 링커는 배타적으로 아미노산 잔기만으로 이루어진다. 링커의 아미노산 잔기는 바람직하게 자연발생적 아미노산 또는 본 기술분야에 공지되어 있는 비-천연 아미노산, 모든 L형 또는 모든 D형의 아미노산 또는 이들의 혼합물로 구성되며, 가장 바람직하게는 모두 L형으로 구성된다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 링커는 설프하이드릴기 또는 시스테인 잔기를 포함하는 분자이며, 이러한 분자들은 모두 본 발명에 포함된다.
NGF 항원: "NGF 항원"은 본 명세서에서 NGF 단백질, NGF 단편 또는 NGF 뮤테인(mutein)을 포함한다. 더욱 바람직하게, NGF 항원은 NGF 뮤테인이다. 본 명세서에서 "NGF 항원"은 비제한적 예로서 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화와 같은 상기 정의된 NGF 항원의 번역후 변경물(post-translational modifications)들을 포함한다. 반드시 그러한 것은 아니나, 통상 바람직하게 NGF 항원은 단클론 및/또는 다클론 항 NGFβ 항체에 의해 특이적으로 결합된다.
NGF 단백질: "NGF 단백질"은 본 발명에서 서열: 22의 인간 NGF, 서열: 24의 마우스 NGF, 또는 기타 상응하는 다양한 동물종에서 유래된 오솔로그(ortholog)를 포함하는, 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있는 모든 폴리펩타이드를 포함한다. 매우 바람직한 다양한 동물 종에서 유래된 바람직한 NGF 오솔로그는 서열: 32 내지 39의 폴리펩타이드들이다. NGF 단백질은 반드시는 아니지만 통상 생물학적 활성을 나타내며, 바람직하게는 세포증식시험에서 생물학적 활성을 나타낸다. 또한 본 발명에서 "NGF 단백질"은 서열: 22의 인간 NGF, 서열: 24의 마우스 NGF, 또는 다양한 동물종에서 유래된 상응하는 오솔로그들과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 97% 이상의 아미노산 상동성을 갖는 자연적인 또는 유전공학적인 변이체를 포함하거나, 또는 이들로 이루어져 있는 폴리펩타이드들을 포함한다. "NGF 단백질"은 또한 본 발명에서 비제한적 예로서 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화와 같은 상기 정의된 NGF 단백질의 번역후 변경물들을 포함한다. 바람직하게 NGF 단백질은 여기에서 정의된 바와 같이, 최대 200 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 최대 150 아미노산 길이, 보다 바람직하게는 최대 130 아미노산 길이이다. 바람직하게 통상 상기 NGF 단백질은 단클론 및/또는 다클론 항NGFβ 항체에 특이적으로 결합한다. 또한 본 발명의 목적에 유용한 NGF 단백질은 동물에 면역원성 콘쥬게이트, 바람직하게 박테리오파지 Qβ의 VLP와의 콘쥬게이트 형태로 투여되었을 때, 통상 바람직하게 그 동물내에 항NGF 항체를 유도할 수 있으며, 상기 항NGF 항체는 생체외 및/또는 바람직하게 본 명세서에 개시된 바와 같은 (참조, 실시예 9 내지 12 및 15) 생체내 어세이에서 NGF 단백질의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다. 특정 종의 NGF 단백질을 포함하는 본 발명의 조성물에 의해 유도된 항체가 통상 바람직하게 그 종의 NGF 단백질과 특이적으로 결합하고/하거나 중화시킬 수 있음은 당업자에게 명백하다.
NGF 단편(fragment): "NGF 단편"은 본 발명에서 NGF 단백질의 최소한 8개, 바람직하게는 최소한 12개, 더욱 바람직하게는 최소한 20개, 보다 바람직하게는 최소한 30개의 인접하는 아미노산을 포함하거나, 또는 거의 이들로 이루어져 있거나 또는 바람직하게 이들로 이루어진 폴리펩타이드, 또한 본 발명에서 정의된 바와 같은 NGF 단백질의 최대 60개, 바람직하게는 최대 50개, 더욱 바람직하게는 최대한 45개, 보다 바람직하게는 최대한 40개의 아미노산을 포함하거나, 거의 이들로 이루어져 있거나, 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있는 동일한 폴리펩타이드 및 이들과 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상의 아미노산 서열 동등성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 상기 NGF 단편은 (a) 본 명세서에 정의된 바와 같은 NGF 단백질의, 바람직하게는 서열: 22의 8 내지 60, 바람직하게는 12 내지 60, 더욱 바람직하게는 20 내지 60, 보다 바람직하게는 30 내지 60의 인접하는 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드, 및 (b) 상기 (a)의 폴리펩타이드와 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상의 아미노산 서열 동등성을 갖는 폴리펩타이드에서 선택되는 폴리펩타이드를 포함하거나, 또는 거의 이들로 이루어져 있거나, 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있다. 바람직하게 "NGF 단편"은 서열: 22의 NGF 단백질의 최소 12개의 인접하는 아미노산을 포함하거나, 거의 이들로 이루어져 있거나, 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있는 폴리펩타이드 및 서열: 22의 NGF 단백질의 최대 45개, 더욱 바람직하게는 최대 40개의 인접하는 아미노산을 포함하거나, 거의 이들로 이루어져 있거나, 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있는 폴리펩타이드를 포함한다. "NGF 단편"은 또한 본 발명에서 비제한적 예로서 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화와 같은 상기 정의된 NGF 단편의 번역후 변경물들을 포함한다. 바람직하게 NGF 단편은 반드시는 아니나 통상 생물학적 활성을 가지며, 특히 세포 증식 어세이에서 생물학적 활성을 나타낸다. 바람직하게 통상 상기 NGF 단편은 단클론 및/또는 다클론 항NGFβ 항체에 특이적으로 결합한다. 또한 본 발명의 목적에 유용한 NGF 단편은 동물에 면역원성 콘쥬게이트, 바람직하게 박테리오파지 Qβ의 VLP와의 콘쥬게이트 형태로 투여되었을 때, 통상 바람직하게 그 동물내에 항NGF 항체 형성을 유도할 수 있다. 가장 바람직한 NGF 단편은 동물에 면역원성 콘쥬게이트, 바람직하게 박테리오파지 Qβ의 VLP와의 콘쥬게이트 형태로 투여되었을 때, 그 동물내에 항NGF 항체 형성을 유도할 수 있으며, 이때 상기 항NGF 항체는 생체외 및/또는 바람직하게 본 명세서에 개시된 바와 같은 (참조, 실시예 9 내지 12 및 15) 생체내 어세이에서 NGF 단백질의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다. 특정 종의 NGF 단편을 포함하는 본 발명의 조성물에 의해 유도된 항체가 통상 바람직하게 그 종의 NGF 단백질과 특이적으로 결합하고/하거나 중화시킬 수 있음은 당업자에게 명백하다.
NGF 뮤테인: "NGF 뮤테인"은 본 발명에서 NGF 단백질, 바람직하게는 인간 NGF 단백질, 가장 바람직하게는 서열: 22의 아미노산서열이 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이들로 이루어져 있는 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 돌연변이된 아미노산 서열은 최소 하나 최대 20개 바람직하게는 최소 하나 최대 10개, 더욱 바람직하게는 최소 하나 최대 5개의 위치에서 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합으로 변경된 것이다. 바람직한 일 실시형태에서, 상기 NGF 뮤테인은 서열: 22의 아미노산 서열이 최소 하나 최대 4개의 위치에서 치환, 결실 또는 이들의 조합, 바람직하게는 치환에 의해 변경된 아미노산 서열이다. 반드시는 아니나 통상 NGF 뮤테인은 단클론 및/또는 다클론 NGFβ 항체와 특이적으로 결합된다. NGF 뮤테인은 돌연변이전 아미노산 서열에 비해 감소된 생물학적 활성을 포함한다. 가장 바람직하게는 상기 NGF 뮤테인은 검출가능한 생물학적 활성을 포함하지 않는다. 또한 본 발명의 목적에 유용한 NGF 뮤테인은 통상 그리고 바람직하게 동물에 면역원성 콘쥬게이트, 바람직하게 박테리오파지 Qβ의 VLP와의 콘쥬게이트 형태로 투여되었을 때, 통상 바람직하게 그 동물내에 항NGF 항체 형성을 유도할 수 있다. 가장 바람직한 NGF 뮤테인은 동물에 면역원성 콘쥬게이트, 바람직하게 박테리오파지 Qβ의 VLP와의 콘쥬게이트 형태로 투여되었을 때, 그 동물내에 항NGF 항체 형성을 유도할 수 있으며, 이때 상기 항NGF 항체는 생체외 및/또는 바람직하게 본 명세서에 개시된 바와 같은 (참조, 실시예 9 내지 12 및 15) 생체내 어세이에서 NGF 단백질의 생물학적 활성을 중화시킬 수 있다. 특정 종의 아미노산 서열이 돌연변이 된 NGF 뮤테인을 포함하는 본 발명의 조성물에 의해 유도된 항체가 통상 바람직하게 그 종의 NGF 단백질과 특이적으로 결합하고/하거나 중화시킬 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 명세서에서, 항원에 대한 항체, 바람직하게는 단클론 또는 다클론 항체의 특이적 결합은 106 M-1 이상, 바람직하게는 107 M-1 이상, 더욱 바람직하게는 108 M-1 이상, 가장 바람직하게는 109 M-1 이상의 친화성(Ka)을 특징으로 하는 결합을 지칭한다. 항체의 친화성은 본 기술분야의 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다(예를 들면, Scatchard 분석, Biacore- 또는 ELISA- 기반의 방법들). 가장 바람직하게, NGF 항원에 대한 단클론 및/또는 다클론 NGF 항체의 특이적 결합은 실시예 5에 개시시된 조건하에서 ELISA법에 의해 어세이된다.
생물학적 활성: "생물학적 활성"은 본 발명에서 항원, 바람직하게는 NGF 항원, 가장 바람직하게는 NGF 단백질, NGF 단편 및/또는 NGF 뮤테인의 세포증식 어세이에서의 활성을 지칭하며, 바람직하게 상기 세포증식 어세이는 NGF 의존성 인간 에리스로류케믹 TF-1 세포주에 기반하여 이루어지며, 더욱 바람직하게 상기 세포증식 어세이는 본질적으로 하기 실시예 6에 개시된 조건하에서 수행된다. NGF 항원은 검출가능한 수준의 세포 증식을 유발할 수 있는 경우, 생물학적 활성으로 간주된다. 통상 그리고 바람직하게 NGF 항원은 적절한 표준방법으로 성취된 최대 증식의 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상의 세포증식을 유도할 수 있는 경우 생물학적으로 활성이다. NGF 뮤테인은 돌연변이될 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드와 비교시 100 % 이하, 바람직하게는 80 % 이하, 더욱 바람직하게는 60 % 이하, 보다 바람직하게는 40 % 이하, 가장 바람직하게는 20 % 이하의 세포 증식을 유도하는 경우 감소된 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주된다.
본 발명에서 NGF 항원, 특히 NGF 단백질, NGF 단편 및 NGF 뮤테인은, 면역원성의 형태로 검사 동물에 투여되었을 때, 항체 반응을 유발하는 경우 "항체를 유도할 수 있는 것"으로 간주되며, 상기 항원 반응에서 생성된 항체는 상기 NGF 항원에 특이적으로 결합한다. 통상적으로 바람직하게 상기 NGF 단백질은 바이러스-유사 입자와 함께, 가장 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사 입자와 콘쥬게이트 형태로 검사 동물에 투여된다. 가장 바람직하게 상기 NGF 항원은 본 명세서에 개시된 바와 같이 조성물, 백신 조성물 또는 약학적 조성물로 투여된다. 매우 바람직하게 NGF 항원의 항체 유도능은 본질적으로 실시예 8에 개시된 것과 같은 조건하에서 분석된다.
본 발명에서 NGF 항원 특히 NGF 단백질, NGF 단편 및 NGF 뮤테인은, 면역원성 콘쥬게이트 형태로 검사 동물에 투여시, 항체 반응을 유도할 수 있고, 상기 항체 반응에서 생성된 항체가 NGF 단백질을 중화할 수 있는 경우, "항체 중화를 유도할 수 있는 것"으로 간주된다. 항체의 NGF 단백질 중화능은 세포증식 어세이를 사용한 생체외 어세이에서 분석되며, 바람직하게 상기 세포증식 어세이는 NGF 의존성 인간 에리스로류케믹 TF-1 세포주에 기반하여 이루어지며, 더욱 바람직하게 상기 세포증식 어세이는 본질적으로 하기 실시예 6 및 9에 개시된 조건하에서 수행된다. 항체는 상기 세포증식 어세이에서 NGF 단백질의 생물학적 활성을 감소시키거나 제거할 때, NGF 단백질을 중화할 수 있는 것으로 간주된다. 또는 항체의 NGF 단백질 중화능은 바람직하게 통증에 대한 동물 모델에서의 생체내 어세이에서 분석되며, 항체의 NGF 단백질 중화능은 종국적으로 상기 동물 모델에서 통증을 경감시키는 것으로 검출된다. 바람직한 통증을 위한 동물 모델은 마우스에서의 콜라겐 유도 관절염, 마우스에서의 지모산 A-유도 염증 동통, 탁솔-유도 신경병변성 통증을 들 수 있으며, 이들 어세이는 바람직하게 실시예 10, 11, 또는 15에 개시된 바와 같은 조건하에서 수행된다.
정돈되고 반복적인 항원 어레이(Ordered and repetitive antigen array): 본 발명에서 "정돈되고 반복적인 항원 어레이"는 일반적으로 항원의 반복 패턴을 지칭하며, 통상 그리고 바람직하게 바이러스-유사 입자에 대한 항원들 각각의 고도의 균일한 공간배열을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 반복 패턴은 기하학적 패턴일 수 있다. 본 발명의 RNA- 박테리오파지의 VLP와 같은 특정 실시형태는 적절한 정도의 정돈되고 반복적인 항원 어레이의 전형적이고 바람직한 예이며, 이들은 또한 엄격한 반복적인 파라결정성 질서의 항원을 가지며, 바람직하게 그 간격은 1 내지 30 나노미터, 바람직하게는 2 내지 15 나노미터, 더욱 바람직하게는 2 내지 10 나노미터, 보다 바람직하게는 2 내지 8 나노미터, 가장 바람직하게는 1.6 내지 7 나노미터이다.
폴리펩타이드: "폴리펩타이드"는 본 발명에서 모노머(아미노산)가 아마이드 결합(펩타이드결합으로도 알려져 있다)으로 선형 연결되어 구성된 분자를 지칭한다. 이는 아미노산들의 분자쇄를 가르키며 특정 길이의 산물을 지칭하는 것은 아니다. 따라서 펩타이드, 디펩타이드, 트리펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질이 본 폴리펩타이드의 정의에 포함된다. 폴리펩타이드의 예컨대 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등의 번역후 변경물들도 포함된다.
폴리펩타이드의 아미노산 서열 동등성은 Bestfit프로그램과 같은 통상의 공기 컴퓨터 프로그램으로 결정될 수 있다. Bestfit 또는 다른 서열 정렬 프로그램을 사용할 때, 바람직하게 Bestfit을 사용하여 특정 서열이 기준 아미노산 서열과 예컨대 95 % 동등한지 여부를 결정할 때, 전장 기준 아미노산 서열에 대해 동등성 퍼센트가 산출되고, 기준 서열내 전체 아미노산 잔기의 호몰로지상 갭이 5%까지 허용되도록 파라미터를 세팅한다. 폴리펩타이드간 동등성 퍼센트를 결정하는 상술한 방법은 본 발명에 개시된 모든 단백질, 폴리펩타이드 또는 이들의 단편에 적용될 수 있다.
보존적인 아미노산 치환은 당업자에게 잘 이해되는 바와 같이, 이소스테릭 치환(isosteric substitutions) 즉 아미노산의 전하, 극성, 방향성, 지방성 또는 소수성 성질이 유지되는 치환을 포함한다. 통상적인 보존적인 아미노산 치환은 하기 군 중 하나내 아미노산들 간의 치환이다: (a) Gly, Ala; Val, Ile, 및 Leu; (b) Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Cys; Lys, 및 Arg; 및 (c) Phe 및 Tyr.
바이러스 입자(Virus particle): "바이러스 입자"는 본 발명에서 바이러스의 형태학적 형식을 지칭한다. 어떤 바이러스 타입에서 바이러스 입자는 단백질 캡시드에 의해 둘러싸인 게놈을 포함하고; 다른 것들은 부가적인 구조들(예, 엔벨롭, 테일 등)을 갖는다.
바이러스-유사 입자 (VLP): 본 발명에서 바이러스-유사 입자는 비-복제성 또는 비-감염성, 바람직하게는 비-복제성이며 비-감염성인 바이러스 입자를 지칭하거나 또는 바이러스 입자, 바람직하게는 바이러스의 캡시드를 닮은 비-복제성 또는 비-감염성, 바람직하게는 비-복제성이며 비-감염성인 구조를 지칭한다. 본 발명에서, "비복제성"은 VLP에 의해 포함되는 게놈을 복제할 수 없는 것을 지칭한다. "비감염성"은 숙주 세포내로 들어갈 수 없는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 비복제성 및/또는 비감염성인데, 물리적 화학적 불활성화 또는 유전적 조작으로 인해 바이러스 게놈 또는 게놈 기능의 전부 또는 일부가 부족하기 때문이다. 바이러스-유사 입자는 통상 바람직하게 바이러스 게놈의 복제성 및 감염성 구성성분의 전부 또는 일부가 결핍되어 있다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 바이러스 게놈과 구별되는 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자의 전형적이고 바람직한 실시형태는 상응하는 바이러스, 박테리오파지, 바람직하게 RNA-박테리오파지의 바이러스 캡시드와 같은 바이러스 캡시드이다. "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드(capsid)"는 바이러스 단백질 서브유닛으로 구성되는 매크로분자 어셈블리를 지칭한다. 통상 60, 120, 180, 240, 300, 360 및 360 이상의 바이러스 단백질 서브유닛이 있다. 이들 서브유닛 간의 상호작용은 통상 그리고 바람직하게 바이러스 캡시드 또는 고유의 반복 조직을 갖는 바이러스-캡시드 유사 구조의 형성을 초래하며, 상기 구조는 통상 구형 또는 관형이다.
재조합 VLP: "재조합 VLP"는, 본 발명에서, 재조합 DNA 테크놀로지의 하나 이상의 단계를 포함하는 과정에 의해 수득되는 VLP를 지칭한다.
패키징된(Packaged): "패키징된"은 본 발명에서 VLP와 관련한 폴리음이온성 마크로분자의 상태를 지칭한다. "패키징된"은 예컨대 화학적 결합과 같은 공유결합, 또는 이온 결합, 소수성 결합, 수소결합 등과 같은 비공유결합을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, "패키징된"은 VLP에 의해 폴리이온성 마크로분자가 봉입되거나 부분적으로 봉입되는 것을 의미한다. 따라서 폴리이온성 마크로분자는 실질적인 결합, 특히 공유결합이 없이도 VLP에 의해 봉입될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 하나 이상의 폴리음이온성 마크로분자가 상기 VLP내에, 가장 바람직하게 비-공유적 방식으로 봉입될 수 있다. 폴리글루탐산과 같은 폴리음이온성 마크로분자를 VLPs, 특히 RNA-박테리오파지의 VLPs내로 패키징하는 방법이 WO2006/037787에 개시되어 있다. 특히 WO2006/037787의 실시예 4를 참조한다.
폴리음이온성 마크로분자(Polyanionic macromolecule): "폴리음이온성 마크로분자"는 본 발명에서 반복되는 음전하기를 포함하는 비교적 고분자량 분자를 지칭하며, 이 구조는 본질적으로 비교적 저분자량의 분자로부터 실질적으로 또는 관념적으로 유도되는 다수의 반복 유닛을 포함한다. "폴리음이온성 마크로분자"는 톨 유사 수용체(toll-like receptor)를 활성화할 수 없는 분자를 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 "폴리음이온성 마크로분자"는 톨 유사 수용체 리간드를 배제하며, 톨 유사 수용체 리간드와 같이 면역 반응을 유도 및/또는 증강할 수 있는 물질, 면역 반응을 유도 및/또는 증강할 수 있는 핵산, 및 리포폴리사카라이드(LPS)를 배제한다. 보다 바람직하게 본 명세서에서 "폴리음이온성 마크로분자"는 사이토킨 생성을 유도할 수 없는 분자를 지칭한다. 바람직하게 폴리음이온성 마크로분자는 폴리음이온성 폴리펩타이드 또는 음이온성 덱스트란이다. 바람직한 일 실시형태에서 상기 폴리음이온성 마크로분자는 폴리음이온성 폴리펩타이드이며, 바람직하게 상기 폴리음이온성 폴리펩타이드는 (a) 폴리글루탐산; (b) 폴리아스파르트산; (c) 폴리(GluAsp); 및 (d) (a) 내지 (c)의 화학적 변경물로 이루어진 군에서 선택된다. 화학적 변경물의 예로는, 글리코실화, 아세틸화, 및 포스포릴화를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서 상기 폴리음이온성 폴리펩타이드는 (a) 덱스트란 설페이트; (b) 카복실메틸 덱스트란; (c) 설포프로필 덱스트란; (d) 메틸 설포네이트 덱스트란; 및 (e) 덱스트란 포스페이트로 이루어진 군에서 선택되는 음이온성 덱스트란이다.
폴리아스파르트산: "폴리아스파르트산"은 본 발명에서, 구성 아미노 잔기 총 수에서 아스파르트산 잔기를 50 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상, 더 바람직하게는 99 % 이상, 가장 바람직하게는 100 %로 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드내 아스파르트산 잔기는 모두 L형이거나 모두 D형이거나 L-형 및 D-형 아스파르트산의 혼합물이다. 가장 바람직하게는 오직 L-아스파르트산 잔기만을 포함한다.
폴리글루탐산: "폴리글루탐산"은 본 발명에서, 구성 아미노 잔기 총 수에서 글루탐산 잔기를 50 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상, 더 바람직하게는 99 % 이상, 가장 바람직하게는 100 %로 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드내 글루탐산 잔기는 모두 L형이거나 모두 D형이거나 L-형 및 D-형 글루탐산의 혼합물이다. 가장 바람직하게는 오직 L-글루탐산 잔기만을 포함한다.
폴리(GluAsp): "폴리(GluAsp)"는 본 발명에서, 구성 아미노 잔기 총 수에서 글루탐산 잔기 및 아스파르트산 잔기를 50 % 이상, 바람직하게는 70 % 이상, 더욱 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상, 더 바람직하게는 99 % 이상, 가장 바람직하게는 100 %로 포함하는 폴리펩타이드를 지칭한다. 폴리펩타이드내 글루탐산 잔기 및 아스파르트산 잔기는 모두 L형이거나 모두 D형이거나 L-형 및 D-형 글루탐산 잔기 및 아스파르트산 잔기의 혼합물이다. 가장 바람직하게는 오직 L-글루탐산 잔기 및 L-아스파르트산 잔기만을 포함한다.
통증: 통증은 부상과 같이 통증 수용체의 자극으로부터(침해성 통증) 생길 수 있고, 또는 명백한 물리적 원인없이, 신경계의 기능이상으로 인해 통증 시그널이 뇌로 전달되어 유발될 수 있다(신경병변성 통증). 통증은 예를 들면 골관절염 통증, 류마티스성 관절염 통증, 암 통증, 내장통, 만성 요통, 만성 두통, 섬유근육통, 당뇨병성 신경병증, 환지통, 헤르페스후 신경통(post herpetic neuralgia)을 포함한다.
침해성 통증(Nociceptive pain): "침해성 통증"은 본 발명에서, 부상, 수술 또는 관절염 및 암과 같이 조직에 침범하는 질병으로 인해, 통증 수용체의 자극으로 발생하는 통증을 지칭한다. 침해성 통증은 또한 만성 통증을 포함한다. 바람직한 침해성 통증 타입은 골관절염 통증, 류마티스성 관절염 통증, 암통증, 내장통, 만성 요통, 및 만성 두통을 들 수 있다.
신경변성 통증(Neuropathic pain): "신경변성 통증"은 본 발명에서, 당뇨병성 신경병증, 환지통, 헤르페스후 신경통과 같이, 명백한 물리적 원인 없이, 신경계의 기능이상으로 인해 통증 시그널이 뇌로 전달되어 유발되는 통증을 지칭한다.
바이러스 입자 및 바이러스-유사 입자의 한가지 공통적인 특징은 고도의 정돈되고 반복적인 서브유닛의 배열이다.
RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자: 본 발명에서, "RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자"는 RNA-박테리오파지의 피막 단백질, 그 돌연변이 또는 단편을 포함하거나, 또는 바람직하게 거의 본질적으로 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지는 바이러스-유사 입자를 지칭한다. 또한 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 구조와 비슷하다. 또한 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자는 비-복제성이며 비감염성이다. 통상 바람직하게 비복제성, 비감염성이다. 통상적이고 바람직하게, "RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자"는 나아가 RNA-박테리오파지의 복제기구를 코딩하는 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 모든 유전자가 결핍되어 있는 바이러스-유사 입자를 지칭하며, 통상적이고 바람직하게는 숙주에 바이러스가 부착하는데 또는 들어가는데 필요한 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전자, 바람직하게는 모든 유전자가 결핍되어 있는 바이러스-유사 입자를 지칭한다. 그러나 이러한 정의는 상술한 유전자(들)이 존재하긴 하나 불활성 상태여서 비복제성 및 비감염성이 되는 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자를 포함한다. 따라서 본 발명에서 "RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자"는 가장 넓은 정의로 RNA-박테리오파지의 바이러스 입자, 바이러스 입자가 비복제성 및/또는 비감염성이 되도록 물리적 또는 화학적 또는 유전적 방법으로 게놈이 불활성화된 것들을 포함한다. 바람직한 RNA-박테리오파지의 VLPs는 정이십면체 대칭(icosahedral symmetry)을 나타내며, 180 서브유닛으로 이루어져 있다.
하나: 본 발명에서 "하나"는 특별히 다르게 지시되지 않는 한, "하나 이상" 또는 "하나 또는 더 이상"을 의미한다.
본 발명은 동물 또는 인간에서 NGF에 대한 면역 반응을 증강시키는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP); 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원;을 포함하는 조성물로서, 상기 하나 이상의 항원이 NGF 항원이며; (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되어 있는 것이다. 바람직하게 NGF 항원은 VLP와 연결되어, 정돈되고 반복적인 항원-VLP 어레이를 형성한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 20 이상, 바람직하게는 30 이상, 더 바람직하게는 60 이상, 보다 바람직하게는 120 이상, 가장 바람직하게는 180 이상의 NGF 항원들이 VLP에 연결된다.
본 기술 분야에서 정돈되고 반복적인 구조를 갖는 어떠한 바이러스도 본 발명의 VLP로 선택될 수 있다. VLPs의 제조에 사용될 수 있는 예시적 DNA 또는 RNA 바이러스, 이들의 피막 단백질은 WO 2004/009124의 25페이지, 10-21줄, 26페이지, 11-28줄, 28페이지, 4줄 내지 31페이지 4줄에 개시되어 있다. 이러한 개시는 본 발명에서 참조로 삽입된다.
바이러스 또는 바이러스-유사 입자들은 바이러스-감염 세포 배양액으로부터 생성되어 정제될 수 있다. 생성된 바이러스 또는 바이러스-유사 입자들은 백신화의 목적으로 독성(virulence)이 제거되어야 한다. 바이러스 게놈 기능을 불활성화시키기 위해, 유전공학 뿐 아니라, UV 조사나 폼알데하이드 처리와 같은 물리적 또는 화학적 방법들도 사용될 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, VLP는 재조합 VLP이다. 거의 모든 공지된 바이러스의 시퀀싱이 이루어졌으며 쉽게 입수할 수 있다. 피막 단백질을 코딩하는 유전자도 당업자에 의해 쉽게 동정될 수 있다. 숙주에서 피막 단백질을 재조합적으로 발현하여 VLPs를 제조하는 것은 당업자의 일반적인 지식에 속한다.
바람직한 일 실시형태에서, 바이러스-유사 입자는 하기 그룹에서 선택되는 바이러스의 재조합 단백질, 그 돌연변이 또는 단편을 포함하거나 또는 이들로 이루어져 있다: (a) RNA-박테리오파지; (b) 박테리오파지; (c) B형 간염 바이러스, 바람직하게는 그 피막 단백질 (Ulrich, et al., Virus Res. 50:141-182 (1998)) 또는 그 표면 단백질 (WO 92/11291); d) 홍역 바이러스 (Warnes, et al., Gene 160: 173-178 (1995)); (e) 신드비스바이러스; (f) 로타바이러스 (US 5,071,651 및 US 5,374,426); (g) 구제역(foot-and-mouth-disease) 바이러스 (Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995)); (h) 노르워크 (Norwalk) 바이러스 (Jiang, X., et al., Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S.M., et al, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991)); (i) 알파(Alpha) 바이러스; j) 레트로바이러스, 바람직하게는 그 GAG 단백질 (WO 96/30523); (k) 레트로트랜스포손(retrotransposon) Ty, 바람직하게는 단백질 파이(pi); (1) 인간 파필로마 바이러스 (WO 98/15631); (m) 폴리오마 바이러스; (n) 담배모자이크병바이러스; 및 (o) 플락 하우스 바이러스(Flock House Virus).
바람직한 일 실시형태에서, VLP는 재조합 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편의 하나 이상의 아미노산 서열, 바람직하게는 두개의 아미노산 서열을 포함하거나 이들로 이루어져 있다. 더 바람직한 일 실시형태에서 VLP는 하나 이상의 제1 폴리펍타이드 및 하나 이상의 제2 폴리펩타이드를 포함하거나 이들로 이루어져 있고, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 피막단백질 또는 이들의 돌연변이나 단편의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드의 아미노산서열은 서로 동일하지 않다. 더 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 폴리펩타이드는 제1 피막 단백질 또는 그 돌연변이 또는 단편의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 폴리펩타이드는 제2 피막 단백질 또는 그 돌연변이 또는 단편의 아미노산 서열을 포함하며, 제1 피막 단백질 및 제2 피막단백질은 동일한 바이러스의 피막 단백질이며 바람직하게 상기 바이러스는 RNA-박테리오파지이다. 하나 이상의 폴리펩타이드 종을 포함하거나 이들로 이루어진 VLP는 모자익 (mosaic) VLP로 지칭된다.
"재조합 단백질의 단편" 또는 "피막 단백질의 단편"은 본 발명에서 야생형 재조합 단백질 또는 피막 단백질 각각의 길이의 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상, 더 바람직하게는 90 % 이상, 보다 바람직하게는 95 % 이상인 폴리펩타이드로서 정의되며, 바람직하게 VLP 형성능을 보유한다. 바람직하게 단편은 하나 이상의 내부 결실, 하나 이상의 절단(truncation) 또는 하나 이상의 이들의 조합으로 수득된다. 더 바람직하게 단편은 최대 5, 4, 3 또는 2개의 내부 결실, 최대 2개의 절단 또는 정확하게 하나의 이들의 조합으로 수득된다.
"재조합 단백질의 단편" 또는 "피막 단백질의 단편"은 위에서 정의된 바와 같은 "재조합 단백질의 단편" 또는 "피막 단백질의 단편"과 80 % 이상, 바람직하게는 90 % 이상, 가장 바람직하게는 95 % 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지며, 바람직하게 바이러스-유사 입자내로 어셈블링할 수 있는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명에서 상호호환적으로 사용되는 "재조합 단백질 돌연변이" 또는 "재조합 단백질의 돌연변이 " 또는 "피막 단백질 돌연변이" 또는 "피막 단백질의 돌연변이"는 각각 야생형 재조합 단백질 또는 피막 단백질에서 유래된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 상기 아미노산 서열은 야생형 서열과 80 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 97 % 이상, 또는 99 % 이상 동등하며, 바람직하게 상기 폴리펩타이드는 VLP내로 어셈블링할 수 있는 능력을 보유한다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 바이러스-유사 입자는 B형 간염 바이러스의 유사입자이다. B형 간염 바이러스의 바이러스-유사 입자는 특히 WO 제 00/32227호, WO 제01/85208호 및 WO 제01/056905호에 개시되어 있다. 이들 세 문헌은 본 발명에 참조로서 명백히 포함된다. 본 발명의 실시에 사용되기 적합한 다른 HBcAg 변이체들은 WO 제01/056905호, 특히 34 내지 39페이지에 개시되어 있다.
본 발명의 더 바람직한 일 실시형태에서, 라이신 잔기가 HBcAg 폴리펩타이드내로 도입되어 NGF 항원과 HBcAg의 VLP를 매개한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 VLPs 및 조성물은 서열: 20의 아미노산 1-144, 또는 1-149, 1-185를 포함하거나 이들로 이루어진 HBcAg를 사용하여 제조되며, 이들은 위치 79 및 80이 아미노산 서열 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly을 갖는 펩타이드로 대체되도록 변경된다. 이러한 변경은 서열: 20을 서열: 21로 변화시킨다. 더 바람직한 실시형태에서, 서열: 21 또는 이들의 대응되는 단편 즉 바람직하게 1-144, 또는 1-149 단편의 위치 48 및 110의 시스테인 잔기는 세린으로 돌연변이된다. 본 발명은 나아가 상술된 대응 아미노산 변경을 갖는 B형 간염 코어 단백질 돌연변이를 포함하는 조성물들을 포함한다. 본 발명은 서열: 21과 최소한 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어져 있는 HBcAg를 포함하는 조성물 및 백신을 더 포함한다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자이며, 바람직하게 상기 RNA-박테리오파지는 (a) 박테리오파지 Qβ; (b) 박테리오파지 R17; (c) 박테리오파지 fr; (d) 박테리오파지 GA; (e) 박테리오파지 SP; (f) 박테리오파지 MS2; (g) 박테리오파지 M11; (h) 박테리오파지 MXl; (i) 박테리오파지 NL95; (k) 박테리오파지 f2; (1) 박테리오파지 PP7, 및 (m) 박테리오파지 AP205로 이루어진 군에서 선택된다. 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사 입자이다.
본 발명의 더 바람직한 일 실시형태에서, 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질, 또는 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하거나 거의 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어지며, 바람직하게 상기 RNA-박테리오파지는 (a) 박테리오파지 Qβ; (b) 박테리오파지 R17; (c) 박테리오파지 fr; (d) 박테리오파지 GA; (e) 박테리오파지 SP; (f) 박테리오파지 MS2; (g) 박테리오파지 M11; (h) 박테리오파지 MXl; (i) 박테리오파지 NL95; (k) 박테리오파지 f2; (1) 박테리오파지 PP7, 및 (m) 박테리오파지 AP205로 이루어진 군에서 선택된다. 더 바람직한 일 실시형태에서 상기 바이러스-유사 입자는 Qβ, fr, AP205 또는 GA에서 선택되는 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질, 또는 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하거나 거의 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진다. 특히 바람직한 일 실시형태에서 상기 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지 Qβ의 재조합 피막 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하거나 거의 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 본 조성물은 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하며, 바람직하게 상기 피막 단백질은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있다: (a) 서열: 1(Qβ CP를 나타냄); (b) 서열: 1 및 서열: 2의 혼합물(Qβ Al 단백질을 나타냄); (c) 서열: 3; (d) 서열: 4; (e) 서열: 5; (f) 서열: 6, (g) 서열: 6 및 서열: 7의 혼합물; (h) 서열: 8; (i) 서열: 9; (j) 서열: 10; (k) 서열: 11; (1) 서열: 12; (m) 서열: 13; (n) 서열: 14; (o) 서열: 40; (p) 서열: 41 ; 및 (q) 서열: 42.
더 바람직한 일 실시형태에서, 상기 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하거나 거의 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진다. 더 바람직한 일 실시형태에서, 상기 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하거나 거의 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어지며, 상기 피막 단백질은 하기로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있다: (a) 서열: 1(Qβ CP를 인용); (b) 서열: 1 및 서열: 2의 혼합물(Qβ Al 단백질을 인용); (c) 서열: 3; (d) 서열: 4; (e) 서열: 5; (f) 서열: 6, (g) 서열: 6 및 서열: 7의 혼합물; (h) 서열: 8; (i) 서열: 9; (j) 서열: 10; (k) 서열: 11; (1) 서열: 12; (m) 서열: 13; (n) 서열: 14; (o) 서열: 40; (p) 서열: 41 ; 및 (q) 서열: 42.
더 바람직한 일 실시형태에서, 상기 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하거나 거의 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어지며, 상기 피막 단백질은 서열: 1의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이들로 이루어져 있다.
바람직한 일 실시형태에서, VLP는 RNA-박테리오파지의 피막 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편의 하나 이상의 아미노산 서열, 바람직하게는 두개의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 모자익 VLP이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서, VLP는 RNA-박테리오파지의 두개의 상이한 피막 단백질을 포함하거나 이들로 이루어지며, 상기 두개의 피막 단백질을 서열: 1 및 서열: 2의 아미노산 서열 또는 서열: 6 및 서열: 7의 아미노산 서열을 각각 포함하거나 또는 바람직하게 이들로 이루어진다.
바람직한 일 실시형태에서 상기 VLP는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP이다. Qβ의 캡시드 또는 바이러스-유사 입자는 직경 25 nm 및 T=3 콰시 대칭을 갖는 20면체의 파지-유사 캡시드 구조를 나타낸다. 캡시드는 피막 단백질의 180 카피를 함유하며, 이들은 디설파이드 가교에 의해 공유 펜타머 및 헥사머로 연결되어(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-5554 (1996)), Qβ 캡시드를 매우 안정하게 한다. 재조합 Qβ 피막 단백질에서 제조된 캡시드 또는 VLP는 그러나 캡시드내 다른 서브유닛과 디설파이드 본드를 통해 연결되어 있지 않거나 또는 불완전하게 연결된 서브유닛을 포함할 수 있다. Qβ의 캡시드 또는 VLP는 유기 용매 또는 변성제에 대해 특이한 저항성을 보인다. 놀랍게도 30%나 되는 고 농도의 DMSO나 아세토니트릴 및 1 M이나 되는 고농도의 구아니듐 농도도 캡시드의 안정성에 영향을 미치지 않는 것을 관찰하였다. 이러한 높은 Qβ의 캡시드 또는 VLP의 안정성은 특히 본 발명에 따른 포유동물 및 인간의 면역 및 백신에 사용되기에 매우 유용한 특징이 된다.
본 발명에 따른 바람직한 RNA-박테리오파지, 특히 RNA-박테리오파지 Qβ 및 RNA-박테리오파지 fr의 더 바람직한 바이러스-유사 입자들이 WO 제02/056905호에 개시된 바 있으며, 이러한 개시는 본 발명에 그대로 참조로 삽입된다. 특히 WO 제02/056905호의 실시예 18은 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP 제조에 대해 자세히 개시하고 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, VLP는 RNA-박테리오파지 AP205의 VLP이다. 아미노산 5 위치의 프롤라인이 트레오닌으로 치환된 AP205 피막 단백질, 또는 아미노산 위치 14의 아스파라긴이 아스파르트산으로 치환된 AP205 피막 단백질 등을 포함하는 AP205 VLPs의 어셈블리-컴피턴트(Assembly-competent) 돌연변이 형태들이 본 발명의 실시에 사용될 수 있으며, 본 발명의 다른 바람직한 실시형태가 된다. WO 제2004/007538호는 특히 실시예 1 및 2에서 AP205 피막 단백질을 포함하는 VLPs를 얻는 방법 및 특히 이들을 발현시키고 정제하는 방법을 개시하고 있다. WO 제 2004/007538호는 본 발명에 참조로 삽입된다. AP205 VLPs는 강한 면역원성을 가지며, 항원에 연결되어, 통상 및 바람직하게 배향되고 반복적인 방식으로 항원을 표시하는 백신 구조체를 생성할 수 있다. 이렇게 표시된 항원에 대해 높은 역가의 항체가 유발되며, 이는 연결된 항체가 면역 시스템, 특히 통상적이며 바람직하게 B-세포와 상호작용할 수 있으며, 따라서 면역원성임을 보여준다.
바람직한 일 실시형태에서, VLP는 바이러스, 바람직하게 RNA-박테리오파지의 돌연변이 피막 단백질을 포함하거나, 이로 이루어지며, 이때 돌연변이 피막 단백질은 하나 이상의 라이신 잔기가 치환 및/또는 결실에 의해 제거됨으로써 변경된다. 다른 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 VLP는 바이러스, 바람직하게 RNA-박테로오파지의 돌연변이 피막 단백질을 포함하거나, 이로 이루어지며, 이때 돌연변이 피막 단백질은 하나 이상의 라이신 잔기가 치환 및/또는 삽입에 의해 부가됨으로써 변경된다. 하나 이상의 라이신 잔기의 결실, 치환 또는 부가는 결합의 정도를 다양하게 하며, 즉 VLP, 바람직하게는 RNA-박테로오파지의 VLP의 서브유닛당 결합되는 항원의 양을 다양하게 한다. 따라서 특정 백신의 디자인에 요구되는 요건을 만족시킬 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 백신은 0.5 내지 4.0의 항원밀도를 가진다. "항원밀도"는 본 발명에서, VLP, 바람직하게 RNA-박테리오파지의 VLP의 서브유닛 당, 바람직하게 피막단백질 당 연결되는 항원 분자의 평균수를 지칭한다. 따라서 이 값은 본 발명의 조성물 또는 백신에서, 상기 VLP, 바람직하게 RNA-박테리오파지의 VLP의 모든 서브유닛에 대한 평균으로 산출된다.
VLP 또는 Qβ 피막 단백질의 캡시드는 그 표면에 특정수의 라이신 잔기를 나타내며, 세개의 라이신 잔기는 캡시드의 내부로 향하여 RNA와 작용하고, 네개의 다른 라이신 잔기는 캡시드 외부로 노출되는 형태로 존재한다. 바람직하게 하나 이상의 제1 부착부위는 VLP의 외부에 있거나 이에 향하는 라이신 잔기이다. 더욱 바람직하게 하나 이상의 제1 부착 부위는 VLP의 외부에 있거나 이에 향하는 라이신 잔기의 아미노기이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 부착부위는 RNA-박테리오파지 Qβ의 피막 단백질의 라이신 잔기의 아미노기이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 부착부위는 서열: 1의 라이신 잔기의 아미노기이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 상기 제1 부착 부위는 서열: 1의 위치 2, 13, 16, 46, 60, 63, 및 67의 라이신 잔기들 중 어느 하나의 아미노기이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서 상기 제1 부착부위는 캡시드의 외부에 노출된 라이신 잔기 중 어느 하나의 아미노기이다.
노출된 라이신 잔기가 아르기닌으로 치환된 Qβ 돌연변이가 본 발명에서 사용될 수 있다. 따라서 본 발명이 다른 바람직한 일 실시형태에서, 바이러스-유사 입자는 돌연변이 Qβ 피막 단백질을 포함하거나, 거의 이로 이루어지거나 또는 이들로 이루어진다. 바람직하게 이들 돌연변이 피막 단백질은 (a) Qβ-240 (서열: 15, 서열: 1의 Lys13-Arg); (b) Qβ-243 (서열: 16, 서열: 1의 Asn1O-Lys ); (c) Qβ-250 (서열:17, 서열: 1의 Lys2-Arg); (d) Qβ-251 (서열: 18, 서열: 1의 Lysl6- Arg); 및 (e) Qβ-259 (서열: 19, 서열: 1의 Lys2-Arg, Lysl6-Arg)로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이들로 이루어져 있다. 상기 Qβ 돌연변이 피막 단백질, 돌연변이 Qβ 피막 단백질 VLPs 및 캡시드 각각의 구축, 발현 및 정제는 WO 02/056905에 개시되어 있다. 특히 WO 02/056905의 실시예 8이 본원에 참조된다.
본 발명의 바람직한 다른 실시형태에서, 바이러스-유사 입자는 Qβ 돌연변이 피막 단백질 또는 이들의 돌연변이 또는 단편, 및 상응하는 A1 단백질을 포함하거나 또는 거의 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 바이러스-유사 입자는 돌연변이 피막단백질을 포함하거나, 거의 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지며, 피막단백질은 서열: 15, 16, 17, 18, 및 19 중에서 선택되는 어느 하나 및 상응하는 A1 단백질에서 선택된다.
또한 RNA-박테리오파지 피막 단백질은 박테리아 숙주에서의 발현에서 자가-조립되는 것으로 보여졌다 (Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. MoI. Biol. 249:283-297 (1995)). 특히 GA (Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5:2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271 :759-773(1997)) 및 fr (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883- 891 (1993), Liljas, L et al. J MoI. Biol. 244:279-290, (1994))의 생물학적 및 생화학적 성질이 개시되었다. 수개의 RNA-박테리오파지의 결정 구조가 결정되었다 (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). 이러한 정보를 이용하여, 표면에 노출된 잔기가 동정될 수 있으며, 따라서 RNA-박테리오파지의 피막 단백질을 변경하여 하나 이상의 반응성 아미노산잔기가 삽입 또는 치환으로 삽입될 수 있다. RNA-박테리오파지에서 유래된 VLPs의 다른 이점은 높은 박테리아에서의 발현 수율인데, 이는 다량의 물질을 적정한 경비로 제조할 수 있게 한다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 항원은 NGF 단백질이다. 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 : (a) 인간 NGF 단백질; (b) 개 NGF 단백질; (c) 고양이 NGF 단백질; (d) 마우스 NGF 단백질, 및 (e) 말 NGF 단백질로 이루어진 군에서 선택된다. 더욱 바람직한 실시형태에서, NGF 단백질은 인간 또는 다른 동물, 바람직하게는 포유동물의 NGF이며, 더욱 바람직하게 상기 NGF 단백질은 서열: 22 내지 25 및 32 내지 39 중에서 선택되는 어느 하나이다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 인간 NGF이다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, 인간 NGF는 서열: 22의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다. 다른 바람직한 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22와 80 % 이상, 또는 바람직하게 85 % 이상, 더욱 바람직하게 90 % 이상, 가장 바람직하게 95 % 이상 동등한 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어져 있다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22가 하나 이상 및 최대 20, 바람직하게는 하나 이상 또는 최대 10, 더욱 바람직하게는 하나 이상 및 최대 5개의 아미노산이 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 또는 이들의 조합으로 변경된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다.
더욱 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있고, 돌연변이될 아미노산 서열이 서열: 22이며, 돌연변이될 아미노산 서열이 하나 이상 및 최대 20, 바람직하게는 하나 이상 또는 최대 10, 더욱 바람직하게는 하나 이상 및 최대 5개 위치에서 변경되며, 상기 위치의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합으로 변경된다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22이 하나 이상 및 최대 20, 바람직하게는 하나 이상 또는 최대 10, 더욱 바람직하게는 하나 이상 및 최대 5개의 아미노산이 결실되어 변경된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22가 하나, 두개 또는 세개의 아미노산이 결실된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다.
더욱 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있고, 돌연변이될 아미노산 서열이 서열: 22이며, 최대 10, 9, 8. 7, 6, 5, 4개의 아미노산 잔기가 돌연변이될 아미노산 서열로부터 결실된다. 매우 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있고, 돌연변이될 아미노산 서열이 서열: 22이며, 3, 2, 또는 바람직하게 1개의 아미노산 잔기가 돌연변이될 아미노산 서열로부터 결실된다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22가 하나 이상 최대 및 최대 20, 바람직하게는 하나 이상 또는 최대 10, 더욱 바람직하게는 하나 이상 및 최대 5개의 아미노산이 삽입되어 변경된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22가 하나, 두개 또는 세개의 아미노산이 삽입되어 변경된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있고, 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이며, 최대 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 7, 6, 5, 또는 4개의 아미노산 잔기가 상기 돌연변이될 아미노산 서열에 삽입된다. 매우 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있고, 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이며, 3, 2, 또는 바람직하게 1개의 아미노산 잔기가 상기 돌연변이될 아미노산 서열에 삽입된다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22가 하나 이상 최대 및 최대 20, 바람직하게는 하나 이상 또는 최대 10, 더욱 바람직하게는 하나 이상 및 최대 5개의 아미노산이 치환, 바람직하게 보존적 치환으로 변경된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다.
더욱 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22가 하나, 두개 또는 세개, 네개, 다섯개, 여섯개, 일곱개, 여덟개, 아홉개 또는 열개의 아미노산 치환, 바람직하게 보존적 치환으로 변경된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다. 더욱 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 22가 하나, 두개 또는 세개의 아미노산 치환, 바람직하게 보존적 치환으로 변경된 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있고, 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이며, 돌연변이될 아미노산 서열의 최대 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8 7, 6, 5, 또는 4개의 아미노산 잔기가 아미노산 치환에 의해 교환되며, 바람직하게 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어져 있고, 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이며, 돌연변이될 아미노산 서열의 3, 2, 또는 바람직하게 1개의 아미노산 잔기가 아미노산 치환에 의해 교환되며, 바람직하게 상기 아미노산 치환은 보존적 아미노산 치환이다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 인간 NGF 전구체이다. 더 바람직한 일 실시형태에서, 인간 NGF 전구체는 서열: 23의 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다. 다른 바람직한 일 실시형태에서, NGF 단백질은 서열: 23과 80 % 이상, 바람직하게 85 % 이상, 더 바람직하게 90 % 이상, 가장 바람직하게 95 % 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 항원은 NGF 단편이며, 상기 NGF 단편은 하나 이상의 에피토프를 포함하거나 바람직하게 이로 이루어진다. 단백질의 에피토프를 결정하는 방법은 본 기술분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. PCT/EP2005/004980는 이들 중 몇가지 방법을 26페이지 첫 문단에서 27페이지 4번째 문단까지 기재하였으며, 이들 기재는 본 명세서에 참조로 삽입된다. 이들 방법은 일반적으로 다른 폴리펩타이드 항원에도 적용되며, 따라서 PCT/EP2005/004980에 개시된 바의 19페이지 IL-23에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태는, NGF 항원이 NGF 단편이다. 더 바람직한 실시형태에서, NGF 단편은 서열: 22의 인간 NGF의 8개 이상, 바람직하게는 12개 이상, 더 바람직하게는 20개 이상, 더욱 바람직하게는 30개 이상의 인접하는 아미노산들을 포함하거나, 또는 바람직하게 이들로 이루어진다. 더 바람직한 실시형태에서, NGF 단편은 서열: 22의 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 개의 인접하는 아미노산들로 이루어지며, 바람직하게 상기 NGF 단편은 서열: 22의 10개의 인접하는 아미노산들로 이루어지며, 더 바람직하게 상기 NGF 단편은 서열: 22의 10개의 N-말단 아미노산들로 이루어진다. 따라서, 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 단편은 서열: 44의 아미노산 서열로 이루어진다.
바람직한 일 실시형태에서, NGF 항원은 NGF 뮤테인이며, 바람직하게 상기 뮤테인은 감소된 생물학적 활성을 포함하며, 더 바람직하게 상기 NGF 뮤테인은 면역원성 콘쥬게이트의 형태로 동물에 투여시 중화항체를 유도할 수 있다. 매우 바람직한 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 생물학적 활성을 포함하지 않으며, 상기 NGF 뮤테인은 면역원성 콘쥬게이트의 형태로 동물에 투여시 중화항체를 유도할 수 있다.
더 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어지며, 이때 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이고, 돌연변이될 아미노산 서열이 하나 이상 최대 9개, 바람직하게는 하나 이상 최대 3개, 더 바람직하게는 하나 이상 최대 2개 가장 바람직하게는 정확히 한 위치에서 변경되며, 상기 위치의 아미노산 잔기가 치환 또는 결실, 가장 바람직하게는 치환에 의해 변경된다.
더 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 돌연변이 아미노산 서열로 이루어지며, 이때 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이고, 돌연변이될 아미노산 서열이 하나 이상 최대 9개 위치에서 변경되며, 상기 위치의 아미노산 잔기가 서열: 22에서 결실되고, 더 바람직하게 상기 결실된 아미노산 잔기는 서열: 22의 1 내지 9의 아미노산 잔기에서 선택되며, 더 바람직하게는 상기 결실되는 아미노산 잔기는 서열: 22의 아미노산 잔기들 4 H, 5 P, 7 F 또는 8 H에서 선택된다(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Woo, S.B. and K.E. Neet J Biol Chem, 1996. 271(40): p. 24433-41; and Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8). 매우 바람직한 일 실시형태에서, 상기 NGF 뮤테인은 서열: 45로 이루어진다.
더 바람직한 일 실시형태에서, 상기 NGF 뮤테인은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어지며, 이때 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이고, 돌연변이될 아미노산 서열이 하나 이상 최대 3개, 바람직하게는 하나 이상 최대 2개, 가장 바람직하게는 정확히 한 위치에서 변경되며, 상기 위치의 아미노산 잔기가 치환에 의해 변경된다.
더 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어지며, 이때 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이고, 돌연변이될 아미노산 서열이 하나 이상 최대 3개, 바람직하게는 하나 이상 최대 2개, 가장 바람직하게는 정확히 한 위치에서 변경되며, 상기 위치의 아미노산 잔기가 치환에 의해 변경되고, 상기 치환되는 아미노산 잔기는 서열: 22의 4 H, 5 P, 7 F 또는 8 H 아미노산 잔기 중에서 선택된다 (Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Woo, S.B. and K.E. Neet J Biol Chem, 1996. 271(40): p. 24433-41; and Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8). 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 서열: 46 내지 52 중 어느 하나로 이루어진다.
더 바람직한 일 실시형태에서, 상기 NGF 뮤테인은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어지며, 이때 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이고, 돌연변이될 아미노산 서열이 하나 이상 최대 3개, 바람직하게는 하나 이상 최대 2개, 가장 바람직하게는 정확히 한 위치에서 변경되며, 상기 위치의 아미노산 잔기가 치환에 의해 변경되고, 상기 치환되는 아미노산 잔기는 서열: 22의 43 내지 45, 48 및 49 아미노산 잔기 중에서 선택된다(Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8, and Xie, Y., et al. J Biol Chem, 2000. 275(38): p. 29868-74). 매우 바람직한 일 실시형태에서, 상기 NGF 뮤테인은 서열: 53 내지 60 중 어느 하나로 이루어진다.
더 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어지며, 이때 돌연변이될 아미노산 서열은 서열: 22이고, 돌연변이될 아미노산 서열이 하나 이상 최대 3개, 바람직하게는 하나 이상 최대 2개, 가장 바람직하게는 정확히 한 위치에서 변경되며, 상기 위치의 아미노산 잔기가 치환에 의해 변경되고, 상기 치환되는 아미노산 잔기는 서열: 22의 94G, 95K 및 96Q 아미노산 잔기 중에서 선택된다 (Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Beglova, N., et al. J Biol Chem, 1998. 273(37): p. 23652-8, and Xie, Y., et al. J Biol Chem, 2000. 275(38): p. 29868-74). 매우 바람직한 일 실시형태에서, 상기 NGF 뮤테인은 서열: 61 내지 66 중 어느 하나로 이루어진다.
더 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 서열: 22에서 정확히 한 위치의 아미노산 잔기가 치환에 의해 변경된 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 치환되는 아미노산 잔기는 75 H, 84 H, 100 R, 111 V, 112 L, 114 R, 115 K, 113 S 중에서 선택되는 어느 하나이다 (Kullander, K. et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7; Larsson, E. et al. Neurobiol Dis, 2008, Kruttgen, A., et al. J Biol Chem, 1997. 272(46): p. 29222-8). 매우 바람직한 일 실시형태에서, 상기 NGF 뮤테인은 서열: 67 내지 74 중 어느 하나로 이루어진다.
더 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 서열: 22에서 정확히 2 위치의 아미노산 잔기가 치환에 의해 변경된 돌연변이 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 상기 치환되는 아미노산 잔기는 75 H 및 84 H (Kullander et al. J Biol Chem, 1997. 272(14): p. 9300-7)이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 NGF 뮤테인은 서열: 75로 이루어진다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 조성물은 (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자; 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원;을 포함하거나 거의 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어지며, 상기 조성물에서 상기 하나 이상의 항원은 NGF 항원이며; (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되며, 여기에서 상기 연결은 하나 이상의 펩타이드 결합, 바람직하게는 배타적으로 펩타이드 결합에 의한 것이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자 및 하나 이상의 항원은 유전적 융합(genetic fusion)으로 연결된다. NGF 항원을 코딩하는 유전자는 VLP의 피막 단백질을 코딩하는 유전자 내부에 또는 바람직하게 N- 말단 또는 C-말단에 인-프레임 리게이션(in-frame ligated)되어 있다. 서열 중 일부가 결실된 피막 단백질의 돌연변이(이하, 절단 돌연변이로 지칭)내로 NGF 항원 서열을 삽입함으로써 융합을 구동시킬 수 있다. 절단 돌연변이는 피막 단백질의 일부 서열이 N- 또는 C-말단 또는 내부에서 결실될 수 있다. 융합 단백질은 바람직하게 발현시 VLP내로 에셈블리하는 능력을 보유하며, 이는 전자현미경으로 관찰될 수 있다.
플랭킹 아미노산 잔기(Flanking amino acid residues)를 NGF 항원에 부가하여 피막 단백질 및 NGF 항원간의 거리를 증가시킬 수 있다. 글라이신 및 세린 잔기는 특히 플랭킹 서열에 빈번히 사용되는 아미노산 잔기이다. 이러한 플랭킹 서열은 융합 구조체에 추가적인 유연성을 부여한다. 이는 VLP 서브 유닛의 서열내로 융합되는 외래 서열의 잠재적인 불안정화 효과를 없애며, 따라서 외래 서열의 VLP 어셈블리에 대한 간섭을 소멸시킨다.
다른 실시형태에서, NGF 항원은 다수의 다른 바이러스 피막 단백질, 예컨대 Qβ의 A1 단백질의 절단 형태의 C-말단에 융합될 수 있다 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39:9-15 (1996)). 또는 NGF 항원은 CP 확장의 72 및 73 위치 사이에 삽입될 수 있다. 예컨대 Kozlovska 등은 (Intervirology, 39: 9-15 (1996)) QβA1 단백질 융합을 기술한 바 있으며, 이때 에피토프는 19위치에서 절단된 QβCP 확장의 C-말단에서 융합된다. 다른 예로서, NGF 항원은 fr CP의 2 및 3 아미노산 사이에 삽입될 수 있다 (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)). 또한 NGF 항원은 RNA-박테리오파지 MS-2 피막 단백질의 N-말단의 융기된 β-헤어핀에 융합될 수 있다 (WO 92/13081). 또는 NGF 항원은 파필로마바이러스의피막단백질에, 바람직하게는 소 파필로마바이러스 타입 1(BPV-I)의 주 피막 단백질 L1에 융합될 수 있다 (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955). BPV-1 L1의 130-136 아미노산의 NGF 항원으로의 치환 또한 본 발명의 일 실시형태이다. NGF 항원을 바이러스의 피막 단백질 또는 그 돌연변이 또는 단편에 융합한 다른 실시형태들이 WO 2004/009124의 62 페이지 20줄 내지 68페이지 17줄에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 삽입된다.
다른 바람직한 일 실시형태에서, NGF 항원은 RNA-박테리오파지 AP205의 피막 단백질 또는 그 돌연변이 또는 단편의 N-말단 또는 C-말단에 융합하고, 바람직하게 상기 피막 단백질 또는 돌연변이 또는 그 단편은 서열: 14 및 40 내지 42 중 어느 하나, 가장 바람직하게는 서열: 41의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이로 이루어진다.
더 바람직한 일 실시형태에서, 융합 단백질은 추가적으로 스페이서(spacer)를 포함하며, 상기 스페이서는 RNA-박테리오파지 AP205의 피막 단백질 또는 그 돌연변이 또는 단편과 상기 NGF 항원 사이에 위치한다. 바람직하게는 상기 스페이서는 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5개 이하의 아미노산으로 구성된다. 매우 바람직하게 상기 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산으로 구성된다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 조성물은 (a) 하나 이상의 제1 부착부위를 갖는 바이러스-유사 입자; 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 NGF 항원을 포함하거나 또는 거의 이들로 이루어지거나 또는 이들로 이루어지며, 상기 (a) 및 (b)는 하나 이상의 제1 부착 부위 및 제2 부착 부위를 통해 연결되고, 상기 연결은 하나 이상의 비-펩타이드성 공유결합을 통해 이루어지며, 바람직하게 상기 제1 부착 부위는 설프하이드릴기가 아니거나 또는 이를 포함하지 않으며, 더욱 바람직하게 상기 제1 부착부위는 시스테인의 설프하이드릴기가 아니거나 또는 이를 포함하지 않는다.
바람직한 일 실시형태에서 제1 부착부위는 아미노기, 바람직하게는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나 또는 바람직하게 아미노기, 바람직하게는 라이신 잔기의 아미노기이다. 더 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 부착부위는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나 바람직하게 라이신 잔기의 아미노기이고, 상기 라이신 잔기는 VLP에 포함되는 재조합 피막 단백질의 라이신 잔기이다. 더 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 부착부위는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나 바람직하게 라이신 잔기의 아미노기이고, 상기 라이신 잔기는 VLP에 포함되는 RNA 박타레이파지의 재조합 피막 단백질의 라이신 잔기이다.
더 바람직한 일 실시형태에서 제1 부착부위를 갖는 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지, 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사입자이고, 제1 부착부위는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나 바람직하게 라이신 잔기의 아미노기이며, 바람직하게 라이신 잔기는 재조합 피막 단백질, 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 재조합 피막 단백질의 라이신 잔기이며, 상기 재조합 피막 단백질은 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사입자에 포함된다.
더 바람직한 일 실시형태에서 하나 이상의 제1 부착부위를 갖는 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지, 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 재조합 피막 단백질, 돌연변이 또는 이들의 단편을 포함하거나, 거의 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지며, 제1 부착부위는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나 바람직하게 라이신 잔기의 아미노기이며, 바람직하게 라이신 잔기는 RNA-박테리오파지 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 재조합 피막 단백질, 돌연변이, 또는 이들의 단편에 포함된 라이신 잔기이다.
더 바람직한 일 실시형태에서, 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질을 포함하거나, 거의 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지며, 재조합 피막 단백질은 서열: 1의 아미노산서열을 포함하거나 또는 바람직하게 이 서열로 이루어지며, 제1 부착부위는 서열: 1의 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나 바람직하게 라이신 잔기의 아미노기이다.
다른 바람직한 본 발명의 실시형태에서, 제2 부착 부위는 설프하이드릴기, 바람직하게는 시스테인 잔기의 설프하이드릴기이거나 또는 이를 포함한다. 매우 바람직한 본 발명의 일 실시형태에서, 하나 이상의 제1 부착부위는 아미노기, 바람직하게는 라이신 잔기의 아미노기이고, 하나 이상의 제2 부착부위는 설프하이드릴기, 바람직하게는 시스테인 잔기의 설프하이드릴기이다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, NGF 항원은 VLP에 화학적 교차-연결, 통상적으로 그리고 바람직하게 헤테로-2기능성 크로스 링커(hetero-bifunctional cross-linkers)를 사용하여 연결된다. 바람직한 실시형태에서, 헤테로-2 기능성 크로스 링커는 바람직한 제1 부착 부위, 바람직하게는 아미노기, 더 바람직하게는 VLP의 라이신 잔기의 아미노기와 반응할 수 있는 기능기 및 바람직한 제2 부착 부위, 즉 설프하이드릴기, 바람직하게는 NGF 항원에 내재하거나 또는 인공적으로 추가된 시스테인 잔기의 설프하이드릴기와 반응할 수 있는 추가적인 기능기를 포함하며, 임의로 환원에 의한 반응에 사용될 수 있도록 한다. 수개의 헤테로-2 기능성 크로스 링커가 본 기술분야에 공지되어 있다. 이들은 바람직한 크로스-링커들인 SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 및 기타 Pierce Chemical Company 등으로부터 입수될 수 있는 기타 크로스-링커들을 포함하며, 이들은 아미노기에 반응성인 기능기와 설프하이드릴기에 반응성인 기능기를 갖는다. 상술된 크로스-링커들은 모두 아미노기와의 반응후 아미드 결합을 형성하고 설프하이드릴기와 티오에테르 결합을 형성한다. 본 발명의 시행에 적합한 다른 클래스의 크로스-링커들은 결합시 NGF 항원 및 VLP 사이에 디설파이드 결합을 도입하는 것을 특징으로 한다. 이 클래스에 속하는 바람직한 크로스-링커로는, 예컨대, SPDP 및 Sulfo-LC-SPDP (Pierce) 등을 들 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 추가적으로 링커를 포함한다. 제2 부착부위를 NGF 항원내로 도입하는 것은,바람직하게 본 발명의 개시에 따라 제2 부착부위로서 적합한 하나 이상의 아미노산을 포함하는 링커의 연합에 의해 성취된다. 따라서 본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 링커는 하나 이상의 공유결합, 바람직하게 하나 이상의 통상 하나의 펩타이드 결합에 의해 NGF 항원에 연합된다. 바람직하게 링커는 제2 부착 부위를 포함하거나, 또는 이로 이루어져 있다. 더 바람직한 일 실시형태에서, 링커는 설프하이드릴기, 바람직하게 시스테인 잔기의 설프하이드릴기를 포함한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 아미노산 링커는 시스테인 잔기이다. 더 바람직한 실시형태에서, 아미노산 링커는 CGG- 또는 GCG-링커, 바람직하게 CGG-링커이다. 본 발명의 목적에 적합한 링커는 WO2005/108425 A1, 32-33 페이지에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 발명에 참조로 삽입된다.
상술한 바람직한 방법에 따라 헤테로-2 기능성 크로스-링커를 사용해 NGF 항원을 VLP에 결합함으로써 NGF 항원을 VLP에 일정하게 배향된 형식으로 결합시킬 수 있다. NGF 항원을 VLP에 결합하는 다른 방법으로는 카보디미드 EDC 및 NHS를 사용해 NGF 항원을 VLP에 교차결합하는 것이다. NGF 항원을 먼저 예컨대 SATA, SATP 또는 이미노티올란과 반응시켜 티올화할 수 있다. NGF 항원을 필요한 경우 탈보호한후 다음과 같이 VLP와 결합시킬 수 있다. 과잉의 티올화 시약을 분리한 후, NGF 항원은 VLP와 반응시키며, VLP는 시스테인 반응성 부분을 포함하는 헤테로-2 기능성 크로스-링커로 미리 활성화되어 시스테인 잔기에 대해 반응성인 하나 이상의 기능기를 나타내며, 이에 티올화 NGF 항원이 상술한 바와 같이 반응할 수 있다. 임의로 소량의 환원제가 반응 혼합물내 포함된다. 추가적인 방법에서, NGF 항원은 VLP의 아민기나 카복실기에 반응성인 기능기를 갖는 글루타랄데하이드(glutaraldhyde), DSG, BM[PEO]4, BS3 (Pierce)와 같은 호모-2 기능성 크로스-링커 또는 다른 공지된 호모-2 기능성 크로스-링커를 사용하여 VLP에 부착된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 본 조성물은 화학적 상호작용을 통해 NGF 항원에 연결된 바이러스-유사 입자를 포함하거나 또는 거의 이로 이루어지며, 이들 상호작용 중 하나 이상은 공유결합이 아니다. 이러한 상호작용은 항원-항체 상호작용, 수용체-리간드 상호작용 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. VLP를 NGF 항원에 연결하는 것은 VLP를 비오틴화하고 NGF 항원을 스트렙타비딘-융합 단백질로서 발현하는 것에 의해 시행될 수 있다.
하나 또는 수개의 항원 분자, 즉 NGF 항원은 VLP의 한 서브유닛, 바람직하게는 RNA-박테리오파지의 피막 단백질의 한 서브유닛에, 공간적으로 허용가능한 경우, RNA-박테리오파지의 VLP의 피막 단백질의 노출된 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다. RNA-박테리오파지의 VLP, 특히 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP의 특징은 서브유닛당 수개의 항원을 결합시킬 수 있다는 것이다. 따라서 밀집된 항원 어레이를 생성할 수 있다.
본 발명의 매우 바람직한 일 실시형태에서, NGF 항원은, NGF 항원의 N-말단 또는 C-말단에 미리 첨가되거나 또는 내재되어 있는 시스테인 잔기를 통해, RNA-박테리오파지의 VLP의 피막 단백질, 특히 RNA-박테리오파지 Qβ의 피막 단백질의 라이신 잔기에 연결된다.
상술한 바와 같이, 4개의 라이신 잔기가 Qβ 피막 단백질의 VLP 표면에서 노출되어 있다. 통상적으로 그리고 바람직하게 이들 잔기는 크로스-링커 분자와의 반응시 유도화된다. 모든 노출된 라이신이 항원과 결합될 수 없는 경우, 크로스-링커와 반응한 라이신 잔기는 유도화 단계 이후 ε-아미노기에 부착된 크로스-링커 분자와 함께 남는다. 이는 하나 이상의 양전하를 소멸시키며, 이는 VLP의 용해도나 안정성에 유해할 수 있다. 개시된 Qβ 피막 단백질 돌연변이에서와 같이, 라이신 잔기의 일부를 아르기닌으로 대체함으로써, 과잉의 양전하 소멸을 예방할 수 있는데, 아르기닌 잔기는 바람직한 크로스-링커와 반응하지 않기 때문이다. 또한 라이신 잔기를 아르기닌 잔기로 대체함으로써 더욱 한정된 항원 어레이를 얻게 되며, 항원과 반응할 수 있는 부위의 수가 줄어든다.
따라서 노출된 라이신 잔기는, 하기 Qβ 피막 단백질 돌연변이에서, 아르기닌으로 대체되었다: Qβ-240 (Lysl3-Arg; 서열: 15), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lysl3- Arg; 서열: 17), Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lysl6-Arg; 서열: 19) 및 Qβ-251; (Lysl6- Arg, 서열: 18). 추가적인 실시형태에서, 하나의 추가적인 라이신 잔기를 갖는 RNA-박테리오파지 Qβ의 돌연변이 피막 단백질 Qβ-243 (Asn 10-Lys; 서열: 16)을 개시하였으며, 이는 RNA-박테리오파지 Qβ의 야생형 피막 단백질(서열: 1) 보다 더 높은 밀도의 항원 어레이를 얻기에 적합하다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 바이러스-유사 입자는 숙주에 의해 재조합적으로 생산되고, 이 바이러스-유사 입자는 본질적으로 숙주 RNA가 없으며, 바람직하게 바이러스-유사 입자는 숙주 핵산이 본질적으로 없으며, 바람직하게 상기 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 본 조성물은 VLP에 결합되는, 바람직하게는 VLP내로 패키징되거나 봉입되는 하나 이상의 폴리음이온성 매크로분자를 더 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파지, 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사 입자이며, 상기 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자는 바람직하게 RNA-박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사 입자는 숙주에 의해 재조합적으로 생산되며, 상기 RNA-박테리오파지, 바람직하게 RNA-박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사 입자는 본질적으로 숙주 RNA가 없으며, 상기 조성물은 하나 이상의 폴리음이온성 매크로분자를 더 포함하며, 상기 하나 이상의 폴리음이온성 매크로분자는 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자내로, 바람직하게는 RNA-박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사 입자내로 패키징된다. 더 바람직한 일 실시형태에서, 상기 폴리음이온성 매크로분자는 폴리글루탐산 및/또는 폴리아스파르트산이며, 바람직하게는 폴리글루탐산이다.
본 발명에서, "본질적으로 숙주 RNA, 바람직하게는 숙주 핵산이 없는"은 VLP에 포함되는 숙주 RNA, 바람직하게는 숙주 핵산의 양이 통상 그리고 바람직하게 VLP mg 당 30 μg 이하, 바람직하게는 20 μg 이하, 더 바람직하게는 10 μg 이하, 더욱 바람직하게는 8 μg 이하, 매우 바람직하게 6 μg 이하, 보다 바람직하게 4 μg 이하, 가장 바람직하게 2 μg 이하이다. 가장 바람직하게, VLP 또는 본 발명의 조성물에 포함되는 숙주 RNA, 바람직하게 숙주 핵산은 검출 한계 이하로 존재한다. 상술된 맥락에서 사용되는 숙주는, VLP가 재조합적으로 생산되는 숙주를 의미하며, 상기 숙주는 통상 그리고 바람직하게 대장균(E. coli)이다. RNA, 바람직하게 핵산의 양을 측정하는 통상적인 방법은 숙련가에게 공지되어 있다. 본 발명에 따라 RNA, 바람직하게 핵산의 양을 측정하는 통상적이고 바람직한 방법은 WO2006/037787A2의 실시예 17에 개시되어 있다. Qβ이외의 VLP를 함유하는 발명 조성물에 대해서는 상기 RNA, 바람직하게 핵산의 양을 측정하는 방법을 동일하거나, 유사한 조건하에서 실시함으로써 측정될 수 있다. 필요로 하는 조건의 변경은 숙련가의 지식 범위내이다. 측정되는 양의 수치는 통상 그리고 바람직하게 표시 숫자 ± 10%, 바람직하게 ± 5%의 오차 범위의 수치를 포함한다.
숙주 RNA, 바람직하게 숙주 핵산: "숙주 RNA, 바람직하게 숙주 핵산"은 원래 숙주에 의해 합성되는 RNA, 또는 바람직하게 핵산을 지칭한다. 그러나 RNA, 바람직하게 핵산은, 예를 들면 본 발명의 방법에 의해 RNA, 바람직하게 핵산에 핵산의 크기를 줄이거나 그 2차 구조를 변경하는 등으로, RNA, 바람직하게 핵산의 양을 감소시키거나 제거하는 과정 동안 화학적 및/또는 물리적 변화를 겪는다. 숙주 RNA 또는 핵산은 또한 이들 분해 산물들을 포함한다.
숙주 RNA 또는 바람직하게 숙주 핵산의 양을 줄이거나 제거하는 것은 염증성 T 세포 반응이나 세포독성 T 세포 반응과 같은 원하지 않는 T 세포 반응, 및 열과 같은 원하지 않은 기타 부작용을 최소화하거나 줄이면서, 항원에 대해서는 강력한 항원 반응을 유지시킨다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 제법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 VLP를 제공하는 단계; (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 NGF 항원을 제공하는 단계; 및 (c) 상기 VLP 및 NGF를 결합하여 조성물을 제조하는 단계, 여기에서 NGF 항원과 상기 VLP는 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결된다. 더 바람직한 실시형태에서, 상기 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 VLP를 제공하는 단계는 하기 단계를 더 포함한다: (a) 상기 바이러스-유사 입자, 바람직하게 RNA-박테리오파지의 바이러스-유사 입자를 해체하여 피막 단백질, 그 돌연변이 또는 단편을 얻는 단계, (b) 피막 단백질, 그 돌연변이 또는 단편을 정제하는 단계; (c) 정제된 피막 단백질, 그 돌연변이 또는 단편을 바이러스-유사 입자로 재조립하는 단계, 여기에서 바이러스-유사 입자는 본질적으로 숙주 RNA, 바람직하게 숙주 핵산이 없다. 더 바람직한 일 실시형태에서, 상기 정제된 피막 단백질의 재조립은 하나 이상의 폴리음이온성 매크로분자의 존재하에 시행된다. 하나 이상의 폴리음이온성 매크로분자의 존재하에 RNA-박테리오파지의 피막 단백질을 재조립하는 방법은, 예컨대 WO2006/037787A2에 개시되어 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료적으로 유효량의 본 발명의 조성물들 중 어느 하나를 포함하거나 또는 이로 이루어진 백신 조성물을 제공한다.
바람직한 일 실시형태에서, 백신 조성물은 하나 이상의 어쥬번트(adjuvant)를 더 포함한다. 하나 이상의 어쥬번트의 투여는 본 발명의 조성물의 투여 전, 또는 동시에, 또는 후에 시행될 수 있다. "어쥬번트"는 본 발명의 백신 조성물 또는 약학적 조성물 각각과 배합시 숙주에서 데폿(depot)을 생성하여 더욱 증강된 면역 반응을 나타내게 하는 물질 또는 비특이적 면역 반응 자극제를 지칭한다. 하나 이상의 어쥬번트의 예로서, 완전 또는 불완전 프로인트 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄염 및 개질 뮤라밀디펩타이드(muramyldipeptide)를 들 수 있다. 추가적인 어쥬번트는 알루미늄 하이드록사이드와 같은 광물성 겔, 리소레시틴과 같은 계면활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanins), 디니트로페놀, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐과 같은 잠재적으로 유용한 인간 어쥬번트를 들 수 있다. 이러한 어쥬번트들은 본 기술분야에 매우 잘 알려져 있다. 본 발명 조성물과 함께 투여될 수 있는 다른 어쥬번트는 비제한적인 예로, 모노포스포릴 지질 면역조절제, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, 알루미늄염 (Alum), MF-59, OM- 174, OM- 197, OM-294, 및 비로조말 어쥬번트 테크놀로지 등을 포함한다. 더 추가적인 어쥬번트로는 면역증강 핵산을 포함하며, 바람직하게 면역증강 핵산은 골격에서 하나 이상의 변경, 바람직하게는 포스포로티오에이트 변경을 포함한다. 이러한 변경은 핵산을 분해에 대해 안정화시킨다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 백신 조성물은 어쥬번트가 없다. 본 발명 조성물의 유용한 특징은 어쥬번트가 없는 경우에도 높은 면역원성을 나타낸다는 것이다. 따라서 본 백신 조성물은 환자에게, 바람직하게 본 조성물의 투여전, 동시 또는 후 동일 환자에 하나 이상의 어쥬번트를 투여하지 않고, 투여된다. VLP는 일반적으로 어쥬번트로서 기술되어 왔다. 그러나, 본 발명에서의 "어쥬번트"는 본 발명의 조성물에서 사용되는 VLP가 아니라, VLP이외의 어쥬번트를 지칭한다.
수용자 개체가 투여된 본 발명의 백신 조성물을 견딜 수 있는 경우, "약학적으로 허용가능하다"고 지칭된다. 나아가 본 백신 조성물은 "치료적으로 유효한 양" 즉, 원하는 생리학적 효과를 발생시키는 양으로 투여된다. 본 발명에서, 원하는 생리적 효과는 통상 그리고 바람직하게 통증의 억제 또는 경감을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물 또는 백신 조성물과 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 바람직한 일 실시형태에서 상기 약학적 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의 조성물을 포함한다. 본 조성물 또는 백신 조성물은 개인에 투여될 때, 염, 버퍼, 어쥬번트 또는 콘쥬게이트의 효능을 개선하는데 요망되는 기타 물질을 포함하는 형태로 투여될 수 있다. 본 약학적 조성물의 제조에 사용되기 적합한 물질의 예는 레밍턴의 약제학을 포함하는 수많은 문헌에 제공되어 있다(Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990)). 약학적 조성물의 추가적 성분은 멸균수(예, 생리식염수) 또는 비수성 용액 및 현탁액을 포함한다. 비-수성 용액의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 및 에틸올레이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르 등을 들 수 있다. 담체 또는 밀봉 드레싱도 피부 침투성을 증가시키고 항원 흡수를 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 바람직하게 NGF 항원에 대한 면역 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 조성물, 백신조성물, 또는 약학적 조성물을 동물, 바람직하게 인간에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 동물은 바람직하게 마우스, 원숭이, 침판지, 개, 고양이, 말 등과 같은 포유류이며, 특히 인간이다. 본 조성물, 백신조성물, 또는 약학적 조성물은 동물, 바람직하게 인간에 본 기술분야 공지의 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 통상적으로 그리고 바람직하게, 본 조성물, 백신조성물, 또는 약학적 조성물은 동물, 바람직하게 인간에 주사, 주입, 흡입 또는 경구로 투여된다. 더 바람직하게 본 조성물, 백신조성물, 또는 약학적 조성물은 근육내, 정맥내, 경점막, 경피, 경비, 복강 또는 피하로 투여된다.
일 측면에서, 본 발명은 특히 통증의 예방 또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 조성물, 백신조성물, 또는 약학적 조성물을 동물, 바람직하게 인간에, 특히 통증으로 고통받는 동물, 바람직하게 인간에, 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증은 침해성 통증이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증은 만성 염증성 통증이다. 더 바람직한 일 실시형태에서 상기 침해성 통증은 골관절염 통증, 류마티스 관절염 통증, 암 통증, 내장통, 만성 요통, 또는 만성 두통, 췌장염 통증, 방광염 통증 또는 전립선염 통증이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증의 골암 통증이다. 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증은 손상에 의해 유발된다.
바람직한 일 실시형태에서, 상기 통증은 신경변성 통증이며, 이는 예를 들어 손상으로 인한 신경 압박/신경 외상, 헤르페스후 신경통과 같은 신경세포의 감염, 뇌졸중 또는 퇴행성 신경성 질환 또는 환지통과 같은 상태에 의해 유발된다.
본 발명의 추가적인 일면은 본 조성물, 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 의약품으로 사용하는 것이다.
다른 일면에서, 본 발명은 본 조성물, 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 동물, 바람직하게는 인간의 통증 치료용 의약품의 제조에 사용하는 용도를 제공하는 것으로, 바람직하게 상기 통증은 침해성 통증 또는 신경변성 통증이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증은 만성 염증성 통증이다. 더 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증은 골관절염 통증, 류마티스 관절염 통증, 암 통증, 내장통, 만성 요통, 또는 만성 두통, 췌장염 통증, 방광염 통증 또는 전립선염 통증이다. 매우 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증의 골암 통증이다. 바람직한 일 실시형태에서 상기 통증은 손상에 의해 유발된다.
다른 일 측면에서, 본 발명은 동물, 바람직하게는 인간의 통증을 치료하기 위한, 상술한 조성물, 백신 조성물 또는 약학적 조성물을 제공하며, 더 바람직하게 상기 조성물, 백신 조성물 또는 약학적 조성물은 동물, 바람직하게 인간에 투여되며, 더 바람직하게 상기 통증은 침해성 통증 또는 신경변성 통증이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하거나, 거의 하기로 이루어지거나, 또는 바람직하게 하기로 이루어지는 조성물에 관한 것이다: (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP), 여기에서 상기 VLP는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP이다; 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원;을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 항원이 NGF 단백질 및 링커를 포함하며, 바람직하게 NGF 단백질은 서열: 22로 이루어진다; 및 (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되고, 제1 부착부위는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP의 라이신 잔기의 아미노기이고, 제2 부착부위는 상기 링커에 포함되며, 상기 링커는 펩타이드 결합에 의해 NGF 단백질에 융합되며, 상기 제2 부착부위는 시스테인의 설프하이드릴기이며; 바람직하게 상기 제1 부착부위 및 제2 부착부위는 헤테로-2 기능성 크로스 링커, 바람직하게 SMPH로 연결된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하거나, 거의 하기로 이루어지거나, 또는 바람직하게 하기로 이루어지는 조성물에 관한 것이다: (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP), 여기에서 상기 VLP는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP이다; 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원;을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 항원이 NGF 단편 및 링커를 포함하며, 바람직하게 NGF 단편은 서열: 44로 이루어진다; 및 (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되고, 제1 부착부위는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP의 라이신 잔기의 아미노기이고, 제2 부착부위는 상기 링커에 포함되며, 상기 링커는 펩타이드 결합에 의해 NGF 단백질에 융합되며, 상기 제2 부착부위는 시스테인의 설프하이드릴기이며; 바람직하게 상기 제1 부착부위 및 제2 부착부위는 헤테로-2 기능성 크로스 링커, 바람직하게 SMPH로 연결된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하거나, 거의 하기로 이루어지거나, 또는 바람직하게 하기로 이루어지는 조성물에 관한 것이다: (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP), 여기에서 상기 VLP는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP이다; 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원;을 포함하고, 여기에서 상기 하나 이상의 항원이 NGF 뮤테인 및 링커를 포함하며, 바람직하게 NGF 뮤테인은 서열: 45 내지 75 중 어느 하나로 이루어진다; 및 (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되고, 제1 부착부위는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP의 라이신 잔기의 아미노기이고, 제2 부착부위는 상기 링커에 포함되며, 상기 링커는 펩타이드 결합에 의해 NGF 단백질에 융합되며, 상기 제2 부착부위는 시스테인의 설프하이드릴기이며; 바람직하게 상기 제1 부착부위 및 제2 부착부위는 헤테로-2 기능성 크로스 링커, 바람직하게 SMPH로 연결된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하거나, 본질적으로 하기로 이루어지거나, 또는 바람직하게 하기로 이루어진 조성물에 관한 것이다: (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자 (VLP), 여기에서 VLP는 서열: 1을 포함하거나 바람직하게 이로 이루어져 있다; 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원, 여기에서 상기 하나 이상의 항원이 NGF 항원 및 링커를 포함하며, NGF 항원은 (i) NGF 단백질, 바람직하게 서열: 22; (ii) NGF 단편, 바람직하게 서열: 44; 및 (iii) NGF 뮤테인, 바람직하게 서열: 45 내지 75 중 어느 하나;로 구성된 군에서 선택되고; 여기에서 (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되고, 제1 부착부위는 서열: 1의 라이신 잔기의 아미노기이고, 제2 부착부위는 상기 링커에 포함되며, 상기 링커는 펩타이드 결합에 의해 NGF 항원에 융합되며, 상기 제2 부착부위는 시스테인의 설프하이드릴기이며; 바람직하게 상기 제1 부착부위 및 제2 부착부위는 헤테로-2 기능성 크로스 링커, 바람직하게 SMPH로 연결된다.
일 실시형태에서, 본 발명은 하기를 포함하거나, 본질적으로 하기로 이루어지거나, 또는 바람직하게 하기로 이루어진 조성물에 관한 것이다: (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자 (VLP), 여기에서 VLP는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP이다; 및 (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원, 여기에서 상기 하나 이상의 항원이 NGF 항원 및 링커를 포함하며, NGF 항원은 (i) NGF 단백질, 바람직하게 서열: 22; (ii) NGF 단편, 바람직하게 서열: 44; 및 (iii) NGF 뮤테인, 바람직하게 서열: 45 내지 75 중 어느 하나;로 구성된 군에서 선택되고; 여기에서 (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되고, 제1 부착부위는 RNA-박테리오파지 Qβ의 VLP의 라이신 잔기의 아미노기이고, 제2 부착부위는 상기 링커에 포함되며, 상기 링커는 펩타이드 결합에 의해 NGF 항원에 융합되며, 상기 제2 부착부위는 시스테인의 설프하이드릴기이며; 바람직하게 상기 제1 부착부위 및 제2 부착부위는 헤테로-2 기능성 크로스 링커, 바람직하게 SMPH로 연결되며, 상기 조성물은 하나 이상의 폴리음이온성 매크로분자를 더 포함하며, 상기 폴리음이온성 매크로분자는 상기 VLP 내로 패키징되며, 바람직하게 상기 폴리음이온성 매크로분자가 폴리글루탐산이다.
실시예
실시예 1
mproNGF β cDNA 의 원핵 발현 벡터내로의 클로닝
쥐 배아뇌조직의 cDNA 라이브리로부터 하기 프라이머를 사용한 PCR에 의해 마우스 proNGFβ를 증폭하였다: Nde-proNGF-F (서열: 26) 및 proNGF-Xho-R (서열 NO: 27). PCR 산물을 Ndel 및 XhoI로 소화하고, pM-His-GGC 벡터내로 리게이션하였다. 생성되는 플라즈미드를 pM-proNGF-HisGGC로 명명하고, 이 플라즈미드는 마우스 NGFβ, His6 태그 및 C-말단에 두개의 글라이신에 뒤이어 시스테인을 함유하는 링커를 포함하는 융합 단백질을 코딩한다.
실시예 2
pCB28 _ proNGF β- His - GGC 진핵 발현 벡터의 구축
하기 두 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 mproNGFβ 서열을 pM-proNGF-HisGGC 벡터로부터 증폭하였다: mproNGFeuk_varl_f (서열: 28) 및 mproNGFeuk_varl_r (서열: 29). PCR 산물을 pCRII-TOPO 벡터 (Invitrogen)내로 리게이션하였다. pCRII-TOPO벡터를 PacI 및 XhoI 로 소화하고 생성되는 mproNGFβ-HisGGC 단편을 pCB28 벡터내로 리게이션하였다. 생성되는 플라즈미드를 pCB28_mproNGF_His_C로 명명하고, 이는 pSECTag2/Hygro A,B,C 벡터 (Invitrogen)에서 유래된 감마 면역글로불린의 카파 경쇄에서 유래된 시그널 서열 및 뒤이어 mproNGFβ 서열, His6 태그 및 C-말단에 두개의 글라이신에 뒤이어 시스테인을 함유하는 링커를 코딩한다.
실시예 3
293T HEK 세포내 pCB28 - proNGF β- His - GGC 의 발현
퓨로마이신 저항 유전자를 함유하는 1 μg의 pCB28_proNGF_His_C 발현 벡터를 200 μl Opti-MEM (Invitrogen) 및 7.5 μl 리포펙타민 2000 (Invitrogen)과 함께 혼합하고 1.5 * 106 HEK 293T 세포내로 감염시켰다. 4시간 후 세포에 10 % FCS 및 1 % 비필수아미노산 을 함유하는 D-MEM 배지(Invitrogen)를 재공급하였다. 퓨로마이신 저항을 선택하게 하도록, 24 시간후, 1 mg/1 퓨로마이신 (Invitrogen)을 배지에 넣었다. 퓨로마이신 저항 세포를 폴리-L-라이신 코팅된 롤러 병의 FCS-가 없는 D-MEM 배지내에서 성장시켰으며, 상기 배지는 10 mg/1의 환원 글루타치온 (Fluka), 161 mg/1 N-아세틸-L-시스테인 (Fluka), 1 % 비-필수아미노산, 1 % 페니실린/스트렙토마이신 (Invitrogen) 및 1 mg/1 퓨로마이신을 포함한다.
퓨로마이신 저항성 세포의 상등액을 수확하고 아미콘 초원심필터 디바이스 (Millipore)를 사용하여 5배 농축하고, 환원 조건하에서 12% NUPAGE Bis/Tris 겔 (Invitrogen)상에 전개시켰다. NGF 발현은 항 펜타 히스티딘-특이적 항원 (Qiagen)을 사용하여 면역 블롯 분석으로 가시화하였다. 발현은 His-tag 및 링커를 함유하는 성숙 mNGFβ(서열: 30)에 대한 예측치 14.7 kDa 에 상응하는 약 15 kDa의 밴드의 가시화에 의해 입증되었다. mproNGFβ-His-GGC-발현 HEK 293T 세포에서 상등액으로 방출되는 성숙 mNGFβ-HisGGC이 정확하게 가공되었는지 여부는 에드만-분해에 의해 검증되었고, 성숙 mNGFβ의 N-말단의 5개 아미노산은 SSTHP으로 나타났다. 이는 성숙 mNGFβ에 대해 예측된 5개의 아미노산에 해당하였으며, HEK 293T 세포에 의해 mproNGFβ-His-GGC이 mNGFβ-His-GGC로 정확히 가공되고 발현됨이 입증되었다.
실시예 4
mNGF β- His - GGC 의 정제
mNGFβ-His-GGC를 HEK 293T 상등액으로부터 Ni2 +-친화성 정제에 의해 정제하였다. 간략하게 설명하면, 상등액에 1/10 부피의 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA)-결합 버퍼 (500 mM NaH2PO4, 1.5 M NaCl, 100 mM 이미다졸, 100 mM β-머캅토에탄올, pH 8)을 보충한 후, 액체이송펌프를 사용하여 평형 Ni-NTA 슈퍼플로우 비드 (Qiagen) 패킹한 칼럼내로 16 시간 동안 4℃에서 펌핑하였다. 결합후, 칼럼을 AEKTA 정제 FPLC 시스템에 연결하고, Ni-NTA 슈퍼플로우 비드를 4 칼럼 부피의 세척 버퍼 (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 20 mM 이미다졸, pH 8)를 사용하여 세척하여 비특이적으로 부착된 불순물의 양을 감소시켰다. 이어 세척버퍼에서 용출 버퍼(50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 500 mM 이미다졸, pH 8)로 2 칼럼 부피의 구배로 mNGFβ를 용출시켰다. 용출된 단백질을 환원조건하에서 12% NUPAGE Bis/Tris겔 상에 전개하여 정제 품질을 체크하였다. 고순도의 mNGFβ-His-GGC가 이러한 방식으로 유도되었으며, 실시예 7에 개시된대로 추가적인 Qβ-mNGFβ-His-GGC의 전개를 위해 사용되었다.
실시예 5
단클론 항체에 의한 mNGF β- His - GGC 의 인식
포획용으로 단클론 항NGFβ항원(Chemicon International)을 사용하고, 검출용으로 다클론 양 항mNGFβ 항체(Chemicon International)를 사용한 샌드위치 ELISA를 사용하여, 마우스의 턱밑샘에서 정제한 천연의 태그 및 링커가 없는 mNGFβ과 비교하여 mNGFβ-His-GGC의 결합을 측정하였다. 간략하게 설명하면 단클론 항mNGFβ 항체를 카보네이트 버퍼(0.1 M NaHCO3, pH 9.6)에서 0.85 μg/ml의 농도로 희석하고 마이크로타이터 웰상 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS-0.05% Tween20 (PBS-T)으로 3회 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 PBS-T 내 2 % BSA로 차단하였다. 이후 PBS-T내 1% BSA내 희석된 턱밑샘에서 정제한 mNGFβ 또는 mNGFβ-His-GGC의 농도를 0.2 에서 200 ng/ml로 증가시키면서 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 PBS-T로 플레이트를 6회 세척하고, 실온에서 10 μg/ml의 양 항 mNGFβ 항체와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBS-T로 6회 세척후, 플레이트를 실온에서 30분간 60 μg/ml의 토끼 항 양 항체와 콘쥬게이트된 퍼옥시다제 (Chemicon International)와 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로 PBS-T로 6회 세척후, 25 ml 시트레이트 버퍼 (66 mM NaH2PO4, 35 mM 시트르산, pH 5)내 10 mg OPD 기질 (Fluka) 및 8 μl H2O2 (30%)로 이루어진 용액 100 μl을 모든 웰내에 첨가하여 효소반응을 시작하였다. 5% H2SO4을 가하여 변색 반응을 중지시키고, ELISA 리더(BioRad)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 시험결과 재조합적으로 발현된 mNGFβ-His-GGC 및 mNGFβ 양자가 동등하게 인식됨이 밝혀졌고, 이는 mNGFβ-His-GGC가 정확하게 발현되며 정확한 3차 구조로 폴딩됨을 의미한다.
실시예 6
mNGF β- His - GGC 의 생활성
mNGFβ-His-GGC의 생활성을 인 비트로 세포 증식 어세이에서 mNGFβ-반응성 인자 의존성 인간 에리쓰로류케믹 TF-1 세포주(ATCC)를 R&D NGFβ 제품 시트에 개시된 대로 리드아웃 시스템으로 사용하여 테스트하였다. 간략하게 104 TF-1 세포를 96웰-평면바닥 플레이트의 각 웰당 100 μl DMEM 배지내에 (10% FCS, 10 mM HEPES, 1 % 페니실린/스트렙토마이신 및 1 % 글루타맥스로 보충) 접종하였다. mNGFβ-His-GGC 또는 마우스 턱밑샘에서 정제한 mNGFβ의 농도를 0.8 에서 100 ng/ml로 증가시켜 세포내로 가하였다. 48 시간후 증식 세포내로 삽입되는 BrdU 라벨링 시약 (Roche Diagnostics)으로 세포를 라벨링하였다. 24시간 후 세포를 고정하고 이어 항-BrdU 단클론 항체 콘쥬게이트된 퍼옥시다제(Roche Diagnostics)와 함께 인큐베이션하였다. 강력하게 세척한 후 100 μl의 테트라벤질-벤지딘 기질 용액을 각 웰내에 넣었다. 5% H2SO4을 가하여 변색 반응을 중지시키고, ELISA 리더(BioRad)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. mNGFβ-His-GGC 및 턱밑샘에서 정제한 mNGFβ 양자 모두 유사한 방식으로 증식을 자극하였으며, 이는 mNGFβ-His-GGC가 생물학적으로 활성임을 나타낸다.
실시예 7
mNGF β- His - GGC 의 Qβ- VLP 로의 결합
Qβ-VLPs (2 mg/ml)를 5배 몰 과량의 헤테로-2 기능성 크로스 링커 숙시니밀-6-(β-말레이미도프로피오나미도)헥사노에이트 (SMPH, Pierce)와 함께 30분간 실온에서 반응시켰다. SMPH는 디메틸설폭사이드에 용해시킨 50 mM 원액에서 취하였다. 반응 산물은 결합 버퍼 (20 mM MES, 300 mM NaCl, 10 % glycerol, pH6)를 2번 바꾸어 10 kDa 분자량 컷-오프(Slide- A-Lyzer, Pierce)로 투석하였다. 실온에서 투석을 수행하였다. 이후 이러한 방식으로 유도화된 Qβ-VLPs을 사용하여 표적 단백질을 결합하였다.
결합전에, 실시예 4에 개시된 바와 같이 수득된 정제된 mNGFβ-His-GGC를 결합 버퍼내에서 투석하고 5몰 과량의 TCEP로 실온(RT)에서 1시간동안 환원하였다 환원된 mNGFβ-His-GGC (0.25 mg/ml)를 유도화된 Qβ (0.25 mg/ml)와 함께 전체 부피 100 μl로 4시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 반응이 종결된 후, 반응 튜브를 원심분리하여 가능한 침전을 제거하였다. 결합 반응은 결합 산물을 환원조건하에서 12% NuPAGE Bis/Tris 겔상에 전개하고 항-펜타 His 항체로 면역 블롯하여 분석하였으며, 그 결과 mNGFβ가 Qβ-VLP에 효과적으로 결합되었음을 보여주었다. 브래드포드로 단백질 농도를 측정하였다.
실시예 8
Qβ- mNGF β- His - GGC 의 면역원성
실시예 7에서 수득한 mNGFβ-His-GGC에 결합된 Qβ VLP 50 μg을 어쥬번트 없이 0일, 10일 및 20일에 수컷 DBA/1 마우스에 피하 투여하여 면역시켰다. Qβ-VLPs 단독으로 면역시킨 마우스를 음성 대조로 사용하였다. 10일, 20일 및 30일에 채혈하였다. 혈액 샘플을 혈청 튜브(Mirotainer, BD Biosciences)에 넣고 10,00Og에서 10분간 회전시켜 혈청을 준비하였다. 혈청 샘플내 mNGFβ-특이 항체는, 코팅용으로 마우스의 턱밑샘에서 정제한 태그 및 링커가 없는 mNGFβ를 사용하여 ELISA법을 시행하여 측정하였다. 간략하게 기술하면, mNGFβ를 카보네이트 버퍼(0.1 M NaHCO3, pH 9.6)내에 2.5 μg/ml의 농도로 희석하고 마이크로타이터 웰상에서 밤새 4℃에서 코팅하였다. 이후 플레이트를 PBS-0.05% Tween20 (PBS-T)으로 3회 세척하고, 37℃에서 2시간 PBS-T 내 2 % BSA로 차단하였다. 이후 1:200의 초기 희석으로부터 출발하여 3배 희석 단계를 사용하여 PBS-T + 2% BSA내에 희석시킨 혈청 샘플과 함께 상기 플레이트를 실온에서 2시간 인큐베이션하였다. 이후 PBS-T로 플레이트를 6회 세척하고, 1:1000 희석의 염소 항 마우스 IgG-Fc 항체와 콘쥬게이트된 퍼옥시다제 (Jackson Immuno Research Laboratories)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 6회 세척후, 25 ml 시트레이트 버퍼 (66 mM NaH2PO4, 35 mM 시트르산, pH 5)내 10 mg OPD 기질 및 8 μl H2O2 (30%)로 이루어진 용액 100 μl을 모든 웰내에 첨가하여 효소반응을 시작하였다. 5% H2SO4을 가하여 변색 반응을 중지시키고, ELISA 리더(BioRad)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. ELISA 시험결과 상술한 면역프로토콜을 사용하여 mNGFβ에 대한 강력한 자가항체반응이 Qβ-mNGFβ-His-GGC에 의해 유도됨이 밝혀졌다.
실시예 9
Qβ- mNGF β- His - GGC 로 상승된 항체의 중화능
Qβ-mNGFβ-His-GGC에 의한 면역으로 상승된 항체의 인 비트로 중화능을, 실시예 6에 상술된 인 비트로 세포 증식 어세이에서 테스트하였다. 간략하게 실시예 8에 상술된 바와 같이 마우스를 Qβ or Qβ-mNGFβ-His-GGC로 면역시켰다. 면역된 동물의 혈청을 수집하고 전체 IgG 분획을 단백질 G 정제에 의해 혈청에서 분리하였다. 이후 Qβ 또는 Qβ- mNGFβ-His-GGC로 면역된 마우스에서 정제한 전체 IgGs의 mNGFβ의 생활성 중화능을 TF-1 세포 증식 어세이로 테스트하였다. 간략하게 104 TF-1 세포를 96-웰 평면바닥 플레이트의 각 웰 당 100 μl DMEM 배지내에 (10% FCS, 10 mM HEPES, 1 % 페니실린/스트렙토마이신 및 1 % 글루타맥스로 보충) 접종하였다. 턱밑샘에서 정제한 mNGFβ의 농도를 0.2 에서 10 ng/ml로 증가시켜 Qβ 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC로 면역시킨 마우스의 혈청에서 정제한 전체 IgGs과 함께 실온에서 30분간 전-인큐베이션한 후 세포에 가하였다. 48시간후 증식 세포내로 삽입되는 BrdU 라벨링 시약 (Roche Diagnostics)으로 세포를 라벨링하였다. 24시간 후 세포를 고정하고 이어 항-BrdU 단클론 항체 콘쥬게이트된 퍼옥시다제(Roche Diagnostics)와 함께 인큐베이션하였다. 강력하게 세척한 후 100 μl의 테트라벤질-벤지딘 기질 용액을 각 웰내에 넣었다. 5% H2SO4을 가하여 변색 반응을 중지시키고, ELISA 리더(BioRad)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Qβ면역된 마우스에서의 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 전체 IgGs과 함께 전-인큐베이션된 상승된 농도의 mNGFβ로 자극된 세포들은 증식 억제를 나타내지 않았다. 한편, Qβ-mNGFβ-His-GGC에서의 10 μg/ml 또는 50 μg/ml 전체 IgGs과 함께 전-인큐베이션된 상승된 농도의 mNGFβ로 자극된 세포들은 심각한 증식 속도의 하강을 나타내었으며, 이는 Qβ-mNGFβ-His-GGC로 면역함으로써 상승된 항체의 NGF-중화능을 입증한다 (도 1).
실시예 10
Qβ- mNGF - His - GGC 예방접종의 마우스에서의 콜라겐 유도 관절염의 카켁시아 억제 효능
자가면역관절염의 카켁시아를 감소시키는 Qβ-mNGF-His-GGC 백신의 효능을 류마티스 관절염(RA) 마우스 모델, 소위 콜라겐 유도 관절염 (CIA) 모델에서 평가하였다. 이 모델에서 RA의 유발은 완전 프루인트 어쥬번트(CFA)내 콜라겐 타입 2(MD Biosciences)를 피내주사하고, 21일 후 불완전 프루인트 어쥬번트(IFA) 내 콜라겐 타입 2를 피내주사함으로써 이루어진다. 염증은 서서히 진행되어 결국 체중 감소를 수반하는 강직 및 영구적인 관절 파괴로 이어진다. 수컷 DBA/1 마우스 (n=8)를 50 μg Qβ- mNGF-His-GGC로 -35일, -21일 및 -7일에 면역시키고, 음성 대조 마우스는 Qβ로만 면역시켰다. 3회 면역시킨 후, 0일에 RA를 유발시켰다. 7-9주에 걸쳐 염증 과정을 모니터하였으며 하기 정의에 따라 각 사지에 임상 점수를 할당하였다: 0 정상, 1 경미한 홍반 및/또는 손가락/발가락의 부종, 2 홍반 및 전체 손발/관절에 걸친 부종, 3 강한 부종, 전체 손발/관절의 변형과 강직. 도 2A는 Qβ 및 Qβ-mNGF-His-GGC 면역 동물 양자에서의 관절염의 진행을 나타낸 것이다. 동일한 기간 동안 마우스의 체중을 매일 측정하여(도 2B), 특히 질병 유발 후 두 그룹간의 평균체중의 실질적인 차이를 살펴본바, Qβ-mNGF-His-GGC 면역된 마우스에서는 자가면역에 수반되는 카켁시아가 억제됨을 알 수 있었다.
실시예 11
Qβ- mNGF - His - GGC 예방접종의 마우스의 지모산 A-유도 염증성 통증 모델에서의 염증성 통증 억제 효능
효모추출물 지모산 A (Sigma)를 수컷 BL/6 마우스의 뒷발 발바닥에 주사하여 열적 및 기계적 자극을 유발시키고, 상기 자극에 대한 염증성 과민반응을 줄이는 Qβ-mNGF-His-GGC 백신의 능력을 하기 방법으로 평가하였다: 수컷 BL/6 mice (n=4)를 0, 10 및 20일에 50 μg의 Qβ-mNGFβ-His-GGC 또는 Qβ 단독으로 면역시켰다. 각 시점에서 기계적 및 열적 자극에 대한 반응으로 양 뒷발의 발바닥의 열 과민성을 측정하였다. 일정 강도(적외빔)의 열원으로 자극시킨 후, 발회피의 지체시간(latency)을 측정하여 열 민감성을 결정하였다. 지체시간은 전기조절장비로 측정하였다 (Plantartest, Ugo Basile). 열원의 강도는 미처치 동물의 지체시간이 약 16 s가 되도록 조정하였다. 각 뒷발마다 6번 측정하고 평균값을 산출하였다. 소위 본 프레이 필라멘트로의 자극에 대한 반응을 측정하여 기계적 민감성을 결정하였다. 본 프레이 필라멘트는 마우스의 발바닥에 압력을 상승하여 적용할 수 있는 캘리브레이트된 플라스틱 필라멘트이다. 전기조절장비로 (IITC, Woodland Hills, USA), 발을 회피할때 적용된 압력을 측정하였다. 각 발마다 6회 측정하고 평균을 산출하였다. 31일에 20 μl의 3 mg/ml 지모산 A용액을 왼쪽 뒷발 발바닥에 주사하여 염증성 통증을 유발시켰다. 지모산 A 유도 염증 발생후 바로 일어나는 열적 및 기계적 자극에 대한 과민성을, 상술한 염증성 통증 유도 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 1일, 2일, 3일, 4일 및 7일후의 발 회피로 측정하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Qβ-mNGF-His-GGC로 면역시킨 동물은 Qβ만으로 면역시킨 동물에 비해 열적 (도 3 A) 및 기계적 자극 (도 3B) 양자에 대해 과민성이 매우 감소되었다.
실시예 12
NGF - His - GGC 의 만성 수축 손상-유도 신경변성 마우스 통증 모델에서의 신경변성 통증 억제 효과
수컷 BL/6 마우스 (n=6)를 0, 14 및 28일에 50 μg의 Qβ- mNGFβ-His-GGC 또는 Qβ 단독으로 면역시켰다. 각 시점에서 상술한 실시예 11에 나타낸 바와 같이 양 뒷발 발바닥의 열적 및 기계적 자극에 대한 열과민성을 측정하였다. 42일에, 좌골신경을 묶어 만성 수축 손상(CCI)을 유도시키고, 대조군은 좌골신경을 그대로 두었다(샴 작동 대조군:sham operated control group). 좌골신경을 묶으면 14일 내 각 사지에 과민성(hypersensitivity)을 유발하고 2-3주 지속되었다가 사라진다. CCI는 신경변성 통증에 대해 확립된 쥐 모델이다. CCI 조작후, 격일마다 실시예 11에 상술된 바와 같이 열적 및 기술적 자극에 대한 민감성을 측정하였다.
실시예 13
인간 NGF β의 클로닝 , 발현, 정제 및 Qβ- VLPs 에의 결합
인간 proNGFβ는 PCR에 의해 인간 태아 뇌 조직 cDNA 라이브러리로부터 증폭하였고, 이후 PCR 산물을 pCB28 발현 벡터에 리게이션하였다. 생성되는 플라스미드를 pCB28_huproNGF_His_C로 명명하고, 이 플라스미드는 감마 면역글로불린의 카파 경쇄에서 유리된 시그널 서열 및 뒤이어 huproNGFβ 서열, His6 태그 및 C-말단에 두개의 글라이신에 뒤이어 시스테인을 함유하는 링커를 코딩한다. 진핵 발현 벡터 pCB28_huproNGF_His_C를 실시예 3에 상술한 바와 같이 HEK 293T 세포내로 감염시키고, 실시예 4에 상술한 바와 같이 성숙 huNGFβ-His-GGC을 함유하는 상등액을 수확하여 Ni-NTA로 정제하였다. 정제된 단백질은 서열: 31의 서열을 나타낸다. 정제된 huNGFβ-His-GGC는 실시예 7에 상술한 프로토콜에 따라 SMPH 유도화 Qb-VLPs에 결합하였다.
실시예 14
폴리음이온성 매크로 분자 폴리글루탐산을 함유하는 Qβ-입자에 결합된 mNGF β- His - GGC 예방접종의 효능
폴리음이온성 매크로 분자 폴리글루탐산을 함유하는 Qβ-입자(이하, Qβ (PolyGlu)로 지칭)는 WO 06/037787의 실시예 4에 개시된 방법으로 제조하였다. mNGFβ-His-GGC를 상기 실시예 7에 상술한 바와 같이 Qβ(PolyGlu)에 결합하였다. Qβ (PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC의 면역원성은 하기 방법으로 측정하였다: 암컷 BL6 마우스 (그룹당 n=4)를 피하로 0일, 14일, 28일 및 42일에 50 ㎍의 Qβ (PolyGlu), Qβ (PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC 및 0.33 % Al 하이드로겔 어쥬번트 혼합물을 투여하여 면역시켰다. 0일, 14일, 28일, 42일 및 56일에 채혈하였다. 실시예 8에 상술한 대로, 혈청을 제조하고 mNGFβ-특이적 항체를 ELISA법으로 측정하였다. Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC 로의 면역에 의해 유도된 항 mNGFβ-특이적 항체의 역가는 Qβ-mNGFβ-His-GGC로 면역에 의해 유도된 것보다 훨씬 낮았으며, Th2 IgG 이소형 패턴은 IgG2a 역가는 경감되었으나 IgGl 역가는 상승된 것으로 나타났다 (표 1).
표 1: Qβ(PolyGlu)- mNGFβ-His-GGC 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC로 면역한 후 mNGFβ-특이적 항체의 유도. 마우스는 0일, 14일, 28일 및 42일에 Qβ(PolyGlu), Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC로 면역하였다. 혈액은 0일, 14일, 28일, 42일 및 56일에 채취하고, 혈청을 생성하고, 혈청샘플내 mNGFβ-특이적 전체 IgGs, IgGl 이소타입 및 IgG2a 이소타입의 역가를 ELISA로 분석하였다.
Figure pct00001
지모산 A 유도 염증성 통증모델에서의 침해성 통증에 대한 Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC로의 면역에 의해 유도된 항-mNGFβ-특이적 자가가항체의 억제 효능은 하기 방법으로 평가하였다: 암컷 BL6 마우스 (그룹당 n=4)를 피하로 0일, 14일, 28일 및 42일에 50 μg의 Qβ (PolyGlu), Qβ (PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC 또는 Qβ-mNGFβ-His-GGC 및 0.33 % Al 하이드로겔 어쥬번트 혼합물을 투여하여 면역시켰다. 62일에 20 μl의 3 mg/ml 지모산 A용액을 왼쪽 뒷발의 발바닥에 주사하여 염증성 통증을 유발시켰다. 상기 백신의 열적 및 기계적 자극에 대한 과민반응을 경감시키는 능력을 실시예 11에 상술한 바와 같은 방법으로 평가하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이 Qβ(PolyGlu)-mNGFβ-His-GGC의 접종에 의해 유도된 항-mNGFβ 자가항체 수준은 열적 및 기계적 자극 모두에 대한 과민반응을 경감시키는데 충분하였다. Qβ-mNGFβ-His-GGC로 면역시킨 경우와 유사한 정도로 경감되었다.
실시예 15
Qβ- mNGF β- His - GGC 에 의한 신경변성 통증의 억제 ; 탁솔 -유도 신경변성 통증 쥐 모델에서의 효능
성체 수컷 스프라그-돌리 쥐를 0일, 14일 및 28일에 500 μg Qβ-mNGFβ-His-GGC 또는 Qβ 단독으로 면역시켰다. 35일째부터 격일로(35일, 37일, 39일, 41일) 파크리탁셀 2 mg/kg을 4회 복강 주사하여 신경변성 통증을 유발시켰다. 파클리탁셀을 마지막으로 투여하고 3일후부터 4주간 계속하여, 격일마다 열-통각과민 및 기계적 이질통증을 실시예 11에 상술한 바와 같이 마우스 뒷발 발바닥에서 측정하여 변경된 통각 민감성 테스트를 실시하였다.
실시예 16
Qβ- VLP 에 결합된 NGF 뮤테인의 항원 가능성 평가
상술한 바와 같이 서열이 변경된 NGF 뮤테인 (서열: 45 내지 75)을, 실시예 1-4에 기재한 바와 같이 재조합적으로 발현시키고 정제하였다. 제조된 뮤테인의 생활성을 실시예 4에 기재된 바와 같은 인 비트로 생활성 어세이로 테스트하였다. 인 비트로 어세이에서 생활성이 낮거나 나타내지 않는 뮤테인을 선택하여 실시예 7에 기재된 바와 같이 Qβ VLPs에 결합하였다. Qβ-VLP에 결합된 뮤테인의 면역원성 및 유도된 항체의 중화능을 실시예 8 및 9에 상술된 방법으로 측정하였다. 생활성이 낮거나 없지만 Qβ-VLP에 결합시 여전히 중화 항체를 유도하는 뮤테인을 선택하였다. 유도된 항체의 통증 및 카켁시아를 억제하는 인 비보 활성을 실시예 10-15에서 상술한 바와 같이 인 비보 모델에서 테스트하였다.
실시예 17
mNGF β- His - GGC 및 플래그 펩타이드 ( Flag peptide ) 항원의 AP205 VLP 에의 결합 및 AP205 VL 에 결합된 mNGF β- His - GGC 로의 마우스 면역
A. mNGF β- His - GGC 펩타이드 및 플래그 펩타이드의 재조합 AP205 VLP 에의 결합
펩타이드 mNGFβ-His-GGC (서열: 31) 및 플래그 (서열: 43)는 본 기술분야에 공지된 방법에 따라 화학적으로 합성되었다. AP205 VLP(서열: 14)는 PCT/EP2003 /007572의 실시예 1 및 2 (75-79 페이지)에 기재된 바와 같이 발현되고 정제되어, 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.4 버퍼(HBS buffer)에 재용해하였다. 재용해된 AP205 VLP는 이후 2 mg/ml (브래드포드 어세이에서 측정)의 농도로, 2.85 mM SMPH (Pierce)와 함께 실온(RT)에서 30분간 반응시켰다. 이후 반응혼합물을 HBS 버퍼에 대해 투석하고, DMSO내 50 mM 원액을 반응혼합물로 희석시킨 0.714 mM mNGFβ-His-GGC 또는 FLAG와 반응시켰다. 15℃에서 2시간 동안 두어 결합반응이 진행되도록 한후, 반응 혼합물을 1000배 부피 HBS에 대해 2 X 2 시간 투석하고, 액체 질소내에서 분취 상태로 급냉하고, 추후 사용을 위해 -80℃에서 보관하였다. 분취물을 해동하고, 항원과 AP205 서브유닛의 결합을 SDS-PAGE로 평가하고, 브래드포드 어세이로 단백질 농도를 측정하였다. AP205 VLP을 크로스-링커로 유도화하고, 서브유닛의 모노머형태이외에, 교차결합으로 유도된 다이머, 트라이머, 테트라머, 펜타머 및 헥사머도 SDS-PAGE로 검출하였다.
B. 재조합 AP205 VLP 에 결합된 mNGF β- His - GGC 펩타이드로의 마우스 면역, 면역반응의 분석 및 IgG 서브타입의 결정
AP205 VLP 결합된 mNGFβ-His-GGC 펩타이드를 마우스 (각각 3마리)에 0일 및 14일에 피하주사하였다. 10 μg의 백신을 PBS에 200 μl로 희석시켜, 각 마우스를 면역하는데 사용하였다. 20일째에 마우스들의 안와후방에서 채혈하여, mNGFβ-His-GGC 펩타이드에 특이적인 항체의 역가를 mNGFβ-His-GGC 펩타이드에 대한 ELISA 어세이로 측정하였다. 화학적 크로스-링커제인 설포-SPDP를 사용하여 mNGFβ-His-GGC를 소 RNAse A와 결합시켰다. 10 μg/ml 농도의 결합된 RNAse 제제로 ELISA 플레이트를 코팅하였다. 플레이트를 차단하고 아후 단계적으로 희석된 마우스 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 각각의 서브타입에 특이적인 효소적으로 라벨링된 항-마우스 IgG 항체로 결합된 항체를 검출하였다. 대조군으로서 동일한 마우스의 면역전 혈청으로 테스트하였다.
실시예 18
mNGF β 단편의 AP205 VLP 에의 융합, 및 AP205 VLP 에 융합된 mNGF β 단편으로의 마우스 면역
PCT/EP2005/054721의 실시예 1에 개시된 방법에 의해, mNGFβ 1-10 펩타이드의 N- 또는 C-말단 부분에 융합된 AP205를 함유하는 구조체를 수득하였다. 발현된 융합 단백질의 정제법은 PCT/EP2005/054721의 실시예 2에 개시된 것과 실질적으로 동일하다. PAP405 및 pAP283의 작제와 서열은 각각 PCT/EP2005/054721 및 WO2004/007538A2에 개시되어 있다. 성체 암컷, C57BL/6 마우스 (그룹당 5마리)에, mNGFβ 1-10 펩타이드(SEQ ID NO:44)를 C-말단에 융합시킨 AP205를 예방접종하였다. 50 μg의 투석된 백신을 PBS에 200 μl의 부피로 희석하고, 0일, 14일, 28일 및 42일에 피하주사하였다 (양쪽 배 측에 100 μl). 백신은 어쥬번트 없이 투여되었다. 대조군으로서, 한 그룹의 마우스에 PBS 또는 AP205 VLP를 단독으로 투여하였다. 0일, 14일, 28일, 42일, 56일 및 70일에 쥐의 후방안외에서 채혈하고, 그 혈청을 ELISA로 분석하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Cytos Biotechnology AG Jennings, Gary F Roehn, Till Bachmann, Martin <120> NGF Conjugates and Uses Thereof <130> P1079PC00 <150> 07150234.8 <151> 2007-12-20 <160> 75 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Bacteriophage Q-beta <400> 1 Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60 Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Bacteriophage Q-beta <400> 2 Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly 1 5 10 15 Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser 65 70 75 80 Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95 Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln 115 120 125 Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro 145 150 155 160 Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu 165 170 175 Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala 180 185 190 Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu 195 200 205 Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr 210 215 220 Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu 245 250 255 Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu 260 265 270 Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His 275 280 285 Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly 290 295 300 Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile 305 310 315 320 Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala 325 <210> 3 <211> 129 <212> PRT <213> Bacteriophage R17 <400> 3 Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125 Tyr <210> 4 <211> 130 <212> PRT <213> Bacteriophage fr <400> 4 Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr 100 105 110 Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130 <210> 5 <211> 130 <212> PRT <213> Bacteriophage GA <400> 5 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val 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Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 61 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 61 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Ala Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 62 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Ala Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 63 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 63 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 64 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 64 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Ala Ala Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 65 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 65 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 66 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 66 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Ala Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 67 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 67 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Trp Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 68 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 68 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 69 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 69 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Ala 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 70 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 70 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Ser Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 71 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 71 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Ser Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 72 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 72 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Thr Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 73 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 73 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys Ala Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 74 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 74 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ala Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120 <210> 75 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> NGF mutein <400> 75 Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp 1 5 10 15 Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys 20 25 30 Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val 35 40 45 Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val 50 55 60 Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys Ala Trp Asn Ser Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ala Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln 85 90 95 Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu 100 105 110 Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala 115 120

Claims (24)

  1. (a) 하나 이상의 제1 부착 부위를 갖는 바이러스-유사 입자(VLP); 및
    (b) 하나 이상의 제2 부착 부위를 갖는 하나 이상의 항원;을 포함하는 조성물로서,
    상기 하나 이상의 항원이 NGF 항원이며; 상기 (a) 및 (b)가 상기 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결되어 있는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원이 NGF 단백질, NGF 단편 또는 NGF 뮤테인인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원이 NGF 단백질이고, 상기 NGF 단백질이 서열번호: 22의 아미노서열과 90% 이상의 서열 동등성을 갖는 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 바람직하게는 상기 NGF 단백질이 서열번호: 22의 아미노산 서열로 이루어진 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원이 NGF 단편이고, 바람직하게 상기 NGF 단편이 서열번호: 44의 아미노산 서열로 이루어진 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원이 NGF 뮤테인이고, 바람직하게 상기 NGF 뮤테인은 감소된 생물학적 활성을 가지며, 가장 바람직하게는 상기 NGF 뮤테인은 생물학적 활성을 갖지 않는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 항원이 NGF 뮤테인이고, 바람직하게 상기 NGF 뮤테인은 서열번호: 45 내지 75 중에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VLP는 RNA-박테리오파지의 VLP이고, 바람직하게 상기 RNA-박테리오파지는 하기로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조성물:
    (a) 박테리오파지 Qβ;
    (b) 박테리오파지 R 17 ;
    (c) 박테리오파지 fr;
    (d) 박테리오파지 GA;
    (e) 박테리오파지 SP;
    (f) 박테리오파지 MS2;
    (g) 박테리오파지 M11;
    (h) 박테리오파지 MXl;
    (i) 박테리오파지 NL95;
    (k) 박테리오파지 f2;
    (1) 박테리오파지 PP7; 및
    (m) 박테리오파지 AP205.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VLP는 RNA-박테리오파지의 재조합 피막 단백질, 이들의 돌연변이 또는 단편을 포함하며, 바람직하게 상기 피막 단백질은 서열번호: 1을 포함하거나, 바람직하게 서열번호: 1로 이루어진 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부착 부위는 하나 이상의 공유 결합에 의해 상기 제2 부착 부위에 연결되어 있는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 공유 결합은 비-펩타이드 결합인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 부착 부위는 아미노기, 바람직하게는 라이신 잔기의 아미노기를 포함하거나, 바람직하게는 이들로 이루어진 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 부착 부위는 설프하이드릴기, 바람직하게는 시스테인 잔기의 설프하이드릴기를 포함하거나, 바람직하게는 이들로 이루어진 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 하나 이상의 공유 결합은 펩타이드 결합이며, 바람직하게 상기 VLP가 RNA-박테리오파지 AP205의 VLP인 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 VLP가 재조합 VLP이며, 상기 재조합 VLP는 본질적으로 숙주 RNA가 없는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 추가적으로 하나 이상의 폴리음이온성 매크로 분자를 포함하며, 상기 폴리음이온성 매크로 분자는 상기 VLP내로 패키징되며, 바람직하게 상기 폴리음이온성 매크로분자는 폴리음이온성 폴리펩타이드 또는 음이온성 덱스트란인 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 폴리음이온성 매크로 분자는 (a) 폴리글루탐산; (b) 폴리아스파르트산; (c) 폴리(GluAsp); 및 (d) (a) 내지 (c)의 화학적 변경물로 이루어진 군에서 선택되는 폴리음이온성 폴리펩타이드이며, 상기 폴리음이온성 폴리펩타이드는 바람직하게 폴리글루탐산 및/또는 폴리아스파르트산이며, 더욱 바람직하게 상기 폴리음이온성 폴리펩타이드는 폴리글루탐산인 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 폴리음이온성 매크로 분자는 음이온성 덱스트란이며, 바람직하게 상기 음이온성 덱스트란은
    (a) 덱스트란 설페이트;
    (b) 카복실메틸 덱스트란;
    (c) 설포프로필 덱스트란;
    (d) 메틸 설포네이트 덱스트란; 및
    (e) 덱스트란 포스페이트로 이루어진 군에서 선택되는 조성물.
  18. 치료적 유효량의 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 백신 조성물로서, 바람직하게 어쥬번트를 더 포함하는 백신 조성물.
  19. (a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물; 및
    (b) 약학적으로 허용가능한 담체
    를 포함하는 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제18항의 백신조성물, 또는 제19항의 약학적 조성물을 동물, 바람직하게 인간에 투여하는 단계를 포함하는 면역방법.
  21. 의약품으로 사용되기 위한 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제18항의 백신조성물, 또는 제19항의 약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제18항의 백신조성물을 통증 치료용, 바람직하게는 만성 통증, 가장 바람직하게는 류마티스성 관절염 통증 치료용 의약품의 제조에 사용하는 용도.
  23. 통증 치료용, 바람직하게는 만성 통증, 가장 바람직하게는 류마티스성 관절염 통증 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물, 제18항의 백신조성물 또는 19항의 약학적 조성물.
  24. 하기 단계들을 포함하는 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 제조방법:
    (a) 하나 이상의 제1부착 부위를 갖는 VLP를 제공하는 단계;
    (b) 하나 이상의 제2부착 부위를 갖는 하나 이상의 NGF 항원을 제공하는 단계; 및
    (c) 상기 VLP 및 NGF 항원을 하나 이상의 제1 및 제2 부착 부위를 통해 연결하여 조성물을 제조하는 단계.
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