CN117222427A - 大肠杆菌o18生物缀合物的生产 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞。该宿主细胞的特征在于它们包含与SEQ ID NO:1的野生型Wzy O‑抗原聚合酶相比在位置199、377和395中的一个或多个位置中具有氨基酸取代的特定组合的经修饰的Wzy O‑抗原聚合酶,该经修饰的Wzy O‑抗原聚合酶改善了由该宿主细胞生产的该O18生物缀合物的产率和糖基化模式。本发明还涉及方法,其中该宿主细胞用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物、包含这些生物缀合物的组合物,包括包含附加O抗原多糖血清型的生物缀合物的多价组合物。
Description
技术领域
本发明涉及医学微生物学、免疫学和疫苗领域。具体地,本发明涉及包含改进的Wzy O-抗原聚合酶的宿主细胞,以用于以增加的产率和增加的糖基化程度生产大肠杆菌(E.coli)O18抗原多糖的生物缀合物。本发明还涉及包含本发明的生物缀合物的组合物以及此类组合物用于诱导针对大肠杆菌的免疫应答的用途,以便预防或治疗大肠杆菌感染,特别是侵袭性肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)疾病的感染。
背景技术
肠外致病性大肠杆菌(Escherichia coli)(ExPEC)菌株与共生大肠杆菌菌株一样,通常是人类胃肠道中无害的习居菌。尽管如O-抗原、荚膜和鞭毛抗原血清型(缩写为O:K:H,例如O25:K1:H4)所定义,许多克隆谱系都以ExPEC为主,但是ExPEC分离株不能容易地通过血清型与共生分离株区分开。与共生大肠杆菌相比,ExPEC菌株表达各种各样的毒力因子,使得它们能够定殖于胃肠道,而且能够引起多种肠外感染,由此因住院和死亡带来巨大的医疗成本负担。新生儿、老年人和免疫力低下的患者特别容易感染ExPEC,包括侵袭性ExPEC疾病(IED)。
O-抗原包含革兰氏阴性细菌(包括大肠杆菌)中的细胞壁脂多糖(LPS)的免疫显性组分。目前已鉴定出超过180种血清学上独特的大肠杆菌O-抗原,其中绝大多数ExPEC分离株被归入不到20种O-抗原血清型。全长大肠杆菌O-抗原通常由约10至25个与高度保守的LPS核心结构连接的重复糖单元构成,其中每个组分分别由主要在rfb和rfa基因簇中编码的酶单独合成。在O-抗原聚合后,可以修饰O-抗原多糖主链,通常通过添加乙酰基或葡萄糖残基。这些修饰通过产生抗原上不同的血清型,有效地增加了血清型的多样性,这些血清型具有共同的多糖主链,但侧枝不同。编码O-抗原修饰酶的基因通常位于染色体上的rfb簇之外,并且在一些情况下,这些基因存在于溶原性噬菌体中。
为开发预防ExPEC感染的疫苗所做的努力集中在O-抗原多糖缀合物上。通过提取和纯化O-抗原多糖并与解毒的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A化学缀合来合成12价O-抗原缀合物疫苗,并在1期临床研究中测试该疫苗的安全性和免疫原性(Cross等人,J.Infect.Dis.(1994)第170卷,第834-40页)。该候选疫苗从未被批准用于临床应用。最近已经开发出大肠杆菌中的生物缀合系统,其中抗原多糖和载体蛋白均在体内合成,随后在体内通过大肠杆菌中表达的寡糖基转移酶PglB(一种空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)酶)的活性来缀合(Wacker等人,Proc.Nat.Acad.Sci.(2006),第103卷,第7088-93页)。这种N-连接的蛋白质糖基化系统能够将多样的多糖转移至载体蛋白,从而允许使用方法从表达生物缀合物的细菌中纯化生物缀合物。生物缀合已经成功地用于生产大肠杆菌四价O-抗原候选疫苗的缀合物多糖(Poolman和Wacker,J.Infect.Dis.(2016),第213卷第1期,第6-13页;WO 2015/124769;WO 2017/035181)。
已经描述了包含10种生物缀合物的组合物(O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75,该组合物称为ExPEC10V)并且该组合物正在进行临床试验(例如,WO2020/191082A1)。
据观察,与为ExPEC10V制备的其他九种生物缀合物相比,具有O18A抗原多糖的生物缀合物的产物产率最低(WO2020/191082A1)。此外,这样生产的O18A生物缀合物似乎含有相对大量的由有限数目的O18A抗原多糖重复单元组成的聚糖,称为“sEPA”(即,具有仅含约1至3个重复单元的多糖链的EPA载体蛋白,其总计超过在O18A生物缀合物药物物质的生产过程中周质级分中的O18A生物缀合物的20%),该sEPA产物不容易与主要包含其中O18A抗原多糖由至少五个重复单元组成的聚糖的优选生物缀合物分离。属于O18血清组的ExPEC分离株已在美国和欧洲血液分离株的同期监视研究中被普遍鉴定,因此O18缀合物被认为是ExPEC疫苗的相关组分。因此期望提高O18抗原多糖的缀合物的产率。
因此,本发明的一个目的是提供用于在生产期间增加包含O18抗原多糖的生物缀合物的产物产率的材料和方法,和/或生产用于获得与使用先前描述的生产过程获得的O18生物缀合物相比sEPA相对量降低的O18生物缀合物的材料和方法。本发明的另一个目的是提供用于生产大肠杆菌O18A抗原多糖的生物缀合物的材料和方法,该生物缀合物与使用如先前描述的材料和方法获得的O18生物缀合物相比具有增加的糖基化程度。
发明内容
在第一方面,本发明涉及革兰氏阴性细菌宿主细胞,该革兰氏阴性细菌宿主细胞包含:(a)包含至少一个糖基化共有序列的载体蛋白;(b)大肠杆菌O18 rfb基因座;以及(c)寡糖基转移酶;其中该细胞包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,该多肽包含与SEQ IDNO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中该氨基酸序列包含:i)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸(Ile,I)、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸(Lys,K)和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸(Ala,A);ii)与SEQID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸(Thr,T)、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸(Val,V);iii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;iv)与SEQID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;或v)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的甲硫氨酸(Met,M)和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸。
在一个实施方案中,在宿主细胞中,具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽包含SEQID NO:1的氨基酸序列,不同的是该氨基酸序列包含:i)位置199处的Ile、位置377处的Lys和位置395处的Ala;ii)位置199处的Thr、位置377处的Lys和位置395处的Val;iii)位置199处的Thr、位置377处的Lys和位置395处的Ala;iv)位置199处的Ile、位置377处的Lys和位置395处的Val;或v)位置199处的Ile、位置377处的Met和位置395处的Ala;其中所有位置对应于SEQ ID NO:1中的那些位置。
在一个实施方案中,在宿主细胞中,具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽包含位置199处的Ile、位置377处的Lys和位置395处的Ala,其中这些位置对应于SEQ ID NO:1中的那些位置。
在一个实施方案中,宿主细胞包含编码具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸或载体,该多核苷酸或载体被整合到宿主细胞的基因组中。
在一个实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。在一个优选的实施方案中,宿主细胞是大肠杆菌K-12菌株,更优选大肠杆菌K-12菌株W3110。
在一个实施方案中,在宿主细胞中,存在如下至少一种情况:a)寡糖基转移酶包含与SEQ ID NO:6具有至少95%序列同一性的氨基酸序列;b)载体蛋白包含SEQ.ID NO.3;以及c)大肠杆菌O18 rfb基因座是具有血清型O18A的大肠杆菌菌株的rfb基因座。优选地,寡糖基转移酶包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
在一个实施方案中,宿主细胞包含具有编码Wzy O-抗原聚合酶的核苷酸序列的大肠杆菌O18 rfb基因座,该核苷酸序列编码具有如上文所定义的Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽。
在进一步方面,本发明涉及用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的方法,该方法包括:(a)培养如上文所定义的本发明的宿主细胞,以生产生物缀合物。优选地,该方法还包括回收生物缀合物。
在一个实施方案中,该方法还包括将回收的生物缀合物配制成药物组合物。
在一个实施方案中,该方法还包括将与载体蛋白缀合的大肠杆菌O-抗原多糖的一种或多种附加生物缀合物添加到药物组合物中以获得多价生物缀合物组合物。优选地,一种或多种附加生物缀合物包含选自由大肠杆菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75组成的组的至少一种O-抗原多糖。在一个优选的实施方案中,该方法中生产的多价生物缀合物组合物包含:(i)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18A抗原多糖的生物缀合物;(ii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O1A抗原多糖的生物缀合物;(iii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O2抗原多糖的生物缀合物;(iv)与载体蛋白缀合的大肠杆菌葡糖基化O4抗原多糖的生物缀合物;(v)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O6A抗原多糖的生物缀合物;(vi)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O15抗原多糖的生物缀合物;(vii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O16抗原多糖的生物缀合物;(viii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O25B抗原多糖的生物缀合物;以及(ix)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O75抗原多糖的生物缀合物,其中优选地每个生物缀合物中的载体蛋白包含SEQ ID NO:3。在一个更优选的实施方案中,该方法中生产的多价生物缀合物组合物还包含:(x)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O8抗原多糖的生物缀合物,其中优选地载体蛋白包含SEQ ID NO:3。
附图说明
图1.考马斯染色的SDS-PAGE,其加载了来自大肠杆菌O18A生物缀合物生产菌株W3110的摇瓶培养物的周质提取物,这些周质提取物含有具有SEQ ID NO:1(泳道1和3)或具有氨基酸取代199I、377K、395A(泳道2和4)的Wzy变体,这些Wzy变体被诱导用于O18A多糖生物缀合物表达。在加载于泳道1和2上的样品中,寡糖基转移酶PglB由大小减小的表达质粒表达,而在泳道3和4中,PglB表达质粒的载体骨架含有额外4500bp的DNA序列,其包含非编码DNA和lac阻遏基因lacI,这似乎对于产物表达是最佳的。用箭头指示了显示O18A多糖生物缀合物材料的条带,描绘了单糖基化EPA(M)、二糖基化EPA(D)和三糖基化EPA(T)的近似大小。
具体实施方式
除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。否则,本文引用的某些术语具有本说明书中所述的含义。本文引用的所有专利、公布的专利申请和出版物均以引用方式并入本文,如同在本文中进行了充分阐述。应该注意的是,除非上下文清楚地指明,否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
贯穿本具体实施方式和随后的权利要求书,除非上下文另有要求,否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”等变型形式将被理解为暗示包括所陈述的整数或步骤或者整数或步骤的组,但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文使用时,术语“包含”可用术语“含有”或“包括”替代,或者有时在本文使用时用术语“具有”替代。
当在本文使用时,“由……组成”排除权利要求要素中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文使用时,“基本上由……组成”不排除没有实质上影响权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤。每当在本文中用于本发明的一个方面或实施方案的情境时,任何前述术语“包含”、“含有”、“包括”和“具有”均可用术语“由……组成”或“基本上由……组成”替代以改变本公开的范围。
如本文所用,多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如,在两个要素由“和/或”连接的情况下,第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内,并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内,并且因此满足术语“和/或”的要求。
当与数值结合使用时,词语“约”或“大约”是指该值可以是给定值加上或减去该值的20%,优选地加上或减去该值的10%,更优选地加上或减去该值的5%。
序列同一性在本文中定义为通过序列比较所确定的两个或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或者两个或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。两个氨基酸序列之间的“相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较来确定的。可以通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”。
可以根据两个序列的长度,使用全局或局部比对算法通过比对两个肽或两个核苷酸序列来确定“序列同一性”和“序列相似性”。优选地使用全局比对算法(例如NeedlemanWunsch)对相似长度的序列进行比对,该全局比对算法优选地在整个长度上比对序列,而优选地使用局部比对算法(例如Smith Waterman)对长度大不相同的序列进行比对。当序列(例如,通过程序GAP或BESTFIT使用预设参数进行最佳比对时)至少共有某一最小百分比的序列同一性(如下文所定义)时,则可以将序列称为“基本上相同”或“基本上相似”。最优选地,在ClustalW(1.83)序列比对中使用默认设置进行序列比对。
另选地,可以使用如FASTA、BLAST等算法,通过针对公共数据库进行搜索来确定相似性或同一性百分比。因此,本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索,以例如鉴定其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403—10的BLASTn和BLASTx程序(2.0版)进行此类搜索。可以用NBLAST程序、得分=100、字长=12进行BLAST核苷酸检索以获得与本发明的wzy核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以用BLASTx程序、得分=50、字长=3进行,以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对,可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述利用空位BLAST。当利用BLAST和空位BLAST程序时,可以使用相应程序(例如,BLASTx和BLASTn)的默认参数。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上国家生物技术信息中心的主页。
除非另有说明,否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。
具体实施方式
本申请的发明人已经令人惊讶地发现,使用在一个或多个特定位置处不同于参考序列的Wzy O-抗原聚合酶带来了O18抗原多糖生物缀合物的产率的显著提高。此外,发现使用这种聚合酶竟然有利于生产出聚糖与蛋白质比率增加和/或糖基化位点占有率增加的O18抗原多糖缀合物。
因此,在第一方面,本发明提供了用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的宿主细胞。
在一个实施方案中,本发明的宿主细胞至少包含:(a)包含至少一个糖基化共有序列的载体蛋白;(b)大肠杆菌O18 rfb基因座;(c)寡糖基转移酶;以及(d)具有Wzy O-抗原聚合酶活性的本发明的多肽。
在宿主细胞中,具有Wzy O-抗原聚合酶活性的本发明的多肽是包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列并且还具有O-抗原聚合酶活性的多肽。本发明的多肽是否具有O-抗原聚合酶活性可以通过以下方式测定:在合适的宿主细胞中表达编码Wzy O-抗原聚合酶的核苷酸序列并确定由本领域技术人员已知的方法或例如如Woodward等人(2010,NatChem Biol.2010年6月;6(6):418–423)所述的方法生产的聚合O-抗原的量,该文献全文并入本文。
在一个实施方案中,本发明的宿主细胞包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列,其中该氨基酸序列包含:
i)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;
ii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;
iii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;
iv)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;或
v)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的甲硫氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸。
分别与SEQ ID NO:1中的氨基酸位置199、377或395之一相对应的氨基酸位置在本文中应被理解为是指在SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:1以外的序列的序列比对中,优选地在与SEQ ID NO:1的ClustalW(1.83)序列比对(优选地使用默认设置)中,在SEQ ID NO:1以外的氨基酸序列中分别与SEQ ID NO:1中的位置199、377或395之一比对的位置。技术人员将知道如何使用如本文所定义的氨基酸序列比对算法来鉴定SEQ ID NO:1以外的Wzy O-抗原聚合酶氨基酸序列中的对应氨基酸位置。
在一个优选的实施方案中,本发明的宿主细胞包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,该多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列,不同的是该氨基酸序列包含:i)与SEQ IDNO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;ii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;iii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;iv)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ IDNO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;或v)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的甲硫氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸。因此,在该实施方案中,本发明的宿主细胞包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,该多肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列,不同的是该氨基酸序列包含:i)SEQ ID NO:1中的位置199处的异亮氨酸、SEQ ID NO:1中的位置377处的赖氨酸和SEQ ID NO:1中的位置395处的丙氨酸;ii)SEQ ID NO:1中的位置377处的赖氨酸;iii)SEQ ID NO:1中的位置377处的赖氨酸和SEQ ID NO:1中的位置395处的丙氨酸;iv)SEQID NO:1中的位置199处的异亮氨酸和SEQ ID NO:1中的位置377处的赖氨酸;或v)SEQ IDNO:1中的位置199处的异亮氨酸和SEQ ID NO:1中的位置395处的丙氨酸。
在一个特别优选的实施方案中,本发明的宿主细胞包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ IDNO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸。
如技术人员将理解的,在一个实施方案中,为了表达具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,本发明的宿主细胞将优选地包含编码如上文所定义的本发明的具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸。该多核苷酸的前面可以是与其可操作地连接的启动子。在某些实施方案中,启动子对于Wzy O-抗原聚合酶编码序列是内源的。在某些优选的实施方案中,启动子是驱动Wzy O-抗原聚合酶在肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌,优选埃希氏菌属(Escherichia)的细菌,更优选大肠杆菌物种的细菌中表达的内源启动子。在其他实施方案中,启动子对于Wzy编码序列是异源的,例如使用技术人员已知的用于重组表达系统的强启动子。例如,启动子是诱导型或组成型原核启动子,诸如ara、phoA、tac、tet、trc、trp、PBAD、λPL、T5或T7启动子。
在某些实施方案中,本发明提供了可用于构建根据本发明的宿主细胞的分离的多核苷酸。多核苷酸可以是重组的、合成的或人工的多核苷酸。多核苷酸可以是任何形式的核酸,例如DNA或RNA,优选是DNA。多核苷酸可以包含天然存在的Wzy编码多核苷酸(诸如SEQID NO:2的天然存在的Wzy编码多核苷酸)中不存在的一个或多个核苷酸。具体地,用于本发明的多核苷酸将至少在与SEQ ID NO:1中的位置199、377和395相对应的一个或多个密码子上不同于天然存在的Wzy编码多核苷酸诸如SEQ ID NO:2。此外,用于本发明的多核苷酸可以在除与SEQ ID NO:1中的位置199、377和395中的至少一个位置相对应的位置之外的密码子上不同于天然存在的Wzy编码多核苷酸。多核苷酸可以在其5'末端和/或3'末端具有天然存在的Wzy编码多核苷酸中不存在的一个或多个核苷酸。技术人员可以使用常规技术产生不影响由所描述的多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代,以反映有待在其中表达多肽的任何特定宿主生物体的密码子使用。因此,除非另外指明,否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并型式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。
如技术人员将进一步理解的,在一个实施方案中,编码如上文所定义的本发明的具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸可以包含在表达构建体或载体中。优选地,在表达构建体中,编码具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸可操作地连接到用于在本发明的宿主细胞中表达该多肽的表达控制序列,例如在表达盒中。这种表达控制序列可以包括如上所指定的启动子,并且还可以包括夏因-达尔加诺(Shine–Dalgarno)序列、转录终止序列等。在一个实施方案中,表达构建体包含在载体中。在一个实施方案中,载体是附加型载体,诸如质粒或病毒载体,优选质粒。在另一个实施方案中,多核苷酸、载体或表达构建体被整合到宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中,载体或表达构建体优选地为DNA的形式。在某些实施方案中,载体包含与启动子可操作地连接的本发明的多核苷酸,这意味着多核苷酸受启动子的控制。在某些实施方案中,编码如本文所定义的本发明的具有WzyO-抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸被整合到其在宿主细胞基因组中的rfb基因座中的天然位置中,例如通过定点诱变、使用分子生物学领域技术人员已知的基于同源重组的遗传修饰技术产生。
用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的本发明的宿主细胞是细菌宿主细胞。在一个实施方案中,宿主细胞是革兰氏阴性细菌宿主细胞。用于生产包含大肠杆菌O18抗原的生物缀合物的合适的细菌或原核宿主细胞包括但不限于埃希氏菌属物种、志贺菌属(Shigella)物种、克雷伯菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森菌属(Yersinia)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种、乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽孢杆菌属(Bacillus)物种和梭菌属(Clostridium)物种。在一个优选的实施方案中,本发明的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞,更优选大肠杆菌K-12菌株,诸如菌株W3110,后者是特别优选的。
在一个实施方案中,宿主细胞是非天然存在的宿主细胞。因此,宿主细胞可以来源于天然存在的分离株,例如临床分离株,其已经被修饰以表达如本文所述的具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,并且其优选地已经被进一步修饰以包含以下的一者或多者或全部:i)如本文所定义的O18 rfb基因座、ii)包含如本文所定义的至少一个糖基化共有序列的载体蛋白(用于表达该载体蛋白的核酸构建体)以及iii)如本文所定义的寡糖基转移酶(用于表达该寡糖基转移酶的核酸构建体)。
用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的本发明的宿主细胞还优选地包含用于将寡糖转移至载体蛋白上的N-糖基化位点的寡糖基转移酶(OST)。因此,优选地,如本文所提供的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶(OST)的核苷酸序列。如本文所用的寡糖基转移酶是将脂质连接的寡糖转移至包含糖基化共有基序的新生多肽链的残基,例如转移至包含N-糖基化共有基序的新生多肽链的天冬酰胺(Asn,N)残基的酶,此类N-糖基化共有基序的示例是SEQ ID NO:4或Asn-X-Ser(Thr)。在整篇本申请中,应当理解,对于N-糖基化基序Asn-X-Ser(Thr),X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。优选地,此类寡糖基转移酶将寡糖转移至如本文所述的载体蛋白的多肽链中的SEQ ID NO:4的天冬酰胺残基。编码寡糖基转移酶的核酸可以是宿主细胞天然的,或者可以使用遗传方法引入宿主细胞中。在优选的实施方案中,寡糖基转移酶对于宿主细胞是异源的。大肠杆菌天然不包含寡糖基转移酶,因此如果大肠杆菌用作生产生物缀合物的宿主细胞,则异源寡糖基转移酶包含在这样的宿主细胞中,例如在通过遗传工程引入时。鉴于本公开,寡糖基转移酶可以来自本领域已知的任何来源。
在某些优选的实施方案中,寡糖基转移酶是来自弯曲杆菌(Campylobacter)的寡糖基转移酶。例如,在一个实施方案中,寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶(即,PglB;参见例如Wacker等人,2002,Science 298:1790-1793;也参见例如NCBI基因ID:3231775,UniProt登录号O86154)。在另一个实施方案中,寡糖基转移酶是来自红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)的寡糖基转移酶(参见例如NCBI基因ID:7410986)。
在具体的实施方案中,寡糖基转移酶是来自空肠弯曲杆菌的PglB,包括天然(野生型)蛋白或其任何变体,诸如在国际专利申请公布WO 2016/107818和WO 2016/107819中描述的那些。PglB可以将脂质连接的寡糖转移至共有序列SEQ ID NO:4和Asn-X-Ser(Thr)中的天冬酰胺残基。在特定实施方案中,PglB寡糖基转移酶是具有如本文所定义的寡糖基转移酶的多肽,该多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中,PglB寡糖基转移酶包含与SEQID NO:6相同的氨基酸序列。在某些实施方案中,野生型PglB中的一个或多个内源糖基化共有序列已发生突变以避免PglB自糖基化,例如包含突变N534Q的SEQ ID NO:6。适用于本文所提供的宿主细胞的变体PglB的示例包括包含突变N311V的SEQ ID NO:6的PglB。
用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的本发明的宿主细胞还优选地包含编码载体蛋白的核苷酸序列,该载体蛋白包含至少一个具有糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)的糖基化位点,更优选至少一个具有SEQ ID NO:4的糖基化位点。
在一些实施方案中,载体蛋白选自由以下各项组成的组:解毒的铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)外毒素A(EPA)、大肠杆菌鞭毛蛋白(FliC)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、解毒的金黄色葡萄球菌(S.aureus)溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌不耐热肠毒素、解毒的大肠杆菌不耐热肠毒素变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、解毒的霍乱毒素变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的乘客结构域、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)肺炎球菌溶血素、钥孔血蓝蛋白(KLH)、铜绿假单胞菌PcrV、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白(OMPC)以及来自不可分型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)的蛋白D。
在某些实施方案中,载体蛋白是解毒的铜绿假单胞菌外毒素A(EPA)或CRM197,优选地载体蛋白是EPA。对于EPA,各种脱毒蛋白变体已经在文献中进行了描述并且可以用作载体蛋白。在某些实施方案中,本发明的缀合物中使用的EPA载体蛋白以一定方式被修饰,使得该蛋白毒性更小和/或更容易糖基化。例如,根据Lukac等人,1988,Infect Immun,56:3095-3098和Ho等人,2006,Hum Vaccin,2:89-98,解毒可以通过使催化必需残基L552V和ΔE553发生突变和缺失来实现。在一个具体的实施方案中,用于产生本发明的缀合物的载体蛋白被修饰,使得载体蛋白中糖基化位点的数目以一定方式进行优化,从而允许施用更低浓度的蛋白,例如以其生物缀合物形式在免疫原性组合物中施用。在一个特定实施方案中,宿主细胞编码包含1至10、优选2至4、优选4个糖基化位点的EPA,这些糖基化位点包含具有SEQ ID NO:4的糖基化共有序列。在一个实施方案中,载体蛋白包含与SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,并且包含1至10、优选2至4、优选4个糖基化位点,这些糖基化位点包含糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr),更优选具有SEQ ID NO:4。在一个优选的实施方案中,载体蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的EPA。
在某些优选的实施方案中,根据本发明的宿主细胞包含编码具有SEQ ID NO:6的寡糖基转移酶的核苷酸序列以及编码具有SEQ ID NO:3的载体蛋白的核苷酸序列。
用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的本发明的宿主细胞还优选地包含用于合成O18-抗原多糖结构的大肠杆菌O18rfb基因座。
在大肠杆菌中,参与O-抗原生物发生的基因产物由rfb基因座编码。因此,如本文所提供的宿主细胞还优选地包含大肠杆菌O18 rfb基因座,优选具有血清型O18A的大肠杆菌菌株的rfb基因座的核苷酸序列。如本文所用,“O18 rfb基因座”和“O18 rfb基因簇”是指革兰氏阴性细菌基因组中包含基因簇的基因座,该基因簇一起编码能够合成O18-抗原多糖结构的酶学机制。术语rfb基因座优选地是指来自埃希氏菌属,特别是大肠杆菌的基因组基因座。
在某些实施方案中,O18 rfb基因座对于宿主细胞是异源的,例如被引入宿主细胞的前体细胞中,并且优选地被整合到其基因组中。优选地,原始rfb基因簇(如果其存在于前体细胞中的话)已经被宿主细胞中的O18rfb基因簇替代,以使得能够生产O18的生物缀合物。
在某些实施方案中,大肠杆菌O18抗原多糖的rfb基因簇是大肠杆菌O18A抗原多糖的rfb基因簇。因此,优选地,大肠杆菌O18A抗原多糖的rfb基因簇包含与SEQ ID NO:5具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列,该核苷酸序列编码产生大肠杆菌O18A抗原多糖的酶,并且其中优选地,编码Wzy O-抗原聚合酶的核苷酸序列是编码如上文所定义的本发明的具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中,rfb基因簇包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列,但编码Wzy O-抗原聚合酶的序列除外,后者是编码如上文所定义的本发明的具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。大肠杆菌O18A抗原多糖的重复单元的结构被示出为表1中的条目(O18A)。
因此,在某些优选的实施方案中,本发明的宿主细胞包含大肠杆菌rfb基因簇,其中编码Wzy O-抗原聚合酶的核苷酸序列是编码如上文所定义的本发明的具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。因此,在某些优选的实施方案中,内源Wzy O-抗原聚合酶编码序列已被编码如上文所定义的本发明的具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽的核苷酸序列替代。去除内源Wzy编码序列以及用编码本发明的Wzy聚合酶的序列替代可以通过使用本领域公知的基因编辑技术来实现。
在一个实施方案中,waaL基因在本发明的宿主细胞的基因组中发生缺失或功能失活。术语“waaL”和“waaL基因”是指编码具有位于周质中的活性位点的膜结合酶的O-抗原连接酶基因。waaL编码的酶将十一异戊二烯基磷酸酯(UPP)结合的O抗原转移到脂质A核心,从而形成脂多糖。内源waaL基因的缺失或破坏(例如,ΔwaaL菌株)破坏了O-抗原向脂质A的转移,并且可以替代地增强O-抗原向另一种可用的生物分子(诸如在本发明的宿主细胞中表达的载体蛋白)的转移。
在本发明的宿主细胞的一个实施方案中,负责O16 O-抗原糖基化的大肠杆菌gtrABS基因在宿主细胞的基因组中发生缺失或功能失活。在一个优选的实施方案中,大肠杆菌gtrABS基因在大肠杆菌W3110宿主细胞的基因组中发生缺失或功能失活。虽然不同血清型中的gtrA和gtrB基因是高度同源和可互换的,但gtrS基因编码血清型特异性O-抗原糖基转移酶。在大肠杆菌中,W3110 GtrS可以将葡萄糖(Glc)残基转移到大肠杆菌O16 O-抗原的a-L-Rha-(1→3)-D-G1cNAc基序中的GlcNAc糖。
如技术人员将理解的,包含在本发明的宿主细胞中的本发明的多肽,诸如载体蛋白、寡糖基转移酶、具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽和rfb基因簇的其他酶,以编码本发明的多肽的核酸形式方便地提供给宿主细胞。编码本发明的多肽的核酸优选地是核酸构建体,特别是包含用于表达本发明的多肽的一个或多个表达盒的表达构建体,其中编码本发明的多肽的核苷酸序列与用于在本发明的宿主细胞中表达该多肽的表达控制序列可操作地连接。合适的表达控制序列如上所述,并且通常至少包括启动子。启动子可以是组成型启动子,或者它可以是活性可以被调节的启动子,例如在某些条件(例如温度变化或细胞中某些化学物质或蛋白质的存在)下被遏制或诱导,所有这些同样都是本领域众所周知的。核酸构建体可以是染色体外的,例如质粒或其他载体,或者核酸构建体可以被整合到本发明的宿主细胞的基因组中。用于在本发明的宿主细胞中表达多肽的核酸构建体的构建和/或合成的分子生物学方法通常是本领域熟知的。
任选地,O-抗原的链长可以通过操纵天然Wzz O-抗原链长调节剂机制来操纵,例如通过过表达或补充Wzz O-抗原链调节剂,例如通过将大肠杆菌wzzB基因替代为来自沙门氏菌属和志贺菌属内的物种或来自铜绿假单胞菌的其对应物之一,例如肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)对应物、fepE或其他wzz同源物(参见例如US2018/0099038、WO2020/039359),由此例如可以增加O-抗原的重复单元的数目,伴有或不伴有Wzy蛋白的额外过表达。有关这些物种的wzz样基因的效应已有文献描述。然而,不需要这些来获得具有良好免疫原性的生物缀合物,并且在优选的实施方案中,在不操纵Wzz链长调节剂机制的情况下制备根据本发明的生物缀合物。
在一个实施方案中,用包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性和如上文所定义的指示位置处的特定氨基酸的多肽的本发明的宿主细胞生产的大肠杆菌O18抗原生物缀合物的产率为当使用相同条件与表达具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的参考Wzy O-抗原聚合酶的其他方面相同的宿主细胞时产生的产率的至少105%、110%、120%、150%或200%。
在一个实施方案中,相比于当使用相同条件与表达具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的参考Wzy O-抗原聚合酶的其他方面相同的宿主细胞时生产的生物缀合物的糖基化位点的占有率,用包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性和如上文所定义的指示位置处的特定氨基酸的多肽的本发明的宿主细胞生产的大肠杆菌O18抗原生物缀合物的糖基化位点的占有率有所改善。因此,在一个实施方案中,在包含用本发明的宿主细胞生产的大肠杆菌O18抗原生物缀合物且其载体蛋白包含4个糖基化位点的组合物中,至少50%、55%、60%、65%或70%的生物缀合物分子被二糖基化、三糖基化或四糖基化,即占有二至四个糖基化位点。优选地,在该实施方案中,载体蛋白包含与SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,包含4个糖基化位点,这些糖基化位点包含糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr),更优选具有SEQ ID NO:4。更优选地,在该实施方案中,载体蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的EPA。在某些实施方案中,此类组合物是生产O18生物缀合物的宿主细胞的周质级分。优选地,此类组合物包含O18抗原(“sEPA”)的重复单元平均数为约1至3的不超过20%、15%、10%生物缀合物。
在进一步方面,本发明还涉及方法,其中本发明的宿主细胞用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物。因此,一个实施方案涉及用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的方法,其中优选地,该方法至少包括以下步骤:a)培养本发明的宿主细胞以生产生物缀合物。在一个实施方案中,在步骤a)中,在有利于生产生物缀合物的条件下培养本发明的宿主细胞。在某些实施方案中,该方法涉及O18A生物缀合物的生产。在适于表达包含与大肠杆菌O18抗原多糖共价偶联的载体蛋白的生物缀合物的条件下培养本发明的宿主细胞,此类条件是本领域技术人员已知的,使用例如先前在WO 2015/124769或WO 2020/191082中描述的方法。
在一个实施方案中,用于生产O18生物缀合物的方法还包括以下步骤:b)回收生物缀合物。鉴于本公开,可以使用本领域已知的任何方法从重组宿主细胞或培养基中分离、离析和/或纯化O18生物缀合物。例如,O18生物缀合物可以通过蛋白质纯化领域中已知的任何方法来纯化,例如通过色谱法(例如,离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、亲和色谱法和分级柱色谱法)、离心、差异溶解度,或者通过用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。参见例如Saraswat等人,2013,Biomed.Res.Int.,(第1-18页);也参见WO 2009/104074中描述的方法。此外,可以使生物缀合物与异源多肽序列融合以促进纯化。纯化和表征生物缀合物的方法已描述于例如上文Ihssen等人,2010,以及WO 2006/119987、WO 2009/104074,特别是WO2015/124769和WO 2017/035181及WO2020/191082A1中,这些文献中的每一者的公开内容均以引用方式并入本文。
在一个实施方案中,用于生产O18生物缀合物的方法还包括以下步骤c):将回收的生物缀合物配制成药物组合物。将生物缀合物配制成药物组合物通常将涉及制备组合物,该组合物包含本发明的生物缀合物和至少一种药学上可接受的赋形剂,如下文更详细描述的。在一个实施方案中,用于生产O18生物缀合物的方法还包括将佐剂添加到包含生物缀合物的药物组合物中。用于掺入药物组合物中的合适佐剂在下文中更详细地描述。
在一个实施方案中,用于生产O18生物缀合物的方法还包括将与载体蛋白缀合的大肠杆菌O-抗原多糖的一种或多种附加缀合物或生物缀合物添加到药物组合物中以获得多价组合物,优选多价生物缀合物组合物。因此与载体蛋白缀合的大肠杆菌O-抗原多糖的一种或多种附加缀合物优选地是O18以外的或更优选O18A以外的血清型的大肠杆菌O-抗原多糖的生物缀合物。在一个优选的实施方案中,一种或多种附加生物缀合物包含选自由大肠杆菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75组成的组的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部九种O-抗原多糖。下文提供了大肠杆菌O-抗原多糖血清型的详细描述(也参见表1)。此类附加缀合物或生物缀合物可如之前所述获得,例如如WO2020/191082A1中所述。
因此,在一个优选的实施方案中,用于生产O18生物缀合物的方法还包括将与载体蛋白缀合的大肠杆菌O-抗原多糖的附加生物缀合物添加到药物组合物中以获得多价组合物,其中多价生物缀合物组合物包含:(i)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18A抗原多糖的生物缀合物;(ii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O1A抗原多糖的生物缀合物;(iii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O2抗原多糖的生物缀合物;(iv)与载体蛋白缀合的大肠杆菌葡糖基化O4抗原多糖的生物缀合物;(v)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O6A抗原多糖的生物缀合物;(vi)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O15抗原多糖的生物缀合物;(vii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O16抗原多糖的生物缀合物;(viii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O25B抗原多糖的生物缀合物;以及(ix)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O75抗原多糖的生物缀合物。在一个实施方案中,多价生物缀合物组合物还包含:(x)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O8抗原多糖的生物缀合物。优选地,在这些实施方案中,每种生物缀合物(i)至(ix)中的载体蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在另一方面,本发明涉及本发明的宿主细胞用于改善大肠杆菌O18抗原生物缀合物的糖基化位点的占有率的用途,该宿主细胞包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性和如上文所定义的指示位置处的特定氨基酸(即,具有(i)I199、K377和A395;或(ii)T199、K377和V395;或(iii)T199、K377和A395;或(iv)I199、K377和V395;或(v)I199、M377和A395;其中在每种情况下,这些位置对应于SEQ ID NO:1的位置)的多肽。相比于当使用相同条件与表达具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的参考Wzy O-抗原聚合酶的其他方面相同的宿主细胞时生产的生物缀合物的糖基化位点的占有率,大肠杆菌O18抗原生物缀合物的糖基化位点的占有率的改善可以例如通过具有短重复单元的生物缀合物的量的减少(其中表1的O18结构中的n仅为约1至3)和/或优选地通过由载体蛋白组成的生物缀合物的量的增加(该载体蛋白包含与载体蛋白中的至少两个或更多个N-糖基化共有序列缀合的O18抗原多糖)(并且优选地其中表1的O18结构中的n为至少5)来观察。
在另一方面,本发明涉及与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物,其在使用如上文所述的本发明的宿主细胞生产生物缀合物的本发明方法中获得或可获得。
如本文所用,术语“缀合物”、“糖缀合物”和“生物缀合物”是指含有与载体蛋白共价结合的大肠杆菌O-抗原的缀合产物。本发明的缀合物优选地是生物缀合物,其是在宿主细胞中生产的缀合产物,其中O-抗原和载体蛋白由宿主细胞的机制通过生物合成来生产,并且其中O-抗原还酶促地共价连接至载体蛋白,例如通过宿主细胞的酶经由N-连接。
在又一方面,本发明涉及一种组合物,该组合物包含与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物,其在使用如上文所述的本发明的宿主细胞生产生物缀合物的本发明方法中获得或可获得。
在一个实施方案中,包含与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原的生物缀合物的组合物是包含这样的生物缀合物的组合物,其中载体蛋白包含4个糖基化位点,并且其中该组合物中至少50%、55%、60%、65%或70%的载体蛋白分子在至少两个N-糖基化序列处被大肠杆菌O18抗原重复序列糖基化,即被二糖基化、三糖基化或四糖基化,因此占有二至四个糖基化位点。优选地,在该实施方案中,载体蛋白包含与SEQ ID NO:3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列,包含4个糖基化位点,这些糖基化位点包含糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr),更优选具有SEQ ID NO:4。更优选地,在该实施方案中,载体蛋白包含具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的EPA。在某些实施方案中,此类组合物是生产O18生物缀合物的宿主细胞的周质级分。优选地,此类组合物包含大肠杆菌O18抗原多糖(“sEPA”)的重复单元平均数为约1至3的不超过20%、15%、10%生物缀合物。
在一个实施方案中,包含与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原的生物缀合物的组合物是除生物缀合物外还包含药学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的(药物)组合物可以包含任何药学上可接受的赋形剂,包括载剂、填充剂、防腐剂、增溶剂和/或稀释剂。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液体载剂,特别是对于可注射溶液而言。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合适的药物载剂的另外示例是技术人员熟知的并且已描述于教科书中。
如本文所用,术语“药学上可接受的载剂”是指不干扰根据本发明的组合物的效果或根据本发明的组合物的生物活性的非毒性材料。“药学上可接受的载剂”可以包括任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、油、类脂、含脂质囊泡、微球体、脂质体包囊或本领域熟知的用于在药物配制品中使用的其他材料。应当理解,药学上可接受的载剂的特性将取决于具体应用的施用途径。根据本公开,根据具体实施方案,适合用于疫苗的任何药学上可接受的载剂均可用于本发明。合适的赋形剂包括但不限于无菌水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合,以及稳定剂,例如人血清白蛋白(HSA)或其他合适的蛋白质和还原糖。
合适的缓冲液包括Tris缓冲盐水、磷酸盐缓冲液和蔗糖-磷酸盐-谷氨酸缓冲液。例如,Tris缓冲盐水(TBS)pH 7.4(例如含有Tris、NaCl和KCl,例如分别为25mM、137mM和2.7mM);包含pH为约7.0的约10mM KH2PO4/Na2HPO4缓冲液、约5%(w/v)山梨醇、约10mM甲硫氨酸和约0.02%(w/v)聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液;或包含pH为约7.0的约10mM KH2PO4/Na2HPO4缓冲液、约8%(w/v)蔗糖、约1mM EDTA和约0.02%(w/v)聚山梨酯80的磷酸盐缓冲液。
合适的盐包括例如以下的一种或多种盐:Tris-盐酸盐、氯化钠、氯化钙、氯化钾、磷酸钠、谷氨酸一钠和铝盐(例如,氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾、或此类铝盐的混合物)。
合适的防腐剂包括苯酚、苄索氯铵、2-苯氧乙醇或硫柳汞,防腐剂含量为0.001%至0.01%(w/v)。在其他实施方案中,不包括防腐剂。
该组合物可以被配制成适于向受试者施用的预期途径。例如,该组合物可以被配制成适于皮下、肠胃外、口服、皮内、经皮、结肠直肠、腹膜内、阴道内、直肠、静脉内、口腔、鼻内、气管内、肌内、局部、经皮或肺部施用,优选肌内施用。
本发明的组合物可以与用于施用的说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。
在某些实施方案中,可以在使用前储存本发明的组合物,例如,组合物可以冷冻储存(例如,在约-20℃或在约-70℃下);储存在冷藏条件下(例如,在约2℃-8℃,例如约4℃下);或储存在室温下。
药物组合物任选地可以包含佐剂,或任选地可以与佐剂组合施用。用于与本发明的组合物组合施用的佐剂可以在施用免疫原性组合物之前、同时或之后施用。在其他优选的实施方案中,本发明的药物组合物不包含佐剂,和/或不与佐剂组合施用。
如本文所用,术语“佐剂”是指当与本发明的组合物结合或作为其一部分施用时增大、增强和/或促进对包含与载体蛋白偶联的大肠杆菌O18-抗原的缀合物的免疫应答,但是当该佐剂化合物单独施用时,并不产生对缀合物的免疫应答的化合物。佐剂可以通过若干机制增强免疫应答,这些机制包括例如淋巴细胞募集、B细胞和/或T细胞的刺激以及/或者抗原呈递细胞的刺激。
佐剂的具体示例包括但不限于铝盐(明矾)(诸如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝和氧化铝,包括包含明矾的纳米颗粒或纳米明矾(nanoalum)配制品)、磷酸钙、单磷酰基脂质A(MPL)或3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)(参见例如,英国专利GB2220211、EP0971739、EP1194166、US6491919)、AS01、AS02、AS03和AS04(全部为GlaxoSmithKline;参见例如EP1126876、US7357936了解AS04,参见EP0671948、EP0761231、US5750110了解AS02)、咪唑并吡啶化合物(参见WO2007/109812)、咪唑并喹喔啉化合物(参见WO2007/109813)、δ-菊粉、STING活化合成环二核苷酸(例如,US20150056224)、卵磷脂和卡波姆均聚物的组合(例如,US6676958)以及皂苷,诸如Quil A和QS21,任选地与QS7组合(例如,US 5,057,540)。在一些实施方案中,佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全)。在某些实施方案中,佐剂包含Quil-A,诸如例如可从Brenntag(现Croda)或Invivogen商购获得。QuilA含有来自皂树Molina树的皂苷的水可提取部分。这些皂苷属于三萜皂苷的组,这些三萜皂苷具有共同的三萜主链结构。已知皂苷诱导对T依赖性抗原以及T非依赖性抗原的强佐剂应答,以及强细胞毒性CD8+淋巴细胞应答,并且增强对粘膜抗原的应答。它们还可以与胆固醇和磷脂组合,以形成免疫刺激复合物(ISCOM),其中QuilA佐剂可以活化对来自不同起源的广泛抗原的抗体介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答两者。在某些实施方案中,佐剂是AS01,例如AS01B。AS01是含有MPL(3-O-去酰基-4'-单磷酰基脂质A)、QS21(皂树Molina,级分21)和脂质体的佐剂系统。在某些实施方案中,AS01是可商购获得的(GSK)或者可以如以引用方式并入本文的WO 96/33739中所述进行制备。某些佐剂包含乳剂,这些乳液是两种不混溶流体(例如油和水)的混合物,其中一种作为小液滴悬浮在另一种内部,并且通过表面活性剂稳定。水包油乳液具有形成连续相、围绕小油滴的水,而油包水乳液具有形成连续相的油。某些乳液包含角鲨烯(一种可代谢的油)。某些佐剂包含嵌段共聚物,这些嵌段共聚物是当两种单体聚集在一起并形成重复单元的嵌段时形成的共聚物。包含嵌段共聚物、角鲨烯和微粒稳定剂的油包水乳液的示例是其可以从Sigma-Aldrich商购获得。任选地,乳剂可以与另外的免疫刺激组分(诸如TLR4激动剂)组合或包含另外的免疫刺激组分。某些佐剂是也用于MF59(参见例如EP0399843、US 6299884、US6451325)和AS03中的水包油乳剂(诸如角鲨烯或花生油),任选地与免疫刺激剂(诸如单磷酰基脂质A和/或QS21组合(诸如在AS02中)(参见Stoute等人,1997,N.Engl.J.Med.336,86-91)。佐剂的其他示例是含有免疫刺激剂(诸如MPL和QS21)的脂质体,诸如在AS01E和AS01B中(例如US2011/0206758)。佐剂的其他示例是CpG和咪唑并喹啉(诸如咪喹莫特和R848)。参见例如,Reed G等人,2013,Nature Med,19:1597-1608。在某些实施方案中,佐剂是Th1佐剂。
在某些实施方案中,佐剂包含皂苷,优选地从皂树获得的皂苷的水可提取部分。在某些实施方案中,佐剂包含QS-21。
在某些实施方案中,佐剂含有toll样受体4(TLR4)激动剂。TLR4激动剂是本领域中熟知的,参见例如Ireton GC和SG Reed,2013,Expert Rev Vaccines 12:793-807。在某些实施方案中,佐剂是包含脂质A或其类似物或衍生物的TLR4激动剂。
佐剂(例如包括TLR4激动剂)可以按各种方式配制在例如乳剂诸如油包水(w/o)乳剂或水包油(o/w)乳剂(示例是MF59、AS03)、稳定(纳米)乳剂(SE)、脂质悬浮液、脂质体、(聚合物)纳米颗粒、病毒颗粒、明矾吸附的水性配制品(AF)等中,代表用于佐剂中的免疫调节分子和/或用于免疫原的各种递送系统。
免疫刺激性TLR4激动剂可以任选地与其他免疫调节组分组合,这些免疫调节组分诸如皂苷(例如QuilA、QS7、QS21、基质M、Iscoms、Iscomatrix等)、铝盐、其他TLR的活化剂(例如咪唑并喹啉、鞭毛蛋白、dsRNA类似物、TLR9激动剂诸如CpG等)以及类似物质(参见例如Reed等人,2013,同上)。
如本文所用,术语“脂质A”是指LPS分子的疏水性脂质部分,该疏水性脂质部分包含葡萄糖胺并且通过酮苷键连接至LPS分子的内核中的酮基-去氧辛酮糖酸,该酮苷键将LPS分子锚定在革兰氏阴性细菌的外膜的外小叶中。关于LPS和脂质A结构的合成的概述,参见例如,Raetz,1993,J.Bacteriology 175:5745-5753;Raetz CR和C Whitfield,2002,Annu Rev Biochem 71:635-700;US 5,593,969和US 5,191,072。如本文所用的脂质A包括天然存在的脂质A、其混合物、类似物、衍生物和前体。该术语包括单糖,例如被称为脂质X的脂质A的前体;二糖脂质A;七酰基脂质A;六酰基脂质A;五酰基脂质A;四酰基脂质A,例如脂质A的四酰基前体,称为脂质IVA;去磷酸化脂质A;单磷酰基脂质A;二磷酰基脂质A,例如来自大肠杆菌和类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的脂质A。若干免疫活化脂质A结构含有6个酰基链。直接附接至葡萄糖胺糖上的四个一级酰基链是通常长度在10-16个碳之间的3-羟基酰基链。两个另外的酰基链通常附接至一级酰基链的3-羟基基团。例如,大肠杆菌脂质A通常具有四个附接至糖的C14 3-羟基酰基链,以及分别在2’和3’位置附接至一级酰基链的3-羟基基团的一个C12和一个C14。
如本文所用,术语“脂质A类似物或衍生物”是指类似于脂质A的结构和免疫活性、但不一定天然存在于自然界中的分子。类脂A类似物或衍生物可以被修饰成例如缩短或缩合,和/或使其葡萄糖胺残基被另一个胺糖残基(例如半乳糖胺残基)取代,以在还原端含有2-去氧-2-胺基葡糖酸代替葡萄糖胺-1-磷酸,在位置4’带有半乳糖醛酸部分而不是磷酸。脂质A类似物或衍生物可以从分离自细菌的脂质A制备,例如通过化学衍生;或化学合成,例如通过首先确定优选的脂质A的结构并合成其类似物或衍生物。脂质A类似物或衍生物还可以用作TLR4激动剂佐剂(参见,例如Gregg KA等人,2017,MBio 8,eDD492-17,doi:10.1128/mBio.00492-17)。
例如,脂质A类似物或衍生物可以通过野生型脂质A分子的去酰化,例如通过碱处理而获得。脂质A类似物或衍生物可以例如由分离自细菌的脂质A制备。此类分子也可以化学合成。脂质A类似物或衍生物的另一个示例是从细菌细胞分离的脂质A分子,这些细菌细胞含有参与脂质A生物合成和/或脂质A修饰的酶中的突变或缺失或插入。
MPL和3D-MPL是经修饰以减弱脂质A毒性的脂质A类似物或衍生物。脂质A、MPL和3D-MPL具有糖主链,长脂肪酸链附接到该糖主链上,其中该主链含有糖苷键连中的两个6-碳糖以及4位置处的磷酰基部分。通常,五至八个长链脂肪酸(通常12-14个碳原子)附接至糖主链。由于天然来源的衍生,MPL或3D-MPL可以作为多种脂肪酸取代模式(例如七酰基、六酰基、五酰基等)的复合物或混合物存在,具有不同的脂肪酸长度。对于本文所述的一些其他脂质A类似物或衍生物也是如此,然而合成脂质A变体还可以是限定的和均匀的。MPL及其制造例如在US 4,436,727中进行了描述。3D-MPL例如在US 4,912,094B1中进行了描述,并且与MPL的不同之处在于选择性去除与位置3处的还原端葡萄糖胺酯连接的3-羟基肉豆蔻酰基残基,(比较例如US 4,912,094B1的第1列中的MPL对比第6列中的3D-MPL的结构)。在本领域中,通常使用3D-MPL,但是有时称为MPL(例如,Ireton GC和SG Reed,2013,同上的表1中的第一结构,这种结构被称为但实际上描绘了3D-MPL的结构)。
脂质A(类似物、衍生物)的示例包括MPL、3D-MPL、RC529(例如EP1385541)、PET-脂质A、GLA(吡喃糖基脂质佐剂,一种合成的二糖糖脂;例如US20100310602、US8722064)、SLA(例如Carter D等人,2016,Clin Transl Immunology 5:e108(doi:10.1038/cti.2016.63),其描述了用于优化人类疫苗的TLR4配体的结构-功能方法)、PHAD(磷酸化的六酰基二糖;其结构与GLA的结构相同)、3D-PHAD、3D-(6-酰基)-PHAD(3D(6A)-PHAD)(PHAD、3D-PHAD和3D(6A)PHAD是合成的脂质A变体,参见例如avantilipids.com/divisions/adjuvants,其还提供这些分子的结构)、E6020(CAS编号287180-63-6)、ONO4007、OM-174等。关于3D-MPL、RC529、PET-脂质A、GLA/PHAD、E6020、ONO4007和OM-174的示例性化学结构,参见例如Ireton GC和SG Reed,2013,同上的表1。关于SLA的结构,参见例如Reed SG等人,2016,Curr Opin Immunol 41:85-90中的图1。在某些优选的实施方案中,TLR4激动剂佐剂包含选自3D-MPL、GLA或SLA的脂质A类似物或衍生物。在某些实施方案中,将脂质A类似物或衍生物配制在脂质体中。
包含类脂A类似物或衍生物的示例性佐剂包括GLA-LSQ(合成MPL[GLA]、QS21、脂质,配制为脂质体)、SLA-LSQ(合成MPL[SLA]、QS21,脂质,配制为脂质体)、GLA-SE(合成MPL[SLA],角鲨烯油/水乳液)、SLA-SE(合成MPL[SLA],角鲨烯油/水乳液)、SLA-纳米明矾(合成MPL[SLA],铝盐)、GLA-纳米明矾(合成MPL[GLA],铝盐)、SLA-AF(合成MPL[SLA],水性悬浮液)、GLA-AF(合成MPL[GLA],水性悬浮液)、SLA-明矾(合成MPL[SLA],铝盐)、GLA-明矾(合成MPL[GLA],铝盐)以及GSK ASxx系列佐剂中的几种,包括AS01(MPL、QS21,脂质体)、AS02(MPL、QS21,油/水乳液)、AS25(MPL,油/水乳液)、AS04(MPL,铝盐)和AS15(MPL、QS21、CpG,脂质体)。参见例如,WO 2013/119856、WO 2006/116423、US 4,987,237、U.S.4,436,727、US 4,877,611、US 4,866,034、US 4,912,094、US 4,987,237、US5191072、US5593969、US 6,759,241、US 9,017,698、US 9,149,521、US 9,149,522、US 9,415,097、US 9,415,101、US 9,504,743;Reed G,等人,2013,同上。
非糖脂分子也可以用作TLR4激动剂佐剂,例如合成分子诸如Neoseptin-3或天然分子诸如LeIF,参见例如Reed SG等人,2016,同上。
在一个实施方案中,包含与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原的生物缀合物的本发明的组合物还包含至少一种附加缀合物,该至少一种附加缀合物包含与载体蛋白共价偶联的大肠杆菌O-抗原多糖。与载体蛋白缀合的大肠杆菌O-抗原多糖的一种或多种附加生物缀合物优选地是O18以外的或更优选O18A以外的血清型的大肠杆菌O-抗原多糖的生物缀合物。在一个优选的实施方案中,一种或多种附加生物缀合物包含选自由大肠杆菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75组成的组的至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或全部九种O-抗原多糖。
在一个优选的实施方案中,附加缀合物中的一种或多种附加大肠杆菌O-抗原选自由大肠杆菌O1抗原多糖(例如,O1A抗原多糖)、大肠杆菌O2抗原多糖、大肠杆菌O4抗原多糖(例如,大肠杆菌葡糖基化O4抗原多糖)、大肠杆菌O6抗原多糖(例如,O6A抗原多糖)、大肠杆菌O8抗原多糖、大肠杆菌O15抗原多糖、大肠杆菌O16抗原多糖、大肠杆菌O25抗原多糖(例如,O25A或O25B抗原多糖,优选O25B抗原多糖)和大肠杆菌O75抗原多糖组成的组。优选地,每种附加O-抗原多糖共价连接至载体蛋白。在某些实施方案中,每种载体蛋白(即,每种缀合物的载体蛋白)是EPA载体蛋白。优选地,一种或多种(优选全部)附加缀合物是生物缀合物。
如本文所用,术语“O18”是指大肠杆菌的O18抗原(大肠杆菌血清型O18),并且可以是O18A、O18B、O18A1或O18B1抗原(大肠杆菌血清型O18的四种血清亚型中的每一种),并且在优选的实施方案中,O18是指O18A。O18A抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O18A)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。术语“O1A”是指大肠杆菌的O1A抗原(大肠杆菌血清型O1的血清亚型)。术语“O2”是指大肠杆菌的O2抗原(大肠杆菌血清型O2)。术语“O4”是指大肠杆菌的O4抗原(大肠杆菌血清型O4),其可以包括或可以不包括葡萄糖侧枝(分别称为葡糖基化O4抗原多糖(O4-Glc+)和非葡糖基化O4抗原多糖(O4-Glc-);在优选的实施方案中,O4是O4-Glc+)。术语“O6A”是指大肠杆菌的O6A抗原(大肠杆菌血清型O6的血清亚型)。术语“O8”是指大肠杆菌的O8抗原(大肠杆菌血清型O8)。术语“O15”是指大肠杆菌的O15抗原(大肠杆菌血清型O15)。术语“O16”是指大肠杆菌的O16抗原(大肠杆菌血清型O16)。术语“O25B”是指来自大肠杆菌的O25B抗原(大肠杆菌血清型O25的血清亚型)。术语“O75”是指大肠杆菌的O75抗原(大肠杆菌血清型O75)。
在整个本申请中提及的大肠杆菌O-抗原多糖的结构示于下表1中。示出了每个大肠杆菌O-抗原多糖的单个重复单元。
表1:大肠杆菌O-抗原多糖的结构
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1每个n独立地是1至100的整数,诸如1至50、1至40、1至30、1至20和1至10、3至50、3至40,例如至少5,诸如5至40,例如7至30,例如7至25,例如10至20
本文所述的所有单糖具有它们在本领域中已知的通用含义。单糖可以具有D或L构型。如果未指定D或L,则糖被理解为具有D构型。单糖通常以本领域公知和使用的缩写表示。例如,Glc是指葡萄糖;D-Glc是指D-葡萄糖;并且L-Glc是指L-葡萄糖。单糖的其他常用缩写包括:Rha,鼠李糖;GlcNAc,N-乙酰葡糖胺;GalNAc,N-乙酰半乳糖胺;Fuc,岩藻糖;Man,甘露糖;Man3Me,3-O-甲基-甘露糖;Gal,半乳糖;FucNAc,N-乙酰岩藻糖胺;以及Rib,核糖。后缀“f”是指呋喃糖,并且后缀“p”是指吡喃糖。
包含根据本发明的与大肠杆菌O18抗原多糖共价偶联的载体蛋白的生物缀合物的组合物还可以包含与大肠杆菌O-抗原多糖共价偶联的载体蛋白的至少一种附加缀合物,并且在某些实施方案中,至少一种附加缀合物包含选自由以下各项组成的组的大肠杆菌O-抗原多糖:大肠杆菌O1A抗原多糖、大肠杆菌O2抗原多糖、大肠杆菌O4抗原多糖、大肠杆菌O6A抗原多糖、大肠杆菌O8抗原多糖、大肠杆菌O15抗原多糖、大肠杆菌O16抗原多糖、大肠杆菌O25B抗原多糖和大肠杆菌O75抗原多糖。此类组合物可以通过以下方式制备:将这些缀合物一起加入以获得多价缀合物组合物。优选地,一种或多种并优选全部附加缀合物也是生物缀合物。
在某些实施方案中,O1A抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O1A抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O1A)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O1A抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。
在某些实施方案中,O2抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O2抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O2)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O2抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。
在某些实施方案中,O4抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。已知O-抗原结构修饰存在于大肠杆菌O4血清型内。具体地,一些O4血清型表达具有分支葡萄糖单元的经修饰的O-抗原。如本文所用,“葡糖基化O4抗原”、“葡糖基化O4抗原多糖”、“葡萄糖分支的O4”、“O4-Glc+抗原多糖”、“Glc+O4”和“O4-Glc+抗原”是指具有葡萄糖分支的O4抗原。一些O4血清型具有不含这种分支葡萄糖单元的O4抗原,并且这在本文中称为“非葡糖基化O4抗原”、“非葡糖基化O4抗原多糖”、“O4-Glc-抗原”或“O4-Glc-”。当在本文中提及“O4抗原”时,其可以是O4-Glc+抗原或O4-Glc-抗原。在优选的实施方案中,O4是指O4-Glc+抗原。大肠杆菌非葡糖基化O4抗原和大肠杆菌葡糖基化O4抗原的结构分别示于表1中的式(O4-Glc-)和(O4-Glc+)中,其中n是1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。用于特异性生产O4-Glc+生物缀合物的方法已描述于WO2020/191082A1中,其全文并入本文。优选地,O4抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。
在某些实施方案中,O6A抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O6A抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O6A)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O6A抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。
在某些实施方案中,O8抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O8抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O8)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O8抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。
在某些实施方案中,O15抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O15抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O15)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O15抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。
在某些实施方案中,O16抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O16抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O16)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O16抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。与载体蛋白共价连接的大肠杆菌O16抗原多糖的缀合物可能在L-Rha糖的位置2处具有一定程度的乙酰化。缀合物中O16抗原多糖的这种O-乙酰化程度优选地为至少30%,优选至少50%,诸如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在某些实施方案中,O25B抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O25B抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O25B)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O25B抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。与如上所述的O16抗原多糖类似,与载体蛋白共价连接的大肠杆菌O25B抗原多糖的缀合物可能在L-Rha糖的位置2处具有一定程度的乙酰化。缀合物中大肠杆菌O25B抗原多糖的这种O-乙酰化程度优选地为至少30%,优选至少50%,诸如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在某些实施方案中,O75抗原多糖(例如,呈分离形式或作为糖缀合物(优选生物缀合物)的一部分)存在于如本文所提供的(药物)组合物(例如,包含通过如本文所述的方法获得的大肠杆菌O18生物缀合物的组合物)中。O75抗原多糖可以包含如表1中所示的式(O75)的结构,其中n为1至100的整数,例如3至50,优选5至40,例如7至25,例如10至20。优选地,O75抗原多糖是缀合物的一部分,更优选地是生物缀合物的一部分,并且共价连接至载体蛋白,例如EPA。
在某些实施方案中,根据本发明的组合物包含根据本发明的具有与大肠杆菌O18抗原多糖共价偶联的载体蛋白的生物缀合物,并且还包含具有与大肠杆菌O-抗原多糖共价偶联的载体蛋白的一种或多种附加缀合物,优选4至25种这样的附加缀合物。优选地,附加缀合物包含一种或多种如上所述的大肠杆菌O-抗原多糖,最优选至少O25B、O1A、O2和O6。特别优选的是包含至少7种、优选至少8种附加缀合物的组合物,并且这些附加缀合物中的优选一些附加缀合物并最优选全部附加缀合物是生物缀合物。
在优选的实施方案中,根据本发明的组合物至少包含大肠杆菌O1A、O2、O4(优选葡糖基化O4)、O6A、O15、O16、O18(优选O18A)、O25B和O75抗原多糖,优选各自独立地与载体蛋白例如EPA共价连接的O1A、O2、葡糖基化O4、O6A、O15、O16、O18A、O25B和O75抗原多糖的缀合物(即至少9价的组合物)。在某些实施方案中,此类组合物还包含大肠杆菌O8抗原多糖,优选为缀合物形式,优选为生物缀合物形式。在某些实施方案中,此类组合物(具有或不具有O8抗原多糖)包含来自其他血清型的附加大肠杆菌O-抗原多糖,该多糖优选与载体蛋白缀合,优选生物缀合物,例如来自2至10种附加血清型。在某些实施方案中,提供了包含至少九种生物缀合物的药物组合物,其中每种生物缀合物包含与来自不同血清型的大肠杆菌O-抗原多糖共价连接的载体蛋白,其中血清型包括O18A(并且O18A生物缀合物是根据本发明的生物缀合物,其使用根据本发明的方法制备)、O1A、O2、O4-Glc+、O6A、O15、O16、O25B和O75。在某些实施方案中,载体蛋白是EPA,例如具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的EPA。
根据本发明的组合物可以任选地包含期望因此产生免疫应答的另外蛋白质、碳水化合物和脂多糖,或与它们组合或一起施用。
在另一方面,本发明涉及用作药剂的本发明药物组合物。
在进一步方面,本发明涉及如本文所述的药物组合物作为用于诱导针对大肠杆菌的免疫应答的药剂的用途。
如本文所用,术语“免疫原”或“免疫原性”或“抗原”可互换使用以描述一种分子,这种分子在单独或连同佐剂一起施用于接受者,或在展示媒介物上呈现时,可以产生免疫应答。
如本文所用,对抗原或组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是指在受试者中发展对该抗原或该组合物中存在的抗原的体液和/或细胞免疫应答。
在某些实施方案中,如本文所述的药物组合物用于预防或治疗由大肠杆菌感染引起的疾病。在优选的实施方案中,由大肠杆菌感染引起的疾病是侵袭性肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)疾病(IED)。
如本文所用,术语“肠外致病性大肠杆菌”或“ExPEC”是指遗传相关致病性大肠杆菌菌株,其通常在胃肠道外的身体部位侵袭、定殖和诱导疾病。ExPEC细菌包括尿路致病性(UPEC)大肠杆菌、新生儿脑膜炎(NMEC)大肠杆菌、败血症相关(SePEC)大肠杆菌、粘附侵袭性(AIEC)大肠杆菌和禽致病性(APEC)大肠杆菌。与ExPEC或ExPEC感染相关的疾病包括但不限于尿道感染(UTI)、手术部位感染、菌血症、腹腔或骨盆感染诸如腹内感染(IAI)、肺炎、医院获得性肺炎、骨髄炎、蜂窝组织炎、肾盂肾炎、伤口感染、脑膜炎、新生儿脑膜炎、腹膜炎、胆管炎、软组织感染、脓性肌炎、化脓性关节炎和败血症。
在进一步方面,本发明涉及在有此需要的受试者中预防或治疗由大肠杆菌感染引起的疾病、特别是侵袭性肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)疾病(IED)的方法,该方法包括施用有效量的如本文所述的药物组合物。
如本文所用,术语“有效量”是指在受试者中引起期望的生物学或药物学应答的活性成分或组分的量。关于所阐述的目的,有效量可以根据经验并且以常规方式来确定。例如,可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。
如本文所用,“受试者”或“患者”意指将或已经通过根据本发明的实施方案的方法或组合物疫苗接种的任何动物,优选地哺乳动物,最优选地人。如本文所用,术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、天竺鼠、猴、人等,最优选地人。在某些实施方案中,受试者是成人。如本文所用,术语“成人”是指18岁或以上的人。在某些实施方案中,受试者是以下的一者或多者:(i)约16岁至约50岁,例如约16岁至约35岁的女性;
(ii)超过50岁、或超过55岁、或超过60岁、或超过65岁的成人;
(iii)出现UTI复发的人类受试者;
(iv)患有或有风险患上大肠杆菌菌血症或败血症的人类受试者;
(v)患有需要使用导管的病症的人类受试者;
(vi)接受预先安排的手术的人类受试者;
(vii)人类绝经后妇女;或者
(viii)患有糖尿病的人类受试者。
在又进一步方面,本发明还涉及如本文所述的药物组合物用于制造预防或治疗由大肠杆菌感染引起的疾病,特别是侵袭性肠外致病性大肠杆菌(ExPEC)疾病(IED)的疫苗或药剂的用途。
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利;这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均关于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
序列描述
表2:序列
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实施例
本发明的以下实施例旨在进一步说明本发明的性质。应当理解,以下实施例不限制本发明,并且本发明的范围由所附权利要求书确定。
最近已经开发出大肠杆菌中的生物缀合系统,其中抗原多糖和载体蛋白均在体内合成,随后在体内通过大肠杆菌中表达的寡糖基转移酶PglB(一种空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)酶)的活性来缀合(Wacker等人,Proc.Nat.Acad.Sci.(2006),第103卷,第7088-93页)。这种N-连接的蛋白质糖基化系统能够将多样的多糖转移至载体蛋白,从而允许使用方法从表达生物缀合物的细菌中纯化生物缀合物。生物缀合已经成功地用于生产大肠杆菌四价O-抗原候选疫苗的缀合物多糖(Poolman和Wacker,J.Infect.Dis.(2016),第213卷第1期,第6-13页;WO 2015/124769;WO 2017/035181)。已经描述了包含10种生物缀合物的组合物(O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75,该组合物称为ExPEC10V)并且该组合物正在进行临床试验(例如,WO2020/191082A1)。每种生物缀合物由单独的生产菌株生产,其显示出O-血清型依赖性产率变化。对于几种O-血清型的O-抗原生产菌株,通过表达具有经修饰的底物特异性的空肠弯曲杆菌糖基转移酶PglB的变体可以获得产率的提高(参见例如WO 2016/107818、WO 2016/107819)。然而,对于在为ExPEC10V组合物制造生物缀合物的十种血清型中生物缀合物产率最低的O18 O-血清型,使用空肠弯曲杆菌PglB蛋白的变体及使用替代PglB同源物并不能提高产率。另外,旨在提高O18生物缀合产率的进一步平台修饰未成功达到该目标。这些修饰包括WecA的过表达,WecA这种蛋白质通过催化N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)-1-磷酸转移到十一异戊二烯基磷酸酯(Und-P)上以形成Und-P-P-GlcNAc来引发O-单元生物合成。另外,将大肠杆菌K-12生物缀合平台菌株中存在的天然Wzz O-抗原链长调节剂替换为其他革兰氏阴性细菌物种的O-抗原链长调节剂,导致O18A O-抗原链长增加,但没有引起产物产率显著增加。
实施例1:产率提高的O18生物缀合物生产菌株
然而,我们确实获得了O18生物缀合物产物产率增加的菌株,并且发现与现有O18生物缀合物生产菌株(其包含具有SEQ ID NO:1的Wzy O-抗原聚合酶)中的Wzy相比,那些菌株中的Wzy O-抗原聚合酶具有氨基酸突变。基于此,我们建立了O18生物缀合物的新型生产菌株,与先前描述的(参见WO 2020/191082)O18生物缀合物生产菌株相比,除了在其Wzy O-抗原聚合酶中的三个氨基酸突变之外,该新型生产菌株在其他方面是相同的。具体地,先前描述的菌株中的Wzy O-抗原聚合酶分别在位置199、377和395处具有氨基酸苏氨酸(T)、甲硫氨酸(M)和缬氨酸(V)(即,该先前描述的菌株的Wzy O-抗原聚合酶在SEQ ID NO:1中给出),而新生产菌株在那些相应位置处具有氨基酸异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)和丙氨酸(A)。
在渗透压休克后运行的200L生物反应器的过滤的周质级分中的O18生物缀合物的产率(即,在有可能合理定量产率的该过程的早期时间点)对于新菌株而言是先前描述的菌株的约2.4倍。
与先前描述的菌株相比,在新菌株中具有四个N-糖基化共有序列的EPA载体蛋白的糖基化位点的占有率增加,即新菌株诱导更多的二糖基化、三糖基化和四糖基化EPA载体蛋白(例如图1)。
实施例2:经修饰的WzyO-抗原聚合酶的构建
接下来,我们进行了Wzy O-抗原聚合酶氨基酸序列的诱变研究,并且我们鉴定了SEQ ID NO:1的Wzy O-抗原聚合酶序列中的这三个位置中的氨基酸取代的特定组合,其对O18生物缀合物的产率和糖基化模式具有影响。
按标准程序使用定点诱变产生了在Wzy O-抗原聚合酶的SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置199、377和395中的一个或多个位置中的氨基酸取代的各种组合。表3中指示了所产生的各种组合。
实施例3:使用经修饰的Wzy O-抗原聚合酶生产O-抗原多糖
通过基于同源重组的遗传修饰技术,将存在于来自大肠杆菌血清型O18A的rfb簇中的wzy基因(示例作为SEQ ID NO:5提供)(已经插入大肠杆菌K-12生物缀合物生产菌株W3110的染色体中)替换为编码具有如表3中所指示的突变的SEQ ID NO:1的经修饰的WzyO-抗原聚合酶的基因变体。除了来自大肠杆菌血清型O18A的rfb簇之外,大肠杆菌生物缀合物生产菌株W3110还包含编码EPA载体蛋白的核酸(具有SEQ ID NO:3)和编码寡糖基转移酶PglB的核酸(具有SEQ ID NO:6)。O18A多糖生物缀合物在摇瓶培养物中生产并使用渗透压休克提取,如先前例如在WO 2020/191082中所述。
实施例4:表征O18-生物缀合物
使用用于生物缀合物免疫检测的O18A特异性单克隆抗体,对来自含有诱导O18A多糖生物缀合物表达的Wzy变体(具有如表3中所指示的突变)的大肠杆菌K-12生物缀合物生产菌株W3110的摇瓶培养物的周质提取物进行毛细管电泳免疫测定。基于与sEPA、单糖基化EPA和更高级形式的糖基化EPA(二-/三-/四-糖基化EPA)相对应的峰的信号强度,对每个样品进行相对定量,如通过相对于总产物信号的MW所确定的(表3)。
表3.野生型及在所指示的SEQ ID NO:1的位置199、377和395中的一个或多个位置 中具有氨基酸取代的变体Wzy O抗原聚合酶以及它们对O18生物缀合物的糖基化模式的影 响。使糖基化模式得到改善的变体以粗体指示。
实施例5:用新生产菌株生产O18生物缀合物,以及具有免疫原性活性的ExPEC9V和
ExPEC10V多价产物
使用用于生产O18A生物缀合物的新菌株来生产O18A生物缀合物,在渗透压休克后从周质提取O18A生物缀合物,对该生物缀合物进行色谱分析以去除宿主细胞蛋白,并且使用提取的生物缀合物来制备包含该O18A生物缀合物作为药物物质的药物组合物,基本上如WO 2020/191082(其中的实施例8)中所述。
还将新的O18A药物物质与大肠杆菌O-抗原O1A、O2、O4(glc+)、O6A、O15、O16、O25B和O75(并且在一些情况下还包括O8)的其他生物缀合物的药物物质混合,以获得多价(分别为9价、10价)药物产物。这些药物产物在施用给兔时诱导针对其O-抗原存在于组合物中的大肠杆菌血清型的抗体。因此,根据本发明(的方法)(获得的)的生物缀合物和组合物被证明适于诱导针对大肠杆菌的免疫应答。
Claims (16)
1.一种革兰氏阴性细菌宿主细胞,包含:
(a)包含至少一个糖基化共有序列的载体蛋白;
(b)大肠杆菌O18 rfb基因座;以及
(c)寡糖基转移酶;
其中所述细胞包含具有Wzy O-抗原聚合酶活性的多肽,所述多肽包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含:
i)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;
ii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;
iii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;
iv)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;或
v)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的甲硫氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的宿主细胞,其中具有Wzy O-抗原聚合酶活性的所述多肽包含SEQ ID NO:1的所述氨基酸序列,不同的是所述氨基酸序列包含:
i)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;
ii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;
iii)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的苏氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸;
iv)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的缬氨酸;或
v)与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的甲硫氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的宿主细胞,其中具有Wzy O-抗原聚合酶活性的所述多肽包含与SEQ ID NO:1中的位置199相对应的位置处的异亮氨酸、与SEQ ID NO:1中的位置377相对应的位置处的赖氨酸和与SEQ ID NO:1中的位置395相对应的位置处的丙氨酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的宿主细胞,其中编码具有Wzy O-抗原聚合酶活性的所述多肽的多核苷酸或载体被整合到所述宿主细胞的所述基因组中。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞是大肠杆菌K-12菌株,优选菌株W3110。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的宿主细胞,其中存在如下至少一种情况:
a)所述寡糖基转移酶包含与SEQ ID NO:6具有至少95%序列同一性的氨基酸序列;
b)所述载体蛋白包含SEQ.ID NO.3;以及
c)所述大肠杆菌O18 rfb基因座是具有血清型O18A的大肠杆菌菌株的rfb基因座。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的宿主细胞,其中所述寡糖基转移酶包含SEQ IDNO:6的所述氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的宿主细胞,其中所述宿主细胞包含具有编码WzyO-抗原聚合酶的核苷酸序列的大肠杆菌O18 rfb基因座,所述核苷酸序列编码具有Wzy O-抗原聚合酶活性并具有如权利要求1至3中任一项所定义的序列的多肽。
10.一种用于生产与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18抗原多糖的生物缀合物的方法,所述方法包括:培养根据权利要求1至9中任一项所述的宿主细胞以生产所述生物缀合物。
11.根据权利要求10所述的方法,还包括回收所述生物缀合物。
12.根据权利要求11所述的方法,还包括将所述回收的生物缀合物配制成药物组合物。
13.根据权利要求12所述的方法,还包括将与载体蛋白缀合的大肠杆菌O-抗原多糖的一种或多种附加生物缀合物添加到所述药物组合物中以获得多价生物缀合物组合物。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述一种或多种附加生物缀合物包含选自由大肠杆菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75组成的组的至少一种O-抗原多糖。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述多价生物缀合物组合物包含:
(i)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O18A抗原多糖的所述生物缀合物;
(ii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O1A抗原多糖的生物缀合物;
(iii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O2抗原多糖的生物缀合物;
(iv)与载体蛋白缀合的大肠杆菌葡糖基化O4抗原多糖的生物缀合物;
(v)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O6A抗原多糖的生物缀合物;
(vi)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O15抗原多糖的生物缀合物;
(vii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O16抗原多糖的生物缀合物;
(viii)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O25B抗原多糖的生物缀合物;以及
(ix)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O75抗原多糖的生物缀合物,其中优选地,每种生物缀合物中的所述载体蛋白包含SEQ ID NO:3。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述多价生物缀合物组合物还包含:
(x)与载体蛋白缀合的大肠杆菌O8抗原多糖的生物缀合物,其中优选地,所述载体蛋白包含SEQ ID NO:3。
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