TW202304504A - 大腸桿菌ｏ１８生物軛合物之生產 - Google Patents

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Abstract

本發明關於用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物的宿主細胞。該等宿主細胞的特徵在於，它們包含與SEQ ID NO: 1的野生型Wzy O抗原聚合酶相比經修飾的Wzy O抗原聚合酶，該等經修飾的Wzy O抗原聚合酶在位置199、377和395的一個或多個中具有胺基酸取代的特定組合，並且該等經修飾的Wzy O抗原聚合酶改進了由該等宿主細胞生產的O18生物軛合物的產率和糖基化模式。本發明進一步關於其中使用該等宿主細胞來生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物之方法，包含該等生物軛合物的組成物（包括包含另外的O抗原多糖血清型的生物軛合物的多價組成物）。

Description

大腸桿菌O18生物軛合物之生產
本發明關於醫學微生物學、免疫學和疫苗領域。特別地，本發明關於包含改進的Wzy O抗原聚合酶的宿主細胞，該等宿主細胞用於生產具有增加的產率和增加的糖基化程度的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物。本發明進一步關於包含本發明之生物軛合物的組成物，並且關於這樣的組成物用於誘導針對大腸桿菌的免疫反應以預防或治療大腸桿菌感染、特別是侵襲性腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）疾病感染之用途。
腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）菌株與共生大腸桿菌菌株一起通常是人胃腸道中無害之棲居生物。儘管許多株譜系由O抗原、莢膜抗原（capsule）和鞭毛抗原血清型（縮寫為O:K:H，例如O25:K1:H4）所定義的ExPEC為主，但ExPEC分離株不能容易地根據血清型與共生分離株進行區分。與共生大腸桿菌相比，ExPEC菌株表現多種毒力因子，使其能夠在胃腸道中定殖並引起廣泛的腸外感染，這與住院和死亡造成的巨大醫療費用負擔有關。新生兒、老年人和免疫功能低下的患者特別容易受到ExPEC感染，包括侵襲性ExPEC疾病（IED）。
O抗原包含革蘭氏陰性細菌（包括大腸桿菌）中細胞壁脂多糖（LPS）之免疫優勢組分。目前已鑒定出超過（＞）180種血清學上獨特的大腸桿菌O抗原，絕大多數ExPEC分離株被分類在少於20種O抗原血清型中。全長大腸桿菌O抗原通常由約10至25個附接到高度保守的LPS核心結構的重複糖單元組成，每個組分分別由主要在 rfb和 rfa基因簇中編碼的酶獨立地合成。O抗原聚合後，通常可以藉由添加乙醯基或葡萄糖殘基來修飾O抗原多糖骨架。該等修飾藉由產生具有共同多糖骨架但側支不同的抗原性不同的血清型而有效地增加了血清型的多樣性。編碼O抗原修飾酶的基因通常位於染色體上的 rfb簇之外，並且在某些情況下，該等基因存在於溶原性噬菌體中。
開發疫苗以預防ExPEC感染的努力集中在O抗原多糖軛合物上。12價O抗原軛合物疫苗係藉由提取和純化O抗原多糖並與去毒的銅綠假單胞菌（ Pseudomonas aeruginosa）外毒素A進行化學軛合來合成的，並且在1期臨床研究中針對安全性和免疫原性進行了測試（Cross等人, J. Infect. Dis. [感染性疾病雜誌] (1994) 第170卷, 第834-40頁）。這種候選疫苗從未獲得臨床使用許可。最近在大腸桿菌中開發了一種生物軛合系統，其中抗原多糖和運載體蛋白兩者均在體內合成並且隨後藉由寡糖基轉移酶PglB（一種在大腸桿菌中表現的空腸彎曲桿菌（ Campylobacter jejuni）酶）的活性在體內軛合（Wacker等人, Proc. Nat. Acad. Sci. [美國國家科學院院刊] (2006) 第103卷, 第7088-93頁）。這種N連接的蛋白質糖基化系統能夠將多種多糖轉移到運載體蛋白上，從而實現從表現生物軛合物的細菌中純化該生物軛合物之方法。生物軛合已成功用來生產用於大腸桿菌四價O抗原候選疫苗的軛合物多糖（Poolman和Wacker, J. Infect. Dis. [感染性疾病雜誌] (2016) 第213 (1) 卷, 第6-13頁；WO 2015/124769；WO 2017/035181）。
包含10種生物軛合物的組成物（O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75，該組成物被稱為ExPEC10V）已有描述並且處於臨床試驗中（例如，WO 2020/191082 A1）。
據觀察，與針對ExPEC10V製備的其他九種生物軛合物相比，含有O18A抗原多糖的生物軛合物的產物產率最低（WO 2020/191082 A1）。此外，如此生產的O18A生物軛合物似乎包含相對大量的、由有限數量的O18A抗原多糖重複單元組成的聚糖，稱為「sEPA」（即，具有僅含約1-3個重複單元的多糖鏈的EPA運載體蛋白，在O18A生物軛合物藥物物質的生產製程中，其量超過周質部分中O18A生物軛合物的20%），該sEPA產物不易與主要包含聚糖（其中O18A抗原多糖由至少五個重複單元組成）的較佳的生物軛合物分離。屬於O18血清組的ExPEC分離株已在美國和歐盟血液分離株的當代監測研究中得到普遍鑒定，因此，O18軛合物被認為係ExPEC疫苗的相關組分。因此，期望改進O18抗原多糖軛合物的產率。
因此，本發明之一個目的係提供用於在生產期間增加包含O18抗原多糖的生物軛合物的產物產率的材料和方法，和/或生產用於獲得與使用先前描述的生產製程獲得的O18生物軛合物相比具有降低的sEPA相對量的O18生物軛合物之材料和方法。本發明之另一個目的係提供用於生產與使用先前描述的材料和方法獲得的O18生物軛合物相比具有增加的糖基化程度的大腸桿菌O18A抗原多糖的生物軛合物之材料和方法。
在第一方面，本發明關於革蘭氏陰性細菌宿主細胞，其包含：(a) 含有至少一個糖基化共有序列的運載體蛋白；(b) 大腸桿菌O18 rfb基因座；和 (c) 寡糖基轉移酶；其中該細胞包含具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含：i) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸（Ile，I）、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸（Lys，K）、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸（Ala，A）；ii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸（Thr，T）、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸（Val，V）；iii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸；iv) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸；或v) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的甲硫胺酸（Met，M）、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸。
在一個實施方式中，在宿主細胞中，具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，區別在於該胺基酸序列包含：i) 在位置199處的Ile、在位置377處的Lys、和在位置395處的Ala；ii) 在位置199處的Thr、在位置377處的Lys、和在位置395處的Val；iii) 在位置199處的Thr、在位置377處的Lys、和在位置395處的Ala；iv) 在位置199處的Ile、在位置377處的Lys、和在位置395處的Val；或v) 在位置199處的Ile、在位置377處的Met、和在位置395處的Ala；其中所有位置均對應於SEQ ID NO: 1中的那些。
在一個實施方式中，在宿主細胞中，具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽包含在位置199處的Ile、在位置377處的Lys、和在位置395處的Ala，其中該等位置對應於SEQ ID NO: 1中的那些。
在一個實施方式中，宿主細胞包含多核苷酸或載體，該多核苷酸或載體編碼具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽且被整合到該宿主細胞的基因組中。
在一個實施方式中，宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞。在較佳的實施方式中，宿主細胞為大腸桿菌K-12菌株、更較佳的是大腸桿菌K-12菌株W3110。
在一個實施方式中，在宿主細胞中，具有以下中的至少一項：a) 寡糖基轉移酶包含與SEQ ID NO: 6具有至少95%序列同一性的胺基酸序列；b) 運載體蛋白包含SEQ. ID NO. 3；以及c) 大腸桿菌O18 rfb基因座為具有血清型O18A的大腸桿菌菌株的 rfb基因座。較佳的是，寡糖基轉移酶包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。
在一個實施方式中，宿主細胞包含具有編碼Wzy O抗原聚合酶的核苷酸序列的大腸桿菌O18 rfb基因座，該基因座編碼如上文所定義的具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽。
在另一個方面，本發明關於一種用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物之方法，該方法包括：(a) 培養如上文所定義的本發明之宿主細胞以生產生物軛合物。較佳的是，該方法進一步包括回收生物軛合物。
在一個實施方式中，該方法進一步包括將回收的生物軛合物配製到藥物組成物中。
在一個實施方式中，該方法進一步包括將一種或多種另外的與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O抗原多糖的生物軛合物添加到藥物組成物中以獲得多價生物軛合物組成物。較佳的是，一種或多種另外的生物軛合物包含至少一種選自由大腸桿菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75組成之群組的O抗原多糖。在較佳的實施方式中，在該方法中生產的多價生物軛合物組成物包含：(i) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18A抗原多糖的生物軛合物；(ii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O1A抗原多糖的生物軛合物；(iii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O2抗原多糖的生物軛合物；(iv) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌葡糖基化O4抗原多糖的生物軛合物；(v) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O6A抗原多糖的生物軛合物；(vi) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O15抗原多糖的生物軛合物；(vii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O16抗原多糖的生物軛合物；(viii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O25B抗原多糖的生物軛合物；以及 (ix) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O75抗原多糖的生物軛合物，其中較佳的是，每種生物軛合物中的運載體蛋白包含SEQ ID NO: 3。在更較佳的實施方式中，在該方法中生產的多價生物軛合物組成物進一步包含：(x) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O8抗原多糖的生物軛合物，其中較佳的是，運載體蛋白包含SEQ ID NO: 3。
本申請的發明人已驚奇地發現，使用在一個或多個特定位置處與參考序列不同的Wzy O抗原聚合酶導致O18抗原多糖生物軛合物的生產產率的顯著改進。此外，發現使用這種聚合酶令人驚訝地促進了具有增加的聚糖與蛋白質比率和/或增加的糖基化位點佔用率的O18抗原多糖軛合物的生產。
因此，在第一方面，本發明提供了一種用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物的宿主細胞。
在一個實施方式中，本發明之宿主細胞至少包含：(a) 含有至少一個糖基化共有序列的運載體蛋白；(b) 大腸桿菌O18 rfb基因座；(c) 寡糖基轉移酶；和 (d) 具有Wzy O抗原聚合酶活性的本發明之多肽。
在宿主細胞中，具有Wzy O抗原聚合酶活性的本發明之多肽為如下多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列並且進一步具有O抗原聚合酶活性。本發明之多肽是否具有O抗原聚合酶活性可以藉由以下方式測定：在合適的宿主細胞中表現編碼Wzy O抗原聚合酶的核苷酸序列，並且確定由熟悉該項技術者已知之方法或例如Woodward等人所述之方法（2010, Nat Chem Biol. [自然化學生物學] 2010年6月；6 (6): 418-423）（將該文獻以其全文併入本文）生產的聚合O抗原的量。
在一個實施方式中，本發明之宿主細胞包含具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含： i) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸； ii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸； iii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸； iv) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸；或 v) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的甲硫胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸。
分別對應於SEQ ID NO: 1中胺基酸位置199、377或395之一的胺基酸位置在本文中被理解為係指在SEQ ID NO: 1與SEQ ID NO: 1以外的序列的序列比對中（較佳的是在與SEQ ID NO: 1的ClustalW（1.83）序列比對中），較佳的是使用預設設置，在SEQ ID NO: 1以外的胺基酸序列中分別與SEQ ID NO: 1中位置199、377或395之一進行比對的位置。技術人員將知曉如何使用如本文所定義的胺基酸序列比對演算法來鑒定SEQ ID NO: 1以外的Wzy O抗原聚合酶胺基酸序列中的對應胺基酸位置。
在較佳的實施方式中，本發明之宿主細胞包含具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，該多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，區別在於該胺基酸序列包含：i) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸；ii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸；iii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸；iv) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸；或v) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的甲硫胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸。因此，在該實施方式中，本發明之宿主細胞包含具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，該多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，區別在於該胺基酸序列包含：i) 在SEQ ID NO: 1中位置199處的異白胺酸、在SEQ ID NO: 1中位置377處的離胺酸、和在SEQ ID NO: 1中位置395處的丙胺酸；ii) 在SEQ ID NO: 1中位置377處的離胺酸；iii) 在SEQ ID NO: 1中位置377處的離胺酸和在SEQ ID NO: 1中位置395處的丙胺酸；iv) 在SEQ ID NO: 1中位置199處的異白胺酸和在SEQ ID NO: 1中位置377處的離胺酸；或v) 在SEQ ID NO: 1中位置199處的異白胺酸和在SEQ ID NO: 1中位置395處的丙胺酸。
在特別較佳的實施方式中，本發明之宿主細胞包含具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，該多肽包含對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸。
如技術人員將理解的，在一個實施方式中，為了表現具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，本發明之宿主細胞將較佳的是包含編碼如上文所定義的本發明之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸。該多核苷酸的前面可以是與之可操作地連接的啟動子。在某些實施方式中，啟動子對於Wzy O抗原聚合酶編碼序列係內源性的。在某些較佳的實施方式中，啟動子為驅動Wzy O抗原聚合酶在腸桿菌科（Enterobacteriaceae family）細菌、較佳的是埃希菌屬（genus Escherichia）細菌、更較佳的是大腸桿菌物種（species E. coli）細菌中的表現的內源性啟動子。在其他實施方式中，啟動子對於Wzy編碼序列係異源性的，例如，使用技術人員已知的用於重組表現的強啟動子。例如，啟動子係誘導型或組成型原核啟動子，諸如ara、phoA、tac、tet、trc、trp、PBAD、λPL、T5或T7啟動子。
在某些實施方式中，本發明提供了分離的多核苷酸，其可用於構建根據本發明之宿主細胞。多核苷酸可為重組多核苷酸、合成多核苷酸或人工多核苷酸。多核苷酸可以是任何形式的核酸，例如DNA或RNA，較佳的是DNA。多核苷酸可包含一個或多個不存在於天然存在的編碼Wzy的多核苷酸（諸如SEQ ID NO: 2的天然存在的編碼Wzy的多核苷酸）中的核苷酸。特別地，用於本發明之多核苷酸將至少在對應於SEQ ID NO: 1中位置199、377和395的一個或多個密碼子上與天然存在的編碼Wzy的多核苷酸（諸如SEQ ID NO: 2）不同。此外，用於本發明之多核苷酸可以在對應於SEQ ID NO: 1中位置199、377和395中至少一個的位置以外的密碼子上與天然存在的編碼Wzy的多核苷酸不同。多核苷酸可在其5’端和/或3’端具有一個或多個不存在於天然存在的編碼Wzy的多核苷酸中的核苷酸。技術人員可以使用常規技術進行核苷酸取代，該等取代不影響由所描述的多核苷酸編碼的多肽序列，以反映有待表現多肽的任何特定宿主生物體的密碼子使用。因此，除非另外說明，否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此呈簡並形式且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。
如技術人員將進一步理解的，在一個實施方式中，編碼如上文所定義的本發明之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸可被包含在表現構建體或載體中。較佳的是，在表現構建體中，編碼具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸與表現控制序列可操作地連接以在本發明之宿主細胞中（例如在表現盒中）表現多肽。這種表現控制序列可包括如上指定的啟動子，並且可進一步包括夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno）序列、轉錄終止序列等等。在一個實施方式中，表現構建體被包含在載體中。在一個實施方式中，載體為附加型載體，諸如質體或病毒載體，較佳的是質體。在另一實施方式中，多核苷酸、載體或表現構建體被整合到宿主細胞的基因組中。在某些實施方式中，載體或表現構建體較佳的是DNA形式。在某些實施方式中，載體包含與啟動子可操作地連接的本發明之多核苷酸，這意味著多核苷酸受啟動子的控制。在某些實施方式中，編碼如本文所定義的本發明之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸被整合到其在宿主細胞基因組中的 rfb基因座中的天然位置中，例如，使用分子生物學領域技術人員已知的基於同源重組的遺傳修飾技術藉由定點誘變產生。
用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物的本發明之宿主細胞為細菌宿主細胞。在一個實施方式中，宿主細胞為革蘭氏陰性細菌宿主細胞。用於生產包含大腸桿菌O18抗原的生物軛合物的合適的細菌或原核宿主細胞包括但不限於埃希菌屬物種（ Escherichiaspecies）、志賀菌屬物種（ Shigellaspecies）、克雷伯菌屬物種（ Klebsiellaspecies）、黃單胞菌屬物種（ Xhantomonasspecies）、沙門菌屬物種（ Salmonellaspecies）、耶爾森菌屬物種（ Yersiniaspecies）、乳球菌屬物種（ Lactococcusspecies）、乳桿菌屬物種（ Lactobacillusspecies）、假單胞菌屬物種（ Pseudomonasspecies）、棒狀桿菌屬物種（ Corynebacteriumspecies）、鏈黴菌屬物種（ Streptomycesspecies）、鏈球菌屬物種（ Streptococcusspecies）、葡萄球菌屬物種（ Staphylococcusspecies）、芽孢桿菌屬物種（ Bacillusspecies）、和梭菌屬物種（ Clostridiumspecies）。在較佳的實施方式中，本發明之宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞，更較佳的是大腸桿菌K-12菌株，諸如菌株W3110，後者係特別較佳的。
在一個實施方式中，宿主細胞為非天然存在的宿主細胞。因此，宿主細胞可衍生自天然存在的分離株（例如，臨床分離株），該分離株已被修飾以表現如本文所述之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，並且已較佳的是被進一步修飾以包含以下中的一種或多種或全部：i) 如本文所定義的O18 rfb基因座，ii)（用於表現如下的核酸構建體）如本文所定義的包含至少一個糖基化共有序列的運載體蛋白，和iii)（用於表現如下的核酸構建體）如本文所定義的寡糖基轉移酶。
用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物的本發明之宿主細胞進一步較佳的是包含用於將寡糖轉移到運載體蛋白上的N糖基化位點的寡糖基轉移酶（OST）。因此，較佳的是，如本文所提供的宿主細胞包含編碼寡糖基轉移酶（OST）的核苷酸序列。如本文所用的寡糖基轉移酶係將脂質連接的寡糖轉移到包含糖基化共有模體的新生多肽鏈的殘基、例如轉移到包含N糖基化共有模體的新生多肽鏈的天冬醯胺（Asn，N）殘基的酶，這樣的N糖基化共有模體的實例係SEQ ID NO: 4或Asn-X-Ser(Thr)。貫穿本申請，應理解，對於N糖基化模體Asn-X-Ser(Thr)，X可以是除脯胺酸之外的任何胺基酸。較佳的是，這樣的寡糖基轉移酶將寡糖轉移到如本文所述之運載體蛋白的多肽鏈中SEQ ID NO: 4的天冬醯胺殘基上。編碼寡糖基轉移酶的核酸對於宿主細胞可以是天然的，或者可以使用遺傳方法引入宿主細胞中。在較佳的實施方式中，寡糖基轉移酶對於宿主細胞係異源性的。大腸桿菌並非天然包含寡糖基轉移酶，因此如果將大腸桿菌用作宿主細胞以生產生物軛合物，則異源性寡糖基轉移酶被包含在這樣的宿主細胞中，例如在藉由遺傳工程引入後。鑒於本揭露，寡糖基轉移酶可以來自本領域已知之任何來源。
在某些較佳的實施方式中，寡糖基轉移酶為來自彎曲桿菌（ Campylobacter）的寡糖基轉移酶。例如，在一個實施方式中，寡糖基轉移酶為來自空腸彎曲桿菌的寡糖基轉移酶（即，PglB；參見例如，Wacker等人, 2002, Science [科學] 298: 1790-1793；還參見例如，NCBI基因ID：3231775，UniProt登錄號O86154）。在另一實施方式中，寡糖基轉移酶為來自紅嘴鷗彎曲桿菌（ Campylobacter lari）的寡糖基轉移酶（參見例如，NCBI基因ID：7410986）。
在特定的實施方式中，寡糖基轉移酶為來自空腸彎曲桿菌的PglB，包括天然（野生型）蛋白質或其任何變體，諸如國際專利申請公開WO 2016/107818和WO 2016/107819中所述之那些。PglB可將脂質連接的寡糖轉移到共有序列SEQ ID NO: 4和Asn-X-Ser(Thr)中的天冬醯胺殘基上。在特定的實施方式中，PglB寡糖基轉移酶為如本文所定義的具有寡糖基轉移酶的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 6具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列。在較佳的實施方式中，PglB寡糖基轉移酶包含與SEQ ID NO: 6同一的胺基酸序列。在某些實施方式中，野生型PglB中的一個或多個內源性糖基化共有序列已被突變以避免PglB自身糖基化，例如包含突變N534Q的SEQ ID NO: 6。適合用於本文提供的宿主細胞中的變體PglB的實例包括包含突變N311V的SEQ ID NO: 6的PglB。
用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物的本發明之宿主細胞進一步較佳的是包含編碼運載體蛋白的核苷酸序列，該運載體蛋白包含至少一個含有糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)的糖基化位點，更較佳的是至少一個具有SEQ ID NO: 4的糖基化位點。
在一些實施方式中，運載體蛋白選自由以下組成之群組：去毒的銅綠假單胞菌外毒素A（EPA）、大腸桿菌鞭毛蛋白（FliC）、CRM197、麥芽糖結合蛋白（MBP）、白喉類毒素、破傷風類毒素、去毒的金黃色葡萄球菌溶血素A、凝集因子A、凝集因子B、大腸桿菌不耐熱腸毒素、去毒的大腸桿菌不耐熱腸毒素變體、霍亂毒素B亞基（CTB）、霍亂毒素、去毒的霍亂毒素變體、大腸桿菌Sat蛋白、大腸桿菌Sat蛋白的載客結構域（passenger domain）、肺炎鏈球菌（ Streptococcus pneumoniae）溶血素（Pneumolysin）、鑰孔戚血藍素（KLH）、銅綠假單胞菌PcrV、腦膜炎奈瑟氏菌（ Neisseria meningitidis）外膜蛋白（OMPC）、以及來自不可分型流感嗜血桿菌（ Haemophilus influenzae）的蛋白質D。
在某些實施方式中，運載體蛋白為去毒的銅綠假單胞菌外毒素A（EPA）或CRM197，較佳的是，運載體蛋白為EPA。對於EPA，各種去毒的蛋白質變體已經在文獻中進行了描述並且可以用作運載體蛋白。在某些實施方式中，在本發明之軛合物中使用的EPA運載體蛋白以蛋白質毒性較低和/或對糖基化更敏感的這樣一種方式進行修飾。例如，根據Lukac等人, 1988, Infect Immun [感染與免疫], 56: 3095-3098以及Ho等人, 2006, Hum Vaccin [人類疫苗], 2: 89-98，可以藉由使催化必需殘基L552V和ΔE553突變和缺失來實現去毒。在特定的實施方式中，對用於生產本發明之軛合物的運載體蛋白進行修飾，使得該等運載體蛋白中糖基化位點的數量以允許例如在免疫原性組成物中以其生物軛合物形式投與較低濃度的蛋白質的方式進行優化。在特定的實施方式中，宿主細胞編碼包含1-10個、較佳的是2-4個、較佳的是4個糖基化位點的EPA，該等糖基化位點包含具有SEQ ID NO: 4的糖基化共有序列。在一個實施方式中，運載體蛋白包含與SEQ ID NO: 3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，並且包含1-10個、較佳的是2-4個、較佳的是4個糖基化位點，該等糖基化位點包含糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)、更較佳的是具有SEQ ID NO: 4。在較佳的實施方式中，運載體蛋白包含含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的EPA。
在某些較佳的實施方式中，根據本發明之宿主細胞包含編碼含有SEQ ID NO: 6的寡糖基轉移酶的核苷酸序列和編碼含有SEQ ID NO: 3的運載體蛋白的核苷酸序列。
用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物的本發明之宿主細胞進一步較佳的是包含用於合成O18抗原多糖結構的大腸桿菌O18 rfb基因座。
在大腸桿菌中，參與O抗原生物發生的基因產物由 rfb基因座編碼。因此，如本文所提供的宿主細胞進一步較佳的是包含大腸桿菌O18 rfb基因座、較佳的是具有血清型O18A的大腸桿菌菌株的 rfb基因座的核苷酸序列。如本文所用，「O18 rfb基因座」和「O18 rfb基因簇」係指革蘭氏陰性細菌基因組中的、包含共同編碼能夠合成O18抗原多糖結構的酶機制的基因簇的基因座。術語 rfb基因座較佳的是係指來自埃希菌屬、特別是大腸桿菌的基因組基因座。
在某些實施方式中，O18 rfb基因座對於宿主細胞係異源性的，例如被引入宿主細胞的先質細胞中，並且較佳的是被整合到其基因組中。較佳的是，如果原始 rfb基因簇存在於先質細胞中，則這種基因簇已被宿主細胞中的O18 rfb基因簇替換，從而能夠生產O18的生物軛合物。
在某些實施方式中，大腸桿菌O18抗原多糖的 rfb基因簇為大腸桿菌O18A抗原多糖的 rfb基因簇。因此，較佳的是，大腸桿菌O18A抗原多糖的 rfb基因簇包含與SEQ ID NO: 5具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼產生大腸桿菌O18A抗原多糖的酶，並且其中較佳的是，編碼Wzy O抗原聚合酶的核苷酸序列為編碼如上文所定義的本發明之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。在某些實施方式中， rfb基因簇包含除編碼Wzy O抗原聚合酶的序列之外的SEQ ID NO: 5的核苷酸序列，該核苷酸序列為編碼如上文所定義的本發明之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。大腸桿菌O18A抗原多糖的重複單元結構如表1中的條目（O18A）所示。
因此，在某些較佳的實施方式中，本發明之宿主細胞包含大腸桿菌 rfb基因簇，其中編碼Wzy O抗原聚合酶的核苷酸序列為編碼如上文所定義的本發明之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的核苷酸序列。因此，在某些較佳的實施方式中，內源性Wzy O抗原聚合酶編碼序列已被編碼如上文所定義的本發明之具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽（本發明之Wzy聚合酶）的核苷酸序列替換。內源性Wzy編碼序列的去除和用編碼本發明之Wzy聚合酶的序列替換可藉由使用本領域公知的基因編輯技術來實現。
在一個實施方式中，將 waaL基因從本發明之宿主細胞的基因組中缺失或在其中功能失活。術語「 waaL」和「 waaL基因」係指編碼膜結合酶（其活性位點位於周質中）的O抗原連接酶基因。 waaL基因編碼的酶將十一碳二烯磷酸酯（UPP）結合的O抗原轉移到脂質A核心上，從而形成脂多糖。缺失或破壞內源性 waaL基因（例如，Δ waaL菌株）破壞了O抗原向脂質A的轉移，反而可增強O抗原向另一可用生物分子、諸如在本發明之宿主細胞中表現的運載體蛋白的轉移。
在本發明之宿主細胞的一個實施方式中，將負責O16 O抗原糖基化的大腸桿菌 gtrABS基因從宿主細胞的基因組中缺失或在其中功能失活。在較佳的實施方式中，將大腸桿菌 gtrABS基因從大腸桿菌W3110宿主細胞的基因組中缺失或在其中功能失活。儘管不同血清型中的 gtrA和 gtrB基因具有高度同源性和可互換性，但 gtrS基因編碼血清型特異性的O抗原糖基轉移酶。在大腸桿菌W3110中，GtrS可以將葡萄糖（Glc）殘基轉移到大腸桿菌O16 O抗原的a-L-Rha-(1à3)-D-G1cNAc模體中的GlcNAc糖上。
如技術人員將理解的，包含在本發明之宿主細胞中的本發明之多肽，諸如運載體蛋白、寡糖基轉移酶、具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽、和 rfb基因簇的其他酶，以編碼本發明之多肽的核酸形式方便地提供給宿主細胞。編碼本發明之多肽的核酸較佳的是核酸構建體，特別是包含一個或多個用於表現本發明之多肽的表現盒的表現構建體，其中編碼本發明之多肽的核苷酸序列可操作地與表現控制序列連接以在本發明之宿主細胞中表現多肽。合適的表現控制序列如上所述並且通常至少包含啟動子。啟動子可以是組成型啟動子或者它可以是活性可以被調節的啟動子，例如在某些條件（例如溫度變化或細胞中某些化學物質或蛋白質的存在）下被遏制或誘導，所有該等同樣皆為本領域眾所周知的。核酸構建體可以是染色體外的，例如，質體或其他載體或核酸構建體可以被整合到本發明之宿主細胞的基因組中。用於構建和/或合成用於在本發明之宿主細胞中表現多肽的核酸構建體的分子生物學方法在本領域中通常是眾所周知的。
視需要，O抗原的鏈長可以藉由操縱天然Wzz O抗原鏈長調節劑機制來操縱，例如藉由過表現或補充Wzz O抗原鏈調節劑，例如藉由將大腸桿菌 wzzB基因替換為來自沙門菌屬和志賀菌屬內的物種或來自銅綠假單胞菌的其對應物之一，例如腸沙門菌對應物、 fepE或其他 wzz同系物（參見例如，US 2018/0099038、WO 2020/039359），由此例如在有或沒有Wzy蛋白的另外的過表現的情況下可以增加O抗原的重複單元數。wzz樣基因對於該等物種的作用已經在文獻中進行了描述。然而，該等都不是獲得具有良好免疫原性的生物軛合物所必需的，並且在較佳的實施方式中，根據本發明之生物軛合物在不操縱Wzz鏈長調節劑機制的情況下製備。
在一個實施方式中，用包含如上文所定義的具有Wzy O抗原聚合酶活性和指示位置處的特定胺基酸的多肽的本發明宿主細胞生產的大腸桿菌O18抗原生物軛合物的產率為在使用相同條件時用表現具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的參考Wzy O抗原聚合酶的其他方面相同的宿主細胞生產的產率的至少105%、110%、120%、150%或200%。
在一個實施方式中，用包含如上文所定義的具有Wzy O抗原聚合酶活性和指示位置處的特定胺基酸的多肽的本發明宿主細胞生產的大腸桿菌O18抗原生物軛合物的糖基化位點佔用率相對於在使用相同條件時用表現具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的參考Wzy O抗原聚合酶的其他方面相同的宿主細胞生產的生物軛合物的糖基化位點佔用率有所改進。因此，在一個實施方式中，在包含用本發明之宿主細胞生產的大腸桿菌O18生物軛合物並且其中運載體蛋白包含4個糖基化位點的組成物中，至少50%、55%、60%、65%或70%的生物軛合物分子為二-、三-或四糖基化的，即，有二到四個糖基化位點被佔用。較佳的是，在該實施方式中，運載體蛋白包含與SEQ ID NO: 3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，該運載體蛋白包含4個糖基化位點，包含糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)，更較佳的是具有SEQ ID NO: 4。最較佳的是，在該實施方式中，運載體蛋白包含含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的EPA。在某些實施方式中，這樣的組成物係生產O18生物軛合物的宿主細胞的周質部分。較佳的是，這樣的組成物包含不多於20%、15%、10%的平均數為約1-3個重複單元的O18抗原（「sEPA」）的生物軛合物。
在另一個方面，本發明進一步關於其中本發明之宿主細胞用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物之方法。因此，一個實施方式關於一種用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物之方法，其中較佳的是，該方法至少包括以下步驟：a) 培養本發明之宿主細胞以生產生物軛合物。在一個實施方式中，在步驟a) 中，本發明之宿主細胞在有益於生產生物軛合物的條件下培養。在某些實施方式中，該方法關於O18A生物軛合物的生產。本發明之宿主細胞在適於表現包含與大腸桿菌O18抗原多糖共價偶聯的運載體蛋白的生物軛合物的條件下使用先前例如在WO 2015/124769或WO 2020/191082中描述之方法進行培養，這樣的條件係熟悉該項技術者已知的。
在一個實施方式中，用於生產O18生物軛合物之方法進一步包括以下步驟：b) 回收生物軛合物。鑒於本揭露，O18生物軛合物可使用本領域已知的任何方法從重組宿主細胞或培養基中分離、分開和/或純化。例如，O18生物軛合物可藉由本領域已知的用於純化蛋白質的任何方法進行純化，例如，藉由層析法（例如，離子交換層析法、陰離子交換層析法、親和層析法和尺寸分級柱層析法）、離心、差異溶解度、或藉由用於純化蛋白質的任何其他標準技術進行純化。參見例如，Saraswat等人, 2013, Biomed. Res. Int. [國際生物醫學研究]，（第1-18頁）；還參見WO 2009/104074中描述之方法。此外，生物軛合物可與異源性多肽序列融合以促進純化。純化和表徵生物軛合物之方法已在以下文獻中進行描述：例如，Ihssen等人, 2010, 同上；WO 2006/119987；WO 2009/104074；特別是WO 2015/124769和WO 2017/035181及WO 2020/191082 A1，該等中的每一篇的揭露內容藉由引用併入本文。
在一個實施方式中，用於生產O18生物軛合物之方法進一步包括步驟c)：將回收的生物軛合物配製到藥物組成物中。將生物軛合物配製到藥物組成物中通常將關於製備包含本發明之生物軛合物和如下文更詳細描述的至少一種藥學上可接受的賦形劑的組成物。在一個實施方式中，用於生產O18生物軛合物之方法進一步包括將佐劑添加到包含生物軛合物的藥物組成物中。用於摻入藥物組成物中的合適的佐劑在下文更詳細描述。
在一個實施方式中，用於生產O18生物軛合物之方法進一步包括將一種或多種另外的與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O抗原多糖的軛合物或生物軛合物添加到藥物組成物中以獲得多價組成物，較佳的是多價生物軛合物組成物。因此，一種或多種另外的與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O抗原多糖的軛合物較佳的是O18以外的血清型、或更較佳的是O18A以外的血清型的大腸桿菌O抗原多糖的生物軛合物。在較佳的實施方式中，一種或多種另外的軛合物或生物軛合物包括選自由大腸桿菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75組成之群組的至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或全部九種O抗原多糖。大腸桿菌O抗原多糖血清型的詳細描述在下文提供（還參見表1）。這樣的另外的軛合物或生物軛合物可如前所述（例如在WO 2020/191082 A1中）獲得。
因此，在一個較佳的實施方式中，用於生產O18生物軛合物之方法進一步包括將另外的與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O抗原多糖的生物軛合物添加到藥物組成物中以獲得多價組成物，其中該多價生物軛合物組成物包含：(i) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18A抗原多糖的生物軛合物；(ii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O1A抗原多糖的生物軛合物；(iii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O2抗原多糖的生物軛合物；(iv) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌葡糖基化O4抗原多糖的生物軛合物；(v) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O6A抗原多糖的生物軛合物；(vi) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O15抗原多糖的生物軛合物；(vii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O16抗原多糖的生物軛合物；(viii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O25B抗原多糖的生物軛合物；以及 (ix) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O75抗原多糖的生物軛合物。在一個實施方式中，多價生物軛合物組成物進一步包含：(x) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O8抗原多糖的生物軛合物。較佳的是，在該等實施方式中，每種生物軛合物 (i) 至 (ix) 中的運載體蛋白包含SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
在另一方面，本發明關於使用本發明之宿主細胞來改進大腸桿菌O18抗原生物軛合物的糖基化位點佔用率，該宿主細胞包含如上文所定義的具有Wzy O抗原聚合酶活性和指示位置處的特定胺基酸（即，具有 (i) I199、K377和A395；或 (ii) T199、K377和V395；或 (iii) T199、K377和A395；或 (iv) I199、K377和V395；或 (v) I199、M377和A395；其中在每種情況下，該等位置對應於SEQ ID NO: 1的位置）的多肽。與在使用相同條件時用表現具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的參考Wzy O抗原聚合酶的其他方面相同的宿主細胞生產的生物軛合物的糖基化位點佔用率相比，大腸桿菌O18抗原生物軛合物的糖基化位點佔用率的改進可以例如藉由具有短重複單元（其中表1的O18結構中的n僅為約1-3）的生物軛合物的量減少來觀察，和/或較佳的是藉由由包含與運載體蛋白中至少兩個或更多個N糖基化共有序列軛合的O18抗原多糖（較佳的是，其中表1的O18結構中的n為至少5）的運載體蛋白組成的生物軛合物的量增加來觀察。
在另一方面，本發明關於與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物，該生物軛合物在使用如上文所述之本發明之宿主細胞來生產生物軛合物的本發明之方法中獲得或可在該方法中獲得。
如本文所用，術語「軛合物」、「糖軛合物」和「生物軛合物」係指含有與運載體蛋白共價結合的大腸桿菌O抗原的軛合產物。本發明之軛合物較佳的是生物軛合物，其係在宿主細胞中生產的軛合產物，其中O抗原和運載體蛋白藉由宿主細胞的機制生物合成生產，並且其中O抗原還例如藉由宿主細胞的酶經由N連接（酶促）共價附接到運載體蛋白。
在又另一方面，本發明關於包含與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物的組成物，該生物軛合物在使用如上文所述之本發明之宿主細胞來生產生物軛合物的本發明之方法中獲得或可在該方法中獲得。
在一個實施方式中，包含與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原的生物軛合物的組成物為包含如下生物軛合物的組成物：其中運載體蛋白包含4個糖基化位點，並且其中組成物中至少50%、55%、60%、65%或70%的運載體蛋白分子在至少兩個N糖基化序列處被大腸桿菌O18抗原重複序列糖基化，即，其為二-、三-或四-糖基化的，並因此有二至四個糖基化位點被佔用。較佳的是，在該實施方式中，運載體蛋白包含與SEQ ID NO: 3具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的胺基酸序列，該運載體蛋白包含4個糖基化位點，包含糖基化共有序列Asn-X-Ser(Thr)，更較佳的是具有SEQ ID NO: 4。最較佳的是，在該實施方式中，運載體蛋白包含含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的EPA。在某些實施方式中，這樣的組成物係生產O18生物軛合物的宿主細胞的周質部分。較佳的是，這樣的組成物包含不多於20%、15%、10%的平均數為約1-3個重複單元的大腸桿菌O18抗原（「sEPA」）的生物軛合物。
在一個實施方式中，包含與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原的生物軛合物的組成物為除該生物軛合物之外還包含藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物。本發明之（藥物）組成物可以包含任何藥學上可接受的賦形劑，包括運載體、填充劑、防腐劑、增溶劑和/或稀釋劑。鹽水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可以用作液體運載體，特別是對於可注射溶液而言。合適的賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合適的藥物運載體的其他實例係技術人員眾所周知的，並且已在教科書中進行了描述。
如本文所用，術語「藥學上可接受的運載體」係指不會干擾根據本發明之組成物的有效性或根據本發明之組成物的生物活性的無毒材料。「藥學上可接受的運載體」可以包括任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝液、穩定劑、增溶劑、油、脂質、含脂質的囊泡、微球、脂質體包封物或本領域中眾所周知的用於藥物配製物中的其他材料。應理解，藥學上可接受的運載體的特徵將取決於特定應用的投與途徑。根據特定的實施方式，鑒於本揭露，適合用於疫苗的任何藥學上可接受的運載體均可用於本發明中。合適的賦形劑包括但不限於無菌水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等及其組合，以及穩定劑，例如人血清白蛋白（HSA）或其他合適的蛋白質和還原糖。
合適的緩衝液包括Tris緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝液和蔗糖磷酸鹽麩胺酸鹽緩衝液。例如，Tris緩衝鹽水（TBS）pH 7.4（例如含有例如分別為25 mM、137 mM和2.7 mM的Tris、NaCl和KCl）；包含約10 mM KH 2PO 4/Na 2HPO 4緩衝液（pH為約7.0）、約5%（w/v）山梨糖醇、約10 mM甲硫胺酸和約0.02%（w/v）聚山梨醇酯80的磷酸鹽緩衝液；或包含約10 mM KH 2PO 4/Na 2HPO 4緩衝液（pH為約7.0）、約8%（w/v）蔗糖、約1 mM EDTA和約0.02%（w/v）聚山梨醇酯80的磷酸鹽緩衝液。
合適的鹽包括例如Tris鹽酸鹽、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、磷酸鈉、麩胺酸一鈉和鋁鹽（例如，氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鉀鋁或這樣的鋁鹽的混合物）中的一種或多種。
合適的防腐劑包括苯酚、苄索氯銨、2-苯氧基乙醇或硫柳汞，其量為防腐劑的0.001%至0.01%（w/v）。在其他實施方式中，不含防腐劑。
組成物可配製為適合投與於受試者的預期途徑。例如，組成物可配製為適合用於皮下投與、腸胃外投與、口服投與、皮內投與、透皮投與、結直腸投與、腹膜內投與、陰道內投與、直腸投與、靜脈內投與、口腔投與、鼻內投與、氣管內投與、肌肉內投與、局部投與、經皮投與或肺部投與，較佳的是肌肉內投與。
本發明之組成物可與用於投與的說明書一起包括在容器、包裝、或分配器中。
在某些實施方式中，可以在使用前儲存本發明之組成物，例如，組成物可以冷凍儲存（例如，在約-20°C或在約-70°C）；儲存在冷藏條件下（例如，在約2°C-8°C，例如約4°C）；或儲存在室溫下。
藥物組成物可視需要包含佐劑，或者可視需要與佐劑組合投與。用於與本發明之組成物組合投與的佐劑可以在投與免疫原性組成物之前、與之同時或之後投與。在其他較佳的實施方式中，本發明之藥物組成物不包含佐劑和/或不與佐劑組合投與。
如本文所用，術語「佐劑」係指當與本發明之組成物結合投與或作為本發明之組成物的一部分投與時增加、增強和/或加強對包含與運載體蛋白偶聯的大腸桿菌O18抗原的軛合物的免疫反應，但是當單獨投與佐劑化合物時不會產生對該軛合物的免疫反應的化合物。佐劑可藉由幾種機制增強免疫反應，該等機制包括例如淋巴細胞募集、B細胞和/或T細胞的刺激、和/或抗原呈遞細胞的刺激。
佐劑的特定實例包括但不限於鋁鹽（明礬）（諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁和氧化鋁，包括含有明礬的奈米顆粒或奈米明礬（nanoalum）配製物）、磷酸鈣、單磷醯基脂質A（MPL）或3-脫-O-醯基化單磷醯基脂質A（3D-MPL）（參見例如，英國專利GB 2220211、EP 0971739、EP 1194166、US 6491919）、AS01、AS02、AS03和AS04（全部為葛蘭素史克公司（GlaxoSmithKline）；對於AS04參見例如EP 1126876、US 7357936；對於AS02參見例如EP 0671948、EP 0761231、US 5750110），咪唑并吡啶化合物（參見WO 2007/109812）、咪唑并喹㗁啉化合物（參見WO 2007/109813）、δ-菊粉、STING活化的合成環狀二核苷酸（例如US 20150056224）、卵磷脂與卡波姆均聚物的組合（例如US 6676958）以及皂苷（諸如Quil A和QS21，視需要與QS7組合（例如US 5,057,540））。在一些實施方式中，佐劑係弗氏佐劑（完全或不完全）。在某些實施方式中，佐劑包含Quil-A，例如可從邦泰公司（Brenntag）（現禾大公司（Croda））或英威傑公司（Invivogen）商購獲得。QuilA含有來自皂樹（Quillaja saponaria Molina tree）的皂苷的水可提取部分。該等皂苷屬於三萜皂苷的組，該等三萜皂苷具有共同的三萜骨架結構。已知皂苷誘導對T依賴性抗原以及T非依賴性抗原的強佐劑反應，以及強細胞毒性CD8+淋巴細胞反應，並且增強對黏膜抗原的反應。它們還可以與膽固醇和磷脂組合，以形成免疫刺激複合物（ISCOM），其中QuilA佐劑可以活化對來自不同起源的廣泛抗原的抗體介導的免疫反應和細胞介導的免疫反應兩者。在某些實施方式中，佐劑為AS01，例如AS01B。AS01為含有MPL（3-O-脫醯基-4'-單磷醯基脂質A）、QS21（皂樹（Quillaja saponaria Molina），級分21）和脂質體的佐劑系統。在某些實施方式中，AS01係可商購的（葛蘭素史克公司（GSK））或可以如藉由引用併入本文的WO 96/33739中所述進行製備。某些佐劑包含乳液，該等乳液係兩種不混溶流體（例如油和水）的混合物，其中一種作為小液滴懸浮在另一種內部，並且藉由表面活性劑穩定。水包油乳液具有形成連續相、圍繞小油滴的水，而油包水乳液具有形成連續相的油。某些乳液包含角鯊烯（一種可代謝的油）。某些佐劑包含嵌段共聚物，該等嵌段共聚物係當兩種單體聚集在一起並形成重複單元的嵌段時形成的共聚物。包含嵌段共聚物、角鯊烯和微粒穩定劑的油包水乳液的實例係TiterMax®，其可以從西格瑪-奧德里奇公司（Sigma-Aldrich）商購獲得。視需要，乳液可以與其他免疫刺激組分（諸如TLR4促効劑）組合或包含其他免疫刺激組分。某些佐劑係也用於MF59（參見例如EP 0399843、US 6299884、US 6451325）和AS03中的水包油乳液（諸如角鯊烯或花生油），視需要與免疫刺激劑諸如單磷醯基脂質A和/或QS21組合（諸如在AS02中）（參見Stoute等人, 1997, N. Engl. J. Med. [新英格蘭醫學雜誌] 336, 86-91）。佐劑的其他實例係含有免疫刺激劑諸如MPL和QS21的脂質體，諸如在AS01E和AS01B中（例如US 2011/0206758）。佐劑的其他實例係CpG和咪唑并喹啉（諸如咪喹莫特和R848）。參見例如，Reed G等人, 2013, Nature Med [自然醫學], 19: 1597-1608。在某些實施方式中，佐劑為Th1佐劑。
在某些實施方式中，佐劑包含皂苷，較佳的是從皂樹獲得的皂苷的水可提取部分。在某些實施方式中，佐劑包含QS-21。
在某些實施方式中，佐劑含有toll樣受體4（TLR4）促効劑。TLR4促効劑係本領域中眾所周知的，參見例如Ireton GC和SG Reed, 2013, Expert Rev Vaccines [疫苗專家評論] 12: 793-807。在某些實施方式中，佐劑係包含脂質A或其類似物或衍生物的TLR4促効劑。
佐劑（例如包括TLR4促効劑）可以按各種方式配製在例如乳液諸如油包水（w/o）乳液或水包油（o/w）乳液（實例係MF59、AS03）、穩定（奈米）乳液（SE）、脂質懸浮液、脂質體、（聚合物）奈米顆粒、病毒顆粒、明礬吸附的水性配製物（AF）等中，代表用於佐劑中的免疫調節分子和/或用於免疫原的各種遞送系統。
免疫調節TLR4促効劑可視需要與其他免疫調節組分組合，該等免疫調節組分諸如皂苷（例如QuilA、QS7、QS21、Matrix M、Iscom、Iscomatrix等）、鋁鹽、其他TLR活化劑（例如咪唑并喹啉、鞭毛蛋白、dsRNA類似物、TLR9促効劑諸如CpG等）等等（參見例如，Reed等人, 2013, 同上）。
如本文所用，術語「脂質A」係指LPS分子的疏水性脂質部分，該疏水性脂質部分包含葡糖胺並且藉由酮苷鍵連接至LPS分子的內核中的酮基-去氧辛酮糖酸，其將LPS分子錨定在革蘭氏陰性細菌外膜的外葉中。關於LPS和脂質A結構的合成的概述，參見例如，Raetz, 1993, J. Bacteriology [細菌學雜誌] 175: 5745-5753；Raetz CR和C Whitfield, 2002, Annu Rev Biochem [生物化學年評] 71: 635-700；US 5,593,969和US 5,191,072。如本文所用的脂質A包括天然存在的脂質A、其混合物、類似物、衍生物和先質。該術語包括單糖，例如稱為脂質X的脂質A的先質；二糖脂質A；七醯基脂質A；六醯基脂質A；五醯基脂質A；四醯基脂質A，例如稱為脂質IVA的脂質A的四醯基先質；去磷酸化脂質A；單磷醯基脂質A；二磷醯基脂質A，諸如來自大腸桿菌和類球紅細菌（ Rhodobacter sphaeroides）的脂質A。幾種免疫活化脂質A結構含有6條醯基鏈。直接附接至葡糖胺糖的四條一級醯基鏈係通常長度在10至16個碳之間的3-羥基醯基鏈。兩條另外的醯基鏈通常附接至一級醯基鏈的3-羥基基團。例如，大腸桿菌脂質A通常具有四條附接至糖的C14 3-羥基醯基鏈，以及分別在2’和3’位置附接至一級醯基鏈的3-羥基基團的一個C12和一個C14。
如本文所用，術語「脂質A類似物或衍生物」係指類似於脂質A的結構和免疫活性、但不一定天然存在於自然界中的分子。脂質A類似物或衍生物可以修飾成例如縮短或縮合，和/或使其葡糖胺殘基被另一個胺糖殘基（例如半乳糖胺殘基）取代，以在還原端含有2-去氧-2-胺基葡糖酸代替葡糖胺-1-磷酸，在位置4’帶有半乳糖醛酸部分而不是磷酸。脂質A類似物或衍生物可以從分離自細菌的脂質A製備，例如藉由化學衍生；或化學合成，例如藉由首先確定較佳的脂質A的結構並且合成其類似物或衍生物。脂質A類似物或衍生物還可用作TLR4促効劑佐劑（參見例如，Gregg KA等人, 2017, MBio [分子生物學] 8, eDD492-17, doi: 10.1128/mBio.00492-17）。
例如，脂質A類似物或衍生物可以藉由野生型脂質A分子的脫醯化，例如藉由鹼處理而獲得。脂質A類似物或衍生物可以例如由分離自細菌的脂質A製備。這樣的分子也可以化學合成。脂質A類似物或衍生物的另一個實例係從細菌細胞分離的脂質A分子，該等細菌細胞具有參與脂質A生物合成和/或脂質A修飾的酶中的突變或缺失或插入。
MPL和3D-MPL係經修飾以減弱脂質A毒性的脂質A類似物或衍生物。脂質A、MPL和3D-MPL具有糖骨架，長脂肪酸鏈附接到該骨架上，其中該骨架含有糖苷鍵聯中的兩個6-碳糖以及4位置處的磷醯基部分。典型地，五至八個長鏈脂肪酸（通常12-14個碳原子）附接至糖骨架。由於天然來源的衍生，MPL或3D-MPL可以作為多種脂肪酸取代模式（例如七醯基、六醯基、五醯基等）的複合物或混合物存在，具有不同的脂肪酸長度。對於本文所述之一些其他脂質A類似物或衍生物也是如此，然而合成脂質A變體還可以是限定的和均勻的。MPL及其製造例如在US 4,436,727中進行了描述。3D-MPL例如在US 4,912,094 B1中進行了描述，並且與MPL的不同之處在於選擇性去除與位置3處的還原端葡糖胺酯連接的3-羥基肉豆蔻酸醯基殘基（比較例如US 4,912,094 B1的第1列中的MPL對比第6列中的3D-MPL的結構）。在本領域中，通常使用3D-MPL，但是有時稱為MPL（例如，Ireton GC和SG Reed, 2013, 同上的表1中的第一結構，這種結構被稱為MPL®，但實際上描繪了3D-MPL的結構）。
脂質A（類似物、衍生物）的實例包括MPL、3D-MPL、RC529（例如EP 1385541）、PET-脂質A、GLA（哌喃糖基脂質佐劑，一種合成二糖糖脂；例如US 20100310602、US 8722064）、SLA（例如Carter D等人, 2016, Clin Transl Immunology [臨床與轉化免疫學] 5: e108（doi: 10.1038/cti.2016.63），其描述了用於優化人疫苗的TLR4配位基的結構功能方法）、PHAD（磷酸化六醯基二糖；其結構與GLA的結構相同）、3D-PHAD、3D-(6-醯基)-PHAD（3D(6A)-PHAD）(PHAD、3D-PHAD和3D(6A)PHAD係合成脂質A變體，參見例如avantilipids.com/divisions/adjuvants，其還提供該等分子的結構）、E6020（CAS編號287180-63-6）、ONO4007、OM-174等。關於3D-MPL、RC529、PET-脂質A、GLA/PHAD、E6020、ONO4007和OM-174的示例性化學結構，參見例如Ireton GC和SG Reed, 2013，同上中的表1。關於SLA的結構，參見例如Reed SG等人, 2016, Curr Opin Immunol [免疫學當前觀點] 41: 85-90中的圖1。在某些較佳的實施方式中，TLR4促効劑佐劑包含選自3D-MPL、GLA或SLA的脂質A類似物或衍生物。在某些實施方式中，脂質A類似物或衍生物在脂質體中配製。
包含脂質A類似物或衍生物的示例性佐劑包括GLA-LSQ（合成MPL [GLA]、QS21、脂質，配製為脂質體）、SLA-LSQ（合成MPL [SLA]、QS21、脂質，配製為脂質體）、GLA-SE（合成MPL [GLA]，角鯊烯油/水乳液）、SLA-SE（合成MPL [SLA]，角鯊烯油/水乳液）、SLA-奈米明礬（合成MPL [SLA]，鋁鹽）、GLA-奈米明礬（合成MPL [GLA]，鋁鹽）、SLA-AF（合成MPL [SLA]，水性懸浮液）、GLA-AF（合成MPL [GLA]，水性懸浮液）、SLA-明礬（合成MPL [SLA]，鋁鹽）、GLA-明礬（合成MPL [GLA]，鋁鹽）以及GSK ASxx系列佐劑中的幾種，包括AS01（MPL、QS21，脂質體）、AS02（MPL、QS21，油/水乳液）、AS25（MPL，油/水乳液）、AS04（MPL，鋁鹽）和AS15（MPL、QS21、CpG，脂質體）。參見例如，WO 2013/119856、WO 2006/116423、US 4,987,237、U.S. 4,436,727、US 4,877,611、US 4,866,034、US 4,912,094、US 4,987,237、US 5191072、US 5593969、US 6,759,241、US 9,017,698、US 9,149,521、US 9,149,522、US 9,415,097、US 9,415,101、US 9,504,743、Reed G等人, 2013, 同上。
非糖脂分子也可以用作TLR4促効劑佐劑，例如合成分子諸如新賽普酊（Neoseptin）-3或天然分子諸如LeIF，參見例如Reed SG等人, 2016, 同上。
在一個實施方式中，包含與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原的生物軛合物的本發明之組成物進一步包含至少一種另外的含有與運載體蛋白共價偶聯的大腸桿菌O抗原多糖的軛合物。一種或多種另外的與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O抗原多糖的生物軛合物較佳的是O18以外的血清型、或更較佳的是O18A以外的血清型的大腸桿菌O抗原多糖的生物軛合物。在較佳的實施方式中，一種或多種另外的軛合物或生物軛合物包括選自由大腸桿菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75組成之群組的至少一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或全部九種O抗原多糖。
在較佳的實施方式中，一種或多種另外的軛合物中的一種或多種另外的大腸桿菌O抗原選自由以下組成之群組：大腸桿菌O1抗原多糖（例如O1A抗原多糖）、大腸桿菌O2抗原多糖、大腸桿菌O4抗原多糖（例如大腸桿菌葡糖基化O4抗原多糖）、大腸桿菌O6抗原多糖（例如O6A抗原多糖）、大腸桿菌O8抗原多糖、大腸桿菌O15抗原多糖、大腸桿菌O16抗原多糖、大腸桿菌O25抗原多糖（例如O25A或O25B抗原多糖，較佳的是O25B抗原多糖）、和大腸桿菌O75抗原多糖。較佳的是，每種另外的O抗原多糖共價連接到運載體蛋白。在某些實施方式中，每種運載體蛋白（即，每種軛合物的運載體蛋白）為EPA運載體蛋白。較佳的是，另外的軛合物中的一種或多種、較佳的是全部為生物軛合物。
如本文所用，術語「O18」係指大腸桿菌的O18抗原（大腸桿菌血清型O18），並且可為O18A、O18B、O18A1或O18B1抗原（大腸桿菌血清型O18的四種血清亞型中的每種），並且在較佳的實施方式中，O18係指O18A。O18A抗原多糖可包含如表1所示的式 (O18A) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。術語「O1A」係指大腸桿菌的O1A抗原（大腸桿菌血清型O1的血清亞型）。術語「O2」係指大腸桿菌的O2抗原（大腸桿菌血清型O2）。術語「O4」係指大腸桿菌的O4抗原（大腸桿菌血清型O4），其可以包括或不包括葡萄糖側支（分別稱為葡糖基化O4抗原多糖（O4-Glc+）和非葡糖基化O4抗原多糖（O4-Glc-）；在較佳的實施方式中，O4為O4-Glc+）。術語「O6A」係指大腸桿菌的O6A抗原（大腸桿菌血清型O6的血清亞型）。術語「O8」係指大腸桿菌的O8抗原（大腸桿菌血清型O8）。術語「O15」係指大腸桿菌的O15抗原（大腸桿菌血清型O15）。術語「O16」係指大腸桿菌的O16抗原（大腸桿菌血清型O16）。術語「O25B」係指來自大腸桿菌的O25B抗原（大腸桿菌血清型O25的血清亞型）。術語「O75」係指大腸桿菌的O75抗原（大腸桿菌血清型O75）。
貫穿本申請提及的大腸桿菌O抗原多糖的結構如下表1所示。示出了每種大腸桿菌O抗原多糖的單個重複單元。
Figure 02_image001
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Figure 02_image005
本文所述之所有單糖均具有本領域已知的它們的常用含義。單糖可以具有D或L組態。如果未指定D或L，則糖被理解為具有D組態。單糖通常由本領域公知和使用的縮寫表示。例如，Glc係指葡萄糖；D-Glc係指D-葡萄糖；並且L-Glc係指L-葡萄糖。單糖的其他常見縮寫包括：Rha，鼠李糖；GlcNAc，N-乙醯葡糖胺；GalNAc，N-乙醯半乳糖胺；Fuc，岩藻糖；Man，甘露糖；Man3Me，3-O-甲基-甘露糖；Gal，半乳糖；FucNAc，N-乙醯岩藻糖胺；以及Rib，核糖。後綴「f」係指呋喃糖，後綴「p」係指哌喃糖。
根據本發明之、包含與大腸桿菌O18抗原多糖共價偶聯的運載體蛋白的生物軛合物的組成物可進一步包含至少一種另外的與大腸桿菌O抗原多糖共價偶聯的運載體蛋白的軛合物，並且在某些實施方式中，至少一種另外的軛合物包含選自以下群組的大腸桿菌O抗原多糖，該群組由以下組成：大腸桿菌O1A抗原多糖、大腸桿菌O2抗原多糖、大腸桿菌O4抗原多糖、大腸桿菌O6A抗原多糖、大腸桿菌O8抗原多糖、大腸桿菌O15抗原多糖、大腸桿菌O16抗原多糖、大腸桿菌O25B抗原多糖、和大腸桿菌O75抗原多糖。這樣的組成物可以藉由共同添加多種軛合物來製備以獲得多價軛合物組成物。較佳的是，另外的軛合物中的一種或多種、並且較佳的是全部也是生物軛合物。
在某些實施方式中，O1A抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O1A抗原多糖可包含如表1所示的式 (O1A) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O1A抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。
在某些實施方式中，O2抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O2抗原多糖可包含如表1所示的式 (O2) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O2抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。
在某些實施方式中，O4抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。已知O抗原結構修飾存在於大腸桿菌O4血清型中。特別地，一些O4血清型表現具有分支葡萄糖單元的經修飾的O抗原。如本文所用，「葡糖基化O4抗原」、「葡糖基化O4抗原多糖」、「葡萄糖分支的O4」、「O4-Glc+抗原多糖」、「Glc+ O4」和「O4-Glc+抗原」係指具有葡萄糖分支的O4抗原。一些O4血清型具有不含這種分支葡萄糖單元的O4抗原，這在本文中稱為「非葡糖基化O4抗原」、「非葡糖基化O4抗原多糖、「O4-Glc-抗原」或「O4-Glc-」。當在本文中提及「O4抗原」時，其可以是O4-Glc+抗原或O4-Glc-抗原。在較佳的實施方式中，O4係指O4-Glc+抗原。大腸桿菌非葡糖基化O4抗原和大腸桿菌葡糖基化O4抗原的結構分別如表1中式 (O4-Glc-) 和式 (O4-Glc+) 所示，其中n為1至100的整數，例如3至50，較佳的是5至40，例如7至25，例如10至20。專門生產O4-Glc+生物軛合物之方法已在WO 2020/191082 A1中進行了描述，將該文獻以其全文併入本文。較佳的是，O4抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。
在某些實施方式中，O6A抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O6A抗原多糖可包含如表1所示的式 (O6A) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O6A抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。
在某些實施方式中，O8抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O8抗原多糖可包含如表1所示的式 (O8) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O8抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。
在某些實施方式中，O15抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O15抗原多糖可包含如表1所示的式 (O15) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O15抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。
在某些實施方式中，O16抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O16抗原多糖可包含如表1所示的式 (O16) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O16抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。與運載體蛋白共價連接的大腸桿菌O16抗原多糖的軛合物可在L-Rha糖的位置2處具有一定程度的乙醯化。軛合物中O16抗原多糖的這種O乙醯化程度較佳的是至少30%，較佳的是至少50%，諸如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在某些實施方式中，O25B抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O25B抗原多糖可包含如表1所示的式 (O25B) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O25B抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。類似於如上所述之O16抗原多糖，與運載體蛋白共價連接的大腸桿菌O25B抗原多糖的軛合物可在L-Rha糖的位置2處具有一定程度的乙醯化。軛合物中大腸桿菌O25B抗原多糖的這種O乙醯化程度較佳的是至少30%，較佳的是至少50%，諸如至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在某些實施方式中，O75抗原多糖（例如，以分離的形式或作為糖軛合物（較佳的是生物軛合物）的一部分）存在於如本文所提供的（藥物）組成物（例如，包含藉由如本文所述之方法獲得的大腸桿菌O18生物軛合物的組成物）中。O75抗原多糖可包含如表1所示的式 (O75) 的結構，其中n為1-100的整數，例如3-50，較佳的是5-40，例如7至25，例如10至20。較佳的是，O75抗原多糖為軛合物、更較佳的是生物軛合物的一部分，並且共價連接到運載體蛋白，例如EPA。
在某些實施方式中，根據本發明之組成物包含根據本發明之、含有與大腸桿菌O18抗原多糖共價偶聯的運載體蛋白的生物軛合物，並且進一步包含一種或多種另外的含有與大腸桿菌O抗原多糖共價偶聯的運載體蛋白的軛合物，較佳的是4至25種這樣的另外的軛合物。較佳的是，另外的軛合物包含一種或多種如上所述之大腸桿菌O抗原多糖，最較佳的是至少O25B、O1A、O2和O6。特別較佳的是包含至少7種、較佳的是至少8種另外的軛合物的組成物，並且較佳的是，該等另外的軛合物中的一些、並且最較佳的是全部為生物軛合物。
在較佳的實施方式中，根據本發明之組成物至少包含大腸桿菌O1A、O2、O4（較佳的是葡糖基化O4）、O6A、O15、O16、O18（較佳的是O18A）、O25B和O75抗原多糖，較佳的是各自獨立地與運載體蛋白（例如EPA）共價連接的O1A、O2、葡糖基化O4、O6A、O15、O16、O18A、O25B和O75抗原多糖的軛合物（即，至少9價組成物）。在某些實施方式中，這樣的組成物進一步包含大腸桿菌O8抗原多糖，較佳的是以軛合物、較佳的是生物軛合物的形式。在某些實施方式中，這樣的組成物（含或不含O8抗原多糖）包含來自其他血清型的另外的大腸桿菌O抗原多糖，較佳的是與運載體蛋白軛合，較佳的是生物軛合物，例如來自2-10種另外的血清型。在某些實施方式中，提供了包含至少九種生物軛合物的藥物組成物，其中每種生物軛合物包含與來自不同血清型的大腸桿菌O抗原多糖共價連接的運載體蛋白，其中該等血清型包括O18A（並且該O18A生物軛合物為使用根據本發明之方法製備的根據本發明之生物軛合物）、O1A、O2、O4-Glc+、O6A、O15、O16、O25B和O75。在某些實施方式中，運載體蛋白為EPA，例如具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的EPA。
根據本發明之組成物可視需要包含期望對其有免疫反應的其他蛋白質、碳水化合物和脂糖或者與它們共同組合或投與。
在另一方面，本發明關於本發明之藥物組成物用作藥物。
在另一個方面，本發明關於如本文所述之藥物組成物用作誘導針對大腸桿菌的免疫反應的藥物之用途。
如本文所用，術語「免疫原」或「免疫原性」或「抗原」可互換用於描述單獨或與佐劑結合投與給受者，或在展示媒介物上呈遞時能夠產生免疫學反應的分子。
如本文所用，對抗原或組成物的「免疫學反應」或「免疫反應」係指在受試者中發展對該抗原或該組成物中存在的抗原的體液和/或細胞免疫反應。
在某些實施方式中，如本文所述之藥物組成物用於預防或治療由大腸桿菌感染引起的疾病。在較佳的實施方式中，由大腸桿菌感染引起的疾病為侵襲性腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）疾病（IED）。
如本文所用，術語「腸外致病性大腸桿菌」或「ExPEC」係指遺傳相關的致病性大腸桿菌菌株，該等菌株通常在胃腸道外部的身體部位中侵襲、定殖並誘導疾病。ExPEC細菌包括尿路致病性（UPEC）大腸桿菌、新生兒腦膜炎（NMEC）大腸桿菌、敗血症相關的（SePEC）大腸桿菌、黏附侵襲性（AIEC）大腸桿菌、和禽致病性（APEC）大腸桿菌。與ExPEC或ExPEC感染相關的疾病包括但不限於尿道感染（UTI）、手術部位感染、菌血症、腹部或盆腔感染（諸如腹內感染（IAI））、肺炎、醫院獲得性肺炎、骨髓炎、蜂窩組織炎、腎盂腎炎、傷口感染、腦膜炎、新生兒腦膜炎、腹膜炎、膽道炎、軟組織感染、膿性肌炎、膿毒性關節炎、和敗血症。
在另一個方面，本發明關於一種預防或治療有需要的受試者的由大腸桿菌感染引起的疾病、特別是侵襲性腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）疾病（IED）之方法，該方法包括投與有效量的如本文所述之藥物組成物。
如本文所用，術語「有效量」係指在受試者中引發期望的生物或藥物反應的活性成分或組分的量。關於所闡述的目的，有效量可以根據經驗並且以常規方式來確定。例如，體外測定可以視需要用於幫助鑒定最佳劑量範圍。
如本文所用，「受試者」或「患者」意指將或已經藉由根據本發明之實施方式之方法或組成物疫苗接種的任何動物，較佳的是哺乳動物，最較佳的是人。如本文所用，術語「哺乳動物」涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，最較佳的是人。在某些實施方式中，受試者係成人。如本文所用，術語「成人」係指18歲或以上的人。在某些實施方式中，受試者為以下中的一者或多者：(i) 約16與約50歲之間、例如約16與約35歲之間的女人； (ii) 超過50歲、或超過55歲、或超過60歲、或超過65歲的成人； (iii) 患有復發性UTI的人受試者； (iv) 患有大腸桿菌菌血症或敗血症或處於獲得大腸桿菌菌血症或敗血症的風險的人受試者； (v) 患有需要使用導管的病症的人受試者； (vi) 經歷預先安排的手術的人受試者； (vii) 絕經後婦女；或 (viii) 患有糖尿病的人受試者。
在又另一方面，本發明還關於如本文所述之藥物組成物用於製造用於預防或治療由大腸桿菌感染引起的疾病、特別是侵襲性腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）疾病（IED）的疫苗或藥物之用途。
在背景和整個說明書中引用或描述了各種出版物、文章和專利；該等參考文獻中的每篇藉由引用以其全文併入本文。包括在本說明書中的對文檔、法案、材料、裝置、製品等的討論係出於提供本發明之背景的目的。這種討論不承認任何或所有該等事項形成關於所揭露或要求保護的任何發明的先前技術的一部分。 序列描述[ 表 2] ：序列
描述 序列 SEQ ID NO.
Wzy O18聚合酶 （胺基酸序列） MIYILTLTLLLVIAIMFSLLGTKSRITSPLPLHFLPWLLTLIVGISNYDQFYEFNERSFYSLLIWFTVIFIFYFIGELVNYKRENINVYYGLSHIKYECKKYWIIVIPISLYTIFEIYMVGMGGADGFFLNLRLANTLEGYTGKKFILMPAVYPLMMAMFAIVCLTKTSKLNKYSIYFWMFLYCIGTMGKFSILTPILTYLIIYDFKHRLKVKKTIKFTLLIIILALTLHFTRMAENDHSTFLSILGLYIYSPIIALGQLNEVNSSHFGEYTFRFIYAITNKIGLIKELPVNTILDYSYVPVPTNVYTALQPFYQDFGYTGIIFGAVLYGLIYVSLYTAGVRGNNTQALLIYALFSVSSATAFFAETLVTNLAGNVMLVLCTILLWRFTVICKPVQ 1
Wzy O18聚合酶（核酸序列） ATGATATATATATTAACTTTAACTCTTCTTCTAGTTATAGCCATAATGTTTTCTCTTCTCGGCACAAAAAGTAGGATCACATCTCCATTACCTTTGCATTTTTTACCATGGTTACTAACTTTAATTGTCGGGATAAGTAATTACGATCAATTTTACGAGTTTAATGAAAGAAGCTTTTACTCTTTGTTGATTTGGTTTACAGTTATTTTTATATTTTATTTCATAGGGGAACTGGTTAATTATAAACGTGAAAATATAAATGTTTATTATGGTCTTTCACATATTAAATATGAATGTAAAAAATATTGGATCATTGTCATCCCAATTTCATTATATACCATTTTCGAAATATATATGGTTGGTATGGGGGGAGCAGATGGATTCTTTCTCAATTTACGTCTTGCAAATACATTGGAGGGCTATACGGGTAAAAAATTTATCTTAATGCCTGCTGTATATCCTCTAATGATGGCTATGTTCGCAATTGTTTGTCTAACAAAAACTTCCAAATTAAATAAATACTCCATTTATTTCTGGATGTTTTTGTATTGTATTGGCACAATGGGAAAATTTTCAATATTAACGCCAATATTGACATATTTAATTATTTATGACTTCAAACATAGATTAAAAGTAAAAAAAACAATAAAGTTTACATTGTTGATAATTATATTAGCTTTAACTTTGCATTTTACACGTATGGCTGAGAATGACCACTCAACATTTTTATCTATTTTAGGGCTCTATATTTATTCACCAATAATTGCTTTAGGCCAGTTGAATGAAGTAAATAGTAGTCATTTTGGTGAGTATACGTTTAGATTCATATATGCTATAACTAATAAAATTGGCCTTATTAAAGAATTGCCAGTAAATACTATTCTTGACTATTCATACGTTCCTGTACCAACAAATGTATATACTGCACTTCAACCATTTTACCAGGATTTTGGTTATACTGGCATCATATTTGGAGCAGTATTATACGGACTAATATATGTGAGTTTATACACGGCCGGTGTTCGTGGAAATAATACACAGGCATTACTGATTTACGCATTGTTTTCAGTTAGCAGTGCAACGGCTTTCTTCGCTGAAACGCTAGTAACGAATTTAGCTGGAAATGTGATGTTAGTATTATGTACCATCTTACTATGGCGATTTACAGTAATATGCAAACCAGTACAGTAA 2
包含4個優化的N糖基化序列的去毒的EPA蛋白 GSGGGDQNATGSGGGKLAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVRSSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAIDNALSITSDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKPSNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVRAHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVLCLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLDIKDNNNSTPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAASADVVSLTCPVAKDQNRTKGECAGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYRTGLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLKLGSGGGDQNAT 3
優化的N糖基化共有序列 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z獨立地選自除Pro之外的任何天然胺基酸 4
O18A的 rfb基因簇 ATGACGAATTTAAAAGCAGTTATTCCTGTAGCGGGTCTTGGGATGCATATGTTGCCTGCCACTAAGGCGATTCCCAAAGAGATGCTACCGATCGTCGACAAGCCAATGATTCAGTACATCGTTGACGAGATTGTGGCTGCAGGGATCAAAGAAATCCTCCTGGTAACTCACGCGTCCAAGAACGCGGTCGAAAACCACTTCGACACCTCTTATGAATTAGAATCTCTCCTTGAACAGCGCGTGAAGCGTCAACTGCTGGCGGAAGTACAGTCCATTTGCCCGCCGGGCGTGACAATTATGAACGTGCGTCAGGGCGAACCTTTAGGTTTGGGCCACTCCATTTTATGTGCACGACCTGCCATTGGTGACAATCCATTTGTCGTGGTGCTGCCAGACGTTGTGATCGACGACGCCAGCGCCGACCCGCTGCGCTACAACCTTGCTGCCATGATTGCGCGCTTTAACGAAACTGGCCGCAGCCAGGTTCTGGCAAAACGCATGCCGGGCGATCTCTCTGAATACTCCGTCATCCAGACTAAAGAACCGCTTGATCGCGAAGGTAAAGTCAGCCGCATTGTTGAATTTATCGAAAAACCGGATCAGCCGCAGACCCTGGACTCAGACATCATGGCTGTAGGGCGTTATGTGCTTTCTGCCGATATTTGGCCTGAACTGGAGCGTACTCAACCTGGAGCATGGGGACGTATTCAGTTGACTGATGCCATTGCTGAGTTGGCAAAAAAACAAGCAGTTGACGCAATGCTGATGACTGGGGACAGTTACGACTGCGGAAAGAAAATGGGTTATATGCAAGCGTTTGTGAAGTATGGGCTGCGTAACCTAAAAGAAGGGGCGAAGTTCCGTAAAGGGATTGAGAAGCTGTTAAGCGAATAATGAAAATCTGACCGGATGTAACGGTTGATAAGAAAATTATAACGGCAGTGAAGATTAGCGGCGAAAGTAATTTGTTGCGAATTTTCCTGCCGTTGTTTTATATAAACAATCAGAATAACAACGAGTTAGCAACAGGATTATCGTCAAAGTTTTCCAGGATTTTCCTTGTTTCCAGAGCGGATTGGTAAGACAATTAGCTTCTGAATTTTTCGGGTTTAGCGCGAGTGGGTAACACTCGTCACATCGTAGGCATGCATGCAGTGCTCTGGTAGCTGTAAAGCCAGGGGCGGTAGCGTGCATTAATACCTCTATTAATCAAACTGAGAGCCGCTTATTTCACAGCATGCTCTGAAGTAATATGGAATAAATTAAGTGAAAATACTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCTGCTGTAGTTCGTCACATTATAAATGATACGCAGGATAGTGTTGTTAATGTCGATAAATTAACGTACGCCGGAAACCTGGAATCACTTGCAGATGTTTCTGATTCTGAACGCTATTTCTTTGAACATGCGGATATTTGTGATGCAGCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCGGATGCAGTGATGCACCTGGCAGCTGAAAGCCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAACCAATATTGTTGGTACTTATGTCCTTTTAGAAGCGGCTCGGAATTACTGGTCTGCACTTGATGGCGACAAGAAAAACAGCTTCCGTTTTCATCATATTTCTACTGACGAAGTCTATGGTGATTTGCCTCATCCTGACGAGGTAAATAATAAAGAAGGATTACCCTTATTTACTGAGACGACAGCCTACGCACCAAGCAGCCCTTATTCTGCATCAAAAGCGTCCAGCGATCATTTAGTCCGTGCGTGGAAACGTACCTATGGTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCTAACAATTATGGTCCTTATCATTTCCCGGAAAAATTGATTCCATTGGTTATTCTGAATGCTCTGGAAGGTAAAGGATTACCTATTTATGGAAAAGGCGATCAAATTCGCGACTGGCTGTATGTTGAAGATCATGCGCGTGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTAAAGCGGGTGAAACTTATAACATTGGTGGACACAACGAAAAGAAAAACATCGATGTAGTGCTCACTATTTGTGATTTGTTGGATGAGATTGTCCCGAAAGAGAAATCTTACCGCGAGCAAATTACTTATGTTGCCGATCGTCCGGGACACGATCGACGTTATGCGATTGATGCTGAGAAGATTGGTCGCGAATTGGGATGGAAACCACAGGAAACGTTTGAGAGCGGGATTCGTAAAACTGTGGAATGGTATCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGGTGCCTATCAATCGTGGATTGAACAGAACTATGAGGGCCGCCACTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTTGGTTGGGAACTACAGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGTAATTTGATTGCTCTTGATGTTCACTCCACTGATTACTGTGGTGATTTTAGTAACCCTGAAGGTGTGGCTGAAACCGTTAGAAGCATTCGGCCTGATATTATTGTCAACGCAGCCGCTCACACCGCAGTAGACAAAGCAGAATCAGAACCGGAGTTTGCACAATTACTGAACGCGACGAGTGTCGAAGCGATCGCGAAAGCAGCCAATGAAGTCGGCGCTTGGGTTATTCACTACTCTACTGACTACGTATTTCCGGGGACCGGTGAAATACCATGGCAGGAGGAGGATGCAACCGCACCGCTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCAGGAGAAAAAGCATTACAAGAGCATTGTGCGAAGCACCTTATTTTCCGGACCAGCTGGGTCTATGCAGGTAAAGGAAATAACTTCGCCAAAACGATGTTGCGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCCGTTATTAATGATCAGTTTGGTGCGCCAACTGGCGCAGAGTTGCTGGCTGATTGTACGGCACATGCCATTCGTGTGGCACTGAATAAACCGGAAGTCGCAGGTTTGTACCATCTGGTAGCCAGTGGTACCACAACCTGGCACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGCATTCCCCTTGCACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAACAACAGTCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATAACTCTCGCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAACTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGTGTGAAACGCATGCTCAACGAATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTTTGCATCTTGTTCGTGATGGTGGAACAAGATGAATTAAAAGGAATGATGGAATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTTTAGCGGGTGGTTCTGGTACACGTCTTTATCCTGTGACTATGGCTGTCAGTAAACAGCTGTTACCGATTTATGATAAACCGATGATCTATTACCCGCTCTCTACACTGATGTTGGCGGGTATTCGCGATATTTTGATTATCAGCACGCCACAGGATACTCCTCGTTTTCAACAACTGCTGGGTGATGGGAGCCAGTGGGGGCTAAATCTTCACTACAAAGTGCAACCGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGCATTTATCATCGGTGAAGAGTTTATCGGTGGTGATGATTGTGCTTTGGTACTTGGTGATAATATCTTCTACGGTCACGACCTGCCTAAGTTAATGGATGCCGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCTGAACGCTATGGTGTCGTTGAGTTTGATAAAAACGGTACGGCAATTAGCCTCGAAGAAAAACCGCTACAACCAAAAAGTAATTATGCAGTAACCGGGCTTTATTTCTATGATAACTACGTTGTGGAAATGGCGAAAAATCTTAAGCCTTCTGCCCGCGGTGAACTGGAAATTACCGATATTAACCGTATTTATATGGAACAGGGGCATTTATCTGTTGCCATGATGGGACGTGGTTATGCATGGCTGGACACGGGGACACATCAGAGTCTTATTGAAGCAAGCAACTTCATTGCCACCATTGAAGAGCGCCAGGGACTAAAGGTTTCCTGCCCAGAAGAAATTGCTTATCGTAAAGGATTTATTGACGCAGAGCAGGTTAAGGTATTAGCCGAACCGCTGAAGAAAAACGCTTATGGTCAGTATTTGCTGAAAATGATTAAAGGTTAGTAATAAAATGAATGTTATTAAAACAGAAATTCCAGACGTACTGATTTTTGAACCGAAAGTTTTTGGTGACGAGCGCGGTTTCTTTTTCGAAAGCTATAACCAGAGGGTTTTTGAGGAAGCTGTAGGTCGCAAAGTTGAGTTTGTTCAGGATAACCATTCTAAATCGAGAAAAGGAGTATTGCGGGGATTGCATTATCAATTAGAGCCGTATGCGCAAGCAAAACTTGTGCGTTGCATTGAGGGTGAAGTATTTGATATTGCTGTAGATATACGGAAGTCATCTCCATTTTTTGGTAAATGGGTTGGTGTAACATTATCCGCTGAAAATAAACGTCAATTATGGATCCCTGAAGGGTTTGCTCATGGTTTTGTGGTGATTAGTGATACTGCGGAATTTGTCTATAAAACGAACAATTATTACAGTCAACAAGCAGAGCGAAGCATAATTTTTGATGATAAAGACTTAGGGATTGCTTGGCCATTGAATACTCATTATATTCTTTCAGAAAAAGATTTAAATGCGCCAACATTTAAGAAAATATCGAGTAATGAGTATTTTAAATGAGTTTAATCAAAAACAGTTTTTGGAACCTTTGCGGGTATGTACTTCCAGCTATTGTGACACTACCAGCTTTGGGTATTATGGGGCGAAAATTAGGCCCAGAATTATTTGGTGTATTCACTTTGGCATTAGCTGTTGTGGGTTATGCAAGCATTTTTGATGCAGGCCTTACTCGCGCAGTGATACGAGAAGTCGCAATTGAAAAAGATAATGAAGAAAATAAGTTGAAAATTATTTCTTCAGCGACAGTTGTA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CAAGAACTCTATGGAACTATAATTTGCTCAAAACATGAAAGGTAGATTTATATTTGGAACGTGTCTTTTGTTTGAATTTAATTCAATCTCAATTGAGATTTTTGTATTTCAAAAATACCATCATAGCTAACGATGATTGGTATTTATTTTAAGATGCTTTCTATAAATATATTGACGTTTTTAATGCGCCGAAACGATTGGGCTGGGAACAGAGAAGTAAAACTGTTTTGAGAATGAAGAGTTTTTGAGATGTTTATGGATATTAAAAATTGATCCAGTGAATTAATTATTTATAATAAATCAAGATTTAATGTTAATAAATGATAATCTTTTCTGACACTCATATTAATTATGAGTGGTACGTTTGGTAAACGGTAAACTATTATATGACAGCTAGAACAACTAAAGTTTTGCACTTACAATTACTCCCACTCTTAAGTGGCGTTCAAAGGGTAACATTAAACGAAATTAGTGCGTTATATACTGATTATGATTATACACTAGTTTGCTCAAAAAAAGGTCCACTAACAAAAGCATTGCTGGAATATGATGTCGATTGTCATTGTATCCCCGAACTTACGAGAGAAATTACCGTAAAGAATGATTTTAAAGCATTGTTCAAGCTTTATAAGTTCATAAAAAAAGAAAAATTTGACATTGTGCATACACATTCTTCAAAAACAGGTATTTTGGGGCGAGTTGCTGCCAAATTAGCACGTGTTGGAAAGGTGATCCACACTGTACATGGTTTTTCTTTTCCAGCCGCATCTAGTAAAAAAAGTTATTACCTTTATTTTTTCATGGAATGGATAGCAAAGTTCTTTACGGATAAGTTAATCGTCTTGAATGTAGATGATGAATATATAGCAATAAACAAATTAAAATTCAAGCGGGATAAAGTTTTTTTAATTCCTAATGGAGTAGACACTGATAAGTTTTCTCCTTTAGAAAATAAAATTTATAGTAGCACCTTGAATCTAGTAATGGTTGGTAGATTATCCAAGCAAAAAGATCCTGAGACATTATTGCTTGCTGTTGAAAAACTGCTGAATGAAAATGTTAATGTTAAGCTGACACTTGTAGGAGATGGTGAACTAAAAGAACAGTTAGAAAGCAGGTTCAAACGGCAAGATGGACGTATAATTTTTCATGGATGGTCAGATAACATTGTTAATATTTTAAAAGTTAATGATCTTTTTATATTACCTTCTCTTTGGGAGGGTATGCCATTAGCAATTTTAGAAGCATTGAGCTGTGGACTTCCATGTATAGTCACTAATATTCCAGGTAATAATAGCTTAATAGAAGATGGCTATAATGGTTGTTTGTTTGAAATTAGAGATTGTCAGTTATTATCTCAAAAAATCATGTCATATGTTGGTAAGCCAGAACTGATTGCACAGCAATCTACCAATGCACGATCATTTATTCTGAAAAATTATGGATTAGTTAAAAGAAATAATAAGGTCAGACAGCTATATGATAATTAAATGAAACCGAAAAGTTAAAAAAGAACAGGTTTTTCAAAGTGAAAATAAAATTACAGTTTTTTTATTGCAATGATTAACGTAACATCTGCATTACATTCAAGCCGCACAACCCCGCGGTGACCACCCCTGACAGGAGTAAACAATGTCAAAGCAACAGATCGGCGTCGTCGGTATGGCAGTGATGGGACGCAACCTCGCGCTCAACATCGAAAGCCGTGGTTATACCGTCTCTATTTTCAACCGTTCCCGTGAAAAGACGGAAGAAGTTATTGCCGAAAATCCAGGCAAGAAACTGGTTCCTTACTATACGGTGAAAGAGTTCGTTGAATCTCTTGAAACGCCTCGTCGCATCCTGTTAATGGTTAAAGCAGGTGCAGGCACGGATGCTGCTATTGATTCCCTGAAACCATATCTCGATAAAGGCGATATCATCATTGATGGTGGTAATACCTTCTTCCAGGACACCATTCGTCGTAACCGCGAGCTTTCTGCACAAGGCTTTAACTTCATCGGTACGGGTGTTTCCGGTGGTGAAGAGGGCGCGCTGAAAGGACCTTCTATCATGCCTGGTGGGCAGAAAGAGGCCTATGAACTGGTTGCTCCTATCCTGACCAAAATCGCCGCCGTGGCTGAAGATGGTGAACCATGCGTTACCTATATTGGTGCCGATGGCGCAGGTCACTATGTGAAGATGGTTCACAACGGTATTGAATACGGTGATATGCAACTGATTGCTGAAGCCTATTCTCTGCTGAAAGGTGGTCTGAATCTCTCTAACGAAGAACTGGCACAAACCTTTACCGAGTGGAATAACGGTGAACTGAGCAGTTACCTGATCGACATCACTAAAGACATCTTCACCAAAAAAGATGAAGACGGTAACTACCTGGTTGATGTGATCCTGGATGAAGCAGCAAACAAAGGTACGGGTAAATGGACCAGTCAGAGCGCGCTGGATCTCGGTGAGCCACTGTCGCTGATTACTGAGTCTGTGTTTGCACGCTACATCTCTTCACTAAAAGATCAGCGCGTGGCTGCGTCTAAAGTACTGTCGGGTCCACAAGCGCAGCCAGCAGGCGACAAAGCAGAGTTCATTGAAAAAGTTCGCCGTGCGCTTTATCTGGGTAAGATTGTTTCTTACGCGCAGGGCTTCTCTCAGCTGCGTGCTGCGTCTGAAGAGTACAACTGGGATCTGAACTACGGTGAAATCGCGAAGATTTTCCGTGCTGGCTGCATCATCCGTGCGCAGTTCCTGCAGAAAATCACCGATGCTTATGCCGAAAATCCGCAGATCGCTAACCTGCTGCTGGCTCCGTACTTCAAGCAAATTGCCGATGACTACCAGCAGGCTCTGCGTGATGTCGTTGCTTATGCAGTACAGAACGGTATCCCGGTTCCGACCTTCGCCGCTGCGGTTGCCTATTACGATAGCTACCGTGCCGCTGTTCTGCCTGCGAACCTGATCCAGGCACAGCGTGACTATTTCGGTGCACATACTTATAAGCGCATTGATAAAGAAGGTGTGTTCCATACTGAATGGCTGGATTGA 5
PglB寡糖基轉移酶 MLKKEYLKNPYLVLFAMIILAYVFSVFCRFYWVWWASEFNEYFFNNQLMIISNDGYAFAEGARDMIAGFHQPNDLSYYGSSLSALTYWLYKITPFSFESIILYMSTFLSSLVVIPTILLANEYKRPLMGFVAALLASIANSYYNRTMSGYYDTDMLVIVLPMFILFFMVRMILKKDFFSLIALPLFIGIYLWWYPSSYTLNVALIGLFLIYTLIFHRKEKIFYIAVILSSLTLSNIAWFYQSAIIVILFALFALEQKRLNFMIIGILGSATLIFLILSGGVDPILYQLKFYIFRSDESANLTQGFMYFNVNQTIQEVENVDLSEFMRRISGSEIVFLFSLFGFVWLLRKHKSMIMALPILVLGFLALKGGLRFTIYSVPVMALGFGFLLSEFKAIMVKKYSQLTSNVCIVFATILTLAPVFIHIYNYKAPTVFSQNEASLLNQLKNIANREDYVVTWWDYGYPVRYYSDVKTLVDGGKHLGKDNFFPSFALSKDEQAAANMARLSVEYTEKSFYAPQNDILKTDILQAMMKDYNQSNVDLFLASLSKPDFKIDTPKTRDIYLYMPARMSLIFSTVASFSFINLDTGVLDKPFTFSTAYPLDVKNGEIYLSNGVVLSDDFRSFKIGDNVVSVNSIVEINSIKQGEYKITPIDDKAQFYIFYLKDSAIPYAQFILMDKTMFNSAYVQMFFLGNYDKNLFDLVINSRDAKVFKLKI 6
實例
本發明之以下實例係為了進一步說明本發明之性質。應當理解，以下實例不限制本發明，並且本發明之範圍由所附請求項確定。
最近在大腸桿菌中開發了一種生物軛合系統，其中抗原多糖和運載體蛋白兩者均在體內合成並且隨後藉由寡糖基轉移酶PglB（一種在大腸桿菌中表現的空腸彎曲桿菌酶）的活性在體內軛合（Wacker等人, Proc. Nat. Acad. Sci. [美國國家科學院院刊] (2006) 第103卷, 第7088-93頁）。這種N連接的蛋白質糖基化系統能夠將多種多糖轉移到運載體蛋白上，從而實現從表現生物軛合物的細菌中純化該生物軛合物之方法。生物軛合已成功用來生產用於大腸桿菌四價O抗原候選疫苗的軛合物多糖（Poolman和Wacker, J. Infect. Dis. [感染性疾病雜誌] (2016) 第213 (1) 卷, 第6-13頁；WO 2015/124769；WO 2017/035181）。包含10種生物軛合物的組成物（O1A、O2、O4、O6A、O8、O15、O16、O18A、O25B和O75，該組成物被稱為ExPEC10V）已有描述並且處於臨床試驗中（例如，WO 2020/191082 A1）。每種生物軛合物均藉由單獨的生產菌株生產，顯示出O血清型依賴的產率變化。對於幾種O血清型的O抗原生產菌株，產率改進可藉由表現具有經修飾的底物特異性的空腸彎曲桿菌糖基轉移酶PglB的變體來獲得（參見例如，WO 2016/107818、WO 2016/107819）。然而，對於O18 O血清型（其在為ExPEC10V組成物製備的生物軛合物的十種血清型中展示出最低產率的生物軛合物生產），使用空腸彎曲桿菌PglB蛋白的變體和使用替代性PglB同系物並沒有導致產率改進。另外，旨在增加O18生物軛合產率的其他平臺修飾未能成功實現這一目標。該等修飾包括WecA的過表現，WecA係一種藉由催化N-乙醯葡糖胺（GlcNAc）-1-磷酸轉移到十一碳二烯磷酸酯（Und-P）上形成Und-P-P-GlcNAc來激活O單元生物合成的蛋白質。另外，將大腸桿菌K-12生物軛合平臺菌株中存在的天然Wzz O抗原鏈長調節劑替換為其他革蘭氏陰性細菌物種的O抗原鏈長調節劑導致O18A O抗原鏈長增加，並未導致產物產率的顯著增加。 實例 1 ： 具有改進產率的 O18 生物軛合物生產菌株
然而，我們確實獲得了具有增加的O18生物軛合物產物產率的菌株，並且發現那些菌株中的Wzy O抗原聚合酶與現有的O18生物軛合物生產菌株（其具有Wzy O抗原聚合酶，該酶具有SEQ ID NO: 1）中的Wzy相比具有胺基酸突變。基於此，我們創建了一種O18生物軛合物的新生產菌株，該新生產菌株與先前描述的（參見WO 2020/191082）O18生物軛合物生產菌株相比，除了其Wzy O抗原聚合酶中的三個胺基酸突變之外在其他方面係相同的。特別地，先前描述的菌株中的Wzy O抗原聚合酶分別在位置199、377和395處具有胺基酸蘇胺酸（T）、甲硫胺酸（M）和纈胺酸（V）（即，先前描述的菌株的Wzy O抗原聚合酶在SEQ ID NO: 1中給出），而新生產菌株在那些對應位置處具有胺基酸異白胺酸（I）、離胺酸（K）和丙胺酸（A）。
在滲透衝擊後運行的200 L生物反應器的過濾周質部分中，新菌株的O18生物軛合物的產率係先前描述的菌株的約2.4倍大（即在過程的早期，可以對產率進行合理量化）。
與先前描述的菌株相比，新菌株中具有四個N糖基化共有序列的EPA運載體蛋白的糖基化位點佔用率增加，即新菌株誘導更多的二-、三-和四糖基化的EPA運載體蛋白（例如圖1）。 實例 2： 經修飾的 Wzy O 抗原聚合酶的構建
接下來，我們對Wzy O抗原聚合酶胺基酸序列進行了誘變研究，並且我們鑒定了對O18生物軛合物的產率和糖基化模式有影響的SEQ ID NO: 1的Wzy O抗原聚合物序列中這三個位置中的胺基酸取代的特定組合。
使用定點誘變使用標準程序產生Wzy O抗原聚合酶的SEQ ID NO: 1的胺基酸序列中位置199、377和395中的一個或多個中的胺基酸取代的各種組合。所產生的各種組合如表3所示。 實例 3： 使用經修飾的 Wzy O 抗原聚合酶生產 O 抗原多糖
藉由基於同源重組的遺傳修飾技術，將已插入到大腸桿菌K-12生物軛合物生產菌株W3110的染色體中的大腸桿菌血清型O18A的 rfb簇中存在的 wzy基因（實例提供為SEQ ID NO: 5）替換為編碼具有SEQ ID NO: 1的經修飾的Wzy O抗原聚合酶的基因變體（其具有如表3所示的突變）。除了大腸桿菌血清型O18A的 rfb簇之外，大腸桿菌生物軛合物生產菌株W3110進一步包含編碼EPA運載體蛋白（具有SEQ ID NO: 3）的核酸和編碼寡糖基轉移酶PglB（具有SEQ ID NO: 6）的核酸。O18A多糖生物軛合物在搖瓶培養物中生產並使用滲透衝擊提取，如先前在例如WO 2020/191082中所述。 實例 4： 表徵 O18 生物軛合物
使用O18A特異性單株抗體（用於生物軛合物的免疫檢測）對周質提取物進行毛細管電泳免疫測定，該等提取物來自含有Wzy變體（具有如表3所示的突變）的大腸桿菌K-12生物軛合物生產菌株W3110的搖瓶培養物，該等變體針對O18A多糖生物軛合物表現進行誘導。基於與sEPA、單糖基化EPA和更高形式的糖基化EPA（二/三/四糖基化EPA）對應的峰的信號強度，對每個樣品進行相對定量，如藉由相對於總產物信號的MW測定（表3）。 [表3]. 野生型Wzy O抗原聚合酶和如所示在SEQ ID NO: 1的位置199、377和395中的一個或多個中具有胺基酸取代的變體Wzy O抗原聚合酶以及它們對O18生物軛合物的糖基化模式的影響。導致改進的糖基化模式的變體以粗體表示。
構建體 ID Wzy 胺基酸位置 總產物中每種亞型的百分比
199 377 395 sEPA 單 二/三/四
先前描述的生產菌株（具有SEQ ID NO: 1的Wzy） T M V 31% 45% 24%
新生產菌株 I K A 10% 34% 57%
變體1 I M V 26% 45% 29%
變體 2 T K V 6% 24% 71%
變體3 T M A 21% 41% 38%
變體 4 T K A 8% 27% 65%
變體 5 I K V 10% 30% 61%
變體 6 I M A 6% 34% 60%
實例 5： 使用新生產菌株生產 O18 生物軛合物，以及具有免疫原性活性的 ExPEC9V 和 ExPEC10V 多價產物
使用用於生產O18A生物軛合物的新菌株生產O18A生物軛合物，O18A生物軛合物在滲透衝擊後從周質中提取，對其進行層析法以去除宿主細胞蛋白質，並且使用提取的生物軛合物製備包含該O18A生物軛合物作為藥物物質的藥物組成物，基本上如WO 2020/191082（其中的實例8）中所述。
還將新的O18A藥物物質與大腸桿菌O抗原O1A、O2、O4（glc+）、O6A、O15、O16、O25B和O75、並且在一些情況下還包括O8的其他生物軛合物的藥物物質混合以獲得多價（分別為9價和10價）藥物產物。該等藥物產物在投與給兔子時誘導針對大腸桿菌血清型的抗體，該等血清型的O抗原存在於組成物中。因此，根據本發明之生物軛合物和組成物或者根據本發明之方法獲得的生物軛合物或組成物被證明適合誘導針對大腸桿菌的免疫反應。
無
[圖1]. 裝載有周質提取物的考馬斯染色之SDS-PAGE，該等提取物來自O18A生物軛合物的大腸桿菌生產菌株W3110的搖瓶培養物，該SDS-PAGE含有具有SEQ ID NO: 1的Wzy變體（泳道1和3）或具有針對O18A多糖生物軛合物表現進行誘導的胺基酸取代199I、377K、395A的Wzy變體（泳道2和4）。在泳道1和2上裝載的樣品中，寡糖基轉移酶PglB從尺寸減小的表現質體表現，而在泳道3和4中，PglB表現質體的載體骨架含有另外的包含非編碼DNA和lac阻遏基因lacI的4500 bp DNA序列，該序列似乎最適合產物表現。顯示O18A多糖生物軛合物材料的條帶用箭頭指示，描繪了單糖基化EPA（M）、二糖基化EPA（D）和三糖基化EPA（T）的大致尺寸。 發明描述
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同含義。否則，本文引用的某些術語具有如說明書中闡述的含義。本文引用的所有專利、公開的專利申請和出版物如同完全列出一樣藉由引用併入本文。必須注意，除非上下文另外明確規定，否則如本文和所附申請專利範圍中所用，單數形式「一/一個/種（a/an）」和「該（the）」包括複數指示物。
在本說明書和隨後的申請專利範圍全篇，除非上下文另有要求，否則詞語「包含（comprise）」，以及變型如「comprises」和「comprising」應當被理解為暗指包括所陳述的整數或步驟或者多個整數或步驟的組，但不排除任何其他整數或步驟或者多個整數或步驟的組。當在本文中使用時，術語「包含（comprising）」可以被術語「含有（containing）」或「包括（including）」替代或者當在本文中使用時有時被術語「具有（having）」替代。
當在本文中使用時，「由……組成」不包括未在請求項要素中指定的任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」並不排除不會實質性地影響請求項的基本和新穎特徵的材料或步驟。無論何時本文在本發明之一個方面或實施方式的上下文中使用時，前述術語「包含」、「含有」、「包括」和「具有」中的任一種可以被術語「由……組成（consisting of）」或「基本上由……組成」替代以改變本揭露的範圍。
如本文所用，多個引用的要素之間的連接術語「和/或」應被理解為涵蓋單獨的和組合的選項兩者。例如，當兩種要素由「和/或」連接時，第一選項係指在沒有第二要素的情況下第一要素的適用性。第二選項係指在沒有第一要素的情況下第二要素的適用性。第三選項係指第一要素和第二要素一起的適用性。該等選項中的任一種應被理解為落入該含義內，因此滿足如本文所用的術語「和/或」之要求。該等選項中的多於一種的同時適用性也應被理解為落入該含義內，因此滿足術語「和/或」之要求。
詞語「約」或「大約」在與數值結合使用時表示該值可以為指定值加或減該值的20%、較佳的是加或減該值的10%、更較佳的是加或減該值的5%。
序列同一性在本文中定義為藉由序列比較所確定的兩個或更多個胺基酸（多肽或蛋白質）序列或者兩個或更多個核酸（多核苷酸）序列之間的關係。兩個胺基酸序列之間的「相似性」係藉由將一個多肽的胺基酸序列及其保守性胺基酸取代物與第二個多肽的序列進行比較來確定的。可以藉由已知方法容易地計算「同一性」和「相似性」。
可以根據兩個序列的長度，使用全域或局部比對演算法藉由比對兩個肽或兩個核苷酸序列來確定「序列同一性」和「序列相似性」。較佳的是使用全域比對演算法（例如Needleman Wunsch）對相似長度的序列進行比對，該全域比對演算法最佳地在整個長度上比對序列，而較佳的是使用局部比對演算法（例如Smith Waterman）對長度大不相同的序列進行比對。當序列（例如，藉由程式GAP或BESTFIT使用預設參數進行最佳比對時）至少共有某一最小百分比的序列同一性（定義如下）時，則可以將序列稱為「基本上相同」或「基本上相似」。最較佳的是，序列比對在ClustalW（1.83）序列比對中使用預設設置進行。
替代性地，可以使用如FASTA、BLAST等演算法，藉由針對公共資料庫進行搜索來確定相似性或同一性百分比。因此，本發明之核酸和蛋白質序列可以進一步用作「查詢序列」以針對公共資料庫進行搜索，以例如鑒定其他家族成員或相關序列。可以使用Altschul等人 (1990) J. Mol. Biol. [分子生物學雜誌] 215: 403—10的BLASTn和BLASTx程式（2.0版）進行此類搜索。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程式進行，得分 = 100，字長 = 12，以獲得與本發明之wzy核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質搜索可以用BLASTx程式進行，得分 = 50，字長 = 3，以獲得與本發明之蛋白質分子同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對，可以如Altschul等人, (1997) Nucleic Acids Res. [核酸研究] 25 (17): 3389-3402中所述，利用空位BLAST。利用BLAST和空位BLAST程式時，可以使用各程式（例如，BLASTx和BLASTn）的預設參數。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov/上國家生物技術資訊中心的主頁。
除非另外指明，否則在一系列要素前面的術語「至少」應被理解為指該系列中的每一個要素。
無
 

          <![CDATA[<110>  美商詹森藥物公司（Janssen Pharmaceuticals, Inc.）]]>
          <![CDATA[<120>  大腸桿菌O18生物軛合物之生產]]>
          <![CDATA[<130>  CRU6060EPEPA1]]>
          <![CDATA[<140>  TW 111112472]]>
          <![CDATA[<141>  2022-03-31]]>
          <![CDATA[<150>  EP 21166781.1]]>
          <![CDATA[<151>  2021-04-01]]>
          <![CDATA[<160>  6     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  396]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌（Escherichia coli）]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Ile Tyr Ile Leu Thr Leu Thr Leu Leu Leu Val Ile Ala Ile Met 
          1               5                   10                  15      
          Phe Ser Leu Leu Gly Thr Lys Ser Arg Ile Thr Ser Pro Leu Pro Leu 
                      20                  25                  30          
          His Phe Leu Pro Trp Leu Leu Thr Leu Ile Val Gly Ile Ser Asn Tyr 
                  35                  40                  45              
          Asp Gln Phe Tyr Glu Phe Asn Glu Arg Ser Phe Tyr Ser Leu Leu Ile 
              50                  55                  60                  
          Trp Phe Thr Val Ile Phe Ile Phe Tyr Phe Ile Gly Glu Leu Val Asn 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Lys Arg Glu Asn Ile Asn Val Tyr Tyr Gly Leu Ser His Ile Lys 
                          85                  90                  95      
          Tyr Glu Cys Lys Lys Tyr Trp Ile Ile Val Ile Pro Ile Ser Leu Tyr 
                      100                 105                 110         
          Thr Ile Phe Glu Ile Tyr Met Val Gly Met Gly Gly Ala Asp Gly Phe 
                  115                 120                 125             
          Phe Leu Asn Leu Arg Leu Ala Asn Thr Leu Glu Gly Tyr Thr Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          Lys Phe Ile Leu Met Pro Ala Val Tyr Pro Leu Met Met Ala Met Phe 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ile Val Cys Leu Thr Lys Thr Ser Lys Leu Asn Lys Tyr Ser Ile 
                          165                 170                 175     
          Tyr Phe Trp Met Phe Leu Tyr Cys Ile Gly Thr Met Gly Lys Phe Ser 
                      180                 185                 190         
          Ile Leu Thr Pro Ile Leu Thr Tyr Leu Ile Ile Tyr Asp Phe Lys His 
                  195                 200                 205             
          Arg Leu Lys Val Lys Lys Thr Ile Lys Phe Thr Leu Leu Ile Ile Ile 
              210                 215                 220                 
          Leu Ala Leu Thr Leu His Phe Thr Arg Met Ala Glu Asn Asp His Ser 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Phe Leu Ser Ile Leu Gly Leu Tyr Ile Tyr Ser Pro Ile Ile Ala 
                          245                 250                 255     
          Leu Gly Gln Leu Asn Glu Val Asn Ser Ser His Phe Gly Glu Tyr Thr 
                      260                 265                 270         
          Phe Arg Phe Ile Tyr Ala Ile Thr Asn Lys Ile Gly Leu Ile Lys Glu 
                  275                 280                 285             
          Leu Pro Val Asn Thr Ile Leu Asp Tyr Ser Tyr Val Pro Val Pro Thr 
              290                 295                 300                 
          Asn Val Tyr Thr Ala Leu Gln Pro Phe Tyr Gln Asp Phe Gly Tyr Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ile Ile Phe Gly Ala Val Leu Tyr Gly Leu Ile Tyr Val Ser Leu 
                          325                 330                 335     
          Tyr Thr Ala Gly Val Arg Gly Asn Asn Thr Gln Ala Leu Leu Ile Tyr 
                      340                 345                 350         
          Ala Leu Phe Ser Val Ser Ser Ala Thr Ala Phe Phe Ala Glu Thr Leu 
                  355                 360                 365             
          Val Thr Asn Leu Ala Gly Asn Val Met Leu Val Leu Cys Thr Ile Leu 
              370                 375                 380                 
          Leu Trp Arg Phe Thr Val Ile Cys Lys Pro Val Gln 
          385                 390                 395     
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  1191]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌（Escherichia coli）]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          atgatatata tattaacttt aactcttctt ctagttatag ccataatgtt ttctcttctc       60
          ggcacaaaaa gtaggatcac atctccatta cctttgcatt ttttaccatg gttactaact      120
          ttaattgtcg ggataagtaa ttacgatcaa ttttacgagt ttaatgaaag aagcttttac      180
          tctttgttga tttggtttac agttattttt atattttatt tcatagggga actggttaat      240
          tataaacgtg aaaatataaa tgtttattat ggtctttcac atattaaata tgaatgtaaa      300
          aaatattgga tcattgtcat cccaatttca ttatatacca ttttcgaaat atatatggtt      360
          ggtatggggg gagcagatgg attctttctc aatttacgtc ttgcaaatac attggagggc      420
          tatacgggta aaaaatttat cttaatgcct gctgtatatc ctctaatgat ggctatgttc      480
          gcaattgttt gtctaacaaa aacttccaaa ttaaataaat actccattta tttctggatg      540
          tttttgtatt gtattggcac aatgggaaaa ttttcaatat taacgccaat attgacatat      600
          ttaattattt atgacttcaa acatagatta aaagtaaaaa aaacaataaa gtttacattg      660
          ttgataatta tattagcttt aactttgcat tttacacgta tggctgagaa tgaccactca      720
          acatttttat ctattttagg gctctatatt tattcaccaa taattgcttt aggccagttg      780
          aatgaagtaa atagtagtca ttttggtgag tatacgttta gattcatata tgctataact      840
          aataaaattg gccttattaa agaattgcca gtaaatacta ttcttgacta ttcatacgtt      900
          cctgtaccaa caaatgtata tactgcactt caaccatttt accaggattt tggttatact      960
          ggcatcatat ttggagcagt attatacgga ctaatatatg tgagtttata cacggccggt     1020
          gttcgtggaa ataatacaca ggcattactg atttacgcat tgttttcagt tagcagtgca     1080
          acggctttct tcgctgaaac gctagtaacg aatttagctg gaaatgtgat gttagtatta     1140
          tgtaccatct tactatggcg atttacagta atatgcaaac cagtacagta a              1191
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  652]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  包含4個優化的N糖基化序列的去毒的EPA蛋白]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 
                      20                  25                  30          
          Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 
                  35                  40                  45              
          Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met 
              50                  55                  60                  
          Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 
                          85                  90                  95      
          Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 
                      100                 105                 110         
          Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 
                  115                 120                 125             
          Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 
              130                 135                 140                 
          His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 
          145                 150                 155                 160 
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                          165                 170                 175     
          Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 
                      180                 185                 190         
          Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala 
                  195                 200                 205             
          Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn 
              210                 215                 220                 
          Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile 
                          245                 250                 255     
          Lys Asp Asn Asn Asn Ser Thr Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His 
                      260                 265                 270         
          Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys 
                  275                 280                 285             
          His Leu Pro Leu Glu Ala Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp 
              290                 295                 300                 
          Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg 
                          325                 330                 335     
          Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile 
                      340                 345                 350         
          Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala 
                  355                 360                 365             
          Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly 
              370                 375                 380                 
          Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Lys Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Asn Arg Thr Lys Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp 
                          405                 410                 415     
          Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 
                      420                 425                 430         
          Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 
                  435                 440                 445             
          Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val 
              450                 455                 460                 
          Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 
          465                 470                 475                 480 
          Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg 
                          485                 490                 495     
          Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 
                      500                 505                 510         
          Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu 
                  515                 520                 525             
          Arg Val Tyr Val Pro Arg Trp Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly 
              530                 535                 540                 
          Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu 
                          565                 570                 575     
          Glu Gly Gly Arg Val Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 
                      580                 585                 590         
          Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly 
                  595                 600                 605             
          Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala 
              610                 615                 620                 
          Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr 
                          645                 650         
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  優化的N糖基化共有序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (1)..(1)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa可以為Asp或Glu]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (2)..(2)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa可以為除Pro之外的任何天然胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (4)..(4)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa可以為除Pro之外的任何天然胺基酸]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<221>  尚未歸類的特徵]]>
          <![CDATA[<222>  (5)..(5)]]>
          <![CDATA[<223>  Xaa可以為Ser或Thr]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  13039]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  大腸桿菌（Escherichia coli）]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          atgacgaatt taaaagcagt tattcctgta gcgggtcttg ggatgcatat gttgcctgcc       60
          actaaggcga ttcccaaaga gatgctaccg atcgtcgaca agccaatgat tcagtacatc      120
          gttgacgaga ttgtggctgc agggatcaaa gaaatcctcc tggtaactca cgcgtccaag      180
          aacgcggtcg aaaaccactt cgacacctct tatgaattag aatctctcct tgaacagcgc      240
          gtgaagcgtc aactgctggc ggaagtacag tccatttgcc cgccgggcgt gacaattatg      300
          aacgtgcgtc agggcgaacc tttaggtttg ggccactcca ttttatgtgc acgacctgcc      360
          attggtgaca atccatttgt cgtggtgctg ccagacgttg tgatcgacga cgccagcgcc      420
          gacccgctgc gctacaacct tgctgccatg attgcgcgct ttaacgaaac tggccgcagc      480
          caggttctgg caaaacgcat gccgggcgat ctctctgaat actccgtcat ccagactaaa      540
          gaaccgcttg atcgcgaagg taaagtcagc cgcattgttg aatttatcga aaaaccggat      600
          cagccgcaga ccctggactc agacatcatg gctgtagggc gttatgtgct ttctgccgat      660
          atttggcctg aactggagcg tactcaacct ggagcatggg gacgtattca gttgactgat      720
          gccattgctg agttggcaaa aaaacaagca gttgacgcaa tgctgatgac tggggacagt      780
          tacgactgcg gaaagaaaat gggttatatg caagcgtttg tgaagtatgg gctgcgtaac      840
          ctaaaagaag gggcgaagtt ccgtaaaggg attgagaagc tgttaagcga ataatgaaaa      900
          tctgaccgga tgtaacggtt gataagaaaa ttataacggc agtgaagatt agcggcgaaa      960
          gtaatttgtt gcgaattttc ctgccgttgt tttatataaa caatcagaat aacaacgagt     1020
          tagcaacagg attatcgtca aagttttcca ggattttcct tgtttccaga gcggattggt     1080
          aagacaatta gcttctgaat ttttcgggtt tagcgcgagt gggtaacact cgtcacatcg     1140
          taggcatgca tgcagtgctc tggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt gcattaatac     1200
          ctctattaat caaactgaga gccgcttatt tcacagcatg ctctgaagta atatggaata     1260
          aattaagtga aaatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt     1320
          cacattataa atgatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga     1380
          aacctggaat cacttgcaga tgtttctgat tctgaacgct atttctttga acatgcggat     1440
          atttgtgatg cagctgcaat ggcacggatt tttgctcagc atcagccgga tgcagtgatg     1500
          cacctggcag ctgaaagcca tgttgaccgt tcaattacag gccctgcggc atttattgaa     1560
          accaatattg ttggtactta tgtcctttta gaagcggctc ggaattactg gtctgcactt     1620
          gatggcgaca agaaaaacag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggt     1680
          gatttgcctc atcctgacga ggtaaataat aaagaaggat tacccttatt tactgagacg     1740
          acagcctacg caccaagcag cccttattct gcatcaaaag cgtccagcga tcatttagtc     1800
          cgtgcgtgga aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaattgctc taacaattat     1860
          ggtccttatc atttcccgga aaaattgatt ccattggtta ttctgaatgc tctggaaggt     1920
          aaaggattac ctatttatgg aaaaggcgat caaattcgcg actggctgta tgttgaagat     1980
          catgcgcgtg cgttatatac cgtcgtaacc gaaggtaaag cgggtgaaac ttataacatt     2040
          ggtggacaca acgaaaagaa aaacatcgat gtagtgctca ctatttgtga tttgttggat     2100
          gagattgtcc cgaaagagaa atcttaccgc gagcaaatta cttatgttgc cgatcgtccg     2160
          ggacacgatc gacgttatgc gattgatgct gagaagattg gtcgcgaatt gggatggaaa     2220
          ccacaggaaa cgtttgagag cgggattcgt aaaactgtgg aatggtatct gtccaataca     2280
          aaatgggttg ataatgtgaa aagtggtgcc tatcaatcgt ggattgaaca gaactatgag     2340
          ggccgccact aatgaatatc ctcctttttg gcaaaacagg gcaggttggt tgggaactac     2400
          agcgtgctct ggcacctctg ggtaatttga ttgctcttga tgttcactcc actgattact     2460
          gtggtgattt tagtaaccct gaaggtgtgg ctgaaaccgt tagaagcatt cggcctgata     2520
          ttattgtcaa cgcagccgct cacaccgcag tagacaaagc agaatcagaa ccggagtttg     2580
          cacaattact gaacgcgacg agtgtcgaag cgatcgcgaa agcagccaat gaagtcggcg     2640
          cttgggttat tcactactct actgactacg tatttccggg gaccggtgaa ataccatggc     2700
          aggaggagga tgcaaccgca ccgctaaatg tttacggtga aaccaagtta gcaggagaaa     2760
          aagcattaca agagcattgt gcgaagcacc ttattttccg gaccagctgg gtctatgcag     2820
          gtaaaggaaa taacttcgcc aaaacgatgt tgcgtctggc aaaagagcgt gaagaattag     2880
          ccgttattaa tgatcagttt ggtgcgccaa ctggcgcaga gttgctggct gattgtacgg     2940
          cacatgccat tcgtgtggca ctgaataaac cggaagtcgc aggtttgtac catctggtag     3000
          ccagtggtac cacaacctgg cacgattatg ctgcgctggt ttttgaagag gcgcgcaaag     3060
          caggcattcc ccttgcactc aacaagctca acgcagtacc aacaacagtc tatcctacac     3120
          cagctcgtcg tccacataac tctcgcctta atacagaaaa atttcagcag aactttgcgc     3180
          ttgtcttgcc tgactggcag gttggtgtga aacgcatgct caacgaatta tttacgacta     3240
          cagcaattta atagtttttg catcttgttc gtgatggtgg aacaagatga attaaaagga     3300
          atgatggaat gaaaacgcgt aaaggtatta ttttagcggg tggttctggt acacgtcttt     3360
          atcctgtgac tatggctgtc agtaaacagc tgttaccgat ttatgataaa ccgatgatct     3420
          attacccgct ctctacactg atgttggcgg gtattcgcga tattttgatt atcagcacgc     3480
          cacaggatac tcctcgtttt caacaactgc tgggtgatgg gagccagtgg gggctaaatc     3540
          ttcactacaa agtgcaaccg agtccggatg gtcttgcgca ggcatttatc atcggtgaag     3600
          agtttatcgg tggtgatgat tgtgctttgg tacttggtga taatatcttc tacggtcacg     3660
          acctgcctaa gttaatggat gccgctgtta acaaagaaag tggtgcaacg gtatttgcct     3720
          atcacgttaa tgatcctgaa cgctatggtg tcgttgagtt tgataaaaac ggtacggcaa     3780
          ttagcctcga agaaaaaccg ctacaaccaa aaagtaatta tgcagtaacc gggctttatt     3840
          tctatgataa ctacgttgtg gaaatggcga aaaatcttaa gccttctgcc cgcggtgaac     3900
          tggaaattac cgatattaac cgtatttata tggaacaggg gcatttatct gttgccatga     3960
          tgggacgtgg ttatgcatgg ctggacacgg ggacacatca gagtcttatt gaagcaagca     4020
          acttcattgc caccattgaa gagcgccagg gactaaaggt ttcctgccca gaagaaattg     4080
          cttatcgtaa aggatttatt gacgcagagc aggttaaggt attagccgaa ccgctgaaga     4140
          aaaacgctta tggtcagtat ttgctgaaaa tgattaaagg ttagtaataa aatgaatgtt     4200
          attaaaacag aaattccaga cgtactgatt tttgaaccga aagtttttgg tgacgagcgc     4260
          ggtttctttt tcgaaagcta taaccagagg gtttttgagg aagctgtagg tcgcaaagtt     4320
          gagtttgttc aggataacca ttctaaatcg agaaaaggag tattgcgggg attgcattat     4380
          caattagagc cgtatgcgca agcaaaactt gtgcgttgca ttgagggtga agtatttgat     4440
          attgctgtag atatacggaa gtcatctcca ttttttggta aatgggttgg tgtaacatta     4500
          tccgctgaaa ataaacgtca attatggatc cctgaagggt ttgctcatgg ttttgtggtg     4560
          attagtgata ctgcggaatt tgtctataaa acgaacaatt attacagtca acaagcagag     4620
          cgaagcataa tttttgatga taaagactta gggattgctt ggccattgaa tactcattat     4680
          attctttcag aaaaagattt aaatgcgcca acatttaaga aaatatcgag taatgagtat     4740
          tttaaatgag tttaatcaaa aacagttttt ggaacctttg cgggtatgta cttccagcta     4800
          ttgtgacact accagctttg ggtattatgg ggcgaaaatt aggcccagaa ttatttggtg     4860
          tattcacttt ggcattagct gttgtgggtt atgcaagcat ttttgatgca ggccttactc     4920
          gcgcagtgat acgagaagtc gcaattgaaa aagataatga agaaaataag ttgaaaatta     4980
          tttcttcagc gacagttgta attatttatt tgagtttggc cgcctcactc ttattatttt     5040
          tttttagtgg tcatatcgca ttgctactga acattagtga gacttttttt cataatgtaa     5100
          gtgtctcgct taaaattctc gcagcatcca taccattatt tttgattact caaatatggt     5160
          tgtcaatttt agaaggtgaa gaaagatttg gtttacttaa tatctacaaa tcaattacgg     5220
          gagtgatatt agcaatctca ccggcattat ttatacttat taaaccctct ttgatgtatg     5280
          cgataatagg cttagttcta gcaaggtttt tatgttttat tttggctttt ataatttgtc     5340
          acgataaagt gcttaaagct aaactaacaa tcgatatacc aacaattaaa agattgttta     5400
          tgttcggtgg ttggattaca gtaagtaata tcatcagccc tgtgctatca tattttgata     5460
          ggtttattgt ttcaaatcaa cttggggctg ctaatgttgc tttttatact gcaccatcag     5520
          aaattatttc tcggcttagt ataattccag gtgcgttttc aagagcctta tttccaagat     5580
          tagctaatgc aaataattcc gctgaaagat ataaaacgaa aagattaatt acaatttcac     5640
          ttttaataat catcacccct attttttgta ttggcgtgtt attttcagag aagataatgg     5700
          ttttatggat gggggcatca ttttttggtg agcctggttt ggtattatca atattactga     5760
          ttggctttat ttttaatgga ttggcacaag taccatttgc cagtattcaa tcccgaggtc     5820
          atgctaagat aactgcattt gttcatctct tagagttgtt tccttattta ttacttttat     5880
          tttacctcat aaaagcacat ggggttgttg gcgcgggtat tgcgtggtca gtgaggatga     5940
          tagtagatta tatagcatta agtcttttgg acggtaagta tattaataaa taaaattcaa     6000
          aatgcaagtt aataactcat ggctttattt gggtaggtga caatttataa tgatatatat     6060
          attaacttta actcttcttc tagttatagc cataatgttt tctcttctcg gcacaaaaag     6120
          taggatcaca tctccattac ctttgcattt tttaccatgg ttactaactt taattgtcgg     6180
          gataagtaat tacgatcaat tttacgagtt taatgaaaga agcttttact ctttgttgat     6240
          ttggtttaca gttattttta tattttattt cataggggaa ctggttaatt ataaacgtga     6300
          aaatataaat gtttattatg gtctttcaca tattaaatat gaatgtaaaa aatattggat     6360
          cattgtcatc ccaatttcat tatataccat tttcgaaata tatatggttg gtatgggggg     6420
          agcagatgga ttctttctca atttacgtct tgcaaataca ttggagggct atacgggtaa     6480
          aaaatttatc ttaatgcctg ctgtatatcc tctaatgatg gctatgttcg caattgtttg     6540
          tctaacaaaa acttccaaat taaataaata ctccatttat ttctggatgt ttttgtattg     6600
          tattggcaca atgggaaaat tttcaatatt aacgccaata ttgacatatt taattattta     6660
          tgacttcaaa catagattaa aagtaaaaaa aacaataaag tttacattgt tgataattat     6720
          attagcttta actttgcatt ttacacgtat ggctgagaat gaccactcaa catttttatc     6780
          tattttaggg ctctatattt attcaccaat aattgcttta ggccagttga atgaagtaaa     6840
          tagtagtcat tttggtgagt atacgtttag attcatatat gctataacta ataaaattgg     6900
          ccttattaaa gaattgccag taaatactat tcttgactat tcatacgttc ctgtaccaac     6960
          aaatgtatat actgcacttc aaccatttta ccaggatttt ggttatactg gcatcatatt     7020
          tggagcagta ttatacggac taatatatgt gagtttatac acggccggtg ttcgtggaaa     7080
          taatacacag gcattactga tttacgcatt gttttcagtt agcagtgcaa cggctttctt     7140
          cgctgaaacg ctagtaacga atttagctgg aaatgtgatg ttagtattat gtaccatctt     7200
          actatggcga tttacagtaa tatgcaaacc agtacagtaa ccattctaat ggccacctac     7260
          aatggcgagg ccttcatcaa aaatcagatt ttgtcactac aacaacaaac attttctaac     7320
          tggcggttat ttattcagga tgatgggtct acagacaata ctatatctat aataaaaaac     7380
          ttccaaaaat ctgactccag aattcggcta gttgatgata atttgaaagg tcaaggtgca     7440
          ggaaaaaatt ttttatcgct gataaagtac agcgagacag attatacaat ttattgtgac     7500
          caagatgata tttggttaga aaacaaaata tttgaattag taaagtatgc aaatgaaatt     7560
          aaattgaatg tatcagatgc gccttcgcta gtttatgctg atggctatgc ttatatggat     7620
          ggtgagggta caatcgattt ttctgggata tctaacaatc atgctgatca attaaaggat     7680
          tttctttttt ttaatggtgg ataccaagga tgttctatta tgttcaatcg tgcaatgacc     7740
          aaatttcttc tgaattatcg aggatttgta tatctacatg acgatatcac aacattagct     7800
          gcatacgctc ttggtaaagt ttattttctc ccgaaatacc ttatgttata tagacagcac     7860
          acgaatgcgg taactggtat caaaacattc cgcaatggat tgacttctaa atttaaatca     7920
          ccagtaaact atcttttatc acgaaaacat tatcaggtaa aaaaatcttt ttttgaatgt     7980
          aacagctcta tcttatcaga gacgaataaa aaagtttttt tggattttat ttcattttgt     8040
          gaatcaaata ataaatttac agattttttt aagttatggc gaggtgggtt tagattaaat     8100
          aacagtagaa ctaaattatt attaaaattc ttaatacgga gaaaatttag cgaatgattt     8160
          caatacttac acctactttt aatcggcaac atactttatc aaggctattc aattctctta     8220
          tattacaaac tgataaagat tttgagtgga taataattga tgatggtagt atagatgcaa     8280
          cagcggtact tgtagaagat tttagaaaaa aatgtgattt tgacttgatt tattgctatc     8340
          aggaaaataa tggtaagccc atggctttaa acgctggtgt taaagcttgt agaggcgatt     8400
          atatctttat tgttgacagt gatgatgcac taactcccga tgccataaaa ttaattaaag     8460
          aatcaataca tgattgctta tctgagaagg aaagtttcag cggagtcggt tttagaaaag     8520
          catatataaa aggggggatt attggtaatg atttaaataa ttcttcagaa catatatact     8580
          atttaaatgc gactgagatt agcaatttaa taaatggtga tgttgcatat tgttttaaaa     8640
          aagaaagttt ggtaaaaaat ccattccccc gtatagaaga tgaaaaattt gttccagaat     8700
          tatatatttg gaataaaata actgacaagg cgaagattcg atttaacata agcaaagtta     8760
          tatatctttg tgagtatctt gatgatggtc tttctaaaaa tttccataac cagcttaaaa     8820
          aatacccaaa ggggtttaag atttattaca aagatcaaag aaaacgagag aaaacttata     8880
          taaaaaaaac aaagatgcta attagatatt tgcaatgttg ttattatgag aaaataaaat     8940
          gaaaatacta tttgtcatta caggtttagg ccttggaggt gctgagaagc aggtttgtct     9000
          tttagctgat aaattaagtt taagcgggca ccatgtaaag attatttcac ttggacatat     9060
          gtctaataat aaagtctttc ctagcgaaaa taatgttaat gtcattaatg taaatatgtc     9120
          aaaaaacatt tctggagtta taaaaggttg tgtcagaatt agagatgtta tagctaattt     9180
          caaaccagac attgtacaca gtcatatgtt tcatgcaaac attatcacta gattgtctgt     9240
          aattggaatc aaaaacagac ctggtattat atcaactgca cataataaaa atgaaggtgg     9300
          gtatttcaga atgctcacat atagaataac cgattgttta agtgattgtt gtacaaatgt     9360
          tagcaaagaa gcagtggatg agtttttacg gataaaagcc tttaatcccg ctaaagcaat     9420
          tactatgtat aatgggatag ataccaataa atttaaattt gatttattgg caaggaggga     9480
          aattcgagac ggtattaata taaaaaatga tgatatatta ttacttgctg caggtcgttt     9540
          aacgttagct aaagattatc ctaatttatt gaatgcaatg actctgcttc ctgaacactt     9600
          taaacttatt attattggtg atggtgaatt gcgtgacgaa attaatatgc ttataaaaaa     9660
          attgcaatta tctaataggg tgtccttgtt gggagttaaa aaaaatattg ctccctattt     9720
          ttctgcatgt gatatttttg ttctctcttc tcgttgggaa ggatttggat tagtcgtggc     9780
          agaagctatg tcatgtgagc gaattgttgt tggcacggat tcagggggag taagagaagt     9840
          tattggtgac gatgattttc ttgtacccat atctgattca acacaacttg caagcaaaat     9900
          tgaaaaattg tctttgagcc agatacgtga tcacattggt tttcggaatc gtgagcgtat     9960
          tttaaaaaat ttctcaatag atactattat tatgcagtgg caagaactct atggaactat    10020
          aatttgctca aaacatgaaa ggtagattta tatttggaac gtgtcttttg tttgaattta    10080
          attcaatctc aattgagatt tttgtatttc aaaaatacca tcatagctaa cgatgattgg    10140
          tatttatttt aagatgcttt ctataaatat attgacgttt ttaatgcgcc gaaacgattg    10200
          ggctgggaac agagaagtaa aactgttttg agaatgaaga gtttttgaga tgtttatgga    10260
          tattaaaaat tgatccagtg aattaattat ttataataaa tcaagattta atgttaataa    10320
          atgataatct tttctgacac tcatattaat tatgagtggt acgtttggta aacggtaaac    10380
          tattatatga cagctagaac aactaaagtt ttgcacttac aattactccc actcttaagt    10440
          ggcgttcaaa gggtaacatt aaacgaaatt agtgcgttat atactgatta tgattataca    10500
          ctagtttgct caaaaaaagg tccactaaca aaagcattgc tggaatatga tgtcgattgt    10560
          cattgtatcc ccgaacttac gagagaaatt accgtaaaga atgattttaa agcattgttc    10620
          aagctttata agttcataaa aaaagaaaaa tttgacattg tgcatacaca ttcttcaaaa    10680
          acaggtattt tggggcgagt tgctgccaaa ttagcacgtg ttggaaaggt gatccacact    10740
          gtacatggtt tttcttttcc agccgcatct agtaaaaaaa gttattacct ttattttttc    10800
          atggaatgga tagcaaagtt ctttacggat aagttaatcg tcttgaatgt agatgatgaa    10860
          tatatagcaa taaacaaatt aaaattcaag cgggataaag tttttttaat tcctaatgga    10920
          gtagacactg ataagttttc tcctttagaa aataaaattt atagtagcac cttgaatcta    10980
          gtaatggttg gtagattatc caagcaaaaa gatcctgaga cattattgct tgctgttgaa    11040
          aaactgctga atgaaaatgt taatgttaag ctgacacttg taggagatgg tgaactaaaa    11100
          gaacagttag aaagcaggtt caaacggcaa gatggacgta taatttttca tggatggtca    11160
          gataacattg ttaatatttt aaaagttaat gatcttttta tattaccttc tctttgggag    11220
          ggtatgccat tagcaatttt agaagcattg agctgtggac ttccatgtat agtcactaat    11280
          attccaggta ataatagctt aatagaagat ggctataatg gttgtttgtt tgaaattaga    11340
          gattgtcagt tattatctca aaaaatcatg tcatatgttg gtaagccaga actgattgca    11400
          cagcaatcta ccaatgcacg atcatttatt ctgaaaaatt atggattagt taaaagaaat    11460
          aataaggtca gacagctata tgataattaa atgaaaccga aaagttaaaa aagaacaggt    11520
          ttttcaaagt gaaaataaaa ttacagtttt tttattgcaa tgattaacgt aacatctgca    11580
          ttacattcaa gccgcacaac cccgcggtga ccacccctga caggagtaaa caatgtcaaa    11640
          gcaacagatc ggcgtcgtcg gtatggcagt gatgggacgc aacctcgcgc tcaacatcga    11700
          aagccgtggt tataccgtct ctattttcaa ccgttcccgt gaaaagacgg aagaagttat    11760
          tgccgaaaat ccaggcaaga aactggttcc ttactatacg gtgaaagagt tcgttgaatc    11820
          tcttgaaacg cctcgtcgca tcctgttaat ggttaaagca ggtgcaggca cggatgctgc    11880
          tattgattcc ctgaaaccat atctcgataa aggcgatatc atcattgatg gtggtaatac    11940
          cttcttccag gacaccattc gtcgtaaccg cgagctttct gcacaaggct ttaacttcat    12000
          cggtacgggt gtttccggtg gtgaagaggg cgcgctgaaa ggaccttcta tcatgcctgg    12060
          tgggcagaaa gaggcctatg aactggttgc tcctatcctg accaaaatcg ccgccgtggc    12120
          tgaagatggt gaaccatgcg ttacctatat tggtgccgat ggcgcaggtc actatgtgaa    12180
          gatggttcac aacggtattg aatacggtga tatgcaactg attgctgaag cctattctct    12240
          gctgaaaggt ggtctgaatc tctctaacga agaactggca caaaccttta ccgagtggaa    12300
          taacggtgaa ctgagcagtt acctgatcga catcactaaa gacatcttca ccaaaaaaga    12360
          tgaagacggt aactacctgg ttgatgtgat cctggatgaa gcagcaaaca aaggtacggg    12420
          taaatggacc agtcagagcg cgctggatct cggtgagcca ctgtcgctga ttactgagtc    12480
          tgtgtttgca cgctacatct cttcactaaa agatcagcgc gtggctgcgt ctaaagtact    12540
          gtcgggtcca caagcgcagc cagcaggcga caaagcagag ttcattgaaa aagttcgccg    12600
          tgcgctttat ctgggtaaga ttgtttctta cgcgcagggc ttctctcagc tgcgtgctgc    12660
          gtctgaagag tacaactggg atctgaacta cggtgaaatc gcgaagattt tccgtgctgg    12720
          ctgcatcatc cgtgcgcagt tcctgcagaa aatcaccgat gcttatgccg aaaatccgca    12780
          gatcgctaac ctgctgctgg ctccgtactt caagcaaatt gccgatgact accagcaggc    12840
          tctgcgtgat gtcgttgctt atgcagtaca gaacggtatc ccggttccga ccttcgccgc    12900
          tgcggttgcc tattacgata gctaccgtgc cgctgttctg cctgcgaacc tgatccaggc    12960
          acagcgtgac tatttcggtg cacatactta taagcgcatt gataaagaag gtgtgttcca    13020
          tactgaatgg ctggattga                                                 13039
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  713]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  PglB寡糖基轉移酶]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Met Leu Lys Lys Glu Tyr Leu Lys Asn Pro Tyr Leu Val Leu Phe Ala 
          1               5                   10                  15      
          Met Ile Ile Leu Ala Tyr Val Phe Ser Val Phe Cys Arg Phe Tyr Trp 
                      20                  25                  30          
          Val Trp Trp Ala Ser Glu Phe Asn Glu Tyr Phe Phe Asn Asn Gln Leu 
                  35                  40                  45              
          Met Ile Ile Ser Asn Asp Gly Tyr Ala Phe Ala Glu Gly Ala Arg Asp 
              50                  55                  60                  
          Met Ile Ala Gly Phe His Gln Pro Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Gly Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Leu Ser Ala Leu Thr Tyr Trp Leu Tyr Lys Ile Thr Pro Phe Ser 
                          85                  90                  95      
          Phe Glu Ser Ile Ile Leu Tyr Met Ser Thr Phe Leu Ser Ser Leu Val 
                      100                 105                 110         
          Val Ile Pro Thr Ile Leu Leu Ala Asn Glu Tyr Lys Arg Pro Leu Met 
                  115                 120                 125             
          Gly Phe Val Ala Ala Leu Leu Ala Ser Ile Ala Asn Ser Tyr Tyr Asn 
              130                 135                 140                 
          Arg Thr Met Ser Gly Tyr Tyr Asp Thr Asp Met Leu Val Ile Val Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Met Phe Ile Leu Phe Phe Met Val Arg Met Ile Leu Lys Lys Asp 
                          165                 170                 175     
          Phe Phe Ser Leu Ile Ala Leu Pro Leu Phe Ile Gly Ile Tyr Leu Trp 
                      180                 185                 190         
          Trp Tyr Pro Ser Ser Tyr Thr Leu Asn Val Ala Leu Ile Gly Leu Phe 
                  195                 200                 205             
          Leu Ile Tyr Thr Leu Ile Phe His Arg Lys Glu Lys Ile Phe Tyr Ile 
              210                 215                 220                 
          Ala Val Ile Leu Ser Ser Leu Thr Leu Ser Asn Ile Ala Trp Phe Tyr 
          225                 230                 235                 240 
          Gln Ser Ala Ile Ile Val Ile Leu Phe Ala Leu Phe Ala Leu Glu Gln 
                          245                 250                 255     
          Lys Arg Leu Asn Phe Met Ile Ile Gly Ile Leu Gly Ser Ala Thr Leu 
                      260                 265                 270         
          Ile Phe Leu Ile Leu Ser Gly Gly Val Asp Pro Ile Leu Tyr Gln Leu 
                  275                 280                 285             
          Lys Phe Tyr Ile Phe Arg Ser Asp Glu Ser Ala Asn Leu Thr Gln Gly 
              290                 295                 300                 
          Phe Met Tyr Phe Asn Val Asn Gln Thr Ile Gln Glu Val Glu Asn Val 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Leu Ser Glu Phe Met Arg Arg Ile Ser Gly Ser Glu Ile Val Phe 
                          325                 330                 335     
          Leu Phe Ser Leu Phe Gly Phe Val Trp Leu Leu Arg Lys His Lys Ser 
                      340                 345                 350         
          Met Ile Met Ala Leu Pro Ile Leu Val Leu Gly Phe Leu Ala Leu Lys 
                  355                 360                 365             
          Gly Gly Leu Arg Phe Thr Ile Tyr Ser Val Pro Val Met Ala Leu Gly 
              370                 375                 380                 
          Phe Gly Phe Leu Leu Ser Glu Phe Lys Ala Ile Met Val Lys Lys Tyr 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Gln Leu Thr Ser Asn Val Cys Ile Val Phe Ala Thr Ile Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Leu Ala Pro Val Phe Ile His Ile Tyr Asn Tyr Lys Ala Pro Thr Val 
                      420                 425                 430         
          Phe Ser Gln Asn Glu Ala Ser Leu Leu Asn Gln Leu Lys Asn Ile Ala 
                  435                 440                 445             
          Asn Arg Glu Asp Tyr Val Val Thr Trp Trp Asp Tyr Gly Tyr Pro Val 
              450                 455                 460                 
          Arg Tyr Tyr Ser Asp Val Lys Thr Leu Val Asp Gly Gly Lys His Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Lys Asp Asn Phe Phe Pro Ser Phe Ala Leu Ser Lys Asp Glu Gln 
                          485                 490                 495     
          Ala Ala Ala Asn Met Ala Arg Leu Ser Val Glu Tyr Thr Glu Lys Ser 
                      500                 505                 510         
          Phe Tyr Ala Pro Gln Asn Asp Ile Leu Lys Thr Asp Ile Leu Gln Ala 
                  515                 520                 525             
          Met Met Lys Asp Tyr Asn Gln Ser Asn Val Asp Leu Phe Leu Ala Ser 
              530                 535                 540                 
          Leu Ser Lys Pro Asp Phe Lys Ile Asp Thr Pro Lys Thr Arg Asp Ile 
          545                 550                 555                 560 
          Tyr Leu Tyr Met Pro Ala Arg Met Ser Leu Ile Phe Ser Thr Val Ala 
                          565                 570                 575     
          Ser Phe Ser Phe Ile Asn Leu Asp Thr Gly Val Leu Asp Lys Pro Phe 
                      580                 585                 590         
          Thr Phe Ser Thr Ala Tyr Pro Leu Asp Val Lys Asn Gly Glu Ile Tyr 
                  595                 600                 605             
          Leu Ser Asn Gly Val Val Leu Ser Asp Asp Phe Arg Ser Phe Lys Ile 
              610                 615                 620                 
          Gly Asp Asn Val Val Ser Val Asn Ser Ile Val Glu Ile Asn Ser Ile 
          625                 630                 635                 640 
          Lys Gln Gly Glu Tyr Lys Ile Thr Pro Ile Asp Asp Lys Ala Gln Phe 
                          645                 650                 655     
          Tyr Ile Phe Tyr Leu Lys Asp Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Gln Phe Ile 
                      660                 665                 670         
          Leu Met Asp Lys Thr Met Phe Asn Ser Ala Tyr Val Gln Met Phe Phe 
                  675                 680                 685             
          Leu Gly Asn Tyr Asp Lys Asn Leu Phe Asp Leu Val Ile Asn Ser Arg 
              690                 695                 700                 
          Asp Ala Lys Val Phe Lys Leu Lys Ile 
          705                 710
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
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Claims (16)

  1. 一種革蘭氏陰性細菌宿主細胞，其包含： (a) 含有至少一個糖基化共有序列的運載體蛋白； (b) 大腸桿菌O18 rfb基因座；以及 (c) 寡糖基轉移酶； 其中該細胞包含具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽，該多肽包含與SEQ ID NO: 1具有至少95%同一性的胺基酸序列，其中該胺基酸序列包含： i) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸； ii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸； iii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸； iv) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸；或 v) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的甲硫胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸。
  2. 如請求項1所述之宿主細胞，其中該具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽包含SEQ ID NO: 1的胺基酸序列，區別在於該胺基酸序列包含： i) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸； ii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸； iii) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的蘇胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸； iv) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的纈胺酸；或 v) 對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的甲硫胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸。
  3. 如請求項1或2所述之宿主細胞，其中該具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽包含對應於SEQ ID NO: 1中位置199的位置處的異白胺酸、對應於SEQ ID NO: 1中位置377的位置處的離胺酸、和對應於SEQ ID NO: 1中位置395的位置處的丙胺酸。
  4. 如請求項1-3中任一項所述之宿主細胞，其中編碼該具有Wzy O抗原聚合酶活性的多肽的多核苷酸或載體被整合到該宿主細胞的基因組中。
  5. 如請求項1-4中任一項所述之宿主細胞，其中該宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞。
  6. 如請求項5所述之宿主細胞，其中該宿主細胞為大腸桿菌K-12菌株，較佳的是菌株W3110。
  7. 如請求項1-6中任一項所述之宿主細胞，其中具有以下中的至少一項： a) 該寡糖基轉移酶包含與SEQ ID NO: 6具有至少95%序列同一性的胺基酸序列； b) 該運載體蛋白包含SEQ. ID NO. 3；以及 c) 該大腸桿菌O18 rfb基因座為具有血清型O18A的大腸桿菌菌株的 rfb基因座。
  8. 如請求項1-7中任一項所述之宿主細胞，其中該寡糖基轉移酶包含SEQ ID NO: 6的胺基酸序列。
  9. 如請求項1-8中任一項所述之宿主細胞，其中該宿主細胞包含具有編碼Wzy O抗原聚合酶的核苷酸序列的大腸桿菌O18 rfb基因座，該基因座編碼如請求項1-3中任一項所定義的具有Wzy O抗原聚合酶活性並且具有序列的多肽。
  10. 一種用於生產與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18抗原多糖的生物軛合物之方法，該方法包括：培養如請求項1-9中任一項所述之宿主細胞以生產該生物軛合物。
  11. 如請求項10所述之方法，該方法進一步包括：回收該生物軛合物。
  12. 如請求項11所述之方法，該方法進一步包括：將該回收的生物軛合物配製到藥物組成物中。
  13. 如請求項12所述之方法，該方法進一步包括：將一種或多種另外的與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O抗原多糖的生物軛合物添加到該藥物組成物中以獲得多價生物軛合物組成物。
  14. 如請求項13所述之方法，其中該一種或多種另外的生物軛合物包含至少一種選自由大腸桿菌血清型O1、O2、O4、O6、O8、O15、O16、O25和O75組成之群組的O抗原多糖。
  15. 如請求項14所述之方法，其中該多價生物軛合物組成物包含： (i) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O18A抗原多糖的生物軛合物； (ii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O1A抗原多糖的生物軛合物； (iii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O2抗原多糖的生物軛合物； (iv) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌葡糖基化O4抗原多糖的生物軛合物； (v) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O6A抗原多糖的生物軛合物； (vi) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O15抗原多糖的生物軛合物； (vii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O16抗原多糖的生物軛合物； (viii) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O25B抗原多糖的生物軛合物；以及 (ix) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O75抗原多糖的生物軛合物， 其中較佳的是，每種生物軛合物中的該運載體蛋白包含SEQ ID NO: 3。
  16. 如請求項15所述之方法，其中該多價生物軛合物組成物進一步包含： (x) 與運載體蛋白軛合的大腸桿菌O8抗原多糖的生物軛合物， 其中較佳的是，該運載體蛋白包含SEQ ID NO: 3。
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