KR101855142B1 - 신규한 폴리사카라이드 및 이의 용도 - Google Patents

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미하 에이. 해두프틀레
베로니카 감빌라라
마누엘라 말리
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

신규한 E. 콜라이 O 폴리사카라이드 즉, O25B가 본원에 제공된다. 또한, O25B 생산에 이용되는 효소를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 숙주 세포는 O25B 바이오컨주게이트를 생성하며, 여기에서 상기 바이오컨주게이트는 담체 단백질에 연결된 O25B를 포함하낟. O25B 및/또는 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 추가로 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 ExPEC로의 감염에 대한 백신으로서 사용될 수 있으며, 하나 이상의 추가적인 바이오컨주게이트를 추가로 포함할 수 있다.

Description

신규한 폴리사카라이드 및 이의 용도 {NOVEL POLYSACCHARIDE AND USES THEREOF}
1. 도입
E. 콜라이 항원 O25B의 구조물, 뿐만 아니라 O25B의 용도, O25B의 제조 방법, 및 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 기재된다. 출원인은 O25B의 생성을 담당하는 E. 콜라이 유전자 클러스터를 확인하였으며, O25B 항원의 구조를 완전히 특성 규명하였다. 따라서, 숙주 세포에서 O25B를 생성할 수 있는 핵산이 본원에 제공된다. 또한, O25B 생산 가능한 핵산을 포함하는, 숙주 세포 예를 들어, 재조합에 의해 조작된 숙주 세포가 본원에 제공된다. 이러한 숙주 세포는 담체 단백질에 연결된 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 치료제 (예를 들어, 백신)의 제형화에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 O25B 항원은 또한 항체 생성에 유용하며, 이는 예를 들어, 대상체의 수동 면역과 같은 치료학적 방법에 사용될 수 있다. E. 콜라이 (예를 들어, 장외 병원성, 예컨대, 요로병원성 E. 콜라이)로의 감염에 대한 치료학적 방법 예를 들어, 숙주의 백신화에 사용하기 위한, O25B를 단독으로 또는 기타 E. 콜라이 항원 (예를 들어, O1, O2 및 O6 및 이들의 하위혈청형(subserotype))과 조합되어 포함하는 조성물이 본원에 추가로 제공된다.
2. 배경
장외 병원성 E. 콜라이 (ExPEC)는 연간 상당한 이환율, 사망률 및 비용에 대한 원인이 되는 광범위한 감염을 초래한다. 요로 감염은 인간에서 ExPEC에 의해 초래되는 가장 빈번한 질환에 속한다. 그러나, 생명을 위협하는 질환 예컨대, 뇌막염 및 패혈증 또한 ExPEC에 의해 초래된다.
항생제에 대한 박테리아 내성은 박테리아 감염과의 싸움에서 주요 관심사이며, 다중-약물 내성 (MDR) E. 콜라이 균주가 더욱 더 유행이 되고 있다. Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; and Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10):1165-1176. 따라서, ExPEC에 대한 효과적인 백신 개발이 요구된다.
3. 개요
한 양태에서, 본원에 기재된 신규한 폴리사카라이드 즉, E. 콜라이 O25B를 생성할 수 있는 효소 (예를 들어, 글리코실전달효소)를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또한, 기타 E. 콜라이 항원, 예를 들어, O25A, O1, O2, 및 O6, 및 이의 하위혈청형을 생성할 수 있는 효소 (예를 들어, 글리코실전달효소)를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 본원에 제공된 숙주 세포는 관심있는 O 항원의 생성에 특이적인 핵산을 자연적으로 발현할 수 있거나, 숙주 세포는 이러한 핵산을 발현하도록 만들어질 수 있으며 즉, 특정 구체예에서, 상기 핵산은 숙주 세포에 이종성이다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 단백질의 N-당화에 활성인 추가적인 효소를 엔코딩하는 핵산을 포함하며 예를 들어, 본원에 제공된 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 또는 기타 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 담체 단백질 예를 들어, 올리고사카라이드 및/또는 폴리사카라이드가 부착되어 바이오컨주게이트를 형성할 수 있는 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.. 섹션 5.3 참조.
특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec138) 유전자 클러스터 (SEQ ID NO:12), 또는 E. 콜라이 rfb(upec138) 유전자 클러스터 (SEQ ID NO:12)와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다..
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec163) 유전자 클러스터, 또는 E. 콜라이 rfb(upec163) 유전자 클러스터와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec177) 유전자 클러스터, 또는 E. 콜라이 rfb(upec177) 유전자 클러스터와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
추가의 특정 구체예에서, 하기 유전자 (또는 하기 유전자 중 하나와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 핵산) 중 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과를 포함하도록 (예를 들어, 숙주 세포 내로의 하나 이상의 벡터/플라스미드의 도입에 의해) 재조합으로 조작된 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다: rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2), rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), wekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10), 및/또는 wbbL (SEQ ID NO:11). 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소 (예를 들어, 이종성 올리고사카릴전달효소)를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, 하기 (i) dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제; (ii) dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제; (iii) 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소; (iv) dTDP -4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제; (v) O 항원 플립파제; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPPα-1,3-람노실전달효소; (vii) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-글루코실전달효소; (viii) O 항원 중합효소; (ix) O-아세틸 전달효소; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPPα-1,3-글루코실전달효소; 및/또는 (xi) dTDP-Rha:GlcNAc-UPPα-1,3-람노실전달효소 중 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과를 (예를 들어, 숙주 세포 내로의 하나 이상의 벡터/플라스미드의 도입에 의해) 포함하도록 재조합으로 조작된 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소 (예를 들어, 이종 올리고사카릴 전달효소)를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
특정 구쳬예에서, 본원에서 제공된 원핵 숙주 세포는 하나 이상의 유전자의 결실 또는 기능적 불활성화를 포함한다. 섹션 5.3.1 참조. 특정 구체예에서, waaL 유전자, gtrA 유전자, gtrB 유전자, gtrS 유전자 또는 rfb 유전자 클러스터 (또는 rfb 클러스터의 유전자 또는 유전자들) 중 하나 이상이 본원에 제공된 원핵 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다.
본원에 제공된 원핵 숙주 세포에 의해 발현된 담체 단백질은 당업자에게 공지된 임의의 담체 단백질 예를 들어, P. 애루기노사의 무독화된 외독소 A (EPA; 예를 들어, 문헌 [Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61] 참조), CRM197, 말토오스 결합 단백질 (MBP), 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스의 무독화된 용혈소, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜라이 FimH, E. 콜라이 FimHC, E. 콜라이 열 민감성 장독소, E. 콜라이 열 민감성 장독소의 무독화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜라이 Sat 단백질, E. 콜라이 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴몰리신 및 이의 무독화된 변이체, C. 제주니 AcrA 및 C. 제주니 천연 당단백질로부터 선택될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 원핵 숙주 세포에 의해 발현된 담체 단백질은 무독화된 슈도모나스 외독소 (EPA)이다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포의 담체 단백질은 숙주 세포의 주변세포질 공간내로 담체 단백질을 표적화시키기 위한 신호 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 신호 서열은 E. 콜라이 DsbA, E. 콜라이 외막 포린 A (OmpA), E. 콜라이 말토스 결합 단백질 (MalE), 에르위니아 카로토보란스 (Erwinia carotovorans) 펙테이트 리아제 (PelB), FlgI, NikA, 또는 바실러스 sp. 엔독실라나제 (XynA), 열 민감성 E. 콜라이 장독소 LTIIb, 바실러스 엔독실라나제 XynA, 또는 E. 콜라이 플라겔린 (FlgI)으로부터 비롯된다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포에 의해 발현된 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열은 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14); 및/또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15) 중 하나 이상을 엔코딩하도록 (예를 들어, 재조합 기법을 통해) 조작되었다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포에 의해 발현된 담체 단백질은 상기 컨센서스 서열 중 2, 3, 4, 5개 또는 그 초과를 포함한다. 섹션 5.3.2 참조.
또 다른 양태에서, E. 콜라이 O 항원 (예를 들어 , E. 콜라이 O25B)에 N-연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 N-당화된 담체 단백질 (또한 바이오컨주게이트로 본원에서 지칭됨)을 생성하는 방법으로서, 단백질의 생성에 적합한 조건하에 본원에 기술된 숙주 세포를 배양하고, N-당화된 담체 단백질을 정제하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 숙주 세포 예를 들어, E. 콜라이를 사용하여 단백질을 생성하고 숙주 세포에 의해 생성된 단백질을 분리하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 섹션 5.3 참조.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 숙주 세포에 의해 생성된 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B에 N-연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)를 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다. 섹션 5.4 참조.
특정 구체예에서, 하기 제시된 화학식 O25B의 화합물에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00001
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 화학식 O25B의 O 항원에 N-연결된다.
또 다른 특정 구체예에서, 하기 제시된 화학식 O25B'의 화합물에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00002
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 화학식 O25B'의 O 항원에 N-연결된다.
또 다른 양태에서, ExPEC E. 콜라이 균주로부터 분리된 O 항원이 본원에 제공되며, 상기 균주는 O25B를 생성한다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 균주 upec138로부터 분리된 O 항원이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 균주 upec163으로부터 분리된 O 항원이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 균주 upec177로부터 분리된 O 항원이 본원에 제공된다. 섹션 5.2 참조.
또 다른 양태에서, 하기 제시된 화학식 O25B의 분리된 거대분자의 군집이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00003
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 군집 내의 거대분자의 적어도 80%의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20이다.
또 다른 양태에서, 하기 제시된 화학식 O25B'의 분리된 거대분자의 군집이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00004
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 군집 내의 거대분자의 적어도 80%의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20이다.
또 다른 양태에서, O25B 및/또는 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트를 사용하여 항-O25B 항체를 생성하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법에 따라 생성된 항체가 본원에 추가로 제공된다. 섹션 5.5 참조.
또 다른 양태에서, 본원에서 제공하는 바이오컨주게이트 및/또는 본원에서 제공된 거대분자 (또는 이의 군집)를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 섹션 5.6 참조.
특정 구체예에서, 화학식 O25B의 구조를 포함하는 거대분자를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00005
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다.
또 다른 특정 구체예에서, 화학식 O25B'의 구조를 포함하는 거대분자를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00006
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기술된 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물로서, 상기 바이오컨주게이트가 하기 제시된 화학식 O25B의 화합물에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00007
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 화학식 O25B'의 O 항원에 N-연결된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기술된 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물로서, 상기 바이오컨주게이트가 하기 제시된 화학식 O25B'의 화합물에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다 :
Figure 112016092556323-pct00008
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 화학식 O25B '의 O 항원에 N-연결된다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 약제 조성물은 하나 이상의 추가적인 E. 콜라이 O 항원 (여기에서, 상기 항원은 O25B (예를 들어, 화학식 O25B 또는 화학식 O25B')이 아님) 예를 들어, E. 콜라이 O25B 혈청형으로부터의 항원이 아닌 E. 콜라이 (예를 들어, ExPEC)로부터의 O 항원 및/또는 E. 콜라이 O 항원에 연결된 담체 단백질을 포함하는 하나 이상의 바이오컨주게이트 (여기에서, 상기 항원은 O25B (예를 들어, 화학식 O25B 또는 화학식 O25B')이 아님)를 포함한다. 이러한 조성물은 ExPEC O 항원을 포함하는 하나 이상의 추가적인 거대분자 및/또는 하나 이상의 추가적인 바이오컨주게이트, 예를 들어, O1A, O2 및/또는 O6 거대 분자 및/또는 O1A, O2 및/또는 O6 바이오컨주게이트를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, O25B 거대분자 (예를 들어, 화학식 O25B 또는 화학식 O25B'를 포함하는 거대분자) 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (예를 들어, 화학식 O25B 또는 화학식 O25B'에 연결된 담체 단백질을 포함하는 바이오컨주게이트)에 더하여 ExPEC O 항원을 포함하는 하나 이상의 추가적인 거대분자 및/또는 하나 이상의 추가적인 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물로서, 상기 추가적인 거대분자가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다:
a. 화학식 O25A
Figure 112016092556323-pct00009
b. 화학식 O1A
Figure 112016092556323-pct00010
c. 화학식 O1B
Figure 112016092556323-pct00011
d. 화학식 O1C
Figure 112016092556323-pct00012
e. 화학식 O6Glc
Figure 112016092556323-pct00013
f. 화학식 O6GlcNAc
Figure 112016092556323-pct00014
g. 화학식 O2
Figure 112016092556323-pct00015
특정 구체예에서, O25B 거대분자 (예를 들어, 화학식 O25B 또는 화학식 O25B'를 포함하는 거대분자) 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (예를 들어, 화학식 O25B 또는 화학식 O25B'에 연결된 담체 단백질을 포함하는 바이오컨주게이트)에 더하여, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 거대분자 또는 상기 거대분자를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물로서, 상기 추가적인 거대분자가 하기로 구성된 군으로부터 선택된 구조를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다:
a. 화학식 O25A'
Figure 112016092556323-pct00016
b. 화학식 O1A'
Figure 112016092556323-pct00017
c. 화학식 O1B'
Figure 112016092556323-pct00018
d. 화학식 O1C'
Figure 112016092556323-pct00019
e. 화학식 O6Glc'
Figure 112016092556323-pct00020
f. 화학식 O6GlcNAc'
Figure 112016092556323-pct00021
g. 화학식 O2'
Figure 112016092556323-pct00022
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트 및 (ii) O1 거대 분자 또는 O1을 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1B이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1C이다.
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트 및 (ii) O2 거대 분자 또는 O2를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다.
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트 및 (ii) O6 거대 분자 (예를 들어, 분지형 Glc 모노사카라이드 (O6Glc) 또는 분지형 GlcNAc 모노사카라이드 (O6GlcNAc)를 포함하는 O6 거대분자) 또는 O6를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대분자는 O25B 거대분자이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O6 거대분자는 분지형 Glc 모노사카라이드 (O6Glc)를 포함하는 O6 거대분자이다.
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트 및 (ii) O1 거대 분자 또는 O1을 포함하는 바이오컨주게이트; (iii) O2 또는 O2를 포함하는 바이오컨주게이트; 및/또는 (iv) O6 거대분자 (예를 들어, 분지형 Glc 모노사카라이드 또는 분지형 GlcNAc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자) 또는 O6를 포함하는 바이오컨주게이트 중 적어도 2개를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대분자는 O1B이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대분자는 O1C이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O6 거대분자는 분지형 Glc 모노사카라이드 (본원에서 또한 O6Glc로서 불림)를 포함하는 O6 거대분자이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 거대분자, O1A 거대분자, O2 거대분자, 및 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 거대분자는 담체 단백질에 컨주게이팅된다.
또 다른 양태에서, 약제학적 유효량의 본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 면역원성 조성물)을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, ExPEC에 의한 대상체 예를 들어, 인간 대상체의 감염을 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 섹션 5.7 참조.
또 다른 양태에서, 약제학적 유효량의 본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 면역원성 조성물)을 ExPEC로 감염된 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체 예를 들어, 인간 대상체의 감염을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 섹션 5.7 참조.
또 다른 양태에서, 약제학적 유효량의 본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 면역원성 조성물)을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체 예를 들어, 인간 대상체에서 ExPEC에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 섹션 5.7 참조.
또 다른 양태에서, 약제학적 유효량의 본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 면역원성 조성물)을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체 예를 들어, 인간 대상체에서 ExPEC에 대한 옵소닌식균작용성 항체 (opsonophagocytic antibody) 생성을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. 섹션 5.7 참조.
용어 및 약어:
OPS: O 폴리사카라이드; 그람-네거티브 박테리아의 O 항원. OPS는 또한 본원에서 O 항원으로서 지칭된다.
rfb 클러스터: O 항원 백본 구조를 합성할 수 있는 효소 시스템을 엔코딩하는 유전자 클러스터 (예를 들어, E. 콜라이 유전자 클러스터). 용어 rfb 클러스터는 대장균 속에 속하지 않는 박테리아로부터의 클러스터를 포함하는 임의의 O 항원 생합성 클러스터에 적용될 수 있다.
waaL: 주변세포질에 위치한 활성 부위를 갖는 막 결합된 효소를 엔코딩하는 O 항원 리가제 유전자. 엔코딩된 효소는 운데카프레닐포스페이트 (UPP)-결합된 O 항원을 지질 A 코어에 전달하여, 리포폴리사카라이드를 형성한다.
wecA: wec 클러스터에 엔코딩된 제 1 유전자. 엔코딩된 단백질은 UDP-GlcNAc로부터 UPP로의 GlcNAc-포스페이트의 전달을 촉매작용하여 UPP-결합된 GlcNAc를 형성한다.
ECA: 엔테로박테리아 공통 항원.
RU: 반복 단위. 본원에 사용된 바와 같이, RU는 생물학적 반복 단위 BRU와 동일하게 설정된다. BRU는 생체내에서 합성될 때 O 항원의 RU를 기술한다.
UPP: 운데카프레닐피로포스페이트.
LLO: 지질 연결된 올리고사카라이드.
2AB: 2 아미노 벤즈아미드.
MS: 질량 분광법.
O25B: 용어 O25B는 본원에서 확인된 E. 콜라이로부터의 O25B 항원을 지칭한다 (E. 콜라이 혈청형 O25의 하위혈청형). 본원에서 O25B에 대한 언급은 상기에서 둘 모두 확인된 화학식 O25B 및 화학식 O25B'를 포함한다.
O25A: 용어 O25A는 E. 콜라이의 O25A 항원을 지칭한다 (E. 콜라이 혈청형 O25의 혈청형). 본원에서 O25A에 대한 언급은 상기에서 둘 모두 확인된 화학식 O25A 및 화학식 O25A'를 포함한다.
O1A: 용어 O1A는 E. 콜라이의 O1A 항원을 지칭한다 (E. 콜라이 혈청형 O1의 하위혈청형). 본원에서 O1A에 대한 언급은 상기에서 둘 모두 확인된 화학식 O1A 및 화학식 O1A'를 포함한다.
O1B: 용어 O1B는 E. 콜라이의 O1B 항원을 지칭한다 (E. 콜라이 혈청형 O1의 하위혈청형). 본원에서 O1B에 대한 언급은 상기에서 둘 모두 확인된 화학식 O1B 및 화학식 O1B'를 포함한다.
O1C: 용어 O1C는 E. 콜라이의 O1C 항원을 지칭한다 (E. 콜라이 혈청형 O1의 하위혈청형). 본원에서 O1C에 대한 언급은 상기에서 둘 모두 확인된 화학식 O1C 및 화학식 O1C'를 포함한다.
O2: 용어 O2는 E. 콜라이의 O2 항원을 지칭한다 (E. 콜라이 혈청형 O2). 본원에서 O2에 대한 언급은 상기에서 둘 모두 확인된 화학식 O2 및 화학식 O2'를 포함한다.
O6: 용어 O6은 E. 콜라이의 O6 항원을 지칭한다 (E. 콜라이 혈청형 O6). 본원에서 O6에 대한 언급은 상기에서 둘 모두 확인된 화학식 O6 및 화학식 O6'를 포함한다.
바이오컨주게이트: 용어 바이오컨주게이트는 숙주 세포 배경에서 제조된 항원 예를 들어, O 항원 (예를 들어, O25B)와 단백질 (예를 들어, 담체 단백질) 간의 컨주게이트를 지칭하며, 여기에서 숙주 세포 시스템은 항원을 단백질에 연결시킨다 (예를 들어, N-링크). 글리코컨주게이트는 바이오컨주게이트는 물론, 다른 수단 예를 들어, 단백질과 당 항원의 화학적 결합에 의해 제조된 당 항원 (예를 들어, 올리고- 및 폴리사카라이드)-단백질 컨주게이트를 포함한다.
용어 "약"은 숫자와 함께 사용되는 경우, 언급된 수의 ±1, ±5 또는 ±10% 내의 임의의 수를 지칭한다.
본원에 사용된 경우, 대상체에 요법제 (예를 들어, 본원에 기술된 조성물)를 투여하는 맥락에서 용어 "유효량"은 예방 및/또는 치료 효과(들)를 갖는 요법제의 양을 지칭한다. 특정 구체예에서, "유효량"은 하기 효과 중 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 효과를 달성하기에 충분한 요법제의 양을 지칭한다: (i) ExPEC 감염의 중증도 또는 이와 관련된 증상을 감소시키거나 개선함; (ii) ExPEC 감염 또는 이와 관련된 증상의 기간을 감소시킴; (iii) ExPEC 감염 또는 이와 관련된 증상의 진행을 예방; (iv) ExPEC 감염 또는 이와 관련된 증상의 퇴행 초래; (v) ExPEC 감염 또는 이와 관련된 증상의 발달 또는 발병 예방; (vi) ExPEC 감염 또는 이와 관련된 증상의 재발 예방; (vii) ExPEC 감염과 관련된 장기 부전의 감소; (viii) ExPEC 감염에 걸린 대상체의 입원 감소; (ix) ExPEC 감염에 걸린 대상체의 입원 기간 감소; (x) ExPEC 감염에 걸린 대상체의 생존 증가; (xi) 대상체에서 ExPEC 감염 제거; (xii) 대상체에서 ExPEC 복제 억제 또는 감소; 및/또는 (xiii) 또 다른 요법제의 예방 또는 치료 효과(들)의 증강 또는 향상.
본원에 사용된 바와 같은, 대상체에 2개 또는 그 초과의 요법제의 투여 맥락에서 "~와 조합되어"는 하나 초과의 요법제의 사용을 지칭한다. 용어 "~와 조합되어"의 사용은 요법제가 대상체에 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 예를 들어, 제 1 요법제 (예를 들어, 본원에 기술된 조성물)는 대상체로의 제 2 요법제의 투여 전에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전에), 동시에, 또는 후에 (예를 들어, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 16시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "대상체"는 동물 (예를 들어, 조류, 파충류, 및 포유류)을 지칭한다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 비-영장류 (예를 들면, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 돼지, 말, 염소, 양, 고양이, 개, 쥐, 및 마우스) 및 영장류 (예를 들어, 원숭이, 침팬지, 및 인간)를 포함하는 포유동물이다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간 이외의 동물이다. 일부 구체예에서, 대상체는 가축 또는 애완 동물 (예컨대, 개, 고양이, 말, 염소, 양, 돼지, 당나귀 또는 닭)이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 유아이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 아동이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 성인이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 노인이다. 또 다른 구체예에서, 대상체는 미숙아이다. 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "미숙아"는 37주수 미만에서 태어난 유아를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "유아"는 신생아 내지 1세의 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "토들러"는 1세 내지 3세의 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "아동"은 1세 내지 18세의 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "성인"은 18세 이상의 인간을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "노인"은 65세 이상의 인간을 지칭한다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1: O25A 생합성 경로. 화살표는 각각의 효소 전환을 나타내며, 효소명을 표시하였다. 뉴클레오타이드 활성화된 당은 O 항원 클러스터에 제공된 효소에 의해 또는 그람-네거티브 숙주 세포의 하우스키핑 효소에 의해 세포질에서 제조된다. 글리코실포스페이트 전달효소 (WecA)는 D-GlcNAc 포스페이트를 운데카프레닐 포스페이트 (UP)에 첨가하여 GlcNAc-UPP를 형성시킨다. 이어서 특정 글리코실전달효소는 모노사카라이드를 첨가함으로써 추가로 UPP-GlcNAc 분자를 연장시켜 생물학적 반복 단위 (BRU) 올리고사카라이드 (WekABC WbuB)를 형성시킨다. 효소의 표시된 순서는 BRU 합성 동안의 사건 순서를 나타내지는 않는다 (<>에 의한 표시). 이어서, BRU는 Wzx에 의해 주변세포질 공간 내로 플립핑(flipping)된다. Wzy는 주변세포질 BRU를 선형 중합시켜 O 항원 폴리사카라이드를 형성한다. 폴리머 길이는 Wzz에 의해 조정된다. 많은 박테리아 올리고- 및 폴리사카라이드는 UPP 상에 조립되고, 이어서 다른 분자에 전달되며 즉, UPP는 박테리아에서 올리고- 및 폴리사카라이드에 대한 일반적인 빌딩 플랫폼이다. E. 콜라이 및 대부분의 기타 그람 네거티브 박테리아에서, O 항원은 E. 콜라이 효소 WaaL에 의해 UPP로부터 지질 A 코어에 전달되어 리포폴리사카라이드 (LPS)를 형성한다.
도 2: E. 콜라이 O25A rfb 클러스터 및 O 항원에 의해 예시된, wzx/wzy-의존적 O-항원 합성을 위한 rfb 클러스터, 구조 및 경로. A. galF 및 gnd 유전자 사이에 위치한 E. 콜라이 균주 E47a의 rfb 클러스터 구조가 도시된다. 유전자는 화살표로 도시되었으며, 화살표 색상은 유전자 생성물의 기능에 따라 표시된다: 검정색은 E. 콜라이의 하우스키핑 레퍼토리의 일부가 아닌 뉴클레오타이드-활성화된 모노사카라이드 생합성을 위한 유전자이며 (이들은 게놈의 다른 곳에서 엔코딩됨), 검정/흰색 사선은 단일 모노사카라이드 단위체의 BRU로의 첨가를 담당하는 글리코실전달효소이며, 플립파제 wzx 및 중합효소 wzy이다. B. 제시된 바와 같은 O25A O 항원의 BRU의 화학 구조 (문헌 [Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4] 참조).
도 3. A. O25A, O25B, 및 O16 BRU 구조. B. O25A, O25B, 및 O16 사이의 O 항원 생합성 클러스터 (rfb 클러스터) 비교. 검정색 유전자는 뉴클레오타이드 활성화된 모노사카라이드 생합성에 관련된 유전자이며, 사선은 글리코실전달효소 유전자로 예측되며, 회색은 BRU 프로세싱 또는 수송 유전자를 나타내며, 수직선은 O-아세틸전달효소 상동체를 보여준다. 회색 박스는 유전자 간 25% 초과의 상동성 스코어를 나타낸다; 상세한 값이 표시된다. 얇은 검정 및 회색 화살표는 wzy (O25A 및 O25B 특이적) 및 O25B 3' 영역 (O25B 특이적)에 대한 유형별 PCR 올리고뉴클레오타이드의 어닐링 위치를 보여준다.
도 4. 역학 연구로부터의 혈청형 분포. 지역사회획득 UTI 종의 샘플에서 확인된 E. 콜라이 O 항원 혈청형은 발생에 따라 그룹화하였다.
도 5. O25 파지티브 응집 표현형을 갖는 임상 분리물로부터 LPS의 실버 및 웨스턴 염색 분석. 균주 수는 겔 레인 위에 나타냈다. 개별 클론을 성장시키고, OD 정규화된 바이오매스는 원심분리에 의해 수확하였다. 펠렛을 SDS PAGE 람리 완충제(Laemmli buffer)에 용해시키고 프로테이나제 K로 처리하여 샘플 중의 모든 단백질을 가수분해하였다. 표준 실버 염색을 A로 나타낸 PAGE 겔에 가하고, 식별적으로 진행시킨 겔로부터의 전기전달된 물질을 함유하는 니트로셀룰로스 막의 시중의 O25 응집 항혈청으로의 프로빙은 B에 도시되어 있다.
도 6. O25A 및 O25B 샘플의 2AB HPLC 미량. 균주 upec138 (점선) 및 upec436 (실선)으로부터의 2AB 라벨링된 LLO 샘플을 제조하였다. 피크를 수집하고, 도 7에 상세하게 도시된 MS/MS 단편화 패턴으로부터 추론된 상응하는 BRU 구조는 화살표로 나타내었다.
도 7. 어미 이온 m/z=1022 (A; 균주 upec138로부터) 또는 m/z=1021 (B; upec_436로부터)의 50' 및 62' 용리 시간에서 도 6에 나타낸 피크로부터 수득된 MS/MS 단편화 이온 시리즈. 이온 시리즈는 추정 BRU의 카툰과 관련하여 도시된다.
도 8. O25B 양성 임상 분리물로부터 유래된 2AB 라벨링된 LLO 샘플의 탈아세틸화. O25B 유전형을 갖는 임상 분리물의 2AB 라벨링된 LLO로부터 수득된 50' 용리 시간에서 O25B 특이적 피크를 수집하고, ND Cal의 특정 특허 프로그램 (ND Cal's Special Patent Program) O-아세틸 기의 가수분해를 위한 NaOH의 존재 (실선) 또는 부재 (점선) 하의 처리 후 정상 HPLC에 의해 분석하였다.
도 9. O25A 및 O25B 바이오컨주게이트의 모노사카라이드 조성물 분석. O25 바이오컨주게이트를 생성하고 정제하고 모노사카라이드 조성 분석을 위해 프로세싱하였다. 샘플의 C18 HPLC 흔적이 도시된다. O25A (실선) 및 O25B (점섬) 유래된 샘플을 시중의 공급원 (Glc, GlcNAc, Rha, FucNAc)으로부터의 모노사카라이드의 믹스와 비교하였다. 모노사카라이드의 용리 시간은 화살표로 나타냈다.
도 10. O25A 바이오컨주게이트의 특성 규명. 정제된 최종 대용량의 4S-EPA-O25A 바이오컨주게이트를 SDS PAGE에 의해 분석하고 항-EPA 항혈청 또는 항-O25A 항혈청을 사용하여 직접 코마시에 염색 (C) 및 웨스턴 블롯에 의해 시각화시켰다.
도 11. O25B 바이오컨주게이트의 특성 규명. 정제된 최종 대용량의 4S-EPA-O25B 바이오컨주게이트를 SDS PAGE에 의해 분석하고 항-EPA 항혈청 또는 항-O25B 항혈청을 사용하여 직접 코마시에 염색 (C) 및 웨스턴 블롯에 의해 시각화시켰다.
도 12. O1 O 항원 유전자 생합성 및 화학 구조. A. O1A 균주 E. 콜라이 G1632 (수탁 번호. GU299791)의 rfb 클러스터 및 측면 유전자가 도시된다. 검정, 회색 및 실선 코드는 상기 기술된 도 2에 대한 것과 동일하다. B. O1 하위혈청형의 BRU 화학 구조가 도시된다.
도 13. O1 파지티브 응집 표현형을 갖는 임상 분리물로부터의 LPS 분석. 항-O1 항혈청을 사용한 A. 실버 염색 및 B. 웨스턴 블롯.
도 14. O1 임상 분리물에서 O1A의 확인. O1 임상 분리물로부터의 2AB 라벨링된 LLO 샘플을 LLO 핑거프린팅에 의해 분석하였다. A. 60' 전진으로부터의 정상 HPLC 흔적이 도시된다. 모든 샘플에 있어서의 기준선을 이동시켜 공동-이동 (co-migrating) 피크를 가시화시켰다. upec 수는 임상 균주를 나타낸다. B. m/z=1849.6의 MS/MS 단편화 이온 시리즈 (Na+ 부가물). 카툰은 O1A의 2 BRU의 올리고사카라이드에 단편화 이온 패턴 및 예상되는 글리코시드 결합 파괴를 할당한다.
도 15. O1 바이오컨주게이트. EPA 발현 플라스미드 (pGVXN659) 및 5개의 상이한 pglB 발현 플라스미드로 형질전환된 E. 콜라이 세포 (W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL)에 의한 EPA-O1 당단백질의 소규모 발현 평가: A, p114: 비-코돈 최적화된 HA 태그 함유 pglB의 발현; B, p939: 코돈 최적화된 HA tag 함유 pglB; C, p970: 코돈 최적화된 HA 태그 제거된 pglB; D, 코돈 최적화된 HA 태그 함유 천연 당화 부위 N534Q 제거된 pglB; 및 E, 코돈 최적화된 HA 태그 제거된 천연 당화 부위 N534Q 제거된 pglB. 세포를 성장시키고, 아라비노스 및 IPTG로 유도하고, 37℃에서 하룻밤 배양 후, 세포를 수확하고, 주변세포질 단백질 추출물을 제조하였다. 그 후, 추출물을 SDS PAGE에 의해 분리하고, 일렉트로블로팅에 의해 니트로셀룰로스 막으로 전달하고 항-EPA 혈청을 사용하여 면역검출하였다.
도 16. 항-O1 혈청으로 검출된 도 15에 기술된 바이오컨주게이트.
도 17. O6 유전자 및 화학 구조. A. E. 콜라이 CFT073 (Genbank AE014075.1)의 O 항원 생합성 클러스터 (rfb 클러스터) 및 측면 유전자. BLAST에 따른 추정된 유전자 기능을 나타내고, O6 O 항원 생합성에 특이적인 유전자를 나타내었다. B. 보고된 O6 BRU 구조의 화학 구조 (Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225).
도 18. 분지형 Glc를 갖는 O6의 확인. O6 임상 분리물로부터의 2AB 라벨링된 LLO 샘플을 LLO 핑거프린팅에 의해 분석하였다. A. 60' 전진으로부터의 정상 HPLC 흔적이 도시된다. 추출물은 Glc 및 GlcNAC 분지 기준 균주를 함유하는 CCUG 11309 (얇은 실선)과 11311 (점선)으로부터 제조하였다. 오버레이는 나타낸 BRU의 용리 시간의 분명한 차이를 보여준다. B. upec 수에 의해 나타낸 바와 같은 임상 분리물로부터의 추출물을 A로부터의 기준 균주와 비교하였다.
도 19. O2 O 항원 유전자 생합성 및 화학 구조. A. E. 콜라이 G1674 (수탁 번호 GU299792)의 O 항원 생합성 클러스터 (rfb 클러스터) 및 측면 유전자. 검정, 회색, 및 실선 색상 코드는 이전 도면에서 설명된 바와 같다 (예를 들어, 도 2). B. O2 항원의 화학 BRU 구조.
도 20. O2 파지티브 응집 표현형을 갖는 임상 분리물로부터의 LPS 분석. 항-O2 항혈청을 사용한 A. 실버 염색. B. 웨스턴 블롯.
도 21. 균주 W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS로부터의 OPS 분석. 정상 HPLC에 의한 2AB 라벨링된 LLO 분석의 크로마토그램이 도시된다.
도 22. 웨스턴 블롯 분석에서 항-O25A 및 항-O25B MBP 항혈청에 의한 O25A 및 O25B의 인식. upec436 (O25A) 및 upec138 (O25B)로부터 제조되고 SDS-PAGE에 의해 분리된 LPS 샘플의 전기이동 후 수득된 2개의 니트로셀룰로스 막. 로딩 패턴을 두 막 모두에 대해 확인하였다; 왼쪽 레인: upec438로부터의 O25A LPS, 중간 레인: upec 138로부터의 O25B LPS. MBP 바이오컨주게이트를 래빗의 면역화를 위해 사용하였다. 왼쪽 패널: 항 O25B-MBP 항혈청; 오른쪽 패널: 항 O25A-MBP 항혈청.
도 23. O2 OPS BRU의 MS/MS 스펙트럼. 균주 CCUG25로부터의 2AB 라벨링된 LLO 추출물로부터의 43.5 min에서 용리 피크로부터 m/z=989.4를 갖는 Na+ 부가물의 MS/MS 스펙트럼. O2 BRU 카툰 및 관련된 Y 이온 시리즈를 나타내며 예측된 모노사카라이드 서열을 확인시켜 준다.
도 24. 전임상 연구에 사용된 O1A, O2, 및 O6 항원을 함유하는 EPA 바이오컨주게이트. OPS 글리칸을 생성시키고 정제하고, SDS PAGE에 의해 분석하고 코사미에 염색에 의해 가시화시켰다.
도 25는 O1A-EPA (G1), 담체 단백질 단독 (G10), TBS (G11), 또는 EPA-O1A, O2, O6Glc, 및 O25B (G12)로 구성된 4가 조성물로 면역화되고, 균주 upec032로부터 정제된 O1A-LPS로 코팅된 ELISA 플레이트에 대해 프로빙한, 래트로부터의 혈청으로 수득된 평균 ELISA 역가를 보여준다.
도 26은 O2-EPA (G4), 담체 단백질 단독 (G10), TBS (G11), 또는 EPA-O1A, O2, O6Glc, 및 O25B (G12)로 구성된 4가 조성물로 면역화되고, 균주 CCUG25로부터 정제된 O2 LPS로 코팅된 ELISA 플레이트에 대해 프로빙한, 래트로부터의 혈청으로 수득된 평균 ELISA 역가를 보여준다.
도 27은 O6Glc-EPA (G7), 담체 단백질 단독 (G10), TBS (G11), 또는 EPA-O1A, O2, O6Glc, 및 O25B (G12)로 구성된 4가 조성물로 면역화되고, 균주 CCUG11309로부터 정제된 O6Glc-LPS로 코팅된 ELISA 플레이트에 대해 프로빙한, 래트로부터의 혈청으로 수득된 평균 ELISA 역가를 보여준다.
도 28은 O25B-EPA (G9), 담체 단백질 단독 (G10), TBS (G11), 또는 O1A, O2, O6Glc, 및 O25B (G12)로 구성된 4가 조성물로 면역화되고, 균주 upec177로부터 정제된 O25B-LPS로 코팅된 ELISA 플레이트에 대해 프로빙한, 래트로부터의 혈청으로 수득된 평균 ELISA 역가를 보여준다.
도 29: 1가 백신의 지시된 용량의 1회 프라이밍 용량 및 2회 부스터 용량으로의 42일 후-면역화 (검정 사각형)와 비교하여 사전-면역화 (빈 원) 래트로부터 유래된 혈청의 옵소닌화 지수. (A) O2-EPA 면역화; (B) O6-EPA 면역화; (C) O25B-EPA 면역화.
도 30: E. 콜라이 항원 O1A, O2, O6Glc 및 O25B를 포함하는 4가 백신으로 접종한 인간 대상체로부터의 혈청으로 수득된 ELISA 역가. 주입 후 (주입 후 30일) 및 주입 전 (1일) 간의 ELISA 역가의 유의한 증가는 단지 접종된 군에서만 관찰되었다 (*, 통계학적 유의성을 나타냄).
도 31: E. 콜라이 항원 O1A, O2, O6Glc 및 O25B을 포함하는 4가 백신으로 접종한 인간 대상체로부터의 혈청으로 수득된 옵소닌 지수 (OI). 주입 전 및 후의 4가 백신의 성분 (O1A-EPA (31A), O2-EPA (31B), O6Glc-EPA (31C), 및 O25B-EPA (31D)) 및 플라세보에 대한 OI로 나타낸 면역 반응이 묘사된다. 1일로서 규정된 사전-주입은 V2 (방문 2)로 나타내고, 30일로서 규정된 주입-후는 V4 (방문 4)로 나타낸다. 주입 후 및 주입 전 사이의 OI의 유의한 증가 (*로 나타내며, 다중 *는 유의성의 증가된 정도는 나타냄)가 단지 접종 군에서만 관찰되었다. NS, 유의한 차이가 없음.
도 32: 1일 (접종 전) 및 30일 후 (접종 후) O25A LPS (검정 막대) 및 O25B LPS (회색 막대)에 대한 접종된 대상체로부터의 혈청의 ELISA 역가 (EC50 값으로 표현함). 주입 후 (주입 후 30일) 및 주입 전 (1일) 간의 ELISA 역가의 통계학적으로 유의한 증가가 두 혈청형 모두에 대해 관찰되었다: O25A LPS (검정 막대) 및 O25B LPS (회색 막대).
도 33 : O25A (검정 선) 및 O25B (회색 선)를 발현하는 E. 콜라이 균주에 대한 접종된 대상체로부터의 혈청의 반응성. 회색 점선: 혈청형 O75 균주, 음성 대조군. 도 33은 접종된 대상체로부터의 백신-유도 혈청 IgG 항체가 O25A 및 O25B 균주에 대해 강하게 반응함을 입증한다.
5. 상세한 설명
E. 콜라이 항원 O25B의 구조물, 뿐만 아니라 O25B의 용도, O25B의 제조 방법, 및 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 기재된다. 출원인은 O25B의 생성을 담당하는 E. 콜라이 유전자 클러스터를 확인하였으며, O25B 항원의 구조를 완전히 특성 규명하였다. 따라서, 숙주 세포에서 O25B를 생성할 수 있는 핵산이 본원에 제공된다. 또한, O25B를 생산할 수 있는 핵산을 포함하는, 숙주 세포 예를 들어, 재조합에 의해 조작된 숙주 세포가 본원에 제공된다. 이러한 숙주 세포는 담체 단백질에 연결된 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트를 생성하는데 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 치료제 (예를 들어, 백신)의 제형화에 사용될 수 있다. 본원에 기술된 O25B 항원은 또한, 항체 생성에 유용하며, 이는 예를 들어, 대상체의 수동 면역과 같은 치료학적 방법에 사용될 수 있다. E. 콜라이 (예를 들어, 요로병원성 E. 콜라이)로의 감염에 대한 치료학적 방법 예를 들어, 숙주의 백신화에 사용하기 위한, O25B를 단독으로 또는 기타 E. 콜라이 항원 (예를 들어, O1, O2 및 O6 및 이들의 하위혈청형)과 조합되어 포함하는 조성물이 본원에 추가로 제공된다.
5.1 핵산 및 단백질
일 양태에서, O25B 생성과 관련된 분리된 핵산 예를 들어, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 하나 이상의 단백질을 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 당업자는 유전자 코드의 축중으로 인해, 특정 아미노산 서열을 갖는 단백질이 다수의 상이한 핵산에 의해 엔코딩될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 당업자는 본원에 제공된 핵산이, 핵산에 의해 엔코딩된 단백질의 아미노산 서열에 영향을 끼치지 않으면서 이의 서열이 본원에 제공된 서열과 상이한 방식으로 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb (upec138) 유전자 클러스터를 엔코딩하는 핵산 (SEQ ID NO : 12)이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:12와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. Upec 138은 O25B 혈청형의 E. 콜라이 균주의 예이다. 당업자는 이러한 혈청형으로부터의 다른 균주가 본원에 기술된 방법에 따라 임상 분리물로부터 현재 용이하게 수득될 수 있으며, 이러한 기타 균주의 예는 upec177 및 upec163임이 이해될 것이다. 따라서, 이러한 O25B 균주의 이러한 클러스터로부터의 rfb 유전자 클러스터 또는 개별 유전자가 본원에 언급된 모든 경우에, 이는 기타 O25B 균주로부터의 상응하는 유전자 클러스터 또는 유전자를 포함함을 의미한다. 또한, 제공된 서열은 rfb 유전자 클러스터 또는 요망되는 경우, 이러한 기타 분리물로부터의 개별 유전자의 시퀀싱에 의해 밝혀질 수 있으며, 유전자 클러스터 또는 유전자와 상동인 단백질을 엔코딩하는 상동 서열을 제공할 것이다. 상동 유전자 클러스터 또는 유전자가 유전자 클러스터 또는 유전자와 관련하여 특정 백분율로서 언급되는 임의의 구체예에서, 이러한 상동 서열은 바람직하게는 기준 균주 또는 서열로부터의 것과 동일한 기능을 갖는 단백질(들)을 엔코딩한다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb (upec163) 유전자 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec163) 유전자 클러스터와 약 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb (upec177) 유전자 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec177) 유전자 클러스터와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다.
또 다른 구체예에서, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산이 본원에 제공된다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:1, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 rmlB 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:1과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:2, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 rmlD 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:2와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:3, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 rmlA 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:3과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:4, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 rmlC 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:4와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:5, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 wzx 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:5와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:6, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 wekA 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:6과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:7, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 wekB 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:7과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:8, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 wzy 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:8과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:9, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 wbbJ 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:9와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:10, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 wbbK 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:10과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:11, E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 wbbL 유전자를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 E. 콜라이 O25B rfb 클러스터의 단백질을 엔코딩하는 핵산은 SEQ ID NO:11과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다.
또 다른 양태에서, 본원에 제공된 핵산에 의해 엔코딩된 단백질이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, SEQ ID NO:1에 의해 엔코딩된 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:2에 의해 엔코딩된 dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:3에 의해 엔코딩된 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:4에 의해 엔코딩된 dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:5에 의해 엔코딩된 O 항원 플립파제가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:6에 의해 엔코딩된 dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:7에 의해 엔코딩된 UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-글루코실전달효소가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:8에 의해 엔코딩된 O 항원 중합효소가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:9에 의해 엔코딩된 O-아세틸 전달효소가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:10에 의해 엔코딩된 UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-글루코실전달효소가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, SEQ ID NO:11에 의해 엔코딩된 dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소가 본원에 제공된다.
5.2 E. 콜라이 O 항원
한 양태에서, O25, O1, O2, 및 O6 혈청형의 분리된 E. 콜라이 항원이 본원에 제공된다.
특정 구체예에서, E. 콜라이 균주 upec138로부터 분리된 O 항원이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 균주 upec163으로부터 분리된 O 항원이 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 균주 upec177로부터 분리된 O 항원이 본원에 제공된다.
또 다른 특정 구체예에서, 분리된 화학식 O25B의 E. 콜라이 O25B 항원이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00023
.
또 다른 특정 구체예에서, 분리된 화학식 O25B'의 E. 콜라이 O25B 항원이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00024
.
또 다른 양태에서, 하기 제시된 화학식 O25B의 분리된 거대분자의 군집이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00025
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 군집 내의 거대분자의 적어도 80%의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20이다.
또 다른 양태에서, 하기 제시된 화학식 O25B'의 분리된 거대분자의 군집이 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00026
,
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 군집 내의 거대분자의 적어도 80%의 n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20이다.
본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 치료학적 조성물 예를 들어, 백신; 섹션 5.6 참조)에 유용한 기타 E. 콜라이 항원은 O25A는 물론 O1, O2, 및 O6 항원 및 이의 하위혈청형을 포함한다.
한 구체예에서, O25A 항원 (예컨대, 분리된 형태 또는 바이오컨주게이트의 일부로서)은 (예를 들어, O25B 항원 (또는 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트)과 함께) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O25A 항원은 하기 화학식 O25A이다:
Figure 112016092556323-pct00027
.
또 다른 특정 구체예에서, O25A 항원은 화학식 O25A'이다:
Figure 112016092556323-pct00028
.
한 구체예에서, O1A 항원 (예컨대, 분리된 형태 또는 바이오컨주게이트의 일부로서)은 (예를 들어, O25B 항원 (또는 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트)과 함께) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O1A 항원은 하기 화학식 O1A이다:
Figure 112016092556323-pct00029
.
또 다른 특정 구체예에서, O1A 항원은 하기 화학식 O1A'이다:
Figure 112016092556323-pct00030
.
한 구체예에서, O1B 항원 (예컨대, 분리된 형태 또는 바이오컨주게이트의 일부로서)은 (예를 들어, O25B 항원 (또는 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트)과 함께) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O1B 항원은 하기 화학식 O1B이다:
Figure 112016092556323-pct00031
.
또 다른 특정 구체예에서, O1B 항원은 하기 화학식 O1B'이다:
Figure 112016092556323-pct00032
.
한 구체예에서, O1C 항원 (예컨대, 분리된 형태 또는 바이오컨주게이트의 일부로서)은 (예를 들어, O25B 항원 (또는 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트)과 함께) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O1C 항원은 하기 화학식 O1C이다:
Figure 112016092556323-pct00033
.
또 다른 특정 구체예에서, O1C 항원은 하기 화학식 O1C'이다:
Figure 112016092556323-pct00034
.
한 구체예에서, O2 항원 (예컨대, 분리된 형태 또는 바이오컨주게이트의 일부로서)은 (예를 들어, O25B 항원 (또는 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트)과 함께) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O2 항원은 하기 화학식 O2이다:
Figure 112016092556323-pct00035
.
또 다른 특정 구체예에서, O2 항원은 하기 화학식 O2'이다:
Figure 112016092556323-pct00036
.
한 구체예에서, O6 항원 (예컨대, 분리된 형태 또는 바이오컨주게이트의 일부로서)은 (예를 들어, O25B 항원 (또는 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트)과 함께) 본원에 제공된 조성물에 사용된다. 특정 구체예에서, O6 항원은 하기 화학식 O6K2 (본원에서 또한, O6Glc로 지칭됨)이다:
Figure 112016092556323-pct00037
.
또 다른 특정 구체예에서, O6 항원은 하기 화학식 O6K2' (본원에서 또한, O6Glc'로 지칭됨)이다:
Figure 112016092556323-pct00038
.
또 다른 특정 구체예에서, O6 항원은 하기 화학식 O6K54 (본원에서 또한, O6GlcNAc로 지칭됨)이다:
Figure 112016092556323-pct00039
.
또 다른 특정 구체예에서, O6 항원은 하기 화학식 O6K54' (본원에서 또한, O6GlcNAc'로 지칭됨)이다:
Figure 112016092556323-pct00040
.
5.3 숙주 세포
E. 콜라이 O 항원 및 이러한 E. 콜라이 O 항원을 포함하는 바이오컨주게이트를 생성할 수 있는 숙주 세포 예를 들어, 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 (예를 들어, 자연적으로 또는 유전자 조작을 통해) 본원에 기술된 하나 이상의 핵산을 포함한다. 섹션 5.1 참조. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 본원에 기술된 하나 이상의 E. 콜라이 O 항원을 생성하고/거나 본원에 기술된 하나 이상의 E. 콜라이 O 항원을 포함하는 바이오컨주게이트를 생성한다. 섹션 5.2 참조.
한 양태에서, 본원에 기재된 신규한 폴리사카라이드 즉, E. 콜라이 O25B를 생성할 수 있는 효소 (예를 들어, 글리코실전달효소)를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또한, 기타 E. 콜라이 항원, 예를 들어, O25A, O1, O2, 및 O6, 및 이의 하위혈청형을 생성할 수 있는 효소 (예를 들어, 글리코실전달효소)를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다 (섹션 5.2 참조). 본원에 제공된 숙주 세포는 관심 있는 O 항원을 생성할 수 있는 핵산을 자연적으로 발현할 수 있거나, 숙주 세포는 이러한 핵산을 발현하도록 만들어질 수 있으며 즉, 특정 구체예에서, 상기 핵산은 숙주 세포에 이종성이며 당업계에 공지된 유전자 접근법을 이용하여 숙주 세포 내로 도입된다. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 단백질의 N-당화에 활성인 추가적인 효소를 엔코딩하는 핵산을 포함하며 예를 들어, 본원에 제공된 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 또는 기타 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 섹션 5.3.3 참조. 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 담체 단백질 예를 들어, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드가 부착되어 바이오컨주게이트를 형성할 수 있는 단백질을 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 담체 단백질의 설명에 있어서 섹션 5.3.2 및 바이오컨주게이트의 설명에 있어서 섹션 5.4 참조. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
Upec138은 O25B 혈청형에 속하는 것으로 본원에서 확인되는 E. 콜라이 균주이며, 균주 (및 일반적으로 O25B 혈청형의 균주)의 rfb 유전자 클러스터는 신규한 E. 콜라이 폴리사카라이드 O25B를 생성하는 유전자를 포함하는 것으로서 제일 먼저 본원에서 확인되었다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec138) 유전자 클러스터 (SEQ ID NO:12), 또는 SEQ ID NO:12와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb (upec138) 유전자 클러스터 (SEQ ID NO: 12)가 유전자 조작에 의해 숙주 세포로 도입된다 (예를 들어, 유전자 클러스터는 플라스미드 또는 플라스미드들에서 발현되거나 숙주 세포 게놈으로 통합된다 (예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/068737 참조)). 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 또 다른 특정 구체예에서, rfb 클러스터의 유전자의 전부 또는 일부는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 올리고사카릴 전달효소는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 담체 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
Upec163은 O25B 혈청형에 속하는 것으로 본원에서 확인된 E. 콜라이 균주이며, 균주 (및 일반적으로 O25B 혈청형의 균주)의 rfb 유전자 클러스터는 신규한 E. 콜라이 폴리사카라이드 O25B를 생성하는 유전자를 포함하는 것으로서 제일 먼저 본원에서 확인되었다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec163) 유전자 클러스터, 또는 E. 콜라이 rfb(upec163) 유전자 클러스터와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb (upec163) 유전자 클러스터가 유전자 조작에 의해 숙주 세포로 도입된다 (예를 들어, 유전자 클러스터는 플라스미드 또는 플라스미드들에서 발현되거나 숙주 세포 게놈으로 통합된다 (예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/068737 참조)). 또 다른 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 또 다른 특정 구체예에서, rfb 클러스터의 유전자의 전부 또는 일부는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 올리고사카릴 전달효소는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 담체 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
Upec177은 O25B 혈청형에 속하는 것으로 본원에서 확인되는 E. 콜라이 균주이며, 균주 (및 일반적으로 O25B 혈청형의 균주)의 rfb 유전자 클러스터는 신규한 E. 콜라이 폴리사카라이드 O25B를 생성하는 유전자를 포함하는 것으로서 제일 먼저 본원에서 확인되었다. 또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb(upec177) 유전자 클러스터, 또는 E. 콜라이 rfb(upec177) 유전자 클러스터와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 rfb (upec177) 유전자 클러스터는 유전자 조작에 의해 숙주 세포로 도입된다 (예를 들어, 유전자 클러스터는 플라스미드 또는 플라스미드들에서 발현되거나 숙주 세포 게놈으로 통합된다 (예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/068737 참조)). 또 다른 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 또 다른 특정 구체예에서, rfb 클러스터의 유전자의 전부 또는 일부는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 올리고사카릴 전달효소는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 담체 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B를 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 rmlB , rmlD , rmlA , rmlC, wzx , WEKA , wekB , wzy , wbbJ , wbbK 및/또는 wbbL를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 이러한 숙주 세포는 rmlB , rmlD , rmlA , rmlC , wzx , wekA , wekB, wzy , wbbJ , wbbK, 및/또는 wbbL 유전자를 포함하는 하나 이상의 플라스미드를 포함하도록 재조합 접근법을 이용하여 조작될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 하나 이상의 플라스미드는 숙주 세포 게놈에 통합된다. 특정 구체예에서, 상기 rmlB는 SEQ ID NO:1을 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:1과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 rmlD는 SEQ ID NO:2를 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:2와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 rmlA는 SEQ ID NO:3을 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:3과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 rmlC는 SEQ ID NO:4를 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:4와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 wzx는 SEQ ID NO:5를 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:5와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 wekA는 SEQ ID NO:6을 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:6과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 wekB는 SEQ ID NO:7을 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:7과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 wzy는 SEQ ID NO:8을 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:8과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 wbbJ는 SEQ ID NO:9를 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:9와 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 wbbK는 SEQ ID NO:10을 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:10과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 특정 구체예에서, 상기 wbbL은 SEQ ID NO:11을 포함하거나 이로 구성되거나, SEQ ID NO:11과 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일하거나 상동이다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 유전자 rmlB , rmlD , rmlA , rmlC , wzx , WEKA , wekB , wzy , wbbJ , wbbK 및 wbbL의 일부 또는 모두는 숙주 세포에 이종이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 올리고사카릴 전달효소는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 담체 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
추가의 특정 구체예에서, O25B를 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 하기 유전자 (또는 하기 유전자 중 하나와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%와 동일하거나 상동인 핵산, 및 바람직하게는, 동일한 기능을 갖는 엔코딩 단백질) 중 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과 예를 들어, 전부를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다: rmlB (SEQ ID NO:1), rmlD (SEQ ID NO:2), rmlA (SEQ ID NO:3), rmlC (SEQ ID NO:4), wzx (SEQ ID NO:5), wekA (SEQ ID NO:6), wekB (SEQ ID NO:7), wzy (SEQ ID NO:8), wbbJ (SEQ ID NO:9), wbbK (SEQ ID NO:10), 및/또는 wbbL (SEQ ID NO:11). 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 rmlB의 핵산 서열 (SEQ ID NO:1)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제 예를 들어, rmlB에 의해 엔코딩된 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:1와 약 또는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 rmlD의 핵산 서열 (SEQ ID NO:2)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제 예를 들어, rmlD에 의해 엔코딩된 dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포가 SEQ ID NO:2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 rmlA의 핵산 서열 (SEQ ID NO:3)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소 예를 들어, rmlA에 의해 엔코딩된 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
[ 00139] 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 rmlC의 핵산 서열 (SEQ ID NO:4)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제 예를 들어, rmlC에 의해 엔코딩된 dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 wzx의 핵산 서열 (SEQ ID NO:5)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 O 항원 플립파제 예를 들어, wzx에 의해 엔코딩된 O 항원 플립파제를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:5와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 wekA의 핵산 서열 (SEQ ID NO:6)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 람노실전달효소 예를 들어, wekA에 의해 엔코딩된 dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:6과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 wekB의 핵산 서열 (SEQ ID NO:7)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 wekB 글루코실전달효소 예를 들어, wekB에 의해 엔코딩된 UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-글루코실전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:7과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 wzy의 핵산 서열 (SEQ ID NO:8)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 O 항원 중합효소 예를 들어, wzy에 의해 엔코딩된 O 항원 중합효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:8과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 wbbj의 핵산 서열 (SEQ ID NO:9)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 O-아세틸 전달효소 예를 들어, wbbJ에 의해 엔코딩된 O-아세틸 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:9와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 wbbK의 핵산 서열 (SEQ ID NO:10)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 글루코실전달효소 예를 들어, wbbk에 의해 엔코딩된 UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-글루코실전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:10과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 wbbL의 핵산 서열 (SEQ ID NO:11)을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 람노실전달효소 예를 들어, wbbL에 의해 엔코딩된 dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 자연적으로 포함하거나 이를 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포로서, 상기 숙주 세포는 SEQ ID NO:11과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 핵산을 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B 바이오컨주게이트 (즉, E. 콜라이 O25B 항원에 연결된 담체 단백질)를 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포는 하기 중 적어도 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과 예를 들어, 모두를 자연적으로 포함하거나 포함하도록 조작되는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다:(i) SEQ ID NO:1과 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (ii) SEQ ID NO:2와 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (iii) SEQ ID NO:3과 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (iv) SEQ ID NO:4와 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (v) SEQ ID NO:5와 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (vi) SEQ ID NO:6과 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (vii) SEQ ID NO:7과 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (viii) SEQ ID NO:8과 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열;(ix) SEQ ID NO:9와 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; (x) SEQ ID NO:10과 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열; 및/또는 (xi) SEQ ID NO:11과 적어도 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 또는 100 % 동일한 핵산 서열. 특정 구체예에서, 상기 숙주 세포는 상기 서열 각각을 포함하도록 조작되었으며 즉, 상기 서열은 상기 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B를 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 (i) wbbJ (SEQ ID NO : 9) 또는 SEQ ID NO : 9에 약 또는 적어도 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일하거나 상동인 핵산; (ii) wbbK (SEQ ID NO : 10) 또는 SEQ ID NO: 10에 약 또는 적어도 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일하거나 상동인 핵산; 및/또는 (iii) wbbL (SEQ ID NO : 11) 또는 SEQ ID NO: 11에 약 또는 적어도 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일하거나 상동인 핵산 중 적어도 2개를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B를 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 (i) wbbJ (SEQ ID NO: 9) 또는 SEQ ID NO: 9에 약 또는 적어도 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일하거나 상동인 핵산; (ii) wbbK (SEQ ID NO : 10) 또는 SEQ ID NO: 10에 약 또는 적어도 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일하거나 상동인 핵산; 및 (iii) wbbL (SEQ ID NO : 11) 또는 SEQ ID NO: 11에 약 또는 적어도 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일하거나 상동인 핵산 각각을 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B를 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 상기 숙주 세포가 (i) dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제; (ii) dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제; (iii) 글루코스-1-티미딜일전달효소; (iv) dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제; (v) O 항원 플립파제; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-글루코실전달효소; (viii) O 항원 중합효소; (ix) O-아세틸 전달효소; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-글루코실전달효소; 및/또는 (xi) dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 또 다른 특정 구체예에서, (i) dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제; (ii) dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제; (iii) 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소; (iv) dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제; (v) O 항원 플립파제; (vi) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소; (vii) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-글루코실전달효소; (viii) O 항원 중합효소; (ix) O-아세틸 전달효소; (x) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-글루코실전달효소; 및/또는 (xi) dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소의 일부 또는 전부가 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 올리고사카릴 전달효소는 숙주 세포에 이종성이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 담체 단백질은 숙주 세포에 대해 이종성이다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 양태에서, E. 콜라이 O25A를 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 즉 상기 숙주 세포가 E. 콜라이 O25A를 합성할 수 있는 효소를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다 (예를 들어, 도 3 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 양태에서, E. 콜라이 O1을 생성하는 원핵 숙주 세포는 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 즉 상기 숙주 세포는 E. 콜라이 O1을 합성할 수 있는 효소를 포함하는, 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다 (예를 들어, 도 12 참조). 특정 구체예에서, E. 콜라이 O1A를 생성하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 O1B를 생성하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 O1C를 생성하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포가 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 양태에서, E. 콜라이 O2를 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 즉 상기 숙주 세포가 E. 콜라이 O2를 합성할 수 있는 효소를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다 (예를 들어, 도 19 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
또 다른 양태에서, E. 콜라이 O6을 생성하는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)로서, 즉 상기 숙주 세포가 E. 콜라이 O6을 합성할 수 있는 효소를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본원에 제공된다 (예를 들어, 도 17 참조). 특정 구체예에서, 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 E. 콜라이 O6 또는 분지형 GlcNAc 모노사카라이드를 포함하는 O6 항원을 생성하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
하나 초과의 유형의 E. 콜라이 O 항원을 생성할 수 있는 원핵 숙주 세포 (예를 들어, 재조합적으로 조작된 원핵 숙주 세포)가 본원에 추가로 제공된다. 특정 구체예에서, 하기 중 적어도 2개를 생성할 수 있는 숙주 세포가 본원에 제공된다: O25B, O25A, O1 (예를 들어, O1A, O1B, O1C), O2 및 O6. 또 다른 특정 구체예에서, O25A, O1 (예를 들어, O1A, O1B, O1C), O2 및 O6 중 하나 이상 및 O25B를 생성할 수 있는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 원핵 숙주 세포는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다 (WO 2006/119987 참조). 특정 구체예에서, 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
5.3.1 유전자 배경
고세균, 원핵 숙주 세포 및 진핵 숙주 세포를 포함하여 당업자에게 공지된 임의의 숙주 세포는 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (예를 들어, O25B) 및 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (예를 들어, O25B)을 포함하는 바이오컨주게이트를 생성하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 및 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원을 포함하는 바이오컨주게이트의 생성에 사용하기 위한 예시적인 원핵 숙주 세포는 비제한적으로, 에스체리치아(Escherichia) 종, 쉬겔라(Shigella) 종, 클렙시엘라(Klebsiella) 종, 잔토모나스(Xhantomonas) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 락토코커스(Lactococcus) 종, 락토바실러스 (Lactobacillus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 코리네박테리움(Corynebacterium) 종, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종, 스트렙토코커스(Streptococcus) 종, 스타필로코커스(Staphylococcus) 종, 바실러스 (Bacillus) 종 및 클로스트리듐(Clostridium) 종을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 및 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원을 포함하는 바이오컨주게이트를 생성하는데 사용된 숙주 세포는 E. 콜라이이다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 E. 콜라이 O 항원 및 바이오컨주게이트를 생성하는데 사용되는 숙주 세포는 이종 핵산, 예를 들면, 하나 이상의 담체 단백질을 엔코딩하는 이종 핵산 및/또는 하나 이상의 단백질을 엔코딩하는 이종 핵산, 예를 들면, 하나 이상의 단백질을 엔코딩하는 유전자를 포함하도록 조작된다. 특정 구체예에서, 당화 경로(예를 들면, 원핵 및/또는 진핵 당화 경로)에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 이종 핵산이 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 핵산은 올리고사카릴전달효소 및/또는 글리코실 전달효소를 포함하나 이들로 한정되지 않는 단백질을 엔코딩할 수 있다. 이종 핵산(예를 들면, 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산 및/또는 다른 단백질, 예를 들면, 당화에 관여하는 단백질을 엔코딩하는 핵산)이 당업자에게 공지되어 있는 임의의 방법, 예를 들면, 전기천공, 열 충격에 의한 화학적 형질전환, 천연 형질전환, 파지 형질도입 및 컨주게이션을 이용하여 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 구체예에서, 이종 핵산은 플라스미드를 사용하여 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입되며, 예를 들어, 이종 핵산은 플라스미드(예를 들면, 발현 벡터)에 의해 숙주 세포에서 발현된다. 또 다른 특정 구체예에서, 이종 핵산은 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/068737에 기재된 삽입 방법을 이용하여 본원에 기재된 숙주 세포 내로 도입된다.
특정 구체예에서, 추가 변형은 본원에 기재된 숙주 세포 내로 (예를 들면, 재조합 기법을 이용하여) 도입될 수 있다. 예를 들어, 가능하게는 경쟁 또는 간섭 당화 경로의 일부를 형성하는(예를 들면, 숙주 세포 내로 재조합적으로 도입되는, 당화에 관여하는 하나 이상의 이종 유전자와 경쟁하거나 이러한 이종 유전자를 방해하는) 단백질을 엔코딩하는 숙주 세포 핵산(예를 들면, 유전자)이 그 자신을 불활성/비기능적 상태로 만드는 방식으로 숙주 세포 배경(게놈)에서 결실될 수 있거나 변형될 수 있다(즉, 결실/변형된 숙주 세포 핵산은 기능성 단백질을 엔코딩하지 않거나 단백질을 전혀 엔코딩하지 않는다). 특정 구체예에서, 핵산이 본원에 제공된 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되는 경우, 이들은 바람직한 서열 예를 들어, 당단백질 생성에 유용한 서열에 의해 대체된다.
숙주 세포에서 결실될 수 있는(그리고, 일부 경우, 다른 원하는 핵산 서열로 대체될 수 있는) 예시적인 유전자는 당지질 생합성에 관여하는 숙주 세포의 유전자, 예컨대, waaL(예를 들면, 문헌[Feldman etal., 2005, PNAS USA 102:3016-3021] 참조), 지질 A 코어 생합성 클러스터 (waa), 갈락토스 클러스터 (gal), 아라비노스 클러스터 (ara), 콜론산 클러스터 (wc), 캡슐형 폴리사카라이드 클러스터, 운데카프레놀-p 생합성 유전자 (예를 들어, uppS , uppP), 운드-P 재순환 유전자, 뉴클레오타이드 활성화된 당 생합성에 관여하는 대사 효소, 장세균 공통 항원 클러스터, 및 프로파지 O 항원 변형 클러스터, 예컨대, gtrABS 클러스터를 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포는 ExPEC로부터의 요망되는 O 항원 예를 들어, O25B 이외에 어떠한 O 항원도 생성하지 않는 방식으로 변형된다. 특정 구체예에서, waaL 유전자, gtrA 유전자, gtrB 유전자, gtrS 유전자 또는 rfb 유전자 클러스터 중 하나 이상이 본원에 제공된 원핵 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다. 한 구체예에서, 본원에 사용된 숙주 세포는 O25B 항원을 생성하는 E. 콜라이이며, 여기에서 waaL 유전자, gtrA 유전자, gtrB 유전자, 및 gtrS 유전자는 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다. 또 다른 구체예에서, 본원에 사용된 숙주 세포는 O25B 항원을 생성하는 E. 콜라이이며, 여기에서 waaL 및 gtrS 유전자는 숙주 세포의 게놈으로부터 결실되거나 기능적으로 불활성화된다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 변형된 숙주 세포는 단백질 당화에 사용될 수 있다. 단백질 당화는 E. 콜라이 폴리사카라이드 항원(들) 예를 들어, O25 (예를 들어, O25B), O1, O2, 및 O6을 함유하는 백신 제형 예를 들어, 백신에 사용하기 위한 바이오컨주게이트를 생성하도록 설계될 수 있다.
5.3.2 담체 단백질
컨주게이트 백신 (예를 들어, 백신에 사용하기 위한 바이오컨주게이트) 생성에 사용하기에 적합한 임의의 담체 단백질이 본원에 사용될 수 있으며, 예를 들어, 담체 단백질을 엔코딩하는 핵산은 ExPEC 항원 (예를 들어, O25B)에 연결된 담체 단백질을 포함하는 바이오컨주게이트의 생성을 위해 본원에 제공된 숙주 내로 도입될 수 있다. 예시적인 담체 단백질은 비제한적으로, P. 애루기노사의 무독화된 외독소 (EPA; 예를 들어, 문헌 [Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61] 참조), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스의 무독화된 용혈소 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜라이 FimH, E. 콜라이 FimHC, E. 콜라이 열 민감성 장독소, E. 콜라이 열 민감성 장독소의 무독화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜라이 Sat 단백질, E. 콜라이 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴몰리신 및 이의 무독화된 변이체, C. 제주니 AcrA, 및 C. 제주니 천연 당단백질을 포함한다. EPA에 있어서, 다양한 무독화된 단백질 변이체는 문헌에 기술되었으며 담체 단백질로서 사용될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바이오컨주게이트의 생성에 사용되는 담체 단백질은 변형되는데, 예를 들어, 단백질이 보다 낮은 독성을 나타내고/내거나 당화에 대한 보다 높은 민감성을 나타내는 방식으로 변형된다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 바이오컨주게이트의 생성에 사용되는 담체 단백질은 담체 단백질의 당화 부위의 수가 그의 바이오컨주게이트 형태로 예를 들어, 면역원성 조성물로 투여될 단백질의 보다 낮은 농도를 가능하게 하는 방식으로 최대화하도록 변형된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 담체 단백질은 (예를 들면, 그의 천연/자연, 예를 들면, "야생형" 상태의 담체 단백질과 회합된 당화 부위의 수에 비례하여) 담체 단백질과 정상적으로 회합될 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 당화 부위를 포함하도록 변형된다. 특정 구체예에서, 당화 부위의 도입은 단백질의 일차 구조의 임의의 위치에 당화 컨센서스 서열 (예를 들어, Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산 서열일 수 있음) (SEQ ID NO: 14); 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)) (WO 2006/119987 참조)을 삽입함으로써 달성된다. 이러한 당화 부위의 도입은 예를 들면, 신규 아미노산을 단백질의 일차 구조에 추가하거나(즉, 당화 부위가 전체적으로 또는 부분적으로 추가됨), 당화 부위를 발생시키도록 단백질의 기존 아미노산을 돌연변이시킴으로써(즉, 아미노산이 단백질에 추가되는 것이 아니라, 단백질의 선택된 아미노산이 당화 부위를 형성하도록 돌연변이됨) 달성될 수 있다. 당업자는 단백질의 아미노산 서열이 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열의 변형을 포함하는, 당분야에서 공지되어 있는 방법, 예를 들면, 재조합 방법을 이용하여 용이하게 변형될 수 있음이 인지할 것이다. 특정 구체예에서, 당화 컨센서스 서열은 단백질의 N 또는 C-말단에서 및/또는 단백질의 기저에서 다이설파이드 브릿지에 의해 안정화되는 루프에서 담체 단백질의 특정 영역, 예를 들면, 단백질의 표면 구조 내로 도입된다. 특정 구체예에서, 고전적인 5개 아미노산 당화 컨센서스 서열이 보다 효율적인 당화를 위해 라이신 잔기에 의해 연장될 수 있으므로, 삽입된 컨센서스 서열은 삽입되어야 하거나 수용체 단백질 아미노산을 대체하는 5개, 6개 또는 7개의 아미노산을 엔코딩할 수 있다. 한 특정 구체예에서, 담체 단백질은 4개 컨센서스 당화 서열 Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO:15)을 포함하는 무독화된 EPA이며, SEQ ID NO:13에 제공된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 바이오컨주게이트의 발생에 사용되는 담체 단백질은 "태그", 즉 담체 단백질의 분리 및/또는 확인을 가능하게 하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 태그를 본원에 기재된 담체 단백질에 추가하는 것은 그러한 단백질의 정제 및 따라서, 태깅된 담체 단백질을 포함하는 컨주게이트 백신의 정제에 유용할 수 있다. 본원에서 사용될 수 있는 예시적인 태그는 히스티딘(HIS) 태그(예를 들면, 헥사 히스티딘-태그, 또는 6XHis-태그), FLAG-TAG 및 HA 태그를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 특정 구체예에서, 본원에서 사용되는 태그는 예를 들어, 단백질이 정제된 후에 더 이상 필요하지 않으면, 예를 들어, 화학 제제 또는 효소적 수단에 의해 제거가능하다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 담체 단백질은 담체 단백질을 발현하는 숙주 세포의 세포질주변 공간으로 담체 단백질을 표적화시키는 신호 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 신호 서열은 E. 콜라이 DsbA, E. 콜라이 외막 포린 A (OmpA), E. 콜라이 말토스 결합 단백질 (MalE), 에르위니아 카로토보란스 (Erwinia carotovorans) 펙테이트 리아제 (PelB), FlgI, NikA, 또는 바실러스 sp. 엔독실라나제 (XynA), 열 민감성 E. 콜라이 장독소 LTIIb, 바실러스 엔독실라나제 XynA, 또는 E. 콜라이 플라겔린 (FlgI)으로부터 비롯된다.
5.3.3 당화 시스템
본원에 제공된 숙주 세포는 ExPEC로부터의 O 항원 예를 들어, O25 (예를 들어, O25B), O1, O2, 및/또는 O6 항원을 생성할 수 있는 유전자 시스템 (예를 들어, 글리코실전달효소)을 엔코딩하는 핵산을 포함하고/거나 포함하도록 변형될 수 있다. 섹션 5.1 참조.
글리코실전달효소
본원에 제공된 숙주 세포는 ExPEC O 항원 예를 들어, 혈청형 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B, 도 3B 참조), O1 (도 12 참조), O2 (도 19 참조), 및 O6 (예를 들어, 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6 항원 또는 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6 항원을 생성하는 O6 혈청형, 도 17 참조)의 E. 콜라이로부터의 O 항원을 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 예시적인 핵산은 섹션 5.1에 기술되어 있다. 특정 구체예에서, ExPEC O 항원을 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산의 일부 또는 모두는 본원에 제공된 숙주 세포에 의해 자연적으로 발현된다 (예를 들어, 핵산은 숙주 세포의 "야생형" 배경에 존재한다). 특정 구체예에서, ExPEC O 항원을 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산의 일부 또는 모두는 본원에 제공된 숙주 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않으며 즉, 핵산의 일부 또는 모두는 숙주 세포에 이종성이다. 숙주 세포는 당업계에 공지된 방법 예를 들어, 섹션 5.3에 기술된 방법을 이용하여 특정 핵산 예를 들어, 섹션 5.1에 기술된 핵산을 포함하도록 조작될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 O25B 혈청형의 E. 콜라이 O 항원 즉, 본원에 기술된 O25B 항원을 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 핵산은 upec138로부터의 rfb 클러스터 (SEQ ID NO:12), 또는 SEQ ID NO:12와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 엔코딩한다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 핵산은 upec163으로부터의 rfb 클러스터, 또는 upec163으로부터의 rfb 클러스터와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 엔코딩한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 핵산은 upec177로부터의 rfb 클러스터, 또는 upec177로부터의 rfb 클러스터와 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하거나 상동인 유전자 클러스터를 엔코딩한다.
또 다른 특정 구체예에서, O25B 혈청형의 E. 콜라이 O 항원을 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 상기 핵산은 O25B 혈청형의 유전자이며, 여기에서 상기 유전자는 rmlB (SEQ ID NO : 1), rmlD (SEQ ID NO : 2), rmlA (SEQ ID NO : 3), rmlC (SEQ ID NO : 4), wzx (SEQ ID NO : 5), wekA (SEQ ID NO : 6), wekB (SEQ ID NO : 7), wzy (SEQ ID NO : 8), wbbJ (SEQ ID NO : 9), wbbK (SEQ ID NO : 10) 및 wbbL (SEQ ID NO : 11)이다. 표 3 및 9 참조.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 O25A 혈청형의 E. 콜라이 O 항원 즉, 본원에 기술된 O25A 항원을 생성할 수 있는 단백질 (예를 들어, 글리코실전달효소)를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, O25A의 E. 콜라이 O 항원을 생성할 수 있는 단백질 (예를 들어, 글리코실전달효소)을 엔코딩하는 상기 핵산은 O25 혈청형의 유전자이며, 여기에서 상기 유전자는 rmlB , rmlD, rmlA, rmlC , wzx , wekA , wekB , wekC , wzy , fnlA , fnlB , fnlC , wbuB 및/또는 wbuC이다. 문헌 [Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; GenBank GU014554]; 및 표 2 참조.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 O2 혈청형의 O 항원 E. 콜라이를 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, O2의 E. 콜라이 O 항원을 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 상기 핵산은 O2 혈청형의 유전자이며, 여기에서 상기 유전자는 rmlB, rmlD , rmlA , rmlC , wzx , wekP , wekQ , wekR , wzy , fdtA , fdtB, 및/또는 fdtC이다. 문헌 [Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77; Fratamico, et al., 2010, Canadian Journal of Microbiology 56, 308-316]; 및 표 5 참조.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 O6 혈청형의 O 항원 E. 콜라이를 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 문헌 [Welch et al., 2002, PNAS USA 99(26):17020-17024; Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225, and Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283] 참조. 특정 구체예에서, 상기 O6 혈청형은 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 O1 혈청형의 O 항원 E. 콜라이를 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 O1 혈청형은 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, O1 혈청형의 E. 콜라이 O 항원을 생성할 수 있는 글리코실전달효소를 엔코딩하는 상기 핵산은 O1 혈청형의 유전자이며, 여기에서 상기 유전자는 rmlB , rmlD , rmlA, rmlC , wzx, mnaA, wekM, wzy, wekN, 및/또는 wekO이다.
올리고사카릴 전달효소
올리고사카릴 전달효소는 N-당화 컨센서스 모티프 예를 들어, Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산 서열일 수 있음) (SEQ ID NO: 14); 또는 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서, X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15) (WO 2006/119987 참조)을 초기 폴리펩티드 사슬의 아스파라긴 잔기에 지질-연결된 올리고사카라이드를 전달한다. 예를 들어, 그 기재내용이 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 WO 2003/074687 및 WO 2006/119987 참조.
특정 구체예에서, 본원에 제공된 숙주 세포는 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산을 포함한다. 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 핵산은 숙주 세포 본래의 것일 수 있거나, 상기 기술된 바와 같은 유전자 접근법을 이용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 올리고사카릴 전달효소는 당업계에 공지된 임의의 공급원으로부터 비롯될 수 있다. 특정 구체예에서, 올리고사카릴 전달효소는 캄필로박터로부터의 올리고사카릴 전달효소이다. 또 다른 특정 구체예에서, 올리고사카릴 전달효소는 캄필로박터 제주니로부터의 올리고사카릴 전달효소이다 (즉, pglB; 예를 들어, 문헌 [Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793; see also, e.g., NCBI Gene ID: 3231775, UniProt Accession No. O86154] 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 올리고사카릴 전달효소는 캄필로박터 라리로부터의 올리고사카릴 전달효소이다 (예를 들어, NCBI Gene ID: 7410986 참조).
5.4 바이오컨주게이트
특정 구체예에서, 본원에 기재된 숙주 세포는 담체 단백질에 연결된 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (예를 들어, O25B; 섹션 5.2 참조)을 포함하는 바이오컨주게이트를 생성하는데 사용될 수 있다. 숙주 세포를 이용하여 이러한 바이오컨주게이트를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, WO 2003/074687 및 WO 2006/119987 참조.
대안적으로, 글리코컨주게이트는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있으며 즉, 숙주 세포 외부에서 (시험관내에서) 제조될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원, 예를 들어, O25B는 폴리사카라이드/올리고사카라이드는 물론 단백질 담체에서 반응성 기의 활성화를 이용하는 것을 포함하는, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 담체 단백질에 컨주게이팅될 수 있다. 예를 들어, 그 기재내용이 본원에 참조로서 통합된 문헌 [Pawlowski et al., 2000, Vaccine 18:1873-1885; and Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978] 참조. 이러한 접근 방식은 숙주 세포로부터 항원 폴리사카라이드/올리고사카라이드의 추출, 폴리사카라이드/올리고사카라이드 정제, 폴리사카라이드/올리고사카라이드의 화학적 활성화, 및 폴리사카라이드/올리고사카라이드의 담체 단백질로의 컨주게이팅을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같은 바이오컨주게이트는 글리코컨주게이트에 비해 유리한 특성을 가지며 예를 들어, 바이오컨주게이트는 제조에서 화학물질이 덜 요구되며 생성된 최종 상품에 있어서 더욱 일관된다. 따라서, 바이오컨주게이트는 화학적으로 생성된 글리코컨주게이트에 비해 바람직하다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 ExPEC O 항원에 연결된 담체 단백질을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다. 섹션 5.2 참조.
특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B에 N-연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)를 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다.
또 다른 특정 구체예에서, 하기 제시된 화학식 O25B의 화합물에 연결된 운반 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00041
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 화학식 O25B의 O 항원에 N-연결되며 즉, O25B는 서열 Asn-X-Ser(Thr) (여기에서, X는 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) (SEQ ID NO:14)을 포함하는 담체 단백질; 또는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질의 Asn 잔기에 연결된다.
또 다른 특정 구체예에서, 하기 제시된 화학식 O25B'의 화합물에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다:
Figure 112016092556323-pct00042
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20 사이의 정수이다. 특정 구체예에서, 담체 단백질은 화학식 O25B'의 O 항원에 N- 연결된다.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 O25A 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, O25A는 하기 화학식 O25A; 또는
Figure 112016092556323-pct00043
O25A'를 포함한다:
Figure 112016092556323-pct00044
.
또 다른 특정 구체예에서, O1 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O1 항원은 O1A이며, 예를 들어, 상기 항원은 하기 화학식 O1A; 또는
Figure 112016092556323-pct00045
,
O1A'를 포함한다:
Figure 112016092556323-pct00046
.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 항원은 O1B이며, 예를 들어, 상기 항원은 하기 화학식 O1B; 또는
Figure 112016092556323-pct00047
,
O1B'을 포함한다:
Figure 112016092556323-pct00048
.
또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 항원은 O1C이며, 예를 들어, 상기 항원은 하기 화학식 O1C; 또는
Figure 112016092556323-pct00049
,
O1C'를 포함한다:
Figure 112016092556323-pct00050
.
또 다른 특정 구체예에서, O2 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O2 항원은 하기 화학식 O2; 또는
Figure 112016092556323-pct00051
,
O2'를 포함한다:
Figure 112016092556323-pct00052
.
또 다른 특정 구체예에서, O6 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, EPA)을 포함하는 바이오컨주게이트가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O6 항원은 하기 화학식 O6Glc;
Figure 112016092556323-pct00053
,
O6GlcNAc;
Figure 112016092556323-pct00054
,
O6Glc'; 또는
Figure 112016092556323-pct00055
,
O6GlcNAc'를 포함한다:
Figure 112016092556323-pct00056
.
본원에 기술된 바이오컨주게이트는 단백질의 정제를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 음이온 교환, 친화도, 및 사이징 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 차등 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기법에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18)] 참조; 또한 WO 2009/104074에 기술된 방법 참조. 또한, 바이오컨주게이트는 본원에 기술된 이종 폴리펩티드 서열 또는 그렇지 않으면, 정제를 용이하게 하기 위해 당업계에 공지된 서열에 융합될 수 있다. 특정 바이오컨주게이트를 정제하는데 사용된 실제 조건은 부분적으로는, 합성 전략 (예를 들어, 합성 생산 대 재조합 생산) 및 바이오컨주게이트의 순 전하, 소수성 및/또는 친수성과 같은 인자에 의존적일 것이며, 당업자에게 자명할 것이다.
5.5 O25B에 대한 항체
본원에 기술된 O25B 항원 (섹션 5.2 참조) 및/또는 본원에 기술된 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조)는 ExPEC에 대한 항체 중화를 유도하는데 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 O25B 항원 및/또는 본원에 기술된 O25B 항원을 포함하는 바이오컨주게이트는 대상체 (예를 들어, 인간, 마우스, 토끼, 래트, 기니아 피그 등)에 투여되어 항체 생성을 포함하는 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 기법 (예를 들면, 면역친화 크로마토그래피, 원심분리, 침전 등)을 사용하여 분리될 수 있다.
또한, 본원에 기술된 O25B 항원은 항체 라이브러리로부터 항체에 대해 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 분리된 O25B는 고형 지지체 (예를 들어, 실리카 겔, 수지, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 면, 플라스틱 비드, 폴리스티렌 비드, 알루미나 겔, 또는 폴리사카라이드, 자성 비드)에 고정화될 수 있으며, 항체로의 결합에 대해 스크리닝되었다. 대안적으로, 스크리닝될 항체는 고형 지지체에 고정화되고 O25B로의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 임의의 스크리닝 검정 예컨대, 패닝 검정법, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 또는 당업계에 공지된 기타 항체 스크리닝 검정은 O25B로 결합되는 항체에 대해 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 스크리닝된 항체 라이브러리는 시중에서 입수가능한 항체 라이브러리, 시험관내 생성된 라이브러리, 또는 EXPEC로 감염된 개체로부터 항체를 식별하고 클로닝하거나 분리함으로써 수득된 라이브러리일 수 있다. 항체 라이브러리는 당분야에 공지된 방법에 따라 발생될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 라이브러리는 항체를 클로닝하고 파지 디스플레이 라이브러리 또는 파지미드 디스플레이 라이브러리에 이를 사용함으로써 생성된다.
O25B 및/또는 O25B의 바이오컨주게이트를 사용하여 식별되거나 유발된 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분 즉, O25B에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함할 수 있다. 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류일 수 있다. 항체는 비제한적으로, 모노클로날 항체, 다중 특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs (scFv), 단일쇄 항체, Fab 단편, F (ab') 단편, 디설파이드-결합 Fvs (sdFv), 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 본원에 기술된 방법을 이용하여 유발되거나 식별된 항체에 대한 항-Id 항체 포함), 및 상기 중 임의의 에피토프-결합 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, O25B 및/또는 O25B의 바이오컨주게이트를 사용하여 유발되거나 식별된 항체는 인간 또는 인간화된 모노클로날 항체이다.
O25B 및/또는 O25B의 바이오컨주게이트를 사용하여 유발되거나 식별된 항체는 치료법의 효능 및/또는 질환 진행을 모니터링하는데 이용될 수 있다. 비제한적으로, 방사선 면역 검정, ELISA (효소 결합 면역흡착 검정법), "샌드위치" 면역검정법, 침강소 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 검정, 방사면역검정법, 형광 면역검정법, 단백질 A 면역검정법 및 면역전기영동 검정법과 같은 기법을 사용하는 경쟁 및 비경쟁 검정 시스템을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 면역검정 시스템이 이러한 목적을 위해 이용될 수 있다.
O25B 및/또는 O25B의 바이오컨주게이트를 사용하여 유발되거나 식별된 항체는 예를 들어, 복수의 E. 콜라이 균주로부터 E. 콜라이 O25B 균주를 검출하고/거나 E. 콜라이 O25B 균주에 의한 감염을 진단하는데 이용될 수 있다.
5.6 조성물
5.6.1 숙주 세포를 포함하는 조성물
한 양태에서, 본원에 기재된 숙주 세포를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 조성물은 본원에 기재된 바이오컨주게이트를 발생시키는 방법에 사용될 수 있으며 (섹션 5.4 참조), 예를 들면, 상기 조성물은 단백질의 생성에 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 그 후, 바이오컨주게이트는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 상기 조성물로부터 분리될 수 있다.
본원에서 제공된 숙주 세포를 포함하는 조성물은 본원에 기재된 숙주 세포의 유지 및 생존에 적합한 추가 성분을 포함할 수 있고, 숙주 세포에 의한 단백질의 생성에 필요하거나 유리한 추가 성분, 예를 들면, 유도성 프로모터를 위한 유도인자, 예컨대, 아라비노스, IPTG를 추가로 포함할 수 있다.
5.6.2 항원 및/또는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 중 하나 이상을 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제 조성물) (섹션 5.2 참조) 및 본원에 기술된 바이오컨주게이트 중 하나 이상을 포함하는 조성물 (예를 들어, 약제 조성물) (섹션 5.4 참조)가 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다 (섹션 5.2 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기술된 바이오컨주게이트 중 하나 이상을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다 (섹션 5.4 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 중 하나 이상 (섹션 5.2 참조) 및 본원에 기술된 바이오컨주게이트 중 하나 이상 (섹션 5.4 참조)을 포함한다. 본원에 기술된 조성물은 장외 병원성 E. 콜라이 (ExPEC)로의 대상체 (예를 들어, 인간 대상체) 감염의 치료 및 예방에 유용하다. 섹션 5.7 참조.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조) 및/또는 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조)를 포함하는 것 이외에, 본원에 기술된 조성물 (예를 들어, 약제 조성물)은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물 및 더욱 특히, 인간에 사용하기 위한 기타 일반적으로 인식된 약전에 기술됨을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 문맥에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "담체"는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비히클을 지칭하며, 이와 함께 약제 조성물이 투여된다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 특히, 주입 용액을 위한 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 소듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 및 기타 등등을 포함한다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 항원 예를 들어, 섹션 5.2에 기술된 ExPEC O 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질)을 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 E. 콜라이 O25B에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질, 예를 들어, EPA 또는 MBP)을 포함한다 (섹션 5.2 참조).
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 E. 콜라이 O25A에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질, 예를 들어, EPA 또는 MBP)을 포함한다 (섹션 5.2 참조).
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 E. 콜라이 O1에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질, 예를 들어, EPA 또는 MBP)을 포함한다 (섹션 5.2 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1B이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1C이다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 E. 콜라이 O2에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질, 예를 들어, EPA 또는 MBP)을 포함한다 (섹션 5.2 참조).
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 E. 콜라이 O6에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질, 예를 들어, EPA 또는 MBP)을 포함한다 (섹션 5.2 참조). 특정 구체예에서, 상기 O6 거대분자는 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자이다.
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트 및 (ii) O1 거대 분자 또는 O1을 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 섹션 5.2 참조. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1B이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1C이다.
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트 및 (ii) O2 거대 분자 또는 O2를 포함 하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 섹션 5.2 및 5.4 참조. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다.
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트 및 (ii) O6 거대 분자 (예를 들어, 분지형 Glc 모노사카라이드 또는 분지형 GlcNAc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자) 또는 O6를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 섹션 5.2 및 5.4 참조. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O6 거대분자는 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자이다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B (섹션 5.2 참조) 또는 O25를 포함하는 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조), 및 하기 중 적어도 하나를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다: (i) E. 콜라이 O1 또는 O1을 포함하는 바이오컨주게이트 (섹션 5.2 및 5.4 참조); (ii) E. 콜라이 O2 또는 O2를 포함하는 바이오컨주게이트 (섹션 5.2 및 5.4 참조); 및/또는 (iii) E. 콜라이 O6 또는 O6를 포함하는 바이오컨주게이트 (섹션 5.2 및 5.4 참조). 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1은 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1은 O1B이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1은 O1C이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O6은 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6이다.
또 다른 특정 구체예에서, (i) O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자 또는 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B)를 포함하는 바이오컨주게이트; (ii) O1 거대 분자 또는 O1을 포함하는 바이오컨주게이트; (iii) O2 거대분자 또는 O2를 포함하는 바이오컨주게이트; 및/또는 (iv) O6 거대분자 (예를 들어, 분지형 Glc 모노사카라이드 또는 분지형 GlcNAc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자) 또는 O6를 포함하는 바이오컨주게이트 중 적어도 2개를 포함하는 조성물 예를 들어, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1B이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1C이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O6 거대분자는 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자이다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트 및 E. 콜라이 O1A를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 바이오컨주게이트는 섹션 5.4에 기술되어 있다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트 및 E. 콜라이 O1B를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 바이오컨주게이트는 섹션 5.4에 기술되어 있다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트 및 E. 콜라이 O1C를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 바이오컨주게이트는 섹션 5.4에 기술되어 있다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트 및 E. 콜라이 O2를 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 바이오컨주게이트는 섹션 5.4에 기술되어 있다.
또 다른 특정 구체예에서, E. 콜라이 O25B를 포함하는 바이오컨주게이트 및 E. 콜라이 O6을 포함하는 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물, 예를 들면, 약제 조성물이 본원에 제공된다. 이러한 바이오컨주게이트는 섹션 5.4에 기술되어 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 E. 콜라이 O25B에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질, 예를 들면, EPA 또는 MBP) (섹션 5.2 참조), (ii) O1 혈청형 예를 들어, O1A의 E. 콜라이 O 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질 예를 들어, EPA 또는 MBP) (섹션 5.2 참조), (iii) O2 혈청형의 E. 콜라이 O 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.1.2에 기술된 담체 단백질 예를 들어, EPA 또는 MBP) (섹션 5.2 참조), 및 (iv) O6 혈청형의 E. 콜라이 O 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질 예를 들어, EPA 또는 MBP) (섹션 5.2 참조)을 포함한다.
특정 구체예에서, 상기 조성물은 O1, O2, O6, 또는 O25 이외의 E. 콜라이 혈청형의 E. 콜라이 O 항원에 연결된 담체 단백질 (예를 들어, 섹션 5.3.2에 기술된 담체 단백질, 예를 들어, EPA 또는 MBP)을 포함한다. 다른 유용한 E. 콜라이 혈청형은 예를 들어, 하기 실시예 1 및 표 1에 기술되어 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대분자를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 O1 거대분자 (예를 들어, O1A, O1B, 또는 O1C)를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 O2 거대 분자를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 O6 거대분자 (예를 들어, 분지형 Glc 모노사카라이드 또는 분지형 GlcNAc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자)를 포함한다.
또 다른 특정 구체예에서, 본원에 제공된 조성물은 O25 (예를 들어, O25A 또는 O25B) 거대 분자, O1 거대 분자, O2 거대 분자 및 O6 거대 분자 (예를 들어, Glc 모노사카라이드 또는 분지형 GlcNAc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자)를 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 O25 거대 분자는 O25B 거대분자이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 거대 분자는 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O6 거대분자는 분지형 Glc 모노사카라이드를 포함하는 O6 거대분자이다.
본원에 제공된 조성물은 조성물이 투여되는 숙주에서 면역 반응을 유발시키는데 사용될 수 있으며 즉, 면역원성이다. 따라서, 본원에 기재된 조성물은 ExPEC 감염에 대한 백신으로 사용될 수 있거나 ExPEC 감염의 치료에 사용될 수 있고, 따라서 약제 조성물로서 제형화될 수 있다. 섹션 5.7 참조.
본원에 기술된 바이오컨주게이트 및/또는 거대분자를 포함하는 조성물은 약제 투여에 사용하기에 적합한 임의의 추가 성분을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 일가 제형이다. 다른 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 다가 제형 예를 들어, 2가, 3가 및 4가 제형이다. 예를 들어, 다가 제형은 본원에 기술된 하나 초과의 바이오컨주게이트 또는 E. 콜라이 O 항원을 포함한다. E. 콜라이 O 항원 및 바이오컨주게이트의 설명에 있어서 각각 섹션 5.2 및 5.4 참조. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 거대분자 또는 바이오컨주게이트를 포함하는 4가 제형이며, 여기에서 상기 원자가는 O25B, O1A, O6 및 O2 혈청형/하위혈청형의 E. 콜라이 O 항원으로부터 비롯된다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 보존제 예를 들어, 수은 유도체 티메로살을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 약제 조성물은 0.001 % 내지 0.01 %의 티메로살을 포함한다. 다른 구체예에서, 본원에 기재된 약제 조성물은 보존제를 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, 면역원성 조성물)은 애주번트를 포함하거나 이와 조합되어 투여된다. 본원에 기술된 조성물과 조합되어 투여하기 위한 애주번트는 상기 조성물의 투여 전에, 동시에 또는 후에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 용어 "애주번트"는 본원에 기재된 조성물과 함께 또는 본원에 기재된 조성물의 일부로서 투여될 때에는 바이오컨주게이트에 대한 면역 반응을 증강시키고/시키거나, 향상시키고/시키거나 부스팅하나, 화합물이 단독으로 투여될 때에는 바이오컨주게이트에 대한 면역 반응을 발생시키지 않는 화합물을 지칭한다. 일부 구체예에서, 애주번트는 폴리 바이오컨주게이트 펩티드에 대한 면역 반응을 발생시키고 알레르기 또는 다른 불리한 반응을 생성하지 않는다. 애주번트는 예를 들면, 림프구 동원, B 및/또는 T 세포의 자극, 및 대식세포의 자극을 포함하는 여러 기작으로 면역 반응을 향상시킬 수 있다.
애주번트의 구체적인 예로는 알루미늄 염(명반)(예컨대, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 및 알루미늄 설페이트), 3 데-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A(MPL)(영국 특허 2220211 참조), MF59(Novartis), AS03(GlaxoSmithKline), AS04(GlaxoSmithKline), 폴리소르베이트 80(Tween 80; ICL Americas, Inc.), 이미다조피리딘 화합물(국제 공개 WO2007/109812로서 공개된 국제 특허출원 PCT/US2007/064857 참조), 이미다조퀴녹살린 화합물(국제 공개 WO2007/109813로서 공개된 국제 특허출원 PCT/US2007/064858 참조) 및 사포닌, 예컨대, QS21(문헌[Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995)] 및 미국 특허 번호5,057,540 참조)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 애주번트는 (완전 또는 불완전) 프로인트 애주번트이다. 다른 애주번트는 임의적으로 면역 자극제, 예컨대, 모노포스포릴 지질 A와 함께 사용되는 수중유 에멀젼(예컨대, 스쿠알렌 또는 땅콩유)이다 (문헌[Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)] 참조). 또 다른 애주번트는 CpG이다[Bioworld Today, Nov. 15, 1998].
특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 대상체로의 의도된 투여 경로에 적합하게 되도록 제형화된다. 예를 들어, 본원에 기재된 조성물은 피하, 비경구, 경구, 피내, 경피, 결장내, 복강내 및 직장 투여에 적합하게 되도록 제형화될 수 있다. 특정 구체예에서, 약제 조성물은 정맥내, 경구, 복강내, 비내, 기관내, 피하, 근육내, 국소, 진피내, 경피 또는 폐 투여 용으로 제형화될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 추가로 하나 이상의 완충제, 예컨대, 포스페이트 완충제 또는 수크로스 포스페이트 글루타메이트 완충제를 포함한다. 기타 구체예에서, 본원에 기재된 약제 조성물은 완충제를 포함하지 않는다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물은 추가로 하나 이상의 염 예를 들어, 소듐 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 포스페이트, 모노소듐 글루타메이트, 및 알루미늄 염 (예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드, 알루미늄 포스페이트, 명반 (포타슘 알루미늄 설페이트) 또는 이러한 알루미늄 염의 혼합물)을 포함한다. 기타 구체예에서, 본원에 기재된 조성물은 염을 포함하지 않는다.
본원에 기재된 조성물은 투여 지침과 함께 용기, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
본원에 기재된 조성물은 사용 전에 저장될 수 있으며, 예를 들어, 상기 조성물은 (예를 들어, 약 -20℃ 또는 약 -70℃)에서 냉동 저장될 수 있거나; (예를 들어, 약 4℃에서) 냉장 조건에서 저장될 수 있거나; 실온에서 저장될 수 있다.
5.7 예방 및 치료 용도
본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체의 장외 E. 콜라이 (ExPEC) 감염을 치료하고 예방하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 본원에 기재된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 ExPEC에 의해 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)의 감염을 예방하는데 사용되며, 즉 본원에 기재된 조성물은 ExPEC 감염에 대하여 대상체를 백신화하는데 사용된다. 또 다른 특정 구체예에서, 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 ExPEC로 감염된 대상체의 치료에 사용된다.
본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, ExPEC에 대하여 대상체의 면역 반응을 유발하는 방법이 또한 본원에 제공된다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 투여시에 ExPEC 감염이 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 대상체는 투여시에 ExPEC 감염을 갖지 않는다.
또한, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)을 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체에서 ExPEC에 대한 옵소닌식균작용 항체의 생성을 유발하는 방법이 본원에 제공된다. 한 구체예에서, 상기 대상체는 투여시에 ExPEC 감염이 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 대상체는 투여시에 ExPEC 감염을 갖지 않는다.
특정 구체예에서, 대상체에서 E. 콜라이 (예를 들어, ExPEC) 감염을 예방하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 섹션 5.6.2에 기술된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 본원에서 제공되는 대상체의 ExPEC 감염 예방 방법은 섹션 5.6.2에 기재되어 있는 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하여 대상체에서의 면역 반응 유발을 발생시킨다. 당업자는 본원에 기술된 대상체에서 면역 반응을 유발시키는 방법이 O 항원이 조성물(들)에 존재하는 ExPEC 균주에 의한 감염에 대한 대상체의 백신화를 유도함을 이해할 것이다.
특정 구체예에서, 대상체에서 E. 콜라이 (예를 들어, ExPEC) 감염을 치료하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 유효량의 섹션 5.6.2에 기술된 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 ExPEC의 임의의 혈청형, 하위혈청형 또는 균주에 의해 초래된 ExPEC 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 ExPEC의 하나 초과의 혈청형에 의한 ExPEC 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 O25 혈청형의 E. 콜라이에 의해 초래된 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다. 특정 구체예에서, 상기 O25 혈청형은 O25B이다. 특정 구체예에서, 상기 O25 혈청형은 O25A이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 O1 혈청형의 E. 콜라이에 의해 초래된 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다. 특정 구체예에서, 상기 O1 혈청형은 O1A이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 혈청형은 O1B이다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 O1 혈청형은 O1C이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 O2 혈청형의 E. 콜라이에 의해 초래된 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 O6 혈청형의 E. 콜라이에 의해 초래된 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 하기 E. 콜라이 혈청형 중 2개 이상에 의해 초래된 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다: O25 (예를 들어, O25B 및 O25A), O1 (예를 들어, O1A, O1B, 및 O1C), O2, 및/또는 O6.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)에 의해 유발된 면역 반응은 하기 E. 콜라이 혈청형 각각에 의해 초래된 감염을 예방 및/또는 치료하는데 효과적이다: O25 (예를 들어, O25B 및 O25A), O1 (예를 들어, O1A, O1B, 및 O1C), O2, 및 O6.
ExPEC 감염에 대하여 대상체를 면역화시키거나 ExPEC 감염을 갖는 대상체를 치료하기 위해, 대상체에는 본원에 기술된 단일 조성물이 투여될 수 있으며, 여기에서 상기 조성물은 본원에 기술된 1, 2, 3, 4 개 또는 그 초과의 E. 콜라이 항원을 포함한다. 섹션 5.2 참조. 대안적으로, ExPEC 감염에 대하여 대상체를 면역화시키거나 ExPEC 감염을 갖는 대상체를 치료하기 위해, 대상체에는 본원에 기술된 다중 바이오컨주게이트가 투여될 수 있으며, 예를 들어, 대상체에는 섹션 5.4에 기술된 2, 3, 4 개 또는 그 초과의 바이오컨주게이트가 투여될 수 있다. 대안적으로, ExPEC 감염에 대하여 대상체를 면역화시키거나 ExPEC 감염을 갖는 대상체를 치료하기 위해, 대상체에는 본원에 기술된 다중 조성물이 투여될 수 있으며, 예를 들어, 대상체에는 섹션 5.6.2에 기술된 2, 3, 4 개 또는 그 초과의 조성물이 투여될 수 있다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)의 투여 후 대상체에서 유발된 면역 반응은 ExPEC 감염으로부터 발생된 증상을 감소시키는데 효과적이다. ExPEC 감염의 증상은 감염의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 비제한적으로, (예를 들어, ExPEC에 의해 초래된 요로 감염을 갖는 대상체에서) 배뇨통, 증가된 빈뇨 또는 요절박, 농뇨, 혈뇨, 요통, 배뇨시 통증, 열, 오한, 및/또는 오심; (예를 들어, ExPEC에 의해 초래된 수막염을 가진 대상체에서) 고열, 두통, 어깨 결림, 메스꺼움, 구토, 발작, 졸음, 및/또는 광과민; (예를 들어, ExPEC 의해 초래된 패혈증을 가진 대상체에서) 발열, 증가된 심박수, 증가된 호흡률, 감소된 요배설량, 감소된 혈소판 수, 복통, 호흡 곤란, 및/또는 비정상적 심장 기능을 포함한다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)의 투여 후 대상체에서 유발된 면역 반응은 ExPEC 감염으로부터 고통받는 대상체의 입원 가능성을 감소시키는데 효과적이다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)의 투여 후 대상체에서 유발된 면역 반응은 ExPEC 감염으로부터 고통받는 대상체의 입원 기간을 감소시키는데 효과적이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 항체, 즉 본원에 기재된 항-O25B 항체를 투여하여 O25B 혈청형의 E. 콜라이에 의해 초래된 대상체에서의 ExPEC 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 특정 구체예에서, 중화 항체는 모노클로날 항체이다.
5.7.1 조합 치료법
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 하나 이상의 기타 치료법 (예를 들어, 항박테리아 또는 면역조절 요법)과 조합되어 대상체에 투여된다. 하나 이상의 다른 치료법은 ExPEC 감염의 치료 또는 예방에 유익할 수 있거나 ExPEC 감염과 관련된 증상 또는 상태를 개선시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 기타 요법제는 통증 완화제 또는 항-발열 의약이다. 특정 구체예에서, 치료제는 5분 미만, 30분 미만, 1시간, 약 1시간, 약 1 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 약 5시간, 약 5시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 7시간, 약 7시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 9시간, 약 9시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 11시간, 약 11시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 18시간, 18시간 내지 24시간, 24시간 내지 36시간, 36시간 내지 48시간, 48시간 내지 52시간, 52시간 내지 60시간, 60시간 내지 72시간, 72시간 내지 84시간, 84시간 내지 96시간, 또는 96시간 내지 120시간 간격으로 투여된다.
당업자에게 공지된 임의의 항-박테리아 제제는 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)과 함께 사용될 수 있다. 항-박테리아 제제의 비제한적 예는 아미카신 (Amikacin), 아목시실린(Amoxicillin), 아목시실린-클라불라닉산 (Amoxicillin-clavulanic acid), 암포테리신-B(Amphothericin-B), 암피실린 (Ampicillin), 암피실린-설박탐(Ampicllin-sulbactam), 아프라마이신(Apramycin), 아지트로마이신(Azithromycin), 아즈트레오남(Aztreonam), 박시트라신(Bacitracin), 벤질페니실린(Benzylpenicillin), 카스포푼진(Caspofungin), 세파클로르(Cefaclor), 세파드록실(Cefadroxil), 세파렉신(Cefalexin), 세파로틴(Cefalothin), 세파졸린(Cefazolin), 세프디니르(Cefdinir), 세페파임(Cefepime), 세픽자임(Cefixime), 세프메녹자임(Cefmenoxime), 세포페라존(Cefoperazone), 세포페라존-설박탐(Cefoperazone-sulbactam), 세포탁심(Cefotaxime), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프피롬(Cefpirome), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프포독심-클라불라닉산(Cefpodoxime-clavulanic acid), 세프포독심-설박탐(Cefpodoxime-sulbactam), 세프프로질(Cefprozil), 세프퀴놈(Cefquinome), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프티부틴(Ceftibutin), 세프티오푸르(Ceftiofur), 세프토비프롤(Ceftobiprole), 세프트리악손(Ceftriaxon), 세푸록심(Cefuroxime), 클로르암페니콜(Chloramphenicole), 플로르페니콜(Florfenicole), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 클라리트로마이신(Clarithromycin), 클리나플록사신(Clinafloxacin), 클린다마이신(Clindamycin), 클록사실린(Cloxacillin), 콜리스틴(Colistin), 코트리목사졸(Cotrimoxazol) (트림토프라임(Trimthoprim)/설파메톡사졸(sulphamethoxazole)), 달바반신(Dalbavancin), 달포프리스틴(Dalfopristin)/퀴노프리스틴(Quinopristin), 답토마이신(Daptomycin), 디베카신(Dibekacin), 디클록사실린(Dicloxacillin), 도리페넴(Doripenem), 독시사이클린(Doxycycline), 엔로플록사신(Enrofloxacin), 에르타페넴(Ertapenem), 에리트로마이신(Erythromycin), 플루클록사실린(Flucloxacillin), 플루코나졸(Fluconazol), 플루사이토신(Flucytosin), 포스포마이신(Fosfomycin), 푸시드산(Fusidic acid), 가레녹사신(Garenoxacin), 가티플록사신(Gatifloxacin), 젬니플록사신(Gemifloxacin), 젠타마이신(Gentamicin), 이미페넴(Imipenem), 이트라코나졸(Itraconazole), 카나마이신(Kanamycin), 케토코나졸(Ketoconazole), 레보플록사신(Levofloxacin), 린코마이신(Lincomycin), 리네졸리드(Linezolid), 로라카르베프(Loracarbef), 메실남(Mecillnam) (암디노실린), 메로페넴(Meropenem), 메트로니다졸(Metronidazole), 메지오실린(Meziocillin), 메즐로실린-설바탐(Mezlocillin-sulbactam), 미노사이클린(Minocycline), 목시플록사신(Moxifloxacin), 무피로신(Mupirocin), 날리딕스산(Nalidixic acid), 네오마이신(Neomycin), 네틸미신(Netilmicin), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 노르플록사신(Norfloxacin), 오플록사신(Ofloxacin), 옥사실린(Oxacillin), 페플록사신(Pefloxacin), 페니실린 V(Penicillin V), 피페라실린(Piperacillin), 피페라실린-설바탐(Piperacillin-sulbactam), 피페라실린-타조박탐(Piperacillin-tazobactam), 리팜피신(Rifampicin), 록시트로마이신(Roxythromycin), 스파르플록사신(Sparfloxacin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 스피라마이신(Spiramycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 설바탐(Sulbactam), 설파메톡사졸(Sulfamethoxazole), 테이코플라닌(Teicoplanin), 텔라반신(Telavancin), 텔리트로마이신(Telithromycin), 테모실린(Temocillin), 테트라사이클린(Tetracyklin), 티카르실린(Ticarcillin), 티카르실린-클라불라닉산 (Tricarcillin-clavulanic acid), 티게사이클린(Tigecycline), 토브라마이신(Tobramycin), 트리메토프라임(Trimethoprim), 트로바플록사신(Trovafloxacin), 타일로신(Tylosin), 반코마이신(Vancomycin), 비르기니아마이신(Virginiamycin), 및 보리코나졸(Voriconazole)을 포함한다.
특정 구체예에서, 조합 치료는 2개 이상의 본원에 기재된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기재된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조), 및/또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)의 투여를 포함한다.
5.7.2 환자 개체군
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 순수 대상체 즉, ExPEC 감염에 걸리지 않거나 ExPEC 감염에 이전에 걸린 적이 없는 대상체에 투여된다. 한 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 ExPEC 감염에 걸릴 위험이 있는 순수 대상체에 투여된다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 ExPEC 감염을 갖는 것으로 진단된 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 증상이 나타나거나 증상이 심각해지기 전에 (예를 들어, 환자에게 입원이 필요하기 전에) ExPEC로 감염된 대상체에 투여된다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 UPEC 감염을 갖는 것으로 진단된 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 재발성 요로 감염으로부터 고통받는 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 재발성 요로 감염으로부터 고통받고 있으나, 치료 당시에는 건강한 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 균혈증 또는 패혈증에 걸린 또는 이에 걸릴 위험성이 있는 대상체에 투여된다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 동물이다. 특정 구체예에서 동물은 새이다. 특정 구체예에서, 동물은 개과이다. 특정 구체예에서, 동물은 고양이과이다. 특정 구체예에서, 동물은 말이다. 특정 구체예에서, 동물은 소이다. 특정 구체예에서, 동물은 포유 동물, 예를 들어, 말, 돼지, 마우스 또는 영장류이다. 특정 구체예에서, 대상체는 인간이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 성인이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 50세 초과의 인간 성인이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 노인 대상체다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 아동이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 신생아이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 미숙아이다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 인간 토들러이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 6개월 미만의 신생아가 아니다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 임신한 개체이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 일찍 출산한 여성이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 ExPEC의 증가된 위험성을 갖는 개체 (예를 들어, 면역약화되거나 면역결핍된 개체)이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 증가된 ExPEC 감염 위험성을 갖거나 ExPEC 감염 위험성이 증가된 개체와 밀접하게 접촉한 개체이다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 의료인 (예를 들어, 의사 또는 간호사)이다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 면역약화되거나 (예를 들어, HIV 감염으로부터 고통받거나) 또는 면역억제된다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 당뇨병을 갖는다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 다발성 경화증을 갖는다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 카테터를 사용해야하는 상태를 갖는다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)이 투여될 대상체는 척수 손상을 갖는다.
5.7.3 투여량 및 투여 빈도
ExPEC 감염의 치료 및/또는 예방에 효과적일, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)의 양은 질환의 특성에 좌우될 것이며, 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. O-항원, 바이오컨주게이트 및/또는 조성물의 투여는 임상의에 공지된 다양한 경로 예를 들어, 피하, 비경구, 정맥내, 근내, 국소, 경구, 피내, 경피, 비내 등을 통해 수행될 수 있다. 한 구체예에서, 투여는 근내 주입을 통해서이다.
제형에 사용될 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 감염의 중증도에 의존적일 것이며, 의료인의 판단 및 각 대상체의 상황에 따라 결정되어야한다. 예를 들어, 유효 투여량은 또한, 투여 수단, 표적 부위, 환자의 생리학적 상태 (연령, 체중, 건강 상태 포함), 환자가 인간 또는 동물 인지, 기타 투여되는 의약, 및 처리가 예방용 또는 치료용인지에 따라 달라질 수 있다. 처리 투여량은 안전성과 효능을 최적화하도록 최적으로 적정된다.
특정 구체예에서, 시험관내 검정은 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕는데 이용된다. 섹션 5.8 참조. 유효량은 시험관내 또는 동물 모델 평가 시스템으로부터 유래된 투여량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
특정 구체예에서, 글리코컨주게이트 기반 백신 (예를 들어, 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물)에 대한 예시적인 투여량은 용량당 약 0.1 ㎍ 내지 400 ㎍의 탄수화물 범위이다. 기타 구체예에서, 글리코컨주게이트 기반 백신 (예를 들어, 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물)에 대한 예시적인 투여량은 용량당 약 0.1 ㎍ 내지 4000 ㎍의 단백질(들) 범위이다. 특정 구체예에서, 글리코컨주게이트 기반 백신 (예를 들어, 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물)에 대한 예시적인 투여량은 용량 당 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50㎍의 탄수화물(들)을 포함한다. 특정 구체예에서, 글리코컨주게이트 기반 백신 (예를 들어, 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물)에 대한 예시적인 투여량은 용량당 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 ㎍의 단백질(들)을 포함한다. 특정 예시적인 구체예에서, 인간에게 투여하기위한 투여량은 포함된 글리코컨주게이트 각각에 대해 약 1-10, 예를 들어, 약 2-6, 예를 들어, 약 4 ㎍의 폴리사카라이드를 함유하는 0.5ml에 상응한다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 단일 용량으로서 대상체에 한번에 투여된다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 단일 투여에 이어서 3 내지 6주 후에 제 2 투여로서 대상체에 투여된다. 이러한 구체예에 따르면, 부스터 접종은 제 2 접종 후 6 내지 12개월 간격을 두고 대상체에 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 부스터 접종은 상이한 E. 콜라이 O 항원, 바이오컨주게이트 또는 조성물을 이용할 수 있다. 일부 구체예에서, 동일한 E. 콜라이 O 항원, 바이오컨주게이트 또는 조성물의 투여는 반복될 수 있고, 투여는 적어도 1일, 2일, 3일, 5일, 7일 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월 또는 적어도 6개월 간격을 둘 수 있다. 특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 1년에 1회 단일 용량으로서 대상체에 투여된다.
특정 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)은 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 간격을 두고 2, 3, 4, 5회 또는 그 초과의 용량으로 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 E. 콜라이 O 항원 (섹션 5.2 참조), 본원에 기술된 바이오컨주게이트 (섹션 5.4 참조) 또는 본원에 기술된 조성물 (섹션 5.6.2 참조)의 2, 3, ,4, 5회 또는 그 초과의 용량이 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 간격을 두고 0.1 ㎍ 내지 0.5 mg, 0.1 ㎍ 내지 0.4 mg, 0.1 ㎍ 내지 0.3 mg, 0.1 ㎍ 내지 0.2 mg, 또는 0.1 ㎍ 내지 0.1 mg 탄수화물 함량의 투여량으로 대상체에 투여된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 O 항원, 바이오컨주게이트 또는 조성물이 동일한 각 시간에 투여된다. 특정 구체예에서, E. 콜라이 O 항원, 바이오컨주게이트 또는 조성물이 상이한 각 시간에 투여된다.
항체 (예를 들어, 항-OB25B 항체)로의 패시브 면역화에 있어서, 투여량은 체중 kg 당 약 0.0001 내지 100 mg의 항체, 또는 체중 kg 당 0.01 내지 5 항체의 범위일 수 있다. 예를 들어, 투여량은 70kg 환자에 있어서 각각 1 내지 10 mg/ 체중 kg 또는 10mg/체중 kg, 또는 1-10mg/kg의 범위내 또는 다른 말로, 70mg 또는 700mg, 또는 70-700mg의 범위 내일 수 있다. 예시적인 치료 요법은 1년 또는 수년에 걸쳐 또는 수년의 간격을 두고 매 2주마다 1회 또는 매달 1회 또는 매 3 내지 6개월 마다 1회 투여를 수반한다. 간격은 불규칙적일 수 있으며, 환자의 항체의 혈중 농도에 따라 변경될 수 있다.
5.8 검정법
면역 반응을 유발하는 바이오컨주게이트의 능력을 평가하기 위한 검정법
대상체에서 면역 반응을 발생시키는 본원에 기술된 바이오컨주게이트/조성물의 능력은 본원에 기술된 또는 당업자에게 공지된 임의의 접근법을 이용하여 평가될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체에서 면역 반응을 발생시키는 바이오컨주게이트의 능력은 본원에 기술된 바이오컨주게이트로 대상체 (예를 들어, 마우스) 또는 대상체 세트를 면역화시키고 대조군 (PBS)으로 추가적인 대상체(예를 들어, 마우스) 또는 대상체 세트를 면역화시킴으로써 평가될 수 있다. 대상체 또는 대상체 세트는 후속하여 ExPEC로 자극될 수 있으며 대상체 또는 대상체 세트에서 질환 (예를 들어, UTI)을 초래하는 ExPEC의 능력이 측정될 수 있다. 당업자는, 대조군으로 면역화된 대상체 또는 대상체 세트가 ExPEC로의 자극 후 질환으로부터 고통을 받으나 본원에 기술된 바이오컨주게이트(들) 또는 이의 조성물로 면역화된 대상체 또는 대상체 세트는 질환으로부터 덜 고통받거나 고통받지 않는 경우, 그러면 바이오컨주게이트는 대상체에서 면역 반응을 발생시킬 수 있음을 인지할 것이다. ExPEC로부터의 O 항원과 가교-반응하는 항혈청을 유도하는 본원에 기술된 바이오컨주게이트(들) 또는 이의 조성물의 능력은 예를 들어, 면역검정법 예컨대, ELISA에 의해 평가될 수 있다.
생체내 살균 검정
대상체에서 면역 반응을 발생시키는 본원에 기술된 바이오컨주게이트의 능력은 혈청 살균 검정법 (SBA) 또는 옵소닌식균작용성 치사 검정법 (OPK)을 사용하여 평가될 수 있으며, 이는 글리코컨주게이트-기반 백신의 허용을 획득하기 위해 이용되었던 확립되고 수용된 방법을 나타낸다. 이러한 검정법은 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 간단하게는 관심 표적에 대한 항체 (예를 들어, O 항원 예를 들어, E. 콜라이의 O25B)를 유발시키는 화합물을 대상체 (예를 들어, 마우스)에 투여함으로써 이러한 항체를 발생시키고 분리시키는 단계를 포함한다. 후속하여, 항체의 살균력은 예를 들어, 상기 항체 및 보체 및 - 검정법에 따라 - 호중성 세포의 존재하에 해당 박테리아 (예를 들어, 관련 혈청형의 E. 콜라이)를 배양하고, 예를 들어, 표준 미생물 접근법을 사용하여 박테리아를 치사하고/거나 중화시키는 항체의 능력을 검정함으로써 평가될 수 있다.
5.9 키트
본원에 기재된 조성물의 성분(섹션 5.6.2 참조) 중 하나 이상, 예를 들어, 본원에 제공된 하나 이상의 E. 콜라이 항원(섹션 5.2 참조) 및/또는 바이오컨주게이트(섹션 5.4 참조)로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트가 본원에 제공된다. 임의로 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 단속하는 정부 기관에 의해 규정되는 형태의 공고가 상기 용기(들)과 관련될 수 있으며, 이러한 공고는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매 기관에 의한 승인을 반영한다. 본원에 포함된 키트는 대상체의 치료 및 면역화의 상기 방법에서 이용될 수 있다.
6. 실시예
방법
응집
세포 또는 용해된 세포 덩어리가 중합체 구조, 예를 들어, O 항원에 특이적인 항체를 함유하는 항혈청과 혼합되는 과정. 항혈청이 세포 구조를 인지하는 경우 눈에 보이는 불용성 응집물을 형성한다. 이러한 방법은 O, K, 및 H 혈청형을 확인하기 위해 고전적으로 이용된다. 문헌[DebRoy, et al., (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185]을 참조한다.
SDS PAGE에 의한 분석을 위한 LPS 샘플 제조
그람-음성 세포의 LPS는 O 항원에 대한 부착을 제공하는 코어 올리고사카라이드로 변형된 지질 A 염기로 구성된다. 임상 분리물의 LPS를 분석하기 위해, 세포가 24시간 동안 37℃에서 표준 LB 배지에서 성장되고, 2의 OD600을 갖는 1 ml의 배양물에 해당하는 바이오매스가 수거되고, 1x Laemmli 샘플 완충액에서 용해되고, 10분 동안 95℃에서 인큐베이션되었다. 추출물은 65℃에서 1시간 동안 추가로 처리되어 1 g/l 프로테이나제 K를 이용하여 임의의 단백질 신호가 제거되었다. 처리된 추출물은 SDS PAGE에 의해 분리되었고, 적절한 항혈청을 이용한 실버 염색 또는 웨스턴 블로팅에 의해 LPS가 시각화되었다.
ELISA 플레이트의 코팅을 위한 LPS 제조
LPS는 문헌[Apicella, (2008) Methods Mol Biol 431, 3-13]에 기재된 방법을 이용하여 제조되고, 문헌[Perdomo and Montero, (2006) Biotecnologia Aplicada 23:124-129]에 기재된 바와 같이 추가로 정제되었다.
2AB OPS HPLC : ' LLO 핑거프린팅(fingerprinting)'
이러한 방법은 UPP 연결된 OPS의 구조를 분석하기 위해 이용된다.
UPP-연결된 글리칸을 추출하기 위해, E. 콜라이 세포가 0.9% NaCl로 세척되고, 동결건조되었다. 건조된 세포가 유기 용매(메탄올:물(M:W=17:3 내지 19:1, v/v), 및/또는 최적화된 비의 클로로포름:메탄올:물 혼합물(예를 들어, C:M:W = 10:10:3; v/v/v))로 추출되었다. 추출물은 N2의 기류 하에서 건조되고, C:M:W=3:48:47에 재현탁되었다. 추출된 당지질을 정제하기 위해, 3:48:47 재현탁액이 tC18 Sep-PAK 카트리지를 통해 통과되었다. 카트리지가 10 ml 메탄올로 컨디셔닝된 후, 10 ml의 3:48:47(C:M:W)로 평형화되었다. 샘플의 로딩 후, 카트리지가 10 ml의 3:48:47(C:M:W)로 세척되고, 5 ml의 메탄올 및 5 ml의 10:10:3(C:M:W)로 용리되었다. 조합된 용리액이 N2 하에서 건조되었다. 건조된 샘플을 2 ml의 n-프로판올:2 M 트리플루오로아세트산(1:1) 중에 용해시키고, 15분 동안 50℃로 가열한 후, N2 하에서 증발 건조시킴으로써 당지질 샘플이 가수분해되었다(Glover, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9). 건조된 샘플이 3:48:47에 한번 더 재현탁되고, tC18 카트리지를 통해 통과되고, 유통(flow through)이 N2 하에서 건조되었다. 2-AB를 이용한 표지화 및 글리칸 정화가 문헌[Bigge, et al., Anal Biochem 230(2): 229-38; Merry, et al., Anal Biochem 304(1): 91-9]에 기재된 바와 같은 종이 디스크 방법을 이용하여 수행되었다.
2-AB 표지된 글리칸이 문헌[Royle et al.]에 따르나, 3 용매 시스템으로 변형된(Royle, et al., Anal Biochem 304(1): 70-90) GlycoSep-N 정상상 컬럼을 이용한 HPLC에 의해 분리되었다. 용매 A는 80% 아세토니트릴 중 10 mM 암모늄 포르메이트 pH 4.4였다. 용매 B는 40% 아세토니트릴 중 30 mM 암모늄 포르메이트 pH 4.4였다. 용매 C는 0.5% 포름산이었다. 컬럼 온도는 30℃였고, 2-AB 표지된 글리칸은 형광(여기 λex = 330 nm, 방출 λem = 420 nm)에 의해 검출되었다. 구배 조건은 0.4 ml/분의 유량으로 160분에 걸쳐 100% A로부터 100% B 후, 유량을 1 ml/분으로 증가시키면서 2분의 100% B로부터 100% C로의 선형 구배였다. 컬럼은 100% C로 5분 동안 세척되고, 2분에 걸쳐 100% A로 복귀되고, 1 ml/분의 유량으로 100% A에서 15분 동안 이동된 후, 5분 동안 0.4 ml/분으로 유량이 복귀되었다. 샘플은 물 중에서 주입되었다.
탈아세틸화 검정:
당량의 2-AB 표지된 글리칸이 30℃에서 건조되고, 200 mM NaOH(pH 14)와 함께(샘플) 또는 200 mM NaOH(pH
Figure 112016092556323-pct00058
14) 없이(모의) 50 ㎕ 물에 재현탁되고, 37℃에서 25시간 동안 인큐베이션된다. 이후, 용액은 실온이 되고, 200 mM HCl 용액(pH
Figure 112016092556323-pct00059
1)의 첨가에 의해 중화된다. 30℃에서의 고속 진공에서의 건조 후, 샘플이 2AB로 재표지되고, HPLC에 의해 분석된다.
하이드라진분해 HPLC
상기 기재된 동일 정상상 HPLC 기술이 하이드라진분해 후에 바이오컨주게이트로부터 방출된 OPS를 분리시키기 위해 이용되었다. 하이드라진분해 전, 1 mg 단백질에 해당하는 바이오컨주게이트가 N2의 기류 하에서 완전히 건조되었다. 제조업체의 설명서에 따라 Ludger Liberate 하이드라진분해 글리칸 방출 키트(Ludger #LL-HYDRAZ-A2)를 이용하여 폴리사카라이드 방출이 수행되었다. 간단히, 450 ㎕ 하이드라진이 N2의 블랭킷(blanket) 하에서 건조된 샘플에 첨가되고, 85℃에서 16시간 동안 인큐베이션되었다. 45℃에서 N2 하에서의 증발에 의해 하이드라진이 제거되었다. 얼음 상에서 2시간 동안 1 M 소듐 바이카르보네이트 중 471 ㎕ 4.5% 아세트산 무수물에서의 인큐베이션에 의해 폴리사카라이드의 재-N-아세틸화가 수행되었다. 이후, 600 ㎕의 5% TFA 용액이 첨가되고, 샘플이 얼음 상에서 또 다른 시간 동안 가수분해되었다. 해당 완충액 EB20 A 및 B를 이용하여 EB20 컬럼 상에서 정제가 수행되었다.
방출되고 정제된 폴리사카라이드가 2-AB로 표지되고, LLO 샘플에 대해 기재된 것과 유사한 NP-HPLC에 의해 분석되었다. 관심 피크가 수거되고, MS/MS에 의해 확인되었다.
HPLC 피크의 MS 및 MS/MS
관심 OPS 분자의 모노사카라이드 서열을 분석하기 위해, 질량 분광 분석이 수행되었다. 특정 HPLC 피크에 해당하는 건조되고 수거된 분획이 5 ul 10% 아세토니트릴(ACN), 0.1% 트리플루오로 아세트산(TFA)에 재현탁되고, 표적 플레이트 상에서 매트릭스 용액(50%ACN 중 40mg/ml DHB, 0.1% TFA)과 1:1 혼합되었다. MS 및 MS/MS 데이터가 Ultraflex-II MALDI-ToF/ToF 질량분광계(Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany)에서 양성 이온 방식으로 수작업으로 획득되었다. MS/MS가 LIFT 방법을 이용하여 획득되었다. 외부 검량을 위해 표준 펩티드 혼합물(Bruker Daltonik GmbH)이 이용되었다. 스펙트럼이 Flex Analysis 소프트웨어(Bruker Daltonik GmbH)를 이용하여 내보내졌고, 수작업으로 분석되었다.
숙주 세포
플라스미드(들)을 통해 담체 단백질(들) 및 C. 제주니(C. jejuni)로부터의 올리고사카릴 전달효소(PglB), 및 코스미드 또는 염색체 삽입 돌연변이로부터 OPS를 발현하는 재조합 E. 콜라이 세포에 의해 바이오컨주게이트가 생성되었다.
유전학적으로 무독화된 EPA(돌연변이 L552V를 함유하는 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 외독소 A, ΔE553)가 담체 단백질로 이용되었고, 2 또는 4개의 당화 부위(각각 2S-EPA 및 4S-EPA로 본원에서 언급됨) 및 C-말단 HIS 태그를 포함하도록 변형되었고, pBR322 유래된 아라비노스 유도성 플라스미드로부터 발현되었다(Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61 참조).
천연 주변세포질 가용성 E. 콜라이 단백질인 MBP(말토스 결합 단백질)가 pGVXN579로부터 발현되었다. pGVXN579는 일렬로 3개의 박테리아 N 당화 컨센서스 서열에 이어 플라스미드 상에서 엔코딩된 말토스 결합 단백질 ORF에 C-말단 융합된 Myc-Tag를 엔코딩하는 변형된 pMAL-p2X(New England Biolabs) 플라스미드이다. 이러한 구성은 HIS-태그와 상관 없이 MBP 바이오컨주게이트의 친화성 정제를 가능케 하였다. 발현의 유도는 tac 프로모터에 의해 조절되고, IPTG를 이용하여 유도성이다.
PglB 단백질은 플라스미드 pEXT21(pMAF10로부터의 EcoRI/BamHI 단편)로부터 발현되었고(Feldman et al., 2005, PNAS USA 102(8):3016-3021), C-말단 융합된 HA-태그와 함께 pEXT21로 클로닝되었다. 발현 플라스미드의 변이체는 코돈 최적화(pGVXN939), 당화 부위의 결실을 갖는 코돈 최적화(pGVXN948), 및 HA-T태그 제거(pGVXN970) 및 코돈 최적화 및 HA 태그 결실(pGVXN971)을 갖는 변이체이다.
임상 분리물은 응집, 웨스턴 블롯, 실버 염색, LLO 핑거프린팅, PCR 혈청형분석, 또는 OPS 구조 특징의 확인을 가능케 하는 유사한 기술을 이용하여 특정 OPS를 합성하는 이들의 능력, 및 또한 이들의 항생제 내성 표현형에 대해 분석되었다. 단백질 당화 또는 OPS 분석에 대한 OPS 이용가능성을 향상시키기 위해 특정 임상 분리물은 리가제 효소 WaaL에 대해 추가로 염색체적으로 결실되었다.
임상 분리물을 추가로 분석하기 위해, 실험실 균주 W3110의 rfb 클러스터가 임상 분리물로부터 클로닝된 rfb 클러스터에 의해 대체되고, OPS 생합성이 분석되었다. 바이오컨주게이트 생성의 효율을 향상시키기 위해 waaL 유전자가 결실되었다.
최적화된 방법을 이용한 상동성 재조합(국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/068737호 참조) 또는 공개된 절차(Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645)에 의해 클러스터 교환 및 waaL 결실이 달성되었다. OPS 클러스터 교환을 위해, 임상 분리물의 관심 rfb 클러스터가 E. 콜라이 균주 W3110의 rfb 유전자좌로의 이후의 통합을 위해 항생제 내성 카세트와 함께 역선택 플라스미드 pDOC-C로 클로닝되었다(Kuhlman and Cox, 2010, Nucleic acids research 38, e92; Lee et al, 2009, BMC Microbiol 9, 252). 길이에 있어서 0.5 내지 1.5 킬로베이스의 W3110의 rfb 클러스터 코딩 서열에 측접하는 DNA 및 플라스미드 매개 rfb로부터의 삽입 DNA의 생체내 선형화를 이용하여 큰 관심 rfb 클러스터의 상동성 재조합이 달성되었다. 생성된 균주는 대체된 rfb 클러스터(항생제 내성 카세트를 갖고, 갖지 않음)를 함유하였고, 즉, W3110의 rfb 클러스터가 임상 E. 콜라이 분리물로부터 분리된 유사한 스트레치(stretch)에 의해 gale과 gnd 유전자 사이의 DNA 분자에 대해 대체되었다.
특정 실험에서, 제공된 E. 콜라이 혈청형의 rfb 클러스터를 엔코딩하는 코스미드를 함유하는 W3110 균주가 숙주 균주로 이용되었다.
W3110 기반 균주에서의 재조합적으로 발현된 바이오컨주게이트의 생성을 위해, 재조합 OPS 생성을 방해하는 W3110 매개 유전자가 결실되었다. 예를 들어, O25B 바이오컨주게이트의 생성 숙주 세포에 대해, W3110의 gtrABS 클러스터가 결실되었다. 이를 달성하기 위해, gtrA 유전자의 업스트림 및 gtrS 유전자의 다운스트림에 측접한 상동성 서열을 이용한 공개된 방법(Bloor AE, Cranenburgh RM. Appl Environ Microbiol. 2006 Apr;72(4):2520-5.)에 따라 상동성 재조합을 수행하였다.
생성 균주를 어셈블리시키기 위해, 숙주 균주가 형질전환에 의해 pglB 및 담체 발현 플라스미드로 형질전환되었다. 문헌[Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793]을 참조한다.
바이오컨주게이트 생성
숙주 세포를 성장시키고, 주변세포질에서 생성된 바이오컨주게이트를 정제함으로써 바이오컨주게이트 생성이 수행되었다. 성장은 진탕 플라스크 또는 산업 규모의 유가식 발효 과정으로 수행되었다.
5 mM MgCl2가 종종 보충된 테리픽 브로쓰(terrific broth) 중에서 적절한 항생제로 구성된 배지를 이용하여 37℃에서 진탕 플라스크 배양이 수행되었다. 배지에 새로이 형질전환된 생성 세포로부터의 밤새의 배양물이 0.05의 OD로 접종되었고, 중간-로그 단계까지 성장되었고, 0.2% 아라비노스 및 1mM IPTG로 유도되었고, 추가로 성장되고, 성장 20시간 후에 수거되었다.
유가식 발효
Soy LB 배지를 함유하는 진탕 플라스크에 적절한 항생제를 접종시키기 위해 생성 세포주 은행의 분취량이 이용되었다. 진탕 플라스크가 약 12시간 동안 180 rpm, 37℃에서 인큐베이션되었다. 보충물이 없는 배치 배지가 생물반응기 내부에서 직접 멸균(≥ 121℃에서 33분)되고, 냉각되고, 보충물이 첨가되었다. 4 M KOH 또는 25% 인산이 pH 조절을 위해 발효기에 부착되고, pH가 pH7로 조정되었다. 0.005의 최초 OD600를 생성시키기 위해 생물반응기 및 예비-배양으로부터의 배치 배양물의 접종이 수행되었다. 4 M KOH 또는 25% 인산의 첨가에 의해 pH가 안정적으로 유지되었다. 용존 산소 장력(DO)이 유지된다. 오버헤드 압력(Overhead pressure)이 600 mbar에서 유지되었다. 생성물 형성이 L-아라비노스(0.1%) 및/또는 IPTG(1 mM)로 유도되었다. 유도 직후, 2.5% 아라비노스 및 IPTG를 함유하는 공급 배지의 첨가에 의해 공급이 개시되었다. 유도 24±2시간 후, 생물반응기가 25℃로 냉각되고, 공급이 중지되고, 접선 유동 여과 또는 원심분리에 의해 수거가 수행되었다.
800 바(bar)에서의 고압 균일화의 4주기 동안의 분쇄에 의해 바이오매스가 0.5% Triton X-100에서 용해되었다.
바이오컨주게이트가 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 바이오컨주게이트를 제조하기 위해 다양한 크로마토그래피 기술, 주로, IMAC, Q-수지 기반 음이온 교환 크로마토그래피(AEC), 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)가 이용되었다. 예를 들어, 상기 방법의 설명에 대해 문헌[Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18)] 및 WO 2009/104074호를 참조한다.
전임상 실험을 위한 바이오컨주게이트 생성
예비-배양으로부터, 규정된 양을 35 ± 0.2℃에서 풍부한 배지를 함유하는 생물반응기로 옮겼다. pH 및 용존 산소 장력이 유지되었다. 진탕 속도가 700 rpm에 도달하였다.
세포 밀도가 OD600 = 40 ± 5에 도달한 경우, 생성물 형성이 L-아라비노스(0.1%) 및 IPTG(1 mM)로 유도되었다. 유도 24±2 시간 후 공급이 개시되고, 생물반응기가 냉각되었다. 온도가 25℃에 도달하자 마자, 공급이 중지되고, 세포가 수거되었다.
고압 균일화
수거시 50 L에 해당하는 바이오매스가 2 내지 8℃에서 1일 동안 해동되었다. 이후, 2.5L의 용해 및 정화 완충액이 용기에 첨가되었다. Triton X-100가 0.5%의 최종 농도로 첨가되고, 800 바에서의 고압 균일화의 4주기에 의해 완전히 해동된 세포가 분쇄되었다. 세포가 수거되고, 표준 기술을 이용하여 세척되었다.
모노사카라이드 조성 분석:
약 8 ug의 폴리사카라이드를 함유하는 바이오컨주게이트가 99℃에서 104 ㎕의 3 M TFA 중에서 6시간 동안 가수분해되었다. TFA가 증발에 의해 제거되고, 샘플이 500 ㎕의 2-프로판올로 1회 세척되었다. 생성된 모노사카라이드가 87.1 mg/ml의 1-페닐-3-메틸-5-피라졸론(PMP), 50% MeOH 및 150 mM NaOH를 함유하는 100 ㎕ 표지화 혼합물에 현탁되었다. 표지화가 70℃에서 60분 동안 수행되었다. 50 ㎕의 300 mM HCl 및 20 ㎕의 100 mM Tris/HCl pH 7.0의 첨가에 의해 샘플이 중화되었다. PMP-표지된 모노사카라이드가 1 ml의 디-부틸 에테르로 1회 및 1 ml의 CHCl3로 3회의 추출에 의해 정제되었다.
PMP 유도체화 모노사카라이드가 프리-컬럼(pre-column)이 장비된 C18 Inertsil ODS-3 컬럼(GL Sciences) 상에서 RP-HPLC(Merck-Hitachi)에 의해 분리되었다. 4분에 걸쳐 100% 완충액 A(13% 아세토니트릴, 87% H2O (0.045% KH2PO4, 0.05% 트리에틸아민, pH 7.0))으로부터 50% 완충액 A/50% 완충액 B(21% 아세토니트릴, 79% H2O (0.045% KH2PO4, 0.05% 트리에틸아민, pH 7.0)) 및 47분에 걸쳐 이로부터 100% 완충액 B로의 2-단계 구배가 35℃ 및 1 ml/분의 유량에서 적용되었다. 주입 부피는 50 ㎕였고, 용리는 250 nm에서의 온라인 UV-검출에 의해 모니터되었다. 개별적 피크가 상업적으로 이용가능한 모노사카라이드 표준 D-글루코스(Sigma-Aldrich #G7528), L-람노스(Sigma-Aldrich #R3875), N-아세틸-D-글루코사민(Sigma-Aldrich #A8625) 및 N-아세틸-L-푸코사민(Omicron Biochemicals #FUC-006)의 크로마토그램과의 중첩에 의해 확인되었다.
실시예 1: 역학
요로 감염(UTI)을 야기시키는 E. 콜라이의 혈청형 분포를 결정하기 위해, 역학 연구를 수행하였다. 1800개가 넘는 E. 콜라이 분리물 형태 인간 소변 샘플을 스위스의 대상체로부터 수거하고, 각각의 샘플로부터의 O 항원 혈청형(OPS)을 고전적 응집 기술을 이용하여 분석하였다. 도 4를 참조한다.
분리된 인간 소변 샘플을 분석하여 그 안의 병원체의 정체 및 이들의 항생제 내성 패턴을 결정하였다. E. 콜라이 분리물을 분석에 따라 샘플로부터 획득하였다. E. 콜라이 분리물을 크롬(chrome)(CPS3) 및 MacConkey 아가에서의 성장을 수반하는 고전적 미생물학적 배제 및 포함 전략에 의해 확인하였다. E. 콜라이 분리물을 이들의 O 항원 혈청형을 결정하기 위해 응집 검정을 이용하여 추가로 분석하였다. 문헌[DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185]을 참조한다. 동일한 O 항원 혈청군으로부터의 분리물을 추가로 분석하여 각각의 분리물로부터의 O 사슬의 화학 구조를 결정하였다. 표 1A를 참조한다. 특정한 분리된 E. 콜라이 균주는 플루오로퀴놀론-내성 균주 및 확장-스펙트럼 베타-락타마제(ESBL) 생성 균주의 확인을 포함하여 항생제 내성인 것으로 결정되었다.
표 1A: 2012년에 스위스에서 수거된 1841개의 소변 샘플의 수거로부터의 가장 흔한 UTI-관련 E. 콜라이 혈청형의 분포. 671명의 대상체의 관련 부분모집단으로부터의 샘플의 혈청형 분포, 및 모든** 샘플로부터의 분포가 제시된다.
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혈청형 O1, O2, O4, O6, O7, O8, O16, O18, O25, O73, 및 O75를 위치, 분리 시간, 증상, 및 표적 집단과 상관 없이 대상체로부터 분리하였고, 이는 이들이 요로병원성 E. 콜라이(UPEC)의 우세한 혈청형인 것을 암시한다. 따라서, 가장 우세한 O 항원 혈청형의 확인은 O-항원 특이적 백신이 본 실시예에 기재된 연구에서 확인된 바와 같이 혈청형의 부분 집합, 즉, 질병과 가장 관련된 것으로 제한될 수 있음을 나타낸다.
E. 콜라이 참조 센터(ECRC)로부터 획득된 미국에서 과거 30년으로부터의 1323개의 분리물에서의 UTI 혈청형의 후향 분석은 문헌 및 스위스로부터의 현재 데이터에 대한 충분한 비교를 가능케 하였다. 상위 20개의 혈청형의 우세가 위치, 분리 시간, 증상, 또는 표적 집단과 독립적으로 발견되었고, 이는 UPEC와 관련된 우세한 혈청형을 암시한다(표 1B 참조).
표 1B: 1987-2011 범위의 문헌 및 2000-2011로부터의 후향적으로 분석된 US 데이터(ECRC)로부터의 가장 흔한 UTI 관련 혈청형의 우세.
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기재된 혈청형으로부터의 분리물을 분리물의 전체 수에 대한 백분율로 계산하였다(Andreu et al., 1997, J Infect Dis 176:464-469; Blanco et al., 1996, Eur J Epidemiol 12:191-198; Fathollahi et al., 2009, Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81; Johnson et al., 2005, J Clin Microbiol 43:6064-6072; Molina-Lopez et al., 2011, Journal of infection in developing countries 5:840-849; Sandberg et al., 1988, J Clin Microbiol 26:1471-1476; K. L. 2007, The Journal of infection 55:8-18; Terai et al., 1997, Int J Urol 4:289-294.). 특정 경우에, 특정 데이터가 이용가능하지 않았고, 따라서, 백분율 수는 단지 연구에 기재된 다양한 UTI 분리물로부터의 전체 혈청형 분포에 대한 지표만 제공할 수 있으며, 주의와 함께 고려되어야 한다. 그러나, 덜 우세한 것으로 확인된 다른 기재된 혈청형(O15, O20, O21, O22, O77 및 O82)이 또한 포함된다.
역학 분석으로부터의 모든 정보와 함께, 10개의 우세한 혈청형은 E. 콜라이 감염의 추정된 60-80%를 포함할 수 있으며, 이는 유형 분류할 수 없는 균주의 하위부분의 포함을 추정한다. 또한, 데이터는 문헌 데이터 및 USA로부터의 최근의 데이터와 비교하는 경우 스위스로부터의 역학 연구에서의 O25 혈청형의 예기치 않은 중요성을 나타낸다. 표 1A 및 B를 참조한다.
E. 콜라이의 O 항원 혈청형은 종종 별개이나, 구조적 및 항원적으로 유사한 서브타입으로 구성된다. 수거된 임상 분리물 중에서 공지되지 않고/보고되지 않은 서브타입을 확인하고, 가장 우세한 O 항원 서브타입을 확인하기 위해, 가장 우세한 서브타입으로부터의 O 항원의 화학 구조를 더욱 상세히 분석하였다.
실시예 2: E. 콜라이 O25
최근 수년간, O25-양성 균주의 증가된 발생이 관찰되었고(George and Manges (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690 참조), 이는 실시예 1에 기재된 연구에 의해 입증되며, 여기서 O25 혈청형이 유병률과 관련하여 상위 4개의 E. 콜라이 혈청형 중 하나인 것으로 발견되었다.
O25A
E. 콜라이 O25 혈청형의 O 항원 반복 단위 구조가 이전에 공개되었고(Kenne et al., 1983, Carbohydrate Research 122, 249-256; 및 Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4 참조), 도 2B에 제시된다. E. 콜라이 균주 E47a로부터의 O25 O 항원과 관련된 rfb 클러스터는 공적으로 이용 가능하며(GenBank GU014554), 도 2A에 제시된다. E. 콜라이 E47a는 O25 혈청형분석을 위한 참조 균주로 사용된다. 추가의 rfb 클러스터 서열 정보가 무증상 세균노를 야기시키는 균주인 E. 콜라이 83972의 유전체 서열로부터 이용 가능하다(Zdziarskiet al., 2010, PLoS Pathog 6, e1001078 참조). 표현형적 O25 발현이 확인되지 않았으나, E. 콜라이 E47a 및 83972의 rfb 클러스터 서열은 99.49% 동일하며, 이는 이들이 동일한 O 항원을 엔코딩하는 것을 강하게 암시한다.
E. 콜라이 균주 83972 및 E47a로부터의 O 항원은 "O25A"로서 본원에서 명명되는데, 이는 하기 기재되는 바와 같이 "O25B"로 명명된 신규한 E. 콜라이 O 항원이 상기 실시예 1에 기재된 역학 연구에서 획득된 임상 분리물의 분석을 기초로 하여 확인되었기 때문이다.
E. 콜라이 균주 83972 및 E47a의 예측 유전자 생성물에 대한 기능성이 제안된 적이 있다. 표 2; GenBank GU014554; 및 문헌[Szijarto, et al. (2012) FEMS Microbiol Lett 332, 131-136]를 참조한다.
표 2. 문헌[Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074]에 의해 공개된 바와 같은 rfb 클러스터로부터의 O25A O 항원 유전자 예측; 또한 GenBank GU014554를 참조한다.
Figure 112016092556323-pct00062
Figure 112016092556323-pct00063
구조 및 유전자 클러스터의 비교는 O25A OPS의 어셈블리에 필요한 모든 기능이 galE와 gnd 사이에 위치된 rfb 클러스터 내에서 엔코딩되는 것을 암시한다. rfb 유전자 클러스터의 다양한 효소의 기능(도 2A 참조)은 하기와 같다:
RmlBDAC는 OPS 반복 단위에 대한 L-Rha 가지의 첨가를 위한 기질인 dTDP-L-람노스의 생합성에 필요한 효소를 엔코딩한다.
FnlABC는 O25 OPS 반복에 대한 L-FucNAc의 첨가를 위한 공여체 기질인 UDP-L-FucNAc의 생합성에 필요한 효소를 엔코딩한다.
WekABC 및 wbuBC는 상동성 분석에 따른 글리코실전달효소이다. 그러나, wbuC는 짧고 트렁케이션된 것으로 보이며, 기능성일 가능성이 없다. 따라서, 가장 가능성 있는 기능성 주석은 반복 단위의 어셈블리를 위한 4개의 결합을 발생시키는 4개의 글리코실전달효소가 존재하는 것을 나타낸다.
Wzx 및 Wzy는 주변세포질으로의 BRU의 플리핑(flipping) 및 이들의 Und-PP에 대한 중합에 필요하다.
공개된 O25A 반복 단위 구조를 합성하는데 필요한 모든 기능은 E. 콜라이 E47a 및 83972 rfb 클러스터에 의해 엔코딩된다. 따라서, rfb 클러스터가 O25A OPS 엔코딩을 담당하는 것으로 결론 내려졌다.
O25B
2009년에, 스페인 병원 환경으로부터의 임상 E. 콜라이 분리물을 특성 규명하여 클론 그룹을 결정하였다. 문헌[Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141]을 참조한다. a) ESBL 타입, b) O 혈청형, c) 독력 유전자, d) 다중유전자좌 서열 유형분석(MLST), 및 e) 펄스 필드 젤 전기영동 유형분석(PFGE)의 특성규명을 수행하였다. 결과는 모든 분리물의 약 20%가 동일 클론에 기인될 수 있음을 나타내었다: 독력 유전자의 특정 세트를 엔코딩하는, 혈청형 및 MLST O25:H4 ST131, ESBL 타입 CTX-M15, Phylogroup B2. 대표적 임상 분리물의 rfb 클러스터 성분의 분석은 E47a 균주, 및 또한 대립유전자 특이적 PCR 유형분석 방법에 의해 확인된 임상 분리물로부터의 유형분석 균주 서열과 비교하는 경우 공지되지 않은 3' 서열을 나타내었다(Clermont et al., 2008, J Antimicrob Chemother. 61(5):1024-8.; Clermont et al., Diagn. Microbiol Infect Dis. 2007, 57(2):129-36.; 및 Li, et al., 2010, J Microbiol Methods 82, 71-77 참조). 2013년에, 문헌[Phan et al.]에서 클론 O25b:H4 ST131의 유전체 서열을 공개하였고, 이는 상기 클론이 이전에 보고된 바와 같이 이의 waa 유전자 클러스터의 구조와 일치하는 K-12 유도체임을 입증한다. 문헌[Phan et al., 2013, PLOS Genetics 9(10):1-18 (e1003834)]을 참조한다. 이와 함께, 상기 데이터는 신규한 O25 응집 클론이 병원 환경으로부터 분리된 E. 콜라이에서 출현하였고, 상기 클론이 특정한 ESBL, MLST, 및 PFGE 표현형을 갖고, 변경된 O 항원 유전자 클러스터를 함유한 것을 암시한다.
PCR 유형분석
O25B 혈청형이 실시예 1에 기재된 역학 연구에서 확인된 분리된 E. 콜라이 균주 중에서 존재하는지 결정하기 위해, O25 응집 양성 균주를 O25 및 O25B에 대한 유형분석 PCR에 의해 분석하였다. PCR을 주형 DNA 공급원으로서 페트리 접시로부터 채집된 콜로니 및 다양한 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 이용하여 수행하였다. E47a O25 wzy의 증폭을 기초로 하고, 문헌[Li, et al. (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77]에 기재된 O25-특이적 프라이머를 이용하였다. 또한 이용된 것은 O25b rfb 클러스터(LNB220)의 규정되지 않은 3' 부분에 특이적인 문헌[Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141]에 기재된 O25B-특이적 프라이머였다. 문헌[Phan et al., 2013]에 따르면, 이러한 O25B 특이적 올리고뉴클레오타이드 쌍은 O25B rfb 클러스터의 3' 부분에서 어닐링된다.
O25 응집 양성 표현형을 갖는 24개의 시험된 임상 분리물 중에서, 20개가 PCR 유형분석에 의해 O25B 혈청형으로 지정된 반면, 나머지 4개는 PCR 유형분석에 의해 O25A 혈청형에 속하는 것으로 양성으로 확인되었다. 따라서, 놀랍게도, O25B 혈청형의 균주는 O25A 혈청형의 균주보다 분석된 균주 중에서 더욱 빈번한 것으로 결정되었다.
클러스터 시퀀싱
O25B rfb 클러스터를 유전학적으로 분석하기 위해, "upec138"로 명명된 O25B PCR-양성 균주의 클러스터가 시퀀싱되었다. 확인된 유전자 및 제시된 명명법과 함께 이들의 가장 가까운 관련 단백질 동족체가 하기 표 3에 나열된다. O25B에 특이적이고 O25A에 부재하는 유전자가 별표로 표시된다.
표 3. rfb 클러스터로부터의 O25B O 항원 유전자 예측.
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클러스터 조성물 rfb는 O25A 클러스터의 조성과 명백한 차이를 나타낸다. 클러스터의 5' 부분 내의 유전자는 서로 가까운 동족체이다(rmlD 대 wzy; E. 콜라이 E47a 및 83972). 이는 L-람노스를 합성하는 많은 E. 콜라이 균주에서 상동성인 rml 유전자에 대해 놀라운 것이 아니다. O25A 및 B의 유전자 생성물의 상동성은 단백질 서열의 비관련성을 나타내는 25% 동일성 아래의 수준으로 하락하기 전에 wekC(O25A) 유전자에 도달한다. 도 3B를 참조한다. 또한, 2개의 글리코실전달효소가 fnlABC의 하류에 존재함에 따라 O25A의 UDP-N-아세틸푸코사민 생합성 유전자가 균주 upec138(O25B)에 부재하는 것으로 밝혀졌다. 도 3B를 참조한다. 종합하면, 이러한 데이터는 L-FucNAc 생합성 유전자가 rfb 클러스터 외부에서 엔코딩될 수 있음을 예외로 하고 O25B 균주가 UDP-L-FucNAc를 합성할 수 없음을 암시한다. 그러나, L-FucNAc가 O 항원의 BRU 내에 존재하는 경우 rfb 클러스터 외부의 fnlABC 유전자좌에 대해 보고된 단일 경우가 존재하지 않는다. 따라서, 균주 138이 공개된 O25A 기본 반복 단위(BRU)를 합성할 수 있을 가능성이 없다.
혈청형 O25A의 rfb 클러스터에 존재하지 않는 O25B rfb 클러스터에서 확인된 유전자는 2개의 글리코실전달효소 및 O-아세틸전달효소를 엔코딩한다. 이들 3개의 유전자는 동일한 구성을 공유하며, 엔코딩된 단백질은 O16 rfb 클러스터 유전형의 E. 콜라이의 K-12 균주에서 발견되고 특성 규명된 wbbJKL 유전자와 높은 상동성을 갖는다. 도 3B를 참조한다. O25B와 O16 혈청형 사이의 유전적 관련성에 따라, O16 rfb 유전자, wbbJKL의 명명법이 O25B rfb 클러스터에서 확인된 상동성 유전자에 적용되었다.
O16 BRU의 구조는 공지되어 있고, wbbJKL의 유전자 기능이 결정되었다. 문헌[Steveneson et al., (1994) J Bacteriol. 176(13):4144-56]을 참조한다. WbbJKL은 L-람노스의 아세틸화, L-Rha-D-Glc-UndPP로의 D-Glc 잔기의 전달, 및 ECA 클러스터로부터의 wecA에 의해 형성되는 D-GlcNAc-UPP로의 L-Rha의 전달을 담당한다. O16 WbbJKL와의 상동성, 및 O16 WbbJKL의 공지된 기능을 기초로 하여, O25B rfb 클러스터가 부분적으로 O16 및 부분적으로 O25A 요소를 함께 함유하는 구조를 합성하는 것으로 추론되었다. WbbJKLO25B가 WbbJKLO16과 동일한 구조, 즉, α-D-Glc-1,3-α-L-Rha(2Ac)-1,3-α-D-GlcNAc를 합성할 가능성이 높은 것으로 추론되었다. 이러한 트리사카라이드 구조는 L-Rha(2Ac)가 L-FucNAc를 대체하는 것만을 예외로 하고는 O25A의 분지되지 않은 '코어' 백본과 동일하다. 따라서, 대체는 D-FucNAc 및 L-RhaOAc가 둘 모두 6-데옥시 및 2-아세틸 기능을 갖는 모노사카라이드임에 따라 보존성 대체일 것이다. 푸코스가 갈락토스와 관련되고, 람노스는 만노스와 관련되어, 위치 3에서 OH 기 및 위치 5에서 메틸기의 상이한 배향을 발생시킴에 따라 유일한 차이는 입체형태이다. 모노사카라이드 사이의 연결은 동일(모두 α-1,3)할 것인데, 이는 상기 구조가 형태 및 화학적 특징에 있어서 유사함을 나타낸다. 유사하게, O25A 및 B rfb 클러스터(rmlDCAB 및 wekAB)의 업스트림 부분에서 엔코딩된 단백질은 어느 하나의 '코어' 백본 트리사카라이드에 대한 분지하는 D-Glc 및 L-Rha의 부착에 의해 O25A 또는 B의 BRU를 분지시킨다. 이는 이들이 기질로서 어느 하나의 백본(L-FucNAc 또는 L-Rha(2Ac)를 가짐)을 수용하는 것을 의미한다.
O25B BRU의 환원 말단으로부터의 두번째 모노사카라이드로서의 L-Rha의 존재는 L-FucNAc 생합성이 O25B에 부재할 수 있는 이유를 설명한다. UDP-L-FucNAc는 필요하지 않은데, 이는 이것이 클러스터(rmlDBAC)의 5' 말단에 존재하는 dTDP-L-Rha 생합성 유전자에 의해 대체되기 때문이다.
문헌[Phan et al., 2013]에서 O25B 임상 분리물에 대해 유사한 유전적 분석을 수행하였으나, 상이하게 결론내렸다. 이들은 또한 UDP-FucNAc 생합성 유전자 클러스터를 찾기 위해 전체 유전체를 시퀀싱하였으나, 이들은 균주 O25B:H4 ST131 EC958에서의 UDP-L-FucNAc에 대한 기구가 O25B rfb 클러스터 뿐만 아니라 전체 균주에서 존재하지 않는 것으로 언급한다. 그러나, 판(Phan)은 UDP-L-FucNAc가 다양한 방식으로 합성되어야 하는 것으로 결론내렸는데, 여기서 O25B:H4 ST131 EC958이 E47a와 동일한 O 항원 구조, 즉, O25A를 만드는 것으로 추정한다. 대신, 가장 가능성 있는 시나리오는 O25B 균주가 L-FucNAc를 제조할 수 없으나, 대신 O-아세틸화된 L-람노스 잔기를 갖는 BRU의 두번째 잔기를 대체하고, 상기 변화에 필요한 유전자가 rfb 클러스터에서만 엔코딩된다는 것이 본원에서 개시된다.
또한, O25B 클러스터 내의 O-아세틸 전달효소 동족체의 존재는 O25A에서 부재하는 변형인 O25B BRU에서의 O-아세틸화를 암시한다. 따라서, 혈청형 O25A 및 O25B로부터의 O25 항원의 구조가 상이해야 한 것으로 결론내려졌다.
O25B 구조 분석
다양한 O25 항원 구조의 가설을 확인하기 위해, 실시예 1에 기재된 O25 임상 분리물의 O 항원의 화학적 조성 및 배열을 분석하였다. O25 OPS 구조를 더욱 상세히 특성규명하기 위해, 여러 방법을 이용하였다.
첫째로, O 항원 구조를 SDS PAGE에 의해 분석하였다. 임상 분리물로부터의 리포폴리사카라이드(LPS)를 SDS PAGE 후에 다양한 염색 방법을 이용하여 전기영동 이동성에서의 차이에 대해 분석하였다. LPS 양을 시각화시키기 위해, 실버 염색 및 항-O25 특이적 웨스턴 블롯을 수행하였다. 10개의 분리물의 분석의 결과를 도시하는 도 5를 참조한다. 데이터는 유사한 신호 강도가 다양한 LPS 제조물의 실버 염색에 의해 획득되는 것을 나타낸다. 대조적으로, 특정 항혈청을 이용한 프로빙은 10개의 샘플 중 3개(분리물 upec436, upec767, upec827)에서 더 강한 시호 강도를 나타내었다. 다양한 신호 강도가 OPS의 구조에서의 차이로 인해 발생한 것으로 생각되었다.
O25B 구조를 상세히 설명하기 위해, 다양한 분석 방법을 적용시켰다. 임상 분리물 upec138은 PCR에 의해 O25B에 대해 양성이었고, O25A 균주보다 O25 응집 항혈청에 의해 더 약한 인지를 나타낸다. 도 5를 참조한다. 또한, 균주는 ESBL이나, FOS, IPM, 및 TZP에 민감하고, AM, CXM, NOR, 및 CIP에 내성이다. 또 다른 임상 분리물인 균주 upec436은 PCR에 의해 O25B에 대해 음성이었으나, PCR에 의해 일반 O25(O25A)에 대해 양성이었다. upec436은 또한 이의 LPS가 웨스턴 블로팅에 의해 분석되는 경우 O25 응집 항혈청과 강하게 반응성인 것으로 밝혀졌다. 도 5를 참조한다. 둘 모두의 균주로부터의 LLO를 추출하고, 2AB로 표지하고, 정상상 HPLC에 의해 분석하였다. 도 6을 참조한다(upec138 및 upec436의 LLO, 9.079 및 9.081). 용리 패턴은 2개의 추출물 사이에 명백한 차이를 나타내었다. 균주 특이적 피크의 MS/MS 분석은 예상된 BRU 구조와 양립되는 신호를 검출하였다.
균주 upec436에서의 신호(9.081): 62' 용리 시간에서의 피크를 MS에 의해 분석하고, 주요 질량으로서 m/z=1021 Da를 갖는 분자, 즉, 완전한 O25A OPS BRU의 예상 질량에 해당하는 분자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. MS/MS는 O25A의 모노사카라이드 서열과 일치하는 단편화 패턴을 발생시켰다(도 7A; m/z=1021의 MS/MS).
균주 upec138에서의 신호: 50' 용리 시간에서의 피크의 주요 질량은 m/z 1022 Da, 즉, 완전한 O25A 반복 단위보다 1 Da 더큰 Da였다. MS/MS 분석(도 7B; O25B MS/MS)은 O25A 반복 단위와 거의 동일한 단편화 거동을 나타내었고, 환원 말단으로부터의 2nd 모노사카라이드와 1 Da 차이로 국소화되었다(O25A MS/MS에서의 m/z=551, 및 균주 upec138에서의 m/z=552의 단편화 Y 이온에 의해 확인됨). 60'에서 용리되는 추가 피크는 유사한 단편화를 나타내었으나, 동일 모노사카라이드(m/z=510)로 국소화된 모(mother) 이온 질량(m/z=980), 즉, 환원 말단으로부터 두번째 것에서 42 Da 차이를 나타내었다. 이들 결과의 해석은 하기에 제공된다.
OPS 추출, 가수분해 및 2AB 표지화 절차는 OPS로부터 Und-PP를 제거하기 위한 산 처리를 수반한다. 상기 처리 조건은 부분적으로 O-아세틸화를 제거하나, N-아세틸화를 제거하지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 60'에서의 피크는 50' 피크에서의 물질의 화학적 가수분해로부터 출현한 탈아세틸화된 BRU 질량일 가능성이 있다. 종합하면, 이러한 데이터는 O25A의 L-FucNAc에서 N-아세틸화가 존재함에 따라 동일 모노사카라이드 위치에서 O25B에 O-아세틸화가 존재하는 것을 나타낸다.
환원 말단으로부터의 두번째 잔기에서의 아세틸화가 O-연결되는 것을 화학적으로 확인하기 위해, 탈아세틸화 검정을 수행하였다. 50' 용리 시간에서의 2AB LLO HPLC로부터의 O25B 특이적 피크가 O25B PCR 양성 균주로부터 수거되었고, '방법'에 기재된 알칼리로 처리하였다. HPLC에 의한 재분석은 O-아세틸기가 손실된 O25B BRU와 일치하는 MS/MS 단편화 이온 패턴과 함께 m/z=979의 주요 질량을 함유하는 도 6으로부터의 O25B 피크에서 확인된 바와 같은 60' 용리 시간에서의 피크를 발생시켰다. N-아세틸기는 동일 분자 내의 환원 말단 D-GlcNAc 내의 나머지 N-아세틸기에 의해 제시된 바와 같이 알칼리 처리에 대해 안정적이다.
결론으로서, O25B 대표 균주 upec138가 구조적 및 유전적으로 E. 콜라이로부터의 O25A 및 O16 OPS와 관련(도 3A 및 B)된 것으로 결정되었다. O25B는 L-Rha 잔기이고, D-FucNAc가 아닌 반복 단위의 두번째 모노사카라이드에서 N-아세틸기 대신 O-아세틸기를 함유하는 반복 단위 구조를 갖는 점에서 O25A와 상이하다. 이들 변화는 2개의 글리코실전달효소 및 O-아세틸전달효소를 엔코딩하는 DNA 스트레치에 의한 UDP-FucNAc 생합성 기구 및 D-FucNAc 전달효소의 대체에 의해 야기될 가능성이 가장 높았다. 이들 유전자는 상동성 및 기능성 분석을 기초로 하여 O16 유전자 클러스터와 관련된다. 최종 구조는 상이하나 유사하며, 이는 O25 응집 항혈청으로 관찰된 교차반응성을 설명한다.
상기 논의된 바와 같이, O25A OPS가 L-FucNAc를 함유하는 반면, 상기 구조는 O25B에서 부재하는 것이 rfb 클러스터의 분석을 기초로 하여 결론내려지고 제안되었다. FucNAc가 O25B에서 부재하는지 연구하기 위해, O25A 및 O25B 균주에서 생성된 EPA 바이오컨주게이트의 모노사카라이드 조성 분석을 상기 기재된 PMP 표지화 방법 및 HPLC 분석 방법을 이용하여 수행하였다(도 9). 바이오컨주게이트를 생성시키기 위해, O25A 및 O25B 표현형을 갖는 임상 E. 콜라이 분리물을 제조하고, 최적 바이오컨주게이트 생성을 위해 변형시켰다. 변형의 일부로서, 균주 upec_436(O25A) 및 uepc_138(O25B)로부터의 waaL 유전자를 코어 타입 결정을 위한 방법(Amor, et al., (2000) Infect Immun 68, 1116-1124 참조)에 의해 알려진 이전에 기재된 바(Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645 참조)와 같이 결실시켰다. 결과로서 발생된 균주를 O25A 생성을 위해 4S-EPA(pGVXN659) 및 올리고사카릴 전달효소, PglB(pGVXN939)에 대한 발현 플라스미드; 및 O25B 바이오컨주게이트 생성물의 생성을 위해 pGVXN114 및 pGVXN539(2S-EPA를 생성함)로 형질전환시켰다. O25B 바이오컨주게이트를 IMAC에 의해 주변세포질 추출물로부터의 이후의 친화성 정제와 함께 2L 진탕 플라스크에서 생성시켰다. O25A 컨주게이트를 유가식 발효에 의해 생성시키고, 상기 방법 섹션에 기재된 바와 같이 고압 균일화에 의해 생성된 정화된 전체 세포 균질액으로부터 시작하는 2-단계 정제 절차에 의해 정제하였다. 모노사카라이드 조성 분석을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다.
결과는 O25B-유래 바이오컨주게이트에서의 FucNAc에 대한 신호의 부재를 확인한 반면, O25A-함유 바이오컨주게이트는 대조군으로서 동일 샘플 처리 절차에 모노사카라이드의 혼합물을 적용시킴으로써 결정시 예상 용리 시간에서 피크를 나타내었다. 따라서, O25B의 추정 구조가 rfb 클러스터의 분석을 기초로 하여 예상된 바와 같이 L-FucNAc-less인 것으로 확인되었다.
에스체리치아 콜라이(Escherichia coli) O25B O-항원으로부터의 O-항원 폴리사카라이드(O-PS)의 반복 단위(RU)의 완전한 구조를 EPA 담체 단백질 모이어티의 부분적 효소 분해 후에 바이오컨주게이트의 핵 자기 공명에 의해 결정하였다. 분석은 O25B O-PS가 펜타사카라이드 RU로 구성된 것을 확인하였다. 1H 및 13C 신호를 2D NMR 상관 관계 기술에 의해 지정하였으며, 이는 O25B O-PS RU의 구조가 α-3-Rhap 잔기에 의한 α-3-FucpNAc 잔기의 치환에 의해 공개된 O25A O-PS RU 구조(Kenne, L., et al. 1983. Carbohydr. Res. 122:249-256; Fundin, J., et al. 2003. Magn. Reson. Chem. 41:202-205)와 상이하며, 상기 잔기의 90% 초과가 C2 위치에서 O-아세틸화된 것을 확인하였다. 완전한 O25B O-PS RU가 하기에 제시된다(O25B'):
Figure 112016092556323-pct00066
.
바이오컨주게이트 생성 및 특성규명
O25A 및 O25B 폴리사카라이드 항원을 추가로 분석하기 위해, 더 많은 바이오컨주게이트 물질을 생성시켰다. O25A에 대해, 상기로부터의 O25A-EPA의 정제된 배치를 추가 특성규명 실험에 이용하였다. O25B-EPA 생성을 위해, 유전체학적으로 통합된 O25B 클러스터를 갖는 균주를 작제하였다: 플라스미드 pGVXN1076 및 pGVXN970을 갖는 W3110 ΔwaaL ΔgtrABS ΔrfbO16::rfb(upec138). 이러한 균주를 다첸코 및 워너(Datsenko and Wanner)의 방법 및 박테리아 염색체로의 큰 삽입물의 부위 특이적 통합을 위한 상동성 재조합 기술에 의해 W3110로부터 시작하여 작제하였다(국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/071328호 참조).
생성된 O25B 바이어컨주게이트를 표준 방출 및 특성규명 검정을 이용하여 특성규명하였다. 바이오컨주게이트를 2개의 연속적 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피 단계를 이용하여 정제하여, 각각 97.2 및 98.1%의 순수한 O25A 및 O25B 바이오컨주게이트 제조물을 생성시켰다. 분석물을 정제하기 위해 SDS PAGE 정량을 이용하였다. 도 10(O25A) 및 도 11(O25B)을 참조한다. 당 대 단백질 비를 안트론 검정(Laurentin and Edwards, (2003) Anal Biochem 315, 143-145 참조) 및 단백질 농도에 대한 BCA 검정에 의해 당 정량을 기초로 하여 계산하여 O25A 및 O25B 바이오컨주게이트에 대해 40.2 및 26.6%를 생성시켰다. 분석 크기 배제 크로마토그래피는 부착된 글리칸 사슬을 갖는 EPA의 예상 유체역학적 반경과 일치하는 입자의 단량체 상태를 나타내었다.
적용
O25B 구조의 면역원성 잠재성을 교시하기 위해, O25B 및 O25A 바이오컨주게이트를 이용한 여러 전임상 실험을 수행하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 실시예 1에서 O25 양성으로 확인된 모든 임상 분리물(즉, O25A 및 O25B 분리물 둘 모두)은 웨스턴 블롯에서 O25 혈청형을 검출하기 위해 일반적으로 사용되는 O25A 항혈청(O25A 균주 E47a로부터의 유형분석 혈청)을 이용하여 양성이었다. 따라서, 항 O25A 항혈청은 O25B 균주로부터의 LPS에 대해 교차반응성인 것으로 보인다. 항체 반응 및 교차반응성을 상세히 분석하기 위해, O25 바이오컨주게이트를 생성시켰다. 말토스 결합 단백질(MBP)을 담체 단백질로 사용하였고, 담체 단백질을 O25A 또는 O25B에 연결시켰다. 표 4는 단백질 생성을 위해 사용된 균주를 도시한다. 사용된 균주를 이들의 O25A 또는 B 유전형에 대해 PCR에 의해 확인하였다. 발현을 TB 배지 및 주변세포질 추출물로부터 정제된 단백질 생성물에서 수행하였다.
표 4:
Figure 112016092556323-pct00067
획득된 바이오컨주게이트를 이용한 면역화를 표준 토끼 면역화 프로토콜(eurogentech 28일 급속 프로토콜)을 이용하여 수행하였다. MBP에 결합된 50 ㎍의 폴리사카라이드를 전매의 프로인트 자유 면역자극성 화합물과 함께 0, 7, 8, 및 18일에 주입하였다. 첫번째 면역화 28일 후에 획득된 생성된 최종 채혈 항혈청을 O25A 또는 O25B LPS에 대한 이들의 특이성에 대해 시험하였다. 도 22는 각각의 LPS(O25A 또는 O25B)에 대한 항혈청 반응성의 비교를 제시한다. LPS를 SDS-PAGE Laemmli 완충액 중에서의 전체 세포 샘플의 프로테이나제 K 분해에 의해 upec436 및 upec138로부터 제조하였다. 동일량의 LPS를 2개의 SDS-PAGE 젤에 로딩한 후, 니트로셀룰로스 막으로 전기전달하고, O25A 및 O25B 항혈청을 이용하여 검출하였다. 결과는 O25A 항혈청이 O25B LPS보다 O25A LPS를 더 잘 인지하는 한편, O25B 항혈청은 O25A LPS보다 O25B LPS를 더 잘 인지하는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 자가 항원이 더 나은 항원을 제조하는 것을 나타낸다. 따라서, 백신으로의 O25B 항원의 포함은 O25A 항원보다 O25 그룹의 우세한 O25B 임상 균주에 대한 더 나은 보호를 제공할 것이다.
실시예 3: E. 콜라이 O1
구조적 데이터베이스는 E. 콜라이 O1에 대한 다양한 하위혈청형 구조를 목록화한다. 특히, O1A, O1A1, O1B, O1C. O1A 및 O1A1은 구조적으로 동일하고, 질병과 관련된 것으로 생각되나, O1B 및 C는 병원성인 것으로 보고되지 않았고(Gupta, et al., (1992) J Bacteriol 174, 7963-7970 참조), O1 분리물 중에서 소수이다. O1A/O1A1, O1B, 및 O1C의 구조가 도 12B에 제시된다. 실시예 1의 UPEC 역학 연구에서 O1 하위혈청형 분포를 분석하기 위해, 연구로부터의 여러 임상 분리물의 O 항원 구조를 상세히 분석하였다. 첫째로, 응집 검정에 의해 O1에 대해 양성인 것으로 결정된 12개의 균주의 LPS 구조를 SDS PAGE에 의해 분석하였다. 도 13: O1 실버 염색 및 웨스턴 블롯을 참조한다.
실버 염색은 O1 임상 분리물로부터의 추출물을 함유하는 모든 레인에서 통상적인 LPS 신호를 나타내었다. 약 10-15 kDa의 전기영동 이동성에서의 강한 염색은 지질 A 코어를 도시하며, 더 느린 이동성을 갖는 래더 유사 신호는 다양한 수의 O 항원 반복 단위로 구성된 탄수화물 중합체로 변형된 지질 A 코어이다. 다양한 분리물로부터의 LPS가 비교되는 경우, 형태상의 길이 분포, 개별적 밴드의 전기영동 이동성, 및 래더 패턴에서 차이가 보인다. 이들 관찰을 기초로 하여, 3개의 그룹이 확인될 수 있다: (i) 대부분의 분리물(upec002, upec010, upec032, upec140, upec108, upec143, upec276, upec399, 및 upec425)은 신호 강도 및 평균 사슬 길이에서만 상이한 개별적 밴드의 구별할 수 없는 전기영동 이동성을 나타내었고(형태상의 길이 분포); (ii) 2개의 분리물(upec119 및 upec256)은 모든 반복 단위 LPS 밴드에서 약간 더 빠른 이동성을 갖는 것을 나타내었고, 이는 지질 A 코어의 상이한 구조, 예를 들어, 상이한 변형을 암시하며; (iii) 분리물 upec1096으로부터 획득된 신호는 래더가 아니라 스미어(smear)로 보였으며, 이는 상이한 OPS 구조를 나타낸다. 도 13A를 참조한다.
웨스턴 블로팅에 의한 분석 및 항 O1 항혈청을 이용한 검출은 upec1096은 아닌 모두로부터의 LPS가 특정 O1 항체에 의해 검출되는 것을 나타내었고, 이는 교차반응성 LPS 분자를 나타낸다. 이는 분리물 중 11개는 O1인 것을 의미하며, upec1096은 O1 분리물이 아닐 가능성이 가장 높음을 의미한다(즉, 이는 응집 검정에 의해 거짓 양성이었다).
O1 항원의 구조적 유사성을 상세히 분석하기 위해, LLO의 2AB 표지화 및 고해상도 정상상 HPLC 기술을 상기 기재된 바와 같이 이용하였다. 도 14A는 11개의 임상 분리물 중 5개로부터 획득된 크로마토그램의 오버레이를 제시한다. OPS의 핑거프린팅 영역은 110 내지 150분의 체류 시간에서 보인다. 프로파일은 모든 샘플이 동일 체류 시간에서 나타나는 신호를 갖는 것을 나타내며, 이는 동일 분자 구조를 나타낸다. 관찰된 차이는 강도 분포, 즉, 평균 최대 신호의 용리 시간, 및 일반 신호 강도였다. 나머지 6개의 추출물은 강도에 있어서 차이와 함께 동일 용리 시간에서 피크를 발생시켰다. 샘플 upec1096만 피크 패턴과 관련하여 상이하였으며, 이는 상기 기재된 구조적 차이를 입증한다.
O1 샘플에서 모노사카라이드의 서열을 확인하기 위해 MALDI-TOF/TOF 분석에 의한 개별적 피크 함량의 MS/MS 분석을 이용하였다(도 14B 참조). 임상 분리물로부터 추출되지 않고, upec032의 rfb 클러스터를 갖는 코스미드를 함유하는 W3110 ΔwaaL 균주로부터 추출된 샘플로부터 MS 분석을 수행하였다. 50, 80, 96, 및 108분 용리 시간에서 용리되는 피크는 m/z=1021.4, 1849.6, 2693.9, 3540.4의 주요 질량을 함유하였다. MS/MS 후에 획득된 단편화 이온 시리즈는 HexNAc, 3개의 데옥시헥소스, 및 분지 HexNAc의 1, 2, 3, 및 4개의 반복 단위와 일치하였다. 이러한 데이터는 O1A 하위혈청형 구조에 의해서만 설명될 수 있다. 기재된 피크 시리즈는 임상 분리물에서 UPP에 부착된 O1 OPS이며, 모든 연속 피크는 하나의 반복 단위에 의해 이전 것과 상이하다.
이러한 데이터는 실시예 1에 기재된 연구로부터의 임상 UTI 분리물에서 E. 콜라이의 O1 O 혈청형에 대한 대표적 구조가 서브타입 O1A라는 문헌으로부터의 언급을 입증한다.
O1A 폴리사카라이드를 갖는 바이오컨주게이트를 생성시키기 위해, W3110 E. 콜라이 균주를 O1A OPS를 발현하도록 공학 처리하였다. 생성된 균주는 O1 양성 임상 분리물의 rfb 클러스터(GU299791*, rmlB-wekO 범위의 클러스터)를 함유하는 W3110 ΔrfbO16::rfbO1 ΔwaaL였다. O1A OPS 발현 숙주 균주를 상동성 재조합에 의해 작제하였다. O1A 임상 분리물의 rfb 클러스터를 rfb 클러스터에 측접하는 DNA에서 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 증폭시켰다. 이후, 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/071328호에 기재된 상동성 재조합에 의해 잘 특성규명된 실험실 균주 W3110의 내인성 O 항원 클러스터를 대체하기 위해 증폭된 DNA를 이용하였다. 담체 단백질 pGVXN659 및 PglB(pGVXN114, 939, 970, 971)에 대한 발현 플라스미드를 형질전환에 의해 삽입하고, O1 발현을 확인하였다(도 15 및 도 16 참조).
별개의 실험에서, 임상 O1 분리물 upec032를 바이오컨주게이트를 생성시키도록 공학 처리하였다. 공학 처리는 임상 분리물의 항생제 민감성 표현형이 고려되는 것을 필요로 하였다. upec032 ΔwaaL을 작제하고, 담체 단백질로서 MBP를 이용하여 바이오컨주게이트 생성을 위해 pGVXN939 및 pGVXN579로 형질전환시켰다. 담체 단백질로서 MBP 및 EPA를 이용하는 장점은 항혈청을 발생시킬 가능성이며, 둘 모두는 담체가 아닌 폴리사카라이드 성분에 대한 교차반응성인 항혈청을 발생시킨다. 상기 항혈청은, 예를 들어, 폴리사카라이드 특이적 ELISA 검정을 개발하기 위한 코팅제로서 전임상 실험의 평가에 유용한 도구이다.
실시예 4: E. 콜라이 O6
E. 콜라이 O6 혈청형이 현재까지 보고된 가장 빈번한 ExPEC이다(George, D. B., and Manges, A. R. (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690). 실시예 1에 기재된 연구 뿐만 아니라 문헌으로부터 획득된 데이터는 O6 혈청형이 많은 ExPEC 야기된 소견에서 상위 4개의 혈청형 중 하나인 것을 입증한다(도 4 참조).
O6 OPS의 2개의 구조가 문헌에서 보고되었다(Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225, and Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283 참조). 보고된 O6 항원의 구조가 도 17B에 제시된다. 이들은 Glc 또는 GlcNAc인 각각의 분지 모노사카라이드를 제외하고는 동일하다. 그러나, 문헌에서는 UTI에 포함된 임상 분리물에서 우세한 O6 구조를 확인하지 않았다.
백신 목적을 위한 O6 항원의 가장 대표적 구조를 선택하기 위해, 실시예 1의 연구로부터의 O6 응집 양성 임상 E. 콜라이 분리물의 OPS 구조를 O1 혈청형에 대해 상기 기재된 것과 동일한 접근법을 이용하여 연구하였다. 항 O6 항혈청을 이용한 실버 염색 및 웨스턴 블로팅은 항 O6 혈청에 대해 반응성이 아닌 12개의 임상 분리물 중 하나를 확인하였으나, LPS는 모든 샘플에서 실버 염색되었고(제시되지 않음), 이는 거짓 양성 응집 결과를 암시한다. 그러나, Glc 또는 GlcNAc 차이는 젤 상에서의 전기영동 이동성 전환에 의해 검출되지 않을 가능성이 있다.
상세한 구조 분석을 위해, LLO 핑거프린팅을 이용하였다. 2개의 보고된 구조 중 어느 하나에 대한 참조로서, 보고된 분지 Glc(CCUG11309) 및 GlcNAc(CCUG11311)를 갖는 균주로부터의 추출물을 분석에 포함시켰다. 2개의 HPLC 트레이스의 비교는 CCUG11309 유래 샘플에 대해 70.8, 103.3, 및 122.2'에서 용리되는 피크 시리즈, 및 CCUG11311 샘플에 대해 68.8, 100.3, 및 118.3의 시리즈를 나타낸다. 도 18A를 참조한다. 피크를 피크에 존재하는 주요 질량에 대해 MS 및 이들 주요 질량의 모노사카라이드 서열에 대해 MS/MS에 의해 분석하였다. 데이터에서 예상된 바와 같이 GlcNAc 분지된 1, 2, 및 3개의 BRU 중합체에 해당하는 CCUG11311 추출물 유래 피크 시리즈 m/z=1094.4, 2027.6, 및 2962(MSO154)를 확인하였다. 분지 Glc를 갖는 m/z=1053.4, 1945.7, 및 2836.9가 CCUG11309(MSO138)와 동일한 2AB 핑거프린트 피크 용리 시간을 갖는 CFT O6 임상 분리물의 클로닝된 rfb 클러스터를 발현하는 W3110 균주로부터의 추출물에서 이전에 확인되었다. 12개의 임상 분리물로부터 획득된 크로마토그램을 참조 균주와 비교한 경우, 11개의 신호는 분지 Glc 잔기를 갖는 O6 OPS를 나타내는 피크 시리즈를 함유하였다. 이들 11개의 크로마토그램 중 5개가 도 18B에 제시된다. O6 특이적 용리 시간에서 신호를 발생시키지 않는 한 샘플은 O6이 아니었고, 즉, 응집 시험으로부터의 거짓 양성일 가능성이 가장 높다. 따라서, Glc 분지를 갖는 O6 OPS(도 17B, 상부)는 실시예 1에 기재된 역학으로부터 분리된 O6 혈청형 중에서 가장 대표적 구조이다.
O6Glc 폴리사카라이드를 갖는 바이오컨주게이트를 생성시키기 위해, W3110 rfb 클러스터를 균주 CCUG11309로부터의 rfb 클러스터로 대체함으로써 O6 OPS를 발현하도록 W3110 E. 콜라이 균주를 공학 처리하였다. 표 s7 및 13를 참조한다. 생성된 균주는 BRU에서 보고된 Glc 가지를 갖는 O6 양성 E. 콜라이 균주의 rfb 클러스터를 함유하는 W3110 ΔrfbO16::rfbCCUG11309 ΔwaaL였다(상기 참조). O6Glc OPS 발현 숙주 균주를 상동성 재조합에 의해 작제하였다. rfb 클러스터를 rfb 클러스터에 측접하는 DNA에서 어닐링하는 PCR 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 증폭시켰다. 이후, 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/071328호에 기재된 상동성 재조합에 의해 널리 특성규명된 실험실 균주 W3110의 내인성 O 항원 클러스터를 대체하기 위해 증폭된 DNA를 이용하였다. 담체 단백질 및 PglB에 대한 발현 플라스미드를 형질전환에 의해 삽입하고, EPA에서 예상 OPS의 발현을 웨스턴 블로팅에 의해 확인하였다.
실시예 5 : E. 콜라이 O2
O2 폴리사카라이드의 반복 단위 구조가 1987년 이래로 공지되었다(Jansson, et al., (1987) Carbohydrate research 161, 273-279). 이는 도 19B에 제시되어 있다. 2개의 O2 O 항원 유전자 클러스터 서열이 공적 데이터베이스(GenBank EU549863 및 GU299792)로부터 이용 가능하다. 비교 분석이 이루어졌고, 글리코실전달효소 활성이 암시되었다(표 5; Fratamico et al., 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316; 및 Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77).
표 5. 문헌[Li, et al. and Fratamico, et al.]에 의해 공개된 바와 같은 rfb 클러스터로부터의 O2 O 항원 클러스터 유전자 예측이 괄호 내에 표시된다.
Figure 112016092556323-pct00068
Figure 112016092556323-pct00069
구조의 비교 및 유전자 상동성은 중합체의 생합성을 위한 모든 기능이 제공되는 것을 나타내었다:
rmlBDAC는 글리코실전달효소 wekPOR에 의한 백본으로의 L-Rha의 첨가를 위한 기질인 dTDP-L-람노스의 생합성에 필요한 효소를 엔코딩하고;
fdtABC는 분지하는 글리코실전달효소에 대한 dTDP-D-Fuc3NAc를 제공하고;
wzy 및 wzx 동족체는 세포질로부터 주변세포질으로의 Und-PP-결합된 반복 단위의 플리핑을 담당하고;
wekPOR은 예측 글리코실전달효소이며, O2 BRU의 글리코시드 결합(3개의 L-Rha 및 1개의 L-FucNAc)을 형성할 것으로 예측된다.
공개된 O2 rfb 클러스터 서열에서 발견된 wekS 유전자는 예측된 막 결합된 설파타제이며, 따라서 BRU 형성과 관련되지 않을 가능성이 가장 높다. 이는 1 효소 1 결합 규칙을 가정하는 경우, wekPOR의 그룹 중에서 1개의 효소가 4개의 글리코시드 결합을 제공하기 위해 이기능성이어야 한다는 것을 의미한다.
1 효소 - 1 결합 규칙이 절대적이지 않다는 것이, 예를 들어, 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) Y, S. 플렉스네리 6, C. 제주니(C. jejuni), 및 E. 콜라이 O1A에서와 같이 결합보다 덜한 글리코실전달효소가 공지된 다수의 예에서 제시되었다. 이들 예에서, 다기능성 글리코실전달효소는 1개 초과의 글리코시드 결합의 형성을 담당하며, 이들은 '이기능성' 또는 '다기능성'이다. 항상, 동일한 모노사카라이드가 다수 횟수로 첨가된다. 혈청형 O2에서 발견된 바와 같이 반복 람노스 잔기가 종종 상기 다기능성 효소와 관련된다.
wekS 서열에 측접하는 트렁케이션된 트랜스포존 요소의 존재로 인해, wekS 유전자좌가 DNA 재조합 사건에 의해 rfb 클러스터로 삽입된 것으로 추측되었다(Fratamico et al., 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316 참조). wekS 유전자좌의 트랜스포존-매개 삽입은 O2 OPS 생합성이 사전의 wekS 존재 없이 존재하였고, 따라서 wekS가 O2 OPS 중합체의 합성에 필요하지 않음을 암시한다. 이러한 가설을 확인하기 위해, O2 OPS 형성을 wekS 유전자가 결여된 O2 rfb 클러스터를 함유하는 '깨끗한' 유전체 백그라운드를 재조합 발현 시스템에서 재구성시켰다. 이를 달성하기 위해, 균주 W3110로부터의 O 항원 클러스터를 wekS DNA가 결여된 O2 양성 균주 upec116로부터의 rfb 클러스터에 의해 대체하였다. 염색체 대체를 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2013/071328호에 기재된 바와 같은 상동성 재조합에 의해 수행하였다. 생성된 균주는 W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS였다. OPS를 제조하고, O1A 및 O6 OPS에 대해 수행된 바와 같이(상기 참조) 2AB 표지화 및 정상상 HPLC 및 형광 검출에 의해 분석하고, 정상상 HPLC에 의해 분석하고(도 21), 야생형 균주 CCUG25로부터의 신호와 비교하였다. 분석은 40 내지 140분의 용리 시간 사이에서 일련의 중첩 피크를 발생시켰다.
rfbO2 클러스터 의존성 피크 시리즈의 MS 분석은 연속 피크(즉, 단일 O2 RU의 연속 피크) 사이에서 동일한 차이를 갖는 주요 질량을 나타내었다.
각각의 피크에서 수거된 분자의 MS 분석을 수행하여 OPS의 구조를 분석하였다. 야생형 균주 CCUG25로부터 획득된 43.5, 73.1, 81.4 및 90'에서 획득된 피크를 수거하고, MS 및 MS/MS에 의해 분석하였다. 예상된 1, 2 및 3개의 반복 단위 O2 OPS 분자와 양립되는 질량 및 Y 단편 이온 시리즈가 발견되었다(m/z=989.4(도 23), 1817.8, 2646.1, 모두 Na+ 부가물).
임상 분리물로부터 O2 OPS를 확인하기 위해, 12개의 클론을 O1 혈청형에 대해 상기 기재된 바와 같이 이들의 OPS 구조에 대해 분석하였다. 첫째로, 실버 염색 및 웨스턴 블로팅에 의해 분석되는 LPS를 제조하였다. 결과는 도 20에 도시된다. 모든 샘플은 2개의 명백한 상이한 평균 래더 길이와 함께 래더-유사 밴딩 패턴을 나타내었다. 항-O2 항혈청은 모든 LPS 샘플을 검출하였고, 이는 응집이 모든 분리물을 O2 혈청형으로 정확하게 확인한 것을 나타낸다.
O2 폴리사카라이드를 갖는 바이오컨주게이트를 생성시키기 위해, W3110 ΔwaaL ΔrfbW3110::rfbO2 ΔwekS를 이용하였다. 담체 단백질 및 PglB에 대한 발현 플라스미드를 형질전환에 의해 삽입하였고, EPA에 대한 예상 OPS의 발현이 웨스턴 블로팅에 의해 확인되었다. 표 7 및 13 및 상기를 참조한다.
실시예 6: 다양한 O 항원의 면역학적 분석
선택된 항원성 폴리사카라이드를 함유하는 바이오컨주게이트의 면역학적 잠재성을 평가하기 위해, 전임상 연구를 수행하였다. O1A-EPA, O2-EPA, O6Glc-EPA 및 O25B-EPA 바이오컨주게이트를 상기 및 방법 섹션에 기재된 바와 같이 생성시키고, 정제하고, 특성규명하였다.
표 6. 백신 제조물의 백신 그룹 번호, 그룹 크기, 사용된 백신, 및 품질 표시를 포함하는 전임상 래트 연구의 개관.
Figure 112016092556323-pct00070
Figure 112016092556323-pct00071
9주령 암컷 스프라그 돌리 래트를 면역화시키기 위해 정제된 바이오컨주게이트를 이용하였다. 100 ㎕ 용액의 동일 용량을 래트에 1, 22, 및 43일에 근육내(i.m.) 주사하고, 56일에 마지막으로 채혈하고, 희생시켰다.
다양한 그룹의 래트에 표 6에 나타낸 바와 같이 바이오컨주게이트를 단독으로 또는 조합하여 포함하는 항상 제형화되지 않은 다양한 백신을 투여하였다. 첫번째 주사 56일 후의 말단 채혈 시점에서 래트 혈청의 ELISA 역가의 형태로 면역원성을 측정하기 위해 waaL 양성 균주에서 생성된 인지체 LPS로 코팅된 ELISA 플레이트를 이용하였다(도 25-28). 종합하면, 대조군(당화되지 않은 EPA 또는 TBS 완충액)에 대해 측정된 모든 예방접종 그룹에 대해 통계적으로 유의한 면역원성이 관찰되었다. 따라서, 선택되고 생성된 바이오컨주게이트는 유용한 백신 후보 화합물이다.
시험된 모든 O-항원-EPA 컨주게이트에 대해, 대조군(당화되지 않은 EPA 또는 TBS 완충액)에 대해 측정된 모든 예방접종 그룹에 대해 통계적으로 유의한 면역원성이 관찰되었다. 따라서, 선택되고 생성된 바이어컨주게이트는 O-항원-특이적 항체의 유도를 위한 유용한 백신 후보 화합물이다.
실시예 7: 바이오컨주게이트의 물리-화학적 특성규명
상기 실시예에 기재된 4개의 바이오컨주게이트(담체 단백질로서 EPA에 컨주게이션된 각각 O25B, O1A, O2 및 O6의 O-항원)를 1가 배치(활성 약제학적 성분, API)로서 제조하거나, ExPEC에 대한 다가 백신으로서 단일 제조물로서 조합하였다. 다양한 배치를 생성시켰다: 전임상 배치, 독성 연구 배치, 및 임상 배치. 표 7은 컨주게이트의 생성을 위해 사용된 숙주 균주를 나타낸다.
표 7: 전임상 , 독성 연구 및 임상 배치의 생성을 위한 숙주 균주
Figure 112016092556323-pct00072
따라서, 개별적 바이오컨주게이트의 1-당화 및 2-당화의 정도를 정량하고, 단백질 담체 및 이에 부착된 O-PS의 분자 질량(MW)을 결정하기 위해 4개의 1가 예비-GMP 배치 및 당화되지 않은 EPA 참조 표준을 다각 광 산란을 이용한 크기 배제 크로마토그래피(SEC-MALS)에 의해 분석하였다. 샘플을 인산염 완충액(pH 7.0; 50 mM NaCl, 150 mM 소듐 포스페이트) 중에서 TSKgel-G3000 SWxl 컬럼에서 분리시키고, UV(214 및 280 nm), 굴절 지수(RI) 및 다각 광 산란(MALS)에 의해 모니터하였다.
당화되지 않은 EPA 담체 단백질에 대해, 63-67 kDa의 MW를 결정하였다(아미노산 서열을 기초로 하여 70.5 kDa의 이론적 MW). 바이오컨주게이트에서, EPA만 280 nm에서 검출되었고, 이는 이의 MW가 RI 및 MALS에 의해 측정된 전체 MW로부터 추출되는 것을 가능케 하였고: 바이오컨주게이트에서, EPA 모이어티의 측정된 MW는 65-71 kDa였다.
예비-GMP API 생성물 표준의 분석이 표 8에 제시되며, 이는 각각 75-79 kDa 및 87-91 kDa 범위 내의 MW를 갖는 1-당화 및 2-당화 컨주게이트의 존재를 나타낸다. O-PS 부분은 2-당화된 종에 대해 16-24 kDa, 및 1-당화된 종에 대해 8-14 kDa의 MW를 각각 특징으로 하였다. 각각의 혈청형의 RU의 MW를 고려하여, 폴리사카라이드 사슬 당 10-16 RU의 평균수는 하이드라진분해 및 MS 데이터와 매우 일치하는 것으로 결정되었다.
표 8: 1가 예비- GMP API 생성물 표준의 SEC- MALS 분석
Figure 112016092556323-pct00073
트리스 완충 염수(TBS)에서 제형화된 O25B 바이오컨주게이트 배치의 원편광 이색성(CD) 분석은 pH 6.8 내지 7.4의 제형이 EPA의 공개된 결정 구조를 기초로 하여 예상된 바와 같이 알파 헬리칼 및 베타 시트 구조의 혼합물을 갖는 당화되지 않은 EPA 담체 단백질의 것과 유사한 스펙트럼을 갖는 것을 나타내었다. 따라서, 이들 CD 분석을 기초로 하여, O25B O-PS 사슬을 이용한 당화는 EPA 담체 단백질의 이차 구조에 영향을 미치는 것으로 보이지 않았다.
pH 6.8 내지 7.4의 TBS 및 pH 7.1 내지 7.8의 인산염 완충 염수(PBS) 중 O25B 바이오컨주게이트 배치 제형의 시차 주사 열량측정법(DSC) 분석은 약 52℃의 융점을 갖는 당화되지 않은 EPA의 것과 동등한 용융 곡선을 나타내었다. 이러한 결과는 EPA 담체 단백질의 생물물리학적 특징은 O25B O-PS 사슬을 이용한 변형시 변화되지 않은 것을 나타내었다.
실시예 8: 1가 벌크 및 4가 백신 제조물의 안정성
대규모 생성 전, 제조 과정의 일관성을 소규모로 평가하였다. 일관성 배치를 분해 경로를 확인하기 위한 가속화 및 스트레스 저장 조건을 포함하는 광범위한 안정성 연구에서 평가하였다. 4개의 1가 백신 성분(API)의 안정성을 3개월의 기간에 걸쳐 시험하였다.
전임상 API의 안정성 데이터의 분석은 -75 ±15℃(일반 저장 조건)에서 저장하는 경우 적어도 3개월에 걸쳐 안정성을 나타내었다. 통계적 선형 회귀 분석에 의해 연장된 저장 조건에서 통계적으로 유의한 경향이 관찰되지 않았다. 또한, 가속화(+5 ±3℃) 및 스트레스 저장 조건(+25 ±5℃)에서, 생성물은 안정성을 나타내는 파라미터의 낮은 변동성에 의해 입증되는 바와 같이 적어도 3개월의 걸쳐 안정적이었다. O1A 전임상 API에 대한 데이터는 표 9에 제시된다. 3개의 다른 혈청형(O2, O6, O25B)은 유사한 안정성 데이터를 나타내었다.
표 9: O1A 전임상 API 배치의 안정성 데이터
Figure 112016092556323-pct00074
4가 백신 조성물(O25B, O1A, O2 및 O6 바이오컨주게이트)의 안정성을 3개월에 걸친 기간 동안 시험하였다. 연구는 분해 경로를 확인하기 위해 가속화 및 스트레스 저장 조건을 포함하였다. 결과로서 발생된 데이터는 GMP IMP(연구 의약 제품, 4가 ExPEC 백신 조성물) 저장기간의 최초 정당성 증명과 관련된 것으로 간주된다.
4가 ExPEC 백신 전임상 배치의 안정성 데이터의 분석은 표 10에 제시된 바와 같이 +5 ±3℃(정상 저장 조건)에서 저장되는 경우 적어도 3개월에 걸쳐 안정성을 나타내었다. 통계적 선형 회귀 분석에 의해 의도된 저장 조건에서 통계적으로 유의한 경향이 관찰되지 않았다. 또한, 가속화된 저장 조건(+25 ±5℃)에서, 안정성을 나타내는 파라미터의 낮은 변동성에 의해 입증되는 바와 같이 생성물은 안정적이었다.
표 10: 전임상 4가 백신 배치의 안정성 데이터
Figure 112016092556323-pct00075
종합하면, 이들 연구는 API 및 4가 ExPEC 백신 조성물은 적어도 3개월 동안 안정적이었고, 따라서 안정성과 관련하여 적합한 백신 조성물임을 입증한다.
실시예 9: 4가 백신 제조물에 대한 독성 연구
1 및 14일에 스프라그 돌리 래트에서 2개의 근내 투여(넙다리 네갈래를 치료를 위해 이용함) 후에 4가 백신 제조물(O25B, O1A, O2 및 O6 바이오컨주게이트)의 독성 및 국소 내성을 평가하였다. 임의의 변화의 가역성, 지속성, 또는 지연된 발생을 28일에 14일의 회복 기간 후에 평가하였다. 주요 그룹의 동물(예방접종 그룹 및 대조군 그룹 둘 모두에 대해 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷)의 부검을 17일에 수행하였고, 회복 그룹(예방접종된 그룹 및 대조군 그룹 둘 모두에 대해 5마리의 수컷 및 5마리의 암컷)에 대해서는 28일(14일의 회복 기간 후)에 수행하였다. 이는 치료에 기인될 수 있는 유해한 것으로 간주되는 임의의 효과와 관련되지 않았다. 투여되는 용량, 즉, 1일 및 14일에 투여되는 바와 같은 O-항원 당 4 ㎍의 전체 인간 용량 당량(4가 백신에 대한 16 ㎍의 전체 O-항원)이 상기 연구의 조건하에서 4가 ExPEC 백신에 대한 무영향관찰용량(no-observed-adverse-effect-level)(NOAEL)인 것으로 간주되었다. 또한, 4가 ExPEC 백신의 면역원성이 혈청 샘플의 평가 후 17일 및 28일 둘 모두에서 확인되었다. 제형화 완충액(25 mM Tris, 130 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.4)만 투여된 대조군에 비해 예방접종 그룹에서 더 높은 역가의 항-O1A, 항-O2, 항-O6 및 항-O25B IgG 항체가 유도되었다.
이들 데이터는 4가 ExPEC 백신이 백신으로서 투여를 위한 적합한 독성 프로파일을 갖고, 백신에 존재하는 O-항원(즉, O25B, O1A, O2 및 O6)으로부터의 적어도 4개 모두의 E. 콜라이 혈청형에 대한 항체를 유도하는 것을 입증한다.
실시예 10: 세균혈증과 관련된 O-혈청형의 역학
노인에서 세균혈증을 야기시키는 장외 E. 콜라이 중에서의 O-혈청형 분포를 결정하기 위해, 60세 이상의 환자로부터 수거된 E. 콜라이 혈액 분리물의 패널에 대해 역학 연구를 수행하였다. 전체적으로, 2011-2013 기간으로부터의 860개의 혈액 분리물을 미국, 영국, 독일, 스페인, 및 네덜란드의 대상체로부터 수거하고, 고전적 O-응집에 의해 분석하였다. 표 11에 제시된 바와 같이, 세균혈증 분리물의 O-혈청형 분포는 요로 감염에 걸린 환자에서 발견된 O-혈청형 분포와 유사하였다(UTI, 표 1A 참조). 혈청형 O25는 연구된 세균혈증 집단에서 가장 우세하였고; PCR에 의한 57개의 분리물의 서브타이핑(subtyping)은 O25 혈청형 중 56개(98%)가 O25B로 유형 분류할 수 있었음을 나타내었다. 둘 모두의 표적 집단(UTI 및 세균혈증)에서, 혈청형 O1, O2, O6, 및 O25는 4개의 가장 우세한 혈청형으로 확인되었다. 전체적으로, 이들 데이터는 요로 감염 및 세균혈증 분리물 둘 모두 사이에서의 혈청형 분포가 매우 유사하고, 지리적 위치, 분리 시간, 및 표시와 독립적인 것을 입증한다.
표 11: 2011 -2013 기간에 미국 및 유럽에서 수거된 860개의 혈액 분리물의 수거로부터의 가장 흔한 세균혈증 -관련 E. 콜라이 O-혈청형의 분포. 샘플의 상대 O-혈청형 분포가 표시된다.
Figure 112016092556323-pct00076
실시예 11: 기능성 항체 반응의 유도
상기 기재된 1가 및 4가 백신 제형을 이용한 예방접종 후에 발생된 항체의 기능성을 시험관내 옵소닌식작용 사멸(OPK) 검정으로 연구하였다. 이러한 유형의 검정은 스트렙토코커스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae)에 대한 컨주게이트 백신(Prevenar®)에 대한 보호의 상관관계로서 받아들여졌다. OPK 검정은 다양한 E. 콜라이 혈청형의 옵소닌식작용 및 사멸을 촉진하는 혈청의 능력을 측정한다. 96-웰 플레이트에서, 샘플 혈청의 규정된 희석액을 각각의 웰에서 4개의 백신-특이적 E. 콜라이 혈청형 중 하나로부터의 박테리아, 규정된 양의 HL60 세포, 및 새끼 토끼 보체와 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 일정 비율의 혼합물을 트립틱 소이 아가(tryptic soy agar)(TSA)에 스포팅하고, 박테리아 콜로니의 수를 카운팅하였다. 박테리아 세포에 결합하고, 보체의 침착을 활성화시키고, HL60 세포에 의한 박테리아의 흡수 및 사멸을 매개하는 항체의 능력을 옵소닌 역가로 표현하였다. 옵소닌 역가 또는 옵소닌화 지수(OI)는 박테리아 세포의 50%를 사멸시키는 혈청의 희석액에 해당한다. 면역전 및 면역후 혈청에 대한 옵소닌 지수가 제공된다. 면역전으로부터 면역후로의 OI의 4배 초과의 증가가 유의한 것으로 간주된다. 3개의 혈청형 O2, O6Glc 및 O25B에 대한 OPK 검정을 확립하였다.
1가 백신에 의해 유도된 항체 반응의 기능성
O25B, O1A, O2 및 O6Glc 바이오컨주게이트의 백신-유도 항체 반응의 기능적 활성을 평가하기 위해, 박테리아, 예를 들어, E. 콜라이의 시험관내 보체- 및 항체-의존성 식작용 및 사멸을 측정하는 옵소닌식작용 사멸(OPK) 검정을 이용하여 예방접종된 래트로부터의 혈청을 분석하였다. E. 콜라이를 예방접종된 래트로부터의 혈청의 희석액으로 예비-옵소닌화시키고, 보체 및 포식세포(분화된 HL60 세포)와 함께 인큐베이션시키고, 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정하였다. 이후, 최대 % 사멸 및 옵소닌화 지수(OI: E. 콜라이의 50%를 사멸시키는 혈청 희석액)를 계산하였다. OPK 시험을 위해 선택된 E. 콜라이는 OC 24453(혈청형 O2), OC 24781(혈청형 O6Glc) 및 OC 24176(혈청형 O25B)이었다. 도 29에 제시된 바와 같이, O2-EPA(도 29A), O6Glc-EPA(도 29B) 및 O25B-EPA(도 29C)에 대한 강한 기능적 면역 반응이 관찰되었다.
데이터는 본원에 기재된 백신 성분이 E. 콜라이 혈청형에 대한 항체 반응을 유도하며, 이로부터의 O-항원이 상기 백신에 포함되고, 상기 항체 반응이 이들 혈청형으로부터의 E. 콜라이를 사멸시키는데 있어서 기능성인 것을 입증한다.
4가 백신에 의해 유도된 항체 반응의 기능성
표 12는 O-항원 당 0.4 또는 4 ㎍의 4가 백신으로 면역화된 동물로부터의 O-항원 O2, O6Glc 및 O25B에 대한 전체 OI 역가를 제시한다. 역가를 2개의 별개의 실험으로 결정하였다. 0.4 ㎍ 용량은 O2 및 O6Glc 혈청형에 대해 모든 동물에서 유의한 OI를 유도하였다. O25B에 대해, 3/8 동물은 0.4 ㎍ 용량을 이용한 면역화 후 OI에서 유의한 증가를 나타내었다. 0.4 ㎍ 용량과 비교하여, 4 ㎍ 용량은 모든 동물에서 O2에 대한 더 낮은 OI 증가를 유도하였다. 3/8 동물은 4 ㎍ 용량 그룹으로부터의 혈청이 O25B E. 콜라이에 대해 시험된 경우 OI 증가를 나타내었다. 데이터는 4가 백신이 O2, O6Glc 및 O25B에 대한 O-항원-특이적 옵소닌 항체를 유도할 수 있음을 입증한다.
데이터는 본원에 기재된 백신 성분이 E. 콜라이 혈청형에 대한 항체 반응을 유도하며, 이로부터 O-항원이 상기 백신에 포함되고, 상기 항체 반응이 이들 혈청형으로부터의 E. 콜라이를 사멸시키는데 있어서 기능성임을 입증한다.
표 12: E. 콜라이 O2, O6 및 O25에 대한 OI. 2개의 별개의 실험으로부터의 개별적 예방접종전 및 3회 예방접종후 혈청에 대한 OI가 모든 동물에 대해 제시된다.
Figure 112016092556323-pct00077
최대 % 사멸 및 옵소닌화 지수(OI: E. 콜라이의 50%를 사멸시키는 혈청 희석액)를 계산하였다. OPK 시험에 대해 선택된 E. 콜라이는 OC 24453(혈청형 O2), OC 24781(혈청형 O6Glc) 및 OC 24176(혈청형 O25B)이었다. O2-EPA, O6Glc-EPA 및 O25B-EPA에 대한 강한 기능적 면역 반응이 관찰되었다.
실시예 12: 재발성 요로 감염( RUTI )의 임상 병력을 갖는 여성에서 요로병원성 에스체리치아 콜라이에 대한 후보 백신의 평가
E. 콜라이 바이오컨주게이트 백신이 I 상 임상 연구에서 사용된다. 백신은 염수 완충 용액 내에 4개의 바이오컨주게이트를 포함한다. 4개의 바이오컨주게이트는 (i) EPA 담체 단백질에 컨주게이션된 E. 콜라이 O1A, (ii) EPA 담체 단백질에 컨주게이션된 E. 콜라이 O2, (iii) EPA 담체 단백질에 컨주게이션된 E. 콜라이 O6Glc, 및 (iv) EPA 담체 단백질에 컨주게이션된 E. 콜라이 O25B이다.
연구 집단은 이전 12개월 내의 3회 이상의 독립적 에피소드 또는 지난 6개월 내의 2회 이상의 에피소드로 정의되는 재발성 요로 감염(RUTI)의 병력을 갖는 18세 이상 내지 70세 연령의 194명의 건강한 여성을 포함한다. 요로 감염(UTI) 에피소드의 적어도 하나는 E. 콜라이(단일 병원체 또는 복합균 감염의 일부)에 의해 야기되었고, 원인은 배양 확인되고 문서화되었다. 연구 목적을 위해, UTI는 중간뇨에서 ≥103 CFU/ml 요로감염 병원균의 박테리아 수(CFU)와 함께 적어도 하나의 특정 UTI 증상(배뇨통, 절박뇨, 빈뇨, 옆구리 동통, 방광 압통, 치골상 동통, 열, 구역, 구토)의 존재에 의해 규정된다.
연구는 2개의 아암(arm)인 (i) 후보 백신 및 (ii) 위약을 포함한다. 연구는 RUTI의 병력을 갖는 건강한 여성에서의 스태거드(staggered) 무작위 단일 맹검 위약 대조 다중-센터 연구이다.
연구에 대한 추정 등록 기간은 4개월이며, 추적검사 기간은 각각의 대상체에 대해 9개월이다.
연구 목적은 E. 콜라이 바이오컨주게이트 백신의 안전성, 면역원성, 및 효능을 평가하기 위한 것이다.
연구 계획
대상체를 주사후 9개월 동안 추적하고, 주사된 대상체만 연구 기간 전체에 걸쳐 추적하였다. 대상체는 전체 5회의 예정된 방문에 참석하였다: 스크리닝(첫번째 방문), 1일(두번째 방문), 7일, 30일, 및 270일. 대상체는 2일, 90일, 150일, 및 210일에 4회의 추적 전화 통화를 받았다.
UTI의 발생으로 인한 임의의 예정에 없던 방문은 조화된 처리 옵션을 갖는 진료 표준을 포함한다. 소변 및 혈액(가능한 경우)은 진단 및 혈청유형 분석 목적을 위해 수거된다. 명시되지 않은 유해 사례(AE) 및 중증 유해 사례(SAE)가 연구 기간에 따라 기록되는 반면 명시된 AE가 주사 후 7일 동안 기록된다.
각각의 방문시, 대상체에 새로운 일지 카드가 제공되며, 이전 것이 논의된다.
용량 및 투여
첫번째 방문시, 사전동의가 제공된 적격의 대상체를 스크리닝하고, 포함/배제 기준에 대한 순응을 확인한다. 혈액을 채취하고, 소변을 수거한다.
방문 2(1일)에서, 각각의 대상체에 삼각근에서 0.5 ml의 용액(백신 후보 또는 위약)의 1회의 근내 주사를 투여할 것이다. 후보 백신의 감소된 용량은 1 ㎍의 각각의 폴리사카라이드(전체 4 ㎍ 폴리사카라이드)를 함유할 것이다. 후보 백신의 표적 용량은 4 ㎍의 각각의 폴리사카라이드(전체 16 ㎍ 폴리사카라이드)를 함유할 것이다.
목적
일차 목적은 연구 기간 전체에 걸쳐 위약 그룹에 비해 후보 백신의 주사후 명시된 및 명시되지 않은 유해 사례(AE) 및 중증 유해 사례(SAE)의 발생, 강도, 관계, 및 기간을 평가하는 것이다.
이차 목적은 (i) 위약 그룹에 비한 후보 백신의 주사전(최초 스크리닝 및 1일) 및 주사후(7일 및 30일)의 혈액학적 및 생화학적 안전성 종점에서의 변화를 비교하고; (ii) 기준선(1일)과 주사후(30일 및 270일) 사이의 후보 백신의 면역-반응을 평가하고; (iii) 가장 관련된 효능 종점으로서 전체 연구 기간 동안 후보-백신 또는 위약이 주사된 2개의 아암 사이의 E. 콜라이 백신-혈청형에 의해 야기된 증상적 요로 감염(UTI)의 수를 비교하고; (iv) 연구 기간에 따라 위약 그룹에 비해 백신 그룹에서 백신-혈청형 특이적 E. 콜라이 UTI의 발생 비율을 평가하고; (v) 연구 기간에 따라 위약 그룹에 비해 백신 그룹에서 백신-혈청형 특이적 E. 콜라이 UTI의 임상 증상의 강도 및 기간을 평가하는 것이다.
조사 목적은 (i) 연구 기간 전체에 걸쳐 위약 그룹에 비해 백신 그룹에서 임의의 E. 콜라이 혈청형에 의해 야기된 UTI 발생의 비율을 비교하고; (ii) 연구 기간 전체에 걸쳐 위약 그룹에 비해 백신 그룹에서 임의의 병원체에 의해 야기된 UTI 발생의 비율을 비교하는 것이다.
포함 기준
연구에 대한 포함 기준은 하기와 같다: (i) 이전 12개월 내에 3회 이상의 UTI 독립적 에피소드 또는 지난 6개월 내에 2회 이상의 UTI 에피소드로 정의되는 재발성 UTI의 병력을 갖는 여성 대상체; 지난 5년 동안 적어도 1회 UTI가 E. 콜라이(단일 병원체 또는 복합균 감염의 일부)에 의해 야기되고, 배양 확인되고 문서화됨; (ii) 18세 이상 내지 70세 이하의 연령; (iii) 스크리닝 방문 및 주사일(방문 2)에 진행중이거나 의심되는 증상적 UTI가 없는 건강한 상태의 대상체; (iv) 연구자의 임상 판단에 따라 임상적으로 유의한 의학적 병력, 신체 검사 소견 또는 임상 실험실 이상이 없는 전반적으로 양호한 건강; 및 (v) 프로토콜의 모든 양태가 설명되고 충분히 이해한 후에 연구에 참여할 의지가 있고, 서면으로 된 사전동의 형태가 획득됨.
배제 기준
연구에 대한 배제 기준은 하기와 같다: (i) 스크리닝 방문 전 1년 내에 10회 초과의 재발성 UTI의 병력; (ii) 스크리닝 전 7일 이내에 임의의 단기 요로 카테터의 사용; (iii) 스크리닝 전 30일 이내에 임의의 영구 카테터의 사용; (iv) 임의의 미해결 요로 질병/이상의 병력; (v) 손상된 면역 기능의 증거; (vi) 유의한 심장혈관, 간, 신장 질병 및/또는 기능부전; (vii) 비조절성 당뇨병; (viii) 혈액학, 혈청 화학 또는 요검사에 대한 스크리닝 결과에서의 유의한 이상; (ix) HIV에 대한 양성 시험, 및/또는 HBV 또는 HCV의 증거; (x) BMI >34; (xi) 지난 3개월 내의 UTI 예방을 위한 이전 면역 자극 요법(예를 들어, Urovaxom®, Strovac® 또는 Urovac®), 또는 연구 기간 동안의 계획된 사용; (xii) 면역 기능에 영향을 미치는 것으로 공지된 임의의 약물(예를 들어, 코르티코스테로이드 ≥0.5 mg/kg BW/일)의 현재의 이용; (xiii) 주사 전 6개월 미만에 새로이 시작되고, 연구 동안 지속되거나, 활성 연구 기간 동안에 시작이 계획된 UTI-관련 질내 에스테로겐 치료의 이용; (xiv) 주사 전 1주 내의 임의의 항생제 요법의 이용; (xv) 연구 기간 동안 UTI 예방을 위한 성교후 항생제의 계획된 이용; (xvi) 주사 전 30일 이내 및 주사 후 30일 이내에 계획된 임의의 예방접종; (xvii) 등록 전 60일 내 및 연구 기간 동안 다른 임상 시험의 참여; (xviii) 주사 전 3개월 이내의 면역글로불린 또는 혈액 생성물을 이용한 이전 치료; (xix) 백신의 임의의 성분에 대한 공지된 과민성; (xx) 연구자의 의견으로 연구에서의 참여에 배제되는 유의한 의학적 또는 정신 질환의 존재; (xxi) 주사시의 급성 질병; (xxii) 양성의 임신 시험을 갖거나, 효과적인 피임을 이용하기 거부한 아이를 가질 잠재성이 있는 여성; (xxiii) 연구 기간 전체에 걸쳐 임의의 시점에서 수유하는 여성; (xxiv) 연구 기간 동안 계획된 선택적인 외과적 개입을 갖는 대상체; 및 (xxv) 연구자의 의견으로 연구 참여로부터 유해한 결과를 가질 위험이 증가되는 임의의 다른 유의한 소견.
통계 방법 및 분석
서술적 통계(n, 평균, 표준편차, 연속 변수에 대한 중앙값 및 범위, 범주형 변수에 대한 빈도 및 백분율)가 처리 그룹 및/또는 적용 가능한 경우 방문에 의해 제공된다. 모든 데이터는 대상체, 처리 그룹, 및 적용 가능한 경우, 방문에 의해 나열된다. 위약을 투여받은 그룹 B로부터의 모든 대상체는 조합되어 위약 처리 그룹을 형성한다.
실시예 13: I 상 임상 연구 결과
본 실시예는 실시예 12에 기재된 I 상 임상 연구의 중간 분석의 특정 결과이다.
12.1: 안전성
유해 사례 및 중증 유해 사례의 발생은 위약과 예방접종 그룹 사이에서 동등하였다. 10개의 중증 유해 사례가 보고되었고, 어느 것도 연구 약물과 관련되지 않았다.
12.2: 면역원성
백신 성분의 면역원성을 평가하기 위해, 임상 연구에 참여하는 여성으로부터의 혈청을 획득하고, ELISA에 의해 분석하여, 4가 백신(E. 콜라이 O1, E. 콜라이 O2, E. 콜라이 O6, 및 E. 콜라이 O25B)에 포함된 4개의 상이한 O-항원에 대한 IgG를 정량하였다.
예방접종된 여성으로부터의 혈청을 O1A, O2, O6Glc 및 O25B-LPS 및 EPA로 코팅된 플레이트에서 인큐베이션하였다. 이후, 플레이트를 HRP-표지된 이차 항체(항-인간 IgG)와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 항체를 TMB 기질로 검출하고, 흡광도를 측정하였다. EC50 값을 4PL 적합화에 의해 계산하였다.
도 30에 제시된 바와 같이, O1A-EPA, O2-EPA, O6Glc-EPA 및 O25B-EPA에 대한 강한 면역 반응이 예방접종된 여성의 대다수에서 발생하였다.
이들 데이터는 4가 백신의 각각의 성분의 면역원성을 입증한다.
12.3: 기능성 항체 반응
시험관내 보체-의존성 및 항체-의존성 포식작용 및 E. 콜라이 박테리아의 사멸을 측정하는 OPK 검정을 임상 연구에 참여하는 여성의 기능성 항체 반응을 평가하기 위해 이용하였다.
혈청을 연구 참여자로부터 수거하였다. E. 콜라이를 예방접종된 여성으로부터의 혈청의 희석액으로 예비 옵소닌화시키고, 보체 및 포식세포(분화된 HL60 세포)와 함께 인큐베이션시키고, 나머지 콜로니 형성 단위(CFU)를 결정하였다. 이후, 최대 백분율 사멸 및 옵소닌화 지수(OI: E. 콜라이의 50%를 사멸시키는 혈청 희석액)를 계산하였다. OPK 시험에 대해 선택된 E. 콜라이는 OC 24452(혈청형 O1A), OC 24453(혈청형 O2), OC 24454(혈청형 O6Glc), 및 OC 24176(혈청형 O25B)이었다.
도 31에 제시된 바와 같이, O1A-EPA(도 31A), O2-EPA(도 31B), O6Glc-EPA(도 31C), 및 O25B-EPA(도 31D)에 대한 강한 기능적 면역 반응이 관찰되었다.
이들 데이터는 4가 백신의 각각의 성분이 혈청형-특이적 항체 반응을 유도하고, 상기 항체 반응이 이들 혈청형으로부터의 E. 콜라이를 사멸시키는데 있어서 기능성임을 입증한다. 따라서, 본원에 기재된 백신 조성물은 인간에서 기능성이다.
12.4: O25B -EPA를 포함하는 4가 O-항원 컨주게이트를 이용한 면역화는 인간에서 O25A / O25B 교차반응성 IgG 항체를 유도한다.
2개의 공지된 E. 콜라이 O25 혈청서브타입인 O25A 및 O25B에 대한 백신-유도 혈청 IgG 항체의 교차반응성의 수준을 결정하기 위해, 예방접종된 대상체로부터 유래된 혈청의 연속 희석액을 정제된 O25A LPS, O25B LPS, 또는 온전한 박테리아 세포와 함께 인큐베이션시키고, ELISA에 의해 시험하였다.
도 32에 제시된 바와 같이, 예방접종 30일 후에 O25A LPS(흑색 막대) 및 O25B LPS(회색 막대)에 대한 반응성을 시험한 경우 유사한 EC50 값이 관찰되었다. 전체적으로, 데이터는 O25B 바이오컨주게이트는 O25B 및 O25A에 대해 잘 작동하나, 대부분의 경우/처리된 대상체에서 O25B는 O25A에 비해 O25B에 대한 항체 반응에 의해 약간 더 잘 작동하는 것을 암시한다. 이러한 결과는 일부 자연 변화의 발생으로, 4가 백신이 O25A 및 O25B LPS 둘 모두를 인지하는 항체를 유도하는 것을 입증한다. 전체 박테리아 세포 및 다수의 O25A/O25B 균주에 대해서도 마찬가지인지의 여부를 시험하기 위해, 혈액 또는 소변으로부터 유래된 임상 O25A 또는 O25B 분리물의 세트에 대한 반응성을 또한 시험하였다. 이러한 경우, 4가 백신에 제공되지 않은 혈청형인 혈청형 O75 균주를 음성 대조군으로 이용하였다(도 33에서 회색의 점선). 도 33에서 입증되는 바와 같이, 백신-유도 혈청 IgG 항체는 개별적 O25 균주 각각에 대한 강한 반응을 나타내었다. 균주간 변화가 명백하였으나, O25A(흑색선) 및 O25B 균주(회색선)에 대한 반응성을 관찰하였다. 이들 데이터는 4가 백신의 O25B 백신 성분이 O25A 및 O25B 정제된 LPS 및 E. 콜라이 O25A 및 O25B 균주 둘 모두를 인지하는 항체를 유도하는 것을 입증한다.
하기 표 13 및 14는 상기 실시예에서 사용된 특정 균주 및 플라스미드의 세부사항을 각각 제공한다.
표 13: 균주
Figure 112016092556323-pct00078
Figure 112016092556323-pct00079
표 14: 플라스미드
Figure 112016092556323-pct00080
Figure 112016092556323-pct00081
표 15: 서열
Figure 112016092556323-pct00082
Figure 112016092556323-pct00083
Figure 112016092556323-pct00084
Figure 112016092556323-pct00085
Figure 112016092556323-pct00086
Figure 112016092556323-pct00087
Figure 112016092556323-pct00088
Figure 112016092556323-pct00089
Figure 112016092556323-pct00090
Figure 112016092556323-pct00091
Figure 112016092556323-pct00092
Figure 112016092556323-pct00093
Figure 112016092556323-pct00094
Figure 112016092556323-pct00095
본원에 기재된 구체예는 단지 예시인 것으로 의도되며, 당업자는 일상적인 것을 넘어서지 않는 실험을 이용하여 본원에 기재된 특정 절차에 대한 다수의 동등물을 인지할 것이거나, 확인할 수 있다. 모든 상기 동등물은 본 발명의 범위 내인 것으로 간주되며, 하기 청구항에 의해 포함된다.
본원에 인용된 모든 참고문헌(특허 출원, 특허, 및 간행물을 포함함)은 모든 목적상 각각의 개별적 간행물 또는 특허 또는 특허 출원이 모든 목적상 이의 전체내용이 참조로서 포함되는 것이 구체적 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
7. 구체예
구체예 1:
1. 하기를 포함하는 원핵 숙주 세포:
a. rfb(upec138) 유전자 클러스터(SEQ ID NO:12), rfb(upec163) 유전자 클러스터, 또는 rfb(upec177) 유전자 클러스터;
b. 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
c. X가 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:14).
2. 하기를 포함하는 원핵 숙주 세포:
a. rmlB, rmlD, rmlA, rmlC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, 및 wbbL;
b. 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
c. X가 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:14).
3. 하기를 포함하는 원핵 숙주 세포:
a. 하기를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열:
i. dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제;
ii. dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제;
iii. 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소;
iv. dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제;
v. O 항원 플립파제(flippase);
vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소;
vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-글루코실전달효소;
viii. O 항원 중합효소;
ix. O-아세틸 전달효소;
x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-글루코실전달효소 및
xi. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소;
b. 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
c. X가 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열(SEQ ID NO:14).
4. 제 3항에 있어서,
a. dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제가 SEQ ID NO:1에 의해 엔코딩되는 dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
b. dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제가 SEQ ID NO:2에 의해 엔코딩되는 dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
c. 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소가 SEQ ID NO:3에 의해 엔코딩되는 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
d. dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제가 SEQ ID NO:4에 의해 엔코딩되는 dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
e. O 항원 플립파제가 SEQ ID NO:5에 의해 엔코딩되는 O 항원 플립파제와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
f. (xi)의 람노실 전달효소가 SEQ ID NO: 6에 의해 엔코딩되는 람노실 전달효소와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
g. (xii)의 글루코실전달효소가 SEQ ID NO:7에 의해 엔코딩되는 글루코실전달효소와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
h. O 항원 중합효소가 SEQ ID NO:8에 의해 엔코딩되는 O 항원 중합효소와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
i. O-아세틸 전달효소가 SEQ ID NO:9에 의해 엔코딩되는 O-아세틸 전달효소와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
j. (x)의 글루코실전달효소가 SEQ ID NO:10에 의해 엔코딩되는 글루코실전달효소와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고;
k. (xi)의 람노실전달효소가 SEQ ID NO:11에 의해 엔코딩되는 람노실전달효소와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 숙주 세포.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli)인 숙주 세포.
6. 제 5항에 있어서, waaL 유전자, gtrA 유전자, gtrB 유전자, gtrS 유전자, 및 rfb 클러스터 중 적어도 하나가 숙주 세포의 유전체로부터 결실되거나 기능적으로 비활성화된 숙주 세포.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 P. 애루기노사(P. aeruginosa)의 무독화된 외독소 A(EPA), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스(S. aureus)의 무독화된 용혈소 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜라이 FimH, E. 콜라이 FimHC, E. 콜라이 열 민감성 장독소, E. 콜라이 열 민감성 장독소의 무독화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜라이 Sat 단백질, E. 콜라이 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae) 뉴몰리신 및 이의 무독화된 변이체, C. 제주니(C. jejuni) AcrA, 및 C. 제주니 천연 당단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 X 및 Z가 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택되는 최적화된 N-당화 컨센서스 서열, Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(SEQ ID NO:15)을 포함하는 숙주 세포.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 하나 이상의 재조합적으로 도입된 컨센서스 서열을 포함하는 숙주 세포.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 숙주 세포의 주변세포질으로 담체 단백질을 표적화시키기 위한 신호 서열을 포함하는 숙주 세포.
11. 제 10항에 있어서, 신호 서열이 E. 콜라이 DsbA, E. 콜라이 외막 포린 A(OmpA), E. 콜라이 말토스 결합 단백질(MalE), 에르위니아 카로토보란스(Erwinia carotovorans) 펙테이트 리아제(PelB), FlgI, NikA, 또는 바실러스 종(Bacillus sp.) 엔독실라나제(endoxylanase)(XynA), 열 민감성 E. 콜라이 장독소 LTIIb, 바실러스 엔독실라나제 XynA, 또는 E. 콜라이 플라젤린(FlgI)로부터의 신호 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
12. N-당화 담체 단백질을 제조하는 방법으로서,
a. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하고;
b. N-당화 담체 단백질을 정제하는 것을 포함하는, 방법.
13. 제 12항의 방법에 의해 생성된 N-당화 담체 단백질.
14. 제 13항에 있어서, 하기 화학식 O25B의 화합물을 포함하는 N-당화 담체 단백질:
Figure 112016092556323-pct00096
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다.
15. 제 13항에 있어서, 하기 화학식 O25B'의 화합물을 포함하는 N-당화 담체 단백질:
Figure 112016092556323-pct00097
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다.
16. O25B 균주로부터의 분리된 O 항원, 예를 들어, upec138, upec163, 또는 upec177.
17. 제 15항의 O 항원에 N-연결된 담체 단백질.
18. 하기 화학식 O25B의 구조를 포함하는 분리된 거대분자의 집단:
Figure 112016092556323-pct00098
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다.
19. 하기 화학식 O25B'의 구조를 포함하는 분리된 거대분자의 집단:
Figure 112016092556323-pct00099
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다.
20. 하기 화학식 O25B의 구조를 포함하는 거대분자를 포함하는 약제학적 조성물:
Figure 112016092556323-pct00100
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다.
21. 하기 화학식 O25B'의 구조를 포함하는 거대분자를 포함하는 약제학적 조성물:
Figure 112016092556323-pct00101
상기 식에서, n은 1 내지 30, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 10 내지 30, 15 내지 30, 20 내지 30, 25 내지 30, 5 내지 25, 10 내지 25, 15 내지 25, 20 내지 25, 10 내지 20, 또는 15 내지 20의 정수이다.
22. 제 20항에 있어서, 화학식 O25B의 구조가 담체 단백질 내의 Asn 잔기에 공유적으로 결합된 약제학적 조성물.
23. 제 21항에 있어서, 화학식 O25B'의 구조가 담체 단백질 내의 Asn 잔기에 공유적으로 결합된 약제학적 조성물.
24. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, Asn 잔기가 X가 Pro를 제외한 임의의 아미노산일 수 있는 컨센서스 서열 Asn-X-Ser(Thr)(SEQ ID NO:14) 내에 위치되는 약제학적 조성물.
25. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고사카릴 전달효소가 숙주 세포에 대해 이종성인 원핵 숙주 세포.
26. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고사카릴 전달효소가 C. 제주니 올리고사카릴 전달효소 pglB인 원핵 숙주 세포.
27. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질이 숙주 세포에 대해 이종성인 원핵 숙주 세포.
28. 제 1항 내지 제 11항, 제 25항, 제 26항, 또는 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 담체 단백질이 E. 콜라이 단백질이 아닌 원핵 숙주 세포.
29. 사카라이드 또는 올리고사카라이드와 SEQ ID NO:11을 포함하는 람노실 전달효소를 인큐베이션시키는 것을 포함하는 L-Rha(2Ac)를 포함하는 올리고사카라이드를 생성시키기 위한 방법으로서, 상기 사카라이드 또는 올리고사카라이드가 말단 D-GlcNAc를 포함하는, 방법.
30. 제 29항에 있어서, L-Rha(2Ac) 및 D-GlcNAc가 알파 1, 3 결합을 통해 연결되는 방법.
31. 제 29항에 있어서, 상기 인큐베이션이 시험관 내에서 발생하는 방법.
32. 제 29항에 있어서, 상기 올리고사카라이드가 SEQ ID NO:11을 포함하는 람노실 전달효소를 재조합적으로 발현하는 숙주 세포에서 생성되는 방법.
구체예 2:
1. (i) 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유적으로 결합된 E. 콜라이 O25B 항원을 포함하는 O25B 바이오컨주게이트, (ii) 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유적으로 결합된 E. 콜라이 O1A 항원을 포함하는 O1A 바이오컨주게이트, (iii) 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유적으로 결합된 E. 콜라이 O2 항원을 포함하는 O2 바이오컨주게이트, 및 (iv) 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유적으로 결합된 E. 콜라이 O6 항원을 포함하는 O6 바이오컨주게이트를 포함하는, 조성물.
2. 제 1항에 있어서, O25B 항원, O1A 항원, O6 항원, 및 O2 항원이 각각 하기 화학식을 포함하는 조성물:
a. 화학식 O25B'
Figure 112016092556323-pct00102
b. 화학식 O1A'
Figure 112016092556323-pct00103
c. 화학식 O6Glc'
Figure 112016092556323-pct00104
d. 화학식 O2'
Figure 112016092556323-pct00105
.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 담체 단백질이 P. 애루기노사의 무독화된 외독소 A(EPA), CRM197, 말토스 결합 단백질(MBP), 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스의 무독화된 용혈소 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜라이 FimH, E. 콜라이 FimHC, E. 콜라이 열 민감성 장독소, E. 콜라이 열 민감성 장독소의 무독화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛(CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜라이 Sat 단백질, E. 콜라이 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴몰리신 및 이의 무독화된 변이체, C. 제주니 AcrA, 및 C. 제주니 천연 당단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 담체 단백질이 무독화된 EPA, CRM197, 또는 MBP인 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질의 Asn 잔기가 X 및 Z가 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택되는 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)(SEQ ID NO:15)에 위치되는 조성물.
6. 장외 병원성 에스체리치아 콜라이에 의한 대상체의 감염을 치료하기 위한 방법으로서, 유효량의 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
7. 장외 병원성 에스체리치아 콜라이에 의한 대상체의 감염을 예방하기 위한 방법으로서, 유효량의 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
8. 장외 병원성 에스체리치아 콜라이에 대한 대상체의 면역 반응을 유도하기 위한 방법으로서, 유효량의 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
9. 장외 병원성 에스체리치아 콜라이에 특이적인 대상체에서 옵소닌식균작용성항체의 생성을 유도하기 위한 방법으로서, 유효량의 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에 투여하는 것을 포함하는, 방법.
10. 제 6항, 제 8항, 또는 제 9항에 있어서, 대상체가 요로 감염을 갖는 것으로 진단된 방법.
11. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 요로 감염이 발생할 위험이 있는 방법.
12. 제 6항, 제 8항, 또는 제 9항에 있어서, 대상체가 세균혈증을 갖는 것으로 진단된 방법.
13. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 세균혈증이 발생할 위험이 있는 방법.
14. 제 6항, 제 8항, 또는 제 9항에 있어서, 대상체가 패혈증을 갖는 것으로 진단된 방법.
15. 제 7항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 패혈증이 발생할 위험이 있는 방법.
16. 제 6항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
SEQUENCE LISTING <110> GlycoVaxyn AG <120> NOVEL POLYSACCHARIDE AND USES THEREOF <130> 13064-042 <140> TBA <141> On even date herewith <150> 61/943,710 <151> 2014-02-24 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1086 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> rmlB (upec138) <400> 1 gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt ctgctgttgt tcgtcacata 60 ataaataata cgcaagatag tgttgttaat gtcgataaat taacatacgc cggaaacctg 120 gaatcacttg cagatgtttc tgattctgaa cgctatttct ttgaacatgc ggatatttgt 180 gatgcagctg caatggcacg gatttttgct cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg 240 gcagctgaaa gccatgttga ccgttcaatt acaggccctg cggcatttat tgaaaccaat 300 attgtgggta cttatgtcct tttagaagcg gctcggaatt attggtctgg tctggatgat 360 gaaaagaaaa aaaacttccg ttttcatcat atttctactg atgaggtgta tggtgactta 420 ccccatccgg atgaagtaaa tagcaatgaa acgttgccgc tatttacgga aacgacagca 480 tacgcgccaa gtagtccata ttctgcttct aaagcttcca gcgatcattt ggttcgcgca 540 tggaaacgta cttatggttt accgaccatt gtgactaatt gctcgaacaa ctatggtcct 600 tatcatttcc cggaaaagct tattccactg gttattctta attcactgga aggtaaggca 660 ttacctattt atggcaaagg agatcagatc cgcgactggt tgtatgtaga ggatcatgct 720 cgagcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggcg aaacttataa cattggtgga 780 cacaacgaaa agaaaaacat cgacgtagtg ttcactattt gtgatttgtt ggatgagata 840 gtcccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg ttaccgatcg tccgggacac 900 gatcgccgtt atgcgattga tgctgagaag attggtcgcg aattgggatg gaaaccacag 960 gaaacgtttg agagtgggat tcgtaaaacg gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg 1020 gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc 1080 cagtaa 1086 <210> 2 <211> 900 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> rmlD (upec138) <400> 2 atgaatatcc tcctttttgg caaaacaggg caggtaggtt gggaactaca gcgtgctctg 60 gcacctctgg gtaatttgat tgctcttgat gttcactcca ctgattactg tggtgatttt 120 agtaatcctg aaggtgtagc tgaaaccgta agaagcattc ggcctgatat tattgtcaac 180 gcagccgctc acaccgcagt agacaaagca gaatcagaac cgaagtttgc acaattactg 240 aacgcgacga gtgtcgaagc gatcgcgaaa gcagccaatg aagtcggcgc ctgggttatt 300 cactactcta ctgactacgt atttccgggg accggtgaaa taccatggca ggaggaggat 360 gcaaccgcac cgctaaatgt ttacggtgaa accaagttag cgggagaaaa agcattacaa 420 gagcattgtg cgaagcacct tattttccgg accagctggg tctatgcagg taaaggaaat 480 aacttcgcca aaacaatgtt gcgtctggca aaagagcgtg aagaattagc cgttattaat 540 gatcagtttg gtgcgccaac tggcgcagag ttactggctg attgtacggc acatgctatt 600 cgtgtggcac tgaataaacc ggaagtcgca ggcttgtacc atctggtagc tagtggtacc 660 acaacgtggc acgattatgc tgcgctggtt tttgaagagg cgcgcaaagc aggcattccc 720 cttgcactca acaagctcaa cgcagtacca acaacagcct atcctacacc agctcgtcgt 780 ccacataact ctcgccttaa tacagaaaaa tttcagcaga actttgcgct tgtcttgcct 840 gactggcagg ttggcgtgaa acgaatgctt aacgaattat ttacgactac agcaatttaa 900 <210> 3 <211> 879 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> rmlA (upec138) <400> 3 atgaaaacgc gtaaaggtat tattttggcg ggtggttctg gtactcgtct ttatcctgtg 60 acgatggccg tcagtaaaca gctgttaccg atttatgata aaccgatgat ctattacccg 120 ctctctacac tgatgttagc gggtattcgc gatattctga ttatcagtac accacaggat 180 actcctcgtt ttcaacaact gctgggtgac gggagccagt ggggcctgaa tcttcagtac 240 aaagtgcaac cgagtccgga tggtcttgcg caggcgttta ttatcggtga agagtttatt 300 ggtggtgatg attgtgcttt ggtacttggt gataatatct tctacggcca cgacctgccg 360 aagttaatgg acgtagctgt taacaaagaa agtggtgcaa cggtatttgc ctatcacgtt 420 aatgatcctg aacgttatgg tgtcgtggag tttgataata acggtactgc aattagcctg 480 gaagaaaaac cgctggaacc aaaaagtaac tatgcggtta ctgggcttta tttctatgac 540 aatgacgttg tggaaatggc gaaaaacctt aagccttctg cccgaggtga actggaaatt 600 accgatatta accgtattta tatggaacaa ggacgtttgt ctgtcgctat gatggggcgt 660 ggctatgcat ggctggatac agggacgcat caaagtctta ttgaagcaag caacttcatt 720 gccaccattg aagagcgcca gggactaaag gtttcctgtc cggaagaaat tgcttatcgt 780 aaagggttta ttgatgctga gcaggtaaaa gtattagccg aaccgttgaa gaaaaatgct 840 tatggtcagt atctgctcaa aatgattaaa ggttattaa 879 <210> 4 <211> 543 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> rmlC (upec138) <400> 4 atgaacgtaa ttaaaactga aattcctgat gtgctgattt ttgaaccaaa agtttttggg 60 gatgaacgtg gcttcttttt tgagagtttt aatcagagga tttttgaaga agcagtaggt 120 cgtaaggttg agtttgttca ggataaccat tctaagtcca gtaaaggtgt tttacgtggt 180 cttcattatc agttagaacc ttatgctcaa ggaaaactgg tgcgctgtgt tgttggcgag 240 gtttttgatg ttgcggttga tattcgtaaa tcgtcaccta catttgggaa atgggttggg 300 gtgaatttgt ctgctgagaa taagcgtcag ttgtggattc ctgagggatt tgcacatggt 360 tttttggtgc tgagtgattt agcagaagtt ttatataaaa cgaatcaata ttatgctcca 420 tcacatgaaa aaaatattat atggaatgac ctcttgctta atattaaatg gccgagcaca 480 gcactgatca ctctgtctga taaggatgca aatggggaaa gatttgaact aagtgagttt 540 tga 543 <210> 5 <211> 1260 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> wzx (upec138) <400> 5 atgtctctct taaaacatag tatatggaat gttgcgggct actttatacc aacattaatt 60 gcaattcccg cctttggatt aattgcgagg aaaattggtg tagaactatt tggtttgtat 120 acgttagcaa tgatttttat agggtatgca agtatatttg atgctgggtt aacaagagct 180 gttgtgcgtg aaatagcatt actaaaaaac agagtggacg attgtaatac gataatagta 240 acttctatta tcgctgtgat atttttaggg tttatcggag gcgggggagt gtttctgctt 300 aaaggcgata ttattgaact gttaaatatc tcaccaatat attacgccga ttcgataaag 360 tctctagtat tattatcatc tctgatacct gtattcttag tcacgcaaat actattagca 420 gagcttgagg gtcgggaata ttttgggatt ctaaatatac aaaaaagtgt agggaattct 480 ttaattgcag ggttacctgc attatttgtt ttaattaatc aaacgctttt ttctgcaatt 540 attggtgtag cgattgcaag agttatatgc ttgtggttaa gctacattat gagcagggaa 600 agaataacta tcgatatctc atttttttca ataactgttt taaagcggtt atttagatat 660 ggcgggtggg taactataag taacataata tctcctatat tagcgagtat ggatagattt 720 attctatccc atatccaggg agcatcaaaa atatcattct atacagtccc taatgagctg 780 gtaactaggc ttggaatagt tccaggctct cttgggaaag ctgtttttcc aaaattaagt 840 catgcaagga attttacagc gtcatatgca gagcaaaaaa aagcttatat attaatgact 900 gtcattgtaa tgcctttggt tttatttgta tattattacg caaagtttat tttaacattg 960 tggatggggg ctgagtatgc agggatttcg gtcgaaatat tacggattat gcttataggg 1020 tatattttta actgttattc acaaatctct tttgccaaca tacaggcctt tggaaaagca 1080 aaatacactg catacatcca tatgatggaa tttattcctt atttgataat gttatatata 1140 atttcaaagg aatatggggt tattggtgtt gcgtggttat ggacaattcg agtaataatt 1200 gattttttga tgcttttata tatgagttat cgttgtaata atcttatgaa aaaagggtag 1260 <210> 6 <211> 966 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> wekA (upec138) <400> 6 atgatatata ttgtggtatt aaattggaat ggggctatag ataccattaa ttgtgttaaa 60 agtttaatgg atttaaatgt tagcgattat aaaattatca ttgttgataa ctgttctatg 120 gataactcat atgatactat aaaagaaaat cttaattcat tatatattgc tgataaaagt 180 atcattgagg tgaagtatga ggatagaaat aaatataaaa ccttagaaaa cgataaaatc 240 atattaatac aatctccgca aaataatggg tacgcaagtg gtaataatat tggcatagag 300 ttcgctctta atcaggagaa tatgaaatac gtctgggttc tgaataatga tactgaagtg 360 gataaagagg ctttaactca tttaattagt aaatgtgatt cagataaaag tatagggatt 420 tgcggttctc gtttagtcta ttttgccgac agagagatgc agcaaggact aggtggggtg 480 cataacaaat ggttatgcac tacaaaaaat tatgaaatgg gaagattagt ttccaaaaaa 540 tatgatgatg aagtcattag taatgatata gattatataa ttggcgcatc gatgtttttc 600 tctagagaat gtttggaaac agttggattg atgaatgaag aatatttttt atactatgaa 660 gagttagata tttgcctcag agcaaaagca aagaacttta aattaggtat ttgctcagaa 720 agtttggttt atcataaaat aggtgcaagt actgatgggg gaaagagcat gatggctgat 780 ctttgctcaa taaaaaatag gctggtcatt acagaaaggt tttatcccca atattattgg 840 acggtatggt tgtcactttt tgttgtagca tttaaccgtg ctagaagagg tgagtttaat 900 aagatgaaaa gatgtttgaa tgttatgttt aacttcaaac gaaacaaagg tagcaaatgc 960 cattag 966 <210> 7 <211> 1149 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> wekB (upec138) <400> 7 atgaaagtgg cttttttatc tgcttatgat ccactatcta catccagttg gtctggcaca 60 ccttattata tgctaaaggc attatcgaag agaaatattt ccattgaaat attaggaccg 120 gtaaatagct atatgatata catgttaaaa gtatataaat taatattaag gtgtttcgga 180 aaagaatatg attatagtca ttcgaagttg ctttccaggt attacggtag aatattcggt 240 aggaaattaa aaaaaattga tggtttggat tttattatcg cacctgcagg ttcctcacaa 300 attgcttttt taaaaacaac cataccaata atatatctat cggatacaac atatgatcaa 360 ttaaaaagct attatccgaa tttaaataaa aaaacaatta taaatgatga ggatgcaagt 420 ttaatcgaac gcaaggctat tgaaaaagca acagtagtat ctttcccatc taaatgggca 480 atggattttt gcaggaatta ttacagatta gattttgata aattagttga aataccatgg 540 ggggctaatt tatttgatga tattcacttt gctaataaaa atataattca aaagaatagt 600 tatacttgtc ttttcttggg agttgattgg gaaagaaaag gtgggaaaac agccttgaaa 660 gcaattgaat atgtaaggca gttatatggg atcgatgtta gactaaaaat ttgtggatgt 720 actccgaatc aaaagatttt acctacttgg gttgaattaa ttgataaagt agataaaaat 780 aacgttgacg aatatcagaa attcatcgat gtgttatcta acgctgatat acttctttta 840 ccaaccattg ctgaatgtta tggaatggta ttttgtgaag ctgctgcttt tggattgcct 900 gttgtcgcta cagatacagg tggagtcagt tctatagtta tcaacgaaag gacggggata 960 ttaattaaag acccgttaga ctataagcac tttggaaatg caattcataa aataattagt 1020 tccgtagaga cttatcaaaa ctactcccaa aacgcaagaa ttagatataa taatatattg 1080 cattgggaca attgggctaa aaagataatt gagattatgt atgagcataa gaatagaaga 1140 atcaaatag 1149 <210> 8 <211> 1218 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> wzy (upec138) <400> 8 atgagcataa gaatagaaga atcaaatagc acaaaaagaa ttatatgttt atttatactt 60 tttcttgttt tccctgattt tttgttttat acattagggg ttgataattt tagcatttca 120 acgataatct caattacatt gctttttgtt tttttaagag ctaaaaatat ttgcaaagat 180 aattttctaa taatagtagc gttattcata ttgttgtgtt ttaactgttt gttaagtatg 240 ctatttaata ttgaacaggc tttaacattt aaagttgtac tttcaatata tagcatctta 300 ataatggcat acgtctcctc ttgttatgca cagacgttgt ggttatgttc tgaagaaata 360 cttaagagat ccgtctttta tttgttcgca tttctttgcc ttattggcat tataagtatt 420 cttttacaga agactgagat tatacatgat aaaagtatga ttctttttcc tgaaccatca 480 gcatttgcat tggtttttat acctatcttt tcattttgtt tatactatac aagagggggg 540 gggctactat tgctctatat attatctttg ggtattgcgt taggtatcca gaatttaaca 600 atgttggtag gcattgtgat tagtgttttt gtgatgaaaa aaataactat aaggcaaact 660 attgttatac ttttgggggc atggattttt tccatgatat taagtgattt agacatttct 720 tactatacat cgcggcttga ttttaaaaat actacgaacc tatcagtgct tgtatatctt 780 tcaggaattg aaagagcttt cttgaatttt attacaagtt atggtcttgg tattggtttt 840 caacaaatgg gagtgaatgg ggagatagga atatatcaac aaattttagc tgaacttgat 900 gcccctatgt taaatatata cgatggctca tttatttctt ctaagttaat atctgagttt 960 ggggttattg gtgcattaat gtgtattttc tatttttttt atttttcccg attttatctg 1020 cgtttcaaaa aaagtaagag atattcaccg cagtatattt tagcatatag cttctacatg 1080 tgtttcttca tccctctttt tatacgtggt gctggttata taaaccccta tgtgtttatg 1140 ttattttcat caatattttt gtgcaaatat cacgctaaaa atatcttgat gaaatctaat 1200 gtccagatag ctatataa 1218 <210> 9 <211> 606 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> wbbJ (upec138) <400> 9 atgtgcatta aaaaaaaact taagttaatt aaacgatatg gcctttatgg tggtcttagg 60 cttcttaaag atatattctt aacaaaattt ttattttgtt caaatgttag gattattaga 120 tttccatgtt atattagaaa agatggaagt gttagttttg gaaaaggttt tacatcaggt 180 gtaggattac gagttgatgc atttatggat gccgtagttt ccattggaga aaatgttcaa 240 attaatgact atgttcacat cgcggctatt aataatgtca ttattggtag agatacatta 300 atagcaagta aagtatttat tagtgatcat aatcatggta ttttttctaa atccgatatc 360 catagttcac caactattat tccttcgtct aggccccttg aatctgcacc tgtgtatatt 420 ggagagcgtg tgtggattgg cgaaaatgtg acaatattac caggtgcgtg tataggtaat 480 ggtgtagtta ttggcgcaaa cagtgttgtt cgtggtgaga ttcctaataa tgtgatcatt 540 gctggtgttc cagctaaaat tgttaaaaaa tataactatg agcgtatgca atgggaaaga 600 atatag 606 <210> 10 <211> 1101 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> wbbK (upec138) <400> 10 atgggaaaga atatagttgt aatatcggct gttaatttta caaccggagg cccctttacc 60 gtactaaaaa atgtgcttac agcaactaaa gatagagccg aatgtaaatt tattgcactg 120 gttcatagct ctgctgaact aatggaatta tttccgtggg ttgaatttat agagtatcca 180 gaagtcaagt cttcgtgggt taaaagatta tatttcgaat atataacttg caatagatta 240 tctaaggtga ttaaggcaac tcattgggta tgcttacatg atattacagc aaatgttagt 300 gtaccctata gatttgttta ttgccacaat cctgcaccgt tctataaata tttaagctat 360 cgagatatta taggagaacc taaattttat cttttttatc ttttttatgg gcttttatac 420 aatatcaata taaaaaagaa cacagcagtt tttgttcagc agcagtggct aaaaaaagaa 480 ttcgaaaaaa aatataagtt aaagaatgtt gttgttagtc gccctgaaga tatttgccct 540 tttgaaagtg atggtttggt aagaaataat aataaaaagg atgtgaggat attttaccca 600 gcagtgcccc gtatatttaa aaactttgaa gttatcatac gtgctgcaca aatattacaa 660 gataaaaata ttcattttta tcttactttt gatggtactg aaaataagta tgcaaaaaga 720 atatataaat tagcttccga actgaaaaat gtacatttcc tcggttacct taatgcaacc 780 gagatggtta acttttatca agattcagat attatttgtt tcccatcgaa actagaaacg 840 tggggattac cattatcaga agctaaaaca tacaaaaaat ggatatttgc ggcagactta 900 ccttatgctc atgaagtttt atataactat tcaaaaacta gatattttcc atttgacgat 960 gagaaaatac ttgttcgcta catattagag tacacaagta aaaatatgca tgaagatata 1020 aaaaatagta gggtgaattt taataatgat gcattgactg gttttgaaca gtttattgaa 1080 tatatcctca aggggaactg a 1101 <210> 11 <211> 564 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> wbbL (upec138) <400> 11 atgattatga ataatgatta ttttctcttt cttaaccccg atgtattcat aaccagtgaa 60 agtttgatta attatgttga ttatataatt agtaatgatt ataagtttag cacattatgt 120 ctttatcgag attttactaa aagcaaacat gattattcaa tacggagttt tccaacttta 180 tatgattttc tttgttcttt tttattgggg gtgaataaaa gtaaaattaa gaaggaaaat 240 atactttctg atactgtagt tgattggtgt gctggctcat ttatgcttat tcatgcttta 300 agtttcttaa atgtgaatgg ttttgatcaa aaatatttta tgtattgtga agatattgac 360 ctttgtatgc gtttaaaatt aagtggagta gatctttact atactcccca ttttgatgct 420 attcattatg cgcagcatga aaatagaaga atatttacta aagcatttcg atggcatata 480 aggagtatta cgcgctacat attacggaaa ccaattcttt cttataaaaa ctatagaaaa 540 attacatccg aactggtaaa gtga 564 <210> 12 <211> 10653 <212> DNA <213> E. Coli <220> <223> E. coli rfb(upec138) gene cluster <400> 12 gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt ctgctgttgt tcgtcacata 60 ataaataata cgcaagatag tgttgttaat gtcgataaat taacatacgc cggaaacctg 120 gaatcacttg cagatgtttc tgattctgaa cgctatttct ttgaacatgc ggatatttgt 180 gatgcagctg caatggcacg gatttttgct cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg 240 gcagctgaaa gccatgttga ccgttcaatt acaggccctg cggcatttat tgaaaccaat 300 attgtgggta cttatgtcct tttagaagcg gctcggaatt attggtctgg tctggatgat 360 gaaaagaaaa aaaacttccg ttttcatcat atttctactg atgaggtgta tggtgactta 420 ccccatccgg atgaagtaaa tagcaatgaa acgttgccgc tatttacgga aacgacagca 480 tacgcgccaa gtagtccata ttctgcttct aaagcttcca gcgatcattt ggttcgcgca 540 tggaaacgta cttatggttt accgaccatt gtgactaatt gctcgaacaa ctatggtcct 600 tatcatttcc cggaaaagct tattccactg gttattctta attcactgga aggtaaggca 660 ttacctattt atggcaaagg agatcagatc cgcgactggt tgtatgtaga ggatcatgct 720 cgagcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggcg aaacttataa cattggtgga 780 cacaacgaaa agaaaaacat cgacgtagtg ttcactattt gtgatttgtt ggatgagata 840 gtcccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg ttaccgatcg tccgggacac 900 gatcgccgtt atgcgattga tgctgagaag attggtcgcg aattgggatg gaaaccacag 960 gaaacgtttg agagtgggat tcgtaaaacg gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg 1020 gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc 1080 cagtaatgaa tatcctcctt tttggcaaaa cagggcaggt aggttgggaa ctacagcgtg 1140 ctctggcacc tctgggtaat ttgattgctc ttgatgttca ctccactgat tactgtggtg 1200 attttagtaa tcctgaaggt gtagctgaaa ccgtaagaag cattcggcct gatattattg 1260 tcaacgcagc cgctcacacc gcagtagaca aagcagaatc agaaccgaag tttgcacaat 1320 tactgaacgc gacgagtgtc gaagcgatcg cgaaagcagc caatgaagtc ggcgcctggg 1380 ttattcacta ctctactgac tacgtatttc cggggaccgg tgaaatacca tggcaggagg 1440 aggatgcaac cgcaccgcta aatgtttacg gtgaaaccaa gttagcggga gaaaaagcat 1500 tacaagagca ttgtgcgaag caccttattt tccggaccag ctgggtctat gcaggtaaag 1560 gaaataactt cgccaaaaca atgttgcgtc tggcaaaaga gcgtgaagaa ttagccgtta 1620 ttaatgatca gtttggtgcg ccaactggcg cagagttact ggctgattgt acggcacatg 1680 ctattcgtgt ggcactgaat aaaccggaag tcgcaggctt gtaccatctg gtagctagtg 1740 gtaccacaac gtggcacgat tatgctgcgc tggtttttga agaggcgcgc aaagcaggca 1800 ttccccttgc actcaacaag ctcaacgcag taccaacaac agcctatcct acaccagctc 1860 gtcgtccaca taactctcgc cttaatacag aaaaatttca gcagaacttt gcgcttgtct 1920 tgcctgactg gcaggttggc gtgaaacgaa tgcttaacga attatttacg actacagcaa 1980 tttaatagtt tttgcatctt gttcgtaatg gtggagcaag atgtattaaa aggaatgatg 2040 aaatgaaaac gcgtaaaggt attattttgg cgggtggttc tggtactcgt ctttatcctg 2100 tgacgatggc cgtcagtaaa cagctgttac cgatttatga taaaccgatg atctattacc 2160 cgctctctac actgatgtta gcgggtattc gcgatattct gattatcagt acaccacagg 2220 atactcctcg ttttcaacaa ctgctgggtg acgggagcca gtggggcctg aatcttcagt 2280 acaaagtgca accgagtccg gatggtcttg cgcaggcgtt tattatcggt gaagagttta 2340 ttggtggtga tgattgtgct ttggtacttg gtgataatat cttctacggc cacgacctgc 2400 cgaagttaat ggacgtagct gttaacaaag aaagtggtgc aacggtattt gcctatcacg 2460 ttaatgatcc tgaacgttat ggtgtcgtgg agtttgataa taacggtact gcaattagcc 2520 tggaagaaaa accgctggaa ccaaaaagta actatgcggt tactgggctt tatttctatg 2580 acaatgacgt tgtggaaatg gcgaaaaacc ttaagccttc tgcccgaggt gaactggaaa 2640 ttaccgatat taaccgtatt tatatggaac aaggacgttt gtctgtcgct atgatggggc 2700 gtggctatgc atggctggat acagggacgc atcaaagtct tattgaagca agcaacttca 2760 ttgccaccat tgaagagcgc cagggactaa aggtttcctg tccggaagaa attgcttatc 2820 gtaaagggtt tattgatgct gagcaggtaa aagtattagc cgaaccgttg aagaaaaatg 2880 cttatggtca gtatctgctc aaaatgatta aaggttatta ataagatgaa cgtaattaaa 2940 actgaaattc ctgatgtgct gatttttgaa ccaaaagttt ttggggatga acgtggcttc 3000 ttttttgaga gttttaatca gaggattttt gaagaagcag taggtcgtaa ggttgagttt 3060 gttcaggata accattctaa gtccagtaaa ggtgttttac gtggtcttca ttatcagtta 3120 gaaccttatg ctcaaggaaa actggtgcgc tgtgttgttg gcgaggtttt tgatgttgcg 3180 gttgatattc gtaaatcgtc acctacattt gggaaatggg ttggggtgaa tttgtctgct 3240 gagaataagc gtcagttgtg gattcctgag ggatttgcac atggtttttt ggtgctgagt 3300 gatttagcag aagttttata taaaacgaat caatattatg ctccatcaca tgaaaaaaat 3360 attatatgga atgacctctt gcttaatatt aaatggccga gcacagcact gatcactctg 3420 tctgataagg atgcaaatgg ggaaagattt gaactaagtg agttttgaaa tgtctctctt 3480 aaaacatagt atatggaatg ttgcgggcta ctttatacca acattaattg caattcccgc 3540 ctttggatta attgcgagga aaattggtgt agaactattt ggtttgtata cgttagcaat 3600 gatttttata gggtatgcaa gtatatttga tgctgggtta acaagagctg ttgtgcgtga 3660 aatagcatta ctaaaaaaca gagtggacga ttgtaatacg ataatagtaa cttctattat 3720 cgctgtgata tttttagggt ttatcggagg cgggggagtg tttctgctta aaggcgatat 3780 tattgaactg ttaaatatct caccaatata ttacgccgat tcgataaagt ctctagtatt 3840 attatcatct ctgatacctg tattcttagt cacgcaaata ctattagcag agcttgaggg 3900 tcgggaatat tttgggattc taaatataca aaaaagtgta gggaattctt taattgcagg 3960 gttacctgca ttatttgttt taattaatca aacgcttttt tctgcaatta ttggtgtagc 4020 gattgcaaga gttatatgct tgtggttaag ctacattatg agcagggaaa gaataactat 4080 cgatatctca tttttttcaa taactgtttt aaagcggtta tttagatatg gcgggtgggt 4140 aactataagt aacataatat ctcctatatt agcgagtatg gatagattta ttctatccca 4200 tatccaggga gcatcaaaaa tatcattcta tacagtccct aatgagctgg taactaggct 4260 tggaatagtt ccaggctctc ttgggaaagc tgtttttcca aaattaagtc atgcaaggaa 4320 ttttacagcg tcatatgcag agcaaaaaaa agcttatata ttaatgactg tcattgtaat 4380 gcctttggtt ttatttgtat attattacgc aaagtttatt ttaacattgt ggatgggggc 4440 tgagtatgca gggatttcgg tcgaaatatt acggattatg cttatagggt atatttttaa 4500 ctgttattca caaatctctt ttgccaacat acaggccttt ggaaaagcaa aatacactgc 4560 atacatccat atgatggaat ttattcctta tttgataatg ttatatataa tttcaaagga 4620 atatggggtt attggtgttg cgtggttatg gacaattcga gtaataattg attttttgat 4680 gcttttatat atgagttatc gttgtaataa tcttatgaaa aaagggtagc ctgatgatat 4740 atattgtggt attaaattgg aatggggcta tagataccat taattgtgtt aaaagtttaa 4800 tggatttaaa tgttagcgat tataaaatta tcattgttga taactgttct atggataact 4860 catatgatac tataaaagaa aatcttaatt cattatatat tgctgataaa agtatcattg 4920 aggtgaagta tgaggataga aataaatata aaaccttaga aaacgataaa atcatattaa 4980 tacaatctcc gcaaaataat gggtacgcaa gtggtaataa tattggcata gagttcgctc 5040 ttaatcagga gaatatgaaa tacgtctggg ttctgaataa tgatactgaa gtggataaag 5100 aggctttaac tcatttaatt agtaaatgtg attcagataa aagtataggg atttgcggtt 5160 ctcgtttagt ctattttgcc gacagagaga tgcagcaagg actaggtggg gtgcataaca 5220 aatggttatg cactacaaaa aattatgaaa tgggaagatt agtttccaaa aaatatgatg 5280 atgaagtcat tagtaatgat atagattata taattggcgc atcgatgttt ttctctagag 5340 aatgtttgga aacagttgga ttgatgaatg aagaatattt tttatactat gaagagttag 5400 atatttgcct cagagcaaaa gcaaagaact ttaaattagg tatttgctca gaaagtttgg 5460 tttatcataa aataggtgca agtactgatg ggggaaagag catgatggct gatctttgct 5520 caataaaaaa taggctggtc attacagaaa ggttttatcc ccaatattat tggacggtat 5580 ggttgtcact ttttgttgta gcatttaacc gtgctagaag aggtgagttt aataagatga 5640 aaagatgttt gaatgttatg tttaacttca aacgaaacaa aggtagcaaa tgccattaga 5700 atatgcactt aatcatggtg ttaataaatc tatagtttga tatgttatta aagggtattt 5760 aatgaaagtg gcttttttat ctgcttatga tccactatct acatccagtt ggtctggcac 5820 accttattat atgctaaagg cattatcgaa gagaaatatt tccattgaaa tattaggacc 5880 ggtaaatagc tatatgatat acatgttaaa agtatataaa ttaatattaa ggtgtttcgg 5940 aaaagaatat gattatagtc attcgaagtt gctttccagg tattacggta gaatattcgg 6000 taggaaatta aaaaaaattg atggtttgga ttttattatc gcacctgcag gttcctcaca 6060 aattgctttt ttaaaaacaa ccataccaat aatatatcta tcggatacaa catatgatca 6120 attaaaaagc tattatccga atttaaataa aaaaacaatt ataaatgatg aggatgcaag 6180 tttaatcgaa cgcaaggcta ttgaaaaagc aacagtagta tctttcccat ctaaatgggc 6240 aatggatttt tgcaggaatt attacagatt agattttgat aaattagttg aaataccatg 6300 gggggctaat ttatttgatg atattcactt tgctaataaa aatataattc aaaagaatag 6360 ttatacttgt cttttcttgg gagttgattg ggaaagaaaa ggtgggaaaa cagccttgaa 6420 agcaattgaa tatgtaaggc agttatatgg gatcgatgtt agactaaaaa tttgtggatg 6480 tactccgaat caaaagattt tacctacttg ggttgaatta attgataaag tagataaaaa 6540 taacgttgac gaatatcaga aattcatcga tgtgttatct aacgctgata tacttctttt 6600 accaaccatt gctgaatgtt atggaatggt attttgtgaa gctgctgctt ttggattgcc 6660 tgttgtcgct acagatacag gtggagtcag ttctatagtt atcaacgaaa ggacggggat 6720 attaattaaa gacccgttag actataagca ctttggaaat gcaattcata aaataattag 6780 ttccgtagag acttatcaaa actactccca aaacgcaaga attagatata ataatatatt 6840 gcattgggac aattgggcta aaaagataat tgagattatg tatgagcata agaatagaag 6900 aatcaaatag cacaaaaaga attatatgtt tatttatact ttttcttgtt ttccctgatt 6960 ttttgtttta tacattaggg gttgataatt ttagcatttc aacgataatc tcaattacat 7020 tgctttttgt ttttttaaga gctaaaaata tttgcaaaga taattttcta ataatagtag 7080 cgttattcat attgttgtgt tttaactgtt tgttaagtat gctatttaat attgaacagg 7140 ctttaacatt taaagttgta ctttcaatat atagcatctt aataatggca tacgtctcct 7200 cttgttatgc acagacgttg tggttatgtt ctgaagaaat acttaagaga tccgtctttt 7260 atttgttcgc atttctttgc cttattggca ttataagtat tcttttacag aagactgaga 7320 ttatacatga taaaagtatg attctttttc ctgaaccatc agcatttgca ttggttttta 7380 tacctatctt ttcattttgt ttatactata caagaggggg ggggctacta ttgctctata 7440 tattatcttt gggtattgcg ttaggtatcc agaatttaac aatgttggta ggcattgtga 7500 ttagtgtttt tgtgatgaaa 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agttgatgca tttatggatg ccgtagtttc cattggagaa 8400 aatgttcaaa ttaatgacta tgttcacatc gcggctatta ataatgtcat tattggtaga 8460 gatacattaa tagcaagtaa agtatttatt agtgatcata atcatggtat tttttctaaa 8520 tccgatatcc atagttcacc aactattatt ccttcgtcta ggccccttga atctgcacct 8580 gtgtatattg gagagcgtgt gtggattggc gaaaatgtga caatattacc aggtgcgtgt 8640 ataggtaatg gtgtagttat tggcgcaaac agtgttgttc gtggtgagat tcctaataat 8700 gtgatcattg ctggtgttcc agctaaaatt gttaaaaaat ataactatga gcgtatgcaa 8760 tgggaaagaa tatagttgta atatcggctg ttaattttac aaccggaggc ccctttaccg 8820 tactaaaaaa tgtgcttaca gcaactaaag atagagccga atgtaaattt attgcactgg 8880 ttcatagctc tgctgaacta atggaattat ttccgtgggt tgaatttata gagtatccag 8940 aagtcaagtc ttcgtgggtt aaaagattat atttcgaata tataacttgc aatagattat 9000 ctaaggtgat taaggcaact cattgggtat gcttacatga tattacagca aatgttagtg 9060 taccctatag atttgtttat tgccacaatc ctgcaccgtt ctataaatat ttaagctatc 9120 gagatattat aggagaacct aaattttatc ttttttatct tttttatggg cttttataca 9180 atatcaatat aaaaaagaac acagcagttt ttgttcagca gcagtggcta aaaaaagaat 9240 tcgaaaaaaa atataagtta aagaatgttg ttgttagtcg ccctgaagat atttgccctt 9300 ttgaaagtga tggtttggta agaaataata ataaaaagga tgtgaggata ttttacccag 9360 cagtgccccg tatatttaaa aactttgaag ttatcatacg tgctgcacaa atattacaag 9420 ataaaaatat tcatttttat cttacttttg atggtactga aaataagtat gcaaaaagaa 9480 tatataaatt agcttccgaa ctgaaaaatg tacatttcct cggttacctt aatgcaaccg 9540 agatggttaa cttttatcaa gattcagata ttatttgttt cccatcgaaa ctagaaacgt 9600 ggggattacc attatcagaa gctaaaacat acaaaaaatg gatatttgcg gcagacttac 9660 cttatgctca tgaagtttta tataactatt caaaaactag atattttcca tttgacgatg 9720 agaaaatact tgttcgctac atattagagt acacaagtaa aaatatgcat gaagatataa 9780 aaaatagtag ggtgaatttt aataatgatg cattgactgg ttttgaacag tttattgaat 9840 atatcctcaa ggggaactga cgtggtttat attataatcg tttcacatgg ccatgatgac 9900 tatatagaaa atcttttatt aaatttaaag ttgccctctg gaagatttaa aataatagtt 9960 cgtgataaca aaagttcaat ggttttaaaa aaaacatgcg aaaaaaattg cgtaacctat 10020 ttgcatggag ggcaatatgg atttggacat aataataaca tagcagtgtc atatataatt 10080 aataacttca tgattatgaa taatgattat tttctctttc ttaaccccga tgtattcata 10140 accagtgaaa gtttgattaa ttatgttgat tatataatta gtaatgatta taagtttagc 10200 acattatgtc tttatcgaga ttttactaaa agcaaacatg attattcaat acggagtttt 10260 ccaactttat atgattttct ttgttctttt ttattggggg tgaataaaag taaaattaag 10320 aaggaaaata tactttctga tactgtagtt gattggtgtg ctggctcatt tatgcttatt 10380 catgctttaa gtttcttaaa tgtgaatggt tttgatcaaa aatattttat gtattgtgaa 10440 gatattgacc tttgtatgcg tttaaaatta agtggagtag atctttacta tactccccat 10500 tttgatgcta ttcattatgc gcagcatgaa aatagaagaa tatttactaa agcatttcga 10560 tggcatataa ggagtattac gcgctacata ttacggaaac caattctttc ttataaaaac 10620 tatagaaaaa ttacatccga actggtaaag tga 10653 <210> 13 <211> 652 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Detoxified EPA protein comprising 4 optimized N-glycosylation sequences <400> 13 Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Lys 1 5 10 15 Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys 20 25 30 Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp 35 40 45 Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met 50 55 60 Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala 65 70 75 80 Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val 85 90 95 Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly 100 105 110 Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser 115 120 125 Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser 130 135 140 His Met Ser Pro Ile Tyr Thr Ile Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala 145 150 155 160 Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn 165 170 175 Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val 180 185 190 Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala 195 200 205 Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn 210 215 220 Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys 225 230 235 240 Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile 245 250 255 Lys Asp Asn Asn Asn Ser Thr Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His 260 265 270 Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys 275 280 285 His Leu Pro Leu Glu Ala Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp 290 295 300 Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu 305 310 315 320 Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg 325 330 335 Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile 340 345 350 Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala 355 360 365 Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly 370 375 380 Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Lys Asp 385 390 395 400 Gln Asn Arg Thr Lys Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp 405 410 415 Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp 420 425 430 Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val 435 440 445 Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val 450 455 460 Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val 465 470 475 480 Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg 485 490 495 Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln 500 505 510 Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu 515 520 525 Arg Val Tyr Val Pro Arg Trp Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly 530 535 540 Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile 545 550 555 560 Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu 565 570 575 Glu Gly Gly Arg Val Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr 580 585 590 Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly 595 600 605 Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala 610 615 620 Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu 625 630 635 640 Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr 645 650 <210> 14 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-glycosylation consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 14 Asn Xaa Xaa 1 <210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-glycosylation consensus sequence <220> <221> VARIANT <222> (1)..(1) <223> Xaa = Asp or Glu <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> Xaa = independently selected from any natural amino acid except Pro <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> Xaa = independently selected from any natural amino acid except Pro <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> Xaa = Ser or Thr <400> 15 Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 1 5

Claims (21)

  1. 담체 단백질에 공유 결합된 E. 콜라이 O25B 항원의 바이오컨주게이트를 포함하는 조성물로서, E. 콜라이 O25B 항원이 하기 화학식 O25B'의 구조를 포함하는 조성물:
    Figure 112017119255689-pct00154

    상기 식에서, n은 1 내지 30의 정수이다.
  2. 제 1항에 있어서, E. 콜라이 O25B 항원이 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유 결합된 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, (i) 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유 결합된 E. 콜라이 O1A 항원을 포함하는 O1A 바이오컨주게이트, (ii) 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유 결합된 E. 콜라이 O2 항원을 포함하는 O2 바이오컨주게이트, 및 (iii) 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유 결합된 E. 콜라이 O6 항원을 포함하는 O6 바이오컨주게이트를 추가로 포함하고, 상기 E. 콜라이 O25B 항체는 담체 단백질의 Asn 잔기에 공유결합된 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, O1A 항원, O6 항원, 및 O2 항원이 각각 하기 화학식을 포함하는 조성물:
    a. 화학식 O1A'
    Figure 112017119255689-pct00155
    ,
    b. 화학식 O6Glc'
    Figure 112017119255689-pct00156
    , 및
    c. 화학식 O2'
    Figure 112017119255689-pct00157

    화학식 01A', 화학식 O6Glc' 및 화학식 O2'에서 n은 정수이다.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 담체 단백질이 P. 애루기노사 (P. aeruginosa)의 무독화된 외독소 A(EPA), CRM197, 말토스 결합 단백질 (MBP), 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스 (S. aureus)의 무독화된 용혈소 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜라이 FimH, E. 콜라이 FimHC, E. 콜라이 열 민감성 장독소, E. 콜라이 열 민감성 장독소의 무독화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜라이 Sat 단백질, E. 콜라이 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴몰리신 (Streptococcus pneumoniae Pneumolysin) 및 이의 무독화된 변이체, C. 제주니 AcrA (C. jejuni AcrA), 및 C. 제주니 천연 당단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 담체 단백질이 무독화된 EPA인, 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 2항에 있어서, 담체 단백질의 Asn 잔기가 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)에 위치하는 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 장외 변원성 에스체리치아 콜라이에 대하여 대상체를 백신화시키는데 사용하기 위한 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 장외 변원성 에스체리치아 콜라이에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 4항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 장외 변원성 에스체리치아 콜라이에 대해 특이적인 옵소닌식균작용성 항체 생성을 유도하는데 사용하기 위한 조성물.
  12. 제 9항에 있어서, 대상체가 요로 감염, 세균혈증 또는 패혈증 발병 위험이 있는 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. a. i. dTDP-글루코스 4,6-데하이드라타제;
    ii. dTDP-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제;
    iii. 글루코스-1-포스페이트 티미딜일전달효소;
    iv. dTDP-4-데하이드로람노스 3,5-에피머라제;
    v. O 항원 플립파제;
    vi. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소;
    vii. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP β-1,6-글루코실전달효소;
    viii. O 항원 중합효소;
    ix. O-아세틸 전달효소;
    x. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP α-1,3-글루코실전달효소; 및
    xi. dTDP-Rha:GlcNAc-UPP α-1,3-람노실전달효소를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열;
    b. 올리고사카릴 전달효소를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
    c. 컨센서스 서열 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr) (여기에서 X 및 Z는 Pro를 제외한 임의의 천연 아미노산으로부터 독립적으로 선택됨) (SEQ ID NO:15)을 포함하는 담체 단백질을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 원핵 숙주 세포.
  17. 제 16항에 있어서, 원핵 숙주 세포가 E. 콜라이 숙주 세포인 원핵 숙주 세포.
  18. 제 16항에 있어서, waaL 유전자, gtrA 유전자, gtrB 유전자, gtrS 유전자, 또는 rfb 클러스터 중 적어도 하나가 원핵 숙주 세포의 게놈에서 결실되거나 기능적으로 불활성화된 원핵 숙주 세포.
  19. 제 16항 또는 제 18항에 있어서, 담체 단백질이 P. 애루기노사의 무독화된 외독소 A(EPA), CRM197, 말토스 결합 단백질 (MBP), 디프테리아 톡소이드, 파상풍 톡소이드, S. 아우레우스의 무독화된 용혈소 A, 응괴 인자 A, 응괴 인자 B, E. 콜라이 FimH, E. 콜라이 FimHC, E. 콜라이 열 민감성 장독소, E. 콜라이 열 민감성 장독소의 무독화된 변이체, 콜레라 독소 B 서브유닛 (CTB), 콜레라 독소, 콜레라 독소의 무독화된 변이체, E. 콜라이 Sat 단백질, E. 콜라이 Sat 단백질의 패신저 도메인, 스트렙토코커스 뉴모니애 뉴몰리신 및 이의 무독화된 변이체, C. 제주니 AcrA, 및 C. 제주니 천연 당단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 원핵 숙주 세포.
  20. 제 19항에 있어서, 담체 단백질이 무독화된 EPA인 원핵 숙주 세포.
  21. E. 콜라이 O25B 항원을 포함하는 N-당화된 담체 단백질을 제조하는 방법으로서,
    a. 제 16항 또는 제 18항의 원핵 숙주 세포를 배양하고;
    b. E. 콜라이 O25B 항원을 포함하는 N-당화된 담체 단백질을 정제하는 것을 포함하는 방법.
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