ES2778074T3 - Procedimientos de modificación de células hospedadoras - Google Patents

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Abstract

Una célula hospedadora procariota aislada, en la que i) un gen heterólogo que codifica una oligosacaril transferasa y ii) ADN de al menos 8 kb que codifica un complejo génico rfb o un complejo génico del polisacárido capsular, se han insertado en el genoma de la célula hospedadora.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos de modificación de células hospedadoras
1 Introducción
En el presente documento se describen procedimientos para insertar secuencias de ácidos nucleicos en las células hospedadoras. También se describen en el presente documento células hospedadoras genéticamente estables que comprenden secuencias de ácidos nucleicos insertadas y los procedimientos para usar estas células hospedadoras en la generación de las proteínas y el uso de estas células hospedadoras para la glucosilación de las proteínas.
2 Antecedentes
La expresión recombinante de genes individuales o de fragmentos pequeños de ADN se lleva a cabo más frecuentemente proporcionando el gen recombinante sobre un plásmido. Los plásmidos pueden producirse y manipularse de una manera eficiente mediante técnicas de biología molecular [1]. Se insertan rápidamente en una célula hospedadora y se mantienen mediante la selección de antibiótico conferida a la célula hospedadora portadora del plásmido mediante un casete de resistencia que también está codificado en la molécula del plásmido circular. Típicamente, las proteínas recombinantes se expresan usando plásmidos que contienen los genes que codifican las proteínas.
La expresión recombinante de fragmentos grandes de ADN tiene diversas limitaciones. Por ejemplo, los plásmidos de expresión convencional con frecuencia son genéticamente inestables después de la inserción de fragmentos grandes de ADN. Frecuentemente, se usan cósmidos y/o fósmidos, que contienen elementos que estabilizan el ADN insertado mediante varios mecanismos, en los intentos por superar la inestabilidad del plásmido. Además, los números de copias de los plásmidos varían sobre diferentes órdenes de magnitud, dependiendo del origen de replicación y pueden estar adicionalmente influenciados por el estado de crecimiento [2], la composición del medio y las diferencias individuales de célula a célula [3]. Además, hay solamente un número limitado de cósmidos y fósmidos disponibles. De esta manera, en general es difícil combinar múltiples fragmentos grandes de ADN en una sola célula.
Un inconveniente adicional de los plásmidos en general, ya sean grandes o pequeños, es la necesidad de presión de selección para mantener los elementos episómicos en la célula. La presión de selección requiere del uso de antibióticos, que es indeseable para la producción de productos medicinales debido al peligro de que se presenten reacciones alérgicas contra los antibióticos y a los costes adicionales para la elaboración. Adicionalmente, la presión de selección con frecuencia no es completa, dando como resultado cultivos bacterianos no homogéneos en los que algunos clones han perdido el plásmido y de esta manera ya no producen más el producto recombinante [4].
Además, es difícil la inserción cromosómica de fragmentos grandes de ADN en las células hospedadoras. Aunque se han usado estrategias para insertar fragmentos grandes de ADN en el genoma de E. coli [5], Kuhlman y Cox Nucleic Acids Research 38; E92-1 (2010) y Lee y col. BMC Microbiology 9; 252 (2009), los procedimientos que existen actualmente no permiten la inserción de fragmentos de ADN mayores de 8 kb en los sitios deseados en los genomas de las células hospedadoras. La introducción del fragmento de ADN en células hospedadoras procariotas se desvela en Feldman y col. P.N.A.S. 102; 3016-3021 (2005), el documento WO 09/104074, el documento WO 06/119987, el documento W o 11/62615, el documento WO 13/34664, el documento WO 11/138361 e Ihssen y col. Microbial Cell Factories 9; 61 (2010).
3 Sumario
La invención proporciona, una célula hospedadora procariota aislada, en la que i) un gen heterólogo que codifica una oligosacaril transferasa y ii) ADN de al menos 8 kb que codifica un complejo génico del gen rfb o un complejo génico del gen del polisacárido capsular, se han insertado en el genoma de la célula hospedadora. En un aspecto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para insertar secuencias contiguas de ADN, incluyendo secuencias contiguas grandes de ADN, en los genomas de las células hospedadoras. Dichas secuencias de ADN pueden comprender múltiples componentes, por ejemplo, genes, promotores, terminadores, etc. y pueden insertarse selectivamente en las posiciones deseadas en los genomas de las células hospedadoras. En ciertas realizaciones, las secuencias de ADN, por ejemplo, las secuencias grandes de ADN, pueden insertarse selectivamente en regiones del genoma de la célula hospedadora de tal manera que uno o más componentes presentes en los fragmentos (por ejemplo, genes) se expresen por la célula hospedadora, por ejemplo, la célula hospedadora expresa uno o más componentes (por ejemplo, genes) que no son normalmente expresados por la célula hospedadora y/o la célula hospedadora expresa un componente (por ejemplo, un gen) que se expresa de forma natural por la célula hospedadora, pero expresa más de ese componente. Los procedimientos de inserción de ADN se describen en la Sección 5.1, más adelante.
En un aspecto específico de la divulgación, en el presente documento se proporciona un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia grande de ADN comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco o más genes. En ciertas realizaciones, los genes presentes en las secuencias de ADN insertadas en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento están bajo el control de una o de múltiples secuencias reguladoras o de promotores que también están presentes en las secuencias de ADN. En ciertas realizaciones, las secuencias de ADN insertadas en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender elementos adicionales esenciales o beneficiosos para la expresión de los genes presentes en la secuencia grande de ADN, por ejemplo, potenciadores, terminadores.
En otro aspecto específico de la divulgación, en el presente documento se proporciona un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia grande de ADN comprende uno o más operones, por ejemplo, un complejo génico de genes bajo el control de una señal reguladora o un promotor común.
En otro aspecto específico de la divulgación, en el presente documento se proporciona un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que el genoma de dicha célula hospedadora tiene además una deleción de ADN que está normalmente asociada al genoma de la célula hospedadora, es decir, el procedimiento da como resultado tanto una inserción de ADN heterólogo en el genoma de la célula hospedadora como la retirada del ADN normalmente presente del genoma de la célula hospedadora. En realizaciones específicas, la inserción de una secuencia grande de ADN se hace en el sitio de la retirada de una secuencia de ADN del genoma de la célula hospedadora del tamaño equivalente, es decir, el ADN del genoma de la célula hospedadora se reemplaza por la secuencia de ADN insertada.
En ciertos aspectos de las divulgaciones, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden la introducción de un plásmido auxiliar y un plásmido donador en una célula hospedadora. Como se usa en el presente documento los plásmidos auxiliares pretenden abarcar los plásmidos que comprenden elementos (por ejemplo, codifican genes) que son requeridos para la inserción de una secuencia grande de ADN en el genoma de una célula hospedadora. De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento los plásmidos auxiliares no incorporan cualquier ADN en el genoma de la célula hospedadora por sí mismos, sino que más bien facilitan la incorporación del ADN de inserto que está presente en los plásmidos donadores descritos en el presente documento. Los plásmidos auxiliares se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.1, más adelante. Como se usan en el presente documento los plásmidos donadores pretenden abarcar los plásmidos que comprenden la secuencia grande de ADN a insertarse en un genoma de una célula hospedadora, es decir, el plásmido donador “dona” parte de sí mismo al genoma de la célula hospedadora (es decir, se dona la secuencia grande de ADN para insertarse en el genoma de la célula hospedadora). En ciertas realizaciones, los plásmidos donadores proporcionados en el presente documento comprenden otros elementos que son requeridos o útiles para inserción de la secuencia grande de ADN en el genoma de la célula hospedadora. Los plásmidos donadores se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.2, más adelante.
En otro aspecto de la divulgación, en el presente documento se proporcionan células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras procariotas, por ejemplo, E. coli), las cuales comprenden genomas en los cuales se han insertado secuencias de ADN, tales como secuencias grandes de ADN, de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento. Sin desear quedar ligado a la teoría, los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para generan células hospedadoras genéticamente estables que son capaces de producir las proteínas de interés, por ejemplo, proteínas para su uso como vacunas, proteínas glucosiladas, proteínas para su uso en cosméticos, etc. Como un resultado de los procedimientos de inserción proporcionados en el presente documento tales células hospedadoras no necesitan mantenerse y/o propagarse en presencia de ciertos marcadores, por ejemplo, marcadores de selección de antibióticos, debido al hecho de que el ADN que comprende los genes de interés se inserta directamente en el genoma de las células hospedadoras.
En ciertos aspectos de la divulgación, las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden un genoma en el que se han insertado una o más secuencias de ADN, en el que dichas secuencias de ADN codifican una proteína o comprenden un operón/complejo génico implicado en la glucosilación de las proteínas, por ejemplo, en la N-glucosilación de las proteínas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una célula hospedadora descrita en el presente documento comprende un genoma en el cual se han insertado uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa.
En un aspecto específico de la divulgación, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosiltransferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico de la divulgación, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico de la divulgación, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico de la divulgación, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una cuarta secuencia de ADN, en el que dicha cuarta secuencia de ADN comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico de la divulgación, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende dos o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosiltransferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En un aspecto específico de la divulgación, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico de la divulgación, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacariltransferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico de la divulgación, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora que comprende un plásmido donador y un plásmido auxiliar, (a) en la que el plásmido auxiliar comprende: (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora; y (b) en la que el plásmido donador comprende: (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserto heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contra-selección. En un aspecto específico, la secuencia de reconocimiento comprende al menos 18 pares de bases. En otro aspecto específico, la endonucleasa de restricción es SceI. En un aspecto específico, el ADN de inserto heterólogo comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En un aspecto específico, la célula hospedadora es E. coli.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican oligosacaril-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa derivada de un organismo procariota. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa del género Campylobacter. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa de Campylobacter je juni (por ejemplo, el gen pglB de C. jejuni). En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacariltransferasa derivada de un organismo eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las glucosil-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de una glucosil-transferasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente N.° WO 2011/138361. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Grampositiva, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa deriva de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa del polisacárido capsular 5 de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosiltransferasa del polisacárido capsular 8 de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Gram-negativa, por ejemplo, E. coli. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de un eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las epimerasas que pueden insertarse en las células hospedadoras
descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico
de epimerasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico de epimerasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente N.° WO 2011/062615. En una
realización específica, la secuencia de ácido nucleico de epimerasa insertada en el genoma de una célula
hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de epimerasa representada por el
gen Z3206 de E. coli cepa O157. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/062615 y Rush y col., 2009, The Journal
of Biological Chemistry 285:1671.
Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden los complejos génicos rfb que pueden insertarse en las células
hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, el
complejo génico rfb insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento es un complejo génico
rfb de E. coli, por ejemplo, un complejo génico rfb de E. coli de cualquier serogrupo O/antígeno O conocido en la
materia, por ejemplo, O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19,
O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41,
O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63,
O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86,
O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106,
O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158,
O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 u O187 y los subserotipos de los mismos.
En otra realización específica, el complejo génico rfb insertado en una célula hospedadora descrita en el presente
documento es un complejo génico rfb de una cepa de Pseudomonas (por ejemplo, una cepa de P. aeruginosa), una
cepa de Salmonela (por ejemplo, una cepa de S. entérica), una cepa de Yersinia, una cepa de Klebsiella pneumoniae,
una cepa de Francisella (por ejemplo, F. tularensis), una cepa de Acinetobacter baumannii, una cepa de Burkholderia
o una cepa de Shigella.
Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden complejos génicos de polisacárido capsular que pueden
insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una
realización específica, el complejo génico de polisacárido capsular insertado en una célula hospedadora descrita en
el presente documento es un complejo génico de polisacárido capsular de una cepa de E. coli, una cepa de
Streptococcus (por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae), una cepa de Staphylococcus (por ejemplo,
S. aureus), o una cepa de Burkholderia (por ejemplo, B mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis).
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas vehículo que pueden insertarse en las células
hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. Las proteínas vehículo producidas por
las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al menos una secuencia consenso de N-glucosilación, por ejemplo, ya sea la secuencia consenso (i) Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona
independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan
independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro. En consecuencia, las secuencias de ADN que codifican
las proteínas vehículo insertadas en las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al
menos una secuencia de ácido nucleico dentro de la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo que codifica
una secuencia consenso de N-glucosilación. La secuencia de ADN que codifica una proteína vehículo insertada en
las células hospedadoras descritas en el presente documento puede codificar cualquier proteína vehículo conocida en
la materia, incluyendo las proteínas vehículo descritas en la Sección 5.2.1.2, más adelante. En una realización
específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora
descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica la Exotoxina A de P. aeruginosa
(EPA), incluyendo la EPA que se ha modificado genéticamente para comprender al menos una secuencia consenso
de N-glucosilación. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en
el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que
codifica la toxina colérica B. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo
insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico que codifica AcrA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo
insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico que codifica HlA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo
insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico que codifica ClfA.
En ciertas realizaciones, el número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita
en el presente documento por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una
realización específica, el número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita
en el presente documento por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, es de 1 o 2. En otra realización específica, el
número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento
por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, es de 1.
Las células hospedadoras procariotas de ejemplo que pueden usarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, especies de Escherichia, especies de Shigella, especies de Klebsiella, especies de Xhantomonas, especies de Salmonela, especies de Yersinia, especies de Lactococcus, especies de Lactobacillus, especies de Pseudomonas, especies de Corynebacterium, especies de Streptomyces, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, especies de Bacillus y especies de Clostridium.
El ADN, por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, insertado en el genoma de las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento puede comprender un marcador de selección. En ciertas realizaciones, cuando el ADN insertado, por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, comprende un marcador de selección, el marcador de selección está flanqueado por los sitios diana de reconocimiento de flipasa (FRT). En ciertas realizaciones, la primera y la segunda regiones de homología son homólogas a las regiones adyacentes del genoma de la célula hospedadora.
La primera y la segunda regiones de homología de los plásmidos donadores descritos en el presente documento pueden ser de cualquier tamaño necesario o deseado para la inserción del ADN de inserto heterólogo. Por ejemplo, las regiones de homología pueden ser de aproximadamente o de al menos 0,5 kb, 0,6 kb, 0,7 kb. 0,8 kb, 0,9 kb, 1 kb, 1.1 kb, 1,2 kb, 1,3 kb, 1,4 kb, 1,5 kb, 1,6 kb, 1,7 kb, 1,8 kb, 1,9 kb, 2,0 kb o mayores de 2,0 kb. En ciertas realizaciones, la primera y la segunda regiones de homología pueden ser del mismo tamaño. En ciertas realizaciones, la primera y la segunda regiones de homología pueden ser de diferentes tamaños.
En ciertas realizaciones, el ADN, por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, insertado en las células hospedadoras descritas en el presente documento empleando los procedimientos proporcionados en el presente documento es de un tamaño grande, por ejemplo, el ADN, por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo es de un tamaño que no puede insertarse en los genomas de las células hospedadoras empleando los procedimientos convencionales conocidos en la materia. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el ADN, por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, insertado en las células hospedadoras descritas en el presente documento empleando los procedimientos proporcionados en el presente documento es de aproximadamente o al menos 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 20 kb, 21 kb, 22 kb, 23 kb, 24 kb o 25 kb.
3.1 Abreviaturas y term inología
Como se usa en el presente documento las regiones de homología, abreviadas HR, se refieren a las regiones de ADN presentes en los plásmidos donadores descritos en el presente documento. Las HR son regiones de ADN que son homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que pretende insertarse el ADN. En ciertas realizaciones, las HR son al menos el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 91 %, el 92 %, el 93 %, el 94 %, el 95 %, el 96 %, el 97 %, el 98 %, el 99 % o el 99,5 % homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que pretende insertarse el ADN. En ciertas realizaciones, las HR son 100 % homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que pretende insertarse el ADN. En ciertas realizaciones preferidas, las HR son al menos el 99,5 % homólogas a las regiones de ADN presentes en el genoma de las células hospedadoras en las que pretende insertarse el ADN.
Como se usa en el presente documento los sitios diana se refieren a los sitios presentes sobre el genoma de las células hospedadoras que son complementarios para las regiones de homología de los plásmidos donadores descritos en el presente documento.
Como se usa en el presente documento el ADN de inserto heterólogo se refiere a las secuencias de ADN presentes en los plásmidos donadores descritos en el presente documento las cuales se insertan en los genomas de las células hospedadoras diana usando los procedimientos descritos en el presente documento.
Como se usa en el presente documento en el contexto del ADN, la inserción se refiere al procedimiento de introducir el ADN de inserto heterólogo en otro trozo de ADN (por ejemplo, un genoma de la célula hospedadora), que da como resultado una molécula de ADN (por ejemplo, un genoma de la célula hospedadora modificado) que comprende el ADN de inserto heterólogo.
Como se usa en el presente documento las células aceptoras se refieren a las células hospedadoras que se modifican de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento por ejemplo, las células aceptoras comprenden genomas que se modifican para comprender el ADN de inserto heterólogo.
Como se usa en el presente documento el casete se refiere a una secuencia de ADN que contiene un gen y sus secuencias reguladoras requeridas para la expresión fenotípica de la función del gen, por ejemplo, resistencia a antibióticos. Los casetes también pueden contener secuencias de flanqueo que faciliten la retirada del casete del genoma de una célula aceptora o de otra secuencia de ADN (por ejemplo, un plásmido). Las secuencias de flanqueo de ejemplo que pueden estar asociadas a los casetes incluyen los sitios diana de reconocimiento de flipasa (FRT). De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento la selección del antibiótico (por ejemplo, la selección de las células hospedadoras que expresen marcadores de resistencia a antibióticos específicos) puede llevarse a cabo usando casetes de selección y antibióticos en el medio de crecimiento. Los casetes pueden abreviarse mediante la abreviatura del antibiótico seguida de una R mayúscula por resistencia, por ejemplo, ampR se refiere al casete que confiere resistencia a ampicilina (amp). Esta nomenclatura, de esta manera, describe un fenotipo en lugar de un genotipo. Las abreviaturas para los antibióticos usados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento se proporcionan en la Tabla 6, más adelante.
Como se usa en el presente documento complejo génico de antígeno O y complejo génico rfb se refieren a los complejos génicos responsables de la biosíntesis de los antígenos O [6].
Como se usa en el presente documento fosfato de undecaprenol se abrevia Und-P; y pirofosfato de undecaprenol se abrevia Und-PP.
Como se usa en el presente documento Exotoxina A detoxificada de Pseudomonas aeruginosa se abrevia EPA. La EPA descrita en el presente documento puede detoxificarse usando los procedimientos conocidos en la técnica [7].
En el presente documento se hace referencia a cepas de E. coli de diferentes colecciones. En tales referencias, “número” upecGVXN, “número” CCUG y “número” StGVXN denotan las cepas de un estudio de epidemiología que recolectó E. coli uropatogénicas, la colección de cultivos de Goteborg, Suecia y la colección de cepas GlicoVaxyn, en las que “número” se refiere al número particular asignado a la cepa.
4 Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Mapa esquemático del plásmido donador pDOC-C y los elementos relevantes. ampR: casete de ADN que codifica el gen que confiere resistencia a beta lactama; sacB: casete de expresión que confiere sensibilidad a sacarosa; oriT: origen de replicación; MCS: sitio de clonación múltiple; SceI: sitio de restricción de endonucleasa de asentamiento para movilizar el ADN del plásmido donador; inserto de ADN: tramo de ADN que reemplaza al ADN de la célula aceptora entre HR1 y HR2; HR1, HR2: regiones de homología 1 y 2, éstas son las regiones de ADN presentes en la célula hospedadora en las que se produce el cruzamiento y la recombinación homóloga; casete de selección: gen marcador seleccionable para rastrear los clones integrados; este casete puede estar flanqueado por los sitios de recombinación homóloga específica del sitio, los cuales permiten la retirada del casete; ADN de interés: ADN extraño restante en la cepa diana en lugar del ADN de la cepa diana después de la retirada del casete de selección.
Figura 2. Esquema del procedimiento de integración. Las diferentes etapas del procedimiento están marcadas con números entre paréntesis. La célula diana (rectángulo) que contiene el plásmido auxiliar, el plásmido donador (los círculos marcados con pTKRED y pDOC) y el cromosoma (línea garabateada) se hace crecer (1) y se induce con IPTG y arabinosa (2) para inducir la expresión de la recombinasa Red lambda homóloga y la endonucleasa de asentamiento SceI (tijeras). Ésta última corta el plásmido donador pDOC y de esta manera moviliza al ADN de inserto dando como resultado el ADN de inserto linealizado dentro de la célula (3). El ADN de inserto linealizado es el sustrato óptimo para la recombinasa Red lambda que facilita el cruzamiento y la recombinación homóloga en los sitios de recombinación homóloga HR1 y 2 (barras negras gruesas). La recombinación enzimática está indicada por las líneas negras delgadas cruzadas (4). La cepa resultante contiene el ADN de inserto en lugar del ADN anteriormente presente entre HR1 y 2. Los plásmidos auxiliares y donadores se pierden entonces ('se curan') de la célula diana mediante diferentes procedimientos, como se indica en el texto.
Figura 3. (A) El panel superior muestra el complejo génico rfb de E. coli O1 de un plásmido donador y las regiones HR flanqueantes se indican con líneas delgadas que se conectan a los sitios diana (sitios homólogos a las regiones HR en el ADN de inserto) en el genoma aceptor de la cepa W3110; las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas huecas indican los genes de los plásmidos donadores, las flechas rellenas indican el complejo génico rfb aceptor de W3110, que se retira después de la integración. Los cuadros negros estrechos rellenos indican los sitios de recombinación específica del sitio para la retirada de clmR mediante recombinación específica de sitio mediada por FLP. El rectángulo grande relleno indica el gen wbbL de W3110 incluyendo el elemento de inserción de alteración que hace que el antígeno O de la cepa W3110 sea negativo. Las flechas delgadas y los números indican las regiones de hibridación y los números de oligonucleótidos usados para las pruebas de p Cr y la clonación del plásmido donador. (B) ilustra los resultados de la PCR de colonias para confirmar la presencia del complejo génico rfb O1 en las células. Los paneles inferiores son las reacciones de prueba de PCR separadas en geles de agarosa mediante electroforesis, teñidas con el tinte de ADN Gel Red e iluminadas con luz UV para visualizar el ADN. Las reacciones de PCR contenían los oligonucleótidos 2241 y 2242 (véase A) y se resuspendieron las cepas de las colonias control y las cepas después de la inserción del complejo génico rfb, la deleción de waaL y la retirada de los casetes de selección: 1, W3110 AO16::O1 -clmR; 2, W3110 AO16::rfbO1; 3, W3110 AO16::rfbO1 AwaaL::clmR; 4, W3110 AO16::rfbO1 AwaaL 5, W3110 AwaaL; 6, W3110.
Figura 4. Prueba de expresión de O1-azúcar en diferentes fases de construcción de la cepa. Extractos de células enteras tratadas con proteinasa K de células de E. coli después de la integración del complejo génico rfb (W3110 ArfbO16::rfbO1-clmR, panel A), retirada del casete clmR (W3110 ArfbO16::rfbO1, panel B), alteración de waaL (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL::clmR, panel C) y retirada del casete clmR de la deleción de waaL (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL, panel D). Los cultivos se hicieron crecer en medio LB, se incubaron durante la noche a 37 °C y los lisados celulares se trataron disolviendo en tampón de muestra SDS Lammli e incubando con proteinasa K a 65 °C durante 1 h. Los extractos se separaron mediante SDS PAGE y se desarrollaron directamente usando tinción con plata (para visualizar el LPS, paneles superiores A, C, D), o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia seguida de inmunodetección con antisuero anti-O1 (aO1; paneles inferiores A, B, C, D). Los controles se analizaron en paralelo (Paneles A, B: upecGVXN140, es un aislado clínico que se usó para amplificar el complejo génico rfb O1 para la posterior integración). Se indican los números de carril y las designaciones de cepa se dan en los cuadros negros. M: carril marcador, los pesos moleculares se indican en kDa. Las flechas marcadas con “Clon” indican diferentes clones analizados a partir de un experimento.
Figura 5. Análisis de antígeno O de E. coli O1 de la cepa W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL mediante etiquetado de 2 AB y EM/EM. A. Análisis HPLC de antígeno O recombinante de E. coli O1. Los extractos celulares se procesaron como se describe: los extractos orgánicos secados de las células se hidrolizaron y se purificaron. Los polisacáridos enlazados a Und-PP resultantes se liberaron del lípido, se purificaron adicionalmente y se marcaron mediante aminación reductiva en el extremo reductor con 2 AB. Se midió la emisión de fluorescencia después de la separación de los polisacáridos marcados mediante HPLC en fase normal sobre una columna GlicoSepN. El cromatograma (sólido) es el trazo de fluorescencia que depende del tiempo de elución (cepa W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL). El trazo punteado es una muestra control que no expresa el antígeno O (W3110 AwaaL). Los 1, 2, 3, 4 asteriscos indican los picos que corresponden a 1, 2, 3 y 4 unidades de repetición de antígeno O; 5 asteriscos son un fragmento de la molécula de 6 unidades de repetición. 5. Análisis MALDI-TOF/TOF de la fracción de elución de HPLC de dos asteriscos del Panel A. [m/z] = 1849, correspondiente a la masa esperada del aducto de ion Na+ de dos unidades de repetición O1, se seleccionó para la EM/EM y se indican las series de iones del fragmento Y que confirman la secuencia de monosacárido esperada.
Figura 6. Prueba de expresión a pequeña escala de glucoproteína de EPA-O1 mediante la cepa insertada para la glucosilación con O1 de 4 sitios EPA. Las células de E. coli (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL) se transformaron con un plásmido de expresión de EPA (p659) y cinco plásmidos de expresión de pglB diferentes como se describe en los Ejemplos, más adelante. Las células se cultivaron y se indujeron con arabinosa e IPTG, después de la incubación durante la noche a 37 °C, las células se cosecharon y se prepararon los extractos de proteína periplásmicos. Los extractos se separaron después mediante SDS PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron. Panel de la izquierda: transferencia Western usando antisuero anti-EPA, panel de la derecha: transferencia Western usando antisuero anti-O1. Los plásmidos PglB se indican sobre los carriles (A, p114: expresión de pglB que contiene etiqueta HA sin optimización de codones; B, p939: que contiene etiqueta HA, con optimización de codones; C, p970: etiqueta HA retirada, con optimización de codones; D, que contiene etiqueta HA, con optimización de codones, sitio de glucosilación natural N534Q retirado; y E, etiqueta HA retirada, con optimización de codones, sitio de glucosilación natural N534Q retirado); se indican los tamaños de carril del marcador de peso molecular.
Figura 7. Detección por PCR de colonias de la construcción de la cepa de las cepas de producción de conjugados de antígeno O de E. coli O2 en diferentes fases de construcción. Las células de E. coli de los experimentos de inserción, como se indican en el texto, se probaron para genotipar las características mediante PCR usando oligonucleótidos específicos. A. El panel superior muestra el complejo génico rfb en el plásmido donador y la HR de flanqueo se indica con líneas delgadas que se conectan a los sitios diana en el genoma aceptor de la cepa W3110; las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas huecas muestran los genes de los plásmidos donadores, las flechas rellenas muestran el complejo génico rfb aceptor. Los cuadros negros estrechos rellenos indican los sitios de recombinación específica de sitio para la retirada de clmR mediante recombinación específica de sitio mediada por FLP. El rectángulo grande relleno indica el gen wbbL alterado de W3110 incluyendo el elemento de inserción. Las flechas delgadas y los números indican las regiones de hibridación de los oligonucleótidos usados para las pruebas de PCR y la clonación del plásmido donador. B. Los paneles inferiores son geles de agarosa pasados por electroforesis teñidos con Gel Red iluminados con luz UV para visualizar los productos de las reacciones de prueba de PCR con el fin de probar la deleción de waaL Las reacciones PCR contenían los oligonucleótidos 1114 y 1326 y se resuspendieron colonias de cepas control y de cepas después de la integración, la alteración de waaL y la retirada de los casetes de selección: 1, St4043 = W3110 AO16::O2-kanR; 2, St4044 = W3110 AO16::O2-kanR AwaaL::clmR; 3, W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL; 4 W3110 AwaaL; 5, W3110; 6. W3110 AwaaL::clmR. Los tamaños de amplicones esperados son de 1,7 kb para la secuencia no modificada, de 1,5 kb para la inserción de clmR y de 0,5 kb después de la retirada del casete clmR.
Figura 8. Prueba de expresión de antígeno O de O2 en diferentes fases de construcción de la cepa. Se prepararon extractos de células enteras tratadas con proteinasa K a partir de células de E. coli después de la integración del complejo génico rfb (W3110 ArfbO16::rfbO2-kanR, panel A) y la alteración de waaL seguida de la retirada del casete clmR y kanR (W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL, panel B), a partir de cultivos que se hicieron crecer en medio LB, incubados durante la noche a 37 °C. Los lisados celulares se trataron mediante la disolución en tampón de muestra SDS Lammli e incubación con proteinasa K a 65 °C durante 1 h. Los extractos se separaron después mediante SDS PAGE y se desarrollaron directamente usando tinción con plata (para visualizar el LPS, panel B, izquierda) o bien se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron con antisuero anti-O2 (aO2), para detectar el polisacárido O6 enlazado a Und-PP (antígeno O enlazado a Und-PP, panel A, B, lado derecho). Las muestras control se analizaron en paralelo, en la mayoría de los casos las cepas de los ancestros progenitores. Se indican los números de carril y las designaciones de cepas se dan en los cuadros negros. Panel A: el carril 2 contiene un extracto de un aislado clínico que se usó para generar el ADN de interés mediante PCR (upecGVXN116). Panel B: la carril 2 contiene la cepa insertada antes de la deleción de waaL.
Figura 9. Expresión de antígeno O de E. coli O2 a partir de la cepa W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL mediante mareaje con 2 AB. Las células se procesaron como se describe: los extractos orgánicos secados de las células se hidrolizaron y se purificaron. Los polisacáridos se marcaron mediante aminación reductiva en el extremo reductor con 2 AB y se analizaron mediante HPLC en fase normal sobre una columna GlicoSepN. A. Análisis de HPLC del antígeno O recombinante de E. coli O2 a partir de la cepa W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL. El cromatograma (línea sólida) es el trazo de fluorescencia que depende del tiempo de elución. El trazo punteado es una muestra control que no expresa el antígeno O. 1, 2, 3 asteriscos indican los picos que corresponden a los picos con tiempos de elución consistentes con 1,2 y 3 unidades de repetición de antígeno O. B. Análisis MALDI-TOF/TOF de la fracción pico marcada con dos asteriscos en el panel A. [m/z] = 1817, correspondiente a la masa esperada de dos unidades de repetición de antígeno O de O2 con un ion Na+ unido, se seleccionó para la EM/EM y se indican las series de iones del fragmento Y que confirman la secuencia de monosacárido correcta.
Figura 10. Prueba a pequeña escala de cepas integradas para la glucosilación con O2 de 4 sitios EPA. Las células de E. coli (W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL) se transformaron con p659 y dos plásmidos de expresión diferentes pglB como se describen en el texto. Las células se crecieron y se indujeron con arabinosa e IPTG; después de la incubación durante la noche a 37 °C, las células se cosecharon y se prepararon los extractos de proteína periplásmicos. Los extractos se separaron después mediante SDS PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron. Panel de la izquierda: transferencia Western usando antisuero anti-EPA (aEPA), panel de la derecha: transferencia Western usando antisuero anti-O2 (aO2). Los plásmidos se indican sobre los carriles mediante letras mayúsculas (B, codones optimizados, etiqueta HA que contiene el plásmido de expresión de pglB (p939), D, codones optimizados, sin etiqueta HA (p970)), se indican los tamaños de carriles del marcador de peso molecular. Como control, se analizó un extracto del aislado clínico de E. coli upecGVXN124 (StGVXN3947) que contenía p659 y p939 (carril x).
Figura 11. Detección mediante PCR de colonias de la construcción de las cepas de producción conjugadas con antígeno O de E. coli O6 en diferentes fases de construcción. Se probaron las células de E. coli a partir de los experimentos de integración como se indican en los ejemplos para genotipar las características mediante PCR usando oligonucleótidos específicos. El panel A muestra el complejo génico rfb en el plásmido donador y las regiones HR de flanqueo se indican con líneas delgadas que se conectan a las regiones HR en los sitios aceptores en el genoma W3110; las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas huecas muestran los genes de los plásmidos donadores, las flechas rellenas muestran el complejo génico rfb aceptor en W3110. Los cuadros negros estrechos rellenos indican los sitios de recombinación específica de sitio para la retirada de kanR mediante recombinación FLP. El cuadro relleno grande indica el gen wbbL alterado de W3110. Las flechas delgadas y los números indican las regiones de hibridación y los números de oligonucleótidos usados para las pruebas de p Cr y la clonación del plásmido donador. Los paneles inferiores (B-D) son geles de agarosa teñidos con Gel Red iluminados con luz UV para visualizar los productos de las reacciones de prueba de PCR. Las reacciones de PCR contenían los oligonucleótidos indicados encima de los paneles y se resuspendieron colonias de cepas control y cepas después de la integración, la alteración de waaL y la retirada de los casetes de selección: 1, W3110; 2, W3110 AwaaL; 3, W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL; 4 y 5, dos clones diferentes de W3110 ArfbO16::rfbO6 AwaaL. Se indican los pares de oligonucleótidos probados. La PCR para probar la transición de la región HR 5' (panel B) da como resultado un producto de PCR de 1,697 kb, para la transición de HR 3' de 3,6 kb o 2,3 kb en presencia o ausencia del casete kanR (panel C) y de 0,783 kb para el O6 wzy (c2564) PCR (panel D).
Figura 12. Prueba de expresión de antígeno O de O6 en diferentes fases de construcción de la cepa. Se prepararon extractos de células enteras tratadas con proteinasa K a partir de células de E. coli después de la integración del complejo génico rfb (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR, panel A), la alteración de waaL (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL::clmR, panel B) y la retirada del casete clmR (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL, panel C), a partir del cultivo que se hizo crecer en medio LB, incubado durante la noche a 37 °C. Los lisados celulares se prepararon disolviendo los aglomerados celulares en tampón de muestra SDS Lammli e incubación con proteinasa K a 65 °C durante 1 h. Los extractos se separaron después mediante SDS PAGE y se desarrollaron directamente usando tinción de plata (para visualizar el LPS, panel B y C, izquierda) o se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron con antisuero anti-O6 (aO6), para detectar el polisacárido O6 enlazado con lípido (antígeno O, panel A, B, lado derecho, panel C lado derecho). Las muestras control se analizaron en paralelo, en la mayoría de los casos fueron las cepas de los ancestros directos como se indica. Se indican los números de carril y las designaciones de las cepas se dan en los cuadros negros. Panel A: la carril 3 contiene un extracto de una cepa de E. coli O6 de tipo silvestre (CCUG27).
Figura 13. Prueba a pequeña escala de cepas integradas para la glucosilación con O6 de EPA que codifica 4 sitios. Las células de E. coli (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL) se transformaron con EPA (p659) y un plásmido de expresión de pglB (codones optimizados, etiqueta HA que contiene el plásmido de expresión de pglB, p939) como se describe en el texto. Las células se crecieron y se indujeron con arabinosa e IPTG, después de la incubación durante la noche a 37 °C, las células se cosecharon y se prepararon los extractos de proteína periplásmicos. Los extractos se separaron después mediante SDS PAGe , se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron. Panel de la izquierda: transferencia Western usando antisuero anti-EPA (aEPA), panel de la derecha: transferencia Western usando antisuero anti-O6 (aO6).
Figura 14. Análisis comparativo de diferentes sistemas de producción de glucoconjugados. Diferentes células de E. coli AwaaL que producían el antígeno O de O1 (panel A), O2 (panel B) y O6 (panel C) se transformaron con p659 y p939 (pglB con codones optimizados con la etiqueta HA C-terminal) y se probaron para la expresión del glucoconjugado. Los cultivos de expresión se hicieron crecer en un medio TB suplementado con MgCh 10 mM a 37 °C. Los cultivos se indujeron a una DO600 de 0,4-1,2 mediante la adición de arabinosa al 0,2 % e IPTG 1 mM. Las células se cosecharon después de la inducción durante la noche (20 horas) y los extractos periplásmicos se prepararon mediante el procedimiento de lisozima. Los extractos se separaron después mediante SDS PAGE, se transfirieron a membranas de nitrocelulosa mediante electrotransferencia y se inmunodetectaron usando antisuero anti-EPA (A, B y C, panel de la izquierda) y antisuero específico de antígeno O de O1, O2 u O6 (A, B y C, paneles de la derecha). Las células hospedadoras fueron cualquiera de los aislados clínicos de E. coli (carriles 1), o las células W3110 insertadas como se describen en esta solicitud de patente (carriles 2: A, W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL, B, W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL, C, W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL) o las células W3110 AwaaL que contenían el complejo génico rfb respectivo sobre un cósmido (pLAFR) (carriles 3). Se indican las masas de marcador de tamaño molecular, así como los sueros de sondeo usados para cada transferencia Western.
Figura 15. Detección por PCR de colonias a partir de la integración del complejo génico rfb de P. shigelloides O17 en las cepas W3110. Las células de E. coli de los experimentos de integración como se indican en el texto, se probaron para genotipar las características mediante PCR usando oligonucleótidos específicos. Se probaron dos cepas aceptoras diferentes, W3110 y W3110 AwecA-wzzE AwaaL. El panel superior (A) muestra el complejo génico rfb de P. shigelloides en los plásmidos donadores (sin y con wzz) y las regiones HR de flanqueo en cuadros negros y el sitio diana en el genoma W3110, las cursivas muestran los nombres de los genes, las flechas huecas muestran los genes de los plásmidos donadores, vacíos de sitios aceptores. Los cuadros negros estrechos rellenos indican los sitios de recombinación específica del sitio para la retirada de clmR mediante recombinación específica del sitio dirigida por FLP. El cuadro relleno grande indica la región genética wbbL de W3110 naturalmente interrumpida por un elemento de inserción. Las flechas y los números indican la localización de hibridación y los nombres de los oligonucleótidos usados para las pruebas de PCR. Se probaron los siguientes pares: a) 1226 y 1227 para confirmar la deleción de E. coli O16 wzy, dando como resultado la ausencia de un producto de PCR cuando wzy se elimina y un producto de 0,9 kb cuando wzy está presente; b) 1549 y 1550 para la presencia de wzy y wbgV de P. shigelloides, que dan como resultado un producto de 1,522 kb; c) 1284 y 1513 para la región de transición HR1, que dan como resultado un producto de 2,545 kb con wzz y de 1,403 kb por los clones sin wzz. B: Electroforesis en gel de agarosa de las mezclas de reacción de PCR que contenían los lisados de colonias de integración (números blancos) y los pares de oligonucleótidos indicados. La ausencia de wzy de O16, la presencia de wzy-wbgV y las regiones de transición HR1 (5') son indicativas de una integración exitosa. Se indican los tamaños de banda del marcador de ADN. Se confirmaron las siguientes cepas: W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz: clon 3, W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::PsO17-clmR con wzz: clon 51, W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz: clon 7 y W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR con wzz: clon 46.
Figura 16. Prueba de expresión del antígeno O de P. shigelloides en diferentes etapas de construcción de la cepa. Las células de E. coli de los experimentos de inserción y seleccionadas mediante detección por PCR se probaron para determinar la producción de glucolípidos mediante tinción con plata (panel de la izquierda) y transferencia Western usando antisuero anti-S. sonnei (panel de la derecha). W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz: clon 3 (carril 3), W3110 AwecA-wzzE AwaaL ArfbO16::rfbPsO17-clmR con wzz: clones 51 (carril 4), W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR sin wzz: clones 7 (carril 1) y W3110 ArfbO16::rfbPsO17-clmR con wzz: clon 46 (carril 2).
Figura 17. Prueba de expresión de antígeno O de S. dysenteriae tipo 1 después de la integración del complejo génico rfp y rfb reemplazando al complejo génico rfb de W3110. Como las cepas diana para la inserción, se usaron células W3110 así como W3110 AwaaL. Los clones de E. coli de los experimentos de inserción se rastrearon mediante PCR de colonias. La producción de glucolípidos se analizó mediante tinción con plata (panel de la izquierda) y transferencia Western contra el antisuero anti-S. dysenteriae tipo 1 (panel de la derecha). Carriles 3, 4: cepas W3110 así como W3110 AwaaL después de la integración; carriles 1,2: W3110 así como W3110 AwaaL después de la integración y la retirada del casete clmR.
Figura 18. Análisis de expresión de antígeno O de S. dysenteriae tipo 1 mediante marcaje con 2 AB y HPLC. W3110 ArfbO16::rfbSd1 AwaaL se procesó como se describe en los Ejemplos. El cromatograma (panel A) es el trazo de fluorescencia que depende del tiempo de elución. Los asteriscos indican los picos que corresponden a los picos con tiempos de elución consistentes con 2(**), 3,(***) y 4 (****) unidades de repetición de antígeno O como se analiza mediante MALDI-TOF/TOF EM (panel B) [8, 9].
Figuras 19. Se produjeron glucoconjugados de antígeno O de S. dysenteriae tipo 1 en W3110 ArfbO16::rfbSd1 AwaaL usando p293 y p114. A. Análisis de SEC HPLC. B. Marcaje con PMP para el análisis de la composición del monosacárido. Se usó una mezcla de monosacárido para calibrar los tiempos de elución de Glucosa, Ramnosa y 2-N-Acetilglucosamina. C. Separación mediante SDS PAGE del glucoconjugado y detección mediante tinción con azul Coomassie y detección de antisuero anti-S. dysenteriae 1 después de la electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa. D. Análisis de hidrazinólisis. El polisacárido en la preparación de glucoproteína se separó de la proteína mediante hidrazinólisis, se marcó por 2 AB y se analizó mediante HPLC. Se recogieron los picos indicados y el análisis de EM/EM fue consistente con la estructura del antígeno O de 2 o 3 unidades de repetición.
Figura 20. Prueba de expresión del glucolípido de S. flexneri después del intercambio de la glucosil-transferasa ramificada gtrS por g trll o gtrX. A. Las estructuras de la unidad de repetición de los antígenos O relevantes. La figura muestra que S. flexneri 2a y 3a difieren por el sitio de unión del resto de glucosa ramificado. Los antisueros anti-grupo II y anti-grupo 7, 8 son capaces de discriminar entre estos sitios de unión. B. Análisis de PCR de colonias de la integración de g trll en el genoma W3110. El gen gtrS se reemplazó por un amplicón consistente en g trll fusionado con un casete clmR. El dibujo muestra el tramo del cromosoma alrededor del complejo génico gtr después de la recombinación homóloga de éxito, con el casete clmR todavía presente. Las flechas indican las posiciones de hibridación para los oligonucleótidos usados para la PCR de colonias. El carril 1 (W3110 AwbbIJK AgtrS::gtrII-clmR) muestra el resultado de una PCR de colonias con un clon recombinado, el carril 2 (W3110 AwbbIJK) es el control. El casete clmR está flanqueado por los sitios d if que inducen la escisión del casete mediante recombinación específica del sitio por medio de la recombinasa Xer a partir de E. coli. Esto significa que, en la PCR de colonias, se observan bandas correspondientes al tramo que contiene y que carece del casete clmR (los tamaños esperados son de 2,8 y 1,8 kb). El control muestra una banda en 1,6 kb como se esperaba para la cepa madre. C. Se analizaron células de E. coli W3110 que contenían el complejo génico rfb de S. flexneri 2457T sobre un plásmido mediante tinción con plata (panel de la izquierda), transferencia Western con antisuero anti-grupo II y antisuero anti-grupo 7, 8 (paneles medio y derecho). Carril 1: W3110; carril 2: W3110 AgtrS::gtrII; carril 3: W 31l0 AgtrS::gtrX.
Figura 21. Se produjeron glucoconjugados de antígeno O de S. flexneri tipo 2a en W3110 ArfbO16::rfbpSf2a AwaaL usando p293 y p114. A. Separación mediante SDS PAGE del glucoconjugado y detección mediante tinción con azul Coomassie y detección de antisuero anti-tipo II después de la electrotransferencia a membranas de nitrocelulosa. B. Análisis de SEC HPLC de glucoproteína EPA purificada. C. Marcaje con PMP para el análisis de composición del monosacárido. Se usaron monosacáridos para calibrar los tiempos de elución de Glucosa, Ramnosa y Glucosamina. Los tiempos de elución se indican mediante flechas. D. Análisis de hidrazinólisis. El polisacárido en la preparación de glucoproteína se separó de la proteína mediante hidrazinólisis, se marcó con 2 AB y se analizó mediante HPLC. Se recolectaron los picos indicados y el análisis de EM/EM fue consistente con la estructura del antígeno O de 2 o 3 unidades de repetición y fragmentos del mismo. De forma importante, la ramificación de glucosa se detectó claramente mediante EM/e M (no mostrado).
Figura 22. Los sueros de ratas Sprague Dawley inyectadas se analizaron para determinar los títulos de IgG contra el LPS de S. flexneri 2a. Se muestran los títulos log del suero de cada rata individual. Los sueros se cosecharon 2 semanas después de la tercera inyección. El nivel correspondiente de IgG anti-2a se alcanzó 2 semanas después de la tercera inyección (post 3) y se muestra la diferencia estadística entre los grupos (de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney). La titulación de IgG específica de los sueros de los animales se detectó usando un ensayo de inmunosorción ligado a enzimas (ELISA). El LPS 2a extraído de S. flexneri 2a cepa ATCC700930 se adsorbió en los pocillos de una microplaca. La titulación de anticuerpos 2a se determinó después mediante la adición de diluciones en serie de los sueros que se iban a analizar. Se usó peroxidasa de rábano picante acoplada a un anticuerpo secundario de IgG anti-rata y/o anti-ratón en una reacción colorimétrica enzimática para determinar el título. El título del punto final se define como la dilución más alta sobre el promedio de la reserva preinmunológicos 3 veces la desviación estándar de los sueros preinmunológicos y se expresa como Log10.
Figura 23. Prueba de la expresión del antígeno O de P. aeruginosa O11 después de la integración del complejo génico de antígeno O PA103. Las células de E. coli de los experimentos de integración y seleccionadas mediante detección por PCR y prueba fenotípica se analizaron para determinar la producción de glucolípidos mediante transferencia Western contra el antisuero anti-P. aeruginosa grupo E. Se analizaron las cepas diana integradas (carriles 1-4) y los extractos de control originados a partir de las células DH5a que contenían los plásmidos donadores p1012 (carril 5) y p1013 (carril 6).
Figura 24. La integración de un complejo génico quimérico de 16 kb compuesto por el complejo génico rfb de P. aeruginosa O11 que contiene un casete (compuesto por los genes cap5HIJK fusionados con un casete clmR) que reemplazó a los O11 wzy y wbjA, da como resultado células que pueden producir el glucoconjugado recombinante. Se prepararon extractos de células enteras a partir de células cultivadas durante la noche y se lisaron en tampón SDS Lammli y se trataron con proteinasa K durante 1 hora. Se usó SDS PAGE para separar los glucolípidos a partir de estas muestras y se usó tinción con plata o transferencia Western contra antisuero anti-CP5 para identificar el polisacárido CP5. Carriles 1-3: clones integrados construidos con p471, p477 o p498. p471 contiene HR 1 y 2 correspondientes al ADN en dirección 5' del wecA y en dirección 3' de las secuencias del marco de lectura abierto (ORF) de wzzE de W3110. La inserción se hizo en las células hospedadoras W3110. También se usaron plásmidos donadores para preparar los extractos control en las células DH5a que se analizaron en los carriles 5, 6 y 7 (p498, p477 o p471); el carril 4 contiene un control negativo (p473). El carril 8 representa un control positivo preparado a partir de extractos de células W3110 AwecA que contienen el plásmido p393, el cual produce el polisacárido CP5 [10].
La Figura 25 representa un análisis de transferencia Western de la producción de pglB y O1-EPA mediante la cepa hospedadora de E. coli MG1655 waaL::pglB-galK que alberga un plásmido que expresa un antígeno O1 y un plásmido que expresa EPA. El panel de la izquierda muestra los resultados de sondar para buscar EPA con un anticuerpo anti-HIS; el panel de la derecha muestra los resultados de sondar para buscar pglB con un anticuerpo anti-HA.
La Figura 26 representa una estrategia para la purificación de los bioconjugados de proteína vehículo-antígeno de azúcar.
La Figura 27 representa un cromatograma del extracto bruto obtenido después del choque osmótico de las células hospedadoras que comprenden pglB insertado en el genoma de la célula hospedadora y que albergan plásmidos que producen un antígeno de azúcar (Shigella O1) y una proteína vehículo (EPA). El cromatograma representa los resultados de hacer pasar la fracción del choque osmótico sobre una primera columna de intercambio aniónico (Source Q). El O1-EPA identificado en las fracciones agrupadas A6-A9 del extracto bruto se representa sobre un gel teñido con Coomasie (inserto).
La Figura 28 representa los resultados de la tinción con Coomasie de las proteínas presentes en las fracciones obtenidas de hacer pasar las proteínas aisladas a partir del periplasma de la cepa hospedadora de E. coli MG1655 waaL::pglB-galK cultivada que alberga un plásmido que expresa un antígeno O1 y un plásmido que expresa EPA sobre una primera columna de Source Q.
La Figura 29 representa los resultados de la tinción con Coomasie de las proteínas presentes en las fracciones obtenidas de hacer pasar las proteínas aisladas a partir del periplasma de la cepa hospedadora de E. coli MG1655 waaL::pglB-galK cultivada que alberga un plásmido que expresa un antígeno O1 y un plásmido que expresa EPA sobre una segunda columna de Source Q.
La Figura 30 representa un cromatograma del producto obtenido después de que las células hospedadoras que comprendían pglB insertado en el genoma de la célula hospedadora y que albergaban plásmidos que producían un antígeno de azúcar (Shigella O1) y una proteína vehículo (EPA) se sometieron a choque osmótico, se hicieron pasar sobre una primera columna de intercambio aniónico (Source Q) y se hicieron pasar sobre una segunda columna de intercambio aniónico (Source Q).
La Figura 31 representa los resultados de la tinción con Coomasie de las proteínas presentes en las fracciones obtenidas de hacer pasar las proteínas aisladas a partir del periplasma de la cepa hospedadora de E. coli MG1655 waaL::pglB-galK cultivada que alberga un plásmido que expresa un antígeno O1 y un plásmido que expresa EPA sobre una columna Superdex 200.
La Figura 32 representa un cromatograma del producto obtenido después de que las células hospedadoras que comprendían pglB insertado en el genoma de la célula hospedadora y que albergaban plásmidos que producían un antígeno de azúcar (Shigella O1) y una proteína vehículo (EPA) se sometieron a choque osmótico, se hicieron pasar sobre una primera columna de intercambio aniónico (Source Q), se hicieron pasar sobre una segunda columna de intercambio aniónico (Source Q) y se hicieron pasar sobre una columna Superdex 200.
Figura 33. (A) Los extractos de células enteras a partir de E. coli cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T, AgtrS::gtrII, AwaaL,::poi2ipglB (carril 1) y de E. coli cepa W 3 ll0 ArfbO16::rfb2457T, AgtrS::gtrII, AwaaL que contiene p114 (carril 2) se analizaron mediante SDS-PAGE y el PglB marcado con HA se detectó mediante Transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA. (B) El bioconjugado se produjo en E. coli cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T, AgtrS::gtrII, AwaaL,::poi2ipglB transformada con p150. La EPA se purificó a partir de los extractos periplásmicos usando cromatografía de afinidad. La purificación de EPA se analizó mediante SDS-PAGE seguida de tinción con azul Coomassie. (CE: extracto de células enteras; EP: extracto periplásmico; FT: flujo a través que no se unió a la columna de cromatografía de afinidad; L: fracción de lavado de la columna de afinidad; A10-A14: fracciones de la elución de la columna de afinidad).
La Figura 34 representa la expresión del bioconjugado por las cepas de E. coli que expresan una oligosacariltransferasa, la proteína vehículo y los bioconjugados producidos por el complejo génico rfb de Shigella flexneri 2a (véanse las señales entre los marcadores de peso molecular de 90 a 170 kDa, los cuales corresponden al bioconjugado de S.flexneri 2a-EPA).
5 Descripción detallada
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para insertar secuencias contiguas de ADN, incluyendo secuencias contiguas grandes de ADN, en los genomas de las células hospedadoras. Dichas secuencias de ADN pueden comprender múltiples componentes, por ejemplo, genes, promotores, terminadores, etc. y pueden insertarse selectivamente en las posiciones deseadas en los genomas de las células hospedadoras. En ciertos aspectos, las secuencias de ADN pueden insertarse selectivamente en regiones del genoma de la célula hospedadora de tal manera que uno o más componentes presentes en los fragmentos (por ejemplo, genes) son expresados por la célula hospedadora, por ejemplo, la célula hospedadora expresa uno o más componentes (por ejemplo, genes) que no son normalmente expresados por la célula hospedadora y/o la célula hospedadora expresa un componente (por ejemplo, un gen) que se expresa de forma natural por la célula hospedadora, pero que expresa más de ese componente. Los procedimientos de inserción de ADN se describen en la sección 5.1, más adelante.
En un aspecto específico, en el presente documento se proporciona un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia grande de ADN comprende uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más genes. En ciertas realizaciones, los genes presentes en las secuencias de ADN insertadas en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento están bajo el control de una o de múltiples secuencias reguladoras o de promotores que también están presentes en las secuencias de ADN. En ciertas realizaciones, las secuencias de ADN insertadas en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender elementos adicionales esenciales o beneficiosos para la expresión de los genes presentes en la secuencia grande de ADN, por ejemplo, potenciadores, terminadores.
En otro aspecto específico, en el presente documento se proporciona un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que dicha secuencia grande de ADN comprende uno o más operones, por ejemplo, un complejo génico de genes bajo el control de una señal reguladora o un promotor común.
En otro aspecto específico, en el presente documento se proporciona un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN en un genoma de una célula hospedadora, en el que el genoma de la célula hospedadora tiene además una deleción de ADN que está normalmente asociada al genoma de la célula hospedadora, es decir, el procedimiento da como resultado tanto una inserción de ADN heterólogo en el genoma de la célula hospedadora como la retirada del ADN normalmente presente del genoma de la célula hospedadora. En las realizaciones específicas, la inserción de una secuencia grande de ADN se hace en el sitio de la retirada de una secuencia de ADN del genoma de la célula hospedadora del tamaño equivalente, es decir, el ADN del genoma de la célula hospedadora es reemplazado por la secuencia de ADN insertada.
En ciertos aspectos, los procedimientos descritos en el presente documento comprenden la introducción de un plásmido auxiliar y un plásmido donador en una célula hospedadora. Como se usa en el presente documento los plásmidos auxiliares pretenden abarcar los plásmidos que comprenden elementos (por ejemplo, codifican genes) que son requeridos para la inserción de una secuencia grande de ADN en el genoma de una célula hospedadora. De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento los plásmidos auxiliares no incorporan cualquier ADN en el genoma de la célula hospedadora por sí mismos, sino que más bien facilitan la incorporación del ADN de inserto que está presente en los plásmidos donadores descritos en el presente documento. Los plásmidos auxiliares se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.1, más adelante. Como se usan en el presente documento los plásmidos donadores pretenden abarcar los plásmidos que comprenden la secuencia grande de ADN para insertarse en un genoma de una célula hospedadora, es decir, el plásmido donador “dona” parte de sí mismo al genoma de la célula hospedadora (es decir, la secuencia grande de ADN para insertarse en el genoma de la célula hospedadora es donada). En ciertos aspectos, los plásmidos donadores proporcionados en el presente documento comprenden otros elementos que son requeridos o útiles para la inserción de la secuencia grande de ADN en el genoma de la célula hospedadora. Los plásmidos donadores se describen con mayor detalle en la Sección 5.1.2, más adelante.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras procariotas, por ejemplo, E. coli) que comprenden genomas en los que se han insertado secuencias de ADN, tales como secuencias grandes de ADN, de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento. Sin quedar ligado a teoría alguna, los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para generan células hospedadoras genéticamente estables que son capaces de producir las proteínas de interés, por ejemplo, proteínas para su uso como vacunas, proteínas glucosiladas, proteínas para su uso en cosméticos, etc. Como un resultado de los procedimientos proporcionados en el presente documento estas células hospedadoras no necesitan mantenerse y/o propagarse en la presencia de ciertos marcadores, por ejemplo, marcadores de selección de antibióticos, debido al hecho de que el ADN que comprende los genes de interés se inserta directamente en el genoma de las células hospedadoras.
En ciertos aspectos, las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden un genoma en el cual se han insertado una o más secuencias de ADN, en el que estas secuencias de ADN codifican una proteína o comprenden un operón/complejo génico implicado en la glucosilación de las proteínas, por ejemplo, en la N-glucosilación de las proteínas. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, una célula hospedadora descrita en el presente documento comprende un genoma en el cual se han insertado uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa.
En un aspecto específico, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una cuarta secuencia de ADN, en el que dicha cuarta secuencia de ADN comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende dos o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En un aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora que comprende un plásmido donador y un plásmido auxiliar, (a) en la que el plásmido auxiliar comprende: (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora; y (b) en la que el plásmido donador comprende: (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserto heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contra-selección. En un aspecto específico, la secuencia de reconocimiento comprende al menos 18 pares de bases. En otro aspecto específico, la endonucleasa de restricción es SceI. En un aspecto específico, el ADN de inserto heterólogo comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican oligosacaril-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa derivada de un organismo procariota. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa del género Campylobacter. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa de Campylobacter je juni (por ejemplo, el gen pglB de C. jejuni). En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacariltransferasa derivada de un organismo eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las glucosil-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de una glucosil-transferasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente N.° WO 2011/138361. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Grampositiva, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa deriva de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa del polisacárido capsular 5 a partir de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa del polisacárido capsular 8 de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Gram-negativa, por ejemplo, E. coli. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de un eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las epimerasas que pueden insertarse en las células hospedadoras
descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico
de epimerasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico de epimerasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente Número WO 2011/062615. En
una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de epimerasa insertada en el genoma de una célula
hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de epimerasa representada por el
gen Z3206 de E. coli cepa O157. Véanse, por ejemplo, la Publicación Internacional Número WO 2011/062615 y Rush
y col., 2009, The Journal of Biological Chemistry 285: 1671-1680.
Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden los complejos génicos rfb que pueden insertarse en las células
hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, el
complejo génico rfb insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento es un complejo génico
rfb de E. coli, por ejemplo, un complejo génico rfb de E. coli de cualquier serogrupo O/antígeno O conocido en la
materia, por ejemplo, O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19,
O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41,
O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63,
O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86,
O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106,
O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158,
O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 u O187 y los subserotipos de los mismos.
En otra realización específica, el complejo génico rfb insertado en una célula hospedadora descrita en el presente
documento es un complejo génico rfb de una cepa de Pseudomonas (por ejemplo, una cepa de P. aeruginosa), una
cepa de Salmonela (por ejemplo, una cepa de S. entérica), una cepa de Yersinia, una cepa de Klebsiella pneumoniae,
una cepa de Francisella (por ejemplo, F. tularensis), una cepa de Acinetobacter baumannii, una cepa de Burkholderia
o una cepa de Shigella.
Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden complejos génicos de polisacárido capsular que pueden
insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una
realización específica, el complejo génico de polisacárido capsular insertado en una célula hospedadora descrita en
el presente documento es un complejo génico de polisacárido capsular de una cepa de E. coli, una cepa de
Streptococcus (por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae), una cepa de Staphylococcus (por ejemplo,
S. aureus) o una cepa de Burkholderia (por ejemplo, B mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis).
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas vehículo que pueden insertarse en las células
hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. Las proteínas vehículo producidas por
las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al menos una secuencia consenso de N-glucosilación, por ejemplo, cualquiera de las secuencias consenso (i) Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona
independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan
independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro. En consecuencia, las secuencias de ADN que codifican
las proteínas vehículo insertadas en las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al
menos una secuencia de ácido nucleico dentro de la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo que codifica
una secuencia consenso de N-glucosilación. La secuencia de ADN que codifica una proteína vehículo insertada en
las células hospedadoras descritas en el presente documento puede codificar cualquier proteína vehículo conocida en
la materia, incluyendo las proteínas vehículo descritas en la Sección 5.2.1.2, más adelante. En una realización
específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora
descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica la exotoxina A de P. aeruginosa
(EPA), incluyendo la EPA que se ha modificado genéticamente para comprender al menos una secuencia consenso
de N-glucosilación. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en
el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que
codifica la toxina colérica B. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo
insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico que codifica AcrA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo
insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico que codifica HlA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo
insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido
nucleico que codifica ClfA.
En ciertas realizaciones, el número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita
en el presente documento por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una
realización específica, el número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita
en el presente documento por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, es de 1 o 2. En otra realización específica, el
número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento
por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, es de 1.
En ciertas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden una deleción de un gen, en el que se ha insertado una secuencia de ADN de interés en el genoma de la célula hospedadora en el sitio de la deleción del gen. En una realización específica, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento es E. coli portadora de una deleción del gen waaL. En una realización específica, una secuencia de ADN que codifica una oligosacaril-transferasa se inserta en el sitio de la deleción del gen waaL en la célula hospedadora de E. coli. En otra realización específica, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento es E. coli portadora de una deleción del gen wecG. En una realización específica, una secuencia de ADN que codifica una proteína vehículo se inserta en el sitio de la deleción del gen wecG en la célula hospedadora de E. coli. En otra realización específica, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento es E. coli portadora de una deleción del gen waaL y una deleción del gen wecG, en el que se inserta una oligosacaril-transferasa en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen waaL eliminado y en el que se inserta una proteína vehículo (por ejemplo, EPA que comprende una secuencia consenso de N-glucosilación) en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen wecG eliminado.
5.1 Procedimientos de inserción de ADN
En esta sección (5.1) se describen novedosos procedimientos para insertar secuencias de ADN, incluyendo secuencias grandes de ADN (es decir, el ADN de inserto heterólogo), en el genoma de las células hospedadoras. Aquellos expertos en la materia apreciarán que los procedimientos descritos en esta sección poseen varias ventajas y permiten la generación de células hospedadoras (por ejemplo, células hospedadoras procariotas) que pueden usarse para la producción biológica de bienes comerciales, incluyendo vacunas. Las ventajas de ejemplo que poseen las células hospedadoras genéticamente estables generadas de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, (i) no es necesaria la presión de selección para el ADN cromosómicamente insertado, (ii) se regula estrictamente el número de copias de genes dentro del ADN de inserto heterólogo y (iii) el ADN de inserto heterólogo en el genoma de las células hospedadoras sigue siendo estable a través de múltiples generaciones de propagación de células hospedadoras. Estas células hospedadoras estables son útiles, por ejemplo, para la fermentación industrial.
En ciertas realizaciones, se introducen secuencias de ADN, por ejemplo, secuencias grandes contiguas de ADN, en una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli), usando los procedimientos descritos en el presente documento (véase más adelante). En ciertas realizaciones, se introducen secuencias de ADN en una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli), usando uno o más procedimientos descritos en la Sección 5.1.6, más adelante. Aquellos expertos en la materia apreciarán fácilmente que los procedimientos de esta invención pueden practicarse mediante la modificación de diversos componentes usados en los procedimientos. Por ejemplo, los plásmidos donadores y los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento pueden comprender múltiples elementos diferentes, siempre que sigan siendo funcionales en los procedimientos descritos en el presente documento. Las modificaciones de ejemplo a los plásmidos donadores descritos en el presente documento a los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento y a las células hospedadoras descritas en el presente documento se presentan en las Secciones 5.1.1 y siguientes.
En una realización de ejemplo, un procedimiento para insertar una secuencia grande de ADN (es decir, el ADN de inserto heterólogo) en el genoma de una célula hospedadora comprende el uso de (i) un plásmido donador el cual comprende (a) ADN de inserto heterólogo flanqueado por regiones de homología (HR), por ejemplo, regiones de homología largas (por ejemplo, HR de cualquier tamaño apropiado, por ejemplo, de 0,4-2,0 kb), que dirijan el sitio de recombinación en el genoma de la célula hospedadora (el uso de tales regiones HR aumenta la eficiencia de la inserción) y (b) un marcador de contra-selección que reprime el crecimiento de las células hospedadoras que comprenden el plásmido donador, es decir, el plásmido donador no integrado después de la introducción del plásmido donador en la célula hospedadora (el uso del marcador de contra-selección elimina los clones falsos positivos [H ]); y (ii) un plásmido auxiliar que comprende un marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda y un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, endonucleasa de restricción SceI). En el plásmido auxiliar, el marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda y el marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, endonucleasa de restricción SceI) pueden estar bajo el control de diferentes promotores (por ejemplo, un primer promotor y un segundo promotor) para la expresión concertada de las proteínas producidas por los marcos de lectura abierta [12]. El plásmido donador también puede comprender la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción presente en el plásmido auxiliar.
Los procedimientos descritos en el presente documento permiten hacer múltiples rondas de inserciones una después de otra, es decir, que primero puede insertarse un inserto de ADN grande en una posición y en lo sucesivo pueden llevarse a cabo más inserciones usando la misma metodología. Estas inserciones consecutivas pueden dirigirse hacia cualquier parte del genoma de la célula hospedadora, es decir, también hacia el ADN insertado anteriormente o hacia las secuencias cromosómicas originales presentes en la célula hospedadora. Además, el procedimiento es compatible con otros procedimientos de inserción, como la recombinación homóloga de acuerdo con Datsenko y Wanner (Datsenko KA, Wanner BL: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 2000, 97(12): 6640-6645.). La etapa de inserción de los procedimientos descritos en el presente documento es decir, la etapa de insertar el ADN de inserto heterólogo en el genoma de una célula hospedadora, se basa en la recombinación homóloga - o cruzamiento - de los tramos de ADN homólogo in vivo. Durante la recombinación homóloga, debe haber un homólogo del ADN en el sitio diana y uno en la construcción del donador (es decir, el plásmido donador). De acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento los elementos requeridos para la inserción pueden introducirse en la célula hospedadora, por ejemplo, pueden introducirse sobre uno o más plásmidos que se introduzcan en la célula hospedadora. Aquellos expertos en la materia apreciarán fácilmente cómo pueden introducirse plásmidos en las células hospedadoras y los procedimientos de ejemplo para hacerlo se proporcionan en la Sección 5.1.3, más adelante.
Los procedimientos mediante los cuales puede insertarse el ADN de inserto heterólogo en el genoma de una célula hospedadora pueden comprender múltiples etapas. Por ejemplo, puede necesitarse diseñar los plásmidos donadores y/o los plásmidos auxiliares antes de que pueda llevarse a cabo el procedimiento. Además, pueden llevarse a cabo modificaciones a las células hospedadoras antes o durante el procedimiento de inserción. Aquellos expertos en la materia entenderán fácilmente las etapas que se necesitan llevar a cabo basándose en el ADN de inserto heterólogo que se desee insertar en una célula hospedadora dada. En términos generales, los procedimientos de inserción de ADN de inserto heterólogo en una célula hospedadora descrita en el presente documento pueden comprender algunas o todas las siguientes etapas:
(1) Se fabrica un plásmido donador. Se clona una secuencia de ADN de inserto heterólogo deseada (es decir, una secuencia de ADN de inserto heterólogo que comprende uno o más genes de interés) en un sitio de clonación (por ejemplo, un sitio de clonación múltiple, abreviado MCS) de un plásmido adecuado para su uso como un plásmido donador (véase la Sección 5.1.2). Las secuencias de ADN adecuadas para su uso como regiones de homología (es decir, las secuencias de ADN homólogas a la localización de inserción sobre el genoma de la célula hospedadora) también se clonan en el plásmido donador, de tal manera que las regiones de homología flanqueen al ADN de inserto heterólogo. Estos procedimientos de clonación y ensamble del plásmido donador pueden realizarse de acuerdo con cualquier tecnología establecida y bien conocida para modificar y sintetizar el ADN, tales como, sin limitación, clonación molecular usando enzimas de restricción y ligasa, transposasas, síntesis química, etc. cuyas tecnologías son conocidas por aquellos expertos en la materia [1].
Además, en ciertas realizaciones, se coloca un casete de selección, el cual comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos entre los brazos de homología. Las células hospedadoras que comprenden al ADN de inserto heterólogo insertado en su genoma pueden identificarse mediante su cultivo en un medio que comprenda el antibiótico para el que proporcione resistencia el gen de resistencia a antibióticos del casete de selección. En ciertas realizaciones, el casete de selección puede estar flanqueado por sitios FRT [13], los cuales permiten hacer la retirada posterior del casete mediante recombinación dirigida al sitio. La incorporación de sitios FRT de esta manera en el plásmido donador, por consiguiente, asegura que el casete de selección no permanezca integrado en el genoma de la célula hospedadora. En otra realización, el casete de selección puede retirarse en seguida de la integración por medio de la recombinación homóloga dirigida al sitio mediada por el sitio dif Q4] o mediante otras tecnologías de mutagénesis cromosómica dirigida al sitio.
Los plásmidos donadores descritos en el presente documento también se diseñan para comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteína de contra-selección. Puede incorporarse cualquier gen que codifique una proteína conocido por aquellos expertos en la materia adecuado para su uso en los enfoques de contra-selección, en los plásmidos donadores descritos en el presente documento. En una realización específica, se usa el gen sacB para la contra-selección.
Los plásmidos donadores descritos en el presente documento también se diseñan para comprender un origen de replicación. Aquellos expertos en la materia apreciarán fácilmente que el origen de replicación incorporado en el plásmido donador debe ser adecuado para su uso en la célula hospedadora que se esté sometiendo a la modificación del genoma. Por ejemplo, debe estar presente un origen de replicación de E. coli cuando se esté llevando a cabo la clonación en E. coli. En una realización específica, el origen de replicación es oriT. Aquellos expertos en la materia apreciarán fácilmente que pueden generarse plásmidos lanzadera (es decir, plásmidos capaces de replicarse en múltiples células hospedadoras, por ejemplo, múltiples especies bacterianas) empleando los procedimientos conocidos en la técnica y estos plásmidos podrían usarse para su inserción en numerosos tipos de células hospedadoras, por ejemplo, células procariotas, células de arqueas, células de eubacterias o células eucariotas. Dichos plásmidos lanzadera pueden comprender elementos de control de expresión específicos del organismo y orígenes de replicación.
(2) Se fabrica un plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar se diseña para codificar todas las actividades necesarias para mediar la inserción del ADN en las células hospedadoras como se describe en el presente documento y para el mantenimiento del plásmido auxiliar dentro de las células hospedadoras que experimenten recombinación. En ciertas realizaciones, los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento comprenden (i) un casete de selección para el mantenimiento del plásmido en la célula hospedadora, (ii) un regulón para la expresión de una recombinasa, es decir, una enzima o enzimas que soportan y mejoran la eficiencia del cruzamiento entre los tramos de ADN homólogo, (iii) un regulón para la expresión de una función que linealiza el inserto de ADN dando como resultado secuencias homólogas terminales que pueden experimentar recombinación homóloga, (iv) un regulón que expresa un homólogo de RecA para las células hospedadoras que no tienen una copia de recA propia y (v) un origen de replicación condicional. Estos elementos se describen más adelante con mayor detalle.
En ciertas realizaciones, los plásmidos auxiliares usados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento comprenden componentes similares al plásmido auxiliar pTKRED (Gene Bank GU327533.1;
[12]). En una realización específica, el plásmido auxiliar pTKRED (Gene Bank GU327533.1; [12]) se usa en los procedimientos descritos en el presente documento.
(3) El plásmido donador y el plásmido auxiliar se introducen en la misma célula hospedadora. La inserción de los plásmidos donador y auxiliar puede llevarse a cabo mediante muchas tecnologías diferentes conocidas por aquellos expertos en la materia, incluyendo, sin limitación, electroporación, el uso de células químicamente competentes, choque térmico y transducción de fagos. Las células hospedadoras pueden cultivarse después en condiciones selectivas para enriquecerse en células que lleven los plásmidos introducidos.
(4) Se inicia el procedimiento de inserción. Un procedimiento de inserción de ejemplo comprende las siguientes etapas: los cultivos durante la noche de los clones positivos (es decir, las células hospedadoras que comprenden los plásmidos tanto auxiliar como donador) pueden hacerse crecer, por ejemplo, a 30 °C en el medio, el cual comprende los antibióticos apropiados para la selección (tales antibióticos pueden seleccionarse fácilmente por aquellos expertos en la materia basándose en los casetes de selección presentes en los plásmidos donadores/auxiliares). Los cultivos entonces pueden diluirse y hacerse crecer, por ejemplo, a 30 °C hasta la fase exponencial en presencia de los antibióticos apropiados. Bajo estas condiciones, los plásmidos auxiliares y donadores se mantienen pero silenciosos. A continuación, el medio se reemplaza por un medio que contenga los antibióticos para la selección, así como cualquier inductor de elementos condicionales (por ejemplo, promotores inducibles u orígenes de replicación condicionales) presentes en los plásmidos, seguido de la incubación adicional de las células. Durante este tiempo, se expresan la endonucleasa de restricción (por ejemplo, SceI) en el plásmido auxiliar y la recombinasa (por ejemplo, recombinasa Red lambda) en el plásmido auxiliar, conduciendo a la disociación del plásmido donador en los brazos de homología y la recombinación homóloga del ADN de homología en los sitios homólogos en el genoma de la célula hospedadora (véase la Figura 2). A continuación, las células se colocan en placa sobre el medio que contiene el componente al que corresponde el marcador de contra-selección del plásmido donador corresponde a (por ejemplo, sacarosa si el marcador de contra-selección es sacB). Esta etapa da como resultado la contra-selección de las células que comprenden el plásmido donador, es decir, las células en las que el plásmido donador existe en un estado no insertado. Este medio también comprende el marcador de resistencia presente en el casete de inserción del plásmido donador (es decir, el casete de resistencia a antibióticos que está presente entre la HR del plásmido donador, para seleccionar las células que contengan el ADN de inserto heterólogo. Después de la incubación durante la noche, las células se rastrean entonces para buscar los clones recombinados que muestren un fenotipo de resistencia a antibióticos consistente con (i) la pérdida de los plásmidos auxiliares y donadores y (ii) la presencia del inserto de ADN heterólogo.
Aquellos expertos en la materia apreciarán que las condiciones anteriores pueden modificarse usando planteamientos experimentales convencionales. Por ejemplo, ciertas condiciones pueden cambiarse basándose en las células hospedadoras específicas usadas, en los marcadores de selección y de contra-selección usados, etc. Las cepas de inserción de ejemplo se presentan en las Tablas 1 y 2.
En una realización específica, un procedimiento para insertar ADN en una célula hospedadora comprende lo siguiente: Los cultivos durante la noche de los clones positivos (es decir, que contienen el plásmido auxiliar y el plásmido donador) se hacen crecer a 30 °C en medio LB líquido que contiene los antibióticos para la selección (spec y uno o ambos marcadores seleccionables del plásmido donador), se diluyen hasta una DO600 de 0,05 y se hacen crecer a 30 °C hasta la fase exponencial en la presencia de espectinomicina y el marcador de selección del inserto de ADN (kanR o clmR). Bajo estas condiciones, los plásmidos auxiliar y donador se mantienen, pero silenciosos. Después, el medio se reemplaza por medio LB que contiene los antibióticos para la selección, arabinosa al 0,2 % e IPTG 1 mM y las células se incuban adicionalmente a 30 °C durante varias horas (2, 4, 6, 8 h). Durante este tiempo, se expresan las proteínas de SceI y de recombinasa Red, conduciendo a la disociación del plásmido donador en los brazos de homología y a la recombinación homóloga del ADN de homología en los sitios homólogos en el genoma (Figura 2). Después, las células se colocan en placa en medio LB que contiene sacarosa al 10 % (para contra-seleccionar las células que contengan el plásmido donador) y el marcador de resistencia presente en el casete de inserción (kanR o clmR), para seleccionar las células que todavía contengan el inserto de ADN. Otros marcadores de selección y de contra-selección pueden requerir el ajuste de las condiciones. Después de la incubación durante la noche a 37-42 °C, las células se rastrean para buscar los clones recombinados que muestren un fenotipo de resistencia a antibióticos de una manera consistente con i) la pérdida los plásmidos auxiliar y ii) donador y iii) la presencia del inserto de ADN. Los clones se colocan en placa en réplica sobre LM complementado con amp, spec y kan o clm para detectar las colonias sensibles. Los fenotipos combinados que indican las colonias bacterianas candidatas que posiblemente contienen el inserto de ADN son: Sensibilidad a la ampicilina (indicativa de la pérdida del plásmido donador); Sensibilidad a la espectinomicina (indicativa de la pérdida del plásmido auxiliar); Resistencia a clm o a kan (indicativa de la presencia del inserto de ADN).
Como se demuestra en los Ejemplos de procesamiento más adelante, los procedimientos anteriores se emplearon para insertar secuencias de ADN heterólogo que comprendían el antígeno O y los complejos génicos de polisacáridos capsulares en localizaciones específicas del genoma de E. coli, mientras que simultáneamente se retiraban el antígeno O y los complejos génicos capsulares naturales y previamente existentes del genoma de E. coli en el procedimiento. Las células hospedadoras resultantes se usaron para producir glucoproteínas que consistían en una proteína vehículo expresada en el espacio periplásmico de dichas células hospedadoras que contenían los polisacáridos de antígeno O covalentemente enlazados en sitios específicos. Aquellos expertos en la materia apreciarán fácilmente que estos procedimientos podrían aplicarse para insertar cualquier secuencia de ADN heterólogo deseada en las células hospedadoras.
5.1.1 Plásmidos auxiliares
Los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento y usados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento codifican todos los componentes necesarios para mediar la inserción del ADN y para el mantenimiento del plásmido auxiliar dentro de las células hospedadoras que experimenten recombinación durante el período de tiempo necesario, es decir, las células hospedadoras en las cuales se inserte el ADN heterólogo mediante los procedimientos descritos en el presente documento. A continuación se presentan ciertos componentes que pueden introducirse en los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento.
5.1.1.1 Marcadores seleccionables
Los marcadores seleccionables se introducen en los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento para asegurar la introducción apropiada de los plásmidos auxiliares en las células hospedadoras modificadas como se describe en el presente documento. En particular, los marcadores seleccionables pueden usarse para seleccionar las células hospedadoras que hayan aceptado el plásmido después de la transformación y para mantener el plásmido durante el procedimiento de recombinación. En la técnica se conocen numerosos sistemas para la selección y están disponibles para aquellos expertos en la materia. Los ejemplos incluyen, sin limitación, casetes genéticos que confieren (i) resistencia a antibióticos (por ejemplo, amp, kan, spec, clm, gen, tmp, tet) [15]; (ii) crecimiento en medios selectivos, por ejemplo, sistemas marcadores auxótrofos (Régis Sodoyer, Virginie Courtois, Isabelle Peubez y Charlotte Mignon (2012). Antibiotic-Free Selection for Bio-Production: Moving Towards a New "Gold Standard", Antibiotic Resistant Bacteria - A Continuous Challenge in the New Millennium, Marina Pana (Editor), ISBN: 978-953­ 51-0472-8, InTech, disponible en: http://www.intechopen.com/books/antibiotic-resistant-bacteria-a-continuouschallenge-in-the-new-millennium/antibiotic-free-selection-for-bio-production-moving-towards-a-new-gold-standard), (iii) sistemas de toxina-antitoxina y (iv) resistencia a biocidas como, por ejemplo, triclosán [16]. La Tabla 6, más adelante, también proporciona una lista de antibióticos que pueden usarse para la selección.
En una realización específica, se usa un casete de resistencia a espectinomicina para la selección del plásmido auxiliar, es decir, para el mantenimiento del plásmido auxiliar en la célula diana.
5.1.1.2 Enzimas de recombinasa
Los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento comprenden recombinasas para soportar el cruzamiento (recombinación homóloga) y el re-ligamiento de las partes homólogas del ADN. Las recombinasas de ejemplo que pueden usarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, recombinasa Red lambda, RecE/RecT del profago Rac [17] y RedaJA del bacteriófago lambda [18-20].
En una realización específica, la recombinasa usada en los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento es la recombinasa Red lambda. En otra realización específica, la recombinasa Red lambda está bajo el control del promotor lac. La recombinasa Red lambda cataliza la reacción de recombinación homóloga (el cruzamiento) y consiste en tres subunidades funcionales que son codificadas en tres marcos de lectura abierta en el plásmido. El primer gen es gam, el cual es un miembro de la familia de proteínas Gam inhibidoras de nucleasa del hospedador. La proteína Gam inhibe la nucleasa RecBCD y se encuentra tanto en bacterias como en bacteriófagos. El segundo gen es beta y codifica una proteína de la familia RecT. Las proteínas RecT son proteínas de hibridación de ADN monocatenario (SSAP, por sus siglas en inglés), tales como RecT, Red-beta, ERF y Rad52 y funcionan en las rutas de recombinación de ADN dependientes de RecA e independientes de RecA. El tercer gen es el gen exo, que codifica una proteína de dominio de recombinasa vírica tipo YqaJ. Esta familia de proteínas se encuentra en muchas especies bacterianas diferentes pero es de origen vírico. La proteína forma un oligómero y funciona como una exonucleasa alcalina de procesamiento que digiere el ADN bicatenario lineal en una reacción dependiente de Mg(2+). Tiene una preferencia por los extremos de ADN 5'-fosforilados. Las tres proteínas promueven los eventos de recombinación homóloga en E. coli y otros organismos.
En ciertas realizaciones, las recombinasas presentes en el plásmido auxiliar están bajo el control de promotores diferentes del promotor lac. Tales promotores distintos pueden incluir, sin limitación, el promotor de araBAD [21], el promotor de ramnosa [22], los promotores inducibles por calor [23], el promotor de salicilato [24], el promotor de tetraciclina [25], etc.
5.1.1.3 Endonucleasas
Las endonucleasas en el plásmido auxiliar linealizan el plásmido donador y de esta manera movilizan el trozo de inserción del ADN. En consecuencia, los plásmidos donadores usados en un procedimiento dado descrito en el presente documento poseen la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción presente en el plásmido auxiliar. La recombinación homóloga mediante enzimas de recombinasa depende de los extremos del inserto de ADN de una sola cadena como sustratos para emparejarse con el sitio diana. Por consiguiente, la linealización (es decir, la generación de los extremos de doble cadena) es un paso importante para la activación del inserto de ADN. Los extremos de ADN de doble cadena abiertos se digieren enzimáticamente en las cadenas individuales, que entonces son los sustratos reales para el emparejamiento y la recombinación.
Las endonucleasas usadas en el presente documento pueden actuar en el citoplasma de las células hospedadoras, de esta manera, pueden cortar el plásmido donador, pero no deben afectar a la estabilidad del cromosoma de la célula hospedadora. En términos generales, puede usarse cualquier enzima de restricción o cortador de ADN bicatenario en los procedimientos descritos en el presente documento siempre que no corte el ADN genómico de la célula hospedadora. En las realizaciones específicas, pueden usarse endonucleasas que funcionen en el citoplasma y se dirijan a los sitios de reconocimiento largos y raros, debido a que estas endonucleasas son altamente específicas del sitio por tener secuencias de reconocimiento raras. Por ejemplo, pueden seleccionarse endonucleasas que tengan secuencias de reconocimiento de más de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 28, 29, o 30 sitios de reconocimiento de pares de bases para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento.
En una realización específica, se usan endonucleasas de asentamiento en los procedimientos descritos en el presente documento. Las endonucleasas de asentamiento son un tipo especial de enzimas de restricción codificadas por intrones o inteínas. Comprenden diferentes grupos estructurales, por ejemplo, las familias de las cajas LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1), GIY-ilG (SEQ ID NO: 2), H-N-H e His-Cys. En la Tabla 4 se da una lista de ejemplo de endonucleasas de asentamiento, más adelante. Las endonucleasas usadas en el presente documento pueden estar presentes en el plásmido auxiliar, de tal manera que estén bajo el control de un promotor inducible también presente en el plásmido auxiliar.
En una realización específica, la endonucleasa codificada por los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento es SceI. SceI es un miembro de la familia de endonucleasa de ADN LAGLIDADG (SEQ ID NO: 1). Ésta es una familia de endonucleasas de ADN específicas del sitio codificadas por los elementos móviles del ADN. Funcionalmente, SceI es una endonucleasa de restricción de inicio que corta una secuencia de reconocimiento de 18 pares de bases TAGGGATAACAGGGTAAT (SEQ ID NO: 3), que nunca se presenta en el genoma de E. coli. La secuencia de reconocimiento específica, rara y larga es crucial para su aplicación en la invención. En ciertas realizaciones, el SceI está bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo, el promotor de arabinosa.
5.1.1.4 RecA
RecA es una enzima bacteriana que tiene funciones en la recombinación homóloga, en la reparación del ADN y en la inducción de la respuesta SOS. RecA acopla la hidrólisis de ATP al intercambio de cadena de ADN, es decir, cataliza la reacción de recombinación real. Para el propósito de la recombinación como se describe en el presente documento debe estar presente la actividad de recA, en la célula hospedadora. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la copia presente en el genoma de la célula hospedadora de tipo silvestre es suficiente para que tenga lugar la recombinación. Por consiguiente, no se necesita introducir recA en las células hospedadoras que expresen endógenamente recA.
En las células hospedadoras que no expresan recA, recA puede introducirse en la célula hospedadora en el plásmido auxiliar. Los homólogos de RecA están presentes en casi cada organismo. En consecuencia, aquellos expertos en la materia apreciarán que podría usarse cualquier gen funcional de recA de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento es decir, podría usarse basándose en su presencia natural en la célula hospedadora o bien podría usarse mediante la introducción de la función de recA en las células hospedadoras, por ejemplo, las células hospedadoras que no comprendan naturalmente recA.
5.1.1.5 Orígenes de replicación condicionales
Se requiere un origen de replicación para la replicación del ADN del plásmido auxiliar y para la distribución de las copias del plásmido a las células hijas durante la división celular. Los orígenes de replicación condicionales pueden usarse para mejorar o reducir los números de copias del plásmido en las células. Por ejemplo, puede usarse un origen de replicación sensible a la temperatura en los procedimientos descritos en el presente documento. Un origen de replicación tal no es funcional a temperaturas por encima de 37 °C, dando como resultado la pérdida del plásmido. Se conocen en la técnica otros orígenes de replicación condicionales y pueden usarse con los procedimientos descritos en el presente documento [26]. En la Tabla 5 se proporciona una lista de ejemplo de los orígenes de replicación condicionales.
En una realización específica, el origen de replicación usado en el presente documento es un origen de replicación pSC101 sensible a la temperatura [27], lo cual conduce a la pérdida del plásmido sobre el crecimiento a altas temperaturas. Otros orígenes de replicación que pueden usarse incluyen aquellos de pMB1, ColE1, R100, IncW y otros (véase, por ejemplo, [28]).
5.1.1.6 Promotores inducibles e inductores
La capacidad para controlar la función del plásmido auxiliar es importante para reducir la actividad de recombinación hasta un tiempo limitado durante el crecimiento celular, debido a que se pueden presentar reacciones secundarias indeseadas si se promueve la recombinación continua. Por consiguiente, pueden utilizarse promotores e inductores inducibles para asegurar que se expresen ciertos componentes de los plásmidos auxiliares solamente cuando se desee. Los promotores inducibles de ejemplo incluyen, sin limitación, el sistema promotor araBAD (inducible mediante la presencia de arabinosa) y el promotor tac (inducible mediante la presencia de IPTG). La Tabla 7 proporciona una lista adicional de los componentes inducibles que pueden usarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento.
5.1.2 Plásmidos donadores
Los plásmidos donadores descritos en el presente documento “donan” una secuencia de ADN de inserto heterólogo deseada a una célula hospedadora, que dan como resultado que las células hospedadoras tengan el ADN de inserto heterólogo establemente integrado.
En una realización específica, el plásmido donador usado en los procedimientos descritos en el presente documento se basa en el plásmido pDOC-C (Gene Bank GQ889494.1; [11.]). pDOC-C es un derivado de pEXT100T [29]. El plásmido contiene un gen de resistencia a la ampicilina para la selección (ampR), un origen para la replicación (oriT) y el gen sacB. SacB es una proteína secretada del operón de levansacarasa que se origina a partir de Bacillus subtilis. En presencia de sacarosa, sacB confiere letalidad. Por consiguiente, al agregar simplemente sacarosa al medio, el sacB puede usarse como un sistema para contra-seleccionar contra las células portadoras del plásmido [30]. Adicionalmente, pDOC-C codifica un sitio de clonación múltiple, el cual está flanqueado por los sitios SceI para la linealización in vivo.
A continuación se presentan ciertos componentes que pueden introducirse en los plásmidos auxiliares descritos en el presente documento.
5.1.2.1 Marcadores seleccionables
Los marcadores seleccionables presentes en los plásmidos donadores descritos en el presente documento pueden seleccionarse de las mismas listas que se proporcionan en la Sección 5.1.1.1, anterior, así como aquéllos listados en la Tabla 6, más adelante. También pueden usarse otros sistemas de selección, por ejemplo, los sistemas de selección basados en marcadores auxótrofos serían útiles para la selección de los eventos de inserción. Cuando una cepa aceptora contiene una deleción en un gen que hace que la cepa sea auxótrofa (es decir, su crecimiento depende de cierto componente del medio), este gen podría incluirse en el inserto de ADN.
En una realización específica, el plásmido donador comprende un casete clmR y/o kanR.
5.1.2.2 ADN de inserto heterólogo
Aquellos expertos en la materia apreciarán fácilmente que puede incluirse cualquier gen, o una combinación de genes, en el ADN de inserto heterólogo y posteriormente insertado en los genomas de las células hospedadoras usando los procedimientos descritos en el presente documento.
En una realización específica, el ADN de inserto heterólogo insertado en las células hospedadoras descritas en el presente documento comprende un complejo génico. En una realización específica, el complejo génico es uno que codifica el polisacárido capsular. En otra realización específica, el complejo génico es uno que codifica el antígeno O. Pueden usarse células hospedadoras que comprendan estos complejos génicos insertados, por ejemplo, para sintetizar la producción de glucoproteínas recombinantes que se puedan usar como vacunas.
Aquellos expertos en la materia apreciarán que la presente invención permite la inserción estable de secuencias grandes de ADN en los genomas de las células hospedadoras. Por ejemplo, las secuencias de ADN pueden comprender desde 1 kb hasta 40 kb. En ciertas realizaciones, el ADN de inserto heterólogo es mayor que 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb o 20 kb. En ciertas realizaciones, el ADN de inserto heterólogo es mayor que 25 kb. En ciertas realizaciones, el ADN de inserto heterólogo es mayor que 30 kb. En ciertas realizaciones, el ADN de inserto heterólogo es mayor que 35 kb. En ciertas realizaciones, el ADN de inserto heterólogo es mayor que 40 kb.
En una realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de E. coli en una célula hospedadora. El complejo génico rfb insertado puede pertenecer a cualquier serogrupo O/antígeno O conocido en la materia, por ejemplo, O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 u O187 y los subserotipos de los mismos. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Pseudomonas en una célula hospedadora. En una realización específica, la cepa de Pseudomonas es una cepa de P. aeruginosa. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Salmonela en una célula hospedadora. En una realización específica, la cepa de Salmonela es una cepa de S. enterica. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Yersinia en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Klebsiella pneumoniae en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Francisella tularensis en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Acinetobacter baumannii en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Burkholderia en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico rfb de una cepa de Shigella en una célula hospedadora. En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular de un organismo en una célula hospedadora. En una realización específica, el organismo es una cepa de E. coli. En otra realización específica, el organismo es una cepa de Streptococcus (por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae), una cepa de Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus), una cepa de Burkholderia (por ejemplo, B mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis). En una realización específica, la célula hospedadora es una célula hospedadora procariota. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización, los procedimientos descritos en el presente documento se usan para insertar una secuencia de ADN que comprende una o más enzimas que sintetizan oligo- o polisacáridos en el pirofosfato de undecaprenilo.
En ciertas realizaciones, las células hospedadoras se optimizan mediante la introducción en dichas células hospedadoras de los elementos genéticos que son codificados fuera de un complejo génico rfb. Por ejemplo, los genes que codifican glucosil-transferasas y acetil-transferasas que se encuentran fuera del complejo génico rfbs y los complejos génicos de polisacáridos capsulares y que modifican los polisacáridos recombinantes pueden introducirse en las células hospedadoras. Como otro ejemplo, en los antígenos O de E. coli y Shigella, hay glucosil-transferasas codificadas en los complejos génicos de profagos [31, 32]. Estos complejos génicos se denominan gtr y se organizan en un operón que consiste en una glucosil-transferasa que añade un solo resto de glucosa al fosfato de undecaprenol (GtrA), GtrB que desliza el undecaprenol enlazado con fosfato de glucosa hacia la cara periplásmica de la membrana y la transferasa Gtr específica, la cual después transfiere la glucosa unida al fosfato de undecaprenilo a la cadena de antígeno O en crecimiento. El ADN que comprende estos genes puede introducirse en las células hospedadoras descritas en el presente documento.
Una modificación similar es la acetilación. La acetilación de los antígenos O es común en Shigella y en un menor grado en E. coli. La modificación está catalizada por una sola acetil-transferasa que se codifica algunas veces dentro (E. coli O16) pero también fuera del complejo génico rfb (S. flexneri 3a) [33]. El ADN que codifica tales acetil-transferasas puede introducirse en las células hospedadoras descritas en el presente documento.
La ramificación y modificación de los antígenos O con frecuencia es importante para una respuesta inmunitaria eficiente y específica a los polisacáridos. Por consiguiente, estas rutas de modificación pueden incluirse en las cepas de producción insertadas para producir conjugados que contengan todos los posibles epítopos encontrados en la naturaleza.
Una realización adicional de la invención es la inserción de casetes de expresión para la producción de proteína recombinante que está controlada por un sistema inducible por el promotor. Esto significa que los grandes tramos de ADN que no solamente contienen el casete de expresión pero también las construcciones de expresión para las proteínas reguladoras, son una diana razonable para la tecnología presentada.
Otras secuencias de ADN que pueden insertarse en las células hospedadoras de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, ADN que comprende/que codifica oligosacaril-transferasas y glucosil-transferasas derivadas de las fuentes conocidas, por ejemplo, oligosacaril-transferasas y glucosiltransferasas procariotas y/u oligosacaril-transferasas y glucosil-transferasas eucariotas; ADN que comprende/que codifica epimerasas; y ADN que comprende/que codifica proteínas vehículo.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las oligosacaril-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa derivada de un organismo procariota. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa del género Campylobacter. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa de Campylobacter je juni (por ejemplo, el gen pglB de C. jejuni). En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacariltransferasa derivada de un organismo eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las glucosil-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de una glucosil-transferasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente N.° WO 2011/138361. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Grampositiva, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa deriva de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa del polisacárido capsular 5 de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosiltransferasa del polisacárido capsular 8 de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Gram-negativa, por ejemplo, E. coli. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de un eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las epimerasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de epimerasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de epimerasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente N.° WO 2011/062615. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de epimerasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de epimerasa representada por el gen Z3206 de E. coli cepa O157. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/062615 y Rush y col., 2009, The Journal of Biological Chemistry 285: 1671-1680.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas vehículo que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. Las proteínas vehículo producidas por las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al menos una secuencia consenso de N-glucosilación, por ejemplo, cualquiera de las secuencias consenso (i) Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro. En consecuencia, las secuencias de ADN que codifican las proteínas vehículo insertadas en las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico dentro de la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo que codifica una secuencia consenso de N-glucosilación. La secuencia de ADN que codifica una proteína vehículo insertada en las células hospedadoras descritas en el presente documento puede codificar cualquier proteína vehículo conocida en la materia, incluyendo las proteínas vehículo descritas en la Sección 5.2.1.2, más adelante. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica la exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), incluyendo EPA que se ha modificado genéticamente para comprender al menos una secuencia consenso de N-glucosilación. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica la toxina colérica B. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica AcrA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica HlA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica ClfA.
(a) Selección de regiones de homología
Las longitudes de la región homóloga (HR) para su uso de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento pueden determinarse experimentalmente. En términos generales, la HR puede tener una que varía de aproximadamente 0,1 kb a 3,0 kb, o mayor. En ciertas realizaciones, las HR son de 0,1 kb a 0,5 kb, de 0,5 kb a 1 kb, de 1 kb a 3 kb, de 3 kb a 5 kb, de 5 kb a 10 kb, de 10 kb a 15 kb, de 15 kb a 20 kb o mayores de 20 kb. En ciertas realizaciones, las HR son de una longitud idéntica o son de una longitud comparable. En ciertas realizaciones, las HR no son de una longitud idéntica o no son de una longitud comparable.
La distancia entre las HR también puede determinarse mediante experimentación. La distancia entre las HR puede estar en el intervalo de 1 kb a 12 kb, o mayor y puede determinarse mediante la longitud del ADN de inserto heterólogo y/o el tramo del ADN en el genoma de la célula hospedadora que se va a eliminar (por ejemplo, los tramos largos del genoma de la célula hospedadora pueden eliminarse siempre que no comprendan un gen esencial para la supervivencia de la célula hospedadora). La localización de la inserción del ADN heterólogo se define por la secuencia de la HR. Por consiguiente, la inserción puede llevarse a cabo prácticamente en cualquier posición en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, en cualquier posición sobre cualquier cromosoma de una célula hospedadora).
En ciertas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para clonar grandes piezas de ADN en los plásmidos presentes en las células diana, siempre que las regiones HR del plásmido donador estén presentes en el plásmido diana que está presente en la célula hospedadora, por ejemplo, en lugar de estar en el cromosoma diana.
Un aspecto importante de los procedimientos descritos en el presente documento es que el inserto de ADN se inserta en una localización genómica que se selecciona mediante la selección de las regiones de recombinación homóloga en consecuencia, (HR1 y HR2, véase la figura 1). HR1 y HR2 flanquean el inserto de ADN en el plásmido donador y también flanquean el a Dn que es reemplazado por el inserto de ADN después de la inserción. En los ejemplos de procesamiento proporcionados más adelante, se seleccionaron HR que se localizan a 3 kb (reemplazo de wecA-wzzE) o a 12 kb (reemplazo del complejo génico rfb) de separación entre sí en el cromosoma diana y se observó la inserción de éxito.
Las localizaciones de inserción pueden seleccionarse de muchas formas, incluyendo, sin limitación: I) puede seleccionarse una región de inserción debido a que sea deseable retirar una ruta posiblemente competidora o de interferencia reemplazando la misma con la una deseada (véanse los Ejemplos, más adelante); II) la inserción puede seleccionarse en la posición en la que la célula diana naturalmente contenga un complejo génico similar. Después puede equilibrarse el nivel de expresión y la localización para su expresión óptima; III) una localización de inserción puede no estar relacionada con el ADN que se inserte y puede seleccionarse enteramente de una manera empírica para que el nivel de expresión del inserto de ADN recombinante se muestre en una posición específica. Es decir, podrían realizarse muchas inserciones aleatorias diferentes y podría seleccionarse la mejor cepa productora; y IV) una inserción puede eliminar una función indeseada o puede eliminar una función que pueda usarse para la selección de proteínas recombinantes.
(b) Deleción de ADN en el sitio del inserto
En ciertas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento dan como resultado la deleción del ADN de la célula hospedadora, por ejemplo, la deleción del ADN genómico que codifique uno o más genes que puedan interferir con el resultado deseado del ADN insertado. En ciertas realizaciones, el ADN genómico de la célula hospedadora que va a retirarse se reemplaza directamente por el ADN de inserto heterólogo. Este concepto, es decir, la retirada de una ruta posiblemente competidora o de interferencia, mediante su reemplazo con la una deseada, es una forma razonable de elegir los sitios de inserción del ADN.
En realizaciones específicas, en los casos en los que se desee diseñar glucoconjugados de proteína con células hospedadoras modificadas generadas empleando los procedimientos descritos en el presente documento es útil eliminar los genes que codifican las proteínas que reducen los rendimientos de glucoproteína incluyendo, sin limitación, waaL, los genes codificados en el complejo génico del antígeno común enterobacteriano (ECA) (también denominado complejo génico wec), los genes del complejo génico de profago gtr, los genes implicados en la biosíntesis de azúcar del nucleótido, los genes que codifican las proteasas periplásmicas y los genes biosintéticos y de reciclaje de und-P.
En algunos casos, las glucosil-transferasas de la célula hospedadora pueden interferir con la producción de polisacárido recombinante codificada por el inserto de ADN. En consecuencia, una realización adicional de la invención es la deleción de las glucosil-transferasas de la célula hospedadora que modifican el polisacárido recombinante que da como resultado una estructura híbrida con características indeseadas.
(c) Retirada del ADN insertado
Las secuencias indeseadas e innecesarias son preocupantes cuando se usan cepas bacterianas recombinantes para la producción del material clínico de acuerdo con GIMP. De esta manera, en ciertas realizaciones, se retiran las secuencias de ADN auxiliares de las células hospedadoras generadas de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento una vez que ya no se requieren. Por ejemplo, los casetes de selección que se insertan junto con el ADN de interés pueden retirarse posteriormente, de tal manera que ya no estén asociados a las células hospedadoras generadas. Para retirar estos elementos después de la inserción del ADN, pueden emplearse diferentes procedimientos [34]. Por ejemplo, puede usarse la recombinación específica del sitio derivada de FRT/FLP [35] (véanse los Ejemplos). En tales casos, una recombinasa (por ejemplo, la recombinasa de FLP que reconoce una secuencia de 28 pares de bases) específica para las secuencias FLP que flanquean la secuencia que va a retirarse puede recombinar las secuencias, escindiendo de esta manera el ADN entre estas secuencias específicas. Los sistemas de escisión alternativos son loxP/Cre y los sistemas difXer [14, 36].
5.1.2.3 Otras modificaciones
En ciertas realizaciones, los glucoconjugados descritos en el presente documento se producen en un medio de crecimiento optimizado. En ciertas realizaciones, el medio de crecimiento se optimiza variando una o más de (i) la cantidad de extracto de levadura en el medio (por ejemplo, de 5 a 35 g/l), (ii) la concentración de Mg2+ del medio (por ejemplo, de 0 a 25 mM), (iii) la concentración del extracto de peptona del medio (por ejemplo, de 5-25 g/l), (iv) la concentración de extracto de triptona del medio (por ejemplo, de 5-25 g/l) y/o (v) la adición de chaperonas moleculares al medio, por ejemplo, la adición de trehalosa (por ejemplo, de 25 mM-50 mM), etilenglicol (por ejemplo, al 0,5 %), ácido glutámico (por ejemplo, 0,1 M), putrescina (por ejemplo, 25 mM), N-óxido de trimetilo (por ejemplo, 5 mM) y/o L-prolina (por ejemplo, 5 mM).
En ciertas realizaciones, el medio de crecimiento se optimiza variando el pH del medio. Por ejemplo, las variaciones de pH de 6,5 a 8,5 pueden evaluarse para determinar los efectos sobre el rendimiento del glucoconjugado. Ciertos genes funcionan óptimamente en cierto pH. En consecuencia, el medio de crecimiento puede usarse en valores de pH seleccionados para la optimización de genes específicos. Por ejemplo, la actividad de PglB es óptima a un pH ~ 8. Por consiguiente, en las realizaciones específicas, el crecimiento de células hospedadoras en los procedimientos descritos en el presente documento se lleva a cabo a pH 8. En otra realización específica, el crecimiento de células hospedadoras en los procedimientos descritos en el presente documento se lleva a cabo a un pH que varía de 4-6, 5­ 7, 6-8 o 7-9.
5.1.3 Procedimientos de introducción de plásmidos
Puede usarse cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia para introducir plásmidos, por ejemplo, los plásmidos donadores y auxiliares y ADN en las células hospedadoras. Estos procedimientos pueden incluir, sin limitación, electroporación, transformación química mediante choque térmico, transformación natural, transducción de fagos y conjugación.
5.1.4 Células hospedadoras
En el presente documento se abarcan células hospedadoras diseñadas mediante los procedimientos descritos en el presente documento, en las que estas células hospedadoras comprenden uno o más genes que codifican las proteínas de interés. En una realización específica, las proteínas producidas por las células hospedadoras descritas en el presente documento son antígenos, por ejemplo, antígenos víricos o bacterianos que pueden usarse en vacunas. En otra realización específica, las proteínas producidas por las células hospedadoras descritas en el presente documento son proteínas vehículo, en las que dichas proteínas vehículo se modifican mediante las células hospedadoras descritas en el presente documento de tal manera que posean una o más características beneficiosas, por ejemplo, la proteína vehículo está glucosilada.
En ciertas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento se diseñan usando un procedimiento descrito en la Sección 5.1, anterior. En ciertas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento se diseñan usando un procedimiento descrito en la Sección 5.1.6, más adelante.
En ciertas realizaciones, cuando las células hospedadoras se diseñan usando un procedimiento que comprende el uso de los plásmidos auxiliares y donadores (por ejemplo, como se describe en la Sección 5.1, anterior), los elementos codificados en los plásmidos auxiliares y donadores determinan si la invención puede usarse en cierta célula hospedadora.
Ciertos de los Ejemplos que se encuentran más adelante describen la aplicación de los procedimientos descritos en el presente documento en células hospedadoras de E. coli Gram-negativas; sin embargo, cualquier célula hospedadora conocida por aquellos expertos en la materia podría usarse como las células aceptoras para la inserción del ADN, incluyendo arqueas, células hospedadoras procariotas y células hospedadoras eucariotas.
Las células hospedadoras procariotas de ejemplo que pueden usarse de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, sin limitación, especies de Escherichia, especies de Shigella, especies de Klebsiella, especies de Xhantomonas, especies de Salmonela, especies de Yersinia, especies de Lactococcus, especies de Lactobacillus, especies de Pseudomonas, especies de Corynebacterium, especies de Streptomyces, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, especies de Bacillus y especies de Clostridium.
En ciertos aspectos de la divulgación, las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden un genoma en el cual se han insertado una o más secuencias de ADN, en las que dichas secuencias de ADN codifican una proteína o comprenden un operón/complejo génico implicado en la glucosilación de proteínas, por ejemplo, en la N-glucosilación de proteínas. Por ejemplo, en ciertos aspectos, una célula hospedadora descrita en el presente documento comprende un genoma en el cual se han insertado uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa.
En un aspecto específico, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una cuarta secuencia de ADN, en el que dicha cuarta secuencia de ADN comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende dos o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En un aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora que comprende un plásmido donador y un plásmido auxiliar, (a) en la que el plásmido auxiliar comprende: (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora; y (b) en la que el plásmido donador comprende: (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserto heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contra-selección. En un aspecto específico, la secuencia de reconocimiento comprende al menos 18 pares de bases. En otro aspecto específico, la endonucleasa de restricción es SceI. En un aspecto específico, el ADN de inserto heterólogo comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican oligosacaril-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa derivada de un organismo procariota. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa del género Campylobacter. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa de Campylobacter je juni (por ejemplo, el gen pglB de C. jejuni). En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de oligosacaril-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de oligosacariltransferasa derivada de un organismo eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las glucosil-transferasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de una glucosil-transferasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente N.° WO 2011/138361. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Grampositiva, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa deriva de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa del polisacárido capsular 5 de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de glucosiltransferasa del polisacárido capsular 8 de S. aureus. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de una bacteria Gram-negativa, por ejemplo, E. coli. En otro aspecto específico, la secuencia de ácido nucleico de glucosil-transferasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento deriva de un eucariota.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las epimerasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En ciertas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico de epimerasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico de epimerasa descrita en la Publicación de Solicitud Internacional de Patente N.° WO 2011/062615. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de epimerasa insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es la secuencia de ácido nucleico de epimerasa representada por el gen Z3206 de E. coli cepa O157. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/062615 y Rush y col., 2009, The Journal of Biological Chemistry 285:1671-1680.
Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden los complejos génicos rfb que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, el complejo génico rfb insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento es un complejo génico rfb de E. coli, por ejemplo, un complejo génico rfb de E. coli de cualquier serogrupo O/antígeno O conocido en la materia, por ejemplo, O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91, O92, O93, O95, O96, O97, O98, O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106, O107, O108, O109, O110, O111, O112, O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124, O125, O126, O127, O128, O129, O130, O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141, O142, O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158, O159, O160, O161, O162, O163, O164, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175, O176, O177, O178, O179, O180, O181, O182, O183, O184, O185, O186 u O187 y los subserotipos de los mismos. En otra realización específica, el complejo génico rfb insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento es un complejo génico rfb de una cepa de Pseudomonas (por ejemplo, una cepa de P. aeruginosa), una cepa de Salmonela (por ejemplo, una cepa de S. enterica), una cepa de Yersinia, una cepa de Klebsiella pneumoniae, una cepa de Francisella (por ejemplo, F. tularensis), una cepa de Acinetobacter baumannii, una cepa de Burkholderia o una cepa de Shigella.
Las secuencias de ácidos nucleicos que comprenden complejos génicos de polisacárido capsular que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. En una realización específica, el complejo génico de polisacárido capsular insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento es un complejo génico de polisacárido capsular de una cepa de E. coli, una cepa de Streptococcus (por ejemplo, S. pneumoniae, S. pyrogenes, S. agalacticae), una cepa de Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus) o una cepa de Burkholderia (por ejemplo, B mallei, B. pseudomallei, B. thailandensis).
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas vehículo que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento se conocen en la materia. Las proteínas vehículo producidas por las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al menos una secuencia consenso de N-glucosilación, por ejemplo, cualquiera de las secuencias consenso (i) Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro. En consecuencia, las secuencias de ADN que codifican las proteínas vehículo insertadas en las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden al menos una secuencia de ácido nucleico dentro de la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo que codifica una secuencia consenso de N-glucosilación. La secuencia de ADN que codifica una proteína vehículo insertada en las células hospedadoras descritas en el presente documento puede codificar cualquier proteína vehículo conocida en la materia, incluyendo las proteínas vehículo descritas en la Sección 5.2.1.2, más adelante. En una realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica la exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), incluyendo EPA que se ha modificado genéticamente para comprender al menos una secuencia consenso de N-glucosilación. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica la toxina colérica B. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica AcrA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica HlA. En otra realización específica, la secuencia de ácido nucleico de la proteína vehículo insertada en el genoma de una célula hospedadora descrita en el presente documento es una secuencia de ácido nucleico que codifica ClfA.
En ciertas realizaciones, el número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo, es de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización específica, el número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo es de 1 o 2. En otra realización específica, el número de copias de genes dentro del ADN insertado en una célula hospedadora descrita en el presente documento por ejemplo, el ADN de inserto heterólogo es de 1.
5.1.5 Procedimientos analíticos
En ciertos aspectos, para la aplicación funcional de los procedimientos descritos en el presente documento, se usa una combinación de diferentes sistemas de selección para el mantenimiento del plásmido (plásmido auxiliar, plásmido donador) y para la selección del inserto de ADN. Estos sistemas de selección deben ser compatibles entre sí, es decir, podrían ser como el sistema existente (specR, ampR y clmR o kanR,) o cualquier combinación alternativa de casetes de antibióticos útiles y/o sistemas de selección de plásmidos alternativos.
Los genotipos de los clones de inserción candidatos pueden verificarse mediante cualquier procedimiento usado para el análisis del ADN. La detección debe basarse en el análisis de la presencia del inserto de ADN en el contexto de la localización de la inserción cromosómica. Esto significa que los insertos de ADN deben encontrarse cerca del sitio diana, es decir, las secuencias fuera de la región del sitio diana. Puede hacerse una PCR para mostrar la ausencia de un gen que se haya separado mediante recombinación, por ejemplo, cuando un complejo génico de antígeno O se intercambia con uno diferente. O puede usarse para mostrar la presencia del inserto de ADN. O puede usarse para amplificar un tramo de ADN usando oligonucleótidos que flanqueen las HR, mostrando que se ha presentado la unión de un ADN cromosómico y un inserto de ADN. La secuenciación del ADN puede mostrar el mismo resultado, es decir, la secuencia del inserto de ADN debe conectarse de forma continua con las secuencias de ADN cromosómico no afectadas por la recombinación homóloga. O podría usarse transferencia Southern para identificar los fragmentos de ADN cromosómico que contengan el inserto de ADN y las secuencias cromosómicas no son afectadas en seguida del sitio de inserción (HR). O puede usarse la hibridación de colonias con sondas de PCR específicas para un trozo de inserto de ADN.
Otra manera de mostrar la presencia del inserto de ADN es mediante la evaluación de la actividad de los genes insertados. El análisis fenotípico de los clones candidatos permite verificar la actividad del inserto de ADN, pero no para la localización de la inserción correcta. En los ejemplos mostrados más adelante, se insertó un complejo génico de biosíntesis de polisacárido recombinante y, por consiguiente, un simple experimento que muestre la presencia del polisacárido después de la inserción en la célula recombinada es suficiente para confirmar la recombinación exitosa. Esto puede realizarse mediante inmunotransferencias usando antisueros específicos del polisacárido (transferencia Western, transferencia de colonias, transferencia de puntos, etc.) posiblemente pero no necesariamente en combinación con la separación de los extractos celulares mediante SDS-PAGE o cromatografía seguida de transferencia Western o ELISA; también, las técnicas de alta resolución como EM, RMN, HPLC y los procedimientos de identificación química o física para el producto, son útiles para confirmar la actividad del inserto de ADN.
5.1.6 Procedimientos de inserción adicionales
Además de los procedimientos de inserción novedosos descritos anteriormente (por ejemplo, en la Sección 5.1), el ADN puede insertarse en el genoma de una célula hospedadora usando otros enfoques. En ciertas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora usando cualquier procedimiento de inserción específica del sitio conocido en la materia. En ciertas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora usando cualquier procedimiento de integración aleatoria conocido en la materia. Estos procedimientos se describen con mayor detalle más adelante.
En ciertas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando un procedimiento que comprende la inserción mediada por transposón. Esta inserción aleatoria permite la inserción del ADN de interés en múltiples localizaciones del genoma de la célula hospedadora y, por consiguiente, permite la identificación de los sitios de inserción óptimos en las células hospedadoras en las que se ha insertado el ADN, por ejemplo, las células hospedadoras portadoras del ADN insertado, pueden compararse unas con otras con respecto a la eficiencia de la producción del ADN insertado y pueden seleccionarse las células hospedadoras con la más alta eficiencia para su uso futuro. Los procedimientos de inserción mediada por el transposón de las secuencias de ácidos nucleicos en los genomas de las células hospedadoras se conocen en la materia. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, el sistema de suministro pUTminiTn5 (Biomedical; Sevilla, España) se usa para insertar establemente los genes en los genomas de las células hospedadoras (tales como las células hospedadoras bacterianas). Las cepas en las que se ha insertado el ADN entonces pueden identificarse y aislar. Véase también Herrero y col., 1990, J. Bacteriology 172(11):6557-6567 y DeLorenzo y col., 1990, J. Bacteriology 172(11):6568-6572. Además, en ciertas realizaciones, la inserción del ADN mediada por el transposón en un genoma de una célula hospedadora se lleva a cabo usando un procedimiento de inserción del ADN basado en Tn-7. Véase McKenzie y col., 2006, BMC Microbiology 6:39 y Sibley y col., 2012, Nucleic Acids Res. 40: e19.
En ciertas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando el kit StabyCloningMR o el kit StabyCodon T7 (Delphi Genetics, Charleroi, Bélgica), los cuales permiten la clonación del ADN específica del sitio.
En ciertas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando el procedimiento de “clontegración” para la clonación e integración cromosómica del ADN. Véase St. Pierre y col., 2013, ACS Synthetic Biology 2:537-541.
En ciertas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) empleando un procedimiento que implica plásmidos de replicación condicional, de integración y modulares (CRIM), como se describe descrito por Haldimann y Wanner, 2001, J. Bacteriology 183:6384-6393.
En ciertas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando el diseño mediante recombinación (recombineering), un procedimiento descrito, por ejemplo, por Sharan y col., 2009, Nat. Protoc. 4:206-223; Yu y col., 2000, PNAS EUA 97:5978-5983; Kuhlman y col., 2010, Nucleic Acids Res. 38:e92; y Zhang y col., 1998, Nat. Genet. 20:123-128.
Además en el presente documento se proporcionan construcciones de ADN donadoras aisladas usadas en los procedimientos de inserción adicionales descritos en el presente documento. Las construcciones de ADN se diseñan de tal manera que pueden usarse en el procedimiento de integración aplicado y comprenden ácidos nucleicos que codifican/comprenden una o más proteínas/operones/complejos génicos para insertarse en un genoma de una célula hospedadora de acuerdo con el procedimiento que se lleve a cabo. En ciertas realizaciones, las construcciones de ADN donadoras aisladas comprenden ácidos nucleicos que codifican/comprenden una o más proteínas u operones implicados en la glucosilación de las proteínas, por ejemplo, en la N-glucosilación de las proteínas. En una realización específica, las construcciones de ADN donadoras aisladas comprenden uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
5.2 Aplicaciones
5.2.1 Glucosilación de proteínas
En ciertas realizaciones, las células hospedadoras modificadas proporcionadas en el presente documento pueden usarse para la glucosilación de las proteínas. La glucosilación de las proteínas puede diseñarse para producir vacunas conjugadas, es decir, vacunas que contienen antígenos de polisacárido y proteína del patógeno contra el que se diseñe la vacuna.
5.2.1.1 Antígenos
Puede usarse el ADN que codifique los genes asociados con los siguientes antígenos de polisacárido como el ADN de inserto de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento:
Antígenos O de E. coli (O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19, O20, O21, O22, O23, O24, O25, O26, O27, O28, O29, O30, O32, O33, O34, O35, O36, O37, O38, O39, O40, O41, O42, O43, O44, O45, O46, O48, O49, O50, O51, O52, O53, O54, O55, O56, O57, O58, O59, O60, O61, O62, O63, O64, O65, O66, O68, O69, O70, O71, O73, O74, O75, O76, O77, O78, O79, O80, O81, O82, O83, O84, O85, O86, O87, O88, O89, O90, O91 , O92, O93, O95, O96, O97, O98 , O99, O100, O101, O102, O103, O104, O105, O106 O107 O108, O109, O110, O111, O112 O113, O114, O115, O116, O117, O118, O119, O120, O121, O123, O124 O125 O126, O127, O128, O129, O130 O131, O132, O133, O134, O135, O136, O137, O138, O139, O140, O141 O142 O143, O144,O145, O146, O147, O148, O149, O150, O151, O152, O153, O154, O155, O156, O157, O158 O159 O160, O161, O162, O163, O165, O166, O167, O168, O169, O170, O171, O172, O173, O174, O175 O176 O177, O178, O179, O180, O181, O182, O185, Salmonella sp (S. enterica subsp Entérica, S. entérica subsp. Salamae, S. entérica subsp. arizonae, S. entérica subsp. Diarizonae, S. entérica subsp. Houtenae, S. bongori y S. enterica subsp. Indica y los tipos-O 1-67, como se detallan en [37], Pseudomonas sp (P. aeruginosa o los serotipos 1-20 [38]), Klebsiella sp. (en particular K. pneumonia serotipos O1, O2 (y los subserotipos), O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, [39]), antígenos O de Acinetobacter (en particular antígenos O de A. baumannii identificados en [40]), antígenos O de Clamidia trachomatis (serotipos A, B, C, D, E, F, G, H, I J, K, L1, L2, L3), antígenos O de Vibrio cholera O1 a 155, Listeria sp., en particular L. monocytogenes tipos 1, 2, 3, 4 y los subserotipos de los mismos, antígenos O de Legionella neumophila serotipos 1 a 15, antígenos O de Bordetella parapertussis, antígenos O de Burkholderia mallei y pseudomallei, Francisella tularensis, Campylobacter sp. (C. jejuni); los polisacáridos capsulares de Clostridium difficile (los serotipos A, G, H, K, S1, S4, D, Cd-5, K Toma y col. 1988 y C. perfringens serotipos A, B, C, D y E), Staphylococcus aureus tipos 5 y 8, Streptococcus pyrogenes (polisacáridos de serotipos capsulares de estreptococos del grupo B), E. coli, Streptococcus agalacticae (polisacáridos capsulares de estreptococos del grupo A), Neisseria meningitidis ('los serotipos A, B, C, W y, X), Candida albicans, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis polisacáridos capsulares tipos I-V; y otras estructuras de polisacáridos superficiales, por ejemplo, los glucolípidos de Borrelia burgdorferi ([41.]), pilina-O-glucano de Neisseria meningitidis [42, 43] y lipooligosacárido (LOS), LOS de Haemophilus influenza, lipofosfoglucano de Leishmania major [44, 45]), antígenos de carbohidratos asociados con tumores (glucosil-fosfatidil-inositol de malaria, arabinomanano de Mycobacterium tuberculosis [46].
5.2.1.2 Proteínas vehículo
En el presente documento pueden usarse los ácidos nucleicos que codifiquen/que comprendan cualquier proteína vehículo adecuada para su uso en la producción de las vacunas conjugadas. Las proteínas vehículo de ejemplo incluyen, sin limitación, Exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), CRM197, el toxoide diftérico, el toxoide tetánico, hemolisina A detoxificada de S. aureus, factor de aglomeración A, factor de aglomeración B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina lábil al calor de E. coli, variantes detoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes detoxificadas de la toxina colérica, proteína Sat de E. coli, el dominio pasajero de proteína Sat de E. coli, AcrA de C. je juni y glucoproteínas naturales de C. jejuni.
En ciertas realizaciones, las proteínas vehículo usadas en la generación de las vacunas conjugadas descritas en el presente documento se modifican, por ejemplo, se modifican de tal manera que la proteína sea menos tóxica y o más susceptible a la glucosilación, etc. En una realización específica, las proteínas vehículo usadas en la generación de las vacunas conjugadas descritas en el presente documento se modifican de tal manera que el número de sitios de glucosilación en las proteínas vehículo se maximiza de una manera que permite tener concentraciones más bajas de la proteína para administrarse, por ejemplo, en una composición inmunogénica, en su forma bioconjugada. En consecuencia, en ciertas realizaciones, las proteínas vehículo descritas en el presente documento se modifican para incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de glucosilación que los que se asociarían normalmente a la proteína vehículo (por ejemplo, en relación con el número de sitios de glucosilación asociados con la proteína vehículo en su estado nativo/natural, por ejemplo, “de tipo silvestre”). En las realizaciones específicas, la introducción de sitios de glucosilación se lleva a cabo mediante la inserción de secuencias consenso de glucosilación (por ejemplo, (i) la secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) la secuencia consenso D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro) en cualquier parte de la estructura primaria de la proteína. La introducción de tales sitios de glucosilación puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante la adición de nuevos aminoácidos a la estructura primaria de la proteína (es decir, se añaden los sitios de glucosilación, totalmente o en parte), o mediante la mutación de los aminoácidos existentes en la proteína con el objeto de generar los sitios de glucosilación (es decir, no se añaden aminoácidos a la proteína, pero los aminoácidos seleccionados de la proteína se mutan de tal manera que se formen sitios de glucosilación). Aquellos expertos en la materia reconocerán que la secuencia de aminoácidos de una proteína puede modificarse fácilmente usando los planteamientos conocidos en la materia, por ejemplo, los planteamientos recombinantes que incluyen modificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína. En las realizaciones específicas, se introducen secuencias consenso de glucosilación en regiones específicas de la proteína vehículo, por ejemplo, las estructuras superficiales de la proteína, en los extremos N o C de la proteína y/o en los bucles que están estabilizados por puentes disulfuro en la base de la proteína. En ciertas realizaciones, la secuencia consenso de glucosilación de 5 aminoácidos clásica puede extenderse mediante residuos de lisina para una glucosilación más eficiente y, por consiguiente, la secuencia consenso insertada puede codificar 5, 6 o 7 aminoácidos que deban ser insertados o que reemplacen a los aminoácidos de proteína aceptores.
En ciertas realizaciones, las proteínas vehículo usadas en la generación de las vacunas conjugadas descritas en el presente documento comprenden una “etiqueta", es decir, una secuencia de aminoácidos que permita el aislamiento y/o la identificación de la proteína vehículo. Por ejemplo, la adición de una etiqueta a una proteína vehículo descrita en el presente documento puede ser útil en la purificación de esa proteína y, por lo tanto, en la purificación de las vacunas conjugadas que comprenden la proteína vehículo etiquetada. Las etiquetas de ejemplo que pueden usarse en el presente documento incluyen, sin limitación, etiquetas de histidina (HIS) (por ejemplo, la etiqueta hexa histidina o etiqueta 6XHis), la etiqueta FLAG y las etiquetas HA. En ciertas realizaciones, las etiquetas usadas en el presente documento son retirables, por ejemplo, la retirada mediante agentes químicos o por medios enzimáticos, una vez que ya no se necesiten, por ejemplo, después de que se haya purificado la proteína.
5.2.1.3 Modificaciones de células hospedadoras
En ciertas realizaciones, las células hospedadoras usadas para producir las vacunas conjugadas descritas en el presente documento se diseñan para comprender ácidos nucleicos heterólogos, por ejemplo, ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más proteínas vehículo y/o ácidos nucleicos heterólogos que codifican una o más proteínas, por ejemplo, genes que codifican una o más proteínas. En una realización específica, los ácidos nucleicos heterólogos que codifican las proteínas implicadas en las rutas de glucosilación (por ejemplo, las rutas de glucosilación procariotas y/o eucariotas) pueden introducirse en las células hospedadoras descritas en el presente documento. Estos ácidos nucleicos pueden codificar proteínas, incluyendo, sin limitación, oligosacaril-transferasas y/o glucosiltransferasas, así como epimerasas y complejos génicos de antígeno. Los ácidos nucleicos heterólogos (por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas vehículo y/o los ácidos nucleicos que codifican otras proteínas, por ejemplo, las proteínas implicadas en la glucosilación) pueden introducirse en las células hospedadoras descritas en el presente documento usando cualquier procedimiento conocido por aquellos expertos en la materia, por ejemplo, electroporación, transformación química mediante choque térmico, transformación natural, transducción de fagos y conjugación. En realizaciones específicas, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras descritas en el presente documento usando un plásmido, por ejemplo, los ácidos nucleicos heterólogos son expresados en las células hospedadoras por un plásmido (por ejemplo, un vector de expresión). En otra realización específica, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras descritas en el presente documento empleando los procedimientos de inserción proporcionados en el presente documento.
En ciertas realizaciones, pueden introducirse modificaciones adicionales (por ejemplo, usando técnicas recombinantes) en las células hospedadoras descritas en el presente documento. Por ejemplo, los ácidos nucleicos de las células hospedadoras (por ejemplo, los genes) que codifican las proteínas que forman parte de una ruta de glucosilación posiblemente competidora o de interferencia (por ejemplo, que compiten o interfieren con uno o más genes heterólogos implicados en la glucosilación que se introducen recombinantemente en la célula hospedadora) pueden eliminarse o modificar en el fondo (genoma) de la célula hospedadora de una manera que los haga inactivos/disfuncionales (es decir, los ácidos nucleicos de la célula hospedadora que se eliminan/modifican no codifican una proteína funcional o no codifican ninguna proteína cualquiera que sea). En ciertas realizaciones, cuando los ácidos nucleicos se eliminan del genoma de las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento, se reemplazan por una secuencia deseable, por ejemplo, por una secuencia que sea útil para la producción de glucoproteínas. Este reemplazo puede ser por medio de uno o más de los procedimientos de inserción descritos en el presente documento en el que el ADN de inserto heterólogo que se inserte en la célula hospedadora puede reemplazar a la función de los genes suprimidos de la célula hospedadora.
Los genes de ejemplo que pueden eliminarse en las células hospedadoras (y, en algunos casos, que pueden reemplazarse por otras secuencias de ácidos nucleicos deseadas) incluyen los genes de las células hospedadoras implicados en la biosíntesis de glucolípidos, tales como waaL (véase, por ejemplo, Feldman y col., 2005, PNAS EE.UU.
102:3016-3021), el complejo génico de biosíntesis de núcleo de lípido A, el complejo génico de galactosa, el complejo génico de arabinosa, el complejo génico de ácido colónico, el complejo génico de polisacárido capsular, los genes de biosíntesis de undecaprenol-p, los genes de reciclo de und-P, las enzimas metabólicas implicadas en la biosíntesis de azúcar activada por el nucleótido, el complejo génico de antígeno común enterobacteriano y los complejo génicos de modificación de antígeno O de profago tales como el complejo génico grabs. En una realización específica, las células hospedadoras descritas en el presente documento se modifican de tal manera que no producen antígenos O diferentes de un antígeno O que se produzca como un resultado de la inserción del ADN de inserto heterólogo en el genoma de la célula hospedadora mediante un procedimiento descrito en el presente documento. En otra realización específica, las células hospedadoras descritas en el presente documento se modifican de tal manera que no produzcan polisacáridos capsulares diferentes de un polisacárido capsular que se produzca como un resultado de la inserción del ADN de inserto heterólogo en el genoma del hospedador mediante un procedimiento descrito en el presente documento.
En ciertas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden una deleción génica, en las que se ha insertado una secuencia de ADN de interés en el genoma de la célula hospedadora en el sitio de la deleción génica. En una realización específica, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento es E. coli portadora de una deleción del gen waaL. En una realización específica, una secuencia de ADN que codifique una oligosacaril-transferasa se inserta en el sitio de la deleción del gen waaL en la célula hospedadora de E. coli. En otra realización específica, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento es E. coli portadora de una deleción del gen wecG. En una realización específica, una secuencia de ADN que codifique una proteína vehículo se inserta en el sitio de la deleción del gen wecG en la célula hospedadora de E. coli. En otra realización específica, una célula hospedadora proporcionada en el presente documento es E. coli portadora de una deleción del gen waaL y una deleción del gen wecG, en el que se inserta una oligosacaril-transferasa en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen waaL eliminado y en el que se inserta una proteína vehículo (por ejemplo, EPA que comprende una secuencia consenso de N-glucosilación) en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen wecG eliminado.
5.2.1.4 Glucoconjugados
Los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para producir células hospedadoras que produzcan glucoconjugados, los cuales comprenden una proteína vehículo glucosilada (véase, por ejemplo, la Sección 5.2.1.2). En las realizaciones específicas, en el presente documento se proporcionan glucoconjugados que comprenden una proteína vehículo (véase, por ejemplo, la Sección 5.2.1.2) glucosilada con un antígeno (por ejemplo, un polisacárido) descrito en el presente documento por ejemplo, un antígeno descrito en la Sección 5.2.1.1. En las realizaciones específicas, la proteína vehículo es EPA.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende EPA y uno o más polisacáridos diferentes, por ejemplo, uno o más polisacáridos descritos en la Sección 5.21.1.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende una proteína vehículo conjugada con uno o más de O1, O2, O4, O6, O7, O8, O11, O15, O16, O17, O18, O20, O22, O25, O73, O75 y/u O83 de E. coli. En una realización específica, la proteína vehículo es EPA.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende una proteína vehículo conjugada con uno o más polisacáridos diferentes de P. aeruginosa. En una realización específica, la proteína vehículo es EPA.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona un glucoconjugado que comprende una proteína vehículo conjugada con uno o más polisacáridos diferentes de K. pneumonia. En una realización específica, la proteína vehículo es EPA.
5.2.1.5 Beneficios
Los procedimientos para producir los glucoconjugados descritos en el presente documento son de una importancia y relevancia comercial particulares, debido a que permiten la fermentación a gran escala con un riesgo más bajo debido a la mayor estabilidad del ADN cromosómicamente insertado y, por consiguiente, la expresión del ADN de interés durante la fermentación. Ciertos procedimientos conocidos para mantener la expresión del ADN de inserto se basan en los episomas portadores del ADN de inserto. Estos episomas necesitan mantenerse mediante la selección de antibióticos. Algunos de los procedimientos descritos en el presente documento por consiguiente, son convenientes sobre la expresión del ADN insertado desde el plásmido debido a que, entre otras cosas, no se requiere la selección del antibiótico durante la fermentación una vez que se inserta el ADN heterólogo en el genoma de la célula hospedadora. Es decir, cuando el ADN de inserto se inserta en el cromosoma, no necesita seleccionarse, debido a que se propaga junto con la replicación del genoma del hospedador. Además, es un inconveniente conocido en los sistemas originados en el plásmido que, con cada generación (es decir, el ciclo de replicación de la célula hospedadora), aumenta el riesgo de perder el plásmido. Esta pérdida del plásmido se debe a la distribución algunas veces inapropiada de los plásmidos hacia las células hijas en la etapa de la separación celular durante la división celular. A gran escala, los cultivos celulares bacterianos se duplican con mayor frecuencia que en las escalas de fermentación más pequeñas para alcanzar altas densidades celulares. Por consiguiente, la más alta estabilidad celular y la expresión del ADN de inserto conducen a más altos rendimientos del producto, proporcionando una ventaja distintiva. La estabilidad celular es adicionalmente un criterio de aceptación del procedimiento para ser aprobado por las autoridades reguladoras, mientras que la selección del antibiótico no se desea en general durante la fermentación por diversas razones, por ejemplo, los antibióticos presentes como impurezas en los productos medicinales finales y llevan el riesgo de causar reacciones alérgicas y los antibióticos pueden promover la resistencia a antibióticos (por ejemplo, mediante transferencia genética o la selección de patógenos resistentes). Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento por consiguiente, son convenientes porque comprenden un menor número de plásmidos requeridos para la producción de los bioconjugados. Por ejemplo, los bioconjugados pueden producirse a partir de células hospedadoras (por ejemplo, E. coli) que comprenden 2, 1, o ninguno plásmidos, es decir, alguna o toda la maquinaria heteróloga requerida para la producción de bioconjugados se inserta en el genoma de las células hospedadoras, reduciendo, por consiguiente, el número de plásmidos requeridos.
Otra ventaja de los procedimientos descritos en el presente documento es que, en ciertas realizaciones, pueden insertarse grandes trozos de ADN en el genoma de las células hospedadoras todas a la vez (“inserción toda a la vez"). Ciertos procedimientos existentes para la introducción de ADN en el genoma de la célula hospedadora emplean la inserción repetida de fragmentos pequeños de ADN mediante recombinación homóloga [47]. Por consiguiente, sin estar limitados por la teoría, los procedimientos de inserción toda a la vez descritos en el presente documento son convenientes debido a que permiten eliminar las inserciones múltiples.
5.2.1.6 Procedimientos analíticos
Pueden usarse diferentes procedimientos para analizar las composiciones estructurales y las longitudes de la cadena de azúcar de los glucoconjugados descritos en el presente documento.
En una realización, puede usarse hidrazinólisis para analizar los glucanos. Primero, los polisacáridos se liberan de sus vehículos de proteína mediante la incubación con hidrazina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ludger Libérate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, RU). El nucleófilo hidrazina ataca al enlace glucosídico entre el polisacárido y la proteína vehículo y permite la liberación de los glucanos unidos. Los grupos N-acetilo se pierden durante este tratamiento y tienen que reconstituirse mediante re-N-acetilación. Los glucanos libres se purifican sobre columnas de carbón y posteriormente se marcan en el extremo reductor con el fluoróforo 2-amino-benzamida [48]. Los polisacáridos marcados se separan sobre una columna GlicoSep-N (GL Sciences) de acuerdo con el protocolo de HPLC de Royle y col., [49]. El cromatograma de fluorescencia resultante indica la longitud del polisacárido y el número de unidades de repetición. La información estructural puede recopilarse mediante la recolección de los picos individuales y posteriormente se lleva a cabo el análisis de EM/EM. De esta manera, la composición del monosacárido y la secuencia de la unidad de repetición podrían confirmarse y adicionalmente podrían identificarse en la homogeneidad de la composición del polisacárido. Los cromatogramas de HPLC obtenidos después de la hidrazinólisis y del marcado con 2 AB se muestran en uno de los ejemplos (Figura 21). Los picos específicos de bajo peso molecular se pueden analizar mediante MALDI-EM/EM y el resultado se usa para confirmar la secuencia de glucano. Cada pico corresponde a un polímero que consiste en cierto número de unidades de repetición y fragmentos de las mismas. El cromatograma, por consiguiente, permite medir la distribución de longitud del polímero. El tiempo de elución es una indicación para la longitud del polímero y la intensidad de fluorescencia se correlaciona con la abundancia molar para el polímero respectivo.
En otra realización, puede usarse SDS-PAGE o la electroforesis en gel capilar para evaluar los glucanos y los glucoconjugados. La longitud del polímero para los glucanos del antígeno O que se sintetizan aquí se define por el número de unidades de repetición que se ensamblan linealmente. Esto significa que el patrón de escalera típico es una consecuencia de diferentes números de unidades de repetición que componen el glucano. Por consiguiente, dos bandas una cerca de la otra en el SDS PAGE o en otras técnicas que separen por diferencia de tamaño por solamente una unidad de repetición individual. Estas diferencias separadas son explotadas cuando se analizan las glucoproteínas para determinar el tamaño del glucano: La proteína vehículo no glucosilada y el glucoconjugado con diferentes longitudes de la cadena del polímero se separan de acuerdo con sus movilidades electroforéticas. Se miden el primer número de unidad de repetición detectable (n-i) y el número de la unidad de repetición promedio (npromed¡o) presentes en un glucoconjugado. Estos parámetros pueden usarse para demostrar la consistencia de lote a lote o la estabilidad del polisacárido.
En otra realización, podría aplicarse la EM de alta masa y la HPLC de exclusión molecular para medir el tamaño de los glucoconjugados completos.
En otra realización, puede usarse un ensayo de antrona-ácido sulfúrico para medir los rendimientos de polisacáridos [50].
(a) Cambio en el uso del sitio de glucosilación
Con el fin de mostrar que se cambia el uso del sitio en una proteína específica en un sistema de tres plásmidos en oposición a un sistema insertado, debe cuantificarse el uso del sitio de glucosilación. Los procedimientos para hacerlo se listan a continuación.
CL-EM/EM de glucopéptido: Los glucoconjugados se digieren con proteasa o proteasas y los péptidos se separan mediante un procedimiento cromatográfico adecuado (C18, HPLC de interacción hidrófila HILIC, columnas GlicoSepN, SE HPLC, AE HPLC) y los diferentes péptidos se identifican usando EM/EM. Este procedimiento puede usarse con o sin el acortamiento de la cadena de azúcar anterior, mediante los procedimientos químicos (degradación de Smith) o enzimáticos. La cuantificación de los picos de glucopéptido usando detección UV de 215 a 280 nm permite hacer una determinación relativa del uso del sitio de glucosilación.
HPLC de exclusión molecular: El uso más alto del sitio de glucosilación está reflejado por un tiempo de elución más temprano a partir de una columna de SE HPLC. Véase también (a).
(b) Homogeneidad
La homogeneidad del glucoconjugado (es decir, la homogeneidad de los restos de azúcar unidos) puede evaluarse usando los procedimientos que miden la longitud del glucano y el radio hidrodinámico (véase anteriormente y la Sección 5.3.5).
5.2.2 Otras aplicaciones clínicas/prácticas potenciales
Los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para la construcción de cualquier célula hospedadora para la cual sea deseable introducir fragmentos grandes de ADN en el genoma de la célula hospedadora, en los que los fragmentos de ADN se mantienen durante la producción de la línea de la célula hospedadora portadora del ADN de inserto (por ejemplo, la producción a gran escala de la línea de la célula hospedadora para proporcionar un producto deseado, por ejemplo, una proteína codificada por el ADN de inserto). Por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento pueden usarse para producir células hospedadoras que comprendan ADN insertado que codifique, sin limitación, antibióticos, alcaloides, carotenoides, nicotinamida y otros metabolitos secundarios y co-factores que sean sintetizados por múltiples reacciones enzimáticas dentro de la misma célula. En consecuencia, en el presente documento se proporcionan células hospedadoras que comprenden ADN insertado que codifica tales componentes.
5.2.3 Rendimiento más alto de las proteínas
Las cepas integradas pueden dar un rendimiento más alto de glucoconjugados debido a la carga de selección de antibiótico reducida, comparándose con el sistema de tres plásmidos. Además, se presenta menos degradación proteolítica debido a la carga metabólica reducida en las células.
5.2.4 Homogeneidad más alta de las proteínas
Las cepas integradas otorgan a los glucoconjugados distribuciones de longitudes de polisacáridos más cortas y menos extendidas. Por consiguiente, los glucoconjugados son más fáciles de caracterizar y están mejor definidos. Además, la inserción puede reducir el grado de estrés periplásmico en las células, el cual puede conducir a menos proteólisis del producto durante el procedimiento de fermentación debido a la carga de selección de antibiótico reducida, comparándose con el sistema de tres plásmidos.
5.2.5 Estabilidad más alta de las cepas de producción
Los sistemas de glucosilación de proteínas requieren tres elementos recombinantes en el hospedador de producción: un ADN de expresión de la proteína vehículo, un ADN de expresión de oligosacaril-transferasa y un ADN de expresión de polisacárido. Los sistemas de producción bacteriana de la técnica anterior contienen estos tres elementos en los plásmidos. Por consiguiente, hay un riesgo de inestabilidad durante su elaboración debido a la pérdida del plásmido, en particular debido a que los antibióticos usados para el mantenimiento de los plásmidos no deben estar presentes durante la fermentación del material de GIMP. Debido a que las cepas insertadas contienen todavía un elemento móvil menos, son más estables a través de muchas generaciones. Esto significa que son más factibles las fermentaciones a una escala más alta y los tiempos de incubación más largos (números más altos de generaciones). Además, la ausencia de un antibiótico para la selección hace un producto más seguro, debido a la ausencia de antibióticos traza, los cuales pueden provocar reacciones alérgicas en los sujetos sensibles [4].
5.2.6 Reproducibilidad más alta del procedimiento de producción
Las cepas insertadas son más genéticamente estables debido a la inserción cromosómica fija, conduciendo por consiguiente a una reproducibilidad más alta de los productos de proteína deseados durante el procedimiento de producción, por ejemplo, durante el cultivo de la célula hospedadora que comprende el ADN heterólogo insertado.
5.2.7 Procedimientos analíticos para probar el beneficio
Rendimiento. El rendimiento se mide como la cantidad de carbohidratos derivada de un lecho de un cultivo de producción bacteriano que se haga crecer en un biorreactor en condiciones controladas y optimizadas. Después de la purificación del glucoconjugado, los rendimientos de carbohidratos pueden medirse directamente mediante el ensayo de antrona (véase, por ejemplo, la Sección 5.2.1.7) o bien ELISA usando antisueros específicos de carbohidratos. Son posibles las mediciones indirectas usando la cantidad de proteína (medida mediante los ensayos bien conocidos de BCA, Lowry o Bardford) y la longitud y la estructura del glucano para calcular una cantidad teórica de carbohidratos por gramo de proteína. Además, el rendimiento también puede medirse mediante el secado de la preparación de glucoproteína de un tampón volátil y usando una balanza para medir el peso.
Homogeneidad. Homogeneidad significa la variabilidad de la longitud del glucano y posiblemente, el número de sitios de glucosilación. Los procedimientos listados anteriormente pueden usarse para este fin. La SE-HPLC permite la medición del radio hidrodinámico. Los números más altos de sitios de glucosilación en el vehículo conducen una variación más alta en el radio hidrodinámico comparándose con un vehículo con menos sitios de glucosilación. Sin embargo, cuando se analizan las cadenas individuales del glucano, pueden ser más homogéneas debido a la longitud más controlada. La longitud del glucano se mide mediante hidrazinólisis, SDS PAGE y CGE (véase la Sección 5.1.2.7.). Además, la homogeneidad también puede significar que ciertos patrones de uso del sitio de glucosilación cambian hasta un intervalo más amplio/más estrecho. Estos factores pueden medirse mediante CL-EM/EM del glucopéptido (véase la Sección 5.1.2.7).
Estabilidad y reproducibilidad de la cepa. La estabilidad de la cepa durante la fermentación bacteriana en ausencia de una presión selectiva se mide mediante procedimientos directos e indirectos que confirman la presencia o ausencia del ADN recombinante en las células del cultivo de producción. La influencia del volumen del cultivo puede simularse mediante tiempos de cultivo alargados, los cuales significan un aumento en los tiempos de generación. Cuantas más generaciones haya en la fermentación, más probable será que se pierda un elemento recombinante. La pérdida de un elemento recombinante se considera inestabilidad. Los procedimientos indirectos se apoyan en la asociación de los casetes de selección con el ADN recombinante, por ejemplo, el casete de resistencia a antibióticos en un plásmido. Las células del cultivo de producción se colocan en placa en un medio selectivo, por ejemplo, las placas de LB suplementado con antibióticos o con otros productos químicos relacionados con un sistema de selección y las colonias resistentes se consideran positivas para el ADN recombinante asociado al producto químico de selección respectivo. En el caso de un sistema de tres plásmidos, se cuentan las colonias resistentes a los tres antibióticos y la proporción de las células que contienen las tres resistencias se considera la población estable. De una manera alternativa, puede usarse una PCR cuantitativa para medir la cantidad de ADN recombinante de los tres elementos recombinantes en presencia y en ausencia de selección y en diferentes puntos del tiempo de fermentación. De esta manera, se mide y se compara la cantidad relativa y absoluta del ADN recombinante. La reproducibilidad del procedimiento de producción se mide mediante el análisis completo de los lotes de consistencia mediante los procedimientos mencionados en la presente solicitud.
5.3 Composiciones
5.3.1 Composiciones que comprenden los plásmidos
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden uno o más de los plásmidos descritos en el presente documento por ejemplo, uno o más plásmidos donadores o auxiliares.
En un aspecto específico, en el presente documento se proporciona una composición que comprende un plásmido donador, en la que este plásmido donador comprende (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserto heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contra-selección.
En otro aspecto específico, en el presente documento se proporciona una composición que comprende un plásmido auxiliar, en la que este plásmido auxiliar comprende (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora.
En otro aspecto específico, en el presente documento se proporciona una composición que comprende un plásmido donador y un plásmido auxiliar, en la que dicho plásmido donador comprende (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserto heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contra-selección; y en la que este plásmido auxiliar comprende (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora.
5.3.2 Composiciones que comprenden células hospedadoras
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden una o más de las células hospedadoras descritas en el presente documento. Tales composiciones pueden usarse en los procedimientos para generar las vacunas conjugadas descritas en el presente documento por ejemplo, las composiciones pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la producción de las proteínas. Posteriormente, los bioconjugados pueden aislarse de estas composiciones.
Las composiciones que comprenden las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento pueden comprender componentes adicionales adecuados para el mantenimiento y la supervivencia de las células hospedadoras descritas en el presente documento y adicionalmente pueden comprender componentes adicionales requeridos o beneficiosos para la producción de las proteínas mediante las células hospedadoras, por ejemplo, inductores para promotores inducibles, tales como arabinosa, IPTG.
En un aspecto específico, una composición proporcionada en el presente documento comprende una célula hospedadora, en la que la célula hospedadora comprende un plásmido donador y un plásmido auxiliar, (a) en la que el plásmido auxiliar comprende: (i) bajo el control de un primer promotor, un marco de lectura abierto que codifica la recombinasa Red lambda; y (ii) bajo el control de un segundo promotor, un marco de lectura abierto que codifica una endonucleasa de restricción que tiene una secuencia de reconocimiento que no está presente en el genoma de la célula hospedadora; y (b) en la que el plásmido donador comprende: (i) de 5' a 3': (1) la secuencia de reconocimiento de la endonucleasa de restricción; (2) una primera región de homología de al menos 0,5 kilobases (kb), (3) un ADN de inserto heterólogo de al menos 8 kb; y (4) una segunda región de homología de al menos 0,5 kb; y (ii) un marcador de contra-selección. En una realización específica, la secuencia de reconocimiento comprende al menos 18 pares de bases. En otra realización específica, la endonucleasa de restricción es SceI. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico, una composición proporcionada en el presente documento comprende una célula hospedadora, en la que la célula hospedadora comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacariltransferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En un aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una cuarta secuencia de ADN, en el que dicha cuarta secuencia de ADN comprende uno de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico, una composición proporcionada en el presente documento comprende una célula hospedadora, en el que dicha célula hospedadora comprende un genoma en el cual se ha insertado una secuencia de ADN, en el que la secuencia de ADN insertada comprende dos o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En un aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una segunda secuencia de ADN, en el que dicha segunda secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacaril-transferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En otro aspecto específico, el genoma de la célula hospedadora adicionalmente tiene insertada en el mismo una tercera secuencia de ADN, en el que dicha tercera secuencia de ADN insertada comprende uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacariltransferasa, ADN que codifica una glucosil-transferasa, ADN que codifica una proteína vehículo, ADN que comprende un complejo génico rfb, ADN que comprende un complejo génico de polisacárido capsular y/o ADN que codifica una epimerasa. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otro aspecto específico, una composición proporcionada en el presente documento comprende una célula hospedadora, en la que la célula hospedadora comprende una secuencia de ADN que se ha insertado en su genoma, en el que esta secuencia de ADN insertada comprende un gen que codifica una oligosacaril-transferasa. En una realización específica, la oligosacaril-transferasa es una oligosacaril-transferasa derivada de un organismo procariota. En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa es una oligosacaril-transferasa del género Campylobacter. En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa es una oligosacaril-transferasa de Campylobacter je juni (por ejemplo, el gen pglB de C. jejuni). En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa deriva de un organismo eucariota. En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa es la oligosacaril-transferasa descrita en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 20120156723. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli portadora de una deleción del gen waaL y dicha oligosacaril-transferasa se inserta en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen waaL eliminado.
En otro aspecto específico, una composición proporcionada en el presente documento comprende una célula hospedadora, en la que la célula hospedadora comprende una secuencia de ADN que se ha insertado en sus genoma, en el que esta secuencia de ADN insertada comprende un gen que codifica una proteína vehículo, en el que la proteína vehículo comprende al menos una secuencia consenso de N-glucosilación, por ejemplo, cualquiera de las secuencias consenso (i) Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro. La proteína vehículo puede ser cualquier proteína vehículo conocida en la materia, incluyendo las proteínas vehículo descritas en la Sección 5.2.1.2, más adelante. En un aspecto específico, la proteína vehículo es Exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), incluyendo EPA que se ha modificado genéticamente para comprender al menos una secuencia consenso de N-glucosilación. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli. En otro aspecto específico, la célula hospedadora es E. coli portadora de una deleción del gen wecG y la proteína vehículo (por ejemplo, EPA) se inserta en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen wecG suprimido.
En otro aspecto específico, una composición proporcionada en el presente documento comprende una célula hospedadora, en la que la célula hospedadora comprende una primera secuencia de ADN y una segunda secuencia de ADN que se han insertado en sus genoma, en el que la primera secuencia de ADN insertada comprende un gen que codifica una oligosacaril-transferasa y en el que la segunda secuencia de ADN insertada comprende un gen que codifica una proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo descrita en la Sección 5.2.1.2, más adelante), en el que dicha proteína vehículo comprende al menos una secuencia consenso de N-glucosilación, por ejemplo, cualquiera de las secuencias consenso (i) Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro; o (ii) D/E-X-N-Z-S/T, en la que X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro. En una realización específica, la oligosacaril-transferasa es una oligosacaril-transferasa derivada de un organismo procariota. En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa es una oligosacariltransferasa del género Campylobacter. En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa es una oligosacariltransferasa de Campylobacter je juni (por ejemplo, el gen pglB de C. jejuni). En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa deriva de un organismo eucariota. En otra realización específica, la oligosacaril-transferasa es la oligosacaril-transferasa descrita en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 20120156723. En otra realización específica, la proteína vehículo es Exotoxina A de P. aeruginosa (EPA), incluyendo EPA que se ha modificado genéticamente para comprender al menos una secuencia consenso de N-glucosilación. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli portadora de una deleción del gen waaL y una deleción del gen wecG, en el que dicha oligosacaril-transferasa se inserta en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen waaL suprimido y en el que dicha proteína vehículo (por ejemplo, EPA) se inserta en la célula hospedadora de E. coli en el sitio del gen wecG suprimido.
5.3.3 Composiciones inmunogénicas
5.3.3.1 Composiciones que comprenden las proteínas glucosiladas
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones inmunogénicas que comprenden uno o más glucoconjugados producidos por una célula hospedadora descrita en el presente documento. Estos glucoconjugados pueden comprender un glucano de antígeno O unido a una secuencia de glucosilación en consenso codificada dentro de una proteína, por ejemplo, dentro de una proteína vehículo. En una realización específica, la proteína vehículo puede ser Exotoxina A que comprenda uno o más sitios de glucosilación introducidos, o la proteína vehículo puede ser FimCH y que comprenda uno o más sitios de glucosilación introducidos. En otras realizaciones específicas, la proteína vehículo puede comprender un antígeno de proteína de E. coli que comprenda uno o más sitios de glucosilación introducidos. En una realización específica, los antígenos O son antígenos O de E. coli de aislados patogénicos de E. coli, por ejemplo, O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, O75 u O83.
En otro aspecto específico, una composición inmunogénica proporcionada en el presente documento comprende una proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo descrita en la Sección 5.2.1.2) conjugada con un antígeno descrito en el presente documento por ejemplo, un antígeno descrito en la Sección 5.2.1.1. En una realización específica, la proteína vehículo es EPA. En otra realización específica, el antígeno es un antígeno de E. coli, por ejemplo, un polisacárido de E. coli.
En otro aspecto específico, una composición inmunogénica proporcionada en el presente documento comprende una proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo descrita en la Sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por el antígeno O de E. coli del serotipo O1 (O1-EPA).
En otro aspecto específico, una composición inmunogénica proporcionada en el presente documento comprende una proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo descrita en la Sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por el antígeno O de E. coli del serotipo O2 (O2-EPA).
En otro aspecto específico, una composición inmunogénica proporcionada en el presente documento comprende una proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo descrita en la Sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por el antígeno O de E. coli del serotipo O6 (O6-EPA).
En otros aspectos específicos, una composición inmunogénica proporcionada en el presente documento comprende una proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo descrita en la Sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por un antígeno O de E. coli del serotipo O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, O75 u O83.
Las composiciones inmunogénicas proporcionadas en el presente documento pueden usarse para provocar una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se administre la composición. Por consiguiente, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento pueden usarse como vacunas y, en consecuencia, pueden formularse como composiciones farmacéuticas. En una realización específica, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan en la prevención de una infección de los sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) por E. coli. En una realización específica, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan como una vacuna contra una infección del tracto urinario provocada por infección de E. coli.
Por ejemplo, una composición inmunogénica descrita en el presente documento para su uso como una vacuna contra una infección del tracto urinario provocada por infección de E. coli, puede comprender una proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo descrita en la Sección 5.2.1.2, por ejemplo, EPA) glucosilada por un antígeno de E. coli (por ejemplo, un antígeno de E. coli descrito en la Sección 5.2.1.1). En una realización específica, el antígeno de E. coli es un antígeno O del serotipo O1, O2, O4, O7, O8, O9, O11, O15, O16, O17, O18; O20, O22, O25, O73, O75 u O83.
En otro aspecto específico, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan en la prevención de una infección de los sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) por Pseudomonas. En otra realización específica, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento se usan en la prevención de una infección de los sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) por Shigella.
Las composiciones que comprenden los bioconjugados descritos en el presente documento pueden comprender cualquier componente adicional adecuado para su uso en la administración farmacéutica. En las realizaciones específicas, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento son formulaciones monovalentes. En otras realizaciones, las composiciones inmunogénicas descritas en el presente documento son formulaciones multivalentes. Por ejemplo, una formulación multivalente comprende más de un bioconjugado descrito en el presente documento.
En ciertos aspectos, las composiciones descritas en el presente documento adicionalmente comprenden un conservante, por ejemplo, el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden del 0,001 % al 0,01 % de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden un conservante.
En ciertos aspectos, las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, las composiciones inmunogénicas) comprenden, o se administran en combinación con, un adyuvante. El adyuvante para su administración en combinación con una composición descrita en el presente documento puede administrarse antes, de una manera concomitante con, o después de, la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término “adyuvante” se refiere a un compuesto que, cuando se administra en conjunto con o como parte de una composición descrita en el presente documento aumenta, potencia y/o refuerza la respuesta inmunitaria a un bioconjugado, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmunitaria al bioconjugado. En algunos aspectos, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria al bioconjugado de polipéptido y no produce una alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden mejorar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos, incluyendo, por ejemplo, el reclutamiento de linfocitos, la estimulación de las células B y/o T y la estimulación de macrófagos. Los ejemplos específicos de los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, sales de aluminio (alum) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforilo-lípido A (MPL) 3-des-O-acilado (véase la Patente del Reino Unido Número GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), ASO4 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la Solicitud Internacional del TCP Número PCT/US2007/064857, publicada como La Publicación Internacional Número WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la Solicitud Internacional N.° PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional N.° WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véanse Kensil y col., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Editores Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Pat. de EE.UU. N.° 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son emulsiones de aceite en agua (tales como escualeno o aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil lípido A (véase Stoute y col., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 Nov., 1998).
5.4 Procedimientos de tratam iento e inmunización
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para el tratamiento de una infección en un sujeto, los cuales comprenden administrar al sujeto un glucoconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo. En una realización específica, un procedimiento para el tratamiento de una infección descrita en el presente documento comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad eficaz de un glucoconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, los cuales comprenden administrar al sujeto un glucoconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo. En una realización específica, un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria a un glucoconjugado descrito en el presente documento comprende administrar a un sujeto que lo necesite, una cantidad eficaz de un bioconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan procedimientos para generar anticuerpos monoclonales para prevenir infecciones usando el bioconjugado descrito en el presente documento o una composición del mismo.
En un aspecto específico, los sujetos a los que se administra un glucoconjugado o una composición del mismo tienen, o son susceptibles a, una infección, por ejemplo, a una infección bacteriana. En otra realización específica, los sujetos a quienes se administra un bioconjugado o una composición del mismo se infectan con, o son susceptibles a la infección con E. coli.
6 EJEMPLOS
6.1 Ejemplo 1: Construcción de cepas para la producción de conjugados de antígeno O de E. co li O1
La etapa para la inserción es la clonación del complejo génico rfb O1 en el plásmido donador pDOC mediante técnicas convencionales de clonación molecular [1J. La región del complejo génico rfb O1 se clonó en el plásmido pLAFR1 para confirmar la actividad (A, a continuación) y en paralelo en el plásmido donador pDOC para insertar el complejo génico O1 en el genoma (B, a continuación).
A. El complejo génico rfb O1 y sus regiones de flanqueo de 1,5 kb se subclonaron en el vector de cósmido pLAFR1 (GenBank: AY532632.1). El complejo génico O1 se amplificó mediante PCR del ADN cromosómico de un aislado clínico denominado como upecGVXN032 (StGVXN3736), usando los oligonucleótidos 2193/2161 (véase la Tabla 3). Los oligonucleótidos 2193/2161 se empalman en los genes que flanquean el complejo génico rfb O1, es decir, en galF y después de gnd. El producto de la PCR se clonó en los sitios SgsI de p157. p157 es un pLAFRI que contiene un casete compuesto por dos oligonucleótidos complementarios (300/301), los cuales se clonaron en el sitio EcoRI dando como resultado el p947. Usando el p947 como una plantilla, se llevó a cabo la PCR para amplificar el ADN del complejo génico rfb O1 de la región flanqueante en el extremo 5' (galF) hasta el final del último gen (wekO) en el complejo génico usando los oligonucleótidos 2198/2166 (véase la Figura 3). El producto se clonó en los sitios BamHI/Sgsl de p967 dando como resultado el p985. El p967 se clonó a partir de pDOC-C (GenBank: GQ889494.1) y contenía un MCS y el casete kanR (para los detalles véase la Sección 6.2). El p985 se usó como plantilla para la PCR del complejo génico rfb O1 para su inserción adicional en el p562 (véase a continuación).
B. El p562 se preparó como sigue: Se generó un inserto resultante de una PCR de ensamble usando dos productos de PCR y los oligonucleótidos 1187/1188 (véase la Tabla 3). Un producto de PCR se generó a partir de pKD3 (GenBank: AY048742.1), usando los oligonucleótidos 1188/1189 (véase la Tabla 3; que codifica un casete clmR y los sitios FRT) y otro fue la región de homología 3' derivada de la PCR del ADN genómico W3110 con los oligonucleótidos 1186/1187 (véase la Tabla 3; es decir, el ADN en dirección 3' del complejo génico rfb O16 en el genoma W3110 que codifica la región intergénica y el gen gnd). El ADN ensamblado se cortó usando BamHI/EcoRI y se clonó en los mismos sitios en pDOC-C, dando como resultado el p482. Un producto de PCR de la región de homología 5' (que codifica parte del gen galF indicado como galF y entonces se generó la región intergénica entre galF y el primer gen O16) usando el ADN cromosómico W3110 y los oligonucleótidos 1171/1515, cortados con BamHI y SpeI y clonados en los sitios SpeI/BamHI del p482, dando como resultado el p562.
El p562 codifica las regiones de homología 5' y 3' (5': 1 kb en dirección 5' de rmlB del complejo génico rfb O16; 3': ADN a 1,6 kb en dirección 3' del último gen en el complejo génico rfb O16) con un MCS y un casete de resistencia a clmR invertido entre los mismos. El MCS se usó para insertar el complejo génico rfb O1 amplificado a partir del p985 usando los oligonucleótidos 2214/2215. El plásmido resultante p1003 fue el plásmido donador para la inserción del complejo génico rfb O1 y contenía los elementos como se ilustran en la Figura 3A y la Tabla 1.
Inserción y selección: Se introdujo el plásmido auxiliar p999 (GenBank: GU327533.1) en las células W3110 mediante electroporación. Debido al fenotipo de replicación sensible a la temperatura del p999, las células resultantes se cultivaron a 30 °C en todo momento en LB suplementado con espectinomicina para la selección del p999. En una siguiente etapa, el p1003 se introdujo en las células W3110 que contenían el p999 mediante electroporación. Las células se seleccionaron para la resistencia a ampicilina y espectinomicina en medio LB a 30 °C. Los plásmidos se insertaron en las células aceptoras para hacer posible la expresión de las enzimas codificadas en el plásmido auxiliar en presencia del ADN del plásmido donador dentro de la misma célula.
A continuación, se llevó a cabo el procedimiento de inserción. La cepa recién transformada se hizo crecer en medio LB en presencia de ampicilina y espectinomicina a 30 °C a una escala de 5 ml durante la noche a 180 rpm. Se transfirieron 10 |jl del cultivo denso a un tubo nuevo que contenía 1 ml de LB suplementado con spec y amp. El nuevo cultivo se hizo crecer entonces a 180 rpm durante 2 h a 30 °C, las células se centrifugaron a 5.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C y el sobrenadante se reemplazó por medio LB suplementado con spec, arabinosa al 0,2 % (p/v) e IPTG 1 mM. La composición del medio soporta la selección del plásmido auxiliar y la expresión de recombinasa y endonucleasa Scel para hacer posible la inserción. Las células se resuspendieron y se incubaron adicionalmente a 30 °C durante 4-18 ha 180 rpm.
En diferentes puntos del tiempo después del cambio del medio, se colocaron en placa 0,5 ml del cultivo en placas de LB suplementado con clm (para la selección del inserto de ADN) y sacarosa al 10 % (p/v) (para contra-seleccionar contra el plásmido donador) y se incubaron a 37 °C durante la noche (para seleccionar la pérdida del plásmido auxiliar sensible a la temperatura).
Con el fin de detectar las colonias resultantes para determinar el fenotipo de inserción correcto, las células se colocaron en placa en réplica sobre placas de LB suplementado con spec, amp o clm. Adicionalmente se analizaron las colonias resistentes a clm (para determinar la presencia del inserto), pero sensibles a amp y spec (para determinar la ausencia de los plásmidos donadores y auxiliares) para la inserción.
Para confirmar que la cepa perdió el ADN reemplazado originado a partir del W3110 y que contenía el inserto de ADN, se llevó a cabo la PCR de colonias. Las colonias candidatas con el fenotipo correcto (sensibilidad a la ampicilina, resistencia al cloranfenicol, sensibilidad a la espectinomicina, resistencia a la sacarosa) se recogieron y se sometieron a una prueba de PCR de colonias. Se utilizó una estrategia de PCR [51] para la identificación de los serotipos O en las cepas de E. coli (ExPEC) extraintestinales. Se usaron pares de oligonucleótidos específicos para las secuencias genéticas únicas presentes en el complejo génico rfbs de los 14 serotipos O ExPEC comunes. En el caso de la inserción del O1, se usaron las partes de amplificación de oligonucleótidos wzx del O1 (2241 y 2242) u O16. Se verificaron diversos clones. La inserción de éxito se confirmó en algunos clones por la ausencia de un producto de PCR con los oligonucleótidos específicos de O16 (no mostrados) y la presencia de una señal específica con los oligonucleótidos O1 (Figura 3B). Las cepas resultantes se designaron W3110 ArfbO16::rfbO1-clmR.
En una siguiente etapa, el casete clmR se retiró del ADN, el cual se insertó junto con el complejo génico rfb O1 usando el plásmido pCP20 sensible a la temperatura que expresaba la recombinasa de FLP como se informa [35]. Las células resultantes se probaron para determinar su sensibilidad a clm y después se probaron adicionalmente. Las cepas resultantes se designaron W3110 ArfbO16::rfbO1.
Adicionalmente, la ligasa del antígeno O (waaL) de la cepa de producción se eliminó para la producción óptima del glucoconjugado. Esto se llevó a cabo mediante transducción de fagos. Se usó el fago P1vir (centro de suministro genético de E. coli n.° 12133) para generar el lisado de una cepa de W3110 AwaaL::clmR en el que un gen waaL fue reemplazado por un casete clmR amplificado mediante PCR a partir de pKD3 usando los oligonucleótidos 623 y 624)) [13, 52]. La transducción de fagos se llevó a cabo sobre W3110 ArfbO16::rfbO1 y las cepas resultantes se designaron W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL::clmR. Posteriormente, el casete resistente al cloranfenicol se retiró mediante recombinación impulsada por FLP (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL).
En cada fase del diseño y selección recombinante, se llevó a cabo una prueba de PCR para determinar la presencia del O1 wzx para confirmar la presencia del complejo génico rfb O1 (Figura 3 B). Pueden llevarse a cabo pruebas adicionales de PCR con oligonucleótidos que amplifiquen específicamente las regiones recombinadas en los extremos 5' y 3' de la inserción, es decir, los pares que hibridan fuera de las regiones HR1 y 2 (“PCR de región de transición 5' y 3'”). Por ejemplo, puede generarse un oligonucleótido de PCR para hibridar en el genoma W3110 y el otro para hibridar en el inserto de ADN. De esta manera, las señales de la PCR positivas solamente son posibles si la inserción tiene éxito. Los productos de PCR resultantes entonces se pueden secuenciar para confirmar el ligamiento del ADN de la cepa aceptora cromosómica y el inserto de ADN. Además, puede usarse la PCR y la secuenciación para confirmar la transducción de fagos y las modificaciones de retirada del casete clmR.
Para confirmar la actividad del ADN insertado, se probó la producción de glucolípido de las cepas insertadas que contenían el polisacárido del antígeno O1 en diferentes fases de construcción de la cepa. Los clones candidatos del experimento de inserción inicial se seleccionaron de acuerdo con los resultados positivos de la predetección mediante antibióticos y el fenotipo de sensibilidad a la sacarosa y las pruebas de PCR. Las células se cultivaron durante la noche en medio l B y se prepararon extractos de células enteras. Para analizar los glucolípidos fabricados, los extractos se trataron con proteinasa K para retirar las posibles interferencias por parte de las proteínas. Las muestras resultantes se corrieron en SDS PAGE y se tiñeron mediante tinción con plata o bien se detectaron mediante inmunotinción usando antisueros específicos anti-O1 después de transferirse a membranas de nitrocelulosa. Cuando se analizaron los extractos de los integrantes supuestos mediante tinción con plata, se observó un patrón tipo escalera de entre 25 y 55 kDa indicativo del LPS (Figura 4A, panel superior, carriles 1,2), como en la cepa de control (carril 3). La transferencia Western mostró señales de tipo escala en el mismo rango de peso molecular confirmando que el LPS contenía el antígeno O1 (Figura 4A, inferior, carriles 1, 2) como el LPS de control, el cual se origina a partir de un aislado de O1 clínico (carril 3). Estos resultados confirman la producción del antígeno O1 exhibida sobre el lípido A en W3110 ArfbO16::rfbO1-clmR.
Las cepas de W3110 ArfbO16::rfbO1 se probaron nuevamente (después de la retirada del casete clmR) mediante transferencia Western (Figura 4B, carriles 1,2) para confirmar la producción de LPS del O1 a pesar de la modificación. Para confirmar la deleción de waaL mediante transducción de fagos en las cepas W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL::cat, se analizó nuevamente la producción de LPS (Figura 4C, carril 1). La señal de tipo escalera desapareció del ensayo de tinción con plata (superior) como se esperaba. El análisis por transferencia Western todavía detectó una señal de tipo escalera (carril 1, inferior), aunque con una intensidad más baja que la cepa control (W3110 ArfbO16::rfbO1), la cual todavía contenía el gen waaL (carril 2) y fue capaz de fabricar LPS como se visualizó mediante la tinción con plata. La señal más débil se origina a partir del antígeno O O1 enlazado a und-PP, que no puede ser transferido al lípido A debido a la deleción del gen waaL. Esto significa que la deleción de waaL mediante transducción de fagos se presentó como se esperaba, confirmando el genotipo W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL::cat. Los clones seleccionados se seleccionaron para la retirada del casete clmR de la misma manera que mediante la recombinación originada de FLP. Los clones resultantes (W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL) se analizaron mediante tinción con plata y transferencia Western (Figura 4 D) y mostraron un fenotipo comparable como se observa en la Figura 4D, carril 1).
La cepa final W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL se caracterizó mediante procedimientos adicionales. Para confirmar la producción del antígeno O sobre und-PP por parte de estas células, se empleó un procedimiento que permite hacer la caracterización molecular de los oligosacáridos enlazados con lípido (antígenos O enlazados con Und-PP) mediante marcaje fluorescente con 2 AB seguido de HPLC y EM/EM. W3110 ArfibO16::rfbO1 AwaaL y una cepa control (W3110 AwaaL) se cultivaron durante la noche en un matraz de agitación a 37 °C. Las células equivalentes a una DO600 de 400 se cosecharon y se lavaron una vez con NaCl al 0,9 %. Los aglomerados celulares lavados se liofilizaron. Los lípidos se extrajeron de las células secadas con metanol (MeOH) al 95 % mediante rondas repetidas de vórtex e incubación sobre hielo durante 10 minutos. La suspensión se convirtió hasta MeOH al 85 % mediante la adición de ddH2O y se incubó adicionalmente durante 10 minutos sobre hielo mientras que se pasaba por vórtex regularmente. Después de la centrifugación, el sobrenadante se recolectó y el extracto se secó en N2. Los lípidos secados se disolvieron en metanol/agua (M/W) 1:1 (v/v) y se sometieron a un cartucho C18 SepPak (Waters Corp., Milford, MA). El cartucho se acondicionó con 10 ml de MeOH, seguido por equilibrado con 10 ml de TBAP 10 mM en M/W 1:1. Después de cargarse la muestra, el cartucho se lavó con 10 ml de TBAP 10 mM M/W 1:1 y se eluyó con 5 ml de metanol (MeOH) seguidos de 5 ml de 10:10:3 de cloroformo/metanol/agua (C/M/W). Las eluciones combinadas se secaron en N2.
La muestra de lípido se hidrolizó mediante la disolución de las muestras secadas en 2 ml de ácido trifluoroacético (TFA) 1 M en n-propanol al 50 % y calentando a 50 °C durante 15 minutos. La muestra hidrolizada se secó en N2 , se disolvió en 4 ml de C/M/W 3:48:47 y se sometió a un cartucho C18 SepPak para separar los lípidos de los glucanos hidrolizados. El cartucho se acondicionó con 10 ml de MeOH, seguido de equilibrado con 10 ml de C/M/W 3:48:47. La muestra se aplicó al cartucho y se recolectó el flujo a través. El cartucho se lavó con 4 ml de C/M/W 3:48:47 y los flujos a través combinados se secaron usando un SpeedVac.
Las muestras secadas se marcaron con 2-amino-benzamida (2 AB) de acuerdo con Bigge y col. [48]. La limpieza de glucano se llevó a cabo usando el procedimiento de disco de papel como se describe en Merry y col. [53]. La separación de los glucanos marcados con 2 AB se llevó a cabo mediante HPLC usando una columna en fase normal GlicoSep N de acuerdo con Royle y col. [49], pero modificada hasta un sistema de tres disolventes. Disolvente A: formiato de amonio 10 mM, pH 4,4, en acetonitrilo al 80 %. Disolvente B: formiato de amonio 30 mM, pH 4,4, en acetonitrilo al 40 %. Disolvente C: ácido fórmico al 0,5 %. La temperatura de la columna fue de 30 °C y se detectaron glucanos marcados con 2 AB mediante fluorescencia (Aex = 330 nm, Aem = 420 nm). Condiciones de gradiente: Un gradiente lineal del 100 % de A hasta el 100 % de B durante 160 minutos a una velocidad de flujo de 0,4 ml min-1, seguidos de 2 minutos con el 100 % de B hasta el 100 % de C, regresando hasta el 100 % de A durante 2 minutos y ejecutando durante 15 minutos hasta el 100 % de A a un caudal de 1 ml min-1, regresando después el caudal 0,4 ml min-1 durante 5 min. Las muestras se inyectaron en ddH2O.
Con el fin de identificar los glucanos específicos del antígeno O, el perfil del glucano con 2 AB de las células control se comparó con el perfil obtenido a partir de W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL (Figura 5 A). Se recolectaron los picos específicos de W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL y se analizaron los glucanos con 2 AB en un sistema MALDI Sy Na PT HDMS Q-TOF (Waters Corp., Milford, MA) (Figura 5 B). Las muestras se disolvieron en acetonitrilo/agua 5:95 y se marcaron 1:1 con 20 mg ml-1 de DHB en metanol/agua 80:20. La calibración se hizo con PEG (solución mezclada lista, Waters Corp., Milford, MA), se marcó con 1:3 con 5 mg ml-1 de ácido a-ciano-4-hidroxi-cinámico (CHCA, Sigma-Aldrich, Suiza) en acetonitrilo/agua/ácido trifluoroacético 60:40:0,1. El instrumento se equipó con un dispositivo de láser UV de estado sólido de 200 Hz. Los espectros de masas se registraron en el modo de ion positivo. Para la EMEM: la energía de láser se fijó en 240 a una velocidad de disparo de 200 Hz, el gas de colisión fue argón, se usó un perfil de energía de colisión para avanzar la energía de colisión dependiendo de m/z. Todos los espectros se combinaron, se restó el fondo, se suavizaron (Savitzsky Golay) y se centraron usando el software MassLynx v4.0 (Waters Corp., Milford, MA). El procedimiento también se describe en el documento US2011/0274720 A1.
Las series de iones de fragmentación derivadas de varios de los picos específicos de W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL (Figura 5B) mediante el análisis MALDI-TOF/TOF fueron consistentes con la secuencia de monosacárido informada para el subserotipo O1A de E. coli [54]. De esta manera, se confirmó la construcción de una cepa de E. coli basada en W3110 productora del antígeno O O1A adecuada para la formación del glucoconjugado.
Con el fin de mostrar la producción del glucoconjugado O1A mediante esta cepa, se introdujeron plásmidos que codificaban la expresión inducible de la oligosacaril-transferasa PglB de C. je juni (cinco variantes diferentes, véase más adelante) y la proteína vehículo Exotoxina A de P. aeruginosa (que codificaba 4 secuencias consenso de glucosilación, p659) mediante electroporación en W3110 ArfbO16::rfbO1 AwaaL. Las células de producción se inocularon en medio LB suplementado con MgCh 5 mM, spec y amp y se cultivaron durante la noche a 37 °C en fase estacionaria. Las células se diluyeron entonces hasta una DO600 de 0,05 y se cultivaron hasta una DO600 de 0,8 en TB que contenía spec y amp. La expresión de EPA y PglB se inició mediante la adición de arabinosa al 0,2 % e IPTG 1 mM y el cultivo se hizo crecer durante otras 20 h. Las células después se cosecharon mediante centrifugación y los extractos periplásmicos celulares se prepararon usando el procedimiento de Lisozima [55]. Los extractos periplásmicos (normalizados a una DO600) se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia después de la electrotransferencia (Figura 6). La detección con el antisuero anti-EPA (panel de la izquierda) y el antisuero anti-O1 (panel de la derecha) muestran ambos un claro patrón de tipo escalera de entre 100 y 130 kDa para todas las muestras, indicando fuertemente las glucoproteínas consistentes en la proteína EPA y el polisacárido O1. La señal obtenida con el antisuero anti-EPA solo (por arriba de 70 kDa) corresponde a la EPA no glucosilada. Es evidente que las diferentes variantes de PglB conducen a diferentes productividades específicas de las glucoproteínas: Se obtuvo el rendimiento más pequeño con el PglB correspondiente a la secuencia de proteína de C. je juni de tipo silvestre original, que contenía una etiqueta HA C-terminal (p114, [9]). La optimización de codones sola (p939), la optimización de codones y retirada de la etiqueta HA (p970), la optimización de codones y la mutación del sitio de glucosilación natural PglB para N534Q (p948) y la optimización de codones, la retirada de la etiqueta HA y la retirada del sitio de glucosilación PglB natural (p971), conducen a señales más fuertes indicativas de rendimientos varias veces más altos. Los rendimientos más altos se pueden explicar por las maneras más eficientes de traducción de PglB cuando se usa un gen con los codones optimizados y porque la etiqueta HA C-terminal obstaculiza la actividad o el pliegue de la proteína PglB.
Las glucoproteínas pueden producirse mediante la cepa insertada en un biorreactor a una escala de 10 l para la purificación de la preparación de glucoconjugados altamente puros que exhiben longitudes de glucano más cortas como se observa con un sistema de tres plásmidos. Puede usarse electroforesis capilar en gel para analizar la pureza y el tamaño de los glucoconjugados. Por ejemplo, los polisacáridos unidos a los glucoconjugados pueden retirarse de la proteína mediante hidrazinólisis y se analizaron mediante marcado con 2 AB y HPLC-Em /EM para el análisis de la estructura y longitud del polisacárido. Este análisis puede usarse para confirmar la unión del antígeno O O1A al vehículo de glucoproteína. Adicionalmente, puede llevarse a cabo el análisis de PMP para la determinación de la composición del monosacárido, el análisis de RMN y la cromatografía de gases para la confirmación de la estructura.
Además, puede llevarse a cabo la inmunización de los animales para elevar los anticuerpos hacia el glucano y la proteína vehículo. La actividad anti-infecciosa se puede demostrar usando ensayos preclínicos, tales como los ensayos de aniquilación opsonofagocitótica y/o la protección pasiva.
6.2 Ejemplo 2: Construcción de cepas para la producción del conjugado de antígeno O de E. co li O2
La construcción de cepas se llevó a cabo de una manera similar al Ejemplo 1. El complejo génico rfb O2 se clonó en un plásmido pDOC consistente en las regiones HR y un casete como se detalla en la Tabla 1. El complejo génico rfb O2 se amplificó a partir del aislado clínico upecGVXN116 (StGVXN3949) con los oligos 2207/2166 y se clonó en los sitios BamHI/SgsI de p967. El amplicón de rfb O2 contenía toda la secuencia desde dentro de galF hasta wekR. El ADN entre wekR y gnd se omitió del inserto de ADN. El p967 se clonó mediante la inserción de un oligocasete compuesto por dos oligonucleótidos parcialmente complementarios (2167/2168) en los sitios XhoI y BamHI de p946. El p946 se obtuvo mediante la digestión del p843 con ^scI, el tratamiento del plásmido linealizado con el fragmento Klenow de la polimerasa de ADN para rellenar los extremos de los sitios de restricción cohesivos y el re-ligamiento consecutivo del plásmido. El p843 se generó mediante la clonación de un amplicón de PCR derivado del pKD4 [13] usando los oligonucleótidos 2066 y 2068 (véase la Tabla 3) en los sitios BamHI y SgsI del p482 usando las mismas enzimas. El plásmido donador resultante p1003 contenía la región HR1 en dirección 5' y el complejo génico rfb del upecGVXN116, seguido de un casete kanR retirable y seguido de la región HR2 (Figura 7).
El plásmido auxiliar p999 (GenBank: GU327533.1) se introdujo en las células W3110 mediante electroporación [1J. Se mezclaron 5-500 ng del ADN en agua con 50 |jl de la suspensión celular electrocompetente en una cubeta de electroporación estándar sobre hielo y se electroporaron en un BioRad Micro Pulser (BioRad, Hercules, CA) a un voltaje de 1,8 kV durante 2-10 ms. Debido al fenotipo de replicación sensible a la temperatura del p999, las células resultantes se colocaron en placa y se hicieron crecer a 30 °C en todos los tiempos. En un siguiente paso, se hicieron células competentes mediante el cultivo de W3110 que contenía el p999 en LB suplementado con espectinomicina para la selección del p999 a 30 °C y se introdujo el p1003 en las células mediante electroporación y las células se seleccionaron por su resistencia a ampicilina y espectinomicina en placas de LB a 30 °C. Los plásmidos se insertaron en las células aceptoras para hacer posible la expresión de las enzimas codificadas en el plásmido auxiliar en la presencia del ADN del plásmido donador dentro de la misma célula.
La cepa recién transformada se hizo crecer en medio LB en la presencia de ampicilina y espectinomicina a 30 °C a una escala de 5 ml durante la noche a 180 rpm. Se transfirieron 10 j l del cultivo a un tubo nuevo que contenía 1 ml de LB líquido complementado con espectinomicina y ampicilina. El nuevo cultivo se hizo crecer entonces a 180 rpm durante 2 ha 30 °C. Después, las células se centrifugaron a 5.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C, el sobrenadante se desechó y se añadió medio LB suplementado con espectinomicina, arabinosa al 0,2 % (p/v) e IPTG 1 mM para soportar la selección del plásmido auxiliar (Spec) y de la recombinasa (arabinosa) y la expresión de endonucleasa Scel (IPTG). Las células resuspendidas se incubaron adicionalmente a 30 °C durante 4-18 ha 180 rpm.
En diferentes puntos del tiempo desde 4 hasta 18 h después del cambio del medio, los 0,5 ml del cultivo se colocaron en placa sobre LB suplementado con kan (para la selección del inserto de ADN) y sacarosa al 10 % (p/v) (para contra­ seleccionar contra el plásmido donador) y se incubaron a 37 °C durante la noche (para seleccionar la pérdida del plásmido auxiliar sensible a la temperatura).
Con el fin de detectar las colonias resultantes para encontrar el fenotipo de inserción correcto, las células se colocaron en placa en réplica sobre placas LB suplementado con spec, amp o kan. Las colonias resistentes a kan (por la presencia del inserto), pero sensibles a amp y spec (por la ausencia de los plásmidos donadores y auxiliares) se analizaron adicionalmente para la inserción.
En una siguiente etapa, al gen waaL se alteró mediante transducción de fagos como se describe anteriormente. La cepa resultante de la transducción de fagos se seleccionó por la resistencia a clm (deleción de waaL) y a la kan (inserción del complejo génico rfb O2), dando como resultado el genotipo W3110 ArfbO16::rfbO2-kanR AwaaL::cat.
Los casetes de resistencia a antibióticos para kan (de la inserción del complejo génico rfb) y clm (deleción de waaL) se retiraron en una sola etapa mediante recombinación impulsada por recombinasa FLP usando el pCP20 como se describe [35].
La inserción del inserto de ADN se probó mediante PCR por la ausencia de O16 wzx y la presencia de O2 wzy usando los oligonucleótidos 2243 y 2244 previamente publicados (Figura 7 A). [51.]. El análisis adicional puede incluir la PCR y secuenciación de la región de transición 5' y 3'. La deleción de waaL se probó mediante un enfoque de PCR de colonias usando los oligonucleótidos 1114 y 1326 (véase la Tabla 3) que hibridan en la región de ADN que flanquea al gen waaL (Figura 7B). Un producto de PCR es mayor de 1,5 kb con estos oligonucleótidos cuando está presente una copia de waaL intacta (en los carriles 1 y 5), ligeramente más pequeña (por debajo de 1,5 kb, carriles 2 y 6) si waaL es reemplazado por el casete clmR y después de la retirada del casete clmR, el amplicón de PCR es de un tamaño de aproximadamente 0,5 kb (Figura 7 B). En consecuencia, la deleción de waaL tuvo éxito. La cepa final (W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL) puede probarse mediante PCR de la región de transición 5' y 3'.
Se usó tinción con plata y el análisis por transferencia Western usando los sueros de tipificación de O2 de las muestras de LPS para confirmar los fenotipos de producción del antígeno O durante la construcción de las cepas (Figura 8).
Cuando se sondeó con el antisuero anti-O2, se detectó una escalera en los extractos del integrante supuesto (W3110 ArfbO16::O2-kanR, A, carril 1), así como en la cepa de control positivo, un aislado clínico de E. coli O2 (carril 2). Esto sugirió que el integrante contenía un complejo génico rfb O2 activo. La cepa final (W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL) se probó para determinar la producción de LPS y antígeno und-PPO mediante tinción con plata (Figura 8B, panel de la izquierda) y Transferencia Western (Figura 8B, panel de la derecha). Mientras que la cepa positiva para waaL produjo el LPS como se visualizó mediante la tinción con plata con una señal de tipo escalera (carril 2), la señal estuvo ausente después de la deleción de waaL y de la retirada de los casetes de antibióticos (carril 1). La transferencia Western (panel B) mostró un patrón de tipo escalera en ambas muestras, aunque con una intensidad mucho más baja en la cepa con waaL eliminado. Esto indica que en realidad la cepa con waaL eliminado produjo el polisacárido reactivo con O2 enlazado a Und-PP.
Para confirmar la producción del antígeno O sobre und-PP por parte de estas células, se usaron los procedimientos de marcado con 2 AB como se describen anteriormente (Sección 6.2). Las señales específicas para W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL se observaron cuando los trazos fluorescentes se compararon con una cepa incapaz de producir el antígeno O. Los tiempos de elución pico específicos fueron consistentes con las unidades de repetición de O2 previamente identificadas como se analizó mediante MALDI EM/EM (Figura 9 A). Se analizaron las series de iones de fragmentación de varios picos recolectados mediante MALDI-TOF/TOF como se describe anteriormente. Los patrones de fragmentación son consistentes con la unidad de repetición del antígeno O O2 (Figura 9 B). De esta manera, se confirmó la construcción de una cepa de E. coli basada en W3110 productora del antígeno O O2 W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL.
Con el fin de mostrar la producción del glucoconjugado O2 por parte del W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL, se introdujeron los plásmidos para la expresión inducible de la oligosacaril-transferasa PglB de C. jejuni (dos variantes diferentes) y la proteína vehículo EPA (que codifica 4 secuencias consenso de glucosilación, p659) en W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL mediante electroporación. Las células se inocularon en medio LB suplementado con MgCh 5 mM, spec y amp y se hicieron crecer durante la noche a 37 °C hacia la fase estacionaria. Las células se diluyeron entonces hasta una DOaoo de 0,05 y se hicieron crecer hasta una DO600 de 0,8 en TB que contenía spec y amp. La expresión de EPA y PglB se inició mediante la adición de arabinosa al 0,2 % e IPTG 1 mM y el cultivo se hizo crecer durante otras 20 h. Las células entonces se cosecharon mediante centrifugación y los extractos periplásmicos celulares se prepararon usando el procedimiento de Lisozima [55]. Los extractos periplásmicos (normalizados hasta la densidad celular) se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante transferencia Western (Figura 10). La detección con el antisuero anti-EPA (panel de la izquierda) y el antisuero anti-O2 (panel de la derecha) muestran ambos dos complejo génicos del patrón de tipo escalera del antígeno O típico por arriba de 100 kDa, fuertemente indicativo de las glucoproteínas consistentes en la proteína EPA y el polisacárido O2. La señal obtenida con el antisuero anti-EPA solo (por encima de 70 kDa) corresponde a la EPA no glucosilada. El primer complejo génico (de entre 100 y 130 kDa) corresponde individualmente, al segundo complejo génico más débil (por arriba de 130 kDa) hasta la proteína EPA doblemente glucosilada. Las señales de tipo escala observadas en el Transferencia Western anti-O2 son más probablemente los productos de degradación del glucoconjugado de EPA O2 que todavía contiene la porción del polisacárido. Es evidente que ambas variantes de PglB conducen a productividades específicas similares de las glucoproteínas. El upecGVXN124 (StGVXN3947) es un aislado clínico del serotipo O2, en el que se suprimió el gen waaL [13] y se introdujeron los plásmidos p659 y p939 en el mismo mediante electroporación. Usando este sistema de control de expresión como un comparador (carril x), se observaron las señales más fuertes de los extractos derivados de W3110 ArfbO16::rfbO2 AwaaL (carril B) que a partir del sistema de expresión usando un aislado clínico (upecGVXN124) como el hospedador de expresión. Por consiguiente, la inserción en W3110 puede dar como resultado rendimientos más altos de los glucoconjugados comparándose con la glucosilación en la cepa natural.
También pueden producirse glucoproteínas mediante la cepa insertada en un biorreactor en una escala de 10 l para la purificación de preparación de los glucoconjugados altamente puros que exhiben longitudes más cortas de glucano como se observa con un sistema de tres plásmidos. La electroforesis capilar en gel puede usarse para analizar la pureza, cantidad y tamaño de los glucoconjugados. Los polisacáridos unidos a los glucoconjugados pueden retirarse de la proteína mediante hidrazinólisis y se pueden analizar mediante marcado con 2 AB y HPLC-EM/EM para el análisis de la estructura y longitud del polisacárido. Este análisis puede usarse para confirmar la unión del antígeno O O2 con el portador de glucoproteína. Adicionalmente, puede llevarse a cabo el análisis de PMP para la determinación de la composición del monosacárido, el análisis de RMN y la cromatografía de gases para la confirmación de la estructura. Además, puede llevarse a cabo la inmunización de los animales para elevar los anticuerpos hacia el glucano y la proteína vehículo. La actividad anti-infecciosa se puede demostrar usando ensayos, tales como ensayos de aniquilación opsonofagocitótica y/o protección pasiva.
6.3 Ejemplo 3: Construcción de cepas para la producción del conjugado de antígeno O de E. co li O6
La construcción de cepas se llevó a cabo como se describe anteriormente. El complejo génico rfb O6 se clonó en un plásmido pDOC consistente en las regiones HR y un casete kanR como se detalla en la Tabla 1. El complejo génico O6 se amplificó a partir del ADN genómico de E. coli cepa CCUG11309 con los oligonucleótidos 1907/1908 (Figura 11 A) y se clonó en los sitios BamHI y Bcul del p843 dando como resultado el p914.
El plásmido auxiliar p999 (GenBank: GU327533.1) se introdujo en las células W3110 mediante electroporación [1]. Se mezclaron 5-500 ng del ADN en agua con 50 pl de la suspensión celular electrocompetente en una cubeta de electroporación estándar sobre hielo y se electroporó en un BioRad Micro Pulser (BioRad) a un voltaje de 1,8 kV durante 2-10 ms. Debido al fenotipo de replicación sensible a la temperatura de p999, las células resultantes se colocaron en placa y se hicieron crecer a 30 °C en todos los tiempos. En una siguiente etapa, el p914 se introdujo en el p999 portador de W3110 mediante electroporación y las células se seleccionaron por su resistencia a amp y spec en placas de LB a 30 °C. Los plásmidos se insertaron en las células aceptoras para hacer posible la expresión de las enzimas codificadas en el plásmido auxiliar en la presencia del ADN del plásmido donador dentro de la misma célula.
Los clones electroporados que contenían los plásmidos auxiliares y donadores se cultivaron en medio LB en la presencia de ampicilina y espectinomicina a 30 °C en una escala de 5 ml durante la noche a 180 rpm. Se transfirieron 10 |jl del cultivo a un tubo nuevo que contenía 1 ml de LB líquido complementado con spec y amp. El nuevo cultivo se hizo crecer entonces a 180 rpm durante 2 ha 30 °C. Entonces, el medio se intercambió: el cultivo se centrifugó a 5.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C, el sobrenadante se desechó y el aglomerado celular se volvió a suspender en el medio LB suplementado con spec, arabinosa al 0,2 % (p/v) e IPTG 1 mM, para soportar la selección del plásmido auxiliar (Spec) y la expresión de recombinasa (ara) y endonucleasa Scel (IPTG). Las células resuspendidas se incubaron adicionalmente a 30 °C durante 4 a 18 ha 180 rpm para permitir que se produjera el evento de recombinación.
En diferentes puntos del tiempo desde 4 hasta 18 horas después de cambiar el medio, los 0,5 ml del cultivo se colocaron en placa en LB suplementado con kan (para la selección del inserto de ADN) y sacarosa al 10 % (p/v) (para contra-seleccionar contra el plásmido donador) y se incubaron a 37 °C durante la noche (para seleccionar la pérdida del plásmido auxiliar sensible a la temperatura).
Con el fin de detectar las colonias resultantes para el fenotipo de inserción correcto (W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR), las células se colocaron en placa en réplica sobre placas de LB suplementado con spec, amp o kan. Las colonias resistentes a kan (por la presencia del inserto de ADN), pero sensibles a la amp y spec (por la ausencia de los plásmidos donadores y auxiliares) se analizaron adicionalmente para la inserción. Además, se llevó a cabo la transferencia de colonias. Las colonias colocan en placadas en réplica cultivadas en LB suplementado con kan se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa mediante 'levantamiento de colonias': se extendió una membrana de nitrocelulosa redonda sobre la placa de LB encima de las colonias en crecimiento hasta que la membrana estuvo completamente húmeda. Después de levantar la membrana, las colonias adheridas a la membrana se lavaron en PBS suplementado con Tween 20 (al 0,02 % en p/v). En lo sucesivo, la membrana se procesó como una transferencia Western usando el antisuero anti-O6 para la detección de las colonias que producían el antígeno O6. Las colonias positivas aparecieron como puntos oscuros después del desarrollo de las membranas.
Los casetes de resistencia a antibióticos para kan (de la inserción del complejo génico rfb) y clm (deleción de waaL) se retiraron en una sola etapa mediante recombinación impulsada por recombinasa FLP usando el plásmido pCP20 como se describe [35].
La inserción del inserto de ADN se probó mediante PCR por la ausencia de O16 wzx y la presencia de O6 wzy [51] (Figura 11 D), mediante PCR de la región de transición 5' (Figura 11 B) y 3' (Figura 11 C), la tinción con plata de las muestras de LPS y el análisis por transferencia Western usando sueros de tipificación de O6 (Figura 12). Solamente el clon A (Figura 12A, carril 1) hizo una señal de antígeno O de tipo escala cuando los extractos se analizaron con el suero anti-O6 (como la cepa control de E. coli O6, carril 3), mientras que el clon B fue negativo (carril 2). Todas las demás pruebas fueron positivas para la actividad funcional del complejo génico rfb.
En una siguiente etapa, el gen waaL se alteró mediante transducción de fagos del clon A como se describe anteriormente [52]. La tinción con plata muestra que el antígeno O está ausente de una cepa de deleción de waaL (Figura 12B, panel de la izquierda, carril 1) y el análisis Western muestra el antígeno O O6 enlazado a Und-PP como una señal de tipo escalera débil típica en los mismos extractos (Figura 12B, panel de la derecha, carril 1). Antes de la deleción de waaL, se observa claramente el LPS (ambos paneles, carriles 2). Este resultado mostró la deleción de waaL exitosa.
El casete de resistencia a antibióticos para clm (deleción de waaL) y después para kan (inserción del complejo génico rfb) se retiraron en dos etapas consecutivas mediante recombinación FLP [35]. La Figura 12 C muestra dos clones (carriles 1, 2) después de la retirada de clmR con las señales enlazadas a Und-PP restantes (transferencia Western, panel de la derecha). Las cepas finales (dos clones, W3110 ArfbO16::rfbO6 AwaaL) se probaron mediante PCR de la región de transición 5' y 3' (Figuras 11A y 11B). Para confirmar, pueden realizarse tinción con plata del LPS, transferencia Western y marcaje con 2 AB fluorescente, seguido de HPLC y análisis de EM/EM de los polisacáridos enlazados con und-PP. Todos los datos pueden confirmar la inserción exitosa y la actividad funcional del complejo génico rfb en ambos clones seleccionados.
Para mostrar la producción del glucoconjugado O6, se introdujeron plásmidos que proporcionaban la expresión inducible de la oligosacaril-transferasa PglB de C. je juni (p939) y la proteína vehículo EPA (que codifica 4 secuencias consenso de glucosilación, p659) en W3110 ArfbO16::rfbO6-kanR AwaaL (es decir, el ancestro de la cepa final W3110 ArfbO16::rfbO6 AwaaL) mediante electroporación. Las células se crecieron y se añadieron los inductores y las células se hicieron crecer adicionalmente durante la noche. Las muestras se recolectaron y se prepararon los extractos periplásmicos celulares usando el procedimiento de Lisozima [55]. Los extractos periplásmicos (normalizados a la densidad celular) se separaron mediante SDS-PAGE y se analizaron mediante inmunotransferencia después de la electrotransferencia. La detección con el antisuero anti-EPA y el antisuero anti-O6 muestran ambos dos claros complejos génicos de señales de tipo escalera, uno de entre 100 y 130 y un por encima de 130 kDa (Figura 13). Estas señales son fuertemente indicativas de las glucoproteínas que consisten en la proteína EPA y el polisacárido O6. La señal obtenida con el antisuero anti-EPA solo (por arriba de 70 kDa) corresponde a la EPA no glucosilada. Es evidente que se detectan dos complejo génicos de escalera, indicativos de la EPA glucosilada en dos sitios.
Las glucoproteínas también pueden producirse mediante la cepa insertada en un biorreactor en una escala de 10 l para la purificación de preparación de los glucoconjugados. Los polisacáridos unidos a los glucoconjugados pueden retirarse de la proteína mediante hidrazinólisis y se pueden analizar mediante marcaje con 2 AB y HPLC-EM/EM como el antígeno O enlazado a und-PP. Este análisis puede confirmar la unión del antígeno O6 al vehículo de glucoproteína.
Con el fin de analizar las cepas insertadas en términos de calidad y cantidad de producción de conjugados, se comparó el rendimiento de las cepas insertadas para la producción de glucoconjugados de EPA O1, O2 y O6 con los sistemas de producción alternativos, los cuales son los “sistemas de tres plásmidos”, es decir, los sistemas con el complejo génico rfb codificado sobre un episoma como se describe en la técnica anterior [9], o el sistema de la “cepa de tipo silvestre”. En los primeros, se usa una cepa W3110 AwaaL como un hospedador de expresión. Hay algunas diferencias técnicas en ese sistema comparándose con los sistemas de inserción y de tipo silvestre. El sistema de tres plásmidos requiere de la introducción y el mantenimiento de tres plásmidos en el hospedador. Esto significa que se tienen que añadir tres antibióticos diferentes al medio de crecimiento durante la fermentación para asegurar el mantenimiento del plásmido. La coexistencia de tres plásmidos requiere de estructuras base del vector compatibles. En especial las secuencias de complejo génico rfb grandes requieren de un sistema de mantenimiento especificado y de una intensa presión de selección. El mantenimiento del plásmido es una causa permanente de rendimientos reducidos en los procedimientos de producción para los productos de fermentación microbiana recombinante, principalmente debido a que se presenta la pérdida del plásmido, y, por consiguiente, las células afectadas dejan de producir el producto recombinante, o debido a que el mantenimiento del plásmido implica una carga tal para la célula que caen los rendimientos. Debido a los eventos adversos alérgicos potenciales de los seres humanos a los antibióticos, hay una creciente petición de las dependencias regulatorias de procedimientos de producción libres de antibióticos. Por consiguiente, hay una clara ventaja en la integración en el cromosoma del complejo génico biosintético previamente presente en un episoma.
El segundo posible sistema de producción se basa en aislados clínicos naturales derivados de individuos infectados o del campo y su uso como plataformas de producción. Debido a que producen naturalmente el antígeno O de interés, una simple deleción de waaL hace que estas cepas sean cepas de producción naturalmente insertadas adecuadas. Sin embargo, debido a las muchas toxinas y factores codificados y expresados en los aislados clínicos de E. coli, las dependencias regulatorias requieren de estándares de calidad más altos para los productos de estos sistemas, los cuales son costosos y tardados. Por consiguiente, la inserción en el hospedador W3110 bien estudiado y seguro representa una alternativa adecuada: se reducen las desventajas asociadas con el plásmido y se satisfacen los requerimientos económicos.
Los presentes inventores analizaron los tres sistemas de producción para los tres antígenos O de E. coli (Figura 14). Se introdujeron plásmidos de expresión para EPA (p659) y PglB (p939) en las células hospedadoras que contenían el locus rfb ya sea en el genoma (las cepas insertadas o los aislados clínicos) o bien en un plásmido (sistema de tres plásmidos). Primero se hicieron crecer los cultivos bacterianos durante la noche en medio LB que contenía todos los antibióticos necesarios para mantener los plásmidos presentes en las células. Entonces, el cultivo se diluyó hasta una DO600 de 0,05 en un medio TB y se hizo crecer hasta una DO600 de 0,4 a 1,2 y se añadieron los inductores (arabinosa al 0,2 %, IPTG 1 mM). 20 horas después de la inducción a 37 °C, las células se cosecharon y se prepararon los extractos periplásmicos usando el procedimiento de lisozima. Los lisados periplásmicos entonces se analizaron mediante SDS-PAGE e inmunodetección (transferencia Western).
Se observa la EPA no glucosilada por arriba de 70 kDa en las transferencias anti-EPA. Los patrones de tipo escalera agrupados por encima de 100 kDa representan los glucoconjugados de longitud completa con la distribución típica de longitud de polisacárido de antígeno O. En términos generales, todos los sistemas producen glucoconjugados en un orden de magnitud similar. Sin embargo, los sistemas de tres plásmidos producen señales de tipo escalera en las transferencias Western anti-EPA y anti-polisacárido que parecen estar más ampliamente extendidos (Figura 14, panel A, comparar carriles 3 y 2) o que alcanzan niveles más altos de peso molecular (todos los paneles, comparar los carriles 3 y 2) que las cepas insertadas (de tipo silvestre e insertadas). Esto muestra que la estrategia de inserción es una poderosa herramienta de ajuste del procedimiento para la producción de glucoconjugados (Figura 14).
Pueden llevarse a cabo comparaciones preclínicas de los glucoconjugados de polisacárido largos (hechos mediante el sistema de tres plásmidos) y las cepas insertadas, para determinar si estos últimos conjugados son más inmunogénicos y están más definidos.
Puede llevarse a cabo la comparación de la homogeneidad del cultivo y el mantenimiento de los elementos del ADN recombinante en los cultivos de producción para mostrar que las células de las cepas hospedadoras insertadas son capaces de producir niveles más altos del producto, exhiben un mejor patrón de reproducibilidad y son genéticamente más estables, confirmando, por consiguiente, que la inserción es superior debido a la alta factibilidad de escalado.
6.4 Ejemplo 4: Construcción de cepas para la producción del antígeno O de S. sonnei
El complejo génico de P. shigelloides O17 es funcionalmente idéntico al complejo génico rfb de S. sonnei pero no está codificado sobre un plásmido de patogenicidad inestable y, por consiguiente, se clonó a partir de P. shigelloides. El complejo génico se amplificó del ADN genómico de P. shigelloides O17 con los oligonucleótidos 1508/1509 (sin wzz) y 1528/1509 (con wzz). El complejo génico rfb de P. shigelloides O17 se clonó en el plásmido derivado de pDOC p562 dando como resultado el p563 (en el que se incluyó wzz) y el p568 (que carecía del gen wzz). Los plásmidos auxiliares consistieron en las regiones HR y un casete de selección como se detalla en la Tabla 1. La construcción de las cepas se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. La inserción del inserto de ADN se probó mediante PCR por la ausencia de O16 wzy y la presencia de S. sonnei wzy-wbgV, mediante PCR de la región de transición 5' y 3' (Figura 15), el teñido con plata de muestras de LPS y el análisis Transferencia Western usando los sueros de tipificación de S. sonnei (Figura 16).
6.5 Ejemplo 5: Cepa insertada para la producción de glucoconjugados del antígeno O de S. dysenteriae
Aunque los complejo génicos rfp y rfb de S. dysenteriae forman una unidad funcional que produce el antígeno O en E. coli, en el genoma de S. dysenteriae están presentes en diferentes localizaciones ([8]). Ambos complejos génicos se clonaron en un plásmido pDOC consistente en las regiones HR y un casete de selección como se detalla en la Tabla 1. Un fragmento BamHI a partir del plásmido pSDM7 que contenía rfb/rfp ([8]) se subclonó en pLAFR1 que contenía un casete MCS adecuado. A partir de allí, se usaron los oligonucleótidos 1261 y 1272 (véase la Tabla 3) para clonar rfp/rfb en un amplicón en el p503 derivado de pDOC, dando como resultado el p504. El p503 se clonó a partir del p482 (véase la Sección 6.1): un amplicón de PCR que codifica la región HR1 para la inserción, que contiene parte de galF (galF’) y la región intergénica entre galF y rmlB de la cepa W3110 (usando los oligonucleótidos 1171/1263) se digirió con SpeI y BamHI y se ligó en el p482 digerido con las mismas enzimas (dando como resultado el p503). rfp y rfb se encuentran como dos complejo génicos separados sobre el genoma de S. dysenteriae tipo I y se clonaron de tal manera que la dirección de la traducción fue la misma para galF, rfp, rfb y gnd cuando se expresaron a partir del p504. La inserción del inserto de ADN se llevó a cabo en las cepas positivas y negativas para waaL y se probó mediante PCR por la ausencia de O16 wzy, mediante PCR de la región de transición 5' y 3', el teñido con plata de las muestras de LPS y el análisis Transferencia Western usando sueros de tipificación (no mostrado). La Figura 17 muestra el análisis de glucolípidos de los W3110 ArfbO16::rfbSd1 AwaaL y W3110 ArfbO16::rfbSd1 insertados antes y después de la retirada del casete clmR. Cuando se analizaron los extractos mediante tinción con plata después de la SDS PAGE, solamente las cepas positivas para waaL mostraron el patrón típico del antígeno O del LPS y no las cepas AwaaL. Todas las cepas respondieron al antisuero específico de antígeno O anti-S. dysenteriae 1 confirmando la producción del antígeno O recombinante en estas cepas (Figura 17).
Con el fin de analizar la estructura del antígeno O recombinante en detalle molecular, se analizó el conjunto de polisacáridos enlazados a Und-PP a partir de W3110 ArfbO16::rfbSd1-clmR AwaaL mediante el marcado con 2 AB de los extractos orgánicos hidrolizados de las células y HPLC en fase normal (Figura 18). El trazo muestra el patrón de tipo escalera observado con frecuencia en SDS PAGE. Puede usarse el análisis de EM/EM de ciertos picos para confirmar la secuencia del polisacárido de S. dysenteriae tipo 1.
W3110 ArfbO16::rfbSd1-clmR AwaaL fue el hospedador para la producción del conjugado de EPA de S. dysenteriae 1, como se describe a continuación. Para confirmar la producción de los candidatos de vacuna del glucoconjugado usando esta cepa, los plásmidos de expresión p293 y p114 se transformaron en la cepa y se fermentaron en una escala de 10 litros en un biorreactor. El conjugado de EPA se purificó y la EPA no glucosilada se retiró mediante cromatografía clásica. El volumen final resultante se analizó para confirmar la estructura del azúcar y la calidad del conjugado mediante SEC HPLC (Figura 19 A), SDS PAGE, seguida de tinción con Coomassie o inmunodetección (Figura 19 C), el análisis de la composición del monosacárido (Figura 19 B) e hidrazinólisis seguida de marcaje con 2 AB, análisis de HPLC y EM/EM (Figura 19 D).
6.6 Ejemplo 6: Cepa insertada para la producción de glucoconjugados del antígeno O de S. flexneri 2a
Los antígenos O de Shigella son inmunológicamente diversos. Para una vacuna comprensiva contra la shigelosis usando el polisacárido del antígeno O como un antígeno, se cree que deben incluirse estructuras de antígeno O de al menos cinco serotipos, para dar como resultado suficiente cobertura. La meta es incluir tantos elementos antigénicos como sea posible de la mayoría de las cepas infecciosas prevalecientes y que contengan los antígenos O de S. dysenteriae tipo 1, S. sonnei y S. flexneri tipo 6 y S. flexneri 2a y 3a [56].
Los serotipos 2a y 3a se basan en la misma estructura de polisacárido base del antígeno O que se denomina serotipo Y. Existe una gran diversidad del serotipo O en S. flexneri. Se debe a las modificaciones de las unidades de repetición del serotipo Y mediante los grupos glucosa y acetilo. Las modificaciones de esta clase son responsables de la constitución de las estructuras de los serotipos 2a o 3a (Figura 20A). Las modificaciones de la estructura base de Y son diversas y las diferentes combinaciones de modificaciones conducen a muchas estructuras de polisacárido que reaccionan de forma cruzada serológicamente. Los serotipos 2a y 3a contienen dos diferentes modificaciones de glucosa y una modificación de ramificación de acetilación encontrados con frecuencia en Shigella y, por consiguiente, se incluyen en una vacuna para proteger contra otros antígenos de reacción cruzada.
Las enzimas de decoración que generan la diversidad estructural son transferasas específicas que unen los residuos de glucosa y acetilo a la estructura base del serotipo Y. Mientras que la estructura base está enteramente codificada en el complejo génico rfb, las enzimas responsables de la adición de glucosa o de los grupos acetilo se codifican fuera del complejo génico rfbs. Se hizo la misma observación para algunos antígenos O de E. coli (por ejemplo, O16). Debido a que en muchos casos se cree que las modificaciones de la estructura base son importantes para la inmunogenicidad, deben incluirse en las cepas de producción insertadas.
Para la construcción de una cepa de E. coli insertada que produjera el antígeno O que requiriera de una glucosiltransferasa (o acetil-transferasa) que se localizara fuera del complejo génico rfb, primero se construyó una cepa hospedadora que contenía la transferasa adicional y se probó su funcionalidad mediante la coexpresión del complejo génico rfb a partir de un plásmido. En un paso adicional, se lleva a cabo la inserción del complejo génico de antígeno O en lugar del complejo génico rfb de W3110. El orden de estos eventos es puramente práctico y no sistemático, es decir, el orden se podría invertir. Este procedimiento se ejecutó para hacer el antígeno O de S. flexneri 2a y se demostró que el glucoconjugado hecho con esta cepa es funcionalmente activo en las pruebas preclínicas.
Los presentes inventores eligieron E. coli W3110 como la cepa hospedadora para la producción de los glucoconjugados 2a y 3a debido a que tiene una capacidad probada para la producción eficiente de glucoconjugados. W3110 es deficiente en la producción del antígeno O debido a un gen de glucosil-transferasa alterado en el complejo génico rfb O16. Sin embargo, para evitar las interferencias potenciales por las actividades restantes del complejo génico rfb con nuestros ensayos planeados, se eliminaron los genes de glucosil- y acetil-transferasa rfb wbbIJK [13]. El casete de selección se retiró automáticamente usando la recombinación específica de sitio que funciona con los sitios dif usados por una recombinasa de E. coli [14]. Cuando se expresó el complejo génico rfb de S. flexneri clonado a partir de la cepa de Shigella flexneri 2457T (serotipo 2a), el análisis de glucolípido de los extractos mostró el serotipo y el fenotipo de S. flexneri. El LPS de estos extractos no fue reactivo a los antisueros anti-grupo II y anti-grupo 7, 8 específicos de la modificación de la cadena lateral (Figura 20C, carril 1).
Para la adición de las decoraciones de glucosa al serotipo Y, se aprovechó la ventaja del sistema de modificación existente presente en E. coli W3110. Las modificaciones de glucosa son con frecuencia catalizadas por una maquinaria enzimática originada a partir de un inserto de ADN de profago [57]. E. coli W3110 contiene este elemento genético denominado como el operón gtr. El operón gtr contiene tres genes. Los primeros dos genes están altamente conservados y son comunes para la mayor parte de los complejo génicos gtr identificados hasta la fecha (gtrAB). El tercer gen codifica la glucosil-transferasa, la cual añade glucosa a una localización específica en la cadena del antígeno O en crecimiento en el lado periplásmico de la membrana. En el caso de W3110, este gen se denomina gtrS. En S. flexneri 2a y 3a, están presentes los complejo génicos gtr. Los genes gtrAB respectivos son altamente homólogos, mientras que los terceros genes (gtrlI en 2a y gtrX en 3a) son diferentes [32]. Debido a su homología mecánica con el sistema de W3110, se razonó que el intercambio de gtrS con gtrlI o gtrX también transferiría la actividad de decoración de la glucosa.
Con el fin de probar esta hipótesis, el gen gtrS se intercambió por gtrlI o gtrX mediante recombinación homóloga [13], usando una estrategia de escisión de casete como se describe [14]. Se colocó un casete clmR flanqueado por sitios dif en dirección 3' para sintetizar químicamente los marcos de lectura abierta (ORF) de gtrlI o gtrX en el plásmido p411. Los oligonucleótidos 1018 y 1019 se usaron para generar un fragmento de PCR que codificara gtrlI y clmR a partir de p411. Los colgantes del oligonucleótido fueron idénticos a las secuencias en dirección 5' (secuencias gtrB) y en dirección 3' del marco de lectura abierto (ORF) de gtrS. Usando este amplicón, se llevó a cabo la recombinación homóloga [13]. La recombinación correcta se verificó mediante PCR de colonias (usando los oligonucleótidos 1016/1017) y se secuenciaron los productos de PCR (Figura 20 B). Con el fin de verificar si las enzimas gtr pueden decorar el tipo y estructura base, las cepas positivas se transformaron con el plásmido que expresaba el complejo génico rfb a partir de la cepa 2457T. Los extractos de estas células contenían LPS como se analizaron mediante tinción con plata, pero su movilidad electroforética pareció ser ligeramente diferente debido a que la cepa de control expresó el complejo génico rfb solo (Figura 20C, panel de la izquierda, comparar los carriles 1, 2, 3). Los mismos extractos se sondearon como antes con los antisueros específicos de la cadena lateral de glucosa y, como se esperaba, el antisuero anti-grupo II elevó una señal con la cepa W3110 AgtrSv.gtrII y la cepa W3110 AgtrSv.gtrXelevó una señal con el antisuero anti-grupo 7,8. Por consiguiente, el intercambio de los genes gtr transfirió la capacidad específica para la decoración de glucosa al E. coli W3110, dando como resultado las cepas W3110 AgtrSv.gtrII y W3110 AgtrSv.gtrX. De una manera similar, se podría insertar el complejo génico gtr entero o también el tercer gen solamente (es decir, la glucosil-transferasa específica) en una cepa hospedadora adecuada para generar la actividad de decoración en una cepa de expresión de glucoconjugado recombinante.
Para completar la estructura de S. flexneri 3a con modificaciones de acetilación, los genes de acetil-transferasa conocidos pueden insertarse dentro de la cepa de producción usando una estrategia similar. Para el serotipo 2a, pueden usarse la secuenciación del genoma y el análisis de homología para identificar los genes de acetil-transferasa candidatos que se pueden probar para determinar su actividad de decoración del polisacárido.
Con el objeto de acomodar la glucosilación de proteínas con el antígeno O 2a recombinante, se eliminó el gen waaL mediante recombinación homóloga [13, 14] dando como resultado la cepa W3110 AgtrSv.gtrII AwaaL. Adicionalmente, el complejo génico rfb de E. coli W3110 se intercambió por aquél de S. flexneri 2457T como se describe en el ejemplo 1, dando como resultado el W3110 ArfbO16::rfb2457T AgtrSv.gtrII AwaaL. El plásmido donador p487 se construyó a partir del p482 mediante la inserción de un amplicón de PCR preparado usando los oligonucleótidos 1171 y 1172. Además, para evitar la degradación metabólica de la arabinosa usada para la inducción de la proteína vehículo, el complejo génico araBAD fue alterado en esta cepa. Es bien sabido que la deleción de araBAD aumenta los rendimientos cuando las proteínas recombinantes son controladas por el sistema promotor araBAD. Por consiguiente, la cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL se transdujo con el lisado de fagos preparado a partir de la cepa W3110 AaraBAD::cat. El W3110 AaraBAD::clmR se preparó mediante recombinación homóloga usando un inserto de ADN hecho mediante PCR usando los oligonucleótidos 1562 y 1563 y pKD3 como una plantilla [13].
Con el fin de usar la cepa resultante W3110 AaraBAD::clmR ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL para la producción de vacunas candidatas a escala industrial, se introdujeron los plásmidos de expresión para la proteína vehículo EPA que contenían 2 sitios de glucosilación (p293) y para la oligosacaril-transferasa de pglB que contenía una etiqueta HA (p114), en el W3110 AaraBAD::clmR ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL mediante electroporación. La cepa resultante se fermentó en una escala de 10 l y el glucoconjugado de EPA se purificó a partir de la biomasa resultante. Se llevó a cabo la purificación para retirar las impurezas de la célula hospedadora y la proteína vehículo no glucosilada. Los conjugados se caracterizaron mediante SEC HPLC (Figura 21B), SDS PAGE, seguida por teñido con Coomassie e inmunodetección (Figura 21 A), hidrazinólisis seguida por EM/EM (Figura 21 D), análisis de la composición del monosacárido (Figura 21 C) y GC-EM para la configuración absoluta del monosacárido (no mostrada) (véanse 5.2.1.7. y 5.3.5.). Estos datos confirmaron que la inserción y modificación cromosómica de la cepa dio como resultado un sistema de producción eficiente para la generación de un producto candidato de vacuna de S. flexneri 2a.
Con el objeto de mostrar que la vacuna candidata era funcional en los modelos animales, se probó la inmunogenicidad de una vacuna de glucoconjugado de 2a-EPAE.coli producida en la cepa insertada W3110 AaraBAD::clmR ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL que contenía p114 y p293. A las ratas se les administró tres veces con un intervalo de tres semanas subcutáneamente el conjugado de 2a-EPA que contenía 2,5 |jg de carbohidrato en PBS o PBS solo (Figura 22). Los resultados muestran una seroconversión significativa en la mayoría de los individuos y que la titulación log promedio fue estadísticamente significativa, más alta en los animales inmunizados (grupos di-BC Flex-BC) comparándose con los animales que recibieron las inyecciones de control (PBS). Este resultado también muestra que para la inmunogenicidad y por lo mismo probablemente la eficacia, no se requiere la acetilación del antígeno O. El glucoconjugado de 2a-EPA acetilado (Flex-BC) se produjo en una cepa de S. flexneri 2a atenuada (cepa 2457T), usando el mismo procedimiento, pero la cepa de producción S. flexneri 2a AwaaL con los p114 y p293 introducidos. Se sabe que la cepa 2457T acetila su antígeno O [58].
6.7 Ejemplo 7: Cepa insertada para la producción de antígeno O de P. aeruginosa O11
El complejo génico O11 de antígeno O se clonó en el plásmido pDOC consistente en las regiones HR y un casete de selección como se detalla en la Tabla 1. El complejo génico de antígeno O se amplificó a partir de P. aeruginosa cepa PA103 con los oligonucleótidos 2245/2247 (véase la Tabla 3). La construcción de las cepas se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. La inserción del inserto de ADN (con wzz) en W3110 AwaaL se probó mediante PCR por la ausencia de O16 wzx y la presencia de O11, mediante PCR de la región de transición 5' y 3', tinción con plata de las muestras de LPS y análisis por transferencia Western usando los sueros de tipificación anti grupo-E de P. aeruginosa (O11). En el ejemplo mostrado, se probaron 4 clones con los fenotipos de resistencia a antibióticos correctos para la producción del antígeno O O11 (A a D, carriles 1-4) y se hizo la señal del antígeno O de tipo de escala típica con la movilidad electroforética correspondiente en un tamaño de alrededor de 34 kDa cuando se analizaron con el suero anti-grupo E (Figura 23). Como los controles, se usaron células de E. coli DH5A que contenían el plásmido donador con wzz y sin wzz (carriles 5 y 6). La cepa control contuvo un gen waaL activo y, por consiguiente, fabrica el LPS O11, que muestra un patrón diferente de aquél del O11 Und-PP (carriles 1 a 4). En consecuencia, las señales son más intensas y se observan en un intervalo de peso molecular más alto. En ausencia de wzz (carril 6), la señal se concentró en los pesos moleculares más pequeños, indicando que el E. coli O16 wzz puede hacerse cargo de esta función de una manera eficiente. Tomados juntos, estos resultados mostraron la inserción de éxito y la expresión funcional del complejo génico de antígeno O de P. aeruginosa O11 en E. coli. Los datos adicionales indican que P. aeruginosa O11 wzz es activo para la regulación de cadena en E. coli DH5a y que su actividad puede ser funcionalmente reemplazada por las enzimas reguladoras de longitud de cadena de E. coli de la clase wzz.
6.8. Ejemplo 8: Inserción de un complejo génico quimérico no natural
Se logró la producción de polisacáridos capsulares Gram-positivos y la glucosilación de las proteínas vehículo usando este polisacárido en E. coli [10]. El polisacárido se sintetizó mediante el ADN introducido compuesto por las construcciones de fusión consistentes en fragmentos del complejo génico de antígeno O y fragmentos del complejo génico de CPS para hacer un antígeno O recombinante con una estructura CPS.
Tales complejos génicos quiméricos construidos se insertaron en dos posiciones diferentes en el genoma W3110 con el fin de probar la productividad del und-PP-CP5. Para dirigir la inserción, se clonaron diferentes regiones de homología en los plásmidos donadores.
En un caso, el sitio diana fue el complejo génico rfb W3110 como en los ejemplos anteriores, es decir, las regiones HR fueron las regiones en dirección 5' y en dirección 3' de los ORF contenidos en el complejo génico rfb O16. Para insertar los sitios de la HR en pDOC-C, el pDOC-C se disoció con HindlII y Xhol y se ligó en el mismo un producto de PCR de ensamble cortado con las mismas enzimas. El ensamble se hizo con los oligonucleótidos 1182 y 1184 sobre dos productos de PCR, los cuales se generaron usando i) los oligonucleótidos 1181 y 1182 o ii) 1183 y 1184 y en ambos casos el ADN genómico de W3110 AwaaL como ADN de plantilla. El plásmido resultante fue el p473. Los oligonucleótidos 1142 y 771 (o 1281) se usaron para amplificar el complejo génico productor de CP5 quimérico a partir de un plásmido (p393, documento US2011/0274720 A1) para la clonación en el p473 usando Eco81I, dando como resultado el p477 (o el p498). El p498 se clonó de una manera que se suprimieron wzz y wzx del complejo génico O11 en este plásmido (comparándose con el p477, en el que están presentes wzz y wzx).
En el otro caso, la inserción se llevó a cabo en los sitios diana que flanqueaban a los genes de ECA wecA y wzzE. Debido a que el wecA puede competir con el polisacárido recombinante por el Und-P disponible en las células, se razonó que la deleción de wecA daría como resultado rendimientos más altos del polisacárido CP5. Para hacer que un plásmido donador permita el reemplazo de wecA y wzzE, primero se modificó el pDOC-C con las dos regiones HR y entonces se insertó el complejo génico quimérico CP5. Los oligonucleótidos 1126 y 1129, así como los 1127 y 1128 se usaron para amplificar las regiones HR 1 y 2 usando el ADN cromosómico de W3110 como plantilla. Los productos de PCR se ensamblaron usando los oligonucleótidos 1126 y 1127 y las regiones HR ensambladas se clonaron en los sitios Xhol y HindlII de pDOC-C, dando como resultado el p467. Los oligonucleótidos 1142 y 771 se usaron para amplificar el CP5 quimérico, produciendo el complejo génico a partir de un plásmido (p393, documento US2011/0274720 A1) y el producto de PCR correspondiente se clonó en el sitio Eco81I del p467 dando como resultado el p471.
La inserción en ambas localizaciones usando p471, p498 y p477 se llevó a cabo con detalle como se describe en el Ejemplo 1. Los plásmidos donadores y auxiliares se electroporaron en las células W3110 y las células se trataron como se describe anteriormente. Se usaron los procedimientos de PCR de colonias para confirmar la localización de inserción correcta. Para mostrar que la inserción dio como resultado cepas capaces de producir un antígeno O recombinante, los lisados celulares tratados con proteinasa K a partir de los clones insertados y las células de control se separaron mediante SDS PAGE y se tiñeron con plata o bien se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y se sondearon con el antisuero anti-CP5 específico. Como controles, se analizaron los extractos de las células DH5a que contenían los plásmidos donadores correspondientes o W3110 hwecA que contenía el cósmido p393 que expresaba el antígeno O modificado por CP5 (documento US2011/0274720 A1). Se obtuvieron diferentes intensidades de señal de tipo escala (Figura 24), más fuertes con el plásmido donador p471 (carril 7), similarmente fuertes con el p498 (carril 5), débiles con la p477 (carril 6). El carril 4 contenía las células de control negativo con el p473, que no contenía el complejo génico CP5 quimérico, solamente las regiones HR1 y 2 y no hubo señales de CP5. Las señales de tipo escalera en el bajo peso molecular se deben más probablemente al polisacárido de ECA y no al CP5, debido a que no se detectan con el antisuero específico anti-CP5. Los p498 y p477 difieren en un pequeño tramo de ADN que codifica los genes wzz y wzx de P. aeruginosa O11, que están presentes en el p477. Por consiguiente, se concluyó que wzz-wzx limita la producción de glucolípido debido a un efecto del promotor. El p471, el cual contenía el complejo génico quimérico que incluye wzz-wzx, se transcribe más probablemente del promotor de ECA presente en la HR1. Por consiguiente, la localización en el p471 soporta la biosíntesis de CP5. Los clones insertados se prepararon usando p471 (carril 1), p477 (carril 2) y p498 (carril 3) como los plásmidos donadores. Aunque las señales fueron en general mucho más débiles, se hizo una detección específica de la banda de escalera central y de una banda de bajo peso molecular. Las intensidades fueron más fuertes para el clon derivado del plásmido donador más fuerte (Figura 24). Por consiguiente, estos datos confirman que los procedimientos de inserción presentados pueden insertar las piezas de ADN de al menos hasta 16 kb de largo en diferentes localizaciones seleccionables.
6.9. Ejemplo 9: Una cepa bacteriana con una oligosacaril-transferasa insertada produce bioconjugados
Este ejemplo demuestra que los bioconjugados pueden producirse con éxito por una cepa hospedadora bacteriana que se haya modificado genéticamente mediante la inserción de un ácido nucleico que codifique una oligosacariltransferasa en el genoma de la célula hospedadora bacteriana.
El gen pglB de C. jejuni, con una etiqueta HA, se insertó establemente en el genoma de E. coli cepa MG1655 (K12), usando la tecnología StabyMRCodon T7 (Delphi Genetics, Charleroi, Bélgica). Como parte del procedimiento de la generación de la cepa de E. coli con el pglB insertado, el pglB se aisló del plásmido p114, se fusionó con el gen galK y se insertó en el genoma de la célula hospedadora en lugar del gen waaL. Se confirmó que la cepa de E. coli resultante, MG1655 waaL::pglB-galK, contenía el pglB establemente integrado de la secuencia correcta.
Para evaluar la capacidad de MG1655 waaL::pglB-galK para producir los bioconjugados, se introdujeron dos plásmidos en la cepa. El primer plásmido, p64, comprende los ácidos nucleicos que codifican el complejo génico de Shigella dysenteriae O1. El segundo plásmido, p271, comprende los ácidos nucleicos que codifican una proteína vehículo EPA con una marca de histidina. Las células hospedadoras se cultivaron durante 4 horas o durante la noche, se aislaron y se sometieron a un análisis por transferencia Western con un anticuerpo anti-HA para identificar la producción de pglB y un anticuerpo anti-his para identificar la producción de EPA. Las transferencias Western confirmaron que la cepa hospedadora MG1655 waaL::pglB-galK que expresaba los plásmidos p64 y p271 produjo con éxito ambas proteínas EPA y pglB. Véase la Figura 25. De forma importante, los bioconjugados de O1-EPA se identificaron, indicando la capacidad del gen pglB insertado para producir una oligosacaril-transferasa funcional en las células hospedadoras y, por consiguiente, demostrando que el gen pglB puede insertarse en las células hospedadoras bacterianas y puede conservar su función. Véase la Figura 25.
En otro experimento para evaluar la capacidad de MG1655 waaL::pglB-galK para producir los bioconjugados, se introdujeron diferentes plásmidos en la cepa. El primer plásmido, p281, comprende los ácidos nucleicos que codifican el complejo génico de Shigella dysenteriae O1. El segundo plásmido, p293, comprende los ácidos nucleicos que codifican una proteína vehículo de EPA. Las células hospedadoras se cultivaron durante hasta 16 horas en un biorreactor. En diversos puntos del tiempo, la producción de pglB y EPA se evaluó mediante análisis por transferencia Western usando los anticuerpos anti-EPA y anti-HA. Como se muestra en la Figura 26, las transferencias Western confirmaron que la cepa hospedadora MG1655 waaL::pglB-galK que expresaba los plásmidos p281 y p293 produjo con éxito ambas proteínas EPA y pglB. Es importante que, como se observa con la cepa hospedadora MG1655 waaL::pglB-galK que expresaba los plásmidos p64 y p271, la cepa hospedadora MG1655 waaL::pglB-galK que expresaba los plásmidos p281 y p293 produjo los bioconjugados de O1-EPA, indicando la capacidad del gen pglB insertado para producir una oligosacaril-transferasa funcional en las células hospedadoras y, por consiguiente, confirmando que el gen pglB puede insertarse en las células hospedadoras bacterianas y puede conservar su función.
A continuación, se aislaron con éxito los bioconjugados de O1-EPA producidos por la cepa hospedadora MG1655 waaL::pglB-galK que expresaba los plásmidos p281 y p293, usando una estrategia de purificación de bioconjugados. Véase la Figura 26. Dicho de una manera breve, las proteínas aisladas de la fracción periplásmica de la cepa hospedadora MG1655 waaL::pglB-galK que expresaba los plásmidos p281 y p293 cultivada durante la noche, se pasaron sobre una primera columna de Q-Sepharose. En la Figura 27 se muestra un cromatograma que ilustra los resultados; se observó una fuerte producción de O1-EPA (véanse las fracciones A6-A9 y la imagen insertada). Las fracciones se pasaron sobre geles de SDS-PAGE, seguidos de tinción con Coomasie para identificar las fracciones que contenían el O1-EPA. Véase la Figura 28. Las fracciones A6-A9, identificadas como abundantes en O1-EPA, se reservaron y se pasaron sobre una segunda columna de Q-Sepharose y las fracciones obtenidas de la segunda columna se pasaron sobre geles de SDS-PAGE, seguidos de tinción con Coomasie para identificar las fracciones que contenían el O1-EPA. Véase la Figura 29. En la Figura 30 se muestra un cromatograma que ilustra los resultados; se observó una fuerte producción de O1-EPA en las fracciones B4-B6. Finalmente, las fracciones B4-B6, identificadas como abundantes en O1-EPA, se reservaron y se pasaron sobre una columna Superdex 200, seguida de tinción con Coomasie para identificar las fracciones que comprendían los bioconjugados de O1-EPA purificados. Se encontró que la reserva final de los bioconjugados de O1-EPA aislados, mostrados mediante teñido con Coomasie en la Figura 31, estaban altamente purificados (véase la Figura 32) y probaron ser de una calidad idéntica a la de los bioconjugados de O1-EPA preparados usando un sistema de tres plásmidos, en el que se introdujo el gen pglB en una célula hospedadora de E. coli por medio de un plásmido, en lugar de hacerlo mediante la inserción en el genoma de la célula hospedadora.
6.10. Ejemplo 10: Una cepa bacteriana que contiene un plásmido para la producción de bioconjugados
Este ejemplo demuestra que los bioconjugados pueden producirse con éxito mediante una cepa hospedadora bacteriana que se haya modificado genéticamente mediante el intercambio de una región del ácido nucleico que codifique un complejo génico rfb y mediante la inserción de un ácido nucleico que codifique una oligosacaril-transferasa en el genoma bacteriano de la célula hospedadora. Solamente se requirió un plásmido, que codificaba una proteína vehículo, para la producción del bioconjugado.
Un gen pglB de C. je juni marcado con HA, bajo el control de transcripción del promotor del complejo génico rfb de E. coli O121, se insertó establemente en el genoma de E. coli cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL (descrito en el ejemplo 6) mediante recombinación homóloga (Ref. 13), usando una estrategia de escisión de casete como se describe (Ref. 14). Se analizaron los extractos de células enteras de cepas positivas para pglB mediante SDS-PAGE y se detectó el PglB marcado con HA mediante transferencia Western usando un anticuerpo anti-HA. La expresión de PglB se verificó en E. coli cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T, AgtrS::gtrII, AwaaL,::po121pglB (Figura 33A, carril 1). El PglB expresado por E. coli cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T, AgtrS::gtrII, AwaaL,::po121pglB se comparó con el PglB expresado por E. coli cepa W3110 ArfbO16::rfb2457T AgtrS::gtrII AwaaL, que contenía el pglB originado del plásmido bajo el control de transcripción de un promotor pTac (Figura 33A, comparar los carriles 1 y 2).
Para evaluar la capacidad de W3110 ArfbO16::rfb2457T, AgtrS::gtrII, AwaaL, ::po121pglB para producir los bioconjugados, se introdujo en la cepa un plásmido de expresión que contenía la proteína vehículo EPA diseñada para comprender dos sitios de N-glucosilación y una marca de histidina (p150). La cepa resultante se cultivó durante la noche y el 2a-EPA se purificó de los extractos periplásmicos usando cromatografía de afinidad-Ni2+. La EPA purificada se analizó mediante SDS-PAGE, seguida de tinción con azul Coomassie y se detectó el glucoconjugado de 2a-EPA (Figura 33B). Se confirmó que podría usarse una célula hospedadora de E. coli con una oligosacaril-transferasa y el complejo génico rfb y el complejo génico rfb heterólogo insertados en su genoma y con un solo plásmido que expresaba una proteína vehículo, para producir con éxito los bioconjugados.
6.11. Ejemplo 11: Una cepa bacteriana que contiene un plásmido para la producción de bioconjugados
Este ejemplo demuestra que los bioconjugados pueden producirse con éxito mediante una cepa hospedadora bacteriana que se haya modificado genéticamente mediante el intercambio de una región de ácido nucleico que codifique el complejo génico rfb y mediante la inserción de un ácido nucleico que codifique una oligosacaril-transferasa en el genoma bacteriano de la célula hospedadora. Solamente se requirió un plásmido, que codificaba una proteína vehículo, para la producción del bioconjugado.
Se usaron dos cepas de E. coli diferentes: (i) StGVXN8905 (genotipo: AaraBAD AgtrS::gtrII ArfbO16::rfb2457T AwaaL::pglBcuo), que comprende tanto pglb como el complejo génico rfb de Shigella flexneri 2a (rfb2457T) insertados en el genoma de la célula hospedadora y un plásmido que codifica la proteína vehículo de EPA (pGVXN1198); (ii) StGVXN5083 (genotipo: AaraBAD AgtrS::gtrII ArfbO16::rfb2457T AwaaL) que comprende el pglb expresado por el plásmido (pGVXN970), la proteína vehículo de EPA expresada por el plásmido (pGVXN1198) y el complejo génico rfb de Shigella flexneri 2a insertado en el genoma de la célula hospedadora. Para la integración genómica del pglB de oligosacaril-transferasa de C. je ju n iy el complejo génico rfb, se usó la recombinación homóloga descrita en el presente documento.
Como se muestra en la Figura 34, ambas cepas de E. coli que expresaban la oligosacaril-transferasa, la proteína vehículo y el complejo génico rfb de Shigella flexneri 2a, produjeron bioconjugados (véanse las señales entre los marcadores de peso molecular de 90-170 kDa, las cuales corresponden al bioconjugado de S.flexneri 2a-EPA). Es importante que esta observación incluye la cepa StGVXN8905, la cual comprende la doble integración de una oligosacaril-transferasa y un complejo génico rfb. Por consiguiente, este Ejemplo demuestra no solamente que pueden generarse células hospedadoras estables después de la doble inserción de genes/complejos génicos en el genoma de la célula hospedadora, sino que también se mantiene la función de los genes. De una manera específica, se conservó la función de la oligosacaril-transferasa insertada y del complejo génico rfb insertado, dando como resultado la producción del bioconjugado.
En conclusión, se ha demostrado en los ejemplos anteriores que pueden producirse con éxito los bioconjugados usando una célula hospedadora bacteriana que se haya diseñado para expresar establemente, como parte de su genoma, una oligosacaril-transferasa y otros elementos genéticos responsables de la producción del polisacárido enlazado al pirofosfato de undecaprenilo (Und-PP) correcto, que son componentes esenciales de la producción de bioconjugados. Convenientemente, se requirieron menos plásmidos, por ejemplo, solamente un plásmido (véanse los Ejemplos 10 y 11), para la producción del bioconjugado usando este sistema novedoso, que en los sistemas actualmente conocidos para generar bioconjugados en las células hospedadoras mediante el uso de la maquinaria de glucosilación heteróloga.
Tabla 1: Cepas de Inserción.
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continuación
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Tabla 2. Cepas de inserción adicionales
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Tabla 3. Lista de oligonucleótidos
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continuación
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Tabla 4. Lista de endonucleasas de asentamiento
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continuación
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continuación
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Tabla 5: lista de orí enes de re licación
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Tabla 6. antibióticos usados en biología molecular
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Tabla 7: Promotores inducibles utilizados en expresión bacteriana
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continuación
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continuación
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continuación
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Tabla 8: cepas de expresión bacteriana
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una célula hospedadora procariota aislada, en la que i) un gen heterólogo que codifica una oligosacaril transferasa y ii) ADN de al menos 8 kb que codifica un complejo génico rfb o un complejo génico del polisacárido capsular, se han insertado en el genoma de la célula hospedadora.
2. La célula hospedadora aislada de la reivindicación 1, en la que un gen heterólogo que codifica una proteína vehículo capaz de estar N-glucosilada se ha insertado en el genoma de la célula hospedadora.
3. La célula hospedadora aislada de la reivindicación 2, en la que dicha proteína vehículo comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro.
4. La célula hospedadora aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha célula hospedadora es E. coli.
5. La célula hospedadora aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho gen heterólogo que codifica una oligosacaril transferasa comprende el gen pglB de C. jejuni.
6. La célula hospedadora aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que el número de copias de los genes heterólogos en la célula hospedadora es de 1,2, 3, 4 o 5.
7. Un procedimiento para producir una proteína N-glucosilada, en el que dicho procedimiento comprende cultivar la célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en condiciones adecuadas para la producción de proteínas.
8. Una célula hospedadora aislada, que comprende (i) un gen heterólogo que codifica una oligosacaril transferasa, en la que dicho gen que codifica una oligosacaril transferasa se ha insertado en el genoma de la célula hospedadora, (ii) un ADN heterólogo que codifica un complejo génico rfb, en la que dicho ADN heterólogo que codifica un complejo génico rfb se ha insertado en el genoma de la célula hospedadora; y (iii) un gen que codifica una proteína vehículo capaz de estar N-glucosilada.
9. La célula hospedadora aislada de la reivindicación 8, en la que dicho gen que codifica una proteína vehículo capaz de estar N-glucosilada es un gen heterólogo.
10. La célula hospedadora aislada de la reivindicación 9, en la que dicho gen que codifica una proteína vehículo capaz de estar N-glucosilada se expresa en un plásmido presente en la célula hospedadora.
11. La célula hospedadora aislada de la reivindicación 9, en la que dicho gen que codifica una proteína vehículo capaz de estar N-glucosilada se ha insertado en el genoma de la célula hospedadora.
12. La célula hospedadora aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en la que dicha proteína vehículo comprende una secuencia consenso Asn-X-Ser(Thr), en la que X se selecciona independientemente de cualquier aminoácido excepto Pro.
13. La célula hospedadora aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en la que dicho gen heterólogo que codifica una oligosacaril transferasa comprende el gen pglB de C. jejuni.
14. La célula hospedadora aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 8-13, en la que el número de copias de los genes heterólogos en la célula hospedadora es de 1,2, 3, 4 o 5.
15. Un procedimiento para producir una proteína N-glucosilada, en el que dicho procedimiento comprende cultivar la célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 8-14 en condiciones adecuadas para la producción de proteínas.
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