ES2939470T3 - Células hospedadoras modificadas y usos de las mismas - Google Patents

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Abstract

En el presente documento se describen células huésped modificadas útiles en la producción de bioconjugados que pueden usarse para vacunar sujetos contra la infección por Pseudomonas. de antígenos específicos de Pseudomonas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Células hospedadoras modificadas y usos de las mismas
1. Introducción
En el presente documento se describen células hospedadoras modificadas útiles en la producción de bioconjugados que pueden usarse para vacunar sujetos contra la infección con Pseudomonas. Los genomas de las células hospedadoras modificadas descritos en el presente documento comprenden genes que codifican proteínas implicadas en la glicosilación de proteínas, así como genes específicos para la producción de antígenos específicos de Pseudomonas.
2. Antecedentes
La enfermedad causada por infección con cepas de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa) representa una grave amenaza a nivel mundial. Aunque el desarrollo de vacunas contra dicha infección está en marcha, sigue existiendo una gran necesidad de vacunas eficaces contra infección por Pseudomonas que se puedan producir con seguridad en grandes cantidades. Dean CR et al Journal of Bacteriology 15 de julio de 1999, páginas 4275-42284 divulga la caracterización del locus del antígeno O del serogrupo O11 de Pseudomonas aeruginosa PA103. Los documentos WO 09/104074 y WO 11/138361 divulgan la producción de bioconjugados en los que un antígeno O se conjuga con una proteína transportadora. Belanger M et al Microbiology 1 de diciembre de 1999, páginas 3505-3521 divulga el análisis funcional de los genes responsables de la síntesis del antígeno O de la banda B de lipopolisacárido del serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
3. Sumario
En un aspecto, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora procariota modificada que es una célula hospedadora que comprende:
i) un ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas;
ii) un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3;
iii) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa; y
un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso de N-glicosilación D/E - X - N - XS/T en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. Dichas células hospedadoras pueden expresar naturalmente ácidos nucleicos específicos para la producción de un antígeno de Pseudomonas, o se puede hacer que las células hospedadoras expresen dichos ácidos nucleicos, es decir, en determinadas realizaciones, dichos ácidos nucleicos son heterólogos para las células hospedadoras. En determinadas realizaciones, uno o más de dichos ácidos nucleicos específicos para la producción de un antígeno de Pseudomonas son heterólogos para la célula hospedadora y están integrados en el genoma de la célula hospedadora. En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican enzimas adicionales activas en la N-glicosilación de proteínas, por ejemplo, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden además un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa y uno o más ácidos nucleicos que codifican otras glicosiltransferasas derivadas de un agrupamiento rfb de Pseudomonas. Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora, por ejemplo, una proteína a la que se pueden unir oligosacáridos y/o polisacáridos para formar un bioconjugado. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora procariota modificada que comprende ácidos nucleicos que codifican enzimas capaces de producir un bioconjugado que comprende un antígeno de Pseudomonas, en donde dicha célula hospedadora comprende un agrupamiento rfb de Pseudomonas o una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas se integra en el genoma de dicha célula hospedadora. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb o glicosiltransferasa de Pseudomonas aeruginosa. Véase Raymond et al., J Bacteriol., 2002 184(13):3614-22. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa es el agrupamiento rfb de uno cualquiera de los serotipos 01-020. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa es el agrupamiento rfb de uno cualquiera de los serotipos descritos en Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa es el agrupamiento rfb del serotipo O2, O5, O6, O11, O15, O16. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa es el agrupamiento rfb del serotipo O6. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa es el agrupamiento rfb del serotipo O11. En otra realización específica, dicha célula hospedadora comprende un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, pglB de Campylobacter jejuni). En otra realización específica, dicho ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, pglB de Campylobacter jejuni) se integra en el genoma de la célula hospedadora. En una realización específica, dicha célula hospedadora comprende un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En determinadas realizaciones, dicha célula hospedadora procariota modificada que comprende ácidos nucleicos que codifican enzimas capaces de producir un bioconjugado que comprende un antígeno de Pseudomonas, comprende además una o más enzimas accesorias, que incluyen enzimas de ramificación, modificación, amidación, regulación de la longitud de cadena, acetilación, formilación, polimerización. En una realización específica, dichas una o más enzimas accesorias son heterólogas para la célula hospedadora. En una realización específica, dichas una o más enzimas accesorias se insertan en el genoma de la célula hospedadora procariota modificada además del agrupamiento rfb. En una realización específica, dichas una o más enzimas accesorias se derivan de Pseudomonas, por ejemplo, P. aeruginosa.
En una realización específica, una célula hospedadora procariota modificada proporcionada en el presente documento comprende un ácido nucleico que codifica una formiltransferasa. En otra realización específica, dicha formiltransferasa es la formiltransferasa presentada en la SEQ ID NO:2, o un homólogo de la misma. En otra realización específica, dicha formiltransferasa se incorpora (por ejemplo, se inserta en el genoma de o el plásmido expresado por) en dicha célula hospedadora como parte de un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas ha sido modificado para comprender la formiltransferasa. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En otra realización específica, una célula hospedadora procariota modificada proporcionada en el presente documento comprende un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad u homología con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3. En otra realización específica, dicha polimerasa wzy es la polimerasa wzy presentada en la SEQ ID NO:3. En otra realización específica, dicha polimerasa wzy se incorpora (por ejemplo, se inserta en el genoma de o el plásmido expresado por) en dicha célula hospedadora como parte de un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas ha sido modificado para comprender la polimerasa wzy. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En otra realización específica, una célula hospedadora procariota modificada proporcionada en el presente documento comprende (i) un ácido nucleico que codifica una formiltransferasa y (ii) un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad u homología con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3. En una realización específica, dicha formiltransferasa es la formiltransferasa presentada en la SEQ ID NO:2, o un homólogo de la misma. En otra realización específica, dicha polimerasa wzy es la polimerasa wzy presentada en la SEQ ID NO:3. En una realización específica, dicha formiltransferasa y dicha polimerasa wzy se incorporan (por ejemplo, se insertan en el genoma de o el plásmido expresado por) en dicha célula hospedadora como parte de un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas ha sido modificado para comprender la formiltransferasa y la polimerasa wzy. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un agrupamiento rfb de Pseudomonas modificado, por ejemplo, agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas modificado comprende (i) un gen que codifica una formiltransferasa (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO:2 o un homólogo de la misma), (ii) un gen que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho gen codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad u homología con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3 (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO3); o
(iii) un gen que codifica una formiltransferasa (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO:2 o un homólogo de la misma) y un gen que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho gen codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % de identidad u homología con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3 (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO3).
Ácidos nucleicos que codifican formiltransferasas y ácidos nucleicos que codifican polimerasas wzy que se usan para generar agrupamientos rfb de Pseudomonas, por ejemplo, agrupamientos rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa modificados, se pueden insertar en el agrupamiento rfb en múltiples posiciones y en múltiples orientaciones.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena abajo de los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena abajo del gen wbpM del agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena arriba de los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena abajo del gen wzz del agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan en el sentido de las agujas del reloj en relación con los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan en sentido contrario a las agujas del reloj en relación con los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
1. En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un método de producción de un bioconjugado que comprende un antígeno de Pseudomonas unido a una proteína transportadora, comprendiendo dicho método cultivar una célula hospedadora que comprende:
i) un ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas; ii) un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ iD NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3;
iii) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa; y
un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso de N-glicosilación D/E - X - N - XS/T en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, como se describe en el presente documento en condiciones adecuadas para la producción de proteínas y la purificación de la proteína transportadora N-glicosilada. Métodos para producir proteínas usando células hospedadoras, por ejemplo, E. coli, y aislar proteínas producidas por las células hospedadoras, son bien conocidos en la técnica.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan bioconjugados producidos por las células hospedadoras que comprenden:
i) un ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas;
ii) un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3;
iii) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa; y
un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso de N-glicosilación D/E - X - N - XS/T en donde X es cualquier aminoácido excepto la prolina proporcionada en el presente documento.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno de Pseudomonas. En una realización específica, dicho antígeno de Pseudomonas es un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden uno o más de los bioconjugados proporcionados en el presente documento.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición, por ejemplo, composición farmacéutica, que comprende un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno de Pseudomonas. En una realización específica, dicho antígeno de Pseudomonas es un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan un bioconjugado o una composición, como se describe en el presente documento, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad causada por una infección por Pseudomonas en un sujeto humano. Dichos bioconjugados o composiciones son para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad causada por Pseudomonas (por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa), que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento.
3.1 Terminología
OPS: polisacárido O; el antígeno O de bacterias Gram-negativas. OPS también se denomina en el presente documento antígeno O.
LPS: lipopolisacárido.
agrupamiento rfb: un agrupamiento de genes que codifica la maquinaria enzimática capaz de sintetizar la estructura básica de un antígeno O.
waaL: el gen de ligasa del antígeno O que codifica una enzima unida a la membrana con un sitio activo ubicado en el periplasma. La enzima codificada transfiere el antígeno O unido a undecaprenilfosfato (UPP) al núcleo del lípido A, formando el lipopolisacárido.
RU: unidad de repetición. Como se usa en el presente documento, la RU se establece igual que la unidad de repetición biológica, BRU. La BRU describe la RU de un antígeno O tal como se sintetiza in vivo.
Und-PP: pirofosfato de undecaprenilo.
LLO: oligosacárido unido a lípido.
Como se usa en el presente documento, el término "bioconjugado" se refiere al conjugado entre una proteína (por ejemplo, una proteína transportadora) y un antígeno, por ejemplo, un antígeno de Pseudomonas, preparado en el fondo de una célula hospedadora, en donde la maquinaria de la célula hospedadora une el antígeno a la proteína (por ejemplo, enlaces N).
El término "aproximadamente", cuando se usa junto con un número, se refiere a cualquier número dentro de ±1, ±5 o ± 10 % del número mencionado.
Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz", en el contexto de la administración de una terapia (por ejemplo, una composición descrita en el presente documento) a un sujeto se refiere a la cantidad de una terapia que tiene efectos profilácticos y/o terapéuticos. En determinadas realizaciones, una "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para lograr uno, dos, tres, cuatro o más de los siguientes efectos: (i) reducir o mejorar la gravedad de una infección por Pseudomonas o síntoma asociado con la misma; (ii) reducir la duración de una infección por Pseudomonas o síntoma asociado con la misma; (iii) prevenir la progresión de una infección por Pseudomonas o síntoma asociado con la misma; (iv) causar la regresión de una infección por Pseudomonas o síntoma asociado con la misma; (v) prevenir el desarrollo o inicio de una infección por Pseudomonas infección o síntoma asociado con la misma; (vi) prevenir la recurrencia de una infección por Pseudomonas o síntoma asociado con la misma; (vii) reducir la insuficiencia orgánica asociada con una infección por Pseudomonas; (viii) reducir la hospitalización de un sujeto que tiene una infección por Pseudomonas; (ix) reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que tiene una infección por Pseudomonas; (x) aumentar la supervivencia de un sujeto con una infección por Pseudomonas; (xi) eliminar una infección por Pseudomonas en un sujeto; (xii) inhibir o reducir una replicación de Pseudomonas en un sujeto; y/o (xiii) potenciar o mejorar el efecto o efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia.
Como se usa en el presente documento, la expresión "en combinación", en el contexto de la administración de dos o más terapias a un sujeto, se refiere al uso de más de una terapia. El uso de la expresión "en combinación" no restringe el orden en el que se administran las terapias a un sujeto. Por ejemplo, una primera terapia (por ejemplo, una composición descrita en el presente documento) se puede administrar antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas después de) la administración de una segunda terapia a un sujeto.
Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" se refiere a un animal (por ejemplo, aves, reptiles y mamíferos). En otra realización, un sujeto es un mamífero, incluyendo un no primate (por ejemplo, un camello, burro, cebra, vaca, cerdo, caballo, cabra, oveja, gato, perro, rata y ratón) y un primate (por ejemplo, un mono, chimpancé y un ser humano). En determinadas realizaciones, un sujeto es un animal no humano. En algunas realizaciones, un sujeto es un animal de granja o una mascota (por ejemplo, un perro, gato, caballo, cabra, oveja, cerdo, burro o pollo). En una realización específica, un sujeto es un ser humano. Los términos "sujeto" y "paciente" pueden usarse en el presente documento de manera intercambiable.
4. Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa una transferencia de Western de extractos periplásmicos de células hospedadoras modificadas que producen bioconjugados. Se indican las cepas como se describen en los ejemplos. "Int." se refiere a un componente integrado. "*" se refiere a integración usando un enfoque mediado por transposón.
La figura 2 representa la estructura de la unidad de repetición del antígeno O de O6 de Pseudomonas aeruginosa. * indica posiciones que pueden variar en su composición química de acuerdo con la identidad del subserotipo. La variabilidad se introduce por la actividad de amidasas que convierten las funciones ácidas de los residuos de GalNAcA en C6 en amida, dando como resultado GalNAcAN (o GalNFmA en GalNFmAN; un grupo acetilo sustituye el C3 del residuo GalNAcAN* en algunos subserotipos). Los genes para la polimerización de la unidad de repetición (wzy), acetilación, formilación y amidación de uno de los residuos de GalNX se desconocen. L-Rha, L-ramnosa; D-GalNA-cAN, ácido 6-amido-2-N-acetil-D-galactosaminurónico; D-GalNFmAN, 2-N-formil-D-galactosaminurónico; D-QuiNAc, N-acetil-D-quinosamina.
Figura 3. Pruebas funcionales de formiltransferasa de O6 de Pseudomonas aeruginosa. 3A: Detección de la unidad de repetición O6 simple formilada unida al núcleo del lípido A mediante transferencia de Western. La E. coliW3110 Awec se transformó con un cósmido que codifica el agrupamiento rfbO6 (incompleto) y un plásmido de expresión que codifica la formiltransferasa de O6 (fmtO6; SEQ NO:2). Los extractos celulares se recogieron después de la inducción durante la noche durante el crecimiento a 37 °C en medio LB, se digirieron con proteinasa K, se separaron por SDS PAGE y se electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa. La inmunodetección con un antisuero específico de O6 indujo una señal en presencia de fmt06, pero no en el control de vector vacío. Este resultado indica fuertemente que la formilación es un antígeno relevante en células de P. aeruginosa y prerrequisito para la detección usando este antisuero. 3B: Confirmación de formilación en una unidad de repetición O6 simple liberada de undecaprenilpirofosfato. La E. coli W3110 Awec AwaaL se transformó con los mismos plásmidos que anteriormente y se cultivó en matraces de agitación para producir unidades de repetición simples del antígeno O de O6 (la polimerasa wzy está ausente en estas cepas) y se analizaron los glicolípidos. En resumen, las unidades de repetición se extrajeron como glicolípidos de células secas, se purificaron por afinidad a cartuchos C18, se hidrolizaron (para eliminar undecaprenilpirofosfato de las unidades de repetición del antígeno O de O6), se marcaron con 2 aminobenzamida usando aminación reductora y se analizaron por HPLC de fase normal. La coexpresión de fmtO6 dio lugar a una señal adicional en el tiempo de elución de 61', que contenía oligosacáridos correspondientes a la unidad de repetición O6 formilada marcada, mientras que en ausencia del gen, la señal principal se descubrió en 58' y contenía la unidad de repetición O6 N-acetilada marcada.
Figura 4. Pruebas funcionales de polimerasa wzy candidata de O6 de P. aeruginosa. Células de E. coli W3110 Awec que contenían un cósmido que codifica el agrupamiento rfb (incompleto) (que carece de los genes fmtO6 y wzy) se transformó con plásmidos que codifican el gen candidato de fmtO6 y wzy PAK 01823 (SEQ ID NO:3) o vectores vacíos correspondientes. Los extractos celulares se trataron con proteinasa K y los LPS se analizaron por inmunodetección después de SDS PAGE y se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa.
Figura 5. Clonación del agrupamiento de expresión del antígeno O de O6 artificial de Pseudomonas aeruginosa. En primer lugar, el agrupamiento rfb de la cepa stGVXN4017 de O6 de P. aeruginosa (cepa "PAK" de O6 de Pseudomonas aeruginosa) se clonó en un vector cosmídico mediante clonación por PCR usando técnicas estándar. Búsquedas de homología respaldadas por bioinformática identificaron la formiltransferasa (FT) y la polimerasa del antígeno O (wzy), que posteriormente se insertaron cadena abajo del agrupamiento rfb de manera gradual. Los agrupamientos de genes resultantes son capaces de efectuar la biosíntesis completa de la unidad de repetición del antígeno O de O6 de P. aeruginosa (rfbO6+, sin polímero) y la biosíntesis de polisacárido (rfbO6++, en el que se incluye wzy) en derivados de E. coli W3110.
La figura 6 representa una transferencia de Western de extractos periplásmicos de células hospedadoras modificadas que producen bioconjugados. Se indican las cepas como se describen en los ejemplos. 6A: resultados para la cepa "St7343" de E. coli modificada para comprender pglB integrado y agrupamiento rfb integrado de O6 de P. aeruginosa. 6B: resultados para la cepa "St7209" de E. coli modificada para comprender pglB portado por plásmido y agrupamiento rfb integrado de O6 de P. aeruginosa. 6C: resultados para la cepa "St2182" de E. coli modificada para comprender pglB portado por plásmido y agrupamiento rfb portado por plásmido de O6 de P. aeruginosa.
Figura 7. Glicoconjugado EPA-06 purificado. EPA-06 se purificó a partir de extracto periplásmico de células hospedadoras modificadas usando cromatografía de afinidad de quelato metálico, cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). El eluato final de SEC se caracterizó mediante SDSPAGE seguida de tinción con azul de Coomassie o transferencia de Western usando los anticuerpos indicados.
Figura 8. Retención de plásmido (PR) de sistemas de plásmido 1 y 3 en presencia y ausencia de presión de selección de antibiótico. La PR se expresa en % de células que contienen el plásmido respectivo. Las figuras A y B muestran la PR del EPA-plásmido (kanamicina, negro) en células hospedadoras modificadas con agrupamiento rfb integrado y pglB en presencia (A) y ausencia (B) de kanamicina. Las figuras C y D muestran la PR del EPA-plásmido (kanamicina, negro), pg/B-Plásmido (espectinomicina, blanco) y plásmido de agrupamiento rfb (tetraciclina, punteado) en células hospedadoras modificadas en presencia (C) y ausencia (D) de los tres antibióticos. El porcentaje de células en las que son retenidos los tres plásmidos se muestra en gris. Inoc=Inóculo; U = células no inducidas; I4=células 6 horas después de la inducción; I6=células después de inducción durante la noche
Figura 9. Actividad biológica del antisuero anti-O6 inducido por vacuna. 9A: Títulos de punto medio de ELISA de sueros de ratón mezclados de los diferentes grupos de vacunación después de la tercera inyección. Sin ady. = sin adyuvante, Ac/Ag: indica el adyuvante usado, un adyuvante de emulsión de aceite en agua. Ac/Ac solo es un grupo de control que no contenía un glicoconjugado. 9B: Se indican los títulos de punto medio de destrucción opsonofagocítica (que inducen una reducción del 50 % en las ufc en comparación con el control). Mezcla pII y pIII son sueros mezclados recogidos después de la segunda y tercera inyección.
5. Descripción detallada
5.1 Células hospedadoras
2. En el presente documento se proporcionan células hospedadoras que comprenden:
i) un ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas;
ii) un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3;
iii) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa; y
un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso de N-glicosilación D/E - X - N - XS/T en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, por ejemplo, células hospedadoras procariotas, capaces de producir bioconjugados que comprenden un antígeno de Pseudomonas unido a una proteína transportadora. Las células hospedadoras descritas en el presente documento comprenden un genoma en el que se han insertado una o más secuencias de ADN, en donde dichas secuencias de ADN codifican una proteína o comprenden un operón implicado en la glicosilación de proteínas, por ejemplo, N-glicosilación de proteínas. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, una célula hospedadora descrita en el presente documento comprende un genoma en el que se ha insertado uno o más de los siguientes: ADN que codifica una oligosacariltransferasa, ADN que codifica una glicosiltransferasa, ADN que codifica una proteína transportadora, ADN que comprende un agrupamiento de genes rfb, ADN que comprende un agrupamiento de genes de polisacárido capsular, ADN que codifica una flipasa, ADN que codifica una epimerasa, ADN que codifica una proteína asociada con un agrupamiento de genes de polisacárido capsular, ADN que codifica una proteína implicada en el ensamblaje de polisacárido capsular, ADN que codifica una proteína implicada en el ensamblaje del antígeno O, ADN que codifica una proteína implicada en el ensamblaje de lipopolisacárido y/o ADN que codifica una proteína implicada en el ensamblaje de lipooligosacárido. En una realización específica, la célula hospedadora es E. co/i.
Células hospedadoras que producen bioconjugados de Pseudomonas
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora procariota modificada que comprende ácidos nucleicos que codifican enzimas capaces de producir un bioconjugado que comprende un antígeno de Pseudomonas. Dichas células hospedadoras pueden expresar naturalmente ácidos nucleicos específicos para la producción de un antígeno de Pseudomonas, o se puede hacer que las células hospedadoras expresen dichos ácidos nucleicos, es decir, en determinadas realizaciones, dichos ácidos nucleicos son heterólogos para las células hospedadoras. En determinadas realizaciones, uno o más de dichos ácidos nucleicos específicos para la producción de un antígeno de Pseudomonas son heterólogos para la célula hospedadora y están integrados en el genoma de la célula hospedadora. En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden ácidos nucleicos que codifican enzimas adicionales activas en la N-glicosilación de proteínas, por ejemplo, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden además un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa y/o uno o más ácidos nucleicos que codifican otras glicosiltransferasas. En determinadas realizaciones, las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora, por ejemplo, una proteína a la que se pueden unir oligosacáridos y/o polisacáridos para formar un bioconjugado. En una realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora procariota modificada que comprende ácidos nucleicos que codifican enzimas capaces de producir un bioconjugado que comprende un antígeno de Pseudomonas, en donde dicha célula hospedadora comprende un agrupamiento rfb de Pseudomonas o una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas se integra en el genoma de dicha célula hospedadora. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa. En otra realización específica, dicha célula hospedadora comprende un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, pglB de Campylobacter jejuni). En otra realización específica, dicho ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, pglB de Campylobacter jejuni) se integra en el genoma de la célula hospedadora. En una realización específica, dicha célula hospedadora comprende un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora procariota modificada que comprende (i) un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicho agrupamiento rfb se integra en el genoma de dicha célula hospedadora; (ii) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, pglB de Campylobacter jejuni), en donde dicho ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa se integra en el genoma de la célula hospedadora; y (iii) una proteína transportadora, en donde dicha proteína transportadora es portada por un plásmido o se integra en el genoma de la célula hospedadora. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En otra realización específica, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora procariota modificada que comprende (i) una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicha glicosiltransferasa se integra en el genoma de dicha célula hospedadora; (ii) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, pglB de Campylobacter jejuni), en donde dicho ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa se integra en el genoma de la célula hospedadora; y (iii) una proteína transportadora, en donde dicha proteína transportadora es portada por un plásmido o se integra en el genoma de la célula hospedadora. En otra realización específica, dicha glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa. En otra realización específica, la célula hospedadora es E. coli.
En una realización específica, el agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb o glicosiltransferasa de un agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb o glicosiltransferasa de serotipo 01, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, 010, O 11,012, 013, 014, 015, O16, O17, O18, O19 u O20 de Pseudomonas.
En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa es el agrupamiento rfb de uno cualquiera de los serotipos descritos en Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb o glicosiltransferasa de la cepa PAK de Pseudomonas del serotipo O6. En una realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas o glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb o glicosiltransferasa de serotipo O11 de Pseudomonas, por ejemplo, cepa PA103 de Pseudomonas aeruginosa (véase, por ejemplo, número de registro de GenBank KF364633.1). En una realización específica, los genes que codifican una
enzima formiltransferasa (GenBank: EOT23134.1; ID proteína NCBI: PAK_01412; SEQ ID NO:2) y una polimerasa wzy (GenBank: EOT19368.1; ID proteína NCBI: PAK_01823; SEQ ID NO:3) se introducen (por ejemplo, por medio de plásmido o integración) además de dicho agrupamiento rfb de la cepa PAK de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa con el fin de extenderlo funcionalmente.
En una realización específica, una célula hospedadora procariota modificada proporcionada en el presente documento comprende un ácido nucleico que codifica una formiltransferasa. En otra realización específica, dicha formiltransferasa es la formiltransferasa presentada en la SEQ ID NO:2, o un homólogo de la misma. En otra realización específica, dicha formiltransferasa se incorpora (por ejemplo, se inserta en el genoma de o el plásmido expresado por) en dicha célula hospedadora como parte de un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas ha sido modificado para comprender la formiltransferasa. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En otra realización específica, una célula hospedadora procariota modificada proporcionada en el presente documento comprende un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3. En otra realización específica, dicha polimerasa wzy es la polimerasa wzy presentada en la SEQ ID NO:3. En otra realización específica, dicha polimerasa wzy se incorpora (por ejemplo, se inserta en el genoma de o el plásmido expresado por) en dicha célula hospedadora como parte de un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas ha sido modificado para comprender la polimerasa wzy. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En otra realización específica, una célula hospedadora procariota modificada proporcionada en el presente documento comprende (i) un ácido nucleico que codifica una formiltransferasa y (ii) un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3. En una realización específica, dicha formiltransferasa es la formiltransferasa presentada en la SEQ ID NO:2, o un homólogo de la misma. En otra realización específica, dicha polimerasa wzy es la polimerasa wzy presentada en la SEQ ID NO:3. En una realización específica, dicha formiltransferasa y dicha polimerasa wzy se incorporan (por ejemplo, se insertan en el genoma de o el plásmido expresado por) en dicha célula hospedadora como parte de un agrupamiento rfb de Pseudomonas, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas ha sido modificado para comprender la formiltransferasa y la polimerasa wzy. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas es un agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
Ácidos nucleicos que codifican formiltransferasas y ácidos nucleicos que codifican polimerasas wzy que se usan para generar agrupamientos rfb de Pseudomonas, por ejemplo, agrupamientos rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa modificados, se pueden insertar en el agrupamiento rfb en múltiples posiciones y en múltiples orientaciones.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena abajo de los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena abajo del gen wbpM del agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena arriba de los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan cadena abajo del gen wzz del agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan en el sentido de las agujas del reloj en relación con los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, el gen que codifica dicha formiltransferasa y/o el gen que codifica dicha polimerasa wzy se insertan en sentido contrario a las agujas del reloj en relación con los genes del agrupamiento rfb de Pseudomonas, por ejemplo, el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una célula hospedadora procariota modificada que comprende ácidos nucleicos que codifican enzimas capaces de producir un bioconjugado que comprende un antígeno O6 de Pseudomonas. En una realización específica, dicha célula hospedadora comprende el agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa, un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la s Eq ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3, y una formiltransferasa. En una realización específica, la polimerasa wzy es la polimerasa wzy de O6 de P. aeruginosa (SEQ ID NO:3), o un homólogo de la misma (por ejemplo, la polimerasa wzy de la cepa PAK o LESB58 de Pseudomonas aeruginosa). En otra realización específica, la formiltransferasa es la formiltransferasa de O6 de P. aeruginosa (SEQ ID NO:2), o un homólogo de la misma (por ejemplo, la formiltransferasa de la cepa PAK o LESB58 de Pseudomonas aeruginosa). En determinadas realizaciones, uno o más de los ácidos nucleicos que codifican el agrupamiento rfb, la polimerasa wzy y/o la formiltransferasa se insertan en el genoma de la célula hospedadora, por ejemplo, usando un método descrito en el presente documento. En una realización específica, cada uno de los ácidos nucleicos que codifican el agrupamiento rfb, la polimerasa wzy y la formiltransferasa se insertan en el genoma de la célula hospedadora, por ejemplo, usando un método descrito en el presente documento. En determinadas realizaciones, la célula hospedadora comprende además un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa (por ejemplo, pglB de Campylobacter jejuni), en donde dicho ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa es portado por un plásmido o se integra en el genoma de la célula hospedadora; y un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora, en donde dicho ácido nucleico que codifica dicha proteína transportadora es portado por un plásmido o se integra en el genoma de la célula hospedadora. En una realización específica, dicho ácido nucleico que codifica dicha oligosacariltransferasa se integra en el genoma de la célula hospedadora.
Acervo genético
Las células hospedadoras de ejemplo que se pueden usar para generar las células hospedadoras modificadas descritas en el presente documento incluyen, sin limitación, especies de Escherichia, especies de Shigella, especies de Klebsiella, especies de Xhantomonas, especies de Salmonella, especies de Yersinia, especies de Lactococcus, especies de Lactobacillus, especies de Pseudomonas, especies de Corynebacterium, especies de Streptomyces, especies de Streptococcus, especies de Staphylococcus, especies Bacillus y especies de Clostrídium. En una realización específica, la célula hospedadora usada en el presente documento es E. coli.
En determinadas realizaciones, el acervo genético de la célula hospedadora es modificado por, por ejemplo, deleción de uno o más genes. Genes de ejemplo que se pueden delecionar en las células hospedadoras (y, en algunos casos, reemplazar con otras secuencias de ácido nucleico deseadas) incluyen genes de células hospedadoras implicadas en la biosíntesis de glicolípidos, tales como waaL (véase, por ejemplo, Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), el agrupamiento del antígeno O (rfb o wb), el agrupamiento del antígeno enterobacteriano común (wec), el agrupamiento de biosíntesis del núcleo del lípido A (waa), y agrupamientos de modificación del antígeno O de profago como el agrupamiento gtrABS. En una realización específica, las células hospedadoras descritas en el presente documento se modifican de modo que no produzcan ningún antígeno O que no sea el antígeno O deseado a partir de, por ejemplo, un antígeno O de Pseudomonas. En una realización específica, uno o más del gen waaL, el gen gtrA, el gen gtrB, el gen gtrS o un gen o genes del agrupamiento wec o un gen o genes del agrupamiento rfb de genes se delecionan o inactivan funcionalmente del genoma de una célula hospedadora procariota proporcionada en el presente documento. En una realización, una célula hospedadora usada en el presente documento es E. coli, en donde el gen waaL, el gen gtrA, el gen gtrB, el gen gtrS se delecionan o inactivan funcionalmente del genoma de la célula hospedadora. En otra realización, una célula hospedadora usada en el presente documento es E. coli, en donde el gen waaL y el gen gtrS se delecionan o inactivan funcionalmente del genoma de la célula hospedadora. En otra realización, una célula hospedadora usada en el presente documento es E. coli, en donde el gen waaL y los genes del agrupamiento wec se delecionan o inactivan funcionalmente del genoma de la célula hospedadora.
Proteínas transportadoras
Cualquier proteína transportadora adecuada para su uso en la producción de vacunas conjugadas (por ejemplo, bioconjugados para su uso en vacunas) puede usarse en el presente documento, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican la proteína transportadora se pueden introducir en un hospedador proporcionado en el presente documento para la producción de un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a antígeno de Pseudomonas. Proteínas transportadoras de ejemplo incluyen, sin limitación, exotoxina A destoxificada de P. aeruginosa (EPA; véase, por ejemplo, Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, proteína de unión a maltosa (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A destoxificada de S. aureus, factor de agregación A, factor de agregación B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes destoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes destoxificadas de la toxina colérica, proteína Sat de E. coli, el dominio de pasajero de la proteína Sat de E. coli, neumolisina de Streptococcus pneumoniae y variantes destoxificadas de la misma, AcrA de C. jejuni, proteína PcrV de Pseudomonas y glicoproteínas naturales de C. jejuni.
En realizaciones específicas, las proteínas transportadoras expresadas por las células hospedadoras modificadas proporcionadas en el presente documento se expresan a partir de un ácido nucleico que se ha integrado en el genoma de la célula hospedadora modificada. Es decir, un ácido nucleico que codifica la proteína transportadora se ha integrado en el genoma de la célula hospedadora. En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras expresadas por las células hospedadoras modificadas proporcionadas en el presente documento se expresan a partir de un plásmido que se ha introducido en la célula hospedadora modificada.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras usadas en la generación de los bioconjugados descritos en el presente documento se modifican, por ejemplo, se modifican de modo que la proteína sea menos tóxica y/o más susceptible a la glicosilación. En una realización específica, las proteínas transportadoras usadas en la generación de los bioconjugados descritos en el presente documento se modifican de modo que el número de sitios de glicosilación en las proteínas transportadoras se maximiza de una manera que permite administrar concentraciones más bajas de la proteína, por ejemplo, en una composición inmunógena, en su forma de bioconjugado.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras descritas en el presente documento se modifican para incluir 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sitios de glicosilación de los que normalmente estarían asociados con la proteína transportadora (por ejemplo, en relación con el número de sitios de glicosilación asociados con la proteína transportadora en su estado nativo/natural, por ejemplo, de ''tipo silvestre"). En realizaciones específicas, la introducción de sitios de glicosilación se logra mediante la inserción de secuencias consenso de glicosilación (por ejemplo, Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro; o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (véase el documento WO 2006/119987)) en cualquier parte de la estructura primaria de la proteína. La introducción de dichos sitios de glicosilación se puede lograr, por ejemplo, añadiendo nuevos aminoácidos a la estructura primaria de la proteína (es decir, se añaden los sitios de glicosilación, en su totalidad o en parte), o mutando aminoácidos existentes en la proteína para generar los sitios de glicosilación (es decir, aminoácidos no se añaden a la proteína, sino aminoácidos seleccionados de la proteína se mutan para formar sitios de glicosilación). Los expertos en la materia reconocerán que la secuencia de aminoácidos de una proteína se puede modificar fácilmente usando enfoques conocidos en la técnica, por ejemplo, enfoques recombinantes que incluyen la modificación de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína. En realizaciones específicas, las secuencias de consenso de glicosilación se introducen en regiones específicas de la proteína transportadora, por ejemplo, estructuras superficiales de la proteína, en los extremos N o C de la proteína y/o en bucles que están estabilizados por puentes disulfuro en la base de la proteína. En determinadas realizaciones, la secuencia consenso de glicosilación de 5 aminoácidos clásica puede extenderse mediante residuos de lisina para una glicosilación más eficiente y, por tanto, la secuencia consenso insertada puede codificar 5, 6 o 7 aminoácidos que deben insertarse o que reemplazan los aminoácidos de la proteína aceptora.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras usadas en la generación de los bioconjugados descritos en el presente documento comprenden una "etiqueta", es decir, una secuencia de aminoácidos que permite el aislamiento y/o identificación de la proteína transportadora. Por ejemplo, añadir una etiqueta a una proteína transportadora descrita en el presente documento puede ser útil en la purificación de esa proteína y, por tanto, la purificación de vacunas conjugadas que comprenden la proteína transportadora etiquetada. Etiquetas de ejemplo que se pueden usar en el presente documento incluyen, sin limitación, etiquetas de histidina (HIS) (por ejemplo, etiqueta de hexahistidina o etiqueta 6XHis), etiquetas FLAG-TAG y HA. En determinadas realizaciones, las etiquetas usadas en el presente documento son extraíbles, por ejemplo, retirada por agentes químicos o por medios enzimáticos, una vez que ya no son necesarias, por ejemplo, después de que la proteína ha sido purificada.
En determinadas realizaciones, las proteínas transportadoras descritas en el presente documento comprenden una secuencia señal que dirige la proteína transportadora al espacio periplásmico de la célula hospedadora que expresa la proteína transportadora. En una realización específica, la secuencia de la señal es de DsbA de E. coli, porina A de la membrana externa (OmpA) de E. coli, proteína de unión a maltosa (MalE) de E. coli, pectato liasa (PelB) de Erwinia carotovorans, FlgI, NikA, o endoxilanasa (XynA) de Bacillus sp., enterotoxina termolábil LTIIb de E. coli, endoxilanasa XynA de Bacillus o flagelina (FlgI) de E. coli.
Maquinaria de glicosilación
Oligosacariltransferasas
Las oligosacariltransferasas transfieren oligosacáridos unidos a lípidos a residuos de asparagina de cadenas polipeptídicas nacientes que comprenden un motivo de consenso de N-glicoxilación, por ejemplo, Asn-X-Ser(Thr), en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro; o Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro (véase el documento WO 2006/119987). Véanse, por ejemplo, WO 2003/074687 y WO 2006/119987.
Las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento comprenden un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa. El ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa puede ser nativo de la célula hospedadora o puede introducirse en la célula hospedadora usando enfoques genéticos, como se ha descrito anteriormente. La oligosacariltransferasa puede ser de cualquier fuente conocida en la técnica. En una realización específica, la oligosacariltransferasa es una oligosacariltransferasa de Campylobacter. En otra realización específica, la oligosacariltransferasa es una oligosacariltransferasa de Campylobacter jejuni (es decir, pglB; véase, por ejemplo, Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793; véase también, por ejemplo, ID gen de NCBI: 3231775, número de registro de UniProt 086154). En otra realización específica, la oligosacariltransferasa es una oligosacariltransferasa de Campylobacter lari (véase, por ejemplo, ID gen de NCBI: 7410986).
En una realización específica, las células hospedadoras modificadas proporcionadas en el presente documento comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa se integra en el genoma de la célula hospedadora.
Enzimas accesorias
En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos que codifican una o más enzimas accesorias se introducen en las células hospedadoras modificadas descritas en el presente documento. Dichos ácidos nucleicos que codifican una o más enzimas accesorias pueden ser potados por plásmidos o integrarse en el genoma de las células hospedadoras descritas en el presente documento. Enzimas accesorias de ejemplo incluyen, sin limitación, epimerasas, enzimas de ramificación, modificación, amidación, regulación de la longitud de cadena, acetilación, formilación, polimerización.
Se conocen en la técnica secuencias de ácido nucleico que codifican epimerasas que pueden insertarse en las células hospedadoras descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, la epimerasa insertada en una célula hospedadora descrita en el presente documento es una epimerasa descrita en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N.° WO 2011/062615. En una realización específica, la epimerasa es la epimerasa codificada por el gen Z3206 de E. co licepa 0157. Véase, por ejemplo, el documento WO 2011/062615 y Rush et al., 2009, The Journal of Biological Chemistry 285:1671-1680. En una realización específica, las células hospedadoras modificadas proporcionadas en el presente documento comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una epimerasa, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que codifica una epimerasa se integra en el genoma de la célula hospedadora.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una formiltransferasa se inserta en o es expresada por las células hospedadoras descritas en el presente documento. Las formiltransferasas son enzimas que catalizan la transferencia de un grupo formilo a una molécula aceptora. En una realización específica, una secuencia de ácido nucleico que codifica la formiltransferasa de O6 de Pseudomonas aeruginosa fmtO6 (SEQ ID NO:2), o un homólogo de la misma (por ejemplo, la polimerasa wzy de la cepa PAK o LESB58 de Pseudomonas aeruginosa), se inserta en o es expresada por las células hospedadoras descritas en el presente documento. En otra realización específica, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad u homología con la SEQ ID NO:2 se inserta en o es expresada por las células hospedadoras descritas en el presente documento.
Se conocen determinadas formiltransferasas implicadas en la biosíntesis de polisacáridos, y pueden insertarse en o ser expresadas por las células hospedadoras descritas en el presente documento. Por ejemplo, vioF es una enzima de serotipo O30 de P. alcalifaciens, que es un 48 % idéntica a la formiltransferasa de Francisella tularensis (Nagaraja et al. 2005). Convierte dTDP-D-Qui4N en dTDP-D-Qui4NFo y está implicada en la biosíntesis del antígeno O (Liu et al. 2012, Glycobiology 22(9): 1236-1244). Otra formiltransferasa implicada en la biosíntesis de polisacáridos es arnA (por ejemplo, de E. coli), una enzima bifuncional en la que el dominio N-terminal convierte UDP-Ara4N en UDP-AraNFo, mientras que el dominio C-terminal está implicado en la descarboxilación oxidativa de UDP-ácido glucurónico. Ambas actividades enzimáticas son necesarias para la modificación L-Ara4N de LipidA y la resistencia a la polimixina (Breazeale et al., 2005, The Journal of Biological Chemistry 280(14): 14154-14167). Otra formiltransferasa implicada en la biosíntesis de polisacáridos es wekD, una enzima de serotipo 0119 de E. coli, implicada en la biosíntesis de TDP-DRhaNAc3NFo (Anderson et al., 1992, Carbohydr Res. 237:249-62).
Además, se han caracterizado dominios que están relacionados con la actividad de formiltransferasa. El llamado dominio FMT_core está presente en la mayoría de las formiltransferasas. Los ejemplos incluyen la metionil-ARNt formiltransferasa, fosforribosilglicinamida formiltransferasa 1, UDP-ácido glucurónico descarboxilasa/UDP-4-amino-4-desoxi-L-arabinosa formiltransferasa, vioF de O30 de Providencia alcalifaciens, y arnA de E. coli. Las formiltransferasas mencionadas anteriormente utilizan FTHF (N-10-formiltetrahidrofolato) como donante de formilo. Asimismo, las enzimas productoras de formiato que utilizan FTHF (10-formiltetrahidrofolato) como sustrato contienen este dominio. Además, AI-CARFT está presente en la fosforribosilaminoimidazolcarboxamida formiltransferasa/IMP ciclohidrolasa y FDH_GDH está presente en la fosforribosilglicinamida formiltransferasa 2.
En determinadas realizaciones, una secuencia de ácido nucleico que codifica una polimerasa del antígeno O (gen wzy) que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3 se inserta en o es expresada por las células hospedadoras descritas en el presente documento. Las polimerasas del antígeno O son proteínas transmembrana de múltiples dominios. Utilizan unidades de repetición de antígeno O unidas a undecaprenilpirofosfato como sustratos para generar un polímero lineal que consiste en las unidades de repetición. Las polimerasas del antígeno O (wzy) están presentes en bacterias Gram negativas que sintetizan polímeros del antígeno O a través de un mecanismo dependiente de wzy.
En una realización específica, una secuencia de ácido nucleico que codifica la polimerasa wzy de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:3), o un homólogo de la misma que tiene aproximadamente o al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO:3 (por ejemplo, la polimerasa wzy de la cepa PAK o LESB58 de Pseudomonas aeruginosa), se inserta en o es expresada por las células hospedadoras descritas en el presente documento. Los ejemplos de bacterias que se sabe que comprenden polimerasas wzy incluyen Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri y Salmonella typhimurium. En otra realización específica, una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad u homología con la SEQ ID NO:3 se inserta en o es expresada por las células hospedadoras descritas en el presente documento.
Número de copias del gen
En determinadas realizaciones, el número de copias de un gen o genes integrados en una célula hospedadora modificada proporcionada en el presente documento es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. En una realización específica, el número de copias de un gen o genes integrados en una célula hospedadora modificada proporcionada en el presente documento es 1 o 2.
Beneficios
Las células hospedadoras modificadas descritas en el presente documento son de particular importancia y relevancia comercial, ya que permiten la fermentación a gran escala de bioconjugados que comprenden antígenos de Pseudomonas que se pueden usar como agentes terapéuticos (por ejemplo, en composiciones inmunógenas, vacunas), con un menor riesgo debido a la mayor estabilidad del ADN insertado cromosómicamente y, por tanto, a la expresión del ADN de interés durante la fermentación. Las células hospedadoras modificadas descritas en el presente documento son ventajosas sobre las células hospedadoras que se basan en la expresión portada por plásmidos de ácidos nucleicos necesarios para la generación de los bioconjugados descritos en el presente documento porque, entre otras cosas, no se requiere la selección de antibióticos durante la fermentación una vez que el ADN heterólogo se inserta en el genoma de la célula hospedadora. Es decir, cuando el ADN de inserto se inserta en el cromosoma, no es necesario que sea seleccionado, porque se propaga junto con la replicación del genoma del hospedador. Además, es una desventaja conocida en los sistemas portados por plásmidos que con cada generación (es decir, ciclo de replicación de la célula hospedadora) aumenta el riesgo de perder el plásmido. Esta pérdida de plásmido se debe a la distribución a veces inapropiada de plásmidos a las células hijas en la fase de separación celular durante la división celular. A gran escala, los cultivos de células bacterianas se duplican más a menudo que a escalas de fermentación más pequeñas para alcanzar altas densidades celulares. Por tanto, una mayor estabilidad celular y la expresión del ADN de inserto conducen a mayores rendimientos del producto, proporcionando una clara ventaja. Además, la estabilidad celular es un criterio de aceptación del proceso para su aprobación por parte de las autoridades reguladoras, mientras que la selección de antibióticos generalmente no se desea durante la fermentación por diversas razones, por ejemplo, los antibióticos presentes como impurezas en los productos médicos finales y conlleva el riesgo de causar reacciones alérgicas, y los antibióticos pueden promover la resistencia a antibióticos (por ejemplo, por transferencia de genes o selección de patógenos resistentes).
La presente solicitud proporciona células hospedadoras modificadas para su uso en la fabricación de bioconjugados que comprenden antígenos de Pseudomonas que se pueden usar como agentes terapéuticos (por ejemplo, en composiciones inmunógenas, vacunas), en donde determinados elementos genéticos necesarios para impulsar la producción de bioconjugados se integran de forma estable en el genoma de la célula hospedadora. En consecuencia, la célula hospedadora puede contener un número reducido de plásmidos, solo un único plásmido o ningún plásmido en absoluto. En algunas realizaciones, la presencia de un único plásmido puede dar como resultado una mayor flexibilidad de la cepa de producción y la capacidad de cambiar la naturaleza de la conjugación (en términos de su contenido de sacárido o proteína transportadora), lo que conduce fácilmente a una mayor flexibilidad de la cepa de producción.
En general, una reducción en el uso de plásmidos conduce a una cepa de producción que es más adecuada para su uso en la producción de medicamentos. Un inconveniente de que el material genético esencial esté presente en los plásmidos es el requisito de presión de selección para mantener los elementos episómicos en la célula hospedadora. La presión de selección requiere el uso de antibióticos, que es indeseable para la producción de medicamentos debido a, por ejemplo, el peligro de reacciones alérgicas a los antibióticos y los costes adicionales de fabricación. Además, la presión de selección a menudo no es completa, dando como resultado cultivos bacterianos no homogéneos en los que algunos clones han perdido el plásmido y, por tanto, no producen el bioconjugado. Las células hospedadoras descritas en el presente documento, por lo tanto, son capaces de producir un producto más seguro que se puede obtener con altos rendimientos.
5.2 Métodos de integración/introducción de ácidos nucleicos en células hospedadoras
Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para integrar un ácido nucleico (por ejemplo, un gen o un operón, por ejemplo, agrupamiento rfb) en el genoma de una célula hospedadora.
En una realización específica, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras descritas en el presente documento usando el método de inserción descrito en la Solicitud de Patente Internacional n.° PCT/EP2013/071328. De acuerdo con este método, grandes secuencias contiguas de ADN pueden insertarse de forma estable directamente en el genoma de una célula hospedadora. En resumen, el método comprende algunas o todas las etapas siguientes:
Etapa 1: Se crea un plásmido donante. Una secuencia de ADN de inserto heterólogo deseada (es decir, una secuencia de ADN de inserto heterólogo que comprende uno o más genes de interés) se clona en un sitio de clonación (por ejemplo, un sitio de clonación múltiple, abreviado como MCS) de un plásmido adecuado para su uso como plásmido donante. Las secuencias de ADN adecuadas para su uso como regiones de homología (es decir, secuencias de ADN homólogas a la ubicación de inserción en el genoma de la célula hospedadora) también se clonan en el plásmido donante, de modo que las regiones de homología flanquean el ADN de inserto heterólogo. Estos métodos de clonación y ensamblaje del plásmido donante se pueden realizar de acuerdo con cualquier tecnología establecida y bien conocida para modificar y sintetizar ADN, tal como, sin limitación, clonación molecular usando enzimas de restricción y ligasa, transposasas, síntesis química, etc., tecnologías que son conocidas por los expertos en la materia.
En determinadas realizaciones, un casete de selección que comprende un marco de lectura abierto que codifica una proteína que confiere resistencia a los antibióticos se coloca entre los brazos de homología. Las células hospedadoras que comprenden el ADN de inserto heterólogo insertado en su genoma pueden identificarse cultivándolas en medios que comprenden el antibiótico al que el gen de resistencia a antibióticos del casete de selección proporciona resistencia. En determinadas realizaciones, un casete de selección puede estar flanqueado por sitios FRT, que permiten la eliminación posterior del casete mediante recombinación dirigida al sitio. La incorporación de sitios FRT de esta manera en el plásmido donante asegura, por tanto, que el casete de selección no permanezca integrado en el genoma de la célula hospedadora. En otra realización, el casete de selección se puede eliminar después de la integración por medio de recombinación homóloga dirigida al sitio mediada por el sitio dif o mediante otras, tecnologías de mutagénesis cromosómica dirigida al sitio.
Los plásmidos donantes pueden diseñarse además para comprender un marco de lectura abierto que codifica una proteína de contraselección. Cualquier gen que codifique una proteína conocida por los expertos en la materia adecuada para su uso en enfoques de contraselección puede incorporarse en los plásmidos donantes descritos en el presente documento. En una realización específica, se usa el gen sacB para contraselección.
Los plásmidos donantes pueden diseñarse además para comprender un origen de replicación. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que el origen de replicación incorporado en el plásmido donante debe ser adecuado para su uso en la célula hospedadora que está experimentando una modificación del genoma. Por ejemplo, un origen de replicación de E. coli debe estar presente cuando se está realizando clonación en E. coli. En una realización específica, el origen de replicación es oriT. Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los plásmidos lanzadera (es decir, plásmidos capaces de replicarse en múltiples células hospedadoras, por ejemplo, múltiples especies bacterianas) pueden generarse usando métodos conocidos en la técnica, y dichos plásmidos podrían usarse para la inserción en numerosos tipos de células hospedadoras, por ejemplo, células procariotas, células arqueales, células eubacterianas o células eucariotas. Dichos plásmidos lanzadera pueden comprender elementos de control de la expresión y orígenes de replicación específicos de organismo.
Etapa 2: Se crea un plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar está diseñado para codificar todas las actividades necesarias para mediar la inserción de ADN en las células hospedadoras y para el mantenimiento del plásmido auxiliar dentro de las células hospedadoras que experimentan recombinación. En determinadas realizaciones, los plásmidos auxiliares comprenden (i) un casete de selección para el mantenimiento del plásmido en la célula hospedadora, (ii) un regulón para la expresión de una recombinasa, es decir, una enzima o enzimas que apoyan y mejoran la eficiencia de entrecuzamiento entre tramos de ADN homólogos, (iii) un regulón para la expresión de una función que linealiza el inserto de ADN dando como resultado secuencias homólogas terminales que pueden experimentar una recombinación homóloga, (iv) un regulón que expresa un homólogo de RecA para células hospedadoras que no tienen una copia de recA propia y (v) un origen de replicación condicional.
En determinadas realizaciones, los plásmidos auxiliares comprenden componentes similares al plásmido auxiliar pTKRED (Genbank GU327533.1). En una realización específica, el plásmido auxiliar pTKRED (Genbank GU327533.1) se usa en el método.
Etapa 3: El plásmido donante y el plásmido auxiliar se introducen en la misma célula hospedadora. La inserción de plásmidos donantes y auxiliares se puede realizar mediante muchas tecnologías diferentes conocidas por los expertos en la materia, que incluyen, sin limitación, electroporación, uso de células químicamente competentes, choque térmico y transducción de fagos. A continuación, las células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones selectivas para enriquecer las células que portan los plásmidos introducidos.
Etapa 4: Se inicia el procedimiento de inserción. Un procedimiento de inserción de ejemplo comprende las siguientes etapas: se pueden cultivar durante la noche cultivos de clones positivos (es decir, células hospedadoras que comprenden tanto el plásmido auxiliar como el donante) a, por ejemplo, 30 °C en medios que comprenden los antibióticos apropiados para la selección (los expertos en la materia pueden seleccionar fácilmente dichos antibióticos basándose en los casetes de selección presentes en los plásmidos donantes/auxiliares). A continuación, los cultivos se pueden diluir y cultivar a, por ejemplo, 30 °C hasta fase exponencial en presencia de antibióticos apropiados. En estas condiciones, los plásmidos auxiliares y donantes se mantienen, pero silenciosos. A continuación, el medio se reemplaza por medio que contiene los antibióticos para la selección, así como cualquier inductor de elementos condicionales (por ejemplo, promotores inducibles u orígenes de replicación condicionales) presentes en los plásmidos, seguido de una incubación adicional de las células. Durante este tiempo, la endonucleasa de restricción (por ejemplo, Scei) en el plásmido auxiliar y la recombinasa (por ejemplo, recombinasa roja lambda) en el plásmido auxiliar se expresan, conduciendo a la escisión del plásmido donante en los brazos de homología y la recombinación homóloga del ADN de homología en los sitios homólogos en el genoma de la célula hospedadora. A continuación, las células se siembran en medio que contiene el componente al que corresponde el marcador de contraselección del plásmido donante (por ejemplo, sacarosa si el marcador de contraselección es sacB). Esta etapa da como resultado la contraselección de células que comprenden el plásmido donante, es decir, células en las que el plásmido donante existe en un estado no insertado. Dicho medio también comprende el marcador de resistencia presente en el casete de inserción del plásmido donante (es decir, el casete de resistencia al antibiótico que está presente entre el HR del plásmido donante, para seleccionar células que contienen el ADN de inserto heterólogo. Después de una incubación durante la noche, a continuación, las células se criban en busca de clones recombinados que muestren un fenotipo de resistencia a los antibióticos compatible con (i) la pérdida de los plásmidos auxiliares y donantes y (ii) la presencia del inserto de ADN heterólogo.
Además de los métodos de inserción descritos anteriormente, el ADN se puede insertar en el genoma de una célula hospedadora usando otros enfoques. En determinadas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora usando cualquier método de inserción específico de sitio conocido en la técnica. En determinadas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora usando cualquier método de integración aleatoria conocido en la técnica. Dichos métodos se describen con mayor detalle a continuación.
En determinadas realizaciones, El ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando un método que comprende inserción mediada por transposón. Dicha inserción aleatoria permite la inserción de ADN de interés en múltiples ubicaciones del genoma de la célula hospedadora y, por tanto, permite la identificación de sitios de inserción óptimos en las células hospedadoras en las que se ha insertado el ADN, por ejemplo, las células hospedadoras que portan el ADN insertado pueden compararse entre sí con respecto a la eficiencia de producción del ADN insertado y las células hospedadoras con la mayor eficiencia pueden seleccionarse para uso futuro. Los métodos de inserción mediada por transposón de secuencias de ácido nucleico en genomas de células hospedadoras son conocidos en la técnica. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el sistema de suministro pUTminiTn5 (Biomedical; Sevilla, España) se usa para insertar genes de forma estable en los genomas de las células hospedadoras (tales como células hospedadoras bacterianas). Las cepas en las que se ha insertado el ADN pueden identificarse y aislarse. Véase también Herrero et al., 1990, J. Bacteriology 172(11):6557-6567 y DeLorenzo et al., 1990, J. Bacteriology 172(11):6568-6572. Además, en determinadas realizaciones, la inserción de ADN mediada por transposón en el genoma de una célula hospedadora se logra usando un método de inserción de ADN basado en Tn-7. Véase McKenzie et al., 2006, BMC Microbiology 6:39 y Sibley et al., 2012, Nucleic Acids Res. 40:e19.
En determinadas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando el kit StabyCloning™ o el kit StabyCodon T7 (Delphi Genetics, Charleroi, Bélgica), que permiten la clonación de ADN específica de sitio.
En determinadas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando el método de "clonointegración" de clonación e integración cromosómica de ADN. Véase St. Pierre et al, 2013, ACS Synthetic Biology 2:537-541.
En determinadas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando un método que implica plásmidos de replicación condicional, integración y modulares (CRIM), como lo describen Haldimann y Wanner, 2001, J. Bacteriology 183:6384-6393.
En determinadas realizaciones, el ADN se inserta en el genoma de una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli) usando ingeniería de recombinación, un método descrito por, por ejemplo, Sharan et al., 2009, Nat. Protoc. 4:206-223; Yu et al., 2000, PNAS USA 97:5978-5983; Kuhlman et al., 2010, Nucleic Acids Res. 38:e92; y Zhang et al., 1998, Nat. Genet. 20:123-128.
En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras modificadas descritas en el presente documento mediante electroporación, transformación química por choque térmico, transformación natural, transducción de fagos y/o conjugación. En realizaciones específicas, los ácidos nucleicos heterólogos se introducen en las células hospedadoras descritas en el presente documento usando un plásmido, por ejemplo, los ácidos nucleicos heterólogos se expresan en las células hospedadoras mediante un plásmido (por ejemplo, un vector de expresión), y el plásmido se introduce en las células hospedadoras modificadas mediante electroporación, transformación química por choque térmico, transformación natural, transducción de fagos o conjugación.
En una realización específica, una secuencia de ácido nucleico aislada se integra en una célula hospedadora (por ejemplo, E. coli), en donde dicho ácido nucleico codifica un agrupamiento rfb de Pseudomonas modificado, por ejemplo, agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas modificado comprende (i) un gen que codifica una formiltransferasa (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO:2 o un homólogo de la misma), (ii) un gen que codifica una polimerasa wzy (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO3 o un homólogo de la misma que tiene aproximadamente o al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO:3); o (iii) un gen que codifica una formiltransferasa (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO:2 o un homólogo de la misma) y un gen que codifica una polimerasa wzy (por ejemplo, un gen que codifica la SEQ ID NO:3 o un homólogo de la misma que tiene aproximadamente o al menos un 80 % de identidad con la SEQ ID NO:3).
5.3 Bioconjugados
Las células hospedadoras modificadas descritas en el presente documento se pueden usar para producir bioconjugados que comprenden un antígeno de Pseudomonas unido a una proteína transportadora. Los métodos de producción de bioconjugados usando células hospedadoras son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, WO 2003/074687 y WO 2006/119987. Los bioconjugados, como se describe en el presente documento, tienen propiedades ventajosas sobre los conjugados químicos de antígeno-proteína transportadora, ya que requieren menos productos químicos en la fabricación y son más consistentes en términos del producto final generado.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno de Pseudomonas. En una realización específica, dicho antígeno de Pseudomonas es un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende un antígeno O de P. aeruginosa y una proteína transportadora, en donde dicha proteína transportadora es EPA, PcrV (alias LcrV, EspA, SseB), PopB (YobB, YopD, FliC) u OprF, Oprl.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho antígeno O de Pseudomonas aeruginosa es un antígeno O de serotipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, 010, O11,012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 u O20 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho antígeno O de Pseudomonas aeruginosa es uno de los serotipos descritos en Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho antígeno O de Pseudomonas aeruginosa es un antígeno O de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho antígeno O de Pseudomonas aeruginosa es un antígeno O de serotipo O11 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, dicho antígeno O de serotipo 011 de Pseudomonas aeruginosa es de la cepa PA103 de Pseudomonas aeruginosa (véase, por ejemplo, número de registro de GenBank KF364633.1).
Los bioconjugados descritos en el presente documento se pueden purificar mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una proteína, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía en columna de intercambio iónico, intercambio aniónico, afinidad y de tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Véase, por ejemplo, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (págs. 1-18); véanse también los métodos descritos en el documento WO 2009/104074. Además, los bioconjugados pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas descritas en el presente documento o conocidas de otro modo en la técnica para facilitar la purificación. Las condiciones reales usadas para purificar un bioconjugado particular dependerán, en parte, de la estrategia de síntesis y de factores tales como la carga neta, la hidrofobia y/o hidrofilia del bioconjugado, y serán evidentes para los expertos en la materia.
5.4 Métodos analíticos
Se pueden usar diversos métodos para analizar las composiciones estructurales y las longitudes de la cadena de azúcar de los bioconjugados descritos en el presente documento.
En una realización, se puede usar hidrazinólisis para analizar los glicanos. En primer lugar, los polisacáridos se liberan de sus portadores proteicos mediante incubación con hidrazina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, RU). El nucleófilo hidrazina ataca el enlace glicosídico entre el polisacárido y la proteína transportadora y permite la liberación de los glicanos unidos. Los grupos N-acetilo se pierden durante este tratamiento y deben reconstituirse mediante re-N-acetilación. Los glicanos libres se purifican en columnas de carbono y posteriormente se marcan en el extremo reductor con el fluoróforo 2-amino benzamida. Véase Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB: Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide and an-thranilic acid. Anal Biochem 1995, 230(2):229-238. Los polisacáridos marcados se separan en una columna GlycoSep-N (GL Sciences) de acuerdo con el protocolo HPLC de Royle et al,. Véase Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM: An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glycans from microgram quantities of glycoproteins. Anal Biochem 2002, 304(1):70-90. El cromatograma de fluorescencia resultante indica la longitud del polisacárido y el número de unidades de repetición. La información estructural se puede recopilar mediante la recopilación de picos individuales y, posteriormente, realizando un análisis de MS/MS. De ese modo, se pudo confirmar la composición de monosacáridos y la secuencia de la unidad de repetición y, además, se pudo identificar la homogeneidad de la composición de polisacáridos.
En otra realización, se puede usar SDS-PAGE o electroforesis en gel capilar para evaluar glicanos y bioconjugados. La longitud del polímero para los glicanos del antígeno O se define por el número de unidades de repetición que se ensamblan linealmente. Esto significa que el patrón típico en forma de escalera es una consecuencia de diferentes números de unidades de repetición que componen el glicano. Por tanto, dos bandas una al lado de la otra en SDS PAGE u otras técnicas que se separan por tamaño difieren en una sola unidad de repetición. Estas diferencias discretas se aprovechan cuando se analizan glicoproteínas para determinar el tamaño de los glicanos: La proteína transportadora no glicosilada y el bioconjugado con diferentes longitudes de cadena polimérica se separan de acuerdo con sus movilidades electroforéticas. Se miden el primer número de unidad repetitivo detectable (m) y el número promedio de unidades de repetición (npromedio) presentes en un bioconjugado. Estos parámetros se pueden usar para demostrar la consistencia de lote a lote o la estabilidad de los polisacáridos.
En otra realización, podrían aplicarse MS de alta masa y HPLC de exclusión por tamaño para medir el tamaño de los bioconjugados completos.
En otra realización, se puede usar un ensayo de antrona-ácido sulfúrico para medir los rendimientos de polisacáridos. Véase Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC: Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals: journal of the International Association of Biological Standardization 2008, 36(2): 134-141. En otra realización, se puede usar un ensayo de metilpentosa para medir los rendimientos de polisacárido. Véase, por ejemplo, Disches et al., J Biol Chem. septiembre de 1948;175(2):595-603.
Cambio en el uso del s itio de glicosilación
Para mostrar que el uso del sitio en una proteína específica cambia en un sistema de múltiples plásmidos a diferencia de un sistema insertado, debe cuantificarse el uso del sitio de glicosilación. Los métodos para hacerlo se enumeran a continuación.
LC-MS/MS de glicopéptido: los bioconjugados se digieren con una o más proteasas y los péptidos se separan mediante un método cromatográfico adecuado (columnas C18, HPLC de interacción hidrófila, HILIC, GlycoSepN, SE HPLC, AE HPLC), y los diferentes péptidos se identifican usando MS/MS. Este método se puede usar con o sin acortamiento previo de la cadena de azúcar mediante métodos químicos (degradación de Smith) o enzimáticos. La cuantificación de los picos de glicopéptido usando detección UV de 215 a 280 nm permite la determinación relativa del uso del sitio de glicosilación.
HPLC de exclusión por tamaño: El mayor uso del sitio de glicosilación se refleja en un tiempo de elución más temprano de una columna de SE HPLC.
Homogeneidad
La homogeneidad del bioconjugado (es decir, la homogeneidad de los residuos de azúcar unidos) se puede evaluar usando métodos que miden la longitud del glicano y el radio hidrodinámico.
Otras posibles aplicaciones clínicas/prácticas
Las cepas integradas pueden generar un mayor rendimiento de bioconjugados debido a la carga de selección de antibióticos reducida en comparación con el sistema de tres plásmidos. Además, se produce menos degradación proteolítica debido a la carga metabólica reducida para las células.
Las cepas integradas producen bioconjugados con distribuciones de longitud de polisacáridos más cortas y menos extendidas. Por tanto, los bioconjugados son más fáciles de caracterizar y están mejor definidos. Además, la inserción puede reducir el grado de estrés periplásmico de las células, lo que puede conducir a menos proteólisis del producto durante el proceso de fermentación debido a la carga de selección de antibióticos reducida en comparación con el sistema de tres plásmidos.
Los sistemas de glicosilación de proteínas requieren tres elementos recombinantes en el hospedador de producción: un ADN de expresión de proteína transportadora, un ADN de expresión de oligosacariltransferasa y un ADN de expresión de polisacárido. Los sistemas de producción bacteriana de la técnica anterior contienen estos tres elementos en plásmidos. Por tanto, existe un riesgo de inestabilidad durante la fabricación debido a la pérdida de plásmidos, particularmente porque los antibióticos usados para el mantenimiento de los plásmidos no deben estar presentes durante la fermentación del material de GMP. Dado que las cepas insertadas contienen un plásmido menos, son más estables durante muchas generaciones. Esto significa que las fermentaciones a mayor escala y los tiempos de incubación más largos (números de generación más altos) son más factibles. Además, la ausencia de un antibiótico para la selección hace a un producto más seguro, debido a la ausencia de vestigios de antibiótico que pueden causar reacciones alérgicas en sujetos sensibles. Véase COMMITTEE WE, BIOLOGICAL O, STANDARDiZa TION: OMS, serie de informes técnicos 941. En: Quincuagésimo Sexto Informe. Editado por OMS. Ginebra: Organización Mundial de la Salud; 2007.
Las cepas insertadas son más estables genéticamente debido a la inserción cromosómica fija, lo que conduce a una mayor reproducibilidad de los productos proteicos deseados durante el proceso de producción, por ejemplo, durante el cultivo de la célula hospedadora que comprende ADN heterólogo insertado.
Métodos analíticos para probar el beneficio
Rendimiento. El rendimiento se mide como la cantidad de carbohidratos derivados de un litro de cultivo de producción bacteriana cultivado en un biorreactor en condiciones controladas y optimizadas. Después de la purificación del bioconjugado, los rendimientos de carbohidratos se pueden medir directamente mediante el ensayo de antrona o ELISA usando antisueros específicos de carbohidratos. Son posibles mediciones indirectas usando la cantidad de proteína (medida mediante los ensayos de BCA, Lowry o bardford bien conocidos) y la longitud y estructura del glicano para calcular una cantidad teórica de carbohidrato por gramo de proteína. Además, el rendimiento también se puede medir secando la preparación de glicoproteína a partir de un tampón volátil y usando una balanza para medir el peso.
Homogeneidad. La homogeneidad significa la variabilidad de la longitud de los glicanos y posiblemente el número de sitios de glicosilación. Los métodos enumerados anteriormente se pueden usar para este propósito. La SE-HPLC permite la medición del radio hidrodinámico. Un mayor número de sitios de glicosilación en el portador conduce a una mayor variación en el radio hidrodinámico en comparación con un portador con menos sitios de glicosilación. Sin embargo, cuando se analizan las cadenas de glicano individuales, pueden ser más homogéneas debido a la longitud más controlada. La longitud de los glicanos se mide por hidrazinólisis, SDS PAGE y CGE. Además, la homogeneidad también puede significar que determinados patrones de uso del sitio de glicosilación cambian a un intervalo más amplio/más estrecho. Estos factores pueden medirse mediante LC-MS/MS de glicopéptido.
Estabilidad y reproducibilidad de la cepa. La estabilidad de la cepa durante la fermentación bacteriana en ausencia de presión selectiva se mide mediante métodos directos e indirectos que confirman la presencia o ausencia del ADN recombinante en las células del cultivo de producción. La influencia del volumen de cultivo se puede simular mediante tiempos de cultivo prolongados, lo que significa mayores tiempos de generación. Cuantas más generaciones en fermentación, más probable es que se pierda un elemento recombinante. La pérdida de un elemento recombinante se considera inestabilidad. Los métodos indirectos se basan en la asociación de casetes de selección con ADN recombinante, por ejemplo, los casetes de resistencia a antibióticos en un plásmido. Las células del cultivo de producción se siembran en medios selectivos, por ejemplo, placas LB complementadas con antibióticos u otros productos químicos relacionados con un sistema de selección y las colonias resistentes se consideran positivas para el ADN recombinante asociado al producto químico de selección respectivo. En el caso de un sistema de múltiples plásmidos, se cuentan las colonias resistentes a múltiples antibióticos y la proporción de células que contienen las tres resistencias se considera la población estable. Como alternativa, se puede usar PCR cuantitativa para medir la cantidad de ADN recombinante de los tres elementos recombinantes en presencia, ausencia de selección, y en diferentes puntos de tiempo de fermentación. Por tanto, se mide y se compara la cantidad relativa y absoluta de ADN recombinante. La reproducibilidad del proceso de producción se mide mediante el análisis completo de los lotes de consistencia mediante los métodos establecidos en esta solicitud.
5.5 Composiciones
Composiciones que comprenden células hospedadoras
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones que comprenden las células hospedadoras descritas en el presente documento (véase la Sección 5.1). Dichas composiciones se pueden usar en métodos para generar los bioconjugados descritos en el presente documento (véase la Sección 5.3), por ejemplo, las composiciones que comprenden células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones adecuadas para la producción de proteínas. Posteriormente, los bioconjugados se pueden aislar a partir de dichas composiciones que comprenden células hospedadoras usando métodos conocidos en la técnica.
Las composiciones que comprenden las células hospedadoras proporcionadas en el presente documento pueden comprender componentes adicionales adecuados para el mantenimiento y la supervivencia de las células hospedadoras descritas en el presente documento, y pueden comprender adicionalmente componentes adicionales necesarios o beneficiosos para la producción de proteínas por las células hospedadoras, por ejemplo, inductores para promotores inducibles, tales como arabinosa, IPTg .
Composiciones que comprenden bioconjugados
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden uno o más de los bioconjugados descritos en el presente documento (véase la Sección 5.3). Las composiciones descritas en el presente documento son útiles en el tratamiento y la prevención de infecciones de sujetos (por ejemplo, sujetos humanos) por Pseudomonas. Véase la Sección 5.6.
En determinadas realizaciones, además de comprender un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3), las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) descritas en el presente documento comprenden un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa que se ha aprobado por parte de un organismo de control del gobierno federal o estatal, o que está listada en la Farmacopea de Estados Unidos o en otra farmacopea reconocida de forma general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término "portador", como se usa en el presente documento en el contexto de un portador farmacéuticamente aceptable, se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra la composición farmacéutica. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Como excipientes adecuados se incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. En "Remington’s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin se describen ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que comprende un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno de Pseudomonas. En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que comprende un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que comprende un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho antígeno O de Pseudomonas aeruginosa es un antígeno O de serotipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, 010, O11, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 u O20 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que comprende un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho antígeno O de Pseudomonas aeruginosa es un antígeno O de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición (por ejemplo, composición farmacéutica) que comprende un bioconjugado que comprende una proteína transportadora unida a un antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, en donde dicho antígeno O de Pseudomonas aeruginosa es un antígeno O de serotipo O11 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, dicho antígeno O de serotipo 011 de Pseudomonas aeruginosa es de la cepa PA103 de Pseudomonas aeruginosa (véase, por ejemplo, número de registro de GenBank KF364633.1).
Las composiciones que comprenden bioconjugados que se proporcionan en el presente documento se pueden usar para provocar una respuesta inmunitaria en un hospedador al que se le administra la composición, es decir, las composiciones son inmunógenas. Por tanto, las composiciones descritas en el presente documento se pueden usar como vacunas contra infección por Pseudomonas, o se pueden usar en el tratamiento de infección por Pseudomonas.
Las composiciones que comprenden los bioconjugados descritos en el presente documento pueden comprender cualquier componente adicional adecuado para su uso en la administración farmacéutica. En realizaciones específicas, las composiciones descritas en el presente documento son formulaciones monovalentes. En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento son formulaciones multivalentes, por ejemplo, formulaciones bivalentes, trivalentes y tetravalentes. Por ejemplo, una formulación multivalente comprende más de un bioconjugado descrito en el presente documento.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente un conservante, por ejemplo, el derivado de mercurio timerosal. En una realización específica, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento comprenden del 0,001 % al 0,01 % de timerosal. En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento no comprenden un conservante.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, las composiciones inmunógenas) comprenden, o se administran en combinación con, un adyuvante. El adyuvante para la administración en combinación con una composición descrita en el presente documento puede administrarse antes, simultáneamente o después de la administración de dicha composición. En algunas realizaciones, el término "adyuvante" se refiere a un compuesto que, cuando se administra junto con o como parte de una composición descrita en el presente documento, aumenta, potencia y/o refuerza la respuesta inmunitaria a un bioconjugado, pero cuando el compuesto se administra solo no genera una respuesta inmunitaria al bioconjugado. En algunas realizaciones, el adyuvante genera una respuesta inmunitaria al péptido polibioconjugado y no produce alergia u otra reacción adversa. Los adyuvantes pueden mejorar una respuesta inmunitaria mediante varios mecanismos que incluyen, por ejemplo, reclutamiento de linfocitos, estimulación de linfocitos B y/o T y estimulación de macrófagos.
Los ejemplos específicos de adyuvantes incluyen, pero sin limitación, sales de aluminio (alumbre) (tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y sulfato de aluminio), monofosforil lípido A (MPL) 3 des-O-acilado (véase la patente del Reino Unido GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), As 04 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compuestos de imidazopiridina (véase la Solicitud Internacional N.° PCT/US2007/064857, publicada como Publicación Internacional N.° WO2007/109812), compuestos de imidazoquinoxalina (véase la Solicitud Internacional N.° PCT/US2007/064858, publicada como Publicación Internacional N.° WO2007/109813) y saponinas, tales como QS21 (véase Kensil et al., en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell y Newman, Plenum Press, NY, 1995); patente de EE. UU. N.° 5.057.540). En algunas realizaciones, el adyuvante es adyuvante de Freund (completo o incompleto). Otros adyuvantes son las emulsiones de aceite en agua (como el escualeno o el aceite de cacahuete), opcionalmente en combinación con estimulantes inmunitarios, tales como monofosforil lípido A (véase Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Otro adyuvante es CpG (Bioworld Today, 15 de noviembre de 1998).
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento se formulan para que sean adecuadas para la vía de administración prevista para un sujeto. Por ejemplo, las composiciones descritas en el presente documento pueden formularse para que sean adecuadas para administración subcutánea, parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorrectal, intraperitoneal y rectal. En una realización específica, la composición farmacéutica puede formularse para administración intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica o pulmonar.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente uno o más tampones, por ejemplo, tampón fosfato y tampón glutamato de fosfato de sacarosa. En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento no comprenden tampones.
En determinadas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento comprenden adicionalmente una o más sales, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de calcio, fosfato de sodio, glutamato monosódico y sales de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, alumbre (sulfato de potasio y aluminio), o una mezcla de dichas sales de aluminio). En otras realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento no comprenden sales.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para su administración.
Las composiciones descritas en el presente documento se pueden almacenar antes de su uso, por ejemplo, las composiciones se pueden almacenar congeladas (por ejemplo, a aproximadamente -20 °C o a aproximadamente -70 °C); almacenarse en condiciones de refrigeración (por ejemplo, a aproximadamente 4 °C); o almacenarse a temperatura ambiente.
5.6 Usos profilácticos y terapéuticos
En un aspecto, en el presente documento se proporciona un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición del mismo (véase la Sección 5.5) para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad causada por una infección por Pseudomonas en un sujeto humano.
También se proporciona en el presente documento un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto contra Pseudomonas, cuando se administra al sujeto. En una realización, dicho sujeto tiene una infección por Pseudomonas en el momento de la administración. En otra realización, dicho sujeto no tiene una infección por Pseudomonas en el momento de la administración.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición para su uso en la prevención de una infección por Pseudomonas en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad eficaz de una composición descrita en la Sección 5.5. Los bioconjugados y las composiciones para su uso en la prevención de una infección por Pseudomonas en un sujeto proporcionados en el presente documento dan como resultado la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición descrita en la Sección 5.5. Un experto en la materia comprenderá que los bioconjugados o composiciones para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria en un sujeto descritos en el presente documento dan como resultado la vacunación del sujeto contra la infección por cepas de Pseudomonas cuyos antígenos están presentes en la o las composiciones.
En una realización específica, en el presente documento se proporciona una composición para su uso en el tratamiento de una infección por Pseudomonas en un sujeto, en donde dicha composición para su uso se administra a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de una composición descrita en la Sección 5.5.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por Pseudomonas causada por Pseudomonas aeruginosa. En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida por un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección por Pseudomonas por más de una cepa o serotipo de Pseudomonas aeruginosa.
En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por serotipo 01, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, 010, O11,012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 019 u O20 de Pseudomonas aeruginosa. En otra realización específica, dicho agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa es el agrupamiento rfb de uno cualquiera de los serotipos descritos en Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336. En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, la respuesta inmunitaria inducida por un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para prevenir y/o tratar una infección causada por serotipo O11 de Pseudomonas aeruginosa. En una realización específica, dicho serotipo 011 de Pseudomonas aeruginosa es la cepa PA103 de Pseudomonas aeruginosa (véase, por ejemplo, número de registro de GenBank KF364633.1).
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para reducir uno o más síntomas que resultan de una infección por Pseudomonas.
En determinadas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para reducir la probabilidad de hospitalización de un sujeto que padece una infección por Pseudomonas. En algunas realizaciones, la respuesta inmunitaria inducida en un sujeto después de la administración de un bioconjugado descrito en el presente documento (véase la Sección 5.3) o una composición descrita en el presente documento (véase la Sección 5.5) es eficaz para reducir la duración de la hospitalización de un sujeto que padece una infección por Pseudomonas.
5.7 Ensayos
Ensayo para evaluar la capacidad de los bioconjugados para inducir una respuesta inmunitaria
La capacidad de los bioconjugados/composiciones descritos en el presente documento para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto puede evaluarse usando cualquier enfoque conocido por los expertos en la materia o descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la capacidad de un bioconjugado para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto puede evaluarse inmunizando a un sujeto (por ejemplo, un ratón) o un conjunto de sujetos con un bioconjugado descrito en el presente documento e inmunizando a un sujeto adicional (por ejemplo, un ratón) o un conjunto de sujetos con un control (PBS). Los sujetos o conjunto de sujetos pueden ser provocados posteriormente con Pseudomonas y puede determinarse la capacidad de Pseudomonas para causar la enfermedad en los sujetos o conjunto de sujetos. Los expertos en la materia reconocerán que si el sujeto o conjunto de sujetos inmunizados con el control padecen una enfermedad posterior a la provocación con el Pseudomonas pero el sujeto o conjunto de sujetos inmunizados con uno o más bioconjugados o una composición de los mismos descrito en el presente documento padece en menor medida o no padece la enfermedad, entonces el bioconjugado es capaz de generar una respuesta inmunitaria en un sujeto. La capacidad de uno o más bioconjugados o una composición de los mismos descritos en el presente documento para inducir un antisuero que reacciona de forma cruzada con un antígeno de Pseudomonas se puede probar mediante, por ejemplo, un inmunoensayo, tal como un ELISA.
Ensayos bactericidas in vitro
La capacidad de los bioconjugados descritos en el presente documento para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto se puede evaluar mediante un ensayo bactericida en suero (SBA) o un ensayo de destrucción opsonofagocítica (OPK), que representa un método establecido y aceptado que se ha usado para obtener la aprobación de vacunas basadas en glicoconjugados. Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica y, en resumen, comprenden las etapas de generar y aislar anticuerpos contra una diana de interés (por ejemplo, un antígeno de Pseudomonas) administrando a un sujeto (por ejemplo, un ratón) un compuesto que desencadena dichos anticuerpos. Posteriormente, la capacidad bactericida de los anticuerpos puede evaluarse, por ejemplo, cultivando las bacterias en cuestión en presencia de dichos anticuerpos y complemento y, dependiendo del ensayo, células neutrófilas y ensayando la capacidad de los anticuerpos para destruir y/o neutralizar las bacterias, por ejemplo, usando enfoques microbiológicos estándar.
6. Ejemplos
Ejemplo 1: Las cepas bacterianas con una oligosacariltransferasa insertada y un agrupamiento rfb insertado son estables y producen bioconjugados
Este ejemplo demuestra que los bioconjugados pueden ser producidos con éxito por una cepa hospedadora bacteriana que ha sido modificada genéticamente mediante la inserción de (i) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa y (ii) un ácido nucleico que codifica un agrupamiento rfb.
Las células hospedadoras de E. coli modificadas se generaron insertando lo siguiente directamente en el genoma de la célula hospedadora: (i) un ácido nucleico que codifica la oligosacariltransferasa de C. jejuni (PglB) y (ii) un ácido nucleico que codifica el agrupamiento rfb de la cepa PA103 de Pseudomonas aeruginosa. Este agrupamiento rfb codifica los genes necesarios para la síntesis del antígeno O del serogrupo O11 de Pseudomonas aeruginosa. Las inserciones se realizaron usando el novedoso método de inserción descrito en el documento PCT/EP2013/071328 (véase la Sección 5.2 anterior) o el sistema pUT mini (Biomedal Lifescience). El método de inserción descrito en el documento PCT/EP2013/071328 es específico de sitio y utiliza recombinación homóloga, mientras que el sistema pUT mini es un enfoque aleatorio mediado por transposón que da como resultado que una secuencia de ácido nucleico de interés se inserte aleatoriamente en el genoma de una célula hospedadora. Las células hospedadoras de E. coli se modificaron aún más mediante la introducción de un plásmido que expresa exotoxina A de Pseudomonas (EPA) destoxificada como proteína transportadora en las células hospedadoras. Por tanto, las células hospedadoras de E. coli modificadas descritas en este ejemplo expresan (i) la oligosacariltransferasa de C. jejuni (PglB), en virtud de la integración de un ácido nucleico que codifica la oligosacariltransferasa en el genoma de la célula hospedadora; (ii) genes de un agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa que producen el antígeno O11, en virtud de la integración de un ácido nucleico que codifica el agrupamiento rfb de la cepa PA103 de Pseudomonas aeruginosa en el genoma de la célula hospedadora; y (iii) la proteína transportadora EPA, en virtud de la transformación de la célula hospedadora con un plásmido que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína transportadora.
Se generaron células hospedadoras de E. coli modificadas adicionales para permitir la comparación de la capacidad de las células hospedadoras modificadas que comprenden integraciones dobles (integración de una oligosacariltransferasa e integración de un agrupamiento rfb) para producir bioconjugados (EPA-O11) con la producción de bioconjugados por células hospedadoras que tienen (i) solo una integración única de la oligosacariltransferasa o el agrupamiento rfb y los componentes restantes (proteína transportadora y oligosacariltransferasa o agrupamiento rfb ) expresados por plásmido por la célula hospedadora; o (ii) sin componentes integrados, con todos los componentes (proteína transportadora y oligosacariltransferasa y agrupamiento rfb) expresados por plásmido.
Se utilizaron tres cepas diferentes de E. coli de referencia en el análisis: (i) "St4167" (W3110 AwaaL, ArfbO16::rfbP.a.O11), que comprende una deleción del gen waaL de E. coli, una deleción del agrupamiento rfb 016 de E. coli, y una inserción del agrupamiento rfb O11 de P. aeruginosa (PCT/EP2013/071328); (ii) "St1128" (W3110 AwaaL), que comprende una deleción del gen waaL de E. coli; y (iii) "St1935" (W3110 AwaaL, AwzzE-wecG, AwbbIJK), que comprende la deleción de los genes indicados. Para la inserción del agrupamiento rfb O11 de P. aeruginosa en St4167, el agrupamiento rfb O11 se clonó en el plásmido pDOC y se empleó el método de acuerdo con el documento PCT/EP2013/071328. Las cepas St4167 representan las cepas de doble integración.
Los plásmidos específicos utilizados para introducir EPA en las cepas de células hospedadoras se denominan "p1077" y "p150". Este último se describe en Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61 y los plásmidos son los mismos con la excepción del hecho de que p1077 reemplaza el casete Amp de p150 con un casete Kan.
Se generaron las siguientes variantes de St4167: (i) St4167 con pglB insertado en lugar del gen yahL de la célula hospedadora (mediante el método del documento PCT/EP2013/071328) y EPA expresada por el plásmido p1077; (ii) St4167 con pglB insertado en lugar del gen ompT de la célula hospedadora (usando el sistema pUT mini) y EPA expresada por el plásmido p150; (iii) St4167 con pglB expresado por el plásmido p1769 (pglB en pDOC) y EPA expresada por el plásmido p1077; (iv) St4167 con pglB expresado por el plásmido p939 (plásmido de expresión basado en pEXT21 para PglB con una etiqueta HA, codones optimizados) y EPA expresada por el plásmido p1077; y (v) St4167 con pglB expresado por el plásmido p1762 (pglB en pDOC) y EPA expresada por el plásmido pl077.
Se generaron las siguientes variantes de St1128: (i) St1128 con pglB expresado por el plásmido p939, agrupamiento rfb O11 de P. aeruginosa expresado por el plásmido p164 (plásmido pLA-FR diseñado para contener el agrupamiento rfb 011 de P. aeruginosa), y EPA expresada por el plásmido p1077; y (ii) St1128 con pglB insertado en lugar del gen yahL de la célula hospedadora (mediante el método del documento PCT/EP2013/071328), agrupamiento rfb O11 de P. aeruginosa expresado por el plásmido p164 y EPA expresada por el plásmido p1077.
Se generaron las siguientes variantes de St1935: (i) St1935 con pglB insertado en lugar del gen ompT de la célula hospedadora (mediante el método del documento PCT/EP2013/071328), agrupamiento rfb 011 de P. aeruginosa expresado por el plásmido p164 y EPA expresada por el plásmido p1077; (ii) St1935 con pglB insertado en lugar del gen yahL de la célula hospedadora (mediante el método del documento PCT/EP2013/071328), agrupamiento rfb 011 de P. aeruginosa expresado por el plásmido p164 y EPA expresada por el plásmido p1077; y St1935 con pglB expresado por el plásmido p939, agrupamiento rfb O11 de P. aeruginosa expresado por el plásmido p164 y EPA expresada por el plásmido p1077.
Como se muestra en la figura 1, todas las cepas que expresan una oligosacariltransferasa, proteína transportadora y un agrupamiento rfb produjeron bioconjugados. Véanse las transferencias representadas entre los marcadores 100 y 130 kDa, que corresponden a EPA-O11. Resulta importante destacar que, esta observación incluye cepas que comprenden doble integración de una oligosacariltransferasa y un agrupamiento rfb. Véanse, en particular, los resultados mostrados para St4167. Por tanto, este ejemplo demuestra no solo que se pueden generar células hospedadoras estables después de la inserción doble de genes/grupos de genes en el genoma de la célula hospedadora, sino que esa función de los genes se mantiene. Específicamente, se conservó la función de la oligosacariltransferasa insertada y el agrupamiento rfb insertado, dando como resultado la producción de bioconjugados.
Ejemplo 2: identificación de un gen de form iltransferasa que contribuye a la síntesis de un oligo/polisacárido del antígeno O de O6 de P. aeruginosa
Este ejemplo describe la identificación de la formiltransferasa de O6 de Pseudomonas aeruginosa.
Se buscaron datos del proteoma para O6 de la cepa "LESB58" de Pseudomonas aeruginosa, cuyo genoma es conocido, para encontrar dominios que contuvieran homología con los dominios de consulta prototipo "Formiltransferasa" y "dominio de tipo C-terminal de FMT " usando el algoritmo proporcionado en www.supfam.org/SUPERFAMILY/. La búsqueda identificó 9 secuencias de proteínas con posibles dominios relacionados.
Para evaluar si alguno de los 9 candidatos identificados era específico para O6 (y por lo tanto para una unidad de repetición de antígeno O formilado), se analizó su ausencia en el proteoma de otro serotipo de Pseudomonas aeruginosa (O5, cepa PAO1) mediante una búsqueda BLAST (sitio web del NCBI). La estructura del antígeno O de O5 de Pseudomonas aeruginosa no está relacionada con la de O6 de Pseudomonas aeruginosa. Específicamente, ningún grupo formilo está presente en la estructura de O5. 8 de 9 candidatos tenían homólogos en serotipo O5 de Pseudomonas aeruginosa, lo que indicó que estas proteínas no eran específicas para la cepa LESB58 de O6 de Pseudomonas aeruginosa. El candidato restante (locus_tag=PLES_12061, GenBank: CAW25933.1; SEQ ID NO:2) no tenía un homólogo obvio en el serotipo O5 de Pseudomonas aeruginosa y, por lo tanto, se clasificó como específico para LESB58/serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
Para confirmar la especificidad de O6, se verificó la presencia de la formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa descubierta (SEQ ID NO:2) en otras cepas de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. Se identificaron proteínas equivalentes a la formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:2) en otras cuatro cepas de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa, que incluyen la etiqueta de locus: PAK_01412 en la cepa "PAK" y la etiqueta de locus: PAM18_1171 en la cepa M18.
También se identificaron formiltransferasas con baja identidad de secuencia de aminoácidos con formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:2) en Metilobacterium sp. (33 % de identidad, REGISTRO WP_020093860), Thiothrixnivea (30 % identidad, REGISTRO WP_002707142), Anaerophaga thermohalophila (28 % identidad, REGISTRO WP_010422313), Halorubrum californiense (27 % identidad, REGISTRO WP_008445073), Azorhizobium caulinodans (25 % identidad, REGISTRO WP_012170036) y Burkholderia glathei (24 % identidad, REGISTRO KDR39707). Considerados en conjunto, estos análisis de homología indicaron que los genes relacionados codifican una actividad específica de O6 relacionada con la formilación.
Para probar la actividad funcional de la formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:2) en la estructura de la unidad de repetición de O6 no formilada, se clonó el gen que codifica la SEQ ID NO:2. El raro codón de iniciación TTG del gen fue reemplazado por ATG. Una representación esquemática de la clonación de la formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:2) en el agrupamiento rfb de O6 de Pseudomonas aeruginosa y la organización relativa de los genes se muestran en la figura 5.
Una vez identificada, se evaluó la función de la formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. Se analizó la formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:2) para la funcionalidad por coexpresión con los agrupamientos de genes rfb de O6 de Pseudomonas aeruginosa en cepas de E. coli que carecen de un agrupamiento ECA (wec) funcional. Para mostrar la formilación, se analizaron unidades de repetición de antígeno únicas unidas al núcleo del lípido a (en una cepa positiva para waaL). La unidad de repetición de antígeno O formilado O6 se identificó mediante inmunodetección usando un anticuerpo específico de O6 (figura 3A), lo que indica que el grupo formilo es un epítopo relevante de la estructura del antígeno O de O6 de Pseudomonas aeruginosa.
Para mostrar la formilación a nivel molecular, las unidades de repetición O6 se analizaron mediante MALDI MSMS. Las unidades de repetición purificadas y marcadas con 2AB mostraron que la coexpresión de formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:2) con los agrupamientos de genes rfb de O6 de Pseudomonas aeruginosa dio lugar a una señal de fluorescencia del pico principal que se desplazó 2-3 minutos (de 58 a 61', figura 3B).
El análisis MALDI-MSMS del material contenido en los picos a 58' dio como resultado una serie de fragmentación de iones Y que está de acuerdo con la unidad de repetición de O6 no formilada, N-acetilada marcada con 2-AB. El ion precursor protonado m/z=905, fragmentado en una serie de iones prominentes de 905->759->543->326, correspondiente a pérdidas de 146 (desoxihexosa), 216 (ácido N-acetilhexosaminurónico amidado), 217 (ácido N-acetilhexosaminurónico) unidades. El material recogido a 61' obtenido de células que expresan el gen de formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa contenía un ion precursor prominente de 891, que se fragmentó en 891->745->529->326, correspondiente a pérdidas de 146 (como anteriormente), 216 (como anteriormente) y 203 (ácido N-formilhexosaminurónico amidado). Estos datos demostraron que la formilación depende de la expresión de formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa y que, por consiguiente, el gen está codificando la formiltransferasa. Por tanto, el gen que codifica la formiltransferasa de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa se denominó fmtO6. El hecho de que el grupo acetilo del ácido N-acetilhexosaminurónico amidado se sustituya por un grupo formilo sugiere un mecanismo de dos etapas en donde primero se elimina el grupo acetilo antes de que se pueda añadir el grupo formilo. Este modelo implica que un grupo amino libre estaría presente en C2 como un intermedio antes de que el dominio formiltransferasa una un grupo formilo al monosacárido. Por tanto, el antígeno O desacetilado y no formilado puede ser una forma sustancial e inmunológicamente relevante, de polisacárido subestequiométricamente presente de serotipo O6 de P. aeruginosa.
Ejemplo 3: identificación y pruebas del gen wzy para la polimerización del antígeno O de O6 de P. aeruginosa.
Este ejemplo describe la identificación de la polimerasa wzy de O6 de Pseudomonas aeruginosa.
Los polisacáridos del antígeno O constituyen la superficie celular externa de muchas bacterias Gram negativas. La maquinaria enzimática responsable de la biosíntesis del antígeno O a menudo está codificada en un solo agrupamiento de genes llamado agrupamiento rfb. Las cepas del serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa expresan un antígeno O polimérico (figura 2). Sin embargo, en el agrupamiento de antígeno O respectivo, está ausente un gen que codifica una polimerasa (wzy) del antígeno O. Esto significa que para poder expresar de forma recombinante el antígeno O de O6 de P. aeruginosa en E. coli, la identificación del gen wzy era necesaria. Las polimerasas de antígeno O (wzy) son proteínas integrales de la membrana interna que catalizan la polimerización de unidades repetitivas de antígeno O en el espacio periplásmico antes del ligamiento "en bloque" al oligosacárido del núcleo A del lípido para formar LPS. Las polimerasas wzy son altamente específicas para su oligómero de unidad de repetición y las homologías entre los genes wzy son escasas.
El antígeno O de 019 de Pseudomonas aeruginosa comparte similitudes estructurales con el de O6 de Pseudomonas aeruginosa. Se especuló que las proteínas wzy que reconocen ambas estructuras también podrían compartir propiedades similares, por ejemplo, estructura, secuencia, número de dominios transmembrana. La secuencia de la proteína Wzy de 019 de 019 de Pseudomonas aeruginosa (REGISTRO AAM27560) es conocida y se usó como consulta principal en un análisis Blast usando el proteoma de la cepa PAK de O6 de Pseudomonas aeruginosa como sujeto para la búsqueda de homología.
Para evaluar si los candidatos identificados eran específicos para O6 de Pseudomonas aeruginosa, se analizó su presencia en el proteoma de otro serotipo de Pseudomonas aeruginosa (O5, cepa PAO1). La estructura del antígeno O de O5 no está relacionada con la de O6 y 019. Los 100 resultados principales fueron analizados individualmente para la presencia en el proteoma de O5 de Pseudomonas aeruginosa usando análisis Blast. 97 de 100 candidatos del proteoma de PAK tenían homólogos en el proteoma del serotipo O5 de Pseudomonas aeruginosa, lo que indicó que estas proteínas estaban generalmente presentes en cepas de Pseudomonas aeruginosa y posiblemente sin relación con la biosíntesis del antígeno O de O6. Tres de los 100 candidatos no tenían un homólogo evidente en el proteoma de O5 de Pseudomonas aeruginosa y, por lo tanto, se determinó que eran específicos de O6 de Pseudomonas aeruginosa.
Para probar si una de las tres proteínas candidatas identificadas era una wzy de O6 de Pseudomonas aeruginosa, las tres proteínas se usaron como consulta en un análisis Blast. Uno de los tres candidatos, PAK 01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3), compartía identidad de secuencia de aminoácidos con otras polimerasas de unidades de repetición de oligosacáridos conocidas, por ejemplo, 25 % identidad a polimerasas de unidades de repetición de oligosacáridos de Streptococcus sanguinis (REGISTRO WP_004192559) y 22 % de identidad con polimerasas de unidades de repetición de oligosacáridos de Escherichia coli 0139 (REGISTRO AAZ85718). Por tanto, PAK_01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3) se identificó como la wzy de O6 de Pseudomonas aeruginosa.
Para confirmar aún más la SEQ ID NO:3 como la proteína codificada por la wzy de O6 de Pseudomonas aeruginosa, la localización subcelular de la proteína se predijo bioinformáticamente usando PSORTb (www.psort.org/psortb/). Se predijo que la proteína estaría localizada en la membrana citoplasmática con 11 dominios transmembrana, una característica que es común entre las polimerasas de antígeno O.
Proteínas equivalentes a PAK_01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3) se encontraron en otras cepas de P. aeruginosa positivas para O6, incluyendo la cepa LESB58 (que tenía una proteína wzy de O6 de Pseudomonas aeruginosa con solo 1 aa de diferencia en comparación con la cepa PAK y una cepa probada internamente).
A continuación, se llevaron cabo pruebas funcionales de la wzy de O6 de Pseudomonas aeruginosa. El agrupamiento rfb de O6 de Pseudomonas aeruginosa, el gen fmtO6 (es decir, el gen que codifica la SEQ ID NO:2, analizado en el ejemplo 2, anteriormente), y el gen que codifica wzy de O6 de Pseudomonas aeruginosa (es decir, el gen que codifica la SEQ ID NO:3) se coexpresaron en células de E. coliW3110 Awec y el lipopolisacárido formado se analizó mediante inmunotransferencia (figura 4). El antisuero anti-O6 detectó una señal de tipo escalera solo en la muestra que se originó en las células que contenían los tres transgenes, lo que indica que PAK 01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3) es de hecho la polimerasa de O6 de P. aeruginosa. Por tanto, el gen que codifica PAK_01823 fue nombrado O6wzy.
Para generar un solo agrupamiento de genes que contenga todos los elementos genéticos necesarios para permitir a E. coli expresar de forma recombinante el antígeno O de O6 de P. aeruginosa, los genes fmtO6 y O6wzy (es decir, los genes que codifican las SEQ ID NO: 2 y 3, respectivamente) fueron clonados cadena abajo del agrupamiento rfb de O6 de P. aeruginosa. Una representación esquemática de la clonación del uso de polimerasa O6wzy del antígeno O de O6 de Pseudomonas aeruginosa con codones optimizados en el agrupamiento rfb de O6 de Pseudomonas aeruginosa clonado junto con la formiltransferasa de O6 y la organización relativa de los genes se representa en la figura 5. Además se determinó que los genes fmtO6 y O6wzy (es decir, los genes que codifican las SEQ ID NO: 2 y 3, respectivamente) podrían insertarse en el agrupamiento rfb de O6 de P. aeruginosa en múltiples posiciones. Específicamente, el gen fmtO6 podría insertarse en una orientación en el sentido de las agujas del reloj con respecto al agrupamiento rfb cadena abajo del agrupamiento rfb o cadena arriba del agrupamiento rfb bajo el control de un promotor separado. Además, el gen fmtO6 podría insertarse en una orientación en sentido contrario a las agujas del reloj en relación con el agrupamiento rfb cadena arriba o cadena abajo del agrupamiento rfb. El gen O6wzy podría insertarse en una orientación en el sentido de las agujas del reloj con respecto al agrupamiento rfb cadena arriba o cadena abajo del agrupamiento rfb o cadena arriba del agrupamiento rfb bajo el control de un promotor separado. Todas las construcciones descritas anteriormente estaban activas en términos de biosíntesis del antígeno O de O6 de P. aeruginosa (datos no mostrados).
Ejemplo 4: Las cepas bacterianas con una oligosacariltransferasa insertada y un agrupamiento rfb, rfbO6 completado, insertado son estables y producen bioconjugados
El ejemplo 1 demuestra que los bioconjugados pueden ser producidos con éxito por una cepa hospedadora bacteriana que ha sido modificada genéticamente mediante la inserción de (i) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa y (ii) un ácido nucleico que codifica un agrupamiento rfb. En este ejemplo, se realizaron experimentos similares a los descritos en el ejemplo 1, usando la proteína PcrV de Pseudomonas como proteína transportadora.
Naturalmente, la secuencia primaria de aminoácidos de PcrV (véase, por ejemplo, UniProt O30527) no comprende una secuencia consenso de N-glicosilación ("glicositio"). Usando los método descritos en el documento WO 2006/119987, se diseñaron variantes recombinantes de PcrV que comprenden uno, dos, tres, cuatro o cinco glicositios. En particular, mediante manipulación de la secuencia de ácido nucleico que codifica PcrV, se crearon variantes de PcrV que expresaban uno, dos, tres, cuatro o cinco de las secuencias consenso de N-glicosilación optimizada Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), en donde X y Z se seleccionan independientemente de cualquier aminoácido natural excepto Pro.
Las células hospedadoras de E. coli modificadas se generaron insertando lo siguiente directamente en el genoma de la célula hospedadora: (i) un ácido nucleico que codifica la oligosacariltransferasa de C. jejuni (PglB) y (ii) un ácido nucleico que codifica el agrupamiento rfb de la cepa PAK de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa. Este agrupamiento rfb codifica los genes necesarios para la síntesis del antígeno O del serogrupo O6 de Pseudomonas aeruginosa. Las inserciones se realizaron usando el novedoso método de inserción descrito en el documento PCT/EP2013/071328 (véase la Sección 5.2 anterior) o el sistema pUT mini (Biomedal Lifescience). Las células hospedadoras de E. coli se modificaron aún más mediante la introducción de un plásmido que expresa PcrV que comprende de uno a cinco glicositios, como se ha descrito anteriormente. Por tanto, las células hospedadoras de E. coli modificadas descritas en este ejemplo expresan (i) la oligosacariltransferasa de C. jejuni (PglB), en virtud de la integración de un ácido nucleico que codifica la oligosacariltransferasa en el genoma de la célula hospedadora; (ii) genes de un agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa que producen el antígeno O6, en virtud de la integración de un ácido nucleico que codifica el agrupamiento rfb de la cepa PAK de Pseudomonas aeruginosa en el genoma de la célula hospedadora; y (iii) la proteína transportadora PcrV modificada, en virtud de la transformación de la célula hospedadora con un plásmido que comprende un ácido nucleico modificado que codifica la proteína transportadora (donde el ácido nucleico ha sido modificado para que codifique de uno a cinco glicositios, como se ha descrito anteriormente).
Se generaron células hospedadoras de E. coli modificadas adicionales para permitir la comparación de la capacidad de las células hospedadoras modificadas que comprenden integraciones dobles (integración de una oligosacariltransferasa e integración de un agrupamiento rfb) para producir bioconjugados (PcrV-O6) con la producción de bioconjugados por células hospedadoras que tienen (i) solo una integración única de la oligosacariltransferasa o el agrupamiento rfb y los componentes restantes (proteína transportadora y oligosacariltransferasa o agrupamiento rfb ) expresados por plásmido por la célula hospedadora; o (ii) sin componentes integrados, con todos los componentes (proteína transportadora y oligosacariltransferasa y agrupamiento rfb) expresados por plásmido.
Se usaron tres cepas diferentes de E. coli y se compararon en el análisis: (i) "St7343", que comprende tanto pglB como el agrupamiento rfb de O6 completado insertados en el genoma de la célula hospedadora (es decir, es una cepa de doble integración), y un plásmido que codifica una proteína transportadora PcrV (con uno, dos, tres, cuatro o cinco glicositios); (ii) "St7209", que comprende pglB expresado por plásmido, el agrupamiento rfb de O6 insertados en el genoma de la célula hospedadora, y un plásmido que codifica una proteína transportadora PcrV (con uno, dos, tres, cuatro o cinco glicositios); y (iii) "St2182", que comprende pglB expresado por plásmido, agrupamiento rfb de O6 expresado por plásmido, y un plásmido que codifica una proteína transportadora PcrV (con uno, dos, tres, cuatro o cinco glicositios). La figura 6 representa las características de cada cepa (6A: St7343; 6B: St7209; 6C: St2182).
Como se muestra en la figura 6, todas las cepas que expresan una oligosacariltransferasa, proteína transportadora y un agrupamiento rfb produjeron bioconjugados. Véanse las transferencias representadas entre los marcadores 40-70 kDa (alrededor del marcador 55 kDa), que corresponden a PcrV-O6. Resulta importante destacar que, como se muestra en el ejemplo 1, esta observación incluye cepas que comprenden doble integración de una oligosacariltransferasa y un agrupamiento rfb. Véanse, en particular, los resultados que se muestran en la figura 6A. Por tanto, similar al Ejemplo 1, este ejemplo demuestra no solo que se pueden generar células hospedadoras estables después de la inserción doble de genes/grupos de genes en el genoma de la célula hospedadora, sino que esa función de los genes se mantiene. Específicamente, se conservó la función de la oligosacariltransferasa insertada y el agrupamiento rfb insertado, dando como resultado la producción de bioconjugados.
Ejemplo 5: Producción y purificación de bioconjugados EPA-O6
Este ejemplo describe la producción de bioconjugados que comprenden el antígeno O6 de Pseudomonas aeruginosa.
La E. coli W3110 AwaaL Awec Arfb se transformó con plásmidos que comprenden el agrupamiento rfb de O6 de Pseudomonas aeruginosa, la oligosacariltransferasa pglB de C. jejuni, el gen que codifica la proteína transportadora destoxificada EPA y los genes de biosíntesis/transferasa de QuiNAc wbpVLM (a partir de una cepa de O6 de Pseudomonas aeruginosa). Los resultados del análisis de retención de plásmidos se muestran en la figura 8. Medio (caldo LB) complementado con tetraciclina, espectinomicina, kanamicina y ampicilina se inoculó con células hospedadoras que contenían los cuatro plásmidos. El precultivo se cultivó durante la noche a 37 °C. El día siguiente, medio (TB) complementado con MgCl2, tetraciclina, espectinomicina, kanamicina y ampicilina se inoculó diluyendo el precultivo a DO6000,1. Las células se cultivaron a 37 ° C hasta que se alcanzó aproximadamente DO6000,8-1,0, entonces la expresión de pglb, epa y wbpVLM se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y arabinosa al 0,1 %. Las células se recogieron por centrifugación después de la inducción durante la noche.
Los bioconjugados EPA-O6 se purificaron a partir de extractos periplásmicos de células hospedadoras modificadas mediante cromatografía de afinidad con quelato metálico (IMAC), cromatografía de intercambio aniónico (Fuente Q) y cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Las fracciones de elución que contenían glicoconjugados se agruparon y posteriormente se enviaron a la siguiente etapa de cromatografía. Los eluatos finales de SEC se caracterizaron mediante SDS-PAGE seguida de tinción con azul de Coomassie o transferencia de Western usando los anticuerpos indicados en la figura 7.
El bioconjugado EPA-06 se caracterizó mediante una serie de métodos analíticos. El nivel de endotoxina se midió usando el ensayo LAL (13 EU/ml). La pureza se determinó mediante SDS-PAGE y electroforesis en gel capilar (CGE, 86 % de pureza). La cantidad de proteína se midió usando el ensayo BCA (1,75 mg/ml). La cantidad de polisacárido se midió usando el ensayo de Antrona (Dubois et al., 1956; 311,6 ug/ml). El tamaño medio del polímero 06 se determinó usando una SDS-PAGE de "grado de glicosilación" (DOG) de alta resolución (promedio de 7,9 unidades de repetición por polímero). La determinación de las isoformas eléctricas del bioconjugado se realizó mediante enfoque isoeléctrico (IEF). Por último, la identidad del bioconjugado se confirmó mediante inmunotransferencia usando anticuerpos dirigidos contra la proteína (EPA) o el polisacárido (O6).
Ejemplo 6 : Estudios de inmunización
Este ejemplo demuestra que el bioconjugado O6-EPA de P. aeruginosa es inmunógeno.
Ratones BALB/c OlaHsd hembra de 6 semanas de edad (en grupos de 25) se inmunizaron por vía intramuscular los días 0, 14 y 28 con 0,2 gg o 2 gg de conjugado 06-EPA (véase el ejemplo 5) en una formulación sin adyuvante o con adyuvante (con una adyuvante de emulsión de aceite en agua). Un grupo de control de 10 ratones fue vacunado con adyuvante (Ac/Ag) solo. Los títulos opsónicos y ELISA anti-O6 se determinaron en sueros individuales recogidos el día 42 (14 post IIl) y en sueros Post-II y Post-III mezclados. Los resultados se muestran en la figura 9 y se describen en detalle a continuación.
La figura 9A representa la respuesta de ELISA anti-O6. El LPS-O6, O6 purificado (PaO6a,6c) se extendió a 8 gg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre placas de microtitulación de alta unión (Nunc Maxisorp), durante la noche a 4 °C. Las placas se bloquearon con PBS-BSa al 1 % durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. Los antisueros de ratones se prediluyeron a 1/10 y a continuación, se realizaron diluciones dobles adicionales en microplacas y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos con agitación. Después del lavado, el anticuerpo murino unido se detectó usando AffiniPure de cabra anti-IgG de ratón (H+L) conjugado con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115-035-003) diluido 1/5000 en PBS-tween 0,05 %-BSA 0,2 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. El color se reveló usando 4 mg de OPD 5 gl de H2O2 por 10 ml de tampón de citrato, pH 4,5, 0,1 M durante 15 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 gl de HCl y se leyó la densidad óptica (DO) a 490 nm con respecto a 650 nm.
El nivel de anticuerpos anti-06 presentes en los sueros se expresó en títulos de punto medio. Se calculó un GMT de sueros individuales para las 25 muestras en cada grupo de tratamiento (10 para el grupo de control).
Se observó una respuesta inmunitaria en ratones después de la inyección del bioconjugado formulado con el adyuvante. No se observaron diferencias entre las dosis. Se hicieron observaciones similares con respecto al porcentaje de seroconversión. No se observaron respuestas o se observaron respuestas muy débiles con la formulación sin adyuvante.
La figura 9B muestra el título opsónico en células HL60 de ratones inmunizados con bioconjugado O6-EPA formulado con adyuvante o sin él.
El ensayo de opsonofagocitosis (OPA) se realizó en microplacas de fondo redondo con 15 gl de células fagocíticas HL-60 (ajustadas a 5 10e6 células/ml), 15 gl de bacterias P. aeruginosa (cultivadas en placa de agar TSA), 15 gl de las diluciones de suero de prueba y 15 gl de complemento de lechón. Los sueros combinados de prueba inactivados se diluyeron primero (dilución final 1/16 o 1 /50) en HBSS-BSA al 1 % y se añadieron a una cepa de O6 de P. aeruginosa (identificación de la cepa: HNCMB 170009, obtenida de la Colección Nacional Húngara de Bacterias Médicas) diluida para contar 200-250 UFC/pocillo al final de la prueba.
A continuación, se añadieron a cada pocillo las células HL-60 (ajustadas a 5,10e6/ml) y el complemento de lechón (12,5 % final). Se incluyó un control con complemento inactivado para cada muestra de prueba.
La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 90 minutos con agitación. Después de una dilución 1/200, a continuación, se transfirieron 50 gl del volumen a una microplaca de fondo plano. Se añadieron 50 gl de agar MH seguido de agar PBS-0,9 %. Se realizaron recuentos de colonias automatizados después de una incubación durante la noche a 34 °C.
La actividad opsonofagocítica se expresa como el recíproco de la dilución del suero que da al menos un 50 % de destrucción.
Los datos demuestran la funcionalidad de los anticuerpos inducidos después de la inyección con el grupo con adyuvante.
En conclusión, este ejemplo demuestra que el bioconjugado O6-EPA de P. aeruginosa es inmunógeno y funcional (es decir, induce anticuerpos que destruyen O6 de P. aeruginosa in vivo).

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una célula hospedadora que comprende:
i) un ácido nucleico que codifica una glicosiltransferasa derivada de un agrupamiento rfb de Pseudomonas; ii) un ácido nucleico que codifica una polimerasa wzy, en donde dicho ácido nucleico codifica una proteína que tiene aproximadamente o al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la SEQ ID NO:3, o en donde dicho ácido nucleico codifica la SEQ ID NO:3;
iii) un ácido nucleico que codifica una oligosacariltransferasa; y
iv) un ácido nucleico que codifica una proteína transportadora que comprende una secuencia consenso de N-glicosilación D/E - X - N - XS/T en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina.
2. La célula hospedadora de la reivindicación 1, en donde la glicotransferasa se deriva de un agrupamiento rfb de Pseudomonas aeruginosa.
3. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el ácido nucleico de (i) se ha insertado de forma estable en el genoma de la célula hospedadora.
4. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha oligosacariltransferasa es el gen pglb de C. jejuni.
5. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína transportadora es exotoxina A destoxificada de P. aeruginosa (EPA), CRM197, proteína de unión a maltosa (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A destoxificada de S. aureus, factor de agregación A, factor de agregación B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes destoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes destoxificadas de la toxina colérica, proteína Sat de E. coli, el dominio de pasajero de la proteína Sat de E. coli, neumolisina de Streptococcus pneumoniae y variantes destoxificadas de la misma, AcrA de C. jejuni, una glicoproteína natural de C. jejuni, PcrV (alias LcrV, EspA, SseB), PopB (YobB, YopD, FliC) u OprF, Oprl.
6. La célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde dicha célula hospedadora es E. coli.
7. Un método de producción de un bioconjugado que comprende un antígeno de Pseudomonas unido a una proteína transportadora, comprendiendo dicho método cultivar la célula hospedadora de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 en condiciones adecuadas para la producción de proteínas.
8. El método de la reivindicación 7 que comprende una etapa adicional de purificar una proteína transportadora N-glicosilada.
9. Un bioconjugado producido mediante el método de la reivindicación 7 u 8, en donde dicho bioconjugado comprende un antígeno de Pseudomonas unido a una proteína transportadora.
10. El bioconjugado de la reivindicación 9, en donde la proteína transportadora se selecciona del grupo que consiste en exotoxina A destoxificada de P. aeruginosa (EPA), CRM197, proteína de unión a maltosa (MBP), toxoide diftérico, toxoide tetánico, hemolisina A destoxificada de S. aureus, factor de agregación A, factor de agregación B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes destoxificadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidad B de la toxina colérica (CTB), toxina colérica, variantes destoxificadas de la toxina colérica, proteína Sat de E. coli, el dominio de pasajero de la proteína Sat de E. coli, neumolisina de Streptococcus pneumoniae y variantes destoxificadas de la misma, AcrA de C. jejuni, una glicoproteína natural de C. jejuni, PcrV (alias LcrV, EspA, SseB), PopB (YobB, YopD, FliC), OprF y Oprl.
11. El bioconjugado de la reivindicación 9 o 10, en donde dicho antígeno de Pseudomonas aeruginosa es un antígeno O de serotipo 01, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 u O20 de Pseudomonas aeruginosa.
12. Una composición que comprende el bioconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. El bioconjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 o la composición de la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad causada por una infección por Pseudomonas en un sujeto humano.
14. Una secuencia de ácido nucleico aislada que codifica un agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa modificado, en donde dicho agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa modificado comprende un gen que codifica una polimerasa wzy en donde el gen que codifica una polimerasa wzy se inserta cadena abajo de los genes del agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
15. La secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 14, en donde el gen que codifica dicha polimerasa wzy se inserta cadena abajo del gen wbpM del agrupamiento rfb de serotipo O6 de Pseudomonas aeruginosa.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201518668D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
CN105732818B (zh) * 2016-03-02 2019-06-07 中国人民解放军第三军医大学 一种铜绿假单胞菌重组蛋白pop及其制备方法和应用
ES2967001T3 (es) * 2017-06-23 2024-04-25 Affinivax Inc Composiciones inmunogénicas
AU2018354221A1 (en) 2017-10-25 2020-05-14 Pivot Bio, Inc. Methods and compositions for improving engineered microbes that fix nitrogen
CN112584699A (zh) * 2018-06-27 2021-03-30 皮沃特生物股份有限公司 引导微生物重塑、农业微生物物种合理改良的平台
WO2020191082A1 (en) 2019-03-18 2020-09-24 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, methods of production thereof, and methods of use thereof
AR118389A1 (es) 2019-03-18 2021-09-29 Janssen Pharmaceuticals Inc Métodos de producción de bioconjugados de polisacáridos de e. coli o-antígeno, sus composiciones y métodos de utilización
EP4118193A1 (en) * 2020-03-12 2023-01-18 Malcisbo AG Vaccines comprising glycoengineered bacteria
EP4213870A1 (en) 2020-09-17 2023-07-26 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Multivalent vaccine compositions and uses thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
KR20090110951A (ko) 2002-03-07 2009-10-23 아이드게노쉬쉐 테흐니쉐 호흐슐레 쥬리히 원핵 숙주에서의 재조합 글리코실화 단백질 생산 방법 및 생산계
EP2853600B1 (en) * 2005-05-11 2018-09-19 ETH Zürich Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells
ATE539079T1 (de) 2006-03-23 2012-01-15 Novartis Ag Imidazochinoxalinverbindungen als immunmodulatoren
CA2646891A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
WO2009104074A2 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Glycovaxyn Ag Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
HUE038456T2 (hu) * 2009-11-19 2018-10-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Bioszintetikus rendszer, amely immunogén poliszaccharidokat termel prokarióta sejtekben
DK2566507T3 (da) * 2010-05-06 2018-01-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Biokonjugatvacciner med kapselformige grampositive bakterier
JP2014526449A (ja) * 2011-09-06 2014-10-06 グリコヴァキシン アーゲー 原核細胞において製造されるバイオコンジュゲートワクチン
JP2015529214A (ja) * 2012-09-10 2015-10-05 グリコヴァキシン アーゲー 修飾された抗原を含むバイオコンジュゲート及びその使用
EA201590488A1 (ru) * 2012-10-12 2015-09-30 Гликоваксин Аг Способы модификации клеток-хозяев
ES2713166T3 (es) * 2012-11-07 2019-05-20 Glaxosmithkline Biologicals Sa Producción de vacuna recombinante en E. coli mediante conjugación enzimática
EP3055416B1 (en) * 2013-10-11 2020-01-22 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods of host cell modification

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