CN106794237B

CN106794237B - 经修饰的宿主细胞及其用途

Info

Publication number: CN106794237B
Application number: CN201480079804.3A
Authority: CN
Inventors: M.科瓦里克; S.J.肯姆勒尔; J.L.凯巴特; C.M-P.S.J.费朗
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2014-04-17
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2034-10-13
Also published as: BR112016023688A2; EP3711776B1; LT3131577T; PL3131577T3; ES2805000T3; JP2017513480A; CA2945542C; CN106794237A; CA2945542A1; ES2939470T3; CY1123403T1; EP3131577B1; PT3131577T; HRP20201021T1; EP3131577A1; MX2016013631A; BR112016023688B1; WO2015158403A1; JP2020114232A; JP6682451B2

Abstract

本文描述了可用于生产生物结合物的经修饰的宿主细胞，所述生物结合物可被用于为个体接种抗假单胞菌感染的疫苗。本文所述的经修饰的宿主细胞的基因组包含编码涉及蛋白质糖基化的蛋白质的基因以及针对假单胞菌特异性抗原的生产的基因。

Description

经修饰的宿主细胞及其用途

1.引言

本文描述了可用于生产生物缀合物的经修饰的宿主细胞，所述生物缀合物可被用于为个体接种抗假单胞菌感染的疫苗。本文所述的经修饰的宿主细胞的基因组包含编码涉及蛋白质糖基化的蛋白质的基因以及针对假单胞菌特异性抗原的生产的基因。

2.背景技术

由假单胞菌（例如，铜绿假单胞菌）菌株感染引起的疾病代表了世界范围内的一个主要威胁。虽然正在不断开发针对此类感染的疫苗，但对于可以安全地大量生产的抗假单胞菌感染的有效疫苗依然有着重大需求。

3.发明概述

在一个方面，本文提供了包含核酸的经修饰的原核宿主细胞，所述核酸编码能够生产包含假单胞菌抗原的生物缀合物的酶。此类宿主细胞可能天然表达针对假单胞菌抗原生产的核酸，或者可使得该宿主细胞表达此类核酸，即，在某些实施方案中，所述核酸与该宿主细胞异源。在某些实施方案中，所述针对假单胞菌抗原生产的核酸中的一种或多种与该宿主细胞异源并且被整合到该宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含这样的核酸，其编码在蛋白质的N-糖基化中有活性的另外的酶，例如，本文提供的宿主细胞还包含编码寡糖基转移酶的核酸和/或编码其它糖基转移酶的一种或多种核酸。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码载体蛋白（例如，寡糖和/或多糖可以附接其上而形成生物缀合物的蛋白质）的核酸。在特定的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

在特定的实施方案中，本文提供了包含核酸的经修饰的原核宿主细胞，所述核酸编码能够生产包含假单胞菌抗原的生物缀合物的酶，其中所述宿主细胞包含假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶。在特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶被整合到所述宿主细胞的基因组中。在另一个特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是铜绿假单胞菌的rfb簇或糖基转移酶。参见 Raymond 等人，J Bacteriol., 2002 184(13):3614-22。在特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌的rfb簇是血清型O1-O20中任一者的rfb簇。在另一个特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌的rfb簇是Knirel 等人，2006, Journal ofEndotoxin Research 12(6):324-336中所述的血清型中任一者的rfb簇，该公开通过引用全文并入本文。在特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌的rfb簇是血清型O2、O5、O6、O11、O15、O16的rfb簇。在特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌的rfb簇是血清型O6的rfb簇。在特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌的rfb簇是血清型O11的rfb簇。在另一个特定的实施方案中，所述宿主细胞包含编码寡糖基转移酶（例如，空肠弯曲菌的pglB）的核酸。在另一个特定的实施方案中，所述编码寡糖基转移酶（例如，空肠弯曲菌的pglB）的核酸被整合到所述宿主细胞的基因组中。在特定的实施方案中，所述宿主细胞包含编码载体蛋白的核酸。在另一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

在某些实施方案中，所述包含核酸（其编码能够生产包含假单胞菌抗原的生物缀合物的酶）的经修饰的原核宿主细胞还包含一种或多种辅助酶，包括分支酶、修饰酶、酰胺化酶、链长调控酶、乙酰化酶、甲酰化酶、聚合酶。在特定的实施方案中，所述一种或多种辅助酶与所述宿主细胞异源。在特定的实施方案中，在所述rfb簇之外，所述一种或多种辅助酶也被插入到所述经修饰的原核宿主细胞的基因组中。在特定的实施方案中，所述一种或多种辅助酶来源于假单胞菌，例如，铜绿假单胞菌。

在特定的实施方案中，本文提供的经修饰的原核宿主细胞包含编码甲酰基转移酶的核酸。在另一个特定的实施方案中，所述甲酰基转移酶是存在于SEQ ID NO:2或其同系物中的甲酰基转移酶。在另一个特定的实施方案中，所述甲酰基转移酶作为假单胞菌rfb簇的一部分被并入所述宿主细胞中（例如，被插入到其基因组中或由其表达的质粒中），其中所述假单胞菌rfb簇已经被修饰以包含所述甲酰基转移酶。在另一个特定的实施方案中，所述假单胞菌rfb簇是铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇。

在另一个特定的实施方案中，本文提供的经修饰的原核宿主细胞包含编码wzy聚合酶的核酸。在另一个特定的实施方案中，所述wzy聚合酶是存在于SEQ ID NO:3或其同系物中的wzy聚合酶。在另一个特定的实施方案中，所述wzy聚合酶作为假单胞菌rfb簇的一部分被并入所述宿主细胞中（例如，被插入到其基因组中或由其表达的质粒中），其中所述假单胞菌rfb簇已经被修饰以包含所述wzy聚合酶。在另一个特定的实施方案中，所述假单胞菌rfb簇是铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇。

在另一个特定的实施方案中，本文提供的经修饰的原核宿主细胞包含：(i) 编码甲酰基转移酶的核酸和(ii) 编码wzy聚合酶的核酸。在特定的实施方案中，所述甲酰基转移酶是存在于SEQ ID NO:2或其同系物中的甲酰基转移酶。在另一个特定的实施方案中，所述wzy聚合酶是存在于SEQ ID NO:3或其同系物中的wzy聚合酶。在特定的实施方案中，所述甲酰基转移酶和所述wzy聚合酶作为假单胞菌rfb簇的一部分被并入所述宿主细胞中（例如，被插入到其基因组中或由其表达的质粒中），其中所述假单胞菌rfb簇已经被修饰以包含所述甲酰基转移酶和wzy聚合酶。在另一个特定的实施方案中，所述假单胞菌rfb簇是铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇。

在另一方面，本文提供了编码经修饰的假单胞菌rfb簇（例如，铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇）的分离的核酸，其中所述经修饰的假单胞菌rfb簇包含：(i) 编码甲酰基转移酶的基因（例如，编码SEQ ID NO:2或其同系物的基因），(ii) 编码wzy聚合酶的基因（例如，编码SEQ ID NO3或其同系物的基因）；或(iii) 编码甲酰基转移酶的基因（例如，编码SEQID NO:2或其同系物的基因）和编码wzy聚合酶的基因（例如，编码SEQ ID NO3或其同系物的基因）。

可以在多个位置并以多个取向将用于生成经修饰的假单胞菌rfb簇（例如，经修饰的铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇）的编码甲酰基转移酶的核酸和编码wzy聚合酶的核酸插入到所述rfb簇中。

在特定的实施方案中，编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因被插入到所述假单胞菌rfb簇（例如，铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇）的基因的下游。在特定的实施方案中，编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因被插入到铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇的wbpM基因的下游。

在特定的实施方案中，编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因被插入到所述假单胞菌rfb簇（例如，铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇）的基因的上游。在特定的实施方案中，编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因被插入到铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇的wzz基因的下游。

在特定的实施方案中，编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因以相对于所述假单胞菌rfb簇（例如，铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇）的基因顺时针取向被插入。

在特定的实施方案中，编码所述甲酰基转移酶的基因和/或编码所述wzy聚合酶的基因以相对于所述假单胞菌rfb簇（例如，铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇）的基因逆时针取向被插入。

在另一方面，本文提供了生产包含连接至载体蛋白的假单胞菌抗原的生物缀合物的方法，所述方法包括：在适于生产蛋白质的条件下培养本文所述的宿主细胞，并纯化N-糖基化的载体蛋白。用于使用宿主细胞（例如，大肠杆菌）生产蛋白质以及分离由宿主细胞生产的蛋白质的方法是本领域熟知的。

在另一方面，本文提供了由本文提供的宿主细胞生产的生物缀合物。

在特定的实施方案中，本文提供了包含连接至假单胞菌抗原的载体蛋白的生物缀合物。在特定的实施方案中，所述假单胞菌抗原是铜绿假单胞菌的O抗原。

在另一方面，本文提供了包含一种或多种本文提供的生物缀合物的组合物（例如，药物组合物）。

在特定的实施方案中，本文提供了包含生物缀合物的的组合物（例如，药物组合物），所述生物缀合物包含连接至假单胞菌抗原的载体蛋白。在特定的实施方案中，所述假单胞菌抗原是铜绿假单胞菌的O抗原。

在另一方面，本文提供了预防个体（例如，人类个体）被假单胞菌（例如，铜绿假单胞菌）感染的方法，包括向所述个体施用有效量的本文所述的组合物。

在另一方面，本文提供了治疗已经被假单胞菌（例如，铜绿假单胞菌）感染的个体（例如，人类个体）的方法，包括向所述个体施用有效量的本文所述的组合物。

在另一方面，本文提供了在个体（例如，人类个体）中诱导针对假单胞菌（例如，铜绿假单胞菌）的免疫应答的方法，包括向所述个体施用有效量的本文所述的组合物。

3.1术语

OPS: O 多糖；革兰氏阴性菌的O抗原。OPS在本文中也被称为O抗原。

LPS: 脂多糖。

rfb簇：编码能够合成O抗原主链结构的酶促机械的基因簇。

waaL：编码具有位于周质中的活性位点的膜结合酶的O抗原连接酶基因。所编码的酶将十一碳异戊二烯磷酸（UPP）结合的O抗原转移到脂质A核心，形成脂多糖。

RU: 重复单元。如本文所用，RU被设为等于生物重复单元，BRU。BRU描述O抗原（当其体内合成时）的RU。

Und-PP: 十一碳异戊二烯焦磷酸。

LLO: 脂质连接的寡糖。

如本文所用，术语“生物缀合物”指代蛋白质（例如，载体蛋白）与抗原（例如，在宿主细胞背景中制备的假单胞菌抗原）之间的缀合物，其中宿主细胞机械将所述抗原连接至所述蛋白质（例如，N-连接）。

术语“约”，当结合数字使用时，指代所引用数字的±1、±5或±10%以内的任何数字。

如本文所用，术语“有效量”，在向个体施用疗法（例如，本文所述的组合物）的上下文中，指代具有预防和/或治疗效果的疗法的量。在某些实施方案中，“有效量”指代这样的疗法的量，其足以达到以下效果中的一种、两种、三种、四种或更多种：(i) 降低或改善假单胞菌感染或其相关症状的严重程度；(ii) 缩短假单胞菌感染或其相关症状的持续时间；(iii) 预防假单胞菌感染或其相关症状的进展；(iv) 引起假单胞菌感染或其相关症状的消退；(v) 预防假单胞菌感染或其相关症状的发展或发作；(vi) 预防假单胞菌感染或其相关症状的复发；(vii) 减少与假单胞菌感染相关的器官衰竭；(viii) 减少患有假单胞菌感染的个体的住院；(ix) 缩短患有假单胞菌感染的个体的住院时间；(x) 提高患有假单胞菌感染的个体的存活率；(xi) 消除个体中的假单胞菌感染；(xii) 抑制或减少个体中的假单胞菌复制；和/或(xiii) 增强或改进另一种疗法的预防或治疗效果。

如本文所用，术语“组合”，在向个体施用两种或更多种疗法的上下文中，指代使用不止一种疗法。使用术语“组合”并不限制向个体施用疗法的次序。例如，可以在施用第二疗法之前（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前）、同时或之后（例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、16小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后）向个体施用第一疗法（例如，本文所述的组合物）。

如本文所用，术语“个体”指代动物（例如，鸟类、爬行类和哺乳类）。在另一个实施方案中，个体是哺乳动物，包括非灵长类（例如，骆驼、驴、斑马、奶牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、大鼠和小鼠）和灵长类（例如，猴子、黑猩猩和人）。在某些实施方案中，个体是非人动物。在一些实施方案中，个体是家畜或宠物（例如，狗、猫、马、山羊、绵羊、猪、驴或鸡）。在特定的实施方案中，个体是人。术语“个体”和“患者”在本文中可互换使用。

4.附图简述

图1描绘了生产生物缀合物的经修饰的宿主细胞的周质提取物的Western印迹。标明了如实施例中所述的菌株。“Int.”指代整合组件。“*”指代使用转座子介导的方法的整合。

图2描绘了铜绿假单胞菌的O6 O抗原的重复单元结构。* 表明其化学组成可以根据亚血清型特征而变化的位置。通过酰胺酶（其将GalNAcA残基C6处的酸性官能团转化成酰胺基）活性而引入可变性，得到GalNAcAN（或将GalNFmA转化成GalNFmAN；在一些亚血清型中，乙酰基取代GalNAcAN*残基的C3）。用于重复单元（wzy）的聚合化、GalNX残基之一的乙酰化、甲酰化和酰胺化的基因是未知的。L-Rha, L-鼠李糖; D-GalNAcAN, 6-酰氨基-2-N-乙酰基-D-半乳糖胺糖醛酸; D-GalNFmAN, 2-N-甲酰基-D-半乳糖胺糖醛酸; D-QuiNAc, N-乙酰基-D-氨基戊糖。

图3：铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶的功能测试。3A: 通过Western印迹检测结合至脂质A核心的甲酰化的单一O6重复单元。用编码（不完整的）rfbO6簇的粘粒和编码O6甲酰基转移酶（fmtO6; SEQ NO:2）的表达质粒转化大肠杆菌W3110 Δwec。在LB培养液中于37℃生长期间过夜诱导后收获细胞提取物，用蛋白酶K消化，通过SDS PAGE分离，并在硝化纤维膜上电印迹。用O6特异性抗血清的免疫检测在存在fmtO6的情况下诱导了信号，但在空载体对照中却没有。此结果充分表明，甲酰化是铜绿假单胞菌细胞上的相关抗原并且是使用此抗血清进行检测的前提。3B: 确认从十一碳异戊二烯焦磷酸释放的单一O6重复单元上的甲酰化用如上相同的质粒转化大肠杆菌W3110 Δwec ΔwaaL并在摇瓶中生长以生产O6 O抗原单一重复单元（这些菌株中缺少wzy聚合酶）并分析糖脂。简而言之，从干燥细胞中以糖脂形式提取重复单元，通过对C18滤筒的亲和力纯化，水解（以从O6 O抗原重复单元中移除十一碳异戊二烯焦磷酸），使用还原胺化反应以2-氨基苯甲酰胺标记，并通过正相HPLC分析。fmtO6的共表达在61’的洗脱时间处产生额外的信号，含有对应于经标记的、甲酰化的O6重复单元的寡糖，而在不存在该基因的情况下，主信号位于58’处并含有经标记的N乙酰化的O6重复单元。

图4：铜绿假单胞菌O6候选wzy聚合酶的功能测试。用编码fmtO6 和 wzy候选基因PAK_01823（SEQ ID NO:3）的质粒或对应的空载体转化含有编码（不完整的）rfb簇（缺少fmtO6 和 wzy基因）的粘粒的大肠杆菌W3110 Δwec细胞。将细胞提取物用蛋白酶K处理并在SDS PAGE以及电转移至硝化纤维膜之后通过免疫检测分析LPS。

图5：克隆人工铜绿假单胞菌O6 O抗原表达簇首先，通过PCR克隆使用标准技术将铜绿假单胞菌O6菌株stGVXN4017（铜绿假单胞菌O6“PAK”菌株）克隆到粘粒载体中。生物信息学支持的同源搜索识别出甲酰基转移酶(FT)和O-抗原聚合酶(wzy)，随后以逐步的方式将其插入到rfb簇的下游。所得的基因簇能够在大肠杆菌W3110衍生物中保证完整的铜绿假单胞菌O6 O抗原重复单元生物合成（rfbO6+，无聚合物）和多糖（rfbO6++，其中包括wzy）生物合成。

图6描绘了生产生物缀合物的经修饰的宿主细胞的周质提取物的Western印迹。标明了如实施例中所述的菌株。6A: 经修饰以包含铜绿假单胞菌O6的整合的pglB和整合的rfb簇的“St7343”大肠杆菌菌株的结果。6B: 经修饰以包含铜绿假单胞菌O6的质粒携带的pglB和整合的rfb簇的“St7209”大肠杆菌菌株的结果。6C: 经修饰以包含铜绿假单胞菌O6的质粒携带的pglB和质粒携带的rfb簇的“St2182”大肠杆菌菌株的结果。

图7：经纯化的EPA-O6糖缀合物。使用金属螯合亲和层析、阴离子交换层析和尺寸排阻层析（SEC）从经修饰的宿主细胞的周质提取物纯化EPA-O6。最终SEC洗脱液通过SDS-PAGE后接考马斯亮蓝染色或Western印迹（使用所指示的抗体）进行表征。

图8：在存在和不存在抗生素选择压力的情况下的1和3质粒系统的质粒保持（PR）。PR以含有相应质粒的细胞的%表示。图A和B示出了在存在（A）和不存在（B）卡那霉素的情况下，含有整合的rfb簇和pglB的经修饰的宿主细胞中EPA-质粒（卡那霉素，黑色）的PR。图C和D示出了在存在（C）和不存在（D）全部三种抗生素的情况下，经修饰的宿主细胞中EPA-质粒（卡那霉素，黑色）、pglB-质粒（大观霉素，白色）和rfb簇质粒（四环素，小圆点）的PR。其中保持了全部三种质粒的细胞的百分比以灰色示出。Inoc=接种物; U=未诱导细胞; I4=诱导后6小时的细胞; I6=o/n诱导后的细胞

图9：疫苗诱导的抗-O6抗血清的生物活性。9A: 来自不同疫苗接种组在第三次注射后的汇集的小鼠血清的ELISA中点效价。Non ads= 无佐剂，O/W: 表明所用的佐剂，一种水包油乳液佐剂。单独的O/W是不含糖缀合物的对照组。9B: 表明了调理吞噬杀伤的中点效价（相比对照，诱导cfu减少50%）。pII和pIII集合是在第二次和第三次注射后收获的汇集的血清。

5.发明详述

5.1 宿主细胞

本文提供了宿主细胞，例如，原核宿主细胞，其能够生产包含连接至载体蛋白的假单胞菌抗原的生物缀合物。本文所述的宿主细胞包含其中已经插入了一种或多种DNA序列的基因组，其中所述DNA序列编码蛋白质或包含涉及蛋白质糖基化（例如，蛋白质的N-糖基化）的操纵子。例如，在某些实施方案中，本文所述的宿主细胞包含其中已经插入了以下中的一种或多种的基因组：编码寡糖基转移酶的DNA、编码糖基转移酶的DNA、编码载体蛋白的DNA、包含rfb基因簇的DNA、包含荚膜多糖基因簇的DNA、编码翻转酶的DNA、编码表异构酶的DNA、编码与荚膜多糖基因簇相关的蛋白质的DNA、编码涉及荚膜多糖装配的蛋白质的DNA、编码涉及O抗原装配的蛋白质的DNA、编码涉及脂多糖装配的蛋白质的DNA和/或编码涉及脂寡糖装配的蛋白质的DNA。在特定的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

生产假单胞菌生物缀合物的宿主细胞

在另一个方面，本文提供了包含核酸的经修饰的原核宿主细胞，所述核酸编码能够生产包含假单胞菌抗原的生物缀合物的酶。此类宿主细胞可能天然表达针对假单胞菌抗原生产的核酸，或者可使得该宿主细胞表达此类核酸，即，在某些实施方案中，所述核酸与该宿主细胞异源。在某些实施方案中，所述针对假单胞菌抗原生产的核酸中的一种或多种与该宿主细胞异源并且被整合到该宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含这样的核酸，其编码在蛋白质的N-糖基化中有活性的另外的酶，例如，本文提供的宿主细胞还包含编码寡糖基转移酶的核酸和/或编码其它糖基转移酶的一种或多种核酸。在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码载体蛋白（例如，寡糖和/或多糖可以附接其上而形成生物缀合物的蛋白质）的核酸。在特定的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

在特定的实施方案中，本文提供了包含核酸的经修饰的原核宿主细胞，所述核酸编码能够生产包含假单胞菌抗原的生物缀合物的酶，其中所述宿主细胞包含假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶。在特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶被整合到所述宿主细胞的基因组中。在另一个特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是铜绿假单胞菌的rfb簇。在另一个特定的实施方案中，所述宿主细胞包含编码寡糖基转移酶（例如，空肠弯曲菌的pglB）的核酸。在另一个特定的实施方案中，所述编码寡糖基转移酶（例如，空肠弯曲菌的pglB）的核酸被整合到所述宿主细胞的基因组中。在特定的实施方案中，所述宿主细胞包含编码载体蛋白的核酸。在另一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

在另一个特定的实施方案中，本文提供了包含以下的经修饰的原核宿主细胞：(i)假单胞菌的rfb簇，其中所述rfb簇被整合到所述宿主细胞的基因组中；(ii) 编码寡糖基转移酶（例如，空肠弯曲菌的pglB）的核酸，其中所述编码寡糖基转移酶的核酸被整合到所述宿主细胞的基因组中；和(iii) 载体蛋白，其中所述载体蛋白是质粒携带的或被整合到所述宿主细胞的基因组中。在另一个特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇是铜绿假单胞菌的rfb簇。在另一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

在另一个特定的实施方案中，本文提供了包含以下的经修饰的原核宿主细胞：(i)源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶，其中所述糖基转移酶被整合到所述宿主细胞的基因组中；(ii) 编码寡糖基转移酶（例如，空肠弯曲菌的pglB）的核酸，其中所述编码寡糖基转移酶的核酸被整合到所述宿主细胞的基因组中；和(iii) 载体蛋白，其中所述载体蛋白是质粒携带的或被整合到所述宿主细胞的基因组中。在另一个特定的实施方案中，所述源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是铜绿假单胞菌的rfb簇。在另一个特定的实施方案中，所述宿主细胞是大肠杆菌。

在特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是铜绿假单胞菌的rfb簇或糖基转移酶。在另一个特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是铜绿假单胞菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20的rfb簇或糖基转移酶在另一个特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌的rfb簇是Knirel 等人，2006, Journal ofEndotoxin Research 12(6):324-336中所述的血清型中任一者的rfb簇，该公开通过引用全文并入本文。在特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是铜绿假单胞菌血清型O6 PAK菌株的rfb簇或糖基转移酶。在特定的实施方案中，所述假单胞菌的rfb簇或源自假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶是铜绿假单胞菌血清型O11（例如，铜绿假单胞菌菌株PA103）的rfb簇或糖基转移酶（参见，例如，Genbank登录号KF364633.1）。在特定的实施方案中，在所述铜绿假单胞菌血清型O6 PAK菌株的rfb簇以外，还（例如，通过质粒或整合）引入了编码甲酰基转移酶（GenBank: EOT23134.1; NCBI 蛋白质 ID: PAK_01412; SEQ ID NO:2）和wzy聚合酶（GenBank: EOT19368.1; NCBI 蛋白质ID: PAK_01823; SEQ ID NO:3）的基因以对其进行功能扩展。

在特定的实施方案中，本文提供了包含核酸的经修饰的原核宿主细胞，所述核酸编码能够生产包含假单胞菌O6抗原的生物缀合物的酶。在特定的实施方案中，所述宿主细胞包含铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇、编码wzy聚合酶的核酸和甲酰基转移酶。在特定的实施方案中，所述wzy聚合酶是铜绿假单胞菌O6 wzy聚合酶(SEQ ID NO:3)或其同系物（例如，铜绿假单胞菌的PAK或LESB58菌株的wzy聚合酶）。在另一个特定的实施方案中，所述甲酰基转移酶是铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶(SEQ ID NO:2)或其同系物（例如，铜绿假单胞菌的PAK或LESB58菌株的甲酰基转移酶）。在某些实施方案中，编码rfb簇、wzy聚合酶和/或甲酰基转移酶的核酸中的一种或多种被插入到所述宿主细胞的基因组中，例如，使用本文所述的方法。在特定的实施方案中，编码rfb簇、wzy聚合酶和甲酰基转移酶的核酸中的每一种均被插入到所述宿主细胞的基因组中，例如，使用本文所述的方法。在某些实施方案中，所述宿主细胞还包含：编码寡糖基转移酶（例如，空肠弯曲菌的pglB）的核酸，其中所述编码寡糖基转移酶的核酸是质粒携带的或被整合到所述宿主细胞的基因组中；和编码载体蛋白的核酸，其中所述编码所述载体蛋白的核酸是质粒携带的或被整合到所述宿主细胞的基因组中。在特定的实施方案中，所述编码所述寡糖基转移酶的核酸被整合到所述宿主细胞的基因组中。

遗传背景

可以用于生成本文所述的经修饰的宿主细胞的示例性宿主细胞包括但不限于：埃希氏杆菌属物种、志贺氏杆菌属物种、克雷白氏杆菌属物种、黄单胞菌属（Xhantomonas）物种、沙门氏菌属物种、耶尔森氏菌属物种、乳球菌属物种、乳酸杆菌属物种、假单胞菌属物种、棒状杆菌属物种、链霉菌属物种、链球菌属物种、葡萄球菌属物种、芽孢杆菌属物种和梭状芽孢杆菌属物种。在特定的实施方案中，本文所用的宿主细胞是大肠杆菌。

在某些实施方案中，通过例如缺失一个或多个基因来修饰宿主细胞遗传背景。宿主细胞中可以缺失（以及，在一些情况下，用其它所需的核酸序列替换）的示例性基因包括涉及糖脂生物合成的宿主细胞基因，如waaL（参见，例如，Feldman 等人，2005, PNAS USA102:3016-3021）、O抗原决定簇（rfb 或 wb）、肠细菌共同抗原决定簇（wec）、脂质A核心生物合成簇（waa）和原噬菌体O抗原修饰簇（如gtrABS簇）。在特定的实施方案中，本文所述的宿主细胞经修饰使得其不产生除所需的例如O抗原假单胞菌的O抗原以外的任何O抗原。在特定的实施方案中，本文提供的原核宿主细胞的基因组缺失或功能上失活waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因中的一个或多个或wec簇的一个或多个基因或rfb基因簇的一个或多个基因。在一个实施方案中，本文所用的宿主细胞是大肠杆菌，其中所述宿主细胞的基因组缺失或功能上失活waaL基因、gtrA基因、gtrB基因、gtrS基因。在另一个实施方案中，本文所用的宿主细胞是大肠杆菌，其中所述宿主细胞的基因组缺失或功能上失活waaL基因和gtrS基因。在另一个实施方案中，本文所用的宿主细胞是大肠杆菌，其中所述宿主细胞的基因组缺失或功能上失活waaL基因和wec簇的多个基因。

载体蛋白

适用于生产缀合物疫苗（例如，用于疫苗的生物缀合物）的任何载体蛋白均可以用于本文中，例如，编码所述载体蛋白的核酸可以被引入到本文提供的宿主中用于生产包含连接至假单胞菌抗原的载体蛋白的生物缀合物。示例性载体蛋白包括但不限于：脱毒的铜绿假单胞菌外毒素A(EPA：参见，例如，Ihssen, 等人，(2010) Microbial cell factories9, 61)、CRM197、麦芽糖结合蛋白(MBP)、白喉类毒素、破伤风类毒素、脱毒的金黄色葡萄球菌溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、脱毒的大肠杆菌不耐热肠毒素变体、霍乱毒素B亚单位(CTB)、霍乱毒素、脱毒的霍乱毒素变体、大肠杆菌Sat蛋白、大肠杆菌Sat蛋白的乘客域、肺炎链球菌肺炎球菌溶血素及其脱毒变体、空肠弯曲菌AcrA、假单胞菌PcrV蛋白以及空肠弯曲菌天然糖蛋白。

在特定的实施方案中，由本文提供的经修饰的宿主细胞表达的载体蛋白是从已经被整合到所述经修饰的宿主细胞的基因组中的核酸表达的。也就是说，编码所述载体蛋白的核酸已经被整合到所述宿主细胞基因组中。在某些实施方案中，由本文提供的经修饰的宿主细胞表达的载体蛋白是从已经被引入到所述经修饰的宿主细胞中的质粒表达的。

在某些实施方案中，用于生成本文所述的生物缀合物的载体蛋白是经修饰的，例如，以这样的方式修饰使得所述蛋白质毒性更低并且/或者更易受糖基化影响。在特定的实施方案中，用于生成本文所述的生物缀合物的载体蛋白是经修饰的，使得所述载体蛋白上的糖基化位点的数目以下述方式被最大化：其允许施用更低浓度的所述蛋白质，例如，在免疫原性组合物中，以其生物缀合物形式。

在某些实施方案中，相比将通常与所述载体蛋白相关联的糖基化位点，本文所述的载体蛋白经修饰以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化位点（例如，相对于与所述载体蛋白的天生/天然，例如，“野生型”状态相关联的糖基化位点的数目）。在特定的实施方案中，引入糖基化位点通过在所述蛋白质的一级结构中的任何位置插入糖基化共有序列（例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸；或Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro以外的任何天然氨基酸（参见WO 2006/119987））而实现。引入此类糖基化位点可以通过例如向所述蛋白质的一级结构添加新的氨基酸（即，所述糖基化位点以完整或部分的形式添加），或通过突变所述蛋白质中现有的氨基酸以生成所述糖基化位点（即，不向所述蛋白质中添加氨基酸，而是突变所述蛋白质中选定的氨基酸从而形成糖基化位点）而实现。本领域技术人员将认识到，可以使用本领域已知的方法（例如，包括修饰编码蛋白质的核酸序列的重组方法）容易地修饰所述蛋白质的氨基酸序列。在特定的实施方案中，糖基化共有序列被引入到所述载体蛋白的特定区中，例如，所述蛋白质的表面结构、所述蛋白质的N或C末端和/或由所述蛋白质碱基上的二硫桥键所稳定的环。在某些实施方案中，经典的5氨基酸糖基化共有序列可通过赖氨酸残基延长以实现更有效率的糖基化，并因而所述插入的共有序列可编码5、6或7个氨基酸，其将被插入或其将替代受体蛋白质氨基酸。

在某些实施方案中，用于生成本文所述的生物缀合物的载体蛋白包含“标签”，即，允许分离和/或识别所述载体蛋白的氨基酸序列。例如，向本文所述的载体蛋白中添加标签可以用于纯化该蛋白质并因此纯化包含所述带标签的载体蛋白的缀合物疫苗。可用于本文中的示例性标签包括但不限于：组氨酸（HIS）标签（例如，六组氨酸标签或6XHis标签）、FLAG-TAG和HA标签。在某些实施方案中，本文所用的标签是可移除的（例如，通过化学试剂或通过酶促方法移除），一旦不再需要它们（例如，在蛋白质已经被纯化后）。

在某些实施方案中，本文所述的载体蛋白包含信号序列，其将所述载体蛋白靶向表达所述载体蛋白的宿主细胞的周质空间。在特定的实施方案中，所述信号序列来自：大肠杆菌DsbA、大肠杆菌外膜孔蛋白A(OmpA)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MalE)、胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酸裂解酶(PelB)、FlgI、NikA或芽孢杆菌木聚糖内切酶(XynA)、不耐热大肠杆菌肠毒素LTIIb、芽孢杆菌木聚糖内切酶XynA或大肠杆菌鞭毛蛋白(FlgI)。

糖基化机械

寡糖基转移酶

寡糖基转移酶将脂质连接的寡糖转移到新生多肽链的天冬酰胺残基上，所述新生多肽链包含N-糖基化共有基序，例如，Asn-X-Ser(Thr)，其中X可以是除Pro以外的任何氨基酸；或 Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro以外的任何天然氨基酸(参见WO 2006/119987)。参见，例如，WO 2003/074687 和 WO 2006/119987，其公开内容以引用方式全文并入本文中。

在某些实施方案中，本文提供的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸。所述编码寡糖基转移酶的核酸可以是所述宿主细胞原生的，或者可以使用如上所述的遗传方法被引入到所述宿主细胞中。所述寡糖基转移酶可以来自本领域已知的任何来源。在特定的实施方案中，所述寡糖基转移酶是弯曲菌属的寡糖基转移酶。在另一个特定的实施方案中，所述寡糖基转移酶是空肠弯曲菌的寡糖基转移酶（即，pglB；参见，例如，Wacker 等人，2002,Science 298:1790-1793；还参见，例如，NCBI 基因 ID: 3231775，UniProt 登录号O86154）。在另一个特定的实施方案中，所述寡糖基转移酶是红嘴鸥弯曲菌的寡糖基转移酶（参见，例如，NCBI 基因 ID: 7410986）。

在特定的实施方案中，本文提供的经修饰的宿主细胞包含编码寡糖基转移酶的核酸序列，其中所述编码寡糖基转移酶的核酸序列被整合到所述宿主细胞的基因组中。

辅助酶

在某些实施方案中，编码一种或多种辅助酶的核酸被引入到本文所述的经修饰的宿主细胞中。此类编码一种或多种辅助酶的核酸可以是质粒携带的或被整合到本文所述的宿主细胞的基因组中。示例性辅助酶包括但不限于：表异构酶、分支酶、修饰酶、酰胺化酶、链长调控酶、乙酰化酶、甲酰化酶、聚合酶。

可以被插入到本文所述的宿主细胞中的编码表异构酶的核酸序列是本领域已知的。在某些实施方案中，所述被插入到本文所述的宿主细胞中的表异构酶是在国际专利申请公布号WO 2011/062615中所述的表异构酶，其公开内容以引用方式全文并入本文中。在特定的实施方案中，所述表异构酶是由大肠杆菌菌株O157的Z3206基因编码的表异构酶。参见，例如，WO 2011/062615 和 Rush 等人，2009, The Journal of Biological Chemistry285:1671-1680，其以引用方式全文并入本文中。在特定的实施方案中，本文提供的经修饰的宿主细胞包含编码表异构酶的核酸序列，其中所述编码表异构酶的核酸序列被整合到所述宿主细胞的基因组中。

在某些实施方案中，编码甲酰基转移酶的核酸序列被插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。甲酰基转移酶是催化将甲酰基转移到受体分子上的酶。在特定的实施方案中，编码铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶fmtO6(SEQ ID NO:2)或其同系物（例如，铜绿假单胞菌的PAK或LESB58菌株的wzy聚合酶）的核酸序列被插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。在另一个特定的实施方案中，编码与SEQ ID NO:2具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白质的核酸序列被插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。

某些涉及多糖生物合成的甲酰基转移酶是已知的，并且可以被插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。例如，vioF是来自产碱普罗威登斯菌血清型O30的酶，其与土拉热弗朗西丝氏菌的甲酰基转移酶48%相同（Nagaraja 等人2005)。其将dTDP-D-Qui4N转化成dTDP-D-Qui4NFo，并且涉及O-抗原生物合成（Liu 等人2012, Glycobiology 22(9):1236–1244）。另一种涉及多糖生物合成的甲酰基转移酶是arnA（例如，来自大肠杆菌），一种双功能酶，其中N-末端域将UDP-Ara4N转化成UDP-AraNFo，而C-末端域涉及UDP-葡糖醛酸的氧化脱羧。两种酶活性对于脂质A的L-Ara4N修饰以及多粘菌素抗性都是必需的（Breazeale 等人，2005, The Journal of Biological Chemistry 280(14):14154-14167）。另一种涉及多糖生物合成的甲酰基转移酶是wekD，一种来自大肠杆菌血清型O119的酶，涉及TDP-DRhaNAc3NFo的生物合成（Anderson 等人，1992, Carbohydr Res.237:249-62）。

另外，与甲酰基转移酶活性有关的域已经被表征。所谓的FMT_核心域存在于大多数甲酰基转移酶中。实例包括：甲硫氨酰-tRNA甲酰基转移酶、磷酸核糖甘氨酰胺甲酰基转移酶1、UDP-葡糖醛酸脱羧酶/UDP-4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖甲酰基转移酶、产碱普罗威登斯菌O30的vioF 和大肠杆菌的arnA。上述甲酰基转移酶使用FTHF(N-10-甲酰四氢叶酸)作为甲酰基供体。使用FTHF(10-甲酰四氢叶酸)作为底物的产甲酸酶也含有此域。另外，AICARFT存在于磷酸核糖基氨基咪唑甲酰胺甲酰基转移酶/IMP环水解酶中，而FDH_GDH存在于磷酸核糖甘氨酰胺转甲酰基酶2中。

在某些实施方案中，编码O抗原聚合酶(wzy基因)的核酸序列被插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。O抗原聚合酶是多跨膜蛋白。其使用十一碳异戊二烯焦磷酸结合的O抗原重复单元作为底物以生成由这些重复单元组成的线性聚合物。O抗原聚合酶(wzy)存在于通过wzy依赖机制合成O抗原聚合酶的革兰氏阴性菌中。

在特定的实施方案中，编码铜绿假单胞菌wzy聚合酶(SEQ ID NO:3)或其同系物（例如，铜绿假单胞菌的PAK或LESB58菌株的wzy聚合酶）的核酸序列被插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。已知包含wzy聚合酶的细菌的实例包括：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、福氏志贺氏菌和鼠伤寒沙门氏菌。在另一个特定的实施方案中，编码与SEQ ID NO:3具有约或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或同源性的蛋白质的核酸序列被插入到本文所述的宿主细胞中或由其表达。

基因拷贝数

在某些实施方案中，被整合到本文提供的经修饰的宿主细胞中的基因的拷贝数是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在特定的实施方案中，被整合到本文提供的经修饰的宿主细胞中的基因的拷贝数是1或2。

有益效果

本文所述的经修饰的宿主细胞具有特别的商业重要性和相关性，因为其允许包含假单胞菌抗原的生物缀合物的大规模发酵，由于插入染色体的DNA的稳定性增加及因此造成的发酵期间目标DNA的表达提高，所述生物缀合物可以更低的风险用作治疗剂（例如，在免疫原性组合物、疫苗中）。本文所述的经修饰的宿主细胞在生成本文所述的生物缀合物上优于依靠质粒携带表达所需核酸的宿主细胞，尤其是因为，一旦异源DNA被插入到所述宿主细胞基因组中，在发酵期间就不再需要抗生素选择。也就是说，当所述插入DNA被插入到染色体中，其不需要被选择，因为其随着所述宿主基因组的复制一同增殖。另外，已知质粒携带系统的缺点在于：丢失质粒的风险随着每一世代（即，宿主细胞复制周期）而增加。这种质粒丢失是由于细胞分裂期间在细胞分离阶段质粒有时不当分配到子细胞所造成的。相比较小发酵规模，细菌细胞培养在大规模下更频繁地复制而达到高细胞密度。因此，更高的细胞稳定性和插入DNA的表达导致更高的产物产率，提供了明显的优势。此外，细胞稳定性还是供监管部门审批的工艺验收标准，而抗生素选择出于各种原因通常在发酵中是不期望的，例如，抗生素作为杂质存在于最终医疗产品中并承担着引起过敏反应的风险，并且抗生素可能促进抗生素抗性（例如，通过基因转移或抗性病原体选择）。

本申请提供了经修饰的宿主细胞用于制备包含假单胞菌抗原的生物缀合物，所述生物缀合物可被用作治疗剂（例如，在免疫原性组合物、疫苗中），其中驱动生物缀合物生产所必需的某些遗传元件被稳定地整合到所述宿主细胞基因组中。因此，所述宿主细胞可以含有减少数目的质粒、仅单个质粒或完全不含质粒。在一些实施方案中，单个质粒的存在可以得到生产菌株的更大的灵活性以及改变所述缀合物的性质（就其糖类或载体蛋白含量而言）的能力，该能力容易导致生产菌株的更大的灵活性。

一般来讲，减少质粒的使用导致更适用于生产医疗产品的生产菌株。必需遗传物质存在于质粒上的缺点在于需要选择压力以将染色体外元件保持在宿主细胞中。所述选择压力需要使用抗生素，而这对于生产医疗产品而言是不期望的，这是由于例如针对抗生素的过敏反应的危险以及额外的制造成本。此外，选择压力常常是不完全的，导致不均匀的细菌培养，其中一些克隆已经丢失了质粒并因而不生产生物缀合物。因此，本文所述的宿主细胞能够生产可以高产率获得的更安全的产物。

5.2 将核酸整合/引入到宿主细胞中的方法

本领域已知的任何方法均可用于将核酸（例如，基因或操纵子，例如，rfb簇）整合到宿主细胞的基因组中。

在特定的实施方案中，使用在国际专利申请号PCT/EP2013/071328中所述的插入方法将异源核酸引入到本文所述的宿主细胞中。根据此方法，大型连续DNA序列可以被稳定地直接插入到宿主细胞基因组中。简而言之，所述方法包括下列步骤中的一些或全部：

步骤1：制备供体质粒。将所需的异源插入DNA序列（即，包含一个或多个目标基因的异源插入DNA序列）克隆到适合用作供体质粒的质粒的克隆位点（例如，多克隆位点，简称MCS）中。适用作同源区的DNA序列（即，与宿主细胞基因组上的插入位置同源的DNA序列）也被克隆到所述供体质粒中，使得所述同源区侧接所述异源插入DNA。这些克隆和装配所述供体质粒的方法可以根据任何成熟并众所周知的修饰和合成DNA的技术完成，如但不限于：使用限制性内切酶和连接酶的分子克隆、转座酶、化学合成等本领域技术人员已知的技术。

在某些实施方案中，包含开放阅读框的选择标记盒被定位在同源臂之间，所述开放阅读框编码赋予抗生素抗性的蛋白质。包含插入到其基因组中的异源插入DNA的宿主细胞可以通过将其在包含抗生素的培养基中培养而识别，其中所述选择标记盒的抗生素抗性基因提供针对所述抗生素的抗性。在某些实施方案中，所述选择标记盒可侧接FRT位点，其允许稍后通过定点重组移除所述标记盒。以此方式将FRT位点并入供体质粒中从而确保所述选择标记盒不会保持整合到宿主细胞基因组中。在另一个实施方案中，所述选择标记盒可以在整合后经由dif位点介导的定点同源重组或通过其它定点染色体诱变技术而被移除。

所述供体质粒可以被进一步工程改造以包含编码反选择蛋白的开放阅读框。适用于反选择方法的编码本领域技术人员已知的蛋白质的任何基因均可以被并入本文所述的供体质粒中。在特定的实施方案中，sacB基因被用于反选择。

所述供体质粒可以被进一步工程改造以包含复制起点。本领域技术人员将容易认识到，并入供体质粒的复制起点应当适用于正在经历基因组修饰的宿主细胞。例如，当正在大肠杆菌中进行克隆时，必须存在大肠杆菌复制起点。在特定的实施方案中，所述复制起点是oriT。本领域技术人员将容易认识到，可以使用本领域已知的方法生成穿梭质粒（即，能够在多种宿主细胞例如多种细菌物种中复制的质粒），并且此类质粒可以用于插入多种类型的宿主细胞中，例如，原核细胞、古细菌细胞、真细菌细胞或真核细胞。此类穿梭质粒可包含生物体特异性表达控制元件和复制起点。

步骤2：制备辅助质粒。所述辅助质粒经工程改造以编码介导DNA插入宿主细胞中并使所述辅助质粒保持在经历重组的宿主细胞内的所有必要活性。在某些实施方案中，所述辅助质粒包含：(i) 用于将质粒保持在宿主细胞中的选择标记盒，(ii) 用于重组酶（即，支持并提高同源DNA段之间的互换效率的一种或多种酶）表达的调节子，(iii) 用于功能表达的调节子，所述功能使DNA插入序列线性化而得到可以经历同源重组的末端同源序列，(iv) 针对自身不含recA拷贝的宿主细胞而表达RecA同系物的调节子和(v) 条件复制起点。

在某些实施方案中，所述辅助质粒包含类似于辅助质粒pTKRED(Gene bankGU327533.1)的组分。在特定的实施方案中，将辅助质粒pTKRED(Gene bank GU327533.1)用于本方法中。

步骤3：将所述供体质粒和所述辅助质粒引入到同一宿主细胞中。插入供体和辅助质粒可以通过本领域技术人员已知的许多不同技术进行，包括但不限于：电穿孔、使用化学感受态细胞、热冲击和噬菌体转导。然后可以将宿主细胞在选择条件下培养以富集携带所引入质粒的细胞。

步骤4：启动插入程序。示例性插入程序包括以下步骤：可以在例如30℃的包含用于选择的适当抗生素（此类抗生素可由本领域技术人员根据所述供体/辅助质粒中存在的选择标记盒而容易地选择）的培养基中生长阳性克隆（即，同时包含所述辅助和供体质粒的宿主细胞）的过夜培养物。然后可将该培养物稀释并在存在合适抗生素的情况下在例如30℃下生长直到指数期。在这些条件下，所述辅助和供体质粒被保持但沉默。接着，用含有用于选择的抗生素以及存在于所述质粒中的条件元件（例如，诱导型启动子或条件复制起点）的任何诱导物的培养基替换原培养基，然后进一步温育细胞。在此期间，所述辅助质粒上的限制性核酸内切酶（例如，SceI）和所述辅助质粒上的重组酶（例如，λred重组酶）被表达，导致所述供体质粒在同源臂处裂解以及同源DNA在宿主细胞基因组中的同源位点处的同源重组。接着，将细胞在含有所述供体质粒的反选择标志物所对应的组分（例如，蔗糖，如果反选择标志物是sacB）的培养基上涂板。此步骤导致反选择包含所述供体质粒的细胞，即，所述供体质粒以未插入的状态存在的细胞。此类培养基还包含存在于所述供体质粒的插入标记盒（即，存在于所述供体质粒的HR间的抗生素抗性标记盒）中的抗性标志物，以选择含有异源插入DNA的细胞。在过夜温育后，随后筛查细胞以选出显示抗生素抗性表型的重组克隆，所述表型符合以下特征：(i) 丢失了所述辅助和供体质粒并且(ii) 存在异源DNA插入序列。

除上述插入方法以外，还可以使用其它方法将DNA插入到宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，使用本领域已知的任何位点特异性插入方法将DNA插入到宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，使用本领域已知的任何随机整合方法将DNA插入到宿主细胞的基因组中。下面更详细地描述了此类方法。

在某些实施方案中，使用包括转座子介导的插入的方法将DNA插入到宿主细胞（例如，大肠杆菌）基因组中。此类随机插入允许将目标DNA插入到宿主细胞基因组的多个位置，并因此允许识别出其中已经插入了DNA的宿主细胞中的最佳插入位点，例如，携带所插入DNA的宿主细胞可以就生产所插入DNA的效率进行相互比较，并可以选择具有最高效率的宿主细胞以备后用。转座子介导的将核酸序列插入到宿主细胞基因组中的方法是本领域已知的。例如，在某些实施方案中，pUTminiTn5递送系统(Biomedical; Sevilla, Spain)被用于将基因稳定地插入到宿主细胞（如细菌宿主细胞）的基因组中。然后可以识别并分离其中已经插入了DNA的菌株。还可参见 Herrero 等人，1990, J. Bacteriology 172(11):6557-6567 和 DeLorenzo 等人，1990, J. Bacteriology 172(11):6568-6572，其每一者均以引用方式全文并入本文中。另外，在某些实施方案中，转座子介导的将DNA插入到宿主细胞基因组中是使用基于Tn-7的DNA插入方法完成的。参见 McKenzie 等人，2006, BMCMicrobiology 6:39 和 Sibley 等人，2012, Nucleic Acids Res.40:e19，其每一者均以引用方式全文并入本文中。

在某些实施方案中，使用允许位点特异性DNA克隆的StabyCloning^TM试剂盒或StabyCodon T7试剂盒(Delphi Genetics, Charleroi, Belgium)将DNA插入到宿主细胞（例如，大肠杆菌）基因组中。

在某些实施方案中，使用克隆并染色体整合DNA的“克隆整合（clonetegration）”方法将DNA插入到宿主细胞（例如，大肠杆菌）基因组中。参见 St. Pierre 等人，2013, ACSSynthetic Biology 2:537-541，其公开内容以引用方式全文并入本文中。

在某些实施方案中，使用涉及条件复制、整合以及模块化(CRIM)质粒的方法将DNA插入到宿主细胞（例如，大肠杆菌）基因组中，如 Haldimann 和 Wanner, 2001, J.Bacteriology 183:6384-6393 所述，其公开内容以引用方式全文并入本文中。

在某些实施方案中，使用重组工程（recombineering）将DNA插入到宿主细胞（例如，大肠杆菌）基因组中，所述重组工程是一种在例如Sharan 等人，2009, Nat. Protoc.4:206-223; Yu 等人，2000, PNAS USA 97:5978-5983; Kuhlman 等人，2010, NucleicAcids Res.38:e92; 以及 Zhang 等人，1998, Nat. Genet.20:123-128 中描述的方法，其每一者均以引用方式全文并入本文中。

在某些实施方案中，通过电穿孔、由热冲击化学转化、天然转化、噬菌体转导和/或缀合将异源核酸引入到本文所述的经修饰的宿主细胞中。在特定的实施方案中，使用质粒将异源核酸引入到本文所述的宿主细胞中，例如，通过质粒（例如，表达载体）在所述宿主细胞中表达所述异源核酸，并通过电穿孔、由热冲击化学转化、天然转化、噬菌体转导或缀合将所述质粒引入到所述经修饰的宿主细胞中。

在特定的实施方案中，分离的核酸序列被整合到宿主细胞（例如，大肠杆菌）中，其中所述核酸编码经修饰的假单胞菌rfb簇（例如，铜绿假单胞菌血清型O6 rfb簇），其中所述经修饰的假单胞菌rfb簇包含：(i) 编码甲酰基转移酶的基因（例如，编码SEQ ID NO:2或其同系物的基因），(ii) 编码wzy聚合酶的基因（例如，编码SEQ ID NO3或其同系物的基因）；或(iii) 编码甲酰基转移酶的基因（例如，编码SEQ ID NO:2或其同系物的基因）和编码wzy聚合酶的基因（例如，编码SEQ ID NO3或其同系物的基因）。

5.3 生物缀合物

本文所述的经修饰的宿主细胞可以用于生产包含连接至载体蛋白的假单胞菌抗原的生物缀合物。使用宿主细胞生产生物缀合物的方法是本领域已知的。参见，例如，WO2003/074687 和 WO 2006/119987。生物缀合物，如本文所述，具有优于抗原载体蛋白的化学缀合物的有利特性，因为其在制造中需要更少的化学物质并且就所生成的最终产物而言更为一致。

在特定的实施方案中，本文提供了包含连接至假单胞菌抗原的载体蛋白的生物缀合物。在特定的实施方案中，所述假单胞菌抗原是铜绿假单胞菌的O抗原。在特定的实施方案中，本文提供了包含铜绿假单胞菌O抗原和载体蛋白的生物缀合物，其中所述载体蛋白是EPA、PcrV(夜称为LcrV、EspA、SseB)、PopB(YopB、YopD、FliC)或OprF、OprI。

在特定的实施方案中，本文提供了包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物，其中所述铜绿假单胞菌O抗原是铜绿假单胞菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20的O抗原。

在特定的实施方案中，本文提供了包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物，其中所述铜绿假单胞菌O抗原是在Knirel 等人，2006, Journal ofEndotoxin Research 12(6):324-336中所述的血清型之一，该公开通过引用全文并入本文。

在特定的实施方案中，本文提供了包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物，其中所述铜绿假单胞菌O抗原是铜绿假单胞菌血清型O6的O抗原。

在特定的实施方案中，本文提供了包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白的生物缀合物，其中所述铜绿假单胞菌O抗原是铜绿假单胞菌血清型O11的O抗原。在特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌血清型O11的O抗原来自铜绿假单胞菌菌株PA103（参见，例如，Genbank 登录号 KF364633.1）。

本文所述的生物缀合物可以通过本领域已知的用于纯化蛋白质的任何方法来纯化，例如，通过层析（例如，离子交换柱层析、阴离子柱交换层析、亲和柱层析以及尺寸柱层析）、离心、差溶或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术。参见，例如，Saraswat 等人，2013, Biomed.Res.Int.ID#312709 (第1-18页)；还可参见WO 2009/104074中所述的方法。此外，可将生物缀合物融合到本文所述的或本领域中其它已知的异源多肽序列以利于纯化。用于纯化具体生物缀合物的实际条件将部分取决于合成策略以及多项因素（如该生物缀合物的净电荷、疏水性和/或亲水性），并且对于本领域技术人员将是显而易见的。

5.4 分析方法

可以使用各种方法来分析本文所述的生物缀合物的结构组成和糖链长度。

在一个实施方案中，可以使用肼解来分析聚糖。首先，根据制造商说明（LudgerLiberate Hydrazinolysis Glycan Release Kit, Oxfordshire, UK），通过与肼温育而使多糖从其蛋白载体上释放。亲核的肼攻击多糖与载体蛋白间的糖苷键，从而允许释放所附接的聚糖。在此处理过程中，失去了N-乙酰基，从而不得不通过重新N-乙酰化来重构。在碳柱上纯化游离的聚糖并随后在还原端用荧光体2-氨基苯甲酰胺进行标记。参见 Bigge JC,Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB: Nonselective andefficient fluorescent labeling of glycans using 2-amino benzamide andanthranilic acid.Anal Biochem 1995, 230(2):229-238。根据Royle等人的HPLC方案，在GlycoSep-N柱(GL Sciences)上分离经标记的多糖。参见 Royle L, Mattu TS, Hart E,Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM: An analyticaland structural database provides a strategy for sequencing O-glycans frommicrogram quantities of glycoproteins.Anal Biochem 2002, 304(1):70-90。所得的荧光色谱图表明所述多糖的长度以及重复单元的数目。可以通过收集各个峰并随后进行MS/MS分析来采集结构信息。从而，可以确认重复单元的单糖组成和序列，并可以另外鉴定所述多糖组合物的均匀性。

在另一个实施方案中，SDS-PAGE或毛细管凝胶电泳可以用于评估聚糖和生物缀合物。O抗原聚糖的聚合物长度由线性装配的重复单元的数目限定。这意味着典型的阶梯状图案是构成所述聚糖的不同的重复单元数目的结果。因此，在SDS PAGE或通过尺寸分离的其它技术上彼此相邻的两条带仅相差单个重复单元。当分析糖蛋白的聚糖大小时，会利用到这些离散的差异：根据其电泳迁移率分离未糖基化的载体蛋白和具有不同聚合物链长的生物缀合物。测量了存在于生物缀合物上的最早可检测到的重复单元数目（n₁）和平均重复单元数目（n_平均）。这些参数可以被用于证实各批次间的一致性或多糖稳定性。

在另一个实施方案中，可运用高质量MS和尺寸排阻HPLC来测量完整生物缀合物的大小。

在另一个实施方案中，蒽酮-硫酸测定法可以被用于测量多糖产率。参见 LeyvaA, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC: Rapid andsensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantifycarbohydrate in biopharmaceutical products: method development andvalidation.Biologicals : journal of the International Association ofBiological Standardization 2008, 36(2):134-141。在另一个实施方案中，甲基戊糖测定法可以被用于测量多糖产率。参见，例如，Dische 等人，J Biol Chem.1948 Sep;175(2):595-603。

糖基化位点使用的改变

为了显示特定蛋白质中的位点使用在多质粒系统中相比于插入系统发生了改变，必须对糖基化位点的使用进行定量。下面列出了这样做的方法。

糖肽LC-MS/MS：用蛋白酶消化生物缀合物，并通过合适的色谱方法(C18, 亲水相互作用 HPLC HILIC, GlycoSepN 柱, SE HPLC, AE HPLC)将肽分离，并且使用MS/MS识别出不同的肽。此方法可以与或不与通过化学（史密斯降解）或酶促方法预先缩短糖链一起使用。在215至280 nm使用UV检测以对糖肽峰进行定量允许相对测定糖基化位点的使用。

尺寸排阻HPLC：更早的SE HPLC柱洗脱时间反映了更高的糖基化位点使用。

均匀性

生物缀合物的均匀性（即，所附接的糖残基的均匀性）可以使用测量聚糖长度和流体力学半径的方法来评估。

其它可能的临床/实际应用

整合菌株可以得到更高产率的生物缀合物，这是由于相比三质粒系统，其抗生素选择负担减轻。另外，由于细胞的代谢负担减轻，所以更少发生蛋白水解降解。

整合菌株制造的生物缀合物具有更短的、较不分散的多糖长度分布。因此，该生物缀合物更易于表征并被更好地定义。另外，插入可降低细胞的周质压力的程度，由于相比三质粒系统减轻的抗生素选择负担，其可导致发酵过程中更少的产物蛋白水解。

蛋白质糖基化系统要求生产宿主中具有三种重组元件：载体蛋白表达DNA、寡糖基转移酶表达DNA和多糖表达DNA。现有技术的细菌生产系统在质粒上含有这三种元件。因此，由于质粒丢失，特别是因为在GMP材料发酵期间绝不能存在用于保持这些质粒的抗生素，而在生产过程中存在不稳定性的风险。由于插入菌株少含有一个质粒，所以其在多个世代上更稳定。这意味着更大规模的发酵和更长的温育时间（更高的世代数目）更为可行。另外，缺少用于选择的抗生素使得产品更安全，这是由于不存在可以引起敏感个体的过敏反应的痕量抗生素。参见 COMMITTEE WE, BIOLOGICAL O, STANDARDIZATION: WHO 技术报告系列941。于: 第五十六次报告。由国际卫生组织编撰。日内瓦：世界卫生组织；2007。

由于固定的染色体插入使得插入菌株在遗传上更加稳定，因此导致在生产过程中（例如，在培养包含插入异源DNA的宿主细胞的过程中）所需蛋白质产物的更高再现性。

用于测试有益效果的分析方法

产率。产率以来源于在受控并优化的条件下于生物反应器中生长的1升细菌生产培养物的糖类的量测量。在纯化生物缀合物后，可以通过蒽酮测定法或使用糖类特异性抗血清的ELISA直接测量糖类产率。可能通过使用蛋白质的量（由熟知的BCA、Lowry或bardford测定法测得）以及聚糖长度和结构以计算理论糖类量/克蛋白质进行间接测量。另外，产率还可以通过从挥发性缓冲液中干燥糖蛋白制备物并用天平称重来测量。

均匀性。均匀性意指聚糖长度和可能的糖基化位点数目的可变性。以上列出的方法可以用于此目的。SE-HPLC允许测量流体力学半径。相比具有更少糖基化位点的载体，载体上糖基化位点数目越高导致流体力学半径的变化越高。然而，当分析单个聚糖链时，其可能由于更受控的长度而更均一。聚糖长度通过肼解、SDS PAGE和CGE测量。另外，均匀性也可以意味着某些糖基化位点的使用模式变为更宽/更窄的范围。这些因素可以通过糖肽LC-MS/MS测量。

菌株稳定性和再现性。通过确认生产培养细胞中是否存在重组DNA的直接和间接方法测量在不存在选择压力的情况下细菌发酵过程中的菌株稳定性。可以通过延长的培养时间（意味着代次增加）来模拟培养体积的影响。发酵中的世代越多，重组元件越可能丢失。丢失重组元件被视为不稳定性。间接方法依靠选择标记盒与重组DNA的关联，例如，质粒中的抗生素抗性标记盒。将生产培养细胞涂布在选择培养基（例如，补充有抗生素或与选择系统有关的其它化学物质的LB平板）上，而抗性菌落被视为阳性的（即，含有与相应的选择化学物质相关的重组DNA）。就多质粒系统而言，针对抗多种抗生素的抗性菌落进行计数，而含有全部三种抗性的那部分细胞被视为稳定的群落。作为另外一种选择，定量PCR可以被用于测量在存在或不存在选择的情况下以及在不同的发酵时间点上具有这三种重组元件的重组DNA的量。因此，测量并比较了重组DNA的相对和绝对量。通过本申请所述的方法对一致性批次进行完整分析而测量了生产过程的再现性。

5.5 组合物

包含宿主细胞的组合物

在一个方面，本文提供了包含本文所述的宿主细胞（参见5.1节）的组合物。此类组合物可以用在生成本文所述的生物缀合物（参见5.3节）的方法中，例如，可以在适于生产蛋白质的条件下培养所述包含宿主细胞的组合物。随后，可以使用本领域已知的方法从所述包含宿主细胞的组合物中分离生物缀合物。

本文提供的包含宿主细胞的组合物可以包含适用于本文所述的宿主细胞的保持和存活的附加组分，并且可以额外包含宿主细胞生产蛋白质所需或于之有益的附加组分，例如，诱导型启动子的诱导物，如阿拉伯糖、IPTG。

包含生物缀合物的组合物

在另一方面，本文提供了包含一种或多种本文所述的生物缀合物（参见5.3节）的组合物（例如，药物组合物）。本文所述的组合物可用于治疗和预防个体（例如，人类个体）的假单胞菌感染。参见5.6节。

在某些实施方案中，除了包含本文所述的生物缀合物（参见5.3节）以外，本文所述的组合物（例如，药物组合物）还包含药学上可接受的载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指获得联邦或州政府的监管部门批准或名列美国药典或其它公认的用于动物以及更具体地讲用于人类的药典。术语“载体”，如本文所用，在药学上可接受的载体的上下文中，指代稀释剂、佐剂、赋形剂或与该药物组合物一起施用的媒介物。也可以采用生理盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射溶液。合适的赋形剂包括：淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中有述。

在特定的实施方案中，本文提供了包含生物缀合物的的组合物（例如，药物组合物），所述生物缀合物包含连接至假单胞菌抗原的载体蛋白。在特定的实施方案中，本文提供了包含生物缀合物的的组合物（例如，药物组合物），所述生物缀合物包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白。

在特定的实施方案中，本文提供了包含生物缀合物的的组合物（例如，药物组合物），所述生物缀合物包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白，其中所述铜绿假单胞菌O抗原是铜绿假单胞菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20的O抗原。

在特定的实施方案中，本文提供了包含生物缀合物的的组合物（例如，药物组合物），所述生物缀合物包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白，其中所述铜绿假单胞菌O抗原是铜绿假单胞菌血清型O6的O抗原。

在特定的实施方案中，本文提供了包含生物缀合物的的组合物（例如，药物组合物），所述生物缀合物包含连接至铜绿假单胞菌O抗原的载体蛋白，其中所述铜绿假单胞菌O抗原是铜绿假单胞菌血清型O11的O抗原。在特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌血清型O11的O抗原来自铜绿假单胞菌菌株PA103（参见，例如，Genbank 登录号 KF364633.1）。

包含本文提供的生物缀合物的组合物可以被用于引发所述组合物所施用的宿主中的免疫应答，即，所述组合物是免疫原性的。因此，本文所述的组合物可以用作针对假单胞菌感染的疫苗，或可以用于治疗假单胞菌感染。

包含本文所述的生物缀合物的组合物可包含适用于药物施用的任何附加组分。在特定的实施方案中，本文所述的组合物是单价制剂。在其它实施方案中，本文所述的组合物是多价制剂，例如，二价、三价以及四价制剂。例如，多价制剂包含不止一种本文所述的生物缀合物。

在某些实施方案中，本文所述的组合物额外包含防腐剂，例如，汞衍生物硫柳汞。在特定的实施方案中，本文所述的药物组合物包含0.001%至0.01%的硫柳汞。在其它实施方案中，本文所述的药物组合物不包含防腐剂。

在某些实施方案中，本文所述的组合物（例如，免疫原性组合物）包含佐剂，或与佐剂组合施用。与本文所述的组合物组合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、与之同时或之后施用。在一些实施方案中，术语“佐剂”指代这样的化合物：当与本文所述的组合物结合施用或作为其一部分施用时，该化合物加强、提高和/或增强针对生物缀合物的免疫应答，但当该化合物单独施用时，不生成针对生物缀合物的免疫应答。在一些实施方案中，佐剂生成针对生物缀合物多肽的免疫应答，而不产生过敏或其它不良反应。佐剂可以通过若干机制（包括，例如，淋巴细胞募集、激发B和/或T细胞以及激发巨噬细胞）提高免疫应答。

佐剂的特定实例包括但不限于：铝盐(明矾)(如氢氧化铝、磷酸铝和硫酸铝)、3De-O-酰化的单磷酰脂A(MPL)(参见英国专利GB2220211)、MF59(Novartis)、AS03(GlaxoSmithKline)、AS04(GlaxoSmithKline)、聚山梨醇酯80(Tween 80; ICL Americas,Inc.)、咪唑并吡啶化合物(参见以国际公布号WO2007/109812公布的国际申请号PCT/US2007/064857)、咪唑并喹啉化合物(参见以国际公布号WO2007/109813公布的国际申请号PCT/US2007/064858)和皂苷如QS21(参见 Kensil 等人，于 Vaccine Design: TheSubunit and Adjuvant Approach (编撰，Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995);美国专利号5,057,540）。在一些实施方案中，所述佐剂是弗氏佐剂（完全或不完全）。其它佐剂是水包油乳液（如角鲨烯或花生油），任选地与免疫刺激剂组合（如单磷酰脂A）（参见Stoute 等人，N. Engl. J. Med.336, 86-91 (1997)）。另一种佐剂是CpG（BioworldToday, Nov. 15, 1998）。

在某些实施方案中，本文所述的组合物经配制以适用于预期的个体施用途径。例如，本文所述的组合物可经配制以适用于皮下、肠胃外、口腔、皮内、透皮、结肠直肠、腹腔内以及直肠施用。在特定的实施方案中，所述药物组合物可经配制用于静脉内、口腔、腹腔内、鼻内、气管内、皮下、肌内、局部、皮内、透皮或肺部施用。

在某些实施方案中，本文所述的组合物额外包含一种或多种缓冲剂，例如，磷酸盐缓冲剂和蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲剂。在其它实施方案中，本文所述的组合物不包含缓冲剂。

在某些实施方案中，本文所述的组合物额外包含一种或多种盐，例如，氯化钠、氯化钙、磷酸钠、谷氨酸一钠和铝盐（例如，氢氧化铝、磷酸铝、明矾（硫酸钾铝）或此类铝盐的混合物）。在其它实施方案中，本文所述的组合物不包含盐。

可以将本文所述的组合物与施用说明书一起包括在容器、包裹或分配器中。

可以在使用前保存本文所述的组合物，例如，所述组合物可以冷冻保存（例如，在约-20℃或在约-70℃）；在冷藏条件下保存（例如，在约4℃）；或在室温下保存。

5.6 预防和治疗用途

在一个方面，本文提供了治疗个体中假单胞菌感染的方法，包括向所述个体施用本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或其组合物（参见5.5节）。在另一方面，本文提供了预防个体中假单胞菌感染的方法，包括向所述个体施用本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或其组合物（参见5.5节）。

本文还提供了在个体中诱导针对假单胞菌的免疫应答的方法，包括向所述个体施用本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）。在一个实施方案中，所述个体在施用时具有假单胞菌感染。在另一个实施方案中，所述个体在施用时不具有假单胞菌感染。

在特定的实施方案中，本文提供了用于预防个体中假单胞菌感染的方法，其中所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的5.5节中所述的组合物。本文提供的预防个体中假单胞菌感染的方法导致在个体中诱导免疫应答，包括向所述个体施用5.5节中所述的组合物。本领域技术人员将理解，本文所述的在个体中诱导免疫应答的方法导致所述个体针对假单胞菌菌株（其抗原存在于组合物中）感染免疫。

在特定的实施方案中，本文提供了用于治疗个体中假单胞菌感染的方法，其中所述方法包括向有此需要的个体施用有效量的5.5节中所述的组合物。

在某些实施方案中，由本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由铜绿假单胞菌引起的假单胞菌感染。在某些实施方案中，由本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由铜绿假单胞菌的不止一种菌株或血清型引起的假单胞菌感染。

在特定的实施方案中，由本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由铜绿假单胞菌血清型O1、O2、O3、O4、O5、O6、O7、O8、O9、O10、O11、O12、O13、O14、O15、O16、O17、O18、O19或O20引起的感染。在另一个特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌的rfb簇是Knirel 等人，2006, Journal ofEndotoxin Research 12(6):324-336中所述的血清型中任一者的rfb簇，该公开通过引用全文并入本文。在特定的实施方案中，由本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由铜绿假单胞菌血清型O6引起的感染。在特定的实施方案中，由本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）诱导的免疫应答能有效预防和/或治疗由铜绿假单胞菌血清型O11引起的感染。在特定的实施方案中，所述铜绿假单胞菌血清型O11是铜绿假单胞菌菌株PA103（参见，例如，Genbank 登录号 KF364633.1）。

在某些实施方案中，施用本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）之后在个体中诱导的免疫应答能有效减轻由假单胞菌感染造成的一种或多种症状。

在某些实施方案中，施用本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）之后在个体中诱导的免疫应答能有效降低患有假单胞菌感染的个体的住院可能性。在一些实施方案中，施用本文所述的生物缀合物（参见5.3节）或本文所述的组合物（参见5.5节）之后在个体中诱导的免疫应答能有效缩短患有假单胞菌感染的个体的住院时间。

5.7 测定法

用于评估生物缀合物诱导免疫应答的能力的测定法

本文所述的生物缀合物/组合物在个体中生成免疫应答的能力可以使用本领域技术人员已知的或本文所述的任何方法进行评估。在一些实施方案中，生物缀合物在个体中生成免疫应答的能力可以通过如下进行评估：用本文所述的生物缀合物使个体（例如，小鼠）或个体组免疫并用对照（PBS）使另外的个体（例如，小鼠）或个体组免疫。随后可以用假单胞菌攻击这些个体或个体组并可以测定所述假单胞菌在所述个体或个体组中引起疾病的能力。本领域技术人员将认识到，在用假单胞菌攻击之后，如果用对照免疫的个体或个体组患病但用本文所述的生物缀合物或其组合物免疫的个体或个体组较少患病或不患病，则所述生物缀合物能够在个体中生成免疫应答。本文所述的生物缀合物或其组合物诱导与假单胞菌抗原交叉反应的抗血清的能力可以通过例如免疫测定法如ELISA进行测试。

体外杀菌测定法

本文所述的生物缀合物在个体中生成免疫应答的能力可以使用血清杀菌测定法（SBA）或调理吞噬杀灭测定法（OPK）进行评估，所述方法代表了已经被用于获得基于糖缀合物的疫苗的审批的成熟并为人所接受的方法。此类测定法是本领域熟知的并且，简而言之，包括通过向个体（例如，小鼠）施用引发抗体的化合物而生成和分离针对目标靶（例如，假单胞菌抗原）的此类抗体的步骤。随后，所述抗体的杀菌能力可以通过如下进行评估：例如，在存在所述抗体和补体以及—取决于测定法—中性粒细胞的情况下培养所考虑的细菌，并且例如使用标准微生物方法测定所述抗体杀灭和/或中和所述细菌的能力。

6.实施例

实施例1：具有插入的寡糖基转移酶和插入的rfb簇的细菌菌株是稳定的并且生产生物缀合物

本实施例证实，生物缀合物可以由细菌宿主菌株成功生产，所述细菌宿主菌株已经通过插入(i) 编码寡糖基转移酶的核酸和(ii) 编码rfb簇的核酸进行了基因修饰。

通过将以下物质直接插入宿主细胞基因组中而生成经修饰的大肠杆菌宿主细胞：(i) 编码空肠弯曲菌寡糖基转移酶(PglB)的核酸和 (ii) 编码铜绿假单胞菌菌株PA103的rfb簇的核酸。此rfb簇编码铜绿假单胞菌血清组O11抗原的O-抗原合成所必需的基因。使用在PCT/EP2013/071328中所述的新型插入方法（参见以上5.2节）或pUT迷你系统（BiomedalLifescience）进行插入。PCT/EP2013/071328中所述的插入方法是位点特异性的并且使用同源重组，而pUT迷你系统是随机的、转座子介导的方法，其导致目标核酸序列被随机插入到宿主细胞基因组中。通过将表达脱毒的假单胞菌外毒素A(EPA)作为载体蛋白的质粒引入到宿主细胞中而进一步修饰大肠杆菌宿主细胞。因此，在本实施例中所述经修饰的大肠杆菌宿主细胞表达：(i) 空肠弯曲菌寡糖基转移酶(PglB)，凭借将编码该寡糖基转移酶的核酸整合到宿主细胞基因组中；(ii) 生产O11抗原的铜绿假单胞菌rfb簇的基因，凭借将编码铜绿假单胞菌菌株PA103的rfb簇的核酸整合到宿主细胞基因组中；和 (iii) EPA载体蛋白，凭借用包含编码该载体蛋白的核酸的质粒转化宿主细胞。

还生成了另外的经修饰的大肠杆菌宿主细胞以允许将包含双整合（整合寡糖基转移酶并且整合rfb簇）的经修饰的宿主细胞生产生物缀合物(EPA-O11)的能力与下列宿主细胞的生物缀合物生产进行比较，所述宿主细胞：(i) 仅具有寡糖基转移酶或rfb簇的单整合，而其余组分（载体蛋白和寡糖基转移酶或rfb簇）由宿主细胞通过质粒表达；或 (ii) 不含整合组分，其全部组分（载体蛋白以及寡糖基转移酶和rfb簇）均通过质粒表达。

三种不同的大肠杆菌背景菌株被用于所述分析：(i) “St4167”(W3110 ∆waaL,∆rfbO16::rfbP.a.O11)，其缺失大肠杆菌waaL基因、缺失大肠杆菌O16 rfb簇并且插入铜绿假单胞菌O11 rfb簇(PCT/EP2013/071328)；(ii) “St1128”(W3110 ∆waaL)，其缺失大肠杆菌waaL基因；和 (iii) “St1935”(W3110 ∆waaL, ∆wzzE-wecG, ∆wbbIJK)，其缺失所指示的基因。为了将铜绿假单胞菌O11 rfb簇插入到St4167中，将O11 rfb簇克隆到pDOC质粒中并采用了根据PCT/EP2013/071328的方法。St4167菌株代表了双整合菌株。

用于将EPA引入宿主细胞菌株的特定质粒被指定为“p1077”和“p150”。后者在Ihssen, 等人，(2010) Microbial cell factories 9, 61中有述，并且除了p1077用Kan标记盒替换了p150的Amp标记盒以外，这些质粒都是相同的。

生成了下列St4167变体：(i) 插入pglB以取代宿主细胞yahL基因(通过PCT/EP2013/071328的方法)并通过质粒p1077表达EPA的St4167；(ii) 插入pglB以取代宿主细胞ompT基因(使用pUT迷你系统)并通过质粒p150表达EPA的St4167；(iii) 通过质粒p1769(pglB于pDOC中)表达pglB并通过质粒p1077表达EPA的St4167；(iv) 通过质粒p939(密码子优化的、基于pEXT21的用于带HA标签的PglB的表达质粒)表达pglB并通过质粒p1077表达EPA的St4167；和 (v) 通过质粒p1762(pglB于pDOC中)表达pglB并通过质粒p1077表达EPA的St4167。

生成了下列St1128变体：(i) 通过质粒p939表达pglB、通过质粒p164(pLAFR质粒经工程改造以含有铜绿假单胞菌O11 rfb簇)表达铜绿假单胞菌O11 rfb簇并通过质粒p1077表达EPA的St1128；和 (ii) 插入pglB以取代宿主细胞yahL基因(通过PCT/EP2013/071328的方法)、通过质粒p164表达铜绿假单胞菌O11 rfb簇并通过质粒p1077表达EPA的St1128。

生成了下列St1935变体：(i) 插入pglB以取代宿主细胞ompT基因(通过PCT/EP2013/071328的方法)、通过质粒p164表达铜绿假单胞菌O11 rfb簇并通过质粒p1077表达EPA的St1935；(ii) 插入pglB以取代宿主细胞yahL基因(通过PCT/EP2013/071328的方法)、通过质粒p164表达铜绿假单胞菌O11 rfb簇并通过质粒p1077表达EPA的St1935；和通过质粒p939表达pglB、通过质粒p164表达铜绿假单胞菌O11 rfb簇并通过质粒p1077表达EPA的St1935。

如图1所示，所有表达寡糖基转移酶、载体蛋白和rfb簇的菌株均生产生物缀合物。参见kDa标志物100至130之间描绘的印迹，其对应于EPA-O11。重要地，此观察结果包括包含寡糖基转移酶和rfb簇的双整合的菌株。特别参见St4167所示的结果。因此，本实施例证实，在将基因簇双插入宿主细胞基因组中之后不仅可以生成稳定的宿主细胞，还保持了所述基因的功能。具体地讲，所述插入的寡糖基转移酶和插入的rfb簇的功能得以保留，导致生产生物缀合物。

实施例2：识别有助于合成原生的铜绿假单胞菌O6 O-抗原寡/多糖的甲酰基转移酶基因

本实施例描述了识别铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶。

使用www.supfam.org/SUPERFAMILY/上提供的算法，在铜绿假单胞菌O6菌株“LESB58”（其基因组是已知的）的蛋白质组数据中搜索含有与原型查询域“甲酰基转移酶”和“FMT C-末端域-样”域同源的域。该搜索识别出9个具有可能相关域的蛋白质序列。

为了评价识别出的9个候选者中的任一者是否特异于O6（并从而特异于甲酰化的O抗原重复单元），使用BLAST搜索(NCBI网站)分析了其在另一种铜绿假单胞菌血清型（O5，菌株PAO1）的蛋白质组中的缺失。所述铜绿假单胞菌O5 O-抗原结构与铜绿假单胞菌O6的O-抗原结构无关。具体地讲，所述O5结构中不存在甲酰基。9个候选者中的8个在铜绿假单胞菌血清型O5中具有同系物，这表明这些蛋白质并不特异于铜绿假单胞菌O6菌株LESB58。剩下的候选者（locus_tag=PLES_12061, GenBank: CAW25933.1; SEQ ID NO:2）在铜绿假单胞菌血清型O5中没有明显的同系物，并因而被归类为特异于LESB58/铜绿假单胞菌血清型O6。

为了确认O6特异性，验证了所发现的铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQID NO:2)在其它铜绿假单胞菌血清型O6菌株中的存在。在四种其它铜绿假单胞菌血清型O6菌株中识别出了与所述铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID No:2)等同的蛋白质，包括菌株中的“PAK”基因座标签：PAK_01412 和菌株M18中的基因座标签：PAM18_1171。

还在以下中识别出与铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID No:2)具有低氨基酸序列同一性的甲酰基转移酶：甲基杆菌属物种(33% 同一性，登录号 WP_020093860)、雪白发硫菌(30% 同一性，登录号 WP_002707142)、Anaerophaga thermohalophila (28% 同一性，登录号 WP_010422313)、Halorubrum californiense(27% 同一性，登录号 WP_008445073)、茎瘤固氮根瘤菌(25% 同一性，登录号 WP_012170036) 和 Burkholderia glathei (24% 同一性，登录号 KDR39707)。综上，这些同源性分析表明，相关基因编码与甲酰化有关的O6特异性活性。

为了测试铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID No:2)在非甲酰化的O6重复单元结构上的功能活性，克隆了编码SEQ ID NO:2的基因。用ATG替换了该基因的稀有TTG起始密码子。在图5中描绘了将铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID No:2)克隆到铜绿假单胞菌O6 rfb簇中以及这些基因的相应编组的示意图。

一旦识别出铜绿假单胞菌O6甲酰基转移酶，即评估其功能。通过在缺少功能性ECA(wec)簇的大肠杆菌中与铜绿假单胞菌O6的rfb簇基因共表达来测试铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID No:2)的功能性。为了显示甲酰化，（在waaL阳性菌株中）分析了结合至脂质A核心的单一抗原重复单元。通过使用O6特异性抗体的免疫检测识别出了甲酰化的O6 O-抗原重复单元（图3A），表明甲酰基是铜绿假单胞菌O6 O抗原结构的相关表位。

为了显示分子水平上的甲酰化，通过MALDI MSMS分析了O6重复单元。经纯化并2AB标记的重复单元显示，铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶(SEQ ID No:2)与铜绿假单胞菌O6的rfb簇基因的共表达产生了主峰（其偏移了2-3分钟（从58到61’，图3B））的荧光信号。

对58’处的峰所含有的物质的MALDI-MSMS分析得到了Y离子碎片系列，其与非甲酰化的、N-乙酰化的2-AB标记的O6重复单元是一致的。质子化的前体离子m/z=905，被破碎成明显的离子系列905->759->543->326，对应于146(脱氧已糖)、216(酰胺化的N-乙酰己糖胺糖醛酸)、217(N-乙酰己糖胺糖醛酸)的丢失。在61’处收集的得自表达铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶基因的细胞的物质含有明显的前体离子891，其被破碎成891->745->529->326，对应于146(如上)、216(如上)和203(酰胺化的N-甲酰己糖胺糖醛酸)的丢失。此数据证明，甲酰化依赖于铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶的表达，并且因此依赖于编码所述甲酰基转移酶的基因。因此，编码铜绿假单胞菌血清型O6甲酰基转移酶的基因被命名为fmtO6。酰胺化的N-乙酰己糖胺糖醛酸的乙酰基被甲酰基所替代的事实提出了两步机制，其中在可以添加所述甲酰基之前首先将所述乙酰基移除。此模型意味着，在甲酰基转移酶域将甲酰基附接至单糖之前，游离胺基将作为中间体存在于C2处。因此，去乙酰化并且非甲酰化的O抗原可能是铜绿假单胞菌血清型O6的重要且免疫相关的、以亚化学计量存在的多糖形式。

实施例3：识别并测试wzy基因用于聚合铜绿假单胞菌O6 O抗原。

本实施例描述了识别铜绿假单胞菌O6 wzy聚合酶。

O抗原多糖构成许多革兰氏阴性菌的细胞外表面。负责O抗原生物合成的酶促机械通常在称为rfb簇的单个基因簇中编码。铜绿假单胞菌血清型O6菌株表达聚合的O-抗原（图2）。然而，在相应的O-抗原簇中，不存在编码O抗原聚合酶的基因（wzy）。这意味着，为了在大肠杆菌中重组表达铜绿假单胞菌O6 O抗原，有必要识别出wzy基因。O-抗原聚合酶(wzy)是整合的内膜蛋白质，其在“整块”连接至脂质A-核心寡糖以形成LPS之前催化O-抗原重复单元在周质空间中的聚合。Wzy聚合酶高度特异于其重复单元低聚物，并且wzy基因间的同源性很差。

铜绿假单胞菌O19的O-抗原与铜绿假单胞菌O6的O-抗原具有结构相似性。据推测，同时识别这两种结构的wzy蛋白还可能具有相似的性质，例如，结构、序列、跨膜域的数目。铜绿假单胞菌O19的O19 Wzy蛋白的序列(登录号 AAM27560)是已知的，并且在使用铜绿假单胞菌O6 PAK菌株蛋白质组作为同源性搜索主题的Blast分析中被用作主查询。

为了评价所识别出的候选者是否特异于铜绿假单胞菌O6，分析了其在另一种铜绿假单胞菌血清型（O5，菌株PAO1）的蛋白质组中的存在。所述O5 O-抗原结构与O6和O19的O-抗原结构无关。使用blast分析分别分析了前100个结果在铜绿假单胞菌O5中的存在。来自PAK蛋白质组的100个候选者中的97个在铜绿假单胞菌血清型O5的蛋白质组中具有同系物，这表明这些蛋白质普遍存在于铜绿假单胞菌菌株中并且可能与O6 O抗原生物合成无关。这100个候选者中的三个在铜绿假单胞菌O5的蛋白质组中没有明显的同系物，并且因此被确定为特异于铜绿假单胞菌O6。

为了测试所述三个识别出的候选蛋白之一是否是铜绿假单胞菌O6 wzy，在Blast分析中将这三种蛋白质用作查询。这三个候选者之一，PAK_01823(O6wzy PAK_01823; SEQID NO:3)，与其它已知的寡糖重复单元聚合酶具有氨基酸序列同一性，例如，与血链球菌寡糖重复单元聚合酶(登录号 WP_004192559)具有25%的同一性，并与大肠杆菌O139寡糖重复单元聚合酶(登录号 AAZ85718)具有22%的同一性。因此，PAK_01823(O6wzy PAK_01823;SEQ ID NO:3)被识别为铜绿假单胞菌O6 wzy。

为了进一步确认SEQ ID NO:3是由铜绿假单胞菌O6 wzy编码的蛋白质，使用PSORTb(www.psort.org/psortb/)从生物信息学上预测了该蛋白质的亚细胞定位。预测该蛋白质位于细胞质膜中，具有11个跨膜域，这是在O-抗原聚合酶中共同的特征。

与PAK_01823(O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3)等同的蛋白质存在于其它O6阳性铜绿假单胞菌菌株中，包括LESB58菌株（其具有铜绿假单胞菌O6 wzy蛋白，相比PAK菌株以及内部测试的一种菌株仅相差1个氨基酸）。

接着，进行了铜绿假单胞菌O6 wzy的功能测试。在大肠杆菌W3110 Δwec细胞中共表达了铜绿假单胞菌O6 rfb簇、fmtO6基因(即，编码SEQ ID NO:2的基因，在以上实施例2中有讨论)和编码铜绿假单胞菌O6 wzy的基因(即，编码SEQ ID NO:3的基因)，并通过免疫印迹法分析了所形成的脂多糖（图4）。抗-O6抗血清仅在来源于含有全部三种转基因的细胞的样品中检测到了阶梯状信号，表明PAK_01823(O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3)确实是铜绿假单胞菌O6的聚合酶。因此，将编码PAK_01823的基因命名为O6wzy。

为了生成含有使大肠杆菌能够重组表达铜绿假单胞菌O6 O抗原所需的全部遗传元件的单个基因簇，将fmtO6和O6wzy基因(即，分别编码SEQ ID NO: 2和3的基因)克隆到铜绿假单胞菌O6 rfb簇的下游。在图5中描绘了将经过密码子使用优化的铜绿假单胞菌O6 O-抗原聚合酶O6wzy连同O6甲酰基转移酶克隆到所克隆的铜绿假单胞菌O6 rfb簇中以及这些基因的相应编组的示意图。还确定了，fmtO6和O6wzy基因（即，分别编码SEQ ID NO: 2和3的基因)可以被插入到铜绿假单胞菌O6 rfb簇中的多个位置。具体地讲，fmtO6基因可以在单独的启动子的控制下相对rfb簇以顺时针取向被插入到rfb簇的下游或rfb簇的上游。另外，fmtO6基因可以相对rfb簇以逆时针取向被插入到rfb簇的上游或rfb簇的下游。O6wzy基因可以在单独的启动子的控制下相对rfb簇以顺时针取向被插入到rfb簇的上游或下游或rfb簇的上游。上述所有构建体就铜绿假单胞菌O6 O抗原生物合成而言都是有活性的（数据未示出）。

实施例4：具有插入的寡糖基转移酶和插入的rfb、完整的rfbO6簇的细菌菌株是稳定的并且生产生物缀合物

实施例1证实，生物缀合物可以由细菌宿主菌株成功生产，所述细菌宿主菌株已经通过插入(i) 编码寡糖基转移酶的核酸和(ii) 编码rfb簇的核酸进行了基因修饰。在本实施例中，进行了类似于实施例1中所述的实验，使用假单胞菌蛋白质PcrV作为载体蛋白。

天然地，PcrV的一级氨基酸序列（参见，例如，UniProt O30527）不包含N-糖基化共有序列（“糖基化位点”）。使用WO 2006/119987中所述的方法工程改造出包含一个、两个、三个、四个或五个糖基化位点的PcrV重组变体。具体地讲，通过操纵编码PcrV的核酸序列，生成PcrV变体，其表达一个、两个、三个、四个或五个经优化的N-糖基化共有序列Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr)，其中X和Z独立地选自除Pro以外的任何天然氨基酸。

通过将以下物质直接插入宿主细胞基因组中而生成经修饰的大肠杆菌宿主细胞：(i) 编码空肠弯曲菌寡糖基转移酶(PglB)的核酸和 (ii) 编码铜绿假单胞菌血清型O6PAK菌株的rfb簇的核酸。此rfb簇编码铜绿假单胞菌血清组O6抗原的O-抗原合成所必需的基因。使用在PCT/EP2013/071328中所述的新型插入方法（参见以上5.2节）或pUT迷你系统（Biomedal Lifescience）进行插入。通过引入表达如上所述包含一至五个糖基化位点的PcrV的质粒进一步修饰大肠杆菌宿主细胞。因此，在本实施例中所述经修饰的大肠杆菌宿主细胞表达：(i) 空肠弯曲菌寡糖基转移酶(PglB)，凭借将编码该寡糖基转移酶的核酸整合到宿主细胞基因组中；(ii) 生产O6抗原的铜绿假单胞菌rfb簇的基因，凭借将编码铜绿假单胞菌PAK菌株的rfb簇的核酸整合到宿主细胞基因组中；和 (iii) 经修饰的PcrV载体蛋白，凭借用包含编码该载体蛋白的经修饰的核酸的质粒转化宿主细胞（其中已经如上所述修饰了所述核酸，使得其编码一至五个糖基化位点）。

还生成了另外的经修饰的大肠杆菌宿主细胞以允许将包含双整合（整合寡糖基转移酶并且整合rfb簇）的经修饰的宿主细胞生产生物缀合物(PcrV-O6)的能力与下列宿主细胞的生物缀合物生产进行比较，所述宿主细胞：(i) 仅具有寡糖基转移酶或rfb簇的单整合，而其余组分（载体蛋白和寡糖基转移酶或rfb簇）由宿主细胞通过质粒表达；或 (ii) 不含整合组分，其全部组分（载体蛋白以及寡糖基转移酶和rfb簇）均通过质粒表达。

使用了三种不同的大肠杆菌菌株并在所述分析中进行了比较：(i) “St7343”，其包含插入到宿主细胞基因组中的pglB和完整的O6 rfb簇二者(即，是一种双整合菌株)以及编码PcrV载体蛋白(具有一个、两个、三个、四个或五个糖基化位点)的质粒；(ii)“St7209”，其包含质粒表达的pglB、插入到宿主基因组中的O6 rfb簇以及编码PcrV载体蛋白(具有一个、两个、三个、四个或五个糖基化位点)的质粒；和 (iii) “St2182”，其包含质粒表达的pglB、质粒表达的O6 rfb簇以及编码PcrV载体蛋白(具有一个、两个、三个、四个或五个糖基化位点)的质粒。图6描绘了各菌株的特性（6A: St7343; 6B: St7209; 6C:St2182）。

如图6所示，所有表达寡糖基转移酶、载体蛋白和rfb簇的菌株均生产生物缀合物。参见kDa标志物40-70之间（在kDa 55标志物周围）描绘的印迹，其对应于PcrV-O6。重要地，如实施例1中所示，此观察结果包括包含寡糖基转移酶和rfb簇的双整合的菌株。特别参见图6A中所示的结果。因此，与实施例1一样，本实施例证实，在将基因簇双插入宿主细胞基因组中之后不仅可以生成稳定的宿主细胞，还保持了所述基因的功能。具体地讲，所述插入的寡糖基转移酶和插入的rfb簇的功能得以保留，导致生产生物缀合物。

实施例5：生产并纯化EPA-O6生物缀合物

本实施例描述了生产包含铜绿假单胞菌O6抗原的生物缀合物。

用包含铜绿假单胞菌O6 rfb簇、空肠弯曲菌寡糖基转移酶pglB、编码脱毒的载体蛋白EPA的基因和QuiNAc生物合成/转移酶基因wbpVLM（来自铜绿假单胞菌O6菌株）的多种质粒转化大肠杆菌W3110 ΔwaaL Δwec Δrfb。在图8中描绘了质粒保持分析的结果。用含有全部四种质粒的宿主细胞接种补充有四环素、大观霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的培养液（LB肉汤）。使该预培养在在37℃生长过夜。第二天，通过将该预培养稀释至OD₆₀₀0.1来接种补充有MgCl₂、四环素、大观霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的培养液（TB）。使细胞在37℃生长直至达到大约OD₆₀₀0.8-1.0，然后通过加入1mM IPTG 和 0.1% 阿拉伯糖来诱导pglb、epa 和 wbpVLM 的表达。在过夜诱导后通过离心收获细胞。

使用金属螯合亲和层析(IMAC)、阴离子交换层析(Source Q)和尺寸排阻层析(SEC)从经修饰的宿主细胞的周质提取物纯化EPA-O6生物缀合物。将含有糖缀合物的洗脱级分集中并随后提交至下一个层析步骤。最终SEC洗脱液通过SDS-PAGE后接考马斯亮蓝染色或Western印迹（使用图7中所指示的抗体）进行表征。

使用一批分析方法对EPA-O6生物缀合物进行表征。使用LAL测定法测量内毒素水平(13EU/ml)。通过SDS-PAGE和毛细管凝胶电泳测定纯度(CGE, 86% 纯度)。使用BCA测定法测量蛋白质的量(1.75mg/ml)。使用蒽酮测定法测量多糖的量(Dubois 等人，1956;311.6ug/ml)。使用高分辨率“糖基化度”(DOG) SDS-PAGE测定O6-聚合物的平均大小(平均7.9个重复单元/聚合物)。通过等电聚焦(IEF)完成对生物缀合物的电同工型的测定。最后，使用针对所述蛋白质(EPA)或所述多糖(O6)的抗体通过免疫印迹法确认生物缀合物的身份。

实施例6：免疫研究

本实施例证实，铜绿假单胞菌O6-EPA生物缀合物是免疫原性的。

在第0、14和28天，用含0.2 µg或2 µg的O6-EPA缀合物（参见实施例5）的无佐剂或有佐剂（含有水包油乳液佐剂）制剂肌内免疫雌性、6周龄BALB/c OlaHsd小鼠（在25只/组的组中）。仅用佐剂(O/W)接种具有10只小鼠的对照组。在第42天(III后14天)收集的个体血清中以及汇集的II后与III后血清中测定抗-O6 ELISA和调理素效价。结果示于图9中并详述于下。

图9描绘了抗-O6 ELISA反应。将8 µg/ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的纯化的O6LPS-O6 (PaO6a,6c)涂布在高结合微孔板(Nunc Maxisorp)上于4℃过夜。在室温并搅拌下用PBS-BSA 1%阻断平板30 min。将小鼠抗血清预稀释1/10并随后在微孔板上进一步稀释两倍并在室温下搅拌温育30分钟。洗涤后，使用在PBS-tween 0.05%-BSA 0.2%中稀释至1/5000的Jackson ImmunoLaboratories Inc.的过氧化物酶缀合的AffiniPure山羊抗-小鼠IgG (H+L)(ref: 115-035-003)检测结合的小鼠抗体。将检测抗体在室温下搅拌温育30分钟。在室温下，使用4 mg OPD + 5 µl H2O2 / 10 ml pH 4.5 0.1M 柠檬酸盐缓冲液在暗室中显色。用50 µl HCl终止反应，并相对于650 nm在490 nm读取光密度(OD)。

血清中存在的抗-O6抗体的水平以中点效价表示。计算各治疗组中的25份样品（对照组为10份）的个体血清的GMT。

在注射与佐剂一起配制的生物缀合物后，在小鼠中观察到免疫应答。剂量间未观察到差别。关于血清转化的百分比，得到了类似的观察结果。对于无佐剂制剂，未观察到应答或观察到极弱的应答。

图9B示出了用O6-EPA生物缀合物制剂（有佐剂或无佐剂）免疫的小鼠的HL60细胞中的调理素效价。

调理吞噬测定法(OPA)在含有15 µl的HL-60吞噬细胞(调整至5 10e6 个细胞/ml)、15 µl的铜绿假单胞菌细菌(生长于TSA琼脂平板上)、15 µl的待测血清稀释液和 15µl的仔猪补体的圆底微孔板中进行。先将失活的待测汇集的血清稀释于HBSS-BSA 1%中(1/16或1/50的最终稀释度)并加入到铜绿假单胞菌O6菌株(菌株ID: HNCMB 170009，得自匈牙利国家医学细菌保藏中心)中稀释以在测试结束时得到200-250 CFU/孔的计数。

然后在每孔中加入HL-60细胞(调整至5.10e6/ml)和仔猪补体(最终12.5%)。针对每个待测样品准备含有失活补体的对照。

将反应混合物在37℃搅拌温育90分钟。在经过1/200稀释后，然后将50 µl的体积转移到平底微孔板中。加入50 µl的MH琼脂，然后是PBS-0.9%琼脂。在34℃温育过夜后进行自动菌落计数。

调理吞噬活性以给予至少50%杀伤的血清稀释度的倒数表示。

此数据证实，在注射有佐剂组后诱导了抗体功能。

结论是：本实施例证实铜绿假单胞菌O6-EPA生物缀合物既是免疫原性的又是功能性的（即，诱导体内杀死铜绿假单胞菌O6的抗体）。

本公开在范围上不受本文描述的具体实施方案限制。实际上，从前述描述和附图中，除了所述的那些内容以外，本文提供的主题的各种修改形式对于本领域技术人员将变得显而易见。这样的改变意图落入所附权利要求的范围内。

本文所引用的各种出版物、专利和专利申请，其公开内容均以引用的方式全文并入。

序列表

<110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

GlycoVaxyn AG

<120> 经修饰的宿主细胞及其用途

<130> 13064-052-228

<140> TBA

<141> 在规定日期附上

<150> 61/980,988

<151> 2014-04-17

<160> 3

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N-糖基化共有序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = Asp 或 Glu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = 除Pro以外的任何天然氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa = 除Pro以外的任何天然氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> Xaa = Ser 或 Thr

<400> 1

Xaa Xaa Asn Xaa Xaa

1 5

<210> 2

<211> 558

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌 O6

<220>

<223> 甲酰基转移酶

<400> 2

Met Ser Trp Gln Leu Phe Ser Glu Lys Cys Arg Phe Leu Gly Ala Val

1 5 10 15

Glu Ile Ser Gln His Phe Trp Gly Phe Ile Val Leu Glu Ala Ser Phe

20 25 30

Gly Met Lys Ile Lys Ala Ala Leu Ile Val Asp Asp Leu Ser Leu Ser

35 40 45

Glu Trp Gln Lys Arg Ala Ile Glu Asp Ser Ser Glu Tyr Leu Asp Ile

50 55 60

Gln Leu Val Leu Ser Cys Arg Asn Ser Ala Thr Lys Lys Ser Val Ile

65 70 75 80

Lys His Cys Gly Tyr Tyr Phe Leu Asn Ile Leu Ser Leu Lys Asn Asp

85 90 95

Met Thr Arg Arg Val Gln Leu Asp Ser Arg Gly Ser Glu Val Ile His

100 105 110

Phe Asp Ser Asp Tyr Glu Gly Ala Trp Gln Arg Ile Pro Glu Asp Val

115 120 125

Cys Ala Arg Ile Leu Asp Lys Gly Ile Lys Leu Val Ile Lys Phe Gly

130 135 140

Met Ser Leu Leu Arg Ile Asp Gly Gly Leu Gln Arg Leu Asp Ile Leu

145 150 155 160

Ser Tyr His His Gly Asp Pro Glu Tyr Tyr Arg Gly Arg Pro Ala Gly

165 170 175

Phe Tyr Glu Ile Tyr Glu Asn Ala Asp Ser Val Gly Ile Ile Val Gln

180 185 190

Lys Leu Ser Asn Lys Leu Asp Ala Gly Glu Val Leu Val Arg Gly Tyr

195 200 205

Ser Lys Val His His His Ser Tyr Lys Lys Thr Ser Arg Asn Phe Tyr

210 215 220

Leu Asn Ser Val Val Leu Leu Arg Lys Ala Leu Val Asn Tyr Ser Arg

225 230 235 240

Gly Glu Gln Val Val Leu Glu Lys Leu Gly Lys Asn Tyr Arg Leu Pro

245 250 255

Ser Asn Phe Thr Val Phe Lys Phe Phe Cys Lys Thr Ile Phe Arg Gly

260 265 270

Leu Ala Arg Leu Ser Tyr Gly Ala Phe Phe Glu Lys Lys Trp Asn Val

275 280 285

Val Ala Leu Pro Tyr Asn Asp Ile Pro Ser Leu Gln Glu Leu Ser Val

290 295 300

Ser Ala Gly Lys Ile Pro Lys Val Glu Lys Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala

305 310 315 320

Asp Pro Phe Phe Ser Ala Asp Gly Lys Leu Ile Arg Leu Glu Ala Leu

325 330 335

Asn Ala Ser Asn Gly Leu Gly Glu Ile Ile Glu Leu Lys Ala Gln Ser

340 345 350

Leu Asp Phe Ser Arg Val Ile Leu Lys Gly Asn His Phe Ser Tyr Pro

355 360 365

Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Gly Val Glu Tyr Leu Ile Pro Glu Val Ala

370 375 380

Ser His Ser Ala Pro Cys Leu Leu Pro Pro Pro Phe Ala Leu Glu Ser

385 390 395 400

Lys Lys Leu Phe Gln Gly Met Glu Gly Glu Arg Ile Leu Asp Gly Thr

405 410 415

Leu Phe Glu His Gly Gly Arg Tyr Tyr Leu Phe Cys Gly Gln Ala Val

420 425 430

Ser Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Leu Tyr Val Gly Glu Ser Leu Glu Gly

435 440 445

Pro Tyr Thr Ser His Pro Cys Asn Pro Val Val Met Asn Pro Gly Ser

450 455 460

Ala Arg Met Gly Gly Arg Ile Phe Lys Glu Gly Gly Lys Leu Tyr Arg

465 470 475 480

Phe Gly Gln Asn Asn Ser Tyr Gly Tyr Gly Ser Ser Leu Ala Val Asn

485 490 495

Glu Ile Glu Val Leu Asp Pro Glu His Tyr Ser Glu Lys Arg Val Ala

500 505 510

Asn Leu Ala Phe Gln Asp Ala Arg Gly Pro His Thr Ile Asp Ile His

515 520 525

Gly Gln Thr Met Ile Leu Asp Phe Tyr Gln Asp Arg Phe Ser Leu Leu

530 535 540

Ala Gly Tyr Arg Arg Leu Val Ala Arg Leu Leu Ser Arg Gly

545 550 555

<210> 3

<211> 417

<212> PRT

<213> 铜绿假单胞菌 O6

<220>

<223> wzy 聚合酶

<400> 3

Met Tyr Ala Met Leu Thr Gly Ala Thr Leu Leu Ile Phe Ala Val Ala

1 5 10 15

Ala Arg Leu Leu Ala Arg Ser Ala Ile His Pro Ser Val Ala Met Pro

20 25 30

Ile Thr Trp Gly Leu Gly Leu Ile Gly Val Ser Leu Ala Ser Leu Ile

35 40 45

Gly Phe Tyr Arg Val Glu Ser Asp Ala Leu Leu Ile Phe Leu Phe Gly

50 55 60

Val Met Ser Phe Ser Leu Ser Ala Gly Cys Phe Ser Phe Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Arg Ala Pro Ser Ser Asn Phe Leu Phe Asp Ser Glu Leu

85 90 95

Arg Thr Arg Ala Leu Val Ile Phe Phe Cys Leu Ala His Ile Val Phe

100 105 110

Leu Thr Val Ile Tyr Arg Asp Leu Ser Ser Ile Ala Pro Thr Leu Arg

115 120 125

Glu Ala Ala Tyr Met Ala Arg Ala Gln Ser Val Ser Gly Glu Pro Val

130 135 140

Leu Ser Ser Leu Ser Met Asn Tyr Leu Gln Leu Gly Gln Thr Val Ile

145 150 155 160

Pro Leu Val Val Leu Leu Tyr Leu Arg Gly Lys Cys Gly Val Leu Gly

165 170 175

Phe Leu Ala Ile Ser Val Pro Trp Met Gly Val Ile Leu Leu Ala Ser

180 185 190

Gly Arg Ala Ser Leu Met Gln Met Leu Val Gly Leu Phe Phe Ile Tyr

195 200 205

Ile Leu Val Lys Gly Ser Pro Ser Leu Lys Ser Leu Leu Val Ile Gly

210 215 220

Leu Ala Met Phe Leu Val Ile Ala Val Gly Ala Val Ala Thr Ser Lys

225 230 235 240

Ile Gln Phe His Glu Gly Asp Gly Ile Ser Thr Leu Phe Ile Glu Leu

245 250 255

Tyr Arg His Val Ala Gly Tyr Ala Leu Gln Gly Pro Val Leu Phe Asp

260 265 270

Arg Tyr Tyr Gln Gly Ser Ile His Leu Glu Pro Tyr Trp Ser Pro Leu

275 280 285

Asn Gly Phe Cys Ser Ile Leu Ala Thr Val Gly Leu Cys Gln Lys Pro

290 295 300

Pro Leu His Leu Asp Phe Tyr Glu Tyr Ala Pro Gly Glu Leu Gly Asn

305 310 315 320

Val Tyr Ser Met Phe Phe Ser Met Tyr Pro His Tyr Gly Ala Leu Gly

325 330 335

Val Ile Gly Val Met Ala Leu Tyr Gly Met Leu Cys Ser Tyr Ala Tyr

340 345 350

Cys Lys Ala Lys Lys Gly Ser Leu Tyr Phe Thr Val Leu Ser Ser Tyr

355 360 365

Leu Phe Ser Ala Ile Val Phe Ser Leu Phe Ser Asp Gln Ile Ser Thr

370 375 380

Ser Trp Trp Phe Tyr Val Lys Met Thr Ile Ile Leu Gly Ile Leu Cys

385 390 395 400

Phe Val Phe Arg Arg Asp Arg Met Phe Val Ile Arg Leu Pro Gln Ala

405 410 415

Gly

Claims

1.宿主细胞，包含：

(i) 编码来源于假单胞菌的rfb簇的糖基转移酶的核酸；

(ii) 编码具有甲酰基转移酶活性的甲酰基转移酶的核酸，其中所述核酸编码SEQ IDNO:2；

(iii) 编码寡糖基转移酶的核酸；和

(iv) 编码载体蛋白的核酸，所述载体蛋白包含N-糖基化共有序列D/E–X–N–X-S/T，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸。

2.权利要求1的宿主细胞，其进一步包含编码具有聚合酶活性的wzy聚合酶的核酸，其中所述核酸编码SEQ ID NO:3。

3.权利要求1-2中任一项的宿主细胞，其中所述糖基转移酶来源于铜绿假单胞菌血清型6的rfb簇。

4.权利要求1-2中任一项的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

5.权利要求3的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。

6.生产生物缀合物的方法，所述生物缀合物包含连接至载体蛋白的假单胞菌抗原，所述方法包括在适于生产蛋白质的条件下培养权利要求1-5中任一项的宿主细胞。

7.由权利要求6的方法生产的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含连接至载体蛋白的假单胞菌抗原，其中所述O抗原是甲酰化的且甲酰基附接到至少1个GalNFmA残基。

8.由权利要求1-5中任一项的宿主细胞生产的生物缀合物，其包含经由至少一个N-糖基化共有序列D/E-X-N-X-S/T的N残基缀合至载体蛋白的铜绿假单胞菌血清型O6抗原，其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸序列，其中所述O抗原是甲酰化的且甲酰基附接到至少1个GalNFmA残基。

9.权利要求8的生物缀合物，其中至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或100%的O抗原重复单元是甲酰化的。

10.权利要求7-9中任一项的生物缀合物，其用于治疗或预防人类个体中由假单胞菌感染引起的疾病。

11.权利要求7-9中任一项的生物缀合物在制造药物上的用途，所述药物用于治疗或预防人类个体中由假单胞菌引起的疾病。