BR112016023688B1 - Bioconjugado e uso de um bioconjugado - Google Patents

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Abstract

célula hospedeira, método para produzir um bioconjugado, bioconjugado, e, uso de um bioconjugado. são descritas aqui células hospedeiras modificadas úteis na produção de bioconjugados que podem ser usados para vacinar indivíduos contra infecção por pseudomonas. os genomas das células hospedeiras modificadas aqui descritas compreendem genes que codificam proteínas envolvidas na glicosilação de proteínas, assim como genes específicos para a produção de antígenos específicos de pseudomonas.

Description

1. INTRODUÇÃO
[0001] São descritas aqui células hospedeiras modificadas úteis na produção de bioconjugados que podem ser usados para vacinar indivíduos contra infecção por Pseudomonas. Os genomas das células hospedeiras modificadas aqui descritas compreendem genes que codificam proteínas envolvidas em glicosilação de proteínas assim como genes específicos para a produção de antígenos específicos de Pseudomonas.
2. FUNDAMENTOS
[0002] A doença causada por infecção por cepas de Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa) representa uma ameaça mundial importante. Embora o desenvolvimento de vacinas contra tal infecção esteja em curso, ainda permanece uma grande necessidade de vacinas eficazes contra infecção por Pseudomonas que possam ser produzidas de modo seguro em grandes quantidades.
3. SUMÁRIO
[0003] Em um aspecto, é prevista aqui uma célula hospedeira procariótica modificada compreendendo ácidos nucleicos codificando enzimas capazes de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno de Pseudomonas. Tais células hospedeiras podem expressar naturalmente ácidos nucleicos específicos para produção de um antígeno de Pseudomonas, ou as células hospedeiras podem ser feitas para expressar tais ácidos nucleicos, isto é, em algumas modalidades ditos ácidos nucleicos sãoheterólogos às células hospedeiras. Em algumas modalidades, um ou mais de ditos ácidos nucleicos específicos para produção de um antígeno de Pseudomonas são heterólogos para a célula hospedeira e integrados no genoma da célula hospedeira. Em algumas modalidades, as células hospedeiras aqui previstas compreendem ácidos nucleicos codificando adicionais enzimas ativas na N-glicosilação de proteínas, por exemplo, as células hospedeiras aqui previstas ainda compreendem um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase e/ou um ou mais ácidos nucleicos codificando outras glicosiltransferases. Em algumas modalidades, as células hospedeiras aqui previstas compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína carreadora, por exemplo, uma proteína à qual oligossacarídeos e/ou polissacarídeos podem ser fixados para formar um bioconjugado. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[0004] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma célula hospedeira procariótica modificada compreendendo ácidos nucleicos codificando enzimas capazes de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno de Pseudomonas, em que dita célula hospedeira compreende um agrupamento rfb de Pseudomonas ou uma glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é integrada no genoma de dita célula hospedeira. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb ou glicosiltransferase de Pseudomonas aeruginosa. Ver, Raymond et al, J Bacterid., 2002 184(13):3614-22. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa é o agrupamento rfb de qualquer um dos serotipos O1-O20. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa é o agrupamento rfb de qualquer um dos serotipos descritos em Knirel et al, 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa é o agrupamento rfb de serotipo O2, O5, O6, O11, O15, O16. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa é o agrupamento rfb de serotipo O6. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa é o agrupamento rfb de serotipo O11. Em outra modalidade específica, dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni). Em outra modalidade específica, dito ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni) é integrado no genoma da célula hospedeira. Em uma modalidade específica, dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico codificando uma proteína carreadora. Em outra modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[0005] Em algumas modalidades, dita célula hospedeira procariótica modificada compreendendo ácidos nucleicos codificando enzimas capazes de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno de Pseudomonas, ainda compreende uma ou mais enzimas acessórias, incluindo ramificação, modificação, amidação, regulação do comprimento de cadeia, acetilação, formilação, polimerização de enzimas. Em uma modalidade específica, ditas uma ou mais enzimas acessórias são heterólogas para a célula hospedeira. Em uma modalidade específica, ditas uma ou mais enzimas acessórias são inseridas no genoma da célula hospedeira procariótica modificada em adição ao agrupamento rfb. Em uma modalidade específica, ditas uma ou mais enzimas acessórias são derivadas de Pseudomonas, por exemplo, P. aeruginosa.
[0006] Em uma modalidade específica, uma célula hospedeira procariótica modificada aqui prevista compreende um ácido nucleico que codifica uma formiltransferase. Em outra modalidade específica, dita formiltransferase é a formiltransferase apresentada em SEQ ID NO:2, ou um homólogo da mesma. Em outra modalidade específica, dita formiltransferase é incorporada (por exemplo, inserida no genoma de ou plasmídeo expressado por) em dita célula hospedeira como parte de um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dito agrupamento rfb de Pseudomonas foi modificado para compreender a formiltransferase. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[0007] Em outra modalidade específica, uma célula hospedeira procariótica modificada aqui prevista compreende um ácido nucleico que codifica uma polimerase wzy. Em outra modalidade específica, dita polimerase wzy é a polimerase wzy apresentada em SEQ ID NO:3, ou um homólogo da mesma. Em outra modalidade específica, dita polimerase wzy é incorporada (por exemplo, inserida no genoma de ou plasmídeo expressado por) dita célula hospedeira como parte de um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dito agrupamento rfb de Pseudomonas foi modificado para compreender uma polimerase wzy. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[0008] Em outra modalidade específica, uma célula hospedeira procariótica modificada aqui prevista compreende (i) um ácido nucleico que codifica uma formiltransferase e (ii) um ácido nucleico que codifica uma polimerase wzy. Em uma modalidade específica, dita formiltransferase é a formiltransferase apresentada em SEQ ID NO:2, ou um homólogo da mesma. Em outra modalidade específica, dita polimerase wzy é a polimerase wzy apresentada em SEQ ID NO:3, ou um homólogo da mesma. Em uma modalidade específica, dita formiltransferase e dita polimerase wzy são incorporadas (por exemplo, inseridas no genoma de ou plasmídeo expressado por) em dita célula hospedeira como parte de um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dito agrupamento rfb de Pseudomonas foi modificado para compreender a formiltransferase e polimerase wzy. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[0009] Em outro aspecto, é prevista aqui uma sequência de ácidos nucleicos isolada codificando um agrupamento modificado rfb de Pseudomonas, por exemplo, agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6, em que dito agrupamento modificado rfb de Pseudomonas compreende (i) um gene codificando uma formiltransferase (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:2 ou um homólogo da mesma), (ii) um gene codificando uma polimerase wzy (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:3 ou um homólogo do mesmo); ou (iii) um gene codificando uma formiltransferase (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:2 ou um homólogo do mesmo) e um gene codificando uma polimerase wzy (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:3 ou um homólogo do mesmo).
[00010] Ácidos nucleicos que codificam formiltransferases e ácidos nucleicos que codificam polimerase wzys que são usados para gerar agrupamentos modificados rfb de Pseudomonas, por exemplo, agrupamentos modificados rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6, podem ser inseridos no agrupamento rfb em múltiplas posições e em múltiplas orientações.
[00011] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a jusante dos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6. Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a jusante do gene wbpM do agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00012] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a montante dos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6. Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a jusante do gene wzz do agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00013] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridas em uma orientação em sentido horário com relação aos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00014] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos em uma orientação em sentido anti-horário com relação aos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00015] Em outro aspecto, é previsto aqui um método de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno de Pseudomonas ligado a uma proteína carreadora, dito método compreendendo cultivar a célula hospedeira aqui descrita sob condições apropriadas para a produção de proteínas, e purificar a proteína carreadora N-glicosilada. Métodos para produzir proteínas usando células hospedeiras, por exemplo, E. coli, e isolando proteínas produzidas por células hospedeiras, são bem conhecidos na técnica.
[00016] Em outro aspecto, são aqui previstos bioconjugados produzidas pelas células hospedeiras aqui previstas.
[00017] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno de Pseudomonas. Em uma modalidade específica, dito antígeno de Pseudomonas é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa.
[00018] Em outro aspecto, são aqui previstas composições, por exemplo, composições farmacêuticas, compreendendo um ou mais dos bioconjugados aqui previstos.
[00019] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma composição, por exemplo, composição farmacêutica, compreendendo um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligado a um antígeno de Pseudomonas. Em uma modalidade específica, dito antígeno de Pseudomonas é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa.
[00020] Em outro aspecto, aqui previstos são métodos de prevenir infecção de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, por Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa), compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição aqui descrita.
[00021] Em outro aspecto, são aqui previstos métodos de tratar um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, que foi infectado por Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa), compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição aqui descrita.
[00022] Em outro aspecto, são aqui previstos métodos de induzir uma resposta imune em um indivíduo, por exemplo, um indivíduo humano, contra Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa), compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de uma composição aqui descrita.
3.1 Terminologia
[00023] OPS: polissacarídeo O; o antígeno O de bactérias Gram- negativas. OPS também são ditos aqui como antígeno O.
[00024] LPS: lipopolissacarídeo.
[00025] Agrupamento rfb: um gene agrupamento que codifica maquinário enzimático capaz de síntese de uma estrutura dorsal de antígeno O.
[00026] waaL: o gene de antígeno Oligase gene codificando uma enzima ligada a membrana com um sítio ativo localizado no periplasma. A enzima codificada transfere antígeno O ligado a undecaprenilfosfato (UPP)-ao núcleo do lipídeo A, formando lipopolissacarídeo.
[00027] RU: unidade de repetição. Como usada aqui, a RU é fixada igual à unidade de repetição biológica, BRU. A BRU descreve a RU de um antígeno O como ele é sintetizado in vivo.
[00028] Und-PP: undecaprenil pirofosfato.
[00029] LLO: oligossacarídeo ligado a peptídeo.
[00030] Como aqui usado, o termo “bioconjugado” refere-se a um conjugado entre uma proteína (por exemplo, uma proteína carreadora) e um antígeno, por exemplo, um antígeno de Pseudomonas, preparado em um fundo de célula hospedeira, em que o maquinário da célula hospedeira liga o antígeno à proteína (por exemplo, N-ligações).
[00031] O termo” cerca de”, quando usado em conjunto com um número, refere-se a qualquer número em ±1, ±5 ou ±10% do número de referência.
[00032] Como aqui usado, o termo “quantidade eficaz”, no contexto de administrar uma terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) a um indivíduo refere-se à quantidade de uma terapia que tem efeito(s) profilático(s) e/ou terapêutico(s). Em algumas modalidades, uma “quantidade eficaz” refere-se à quantidade de uma terapia que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a severidade de um infecção por Pseudomonas ou sintoma associado com o mesmo; (ii) reduzir a duração de uma infecção por Pseudomonas ou sintoma associado com o mesmo; (iii) prevenir a progressão de uma infecção por Pseudomonas ou sintoma associado com o mesmo; (iv) causar regressão de uma infecção por Pseudomonas ou sintoma associado com o mesmo; (v) prevenir o desenvolvimento ou início de uma infecção por Pseudomonas, ou sintoma associado com o mesmo; (vi) prevenir a recorrência de uma infecção por Pseudomonas ou sintoma associado com o mesmo; (vii) reduzir a falha de órgãos associada com uma infecção por Pseudomonas; (viii) reduzir a hospitalização de um indivíduo tendo uma infecção por Pseudomonas; (ix) reduzir a duração de hospitalização de um indivíduo tendo uma infecção por Pseudomonas; (x) aumentar a sobrevivência de um indivíduo com um infecção por Pseudomonas; (xi) eliminar uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo; (xii) inibir ou reduzir uma replicação de Pseudomonas em um indivíduo; e/ou (xiii) intensificar ou melhorar o(s) efeito(s) profilático(s) ou terapêutico(s) de outra terapia.
[00033] Como aqui usado, o termo “em combinação”, no contexto de administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, refere-se ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo “em combinação” não limita a ordem em que as terapias são administradas a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou subsequente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas depois) a administração de uma segunda terapia a um indivíduo.
[00034] Como aqui usado, o termo “indivíduo” refere-se a um animal (por exemplo, pássaros, répteis e mamíferos). Em outra modalidade, um indivíduo é um mamífero incluindo um não primata (por exemplo, um camelo, asno, zebra, vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, gato, cão, rato e camundongo) e um primata (por exemplo, um macaco, um chimpanzé, e um humano). Em algumas modalidades, um indivíduo é um animal não humano. Em algumas modalidades, um indivíduo é animal de criação ou animal de estimação (por exemplo, um cão, gato, cavalo, cabra, ovelha, porco, asno ou frango). Em uma modalidade específica, um indivíduo é um humano. Os termos “indivíduo” e “paciente” podem ser usados aqui de modo interpermutável.
4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00035] Figura 1 mostra um Western blot de extratos periplásmicos de células hospedeiras modificadas que produzem bioconjugados. Cepas como descritas nos Exemplos são indicadas. “Int”. refere-se a um componente integrado. “*” refere-se à integração usando uma abordagem mediada por transpóson.
[00036] Figura 2 mostra a estrutura da unidade de repetição do antígeno O de Pseudomonas aeruginosa O6. * indica as posições que podem variar em sua composição química de acordo com a identidade do subserotipo. Variabilidade é introduzida pela atividade de amidases que convertem as funções ácido de resíduos de GalNAcA em C6 em amida, resultando em GalNAcAN (ou GalNFmA em GalNFrnAN; um grupo acetil substitui C3 do resíduo GalNAcAN* em alguns subserotipos). Os genes para polimerização da unidade de repetição (wzy), acetilação, formilação, e amidação de um dos resíduos de GalNX são desconhecidos. L-Rha, L- Rhamnose; D-GalNAcAN, ácido 6-amido-2-N-acetil-D-galactosaminurônico; D-GalNFmAN, 2-N-formil-D-galactosaminurônico; D-QuiNAc, N-acetil-D- quinosamina.
[00037] Figura 3. Teste funcional de Pseudomonas aeruginosa O6 formiltransferase. 3A: Detecção de unidade de repetição de O6 única formilada ligada ao núcleo de lipídeo A por Western blotting. E. coli W3110 Δwec foi transformado com um cosmídeo codificando o agrupamento rfbO6 (incompleto) e um plasmídeo de expressão codificando a O6 formiltransferase (fmtO6; SEQ NO:2). Extratos de células foram coletados após indução noturna durante crescimento a 37°C em meio LB, digeridos com proteinase, separado por SDS PAGE, e electroblotted em membranas de nitrocelulose. Imunodetecção com um antissoro específico de O6 induziu um sinal na presença de fmtO6, mas não no controle de vetor vazio. Este resultado indica fortemente que a formilação é um antígeno relevante em células de P. aeruginosa e um pré-requisito para a detecção usando este antissoro. 3B: Confirmação de formilação em uma unidade de repetição O6 única liberado de undecaprenilpirofosfato. W3110 Δwec AwaaL de E. coli foi transformado com os mesmos plasmídeos como acima e cultivados em frascos agitados para produzir unidades de repetição de antígeno O O6 único (a polimerase wzy está faltando nestas cepas) e glicolipídeos foram analisados. Brevemente, unidades de repetição foram extraídas como glicolipídeos de células secas, purificadas por afinidade em cartuchos C 18, hidrolisados (para remover undecaprenilpirofosfato das unidades de repetição de antígeno O O6), rotulados com 2 aminobenzamida usando aminação redutiva e analisados por HPLC em fase normal. Coexpressão de fmtO6 deu origem a um sinal adicional em tempo de eluição de 61’, contendo oligossacarídeos correspondendo à unidade de repetição O6 rotulada, formilada, enquanto que na ausência do gene, o sinal principal foi encontrado em 58’ e continha a unidade de repetição O6 acetilada N rotulada.
[00038] Figura 4. Teste funcional de polimerase wzy candidata de P. aeruginosa O6. Células de E. coli W3110 Δwec contendo um cosmídeo codificando o agrupamento rfb (incompleto) (faltando os genes fmtO6 e wzys) foram transformadas com plasmídeos codificando o gene candidato de fmtO6 e wzy PAK_01823 (SEQ ID NO:3) ou vetores vazios correspondentes. Extratos de células foram tratados com proteinase e LPS analisados por imunodetecção após SDS PAGE e eletrotransferência em membranas de nitrocelulose.
[00039] Figura 5. Clonagem do agrupamento de expressão do antígeno O artificial de Pseudomonas aeruginosa O6. Primeiro, o agrupamento rfb de P. aeruginosa O6 cepa stGVXN4017 (Pseudomonas aeruginosa O6 cepa “PAK”) foi clonado em um vetor de cosmídeo por clonagem PCR usando técnicas padrões. Buscas de homologia auxiliadas por bioinformática identificaram uma formiltransferase (FT) e O-antígeno polimerase (wzy), que foram subsequentemente inseridas a jusante do agrupamento rfb em um modo em etapas. Os resultantes genes agrupamentos são capaz de alcançar uma biossíntese de unidade de repetição de antígeno O completo de P. aeruginosa O6 (rfbO6+, sem polímero) e biossíntese de polissacarídeo (rfbO6++, em que wzy é incluído) em derivados W3110 de E. coli.
[00040] Figura 6 mostra um Western blot de extratos periplásmicos de células hospedeiras modificadas que produzem bioconjugados. Cepas como descritas em Exemplos são indicadas. 6A: resultados para cepa “St7343” de E. coli modificada para compreender pglB integrado e agrupamento rfb integrado de P. aeruginosa O6. 6B: resultados para cepa “St7209” de E. coli modificada para compreender origem em plasmídeo pglB e agrupamento rfb integrado de P. aeruginosa O6. 6C: resultados para cepa “St2182” de E. coli modificada para compreender origem em plasmídeo pglB e origem em plasmídeo de agrupamento rfb de P. aeruginosa O6.
[00041] Figura 7. glicoconjugado EPA-O6 purificado. EPA-O6 foi purificado de extratos periplásmicos de células hospedeiras modificadas usando cromatografia de afinidade Metal-quelato, cromatografia de troca aniônica e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). O eluado SEC final foi caracterizado por SDS-PAGE seguido por coloração de azul Coomassie ou Western blot usando os anticorpos indicados.
[00042] Figura 8. Retenção de plasmídeo (PR) de 1 e 3 sistemas de plasmídeo na presença e ausência de pressão de seleção de antibiótico. O PR é expressado em % de células que contém o respectivo plasmídeo. Figuras A e B mostram PR do EPA-plasmídeo (canamicina, preto) em células hospedeiras modificadas com agrupamento rfb integrado e pglB na presença (A) e ausência (B) de canamicina. Figuras C e D mostram PR do EPA-plasmídeo (canamicina, preto), pglB-Plasmídeo (espectinomicina, branco) e plasmídeo de agrupamento rfb (tetraciclina, pontilhado) em células hospedeiras modificadas na presença (C) e ausência (D) de todos os três antibióticos. A porcentagem de células em que todos os três plasmídeos estão retidos é mostrada em cinza. Inoc=inóculo; U= células não induzidas; I4=células 6horas após indução; I6=células após indução o/n
[00043] Figura 9. Atividade biológica de vacina induziu antissoro anti- O6. 9A: títulos de ponto médio ELISA de soros de camundongos reunidos a partir de grupos de vacinação diferente após a terceira injeção. Não ads= sem adjuvante, O/W: indica o adjuvante usado, um adjuvante em emulsão óleo- em-água. O/W sozinho é um grupo de controle que não contém um glicoconjugado. 9B: títulos de ponto médio de extermínio opsonofagocitótico (induzindo uma redução de 50% em cfu comparado com controle) são indicados. Pools pII e pIII são soros reunidos coletados após a segunda e terceira injeção.
5. DESCRIÇÃO DETALHADA 5.1 Células hospedeiras
[00044] São previstas aqui células hospedeiras, por exemplo, células hospedeiras procarióticas, capazes de produzir bioconjugados compreendendo um antígeno de Pseudomonas ligado a uma proteína carreadora. As células hospedeiras aqui descritas compreendem um genoma em que uma ou mais sequências de DNA foram inseridas, em que ditas sequências de DNA codificam uma proteína ou compreendem um operon envolvido em glicosilação de proteínas, por exemplo, N-glicosilação de proteínas. Por exemplo, em algumas modalidades, a célula hospedeira aqui descrita compreende um genoma em que um ou mais dos seguintes foram inseridas: DNA codificando uma oligossacaril transferase, DNA codificando uma glicosiltransferase, DNA codificando uma proteína carreadora, DNA compreendendo um agrupamento de genes rfb, DNA compreendendo um agrupamento de genes de polissacarídeo capsular, DNA codificando uma flipase, DNA codificando uma epimerase, DNA codificando uma proteína associada com um agrupamento de gene de polissacarídeo capsular, DNA codificando uma proteína envolvida em conjunto de polissacarídeo capsular, DNA codificando uma proteína envolvida em conjunto de antígeno O, DNA codificando uma proteína envolvida em conjunto de lipopolissacarídeos, e/ou DNA codificando uma proteína envolvida em conjunto de lipoligossacarídeos. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli. Células hospedeiras que produzem bioconjugados de Pseudomonas
[00045] Em outro aspecto, é prevista aqui uma célula hospedeira procariótica modificada compreendendo ácidos nucleicos codificando enzimas capazes de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno de Pseudomonas. Tais células hospedeiras podem expressar naturalmente ácidos nucleicos específicos para produção de um antígeno de Pseudomonas, ou as células hospedeiras podem ser feitas para expressar tais ácidos nucleicos, isto é, em algumas modalidades, ditos ácidos nucleicos são heterólogos às células hospedeiras. Em algumas modalidades, um ou mais dos ditos ácidos nucleicos específicos para produção de um antígeno de Pseudomonas são heterólogos à célula hospedeira e integrados no genoma da célula hospedeira. Em algumas modalidades, as células hospedeiras aqui previstas compreendem ácidos nucleicos codificando enzimas ativas adicionais na N-glicosilação de proteínas, por exemplo, as células hospedeiras aqui previstas ainda compreendem um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase e/ou um ou mais ácidos nucleicos que codificam outras glicosiltransferases. Em algumas modalidades, as células hospedeiras aqui previstas compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína carreadora, por exemplo, uma proteína à qual oligossacarídeos e/ou polissacarídeos podem ser fixados para formar um bioconjugado. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00046] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma célula hospedeira procariótica modificada compreendendo ácidos nucleicos codificando enzimas capazes de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno de Pseudomonas, em que dita célula hospedeira compreende um agrupamento rfb de Pseudomonas ou uma glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é integrado no genoma de dita célula hospedeira. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa. Em outra modalidade específica, dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni). Em outra modalidade específica, dito ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni) é integrado no genoma da célula hospedeira. Em uma modalidade específica, dita célula hospedeira compreende um ácido nucleico codificando uma proteína carreadora. Em outra modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00047] Em outra modalidade específica, é prevista aqui uma célula hospedeira procariótica modificada compreendendo (i) um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dito agrupamento rfb é integrada no genoma de dita célula hospedeira; (ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni), em que dito ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase é integrado no genoma da célula hospedeira; e (iii) uma proteína carreadora, em que dita proteína carreadora é ou de origem em plasmídeo ou integrada no genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa. Em outra modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00048] Em outra modalidade específica, é prevista aqui uma célula hospedeira procariótica modificada compreendendo (i) uma glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dita glicosiltransferase é integrada no genoma de dita célula hospedeira; (ii) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni), em que dito ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase é integrado no genoma da célula hospedeira; e (iii) uma proteína carreadora, em que dita proteína carreadora é ou de origem em plasmídeo ou integrada no genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade específica, dita glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa. Em outra modalidade específica, a célula hospedeira é E. coli.
[00049] Em uma modalidade específica, o agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb ou glicosiltransferase de Pseudomonas aeruginosa. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb ou glicosiltransferase de Pseudomonas aeruginosa serotipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 ou O20. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa é o agrupamento rfb de qualquer um dos serotipos descritos em Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb ou glicosiltransferase de Pseudomonas aeruginosa cepa PAK serotipo O6. Em uma modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas ou glicosiltransferase derivada de um agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb ou glicosiltransferase de Pseudomonas aeruginosa serotipo O11, por exemplo, Pseudomonas aeruginosa cepa PA103 (ver, por exemplo, No. de acesso no Genbank KF364633.1). Em uma modalidade específica, os genes que codificam uma enzima formiltransferase (GenBank: EOT23134.1; ID proteína NCBI: PAK 01412; SEQ ID NO:2) e uma polimerase wzy (GenBank: EOT19368.1; ID proteína NCBI: PAK_01823; SEQ ID NO:3) são introduzidos (por exemplo, via plasmídeo ou integração) em adição ao dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 cepa PAK a fim de estender funcionalmente a mesma.
[00050] Em uma modalidade específica, uma célula hospedeira procariótica modificada aqui prevista compreende um ácido nucleico que codifica uma formiltransferase. Em outra modalidade específica, dita formiltransferase é a formiltransferase apresentada em SEQ ID NO:2, ou um homólogo da mesma. Em outra modalidade específica, dita formiltransferase é incorporada (por exemplo, inserida no genoma de ou plasmídeo expressado por) em dita célula hospedeira como parte de um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dito agrupamento rfb de Pseudomonas foi modificado para compreender a formiltransferase. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00051] Em outra modalidade específica, uma célula hospedeira procariótica modificada aqui prevista compreende um ácido nucleico que codifica uma polimerase wzy. Em outra modalidade específica, dita polimerase wzy é a polimerase wzy apresentada em SEQ ID NO:3, ou um homólogo da mesma. Em outra modalidade específica, dita polimerase wzy é incorporada (por exemplo, inserida no genoma de ou plasmídeo expressado por) em dita célula hospedeira como parte de um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dito agrupamento rfb de Pseudomonas foi modificado para compreender uma polimerase wzy. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00052] Em outra modalidade específica, uma célula hospedeira procariótica modificada aqui prevista compreende (i) um ácido nucleico que codifica uma formiltransferase e (ii) um ácido nucleico que codifica uma polimerase wzy. Em uma modalidade específica, dita formiltransferase é a formiltransferase apresentada em SEQ ID NO:2, ou um homólogo da mesma. Em outra modalidade específica, dita polimerase wzy é uma polimerase wzy apresentada em SEQ ID NO:3, ou um homólogo da mesma. Em uma modalidade específica, dita formiltransferase e dita polimerase wzy são incorporadas (por exemplo, inseridas no genoma de ou plasmídeo expressado por) em dita célula hospedeira como parte de um agrupamento rfb de Pseudomonas, em que dito agrupamento rfb de Pseudomonas foi modificado para compreender a formiltransferase e polimerase wzy. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas é um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00053] Ácidos nucleicos que codificam formiltransferases e ácidos nucleicos que codificam polimerase wzys que são usados para gerar agrupamentos modificados rfb de Pseudomonas, por exemplo, agrupamento modificado rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6s, podem ser inseridos no agrupamento rfb em múltiplas posições e em múltiplas orientações.
[00054] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a jusante dos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6. Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a jusante do gene wbpM gene do agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00055] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a montante dos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6. Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos a jusante do gene wzz do agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00056] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos em uma orientação em sentido horário com relação aos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00057] Em uma modalidade específica, o gene codificando dita formiltransferase e/ou o gene codificando dita polimerase wzy é/são inseridos em uma orientação em sentido anti-horário com relação aos genes do agrupamento rfb de Pseudomonas, por exemplo, o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[00058] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma célula hospedeira procariótica modificada compreendendo ácidos nucleicos codificando enzimas capazes de produzir um bioconjugado compreendendo um antígeno O6 de Pseudomonas. Em uma modalidade específica, dita célula hospedeira compreende o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6, um ácido nucleico codificando uma polimerase wzy, e uma formiltransferase. Em uma modalidade específica, a polimerase wzy é a polimerase wzy O6 de P. aeruginosa (SEQ ID NO:3), ou um homólogo da mesma (por exemplo, a polimerase wzy da cepa PAK ou LESB58 de Pseudomonas aeruginosa). Em outra modalidade específica, a formiltransferase é a P. aeruginosa O6 formiltransferase (SEQ ID NO:2), ou um homólogo da mesma (por exemplo, a formiltransferase cepa PAK ou LESB58 de Pseudomonas aeruginosa). Em algumas modalidades, um ou mais dos ácidos nucleicos codificando o agrupamento rfb, a polimerase wzy, e/ou a formiltransferase são inseridas no genoma da célula hospedeira, por exemplo, usando um método aqui descrito. Em uma modalidade específica, cada um dos ácidos nucleicos codificando o agrupamento rfb, a polimerase wzy, e a formiltransferase é inserido no genoma da célula hospedeira, por exemplo, usando um método aqui descrito. Em algumas modalidades, a célula hospedeira ainda compreende um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase (por exemplo, pglB de Campylobacter jejuni), em que dito ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase é ou de origem em plasmídeo ou integrado no genoma da célula hospedeira; e um ácido nucleico codificando uma proteína carreadora, em que dito ácido nucleico codificando dita proteína carreadora é ou de origem em plasmídeo ou integrado no genoma da célula hospedeira. Em uma modalidade específica, dito ácido nucleico codificando dita oligossacaril transferase é integrado no genoma da célula hospedeira.
Antecedentes genéticos
[00059] As células hospedeiras exemplares que podem ser usadas para gerar as células hospedeiras modificadas aqui descritas incluem, sem limitação, espécie Escherichia, espécie Shigella, espécie Klebsiella, espécie Xhantomonas, espécie Salmonella, espécie Yersinia, espécie Lactococcus, espécie Lactobacillus, espécie Pseudomonas, espécie Corynebacterium, espécie Streptomyces, espécie Streptococcus, espécie Staphylococcus, espécie Bacillus, e espécie Clostridium. Em uma modalidade específica, a célula hospedeira usada aqui é E. coli.
[00060] Em algumas modalidades, o antecedente genético da célula hospedeira é modificado por, por exemplo, deleção de um ou mais genes. Genes exemplares que podem ser deletados em células hospedeiras (e, em alguns casos, substituídos com outras sequências desejadas de ácidos nucleicos) incluem genes de células hospedeiras envolvidos em biossíntese de glicolipídeos, como waaL (ver, por exemplo, Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), o agrupamento de antígeno O (rfb ou wb), agrupamento de antígenos comuns enterobacterianos (wec), o agrupamento de biossíntese de núcleo de lipídeo A (waa), e agrupamentos de modificação de antígeno O profago, como o agrupamento gtrABS. Em uma modalidade específica, as células hospedeiras aqui descritas são modificadas de modo que elas não produzem quaisquer antígenos O diferentes do antígeno O desejado de, por exemplo, um antígeno O de Pseudômonas. Em uma modalidade específica, um ou mais do gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS, ou um gene ou genes do agrupamento wec ou um gene ou genes do agrupamento de gene rfb são deletados ou funcionalmente inativados do genoma da célula hospedeira procariótica aqui prevista. Em uma modalidade, a célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL, gene gtrA, gene gtrB, gene gtrS são deletados ou funcionalmente inativados do genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade, a célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL e gene gtrS são deletados ou funcionalmente inativados do genoma da célula hospedeira. Em outra modalidade, a célula hospedeira usada aqui é E. coli, em que o gene waaL e genes do agrupamento wec são deletados ou funcionalmente inativados do genoma da célula hospedeira.
Proteínas carreadoras
[00061] Qualquer proteína carreadora apropriada para uso na produção de vacinas conjugadas (por exemplo, bioconjugados para uso em vacinas) pode ser usada aqui, por exemplo, ácidos nucleicos codificando a proteína carreadora podem ser introduzidos em um hospedeiro aqui previsto para a produção de um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno de Pseudomonas. Exemplares proteínas carreadoras incluem, sem limitação, Exotoxina A desintoxicada de P. aeruginosa (EPA; ver, por exemplo, Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM 197, proteína de ligação a maltose (MBP), toxoide de difteria, toxoide de tétano, hemolisina A desintoxicada de S. aureus, fator de aglutinação A, fator de aglutinação B, FimH de E. coli, FimHC de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli, variantes desintoxicadas de enterotoxina termolábil de E. coli, subunidade B da toxina da cólera (CTB), toxina da cólera, variantes desintoxicadas de toxina da cólera, proteína Sat de E. coli, o domínio passageiro de proteína Sat de E. coli, pneumolisina de Streptococcus pneumoniae e variantes desintoxicadas da mesma, AcrA de C. jejuni, proteína PcrV de Pseudomonas, e glicoproteínas naturais de C. jejuni.
[00062] Em modalidades específicas, as proteínas carreadoras expressadas pelas células hospedeiras modificadas aqui previstas são expressadas a partir de um ácido nucleico que foi integrado no genoma da célula hospedeira modificada. Isto é, um ácido nucleico codificando a proteína carreadora foi integrado no genoma da célula hospedeira. Em algumas modalidades, as proteínas carreadoras expressadas pelas células hospedeiras modificadas aqui previstas são expressadas a partir de um plasmídeo que foi introduzido na célula hospedeira modificada.
[00063] Em algumas modalidades, as proteínas carreadoras usadas na geração dos bioconjugados aqui descritos são modificadas, por exemplo, modificadas em tal modo que a proteína é menos tóxica e/ou mais susceptível à glicosilação. Em uma modalidade específica, as proteínas carreadoras usadas na geração dos bioconjugados aqui descritos são modificadas de modo que o número de sítios de sítios de glicosilação nas proteínas carreadoras é maximizado de um modo que permite que menores concentrações da proteína sejam administradas, por exemplo, em uma composição imunogênica, em sua forma bioconjugada.
[00064] Em algumas modalidades, as proteínas carreadoras aqui descritas são modificadas para incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sítios de glicosilação do que seriam normalmente associados com a proteína carreadora (por exemplo, com relação ao número de sítios de glicosilação associados com a proteína carreadora em seu estado nativo/natural, por exemplo, “tipo selvagem”). Em modalidades específicas, introdução de sítios de glicosilação é obtida por inserção de sequências de consenso de glicosilação (por exemplo, Asn-X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer sequência exceto Pro; ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionado dentre qualquer aminoácido natural exceto Pro (ver WO 2006/119987)) em qualquer parte na estrutura primária da proteína. Introdução de tais sítios de glicosilação pode ser obtida por, por exemplo, adição de novos aminoácidos à estrutura primária da proteína (isto é, os sítios de glicosilação são adicionados, no todo ou em parte), ou por mutação dos aminoácidos existentes na proteína a fim de gerar os sítios de glicosilação (isto é, aminoácidos não são adicionados à proteína, mas aminoácidos selecionados da proteína são mudados de modo a formar sítios de glicosilação). Os versados na técnica irão reconhecer que a sequência de aminoácidos de uma proteína pode ser prontamente modificada usando abordagens conhecidas na técnica, por exemplo, abordagens recombinantes que incluem modificação da sequência de ácidos nucleicos codificando a proteína. Em modalidades específicas, sequências de consenso de glicosilação são introduzidas em regiões específicas da proteína carreadora, por exemplo, estruturas de superfície da proteína, no N ou C terminais da proteína, e/ou em laços que são estabilizados por pontes dissulfeto na base da proteína. Em algumas modalidades, a sequência de consenso de glicosilação de 6 aminoácidos clássica pode ser estendida por resíduos de lisina para uma glicosilação mais eficiente e, assim, a sequência de consenso inserida pode codificar 5, 6, ou 7 aminoácidos que devem ser inseridos ou que substituem os aminoácidos de proteína aceitadora.
[00065] Em algumas modalidades, as proteínas carreadoras usadas na geração dos bioconjugados aqui descritos compreendem uma “etiqueta”, isto é, uma sequência de aminoácidos que permite o isolamento e/ou identificação da proteína carreadora. Por exemplo, a adição de uma etiqueta a uma proteína carreadora aqui descrita pode ser útil na purificação desta proteína e, assim, a purificação de vacinas conjugadas compreendendo a proteína carreadora etiquetada. Exemplares etiquetas que podem ser usadas aqui incluem, sem limitação, etiquetas histidina (HIS) (por exemplo, etiquetas hexa-histidina, ou 6XHis-Tag), FLAG-TAG, e etiquetas HA. Em algumas modalidades, as etiquetas usadas aqui são removíveis, por exemplo, remoção por agentes químicos ou por meios enzimáticos, uma vez que elas não são mais necessárias, por exemplo, após a proteína ser purificada.
[00066] Em algumas modalidades, as proteínas carreadoras aqui descritas compreendem a sequência de sinal que alveja a proteína carreadora para o espaço periplásmico da célula hospedeira que expressa a proteína carreadora. Em uma modalidade específica, a sequência de sinal é de DsbA de E. coli, porina de membrana externa de E. coli A (OmpA), proteína de ligação a maltose de E. coli (MalE), pectato liase de Erwinia carotovorans (PelB), Flgl, NikA, ou endoxilanase de Bacillus sp. (XynA), enterotoxina LTIIb termolábil de E. coli, endoxilanase XynA de Bacillus, ou flagelina de E. coli (Flgl).
Maquinário de glicosilação Oligossacaril Transferases
[00067] Oligossacaril transferases transferem oligossacarídeos ligados a lipídeos para resíduos de asparagina de cadeias de polipeptídeos nascentes que compreendem um motivo de consenso N-glicosilação, por exemplo, Asn- X-Ser(Thr), em que X pode ser qualquer aminoácido exceto Pro; ou Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer aminoácido natural exceto Pro (ver WO 2006/119987). Ver, por exemplo, WO 2003/074687 e WO 2006/119987, cujas descrições são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[00068] Em algumas modalidades, as células hospedeiras aqui previstas compreendem um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase. O ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase pode ser nativo para a célula hospedeira, ou pode ser introduzido na célula hospedeira usando abordagens genéticas, como descrito acima. A oligossacaril transferase pode ser de qualquer fonte conhecida na técnica. Em uma modalidade específica, uma oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase de Campylobacter. Em outra modalidade específica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase de Campylobacter jejuni (isto é, pglB; ver, por exemplo, Wacker et al, 2002, Science 298:17901793; ver também, por exemplo, NCBI Gene ID: 3231775, No. de acesso UniProt O86154). Em outra modalidade específica, a oligossacaril transferase é uma oligossacaril transferase de Campylobacter lari (ver, por exemplo, NCBI Gene ID: 7410986).
[00069] Em uma modalidade específica, as células hospedeiras modificadas aqui previstas compreendem uma sequência de ácido nucleico codificando uma oligossacaril transferase, em que dita sequência de ácido nucleico codificando uma oligossacaril transferase é integrada no genoma da célula hospedeira.
Enzimas Acessórias
[00070] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos codificando uma ou mais enzimas acessórias são introduzidos nas células hospedeiras modificadas aqui descritas. Tais ácidos nucleicos codificando uma ou mais enzimas acessórias podem ser ou de origem em plasmídeo ou integrados no genoma das células hospedeiras aqui descritas. Exemplares enzimas acessórias incluem, sem limitação, epimerases, enzimas de ramificação, modificação, amidação, regulação do comprimento de cadeia, acetilação, formilação, polimerização.
[00071] Sequências de ácidos nucleicos codificando epimerases que podem ser inseridas nas células hospedeiras aqui descritas são conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a epimerase inserida em uma célula hospedeira aqui descrita é uma epimerase descrita em Publicação de pedido de patente internacional No. WO 2011/062615, cuja descrição é incorporada por referência aqui em sua totalidade. Em uma modalidade específica, a epimerase é a epimerase codificada pelo gene Z32O6 de E. coli cepa O157. Ver, por exemplo, WO 2011/062615 e Rush et al., 2009, The Journal of Biological Chemistry 285:1671-1680, que é incorporado por referência aqui em sua totalidade. Em uma modalidade específica, as células hospedeiras modificadas aqui previstas compreendem uma sequência de ácido nucleico codificando uma epimerase, em que dita sequência de ácidos nucleicos codificando uma epimerase é integrada no genoma da célula hospedeira.
[00072] Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico codificando uma formiltransferase é inserida em ou expressada pelas células hospedeiras aqui descritas. Formiltransferases são enzimas que catalisam a transferência de um grupo formila para uma molécula aceitadora. Em uma modalidade específica, uma sequência de ácidos nucleicos codificando a Pseudomonas aeruginosa O6 fmtO6 formiltransferase (SEQ ID NO:2), ou um homólogo da mesma (por exemplo, a polimerase wzy da cepa PAK ou LESB58 de Pseudomonas aeruginosa), é inserida em ou expressada pelas células hospedeiras aqui descritas. Em outra modalidade específica, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína tendo cerca de ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade ou homologia para SEQ ID NO:2 é inserida em ou expressada pelas células hospedeiras aqui descritas.
[00073] Algumas formiltransferases envolvidas em biossíntese de polissacarídeos são conhecidas, e podem ser inseridas em ou expressadas pelas células hospedeiras aqui descritas. Por exemplo, vioF é uma enzima de P. alcalifaciens serotipo O30, que é 48% idêntica a uma Francisella tularensis formiltransferase (Nagaraja et al. 2005). Ela converte dTDP-D- Qui4N em dTDP-D-Qui4NFo, e está envolvida em biossíntese de O-antígeno (Liu et al. 2012, Glicobiology 22(9): 1236-1244). Outra formiltransferase envolvida em biossíntese de polissacarídeo é arnA (por exemplo, de E. coli), uma enzima bifuncional em que o domínio N-terminal converte UDP-Ara4N em UDP-AraNFo, enquanto que o domínio C-terminal está envolvido em descarboxilação oxidativa de ácido UDP-glucurônico. Ambas as atividades enzimáticas são requeridas para modificação L-Ara4N de LipidA e resistência a polimixina (Breazeale et al., 2005, The Journal of Biological Chemistry 280(14): 14154-14167). Outra formiltransferase envolvida em biossíntese de polissacarídeo é wekD, uma enzima de E. coli serotipo O119, envolvida na biossíntese de TDP-DRhaNAc3NFo (Anderson et al, 1992, Carbohydr Res. 237:249-62).
[00074] Ainda, domínios que estão relacionados com a atividade de formiltransferase foram caracterizados. O assim chamado domínio de núcleo_ FMT está presente na maior parte das formiltransferases. Exemplos incluem a metionil-tRNA formiltransferase, fosforibosilglicinamida formiltransferase 1, UDP-ácido glucurônico decarboxilase/UDP-4-amino-4-deoxi-L-arabinose formiltransferase, vioF de Providencia alcalifaciens O30, e arnA de E.coli. As acima mencionadas formiltransferases usam FTHF (N-10- formiltetrahidrofolato) como doador de formila. Também, enzimas produzindo formato usando FTHF (10-formiltetrahidrofolato) como substrato contém este domínio. Além disso, AICARFT está presente em fosforibosilaminoimidazolcarboxamida formiltransferase/IMP ciclo hidrolase e FDH_GDH está presente em fosforibosilglicinamida formiltransferase 2.
[00075] Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico codificando um antígeno O polimerase (gene wzy) é inserida em ou expressada pelas células hospedeiras aqui descritas. As antígeno O polimerases são proteínas de transmembrana de múltipla abrangência. Elas usam unidades de repetição de antígeno O ligado a undecaprenilpirofosfato como substratos para gerar um polímero linear consistindo das unidades de repetição. As antígeno O polimerases (wzy) estão presentes em bactérias Gram negativas que sintetizam polímeros de antígeno O via um mecanismo dependente de wzy.
[00076] Em uma modalidade específica, uma sequência de ácidos nucleicos codificando a polimerase wzy de Pseudomonas aeruginosa (SEQ ID NO:3), ou um homólogo da mesma (por exemplo, uma polimerase wzy da cepa PAK ou LESB58 de Pseudomonas aeruginosa), é inserida em ou expressada pelas células hospedeiras aqui descritas. Exemplos de bactérias conhecidas para compreender polimerase wzys incluem Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Shigella flexneri e Salmonella typhimurium. Em outra modalidade específica, uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína tendo cerca de ou pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade ou homologia para SEQ ID NO: 3 é inserida em ou expressada pelas células hospedeiras aqui descritas.
Número de cópias de genes
[00077] Em algumas modalidades, o número de cópias de um gene(s) integrado em uma célula hospedeira modificada aqui previsto é de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10. Em uma modalidade específica, o número de cópias do(s) gene(s) integrado(s) em uma célula hospedeira modificada é previsto aqui 1 ou 2.
Benefícios
[00078] As células hospedeiras modificadas aqui descritas são de importância comercial particular e relevância, como elas permitem uma fermentação em larga escala de bioconjugados compreendendo antígenos de Pseudomonas que podem ser usados como terapêuticos (por exemplo, em composições imunogênicas, vacinas), em um risco menor devido à aumentada estabilidade do DNA cromossomicamente inserido e, assim, a expressão do DNA de interesse durante fermentação. As células hospedeiras modificadas aqui descrita são vantajosas sobre as células hospedeiras que se baseiam em uma expressão de origem em plasmídeos de ácidos nucleicos requeridos para a geração de bioconjugados aqui descritos, porque, inter alia, a seleção de antibióticos durante fermentação não é requerida uma vez que o DNA heterólogo é inserido no genoma da célula hospedeira. Isto é, quando o DNA do inserto é inserido no cromossoma, ele não precisa ser selecionado, porque ele é propagado junto com a replicação do genoma hospedeiro. Ainda, é conhecida uma desvantagem nos sistemas de origem em plasmídeos pois com cada geração (isto é, ciclo de replicação de célula hospedeira) o risco de perder o plasmídeo aumenta. Esta perda de plasmídeo é devida, algumas vezes, à distribuição inapropriada de plasmídeos para as células filhas no estágio de separação de células durante a divisão celular. Em grande escala, culturas de células bacterianas duplicam mais de uma vez do que em escalas de fermentação menores para alcançar densidades elevadas de células. Assim, uma estabilidade mais elevada de células e expressão de DNA de inserto conduz a rendimentos de produto mais elevados, fornecendo uma vantagem distinta. Estabilidade das células é, além disso, um critério de aceitação de processo para aprovação pelas autoridades reguladoras, enquanto a seleção de antibióticos geralmente não é desejada durante a fermentação, por várias razões, por exemplo, antibióticos estão presentes como impurezas nos produtos medicinais finais e contém o risco de causar reações alérgicas, e antibióticos podem promover resistência a antibióticos (por exemplo, por transferência de genes ou seleção de patógenos resistentes).
[00079] O presente pedido fornece células hospedeiras modificadas para uso na preparação de bioconjugados compreendendo antígenos de Pseudomonas que podem ser usados como agentes terapêuticos (por exemplo, em composições imunogênicas, vacinas), em que certos elementos genéticos necessários para dirigir a produção de bioconjugados estão estavelmente integrados no genoma da célula hospedeira. Por conseguinte, a célula hospedeira pode conter um número reduzido de plasmídeos, apenas um único plasmídeo ou sem plasmídeos de todo. Em algumas modalidades, a presença de um único plasmídeo pode resultar em uma maior flexibilidade da cepa de produção e a capacidade de mudar a natureza da conjugação (em termos de seu teor de sacarídeo ou proteína carregadora) facilmente levando a uma maior flexibilidade da cepa de produção.
[00080] Em geral, uma redução no uso de plasmídeos conduz a uma cepa de produção que é mais adequada para uso na produção de medicamentos. Uma desvantagem do material genético essencial estar presente em plasmídeos é o requisito para a pressão de seleção manter os elementos epissomais na célula hospedeira. A pressão de seleção requer o uso de antibióticos, o que é indesejável para a produção de produtos medicinais, devido a, por exemplo, o perigo de reações alérgicas contra os antibióticos e os custos adicionais de fabricação.
[00081] Além disso, a pressão de seleção muitas vezes não é completa, resultando em culturas bacterianas não homogêneas em que alguns clones perderam o plasmídeo e, portanto, não estão produzindo o bioconjugado. As células hospedeiras aqui descritas, portanto, são capazes de produzir um produto mais seguro que pode ser obtido com rendimentos elevados.
5.2 Métodos de integração/introdução de ácidos nucleicos em células hospedeiras
[00082] Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para integrar um ácido nucleico (por exemplo, um gene ou operon, por exemplo, agrupamento rfb) no genoma de uma célula hospedeira.
[00083] Em uma modalidade específica, ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras aqui descritas usando o método de inserção descrito em pedido de patente internacional No.PCT/EP2013/071328. De acordo com esse método, grandes sequências contíguas de DNA podem ser estavelmente inseridas diretamente no genoma da célula hospedeira. Breve, o método compreende algumas ou todas das seguintes etapas:
[00084] Etapa 1: Um plasmídeo doador é obtido. Uma sequência de DNA de inserto heterólogo (isto é, sequência de DNA de inserto heterólogo que compreende um ou mais genes de interesse) é clonada em um sítio de clonagem (por exemplo, um sítio de clonagem múltiplo, abreviado como MCS) de um plasmídeo apropriado para uso como um plasmídeo doador. As sequências de DNA apropriadas para uso como regiões de homologia (isto é, sequências de DNA homólogas ao local de inserção no genoma de célula hospedeira) são também clonadas no plasmídeo doador, de modo que as regiões de homologia flanqueiam o DNA de inserto heterólogo. Estes métodos de clonagem e montagem do plasmídeo doador podem ser feitos de acordo com qualquer tecnologia bem estabelecida e conhecida para modificar e sintetizar DNA como, sem limitação, clonagem molecular usando enzimas de restrição e ligase, transposases, síntese química, etc. cujas tecnologias são conhecidas dos versados na técnica.
[00085] Em algumas modalidades, um cassete de seleção compreendendo um quadro de leitura aberto codificando uma proteína que confere resistência a antibiótico é posicionado entre os braços de homologia. Células hospedeiras compreendendo o DNA de inserto heterólogo inserido em seu genoma pode ser identificado por cultivo dos mesmos em meio que compreende o antibiótico ao qual o gene de resistência ao antibiótico do cassete de seleção confere resistência. Em algumas modalidades, o cassete de seleção pode ser flanqueado por sítios FRT, que permitem a remoção posterior do cassete por recombinação sítio-dirigida. A incorporação de sítios FRT deste modo no plasmídeo doador que assegura que o cassete de seleção não permanece integrado no genoma de célula hospedeira. Em outra modalidade, o cassete de seleção pode ser removido após integração via recombinação homóloga sítio-dirigida mediada por sítio diff ou por outras tecnologias de mutagênese cromossômica sítio-dirigidas.
[00086] Os plasmídeos doadores ainda podem ser engenheirados para compreender um quadro de leitura aberto codificando uma proteína de contrasseleção. Qualquer gene codificando uma proteína conhecida dos versados na técnica apropriada para uso em abordagens de contrasseleção pode ser incorporada nos plasmídeos doadores aqui descritos. Em uma modalidade específica, o gene sacB é usado para contrasseleção.
[00087] Os plasmídeos doadores ainda podem ser engenheirados para compreender uma origem de replicação. Os versados na técnica irão prontamente apreciar que a origem de replicação incorporada no plasmídeo doador deve ser apropriada para uso em célula hospedeira que está sofrendo modificação do genoma. Por exemplo, uma origem de replicação de E. coli deve estar presente quando a clonagem é realizada em E. coli. Em uma modalidade específica, a origem de replicação é oriT. Os versados na técnica irão prontamente apreciar que plasmídeos shuttle (isto é, plasmídeos capazes de replicação em células hospedeiras múltiplas, por exemplo, espécies bacterianas múltiplas) podem ser gerados usando métodos conhecidos na técnica, e tais plasmídeos podem ser usados para inserção em numerosos tipos de células hospedeiras, por exemplo, células procarióticas, células arqueais, células eubacterianas, ou células eucarióticas. Tais plasmídeos shuttle podem compreender elementos de controle de expressão específica do organismo e origens de replicação.
[00088] Etapa 2: Um plasmídeo ajudante é obtido. O plasmídeo ajudante é engenheirado para codificar todas as atividades necessárias para mediar a inserção do DNA em células hospedeiras e para manutenção do plasmídeo ajudante dentro das células hospedeiras que sofrem recombinação. Em algumas modalidades, os plasmídeos ajudantes compreendem (i) um cassete de seleção para manutenção do plasmídeo na célula hospedeira, (ii) um régulon para a expressão de um recombinase, isto é, um enzima ou enzimas que suporta e intensifica o cruzamento sobre eficiência entre pedaços de DNA homólogos, (iii) um régulon para expressão de uma função que lineariza o inserto de DNA resultando em sequências homólogas terminais que podem sofrer recombinação homóloga, (iv) um régulon expressando um homólogo RecA para células hospedeiras que não tem sua própria cópia recA e (v) uma origem de replicação condicional.
[00089] Em algumas modalidades, os plasmídeos ajudantes compreendem componentes similares ao plasmídeo ajudante pTKRED (Gene bank GU327533.1). Em uma modalidade específica, o plasmídeo ajudante pTKRED (Gene bank GU327533.1) é usado no método.
[00090] Etapa 3: O plasmídeo doador e o plasmídeo ajudante são introduzidos na mesma célula hospedeira. Inserção de plasmídeos doadores e ajudantes pode ser realizada por qualquer diferente tecnologia conhecida dos versados na técnica incluindo, sem limitação, eletroporação, uso de células quimicamente competente, choque térmico, e transdução de fagos. As células hospedeiras podem ser, então, cultivadas, sob condições seletivas para enriquecer as células carregando os plasmídeos introduzidos.
[00091] Etapa 4: O procedimento de inserção é iniciado. O procedimento de inserção exemplar compreende as seguintes etapas: culturas noturnas de clones positivos (isto é, células hospedeiras compreendendo tanto os plasmídeos ajudantes como doadores) podem ser cultivadas em, por exemplo, meio a 30°C compreendendo os antibióticos apropriados para seleção (tais antibióticos podem ser prontamente selecionados pelos versados na técnica com base em cassetes de seleção presentes nos plasmídeos doadores/ ajudantes). As culturas então podem ser diluídas e cultivadas em, por exemplo, 30°C até a fase exponencial na presença de antibióticos apropriados. Sob estas condições, os plasmídeos ajudantes e doadores são mantidos, mas silentes. A seguir, o meio é substituído por meio contendo os antibióticos para seleção, assim como quaisquer indutores de elementos condicionais (por exemplo, promotores indutíveis ou origens de replicação condicionais) presentes nos plasmídeos, seguido por ainda incubação das células. Durante esse tempo, a endonuclease de restrição (por exemplo, SceI) no plasmídeo ajudante e a recombinase (por exemplo, recombinase lambda red) no plasmídeo ajudante são expressados, levando à clivagem do plasmídeo doador nos braços de homologia, e recombinação homóloga do DNA de homologia nos sítios homólogos no genoma da célula hospedeira. A seguir, as células são colocadas em placa em meio contendo o componente que o marcador de contrasseleção do plasmídeo doador corresponde ao (por exemplo, sacarose se o marcador de contrasseleção é sacB). Esta Etapa resulta na contrasseleção de células que compreendem o plasmídeo doador, isto é, células em que o plasmídeo doador existe em um estado não inserido. Tal meio também compreende o marcador de resistência presente no cassete de inserção do plasmídeo doador (isto é, o cassete de resistência a antibiótico que está presente entre o HR do plasmídeo doador, para selecionar as células que contém o DNA de inserto heterólogo. Após incubação noturna, as células são então triadas para clones recombinados mostrando um fenótipo de resistência a antibiótico consistente com (i) perda dos plasmídeos ajudantes e doadores e (ii) presença do inserto de DNA heterólogo.
[00092] Além dos métodos de inserção descritos acima, DNA pode ser inserido no genoma de uma célula hospedeira usando outras abordagens. Em algumas modalidades, DNA é inserido no genoma da célula hospedeira usando qualquer método de inserção sítio-específica conhecido na técnica. Em algumas modalidades, DNA é inserido no genoma da célula hospedeira usando qualquer método de integração aleatória conhecido na técnica. Tais métodos são descritos em maiores detalhes abaixo.
[00093] Em algumas modalidades, DNA é inserido em um genoma de célula hospedeira (por exemplo, E. coli) usando um método que compreende inserção mediada por transpóson. Tal inserção aleatória permite a inserção de DNA de interesse em locais múltiplos do genoma de célula hospedeira, e assim permite a identificação sítios de inserção ótimos em células hospedeiras em que DNA foi inserido, por exemplo, células hospedeiras contendo DNA inserido podem ser comparadas uma com a outra com relação à eficiência de produção do DNA inserido e células hospedeiras com maior eficiência podem ser selecionadas para uso futuro. Métodos de inserção de sequências de ácidos nucleicos mediadas por transpóson no genoma de células hospedeiras são conhecidos na técnica. Por exemplo, em algumas modalidades, o sistema de liberação pUTminiTn5 (Biomedical; Sevilla, Espanha) é usado para estavelmente inserir genes nos genomas de células hospedeiras (como células hospedeiras bacterianas). As cepas em que DNA foi inserido então podem ser identificadas e isoladas. Ver, também Herrero et al., 1990, J. Bacteriology 172(11):6557-6567 e DeLorenzo et al., 1990, J. Bacteriology 172(11):6568- 6572, cada sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade. Além disso, em algumas modalidades, inserção de DNA mediada por transpóson em um genoma de célula hospedeira é alcançada usando um método com base em Tn-7 de inserção de DNA. Ver, McKenzie et al., 2006, BMC Microbiology 6:39 e Sibley et al., 2012, Nucleic Acids Res. 40:el9, cada sendo aqui incorporado por referência em sua totalidade.
[00094] Em algumas modalidades, DNA é inserido em um genoma de célula hospedeira (por exemplo, E. coli) usando o kit StabyCloning™ ou o kit StabyCodon T7 (Delphi Genetics, Charleroi, Bélgica), que permite a clonagem de DNA específico para sítio.
[00095] Em algumas modalidades, DNA é inserido no genoma da célula hospedeira (por exemplo, E. coli) usando o método “clonetegration” de clonagem e integração cromossômica de DNA. Ver, St. Pierre et al, 2013, ACS Synthetic Biology 2:537-541, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00096] Em algumas modalidades, DNA é inserido no genoma de célula hospedeira (por exemplo, E. coli) usando um método que envolve replicação condicional, integração, e modulação de plasmídeos (CRIM), como descrito por Haldimann e Wanner, 2001, J. Bacteriology 183:63846393, cuja descrição é aqui incorporada referência em sua totalidade.
[00097] Em algumas modalidades, DNA é inserido no genoma de célula hospedeira (por exemplo, E. coli) usando recombineering, um método descrito por, por exemplo, Sharan et al, 2009, Nat. Protoc. 4:206-223; Yu et al., 2000, PNAS USA 97:5978-5983; Kuhlman et al, 2010, Nucleic Acid Res. 38:e92; e Zhang et al., 1998, Nat. Genet. 20:123-128, cada sendo aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[00098] Em algumas modalidades, ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras modificadas aqui descritas por eletroporação, transformação química por choque térmico, transformação natural, transdução de fagos, e/ou conjugação. Em modalidades específicas, ácidos nucleicos heterólogos são introduzidos nas células hospedeiras aqui descritas usando um plasmídeo, por exemplo, os ácidos nucleicos heterólogos são expressados nas células hospedeiras pelo plasmídeo (por exemplo, um vetor de expressão), e o plasmídeo é introduzido nas células hospedeiras modificadas por eletroporação, transformação química por choque térmico, transformação natural, transdução de fagos, ou conjugação.
[00099] Em uma modalidade específica, uma sequência de ácidos nucleicos isolada é integrada em uma célula hospedeira (por exemplo, E. coli), em que dito ácido nucleico codifica um agrupamento modificado rfb de Pseudomonas, por exemplo, agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6, em que dito agrupamento rfb modificado de Pseudomonas compreende (i) um gene codificando uma formiltransferase (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:2 ou um homólogo da mesma), (ii) um gene codificando uma polimerase wzy (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:3 ou um homólogo da mesma); ou (iii) um gene codificando uma formiltransferase (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:2 ou um homólogo da mesma) e um gene codificando uma polimerase wzy (por exemplo, um gene codificando SEQ ID NO:3 ou um homólogo da mesma). 5.3 Bioconjugados
[000100] As células hospedeiras modificadas aqui descritas podem ser usadas para produzir bioconjugados compreendendo um antígeno de Pseudomonas ligado a uma proteína carreadora. Métodos de produzir bioconjugados usando células hospedeiras são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, WO 2003/074687 e WO 2006/119987. Bioconjugados, como aqui descritos, apresentam propriedades vantajosas sobre os conjugados químicos de antígeno-proteína carreadora, em que eles requerem menos produtos químicos em sua fabricação e são mais consistentes em termos do produto final gerado.
[000101] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligado a um antígeno de Pseudomonas. Em uma modalidade específica, dito antígeno de Pseudomonas é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa. Em uma modalidade específica, é previsto aqui um bioconjugado compreendendo um antígeno O de P. aeruginosa e uma proteína carreadora, em que dita proteína carreadora é EPA, PcrV (aka LcrV, EspA, SseB), PopB (YopB, YopD, FliC), ou OprF, Oprl.
[000102] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, em que dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipos O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 ou O20.
[000103] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, em que dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa é um dos serotipos descritos em Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade.
[000104] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, em que dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[000105] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, em que dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipo O11. Em uma modalidade específica, dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipo O11 é de Pseudomonas aeruginosa cepa PA103 (ver, por exemplo, No. de acesso no Genbank KF364633.1).
[000106] Os bioconjugados aqui descritos podem ser purificados por qualquer método conhecidos na técnica para purificação de uma proteína, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, troca aniônica, afinidade e cromatografia de coluna de tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Ver, por exemplo, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18); ver também os métodos descritos em WO 2009/104074. Ainda, os bioconjugados podem ser fundidos a sequências de polipeptídeos heterólogos aqui descritas ou de outra forma conhecidas na técnica para facilitar purificação. As condições reais usadas para purificar um bioconjugado particular irão depender, em parte, da estratégia de síntese e em fatores como a carga líquida, hidrofobicidade e/ou hidrofilicidade do bioconjugado e serão evidentes para os versados na técnica.
5.4 Métodos analíticos
[000107] Vários métodos podem ser usados para analisar as composições estruturais e comprimentos de cadeia de açúcar dos bioconjugados aqui descritos.
[000108] Em uma modalidade, hidrazinólise pode ser usada para analisar glicanos. Primeiro, polissacarídeos são liberados de seus carreadores de proteína por incubação com hidrazina de acordo com as instruções dos fabricantes (Ludger Liberate Hydrazinolysis Glican Release Kit, Oxfordshire, UK). A hidrazina nucleofílica ataca a ligação glicosídica entre o polissacarídeo e a proteína carreadora e permite a liberação dos glicanos fixados. Os grupos N-acetil são perdidos durante este tratamento e precisam ser reconstituídos por re-N-acetilação. Os glicanos livres são purificados em colunas de carbono e subsequentemente rotulados na extremidade redutora com o fluoróforo 2-amino benzamida. Ver, Bigge JC, Patel TP, Bruce JA, Goulding PN, Charles SM, Parekh RB: Nonselective and efficient fluorescent labeling of glicans using 2-amino benzamide and anthranilic acid. Anal Biochem 1995, 230(2):229-238. Os polissacarídeos rotulados são separados em uma coluna GlicoSep-N (GL Sciences) de acordo com o protocolo HPLC de Royle et al. Ver, Royle L, Mattu TS, Hart E, Langridge JI, Merry AH, Murphy N, Harvey DJ, Dwek RA, Rudd PM: An analytical and structural database provides a strategy for sequencing O-glicans from microgram quantities of glicoproteins. Anal Biochem 2002, 304(l):70-90. O cromatograma de fluorescência resultante indica o comprimento de polissacarídeo e número de unidades de repetição. A informação estrutural pode ser reunida por coleta de picos individuais e subsequentemente realizando análise MS/MS. Assim, a composição de monossacarídeo e sequência da unidade de repetição podem ser confirmadas e adicionalmente homogeneidade da composição de polissacarídeo pode ser identificada.
[000109] Em outra modalidade, SDS-PAGE ou eletroforese de gel capilar pode ser usado para avaliar glicanos e bioconjugados. Comprimento de polímero dos glicanos de antígeno O é definido pelo número de unidades de repetição que são linearmente montadas. Isto significa que um padrão semelhante a progressão típico é uma consequência de diferentes números de unidades de repetição que compõem o glicano. Assim, duas bandas próximas uma da outra em SDS PAGE ou outras técnicas que separam por tamanho diferem em apenas uma única unidade de repetição. Estas diferenças discretas são exploradas quando analisando glicoproteínas para o tamanho de glicano. A proteína carreadora não glicosilada e o bioconjugado com diferentes comprimentos de cadeia de polímero se separam de acordo com suas mobilidades eletroforéticas. O primeiro número da unidade de repetição detectável (n1) e o número da unidade de repetição médio (nmédio) presentes em um bioconjugado são medidos. Estes parâmetros podem ser usados para demonstrar a consistência lote a lote ou a estabilidade do polissacarídeo.
[000110] Em outra modalidade, MS de massa elevada e HPLC de exclusão de tamanho podem ser aplicados para medir o tamanho dos bioconjugados completos.
[000111] Em outra modalidade, um teste de antrona-ácido sulfúrico pode ser usado para medir os rendimentos de polissacarídeos. Ver, Leyva A, Quintana A, Sanchez M, Rodriguez EN, Cremata J, Sanchez JC: Rapid and sensitive anthrone-sulfuric acid assay in microplate format to quantify carbohydrate in biopharmaceutical products: method development and validation. Biologicals: Journal of the International Association of Biological Standardization 2008, 36(2):134-141. Em outra modalidade, um teste de Metilpentose pode ser usado para medir os rendimentos de polissacarídeos. Ver, por exemplo, Dische et al., J Biol Chem. 1948 Sep;175(2):595-603.
Mudança em uso de sítio de glicosilação
[000112] Para mostrar que o uso de sítio em uma proteína específica é mudado em um sistema de plasmídeo múltiplo, em oposição a um sistema inserido, o uso de sítio de glicosilação deve ser quantificado. Métodos para sua obtenção são mostrados abaixo.
[000113] LC-MS/MS de glicopeptídeo: bioconjugados são digeridos com protease(s), e os peptídeos são separados por um método cromatográfico apropriado (C18, Interação hidrofílica, HPLC HILIC, colunas GlycoSepN, SE HPLC, AE HPLC), e os diferentes peptídeos são identificados usando MS/MS. Este método pode ser usado com ou sem um prévio encurtamento da cadeia de açúcar por métodos químicos (degradação smith) ou enzimáticos. A quantificação de picos de glicopeptídeos usando detecção UV a 215 a 280 nm permite uma determinação relativa de uso de sítio de glicosilação.
[000114] HPLC de exclusão de tamanho: Um uso de sítio de glicosilação maior é refletido por um tempo de eluição mais cedo a partir de uma coluna SE HPLC.
Homogeneidade
[000115] Homogeneidade de bioconjugado (isto é, a homogeneidade dos resíduos de açúcar fixados) pode ser avaliada usando métodos que medem o comprimento do ligado e raio hidrodinâmico.
Outras aplicações clínicas/práticas potenciais
[000116] As cepas integradas podem produzir um maior rendimento de bioconjugados devido à carga reduzida de seleção de antibiótico como comparado com o sistema de três plasmídeos. Além disso, degradação menos proteolítica ocorre devido à carga metabólica reduzida para as células.
[000117] Cepas integradas produzem bioconjugados com distribuições de comprimento de polissacarídeo mais curtas e menos espalhadas. Assim, os bioconjugados são mais fáceis de caracterizar e são melhor definidos.
[000118] Além disso, inserção pode reduzir a extensão da tensão periplásmica para as células que pode levar a menor proteólise de produto durante o processo de fermentação devido à carga de seleção de antibiótico reduzida como comparado com o sistema de três plasmídeos.
[000119] Os sistemas de glicosilação de proteína requerem três elementos recombinantes no hospedeiro de produção: um DNA de expressão de proteína carreadora, um DNA de expressão de oligossacaril transferase, e um DNA de expressão de polissacarídeo. Os sistemas de produção bacteriana da técnica anterior contêm estes três elementos em plasmídeos. Assim, ocorre um risco para instabilidade durante a fabricação devido à perda de plasmídeo, particularmente porque os antibióticos usados para manutenção dos plasmídeos não devem estar presentes durante a fermentação do material GMP. Porque as cepas inseridas contêm um plasmídeo a menos, elas são mais estáveis em muitas gerações. Isto significa que fermentações em maiores escalas e tempos de incubação mais longos (maiores números de gerações) são possíveis. Além disso, a ausência de um antibiótico para seleção o torna um produto mais seguro, devido à ausência de traços de antibióticos que podem causar reações alérgicas em indivíduos sensíveis. Ver, COMMITTEE WE, BIOLOGICAL O, STANDARDIZATION: WHO Technical Report Series 941. In: Fifty-sixth Report. Editado por Organização WH. Genebra: World Health Organization; 2007.
[000120] Cepas inseridas são mais geneticamente estáveis devido à inserção cromossômica fixa, assim levando a uma maior reprodutibilidade dos produtos desejados de proteína durante o processo de produção, por exemplo, durante cultura de células hospedeiras compreendendo DNA heterólogo inserido.
Métodos analíticos para testar benefícios
[000121] Rendimento. Rendimento é medido como a quantidade de carboidratos derivada de um litro de cultura de produção bacteriana cultivada em um biorreator sob condições controladas e otimizadas. Após a purificação de bioconjugado, os rendimentos de carboidratos podem ser diretamente medidos por ou teste de antrona ou ELISA usando antissoro específico para carboidratos. As medições indiretas são possíveis usando a quantidade de proteína (medida por testes BCA, Lowry, ou bardford bem conhecidos) e o comprimento e estrutura de glicano para calcular uma quantidade teórica de carboidratos por grama de proteína. Além disso, rendimento também pode ser medido secando a preparação de glicoproteína a partir de um tampão volátil e usando uma balança para medir o peso.
[000122] Homogeneidade. Homogeneidade significa a variabilidade de comprimento de glicano e possivelmente o número de sítios de glicosilação. Métodos listados acima podem ser usados para esta finalidade. SE-HPLC permite a medição do raio hidrodinâmico. Números maiores de sítios de glicosilação no carreador levam a uma maior variação no raio hidrodinâmico comparado a um carreador com menos sítios de glicosilação. No entanto, quando cadeias únicas de glicano são analisadas, elas podem ser mais homogêneas devido ao comprimento mais controlado. Comprimento de glicano é medido por hidrazinólise, SDS PAGE, e CGE. Além disso, homogeneidade também pode significar que alguns padrões de uso do sítio de glicosilação mudam para uma faixa mais ampla/mais estreita. Estes fatores podem ser medidos por Glicopeptídeo LC-MS/MS.
[000123] Estabilidade e reprodutibilidade da cepa. Estabilidade da cepa durante bacteriana fermentação na ausência de pressão seletiva é medida por métodos diretos e indiretos que confirmam a presença ou ausência do DNA recombinante em produção de células de cultura. A influência do volume de cultura pode ser simulada por tempos de cultura alongados, significando tempos de geração aumentados. Quanto mais gerações em fermentação, mais provável que um elemento recombinante seja perdido. A perda de um elemento recombinante é considerada instabilidade. Os métodos indiretos se baseiam na associação de cassetes de seleção com DNA recombinante, por exemplo, os cassetes de resistência a antibiótico em um plasmídeo. As células de cultura de produção são colocadas em placas em meio seletivo, por exemplo, placas LB suplementadas com antibióticos ou outros produtos químicos relacionados com um sistema de seleção, e colônias resistentes são consideradas como positivas para o DNA recombinante associado com o produto químico de seleção respectivo. No caso de um sistema múltiplo de plasmídeos, as colônias resistentes para múltiplos antibióticos são contadas e a proporção de células contendo todas as três resistências é considerada como a população estável. Alternativamente, PCR quantitativo pode ser usado para medir uma quantidade de DNA recombinante dos três elementos recombinantes na presença, ausência de seleção, e em pontos de tempo diferentes de fermentação. Assim, a quantidade relativa e absoluta de DNA recombinante é medida e comparada. Reprodutibilidade do processo de produção é medida pela análise de consistência completa de bateladas pelos métodos descritos neste pedido.
5.5 Composições Composições compreendendo células hospedeiras
[000124] Em um aspecto, são aqui previstas composições compreendendo as células hospedeiras aqui descritas (ver Seção 5.1). Tais composições podem ser usadas em métodos para gerar os bioconjugados aqui descritos (ver Seção 5.3), por exemplo, as composições compreendendo células hospedeiras podem ser cultivadas sob condições apropriadas para a produção de proteínas. Subsequentemente, bioconjugados podem ser isolados das ditas composições compreendendo células hospedeiras usando métodos conhecidos na técnica.
[000125] As composições compreendendo as células hospedeiras aqui previstas podem compreender componentes adicionais apropriados para a manutenção e sobrevivência das células hospedeiras aqui descritas, e podem adicionalmente compreender componentes adicionais requeridos ou benéficos para a produção de proteínas pelas células hospedeiras, por exemplo, indutores para promotores indutíveis, como arabinose, IPTG.
Composições compreendendo bioconjugados
[000126] Em outro aspecto, são aqui previstas composições (por exemplo, composições farmacêuticas) compreendendo um ou mais dos bioconjugados aqui descritos (ver Seção 5.3). As composições aqui descritas são úteis no tratamento e prevenção de infecção de indivíduos (por exemplo, indivíduos humanos) por Pseudomonas. Ver, Seção 5.6.
[000127] Em algumas modalidades, além de compreenderem um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3), as composições (por exemplo, composições farmacêuticas) aqui descritas compreendem um carreador farmaceuticamente aceitável. Como aqui usado, o termo “farmaceuticamente aceitável” significa aprovados por uma agência regulatória do governo federal ou estadual ou relacionado na Farmacopeia US ou outra Farmacopeia geralmente reconhecida para uso em animais, e mais particularmente em humanos. O termo “carreador”, como usado aqui no contexto de um carreador farmaceuticamente aceitável, refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veículo com os quais a composição farmacêutica é administrada. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes apropriados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, gesso, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares. Exemplos de carreadores farmacêuticos apropriados são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” por E.W. Martin.
[000128] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligado a um antígeno de Pseudomonas. Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligado a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa.
[000129] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, em que dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipo O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 ou O20.
[000130] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, em que dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[000131] Em uma modalidade específica, é prevista aqui uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) compreendendo um bioconjugado compreendendo uma proteína carreadora ligada a um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa, em que dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa é um antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipo O11. Em uma modalidade específica, dito antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serotipo O11 é de Pseudomonas aeruginosa cepa PA103 (ver, por exemplo, No. de acesso no Genbank KF364633.1).
[000132] As composições compreendendo bioconjugados que são aqui previstos podem ser usadas para elicitar uma resposta imune em um hospedeiro ao qual a composição é administrada, isto é, as composições são imunogênicas. Assim, as composições aqui descritas podem ser usadas como vacinas contra infecção por Pseudomonas, ou podem ser usadas no tratamento de infecção por Pseudomonas.
[000133] As composições compreendendo os bioconjugados aqui descritos podem compreender quaisquer componentes adicionais apropriados para uso em administração farmacêutica. Em modalidades específicas, as composições aqui descritas são formulações monovalentes. Em outras modalidades, as composições aqui descritas são formulações multivalentes, por exemplo, formulações bivalentes, trivalentes e tetravalentes. Por exemplo, uma formulação multivalente compreende mais do que um bioconjugado aqui descrito.
[000134] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas adicionalmente compreendem um conservante, por exemplo, o derivado de mercúrio timerosal. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas aqui descritas compreendem 0,001% a 0,01% de timerosal. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas aqui descritas não compreendem um conservante.
[000135] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas (por exemplo, as composições imunogênicas) compreendem, ou são administradas em combinação com um adjuvante. O adjuvante para administração em combinação com uma composição aqui descrita pode ser administrado antes, concomitantemente com, ou após a administração de dita composição. Em algumas modalidades, o termo “adjuvante” refere-se um composto que, quando administrado em conjunto com ou como parte de uma composição aqui descrita aumenta, intensifica e/ou reforça a resposta imune para um bioconjugado, mas quando o composto é administrado sozinho, ele não gera uma resposta imune ao bioconjugado. Em algumas modalidades, o adjuvante gera uma resposta imune para o bioconjugado de polipeptídeo e não produz uma alergia ou outra reação adversa. Adjuvantes podem intensificar uma resposta imune por vários mecanismos incluindo, por exemplo, recrutamento de linfócitos, estimulação de células B e/ou T, e estimulação de macrófagos.
[000136] Os exemplos específicos de adjuvantes incluem, mas não são limitados a, sais de alumínio (alúmen) (como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, e sulfato de alumínio), 3 De-O-acilado monofosforil lipídeo A (MPL) (ver Patente do Reino Unido GB222021 1), MF59 (Novartis), AS03 (Glaxo SmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polissorbato 80 (Twecn 80; ICL Americas, Inc.), compostos de imidazopiridina (ver pedido internacional No. PCT/US2007/064857, publicado como publicação internacional No. WO2007/109812), compostos de imidazoquinoxalina (ver pedido internacional No. PCT/US2007/064858, publicado como Publicação International No. WO2007/109813) e saponinas, como QS21 (ver Kensil et al, in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995) Patente US 5.057.540). Em algumas modalidades, o adjuvante é adjuvante de Freund (completo ou incompleto). Outros adjuvantes são emulsões óleo em água (como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, como monofosforil lipídeo A (ver Stoute et al, N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Outro adjuvante é CpG (Bioworld Today, nov. 15, 1998).
[000137] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas são formuladas para serem apropriadas para a via administração pretendida para um indivíduo. Por exemplo, as composições aqui descritas podem ser formuladas para serem apropriadas para administração subcutânea, parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorretal, intraperitoneal e retal. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica pode ser formulada para administração intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutânea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica ou pulmonar.
[000138] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas adicionalmente compreendem um ou mais tampões, por exemplo, tampão fosfato e tampão sacarose fosfato glutamato. Em outras modalidades, as composições aqui descritas não compreendem tampões.
[000139] Em algumas modalidades, as composições aqui descritas adicionalmente compreendem um ou mais sais, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, glutamato de monossódio e sais de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, alúmen (alumínio sulfato de potássio), ou uma mistura de tais sais de alumínio). Em outras modalidades, as composições aqui descritas não compreendem sais.
[000140] As composições aqui descritas podem ser incluídas em um recipiente, pacote ou dispensador junto com instruções para administração.
[000141] As composições aqui descritas podem ser armazenadas antes de uso, por exemplo, as composições podem ser armazenadas congeladas (por exemplo, a cerca de -20°C ou a cerca de -70°C); armazenadas em condições refrigeradas (por exemplo, a cerca de 4°C); ou armazenadas em temperatura ambiente.
5.6 Usos profiláticos e terapêuticos
[000142] Em um aspecto, são aqui previstos métodos de tratar uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição do mesmo (ver Seção 5.5). Em outro aspecto, são aqui previstos métodos de prevenir uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição do mesmo (ver Seção 5.5).
[000143] Também são aqui previstos métodos de induzir uma resposta imune em um indivíduo contra Pseudomonas, compreendendo administrar ao indivíduo um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5). Em uma modalidade, dito indivíduo tem uma infecção por Pseudomonas no momento da administração. Em outra modalidade, dito indivíduo não apresenta uma infecção por Pseudomonas no momento de administração.
[000144] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um método para prevenir uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo, em que dito método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição descrita em Seção 5.5. Os métodos de prevenir uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo aqui previstos resultam na indução de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma composição descrita em Seção 5.5. Um versado na técnica irá entender que os métodos de induzir uma resposta imune em um indivíduo aqui descritos resultam em vacinação do indivíduo contra infecção por cepas de Pseudomonas cujos antígenos estão presente na(s) composição(ões).
[000145] Em uma modalidade específica, é previsto aqui um método para tratamento de uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo, em que dito método compreende administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de uma composição descrita em Seção 5.5.
[000146] Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por Pseudomonas causada por Pseudomonas aeruginosa. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por Pseudomonas por mais do que uma cepa ou serotipo de Pseudomonas aeruginosa.
[000147] Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por Pseudomonas aeruginosa serotipos O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 ou O20. Em outra modalidade específica, dito agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa é o agrupamento rfb de qualquer um dos serotipos descritos em Knirel et al., 2006, Journal of Endotoxin Research 12(6):324-336, cuja descrição é aqui incorporada por referência em sua totalidade. Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por Pseudomonas aeruginosa serotipo O6. Em uma modalidade específica, a resposta imune induzida por um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção causada por Pseudomonas aeruginosa serotipo O11. Em uma modalidade específica, dito Pseudomonas aeruginosa serotipo O11 é Pseudomonas aeruginosa cepa PA103 (ver, por exemplo, No. de acesso no Genbank KF364633.1).
[000148] Em algumas modalidades, a resposta imune induzida em um indivíduo após administração de um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para reduzir um ou mais sintomas resultando de uma infecção por Pseudomonas.
[000149] Em algumas modalidades, a resposta imune induzida em um indivíduo após administração de um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para reduzir a possibilidade de hospitalização de um indivíduo sofrendo de uma infecção por Pseudomonas. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida em um indivíduo após administração de um bioconjugado aqui descrito (ver Seção 5.3) ou uma composição aqui descrita (ver Seção 5.5) é eficaz para reduzir a duração de hospitalização de um indivíduo sofrendo de uma infecção por Pseudomonas.
5.7 Testes Teste para avaliar a capacidade de bioconjugados de induzir uma resposta imune
[000150] A capacidade dos bioconjugados/composições aqui descritos para gerar uma resposta imune em um indivíduo pode ser avaliada usando qualquer abordagem conhecida dos versados na técnica ou aqui descrita. Em algumas modalidades, a capacidade de um bioconjugado para gerar uma resposta imune em um indivíduo pode ser avaliada por imunização de um indivíduo (por exemplo, um camundongo) ou conjunto de indivíduos com um bioconjugado aqui descrito e imunização de um indivíduo adicional (por exemplo, um camundongo) ou conjunto de indivíduos com um controle (PBS). Os indivíduos ou conjunto de indivíduos podem ser subsequentemente desafiados com Pseudomonas e a capacidade de Pseudomonas de causar doença nos indivíduos ou conjunto de indivíduos pode ser determinada. Os versados na técnica irão reconhecer que se o indivíduo ou conjunto de indivíduos imunizado com o controle sofre de doença subsequente a desafiar com o Pseudomonas, mas o indivíduo ou conjunto de indivíduos imunizados com um bioconjugado(s) ou composição do mesmo aqui descrito sofre menos ou não sofre da doença, então o bioconjugado é capaz de gerar uma resposta imune em um indivíduo. A capacidade de um bioconjugado(s) ou composição do mesmo aqui descritos para induzir antissoro a reagir de modo cruzado com um antígeno de Pseudomonas pode ser testada por, por exemplo, um imunoteste, como ELISA.
Testes bactericidas in vitro
[000151] A capacidade dos bioconjugados aqui descritos para gerar uma resposta imune em um indivíduo pode ser avaliada usando um teste bactericida de soro (SBA) ou teste de extermínio opsonofagocitótico (OPK), que representa um método estabelecido e aceito que foi usado para obter aprovação de vacinas com base em glicoconjugados. Tais testes são bem conhecidos na técnica e, brevemente, compreendem as etapas de gerar e isolar anticorpos contra o alvo de interesse (por exemplo, um antígeno de Pseudomonas) por administração a um indivíduo (por exemplo, um camundongo) de um composto que elicita tais anticorpos. Subsequentemente, a capacidade bactericida dos anticorpos pode ser avaliada por, por exemplo, cultivo da bactéria em questão na presença de ditos anticorpos e complemento e - dependendo do teste - células neutrofílicas e testando a capacidade dos anticorpos de matar e/ou neutralizar as bactérias, por exemplo, usando abordagens microbiológicas padrões.
6. EXEMPLOS Exemplo 1: Cepas bacterianas com uma oligossacaril transferase inserida e um agrupamento rfb inserido são estáveis e produzem bioconjugados.
[000152] Este exemplo demonstra que os bioconjugados podem ser produzidos com sucesso por uma cepa hospedeira bacteriana que foi geneticamente modificada por inserção de (i) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase e (ii) um ácido nucleico que codifica um agrupamento rfb.
[000153] Células hospedeiras modificadas de E. coli foram geradas por inserção dos seguintes diretamente no genoma de célula hospedeira: (i) um ácido nucleico codificando a oligossacaril transferase de C. jejuni (PglB) e (ii) um ácido nucleico codificando o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa cepa PA 103. Este agrupamento rfb codifica os genes necessários para a síntese de antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serogrupo O11. As inserções foram realizadas usando o novo método de inserção descrito em PCT/EP2013/071328 (ver Seção 5.2, acima) ou o mini sistema pUT (Biomedal Lifescience). O método de inserção descrito em PCT/EP2013/071328 é sítio-específico e utiliza recombinação homóloga, enquanto que o sistema mini pUT é uma abordagem aleatória, mediada por transpóson, que resulta em uma sequência de ácido nucleico de interesse sendo aleatoriamente inserida no genoma de célula hospedeira. As células hospedeiras de E. coli ainda foram modificadas por introdução de um plasmídeo que expressa exotoxina A de Pseudomonas desintoxicada (EPA) como uma proteína carreadora nas células hospedeiras. Assim, as células hospedeiras de E. coli modificadas descritas neste exemplo expressam (i) a oligossacaril transferase de C. jejuni (PglB), devido à integração de um ácido nucleico codificando a oligossacaril transferase no genoma de célula hospedeira; (ii) genes de um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa que produz o antígeno O11, devido à integração de um ácido nucleico codificando o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa cepa PA103 no genoma de célula hospedeira; e (iii) a proteína carreadora EPA, devido à transformação da célula hospedeira com um plasmídeo compreendendo um ácido nucleico codificando a proteína carreadora.
[000154] Células hospedeiras de E. coli modificadas adicionais foram geradas para permitir a comparação de uma capacidade das células hospedeiras modificadas compreendendo duplas integrações (integração de uma oligossacaril transferase e integração de um agrupamento rfb) para produzir bioconjugados (EPA-011) com produção de bioconjugados por células hospedeiras tendo (i) somente uma única integração da oligossacaril transferase ou do agrupamento rfb e os restantes componentes (proteína carreadora e oligossacaril transferase ou agrupamento rfb) de plasmídeo expressado pela célula hospedeira; ou (ii) sem componentes integrados, com todos os componentes (proteína carreadora e oligossacaril transferase e agrupamento rfb) de plasmídeo expressados.
[000155] Três diferentes cepas antecedentes de E. coli foram usadas na análise: (i) “St4167” (W3110 ΔwaaL, Δrfb016::rfbP.a.O11), que compreende uma deleção do gene waaL de E. coli, a deleção do agrupamento rfb de E. coli O16, e uma inserção do agrupamento rfb de P. aeruginosa O11 (PCT/EP2013/071328); (ii) “St1128” (W3110 ΔwaaL), que compreende uma deleção do gene waaL de E. coli; e (iii) “St1935” (W3110 AwaaL, AwzzE- wecG, AwbbUK), que compreende deleção dos genes indicados. Para inserção do agrupamento rfb de P. aeruginosa O11 em St4167, agrupamento rfb O11 foi clonado no plasmídeo pDOC e o método de acordo com PCT/EP2013/071328 foi empregado. As cepas St4167 representam as cepas de integração dupla.
[000156] Os plasmídeos específicos utilizados para introduzir EPA em cepas de célula hospedeira são designados “p1077” e “p150”. O último é descrito em Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61, e os plasmídeos são iguais com a exceção do fato de que 11077 substitui o cassete Amp of p150 com um cassete Kan.
[000157] As seguintes variantes de St4167 foram geradas: (i) St4167 com pglB inserido no lugar de gene yahL da célula hospedeira (pelo método de PCT/EP2013/071328) e EPA expressado por plasmídeo 1077; (ii) St4167 com pglB inserido no lugar do gene ompT da célula hospedeira (usando o mini sistema pUT ) e EPA expressado por plasmídeo p150; (iii) St4167 com pglB expressado por plasmídeo p1769 (pglB em pDOC) e EPA expressado por plasmídeo p1077; (iv) St4167 com pglB expressado por plasmídeo p939 (pEXT21 com base em plasmídeo de expressão para PglB com uma etiqueta HA, otimizada no códon) e EPA expressado por plasmídeo p1077; e (v) St4167 com pglB expressado por plasmídeo p1762 (pglB em pDOC) e EPA expressado por plasmídeo p1077.
[000158] As seguintes variantes St1128 foram geradas: (i) St1128 com pglB expressado por plasmídeo p939, agrupamento rfb de P. aeruginosa O11 expressado por plasmídeo p164 (plasmídeo pLAFR engenheirado para conter o agrupamento rfb de P. aeruginosa O11), e EPA expressado por plasmídeo p1077; e (ii) St1128 com pglB inserido no lugar do gene yahL da célula hospedeira (pelo método de PCT/EP2013/071328), P. aeruginosa O11 agrupamento rfb expressado por plasmídeo pl64, e EPA expressado por plasmídeo p1077.
[000159] As seguintes variantes de St1935 foram geradas: (i) St1935 com pglB inserido no lugar do gene ompT da célula hospedeira (pelo método de PCT/EP2013/071328), agrupamento rfb de P. aeruginosa O11 expressado por plasmídeo p164, e EPA expressado por plasmídeo p1077; (ii) Stl935 com pglB inserido no lugar do gene yahL da célula hospedeira (pelo método de PCT/EP2013/071328), agrupamento rfb de P. aeruginosa O11 expressado por plasmídeo p164, e EPA expressado por plasmídeo p1077; e Stl935 com pglB expressado por plasmídeo p939, agrupamento rfb de P. aeruginosa O11 expressado por plasmídeo p164, e EPA expressado por plasmídeo p1077.
[000160] Como mostrado em Figura I, todas as cepas expressando uma oligossacaril transferase, proteína carreadora, e um agrupamento rfb produziram bioconjugados. Ver, os blots mostrados entre marcadores de 100 e 130 kDa, que correspondem a EPA-O11. Importante, esta observação inclui cepas compreendendo integração dupla de uma oligossacaril transferase e um agrupamento rfb. Ver, em particular, os resultados mostrados para St4167. Assim, este Exemplo demonstra não somente que as células hospedeiras estáveis podem ser geradas após inserção dupla de genes/ agrupamentos de gene no genoma de célula hospedeira, mas que a função dos genes é mantida. Especificamente, função da oligossacaril transferase inserida e agrupamento rfb inserido foi conservada, resultando na produção de bioconjugados.
Exemplo 2: Identificação de um gene formiltransferase que contribui para a síntese de um oligo/polissacarídeo de um antígeno O de P. aeruginosa O6 nativo
[000161] Este exemplo descreve a identificação da Pseudomonas aeruginosa O6 formiltransferase.
[000162] Dados de proteomas para Pseudomonas aeruginosa O6 cepa “LESB58”, cujo genoma é conhecido, foram pesquisados para domínios contendo homologia para os domínios de consulta de protótipo dos domínios “Formyltransferase” e “FMT C-terminal domain-like” usando o algoritmo fornecido em www.supfam.org/SUPEPvFAMILY/. A busca identificou 9 sequências de proteína com possíveis domínios relacionados.
[000163] Para avaliar se qualquer um dos 9 candidatos identificados eram específicos para O6 (e assim para uma unidade de repetição de antígeno O formilado) sua ausência no proteoma de outro serotipo de Pseudomonas aeruginosa (O5, cepa PAO1) foi analisada usando uma busca BLAST (NCBI website). A estrutura de antígeno O de Pseudomonas aeruginosa O5 não está relacionada com a de Pseudomonas aeruginosa O6. Especificamente, nenhum grupo formila está presente na estrutura O5. 8 dentre 9 candidatos tinha homólogos em Pseudomonas aeruginosa serotipo O5 o que indicou que estas proteínas não eram específicas para Pseudomonas aeruginosa O6 cepa LESB58. O restante candidato (locus_tag=PLES_ 12061, GenBank: CAW25933.1; SEQ ID NO:2) não tem homólogo óbvio em Pseudomonas aeruginosa serotipo O5 e foi assim classificado como específico para LESB58/Pseudomonas aeruginosa serotipo O6.
[000164] Para confirmar a especificidade de O6, a presença da Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase descoberta (SEQ ID NO:2) em outras cepas de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 foi verificada. As proteínas equivalentes à Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase (SEQ ID NO:2) foram identificadas em quatro outras cepas de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6, incluindo locus tag: PAK_01412 em cepa “PAK” e locus tag: PAM18_1171 em cepa M18.
[000165] Formiltransferases com baixa identidade de sequência de aminoácidos para Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase (SEQ ID NO:2) também foram identificadas em Methylobacterium sp. (33% de identidade, ACCESSION WP_020093860), Thiothrix nivea (30% de identidade, ACCESSION WP_002707142), Anaerophaga thermohalophila (28% de identidade, ACCESSION WP_010422313), Halorubrum californiense (27% de identidade, ACCESSION WP 008445073), Azorhizobium caulinodans (25% de identidade, ACCESSION WP O12170036) e Burkholderia glathei (24% de identidade, ACCESSION KDR39707). Consideradas em conjunto, estas análises de homologia indicaram que os genes relacionados codificam uma atividade específica de O6 relacionada com a formilação.
[000166] Para testar a atividade funcional da Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase (SEQ ID NO:2) em estrutura de unidade de repetição O6 não formilada, o gene codificando SEQ ID NO:2 foi clonado. O códon START TTG raro do gene foi substituído por ATG. Uma representação esquemática da clonagem da Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase (SEQ ID NO:2) no agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa O6 e a organização relativa dos genes é mostrada na Figura 5.
[000167] Uma vez identificada, a função da Pseudomonas aeruginosa O6 formiltransferase foi avaliada. Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase (SEQ ID NO:2) foi testada para funcionalidade por coexpressão com os genes de agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa O6 em cepas de E. coli faltando um agrupamento funcional ECA (wec). Para mostrar formilação, unidades de repetição de antígeno único ligadas a lipídeo em um núcleo foram analisadas (em uma cepa positiva para waaL). A unidade de repetição de antígeno O O6 formilado foi identificada por imunodetecção usando um anticorpo específico para O6 (Figura 3A) indicando que o grupo formila é um epítopo relevante de estrutura de antígeno O de Pseudomonas aeruginosa O6.
[000168] Para mostrar formilação em nível molecular, unidades de repetição de O6 foram analisadas por MALDI MSMS. As unidades de repetição purificadas e rotuladas 2AB mostraram que a coexpressão de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase (SEQ ID NO:2) com os genes de agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa O6 deram origem a um sinal de fluorescência do pico principal que foi deslocado por 2-3 minutos (de 58 a 61’, Figura 3B).
[000169] A análise MALDI-MSMS do material contido nos picos a 58’ resultou em uma série de fragmentação de íons Y que está de acordo com a unidade de repetição O6 não formilada, N-acetilada, rotulada 2-AB. O íon precursor protonado m/z=905, fragmentado em uma série de íons proeminentes de 905->759->543->326, correspondendo a perdas de 146 unidades de (deoxi hexose), 216 (ácido N-acetil hexosaminurônico amidado), 217 (ácido N-acetil hexosaminurônico). Material coletado a 61’ obtido a partir de células expressando o gene de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase continha um íon precursor proeminente de 891, que fragmentou a 891->745->529->326, correspondendo a perdas de 146 (como acima), 216 (como acima), e 203 (ácido N-formilhexosaminurônico amidado). Estes dados provaram que a formilação é dependente da expressão de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase que, consequentemente, o gene está codificando a formiltransferase. Assim, o gene que codifica a Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 formiltransferase foi chamado fmtO6. O fato de que o grupo acetila do ácido N-acetil hexosaminurônico amidado é substituído por um grupo formila sugere um mecanismo de duas etapas em que o grupo acetila é primeiro removido antes do grupo formila poder ser adicionado. Este modelo implica que um grupo amina livre pode estar presente em C2 como um intermediário antes do domínio da formiltransferase fixar um grupo formila ao monossacarídeo. Assim, antígeno O desacetilado e não formilado pode ser uma forma de polissacarídeo substancial e imunologicamente relevante, e sub- estequiometricamente presente de P. aeruginosa serotipo O6.
Exemplo 3: Identificação e teste do gene wzy para polimerização do antígeno O de P. aeruginosa O6.
[000170] Este exemplo descreve a identificação da polimerase wzy de Pseudomonas aeruginosa O6.
[000171] Os polissacarídeos de antígeno O constituem a superfície de célula externa de muitas bactérias Gram negativas. O maquinário enzimático responsável pela biossíntese de antígeno O é com frequência codificado em um agrupamento de gene único chamado o agrupamento rfb. As cepas de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 expressam um antígeno O polimérico (Figura 2). No entanto, no respectivo agrupamento de antígenos O, um gene codificando um antígeno O polimerase (wzy) está ausente. Isto significa que a fim de expressar de modo recombinante o antígeno O de P. aeruginosa O6 em E. coli, identificação de um gene wzy foi necessária. As antígeno O polimerases (wzy) são proteínas de membrana interna integrantes que catalisam a polimerização de unidades de repetição de antígeno O no espaço periplásmico antes da ligação “en bloc” para o Oligossacarídeo de núcleo de lipídeo A para formar LPS. Wzy polimerases são altamente específicas para seu oligômero de unidade de repetição e homologias entre os genes wzy são pobres.
[000172] O antígeno O de Pseudomonas aeruginosa O19 compartilha similaridades estruturais para Pseudomonas aeruginosa O6. Foi especulado que as proteínas wzy que reconhecem ambas as estruturas também podem compartilhar propriedades similares, por exemplo, estrutura, sequência, número de domínios de transmembrana. A sequência da proteína O19 Wzy de Pseudomonas aeruginosa O19 (ACCESSION AAM27560) é conhecida e foi usada como uma pergunta primária em uma análise Blast usando o proteoma de cepa PAK de Pseudomonas aeruginosa O6 como o assunto para a busca de homologia.
[000173] Para avaliar se os candidatos identificados eram específicos para Pseudomonas aeruginosa O6, sua presença no proteoma de outro Pseudomonas aeruginosa serotipo (05, cepa PAOl) foi analisada. A estrutura de antígeno O O5 não está relacionada com a de O6 e O19. Os 100 melhores resultados foram analisados individualmente para a presença no proteoma de Pseudomonas aeruginosa O5 usando análise blast. 97 dentre 100 candidatos do proteoma PAK tinham homólogos no proteoma de Pseudomonas aeruginosa serotipo O5 o que indicou que estas proteínas estavam geralmente presentes em cepas de Pseudomonas aeruginosa e possivelmente não relacionados com a biossíntese de antígeno O O6. Três dentre os 100 candidatos não tinham homólogo óbvio no proteoma de Pseudomonas aeruginosa O5, e foram assim determinados como sendo específicos para Pseudomonas aeruginosa O6.
[000174] Para testar se uma das três proteínas candidatas identificadas era uma Pseudomonas aeruginosa O6 wzy, as três proteínas foram usadas como pergunta em uma análise Blast. Um dos três candidatos, PAK_01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3), compartilhou identidade de sequência de aminoácido com outras conhecidas polimerases de unidade de repetição de oligossacarídeo, por exemplo, 25% de identidade para polimerases de unidade de repetição de oligossacarídeo de Streptococcus sanguinis (ACCESSION WP 004192559) e 22% de identidade para polimerases de unidade de repetição de oligossacarídeo de Escherichia coli O139 (ACCESSION AAZ85718). Assim, PAK_01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3) foi identificado como wzy de Pseudomonas aeruginosa O6.
[000175] Para ainda confirmar SEQ ID NO: 3 como a proteína codificada por wzy de Pseudomonas aeruginosa O6, a localização subcelular de proteína foi prevista bioinformaticamente usando PSORTb (www.psort.org/psortb/). A proteína foi prevista como estando localizada na membrana citoplásmica com 11 domínios de transmembrana, um aspecto que é comum entre as antígeno O polimerases.
[000176] Proteínas equivalentes a PAK_01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3) foram encontradas em outras cepas de P. aeruginosa positivas O6, incluindo a cepa LESB58 que tinha uma proteína wzy de Pseudomonas aeruginosa O6 com apenas uma diferença de 1 aa comparada com a cepa PAK e a cepa testada internamente).
[000177] A seguir, teste funcional de wzy de Pseudomonas aeruginosa O6 foi realizado. O agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa O6, o gene fmtO6 (isto é, o gene codificando SEQ ID NO:2, discutido em Exemplo 2, acima), e o gene codificando Pseudomonas aeruginosa O6 wzy (isto é, o gene codificando SEQ ID NO:3) foram coexpressados em células W3110 Δwec de E. coli, e o lipopolissacarídeo formado foi analisado por immunoblotting (Figura 4). Antissoro anti-O6 detectou um sinal tipo progressão somente na amostra se originando das células que continham todos os três transgenes, indicando que PAK_01823 (O6wzy PAK_01823; SEQ ID NO:3) é de fato a polimerase de P. aeruginosa O6. Assim, o gene codificando PAK 01823 foi chamado O6wzy.
[000178] Para gerar um agrupamento de gene único contendo todos os elementos genéticos requeridos para E. coli expressar recombinantemente o antígeno O de P. aeruginosa O6, os genes fmtO6 e O6wzy (isto é, os genes codificando SEQ ID NOs: 2 e 3, respectivamente) foram clonados a jusante do agrupamento rfb de P. aeruginosa O6. Uma representação esquemática da clonagem do uso de códon otimizou O-antígeno polimerase O6wzy de Pseudomonas aeruginosa O6 no agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa O6 clonado junto com a O6 formiltransferase e a organização relativa dos genes é mostrada em Figura 5. Foi ainda determinado que os genes fmtO6 e O6wzy (isto é, os genes codificando SEQ ID NOs: 2 e 3, respectivamente) podiam ser inseridos no agrupamento rfb de P. aeruginosa O6 em múltiplas posições. Especificamente, o gene fmtO6 pode ser inserido em uma orientação em sentido horário com relação aos agrupamentos rfb a jusante do agrupamento rfb ou a montante do agrupamento rfb sob o controle de um promotor separado. Além disso, o gene fmtO6 pode ser inserido em uma orientação em sentido anti-horário com relação aos agrupamentos rfb a montante ou a jusante do agrupamento rfb. O gene O6wzy pode ser inserido em uma orientação em sentido horário com relação aos agrupamentos rfb a montante ou a jusante do agrupamento rfb ou a montante do agrupamento rfb sob o controle de um promotor separado. Todos os construtos descritos acima eram ativos em termos de biossíntese de antígeno O de P. aeruginosa O6 (dados não mostrados).
Exemplo 4: Cepas bacterianas com uma oligossacaril transferase inserida e rfb inserido e um agrupamento rfbO6 são estáveis e produzem bioconjugados.
[000179] Exemplo 1 demonstra que os bioconjugados podem ser produzidos com sucesso pela cepa hospedeira bacteriana que foi geneticamente modificada por inserção de (i) um ácido nucleico que codifica uma oligossacaril transferase e (ii) um ácido nucleico que codifica um agrupamento rfb. Neste Exemplo, experimentos similares aos descritos em Exemplo 1 foram realizados, usando a proteína PcrV de Pseudomonas como uma proteína carreadora.
[000180] Naturalmente, a sequência de aminoácidos primária de PcrV (ver, por exemplo, UniProt O30527) não compreende uma sequência de consenso de N-glicosilação (“glicosítio”). Usando os métodos descritos em WO 2006/1 19987, variantes recombinantes de PcrV compreendendo um, dois, três, quatro ou cinco glicosítios foram engenheiradas. Em particular, por manipulação da sequência de ácidos nucleicos que codifica PcrV, as variantes PcrV foram criadas que expressaram uma, duas, três, quatro ou cinco das sequências de consenso de N-glicosilação Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), em que X e Z são independentemente selecionados de qualquer um dos aminoácidos naturais exceto Pro.
[000181] As células hospedeiras de E. coli modificadas foram geradas por inserção do seguinte diretamente no genoma da célula hospedeira: (i) um ácido nucleico codificando a oligossacaril transferase de C. jejuni (PglB) e (ii) um ácido nucleico codificando o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 cepa PAK. Este agrupamento rfb codifica os genes necessários para a síntese de antígeno do antígeno O de Pseudomonas aeruginosa serogrupo O6. As inserções foram realizadas usando o novo método de inserção descrito em PCT/EP2013/071328 (ver Seção 5.2, acima) ou o mini sistema pUT (Biomedical Lifescience). As células hospedeiras de E. coli ainda foram modificadas por introdução de um plasmídeo que expressa PcrV compreendendo um a cinco glicosítios, como descrito acima. As células hospedeiras de E. coli modificadas descritas neste exemplo expressam (i) a oligossacaril transferase de C. jejuni (PglB), devido à integração de um ácido nucleico codificando a oligossacaril transferase no genoma de célula hospedeira; (ii) genes de um agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa que produz o antígeno O6, devido à integração de um ácido nucleico codificando o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa cepa PAK no genoma de célula hospedeira; e (iii) uma proteína carreadora PcrV modificada, devido à transformação da célula hospedeira com um plasmídeo compreendendo um ácido nucleico modificado codificando a proteína carreadora (onde o ácido nucleico foi modificado de modo que ele codifica um a cinco glicosítios, como descrito acima).
[000182] As células hospedeiras modificadas de E. coli adicionais foram geradas para permitir uma comparação da capacidade das células hospedeiras modificadas compreendendo integrações duplas (integração de uma oligossacaril transferase e integração de um agrupamento rfb) para produzir bioconjugados (PcrV-O6) com produção de bioconjugados por células hospedeiras tendo (i) somente uma única integração da oligossacaril transferase ou do agrupamento rfb e dos restantes componentes do plasmídeo (proteína carreadora e oligossacaril transferase ou agrupamento rfb) expressados pela célula hospedeira; ou (ii) sem componentes integrados, com todos os componentes de plasmídeo expressados (proteína carreadora e oligossacaril transferase e agrupamento rfb).
[000183] Três diferentes cepas de E. coli foram usadas e comparadas na análise: (i) “St7343”, que compreende tanto pglB e como o agrupamento O6 rfb completado, inserido no genoma de célula hospedeira (isto é, é uma cepa dupla integrada), e um plasmídeo codificando uma proteína carreadora PcrV (com um, dois, três, quatro ou cinco glicosítios); (ii) “St7209”, que compreende pglB expressado no plasmídeo o agrupamento rfb O6 inserido no genoma de célula hospedeira, e um plasmídeo codificando uma proteína carreadora PcrV (com um, dois, três, quatro ou cinco glicosítios); e (iii) “St2182”, que compreende pglB expressado no plasmídeo, agrupamento rfb O6 expressado no plasmídeo, e um plasmídeo codificando uma proteína carreadora PcrV (com um, dois, três, quatro ou cinco glicosítios). Figura 6 mostra as características de cada cepa (6A: St7343; 6B: St7209; 6C: St2182).
[000184] Como mostrado em Figura 6, todas as cepas expressando uma oligossacaril transferase, proteína carreadora, e um agrupamento rfb produziram bioconjugados. Ver, os blots mostrados entre marcadores de 4070 kDa (em torno de marcador de 55 kDa), que correspondem a PcrV-O6. Importante, como mostrado em Exemplo 1, esta observação inclui cepas compreendendo integração dupla de uma oligossacaril transferase e um agrupamento rfb. Ver, em particular, os resultados mostrados em Figura 6A. Assim, como Exemplo 1, este Exemplo demonstra que não somente células hospedeiras estáveis podem ser geradas após a inserção dupla de genes/ agrupamentos de genes no genoma de célula hospedeira, mas que a função dos genes é mantida. Especificamente, a função da oligossacaril transferase inserida e agrupamento rfb inserido foi preservada, resultando na produção de bioconjugados.
Exemplo 5: Produção e purificação de bioconjugados EPA-O6
[000185] Este exemplo descreve a produção de bioconjugados compreendendo o antígeno O6 de Pseudomonas aeruginosa.
[000186] W3110 ΔwaaL Δwec Arfb de E. coli foi transformado com plasmídeos compreendendo o agrupamento rfb de Pseudomonas aeruginosa O6, a oligossacaril transferase pglB de C. jejuni, o gene codificando a proteína carreadora EPA desintoxicada, e os genes QuiNAc de biossíntese/transferase wbpVLM (de uma cepa de Pseudomonas aeruginosa O6). Resultados de análise de retenção de plasmídeo são mostrados em Figura 8. Meio (caldo LB) suplementado com tetraciclina, espectinomicina, canamicina e ampicilina foi inoculado com células hospedeiras contendo todos os quatro plasmídeos. A pré-cultura foi cultivada durante a noite a 37°C. No próximo meio, meio (TB) suplementado com MgCl2, tetraciclina, espectinomicina, canamicina e ampicilina foi inoculado por diluição da pré- cultura em OD600 0,1. Células foram cultivadas em 37°C até aproximadamente OD600 0,8-1,0 ser alcançado, então a expressão de pglb, epa e wbpVLM foi induzida pela adição de ImM IPTG e 0,1% de arabinose. Células foram coletadas por centrifugação após indução noturna.
[000187] Bioconjugados EPA-O6 foram purificados de extratos periplásmicos de células hospedeiras modificadas usando cromatografia de afinidade de metal-quelato (IMAC), cromatografia de troca aniônica (Source Q) e cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). As frações de eluição contendo glicoconjugados foram reunidas e subsequentemente submetidas à próxima etapa de cromatografia. Os eluatos de SEC finais foram caracterizados por SDS-PAGE seguido por colocação com azul Coomassie ou Western blot usando os anticorpos indicados em Figura 7.
[000188] O bioconjugado EPA-O6 foi caracterizado usando um arranjo de métodos analíticos. O nível de endotoxina foi medido usando o teste LAL (13EU/ml). Pureza foi determinada por SDS-PAGE e eletroforese de gel capilar (CGE, 86% pureza). A quantidade de proteína foi medida usando o teste BCA (1,75mg/ml). A quantidade de polissacarídeo foi medida usando o teste Anthrone (Dubois et al., 1956; 311,6ug/ml). O tamanho médio do O6- Polímero foi determinado usando um “grau de glicosilação” de alta resolução (DOG) SDS-PAGE (média de 7,9 unidades de repetição por polímero). Determinação de isoformas elétricas do bioconjugado foi feita por focalização isoelétrica (IEF). Finalmente, a identidade do bioconjugado foi confirmada por Immunoblotting usando anticorpos dirigidos contra a proteína (EPA) ou o polissacarídeo (O6).
Exemplo 6: Estudos de imunização
[000189] Este Exemplo demonstra que o bioconjugado O6-EPA DE P. aeruginosa é imunogênico.
[000190] Camundongos fêmeas, 6 semanas de idade BALB/c OlaHsd (em grupos de 25) foram imunizados intramuscularmente em dias 0, 14 e 28 com 0,2 μg ou 2 μg de conjugado O6-EPA (ver Exemplo 5) em uma formulação sem adjuvante ou com adjuvante (com um adjuvante em emulsão óleo-em-água). Um grupo de controle de 10 camundongos foi vacinado com adjuvante (O/W) apenas. Os títulos anti-O6 ELISA e opsônicos foram determinados em soro individual coletado no dia 42 (14 pós III) e em soro pós -II e pós-III reunidos. Resultados são mostrados na Figura 9 e descritos em detalhes abaixo.
[000191] Figura 9A mostra a resposta ELISA anti-O6. O O6 LPS-O6 purificado (PaO6a,6c) foi revestido a 8 μg/ml em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em placas de microtitulação de alta ligação (Nunc Maxisorp), durante a noite a 4° C. As placas foram bloqueadas com PBS- BSA 1% durante 30 min a RT com agitação. Os antissoros de camundongos foram pré-diluídos 1/10 e então, ainda foram feitas outras duas diluições em microplacas e incubadas em temperatura ambiente durante 30 minutos com agitação. Após lavagem, anticorpo murino ligado foi detectado usando IgG anticamundongo de cabra AffiniPure conjugado a peroxidase de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (H+L) (ref: 115-035-003) diluído 1/5000 em PBS- twecn 0,05%-BSA 0,2%. Os anticorpos de detecção foram incubados 30 minutos em temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4 mg OPD + 5 μl H2O2 per 10 ml pH 4,5 0,1M tampão citrato durante 15 minutos no escuro em temperatura ambiente. A reação foi parada com 50 μl HCl, e a densidade óptica (OD) foi lida a 490 nm relativo a 650 nm.
[000192] O nível de anticorpos anti-O6 presentes nos soros foi expressado em títulos de ponto médio. Um GMT de soros individuais foi calculado para as 25 amostras em cada grupo de tratamento (10 para o grupo de controle).
[000193] Uma resposta imune foi observada em camundongos após a injeção do bioconjugado formulado com o adjuvante. Não foi observada diferente entre doses. Observações similares foram feitas com relação à porcentagem de seroconversão. Não foram observadas respostas ou muito fracas com a formulação sem adjuvante.
[000194] Figura 9B mostra o título opsônico em células HL60 de camundongos imunizados com bioconjugado O6-EPA formulado com adjuvante ou não.
[000195] O teste de opsonofagocitose (OPA) foi realizado em microplacas de fundo redondo com 15 μl de células fagocíticas HL-60 (ajustadas a 5 10eb células /ml), 15 μl de bactérias de P. aeruginosa (cultivadas em placa de ágar TSA), 15 μl das diluições de soro de teste, e 15 μl de complemento de suíno jovem. Os soros reunidos de teste inativados foram primeiro diluídos (1/16 ou 1/50 diluição final) em HBSS-BSA 1% e adicionados a uma cepa O6 de P. aeruginosa (cepa ID: HNCMB 170009, obtida de Hungarian National Collection of Medical Bacteria) diluída a fim de contar 200-250 CFU/cavidade no final do teste.
[000196] As células HL-60 (ajustadas a 5.10e6/ml) e o complemento de suíno jovem (12,5% final) foram então adicionados em cada cavidade. Um controle com complemento inativado foi incluído para cada amostra de teste.
[000197] A mistura de reação foi incubada a 37°C durante 90 minutos com agitação. Após uma diluição de 1/200, 50 μl do volume foram então transferidos em uma microplaca de fundo plano. 50 μl de ágar MH seguido por ágar PBS-0,9% foram adicionados. Contagens de colônias automatizadas foram realizadas após a incubação noturna a 34°C.
[000198] A atividade opsonofagocítica é expressada como a recíproca da diluição de soro dando pelo menos 50% de morte.
[000199] Os dados demonstraram a funcionalidade dos anticorpos induzida após injeção com o grupo com adjuvante.
[000200] Em conclusão, este exemplo demonstra que o bioconjugado O6-EPA de P. aeruginosa é tanto imunogênico como funcional (isto é, induz anticorpos que matam O6 de P. aeruginosa in vivo).
[000201] A presente descrição não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modificações do assunto aqui previsto, além dos descritos, se tornarão evidentes para os versados na técnica a partir da descrição acima e das figuras em anexo. Tais modificações se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações em anexo.
[000202] Várias publicações, patentes e pedidos de patentes são aqui citados, cujas descrições são incorporadas por referência em suas totalidades.

Claims (6)

1. Bioconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende um antígeno de Pseudomonas aeruginosa serotipo O6 conjugado a uma proteína carreadora por meio do resíduo N de pelo menos uma sequência de consenso de N-glicosilação D/E - X - N - X- S/T, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, em que o antígeno O6 é formilado.
2. Bioconjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o antígeno O6 compreende um grupo formila afixado a pelo menos 1 resíduo de GalNFmA.
3. Bioconjugado de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ou 100% das unidades de repetição de antígeno O são formiladas.
4. Bioconjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento ou na prevenção de doença causada por uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo humano.
5. Bioconjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas por Pseudomonas em um ser humano.
6. Uso de um bioconjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doença causada por uma infecção por Pseudomonas em um indivíduo humano.
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