CN115698273A - 包含糖工程化细菌的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于疫苗的革兰氏阴性细菌宿主细胞，其包含异源功能性胸膜肺炎放线杆菌(APR)rfb基因簇，所述基因簇产生与细菌宿主细胞的脂质A核心结合并位于细菌宿主外表面上的APRO‑抗原，其中细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇不具有功能性。本发明还涉及包含所述宿主细胞的组合物，特别是疫苗，以及在预防和/或治疗胸膜肺炎放线杆菌(APR)感染中的相应用途。

Description

包含糖工程化细菌的疫苗
技术领域
本发明涉及用于疫苗的革兰氏阴性细菌宿主细胞，其包含异源功能性胸膜肺炎放线杆菌(APP)rfb基因簇，所述基因簇产生与细菌宿主细胞的脂质A核心结合并位于细菌宿主外表面上的APP O-抗原，其中细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇并不具有功能性。本发明还涉及包含所述宿主细胞的组合物，特别是疫苗，以及在预防和/或治疗胸膜肺炎放线杆菌(APP)感染中的相应用途。
背景技术
胸膜肺炎放线杆菌(APP)是引发猪胸膜肺炎的主要原因，猪胸膜肺炎是一种会对养猪业造成重大经济损失的传染性高的猪呼吸道疾病。这种疾病通过气溶胶或与被感染动物或无症状携带者密切接触发生传播。迄今为止，已根据表面荚膜多糖对不同地域分布的18种APP血清型进行了分类(Bosséet al..2018,Vet Microbiol.,Vol.220,83-89)。尽管存在毒力差异，但所有血清型都能够引发疾病。由于至少存在18种血清型，因此开发具有广泛保护性的疫苗非常具有挑战性。过去几年，该疾病的经济重要性激起了人们对APP疫苗接种领域的深入研究。然而，随着抗生素被用于控制这种疾病，抗生素耐药性在世界范围内达到了惊人的水平，因此需要寻找替代解决方案。
目前可提供的APP疫苗主要由灭活的全细胞菌苗(化学灭活的细菌细胞)或基于外膜蛋白的亚单位疫苗组成。一些疫苗基于Apx毒素(ApxI-IV类毒素)或补充该毒素，该毒素是一组在APP发病机制中起核心作用的成孔溶细胞素。迄今为止，所有商业化疫苗诱导的保护作用都未能使人满意。已经证明，基于菌苗的疫苗和亚单位疫苗对异源菌株提供的保护有限。基于灭活Apx毒素的疫苗可有效降低与感染相关的发病率，但它们无法阻止肺部定植，并且它们的使用对无症状携带者诱导感染构成潜在威胁(Andresen et al..1997,ActaVet Scand,Vol.38,283-293,Antenucci et al..2017,Vet Res.,Vol.48:74,Antenucciet al..2018,Vet Res.,49:4,Haesebrouck et al.2004,Vet Microbiol.,Vol.100,255-268,Loera-Muro and Angulo 2018,Vet Microbiol.Vol.217,66-75,Ramjeet etal..2008,Anim Health Res Rev,Vol.9(1),25-45)。
除了用于细菌疫苗开发的表面蛋白之外，潜在的抗原结构是存在于病原菌表面上的聚糖。这些聚糖是被感染宿主免疫系统的第一个接触点之一。革兰氏阴性菌的两种重要的表面聚糖结构是胞外荚膜多糖(CPS，革兰氏阳性菌和阴性菌中)和脂多糖(LPS，革兰氏阴性菌中)。人类细菌疾病的基于聚糖的疫苗开发主要集中在CPS结构上。通过分离CPS结构，并将这些聚糖与免疫刺激蛋白载体化学结合，可以应对几种细菌疾病。赛诺菲巴斯德公司的与破伤风类毒素结合的乙型流感嗜血杆菌的CPS(产品ActHIB)、葛兰素史克疫苗公司的与白喉类毒素结合的4种脑膜炎奈瑟菌血清型的CPS(Menveo)，辉瑞公司的与白喉类毒素结合的13种肺炎链球菌血清型的CPS(Prevnar 13)代表了成功开发这种基于CPS的疫苗的三个例子。
然而，对于兽用疫苗开发，表面聚糖的分离和随后与载体结构的化学结合导致生产成本不经济。
发明内容
本发明的目的是提供一种对许多、大多数、优选基本上所有APP细菌血清型都提供保护的安全有效的疫苗，显著减少食品生产中的抗生素治疗，并减少猪育肥期的临床爆发和损失。
所述目的通过提供用于疫苗使用的革兰氏阴性细菌宿主细胞实现，所述宿主细胞包含：
(a)异源功能性胸膜肺炎放线杆菌(APP)rfb基因簇，其中所述异源功能性APP rfb基因簇产生与细菌宿主细胞的脂质A-核心结合并位于细菌宿主外表面上的APP O-抗原，其中所述细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇并不具有功能性；
(b)任选地用于调节异源APP rfb基因簇转录的异源启动子强于内源rfb基因簇的内源启动子；
(c)任选地用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶至少一种另外的基因；
(d)任选地至少一种Apx毒素的中和表位，任选地至少一种Apx毒素I、II和III的中和表位，任选地位于细菌宿主细胞外表面和/或从细胞分泌；
其中任选地(a)、(c)和(d)中的至少一种经密码子优化用于细菌宿主细胞。
我们令人惊讶地发现并临床证明，具有非功能性内源性rfb基因簇，即不产生内源性O-抗原，但包含异源功能性胸膜肺炎放线杆菌(APP)rfb基因簇并产生与细菌宿主细胞的脂质A-核心结合并位于细菌宿主外表面的APP O-抗原的革兰氏阴性细菌宿主细胞将在猪体内引发出色的免疫反应，从而防止APP感染。
此处所述形容词术语“异源”表示所谓的物质，例如细胞成分，例如基因、蛋白质、聚糖、糖蛋白、代谢物等，在所述细胞中本质上并非天然存在的，即其是人工引入的，并且来自异源的，即遗传上不同的有机体。
此处所述形容词术语“内源”表示所谓的物质，例如细胞成分，例如基因、蛋白质、聚糖、糖蛋白、代谢物等，在所述细胞中本质上是原先天然存在的。
本领域技术人员可以通过已知方法，例如通过比较分子遗传学和生化分析常规地将细胞的组分和化合物鉴定为异源的或内源的。例如，本领域技术人员可以常规地将非APP细胞中的APP rfb基因簇和/或APP O-抗原鉴定为异源的。同样，通常证明，在革兰氏阴性细菌中，rfb基因簇是非功能性的或内源性缺失或是非功能性基因结构和/或在所述细胞内或细胞上不存在或感兴趣的细胞不分泌相应的APP O-抗原。
此处所述，特别是在细菌宿主细胞中的rfb基因簇的背景中，术语“非功能性”是指所述基因簇的至少一个基因，任选地所有基因部分或完全缺失、结构或功能改变或至少出现功能障碍，导致基因簇引起至少一种蛋白质，任选地所有蛋白质缺失、异常表达和/或出现功能障碍，并导致基因簇表达产物基本上不产生O-抗原。例如，可以改变和/或删除rfb基因簇的一个或多个基因，和/或可以改变所述簇的基因调控，使其基因表达功能失调，即导致用于O抗原合成的蛋白质在生理上不相关或不表达。可以通过分子生物学和生物化学中的常规技术来分析基因和蛋白质，并评估它们的功能或缺失。
为了实现生理上有效的免疫反应，细菌宿主细胞将异源功能性APP rfb基因簇表达产生的APP O抗原与细菌宿主的脂质A-核心结合，并将结合物转移到细菌宿主的外表面，用于展示并接触环境中相关的免疫相关成分，例如活的和接种过疫苗的猪。
本发明的细菌宿主细胞可以广泛地选自革兰氏阴性细菌细胞，因为所有的革兰氏阴性细胞都将表达并包含与本发明细菌宿主细胞的异源O-抗原结合所需的脂质A。在一个具体的实施例中，例如，细菌宿主细胞可以选自肠杆菌科、伯克氏菌科、假单胞菌科、弧菌科，任选地泰国伯克霍尔德菌、铜绿假单胞菌、需钠弧菌、霍乱弧菌、大肠杆菌(任选地大肠杆菌_5(E.coli_5))、肠道沙门氏菌(任选地肠道沙门氏菌肠亚种，任选地肠道沙门氏菌肠亚种选自鼠伤寒血清型、肠炎血清型、海德堡血清型、沙门氏菌鸡血清型、哈达尔血清型、阿哥纳血清型、肯塔基血清型和婴儿血清型)，以及肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344。
当然，应该理解的是，所选的细菌宿主细胞必须适合药物应用，例如疫苗应用，作为灭活疫苗或活疫苗。
在另一个实施例中，本发明的细菌宿主细胞包含异源功能性rfb基因簇，其可以选自所有已知的APP rfb基因簇，特别是众所周知的APP1至18rfb基因簇。可以对这些基因簇进行改变而用于本发明的细菌宿主细胞，即与天然存在的基因簇的不同之处在于其相应表达的异源APP O-抗原是功能性的，即会在猪中引发抵抗APP攻击的生理相关免疫，并且仍然可以与细菌宿主细胞的脂质A核心结合。
在一个实施例中，用于实施本发明的异源rfb基因簇是APP2或APP8 rfb基因簇，
(i)其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4，或由它们组成；
(ii)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；
(iii)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核酸序列在严格的条件下杂交；和/或
(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的。
正如本领域技术人员已知的和此处在核酸的背景中使用的术语“％(百分)序列一致性”表示两个或多个核酸分子之间通过各序列之间的一致性比对确定的相关程度。“序列一致性”的百分数是两个或多个序列中相同区域的百分数结果，同时考虑了空位和其他序列特性。
可借助已知方法确定相关核酸分子的一致性。通常，采用算法适用于满足该任务特定需求的特殊的计算机程序。确定一致性的优选方法从在要比较的序列中产生最大程度的一致性开始。用于确定两个核酸序列之间一致性的优选计算机程序包括但不限于BLASTN(Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,Vol.215p403-410)和LALIGN(Huang and Miller1991,Adv.Appl.Math.,Vol.12,p337-357)。BLAST程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源获得(BLAST handbook,Altschul et al.,NCB NLM NIH Bethesda,MD 20894)。
相关核酸分子(例如APP rfb基因簇)的一致性也可以通过它们与特定参考核酸序列(任选地在严格条件下)杂交的能力来确定。除了现有技术中确定严格条件下与特定参考核酸序列杂交的能力的常用和/或标准方案(例如Sambrook and Russell,(2001)Molecular cloning:A laboratory manual(3volumes))之外，优选采用比对工具，例如前面提到的BLASTN(Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,Vol.215p403-410)、LALIGN比对工具和多序列比对工具例如CLUSTALW(Sievers et al.2011,Mol.Sys.Bio.,Vol.7,p539),MUSCLE(Edgar 2004,Nucl.Acids Res.,Vol.32,p1792-7)或T-COFFEE(Notredame etal.2000,J.of Mol.Bio.,Vol.302(1),p205-17)，与可在基因数据库(例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝nucleotide)中找到的核苷酸序列进行比较，分析和确定在严格条件下与特定参考核酸序列杂交的能力。
最优选本发明的APP rfb基因簇与特定参考核酸(例如SEQ ID NO：1、3和4中列出的那些核酸)杂交的能力在以下条件的Southern印迹分析中证明：45℃下，6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后在65℃下，在0.2x SSC，0.1％SDS中洗涤。
在进一步的实施例中，细菌宿主细胞产生APP1至18的O-抗原，任选地APP2或APP8O-抗原，其中APP rfb基因簇任选地表达至少一种包含或由以下任一序列的氨基酸组成的蛋白质：SEQ ID NO：2、50-61或SEQ ID NO：5、62-72，或至少一种与这些序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％氨基酸序列一致性的蛋白质。
可借助已知方法确定相关氨基酸分子的百分一致性。通常，采用算法适用于满足该任务特定需求的特殊的计算机程序。确定一致性的优选方法从在要比较的序列中产生最大程度的一致性开始。用于确定两个氨基酸序列之间一致性的优选计算机程序包括但不限于TBLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTX(Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.,Vol.215p403-410)或ClustalW(Larkin et al.2007,Bioinformatics,Vol.23,p2947-2948)。BLAST程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其他来源获得(BLAST handbook,Altschul et al.,NCB NLM NIH Bethesda,MD 20894)。ClustalW程序可从http://www.clustal.org获得。
用于本发明的异源APP rfb基因簇可以通过本领域技术人员熟知的方法合成制备，但也可以从合适的DNA文库和其他可公开获得的核酸来源中分离，然后可以任选地进行突变。这种文库或突变的制备是本领域技术人员熟知的。
在一个替代实施例中，本发明的细菌宿主细胞是其中细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇不具有功能性并且至少部分、任选地完全缺失的一种细菌宿主细胞。
我们发现，如果异源启动子强于APP rfb基因簇的内源启动子，则引入用于调节异源APP rfb基因簇转录的异源启动子会改善APP O-抗原表达。异源APP rfb基因簇的异源启动子任选地选自卡那霉素启动子、proD启动子、j23101启动子、proC启动子、STER_RS05525启动子、STER_RS01225启动子、STER_RS04515启动子、STER_RS05020启动子、STER_RS06870启动子、STER_RS00780启动子、P32启动子，任选地卡那霉素启动子、proD启动子、j23101启动子、STER_RS04515启动子和P32启动子，任选地卡那霉素启动子和proD(Datsenko etal.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645,Davis et al.2010,Nucleic acids research,Vol.39(3),p1121-1141,Kong et al.2019,ACS Synthetic Biology,Vol.8,p1469-1472)。
在比较启动子效率的背景中，此处所述术语“强于”是指与宿主细胞中天然存在的内源性和功能性APP rfb启动子相比，异源启动子将产生更多的转录产物(即rfb基因簇转录物)和翻译产物(即rfb簇表达产物(酶))，和更多的APP O-抗原。
我们发现，APP rfb基因簇产生的一些酶活性可能会限制APP O-抗原的细胞产生。在这方面，证明了本发明的细菌宿主细胞中APP O-抗原的细胞产生效率可以通过引入功能性表达辅助(例如参与)或转化APP O-抗原合成中间产物等的酶的至少一种另外的基因来改善。任选地功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因选自用于核苷酸活化聚糖生物合成的酶、十一烯焦磷酸糖基转移酶、O-抗原糖基转移酶、O-抗原聚合酶、O-抗原链长决定蛋白和N-聚糖差向异构酶及它们的组合，任选地选自gne基因和wzy基因，
i.其中gne基因编码UDP-半乳糖/UDP-N-乙酰半乳糖胺差向异构酶，任选地来自空肠弯曲杆菌的差向异构酶，所述gne基因任选地包含SEQ ID NO：6或由SEQ ID NO：6组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；；
ii.其中wzy基因编码APP、任选地APP2的O-抗原聚合酶，所述wzy基因任选地包含或由SEQ ID NO：7组成或包含或由SEQ ID NO：8的密码子优化的wzy基因组成或具有与SEQID NO：7或SEQ ID NO：8至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的核酸序列杂交。
细菌感染通常与有毒化合物的释放有关。取决于APP血清型，APP细菌通常分泌各种ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV毒素组合。为了改善APP感染的症状，本发明的细菌宿主细胞可以任选地包含至少一种Apx毒素的中和表位，任选地至少Apx毒素I至III的中和表位，其位于细菌宿主细胞外表面上并与膜蛋白结合，任选地选自溶细胞素A、三聚体自转运体粘附素，优选AIDA-I和EaeA，和外膜蛋白(OMP)，优选大肠杆菌的OmpA(Xu et al.2018,PlosOne,Vol.13(1),Rutherford et al.2006,Vol.188(11),Wentzel et al.2001,J.Bacteriol.,Vol.183(24),7273-7284,2001,Georgiou et al.1996,Protein Engineering,Vol.9(2),239-247)。
通过同义替换的密码子优化被广泛用于重组蛋白表达。密码子优化是指在不改变所得氨基酸序列的情况下调整重组基因的密码子组成以改善蛋白质表达。这是可能的，因为大多数氨基酸由一个以上的密码子编码。通常，密码子优化适用于特定的宿主生物(Burgess-Brown et al.2008,Protein Expression&Purification Vol.59,p94-102,Elena et al.2014,Frontiers in Microbiology,Vol.5(21),1-8)。
在一个替代实施例中，本发明的细菌宿主细胞是一种细胞，其中(a)异源功能性APP rfb基因簇，(b)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因，和/或(c)Apx毒素的至少一个中和表位，经密码子优化用于细菌宿主细胞。任选地异源功能性APP rfb基因簇经密码子优化用于细菌宿主细胞。
在下文中，为了进一步说明本发明的总体概念，提供了本发明的细菌宿主细胞的具体的、非限制性的实施例。
在一个替代实施例中，本发明的细菌宿主细胞是大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，或肠道沙门氏菌，任选地肠道沙门氏菌肠亚种，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344，其中：
(a)所述异源功能性APP rfb基因簇选自APP1至18rfb基因簇，任选地是APP2或APP8 rfb基因簇；
(b)调节异源APP rfb基因簇转录的异源启动子是卡那霉素或proD启动子；
(c)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是wzy基因，任选地密码子优化的wzy基因，和/或gne基因，这两种基因任选地整合到细菌宿主细胞的基因组中或位于质粒上；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III的中和表位中的至少一个，任选地与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的溶细胞素A结合，或从宿主细胞分泌；
其中(i)APP2或APP8 rfb基因簇，(ii)gne基因和/或(iii)wzy基因，任选地APP2rfb基因簇和wzy基因经密码子优化用于细菌宿主细胞大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，或肠道沙门氏菌，任选地肠道沙门氏菌肠亚种，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型。
在另一个替代实施例中，任选地上述的，本发明的细菌宿主细胞是肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型，任选地是肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344菌株，其中
(a)密码子优化的异源功能性APP rfb基因簇是APP2 rfb基因簇，任选地(i)包含SEQ ID NO：3或由其组成；(ii)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；(iii)在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列杂交；和/或(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的，
所述细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇至少部分或完全缺失；
(b)所述调节异源APP2 rfb基因簇转录的任选地异源启动子是卡那霉素启动子；
(c)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是gne基因和/或wzy基因，它们任选地整合到细菌宿主细胞的基因组中；
i.其中gne基因，任选地空肠弯曲杆菌的gne基因，任选地包含SEQ ID NO：6或由其组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；
ii.其中wzy基因任选地包含或由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8组成，或具有与SEQID NO：7或SEQ ID NO：8至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的核酸序列杂交；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III，任选地至少Apx毒素II和III的至少2个中和表位，任选地所述表位与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的溶细胞素A结合。
在另一个替代实施例中，本发明的细菌宿主细胞是大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，其中
(a)所述异源功能性APP rfb基因簇是APP2 rfb基因簇，任选地
(i)包含SEQ ID NO：3或由其组成；(ii)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；(iii)在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列杂交；和/或(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的，
所述细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇至少部分或完全缺失；
(b)调节异源APP2 rfb基因簇转录的异源启动子是卡那霉素或proD启动子，任选地卡那霉素启动子；
(c)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是gne基因，任选地整合到细菌宿主细胞的基因组中或位于质粒上，
其中gne基因，任选地空肠弯曲杆菌的gne基因，任选地包含SEQ ID NO：6或由其组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III，任选地至少Apx毒素II和III的至少一个中和表位，任选地所述表位与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的的溶细胞素A结合，或从宿主细胞分泌；
其中APP2 rfb基因簇任选地经密码子优化用于大肠杆菌。
在本发明的另一个实施例中，细菌宿主细胞是肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344菌株或大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，其中
(a)异源功能性APP rfb基因簇是APP8 rfb基因簇，任选地经密码子优化，任选地(i)包含SEQ ID NO：4或由其组成；(ii)与SEQ ID NO：4具有至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；(iii)在严格条件下与SEQ ID NO：4的核酸序列杂交；和/或(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的，
(b)调节异源APP2 rfb基因簇转录的任选地异源启动子是卡那霉素或proD启动子，任选地卡那霉素启动子；
(c)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是wzy和/或gne基因，任选地经密码子优化，任选地这两种基因整合到细菌宿主细胞的基因组中；
i.其中gne基因，任选地空肠弯曲杆菌的gne基因，任选地包含SEQ ID NO：6或由其组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；
ii.其中所述wzy基因，任选地经密码子优化，任选地包含或由SEQ ID NO：7或SEQID NO：8组成，或具有与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的核酸序列杂交；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III，任选地至少Apx毒素II和III的至少2个中和表位，任选地所述表位与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的溶细胞素A结合。
本发明的细菌宿主细胞可以以活的或灭活的形式向猪施用。
本发明的上述细菌宿主细胞具有高度免疫原性，并产生抗APP感染的免疫反应。此外，一旦准备好，它们就可以很容易地繁殖和大量生产。它们可以以活的或灭活的形式，例如，作为活疫苗或灭活疫苗施用，活疫苗允许在宿主中延长繁殖和保持持续免疫刺激，以及在无佐剂时产生完全免疫反应。
因此，本发明还涉及本发明的活的或灭活的细菌宿主细胞的医学用途，特别是用于制备用于预防和/或治疗APP感染的药物，优选疫苗。
优选所述药物可用于预防和/或治疗APP，特别是APP1-18感染，优选猪的APP感染。
本发明的另一方面涉及一种组合物，任选地一种药物组合物，其包含至少一种此处所述的本发明的细菌宿主细胞，以及一种生理学上可接受的赋形剂。
在一个实施例中，本发明的组合物或药物组合物包含细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞表达至少两种不同的O-抗原，任选地APP1至APP18的O-抗原，任选地选自APP1、2、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、17和18，任选地选自APP1、2、5、7、8、10、12、14和18的O-抗原的组合。
在另一个实施例中，本发明的细菌宿主细胞或组合物用于预防和/或治疗胸膜肺炎放线杆菌(APP)感染，任选地哺乳动物，任选地猪(Sus)或家猪(Sus scrofa domesticus)的APP2感染。
在另一个实施例中，本发明包括用于动物，特别是猪牲畜的饲料或饮用水，以及生理上可接受的赋形剂和/或食品。例如，所述疫苗或饲料等组合物将大大减少猪牲畜的APP定植，从而降低感染传播的机会。
在另一个方面，本发明涉及一种治疗方法，包括将生理有效剂量的本发明的细菌宿主细胞或组合物、食物或饲料向有需要的哺乳动物受试者施用用于治疗APP感染，任选地用于预防猪的APP感染的步骤。
对于治疗和/或预防用途，本发明的组合物、药物组合物、食物或饲料可以以任何常规剂型以任何常规方式施用。
施用途径包括但不限于鼻内、口服、口鼻、经皮、结膜、卵内、皮下、皮内、肌内、舌下、经皮或结膜。例如，施用装置和方法包括注射器、原子化和雾化装置、喷雾器(粗喷雾、喷在饲料上)和饮用水。吸入指吸入液体或粉末。施用途径可以组合，例如鼻内和口服施用。
优选的施用方式是鼻内、口服、口鼻、舌下、皮下、皮内、经皮、结膜和肌内，最优选鼻内和口服。
本发明的细菌宿主细胞可以单独施用或与包括其他活性成分的佐剂联合施用，所述佐剂增强细菌的稳定性和/或免疫原性，方便含有它们的药物组合物的施用，提高溶解性或分散性，增加繁殖活性，提供辅助治疗等。
此处所述的细菌宿主细胞(例如大肠杆菌和肠道沙门氏菌肠亚种，任选地鼠伤寒血清型)的药物剂型，包括本领域普通技术人员已知的药学上可接受的载体和/或佐剂。这些载体和佐剂包括，例如，含有或不含有清洁剂和/或盐的水或缓冲溶液、金属盐(例如铝基盐)、皂苷、油(矿物油和非矿物油)、油乳液、细菌衍生物、细胞因子、免疫刺激复合物、脂质体、微粒、维生素(例如α生育酚)、葡聚糖、卡波姆、微乳液、合成寡脱氧核苷酸和其他免疫刺激化合物，单独含有或是它们的组合。优选的剂型包括溶液、悬浮液、乳液、粉末、片剂、胶囊和透皮贴剂。制备剂型的方法是众所周知的，参见，例如Ansel et al.1990,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,5th ed.,ISBN:978-0812112559，特别是Pastoret 1999,Acad.Sci.Paris/Elsevier SAS,Vol.322,p967-972。
例如，采用本发明的细菌宿主细胞和组合物进行的疫苗接种可以作为单次疫苗接种进行，或者采用加强疫苗接种进行，可能随后在规定的时间段后再次接种疫苗。疫苗可以由活细菌组成，以例如10E4到10E6 cfu(菌落形成单位)的剂量施用，或者疫苗可以由灭活的细菌组成，以例如10E6到10E11 cfu(菌落形成单位)的剂量施用，含或不含佐剂。
下面的图和实施例用于说明本发明，而非限制如所附权利要求中描述的本发明的范围。
附图说明
图1是从测序的APP2菌株中鉴定的APP rfb簇的示意图。APP2的rfb簇长度是12928bp，由13个编码推定糖基转移酶、聚糖修饰酶、链长决定蛋白、O-抗原转运蛋白、乙酰转移酶和假定蛋白(与O-抗原聚合酶wzy同源)的基因组成。基因位置和簇的大小以碱基对形式给出。h.P.–假定蛋白
图2是带有侧翼基因erpA的APP2的O-抗原生物合成簇的示意图，并且使用另外的下游序列将其整合到SL1344和大肠杆菌_5中。完整片段的长度是13758bp。基因位置和簇的大小以碱基对形式给出。h.P.–假定蛋白
图3是位于pDOC质粒上的APP2 O-抗原生物合成簇的示意图，其侧翼是rfb簇的同源宿主细胞区域。包含APP2 rfb簇及其侧翼区域的13758bp片段(参见图2)经过修饰，以内源性rfb簇的反义方向整合到SL1344和大肠杆菌_5中。为此，将两侧是FRT位点的卡那霉素抗性盒在下游融合。所述融合构建体的上游和下游侧翼是SL1344或大肠杆菌_5的rfb簇侧翼的同源区域(包括反义方向的galF基因)。整个构建体的侧翼是I-SceI限制性内切核酸酶识别位点。
图4是位于pDOC质粒上的密码子优化的APP2 O-抗原生物合成簇的示意图，其侧翼是内源性rfb簇的同源区。为了将密码子优化的APP2的rfb簇整合到SL1344和大肠杆菌_5中，内源性rfb簇的原始整合位点保持相同。合成了密码子优化的(用于大肠杆菌表达)APP2rfb簇，所述簇在其5'区编码卡那霉素抗性盒(两侧为FRT位点)。这导致受卡那霉素基因的启动子调控的转录。整个构建体的两侧是I-SceI限制性内切核酸酶识别位点。
图5A-D是APP2 LPS的免疫印迹图(A,C)和凝胶银染图(B,D)，用于验证表达APP2O-抗原生物合成簇(A,B)的SL1344中wzy和gne的染色体外表达及表达APP2 O-抗原生物合成簇(C,D)的大肠杆菌_5中gne的染色体外表达。在阿拉伯糖诱导型启动子控制下，Wzy和/或gne在卡那霉素抗性盒下游表达APP2 rfb簇(有或没有密码子优化)的SL1344和大肠杆菌_5细胞中编码在质粒上。用0.1％(SL1344细胞)或0.2％(大肠杆菌_5)阿拉伯糖诱导细胞，通过蛋白酶K处理细胞和通过SDS-PAGE分析消化的提取物，分析过夜培养物的APP2 LPS表达。在左侧，分子标记带以kDa表示。泳道1：APP2 P1875，泳道2：SL1344，泳道3：SL1344Δrfb，泳道4：SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy，泳道5：SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD pEC415，泳道6：SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD-gne，泳道7：SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pEC415-wzy，泳道8：SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD-gne pEC415-wzy，泳道9：大肠杆菌_5，泳道10：大肠杆菌_5Δrfb，泳道11：大肠杆菌_5Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)，泳道12：大肠杆菌_5Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD，泳道13：大肠杆菌_5Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD-gne
图6A和6B是重叠PCR生成整合到大肠杆菌_5和SL1344衍生物中的片段rfaL-Ωgne/cat(A)和rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(B)的示意图。(A)为了生成rfaL-Ωgne/cat，对具有重叠区域的gne和cat的单个片段进行扩增。通过重叠PCR，将两个片段融合，并延长5'端和3'端，以编码具有大肠杆菌_5和SL1344基因组中目标整合位点的同源区域。生成整合构建体rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(B)遵循相同的原则，但在通过重叠PCR组合3个片段并在5'端和3'端整合同源重组序列之前生成了编码密码子优化的wzy的其它片段。
图7是cat/kP整合构建体的示意图。为了将卡那霉素启动子(kP)整合到密码子优化的APP2 rfb簇的上游，合成了一个1414bp的构建体，该构建体包含一个氯霉素抗性盒，其侧翼是FRT位点，后接卡那霉素抗性盒的373bp启动子区域(编码在pKD4上)。
图8A、8B和8C对有或没有进一步糖工程化(APP2 rfb簇表达的KanR和Kp控制，wzy和/或gne整合)的表达APP2 O-抗原生物合成簇的SL1344和大肠杆菌_5中APP2 O-抗原表达水平进行了比较。通过蛋白酶K处理和通过SDS-PAGE分析消化的细胞提取物，分析图8A所列细胞的饱和过夜培养物的APP2 O-抗原表达。图8B是APP2 LPS的银染照片，图8C是使用与凝胶的APP2 LPS反应的兔血清的免疫印迹。在左侧，分子标记带以kDa表示。
图9是从测序的APP8菌株中鉴定的APP rfb簇的示意图。APP8的rfb簇长度是13598bp，由13个基因组成(各个基因的可能功能在表中列出)。基因位置和簇的大小以碱基对形式给出。
图10是位于pDOC_SL1344_Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)上的密码子优化的APP8 O-抗原生物合成簇的示意图，其侧翼是内源性rfb簇的同源区(包括SL1344的galF)。在密码子优化的APP8的rfb簇的上游，是氯霉素抗性盒(侧翼是FRT位点)，然后是kP(卡那霉素)启动子。整个构建体的侧翼是I-SceI限制性内切核酸酶识别位点。
图11A和11B示出了在kP启动子控制下编码密码子优化的APP8 rfb簇的SL1344中的APP8 O-抗原表达水平。通过蛋白酶K处理和通过SDS-PAGE分析消化的细胞提取物，分析SL1344(泳道1)、SL1344Δrfb(泳道2)、APP8(泳道3)、APP3(泳道4)和SL1344Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)(泳道5)的饱和过夜培养物的APP8 O-抗原表达。(A)是LPS的银染照片，(B)是使用与凝胶的APP3 LPS反应的猪血清的免疫印迹。分子标记带(M)以kDa表示。
图12A和12B示出了HIS10-ApxII(439-801aa)的表达和纯化。HIS10-ApxII(439-801aa)在阿拉伯糖诱导后在编码pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)的BL21细胞中表达。培养4小时后，收获细胞，并通过溶菌酶处理破坏细胞，然后进行超声-冷冻-解冻循环。通过Ni-NTA结合和重力流动在变性条件下纯化蛋白质。Ni-NTA珠子的洗脱液(E)是通过采用1ml含有0.5M咪唑的变性缓冲液淋洗5次得到的。载入7.5μl每种洗脱液组分(泳道1：E1，泳道22：E2，泳道3：E3，泳道4：E4，泳道5：E5)，开展SDS-PAGE，并通过考马斯染色(A)和HIS表位(B)的免疫印迹进行分析。在左侧和右侧，分子标记带以kDa表示。
图13A和13B示出了ApxIII(27-245aa)-HIS9的表达和纯化。阿拉伯糖诱导后编码pMLBAD-ApxIII(27-245aa)-HIS9的BL21细胞中的ApxIII(27-245aa)-HIS9。培养4小时后，收获细胞，并通过溶菌酶处理破坏细胞，然后进行超声-冷冻-解冻循环。通过Ni-NTA结合和重力流动纯化蛋白质。在合并的洗脱级分中将缓冲液更换为PBS。将7.5μl合并和透析的样品用于SDS-PAGE，并通过考马斯染色(A)和HIS表位的免疫印迹(B)进行分析。在左侧，分子标记带以kDa表示。
图14是合成的ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6的示意图，其具有侧翼同源重组位点、合成启动子和3'氯霉素抗性盒。
图15A、15B和15C示出了ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6在SL1344中的表达，其具有改善的APP2 O-抗原表达。分析的菌株以其(A)中所示的加载模式示出。将液体培养基中的过夜培养物稀释至0.05OD600，并生长至对数生长(OD600～1)。收获细胞，将其在1x
Figure BDA0003942659990000081
中煮熟，加载到梯度Bis Tris凝胶上进行SDS-PAGE，并通过考马斯染色(A)和HIS表位的免疫印迹(B)进行分析。在左侧和右侧，分子标记带以kDa表示。
图16是免疫接种程序的概述。在研究日(SD)第0天和SD14采用灭活的测试材料对猪进行两次免疫，并在最后一次免疫(SD 28)后2周实施安乐死。每周取血液样品收集血清。每天监测动物的临床症状。
图17示出了针对APP血清型2(APP2)和7(APP7)的纯化LPS测试的所有动物在时间点SD 0和SD 28的血清IgG介导的吸光度。各动物根据它们的耳标示出。记录单次测量的450nm处的OD。各图按施用的抗原及其施用方式(口服和鼻腔vs.注射)进行分类。
图18示出了针对APP血清型2(APP2)、1(APP1)、5(APP5)和7(APP7)的纯化LPS测试的所有动物在时间点SD 28的BALF IgA介导的吸光度。各动物根据它们的耳标示出。记录重复测量的450nm处的OD(示出误差线)。各图按施用的抗原及其施用方式(口服和鼻腔vs.注射)进行分类。
图19示出了第2组和第7组的所有动物、第3组和第10组的两只动物和第11组的一只动物针对纯化的ApxII(439-801aa)和AcrA-HIS6蛋白(作为阴性对照)在时间点SD 0和SD28的血清IgG介导的吸光度和在时间点SD 28的BALF IgA介导的吸光度。各动物根据它们的耳标示出。记录单次测量的450nm处的OD。各图按施用的抗原及其施用方式(口服和鼻腔vs.注射)进行分类。
图20是免疫接种程序的概述。在研究日(SD)0和SD14采用活的重组细菌对猪进行两次免疫接种，并在最后一次免疫接种(SD 28)后2周实施安乐死。每周取血液样品收集血清。每天监测动物的临床症状。
图21是疫苗接种和攻击时间表的概述。猪在SD 0和SD21接种两次，然后在SD 42采用APP2细菌攻击。在第48天(SD48)对猪实施安乐死。在指定的时间点收集血清。定期监测动物的临床症状(在攻击后的6天内每天至少监测两次)。
图22示出了按照Hannan et al.1982开展的病变评分结果。第1组：活的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat，纯化的HIS10-APXII(439-801aa)，纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9。第2组：灭活的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne，纯化的HIS10-APXII(439-801aa)，纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9。第3组：纯化的HIS10-APXII(439-801aa)，纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9。第4组：未接种疫苗的对照组。通过Dunnett多重比较检验开展统计分析。统计显著性以(*)P值0.01表示。
图23示出了按组分类的攻击后6天内的存活率(％)，第0天是攻击日，第6天研究结束。第1组：灭活的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne，纯化的HIS10-APXII(439-801aa)，纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9；第2组：商业疫苗
Figure BDA0003942659990000082
APP。第3组：未接种疫苗的对照组。
图24示出了按照Hannan et al.1982开展的病变评分结果。第1组：灭活的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne，纯化的HIS10-APXII(439-801aa)，纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9。第2组：商业疫苗
Figure BDA0003942659990000092
APP。第3组：未接种疫苗的对照组。通过Dunnett多重比较检验开展统计分析。统计显著性以(**)P-值<0.01表示。
图25示出了所有动物的APP2再分离评估，并按组分类。细菌学评分值设置为0＝没有再分离出APP2细菌，1＝再分离出<20CFU(菌落形成单位)APP2细菌，2＝再分离出<200CFUAPP2细菌，3＝再分离出>200CFU APP2细菌。
在下文中，本发明将通过代表性实例进行描述，这些实例均不应被解释为限制所附权利要求的范围。
实例
材料和方法
实验例中使用的菌株及其来源列于表1中。
表1
Figure BDA0003942659990000091
Figure BDA0003942659990000101
实验例中使用的质粒及其来源列于表2中。
表2
Figure BDA0003942659990000102
Figure BDA0003942659990000111
实验例中使用的质粒寡核苷酸及其核酸序列列于表3中。
表3
Figure BDA0003942659990000112
Figure BDA0003942659990000121
方法-细菌菌株的生长
将上表1和表2中列出的菌株和质粒在Luria-Bertani(LB)培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl)、TB培养基(12g/L胰蛋白胨、24g/L酵母提取物、0.017MKH2PO4、0.072M K2HPO4)或BHI+NAD(37g/L脑心浸出液肉汤(BHI；准确的成分参见SigmaAldrich目录号53286)，补充2mg/Lβ-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD))。
琼脂平板补充1.5％(w/v)琼脂。抗生素的最终浓度如下：氨苄青霉素(Amp)100μg/ml、卡那霉素(Kan)50μg/ml、氯霉素(Cm)25μg/ml、链霉素(Strep)、甲氧苄啶(Tmp)10μg/ml、庆大霉素(gent)15μg/ml。
实例1
1)产生表达APP2 O-抗原生物合成簇的疫苗株
1.1)APP2 O-抗原生物合成簇在大肠杆菌和SL1344中的整合
在第一步中，根据Xu et al.2010,J.Bacteriol.,Vol.192(21)，p5625-5636，对胸膜肺炎放线杆菌血清型2(APP2)菌株(P1875)进行测序，并对O-抗原生物合成簇(rfb簇)进行鉴定。结果表明，此出版物中使用的所有APP血清型的rfb簇位于erpA和rpsU基因之间。图1、表4和序列1示出了本研究的测序APP2菌株的遗传组织和注释基因/蛋白质。
表4-侧翼为erpA和rpsU的APP2的rfb基因座及其各自的注释基因和蛋白质/功能。
注释基因 预测的蛋白质/功能
wzzB 链长决定蛋白
kanE α-D-卡那氨基转移酶(alpha-D-kanosaminyltransferase)
cpsP 糖基转移酶家族2
epsJ 推定糖基转移酶EpsJ
setA 真核运输蛋白A的子版本
假定基因 假定蛋白
rfbX 推定O抗原转运蛋白
vatD 链阳霉素A乙酰转移酶
pglC 十一烯磷酸酯N,N'-二乙酰基bacillosamine1-磷酸转移酶
rffG dTDP-葡萄糖4,6-脱水酶2
rmlA2 葡萄糖-1-磷酸胸苷基转移酶2
rmlD dTDP-4-脱氢鼠李糖还原酶
rfbC dTDP-4-脱氢鼠李糖3,5-差向异构酶
至于疫苗菌株，选择来自肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型和大肠杆菌的两种载体细菌(参见菌株列表)。肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344亲本菌株从被感染的牛中分离得到(Hoiseth et al.1981,Nature,Vol.291(5812),p238-239)。菌株SL1344是亲本菌株的遗传标记形式。第二个菌株，大肠杆菌菌株5(大肠杆菌_5)是从瑞士健康猪的扁桃体中分离出来的。它对毒力因子stx、eae、LT和ST显示为PCR阴性。对这两种菌株进行测序，并在基因galF和gnd之间鉴定出内源性O-抗原生物合成簇(rfb簇)。此外，两种菌株都经过遗传修饰，不表达内源性O-抗原，而是在该位置插入编码APP2的O-抗原生物合成途径的基因簇(序列42，图2)。
包含APP2 rfb簇及其侧翼区域的13758bp片段(图2)经过修饰，以内源性rfb簇的反义方向整合到SL1344和大肠杆菌_5中。为此，将两侧是FRT位点的卡那霉素抗性盒在下游融合。所述融合构建体的上游和下游侧翼是SL1344或大肠杆菌_5的rfb簇侧翼的同源区域(包括反义方向的galF基因)。
详细地说，为了将APP2 rfb簇(序列1)整合到大肠杆菌_5和SL1344中，(通过CRO)产生/合成基于Lee et al.2009的pDOC系统的穿梭载体质粒pDOC_E.coli_5_Δrfb::APP2.LPS/kanR(用于大肠杆菌_5)和pDOC_SL1344_Δrfb::APP2.LPS/kanR(for SL1344)(用于SL1344)。鉴定的APP2rfb操纵子(基因wzzB至rfbC)在5'端和3'端被延长，从而包括序列1的侧翼上游启动子区域(也包含erpA基因)和下游终止子区域(包含rpsU基因的3'区)(见图2)。该序列在3'端与具有5'和3'侧翼FRT识别位点(回文翻转酶识别位点)的卡那霉素抗性标记基因(kanR)融合。从大肠杆菌_5和SL1344的测序结果中，检索到内源性rfb簇的侧翼区域，并将其用作APP2 rfb簇和kanR抗性盒的侧翼区域，如下所示。选择大肠杆菌_5和SL1344的内源性rfb簇的最后一个基因终止后的800bp片段作为位于APP2 rfb簇之前的上游同源重组序列。选择1252bp(大肠杆菌_5)或1399bp(SL1344)的区域作为kanR下游的同源重组序列。这些区域包含整个galF基因和直到所述簇第一个基因的起始密码子之前+1位置的所有核苷酸。整个整合簇的两侧是I-SecI限制性内切核酸酶切割位点。整合盒被设计成在内源性rfb簇的反义方向整合。构建体的一般示意图在图3中示出。为了将APP2 rfb操纵子整合到穿梭载体上，需要另外的基因。至于质粒选择标记，采用氨苄青霉素抗性盒。整合sucB基因(参与蔗糖转化，在蔗糖存在下产生有毒代谢物)用于载体质粒反向选择。
穿梭载体质粒(大肠杆菌_5中pDOC_E.coli_5_Δrfb::APP2.LPS/kanR和SL1344中pDOC_SL1344_Δrfb::APP2.LPS/kanR)与编码阿拉伯糖诱导λ-重组系统，并携带I-SceI限制性内切核酸酶和I-SceI切割位点的辅助质粒pACBSCE一起被转化到靶细胞中。转化后，表达的I-SceI酶在I-SceI限制性内切核酸酶切割位点切割穿梭载体质粒，使上述修饰的APP2rfb操纵子与两侧为内源性同源序列的卡那霉素抗性基因线性化。λ-重组系统识别受体细胞基因组中各个位点的同源侧翼区域，并将内源DNA与供体DNA交换，导致APP2 O-抗原生物合成簇与卡那霉素抗性盒在大肠杆菌_5或SL1344中整合(得到菌株E.coli_5Δrfb::APP2.LPS/kanR和SL1344Δrfb::APP2.LPS/kanR)。所选择的在含有卡那霉素和蔗糖的培养基上的细胞PCR检测阳性，证明了外源DNA的存在，选择培养基上缺乏生长，证明不存在穿梭载体和辅助质粒。
为了“重组(out-recombine)”卡那霉素抗性标记，将编码用于识别回文FRT位点的翻转酶的温度敏感质粒pCP20(Cherepanov et al.1995,Gene,Vol.158,p9-14)(用于SL1344衍生物)或pCP20-Gent(用于大肠杆菌_5衍生物)(在氯霉素抗性基因的下游，整合庆大霉素抗性基因)引入到细胞中。在“翻转”事件之后，基因组中只剩下一个FRT位点。随着培养温度升高，阳性克隆被反向选择，而不是选择翻转酶编码质粒。最后的PCR验证了所有辅助质粒的缺失、卡那霉素抗性标记的缺失以及APP2 rfb簇构建体的引入(得到菌株E.coli_5Δrfb::APP2.LPS和SL1344Δrfb::APP2.LPS)。通过SDS-PAGE和免疫印迹法验证了在大肠杆菌_5和SL1344表面展示的APP2 O-抗原的表达(图8)。分析程序和结果在1.6中描述。
作为对照，在野生型细胞大肠杆菌_5和SL1344中删除内源性rfb簇。为此，使用pKD4作为模板(Datsenko et al.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645)及寡核苷酸E.c._5_Δrfbfw/E.c._5_Δrfb rev(用于大肠杆菌_5rfb簇删除)和的SL1344_Δrfbfw/SL1344_Δrfbfw(用于SL1344 rfb簇删除)，通过PCR生成敲除盒。得到的PCR产物编码两侧为FRT位点的卡那霉素抗性盒，此外还包含21-24bp重叠序列与同源重组所需的内源5'(在rfb簇的第一个基因开始之前→wfgD(E.Coli_5))或rfbB(SL1344))和3'(在rfb簇最后一个基因的终止密码子之后→pglH(E.coli_5)或rfbP(SL1344))。引入DNA片段(E.coli_51759bp，SL13441623bp)和编码λ-重组系统的温度敏感辅助质粒pKD46(Datsenko et al.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645)(对于SL1344)和pLAMBDA46(β-内酰胺酶基因与庆大霉素抗性基因交换)(对于E.coli_5)。λ-重组系统识别rfb簇中第一个基因开始之前和最后一个基因的终止密码子之后各个位点的同源侧翼区域，并通过整合两侧是FRT位点的卡那霉素抗性盒删除内源性rfb基因簇。所得菌株E.coli_5Δrfb::kanR和SL1344Δrfb::kanR被进一步操作以丢掉抗生素标记。为了“重组(out-recombine)”卡那霉素抗性标记，采用如上所述Cherepanov et al.1995,Gene,Vol.158,p9-14建立的翻转技术。通过PCR验证最终的E.coli_5Δrfb和SL1344Δrfb菌株，并通过免疫印迹法分析O-抗原表达的损失(图8)。分析程序和结果在1.6中描述。
1.2)通过在APP2 rfb簇上游引入kanR抗性标记提高大肠杆菌_5和SL1344中APP2O-抗原的表达
为了改善糖工程化大肠杆菌_5和SL1344菌株中的APP2 O-抗原呈递，将rfb簇的启动子区域与卡那霉素抗性基因交换，其中卡那霉素启动子用于诱导下游基因的转录。为此，使用寡核苷酸Ec_SL/Kan_fw和Ec_SL/Kan_rev及采用pKD4作为模板，扩增编码卡那霉素启动子和具有5'和3'编码FRT位点的抗性基因，生成PCR片段。此外，寡核苷酸在起始密码子之前和终止密码子之后引入与erpA基因同源的同源重组序列。得到的大小为1644bp的产物与寡核苷酸Ec_SL/Kan_fw_elo和Ec_SL/Kan_rev_elo一起用于第二次PCR反应，以延长同源重组序列提高整合效率。引入该DNA片段和编码λ-重组系统的温度敏感辅助质粒pKD46(Datsenko et al.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645)(对于SL1344Δrfb::APP2.LPS菌株)和pLAMBDA46(对于大肠杆菌_5Δrfb::APP2LPS菌株)。所述λ-重组系统识别erpA起始密码子和终止密码子各自位点的同源侧翼区域，并“重组(out-recombined)”erpA基因，将卡那霉素启动子和两侧是FRT位点的抗性基因整合到各自的位点。引入的卡那霉素抗性基因允许选择阳性克隆(成功整合)。通过PCR验证了这些阳性候选物erpA的缺失和PCR片段的整合。通过增加几轮孵育的生长温度，温度敏感辅助质粒从细胞中丢失。通过免疫印迹测试最终菌株E.coli_5Δrfb::kanR-APP2.LPS和SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS中的O-抗原呈递(图8)。分析程序和结果在1.6中描述。
1.3)通过APP2 rfb簇的密码子优化提高APP2 O-抗原在大肠杆菌_5和SL1344中的表达
为了改善APP2 O-抗原簇蛋白/酶的表达，并最终增加APP2 O-抗原在脂质A上的呈递，基因编码序列的核苷酸三联体密码子可以经优化用于SL1344和大肠杆菌_5。这导致不需要的三联体的使用减少，这可能有利于胸膜肺炎放线杆菌，但不利于SL1344和大肠杆菌_5。在这项研究中，密码子优化由CRO完成，并适用于大肠杆菌表达水平。如果肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344也是如此，则需要通过将相同密码子优化的APP2 rfb簇整合到SL1344内源性rfb簇中。
为了将密码子优化的APP2的rfb簇整合到SL1344和大肠杆菌_5中，内源性rfb簇的原始整合位点保持相同。合成了在其5'端编码卡那霉素抗性盒(两侧是FRT位点)的密码子优化的APP2 rfb簇(用于大肠杆菌表达)。这导致了受卡那霉素基因启动子调控的(密码子优化的)APP2 rfb簇的转录。具体来说，设计了一个新的整合盒(图4)，其结合APP2 rfb簇上游的卡那霉素抗性基因整合(序列1和7)和APP2 rfb簇的密码子优化(进行合成的CRO应用密码子优化用于质粒的大肠杆菌表达)。所得质粒(序列43；pDOC_E.coli_5_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.))用于操作大肠杆菌_5和产生用于基因操作SL1344细胞的质粒pDOC_E.coli_5_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)(序列44)。寡核苷酸BamHI-FwKanR-Fw/XhoI3'rspU-Rev用于扩增质粒pDOC_E.coli_5_Δrfb::Kan-APP2.LPS(cod.opt.)的14972bp片段，所述片段包含密码子优化的APP2 rfb簇，所述簇含有上游整合的两侧是FRT位点的卡那霉素抗性盒。此外，通过PCR在5'端(BamHI)和3'端(XhoI)整合了新的限制性切割位点。进行第二次PCR，生成包含编码同源重组序列的pDOC主链的片段，用于将所述卡那霉素抗性盒整合到SL1344的rfb簇中。使用pDOC_SL1344_Δrfb::APP2.LPS/kanR作为模板，并通过使用引物BamHI-SL-gndFwext/XhoI-SL-GalF Rev ext生成具有引入的BamHI和XhoI切割位点的8113bp片段。在用BamHI和XhoI对PCR产物进行限制性消化后，将这两个片段进行连接。所述序列通过测序确认(pDOC_SL1344_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.))，质粒进一步用于采用卡那霉素抗性盒下游的密码子优化的APP2 rfb簇替换SL1344的rfb簇。为了将卡那霉素抗性盒和密码子优化的APP2 rfb簇整合到大肠杆菌_5和SL1344中，将质粒pDOC_E.coli_5_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)和pDOC_SL1344_Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)分别转化到大肠杆菌_5或SL1344中。该程序按照上述和Lee et al.2009的描述进行。最终菌株E.coli_5Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.(密码子优化的))和SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(密码子优化的)通过PCR进行验证，并通过免疫印迹法测试O-抗原表达(图8)。分析程序和结果在1.6中描述。
1.4)通过引入gne和wzy提高表达APP2 rfb簇的SL1344中APP2 O-抗原的表达
正如在生成的表达APP2 rfb簇的菌株中所见，脂多糖的典型“梯状”条带仅微弱存在或无法检测到(图8)。相反，在脂质A上观察到作为单亚基寡糖的O-抗原的强积累。这表明O-抗原聚合酶(Wzy)可能无法有效地组装LPS聚糖。选择APP2 O-抗原特异性wzy来表达质粒上编码的Wzy。wzy由Xu et al.2010,J.Bacteriol.,Vol.192(21),p5625-5636注释为APP2簇中的第六个基因，对应于位于序列1和图1中setA和rfbX之间的假定蛋白。采用Blast，将假定蛋白序列与NCBI蛋白质数据库进行比对分析，鉴定出其与乳酸乳球菌的Wzy(基因座AZY91860)具有29％一致性，与酒类酒球菌的多糖聚合酶(基因座WP_071436899)具有22％一致性，与链球菌属DD12的多糖聚合酶(基因座KXR76217)具有24％一致性。基于这些发现，假设所述假定蛋白可能代表APP2 rfb簇的O-抗原聚合酶Wzy。采用寡核苷酸5'NdeI_wzy/3'EcoRI_wzy扩增来自具有5'NdeI和3'EcoRI限制性切割位点的质粒pDOC_E.coli_5_Δrfb::APP2.LPS/kanR的可能的wzy基因，所述质粒(PCR产物的片段大小是1138bp)。为了wzy的表达，选择带阿拉伯糖诱导型启动子的载体pEC415。为了将wzy克隆到pEC415中，使用寡核苷酸3'EcoRI_pEC415fw/5'NdeI_pEC415rev(5419bp片段)通过PCR对载体进行线性化、扩增和修饰。再次，在片段末端引入EcoRI和NdeI切割位点。PCR产生的EcoRI-wzy-NdeI和EcoRI-pEC415-NdeI片段采用各自的限制性内切核酸酶消化并连接。在确认序列(pEC415-wzy)后，所述质粒进一步用于测试表达APP2 rfb簇的细胞。
O-抗原生物合成的第二个潜在限制因素可能是聚糖的可用性和/或转移。某些APP血清型的LPS结构数据由Perry et al.1990发布，在APP2 O-抗原五糖的还原端鉴定了半乳糖[→2)-α-D-Galp-(1→3)-β-D-Glcp-(1→4)-α-D-Glcp(6-(Ac)0-65)-(1→4)-β-D-GalpNAc-(1→2)-α-L-Rhap-(1→]n。在细菌细胞中产生半乳糖的一种关键酶是从葡萄糖作为底物的半乳糖的转化。这需要差向异构酶的作用。空肠弯曲杆菌的UDP-GlcNAc/Glc 4-差向异构酶gne被鉴定为在细菌细胞中为细胞表面碳水化合物提供半乳糖和N-乙酰半乳糖胺(Bernatchez et al.2005)。空肠弯曲菌81116(基因座C8J_1070)的gne序列与C-端HA(血凝素)标签和5'EcoRI和3'XbaI限制性切割位点融合。合成该片段，然后在阿拉伯糖诱导型启动子(pMLBAD-gne-HA)的控制下将其克隆到pMLBAD的EcoRI/XbaI切割位点。
测试在其表面表达APP2 O-抗原的SL1344和大肠杆菌_5中wzy和/或gne的基于质粒的表达。在37℃下，将SL1344及其衍生物(Δrfb、Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gnepEC415-wzy、Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD pEC415、Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD-gne、Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pEC415-wzy和Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD-gne pEC415-wzy)以及E.coli_5及其衍生物(Δrfb、Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)、Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD、Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)pMLBAD-gne)在补充抗生素(根据表1和表2)的LB培养基中振荡生长，直到OD600为0.6。为了诱导wzy和/或gne表达，添加阿拉伯糖使其最终浓度为0.1％(对于SL1344及其衍生物)或0.2％(对于大肠杆菌_5及其衍生物)。在37℃(振荡)再孵育5小时后，再次将阿拉伯糖添加至浓度为0.1％(对于SL1344及其衍生物)或0.2％(对于大肠杆菌_5及其衍生物)，并在37℃(振荡)孵育培养物约16小时。收获固定细胞并进一步处理。作为脂质A上APP2 O-抗原呈递的对照，将APP2 P1875菌株在BHI+NAD中在37℃下缓慢振荡(110rpm)生长至静止期，然后收获细胞。为了开展APP2 O-抗原分析，将细胞重新悬浮在1x
Figure BDA0003942659990000161
缓冲液(1OD600个细胞/100μl 1x
Figure BDA0003942659990000162
缓冲液)中。将样品在95℃下孵育5分钟。每OD600等效细胞中加入12μg蛋白酶K(20mg/ml储备液，在10mM Tris-HCl，pH 7.5、20mM CaCl2、50％甘油中)，并将样品在60℃下孵育1小时。然后将蛋白酶K处理的样品(0.1OD600等效细胞)加载到4-12％Bis-Tris凝胶上，并在MES缓冲液中按大小分离分子。凝胶被进一步处理用于免疫印迹和银染色。为了通过免疫印迹分析LPS合成，将LPS从凝胶转移到PVDF膜上。将膜在封闭溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.1％酪蛋白)中在室温下振荡孵育2小时。然后，将膜在抗体结合溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.05％酪蛋白)中在4℃下振荡孵育过夜，所述抗体结合溶液含有1:2000稀释的与APP2 LPS反应的兔血清(采用蛋白酶K处理的APP2 P1875提取物免疫接种兔子)。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤免疫印迹3次，每次5分钟。然后，将膜在抗体结合溶液中与以1:2000稀释的二级山羊抗兔IgG-HRP抗体(BETHYLCat#A120-401P)在室温下振荡孵育1小时。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤膜4次，每次5分钟。通过采用ECL溶液(GE Healthcare#RPN2105)覆盖膜并用Stella 8300(Raytest)检测光信号来观察抗体结合。对于银染色，采用Tsai et al.1982,Anal.Biochem.,Vol.119(1),p115-9描述的方案。简而言之，将凝胶在室温下在40％EtOH/5％乙酸中固定过夜。然后，凝胶采用40％EtOH/5％乙酸中的0.7％高碘酸处理10分钟，然后采用ddH2O洗涤3次，每次15分钟。凝胶采用染色溶液(0.187N氢氧化钠、0.2N氢氧化铵、0.667％硝酸银)染色，并再次用ddH2O充分洗涤3次，每次10分钟。通过使用显影液(0.25mg/ml柠檬酸一水合物，0.0185％甲醛溶液)观察凝胶上的LPS。
对采用抗APP2的LPS的兔血清处理的膜的免疫印迹进行分析，结果表明脂质A部分在约10kDa处有强染色，以及存在APP2 P1875菌株在～12.5和190kDa之间迁移的梯状条带(脂质A上的O-抗原聚合)(图5A、C泳道1)。对于SL1344和SL1344Δrfb(图5A泳道2、3)或大肠杆菌_5和大肠杆菌_5Δrfb，没有观察到兔血清的任何识别。在银染色中，可以检测到SL1344的LPS，其在SL1344Δrfb中消失，表明内源性O-抗原生物合成的成功缺失(图5B泳道2、3)。E.coli_5的LPS仅在较低分子量时可见，并在E.coli_5Δrfb细胞中消失(图5D泳道9和10)。卡那霉素抗性盒下游密码子优化的APP2 rfb簇在SL1344的rfb簇中的整合(图5A泳道5)导致10到15kDa之间的条带，这可能对应于具有连接的单个O-抗原的脂质A。当gne或wzy在这些细胞中过表达时(图5A泳道6、7)，出现前述梯状条带，如果两种蛋白质都在SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)中过表达，则它们可以进一步得到增强(图5A、B泳道8)。此外，与具有相同表达设置的、没有密码子优化的APP2 rfb簇的细胞相比，这些细胞显示出更强的展示(图5A泳道4)。已经证明gne和wzy表达增强了SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)细胞中的APP2 LPS表达。此外，对于表达密码子优化的APP2 rfb簇的大肠杆菌_5细胞，APP2 O-抗原的梯状条带可以通过gne的过表达进一步改善(图5C、D比较泳道12和13)
1.5)将gne和密码子优化的wzy整合到表达APP2 O-抗原的SL1344中
在将质粒上的gne和/或wzy引入到遗传修饰的SL1344中后，已经看到APP2 O-抗原合成的改善，这些基因被整合到表达APP2 rfb簇的菌株的基因组中。为了比较APP2 LPS的表达水平，将单独的gne和融合到APP2的密码子优化的wzy(wzy(cod.opt.)，序列8)的gne进行整合。至于整合位点，选择O-抗原连接酶rfaL的下游区域，以使用rfaL启动子以及整合的gne和wzy(cod.opt.)进行转录。一般设计(图6)基于生成两个(图6A)至三个(图6B)单独的PCR片段，所述PCR片段分别编码两种酶(gne、wzy-cod.opt.)和两侧是FRT位点的抗生素抗性盒cat(氯霉素抗性盒)。
为了生成rfaL-Ωgne/cat(图6A)，对具有重叠区域的gne和cat的单个片段进行扩增。通过重叠PCR，将两个片段融合，并延长5'端和3'端，以编码具有SL1344基因组中目标整合位点的同源区域。生成整合构建体rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(图6B)遵循相同的原则，但在通过重叠PCR组合3个片段并在5'端和3'端添加同源重组序列之前生成了编码密码子优化的wzy的其它片段。融合构建体的5'端和3'端被进一步延长，以包括可以与rfaL终止密码子下游的目标基因组整合位点重组的同源区域(调整来源于Bryskin et al.2010,Biotechniques,Vol.48(6),p463-465的方法)。表5列出了用于生成操作SL1344的底物的单个PCR和重叠PCR的模板和寡核苷酸信息。
表5
Figure BDA0003942659990000171
将重叠PCR产生的融合构建体与用于SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS、SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)的编码λ-重组系统的温度敏感辅助质粒pLAMBDA46(修饰自Datsenko et al.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645)一起转化。所述λ-重组系统识别融合构建体的同源侧翼区域，并在rfaL的终止密码子之后将它们重组到下游的基因组中。引入的氯霉素抗性基因(cat)允许选择阳性克隆(成功整合)。这些阳性候选物通过PCR验证了PCR片段的整合。通过增加几轮孵育的生长温度，温度敏感的辅助质粒从细胞中丢失。最终菌株SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne/cat、SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPSrfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat、SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne/cat和SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat中的O-抗原呈递通过免疫印迹法测试(图8)。分析程序和结果在1.6中描述。
1.6)仅用卡那霉素启动子交换卡那霉素抗性盒以“驱动”APP2 rfb簇的表达
对于基于全细胞细菌的疫苗，建议其没有抗生素抗性。因此，需要从基因组中删除为了增强APP2 rfb表达而引入的卡那霉素抗性。但卡那霉素启动子增加转录的优势可用于将来的细菌疫苗菌株。第一步，通过将温度敏感质粒pCP20(Cherepanov et al.1995,Gene,Vol.158,p9-14)引入到SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat细胞中，“翻转”卡那霉素和氯霉素抗性盒。在每个位置卡那霉素和氯霉素抗性盒的“翻转”事件之后，基因组中只剩下一个FRT位点。随着培养温度升高，阳性克隆被反向选择，而不是选择翻转酶编码质粒。通过PCR验证了pCP20的缺失和卡那霉素以及氯霉素抗性标记的缺失。为了将卡那霉素启动子(kP)整合到密码子优化的APP2rfb簇的上游，合成了一个1414bp的构建体，其中包含具有侧翼FRT位点的氯霉素抗性盒，接着是卡那霉素抗性盒的373bp启动子区域(图7，序列45)。为了在APP2 rfb簇上游引入序列22，使用寡核苷酸Ec_SL/Kan_fw和Ec_SL/Kan_rev和序列24作为模板，扩增kP整合盒，并为rfb簇上游区域添加同源重组序列，产生PCR片段。得到的产物与寡核苷酸Ec_SL/Kan_fw_elo和Ec_SL/Kan_rev_elo一起用于第二次PCR反应，以延长同源重组序列提高整合效率(片段大小是1671bp)。引入该DNA片段和用于SL1344Δrfb::APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)的编码λ-重组系统的温度敏感辅助质粒pKD46(Datsenko et al.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645)。λ-重组系统识别rfb簇上游的同源侧翼区域，并将具有与卡那霉素启动子融合的侧翼FRT位点的氯霉素抗性基因整合到相应位点中。引入的氯霉素抗性基因允许选择阳性克隆(成功整合)。这些阳性候选物验证了PCR片段的整合。通过增加几轮孵育的生长温度，温度敏感的辅助质粒从细胞中丢失。为了去除氯霉素抗性盒，将生成的菌株SL1344Δrfb::cat/kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)用pCP20转化，并如上所述翻转标记。分析所得菌株SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)的APP2 O-抗原生成，并与其亲本菌株进行比较(图8)。
在37℃振荡条件下，将野生型SL1344和大肠杆菌_5以及缺乏内源性O-抗原生物合成(E.coli_5Δrfb和SL1344Δrfb)或表达APP2 rfb簇(E.coli_5Δrfb::APP2.LPS,Δrfb::kanR-APP2.LPS,Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)和SL1344Δrfb::APP2.LPS，Δrfb::kanR-APP2.LPS，Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)，Δrfb::kanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne/cat，Δrfb::kanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat，Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat，Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)，ΔrfbrfaK-ΩClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL，Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC)的遗传修饰细胞在LB培养基中生长至饱和(OD600>2)。收获细胞用于进一步处理。作为脂质A上APP2 O-抗原呈递的对照，将APP2 P1875菌株在BHI+NAD中在37℃下缓慢振荡(110rpm)生长至静止期。收获细胞并用于进一步处理。为了开展APP2 O-抗原分析，将细胞重新悬浮在1x
Figure BDA0003942659990000181
缓冲液(1OD600个细胞/100μl 1x
Figure BDA0003942659990000182
缓冲液)中。将样品在95℃下孵育5分钟。每OD600等效细胞中加入12μg蛋白酶K(20mg/ml储备液，在10mM Tris-HCl，pH7.5、20mM CaCl2、50％甘油中)，并将样品在60℃下孵育1小时。然后将蛋白酶K处理的样品(0.1OD600等效细胞)加载到4-12％Bis-Tris凝胶上，并在MES缓冲液中按大小分离分子。凝胶被进一步处理用于免疫印迹和银染色。为了通过免疫印迹分析LPS合成，将LPS从凝胶转移到PVDF膜上。将膜在封闭溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.1％酪蛋白)中在室温下振荡孵育2小时。然后，将膜在抗体结合溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.05％酪蛋白)中在4℃下振荡孵育过夜，所述抗体结合溶液含有1:2000稀释的与APP2 LPS反应的兔血清。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤免疫印迹3次，每次5分钟。然后，将膜在抗体结合溶液中与以1:2000稀释的二级山羊抗兔IgG-HRP抗体(BETHYL Cat#A120-401P)在室温下振荡孵育1小时。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤膜4次，每次5分钟。然后，通过将ECL溶液(GE Healthcare#RPN2105)添加到膜中，并记录用Stella 8300(Raytest)检测到的光信号来观察特异性抗体结合。对于银染色，采用Tsai et al.1982,Anal.Biochem.,Vol.119(1),p115-9描述的方案。简而言之，将凝胶在室温下在40％EtOH/5％乙酸中固定过夜。然后，凝胶采用40％EtOH/5％乙酸中的0.7％高碘酸处理10分钟，然后采用ddH2O洗涤3次，每次15分钟。凝胶采用染色溶液(0.187N氢氧化钠、0.2N氢氧化铵、0.667％硝酸银)染色，并再次用ddH2O充分洗涤3次，每次10分钟。通过加入显影液(0.25mg/ml柠檬酸一水合物，0.0185％甲醛溶液)观察凝胶上的LPS。
采用抗APP2的LPS的兔血清开展免疫印迹，表明脂质A部分在约10kDa处有强染色，以及存在APP2 P1875菌株在～12.5和190kDa之间迁移的梯状条带(脂质A上的O-抗原聚合)(图8C泳道1)。对于SL1344和SL1344Δrfb(图8C，泳道2、3)、SL1344Δrfb rfaK-ΩClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL(图8C，泳道11)或E.coli_5和E.coli_5Δrfb(图8C，泳道13、14)，没有观察到兔血清的任何识别。在银染中，可以检测到SL1344(范围从10kDa到>115kDa)和E.coli_5(10kDa–15kDa)的LPS，其在SL1344Δrfb和E.coli_5Δrfb中消失，表明成功删除了内源性O-抗原生物合成(图8C泳道2、3、13、14)。APP2 rfb簇的整合导致在10和15kDa之间出现非常微弱的条带，这可能对应于连接单个O-抗原的脂质A(图8C，泳道4、15)。当APP2 O-抗原生物合成位于卡那霉素抗性盒下游时，该信号可能会得到增强(图8C，泳道5、16)。APP2 rfb簇的密码子优化与上游卡那霉素抗性盒结合进一步改善了APP2 O-抗原生物合成(图8C，泳道6、17)。特别是对于E.coli_5，这导致出现聚合的O-抗原链(梯状条带，图8C泳道17)。在银染色分析中也可以检测到较低分子量的梯状条带(图8B，泳道17)。在将gne或gne和wzy引入到SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS中后(图8C，泳道7、8)，观察到APP2 O-抗原表达逐步增加，出现较高分子量条带，这表明O-抗原在脂质A上聚合。gne和密码子优化的wzy在卡那霉素抗性盒下游(图8C，泳道9)或仅卡那霉素启动子下游(图8C，泳道10)表达密码子优化的APP2rfb簇的SL1344中的基因组表达，增加了O-抗原聚合和脂质A上的呈递量，即使在高分子量(>190kDa)处，也可以检测到聚糖结构。在这两种细胞系中，在银染色分析中也可以检测到低分子量条带(图8B，泳道9、10)。最终的糖工程化SL1344在细胞表面上另外呈递ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6(图8C，泳道12)，其APP2 O-抗原表达强度与其亲本菌株SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)相同。
1.7)整合由SL1344中kP启动子控制的密码子优化的APP8 O-抗原生物合成簇
为了证明所描述的异源O-抗原转移到宿主细菌中可以应用于各种O-抗原类型，将胸膜肺炎放线杆菌血清型8(APP8)菌株(MIDG2331)的rfb簇在基因组上整合到SL1344中，并测试脂质A上的APP8 O-抗原呈递。
对密码子优化的(对于大肠杆菌表达，已表明其对APP2 rfb簇与SL1344一样有效)包含APP8rfb簇的13598bp片段(图9，序列4)进行修饰，将其以内源性rfb簇的反义方向整合到到SL1344中。在APP8 rfb簇的上游，融合了氯霉素抗性盒，其两侧是FRT位点，之后是卡那霉素抗性盒的373bp启动子区域。该构建体的上游和下游侧翼是任一SL1344(包括反义方向的galF基因)的rfb簇侧翼的同源区域，SL1344侧翼是I-SceI限制性内切核酸酶识别位点(序列46，图10)。为了将由kP控制的密码子优化的APP8 rfb簇整合到SL1344中，(通过CRO)生成/合成了基于Lee et al.2009的pDOC系统的穿梭载体质粒pDOC_SL1344_Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)。
将穿梭载体质粒(pDOC_SL1344_Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)与辅助质粒pACBSCE一起转化到SL1344中。该程序按照上述和Lee et al.2019的描述进行。通过PCR验证最终菌株SL1344Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.)，并通过免疫印迹测试O-抗原表达(图11)。
在37℃振荡条件下，将野生型SL1344以及缺乏内源性O-抗原生物合成(SL1344Δrfb)或在kP启动子控制下表达密码子优化的APP8 rfb簇(SL1344Δrfb::cat-kP-APP8.LPS(cod.opt.))的遗传修饰细胞在LB培养基中生长至饱和(OD600>2)。收获细胞用于进一步处理。作为脂质A上APP8 O-抗原呈递的对照，将APP8(MIDG2331)和APP3(ORG1224)菌株在BHI+NAD中在37℃下缓慢振荡(110rpm)生长至静止期。收获细胞并用于进一步处理。为了开展APP8 O-抗原分析，将细胞重新悬浮在1x
Figure BDA0003942659990000191
缓冲液(1OD600个细胞/100μl 1x
Figure BDA0003942659990000192
缓冲液)中。将样品在95℃下孵育5分钟。每OD600等效细胞中加入12μg蛋白酶K(20mg/ml储备液，在10mM Tris-HCl，pH 7.5、20mM CaCl2、50％甘油中)，并将样品在60℃下孵育1小时。然后将蛋白酶K处理的样品(0.1OD600等效细胞)加载到4-12％Bis-Tris凝胶上，并在MES缓冲液中按大小分离分子。凝胶被进一步处理用于免疫印迹和银染色。为了通过免疫印迹分析LPS合成，将LPS从凝胶转移到PVDF膜上。将膜在封闭溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.1％酪蛋白)中在室温下振荡孵育2小时。然后，将膜在抗体结合溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.05％酪蛋白)中在4℃下振荡孵育过夜，所述抗体结合溶液含有1:500稀释的与APP3 LPS反应的猪血清。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤免疫印迹3次，每次5分钟。然后，将膜在抗体结合溶液中与以1:2000稀释的二级猪抗IgG-HRP(BETHYLCat#A100-105P)在室温下振荡孵育1小时。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤膜4次，每次5分钟。然后，通过将ECL溶液(GE Healthcare#RPN2105)添加到膜中，并记录用Stella 8300(Raytest)检测到的光信号来观察特异性抗体结合。对于银染色，采用Tsaiet al.1982,Anal.Biochem.,Vol.119(1),p115-9描述的方案。简而言之，将凝胶在室温下在40％EtOH/5％乙酸中固定过夜。然后，凝胶采用40％EtOH/5％乙酸中的0.7％高碘酸处理10分钟，然后采用ddH2O洗涤3次，每次15分钟。凝胶采用染色溶液(0.187N氢氧化钠、0.2N氢氧化铵、0.667％硝酸银)染色，并再次用ddH2O充分洗涤3次，每次10分钟。通过加入显影液(0.25mg/ml柠檬酸一水合物，0.0185％甲醛溶液)观察凝胶上的LPS。
由于APP3和APP8的O-抗原结构相同，因此使用了对血清型3具有反应性的兔血清(Perry et al.1990,Serodiagnosis and Immunotherapy in Infectious Disease,Vol.4(4),p299-308)。
采用抗APP3的LPS的兔血清开展免疫印迹，表明脂质A部分在约10kDa处有强染色，以及存在APP8和APP3菌株在～12.5和190kDa之间迁移的梯状条带(脂质A上的O-抗原聚合)(图11B泳道3、4)，证明猪血清与这两种血清型O-抗原都具有交叉反应性。对于SL1344和SL1344Δrfb，没有观察到兔血清的任何识别(图11B，泳道1、2)。在银染色中，可以检测到SL1344的LPS(范围从10kDa到>115kDa)，其在SL1344Δrfb中消失(图11A，泳道1、2)。kP启动子控制下的密码子优化APP8 rfb簇的整合导致在10和15kDa之间出现非常强的条带，这可能对应于连接单个O-抗原的脂质A(图11B，泳道5)。此外，可以检测到与APP3反应性猪血清反应的范围为15至190kD的微弱梯状条带，表明O-抗原聚合。
可以得出结论，异源APP8 rfb簇(密码子优化并在kP启动子的控制下)可以成功转移到异源宿主SL1344中，并导致APP8 O-抗原在脂质A上呈递。
实例2
2)克隆APP的Apx毒素的中和表位作为潜在的疫苗接种候选者
2.1)产生编码ApxII和ApxIII的可溶性中和表位的质粒
对于对APP感染有效的疫苗，人们认为，最终疫苗制剂中存在灭活毒素(Apx类毒素)。这些成孔的Apx毒素属于APP的主要毒力因子，确实非常有助于感染的发病机制(Bosséet al.2002,Microbes Infect.,Vol.4(2),p225-235)。四种已鉴定的Apx毒素(ApxI、II、III和IV)在apx操纵子中以其前毒素结构形式编码，所述操纵子还编码激活因子基因和分泌装置编码基因。这四种毒素在不同的APP血清型中以各种组合形式表达。APP血清型2编码用于ApxII、III和IV(Beck et al.1994,J.Clin.Microbiol.,Vol.32(11),p2749-2754)。此处生成了在大肠杆菌中表达的纯化ApxII和III的截短形式。在最近的出版物中，鉴定了可以诱导免疫反应的ApxII和III的中和表位，并且抵抗这些表位产生的抗体在体外具有保护性。Kim et al.2010描述了来自含有氨基酸439-801aa的APP2的N-端HIS10标记的截短ApxII。从数据库(GenBank:AF363362.1)中检索RTX毒素IIA(ApxII)的序列，合成并用于生成在pMLBAD载体pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa))上编码的截短HIS10标记的ApxII(439-801aa)(序列47)。从数据库(GenBank：AF363363.1)中检索到ApxIII的序列并用作合成模板。在之前的一项研究中，表明ApxIII的N-端结构域被恢复期猪的血清识别，具有细胞毒性中和活性并防止ApxIII诱导的体外中性粒细胞凋亡(Seah et al.2004,Vaccine,Vol.22(11-12),p1494-1497)。ApxIII的N-端结构域(氨基酸27-245)采用C-端HIS10标签(序列48)合成，并用作模板，通过在PCR反应中使用引物5'XmaI-XhoI-APXIIIne-HIS-fw/3'APXIIIne-HIS-HindIII-rv，引入起始密码子和5'XmaI/3'HindIII限制性内切核酸酶切割位点。所得片段采用相应的酶消化并连接到经XmaI/HindIII处理的pMLBAD载体(pMLBAD-ApxIII(27-245aa)-HIS9)中；在克隆过程中一个HIS表位丢失。两种质粒都被引入到大肠杆菌BL21中，用于猪疫苗试验的蛋白质表达测试和纯化。为了纯化化HIS10-ApxII(439-801aa)，将在37℃下在LB+Tmp(10μg/ml)中振荡培养的BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)过夜培养物在1L LB+Tmp中稀释至0.1OD600，并在37℃下振荡培养，直到OD600是大约0.8–0.9。添加阿拉伯糖(0.2％终浓度)以诱导蛋白质表达。将细胞在37℃的振荡器上再孵育4小时，然后通过离心(5000x g/4℃/10分钟并弃去上清液)收获。为了细胞裂解，加入1xPBS中的20ml 0.1mg/ml溶菌酶。将细胞通过超声-冻融循环破碎。简而言之，以85％的振幅对细胞颗粒进行超声处理，在液氮中冷冻1分钟，并在37℃下解冻10分钟(振荡)。重复此程序3次。将细胞悬液在4℃下以10000x g离心5分钟。注意到在前面描述的过程中，HIS10-ApxII(439-801aa)聚集，导致在离心后在沉淀部分中发现蛋白质。将大约20ml变性缓冲液(6M盐酸胍，0.1M TrisHCl pH 8.0)添加到沉淀中，并在4℃下以10000x g再次离心所述材料20分钟。将4ml平衡的Nickel-NTA树脂添加到上清液中，并将材料在4℃的旋转轮上孵育1小时。然后将悬浮液加载到重力流动柱上。将树脂用10ml 1x PBS洗涤3次，蛋白质用含0.5M咪唑的1ml变性缓冲液洗脱5次。为了分析收集的材料，将60μl每个洗脱级分与20μl 4x
Figure BDA0003942659990000201
缓冲液混合。将样品在95℃下煮5分钟，然后将10μl样品加载到4-12％Bis-Tris凝胶上，并在MES缓冲液中按大小分离分子。凝胶进一步处理用于考马斯染色(图12A)和使用HIS特异性抗体进行免疫印迹测定(图12B)。对于考马斯染色，在凝胶上覆盖考马斯染色溶液(3mM考马斯亮蓝R 250、40％乙醇、10％乙酸)，并在室温下振荡过夜。将凝胶反复置于考马斯脱色溶液(30％乙醇，10％乙酸)中，直到观察到期望的凝胶脱色和蛋白质染色。为了通过免疫印迹检测纯化的HIS10-ApxII(439-801aa)，将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。将膜在封闭溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.1％酪蛋白)中在室温下振荡孵育2小时。然后，将膜在抗体结合溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.05％酪蛋白)中在4℃下振荡孵育过夜，所述抗体结合溶液含有1:2000稀释的Tetra-HIS抗体(Qiagen#34670)。采用过量的PBS0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤所述膜3次，每次5分钟。然后，将膜在抗体结合溶液中与以1:2000稀释的二级山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(BETHYL Cat#A90-116P)在室温下振荡孵育1小时。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤膜4次，每次5分钟。然后，通过将ECL溶液(GE Healthcare#RPN2105)添加到膜中，并记录用Stella 8300(Raytest)检测到的光信号来观察特异性抗体结合。
使用蛋白质表达和纯化的方法，HIS10-ApxII(439-801aa)可以通过与Nickel-NTA树脂结合并使用重力流洗脱来大量纯化(图12)。我们发现，洗脱级分3-5中蛋白质含量最高。除了大约41kDa的纯化HIS10-ApxII(439-801aa)之外，可以检测到分子量更高和更低的某些杂质(图12A)，这些杂质也被HIS抗体识别(图12B)。通过该实验，可以表明截短的HIS10-ApxII(439-801aa)的成功表达和纯化。
为了纯化ApxIII(27-245aa)-HIS9，将在37℃下在TB+Tmp(10μg/ml)中振荡培养的BL21pMLBAD-ApxIII(27-245aa)-HIS9的过夜培养物在1L TB+Tmp中稀释至0.1OD600，并在37℃下振荡孵育，直到OD600是大约0.6–0.8。添加阿拉伯糖(0.2％终浓度)以诱导蛋白质表达。将细胞在振荡器上在37℃下再孵育4小时，然后通过离心收获。按照描述HIS10-ApxII(439-801aa)时的类似程序进行。简而言之，细胞裂解在最终体积为70ml(30mM Tris HCl pH7.5、300mM NaCl、20％蔗糖、1mM EDTA、1g/l溶菌酶、1x蛋白酶抑制剂混合物)中进行。通过3轮超声-冻融循环裂解细胞(如上所述)。将细胞悬浮液在4℃下以5525x g离心15分钟。将上清液在4℃下以20000xg再次离心1小时。将在结合缓冲液(30mM Tris HCl pH 7.5，300mMNaCl)中平衡的0.3ml Nickel-NTA树脂添加到上清液中，并将材料在4℃的旋转轮上孵育1小时。然后，将悬浮液加载到重力流动柱上。树脂采用3ml结合缓冲液洗涤2次，采用3ml洗涤缓冲液(30mM Tris HCl pH 7.5、300mM NaCl、10mM咪唑)洗涤1次。添加4次0.3ml洗脱缓冲液1(30mM Tris HCl pH 7.5、300mM NaCl、200mM咪唑)、2次0.5ml洗脱缓冲液2(30mM TrisHCl pH 7.5、300mM NaCl、500mM咪唑)和3次0.5ml洗脱缓冲液3(30mM Tris HCl pH 7.5、300mM NaCl、1M咪唑)进行洗脱。为了分析细胞制备和蛋白质纯化，通过针对HIS表位的免疫印迹和考马斯染色测试所有级分，并决定合并洗脱级分4-8，并通过在PBS中透析交换缓冲液。分析合并和透析的样品，将60μl材料与20μl 4x
Figure BDA0003942659990000211
缓冲液混合。将样品在95℃下煮5分钟，然后将10μl样品加载到4-12％Bis-Tris凝胶上，并在MES缓冲液中按大小分离分子。按照如上所述开展使用HIS特异性抗体的免疫印迹和考马斯染色(图13)。在25kDa附近鉴定出HIS特异性信号，与ApxIII(27-245aa)-HIS9(图13B)的计算分子量一致，这也可以在考马斯染色凝胶上检测到(图13A)。还可以检测到一些分子量更低和更高的杂质。证明了截短的ApxIII(27-245aa)-HIS9的成功表达和纯化(图10)。
2.2)ApxI、II和III的中和表位的基因组整合作为融合构建体，所述构建体在表达APP2 O-抗原的大肠杆菌_5或SL1344的细胞表面上表达
为了产生在其表面呈递APP2 LPS和Apx毒素的中和表位的活沙门氏菌疫苗株，在基因组上整合相应基因以产生中和表位的表面呈递。Xu et al.2018,PlosOne,Vol.13(1)描述了由ClyA组成的融合构建体，ClyA是一种在细胞表面表达的成孔溶血蛋白，它诱导与具有C-端HIS6标签的截短的ApxI(628-845aa)、截短的ApxII(612-801aa)和截短的ApxIII(626-860aa)相关的特异性免疫反应。在小鼠的疫苗接种和攻击研究中，该组显示免疫球蛋白和细胞因子水平升高，以及在用不同的APP血清型攻击后存活率增加。构建体的序列是公开的，并进行如下修饰。使用合成公司提供的算法，优化了ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6的密码子使用用于大肠杆菌表达系统。为了强转录率，在起始密码子之前整合了合成启动子proD的序列(Davis et al.2010,Nucleic acidsresearch,Vol.39(3),p1121-1141)。为了选择成功整合到基因组中，在整合构建体的终止密码子之后，加入侧翼是FRT位点的氯霉素抗性盒(cat)(基于pKD3；Datsenko et al.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645)。为了同源整合到基因组中，在构建体的上游和下游，选择与基因间rfaK-rfaL区域同源的序列(在氯霉素抗性盒后250bp后，添加proD启动子的213bp5'端)。完整的合成构建体在图14(序列49)中示意性地表示。为了将融合构建体proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/cat整合到SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)中，使用寡核苷酸FW_pliCint/REV_pagCint通过PCR改变序列32的侧翼区域，然后采用寡核苷酸eloFW_pliCint/eloREV_pagCint延长5'端和3'端。该程序建立了SL1344中pliC下游区域的83bp同源区域，及SL1344中pagC下游区域的87bp同源区域。通过这种修饰，融合构建体proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/cat可以整合到pliC和pagC之间的基因间区域中。最终构建体与编码γ-重组系统的温度敏感辅助质粒pKD46(Datsenko etal.2000,PNAS,Vol.97(12),p6640-6645)一起转化为SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)。λ-重组系统识别各个基因组位点的同源侧翼区域，并将融合构建体proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/cat重组到前面提到的整合位点(SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-cat/pagC)中。为了生成缺乏APP2 rfb簇但表达proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6融合构建体的对照菌株，使用寡核苷酸FW-rfaK_rfaL/REV_rfaL_rfaK扩增序列32，生成一个4513bp片段，该片段包含具有侧翼同源区域的整合构建体，用于在SL1344的rfaK和rfaL之间的基因间区域整合。该片段与pKD46一起转化到SL1344Δrfb中，按照上述程序进行。将构建体proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/cat整合到基因rfaK和rfaL的基因间区域(SL1344Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL/cat)中。在这两种菌株中引入的抗生素抗性盒允许选择阳性克隆(成功整合)。这些阳性候选物通过PCR验证了PCR片段的整合。通过增加几轮孵育的生长温度，温度敏感的辅助质粒从细胞中丢失。为了去除氯霉素抗性盒，将产生的菌株SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩproDClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-cat/pagC和SL1344Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-cat/rfaL采用编码用于识别回文FRT位点的翻转酶的温度敏感质粒pCP20转化(Cherepanov et al.1995,Gene,Vol.158,p9-14)。在“翻转”事件之后，基因组中只剩下一个FRT。再一次，随着培养温度升高，阳性克隆被反向选择，而不是选择翻转酶编码质粒。最后的PCR验证了所有辅助质粒的缺失、氯霉素抗性标记的缺失以及proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6的整合。分析所得菌株SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC和SL1344Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL的APP2 O-抗原生成以及ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6表达。为了验证ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6、SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)和SL1344Δrfb的表达，通过免疫印迹和考马斯染色分析全细胞提取物。
将野生型SL1344、缺乏内源性O抗原生物合成的遗传修饰细胞(SL1344Δrfb)、表达APP2 rfb簇(SL1344Δrfb::APP2.LPS、Δrfb::KanR-APP2.LPS、Δrfb::KanR-APP2.LPS(cod.opt.)、Δrfb::KanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne/cat、Δrfb::KanR-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat、Δrfb::KanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat、Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)的细胞或具有或不具有表达ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC(SL1344Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL、Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC)的改进的整合APP2 rfb簇的细胞的过夜培养物在LB培养基中稀释至OD600/ml是0.05，并在振荡器上在37℃下培养至对数生长期(OD600～1)。此外，将APP2 P1875菌株在BHI+NAD中在37℃下缓慢振荡(110rpm)生长至静止期。收获SL1344衍生物和APP2细胞，并在95℃下在1x
Figure BDA0003942659990000221
(1OD600等效细胞/100μl 1x
Figure BDA0003942659990000222
)中煮5分钟。将0.1OD600等效细胞加载到4-12％Bis-Tris凝胶上。作为对照，将1x
Figure BDA0003942659990000223
中纯化的2.5μg HIS10-APXII(439-801aa)和5μgAPXIII(27-245aa)-HIS9加载到凝胶上。蛋白质和全细胞提取物在MOPS缓冲液中按大小分离(图15A中的加载方案)。凝胶进一步处理用于考马斯染色(图15B)和开展免疫印迹以检测HIS表位(图15C)。对于考马斯染色，在凝胶上覆盖考马斯染色溶液(3mM考马斯亮蓝R 250、40％乙醇、10％乙酸)，并在室温下振荡培养过夜。将凝胶反复置于考马斯脱色溶液(30％乙醇，10％乙酸)中，直到观察到期望的凝胶脱色和蛋白质染色。为了通过免疫印迹检测ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6、HIS10-APXII(439-801aa)和APXIII(27-245aa)-HIS9，将蛋白质从凝胶转移到PVDF膜上。将膜在封闭溶液(PBSpH 7.5/0.05％Tween/0.1％酪蛋白)中在室温下振荡孵育2小时。然后，将膜在抗体结合溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.05％酪蛋白)中在4℃下振荡孵育过夜，所述抗体结合溶液含有1:2000稀释的Tetra-HIS抗体(Qiagen#34670)。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤免疫印迹3次，每次5分钟。然后，将膜在抗体结合溶液中与以1:2000稀释的二级山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(BETHYL Cat#A90-116P)在室温下振荡孵育1小时。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤膜4次，每次5分钟。然后通过向膜中添加ECL溶液(GEHealthcare#RPN2105)，并记录用Stella 8300(Raytest)检测到的光信号来观察特异性抗体结合。当在考马斯染色凝胶上比较SL1344及其衍生物时，除了SL1344Δrfb::Kan-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(可能加载错误，图15B，泳道10)之外，加载相同数量的等效细胞(图15B，泳道4-14)。APP2全细胞提取物的考马斯分析显示，总体蛋白质染色更少，这也与SL1344细胞不同。纯化HIS10-APXII(439-801aa)在约50kDa的条带被视为弱条带(图15B，泳道1)，其在免疫印迹分析中被使用的HIS抗体识别(图15C，泳道1)。此外，APXIII(27-245aa)-HIS9在大约25kDa时可检测到(图15B，泳道2)。在HIS免疫印迹中，监测到这种蛋白质出现高强度的信号(图15C，泳道2)。表达ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6的细胞(图15C，泳道13、14)在HIS免疫印迹中在高于115kDa处显示存在信号，其高于大约104kDa的计算分子量。这可能是由于SDS-PAGE参数导致该跨膜蛋白的运行条带发生变化。此外，检测到低于115kDa的其它条带，这可能是由于融合构建体的蛋白水解切割引起的。在缺乏融合构建体的所有其他测试对照细胞中不存在检测到的这些信号。
实例3-临床研究
3.1)用呈递重组APP2 O-抗原和灭活APP2细菌的灭活疫苗株对小猪开展免疫研究
第一次免疫试验的目的是测试采用编码APP2 rfb簇的灭活大肠杆菌_5和SL1344对猪进行鼻内/口服或肌内免疫后APP2 LPS的安全性和免疫原性(试验设计见表6)。
细菌全细胞疫苗制备如下：第1组和第6组含有SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPSpMLBAD-gne pEC415-wzy，其中在制备免疫菌株之前，需要诱导wzy和gne表达(这两个基因都由阿拉伯糖诱导型启动子控制)。因此，细胞在LB中与相应的抗生素(参见表2)和0.01％阿拉伯糖一起在37℃、180rpm条件下振荡培养，直到OD600约为0.6。采用0.1％阿拉伯糖诱导细胞。孵育6小时后，收获细胞并重悬于PBS缓冲液中。在这些细胞悬液中，测定OD600(1OD600对应4.1x 10E8 cfu)。第4组和第8组的细胞由SL1344Δrfb和E.coli_5Δrfb组成，在单独的免疫接种中它们以1:1混合物的形式使用。将这些细胞在LB培养基中培养，直到培养物达到OD600高于2，收获细胞。将APP血清型2细胞(第5组和第9组)在BHI+NAD中在37℃下缓慢振荡培养至静止期，收获细胞并重悬于PBS缓冲液中。测定细胞悬液的OD600。由于培养条件，OD600换算为cfu的换算率与上述不同(对于APP2，1OD600对应4.1x 10E5 cfu)。糖工程化SL1344以及SL1344Δrfb、E.coli_5Δrfb和APP2细胞(PBS缓冲液中)通过在80℃下以600rpm振荡孵育材料90分钟进行热灭活。在施用该材料之前，对细胞进行完全灭活测试。
基于蛋白质的材料制备如下：通过Ni-NTA琼脂糖结合和FPLC上的咪唑洗脱，从大肠杆菌(BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa))中表达和纯化来自APP2(439-801aa)的ApxII的N-端HIS10标记的中和表位。纯化的蛋白质在PBS中透析。测定蛋白质浓度。
为了制备用于鼻内和口服免疫的材料(第1-5组)，每只动物每次免疫制备2剂，每剂1ml。每剂含PBS中的10E11 cfu细胞(第1、4组)或10E8 cfu(第5组)细胞、400μg HIS10-ApxII(439-801aa)(第2组)或仅PBS(第3组)，并根据供应商信息，与Montanide IMS1313(Seppic)混合，使浓度达到25％。
对于肌内免疫，每只动物制备0.5ml总体积。每剂含0.375ml灭活细胞(第6组、第8组，PBS中含10E8 cfu细胞，第9组，PBS中含10E5 cfu细胞)或400μg HIS10-ApxII(439-801aa)(第7组)及0.125ml Montanide ISA 25(Seppic)，以使佐剂最终浓度达到25％。根据供应商的建议将混合物混匀。第10组是佐剂对照(0.375ml PBS缓冲液与0.125mlMontanide ISA 25混合并混匀)，第11组作为未处理的对照组，未接受任何抗原。
表6提供了免疫组1-11的概述，其中施用了灭活细胞、蛋白质、仅佐剂或未施用任何东西，施用途径是鼻内和口服或肌内施用。给出了抗原数量和剂量体积。对于鼻内和口服疫苗接种，准备向每个鼻孔(每个鼻孔0.5ml)和口服(1ml)进行3次施用。
表6
Figure BDA0003942659990000241
在该研究中，使用研究日(SD)0时大约4周龄的断奶商业品种猪(瑞士兰德瑞斯猪x大白猪)。这些猪来自经证实的无APP饲养，在SD-7采用ELISA分析表明，所有动物的APP抗体均为阴性。每组(随机)三只动物在SD 0和SD 14免疫接种两次(图16)。
使用带有3ml注射器(Teleflex)的MAD鼻、鼻内、粘膜雾化装置MAD 100进行鼻内给药。对于每只动物，两个注射器/MAD装置分别填充1ml空气和0.5ml相关抗原/佐剂混合物。每头猪每个鼻孔接受0.5ml。
使用带有3ml注射器(Teleflex)的MAD鼻、鼻内、粘膜雾化装置100OS进行口服给药。对于每只动物，一个注射器/MAD装置填充1ml空气和1ml相关抗原/佐剂混合物。将材料施用于扁桃体上。
对于肌内给药，每只动物通过肌内注射到颈部右侧接受0.5ml的抗原/佐剂混合物。
每周取血，分离血清，并至少每天检查动物的临床症状。与未处理的对照相比，在肌内注射佐剂以及含有佐剂的疫苗后，直肠温度在4到10小时内短暂升高至41.0℃，这表明体温对佐剂的反应是非特异性升高。
在SD28实施安乐死后，移除肺，并收集BALF(支气管肺泡灌洗液)。对于每组肺，将500ml体积的PBS冲洗到气管中，将肺轻轻颠倒5到10秒，然后回收液体。
通过ELISA分析血清和BALF中对LPS的IgG和IgA反应。将用于血清分析的APP2和7以及用于BALF分析的APP1、2、5a和7的苯酚/氯仿提取的LPS(按照iNtRON Biotechnology#17141的说明手册，每个反应处理10OD600细菌)包被在MaxiSorb 96孔板中(100μl包被缓冲液(PBS缓冲液pH 7.5)中包被0.05OD600等效细菌/孔)。将孔板在4℃在振荡器上培养过夜。每孔用200μl洗涤液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.05％酪蛋白)洗涤孔板一次，每孔加入150μl封闭缓冲液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.1％酪蛋白)。将孔板在室温下振荡孵育1小时。除去封闭缓冲液，加入以1:500稀释(在洗涤液中)的SD 0(免疫前)和SD 28(第2次免疫后2周/安乐死日期)的猪血清。加入以1:2稀释(在洗涤液中)的SD 28的BALF。孵育1小时后，在室温下振荡，将孔板用每孔200μl洗涤液洗涤3次，加入以洗涤液1:1000稀释的二级猪抗IgG HRP抗体(BETHYL Cat#A100-105P)(用于血清)或猪抗IgA HRP抗体(BETHYL Cat#A100-102P)(用于BALF)(每孔总计100μl)。在室温下在振荡器上孵育1小时后，将孔板采用每孔200μl洗涤液洗涤4次。通过每孔加入110μl显影液来完成板的显影(每板将1.5mg 3,3',5,5'-四甲基联苯胺二盐酸盐溶解在1.5ml100％DMSO中，然后加入13.5ml 0.05M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液；在使用前加入2μl新鲜的30％H2O2)。观察到适当的显色后，加入110μl终止试剂BioFX终止反应。使用Tecan Infinite M Nano酶标仪在450nm处测量吸光度。
为了分析对ApxII的免疫反应，使用在BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)中表达的纯化的N-端HIS10标记的ApxII中和表位及从大肠杆菌中纯化的纯化AcrA-HIS6蛋白(HIS6标记的空肠弯曲菌，用作阴性对照)。在96孔板(TPP,92096)中每孔包被500ng每种蛋白质(在100μl包被缓冲液中)，并探测猪血清和BALF。程序按照如上所述进行。为了采用ELISA检测特异性ApxII抗体产生情况，测试了第2组和第7组的所有动物、第3组和第10组的两只动物以及第11组的一只动物。
血清IgG分析(图17)表明，在采用热灭活的APP2免疫的动物(粘膜和肌内免疫的动物，第5组和第9组)和采用糖工程化SL1344(SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gnepEC415-wzy，粘膜和肌内免疫动物，第1组和第6组)免疫的猪中，均在SD 28时表现出特异性抗APP2 LPS反应。在SD 0免疫前未检测到IgG反应。接受SL1344Δrfb和E.coli_5Δrfb(第4组、第8组)、佐剂(第3组、第10组)或阴性对照(第11组)的动物血清中的IgG水平处于所执行ELISA的背景水平。
为了分析对APP2 LPS的IgA反应，使用1:2稀释的BALF。采用SL1344Δrfb和E.coli_5Δrfb免疫的对照组、佐剂对照组和未免疫组都显示出较高的背景水平(图18)。此外，在所有动物中检测到对APP1、APP5和APP7 LPS的交叉反应性。在所有采用灭活的APP2免疫的动物中，无论是通过粘膜还是肌内途径，对APP2的反应都明显超过对APP1、5和7的反应，表明对APP2 LPS具有特异性IgA反应。当分析第1组和第6组时(应用糖工程化的SL1344-SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gnepEC415-wzy)，似乎粘膜免疫的动物对APP2 LPS的IgA滴度高于肌内免疫的动物。此外，一只动物(猪5062)对所有4种测试的APP LPS血清型都显示出类似的识别水平。
采用纯化的HIS10-ApxII(439-801aa)(图19)免疫的动物在肌内注射后，在SD 28时ApxII的血清IgG升高，但在粘膜免疫后未出现这种情况。
在采用纯化的HIS10-ApxII(439-801aa)免疫的猪的BALF中未检测到ApxII的特异性IgA。动物5136也显示出AcrA-HIS6的BALF IgA升高，这表明产生HIS抗体而不是ApxII的抗体(修饰蛋白AcrA和ApxII只有HIS标签相同，没有其它同源性)。此外，对照组的动物(佐剂和非免疫对照组)非特异性识别HIS10-ApxII(429-801aa)和AcrA-HIS6。
总之，灭活抗原在猪中是安全的。观察到的体温瞬时升高很可能主要归因于佐剂反应。糖工程化SL1344(SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pMLBAD-gne pEC415-wzy)具有免疫原性，在所有6头猪中都可检测到APP2 LPS的特异性血清IgG反应，在6头猪中的4头中发现APP2 LPS的特异性IgA。采用纯化的HIS10-ApxII(439-801aa)进行免疫后，肌内免疫猪的血清中开始形成特异性IgG(在粘膜免疫后未出现这种情况)。在BALF中未检测到ApxII的特异性IgA。
3.2)在仔猪中使用改进的重组APP活疫苗株进行免疫研究
在第二次免疫试验中，在猪中测试了其中细胞表面APP2 O-抗原呈递改善的编码APP2 rfb簇的活SL1344的安全性和免疫原性(试验设计见表7)。第1组使用SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat，第2组是未处理的对照(未使用任何抗原)。
在该实验中，活细菌制备如下。将细菌在37℃下在LB培养基中振荡培养，直到培养物达到OD600高于2，收获细胞。测定OD600，估计cfu/ml(1OD600等于4.1x 10E8 cfu)。采用无菌PBS洗涤细胞，并重悬于PBS中至细胞浓度为1x 10E8 cfu/ml。将细胞保持在冰上直到向动物施用。
表7概述了施用活细胞(鼻内和口服)的免疫组1或未处理的对照组2。给出了抗原数量和剂量体积。对于鼻内和口服疫苗接种，准备了2次施用(2次，每次1ml)，并施用于每个鼻孔(每个鼻孔0.5ml)和口服(1ml)。
表7
Figure BDA0003942659990000251
n.a.–未施用
在这项研究中，采用SD 0时大约4-5周龄的Danebreed(兰德瑞斯猪和大白猪的商业杂交品种)杜洛克公猪。每组6只动物(随机)在SD 0和SD 14时免疫两次(图20)。这些猪来自经证实的无APP饲养，在SD-7采用ELISA分析表明，所有动物的APP抗体均为阴性。使用带有3ml注射器(Teleflex)的MAD鼻、鼻内、粘膜雾化装置MAD 100进行鼻内活细菌PBS溶液给药。对于每只动物，两个注射器/MAD装置分别填充1ml空气和0.5ml相关活细胞/PBS混合物。每头猪每个鼻孔接受0.5ml。使用带有3ml注射器(Teleflex)的MAD鼻、鼻内、粘膜雾化装置100OS进行口服给药。对于每只动物，一个注射器/MAD装置填充1ml空气和1ml相关活细胞/PBS混合物。将材料施用于扁桃体。每周取血，分离血清并检查动物的临床症状。
在SD 28实施安乐死后，移除肺，并收集BALF。对于每组肺，将500ml体积的PBS冲洗到气管中，将肺轻轻颠倒5到10秒，然后回收液体(BALF)。安乐死后检测免疫菌株的持久性。从第1组和第2组中每只动物的扁桃体、肺(左右膈叶)和气管支气管淋巴结收集拭子样品。将每个拭子在含有卡那霉素的无菌LB琼脂板上无菌划线，并在37℃下孵育16至24小时。
在整个研究过程中，所有动物都保持良好的健康状况。在任何动物中均未观察到异常的临床体征。尸检后，未观察到肺部异常。在任何动物的肺中均未发现病变或其他病状。
从第1组的两只动物中回收细菌菌落。一只动物(编号341609)从扁桃体中总共回收了366个菌落，但其他组织没有。第二只动物(编号341618)的扁桃体和气管支气管淋巴结有一个菌落，但其他组织没有。未免疫对照组的动物中没有分离出细菌。
通过免疫印迹分析血清和BALF对APP2 LPS的免疫反应。将APP2 P1875菌株在BHI+NAD中在37℃下缓慢振荡(110rpm)生长至静止期。收获细胞并用于进一步处理。为了开展APP2 O-抗原分析，将细胞重新悬浮在1x
Figure BDA0003942659990000262
缓冲液(1OD600个细胞/100μl 1x
Figure BDA0003942659990000263
缓冲液)中。将样品在95℃下孵育5分钟。每OD600等效细胞加入12μg蛋白酶K(20mg/ml储备液，在10mM Tris-HCl，pH 7.5、20mM CaCl2、50％甘油中)，并将样品在60℃下孵育1小时。然后将蛋白酶K处理的样品(0.1OD600等效细胞)加载到4-12％Bis-Tris凝胶上，并在MES缓冲液中按大小分离分子。凝胶被进一步处理用于免疫印迹。将LPS从凝胶转移到PVDF膜上。将膜在封闭溶液(PBS pH7.5/0.05％Tween/0.1％酪蛋白)中在室温下振荡孵育2小时。然后，将膜在4℃下在抗体结合溶液(PBS pH 7.5/0.05％Tween/0.05％酪蛋白)中振荡培养过夜，所述抗体结合溶液含有采用SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat免疫的第1组6只动物和第2组2只动物(未处理的对照)在SD0和SD28时以1:500稀释的猪血清及在SD 28时以1:2稀释的BALF。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH7.5)洗涤免疫印迹3次，每次5分钟。然后，将膜在抗体结合溶液中与以1:2000稀释的二级猪抗IgG-HRP抗体(BETHYL Cat#A100-105P)或猪抗-IgA-HRP(BETHYL Cat#A100-102P)在室温下振荡孵育1小时。采用过量的PBS 0.05％Tween缓冲液(pH 7.5)洗涤所述膜4次，每次5分钟。然后，通过将ECL溶液(GE Healthcare#RPN2105)添加到膜中，并记录用Stella 8300(Raytest)检测到的光信号来观察特异性抗体结合。
表8
Figure BDA0003942659990000261
评估对APP2 LPS的特异性免疫反应(表8)，结果表明，采用活SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(第1组)免疫的6只动物中，6只在SD28时血清IgG明确识别APP2 LPS，在SD 0时不存在这种识别。第2组的2只测试动物(未处理的对照)未显示特异性对APP2 LPS的血清IgG的任何明显增加。
分析BALF中APP LPS的IgA，结果表明，第1组6只动物中有5只对APP2 O-抗原的特异性识别升高。未经处理的对照组1的两只测试动物均未显示针对APP2的IgA反应。
总之，活的糖工程化SL1344是安全的，并且在2头安乐死后的猪中可以确认定植。此外，重组APP2 O-抗原具有免疫原性，可诱导全身IgG和粘膜IgA反应。
3.3)糖工程化APP候选疫苗对仔猪APP血清型2的功效
本研究的目的是考察采用开发的表面展示APP2 O-抗原的糖工程化SL1344疫苗株对猪进行免疫预防APP2感染的功效(分组情况概述见表9)。
疫苗株SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat用作活疫苗(第1组)，第二种菌株(具有诱导的wzy和gne表达的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne)用作灭活疫苗(第2组)。两者都与ApxII和III的中和表位组合施用。通过口服和鼻内途径施用疫苗，Apx毒素的中和表位在SD 0和SD 21肌内施用(图21)。将这些组与接种灭活APP2并联合注射2种Apx中和表位(第3组)、仅Apx中和表位(第4组)或未接种疫苗的动物(第5组)进行比较。在SD 42采用感染剂量的APP血清型2(HK 361,NCTC 10976)攻击猪，并在SD 48时实施安乐死。定期监测动物的临床症状(在攻击后的6天内至少每天监测两次)，并每天进行一次或两次直肠温度测量。通过位于皮下的温度探头，在50％的动物中使用体温的在线遥测测量(Body Cap的AniPill)。
在该实验中，细菌和蛋白质制备如下。为了制备SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat用于活疫苗接种(第1组)，在37℃下将细胞接种在LB培养基中振荡培养大约24小时。在疫苗接种当天，将生长至静止期(OD600>2)的细菌培养物在冰上冷却约10分钟。将培养物在4℃以4100x g离心15分钟。将沉淀的细胞小心地重新悬浮在无菌预冷的PBS缓冲液中。将悬浮液在4℃以4100x g再次离心15分钟，去除上清液，并将所得细胞沉淀重悬于预冷的PBS中。测定600nm(OD600)处的光密度(1OD600对应于4.1x 10E8 cfu)。施用于猪的每剂疫苗在1ml体积中含有1x 10E8 cfu。
为了制备用于灭活和疫苗接种的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzypMLBAD-gne(第2组)，将细胞接种在LB培养基中，在37℃振荡过夜。第二天，测定OD600，将细胞在补充Amp、Tmp和0.01％阿拉伯糖的LB培养基中稀释至0.075OD600/ml。将培养物在37℃下振荡孵育。在OD600为0.6的情况下，添加阿拉伯糖至最终浓度为0.1％，以诱导质粒编码蛋白(gne和wzy)的表达。将培养物进一步在37℃下振荡孵育。再一次，在6小时后，添加阿拉伯糖至最终浓度为0.1％。将培养物进一步在37℃下振荡孵育10-12小时。第二天测定OD600，并将培养物在4℃下以7,000xg离心10分钟。去除上清液，然后采用PBS小心地重悬沉淀的细胞。测定OD600的光密度(1OD600对应于4.1x 10E8 cfu)。为了开展热灭活，将细胞悬浮液在水浴中在80℃下孵育90分钟。然后，将悬浮液冷冻，并储存在-80℃，直到接种疫苗当天。在施用该材料之前，对细胞进行完全灭活测试。
基于蛋白质的疫苗制备如下。通过Ni-NTA琼脂糖结合和FPLC上的咪唑洗脱，从大肠杆菌(BL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa))中表达和纯化ApxII(439-801aa)的N-端HIS10-标记的中和表位(第1-4组)。纯化的蛋白质在PBS中透析。测定蛋白质浓度。通过Ni-NTA琼脂糖结合和咪唑洗脱，从大肠杆菌(BL21 pMLBAD-APXIII(27-245aa)-HIS9)中表达和纯化ApxIII(27-245aa)的C-端HIS9标记的中和表位(第1-4组)。纯化的蛋白质在PBS中透析。测定蛋白质浓度。
为了制备用于鼻内和口服施用的活疫苗(第1组)，每只动物制备2剂，每剂1ml。施用的每剂疫苗在1ml体积中含有1x 10E8 cfu。
为了制备用于鼻内和口服免疫的灭活疫苗(第2组和第3组)，每只动物制备2剂，每剂1ml。每剂在PBS中含10E11(第2组)和10E8(第3组)cfu，并根据供应商信息与佐剂Montanide IMS1313(Seppic)混合达到25％的浓度。
对于HIS10-APXII(439-801aa)和APXIII(27-245aa)-HIS9(第1-3组)的肌内免疫，每个抗原和每只动物制备0.5ml总体积。每剂含0.375ml 400μg蛋白抗原和0.125mlMontanide ISA28(Seppic)，以达到25％的最终浓度。根据供应商的建议将混合物混匀。第4组是未处理的对照(未施用抗原)。
攻击材料制备如下。在攻击感染前两天，将APP2菌株HK361在HIS+V培养板上培养，并在37℃和5％CO2下培养过夜。第二天，将一个菌落转移到10个新的HIS+V培养板中，培养6小时，制备培养物。然后，将每个板的所有菌落转移到装有PBS的试管中，并在冰箱中储存过夜。通过在HIS+V培养板上稀释和铺板细胞来测定cfu细胞/PBS溶液。第二天早上测定cfu，稀释溶液，获得10E6 cfu/ml的攻击浓度。
表9
Figure BDA0003942659990000281
a第1组的一头猪在研究开始前在适应阶段(第-5天)很可能因突发性心力衰竭而意外死亡。b第2组的一头猪在SD 5意外死亡。这头猪在先前没有疾病迹象的情况下死亡。这很可能与疫苗接种无关。在第1组的猪中发现了类似的情况，该猪在第一次疫苗接种之前死亡。
在该研究中，使用大约5周龄的商业品种猪(荷兰托佩克种猪公司，TN70，Z-系)。这些猪来自经证实的无APP饲养，在SD-7采用ELISA分析表明，所有动物的APP抗体均为阴性。每组7-8只动物(随机)以3周的间隔接种2次(SD 0、SD 21；图21)。第1组和第2组每组仅包含7只动物，因为其中两只动物在研究开始前(第1组)或在SD 5(第2组)死亡，尸检时没有任何可检测出的病变。
使用带有3ml注射器(Teleflex)的MADgic喉气管、粘膜雾化装置MAD 600进行鼻内给药。对于每只动物，两个注射器/MAD装置分别填充1ml空气和0.5ml相关抗原/佐剂混合物。每头猪每个鼻孔接受0.5ml。
使用带有3ml注射器(Teleflex)的MAD鼻、鼻内、粘膜雾化装置100OS进行口服给药。对于每只动物，一个注射器/MAD装置填充1ml空气和1ml相关抗原/佐剂混合物。将材料施用于扁桃体上。
对于肌内给药，每只动物通过肌内注射到颈部接受0.5ml的每种抗原/佐剂混合物。
在第42天，通过MAD NasalTM鼻内、粘膜雾化装置
Figure BDA0003942659990000282
采用2ml含10E6cfu/ml的APP2菌株HK361鼻内接种进行攻击。
在SD-6、7、14、21、28、35、41和48(图21)取血，分离血清，并检查动物的临床症状。
在SD 48，动物被安乐死，并进行尸检。根据Hannan et al.1982,Res.Vet.Sci.,Vol.33(1),p76-88，对肺部和胸膜的病变进行评分。评分基于每个肺叶(7个位置)受典型APP病变影响的百分数(表10)。对每个肺的背侧和腹侧表面开展触诊和目测检查，但根据整个表面积的平均值，得出每个肺叶的值。采用Tukey-Kramer均值差的所有对同时置信区间和P值用作统计评价方法。
表10
Figure BDA0003942659990000291
为了测试攻击性APP2菌株是否存在，从所有组中抽取来自肺的组织样本用于细菌学分析。为了重新分离APP2细菌，将肺组织样品在蒸煮水中放7秒，然后在均质器中破碎获得悬浮液，其中100μl平铺在HIS+V板上，并在37℃和5％CO2条件下孵育过夜。通过MALDI-TOF证明菌落。
疫苗接种后没有猪出现异常的局部或全身反应。所有接种疫苗的猪在两次接种疫苗后0.5天都有适度的体温升高，在接种疫苗1天后恢复到正常值。
攻击后每天测量体温两次。攻击一天后直肠温度开始升高。一般来说，与未接种疫苗的对照组相比，接种疫苗组的温度升高较少。这种差异在攻击4天后最为明显，此时所有接种组的平均温度在统计学上显著低于未接种组(表11)。
表11。与未接种疫苗的对照组(第4组)相比，疫苗接种组(第1组至第3组)的体温升高更少具有统计学意义(*)。第1组：活的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat、纯化的HIS10-APXII(439-801aa)、纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9。第2组：灭活的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzyp MLBAD-gne、纯化的HIS10-APXII(439-801aa)、纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9。第3组：纯化的HIS10-APXII(439-801aa)，纯化的APXIII(27-245aa)-HIS9。
第4组：未接种疫苗的对照组。Dunnett多重比较检验。
Figure BDA0003942659990000292
评估单头动物肺病变(参见图22，表12)的肺评分显示，阴性对照组(第4组)中动物的肺病变Hannan评分是0-7(平均值是3.75)。与未接种疫苗的对照组相比，仅接种Apx毒素的动物(第3组)的肺评分没有明显降低，虽然该组的平均值降至2.25。
在采用灭活的APP2和Apx中和表位免疫的第1组中，7只动物中有6只没有可检测到的肺病变，一只动物出现评分为2的肺病变。平均肺病变评分为0.286，与对照组动物(第4组)相比，肺病变明显(P＝0.00369)更少。
表12所有组与阴性对照组4相比的Tukey-Kramer均值差的的所有对同时置信区间和P值。示出了平均值、每组Hannan肺评分平均值的两两比较之差以及多重比较P值(第4组与第1-3组比较)。这是使用Tukey-Kramer多重比较程序时差异变得显著的显著性水平。当与第4组相比，P值<0.05时，肺评分具有统计学意义。
分组 动物数 均值 均值差 P-值
4 8 3.75
1 7 0.285714 3.464 0.00369
2 7 0.285714 3.464 0.00369
3 8 2.25 1.5 0.42721
攻击菌株再分离的半定量结果(表13)表明，在第4组的所有动物中，可以再分离出大量APP2细菌。无法对记录的数据进行统计评估，但观察到肺部病变评分与再分离细菌的数量呈正相关的趋势：在第1组中，只有一头可检测到病变的猪具有大量再分离的攻击细菌。在该组的另外2只动物中，可以从没有可见病变的肺区域再分离出少量的APP2。尽管第1组和第2组的肺部病变评分没有差异(在这两组中，7头猪中有6头没有病变)，但在第2组中，一头具有可检测到病变的猪和五头无病变的猪在再分离出低至高数量的攻击细菌方面呈阳性(7只动物中有6只APP2攻击菌株呈阳性)。对于第3组的4只具有肺病变的动物，可以从肺部具有病变的区域或从没有可见病变的区域中分离出大量的APP2。
表13肺部病变评分和培养评分比较。
Figure BDA0003942659990000311
a总攻击菌株再分离培养分数来自确定的最高分数(肺部病变中或在可见病变之外)。
a样本取自可见的肺部病变。
b样本取自可见病变之外的两个确定的肺部位置。评分见上。2个位置分离总cfu数在括号中给出。
评分：-(无生长)，+(<50cfu)，++(50至500cfu)，+++(>500cfu)。
总之，与未处理的动物相比，糖工程化候选疫苗非常有效，并显著减少了免疫动物的肺部病变。实验证明，表面呈递异源APP O-抗原的重组细菌疫苗，任选地与ApxII和III的中和表位组合，几乎可以完全阻止肺病变的发展，并大大减少APP攻击细菌对肺的定植。
3.4)糖工程化APP候选疫苗经口服和鼻腔途径施用于小猪时抗APP血清型2的功效
本研究的目的是重现口服和鼻内施用灭活APP2疫苗株(具有诱导的wzy和gne表达的SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne)与肌内注射ApxII和III的中和表位组合的功效(第1组)。此外，将此功效与采用商业疫苗
Figure BDA0003942659990000312
APP(第2组)处理的动物进行比较。该程序与第3.3节中描述的实验相当。在SD 0和SD 21接种疫苗。将这两组与未接种疫苗的动物(第3组)进行比较。在SD 42采用感染剂量的APP血清型2(HK 361，NCTC10976)攻击猪，并在SD 48时实施安乐死。定期监测动物的临床症状(在攻击后的6天内至少每天监测两次)，并每天进行一次或两次直肠温度测量。
在本实验中，细菌和蛋白质以及攻击材料的制备如上文第3.3节所述。
表14
Figure BDA0003942659990000321
在该研究中，使用大约5周龄的商业品种猪(荷兰托佩克种猪公司，TN70，Z-系)。这些猪来自经证实的无APP饲养，在研究的第一天，所有动物的APP抗体均为阴性。每组8只动物(随机)以3周的间隔接种2次(SD 0、SD 21)。按照上文第3.3节所述开展糖工程化疫苗的鼻内和口服给药以及Apx抗原(第1组)的肌内注射。第2组动物肌内注射2ml
Figure BDA0003942659990000323
APP。
在第42天，通过MAD NasalTM鼻内、粘膜雾化装置
Figure BDA0003942659990000324
采用2ml含10E6cfu/ml的APP2菌株HK361鼻内接种进行攻击。
在SD-1、7、14、20、28、35、41和48取血，分离血清，并检查动物的临床症状。
在SD 48时，动物被安乐死，并进行尸检。根据Hannan et al.1982,Res.Vet.Sci.,Vol.33(1),p76-88，对肺部和胸膜的病变进行评分。评分基于每个肺叶(7个位置)受典型APP病变影响的百分数(表10)。对每个肺的背侧和腹侧表面开展触诊和目测检查，但根据整个表面积的平均值，得出每个肺叶的值。采用Dunnett多重比较检验和P值作为统计评价方法。
为了测试攻击性APP2菌株是否存在，从所有组中抽取来自肺的组织样本用于细菌学分析。为了重新分离APP2细菌，将肺组织样品在蒸煮水中放7秒，然后在均质器中破碎获得悬浮液，其中100μl平铺在HIS+V板上，并在37℃和5％CO2条件下孵育过夜。通过MALDI-TOF证明菌落。细菌评分值换算为0＝没有分离出APP2细菌，1＝分离出<20CFU(菌落形成单位)APP2细菌，2＝分离出<200CFU APP2细菌，3＝分离出>200CFU APP2细菌。
疫苗接种后没有猪出现异常的局部或全身反应。所有接种疫苗的猪在两次接种疫苗后0.5天都有适度的体温升高，在接种疫苗1天后恢复到正常值。
攻击后每天测量体温两次。对照组3在攻击一天后直肠温度开始适度升高。一般来说，与未接种疫苗的对照组相比，接种疫苗组的温度升高较少。
由于感染引起的症状，达到人类终点标准的动物被安乐死并进行临床评估。图23示出了所有3组动物的存活概率图。在攻击后第2天，对照组4的8只动物中有5只由于发病率增加而不得不实施安乐死。在第4天，商业疫苗组第2组的1只动物必须被实施安乐死。糖工程化疫苗组第1组的动物均未表现出临床症状，所有动物均存活至攻击后第6天研究结束。
评估单头动物的肺病变(参见图24，表15)的肺评分显示，阴性对照组(第3组)中动物的肺病变Hannan评分是0-8(平均值是3.75)。与未接种疫苗的对照组相比，接种商业疫苗的动物(第2组)表现出肺评分下降的趋势，但并不显著，P值略高于0.05。
采用灭活的APP2和Apx中和表位接种的第1组动物没有出现可检测到的肺病变。疫苗接种组1与对照组3显著不同(P＝0.007)。
表15所有组与阴性对照组3相比的Dunnett多重比较和P值。示出了平均值，每组Hannan肺评分平均值的两两比较之差以及多重比较P值(第3组与第1组和第2组比较)。当与第3组相比，P值<0.05时，肺评分具有统计学意义。
Figure BDA0003942659990000322
Figure BDA0003942659990000331
攻击菌株再分离的半定量结果(图25)表明，除1只动物外，在第3组的所有动物中，可以再分离出大量APP2细菌。在商业疫苗组第2组中，可以从8只动物中的4只动物中再分离出APP2细菌，其中2只动物存在大量该细菌。相比之下，在第1组接种糖工程化疫苗的动物中没有一只动物的APP2细菌再分离呈阳性。
综上所述，可以证明前面研究的结果。糖工程化候选疫苗非常有效，并且与未处理的动物相比，在接种的动物中，在攻击后6天没有再分离出APP2细菌，并且没有出现肺部病变。此外，其功效高于采用商业APP疫苗处理动物时所观察到的功效。
序列表
<110> 马尔西博股份有限公司
<120> 包含糖工程化细菌的疫苗
<130> 50797PCT
<140> 2021800352085
<141> 2021-03-03
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12928
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12928)
<223> 序列的APP2菌株的经识别的APP2 O-抗原生物合成簇
<400> 1
atgcttgaac aagcatcaaa ccaaactaac gaggaaatcg atctgattga attaattcgc 60
gtgctttgga agaaaaaatt attaattgct attgttacct ttatttttac tgcattggca 120
gcagtttatg cttttaccgc gaaagagaaa tggacatctc aagcagaggt aattgcgcct 180
agagtgacag atatttccga atatttatcg ttacgaaaag aatataattt aattatgggt 240
tctgagttca aagaaaatga tattcgtaat gaactaaatg agcttttttc tcgttatgtg 300
ctttcttatg acgaagcaat ctctttcttt aagaccacag atacttataa aaaacttgca 360
gaaaaagaaa atgaagcagg tttacaaaga gcagcttctg aatttacaac ggaatcattg 420
aaggtgataa aaccggatgc gaaaaaagac cttaatgctt taggcagtaa gattgctatt 480
tcatctgaga ctgctttatc tgcacaaaca gagttaaatg attttattcg tcatattagt 540
gatatttctt ttaattttag taaaaatgaa tttatttatt gggtaaaaga gagcatatct 600
agcctaaatt acgagaaaga agtgatagag caagatcaga gtattcaacg aaaagttcag 660
attcaaaact tagaagccgc acttgatatg gcgaaaaaag caggaattaa agagtatagt 720
tctgcattgt catcaaatag ttctgtggct aatctcgcgg taagtgatac aaaaattccg 780
ttatcagatt ctaaattagc agatggaacc tatttattta tgcttggtga gaaaaatcta 840
caagcacaat tagatattgc gaaaaccaag gaaattgttt attcgccaag atattatcag 900
attcaagagc aacttttaaa attaaatact ttattaccta aagtagagaa agtaactggg 960
caaacttata gttatgtatc ttcgccgaca tatcctgtta tcaaagatgc acctaaaaaa 1020
ggaattattt tagttatagg tttcttggta ggattgttac tgagttcatt cactgttttg 1080
atttctgtat tagtgagaaa taagaagagc taattatgag gtatgaagag gaatattaac 1140
ctctttatgt gccttttgat gatccaattt actgaagtgc ttagactatt taggtaataa 1200
aatataggga taataatgaa gcataagata ttacatttta gccaagtgct tggcggtgtc 1260
ggtcgatatt tagagctata tgataagtac atcaataaag attcatttga aaatatatat 1320
atattaccta taggtgattg ggaggcggca gaagctcagg ataaacggta tatattaaat 1380
attgaacaat ccttttcacc aattaaattg atctctaatg ttataaaaat tagaaatatc 1440
ttaaaaaaag aaaagccaga tatcttttat ctacatagta cttttgctgg cgttattggg 1500
cggttagctg ctattggtat gaggtgtaaa gtaatttata accctcatgg ttggtcattt 1560
aagatgaatg tatctaggct aaaacaaact ttttataaga ttatcgaagg tggtttagtt 1620
ttcttaactg ataagtttgt tttaatttcg aaatcggagt atgaggcggc acgttcaatt 1680
ggtgtttcag agaagaaatg ttgtctcata tataacggta ttgaaacgat aaaaaaaaca 1740
gatatagcaa tcattcctaa attagatgat aaatatatca ttggaatgat aggacgtatt 1800
agtgagcaaa aaaatccaat gttttttgcc cagtttgcca aagagattat taaacaatac 1860
cctaatactt atttcatttt ggttggtgac ggtgagcaac gagaatcgtt agaagactat 1920
ttagaacgta ataacttgaa tgatgttttt tatattacgg gttgggtaac taatcccgaa 1980
agctacttaa atttatttga tcaagcagta ttattctcaa aatgggaagg gctatgtctt 2040
tcagtctgtg agtatatgtt atatgaaaag cctatattag taagtaatat tggtggtatt 2100
aacgatctta ttcagaatga agttaatggt tttactattg ttgaaggtga tcttaaggat 2160
gcggttaaca aatctaatag attaagaaat gagcctaaaa ctgtagctaa gtttattgaa 2220
gcctcaaaca tacttattca agagaaattt aatgctcaaa aaatggtaaa tagtttagaa 2280
aaacttttta tcaaattatc agagaataaa taatgaaaga aaaatttagt tgcattgttg 2340
tttgttataa ccccgataat tcggtgcttg acaatctcaa aaactatatt agttatgtgg 2400
gaaaagtaat cgtagttgat aattcagatg tggataattc tcaattattt tcctcacttt 2460
cagaatactt aatttatata ccattgtata aaaatgtggg tattgcctat gcactaaata 2520
taggagtaga aaagtccaaa gaattaggat atgaatatat cattactatg gatcaagata 2580
gttcttttgc tactaatcta gtggatgtat attcacatta tataagtaat tatcctatag 2640
atcagatagg agcattatcc ccagtttata ttacggacag gggatttaat cgaacaagta 2700
aagaagaatt taaacaaata aaaattacta tgcaatcagg ttctatgttc tttactgata 2760
aatttgatgt aatcggtcgc tttgataatg atctgttctt agatgtagtt gattgggaat 2820
atttctttag aatttatacg ttaggatata aaacgattca atgtaataaa gcaatgctga 2880
aacatgctcc agcggaaacg ctaacgttat ttaaaataaa aggaaaaaca attggtgttg 2940
gagtcgcttc tccattaagg tattactatc aaattagaaa tctactttgg tgtgttttac 3000
ataaaaagag tttttttatg ataaaaacaa tagcttataa atttattaag attctatttt 3060
tgtttaataa taaaaagcaa tatttatcat ttgcttatat ggctattaaa gacgccttta 3120
ataatcgttt aggggcatat gatacacttt atttagagaa atctcgtaat gaaaaatgat 3180
ttaccattaa ttagtattat tattcctatc tataacgtga agccttatct tgaaaaatgt 3240
gtaaatagtg tattatcaca atcatatcct aatcttgaaa ttattctagt tgatgacggt 3300
gcaactgatg gttctgctca agtgtgtgat gatttttctg aaaagtatgc aaatattcag 3360
gtaattcata agaaaaatgg tgggctatcc tcagcaagaa atgctggaat tgaagctatg 3420
aagggagaat acgtattttt cttagatagt gatgactgga ttgctaatga tgcaatttct 3480
caattatatg atgatatggt ggaatataat gcagatataa cagggattag tttttatcaa 3540
gcatattcag acggtaattt agtattaaat acacatctta ttgaaaaaca aatgctttca 3600
aagaaagagg ctttacgtac tttcctattt aataattacc ttactccttg ttcctgtgga 3660
aaactttata aagcaagtct atggaaagat ataagatttc cggagggacg attatttgaa 3720
gatcagctta ctacttataa agttatcgag ttagcaaata caattatttt taatcctgct 3780
gcaaagtatt tttattttaa aagaatagga tctatcggtc attctgcttt ttctgaaaaa 3840
acatatgacc tttatgaggc tgttaatgaa caatataatg aaataactaa gcatcatcct 3900
gatattgaat ctgatttggc ggttgctaaa attacttggg aaattgtatt tattaatatg 3960
atgctcaatt caaattattc agatcaagcg atagttgata aaacacgagt ttttgcaaga 4020
aaacgtattt tagatgtagt gaaatgtgag tttatcccta atttacgaaa atttcagatt 4080
actttatttg catataattt tagtttatat aaagttttat atgcaagata taaaaagaaa 4140
aatccattat cttaattatt gattttatcg gttgttacaa tgatacctaa aaaaattcat 4200
tattgttggt ttggtggaaa tccattacct aaaagtgtga aaaaatgtat taaatcttgg 4260
aaaaaatact gtccagatta cgagattatt gagtggaatg aatctaatta caatgtgcat 4320
aagaaccttt ttataaaaga agcttatgag aaaaaaaagt ttgcatttgt ttcagattat 4380
gctcgtttag atgtggttca ttctgaaggt gggatttatt tagatactga tgttgagttg 4440
ataaaaccta tagatgattt attagctcat agttgttttt tagcatctga atctattgat 4500
gatgttaata cagggctagg ttttggggct gaaaaaggac attggtttat cgcagaaaat 4560
atgagtgtct atgaaaatat gtactttaat atggaaaata ttattacctg tgtagagatt 4620
actactaaat tattaataga aagaggtttt tctgctagtg ataaaattca aaatatagat 4680
gatattttca tttatccaac tgagtatttt tgcccattaa attataaaac ccacgagttg 4740
catataacac agaatactta ttctatacat cactatgatg caacttggca aagccctctt 4800
atgaaattta aaacaaaaat taagtatata ttgtgtttag ccggaataat aaaatgaact 4860
ccttagtata tagaatagat attagaacac ttattttttc tattttttat tttacttttt 4920
tagtatcgga ttttttatta ttagctcaag atggcactat tacaaaagat atcatcaaat 4980
gggttaaatt attctcatta ttgccattgc tcttattaat atttaaattg cctttgaatc 5040
tcttgatttt aggttttttt actataatga taagtgcttt ttattctatt tatacgggag 5100
attcgttttt attatatata tgtttgctga tgtctttttc ttataaagtt aattttaact 5160
ttttattcaa gataggatta tatcttactt caattctagt tgttctaata ctaacttatt 5220
tcttttttga atattttctg attggtgaca gtcattttgt atatgatgcg acctattggt 5280
ttaaacgtta tacatttaat tttgataatc ctaatgcatt tcctatgaga atattcgttt 5340
tttttatatt ttatatattg catgtaggta agctgcgact ttttgataca tttctatttg 5400
ttatactatt tggaatagtt ttctattttt caaattctag aactgcattt tatattttta 5460
ttttgtgtgt ccttactatt cattttaacc aagtttttaa tgtgctaaat aatacttttg 5520
ttaaattact aattaataat tcaattatat ttataactat tttttcaatt tggtcggcta 5580
tatattatca agattattat tcctatttag aaccgattaa caaaatttta tctaaaagaa 5640
tatactttgc taatgaggct tataagagtt taggatttga attttaccct aggaatatta 5700
aatggtggat agaagaatct gattggcata ttatagataa tggatatgta tatttattta 5760
tttctggtgg tcttttagta ggaaatttat ttatattttc tataacttgg cttatgtata 5820
gactaaataa atttaaccta agtaatgagg caatattatt aatgttttct atgttatatc 5880
ttttatctga gagtcatttt ataaatatat tttacaatat acctatttta ttattagcta 5940
ttttcattaa taaaactaat attgtacgct atttggaatg taaaaaatga ataaaaacct 6000
tgtaaataat agtattatga gttttttgct tacaatatct aactttattt ttccattaat 6060
tacttttact tatgcggcaa gaattttgca acctgataat atgggaaagt ttgcattttc 6120
tctatcggtt gtagattatc tatctctatt tgctacattt ggtgttgtag gttatggtgt 6180
tagagcttgt gcagaagtaa gaaacaataa agaagaacta actaaaacgg tacaagaaat 6240
tttatttatt aatatttttt tagctattat tgcctatctt gtgatatttc ttctaattag 6300
ctatcagcat gcatttagag aagatacttt gttattctta attatgtctt cttgtattat 6360
ctttaatgtg ataggaatag aatggttata taaaagtctc gatgaatata gatacattac 6420
agtaagaagt attctattaa aaataatttc attaataatg attttatgtt ttgttaaaga 6480
aaaggatgat tatccacttt ttgcattgtt ttttgttcta ccaatttgtc tatcttcgtt 6540
gttaaatatt ataaattcaa gaaaaatatt gctttttaaa ttatttaaac ttgatttatc 6600
aaagcatata aaaccaatgt ttgttttatt tttagtgaca ttatcttata cattatatgc 6660
taatgttaat gatgtgctat tagctactgt aactaataca gaacaagttg gttactatag 6720
tgttgctttc aaaataaaag ctgcattatt agctttcatt actagtacaa gtatggtttt 6780
tttacctcga ttaacagagt atattaaaaa taatcaagat attgaattta ttgacttatt 6840
aagaaagtct tttgatctgg ttttttttct agctgtgcca ataacattat ttttcttttt 6900
atacgctaaa gaaacaatat ttttattgtt tggtgagaaa tataataagt caagtttatt 6960
attgcaaacc atgatatggt ctgttttttt tggtggttta aataatatat taagtgtaca 7020
aatgttattg cctttaaaaa aagataatca gttcttaatt tctattttaa gtggtggatg 7080
tatatcttta gttgtgaatt ttatcttctt gagggagctt caatcattaa gtacatcaat 7140
ttcagttcta gttgcagaag ttgttatact gattattcaa ttagttattc taagaaaata 7200
tattgtaaga atttttaata atttaaatcc tttaaaggtg ataatgtcgg tttttttttc 7260
tatatggttt gttaatttaa tttatgccaa ttttattgct ctaggtaata gtttcttaga 7320
gtatattatt tctattttta tattttcatt attttatgtg tttttacttt tttttagtaa 7380
agaaagattt gttcatgatg tgttttttta tataaggagt aaatttgatt aatttattaa 7440
ttagtattct agctaaaatt ctttctagga tttctaaact gattttgaat ataaaaaaac 7500
ggaaggaata caaacgagtt ggctctatag ttgattcaaa gaatatagat ttgagtttta 7560
tttgtggtaa ctattgtaga gtagggagag atactgtaat tgagaaaaat gttattatgg 7620
ggagattatc ttacattaat tcagatatgg gaaaaacata tattggtagt aatgtaaaga 7680
ttggtagttt atgctcaatt tcctcaggtg taataattgc tcctgtaaat cattacctaa 7740
attatgtgac aacgcaccca ttactttata attcctatta tagtagcatt ttaaatatta 7800
attctaatct gttatctcaa caagaattag atgcaaatgt atcaacagtg attggtaatg 7860
atgtatggat tggagctaat gtgattataa agagaggagt aactatagga gatggagcgg 7920
ttattggtgc aggtagtatt ataacaaaag atattccttc ttatgcagta gtagcaggag 7980
ttccagctaa aattattaaa tatcgttttt caaaagatgt aatagaaagc ctgaaagata 8040
gtaagaatgt ttgggaatta tctacctcag aattagaaga gaatttttct catttatatg 8100
atgttgagaa atatcttaat agatttaagt tgtaggatta atttttagtc taggatttta 8160
gtatgagtaa gaaaaatata gttgcacaaa ctttattact ttgcttagat ttattactaa 8220
ttagtatggc aatcttttta gctgtattta ttagaaataa tattttaccg aatattatgt 8280
tatttgagcc tgtatcatat atagagtatc tagtataccc atttccttat gtaatcattg 8340
ttacattgtt tatgtggttt gggctatata caagaagata tgatttatgg caggagtcat 8400
tatttattat aaaagtatgt tttatttctt ttattattat ctttgcaaca ttagcattgg 8460
gtaagaatat agaatattat tctagagctg ttttattatt atctcttttc ttatcagtga 8520
tatttttacc aataggtcgt tattttttga aaaaaagctt gtttagactg ggtctttggg 8580
aaaggaaagt aaagtttatt ggcaatttaa ataagaatga aattgggatt tttaattctc 8640
ctcatgtagg atatgtgtta tctaaagatg atacatatga tgttatattt atatctagtg 8700
gtgataagag tgtatcagaa ttaaatgatt taattgaaag taataaatta ttgaatcgtg 8760
aggttctatt tatccctgtg ttaaatcaat atgattttac tcaatctgtt ttgtacaata 8820
attttagtac aaggctaaat ctatttacgt tagaaaataa attacttgga aagcaaaata 8880
aaattttgaa gtatttacta gattatgtac tagtattatc tactttacct ttttgggggg 8940
ggctgatttt acttattagt ataaaattaa aattagaaga tcctaaaggg aaaatatttt 9000
tcttacaaaa gagattaggt caagagggta agatattcta ttgttataaa tttagaacaa 9060
tggtttcaga ccagagcttt atgcaacaat ggcttattga taatccagaa gaaagagatt 9120
attacgctgt gtatcataag tatattaatg atcctagaat tactaaattc ggacattttt 9180
tgcgaagaac atctttagat gagttacccc aattatttaa tgtacttaaa ggggatatga 9240
gtttagttgg aaatagacct tatatggttg aggaacaaca aaaaatgaaa gatgctgcca 9300
gtattatttt gatgtcaaaa ccaggagtaa caggtttatg gcaagtaagt gggcggagtg 9360
acgtttcatt tgaagaacgt ttacaaattg attcttggta tattaaaaat tggtctattt 9420
ggaatgatat tgttatttta ttcaaaacag ttggtgttgt attaagaaaa gatggagcat 9480
cttagtaata atgtaattac attaaattat tatagatagg gattattatg aaaaaaattt 9540
tagtcaccgg tggtgcaggt tttattggct ctgcggttgt acgtcatatt ataaatgata 9600
cacaagatag tgttgtaaat gttgataaac ttacctatgc gggtaattta gaatcgttat 9660
taatggtaga aaatagccct cgttacgtat ttgagcaagt agatatttgt aatcgtgcgg 9720
aacttgatcg cgtatttgcc caacatcagc ctgatgcagt tatgcactta gccgcagaaa 9780
gccatgttga ccgttcaatc gatgggccgg ctgcttttat cgaaacaaat attgtcggta 9840
cttacacttt gctcgaagct gctcgctatt attggaatag tttagatgct gataaaaaat 9900
cattattccg ttttcatcat atttctacgg atgaggtata tggtgatttg gaaggtacag 9960
aagatttgtt tacggaaacg acgccgtatt ctccgtctag cccatattcg gcttctaaag 10020
cgtcaagtga tcatttagtc cgtgcttggc ttcgtactta tggattacct acgattgtga 10080
ccaattgttc gaataactat ggtccgttcc attttcctga aaaattaatt cctttaatga 10140
ttttaaatgc tttagagggt aaaccattac cagtttatgg taatgggcaa caaatccgtg 10200
actggttatt tgtagaagat catgctagag cattatacaa agtggtaacg gaaggtaagg 10260
tgggagaaac ttataatata ggtggacata atgaaaaagc taatattgat gttgttcgta 10320
ctatttgtag tttattagaa gagcttgtac caaataaacc ggcgggtgtg cataaatatg 10380
aggatttaat tacctacgtt acagatcgtc cagggcatga tgttcgttat gcaattgatg 10440
caacaaaaat tggacgagaa ttaggttgga agccacaaga aacatttgaa acaggtattc 10500
gtaaaacagt cgaatggtat ttaaataata cagagtggtg gagtcgtgta ttagacggtt 10560
cttacaatcg tgagcgttta ggttcaaatt aatattatta caagcgatcc aatttttaat 10620
aaggtttaca atatgaaagg tattattctt gcaggtggct caggtactcg tctttacccg 10680
attactcgtg gcgtgtcaaa acagctctta ccggtatacg ataaaccaat gatttattat 10740
cctttatcag tacttatgct tgcaggtatc cgagaagtct taattattac aacaccggag 10800
gataatgaga gctttaaacg tttattaggc gacggttctg atttcggtat ccaactttcc 10860
tatgctattc aacctagtcc agatggctta gctcaagcat ttttaattgg tgaagagttt 10920
atcggtcagg acagtgtatg tttggttcta ggtgataata tcttctacgg tcagcatttt 10980
actcaatctt tacaagaggc tgtaaaatcg gtagaaacga aaggtgcgac tgtatttggt 11040
tatcaagtga aagatccgga acgttttggt gtggtagagt ttgatgacaa tttccgtgca 11100
ttgtctattg aggaaaaacc gattcaaccc aaatctaatt gggcggtaac cgggttatat 11160
ttctatgata accgagtagt agaatttgca aaacaagtaa aaccctctgc acgtggcgaa 11220
ttagagatta ccactcttaa tgagatgtat cttaatgatg gttcacttaa tgtacaatta 11280
ttagggcgag gctttgcttg gttagatacc ggcacacatg atagcttaca tgatgcggca 11340
gcatttgtga aaacagtaca aaatctacag aatttacagg tagcatgctt agaggaaatt 11400
gcctatcgta acggttggtt atcacttgag caacttgaag cattaacaaa accgatggcg 11460
aaaaatgaat acggtcaata tttgttacgt ttaacaaaag gaacaaaata atggcacgtt 11520
tcttaattac gggagcgaag ggacaggttg gatattgtct tactaagcaa ttacagagca 11580
aagcagatgt cttagcagta gatcgtgatg agcttgatat aacaaatcgt gatgctgtat 11640
ttaaagttgt cagagagttt catcctgatg ttattattaa tgctgccgca catactgctg 11700
tagatcgggc tgagagtgaa atcgaactat cggaagcgat taacgtgaaa ggcccacaat 11760
atcttgcaga agcagccaat gagattgatg caatcatttt acatatttca acggattatg 11820
tctttgaagg gacaggttct ggagaatata aagaaaatga tgaacctaat ccacaaggcg 11880
tatacggcaa aacaaaactt gccggagaga tagcagttca acaggcaaat aaaaggcata 11940
tcattttgcg tactgcttgg gtatttggtg aacatggtaa taactttgtt aaaacgatgc 12000
tccgtttagc aaaagaaaga gaatctttgg gaattgtgag tgatcaattt ggcggaccta 12060
cctatgcagg ggatattgcg agtagcctga ttcatatagc aaatatcatt cttaatagta 12120
agatagatgt atttggtgtt taccatttta ctggcaagcc ttatgtaagt tgggccgatt 12180
ttgctaagaa aatttttgat gaagctgttt cgcaaaaggt attagaaaaa gcaccgcttg 12240
ttaattttat tgctacaagt aattatccaa catcagcaaa acgaccggca aattctcgct 12300
tagatttaac taaaattgat gaggtttttg gtattaaacc gagtaattgg caacaagcat 12360
taaaaaatat taaggcatat gcgtaatgaa gattattgaa acaaatattc cggatgtaaa 12420
gcttttagaa cctcaagtat ttggtgatga acgcggtttt tttatggaaa tttttcgaga 12480
tgaatggttc agacaatatg tcgctgatcg tactttcgtt caagaaaatc attcaaaatc 12540
tattaaggga gttttgagag gcttacatta tcaaactgaa aatacacaag gcaagttagt 12600
gcgtgtagtg caggggtctg tgtttgatgt agcggtagat ttacgtaaaa gttctccgac 12660
ttttggacaa tgggttgggg aagtattatc cgctgaaaat aaacgtcaac tttgggtccc 12720
tgaaggattt gctcacggtt tttatgtatt gacagaaacc gctgaattta cctataaatg 12780
cacagattac tataatccaa aagcggaaca ttcattgatt tggaatgatc cgacagtagc 12840
gattaattgg aatcttggtg gcgcgcctag tttatcagca aaggatttag ctggtaaggt 12900
gttaaatgaa gctgttttat ttgaatag 12928
<210> 2
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(370)
<223> rfb (APP2)簇基因wzzB的氨基酸序列
<400> 2
Met Leu Glu Gln Ala Ser Asn Gln Thr Asn Glu Glu Ile Asp Leu Ile
1 5 10 15
Glu Leu Ile Arg Val Leu Trp Lys Lys Lys Leu Leu Ile Ala Ile Val
20 25 30
Thr Phe Ile Phe Thr Ala Leu Ala Ala Val Tyr Ala Phe Thr Ala Lys
35 40 45
Glu Lys Trp Thr Ser Gln Ala Glu Val Ile Ala Pro Arg Val Thr Asp
50 55 60
Ile Ser Glu Tyr Leu Ser Leu Arg Lys Glu Tyr Asn Leu Ile Met Gly
65 70 75 80
Ser Glu Phe Lys Glu Asn Asp Ile Arg Asn Glu Leu Asn Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Arg Tyr Val Leu Ser Tyr Asp Glu Ala Ile Ser Phe Phe Lys Thr
100 105 110
Thr Asp Thr Tyr Lys Lys Leu Ala Glu Lys Glu Asn Glu Ala Gly Leu
115 120 125
Gln Arg Ala Ala Ser Glu Phe Thr Thr Glu Ser Leu Lys Val Ile Lys
130 135 140
Pro Asp Ala Lys Lys Asp Leu Asn Ala Leu Gly Ser Lys Ile Ala Ile
145 150 155 160
Ser Ser Glu Thr Ala Leu Ser Ala Gln Thr Glu Leu Asn Asp Phe Ile
165 170 175
Arg His Ile Ser Asp Ile Ser Phe Asn Phe Ser Lys Asn Glu Phe Ile
180 185 190
Tyr Trp Val Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Asn Tyr Glu Lys Glu Val
195 200 205
Ile Glu Gln Asp Gln Ser Ile Gln Arg Lys Val Gln Ile Gln Asn Leu
210 215 220
Glu Ala Ala Leu Asp Met Ala Lys Lys Ala Gly Ile Lys Glu Tyr Ser
225 230 235 240
Ser Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Val Ala Asn Leu Ala Val Ser Asp
245 250 255
Thr Lys Ile Pro Leu Ser Asp Ser Lys Leu Ala Asp Gly Thr Tyr Leu
260 265 270
Phe Met Leu Gly Glu Lys Asn Leu Gln Ala Gln Leu Asp Ile Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Glu Ile Val Tyr Ser Pro Arg Tyr Tyr Gln Ile Gln Glu Gln
290 295 300
Leu Leu Lys Leu Asn Thr Leu Leu Pro Lys Val Glu Lys Val Thr Gly
305 310 315 320
Gln Thr Tyr Ser Tyr Val Ser Ser Pro Thr Tyr Pro Val Ile Lys Asp
325 330 335
Ala Pro Lys Lys Gly Ile Ile Leu Val Ile Gly Phe Leu Val Gly Leu
340 345 350
Leu Leu Ser Ser Phe Thr Val Leu Ile Ser Val Leu Val Arg Asn Lys
355 360 365
Lys Ser
370
<210> 3
<211> 12928
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(12928)
<223> 密码子优化的rfb簇的核苷酸序列
<400> 3
atgctggaac aagctagcaa tcaaaccaac gaagaaattg atctgattga gctgattcgc 60
gtgctgtgga agaagaagct gctgattgcc atcgttacct tcatctttac agctttagcc 120
gcagtttatg cctttacagc aaaagagaaa tggaccagtc aagctgaagt gattgccccg 180
cgcgtgaccg acattagtga atatttatct ttacgtaaag aatacaatct gattatgggc 240
agtgaattta aagaaaatga tattcgcaat gaattaaacg aattattcag ccgctacgtg 300
ctgagctatg atgaagccat ctcctttttt aaaaccaccg atacctacaa gaagctggcc 360
gagaaagaaa acgaggctgg tctgcagcgc gcagccagtg aattcaccac cgaatcttta 420
aaggtgatta agccggacgc caagaaagat ttaaatgctt taggcagcaa gatcgccatt 480
agcagcgaaa ccgctttaag tgcccagacc gagctgaacg actttattcg ccacatcagc 540
gatattagct tcaattttag caaaaatgaa tttatttatt gggtgaagga gagcatcagc 600
tctttaaact atgaaaaaga agtgatcgaa caagatcaga gcatccagcg caaagttcag 660
atccagaatc tggaggccgc actggacatg gccaaaaagg ccggcatcaa agagtacagc 720
agcgcactga gcagcaacag cagcgtggca aatttagcag tgagcgacac caagattccg 780
ctgagcgaca gtaaactggc agatggcacc tatttattca tgctgggcga gaagaattta 840
caagcccaac tggatatcgc caagaccaaa gagatcgtgt acagcccgcg ctattaccag 900
atccaagaac agctgctgaa gctgaatact ttactgccga aagttgagaa ggtgaccggc 960
cagacatata gttacgtgag cagcccgacc tatccggtga tcaaagacgc cccgaagaaa 1020
ggcatcattc tggttatcgg ctttttagtg ggtttactgc tgagcagctt taccgtgctg 1080
atcagcgtgc tggtgcgcaa caaaaagagt taattatgag gtatgaagag gaatattaac 1140
ctctttatgt gccttttgat gatccaattt actgaagtgc ttagactatt taggtaataa 1200
aatataggga taataatgaa acataagatt ttacatttta gtcaagttct gggcggtgtg 1260
ggccgctatc tggaactgta tgacaaatac atcaacaaag atagctttga aaacatttat 1320
attttaccga ttggtgattg ggaagccgca gaagcccaag ataaacgtta cattctgaat 1380
attgaacaga gctttagccc gattaaactg attagtaatg ttattaagat tcgtaacatt 1440
ctgaaaaaag aaaaaccgga tatcttttat ttacacagca ccttcgccgg tgttattggc 1500
cgtttagcag ccattggcat gcgctgcaaa gtgatctaca acccgcatgg ctggagcttc 1560
aagatgaatg tgagccgttt aaagcagacc ttctataaga tcattgaggg cggtttagtg 1620
tttttaacag ataaattcgt gctgatcagc aagagcgaat acgaagcagc ccgcagcatc 1680
ggcgttagcg agaaaaaatg ctgtttaatt tacaatggca ttgaaaccat taaaaagacc 1740
gatattgcaa ttattccgaa gctggatgat aaatatatca ttggcatgat tggccgcatc 1800
agcgagcaga aaaacccgat gtttttcgcc cagttcgcca aggagatcat taagcagtac 1860
ccgaacacct actttatttt agttggcgat ggtgagcagc gcgagagtct ggaggattat 1920
ttagaacgca ataacttaaa cgacgtgttt tatatcaccg gctgggtgac caacccggag 1980
agctatctga atctgttcga ccaagctgtt ctgttcagta aatgggaagg tttatgttta 2040
agcgtgtgcg agtatatgct gtacgagaag ccgattttag tgagcaacat tggtggcatc 2100
aacgatttaa tccagaacga ggttaacggc ttcaccatcg ttgagggcga tttaaaggat 2160
gccgtgaaca agagtaaccg tttacgcaat gaaccgaaaa ccgtggccaa gttcatcgaa 2220
gccagcaaca ttttaattca agaaaagttc aacgcacaga aaatggtgaa tagcttagaa 2280
aaactgttca tcaaactgag cgaaaataaa taatgaagga aaaatttagt tgcatcgtgg 2340
tgtgttacaa cccggacaat agcgtgctgg ataatttaaa aaactatatt agttatgtgg 2400
gtaaagtgat tgtggtggat aacagtgatg tggacaacag ccagctgttc agctctttaa 2460
gcgagtatct gatctacatc ccgctgtaca aaaacgtggg catcgcctat gctttaaaca 2520
tcggtgtgga gaagagcaag gaactgggtt atgagtatat tattaccatg gaccaagata 2580
gcagcttcgc cacaaatctg gtggatgtgt acagccatta catcagcaac tacccgatcg 2640
atcagattgg cgctttaagc ccggtgtata ttaccgaccg cggtttcaac cgtaccagca 2700
aagaagaatt taaacagatt aagatcacca tgcagagcgg cagcatgttc ttcaccgaca 2760
aattcgatgt gatcggccgc tttgacaacg atttattttt agacgtggtg gactgggaat 2820
actttttccg catttatact ttaggttata aaacaattca gtgcaataaa gccatgctga 2880
aacacgcccc ggccgaaact ttaactttat ttaaaattaa aggtaaaacc attggtgtgg 2940
gcgtggcaag cccgctgcgc tattactatc agattcgcaa tctgctgtgg tgcgtgctgc 3000
acaagaaaag cttcttcatg attaagacca ttgcctataa gtttatcaag attctgtttc 3060
tgtttaataa taaaaaacag tatttaagct tcgcatacat ggccatcaag gacgccttca 3120
ataaccgttt aggcgcctat gatacactgt atctggagaa aagccgtaat gaaaaatgat 3180
ctgccgctga tcagcatcat catcccgatc tataacgtga aaccgtattt agaaaagtgc 3240
gtgaacagcg tgctgagcca gagctatccg aatctggaga ttattctggt ggatgacggt 3300
gccaccgatg gcagcgcaca agtttgcgat gattttagcg aaaaatatgc aaatattcaa 3360
gttattcata agaaaaatgg tggtttaagc agcgcacgta atgccggtat tgaggccatg 3420
aaaggcgagt acgtgttctt tctggatagc gacgactgga tcgcaaatga cgccatcagc 3480
cagctgtacg atgatatggt ggagtacaac gccgacatca ccggcatcag cttttaccaa 3540
gcttatagcg acggtaattt agtgctgaac acccatctga tcgagaagca gatgctgagc 3600
aagaaagagg cactgcgtac ctttttattc aataattatt taaccccgtg tagctgcggc 3660
aagctgtata aagcctcttt atggaaggac atccgctttc cggaaggtcg tttatttgaa 3720
gatcagctga ccacctataa agttatcgaa ctggccaaca ccatcatctt caatccggcc 3780
gccaaatact tttatttcaa acgtatcggc agcatcggcc acagcgcctt cagcgagaaa 3840
acctatgatt tatatgaggc agtgaatgaa cagtacaacg agatcaccaa acaccacccg 3900
gatatcgaga gtgatctggc cgtggccaaa attacttggg aaattgtgtt tattaatatg 3960
atgctgaaca gtaactacag cgatcaagct atcgtggaca aaacccgcgt gtttgcacgc 4020
aaacgtattt tagatgtggt gaagtgcgag ttcatcccga atttacgcaa gtttcagatc 4080
actttatttg cctacaattt cagtctgtat aaagttctgt atgcccgcta taagaagaaa 4140
aatccgctga gttaattatt gattttatcg gttgttacaa tgattccgaa gaaaattcat 4200
tattgctggt tcggcggcaa tccgctgccg aaaagtgtga agaagtgcat taaaagttgg 4260
aaaaaatatt gtccggatta tgaaattatt gaatggaatg agagcaatta caatgtgcat 4320
aaaaatttat ttattaaaga ggcctacgag aagaagaagt tcgccttcgt gagcgattac 4380
gcccgtttag atgtggtgca cagtgaaggt ggcatctatc tggacaccga tgtggagctg 4440
atcaaaccga tcgatgattt actggcccat agctgctttc tggccagcga aagcatcgat 4500
gacgtgaata ccggtttagg ctttggtgcc gaaaaaggcc actggttcat cgccgagaac 4560
atgagcgtgt atgaaaatat gtactttaat atggaaaata ttatcacttg tgtggagatc 4620
accaccaaac tgctgatcga acgcggcttt agcgccagcg ataaaattca gaatattgat 4680
gatattttta tttatccgac cgaatatttt tgcccgctga actacaaaac ccacgaactg 4740
cacatcaccc agaacaccta cagcatccac cactatgatg ccacttggca gagcccgctg 4800
atgaaattca aaaccaagat caagtacatt ctgtgtttag ccggcattat taaatgaatt 4860
ctttagtgta tcgcattgac atccgcactt taatttttag catcttttat tttacctttc 4920
tggtgagcga ttttttactg ctggcccaag atggcacaat caccaaggac atcatcaagt 4980
gggtgaagct gttttcttta ctgccgctgc tgctgctgat cttcaagctg ccgctgaatt 5040
tactgattct gggctttttt accattatga ttagtgcctt ctacagcatc tataccggtg 5100
acagcttttt actgtacatc tgtttactga tgagctttag ctacaaagtt aattttaatt 5160
ttttatttaa gattggttta tatctgacca gtattttagt ggtgctgatt ctgacatatt 5220
ttttctttga gtactttctg atcggcgaca gccactttgt gtacgacgcc acctactggt 5280
tcaaacgcta cacctttaac tttgataacc cgaacgcatt tccgatgcgc atctttgtct 5340
tttttatttt ttacattctg catgtgggca aactgcgttt attcgacacc tttctgttcg 5400
ttattctgtt tggtatcgtt ttttacttta gcaacagccg tacagccttt tacattttta 5460
ttctgtgtgt tctgaccatt cattttaatc aagtgtttaa tgttctgaat aatacctttg 5520
ttaaactgct gattaacaat agcattatct ttatcaccat ttttagcatt tggagcgcaa 5580
tctattatca agattactat tcttatctgg aaccgattaa taaaatttta agcaaacgta 5640
tttattttgc aaacgaagcc tataagtctt taggcttcga gttctacccg cgcaatatca 5700
agtggtggat cgaggagagc gactggcata ttatcgacaa tggctatgtt tatttattta 5760
tcagcggcgg tttactggtg ggcaacttat ttatcttttc tattacttgg ctgatgtatc 5820
gtctgaataa atttaattta agcaacgagg ccattttact gatgtttagc atgctgtatt 5880
tactgagcga gagccatttt atcaatattt tttataacat cccgatttta ctgctggcaa 5940
tttttattaa taaaaccaat attgtgcgtt atttagagtg taaaaaatga ataagaatct 6000
ggtgaataat agcattatga gctttttact gaccatcagc aacttcatct tcccgctgat 6060
caccttcacc tacgccgcac gtattctgca gccggacaac atgggtaagt tcgcctttag 6120
cttaagcgtg gttgattatt tatctttatt tgccaccttt ggtgtggtgg gttatggcgt 6180
gcgtgcttgt gccgaagttc gcaataataa ggaagaactg accaaaacag tgcaagaaat 6240
tctgtttatt aatatctttt tagcaattat tgcatatctg gttatttttc tgctgatcag 6300
ttatcagcat gcctttcgcg aggacacact gctgtttctg atcatgagta gctgcatcat 6360
tttcaacgtt atcggcattg agtggctgta taaatcttta gatgagtacc gctacatcac 6420
cgtgcgcagc attttactga agattattag cttaatcatg attctgtgct ttgtgaagga 6480
gaaagacgat tatccgctgt tcgctttatt ctttgtgctg ccgatctgtt taagcagctt 6540
actgaacatt attaacagcc gcaaaatttt actgtttaaa ctgtttaagc tggacttaag 6600
caaacatatt aaaccgatgt ttgtgctgtt tctggttact ttaagttaca ctttatacgc 6660
caacgtgaat gatgtgctgc tggccacagt gaccaacacc gagcaagttg gctactatag 6720
tgtggcattt aaaatcaagg ccgctttact ggcatttatc accagcacca gcatggtgtt 6780
tctgccgcgc ttaaccgagt atatcaaaaa caatcaagat atcgaattta ttgatctgtt 6840
acgtaaaagc tttgatctgg tgttcttttt agccgtgcct attactttat tcttttttct 6900
gtatgccaaa gagaccatct ttttactgtt tggtgaaaaa tataacaaga gctctttact 6960
gctgcagacc atgatctgga gcgttttctt cggcggttta aataacattt taagcgttca 7020
gatgctgctg ccgctgaaaa aggacaatca gtttttaatc agtattttaa gcggcggctg 7080
catttcttta gtggtgaatt tcatcttttt acgcgaatta cagagtctga gtaccagtat 7140
cagcgttctg gtggccgaag tggtgatttt aatcatccag ctggtgattt tacgcaagta 7200
catcgttcgt atcttcaata atttaaatcc gctgaaagtt attatgagcg tcttttttag 7260
catttggttt gtgaatttaa tctatgccaa ctttatcgct ttaggcaaca gctttctgga 7320
gtatattatt agtattttta tcttctcttt attctatgtg tttctgctgt ttttcagcaa 7380
agaacgcttt gtgcatgatg tgttctttta tattcgcagc aaatttgatt aatctgctga 7440
tcagcattct ggccaaaatt ttaagccgca ttagcaaact gattttaaat atcaagaagc 7500
gtaaagagta caagcgcgtg ggcagtattg tggatagcaa aaatattgat ttaagcttta 7560
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gccgtttaag ctacatcaac agcgacatgg gcaagaccta tatcggcagc aatgtgaaga 7680
tcggctcttt atgtagcatc agcagcggcg tgatcattgc cccggtgaac cactatttaa 7740
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acagcaattt actgagccag caagaactgg acgcaaacgt gagcaccgtg attggcaatg 7860
atgtgtggat cggtgccaac gtgatcatca aacgcggcgt gaccattggc gatggtgcag 7920
tgatcggcgc tggtagcatt atcaccaaag acatcccgag ttacgcagtg gttgccggcg 7980
tgccggccaa aatcatcaaa tatcgcttta gcaaagatgt gatcgagtct ttaaaggaca 8040
gcaagaatgt gtgggaactg agcaccagcg aactggagga aaactttagc catttatacg 8100
acgtggaaaa atatctgaac cgttttaaac tgtaagatta atttttagtc taggatttta 8160
gtatgagtaa aaagaacatc gtggcacaga ctttactgct gtgtctggat ttactgctga 8220
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tgttcgagcc ggtgagctat atcgagtatt tagtttatcc tttcccgtat gttattattg 8340
tgactttatt catgtggttt ggtttataca cacgtcgcta cgatctgtgg caagaatctt 8400
tatttatcat caaagtgtgc tttattagtt ttattatcat ttttgcaact ttagccttag 8460
gtaaaaatat tgaatactac agccgtgccg tgctgctgct gtctttattt ttaagcgtga 8520
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cgcacgtggg ttacgtgctg agcaaggacg acacctacga cgtgatcttc atcagcagcg 8700
gcgataagag cgttagcgaa ctgaacgatt taatcgagag caataaactg ctgaaccgcg 8760
aggttctgtt catcccggtt ctgaaccagt atgacttcac ccagagtgtt ctgtacaata 8820
atttcagcac ccgtttaaat ttatttacac tggagaacaa attactgggc aaacagaata 8880
aaattttaaa gtatttactg gactacgttc tggtgctgag tacactgccg ttctggggcg 8940
gtctgatttt actgattagc attaagctga aactggaaga tccgaaaggc aaaattttct 9000
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gcatcattct gatgagtaaa ccgggcgtta ccggtttatg gcaagttagt ggtcgtagcg 9360
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gttaataata atgtaattac attaaattat tatagatagg gattattatg aagaaaattc 9540
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cccaagatag cgtggtgaac gtggataaac tgacatacgc cggcaatctg gagtctttac 9660
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gccacgttga tcgcagcatc gatggcccgg ccgccttcat cgagaccaat atcgtgggca 9840
catatacttt actggaggcc gcccgctatt attggaatag tctggacgcc gacaaaaagt 9900
ctttatttcg cttccaccac attagcaccg atgaggtgta tggcgattta gaaggcaccg 9960
aggatttatt taccgaaacc accccgtata gcccgagcag cccgtacagc gcaagcaaag 10020
caagcagcga tcatctggtg cgcgcttggc tgcgcacata tggtttaccg accatcgtga 10080
ccaactgcag caacaactac ggcccgttcc attttccgga gaaactgatc ccgctgatga 10140
ttttaaatgc tttagaaggt aaaccgctgc cggtgtatgg taacggccag cagattcgtg 10200
attggctgtt cgtggaggat cacgcccgtg ctttatataa ggttgtgacc gaaggcaaag 10260
tgggcgagac ctacaatatt ggtggccaca acgagaaggc caacatcgac gttgtgcgca 10320
caatttgctc tttactggag gaactggttc cgaataaacc ggccggcgtg cataagtatg 10380
aagatttaat cacatatgtg accgaccgcc ccggtcacga tgttcgttac gccattgatg 10440
ccaccaagat cggtcgcgaa ctgggttgga aacctcaaga aaccttcgaa accggcatcc 10500
gtaaaaccgt ggaatggtat ttaaacaata ccgagtggtg gagccgtgtg ctggatggta 10560
gctacaatcg cgaacgttta ggcagcaact aatattatta caagcgatcc aatttttaat 10620
aaggtttaca atatgaaagg cattattctg gccggcggta gcggtacccg tttatatccg 10680
attacacgcg gtgtgagcaa acagctgctg ccggtgtatg ataagccgat gatctattat 10740
ccgttaagcg tgctgatgct ggccggcatc cgtgaggtgc tgattattac caccccggag 10800
gacaacgaga gctttaaacg tctgctgggc gatggcagcg atttcggcat tcagctgagt 10860
tacgccattc aaccgagccc ggatggtctg gcacaagctt ttctgatcgg tgaagagttc 10920
atcggccaag atagcgtgtg tttagtgctg ggcgacaaca ttttttacgg tcagcatttc 10980
acccagagtc tgcaagaggc cgttaagagc gttgagacca aaggtgccac cgtgtttggc 11040
taccaagtta aagatccgga acgctttggc gtggtggagt ttgacgataa cttccgcgct 11100
ttaagtatcg aggagaaacc gatccagcct aaaagcaact gggccgtgac cggtctgtac 11160
ttctacgaca accgtgtggt ggaattcgcc aaacaagtta agccgagtgc acgcggcgag 11220
ttagagatta ccactttaaa cgaaatgtat ttaaacgatg gcagtctgaa cgtgcagctg 11280
ctgggccgcg gttttgcatg gctggatacc ggtacccacg atagtctgca cgacgccgca 11340
gcctttgtga aaaccgttca gaatttacag aatctgcaag ttgcttgttt agaagaaatc 11400
gcctatcgta acggctggct gagcttagag cagctggagg ctttaaccaa accgatggca 11460
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ttttaatcac cggcgcaaaa ggccaagttg gttattgttt aaccaagcag ctgcagagca 11580
aagccgatgt tctggccgtg gatcgcgatg aactggacat cacaaaccgc gatgccgtgt 11640
ttaaagtggt gcgcgaattc cacccggacg tgattatcaa tgccgccgcc cataccgcag 11700
tggatcgtgc agaaagcgag atcgaactga gcgaagccat caacgttaag ggtccgcagt 11760
atctggccga ggcagcaaac gagatcgacg ccatcatttt acacattagc acagactacg 11820
tgttcgaggg caccggcagc ggcgaatata aagagaatga tgaaccgaac ccgcaaggtg 11880
tgtacggcaa aaccaaactg gccggcgaaa tcgcagttca gcaagctaac aagcgccata 11940
tcattctgcg caccgcttgg gttttcggcg aacacggcaa caacttcgtg aaaacaatgc 12000
tgcgtttagc caaagaacgc gagagcttag gcattgtgag cgatcagttc ggtggtccga 12060
cctatgccgg tgacatcgcc agctctttaa ttcatattgc caacatcatc ttaaacagta 12120
aaattgatgt gttcggcgtg taccatttca ccggtaagcc gtatgtgagc tgggccgatt 12180
tcgccaaaaa gatcttcgac gaggccgtta gccagaaggt tctggaaaaa gccccgctgg 12240
tgaatttcat cgccaccagc aactatccga ccagcgccaa acgcccggca aacagccgtt 12300
tagatttaac caaaatcgac gaggtgtttg gcatcaagcc gagcaattgg cagcaagctt 12360
taaagaatat caaagcctat gcctaatgaa aattatcgaa accaacatcc cggatgtgaa 12420
actgctggaa ccgcaagttt ttggcgacga gcgcggcttt ttcatggaga tcttccgcga 12480
cgagtggttt cgccagtacg tggcagatcg cacctttgtt caagaaaacc acagcaagag 12540
catcaagggt gtgctgcgcg gtctgcacta tcagaccgaa aacacccaag gtaaactggt 12600
gcgtgtggtg caaggtagcg tgtttgacgt ggccgtggat ctgcgcaaaa gcagcccgac 12660
ctttggtcag tgggtgggtg aagtgctgag cgccgaaaat aaacgtcagc tgtgggtgcc 12720
ggaaggcttc gcccatggtt tctatgtgct gaccgagacc gcagagttta cctacaagtg 12780
caccgactac tataacccga aagccgagca ttctttaatc tggaacgatc cgaccgtggc 12840
cattaactgg aatctgggtg gtgccccgtc tttaagtgcc aaagatctgg ccggcaaagt 12900
gctgaacgaa gcagtgctgt ttgaataa 12928
<210> 4
<211> 13598
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13598)
<223> 密码子优化的rfb APP8核苷酸序列
<400> 4
atggcgacgc cagagcaagt gagcaaccag accaacgagg agattgacct catcgagctg 60
gttcgcgtgc tgtggaagaa aaagctcctc atcgccatcg tgacgtgcat cttcaccgcc 120
ctcgcggccg tttatgcctt caccgccaaa gagaagtgga cgagccagac cgaagttatc 180
gcgccacgtg tgaccgacat tagcgaatat ctgagtctgc gcaaggagta caacctcatc 240
atcggcagcg agttcaaaga aaacgaaatc cgcaacgagc tcagcgagct cttcagtcgc 300
tatgtgctga gttacgacga agccatcgcc ttcttcaaga cgacggacac gtacaagaag 360
ctggccgaaa ccgagaatga agtgggcctc cagcgcgcgg ttgccgaatt cacgacggag 420
agtctgaagg tgatcaagcc agacgccaag aaagacccga atgcgctggg cagtaagatt 480
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atcagcgaca ccagtttcaa cttcagtaag aatgagttca tttattggat taaggagagc 600
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gtgcagatcc agaatctgga gacggccctc gatatggcga agaaggcggg catcaaagag 720
tacagcagcg ccctcagcag taatagtagc gtggccaatc tggcggtgag cgataccaaa 780
atcccgctga gcgatagcaa gctggcggac ggtacctatc tgttcatgct gggcgagaag 840
aatctgcaag cgcagctcga catcgcgaaa acgaaggaga tcgtgtacag cccgcgctac 900
taccagatcc aagaacagct gctgaagctg aataccctcc tcccgaaagt ggaaaaggtt 960
accggccaga gcttcagcta tatcagcagc ccagagctcc cgattaagcg cgattggcca 1020
aagcgcttta ttctgctcct cattggcgcg gtgattggtg gcgttctgag cagtctgtgg 1080
gtgatcggca aacaaatctt cggccagaaa taattatgaa caaggacatc aagattctga 1140
tcgcgacgca taagcagcac ttcatgccga gcgacgaaat gtatctgccg ctccacgtgg 1200
gcaagctggg taaagccgat ctgggttacc aaggcgacga cagcggcgac aacatcagca 1260
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agtgcagcga gtacctcgcc agctttgacg cggtgatcaa acagcgcagc ggctacatgt 1620
tcaacatgtt catcatgagc aaagcgctgg tgaacgacta ctgcagctgg ctgttcccga 1680
ttctgtttga actggagaag cgtatcccaa cggaccagta cagcgccttc catgcccgtt 1740
tctacggccg cgtgagcgaa ctgctgttca acgtgtggct gaaacagtac agccagagca 1800
acccactgaa ggtgaaggcc atcccgtttg tgtatggcga gaagatcaac tggctgaaga 1860
agggtaccgc gtttctggtt gcgaaattct tcggcaaaaa atatgagaaa agcttctaag 1920
ttattatagg gacaaataaa tgaagcgcat tctggtttac ggcatgaccg acaacttcgg 1980
tggcatggag gcctacattc ataacatcta tcagcatctg gataaaaccc aaatccagtt 2040
tgacttcgtg tgtgacttcc cgaaaatgac gctgagcgac tactatctgg acaacggttg 2100
caagatccac ttcatcccgc cgaaaaacca aggtctgttt aagagtctgt gggcgatgtg 2160
gaaagtgatc aaggagaaca actatgatgt tatctatttc aacatcatga acgcgggcta 2220
cgtgctcaac atgctgccgg cctttctgct gggtaagaag atcatcgcgc acagccacaa 2280
tgcggacacc gacaaaaaga agctgcacta cggtctgcgt ctgctgctga acatcgtgac 2340
gaagatcaag ctcgcgtgca gtaaggaggc cggtttcttc atgttcggca aggaagaaaa 2400
tttcagcatc attaataatg cgatcaacct cgaccgctat ctgtatagcg aggagaaata 2460
ccgcgacctc cgccacaaac tgggctgggg cgataagaag gttattctgt acgtggcccg 2520
catgaatcac cagaagaatc cgctgttcgc gctgtatatc atgcgcgaac tgaagcagag 2580
catgccgaat gccgttctgg tgtacgtggg tacgggtgag ctgaaggaac aagttcagca 2640
gtacattctg gacaacaacc tcgacaacgt gattctgctg ggtctgcgca acgatgtgaa 2700
cgagctcatg atcgcggccg atctgtttat tctgccgagt ctgtttgagg gtctgccgat 2760
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gctgagcaaa gcgggttaca acatcgagag cgtggtgaag aacatccaga agattctcgt 3000
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tttaaacaag ttagtaactt ctatctgctg aatgaaccgc tctatttcta catgaagcgc 3660
aacaacggca gtctgaccag caaattcgtg ccggactatt tccgcatcca catgcagacc 3720
ctcgccagct tcaaaagtct gatcgaggtg aaggccacca tcaacgacaa cgtgaaccgt 3780
ctgctggtga accgcttcgt tcgctactgc ctcagcgcga tcgagcgcaa cagcagtctg 3840
aaaagcggca tgagctttct ggagcagaac caatggatta aggaaaatat ctttaatcaa 3900
gaaaaataca acgagtatct gctgctgagc gatctggtga acaagaaaca gaagctgttt 3960
tactttctga tcaagtatcg catcggtttt ctgctcgtga cggccgcgaa catcgtgaaa 4020
ctggtgaagg cgaagttccc gattctgttc gtgaagctga agggttaatt aactggattt 4080
taaaatgaag aagtaccaga tcgtggagct gagtaccgaa cacaaccatg cgggcagcaa 4140
ggccgtgcaa gatgtgtatg agatcgcgct cagcatgggt tacaaggcga atgtggttcg 4200
cacggccacc agtgtggata gtctgctggc caaaattctg cgccaagtta tcttcttcat 4260
cgactggctg aagatctact tcagcatcga gagtaacagc atcgtgctga tccagaaccc 4320
gtactaccac aaacagctca tccgtaactg gattctgaat cgtctgaagc gcattaaaaa 4380
agtgaagttt atcagtctgg ttcacgacgt ggaagagctg cgcaagagtc tgtacaacaa 4440
ctactataaa aacgagttcg agaccatgct gagtctggcg gacagcatca tcgtgcacaa 4500
tgataagatg aaaagctttt tcatcaaaaa gggctacagc gaggacaaac tcatcagtct 4560
gggcatcttc gactatctgc agaagagcgt ggacaaaaag cgcgtgagct tcgaacgtgc 4620
gatcagcgtg gcgggcaacc tcgatatcaa gaagagcagc tatattgcgc agctcggcag 4680
cctcccggcg atcaaagcgc atctgtacgg tccgaacttc gaacatagtc tggaggcgtt 4740
cccgaacatc gaataccacg gtagcttccc ggccacggaa atcccgcaga aactcgtgag 4800
cggttttggt ctggtgtggg acggccagag cattgaaacg tgcaccggcg acttcggcga 4860
gtacctccag tacaataacc cgcacaagct gagcctctat ctgagcagtg gcatgccggt 4920
tgtgatctgg gacaaagccg ccgaggccga tttcgtgaag aaacacaacg tgggtctgtg 4980
cgtgagcagt ctgagcgagc tccaagacaa gctcaacgtg atgaccgagc aagaatttga 5040
agaaatggtg aacaacgtgg aaaaacagac cgcgtgcctc atcagcggcg agtacaccaa 5100
aaaggcgatc agcgaggcgg aacgtgtgat ctaagaatgt tcctctatct gctggtgttc 5160
agtctgctgc tgattctgat cttcaatctg ctcatcgtga atctggacta catgcacccg 5220
agcatcctct ttgttgtgcc atttctggtg tttggcgtga cgagcattct gggcgaggag 5280
gcgtataaga tcatcttcca cgaggagacg ctgctggtga tcgttagcag cgcgctgatc 5340
ttcaccttca tcacgctgct gagccagacc gtgtacaaaa gcaaagagaa tctgaacttc 5400
ccgctgaccg agatcatcat cagtaagaaa gtgacgctgt tttttattgt gttcttcatc 5460
gtgacccagc tggcgttcat caagtatctg gaggccatta gtctggccca cttcggttac 5520
agcggcagtc tgggtgagat gatcagtctg tacgacgtga tgacgaagtt ctggaccgag 5580
atcttcagcg aactcaacgt gccgatcccg ctgctctacc gtatcggcaa tccaatcacg 5640
caaggcttcg gctatctgat tgtgtatatt ttcatccaca actacgttgc caccaagcgc 5700
atcgataagc tgcatctgct gatcattctg ctgctgtgtc tgaacatcat tctcaacggc 5760
agccgcagtc cgatcttccg catcgttacg atgatgctga tcacctttta tgtgctgtat 5820
aacaagcaga acaacgtgcg tcgcggcaac atcaagtttc tgctgaagag tctgctgatc 5880
gtgatcttca gcggcacctt cttcattgcg ctgctgagtc tgatgggccg tgaaaacgat 5940
ctggacatgt tccattacat ttttatctac gttggtgcgc cgctggtgaa cctcgataac 6000
tatctggcgt ttcgtccgga tggtagctac gccaccatct ttggcgagca aacgtttcgc 6060
ggtctgtacg cctatatcgc gaagatcatc agcgatgaga gtctgatctt cccgacgatc 6120
gatcagttca cgttcagcaa caacggtctg gagatcggta acgtgtatac caccttctat 6180
agcttcatct acgatttcga gtacgtgggc ttcatcccgc tgattctgat tatcgcgctg 6240
tactacgtgt tcacgtatca gcgcctcaag acgcgcgcca tcaagaccaa taaagtgcat 6300
ttcagtctgt tcatctatgc ctacctcttc aacgacctca tcatgctggc cttcagtaat 6360
cgcttctaca ccacggtgct ggacatcggc ttcatcaaga ttgttatctt cagctatatc 6420
tgccacctcc tctttgtgca ccgcagcaag atcaaaggca ccgtatgaac gttaaaagtg 6480
tgaaatttaa tttcattatg aatctgattc tgaccgttag caactttctg ttcccgctgg 6540
tgacgttccc atacgttagt cgcattctgc agccagaagg taccggtaaa gtggcctttg 6600
cgattagcgt ggttagctac ttcagcatct tcgcgagtct gggtgtggcc acctatggcg 6660
ttcgtgcgtg tgcgcaagtt cgcgacaata aagatctgct gagtcgtacg gtgcatgagc 6720
tgctgttcat caacatcatc gccacgatca ttgtgtacgt ttgctttctg ctggtggtgg 6780
cgtttacccc acgctttagc gcggaaaaag agctgttctg ggcgacgagc atctttattc 6840
tgttcaccat cattggcatc gagtggctct acaagggtct ggagaagtac cagtacatca 6900
cgatccgcac gatcatcttc aagctcattg cgctggtgct cgtgtttgtg ttcatcaaga 6960
cgaaggatga ctacgtgatc ttcgccgtga tcagtgtgtt tgcgatcgtt ggcagcggca 7020
tcttcaacct ctttaacagt cgcaagctga ttaactacca tctgtacgag gattacgagt 7080
tccgcaagca tttcaagcca atgtttctgc tgtttctcac gacgctcagc atcgccatct 7140
acaccagtgt ggatgaagcg attctgggtc tgctgacgag tccgcaagat gtgggctact 7200
ataacgcggc catgaaggtt aagggcattc tgtttacgct gatcaccagt ctgggcattg 7260
tgctgctgcc gcgtctgagc tattatgttg agaacaatat gacggatgaa ttccatgccg 7320
ccctcaagaa gagcatgaac ttcatcatcg tgatcgccgt tccagtggtg atcttcttca 7380
tgctgttcgc caaggagatt attctgctgc tggccggcga aagttatatc aacgccattc 7440
tgccgctgca gattattgtg tgggcgctgc tgctcagcgc cattaccaac attctgggca 7500
tccagattct gctgccgctc aagaaggata aagagctgct gatcagcgtg ctgctcgcgg 7560
ccattgtgga cattgtggcc aatctgattc tggttccgca actcgccagc gttggtaccg 7620
ccatcagcgt tgtgatggcc gaactcaccg tgctggtggt gcagctggtt atcctccgca 7680
agtacatctg gatcctcttc agcaatctcc agttcgtgcg catcggtctg agcatcgttt 7740
tcagcatcgt gctgagcctc agcatctatc agtggaacat cacgaacagc atcatgctca 7800
cgtttctgat catgggcttc atcttcttca cgacctactt cattctgctg ctgattctga 7860
aggagaactt catgatgtac gtgtaccaga ccatccagca caagattctg aaataaatta 7920
tatagtgtta tcacataacg tatccttgga gaatagaaat gaaatatgat tatctgatcg 7980
tgggcgccgg tctgtttggc agcatctttg cgcgcgaggc caccaagcgt ggcaagaaat 8040
gtctggttat cgagaagcgc gatcacatcg gtggcaactg ctacacgcag aacgtggaag 8100
gcatcaacgt tcacaaatac ggtgcgcaca tcttccacac cagcaacaag gtggtttggg 8160
actacatcca gcagttcgcc gagttcaatc gctttaccaa cagcccggtg gcccgctata 8220
aggacgaact gtacagcctc ccgttcaaca tgctcacctt caacaagatg tggggcgtta 8280
tcacgccgca agaagccgaa gcgaaaatca aggagcagat cgcgaaggag aacatcacgg 8340
atccgaagaa tctcgaggag caagccatca gtctggttgg tcgcgatatc tacgagaagc 8400
tcatcaaggg ctataccgag aagcagtggg gccgtaagtg tacggagctg ccagccttca 8460
tcatcaagcg tctgccagtt cgctacacgt acgacaacaa ctacttctac gacacctatc 8520
aaggcatccc gatcggtggc tacaccggca tctttgaacg catgctcgag ggcatcgagg 8580
tgaaactggg cgttgacttc ttcgcggaac gcgaacatta cgagagtctg gccgagaaga 8640
tcgtgttcac cggtatgatt gacgaatatt ttggttacca gttcggcaaa ctggaatacc 8700
gcagtctgcg cttcgacaac gaagtgctga acatcccgaa ctaccaaggc aatgcggtgg 8760
tgaactatac ggaagccgag gtgccatata cgcgcatcat cgagcataag catttcgagt 8820
acggcaccca gccgaaaacc gtgatcacgc gcgaacacag caaggagtac gaagaaggcg 8880
acgagccgta ttacccgatc aacgacgccc gcaacaacga actgtacgcc aagtacaagg 8940
cgctggccga cgcgacccca aacgttattt tcggtggccg tctggcccag tataagtact 9000
tcgacatgca caatatcatc gccgaggcgc tggagtgcgt taaggtgcac ttttaatata 9060
agggagtaac gctatgaata agatcatcgc gaagatcagt ctgatcctcg tggatatcgt 9120
ggccatcttc gttagcattc tgatcgccgt gagtctgcgt aaaattctgg gtctgctctt 9180
cacgctgccg gagatcgact acagctacat cttcttcgcg tatgtgtatc tgattctgat 9240
tctgatgatg acgtacctcg gcgcgtatac caaacgctac gacttttggc acgaaagccg 9300
tctgatcgtg cgcggcagct ttctcagtct gctgattctg ctgagtgccc tcgcgctggg 9360
ccaaaacgcg gaatactata gccgcagcac gctcgtgctg atctttctct gctgcgccat 9420
cgtgctgccg atcgccaaga ttttcaccaa aaaaattctg ttcaaactgg gtatctggca 9480
gctgccggcg aaggtgatca gcgagaacga ccagttcaaa aacgagctct tcgaagacca 9540
gtatctgggc tatgtgaagg cgaaacacag cgagcacaag attatcttca tcgacggcgc 9600
gaatctgggc aaagatcgtc tgaaccagat catcgaggac aacatcaaga atagccgtga 9660
gatcatcttc accccggttc tgaatggcta cgacttcagc catagctaca tttataacat 9720
cttcaacacg cgcaccaaca ttttcacgct ggagaacgag ctgctgagca aaagcaaccg 9780
catcttcaaa ctgctgatgg actatattct ggtgctgggt agtgccgtgt tctgggtgcc 9840
ggtgctggtg ctcatcgcgt tctggatcaa gaaggaggat ccgaaaggcg aggtgttctt 9900
tctgcagcgt cgcctcggcg tgaatggcaa ggaattcatg tgctacaaat tccgcagcat 9960
gtacagcgac cagagcttca tgcaagaatg gctggagaaa aatccggagg aggccgcgta 10020
ctaccgcatc taccataagt atatgaacga tccgcgcatc accaaaatcg gcgcgttcct 10080
ccgcaaaacc agtctggacg aactgccgca gctgatcaac gtgctgcgtg gtgagatgag 10140
tctcgttggt ccgcgcccgt acatggttat cgagaagaag gacatcggca aaaaagcccc 10200
actggtgctc gcggttaagc cgggcattac gggcatgtgg caagttagcg gccgcagtga 10260
tgtgaacttc gacagccgcg tggagatgga tgtgtggtat atgaaaaatt ggagtctgtg 10320
gaatgacatc gtgattctga tcaaaacggt gcaagccgtg ttcaagcgcg acggtgccta 10380
ttaaagtatg atcaccagca tccagtacct ccgtggcatc gccgcgctgt tcgtggtgct 10440
gttccacatg aagtggatgc tcaacaatgt gtacgtggag aagaacctcg gcgacatctt 10500
cttcatcagc ggcaacttcg gcgtggatct gttcttcgtg atcagcggct tcgtgatctg 10560
tctgagcacg gaacgcgaaa cgctgcaccc ggtgaaggag tttttcatcc gccgcttctt 10620
ccgcatctac ccactgctgc tgctgagcgt ttgcaccatc tacattctgg gcgacttcaa 10680
gatccacgag ctgatcctca gcatgatccc aatccatctg gactacagca gcccgagccc 10740
ggtgttcggc tacaacattc tggttagcgc gtggaccatc acctacgaga ttagcttcta 10800
catcatcctc gtgctgagtc tgatgatcaa ccatcgcttc cgctgcgaac tgaccattct 10860
gttctaatta tcattaatat agtttcaaac tattattatt ttggtgaata tagcctatca 10920
ctagatagag agatacccct tgataaaagg ggacattttt ttgttatgtt ctcatcatca 10980
atgttattaa catttattta tgggatttta atatatataa aattacaaat tttatgaaaa 11040
gcattatcat cctcgacaag tacttcctct acagcattct gctggtggtg atcagcttcg 11100
tgttcatcaa acacccgatc ttcgacggcc acggtgtgct gaaatggggc tttctgagct 11160
tcatcattct gctgattctg ctcatcatcg agaacaccta cggcatcgcc aaaagcaact 11220
ttctgttctg gctgggcgaa atcagctaca gtctgtatct gacgcacatc attatcctcg 11280
aattcattct gaagcacatc accccggaga tctggaacaa cccgaatctg ggcatgagca 11340
agatcctctt ctacctcgcc atcagcatca gcttcagcta tctggtgtat ctgctggtgg 11400
agaagccgtt catcaacctc ggcaagaagc tgatcacgaa gctgtaaata ttaatggatg 11460
attttatgaa gtcacgaaat ctcgaaccta caaaaacgca tctgatctat ttagatatac 11520
taaatatttt tgcttgcatt gctgtacttt tttacatcac aatggtattg tacattggta 11580
taacgtaaat gaattggctt ggaaacaagc cttatttttt gaagtggctt tttattgggc 11640
tgttcctatt ttctttatgc tcaccggcgc cacgctgttc gaataccgca accgctacag 11700
cacgaagcag tttttcatca agcgcatcca gcgcgccgtg ttcccgtttc tgagctgcag 11760
cctcattctg ctgggctata gcttttacag cggcatgatc gaggccttta gcatccgcga 11820
cagcatcagt gccatcttca acaccaagga catcccgttc attgaaatct attggttttt 11880
tatccatctc tttagtctgt acatggtgat cccggtgctc agtctgctga aagataacta 11940
ccgcattctg tgctatattg tgggcgccat gtttctgacc cacagtctgt ttccggtgat 12000
ctttgacttc ttcaagctgc actacaactg gagcatcatt ttcccgatgg cgggctacag 12060
catctatctg gttctgggct atctgctgag taaggtgaaa ctggaaaaga aatatcagat 12120
catcatttac attctgggca ttctgagcgt gctgctccgc tacttttata cctacgtgag 12180
cagtctggag gccaaccagc tcgatcgcac gctgttcagc tacatgcaat tccacaccgt 12240
gtttctggcg gtggcgatct tcattttcgt gaaggaattc ttcagcggtg tgaaactgtt 12300
caacgccaag gtgctggcgg tgttcagcag ctgtagtctg ggcatctatc tgatccacaa 12360
gctcgtgatg gactacgaac tcaagtttct gggcatcagc gaggacaatc tctactggcg 12420
ctttttcggc gccttcatga cgtacggcgc gtgcctcgtg atcgtgctgt ttgttaagcg 12480
catcccgtat ctgcgcgcca tctttccgta aagatattat aaatatgaaa attctgatca 12540
ccggtggcgc cggttttatc ggcagcgccg tgatccgcta tatcatccag catacccaag 12600
atagcgtggt gaatgtggac aaactgacct acgccggcaa tctggcgagt ctggaaagcg 12660
tgagcaatag cagccgctac cactttgagc aagcggatat ttgcgacagc acccgcatca 12720
gtcagatctt ctgcaagtac cagccggatg ttgtgatgca tctggccgcc gagagccacg 12780
ttgatcgcag cattgatggt ccggcggcgt tcatgcagac gaacatcatc ggcacctata 12840
ccctcctcga agccagccgc cagtattggc tcagtctgcc gctggaacgc aagcaaacct 12900
tccgcttcca gcacatcagt acggacgagg tgtatggcga tctcaacgat agcaacgagc 12960
tgttcagcga gaacacggcc tatagcccga gcagcccata tagcgccagc aaggccgcca 13020
gcgatcatct cgttcgtgcg tggtttcgta cctatggtct gccgacgctg gtgaccaact 13080
gcagcaataa ctatggcccg ttccagttcc cggagaaact gatcccgctg atgattctga 13140
acgccattag tggcaaaccg ctgccgatct atggcaatgg tctgcagatc cgcgactggc 13200
tgttcgttga agaccacgcc atcgcgctgt atcaagttct ctgtcgcggc aaagtgggcg 13260
aaacgtacaa catcggtggc cacaatgaga agaccaatat cgaggtggtg caagcgatct 13320
gccgtctgct ggacgaactg gtgccgaata aaccgagcgg catcgagcag tatgaagaac 13380
tcgtgaccta cgtggccgat cgcccgggcc atgatgttcg ctacgccatc gacgcgagca 13440
aaatcgagaa tcagctgggt tggacgccga aagaaacctt cgaaagcggt ctccgcaaga 13500
ccgtggagtg gtatctgaat aaccagaagt ggtggcagag cgttctggat ggcagttact 13560
gcggtgagcg tctgggtctg agtctgaaaa gctactaa 13598
<210> 5
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(370)
<223> rfb APP8链长决定蛋白的氨基酸序列
<400> 5
Met Ala Thr Pro Glu Gln Val Ser Asn Gln Thr Asn Glu Glu Ile Asp
1 5 10 15
Leu Ile Glu Leu Val Arg Val Leu Trp Lys Lys Lys Leu Leu Ile Ala
20 25 30
Ile Val Thr Cys Ile Phe Thr Ala Leu Ala Ala Val Tyr Ala Phe Thr
35 40 45
Ala Lys Glu Lys Trp Thr Ser Gln Thr Glu Val Ile Ala Pro Arg Val
50 55 60
Thr Asp Ile Ser Glu Tyr Leu Ser Leu Arg Lys Glu Tyr Asn Leu Ile
65 70 75 80
Ile Gly Ser Glu Phe Lys Glu Asn Glu Ile Arg Asn Glu Leu Ser Glu
85 90 95
Leu Phe Ser Arg Tyr Val Leu Ser Tyr Asp Glu Ala Ile Ala Phe Phe
100 105 110
Lys Thr Thr Asp Thr Tyr Lys Lys Leu Ala Glu Thr Glu Asn Glu Val
115 120 125
Gly Leu Gln Arg Ala Val Ala Glu Phe Thr Thr Glu Ser Leu Lys Val
130 135 140
Ile Lys Pro Asp Ala Lys Lys Asp Pro Asn Ala Leu Gly Ser Lys Ile
145 150 155 160
Ala Ile Ser Phe Asp Thr Ala Leu Ser Ala Gln Thr Thr Leu Asn Asp
165 170 175
Phe Ile Cys His Ile Ser Asp Thr Ser Phe Asn Phe Ser Lys Asn Glu
180 185 190
Phe Ile Tyr Trp Ile Lys Glu Ser Ile Ser Ser Leu Asn Tyr Glu Lys
195 200 205
Glu Val Ile Glu Gln Asp Gln Ser Ile Gln Arg Lys Val Gln Ile Gln
210 215 220
Asn Leu Glu Thr Ala Leu Asp Met Ala Lys Lys Ala Gly Ile Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Ser Ser Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Val Ala Asn Leu Ala Val
245 250 255
Ser Asp Thr Lys Ile Pro Leu Ser Asp Ser Lys Leu Ala Asp Gly Thr
260 265 270
Tyr Leu Phe Met Leu Gly Glu Lys Asn Leu Gln Ala Gln Leu Asp Ile
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Glu Ile Val Tyr Ser Pro Arg Tyr Tyr Gln Ile Gln
290 295 300
Glu Gln Leu Leu Lys Leu Asn Thr Leu Leu Pro Lys Val Glu Lys Val
305 310 315 320
Thr Gly Gln Ser Phe Ser Tyr Ile Ser Ser Pro Glu Leu Pro Ile Lys
325 330 335
Arg Asp Trp Pro Lys Arg Phe Ile Leu Leu Leu Ile Gly Ala Val Ile
340 345 350
Gly Gly Val Leu Ser Ser Leu Trp Val Ile Gly Lys Gln Ile Phe Gly
355 360 365
Gln Lys
370
<210> 6
<211> 1014
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1014)
<223> gne-HA的核苷酸序列
<400> 6
atgaaaattc ttattagcgg tggtgcaggt tatataggtt ctcatacttt aagacaattt 60
ttaaaaacag atcatgaaat ttgtgtttta gataatcttt ctaagggttc taaaatcgca 120
atagaagatt tgcaaaaaat aagaactttt aaattttttg aacaagattt aagtgatttt 180
caaggcgtaa aagcattgtt tgagagagaa aaatttgacg ctattgtgca ttttgcagcg 240
agcattgaag tttttgaaag tatgcaaaac cctttaaagt attatatgaa taacactgtt 300
aatacgacaa atctcatcga aacttgtttg caaactggag tgaataaatt tatattttct 360
tcaacggcag ccacttatgg cgaaccacaa actcccgttg tgagcgaaac aagtccttta 420
gcacctatta atccttatgg gcgtagtaag cttatgagcg aagaggtttt gcgtgatgca 480
agtatggcaa atcctgaatt taagcattgt attttaagat attttaatgt tgcaggtgct 540
tgcatggatt atactttagg acaacgctat ccaaaagcga ctttgcttat aaaagttgca 600
gctgaatgtg ccgcaggaaa acgtaataaa cttttcatat ttggcgatga ttatgataca 660
aaagatggca cttgcataag agattttatc catgtggatg atatttcaag tgcgcattta 720
tcggctttgg attatttaaa agagaatgaa agcaatgttt ttaatgtagg ttatggacat 780
ggttttagcg taaaagaagt gattgaagcg atgaaaaaag ttagcggagt ggattttaaa 840
gtagaacttg ccccacgccg tgcgggtgat cctagtgtat tgatttctga tgcaagtaaa 900
atcagaaatc ttacttcttg gcagcctaaa tatgatgatt tagggcttat ttgtaaatct 960
gcttttgatt gggaaaaaca gtgctaccca tacgatgttc cagattacgc ttaa 1014
<210> 7
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1137)
<223> wzy (APP2)的核苷酸序列
<400> 7
atgaactcct tagtatatag aatagatatt agaacactta ttttttctat tttttatttt 60
acttttttag tatcggattt tttattatta gctcaagatg gcactattac aaaagatatc 120
atcaaatggg ttaaattatt ctcattattg ccattgctct tattaatatt taaattgcct 180
ttgaatctct tgattttagg tttttttact ataatgataa gtgcttttta ttctatttat 240
acgggagatt cgtttttatt atatatatgt ttgctgatgt ctttttctta taaagttaat 300
tttaactttt tattcaagat aggattatat cttacttcaa ttctagttgt tctaatacta 360
acttatttct tttttgaata ttttctgatt ggtgacagtc attttgtata tgatgcgacc 420
tattggttta aacgttatac atttaatttt gataatccta atgcatttcc tatgagaata 480
ttcgtttttt ttatatttta tatattgcat gtaggtaagc tgcgactttt tgatacattt 540
ctatttgtta tactatttgg aatagttttc tatttttcaa attctagaac tgcattttat 600
atttttattt tgtgtgtcct tactattcat tttaaccaag tttttaatgt gctaaataat 660
acttttgtta aattactaat taataattca attatattta taactatttt ttcaatttgg 720
tcggctatat attatcaaga ttattattcc tatttagaac cgattaacaa aattttatct 780
aaaagaatat actttgctaa tgaggcttat aagagtttag gatttgaatt ttaccctagg 840
aatattaaat ggtggataga agaatctgat tggcatatta tagataatgg atatgtatat 900
ttatttattt ctggtggtct tttagtagga aatttattta tattttctat aacttggctt 960
atgtatagac taaataaatt taacctaagt aatgaggcaa tattattaat gttttctatg 1020
ttatatcttt tatctgagag tcattttata aatatatttt acaatatacc tattttatta 1080
ttagctattt tcattaataa aactaatatt gtacgctatt tggaatgtaa aaaatga 1137
<210> 8
<211> 1137
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(1137)
<223> 密码子优化的wzy (APP2)的核苷酸序列
<400> 8
atgaattctt tagtgtatcg cattgacatc cgcactttaa tttttagcat cttttatttt 60
acctttctgg tgagcgattt tttactgctg gcccaagatg gcacaatcac caaggacatc 120
atcaagtggg tgaagctgtt ttctttactg ccgctgctgc tgctgatctt caagctgccg 180
ctgaatttac tgattctggg cttttttacc attatgatta gtgccttcta cagcatctat 240
accggtgaca gctttttact gtacatctgt ttactgatga gctttagcta caaagttaat 300
tttaattttt tatttaagat tggtttatat ctgaccagta ttttagtggt gctgattctg 360
acatattttt tctttgagta ctttctgatc ggcgacagcc actttgtgta cgacgccacc 420
tactggttca aacgctacac ctttaacttt gataacccga acgcatttcc gatgcgcatc 480
tttgtctttt ttatttttta cattctgcat gtgggcaaac tgcgtttatt cgacaccttt 540
ctgttcgtta ttctgtttgg tatcgttttt tactttagca acagccgtac agccttttac 600
atttttattc tgtgtgttct gaccattcat tttaatcaag tgtttaatgt tctgaataat 660
acctttgtta aactgctgat taacaatagc attatcttta tcaccatttt tagcatttgg 720
agcgcaatct attatcaaga ttactattct tatctggaac cgattaataa aattttaagc 780
aaacgtattt attttgcaaa cgaagcctat aagtctttag gcttcgagtt ctacccgcgc 840
aatatcaagt ggtggatcga ggagagcgac tggcatatta tcgacaatgg ctatgtttat 900
ttatttatca gcggcggttt actggtgggc aacttattta tcttttctat tacttggctg 960
atgtatcgtc tgaataaatt taatttaagc aacgaggcca ttttactgat gtttagcatg 1020
ctgtatttac tgagcgagag ccattttatc aatatttttt ataacatccc gattttactg 1080
ctggcaattt ttattaataa aaccaatatt gtgcgttatt tagagtgtaa aaaatga 1137
<210> 9
<211> 97
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_structure
<222> (1)..(97)
<223> Ec_SL/Kan_fw
<400> 9
caaattccgg ttaaaaaaag accgcttgtt tgagagtgat aatcgcaaac aagcggtctt 60
ttttgatcaa aatattatta cacgtcttga gcgattg 97
<210> 10
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(91)
<223> Ec_SL/Kan_rev
<400> 10
gatgaagagc aaagattggg agataatgtg agaaatcttt agattcaaac taagctgaga 60
agaaaaaggt ccatatgaat atcctcctta g 91
<210> 11
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(82)
<223> E.c._5_DELTArfb fw
<400> 11
gtaatgttaa tgaaagcata taagaaattt tcaaatgaat aaagaaactg tttcagttat 60
tattacacgt cttgagcgat tg 82
<210> 12
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(85)
<223> E.c._5_DELTArfb rev
<400> 12
gagcatgtaa tcttctgata aaaatcattt gtacgatatt ttcagttaca tactatgcgt 60
aggtccatat gaatatcctc cttag 85
<210> 13
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(83)
<223> SL1344_DELTArfb fw
<400> 13
gagcaattaa tttttattgg caaattaaat accacattaa atacgcctta tggaatagaa 60
aaattacacg tcttgagcga ttg 83
<210> 14
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(83)
<223> SL1344_DELTArfb rev
<400> 14
gcgttcagat tttacgcagg ctaatttata caattattat tcagtacttc tcggtaagcg 60
gtccatatga atatcctcct tag 83
<210> 15
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(92)
<223> Ec_SL/Kan_fw_elo
<400> 15
cagggctagc gctaattacc aatttattgt ttagcttagg aattttttta ggttagttgc 60
aaattccggt taaaaaaaga ccgcttgttt ga 92
<210> 16
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(92)
<223> Ec_SL/Kan_rev_elo
<400> 16
caatattagc ttatgtatta tattagaagg cctacagata agcaaaaaat attattgatg 60
aagagcaaag attgggagat aatgtgagaa at 92
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> BamHI-Fw KanR-Fw
<400> 17
cgggaattca agcttggatc cc 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> XhoI 3'rspU- Rev
<400> 18
gacgctagca tatgagctcg ag 22
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> BamHI-SL-gnd Fw ext
<400> 19
gtttcatcag taatgggaca gaaaggtacc 30
<210> 20
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> XhoI-SL-GalF Rev ext
<400> 20
cacactcgag caattgaccg gtttttctat tccataaggc 40
<210> 21
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(46)
<223> 5' NdeI_wzy
<400> 21
caggtaccat atgaactcct tagtatatag aatagatatt agaaca 46
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> 3' EcoRI_wzy
<400> 22
cttatcagaa ttcatttttt acattccaaa tagcgtacaa 40
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 3' EcoRI_pEC415fw
<400> 23
gtaccgagct cgaattcttg aagacgaaag g 31
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> 5' NdeI_pEC415rev
<400> 24
cactgcaatc gcgatagctg tctttttcat atgt 34
<210> 25
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(61)
<223> 3'-gne-cat_overlap
<400> 25
gaataggaac taaggaggat attcatatgg accttaagcg taatctggaa catcgtatgg 60
g 61
<210> 26
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(80)
<223> 5'-gne_Sl1344rfaL
<400> 26
attgctcaaa ttggtatcat taccggtttt ctgctggcgc taagaaatag ataatgaaaa 60
ttcttattag cggtggtgca 80
<210> 27
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(80)
<223> 3'-cat_Sl1344rfaL
<400> 27
aaaaactggt ttgataagtg attgagtcct gatgatggaa aacgcgctga taccgtaatt 60
gtgtaggctg gagctgcttc 80
<210> 28
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(80)
<223> 5'-elo-gne_Sl1344rfaL
<400> 28
ttttatcttt cgtcggtttt tatatcgttc gtggcaattt tgaacaggtc gatattgctc 60
aaattggtat cattaccggt 80
<210> 29
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(80)
<223> 3'-elo-cat_Sl1344rfaL
<400> 29
tttcaaaata cagttgggaa aatgtagcgc agcgtttcga ggaacaaatg aaaaactggt 60
ttgataagtg attgagtcct 80
<210> 30
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(33)
<223> 5'-cat-P2new
<400> 30
ggtccatatg aatatcctcc ttagttccta ttc 33
<210> 31
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(58)
<223> 5' gne overlap_wzy (co)
<400> 31
cccatacgat gttccagatt acgcttaatg aattctttag tgtatcgcat tgacatcc 58
<210> 32
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(68)
<223> 3' wzy (co)-cat_overlap
<400> 32
gaataggaac taaggaggat attcatatgg acctcatttt ttacactcta aataacgcac 60
aatattgg 68
<210> 33
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(58)
<223> 3' gne_wzy (co) overlap
<400> 33
ggatgtcaat gcgatacact aaagaattca ttaagcgtaa tctggaacat cgtatggg 58
<210> 34
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(51)
<223> 5' XmaI-XhoI-APXIIIne-HIS-fw
<400> 34
aaaaaacccg ggctcgagat ggatgtaact aaaaatggtt tgcaatatgg g 51
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(38)
<223> 3' APXIIIne-HIS-HindIII-rv
<400> 35
aaaaaaaagc ttttagtggt gatgatgatg gtgatggt 38
<210> 36
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(72)
<223> FW_pliCint
<400> 36
ctaattagta accactttta agcatggtta atcctatttt gaaaaagcaa aatccctggt 60
gttttcaaaa ta 72
<210> 37
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(71)
<223> REV_pagCint
<400> 37
gattcactct gaaaaatttt cctggaatta atcacaatgt caggtcgata ttgctcaaat 60
tggtatcatt a 71
<210> 38
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(76)
<223> eloFW_pliCint
<400> 38
cgtaacgtta aagaatatgt gaatcactac cgtagtataa tggctaatta gtaaccactt 60
ttaagcatgg ttaatc 76
<210> 39
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(79)
<223> eloREV_pagCint
<400> 39
gataagcagg aaggaaaatc tggtgtaaat aacgccagat ctcacaagat tcactctgaa 60
aaattttcct ggaattaat 79
<210> 40
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> FW_rfaK_rfaL
<400> 40
ctatttatat ggcgctatca tcagggaaac ag 32
<210> 41
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> REV_rfaL_rfaK
<400> 41
gacagtataa ttaatgatat taaccgtgcg cttg 34
<210> 42
<211> 13750
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(13750)
<223> 整合位于pDOC质粒上APP2 O-抗原生物合成簇
<400> 42
tttctgtccc attactgatg aaacacggct tatttgttta tcgccacaaa gacccgattg 60
aattacgccc aattttagga caaatggcag ggctagcgct aattaccaat ttattgttta 120
gcttaggaat ttttttaggt tagttgcaaa ttccggttaa aaaaagaccg cttgtttgag 180
agtgataatc gcaaacaagc ggtctttttt gatcaaaata tttcaaatgc taaaggatga 240
accgcaaccg caggttgagc tagcattcgg gttttgcacc acaaaacgag agccgtccaa 300
accttcggta taatctaccg taccaccgat taaatattgc aggctcatag gatcaaccac 360
taaaccgacg ttttggtttt caatggttaa atcgccttca ttgatttggt cgtcgaaggt 420
aaaaccgtat tggaaaccgc tacaaccgcc acccgtaata tacactcgta aacgaagatt 480
cgggttatcc tcgccctcaa ttaaactctt aactttcttc gccgctgcat cggtaaagat 540
aagaggaatt tgaatatcgt ccattttttc ttctcagctt agtttgaatc taaagatttc 600
tcacattatc tcccaatctt tgctcttcat caataatatt ttttgcttat ctgtaggcct 660
tctaatataa tacataagct aatattggct attattttga gagtaatatt atgcttgaac 720
aagcatcaaa ccaaactaac gaggaaatcg atctgattga attaattcgc gtgctttgga 780
agaaaaaatt attaattgct attgttacct ttatttttac tgcattggca gcagtttatg 840
cttttaccgc gaaagagaaa tggacatctc aagcagaggt aattgcgcct agagtgacag 900
atatttccga atatttatcg ttacgaaaag aatataattt aattatgggt tctgagttca 960
aagaaaatga tattcgtaat gaactaaatg agcttttttc tcgttatgtg ctttcttatg 1020
acgaagcaat ctctttcttt aagaccacag atacttataa aaaacttgca gaaaaagaaa 1080
atgaagcagg tttacaaaga gcagcttctg aatttacaac ggaatcattg aaggtgataa 1140
aaccggatgc gaaaaaagac cttaatgctt taggcagtaa gattgctatt tcatctgaga 1200
ctgctttatc tgcacaaaca gagttaaatg attttattcg tcatattagt gatatttctt 1260
ttaattttag taaaaatgaa tttatttatt gggtaaaaga gagcatatct agcctaaatt 1320
acgagaaaga agtgatagag caagatcaga gtattcaacg aaaagttcag attcaaaact 1380
tagaagccgc acttgatatg gcgaaaaaag caggaattaa agagtatagt tctgcattgt 1440
catcaaatag ttctgtggct aatctcgcgg taagtgatac aaaaattccg ttatcagatt 1500
ctaaattagc agatggaacc tatttattta tgcttggtga gaaaaatcta caagcacaat 1560
tagatattgc gaaaaccaag gaaattgttt attcgccaag atattatcag attcaagagc 1620
aacttttaaa attaaatact ttattaccta aagtagagaa agtaactggg caaacttata 1680
gttatgtatc ttcgccgaca tatcctgtta tcaaagatgc acctaaaaaa ggaattattt 1740
tagttatagg tttcttggta ggattgttac tgagttcatt cactgttttg atttctgtat 1800
tagtgagaaa taagaagagc taattatgag gtatgaagag gaatattaac ctctttatgt 1860
gccttttgat gatccaattt actgaagtgc ttagactatt taggtaataa aatataggga 1920
taataatgaa gcataagata ttacatttta gccaagtgct tggcggtgtc ggtcgatatt 1980
tagagctata tgataagtac atcaataaag attcatttga aaatatatat atattaccta 2040
taggtgattg ggaggcggca gaagctcagg ataaacggta tatattaaat attgaacaat 2100
ccttttcacc aattaaattg atctctaatg ttataaaaat tagaaatatc ttaaaaaaag 2160
aaaagccaga tatcttttat ctacatagta cttttgctgg cgttattggg cggttagctg 2220
ctattggtat gaggtgtaaa gtaatttata accctcatgg ttggtcattt aagatgaatg 2280
tatctaggct aaaacaaact ttttataaga ttatcgaagg tggtttagtt ttcttaactg 2340
ataagtttgt tttaatttcg aaatcggagt atgaggcggc acgttcaatt ggtgtttcag 2400
agaagaaatg ttgtctcata tataacggta ttgaaacgat aaaaaaaaca gatatagcaa 2460
tcattcctaa attagatgat aaatatatca ttggaatgat aggacgtatt agtgagcaaa 2520
aaaatccaat gttttttgcc cagtttgcca aagagattat taaacaatac cctaatactt 2580
atttcatttt ggttggtgac ggtgagcaac gagaatcgtt agaagactat ttagaacgta 2640
ataacttgaa tgatgttttt tatattacgg gttgggtaac taatcccgaa agctacttaa 2700
atttatttga tcaagcagta ttattctcaa aatgggaagg gctatgtctt tcagtctgtg 2760
agtatatgtt atatgaaaag cctatattag taagtaatat tggtggtatt aacgatctta 2820
ttcagaatga agttaatggt tttactattg ttgaaggtga tcttaaggat gcggttaaca 2880
aatctaatag attaagaaat gagcctaaaa ctgtagctaa gtttattgaa gcctcaaaca 2940
tacttattca agagaaattt aatgctcaaa aaatggtaaa tagtttagaa aaacttttta 3000
tcaaattatc agagaataaa taatgaaaga aaaatttagt tgcattgttg tttgttataa 3060
ccccgataat tcggtgcttg acaatctcaa aaactatatt agttatgtgg gaaaagtaat 3120
cgtagttgat aattcagatg tggataattc tcaattattt tcctcacttt cagaatactt 3180
aatttatata ccattgtata aaaatgtggg tattgcctat gcactaaata taggagtaga 3240
aaagtccaaa gaattaggat atgaatatat cattactatg gatcaagata gttcttttgc 3300
tactaatcta gtggatgtat attcacatta tataagtaat tatcctatag atcagatagg 3360
agcattatcc ccagtttata ttacggacag gggatttaat cgaacaagta aagaagaatt 3420
taaacaaata aaaattacta tgcaatcagg ttctatgttc tttactgata aatttgatgt 3480
aatcggtcgc tttgataatg atctgttctt agatgtagtt gattgggaat atttctttag 3540
aatttatacg ttaggatata aaacgattca atgtaataaa gcaatgctga aacatgctcc 3600
agcggaaacg ctaacgttat ttaaaataaa aggaaaaaca attggtgttg gagtcgcttc 3660
tccattaagg tattactatc aaattagaaa tctactttgg tgtgttttac ataaaaagag 3720
tttttttatg ataaaaacaa tagcttataa atttattaag attctatttt tgtttaataa 3780
taaaaagcaa tatttatcat ttgcttatat ggctattaaa gacgccttta ataatcgttt 3840
aggggcatat gatacacttt atttagagaa atctcgtaat gaaaaatgat ttaccattaa 3900
ttagtattat tattcctatc tataacgtga agccttatct tgaaaaatgt gtaaatagtg 3960
tattatcaca atcatatcct aatcttgaaa ttattctagt tgatgacggt gcaactgatg 4020
gttctgctca agtgtgtgat gatttttctg aaaagtatgc aaatattcag gtaattcata 4080
agaaaaatgg tgggctatcc tcagcaagaa atgctggaat tgaagctatg aagggagaat 4140
acgtattttt cttagatagt gatgactgga ttgctaatga tgcaatttct caattatatg 4200
atgatatggt ggaatataat gcagatataa cagggattag tttttatcaa gcatattcag 4260
acggtaattt agtattaaat acacatctta ttgaaaaaca aatgctttca aagaaagagg 4320
ctttacgtac tttcctattt aataattacc ttactccttg ttcctgtgga aaactttata 4380
aagcaagtct atggaaagat ataagatttc cggagggacg attatttgaa gatcagctta 4440
ctacttataa agttatcgag ttagcaaata caattatttt taatcctgct gcaaagtatt 4500
tttattttaa aagaatagga tctatcggtc attctgcttt ttctgaaaaa acatatgacc 4560
tttatgaggc tgttaatgaa caatataatg aaataactaa gcatcatcct gatattgaat 4620
ctgatttggc ggttgctaaa attacttggg aaattgtatt tattaatatg atgctcaatt 4680
caaattattc agatcaagcg atagttgata aaacacgagt ttttgcaaga aaacgtattt 4740
tagatgtagt gaaatgtgag tttatcccta atttacgaaa atttcagatt actttatttg 4800
catataattt tagtttatat aaagttttat atgcaagata taaaaagaaa aatccattat 4860
cttaattatt gattttatcg gttgttacaa tgatacctaa aaaaattcat tattgttggt 4920
ttggtggaaa tccattacct aaaagtgtga aaaaatgtat taaatcttgg aaaaaatact 4980
gtccagatta cgagattatt gagtggaatg aatctaatta caatgtgcat aagaaccttt 5040
ttataaaaga agcttatgag aaaaaaaagt ttgcatttgt ttcagattat gctcgtttag 5100
atgtggttca ttctgaaggt gggatttatt tagatactga tgttgagttg ataaaaccta 5160
tagatgattt attagctcat agttgttttt tagcatctga atctattgat gatgttaata 5220
cagggctagg ttttggggct gaaaaaggac attggtttat cgcagaaaat atgagtgtct 5280
atgaaaatat gtactttaat atggaaaata ttattacctg tgtagagatt actactaaat 5340
tattaataga aagaggtttt tctgctagtg ataaaattca aaatatagat gatattttca 5400
tttatccaac tgagtatttt tgcccattaa attataaaac ccacgagttg catataacac 5460
agaatactta ttctatacat cactatgatg caacttggca aagccctctt atgaaattta 5520
aaacaaaaat taagtatata ttgtgtttag ccggaataat aaaatgaact ccttagtata 5580
tagaatagat attagaacac ttattttttc tattttttat tttacttttt tagtatcgga 5640
ttttttatta ttagctcaag atggcactat tacaaaagat atcatcaaat gggttaaatt 5700
attctcatta ttgccattgc tcttattaat atttaaattg cctttgaatc tcttgatttt 5760
aggttttttt actataatga taagtgcttt ttattctatt tatacgggag attcgttttt 5820
attatatata tgtttgctga tgtctttttc ttataaagtt aattttaact ttttattcaa 5880
gataggatta tatcttactt caattctagt tgttctaata ctaacttatt tcttttttga 5940
atattttctg attggtgaca gtcattttgt atatgatgcg acctattggt ttaaacgtta 6000
tacatttaat tttgataatc ctaatgcatt tcctatgaga atattcgttt tttttatatt 6060
ttatatattg catgtaggta agctgcgact ttttgataca tttctatttg ttatactatt 6120
tggaatagtt ttctattttt caaattctag aactgcattt tatattttta ttttgtgtgt 6180
ccttactatt cattttaacc aagtttttaa tgtgctaaat aatacttttg ttaaattact 6240
aattaataat tcaattatat ttataactat tttttcaatt tggtcggcta tatattatca 6300
agattattat tcctatttag aaccgattaa caaaatttta tctaaaagaa tatactttgc 6360
taatgaggct tataagagtt taggatttga attttaccct aggaatatta aatggtggat 6420
agaagaatct gattggcata ttatagataa tggatatgta tatttattta tttctggtgg 6480
tcttttagta ggaaatttat ttatattttc tataacttgg cttatgtata gactaaataa 6540
atttaaccta agtaatgagg caatattatt aatgttttct atgttatatc ttttatctga 6600
gagtcatttt ataaatatat tttacaatat acctatttta ttattagcta ttttcattaa 6660
taaaactaat attgtacgct atttggaatg taaaaaatga ataaaaacct tgtaaataat 6720
agtattatga gttttttgct tacaatatct aactttattt ttccattaat tacttttact 6780
tatgcggcaa gaattttgca acctgataat atgggaaagt ttgcattttc tctatcggtt 6840
gtagattatc tatctctatt tgctacattt ggtgttgtag gttatggtgt tagagcttgt 6900
gcagaagtaa gaaacaataa agaagaacta actaaaacgg tacaagaaat tttatttatt 6960
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ttacattaat tcagatatgg gaaaaacata tattggtagt aatgtaaaga ttggtagttt 8400
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tgtatcatat atagagtatc tagtataccc atttccttat gtaatcattg ttacattgtt 9060
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gagattaggt caagagggta agatattcta ttgttataaa tttagaacaa tggtttcaga 9780
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ccactcttaa tgagatgtat cttaatgatg gttcacttaa tgtacaatta ttagggcgag 12000
gctttgcttg gttagatacc ggcacacatg atagcttaca tgatgcggca gcatttgtga 12060
aaacagtaca aaatctacag aatttacagg tagcatgctt agaggaaatt gcctatcgta 12120
acggttggtt atcacttgag caacttgaag cattaacaaa accgatggcg aaaaatgaat 12180
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gacaggttct ggagaatata aagaaaatga tgaacctaat ccacaaggcg tatacggcaa 12600
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ttcctgaggt 13750
<210> 43
<211> 22933
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(22933)
<223> pDOC_E.c.5_Drfb::KanR_APP2 LPS(cod.opt.)
<400> 43
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accataatcg gcattttctt ttgcgttttt atttgttaac tgttaattgt ccttgttcaa 240
ggatgctgtc tttgacaaca gatgttttct tgcctttgat gttcagcagg aagctaggcg 300
caaacgttga ttgtttgtct gcgtagaatc ctctgtttgt catatagctt gtaatcacga 360
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gatcaagatc catttttaac acaaggccag ttttgttcag cggcttgtat gggccagtta 480
aagaattaga aacataacca agcatgtaaa tatcgttaga cgtaatgccg tcaatcgtca 540
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cgcgttcaat ttcatctgtt actgtgttag atgcaatcag cggtttcatc acttttttca 660
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ttgcttcaaa tactaagtat ttgtggcctt tatcttctac gtagtgagga tctctcagcg 900
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aggggtgacg ccaaagtata cactttgccc tttacacatt ttaggtcttg cctgctttat 1800
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gggcctaaag aactaaaaaa tctatctgtt tcttttcatt ctctgtattt tttatagttt 1980
ctgttgcatg ggcataaagt tgccttttta atcacaattc agaaaatatc ataatatctc 2040
atttcactaa ataatagtga acggcaggta tatgtgatgg gttaaaaagg atcgatcctc 2100
tagctagagt cgatcttcgc cagcagggcg aggatcgtgg catcaccgaa ccgcgccgtg 2160
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cacctttaag cagagaatag gcttcagcaa tcagctgcat atcgccgtat tcaataccgt 3720
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cctggaagaa ggtattacca ccatcaatga tgatgtcacc tttatcgagg tatggcttga 4020
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ggttgggaag ccctgcaaag taaactggat ggctttcttg ccgccaagga tctgatggcg 5040
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tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc ggctgcatac 5460
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tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc atcaggggct 5580
cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgcgcatg cccgacggcg aggatctcgt 5640
cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc gcttttctgg 5700
attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag cgttggctac 5760
ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg tgctttacgg 5820
tatcgccgct cccgattcgc agcgcatcgc cttctatcgc cttcttgacg agttcttctg 5880
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ggctggatga tcctccagcg cggggatctc atgctggagt tcttcgccca ccccagcttc 6060
aaaagcgctc tgaagttcct atactttcta gagaatagga acttcggaat aggaactaag 6120
gaggatattc atatggacct ttttcttctc agcttagttt gaatctaaag atttctcaca 6180
ttatctccca atctttgctc ttcatcaata atattttttg cttatctgta ggccttctaa 6240
tataatacat aagctaatat tggctattat tttgagagta atattatgct ggaacaagct 6300
agcaatcaaa ccaacgaaga aattgatctg attgagctga ttcgcgtgct gtggaagaag 6360
aagctgctga ttgccatcgt taccttcatc tttacagctt tagccgcagt ttatgccttt 6420
acagcaaaag agaaatggac cagtcaagct gaagtgattg ccccgcgcgt gaccgacatt 6480
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aatgatattc gcaatgaatt aaacgaatta ttcagccgct acgtgctgag ctatgatgaa 6600
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ccatgatgtc tgagtccagc gtctgcggct gatccggttt ttcgataaat tcaacaatgc 20100
ggctgacttt gccttcacga tccagcggct ctttggtctg aataacggag tattcagaaa 20160
ggtcacccgg catacgtttt gccagcacct ggctacggcc cgtttcattg aaacgcgcaa 20220
tcatggcagc aaggttgtag cgcagcgggt cggcactggc gtcgtcgatc acaacatctg 20280
gcagtaccac gacaaatggg ttgtcaccaa tggcgggtcg tgcacacaaa atggagtgac 20340
ctaaacctaa aggttcgccc tgacgcacgt tcataatagt cacgcccggc gggcagatag 20400
attgcacttc cgccagtagt tgacgcttca cgcgctgctc aaggagagat tctaattcat 20460
aagaggtgtc gaagtggttt tcgaccgcgt tcttggacgc gtgagttacc aggaggattt 20520
ctttgatccc tgcagccaca atctcgtcaa caatgtactg aatcattggc ttgtcgacga 20580
tcggtagcat ctctttggga atcgccttag tggcaggcaa catatgcatc ccaagacctg 20640
ctaccggtat aactgctttt aaattcgtca tatcgattac cctgttatcc ctagagcttg 20700
gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 20760
aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 20820
acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 20880
cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 20940
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 21000
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aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 21180
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cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 21480
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ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 21600
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taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 21900
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 21960
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cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 22080
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 22140
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg 22200
gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga 22260
gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt 22320
gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct 22380
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ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat 22500
accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga 22560
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caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 22740
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 22800
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cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 22920
aggccctttc gtc 22933
<210> 44
<211> 23019
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(23019)
<223> pDOC_SL1344_Drfb_KanR::APP2 LPS(cod.opt.)
<400> 44
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
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gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
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gcatgctaaa catcagtaaa atggcctcgt tgcttaaatt aaatttattc agacgataca 10920
tcagccaagt aatagaaaag ataaataagt tgcccaccag taaaccgccg ctgataaata 10980
aataaacata gccattgtcg ataatatgcc agtcgctctc ctcgatccac cacttgatat 11040
tgcgcgggta gaactcgaag cctaaagact tataggcttc gtttgcaaaa taaatacgtt 11100
tgcttaaaat tttattaatc ggttccagat aagaatagta atcttgataa tagattgcgc 11160
tccaaatgct aaaaatggtg ataaagataa tgctattgtt aatcagcagt ttaacaaagg 11220
tattattcag aacattaaac acttgattaa aatgaatggt cagaacacac agaataaaaa 11280
tgtaaaaggc tgtacggctg ttgctaaagt aaaaaacgat accaaacaga ataacgaaca 11340
gaaaggtgtc gaataaacgc agtttgccca catgcagaat gtaaaaaata aaaaagacaa 11400
agatgcgcat cggaaatgcg ttcgggttat caaagttaaa ggtgtagcgt ttgaaccagt 11460
aggtggcgtc gtacacaaag tggctgtcgc cgatcagaaa gtactcaaag aaaaaatatg 11520
tcagaatcag caccactaaa atactggtca gatataaacc aatcttaaat aaaaaattaa 11580
aattaacttt gtagctaaag ctcatcagta aacagatgta cagtaaaaag ctgtcaccgg 11640
tatagatgct gtagaaggca ctaatcataa tggtaaaaaa gcccagaatc agtaaattca 11700
gcggcagctt gaagatcagc agcagcagcg gcagtaaaga aaacagcttc acccacttga 11760
tgatgtcctt ggtgattgtg ccatcttggg ccagcagtaa aaaatcgctc accagaaagg 11820
taaaataaaa gatgctaaaa attaaagtgc ggatgtcaat gcgatacact aaagaattca 11880
tttaataatg ccggctaaac acagaatgta cttgatcttg gttttgaatt tcatcagcgg 11940
gctctgccaa gtggcatcat agtggtggat gctgtaggtg ttctgggtga tgtgcagttc 12000
gtgggttttg tagttcagcg ggcaaaaata ttcggtcgga taaataaaaa tatcatcaat 12060
attctgaatt ttatcgctgg cgctaaagcc gcgttcgatc agcagtttgg tggtgatctc 12120
cacacaagtg ataatatttt ccatattaaa gtacatattt tcatacacgc tcatgttctc 12180
ggcgatgaac cagtggcctt tttcggcacc aaagcctaaa ccggtattca cgtcatcgat 12240
gctttcgctg gccagaaagc agctatgggc cagtaaatca tcgatcggtt tgatcagctc 12300
cacatcggtg tccagataga tgccaccttc actgtgcacc acatctaaac gggcgtaatc 12360
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attgtaattg ctctcattcc attcaataat ttcataatcc ggacaatatt ttttccaact 12480
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tttcttcgga atcattgtaa caaccgataa aatcaataat taactcagcg gatttttctt 12600
cttatagcgg gcatacagaa ctttatacag actgaaattg taggcaaata aagtgatctg 12660
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gtgtttggtg atctcgttgt actgttcatt cactgcctca tataaatcat aggttttctc 12900
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attgaagatg atggtgttgg ccagttcgat aactttatag gtggtcagct gatcttcaaa 13020
taaacgacct tccggaaagc ggatgtcctt ccataaagag gctttataca gcttgccgca 13080
gctacacggg gttaaataat tattgaataa aaaggtacgc agtgcctctt tcttgctcag 13140
catctgcttc tcgatcagat gggtgttcag cactaaatta ccgtcgctat aagcttggta 13200
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caatggtttt acctttaatt ttaaataaag ttaaagtttc ggccggggcg tgtttcagca 13860
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agtccaccac gtctaaaaat aaatcgttgt caaagcggcc gatcacatcg aatttgtcgg 13980
tgaagaacat gctgccgctc tgcatggtga tcttaatctg tttaaattct tctttgctgg 14040
tacggttgaa accgcggtcg gtaatataca ccgggcttaa agcgccaatc tgatcgatcg 14100
ggtagttgct gatgtaatgg ctgtacacat ccaccagatt tgtggcgaag ctgctatctt 14160
ggtccatggt aataatatac tcataaccca gttccttgct cttctccaca ccgatgttta 14220
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gccaatcatg ccaatgatat atttatcatc cagcttcgga ataattgcaa tatcggtctt 15000
tttaatggtt tcaatgccat tgtaaattaa acagcatttt ttctcgctaa cgccgatgct 15060
gcgggctgct tcgtattcgc tcttgctgat cagcacgaat ttatctgtta aaaacactaa 15120
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acgaatctta ataacattac taatcagttt aatcgggcta aagctctgtt caatattcag 15360
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gttttcaaag ctatctttgt tgatgtattt gtcatacagt tccagatagc ggcccacacc 15480
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cctaaatagt ctaagcactt cagtaaattg gatcatcaaa aggcacataa agaggttaat 15600
attcctcttc atacctcata attaactctt tttgttgcgc accagcacgc tgatcagcac 15660
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atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc 17460
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tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc 17640
ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct 17700
gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca 17760
ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc 17820
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ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc 18120
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actctcaaac aagcggtctt tttttaaccg gaatttgcaa ctaacctaaa aaaattccta 18480
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cgtaacagat gagggcaagc ggatggctga tgaaaccaag ccaaccagga agggcagccc 20640
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cacgatcctc gccctgctgg cgaagatcga ctctagctag aggatcgatc ctttttaacc 20940
catcacatat acctgccgtt cactattatt tagtgaaatg agatattatg atattttctg 21000
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gaatgaggtc gaaaagtaaa tcgcgcgggt ttgttactga taaagcaggc aagacctaaa 21240
atgtgtaaag ggcaaagtgt atactttggc gtcacccctt acatatttta ggtctttttt 21300
tattgtgcgt aactaacttg ccatcttcaa acaggagggc tggaagaagc agaccgctaa 21360
cacagtacat aaaaaaggag acatgaacga tgaacatcaa aaagtttgca aaacaagcaa 21420
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gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca 22980
tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcga 23019
<210> 45
<211> 1414
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1414)
<223> 合成的氯霉素抗性盒，其 3' 侧有卡那霉素启动子
<400> 45
attacacgtc ttgagcgatt gtgtaggctg gagctgcttc gaagttccta tactttctag 60
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cactcatcgc agtactgttg taattcatta agcattctgc cgacatggaa gccatcacaa 180
acggcatgat gaacctgaat cgccagcggc atcagcacct tgtcgccttg cgtataatat 240
ttgcccatgg tgaaaacggg ggcgaagaag ttgtccatat tggccacgtt taaatcaaaa 300
ctggtgaaac tcacccaggg attggctgag acgaaaaaca tattctcaat aaacccttta 360
gggaaatagg ccaggttttc accgtaacac gccacatctt gcgaatatat gtgtagaaac 420
tgccggaaat cgtcgtggta ttcactccag agcgatgaaa acgtttcagt ttgctcatgg 480
aaaacggtgt aacaagggtg aacactatcc catatcacca gctcaccgtc tttcattgcc 540
atacgtaatt ccggatgagc attcatcagg cgggcaagaa tgtgaataaa ggccggataa 600
aacttgtgct tatttttctt tacggtcttt aaaaaggccg taatatccag ctgaacggtc 660
tggttatagg tacattgagc aactgactga aatgcctcaa aatgttcttt acgatgccat 720
tgggatatat caacggtggt atatccagtg atttttttct ccattttagc ttccttagct 780
cctgaaaatc tcgacaactc aaaaaatacg cccggtagtg atcttatttc attatggtga 840
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ttcccggtat caacagggac accaggattt atttattctg cgaagtgatc ttccgtcaca 960
ggtaggcgcg ccgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa taggaaggaa 1020
taggaacttc aagatcccct cacgctgccg caagcactca gggcgcaagg gctgctaaag 1080
gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga tgaatgtcag 1140
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tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg aaccggaatt 1260
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cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagatct gatcaagaga caggatgagg 1380
atcgtttcgc ctaaggagga tattcatatg gacc 1414
<210> 46
<211> 17796
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(17796)
<223> 用于 SL1344 rfb 整合（用于 pDOC）的带有cat/kP启动子和侧翼同源重组位点的密码子优化的APP8 rfb 簇
<400> 46
attaccctgt tatccctact agcattgctg agattcaggc cgcctttcag cagggagtaa 60
gcttcagcga taagctgcat atcgccatat tcaataccat tgtggaccat cttgacgtag 120
tgaccagcac catcggcgcc gatataggtc acgcacggtt cgccatcttc tgccacagca 180
gcaatcttcg tcaggatcgg cgccaccagt tcataggcat ctttctgacc gccaggcatg 240
atagatggcc ctttcagcgc gccctcttca ccaccggaaa caccggtacc gataaagtta 300
aaaccttccg cagacagctc gcgattgcga cggattgtgt cctggaagaa ggtgttaccg 360
ccatcaataa tgatatcgcc tttttccaga tacggtttca gcgaatcgat agctgcatca 420
gtacctgcgc ccgctttcac cattaacagg atacgacgag gcgtttcgag ggattcaaca 480
aactctttca ccgtgtaata aggcaccagc tttttgccgg gattctcggc aatcacttct 540
tcggtctttt cacgggagcg gttgaaaacg gagacggtat aaccacggct ttcgatgttg 600
agcgcgaggt tgcgccccat cactgccata ccgacgacgc cgatctgttg cttggacatt 660
acatactcct gtcaggtgtg gaaaccctgc cacaaacggt catggcaggt taaaggtgaa 720
tagtatgtta actcaaaggt atgatattaa ggtagcgatt gatgcgttca gattttacgc 780
aggctaattt atacaattat tattcagtac ttctcggtaa gctcgggaat tcaagcttgg 840
atcccgggta cctttctgtc ccattactga tgaaacacgg cttatttgtt tatcgccaca 900
aagacccgat tgaattacgc ccaattttag gacaaatggc agggctagcg ctaattacca 960
atttattgtt tagcttagga atttttttag gttagttgca aattccggtt aaaaaaagac 1020
cgcttgtttg agagtgataa tcgcaaacaa gcggtctttt ttgatcaaaa tatattacac 1080
gtcttgagcg attgtgtagg ctggagctgc ttcgaagttc ctatactttc tagagaatag 1140
gaacttcgga ataggaactt catttaaatg gcgcgcctta cgccccgccc tgccactcat 1200
cgcagtactg ttgtaattca ttaagcattc tgccgacatg gaagccatca caaacggcat 1260
gatgaacctg aatcgccagc ggcatcagca ccttgtcgcc ttgcgtataa tatttgccca 1320
tggtgaaaac gggggcgaag aagttgtcca tattggccac gtttaaatca aaactggtga 1380
aactcaccca gggattggct gagacgaaaa acatattctc aataaaccct ttagggaaat 1440
aggccaggtt ttcaccgtaa cacgccacat cttgcgaata tatgtgtaga aactgccgga 1500
aatcgtcgtg gtattcactc cagagcgatg aaaacgtttc agtttgctca tggaaaacgg 1560
tgtaacaagg gtgaacacta tcccatatca ccagctcacc gtctttcatt gccatacgta 1620
attccggatg agcattcatc aggcgggcaa gaatgtgaat aaaggccgga taaaacttgt 1680
gcttattttt ctttacggtc tttaaaaagg ccgtaatatc cagctgaacg gtctggttat 1740
aggtacattg agcaactgac tgaaatgcct caaaatgttc tttacgatgc cattgggata 1800
tatcaacggt ggtatatcca gtgatttttt tctccatttt agcttcctta gctcctgaaa 1860
atctcgacaa ctcaaaaaat acgcccggta gtgatcttat ttcattatgg tgaaagttgg 1920
aacctcttac gtgccgatca acgtctcatt ttcgccaaaa gttggcccag ggcttcccgg 1980
tatcaacagg gacaccagga tttatttatt ctgcgaagtg atcttccgtc acaggtaggc 2040
gcgccgaagt tcctatactt tctagagaat aggaacttcg gaataggaag gaataggaac 2100
ttcaagatcc cctcacgctg ccgcaagcac tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg 2160
aacacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg 2220
gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt 2280
acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct 2340
ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg 2400
ccaaggatct gatggcgcag gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt 2460
cgcctaagga ggatattcat atggaccttt tttattctca gtttgaatct aaaaattcta 2520
ggtattatcc cccaatatta actctgcatc aataacattc tttgcttatc tataggcttt 2580
ctaatatact atgcagtcaa tatatttttg ttatttattt ttgagaaaac cttatggcga 2640
cgccagagca agtgagcaac cagaccaacg aggagattga cctcatcgag ctggttcgcg 2700
tgctgtggaa gaaaaagctc ctcatcgcca tcgtgacgtg catcttcacc gccctcgcgg 2760
ccgtttatgc cttcaccgcc aaagagaagt ggacgagcca gaccgaagtt atcgcgccac 2820
gtgtgaccga cattagcgaa tatctgagtc tgcgcaagga gtacaacctc atcatcggca 2880
gcgagttcaa agaaaacgaa atccgcaacg agctcagcga gctcttcagt cgctatgtgc 2940
tgagttacga cgaagccatc gccttcttca agacgacgga cacgtacaag aagctggccg 3000
aaaccgagaa tgaagtgggc ctccagcgcg cggttgccga attcacgacg gagagtctga 3060
aggtgatcaa gccagacgcc aagaaagacc cgaatgcgct gggcagtaag attgcgatca 3120
gcttcgatac cgcgctgagt gcccagacca cgctgaacga cttcatctgc cacatcagcg 3180
acaccagttt caacttcagt aagaatgagt tcatttattg gattaaggag agcattagca 3240
gtctgaatta cgagaaagag gttatcgaac aagatcagag catccaacgc aaggtgcaga 3300
tccagaatct ggagacggcc ctcgatatgg cgaagaaggc gggcatcaaa gagtacagca 3360
gcgccctcag cagtaatagt agcgtggcca atctggcggt gagcgatacc aaaatcccgc 3420
tgagcgatag caagctggcg gacggtacct atctgttcat gctgggcgag aagaatctgc 3480
aagcgcagct cgacatcgcg aaaacgaagg agatcgtgta cagcccgcgc tactaccaga 3540
tccaagaaca gctgctgaag ctgaataccc tcctcccgaa agtggaaaag gttaccggcc 3600
agagcttcag ctatatcagc agcccagagc tcccgattaa gcgcgattgg ccaaagcgct 3660
ttattctgct cctcattggc gcggtgattg gtggcgttct gagcagtctg tgggtgatcg 3720
gcaaacaaat cttcggccag aaataattat gaacaaggac atcaagattc tgatcgcgac 3780
gcataagcag cacttcatgc cgagcgacga aatgtatctg ccgctccacg tgggcaagct 3840
gggtaaagcc gatctgggtt accaaggcga cgacagcggc gacaacatca gcatcaaaaa 3900
cccaaatttt tgcgagctga ccggtctgta ctgggcgtgg aaaaatctgc cgaacgatta 3960
tctgggtctg atccattatc gccgcttctt cagcgtgaag aaccgcgcgg aacgcaaaaa 4020
caatccgctg gagacgctgt atctgaccaa cgaagaagcc aaccagctgc tgagtcagta 4080
cgatgtgatc gttccgagca agcgcaacta ctacatcgag acgctgtaca gccattacgc 4140
caatacgctg cacgccgaac atctggacgt tacccgcgaa atcatcgcgg aaaagtgcag 4200
cgagtacctc gccagctttg acgcggtgat caaacagcgc agcggctaca tgttcaacat 4260
gttcatcatg agcaaagcgc tggtgaacga ctactgcagc tggctgttcc cgattctgtt 4320
tgaactggag aagcgtatcc caacggacca gtacagcgcc ttccatgccc gtttctacgg 4380
ccgcgtgagc gaactgctgt tcaacgtgtg gctgaaacag tacagccaga gcaacccact 4440
gaaggtgaag gccatcccgt ttgtgtatgg cgagaagatc aactggctga agaagggtac 4500
cgcgtttctg gttgcgaaat tcttcggcaa aaaatatgag aaaagcttct aagttattat 4560
agggacaaat aaatgaagcg cattctggtt tacggcatga ccgacaactt cggtggcatg 4620
gaggcctaca ttcataacat ctatcagcat ctggataaaa cccaaatcca gtttgacttc 4680
gtgtgtgact tcccgaaaat gacgctgagc gactactatc tggacaacgg ttgcaagatc 4740
cacttcatcc cgccgaaaaa ccaaggtctg tttaagagtc tgtgggcgat gtggaaagtg 4800
atcaaggaga acaactatga tgttatctat ttcaacatca tgaacgcggg ctacgtgctc 4860
aacatgctgc cggcctttct gctgggtaag aagatcatcg cgcacagcca caatgcggac 4920
accgacaaaa agaagctgca ctacggtctg cgtctgctgc tgaacatcgt gacgaagatc 4980
aagctcgcgt gcagtaagga ggccggtttc ttcatgttcg gcaaggaaga aaatttcagc 5040
atcattaata atgcgatcaa cctcgaccgc tatctgtata gcgaggagaa ataccgcgac 5100
ctccgccaca aactgggctg gggcgataag aaggttattc tgtacgtggc ccgcatgaat 5160
caccagaaga atccgctgtt cgcgctgtat atcatgcgcg aactgaagca gagcatgccg 5220
aatgccgttc tggtgtacgt gggtacgggt gagctgaagg aacaagttca gcagtacatt 5280
ctggacaaca acctcgacaa cgtgattctg ctgggtctgc gcaacgatgt gaacgagctc 5340
atgatcgcgg ccgatctgtt tattctgccg agtctgtttg agggtctgcc gattgttgcc 5400
gttgaggcgc aagccgcggg tctcccaatc attctgagcg aaaacatcag catcgaggcg 5460
aaactcgtga acagcaccta cttcctcccg attaacgacg tttttctgtg ggttaataaa 5520
atcaaaaaga ttctggagat cagtggcaac aagcgcttta gtgaccagct ggcgctgagc 5580
aaagcgggtt acaacatcga gagcgtggtg aagaacatcc agaagattct cgtgaattaa 5640
ggtttggtat gaataacacc aagatcagtc tgatcttcgc gtgctataac gtgagccagt 5700
atctggacaa tctgttccag ctgctgacga accagccgta ccaaaatatt gaaatcattt 5760
tcgtggagga ctgtgccacg gacgatacga aggcgaaact ccagagcttc aacgatccgc 5820
gcgtgaagct gctgtgcaac gagaaaaata tcggtgcggc cgaaagccgt aaccgtggca 5880
tccagatcgt taccggcgaa tacatctggt tcccggatcc agacgatctg tttgacgaac 5940
tgctgctgac caaggtgaac accatcatcc agaaaaaccg cccggatgtg atcagcatcg 6000
gcatgcaaga acgctacgag atcaacggca agacggacta cacgaaggac atcatcagcc 6060
gctacgacgg cctcattacc ggcgacttca ccgatgtttt cgtggatctg gaggaaagct 6120
ttctgtttgg ctacacgaat aacaagtttt acaaggccaa catcatccat aagtaccgca 6180
ttctgaacga gcaccaagcg ctgaaggaag atttcgaatt caatatcaag gtgtttaaac 6240
aagttagtaa cttctatctg ctgaatgaac cgctctattt ctacatgaag cgcaacaacg 6300
gcagtctgac cagcaaattc gtgccggact atttccgcat ccacatgcag accctcgcca 6360
gcttcaaaag tctgatcgag gtgaaggcca ccatcaacga caacgtgaac cgtctgctgg 6420
tgaaccgctt cgttcgctac tgcctcagcg cgatcgagcg caacagcagt ctgaaaagcg 6480
gcatgagctt tctggagcag aaccaatgga ttaaggaaaa tatctttaat caagaaaaat 6540
acaacgagta tctgctgctg agcgatctgg tgaacaagaa acagaagctg ttttactttc 6600
tgatcaagta tcgcatcggt tttctgctcg tgacggccgc gaacatcgtg aaactggtga 6660
aggcgaagtt cccgattctg ttcgtgaagc tgaagggtta attaactgga ttttaaaatg 6720
aagaagtacc agatcgtgga gctgagtacc gaacacaacc atgcgggcag caaggccgtg 6780
caagatgtgt atgagatcgc gctcagcatg ggttacaagg cgaatgtggt tcgcacggcc 6840
accagtgtgg atagtctgct ggccaaaatt ctgcgccaag ttatcttctt catcgactgg 6900
ctgaagatct acttcagcat cgagagtaac agcatcgtgc tgatccagaa cccgtactac 6960
cacaaacagc tcatccgtaa ctggattctg aatcgtctga agcgcattaa aaaagtgaag 7020
tttatcagtc tggttcacga cgtggaagag ctgcgcaaga gtctgtacaa caactactat 7080
aaaaacgagt tcgagaccat gctgagtctg gcggacagca tcatcgtgca caatgataag 7140
atgaaaagct ttttcatcaa aaagggctac agcgaggaca aactcatcag tctgggcatc 7200
ttcgactatc tgcagaagag cgtggacaaa aagcgcgtga gcttcgaacg tgcgatcagc 7260
gtggcgggca acctcgatat caagaagagc agctatattg cgcagctcgg cagcctcccg 7320
gcgatcaaag cgcatctgta cggtccgaac ttcgaacata gtctggaggc gttcccgaac 7380
atcgaatacc acggtagctt cccggccacg gaaatcccgc agaaactcgt gagcggtttt 7440
ggtctggtgt gggacggcca gagcattgaa acgtgcaccg gcgacttcgg cgagtacctc 7500
cagtacaata acccgcacaa gctgagcctc tatctgagca gtggcatgcc ggttgtgatc 7560
tgggacaaag ccgccgaggc cgatttcgtg aagaaacaca acgtgggtct gtgcgtgagc 7620
agtctgagcg agctccaaga caagctcaac gtgatgaccg agcaagaatt tgaagaaatg 7680
gtgaacaacg tggaaaaaca gaccgcgtgc ctcatcagcg gcgagtacac caaaaaggcg 7740
atcagcgagg cggaacgtgt gatctaagaa tgttcctcta tctgctggtg ttcagtctgc 7800
tgctgattct gatcttcaat ctgctcatcg tgaatctgga ctacatgcac ccgagcatcc 7860
tctttgttgt gccatttctg gtgtttggcg tgacgagcat tctgggcgag gaggcgtata 7920
agatcatctt ccacgaggag acgctgctgg tgatcgttag cagcgcgctg atcttcacct 7980
tcatcacgct gctgagccag accgtgtaca aaagcaaaga gaatctgaac ttcccgctga 8040
ccgagatcat catcagtaag aaagtgacgc tgttttttat tgtgttcttc atcgtgaccc 8100
agctggcgtt catcaagtat ctggaggcca ttagtctggc ccacttcggt tacagcggca 8160
gtctgggtga gatgatcagt ctgtacgacg tgatgacgaa gttctggacc gagatcttca 8220
gcgaactcaa cgtgccgatc ccgctgctct accgtatcgg caatccaatc acgcaaggct 8280
tcggctatct gattgtgtat attttcatcc acaactacgt tgccaccaag cgcatcgata 8340
agctgcatct gctgatcatt ctgctgctgt gtctgaacat cattctcaac ggcagccgca 8400
gtccgatctt ccgcatcgtt acgatgatgc tgatcacctt ttatgtgctg tataacaagc 8460
agaacaacgt gcgtcgcggc aacatcaagt ttctgctgaa gagtctgctg atcgtgatct 8520
tcagcggcac cttcttcatt gcgctgctga gtctgatggg ccgtgaaaac gatctggaca 8580
tgttccatta catttttatc tacgttggtg cgccgctggt gaacctcgat aactatctgg 8640
cgtttcgtcc ggatggtagc tacgccacca tctttggcga gcaaacgttt cgcggtctgt 8700
acgcctatat cgcgaagatc atcagcgatg agagtctgat cttcccgacg atcgatcagt 8760
tcacgttcag caacaacggt ctggagatcg gtaacgtgta taccaccttc tatagcttca 8820
tctacgattt cgagtacgtg ggcttcatcc cgctgattct gattatcgcg ctgtactacg 8880
tgttcacgta tcagcgcctc aagacgcgcg ccatcaagac caataaagtg catttcagtc 8940
tgttcatcta tgcctacctc ttcaacgacc tcatcatgct ggccttcagt aatcgcttct 9000
acaccacggt gctggacatc ggcttcatca agattgttat cttcagctat atctgccacc 9060
tcctctttgt gcaccgcagc aagatcaaag gcaccgtatg aacgttaaaa gtgtgaaatt 9120
taatttcatt atgaatctga ttctgaccgt tagcaacttt ctgttcccgc tggtgacgtt 9180
cccatacgtt agtcgcattc tgcagccaga aggtaccggt aaagtggcct ttgcgattag 9240
cgtggttagc tacttcagca tcttcgcgag tctgggtgtg gccacctatg gcgttcgtgc 9300
gtgtgcgcaa gttcgcgaca ataaagatct gctgagtcgt acggtgcatg agctgctgtt 9360
catcaacatc atcgccacga tcattgtgta cgtttgcttt ctgctggtgg tggcgtttac 9420
cccacgcttt agcgcggaaa aagagctgtt ctgggcgacg agcatcttta ttctgttcac 9480
catcattggc atcgagtggc tctacaaggg tctggagaag taccagtaca tcacgatccg 9540
cacgatcatc ttcaagctca ttgcgctggt gctcgtgttt gtgttcatca agacgaagga 9600
tgactacgtg atcttcgccg tgatcagtgt gtttgcgatc gttggcagcg gcatcttcaa 9660
cctctttaac agtcgcaagc tgattaacta ccatctgtac gaggattacg agttccgcaa 9720
gcatttcaag ccaatgtttc tgctgtttct cacgacgctc agcatcgcca tctacaccag 9780
tgtggatgaa gcgattctgg gtctgctgac gagtccgcaa gatgtgggct actataacgc 9840
ggccatgaag gttaagggca ttctgtttac gctgatcacc agtctgggca ttgtgctgct 9900
gccgcgtctg agctattatg ttgagaacaa tatgacggat gaattccatg ccgccctcaa 9960
gaagagcatg aacttcatca tcgtgatcgc cgttccagtg gtgatcttct tcatgctgtt 10020
cgccaaggag attattctgc tgctggccgg cgaaagttat atcaacgcca ttctgccgct 10080
gcagattatt gtgtgggcgc tgctgctcag cgccattacc aacattctgg gcatccagat 10140
tctgctgccg ctcaagaagg ataaagagct gctgatcagc gtgctgctcg cggccattgt 10200
ggacattgtg gccaatctga ttctggttcc gcaactcgcc agcgttggta ccgccatcag 10260
cgttgtgatg gccgaactca ccgtgctggt ggtgcagctg gttatcctcc gcaagtacat 10320
ctggatcctc ttcagcaatc tccagttcgt gcgcatcggt ctgagcatcg ttttcagcat 10380
cgtgctgagc ctcagcatct atcagtggaa catcacgaac agcatcatgc tcacgtttct 10440
gatcatgggc ttcatcttct tcacgaccta cttcattctg ctgctgattc tgaaggagaa 10500
cttcatgatg tacgtgtacc agaccatcca gcacaagatt ctgaaataaa ttatatagtg 10560
ttatcacata acgtatcctt ggagaataga aatgaaatat gattatctga tcgtgggcgc 10620
cggtctgttt ggcagcatct ttgcgcgcga ggccaccaag cgtggcaaga aatgtctggt 10680
tatcgagaag cgcgatcaca tcggtggcaa ctgctacacg cagaacgtgg aaggcatcaa 10740
cgttcacaaa tacggtgcgc acatcttcca caccagcaac aaggtggttt gggactacat 10800
ccagcagttc gccgagttca atcgctttac caacagcccg gtggcccgct ataaggacga 10860
actgtacagc ctcccgttca acatgctcac cttcaacaag atgtggggcg ttatcacgcc 10920
gcaagaagcc gaagcgaaaa tcaaggagca gatcgcgaag gagaacatca cggatccgaa 10980
gaatctcgag gagcaagcca tcagtctggt tggtcgcgat atctacgaga agctcatcaa 11040
gggctatacc gagaagcagt ggggccgtaa gtgtacggag ctgccagcct tcatcatcaa 11100
gcgtctgcca gttcgctaca cgtacgacaa caactacttc tacgacacct atcaaggcat 11160
cccgatcggt ggctacaccg gcatctttga acgcatgctc gagggcatcg aggtgaaact 11220
gggcgttgac ttcttcgcgg aacgcgaaca ttacgagagt ctggccgaga agatcgtgtt 11280
caccggtatg attgacgaat attttggtta ccagttcggc aaactggaat accgcagtct 11340
gcgcttcgac aacgaagtgc tgaacatccc gaactaccaa ggcaatgcgg tggtgaacta 11400
tacggaagcc gaggtgccat atacgcgcat catcgagcat aagcatttcg agtacggcac 11460
ccagccgaaa accgtgatca cgcgcgaaca cagcaaggag tacgaagaag gcgacgagcc 11520
gtattacccg atcaacgacg cccgcaacaa cgaactgtac gccaagtaca aggcgctggc 11580
cgacgcgacc ccaaacgtta ttttcggtgg ccgtctggcc cagtataagt acttcgacat 11640
gcacaatatc atcgccgagg cgctggagtg cgttaaggtg cacttttaat ataagggagt 11700
aacgctatga ataagatcat cgcgaagatc agtctgatcc tcgtggatat cgtggccatc 11760
ttcgttagca ttctgatcgc cgtgagtctg cgtaaaattc tgggtctgct cttcacgctg 11820
ccggagatcg actacagcta catcttcttc gcgtatgtgt atctgattct gattctgatg 11880
atgacgtacc tcggcgcgta taccaaacgc tacgactttt ggcacgaaag ccgtctgatc 11940
gtgcgcggca gctttctcag tctgctgatt ctgctgagtg ccctcgcgct gggccaaaac 12000
gcggaatact atagccgcag cacgctcgtg ctgatctttc tctgctgcgc catcgtgctg 12060
ccgatcgcca agattttcac caaaaaaatt ctgttcaaac tgggtatctg gcagctgccg 12120
gcgaaggtga tcagcgagaa cgaccagttc aaaaacgagc tcttcgaaga ccagtatctg 12180
ggctatgtga aggcgaaaca cagcgagcac aagattatct tcatcgacgg cgcgaatctg 12240
ggcaaagatc gtctgaacca gatcatcgag gacaacatca agaatagccg tgagatcatc 12300
ttcaccccgg ttctgaatgg ctacgacttc agccatagct acatttataa catcttcaac 12360
acgcgcacca acattttcac gctggagaac gagctgctga gcaaaagcaa ccgcatcttc 12420
aaactgctga tggactatat tctggtgctg ggtagtgccg tgttctgggt gccggtgctg 12480
gtgctcatcg cgttctggat caagaaggag gatccgaaag gcgaggtgtt ctttctgcag 12540
cgtcgcctcg gcgtgaatgg caaggaattc atgtgctaca aattccgcag catgtacagc 12600
gaccagagct tcatgcaaga atggctggag aaaaatccgg aggaggccgc gtactaccgc 12660
atctaccata agtatatgaa cgatccgcgc atcaccaaaa tcggcgcgtt cctccgcaaa 12720
accagtctgg acgaactgcc gcagctgatc aacgtgctgc gtggtgagat gagtctcgtt 12780
ggtccgcgcc cgtacatggt tatcgagaag aaggacatcg gcaaaaaagc cccactggtg 12840
ctcgcggtta agccgggcat tacgggcatg tggcaagtta gcggccgcag tgatgtgaac 12900
ttcgacagcc gcgtggagat ggatgtgtgg tatatgaaaa attggagtct gtggaatgac 12960
atcgtgattc tgatcaaaac ggtgcaagcc gtgttcaagc gcgacggtgc ctattaaagt 13020
atgatcacca gcatccagta cctccgtggc atcgccgcgc tgttcgtggt gctgttccac 13080
atgaagtgga tgctcaacaa tgtgtacgtg gagaagaacc tcggcgacat cttcttcatc 13140
agcggcaact tcggcgtgga tctgttcttc gtgatcagcg gcttcgtgat ctgtctgagc 13200
acggaacgcg aaacgctgca cccggtgaag gagtttttca tccgccgctt cttccgcatc 13260
tacccactgc tgctgctgag cgtttgcacc atctacattc tgggcgactt caagatccac 13320
gagctgatcc tcagcatgat cccaatccat ctggactaca gcagcccgag cccggtgttc 13380
ggctacaaca ttctggttag cgcgtggacc atcacctacg agattagctt ctacatcatc 13440
ctcgtgctga gtctgatgat caaccatcgc ttccgctgcg aactgaccat tctgttctaa 13500
ttatcattaa tatagtttca aactattatt attttggtga atatagccta tcactagata 13560
gagagatacc ccttgataaa aggggacatt tttttgttat gttctcatca tcaatgttat 13620
taacatttat ttatgggatt ttaatatata taaaattaca aattttatga aaagcattat 13680
catcctcgac aagtacttcc tctacagcat tctgctggtg gtgatcagct tcgtgttcat 13740
caaacacccg atcttcgacg gccacggtgt gctgaaatgg ggctttctga gcttcatcat 13800
tctgctgatt ctgctcatca tcgagaacac ctacggcatc gccaaaagca actttctgtt 13860
ctggctgggc gaaatcagct acagtctgta tctgacgcac atcattatcc tcgaattcat 13920
tctgaagcac atcaccccgg agatctggaa caacccgaat ctgggcatga gcaagatcct 13980
cttctacctc gccatcagca tcagcttcag ctatctggtg tatctgctgg tggagaagcc 14040
gttcatcaac ctcggcaaga agctgatcac gaagctgtaa atattaatgg atgattttat 14100
gaagtcacga aatctcgaac ctacaaaaac gcatctgatc tatttagata tactaaatat 14160
ttttgcttgc attgctgtac ttttttacat cacaatggta ttgtacattg gtataacgta 14220
aatgaattgg cttggaaaca agccttattt tttgaagtgg ctttttattg ggctgttcct 14280
attttcttta tgctcaccgg cgccacgctg ttcgaatacc gcaaccgcta cagcacgaag 14340
cagtttttca tcaagcgcat ccagcgcgcc gtgttcccgt ttctgagctg cagcctcatt 14400
ctgctgggct atagctttta cagcggcatg atcgaggcct ttagcatccg cgacagcatc 14460
agtgccatct tcaacaccaa ggacatcccg ttcattgaaa tctattggtt ttttatccat 14520
ctctttagtc tgtacatggt gatcccggtg ctcagtctgc tgaaagataa ctaccgcatt 14580
ctgtgctata ttgtgggcgc catgtttctg acccacagtc tgtttccggt gatctttgac 14640
ttcttcaagc tgcactacaa ctggagcatc attttcccga tggcgggcta cagcatctat 14700
ctggttctgg gctatctgct gagtaaggtg aaactggaaa agaaatatca gatcatcatt 14760
tacattctgg gcattctgag cgtgctgctc cgctactttt atacctacgt gagcagtctg 14820
gaggccaacc agctcgatcg cacgctgttc agctacatgc aattccacac cgtgtttctg 14880
gcggtggcga tcttcatttt cgtgaaggaa ttcttcagcg gtgtgaaact gttcaacgcc 14940
aaggtgctgg cggtgttcag cagctgtagt ctgggcatct atctgatcca caagctcgtg 15000
atggactacg aactcaagtt tctgggcatc agcgaggaca atctctactg gcgctttttc 15060
ggcgccttca tgacgtacgg cgcgtgcctc gtgatcgtgc tgtttgttaa gcgcatcccg 15120
tatctgcgcg ccatctttcc gtaaagatat tataaatatg aaaattctga tcaccggtgg 15180
cgccggtttt atcggcagcg ccgtgatccg ctatatcatc cagcataccc aagatagcgt 15240
ggtgaatgtg gacaaactga cctacgccgg caatctggcg agtctggaaa gcgtgagcaa 15300
tagcagccgc taccactttg agcaagcgga tatttgcgac agcacccgca tcagtcagat 15360
cttctgcaag taccagccgg atgttgtgat gcatctggcc gccgagagcc acgttgatcg 15420
cagcattgat ggtccggcgg cgttcatgca gacgaacatc atcggcacct ataccctcct 15480
cgaagccagc cgccagtatt ggctcagtct gccgctggaa cgcaagcaaa ccttccgctt 15540
ccagcacatc agtacggacg aggtgtatgg cgatctcaac gatagcaacg agctgttcag 15600
cgagaacacg gcctatagcc cgagcagccc atatagcgcc agcaaggccg ccagcgatca 15660
tctcgttcgt gcgtggtttc gtacctatgg tctgccgacg ctggtgacca actgcagcaa 15720
taactatggc ccgttccagt tcccggagaa actgatcccg ctgatgattc tgaacgccat 15780
tagtggcaaa ccgctgccga tctatggcaa tggtctgcag atccgcgact ggctgttcgt 15840
tgaagaccac gccatcgcgc tgtatcaagt tctctgtcgc ggcaaagtgg gcgaaacgta 15900
caacatcggt ggccacaatg agaagaccaa tatcgaggtg gtgcaagcga tctgccgtct 15960
gctggacgaa ctggtgccga ataaaccgag cggcatcgag cagtatgaag aactcgtgac 16020
ctacgtggcc gatcgcccgg gccatgatgt tcgctacgcc atcgacgcga gcaaaatcga 16080
gaatcagctg ggttggacgc cgaaagaaac cttcgaaagc ggtctccgca agaccgtgga 16140
gtggtatctg aataaccaga agtggtggca gagcgttctg gatggcagtt actgcggtga 16200
gcgtctgggt ctgagtctga aaagctacta agcggcaaat agtatttcag tggggatcat 16260
tttggatcca tataaaatag ttggtctgtt tttgttgaaa ttttagcgaa aattgttaaa 16320
aaataagtcg atttgcctct tattctcact gaatttaccc tttactttaa ctatcatttt 16380
ctattccata aggcgtattt aatgtggtat ttaatttgcc aataaaaatt aattgctcaa 16440
gtcgttacac acgctaccgc ccctggctca tcagctacca gtgcactgcg tacatatcga 16500
cttgttgcaa acctcgccca gcagggcaaa gctcactaaa acttaaacgc taattgtctt 16560
attaattgca tccggaaaca aggattaatc ttataaaatc agcattaaaa tgctccagat 16620
aaccccttgt tacttaagcc ctttatacaa aactaaaacg gcagtcaaca ctcgtttcag 16680
ccaacttgcc gcttcgaatg ttcactgccg ttattatgtt tatcaccaac catttatcac 16740
ggttgttaat acttattcat gcaaaagctg ctctatgctc ttacggaact tggctccttc 16800
tttcaggttg cgcagcccgt acttcacaaa tgcctgcatg tagcccattt ttttaccgca 16860
gtcatagctg tcacccgtca ttagcatcgc gtcaaccgac tgttttttcg ccagttcagc 16920
aatggcatcg gtgagctgga tgcggcccca ggcgcccggt tcggttcttt ccagttccgc 16980
ccagatgtcg gctgaaagca cataacggcc taccgccatc aaatcggaat ccagcgtctg 17040
cggctgatcc ggtttttcga taaactccac aatccggctg actttgcctt cattatccag 17100
aggttctttc gtctggataa cggaatactc cgataaatca cctttcatgc gcttcgccag 17160
cacctggctg cgacccgttt cattgaaacg cgccaccatc gccgcaaggt tatagcgcag 17220
cggatcggcg gtagcatcat cgataataat atccgggagt accacaatga aagggttatc 17280
gcccacgacc ggacgcgcgc acagaataga atgccccagc cctaacggct gcgcctggcg 17340
aacgttcata atcgtcacgc ccggtgggca gatagattgc acttccgcca aaagctgacg 17400
cttaacgcgc tgctcaagaa gtgattcaag ttcataagag gtgtcgaagt ggttctcaac 17460
ggcgttttta gacgcgtgag tcaccagcac gatttctttg atccctgcag ccacaatctc 17520
atcgacaatg tactgaatca ttggcttgtc gacgatcggt agcatctctt ttgggattgc 17580
cttggtggca ggcaacatat gcatacccaa acccgctacc ggtataactg ctttcaaatt 17640
catcattgtt tcttccacct gtaaaatggt tgctgaatta tagctcttta gcttgttttc 17700
gccagcatga attactctgc tgccagggat aatgatggca cgctctacat tacgtcttag 17760
tcggcaccat aacatatcga ttaccctgtt atccct 17796
<210> 47
<211> 1128
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1128)
<223> 截短的ApxII (N-端 HIS10 tag ApxII(439-801aa)
<400> 47
atggggcacc accatcacca tcatcatcac caccatcaag gttatgattc tcgtcattta 60
gctgatttac aagacaatat gaagtttctt atcaatttaa ataaagaact tcaggctgaa 120
cgcgtagtag ctattaccca acaaagatgg gataaccaaa ttggagacct agcggcaatt 180
agccgtagaa cggataaaat ttccagtgga aaagcttatg tggatgcttt tgaggagggg 240
caacaccagt cctacgattc atccgtacag ctagataaca aaaacggtat tattaatatt 300
agtaatacaa atagaaagac acaaagtgtt ttattcagaa ctccattact aactccaggt 360
gaagagaatc gggaacgtat tcaggaaggt aaaaattctt atattacaaa attacatata 420
caaagagttg acagttggac tgtaacagat ggtgatgcta gctcaagcgt agatttcact 480
aatgtagtac aacgaatcgc tgtgaaattt gatgatgcag gtaacattat agaatctaaa 540
gatactaaaa ttatcgcaaa tttaggtgct ggtaacgata atgtatttgt tgggtcaagt 600
actaccgtta ttgatggcgg ggacggacat gatcgagttc actacagtag aggagaatat 660
ggcgcattag ttattgatgc tacagccgag acagaaaaag gctcatattc agtaaaacgc 720
tatgtcggag acagtaaagc attacatgaa acaattgcca cccacccaac aaatgttggt 780
aatcgtgaag aaaaaattga atatcgtcgt gaagatgatc gttttcatac tggttatact 840
gtgacggact cactcaaatc agttgaagag atcattggtt cacaatttaa tgatattttc 900
aaaggaagcc aatttgatga tgtgttccat ggtggtaatg gtgtagacac tattgatggt 960
aacgatggtg acgatcattt atttggtggc gcaggcgatg atgttatcga tggaggaaac 1020
ggtaacaatt tccttgttgg aggaaccggt aatgatatta tctcgggagg taaagataat 1080
gatatttatg tccataaaac aggcgatgga aatgattcta ttacataa 1128
<210> 48
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(693)
<223> ApxIII(27-245aa)-HIS10 (合成的)
<400> 48
gatgtaacta aaaatggttt gcaatatggg gtgagtcaag caaaattaca agcattagca 60
gctggtaaag ccgttcaaaa gtacggtaat aaattagttt tagttattcc aaaagagtat 120
gacggaagtg ttggtaacgg tttctttgat ttagtaaaag cagctgagga attaggcatt 180
caagttaaat atgttaaccg taatgaattg gaagttgccc ataaaagttt aggtaccgca 240
gaccaattct tgggtttaac agaacgtgga cttactttat ttgcaccgca actagatcag 300
ttcttacaaa aacattcaaa aatttctaac gtagtgggca gttctactgg tgatgcagta 360
agtaaacttg ctaagagtca aactattatt tcaggaattc aatctgtatt aggtactgta 420
ttagcaggta ttaatcttaa tgaagctatt attagtggcg gttcagagct cgaattagct 480
gaagctggtg tttctttagc ctctgagctc gttagtaata ttgctaaagg tacaacaaca 540
atagatgctt tcactacaca aatccagaac tttgggaaat tagtggaaaa tgctaaaggg 600
ttaggtggtg ttggccgcca attacagaat atttcaggtt ctgcattaag caaaactgga 660
caccaccatc accatcatca tcaccaccat taa 693
<210> 49
<211> 4581
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4518)
<223> rfaK(SL1344)-proD- ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6-氯霉素抗性盒-rfaL(SL1344)
<400> 49
cgatcgcaat ttgtgttaga tggcataacg ggctatcacc tcgcagaacc tatgtcgagc 60
gacagtataa ttaatgatat taaccgtgcg cttgctgata aggaacgcca ccagattgcc 120
gaaaaagcaa aatccctggt gttttcaaaa tacagttggg aaaatgtagc gcagcgtttc 180
gaggaacaaa tgaaaaactg gtttgataag tgactcgagt tctagagcac agctaacacc 240
acgtcgtccc tatctgctgc cctaggtcta tgagtggttg ctggataact ttacgggcat 300
gcataaggct cgtataatat attcagggag accacaacgg tttccctcta caaataattt 360
tgtttaactt ttactagagt cacacaggaa agtactagat gaccgaaatc gtggcggaca 420
agaccgtgga ggtggttaaa aacgccatcg aaacggcgga tggcgccctc gatctgtata 480
ataaatatct cgaccaagtt attccgtggc agaccttcga tgagacgatc aaggaactca 540
gccgtttcaa gcaagaatac agccaagccg ccagtgtgct ggtgggcgat atcaaaacgc 600
tgctgatgga cagccaagat aagtacttcg aggcgaccca aaccgtgtat gaatggtgcg 660
gtgttgccac gcaactgctg gccgcgtaca ttctgctgtt cgatgagtat aacgagaaga 720
aggcgagcgc ccagaaggac attctgatca aggtgctcga cgacggcatc acgaagctga 780
acgaagcgca gaagagtctg ctcgttagta gccagagctt caataacgcc agtggcaagc 840
tcctcgcgct ggacagtcag ctgacgaacg actttagcga gaaaagcagt tacttccaga 900
gccaagttga caaaatccgc aaggaggcgt acgccggtgc cgccgcgggt gttgtggccg 960
gtccgtttgg cctcattatc agctacagca tcgcggccgg cgtggtggaa ggcaaactga 1020
tcccggagct gaaaaataaa ctgaaaagcg ttcagaattt cttcaccacg ctgagcaaca 1080
cggtgaagca agcgaacaag gacatcgacg cggcgaaact gaagctgacc acggagatcg 1140
cggccatcgg cgaaatcaag accgaaacgg aaaccacgcg cttctatgtg gactacgatg 1200
atctgatgct cagtctgctg aaggaagcgg cgaagaaaat gattaacacg tgcaacgagt 1260
accagaagcg ccatggtaag aagacgctct tcgaggtgcc ggaggtgtac gcgggtaatg 1320
gccacgacgt ggcgtactac gataagacgg acaccggtta cctcaccttc gatggtcaga 1380
gtgcccaaaa ggcgggcgaa tatatcgtta ccaaggaact gaaggcggac gttaaggtgc 1440
tcaaagaggt ggtgaaaacc caagatatta gcgttggcaa gcgcagcgag aaactggaat 1500
accgcgacta tgagctgagc ccattcgaac tcggcaacgg tatccgcgcc aaagatgagc 1560
tgcatagcgt ggaagaaatt atcggcagca accgcaagga taagttcttc ggcagtcgct 1620
tcacggatat cttccatggc gcgaaaggcg acgacgaaat ctatggcaat gacggtcacg 1680
acattctgta cggcgatgac ggcaacgacg ttattcatgg tggtgacggt aatgaccatc 1740
tggttggcgg caatggtaat gatcgcctca tcggcggcaa aggtaataat ttcctcaacg 1800
gcggcgatgg tgatgatgaa ctgcaagttt tcgagggtca gtacaacgtt ctgctcggtg 1860
gtgcgggtaa cgacattctg tatggcagcg atggcacgaa tctgttcgat ggcggtgtgg 1920
gtaacgacaa gatttacggc ggtctcggca aagatatcaa tctcggtgcg ggcaatgaca 1980
acgtgtttgt gggcagcagt accacggtga ttgatggtgg tgatggccat gatcgcgttc 2040
attacagccg cggcgaatac ggcgccctcg ttattgacgc caccgcggaa acggagaagg 2100
gtagctatag cgtgaagcgt tacgtgggcg atagcaaagc cctccacgaa accatcgcga 2160
cccatcagac caatgtgggc aaccgcgaag agaaaatcga gtaccgccgc gaggatgatc 2220
gcttccatac gggctacacg gtgaccgata gtctgaaaag tgtggaggaa atcatcggta 2280
gccagtttaa tgatatcttc aagggcagcc aattcgacga cgtgttccac ggcggcaacg 2340
gtgtggatac catcgatggc aatgatggtg acgaccatct cttcggcggt gcgggcgatg 2400
atgttatcga tggcggtaac ggcaataact ttctggttgg cggtaccggc aacgacatca 2460
ttagtggcgg caaggacaac gacatctacg ttcacaaaac gggcgacggt aacgacagca 2520
tcaccgatag cggtggccaa gataaactgg cgcatctggg taacggcaac gataaagtgt 2580
ttctggccgc gggtagtgcg gagattcatg cgggtgaggg tcacgatgtg gtgtactatg 2640
ataagaccga taccggtctg ctggtgatcg atggtacgaa agcgacggaa caaggccgct 2700
acagcgttac gcgcgagctg agtggcgcga ccaaaattct gcgtgaggtg attaaaaatc 2760
agaaaagcgc ggttggcaaa cgcgaagaga cgctggaata ccgtgactac gaactgaccc 2820
agagcggcaa cagcaatctg aaagcccacg atgaactgca tagtgtggag gagattattg 2880
gcagcaatca gcgtgacgag ttcaaaggca gcaagttccg cgacatcttc cacggcgccg 2940
acggtgacga tctgctgaac ggtaatgacg gcgatgacat tctgtacggc gacaaaggca 3000
atgatgagct gcgcggcgac aacggtaatg atcagctgta tggcggtgag ggtgatgata 3060
aactgctggg cggtaatggc aacaattatc tgagtggtgg cgacggcaac gatgagctgc 3120
aagttctggg caacggcttt aacgtgctgc gcggcggtaa aggcgatgat aagctgtacg 3180
gtagcagtgg tagcgatctg ctggatggcg gcgagggcaa tgattatctg gaaggcggtg 3240
atggcagtga ctttcaccat caccaccatc actaactaaa tatattttag gtcacctctc 3300
aaatcgtttg cctgataccg ctccaattac acgtcttgag cgattgtgta ggctggagct 3360
gcttcgaagt tcctatactt tctagagaat aggaacttcg gaataggaac ttcatttaaa 3420
tggcgcgcct tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac tgttgtaatt cattaagcat 3480
tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc atgatgaacc tgaatcgcca gcggcatcag 3540
caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa acgggggcga agaagttgtc 3600
catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc cagggattgg ctgagacgaa 3660
aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg ttttcaccgt aacacgccac 3720
atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg tggtattcac tccagagcga 3780
tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa gggtgaacac tatcccatat 3840
caccagctca ccgtctttca ttgccatacg taattccgga tgagcattca tcaggcgggc 3900
aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa 3960
ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc 4020
ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt 4080
tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgac aactcaaaaa atacgcccgg 4140
tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca 4200
ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc ggtatcaaca gggacaccag gatttattta 4260
ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtag gcgcgccgaa gttcctatac tttctagaga 4320
ataggaactt cggaatagga actaaggagg atattcatat ggacccagcg cgttttttta 4380
tctatttctt agcgccagca gaaaaccggt aatgatacca atttgagcaa tatcgacctg 4440
ttcaaaattg ccacgaacga tataaaaacc gacgaaagat aaaaatagca agagatgagc 4500
attgtagggg cttatctcta ctttcctgag ggtagagctg gctgtttccc tgatgatagc 4560
gccatataaa taggcggccg c 4581
<210> 50
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(365)
<223> rfb (APP2)簇基因kanE的氨基酸序列
<400> 50
Met Lys His Lys Ile Leu His Phe Ser Gln Val Leu Gly Gly Val Gly
1 5 10 15
Arg Tyr Leu Glu Leu Tyr Asp Lys Tyr Ile Asn Lys Asp Ser Phe Glu
20 25 30
Asn Ile Tyr Ile Leu Pro Ile Gly Asp Trp Glu Ala Ala Glu Ala Gln
35 40 45
Asp Lys Arg Tyr Ile Leu Asn Ile Glu Gln Ser Phe Ser Pro Ile Lys
50 55 60
Leu Ile Ser Asn Val Ile Lys Ile Arg Asn Ile Leu Lys Lys Glu Lys
65 70 75 80
Pro Asp Ile Phe Tyr Leu His Ser Thr Phe Ala Gly Val Ile Gly Arg
85 90 95
Leu Ala Ala Ile Gly Met Arg Cys Lys Val Ile Tyr Asn Pro His Gly
100 105 110
Trp Ser Phe Lys Met Asn Val Ser Arg Leu Lys Gln Thr Phe Tyr Lys
115 120 125
Ile Ile Glu Gly Gly Leu Val Phe Leu Thr Asp Lys Phe Val Leu Ile
130 135 140
Ser Lys Ser Glu Tyr Glu Ala Ala Arg Ser Ile Gly Val Ser Glu Lys
145 150 155 160
Lys Cys Cys Leu Ile Tyr Asn Gly Ile Glu Thr Ile Lys Lys Thr Asp
165 170 175
Ile Ala Ile Ile Pro Lys Leu Asp Asp Lys Tyr Ile Ile Gly Met Ile
180 185 190
Gly Arg Ile Ser Glu Gln Lys Asn Pro Met Phe Phe Ala Gln Phe Ala
195 200 205
Lys Glu Ile Ile Lys Gln Tyr Pro Asn Thr Tyr Phe Ile Leu Val Gly
210 215 220
Asp Gly Glu Gln Arg Glu Ser Leu Glu Asp Tyr Leu Glu Arg Asn Asn
225 230 235 240
Leu Asn Asp Val Phe Tyr Ile Thr Gly Trp Val Thr Asn Pro Glu Ser
245 250 255
Tyr Leu Asn Leu Phe Asp Gln Ala Val Leu Phe Ser Lys Trp Glu Gly
260 265 270
Leu Cys Leu Ser Val Cys Glu Tyr Met Leu Tyr Glu Lys Pro Ile Leu
275 280 285
Val Ser Asn Ile Gly Gly Ile Asn Asp Leu Ile Gln Asn Glu Val Asn
290 295 300
Gly Phe Thr Ile Val Glu Gly Asp Leu Lys Asp Ala Val Asn Lys Ser
305 310 315 320
Asn Arg Leu Arg Asn Glu Pro Lys Thr Val Ala Lys Phe Ile Glu Ala
325 330 335
Ser Asn Ile Leu Ile Gln Glu Lys Phe Asn Ala Gln Lys Met Val Asn
340 345 350
Ser Leu Glu Lys Leu Phe Ile Lys Leu Ser Glu Asn Lys
355 360 365
<210> 51
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(288)
<223> rfb (APP2)簇基因cpsP的氨基酸序列
<400> 51
Met Lys Glu Lys Phe Ser Cys Ile Val Val Cys Tyr Asn Pro Asp Asn
1 5 10 15
Ser Val Leu Asp Asn Leu Lys Asn Tyr Ile Ser Tyr Val Gly Lys Val
20 25 30
Ile Val Val Asp Asn Ser Asp Val Asp Asn Ser Gln Leu Phe Ser Ser
35 40 45
Leu Ser Glu Tyr Leu Ile Tyr Ile Pro Leu Tyr Lys Asn Val Gly Ile
50 55 60
Ala Tyr Ala Leu Asn Ile Gly Val Glu Lys Ser Lys Glu Leu Gly Tyr
65 70 75 80
Glu Tyr Ile Ile Thr Met Asp Gln Asp Ser Ser Phe Ala Thr Asn Leu
85 90 95
Val Asp Val Tyr Ser His Tyr Ile Ser Asn Tyr Pro Ile Asp Gln Ile
100 105 110
Gly Ala Leu Ser Pro Val Tyr Ile Thr Asp Arg Gly Phe Asn Arg Thr
115 120 125
Ser Lys Glu Glu Phe Lys Gln Ile Lys Ile Thr Met Gln Ser Gly Ser
130 135 140
Met Phe Phe Thr Asp Lys Phe Asp Val Ile Gly Arg Phe Asp Asn Asp
145 150 155 160
Leu Phe Leu Asp Val Val Asp Trp Glu Tyr Phe Phe Arg Ile Tyr Thr
165 170 175
Leu Gly Tyr Lys Thr Ile Gln Cys Asn Lys Ala Met Leu Lys His Ala
180 185 190
Pro Ala Glu Thr Leu Thr Leu Phe Lys Ile Lys Gly Lys Thr Ile Gly
195 200 205
Val Gly Val Ala Ser Pro Leu Arg Tyr Tyr Tyr Gln Ile Arg Asn Leu
210 215 220
Leu Trp Cys Val Leu His Lys Lys Ser Phe Phe Met Ile Lys Thr Ile
225 230 235 240
Ala Tyr Lys Phe Ile Lys Ile Leu Phe Leu Phe Asn Asn Lys Lys Gln
245 250 255
Tyr Leu Ser Phe Ala Tyr Met Ala Ile Lys Asp Ala Phe Asn Asn Arg
260 265 270
Leu Gly Ala Tyr Asp Thr Leu Tyr Leu Glu Lys Ser Arg Asn Glu Lys
275 280 285
<210> 52
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(328)
<223> rfb (APP2)簇基因epsJ的氨基酸序列
<400> 52
Met Lys Asn Asp Leu Pro Leu Ile Ser Ile Ile Ile Pro Ile Tyr Asn
1 5 10 15
Val Lys Pro Tyr Leu Glu Lys Cys Val Asn Ser Val Leu Ser Gln Ser
20 25 30
Tyr Pro Asn Leu Glu Ile Ile Leu Val Asp Asp Gly Ala Thr Asp Gly
35 40 45
Ser Ala Gln Val Cys Asp Asp Phe Ser Glu Lys Tyr Ala Asn Ile Gln
50 55 60
Val Ile His Lys Lys Asn Gly Gly Leu Ser Ser Ala Arg Asn Ala Gly
65 70 75 80
Ile Glu Ala Met Lys Gly Glu Tyr Val Phe Phe Leu Asp Ser Asp Asp
85 90 95
Trp Ile Ala Asn Asp Ala Ile Ser Gln Leu Tyr Asp Asp Met Val Glu
100 105 110
Tyr Asn Ala Asp Ile Thr Gly Ile Ser Phe Tyr Gln Ala Tyr Ser Asp
115 120 125
Gly Asn Leu Val Leu Asn Thr His Leu Ile Glu Lys Gln Met Leu Ser
130 135 140
Lys Lys Glu Ala Leu Arg Thr Phe Leu Phe Asn Asn Tyr Leu Thr Pro
145 150 155 160
Cys Ser Cys Gly Lys Leu Tyr Lys Ala Ser Leu Trp Lys Asp Ile Arg
165 170 175
Phe Pro Glu Gly Arg Leu Phe Glu Asp Gln Leu Thr Thr Tyr Lys Val
180 185 190
Ile Glu Leu Ala Asn Thr Ile Ile Phe Asn Pro Ala Ala Lys Tyr Phe
195 200 205
Tyr Phe Lys Arg Ile Gly Ser Ile Gly His Ser Ala Phe Ser Glu Lys
210 215 220
Thr Tyr Asp Leu Tyr Glu Ala Val Asn Glu Gln Tyr Asn Glu Ile Thr
225 230 235 240
Lys His His Pro Asp Ile Glu Ser Asp Leu Ala Val Ala Lys Ile Thr
245 250 255
Trp Glu Ile Val Phe Ile Asn Met Met Leu Asn Ser Asn Tyr Ser Asp
260 265 270
Gln Ala Ile Val Asp Lys Thr Arg Val Phe Ala Arg Lys Arg Ile Leu
275 280 285
Asp Val Val Lys Cys Glu Phe Ile Pro Asn Leu Arg Lys Phe Gln Ile
290 295 300
Thr Leu Phe Ala Tyr Asn Phe Ser Leu Tyr Lys Val Leu Tyr Ala Arg
305 310 315 320
Tyr Lys Lys Lys Asn Pro Leu Ser
325
<210> 53
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(225)
<223> rfb (APP2)簇基因setA的氨基酸序列
<400> 53
Met Ile Pro Lys Lys Ile His Tyr Cys Trp Phe Gly Gly Asn Pro Leu
1 5 10 15
Pro Lys Ser Val Lys Lys Cys Ile Lys Ser Trp Lys Lys Tyr Cys Pro
20 25 30
Asp Tyr Glu Ile Ile Glu Trp Asn Glu Ser Asn Tyr Asn Val His Lys
35 40 45
Asn Leu Phe Ile Lys Glu Ala Tyr Glu Lys Lys Lys Phe Ala Phe Val
50 55 60
Ser Asp Tyr Ala Arg Leu Asp Val Val His Ser Glu Gly Gly Ile Tyr
65 70 75 80
Leu Asp Thr Asp Val Glu Leu Ile Lys Pro Ile Asp Asp Leu Leu Ala
85 90 95
His Ser Cys Phe Leu Ala Ser Glu Ser Ile Asp Asp Val Asn Thr Gly
100 105 110
Leu Gly Phe Gly Ala Glu Lys Gly His Trp Phe Ile Ala Glu Asn Met
115 120 125
Ser Val Tyr Glu Asn Met Tyr Phe Asn Met Glu Asn Ile Ile Thr Cys
130 135 140
Val Glu Ile Thr Thr Lys Leu Leu Ile Glu Arg Gly Phe Ser Ala Ser
145 150 155 160
Asp Lys Ile Gln Asn Ile Asp Asp Ile Phe Ile Tyr Pro Thr Glu Tyr
165 170 175
Phe Cys Pro Leu Asn Tyr Lys Thr His Glu Leu His Ile Thr Gln Asn
180 185 190
Thr Tyr Ser Ile His His Tyr Asp Ala Thr Trp Gln Ser Pro Leu Met
195 200 205
Lys Phe Lys Thr Lys Ile Lys Tyr Ile Leu Cys Leu Ala Gly Ile Ile
210 215 220
Lys
225
<210> 54
<211> 378
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(378)
<223> rfb (APP2)簇基因假定蛋白的氨基酸序列
<400> 54
Met Asn Ser Leu Val Tyr Arg Ile Asp Ile Arg Thr Leu Ile Phe Ser
1 5 10 15
Ile Phe Tyr Phe Thr Phe Leu Val Ser Asp Phe Leu Leu Leu Ala Gln
20 25 30
Asp Gly Thr Ile Thr Lys Asp Ile Ile Lys Trp Val Lys Leu Phe Ser
35 40 45
Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Ile Phe Lys Leu Pro Leu Asn Leu Leu
50 55 60
Ile Leu Gly Phe Phe Thr Ile Met Ile Ser Ala Phe Tyr Ser Ile Tyr
65 70 75 80
Thr Gly Asp Ser Phe Leu Leu Tyr Ile Cys Leu Leu Met Ser Phe Ser
85 90 95
Tyr Lys Val Asn Phe Asn Phe Leu Phe Lys Ile Gly Leu Tyr Leu Thr
100 105 110
Ser Ile Leu Val Val Leu Ile Leu Thr Tyr Phe Phe Phe Glu Tyr Phe
115 120 125
Leu Ile Gly Asp Ser His Phe Val Tyr Asp Ala Thr Tyr Trp Phe Lys
130 135 140
Arg Tyr Thr Phe Asn Phe Asp Asn Pro Asn Ala Phe Pro Met Arg Ile
145 150 155 160
Phe Val Phe Phe Ile Phe Tyr Ile Leu His Val Gly Lys Leu Arg Leu
165 170 175
Phe Asp Thr Phe Leu Phe Val Ile Leu Phe Gly Ile Val Phe Tyr Phe
180 185 190
Ser Asn Ser Arg Thr Ala Phe Tyr Ile Phe Ile Leu Cys Val Leu Thr
195 200 205
Ile His Phe Asn Gln Val Phe Asn Val Leu Asn Asn Thr Phe Val Lys
210 215 220
Leu Leu Ile Asn Asn Ser Ile Ile Phe Ile Thr Ile Phe Ser Ile Trp
225 230 235 240
Ser Ala Ile Tyr Tyr Gln Asp Tyr Tyr Ser Tyr Leu Glu Pro Ile Asn
245 250 255
Lys Ile Leu Ser Lys Arg Ile Tyr Phe Ala Asn Glu Ala Tyr Lys Ser
260 265 270
Leu Gly Phe Glu Phe Tyr Pro Arg Asn Ile Lys Trp Trp Ile Glu Glu
275 280 285
Ser Asp Trp His Ile Ile Asp Asn Gly Tyr Val Tyr Leu Phe Ile Ser
290 295 300
Gly Gly Leu Leu Val Gly Asn Leu Phe Ile Phe Ser Ile Thr Trp Leu
305 310 315 320
Met Tyr Arg Leu Asn Lys Phe Asn Leu Ser Asn Glu Ala Ile Leu Leu
325 330 335
Met Phe Ser Met Leu Tyr Leu Leu Ser Glu Ser His Phe Ile Asn Ile
340 345 350
Phe Tyr Asn Ile Pro Ile Leu Leu Leu Ala Ile Phe Ile Asn Lys Thr
355 360 365
Asn Ile Val Arg Tyr Leu Glu Cys Lys Lys
370 375
<210> 55
<211> 481
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(481)
<223> rfb (APP2)簇基因rfbX的氨基酸序列
<400> 55
Met Asn Lys Asn Leu Val Asn Asn Ser Ile Met Ser Phe Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ser Asn Phe Ile Phe Pro Leu Ile Thr Phe Thr Tyr Ala Ala Arg
20 25 30
Ile Leu Gln Pro Asp Asn Met Gly Lys Phe Ala Phe Ser Leu Ser Val
35 40 45
Val Asp Tyr Leu Ser Leu Phe Ala Thr Phe Gly Val Val Gly Tyr Gly
50 55 60
Val Arg Ala Cys Ala Glu Val Arg Asn Asn Lys Glu Glu Leu Thr Lys
65 70 75 80
Thr Val Gln Glu Ile Leu Phe Ile Asn Ile Phe Leu Ala Ile Ile Ala
85 90 95
Tyr Leu Val Ile Phe Leu Leu Ile Ser Tyr Gln His Ala Phe Arg Glu
100 105 110
Asp Thr Leu Leu Phe Leu Ile Met Ser Ser Cys Ile Ile Phe Asn Val
115 120 125
Ile Gly Ile Glu Trp Leu Tyr Lys Ser Leu Asp Glu Tyr Arg Tyr Ile
130 135 140
Thr Val Arg Ser Ile Leu Leu Lys Ile Ile Ser Leu Ile Met Ile Leu
145 150 155 160
Cys Phe Val Lys Glu Lys Asp Asp Tyr Pro Leu Phe Ala Leu Phe Phe
165 170 175
Val Leu Pro Ile Cys Leu Ser Ser Leu Leu Asn Ile Ile Asn Ser Arg
180 185 190
Lys Ile Leu Leu Phe Lys Leu Phe Lys Leu Asp Leu Ser Lys His Ile
195 200 205
Lys Pro Met Phe Val Leu Phe Leu Val Thr Leu Ser Tyr Thr Leu Tyr
210 215 220
Ala Asn Val Asn Asp Val Leu Leu Ala Thr Val Thr Asn Thr Glu Gln
225 230 235 240
Val Gly Tyr Tyr Ser Val Ala Phe Lys Ile Lys Ala Ala Leu Leu Ala
245 250 255
Phe Ile Thr Ser Thr Ser Met Val Phe Leu Pro Arg Leu Thr Glu Tyr
260 265 270
Ile Lys Asn Asn Gln Asp Ile Glu Phe Ile Asp Leu Leu Arg Lys Ser
275 280 285
Phe Asp Leu Val Phe Phe Leu Ala Val Pro Ile Thr Leu Phe Phe Phe
290 295 300
Leu Tyr Ala Lys Glu Thr Ile Phe Leu Leu Phe Gly Glu Lys Tyr Asn
305 310 315 320
Lys Ser Ser Leu Leu Leu Gln Thr Met Ile Trp Ser Val Phe Phe Gly
325 330 335
Gly Leu Asn Asn Ile Leu Ser Val Gln Met Leu Leu Pro Leu Lys Lys
340 345 350
Asp Asn Gln Phe Leu Ile Ser Ile Leu Ser Gly Gly Cys Ile Ser Leu
355 360 365
Val Val Asn Phe Ile Phe Leu Arg Glu Leu Gln Ser Leu Ser Thr Ser
370 375 380
Ile Ser Val Leu Val Ala Glu Val Val Ile Leu Ile Ile Gln Leu Val
385 390 395 400
Ile Leu Arg Lys Tyr Ile Val Arg Ile Phe Asn Asn Leu Asn Pro Leu
405 410 415
Lys Val Ile Met Ser Val Phe Phe Ser Ile Trp Phe Val Asn Leu Ile
420 425 430
Tyr Ala Asn Phe Ile Ala Leu Gly Asn Ser Phe Leu Glu Tyr Ile Ile
435 440 445
Ser Ile Phe Ile Phe Ser Leu Phe Tyr Val Phe Leu Leu Phe Phe Ser
450 455 460
Lys Glu Arg Phe Val His Asp Val Phe Phe Tyr Ile Arg Ser Lys Phe
465 470 475 480
Asp
<210> 56
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(236)
<223> rfb (APP2)簇基因vatD的氨基酸序列
<400> 56
Leu Ile Asn Leu Leu Ile Ser Ile Leu Ala Lys Ile Leu Ser Arg Ile
1 5 10 15
Ser Lys Leu Ile Leu Asn Ile Lys Lys Arg Lys Glu Tyr Lys Arg Val
20 25 30
Gly Ser Ile Val Asp Ser Lys Asn Ile Asp Leu Ser Phe Ile Cys Gly
35 40 45
Asn Tyr Cys Arg Val Gly Arg Asp Thr Val Ile Glu Lys Asn Val Ile
50 55 60
Met Gly Arg Leu Ser Tyr Ile Asn Ser Asp Met Gly Lys Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Gly Ser Asn Val Lys Ile Gly Ser Leu Cys Ser Ile Ser Ser Gly Val
85 90 95
Ile Ile Ala Pro Val Asn His Tyr Leu Asn Tyr Val Thr Thr His Pro
100 105 110
Leu Leu Tyr Asn Ser Tyr Tyr Ser Ser Ile Leu Asn Ile Asn Ser Asn
115 120 125
Leu Leu Ser Gln Gln Glu Leu Asp Ala Asn Val Ser Thr Val Ile Gly
130 135 140
Asn Asp Val Trp Ile Gly Ala Asn Val Ile Ile Lys Arg Gly Val Thr
145 150 155 160
Ile Gly Asp Gly Ala Val Ile Gly Ala Gly Ser Ile Ile Thr Lys Asp
165 170 175
Ile Pro Ser Tyr Ala Val Val Ala Gly Val Pro Ala Lys Ile Ile Lys
180 185 190
Tyr Arg Phe Ser Lys Asp Val Ile Glu Ser Leu Lys Asp Ser Lys Asn
195 200 205
Val Trp Glu Leu Ser Thr Ser Glu Leu Glu Glu Asn Phe Ser His Leu
210 215 220
Tyr Asp Val Glu Lys Tyr Leu Asn Arg Phe Lys Leu
225 230 235
<210> 57
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(440)
<223> rfb (APP2)簇基因pglC的氨基酸序列
<400> 57
Met Ser Lys Lys Asn Ile Val Ala Gln Thr Leu Leu Leu Cys Leu Asp
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ile Ser Met Ala Ile Phe Leu Ala Val Phe Ile Arg Asn
20 25 30
Asn Ile Leu Pro Asn Ile Met Leu Phe Glu Pro Val Ser Tyr Ile Glu
35 40 45
Tyr Leu Val Tyr Pro Phe Pro Tyr Val Ile Ile Val Thr Leu Phe Met
50 55 60
Trp Phe Gly Leu Tyr Thr Arg Arg Tyr Asp Leu Trp Gln Glu Ser Leu
65 70 75 80
Phe Ile Ile Lys Val Cys Phe Ile Ser Phe Ile Ile Ile Phe Ala Thr
85 90 95
Leu Ala Leu Gly Lys Asn Ile Glu Tyr Tyr Ser Arg Ala Val Leu Leu
100 105 110
Leu Ser Leu Phe Leu Ser Val Ile Phe Leu Pro Ile Gly Arg Tyr Phe
115 120 125
Leu Lys Lys Ser Leu Phe Arg Leu Gly Leu Trp Glu Arg Lys Val Lys
130 135 140
Phe Ile Gly Asn Leu Asn Lys Asn Glu Ile Gly Ile Phe Asn Ser Pro
145 150 155 160
His Val Gly Tyr Val Leu Ser Lys Asp Asp Thr Tyr Asp Val Ile Phe
165 170 175
Ile Ser Ser Gly Asp Lys Ser Val Ser Glu Leu Asn Asp Leu Ile Glu
180 185 190
Ser Asn Lys Leu Leu Asn Arg Glu Val Leu Phe Ile Pro Val Leu Asn
195 200 205
Gln Tyr Asp Phe Thr Gln Ser Val Leu Tyr Asn Asn Phe Ser Thr Arg
210 215 220
Leu Asn Leu Phe Thr Leu Glu Asn Lys Leu Leu Gly Lys Gln Asn Lys
225 230 235 240
Ile Leu Lys Tyr Leu Leu Asp Tyr Val Leu Val Leu Ser Thr Leu Pro
245 250 255
Phe Trp Gly Gly Leu Ile Leu Leu Ile Ser Ile Lys Leu Lys Leu Glu
260 265 270
Asp Pro Lys Gly Lys Ile Phe Phe Leu Gln Lys Arg Leu Gly Gln Glu
275 280 285
Gly Lys Ile Phe Tyr Cys Tyr Lys Phe Arg Thr Met Val Ser Asp Gln
290 295 300
Ser Phe Met Gln Gln Trp Leu Ile Asp Asn Pro Glu Glu Arg Asp Tyr
305 310 315 320
Tyr Ala Val Tyr His Lys Tyr Ile Asn Asp Pro Arg Ile Thr Lys Phe
325 330 335
Gly His Phe Leu Arg Arg Thr Ser Leu Asp Glu Leu Pro Gln Leu Phe
340 345 350
Asn Val Leu Lys Gly Asp Met Ser Leu Val Gly Asn Arg Pro Tyr Met
355 360 365
Val Glu Glu Gln Gln Lys Met Lys Asp Ala Ala Ser Ile Ile Leu Met
370 375 380
Ser Lys Pro Gly Val Thr Gly Leu Trp Gln Val Ser Gly Arg Ser Asp
385 390 395 400
Val Ser Phe Glu Glu Arg Leu Gln Ile Asp Ser Trp Tyr Ile Lys Asn
405 410 415
Trp Ser Ile Trp Asn Asp Ile Val Ile Leu Phe Lys Thr Val Gly Val
420 425 430
Val Leu Arg Lys Asp Gly Ala Ser
435 440
<210> 58
<211> 354
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(354)
<223> rfb (APP2)簇基因rffG的氨基酸序列
<400> 58
Met Lys Lys Ile Leu Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser Ala
1 5 10 15
Val Val Arg His Ile Ile Asn Asp Thr Gln Asp Ser Val Val Asn Val
20 25 30
Asp Lys Leu Thr Tyr Ala Gly Asn Leu Glu Ser Leu Leu Met Val Glu
35 40 45
Asn Ser Pro Arg Tyr Val Phe Glu Gln Val Asp Ile Cys Asn Arg Ala
50 55 60
Glu Leu Asp Arg Val Phe Ala Gln His Gln Pro Asp Ala Val Met His
65 70 75 80
Leu Ala Ala Glu Ser His Val Asp Arg Ser Ile Asp Gly Pro Ala Ala
85 90 95
Phe Ile Glu Thr Asn Ile Val Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Glu Ala Ala
100 105 110
Arg Tyr Tyr Trp Asn Ser Leu Asp Ala Asp Lys Lys Ser Leu Phe Arg
115 120 125
Phe His His Ile Ser Thr Asp Glu Val Tyr Gly Asp Leu Glu Gly Thr
130 135 140
Glu Asp Leu Phe Thr Glu Thr Thr Pro Tyr Ser Pro Ser Ser Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Lys Ala Ser Ser Asp His Leu Val Arg Ala Trp Leu Arg
165 170 175
Thr Tyr Gly Leu Pro Thr Ile Val Thr Asn Cys Ser Asn Asn Tyr Gly
180 185 190
Pro Phe His Phe Pro Glu Lys Leu Ile Pro Leu Met Ile Leu Asn Ala
195 200 205
Leu Glu Gly Lys Pro Leu Pro Val Tyr Gly Asn Gly Gln Gln Ile Arg
210 215 220
Asp Trp Leu Phe Val Glu Asp His Ala Arg Ala Leu Tyr Lys Val Val
225 230 235 240
Thr Glu Gly Lys Val Gly Glu Thr Tyr Asn Ile Gly Gly His Asn Glu
245 250 255
Lys Ala Asn Ile Asp Val Val Arg Thr Ile Cys Ser Leu Leu Glu Glu
260 265 270
Leu Val Pro Asn Lys Pro Ala Gly Val His Lys Tyr Glu Asp Leu Ile
275 280 285
Thr Tyr Val Thr Asp Arg Pro Gly His Asp Val Arg Tyr Ala Ile Asp
290 295 300
Ala Thr Lys Ile Gly Arg Glu Leu Gly Trp Lys Pro Gln Glu Thr Phe
305 310 315 320
Glu Thr Gly Ile Arg Lys Thr Val Glu Trp Tyr Leu Asn Asn Thr Glu
325 330 335
Trp Trp Ser Arg Val Leu Asp Gly Ser Tyr Asn Arg Glu Arg Leu Gly
340 345 350
Ser Asn
<210> 59
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(292)
<223> rfb (APP2)簇基因rmlA2的氨基酸序列
<400> 59
Met Lys Gly Ile Ile Leu Ala Gly Gly Ser Gly Thr Arg Leu Tyr Pro
1 5 10 15
Ile Thr Arg Gly Val Ser Lys Gln Leu Leu Pro Val Tyr Asp Lys Pro
20 25 30
Met Ile Tyr Tyr Pro Leu Ser Val Leu Met Leu Ala Gly Ile Arg Glu
35 40 45
Val Leu Ile Ile Thr Thr Pro Glu Asp Asn Glu Ser Phe Lys Arg Leu
50 55 60
Leu Gly Asp Gly Ser Asp Phe Gly Ile Gln Leu Ser Tyr Ala Ile Gln
65 70 75 80
Pro Ser Pro Asp Gly Leu Ala Gln Ala Phe Leu Ile Gly Glu Glu Phe
85 90 95
Ile Gly Gln Asp Ser Val Cys Leu Val Leu Gly Asp Asn Ile Phe Tyr
100 105 110
Gly Gln His Phe Thr Gln Ser Leu Gln Glu Ala Val Lys Ser Val Glu
115 120 125
Thr Lys Gly Ala Thr Val Phe Gly Tyr Gln Val Lys Asp Pro Glu Arg
130 135 140
Phe Gly Val Val Glu Phe Asp Asp Asn Phe Arg Ala Leu Ser Ile Glu
145 150 155 160
Glu Lys Pro Ile Gln Pro Lys Ser Asn Trp Ala Val Thr Gly Leu Tyr
165 170 175
Phe Tyr Asp Asn Arg Val Val Glu Phe Ala Lys Gln Val Lys Pro Ser
180 185 190
Ala Arg Gly Glu Leu Glu Ile Thr Thr Leu Asn Glu Met Tyr Leu Asn
195 200 205
Asp Gly Ser Leu Asn Val Gln Leu Leu Gly Arg Gly Phe Ala Trp Leu
210 215 220
Asp Thr Gly Thr His Asp Ser Leu His Asp Ala Ala Ala Phe Val Lys
225 230 235 240
Thr Val Gln Asn Leu Gln Asn Leu Gln Val Ala Cys Leu Glu Glu Ile
245 250 255
Ala Tyr Arg Asn Gly Trp Leu Ser Leu Glu Gln Leu Glu Ala Leu Thr
260 265 270
Lys Pro Met Ala Lys Asn Glu Tyr Gly Gln Tyr Leu Leu Arg Leu Thr
275 280 285
Lys Gly Thr Lys
290
<210> 60
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(291)
<223> rfb (APP2)簇基因rmlD的氨基酸序列
<400> 60
Met Ala Arg Phe Leu Ile Thr Gly Ala Lys Gly Gln Val Gly Tyr Cys
1 5 10 15
Leu Thr Lys Gln Leu Gln Ser Lys Ala Asp Val Leu Ala Val Asp Arg
20 25 30
Asp Glu Leu Asp Ile Thr Asn Arg Asp Ala Val Phe Lys Val Val Arg
35 40 45
Glu Phe His Pro Asp Val Ile Ile Asn Ala Ala Ala His Thr Ala Val
50 55 60
Asp Arg Ala Glu Ser Glu Ile Glu Leu Ser Glu Ala Ile Asn Val Lys
65 70 75 80
Gly Pro Gln Tyr Leu Ala Glu Ala Ala Asn Glu Ile Asp Ala Ile Ile
85 90 95
Leu His Ile Ser Thr Asp Tyr Val Phe Glu Gly Thr Gly Ser Gly Glu
100 105 110
Tyr Lys Glu Asn Asp Glu Pro Asn Pro Gln Gly Val Tyr Gly Lys Thr
115 120 125
Lys Leu Ala Gly Glu Ile Ala Val Gln Gln Ala Asn Lys Arg His Ile
130 135 140
Ile Leu Arg Thr Ala Trp Val Phe Gly Glu His Gly Asn Asn Phe Val
145 150 155 160
Lys Thr Met Leu Arg Leu Ala Lys Glu Arg Glu Ser Leu Gly Ile Val
165 170 175
Ser Asp Gln Phe Gly Gly Pro Thr Tyr Ala Gly Asp Ile Ala Ser Ser
180 185 190
Leu Ile His Ile Ala Asn Ile Ile Leu Asn Ser Lys Ile Asp Val Phe
195 200 205
Gly Val Tyr His Phe Thr Gly Lys Pro Tyr Val Ser Trp Ala Asp Phe
210 215 220
Ala Lys Lys Ile Phe Asp Glu Ala Val Ser Gln Lys Val Leu Glu Lys
225 230 235 240
Ala Pro Leu Val Asn Phe Ile Ala Thr Ser Asn Tyr Pro Thr Ser Ala
245 250 255
Lys Arg Pro Ala Asn Ser Arg Leu Asp Leu Thr Lys Ile Asp Glu Val
260 265 270
Phe Gly Ile Lys Pro Ser Asn Trp Gln Gln Ala Leu Lys Asn Ile Lys
275 280 285
Ala Tyr Ala
290
<210> 61
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(180)
<223> rfb (APP2)簇基因rfbC的氨基酸序列
<400> 61
Met Lys Ile Ile Glu Thr Asn Ile Pro Asp Val Lys Leu Leu Glu Pro
1 5 10 15
Gln Val Phe Gly Asp Glu Arg Gly Phe Phe Met Glu Ile Phe Arg Asp
20 25 30
Glu Trp Phe Arg Gln Tyr Val Ala Asp Arg Thr Phe Val Gln Glu Asn
35 40 45
His Ser Lys Ser Ile Lys Gly Val Leu Arg Gly Leu His Tyr Gln Thr
50 55 60
Glu Asn Thr Gln Gly Lys Leu Val Arg Val Val Gln Gly Ser Val Phe
65 70 75 80
Asp Val Ala Val Asp Leu Arg Lys Ser Ser Pro Thr Phe Gly Gln Trp
85 90 95
Val Gly Glu Val Leu Ser Ala Glu Asn Lys Arg Gln Leu Trp Val Pro
100 105 110
Glu Gly Phe Ala His Gly Phe Tyr Val Leu Thr Glu Thr Ala Glu Phe
115 120 125
Thr Tyr Lys Cys Thr Asp Tyr Tyr Asn Pro Lys Ala Glu His Ser Leu
130 135 140
Ile Trp Asn Asp Pro Thr Val Ala Ile Asn Trp Asn Leu Gly Gly Ala
145 150 155 160
Pro Ser Leu Ser Ala Lys Asp Leu Ala Gly Lys Val Leu Asn Glu Ala
165 170 175
Val Leu Phe Glu
180
<210> 62
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(267)
<223> rfb APP8 DUF4422结构域蛋白的氨基酸序列
<400> 62
Met Asn Lys Asp Ile Lys Ile Leu Ile Ala Thr His Lys Gln His Phe
1 5 10 15
Met Pro Ser Asp Glu Met Tyr Leu Pro Leu His Val Gly Lys Leu Gly
20 25 30
Lys Ala Asp Leu Gly Tyr Gln Gly Asp Asp Ser Gly Asp Asn Ile Ser
35 40 45
Ile Lys Asn Pro Asn Phe Cys Glu Leu Thr Gly Leu Tyr Trp Ala Trp
50 55 60
Lys Asn Leu Pro Asn Asp Tyr Leu Gly Leu Ile His Tyr Arg Arg Phe
65 70 75 80
Phe Ser Val Lys Asn Arg Ala Glu Arg Lys Asn Asn Pro Leu Glu Thr
85 90 95
Leu Tyr Leu Thr Asn Glu Glu Ala Asn Gln Leu Leu Ser Gln Tyr Asp
100 105 110
Val Ile Val Pro Ser Lys Arg Asn Tyr Tyr Ile Glu Thr Leu Tyr Ser
115 120 125
His Tyr Ala Asn Thr Leu His Ala Glu His Leu Asp Val Thr Arg Glu
130 135 140
Ile Ile Ala Glu Lys Cys Ser Glu Tyr Leu Ala Ser Phe Asp Ala Val
145 150 155 160
Ile Lys Gln Arg Ser Gly Tyr Met Phe Asn Met Phe Ile Met Ser Lys
165 170 175
Ala Leu Val Asn Asp Tyr Cys Ser Trp Leu Phe Pro Ile Leu Phe Glu
180 185 190
Leu Glu Lys Arg Ile Pro Thr Asp Gln Tyr Ser Ala Phe His Ala Arg
195 200 205
Phe Tyr Gly Arg Val Ser Glu Leu Leu Phe Asn Val Trp Leu Lys Gln
210 215 220
Tyr Ser Gln Ser Asn Pro Leu Lys Val Lys Ala Ile Pro Phe Val Tyr
225 230 235 240
Gly Glu Lys Ile Asn Trp Leu Lys Lys Gly Thr Ala Phe Leu Val Ala
245 250 255
Lys Phe Phe Gly Lys Lys Tyr Glu Lys Ser Phe
260 265
<210> 63
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(355)
<223> rfb APP8糖基转移酶家族1蛋白的氨基酸序列
<400> 63
Met Lys Arg Ile Leu Val Tyr Gly Met Thr Asp Asn Phe Gly Gly Met
1 5 10 15
Glu Ala Tyr Ile His Asn Ile Tyr Gln His Leu Asp Lys Thr Gln Ile
20 25 30
Gln Phe Asp Phe Val Cys Asp Phe Pro Lys Met Thr Leu Ser Asp Tyr
35 40 45
Tyr Leu Asp Asn Gly Cys Lys Ile His Phe Ile Pro Pro Lys Asn Gln
50 55 60
Gly Leu Phe Lys Ser Leu Trp Ala Met Trp Lys Val Ile Lys Glu Asn
65 70 75 80
Asn Tyr Asp Val Ile Tyr Phe Asn Ile Met Asn Ala Gly Tyr Val Leu
85 90 95
Asn Met Leu Pro Ala Phe Leu Leu Gly Lys Lys Ile Ile Ala His Ser
100 105 110
His Asn Ala Asp Thr Asp Lys Lys Lys Leu His Tyr Gly Leu Arg Leu
115 120 125
Leu Leu Asn Ile Val Thr Lys Ile Lys Leu Ala Cys Ser Lys Glu Ala
130 135 140
Gly Phe Phe Met Phe Gly Lys Glu Glu Asn Phe Ser Ile Ile Asn Asn
145 150 155 160
Ala Ile Asn Leu Asp Arg Tyr Leu Tyr Ser Glu Glu Lys Tyr Arg Asp
165 170 175
Leu Arg His Lys Leu Gly Trp Gly Asp Lys Lys Val Ile Leu Tyr Val
180 185 190
Ala Arg Met Asn His Gln Lys Asn Pro Leu Phe Ala Leu Tyr Ile Met
195 200 205
Arg Glu Leu Lys Gln Ser Met Pro Asn Ala Val Leu Val Tyr Val Gly
210 215 220
Thr Gly Glu Leu Lys Glu Gln Val Gln Gln Tyr Ile Leu Asp Asn Asn
225 230 235 240
Leu Asp Asn Val Ile Leu Leu Gly Leu Arg Asn Asp Val Asn Glu Leu
245 250 255
Met Ile Ala Ala Asp Leu Phe Ile Leu Pro Ser Leu Phe Glu Gly Leu
260 265 270
Pro Ile Val Ala Val Glu Ala Gln Ala Ala Gly Leu Pro Ile Ile Leu
275 280 285
Ser Glu Asn Ile Ser Ile Glu Ala Lys Leu Val Asn Ser Thr Tyr Phe
290 295 300
Leu Pro Ile Asn Asp Val Phe Leu Trp Val Asn Lys Ile Lys Lys Ile
305 310 315 320
Leu Glu Ile Ser Gly Asn Lys Arg Phe Ser Asp Gln Leu Ala Leu Ser
325 330 335
Lys Ala Gly Tyr Asn Ile Glu Ser Val Val Lys Asn Ile Gln Lys Ile
340 345 350
Leu Val Asn
355
<210> 64
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(350)
<223> rfb APP8糖基转移酶家族2蛋白的氨基酸序列
<400> 64
Met Asn Asn Thr Lys Ile Ser Leu Ile Phe Ala Cys Tyr Asn Val Ser
1 5 10 15
Gln Tyr Leu Asp Asn Leu Phe Gln Leu Leu Thr Asn Gln Pro Tyr Gln
20 25 30
Asn Ile Glu Ile Ile Phe Val Glu Asp Cys Ala Thr Asp Asp Thr Lys
35 40 45
Ala Lys Leu Gln Ser Phe Asn Asp Pro Arg Val Lys Leu Leu Cys Asn
50 55 60
Glu Lys Asn Ile Gly Ala Ala Glu Ser Arg Asn Arg Gly Ile Gln Ile
65 70 75 80
Val Thr Gly Glu Tyr Ile Trp Phe Pro Asp Pro Asp Asp Leu Phe Asp
85 90 95
Glu Leu Leu Leu Thr Lys Val Asn Thr Ile Ile Gln Lys Asn Arg Pro
100 105 110
Asp Val Ile Ser Ile Gly Met Gln Glu Arg Tyr Glu Ile Asn Gly Lys
115 120 125
Thr Asp Tyr Thr Lys Asp Ile Ile Ser Arg Tyr Asp Gly Leu Ile Thr
130 135 140
Gly Asp Phe Thr Asp Val Phe Val Asp Leu Glu Glu Ser Phe Leu Phe
145 150 155 160
Gly Tyr Thr Asn Asn Lys Phe Tyr Lys Ala Asn Ile Ile His Lys Tyr
165 170 175
Arg Ile Leu Asn Glu His Gln Ala Leu Lys Glu Asp Phe Glu Phe Asn
180 185 190
Ile Lys Val Phe Lys Gln Val Ser Asn Phe Tyr Leu Leu Asn Glu Pro
195 200 205
Leu Tyr Phe Tyr Met Lys Arg Asn Asn Gly Ser Leu Thr Ser Lys Phe
210 215 220
Val Pro Asp Tyr Phe Arg Ile His Met Gln Thr Leu Ala Ser Phe Lys
225 230 235 240
Ser Leu Ile Glu Val Lys Ala Thr Ile Asn Asp Asn Val Asn Arg Leu
245 250 255
Leu Val Asn Arg Phe Val Arg Tyr Cys Leu Ser Ala Ile Glu Arg Asn
260 265 270
Ser Ser Leu Lys Ser Gly Met Ser Phe Leu Glu Gln Asn Gln Trp Ile
275 280 285
Lys Glu Asn Ile Phe Asn Gln Glu Lys Tyr Asn Glu Tyr Leu Leu Leu
290 295 300
Ser Asp Leu Val Asn Lys Lys Gln Lys Leu Phe Tyr Phe Leu Ile Lys
305 310 315 320
Tyr Arg Ile Gly Phe Leu Leu Val Thr Ala Ala Asn Ile Val Lys Leu
325 330 335
Val Lys Ala Lys Phe Pro Ile Leu Phe Val Lys Leu Lys Gly
340 345 350
<210> 65
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(349)
<223> rfb APP8 β-1,6-半乳糖呋喃糖基转移酶的氨基酸序列
<400> 65
Met Lys Lys Tyr Gln Ile Val Glu Leu Ser Thr Glu His Asn His Ala
1 5 10 15
Gly Ser Lys Ala Val Gln Asp Val Tyr Glu Ile Ala Leu Ser Met Gly
20 25 30
Tyr Lys Ala Asn Val Val Arg Thr Ala Thr Ser Val Asp Ser Leu Leu
35 40 45
Ala Lys Ile Leu Arg Gln Val Ile Phe Phe Ile Asp Trp Leu Lys Ile
50 55 60
Tyr Phe Ser Ile Glu Ser Asn Ser Ile Val Leu Ile Gln Asn Pro Tyr
65 70 75 80
Tyr His Lys Gln Leu Ile Arg Asn Trp Ile Leu Asn Arg Leu Lys Arg
85 90 95
Ile Lys Lys Val Lys Phe Ile Ser Leu Val His Asp Val Glu Glu Leu
100 105 110
Arg Lys Ser Leu Tyr Asn Asn Tyr Tyr Lys Asn Glu Phe Glu Thr Met
115 120 125
Leu Ser Leu Ala Asp Ser Ile Ile Val His Asn Asp Lys Met Lys Ser
130 135 140
Phe Phe Ile Lys Lys Gly Tyr Ser Glu Asp Lys Leu Ile Ser Leu Gly
145 150 155 160
Ile Phe Asp Tyr Leu Gln Lys Ser Val Asp Lys Lys Arg Val Ser Phe
165 170 175
Glu Arg Ala Ile Ser Val Ala Gly Asn Leu Asp Ile Lys Lys Ser Ser
180 185 190
Tyr Ile Ala Gln Leu Gly Ser Leu Pro Ala Ile Lys Ala His Leu Tyr
195 200 205
Gly Pro Asn Phe Glu His Ser Leu Glu Ala Phe Pro Asn Ile Glu Tyr
210 215 220
His Gly Ser Phe Pro Ala Thr Glu Ile Pro Gln Lys Leu Val Ser Gly
225 230 235 240
Phe Gly Leu Val Trp Asp Gly Gln Ser Ile Glu Thr Cys Thr Gly Asp
245 250 255
Phe Gly Glu Tyr Leu Gln Tyr Asn Asn Pro His Lys Leu Ser Leu Tyr
260 265 270
Leu Ser Ser Gly Met Pro Val Val Ile Trp Asp Lys Ala Ala Glu Ala
275 280 285
Asp Phe Val Lys Lys His Asn Val Gly Leu Cys Val Ser Ser Leu Ser
290 295 300
Glu Leu Gln Asp Lys Leu Asn Val Met Thr Glu Gln Glu Phe Glu Glu
305 310 315 320
Met Val Asn Asn Val Glu Lys Gln Thr Ala Cys Leu Ile Ser Gly Glu
325 330 335
Tyr Thr Lys Lys Ala Ile Ser Glu Ala Glu Arg Val Ile
340 345
<210> 66
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(443)
<223> rfb APP8寡糖重复单元聚合酶的氨基酸序列
<400> 66
Met Phe Leu Tyr Leu Leu Val Phe Ser Leu Leu Leu Ile Leu Ile Phe
1 5 10 15
Asn Leu Leu Ile Val Asn Leu Asp Tyr Met His Pro Ser Ile Leu Phe
20 25 30
Val Val Pro Phe Leu Val Phe Gly Val Thr Ser Ile Leu Gly Glu Glu
35 40 45
Ala Tyr Lys Ile Ile Phe His Glu Glu Thr Leu Leu Val Ile Val Ser
50 55 60
Ser Ala Leu Ile Phe Thr Phe Ile Thr Leu Leu Ser Gln Thr Val Tyr
65 70 75 80
Lys Ser Lys Glu Asn Leu Asn Phe Pro Leu Thr Glu Ile Ile Ile Ser
85 90 95
Lys Lys Val Thr Leu Phe Phe Ile Val Phe Phe Ile Val Thr Gln Leu
100 105 110
Ala Phe Ile Lys Tyr Leu Glu Ala Ile Ser Leu Ala His Phe Gly Tyr
115 120 125
Ser Gly Ser Leu Gly Glu Met Ile Ser Leu Tyr Asp Val Met Thr Lys
130 135 140
Phe Trp Thr Glu Ile Phe Ser Glu Leu Asn Val Pro Ile Pro Leu Leu
145 150 155 160
Tyr Arg Ile Gly Asn Pro Ile Thr Gln Gly Phe Gly Tyr Leu Ile Val
165 170 175
Tyr Ile Phe Ile His Asn Tyr Val Ala Thr Lys Arg Ile Asp Lys Leu
180 185 190
His Leu Leu Ile Ile Leu Leu Leu Cys Leu Asn Ile Ile Leu Asn Gly
195 200 205
Ser Arg Ser Pro Ile Phe Arg Ile Val Thr Met Met Leu Ile Thr Phe
210 215 220
Tyr Val Leu Tyr Asn Lys Gln Asn Asn Val Arg Arg Gly Asn Ile Lys
225 230 235 240
Phe Leu Leu Lys Ser Leu Leu Ile Val Ile Phe Ser Gly Thr Phe Phe
245 250 255
Ile Ala Leu Leu Ser Leu Met Gly Arg Glu Asn Asp Leu Asp Met Phe
260 265 270
His Tyr Ile Phe Ile Tyr Val Gly Ala Pro Leu Val Asn Leu Asp Asn
275 280 285
Tyr Leu Ala Phe Arg Pro Asp Gly Ser Tyr Ala Thr Ile Phe Gly Glu
290 295 300
Gln Thr Phe Arg Gly Leu Tyr Ala Tyr Ile Ala Lys Ile Ile Ser Asp
305 310 315 320
Glu Ser Leu Ile Phe Pro Thr Ile Asp Gln Phe Thr Phe Ser Asn Asn
325 330 335
Gly Leu Glu Ile Gly Asn Val Tyr Thr Thr Phe Tyr Ser Phe Ile Tyr
340 345 350
Asp Phe Glu Tyr Val Gly Phe Ile Pro Leu Ile Leu Ile Ile Ala Leu
355 360 365
Tyr Tyr Val Phe Thr Tyr Gln Arg Leu Lys Thr Arg Ala Ile Lys Thr
370 375 380
Asn Lys Val His Phe Ser Leu Phe Ile Tyr Ala Tyr Leu Phe Asn Asp
385 390 395 400
Leu Ile Met Leu Ala Phe Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Thr Val Leu Asp
405 410 415
Ile Gly Phe Ile Lys Ile Val Ile Phe Ser Tyr Ile Cys His Leu Leu
420 425 430
Phe Val His Arg Ser Lys Ile Lys Gly Thr Val
435 440
<210> 67
<211> 483
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(483)
<223> rfb APP8翻转酶的氨基酸序列
<400> 67
Met Asn Val Lys Ser Val Lys Phe Asn Phe Ile Met Asn Leu Ile Leu
1 5 10 15
Thr Val Ser Asn Phe Leu Phe Pro Leu Val Thr Phe Pro Tyr Val Ser
20 25 30
Arg Ile Leu Gln Pro Glu Gly Thr Gly Lys Val Ala Phe Ala Ile Ser
35 40 45
Val Val Ser Tyr Phe Ser Ile Phe Ala Ser Leu Gly Val Ala Thr Tyr
50 55 60
Gly Val Arg Ala Cys Ala Gln Val Arg Asp Asn Lys Asp Leu Leu Ser
65 70 75 80
Arg Thr Val His Glu Leu Leu Phe Ile Asn Ile Ile Ala Thr Ile Ile
85 90 95
Val Tyr Val Cys Phe Leu Leu Val Val Ala Phe Thr Pro Arg Phe Ser
100 105 110
Ala Glu Lys Glu Leu Phe Trp Ala Thr Ser Ile Phe Ile Leu Phe Thr
115 120 125
Ile Ile Gly Ile Glu Trp Leu Tyr Lys Gly Leu Glu Lys Tyr Gln Tyr
130 135 140
Ile Thr Ile Arg Thr Ile Ile Phe Lys Leu Ile Ala Leu Val Leu Val
145 150 155 160
Phe Val Phe Ile Lys Thr Lys Asp Asp Tyr Val Ile Phe Ala Val Ile
165 170 175
Ser Val Phe Ala Ile Val Gly Ser Gly Ile Phe Asn Leu Phe Asn Ser
180 185 190
Arg Lys Leu Ile Asn Tyr His Leu Tyr Glu Asp Tyr Glu Phe Arg Lys
195 200 205
His Phe Lys Pro Met Phe Leu Leu Phe Leu Thr Thr Leu Ser Ile Ala
210 215 220
Ile Tyr Thr Ser Val Asp Glu Ala Ile Leu Gly Leu Leu Thr Ser Pro
225 230 235 240
Gln Asp Val Gly Tyr Tyr Asn Ala Ala Met Lys Val Lys Gly Ile Leu
245 250 255
Phe Thr Leu Ile Thr Ser Leu Gly Ile Val Leu Leu Pro Arg Leu Ser
260 265 270
Tyr Tyr Val Glu Asn Asn Met Thr Asp Glu Phe His Ala Ala Leu Lys
275 280 285
Lys Ser Met Asn Phe Ile Ile Val Ile Ala Val Pro Val Val Ile Phe
290 295 300
Phe Met Leu Phe Ala Lys Glu Ile Ile Leu Leu Leu Ala Gly Glu Ser
305 310 315 320
Tyr Ile Asn Ala Ile Leu Pro Leu Gln Ile Ile Val Trp Ala Leu Leu
325 330 335
Leu Ser Ala Ile Thr Asn Ile Leu Gly Ile Gln Ile Leu Leu Pro Leu
340 345 350
Lys Lys Asp Lys Glu Leu Leu Ile Ser Val Leu Leu Ala Ala Ile Val
355 360 365
Asp Ile Val Ala Asn Leu Ile Leu Val Pro Gln Leu Ala Ser Val Gly
370 375 380
Thr Ala Ile Ser Val Val Met Ala Glu Leu Thr Val Leu Val Val Gln
385 390 395 400
Leu Val Ile Leu Arg Lys Tyr Ile Trp Ile Leu Phe Ser Asn Leu Gln
405 410 415
Phe Val Arg Ile Gly Leu Ser Ile Val Phe Ser Ile Val Leu Ser Leu
420 425 430
Ser Ile Tyr Gln Trp Asn Ile Thr Asn Ser Ile Met Leu Thr Phe Leu
435 440 445
Ile Met Gly Phe Ile Phe Phe Thr Thr Tyr Phe Ile Leu Leu Leu Ile
450 455 460
Leu Lys Glu Asn Phe Met Met Tyr Val Tyr Gln Thr Ile Gln His Lys
465 470 475 480
Ile Leu Lys
<210> 68
<211> 365
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(365)
<223> rfb APP8 UDP-吡喃半乳糖变位酶的氨基酸序列
<400> 68
Met Lys Tyr Asp Tyr Leu Ile Val Gly Ala Gly Leu Phe Gly Ser Ile
1 5 10 15
Phe Ala Arg Glu Ala Thr Lys Arg Gly Lys Lys Cys Leu Val Ile Glu
20 25 30
Lys Arg Asp His Ile Gly Gly Asn Cys Tyr Thr Gln Asn Val Glu Gly
35 40 45
Ile Asn Val His Lys Tyr Gly Ala His Ile Phe His Thr Ser Asn Lys
50 55 60
Val Val Trp Asp Tyr Ile Gln Gln Phe Ala Glu Phe Asn Arg Phe Thr
65 70 75 80
Asn Ser Pro Val Ala Arg Tyr Lys Asp Glu Leu Tyr Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Asn Met Leu Thr Phe Asn Lys Met Trp Gly Val Ile Thr Pro Gln Glu
100 105 110
Ala Glu Ala Lys Ile Lys Glu Gln Ile Ala Lys Glu Asn Ile Thr Asp
115 120 125
Pro Lys Asn Leu Glu Glu Gln Ala Ile Ser Leu Val Gly Arg Asp Ile
130 135 140
Tyr Glu Lys Leu Ile Lys Gly Tyr Thr Glu Lys Gln Trp Gly Arg Lys
145 150 155 160
Cys Thr Glu Leu Pro Ala Phe Ile Ile Lys Arg Leu Pro Val Arg Tyr
165 170 175
Thr Tyr Asp Asn Asn Tyr Phe Tyr Asp Thr Tyr Gln Gly Ile Pro Ile
180 185 190
Gly Gly Tyr Thr Gly Ile Phe Glu Arg Met Leu Glu Gly Ile Glu Val
195 200 205
Lys Leu Gly Val Asp Phe Phe Ala Glu Arg Glu His Tyr Glu Ser Leu
210 215 220
Ala Glu Lys Ile Val Phe Thr Gly Met Ile Asp Glu Tyr Phe Gly Tyr
225 230 235 240
Gln Phe Gly Lys Leu Glu Tyr Arg Ser Leu Arg Phe Asp Asn Glu Val
245 250 255
Leu Asn Ile Pro Asn Tyr Gln Gly Asn Ala Val Val Asn Tyr Thr Glu
260 265 270
Ala Glu Val Pro Tyr Thr Arg Ile Ile Glu His Lys His Phe Glu Tyr
275 280 285
Gly Thr Gln Pro Lys Thr Val Ile Thr Arg Glu His Ser Lys Glu Tyr
290 295 300
Glu Glu Gly Asp Glu Pro Tyr Tyr Pro Ile Asn Asp Ala Arg Asn Asn
305 310 315 320
Glu Leu Tyr Ala Lys Tyr Lys Ala Leu Ala Asp Ala Thr Pro Asn Val
325 330 335
Ile Phe Gly Gly Arg Leu Ala Gln Tyr Lys Tyr Phe Asp Met His Asn
340 345 350
Ile Ile Ala Glu Ala Leu Glu Cys Val Lys Val His Phe
355 360 365
<210> 69
<211> 436
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(436)
<223> rfb APP8 UDP-磷酸半乳糖磷酸转移酶的氨基酸序列
<400> 69
Met Asn Lys Ile Ile Ala Lys Ile Ser Leu Ile Leu Val Asp Ile Val
1 5 10 15
Ala Ile Phe Val Ser Ile Leu Ile Ala Val Ser Leu Arg Lys Ile Leu
20 25 30
Gly Leu Leu Phe Thr Leu Pro Glu Ile Asp Tyr Ser Tyr Ile Phe Phe
35 40 45
Ala Tyr Val Tyr Leu Ile Leu Ile Leu Met Met Thr Tyr Leu Gly Ala
50 55 60
Tyr Thr Lys Arg Tyr Asp Phe Trp His Glu Ser Arg Leu Ile Val Arg
65 70 75 80
Gly Ser Phe Leu Ser Leu Leu Ile Leu Leu Ser Ala Leu Ala Leu Gly
85 90 95
Gln Asn Ala Glu Tyr Tyr Ser Arg Ser Thr Leu Val Leu Ile Phe Leu
100 105 110
Cys Cys Ala Ile Val Leu Pro Ile Ala Lys Ile Phe Thr Lys Lys Ile
115 120 125
Leu Phe Lys Leu Gly Ile Trp Gln Leu Pro Ala Lys Val Ile Ser Glu
130 135 140
Asn Asp Gln Phe Lys Asn Glu Leu Phe Glu Asp Gln Tyr Leu Gly Tyr
145 150 155 160
Val Lys Ala Lys His Ser Glu His Lys Ile Ile Phe Ile Asp Gly Ala
165 170 175
Asn Leu Gly Lys Asp Arg Leu Asn Gln Ile Ile Glu Asp Asn Ile Lys
180 185 190
Asn Ser Arg Glu Ile Ile Phe Thr Pro Val Leu Asn Gly Tyr Asp Phe
195 200 205
Ser His Ser Tyr Ile Tyr Asn Ile Phe Asn Thr Arg Thr Asn Ile Phe
210 215 220
Thr Leu Glu Asn Glu Leu Leu Ser Lys Ser Asn Arg Ile Phe Lys Leu
225 230 235 240
Leu Met Asp Tyr Ile Leu Val Leu Gly Ser Ala Val Phe Trp Val Pro
245 250 255
Val Leu Val Leu Ile Ala Phe Trp Ile Lys Lys Glu Asp Pro Lys Gly
260 265 270
Glu Val Phe Phe Leu Gln Arg Arg Leu Gly Val Asn Gly Lys Glu Phe
275 280 285
Met Cys Tyr Lys Phe Arg Ser Met Tyr Ser Asp Gln Ser Phe Met Gln
290 295 300
Glu Trp Leu Glu Lys Asn Pro Glu Glu Ala Ala Tyr Tyr Arg Ile Tyr
305 310 315 320
His Lys Tyr Met Asn Asp Pro Arg Ile Thr Lys Ile Gly Ala Phe Leu
325 330 335
Arg Lys Thr Ser Leu Asp Glu Leu Pro Gln Leu Ile Asn Val Leu Arg
340 345 350
Gly Glu Met Ser Leu Val Gly Pro Arg Pro Tyr Met Val Ile Glu Lys
355 360 365
Lys Asp Ile Gly Lys Lys Ala Pro Leu Val Leu Ala Val Lys Pro Gly
370 375 380
Ile Thr Gly Met Trp Gln Val Ser Gly Arg Ser Asp Val Asn Phe Asp
385 390 395 400
Ser Arg Val Glu Met Asp Val Trp Tyr Met Lys Asn Trp Ser Leu Trp
405 410 415
Asn Asp Ile Val Ile Leu Ile Lys Thr Val Gln Ala Val Phe Lys Arg
420 425 430
Asp Gly Ala Tyr
435
<210> 70
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(159)
<223> rfb APP8酰基转移酶的氨基酸序列
<400> 70
Met Ile Thr Ser Ile Gln Tyr Leu Arg Gly Ile Ala Ala Leu Phe Val
1 5 10 15
Val Leu Phe His Met Lys Trp Met Leu Asn Asn Val Tyr Val Glu Lys
20 25 30
Asn Leu Gly Asp Ile Phe Phe Ile Ser Gly Asn Phe Gly Val Asp Leu
35 40 45
Phe Phe Val Ile Ser Gly Phe Val Ile Cys Leu Ser Thr Glu Arg Glu
50 55 60
Thr Leu His Pro Val Lys Glu Phe Phe Ile Arg Arg Phe Phe Arg Ile
65 70 75 80
Tyr Pro Leu Leu Leu Leu Ser Val Cys Thr Ile Tyr Ile Leu Gly Asp
85 90 95
Phe Lys Ile His Glu Leu Ile Leu Ser Met Ile Pro Ile His Leu Asp
100 105 110
Tyr Ser Ser Pro Ser Pro Val Phe Gly Tyr Asn Ile Leu Val Ser Ala
115 120 125
Trp Thr Ile Thr Tyr Glu Ile Ser Phe Tyr Ile Ile Leu Val Leu Ser
130 135 140
Leu Met Ile Asn His Arg Phe Arg Cys Glu Leu Thr Ile Leu Phe
145 150 155
<210> 71
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(137)
<223> rfb APP8酰基转移酶的氨基酸序列
<400> 71
Met Lys Ser Ile Ile Ile Leu Asp Lys Tyr Phe Leu Tyr Ser Ile Leu
1 5 10 15
Leu Val Val Ile Ser Phe Val Phe Ile Lys His Pro Ile Phe Asp Gly
20 25 30
His Gly Val Leu Lys Trp Gly Phe Leu Ser Phe Ile Ile Leu Leu Ile
35 40 45
Leu Leu Ile Ile Glu Asn Thr Tyr Gly Ile Ala Lys Ser Asn Phe Leu
50 55 60
Phe Trp Leu Gly Glu Ile Ser Tyr Ser Leu Tyr Leu Thr His Ile Ile
65 70 75 80
Ile Leu Glu Phe Ile Leu Lys His Ile Thr Pro Glu Ile Trp Asn Asn
85 90 95
Pro Asn Leu Gly Met Ser Lys Ile Leu Phe Tyr Leu Ala Ile Ser Ile
100 105 110
Ser Phe Ser Tyr Leu Val Tyr Leu Leu Val Glu Lys Pro Phe Ile Asn
115 120 125
Leu Gly Lys Lys Leu Ile Thr Lys Leu
130 135
<210> 72
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(357)
<223> rfb APP8 dTDP-葡萄糖 4,6-脱水酶的氨基酸序列
<400> 72
Met Lys Ile Leu Ile Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Gly Ser Ala Val
1 5 10 15
Ile Arg Tyr Ile Ile Gln His Thr Gln Asp Ser Val Val Asn Val Asp
20 25 30
Lys Leu Thr Tyr Ala Gly Asn Leu Ala Ser Leu Glu Ser Val Ser Asn
35 40 45
Ser Ser Arg Tyr His Phe Glu Gln Ala Asp Ile Cys Asp Ser Thr Arg
50 55 60
Ile Ser Gln Ile Phe Cys Lys Tyr Gln Pro Asp Val Val Met His Leu
65 70 75 80
Ala Ala Glu Ser His Val Asp Arg Ser Ile Asp Gly Pro Ala Ala Phe
85 90 95
Met Gln Thr Asn Ile Ile Gly Thr Tyr Thr Leu Leu Glu Ala Ser Arg
100 105 110
Gln Tyr Trp Leu Ser Leu Pro Leu Glu Arg Lys Gln Thr Phe Arg Phe
115 120 125
Gln His Ile Ser Thr Asp Glu Val Tyr Gly Asp Leu Asn Asp Ser Asn
130 135 140
Glu Leu Phe Ser Glu Asn Thr Ala Tyr Ser Pro Ser Ser Pro Tyr Ser
145 150 155 160
Ala Ser Lys Ala Ala Ser Asp His Leu Val Arg Ala Trp Phe Arg Thr
165 170 175
Tyr Gly Leu Pro Thr Leu Val Thr Asn Cys Ser Asn Asn Tyr Gly Pro
180 185 190
Phe Gln Phe Pro Glu Lys Leu Ile Pro Leu Met Ile Leu Asn Ala Ile
195 200 205
Ser Gly Lys Pro Leu Pro Ile Tyr Gly Asn Gly Leu Gln Ile Arg Asp
210 215 220
Trp Leu Phe Val Glu Asp His Ala Ile Ala Leu Tyr Gln Val Leu Cys
225 230 235 240
Arg Gly Lys Val Gly Glu Thr Tyr Asn Ile Gly Gly His Asn Glu Lys
245 250 255
Thr Asn Ile Glu Val Val Gln Ala Ile Cys Arg Leu Leu Asp Glu Leu
260 265 270
Val Pro Asn Lys Pro Ser Gly Ile Glu Gln Tyr Glu Glu Leu Val Thr
275 280 285
Tyr Val Ala Asp Arg Pro Gly His Asp Val Arg Tyr Ala Ile Asp Ala
290 295 300
Ser Lys Ile Glu Asn Gln Leu Gly Trp Thr Pro Lys Glu Thr Phe Glu
305 310 315 320
Ser Gly Leu Arg Lys Thr Val Glu Trp Tyr Leu Asn Asn Gln Lys Trp
325 330 335
Trp Gln Ser Val Leu Asp Gly Ser Tyr Cys Gly Glu Arg Leu Gly Leu
340 345 350
Ser Leu Lys Ser Tyr
355

Claims (20)

1.一种用于疫苗用途的革兰氏阴性细菌宿主细胞，包括：
(a)异源功能性胸膜肺炎放线杆菌(APP)rfb基因簇，其中所述异源功能性APP rfb基因簇产生与细菌宿主细胞的脂质A-核心结合并位于细菌宿主外表面上的APP O-抗原，其中所述细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇并不具有功能性；
(b)任选地用于调节异源APP rfb基因簇转录的异源启动子强于内源rfb基因簇的内源启动子；
(c)任选地用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因；
(d)任选地至少一种Apx毒素的中和表位，任选地至少一种Apx毒素I、II和III的中和表位，任选地位于细菌宿主细胞外表面和/或从细胞分泌；
其中任选地(a)、(c)和(d)中的至少一种经密码子优化用于细菌宿主细胞。
2.根据权利要求1所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞选自肠杆菌科、伯克氏菌科、假单胞菌科、弧菌科，任选地泰国伯克霍尔德菌、铜绿假单胞菌、需钠弧菌、霍乱弧菌、大肠杆菌(任选地大肠杆菌_5(E.coli_5))、肠道沙门氏菌(任选地肠道沙门氏菌肠亚种，任选地肠道沙门氏菌肠亚种，选自鼠伤寒血清型、肠炎血清型、海德堡血清型、沙门氏菌鸡血清型、哈达尔血清型、阿哥纳血清型、肯塔基血清型和婴儿血清型)，以及肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344。
3.根据权利要求1或2所述的细菌宿主细胞，其中所述异源rfb基因簇选自APP1至18rfb基因簇，任选地是APP2或APP8 rfb基因簇，
(i)其包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4，或由它们组成；
(ii)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；
(iii)与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的核酸序列在严格的条件下杂交；和/或
(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的细菌宿主细胞，其中所述异源功能性APP rfb基因簇产生APP1至18的O-抗原，任选地APP2或APP8的O-抗原，其中APP rfb基因簇任选地表达至少一种包含以下任一序列的氨基酸或由以下任一序列的氨基酸组成的蛋白质：SEQ IDNO：2、50-61或SEQ ID NO：5、62-72，或至少一种与这些序列具有至少70％、80％、90％、95％或98％氨基酸序列一致性的蛋白质。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇至少部分缺失，任选地完全缺失。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细菌宿主细胞，其中所述调节异源APP rfb基因簇转录的异源启动子选自由卡那霉素启动子、proD启动子、j23101启动子、proC启动子、STER_RS05525启动子、STER_RS01225启动子、STER_RS04515启动子、STER_RS05020启动子、STER_RS06870启动子、STER_RS00780启动子、P32启动子组成的组，任选地选自由卡那霉素启动子、proD启动子、j23101启动子、STER_RS04515启动子和P32启动子组成的组，任选地选自由卡那霉素启动子和proD启动子组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细菌宿主细胞，其中所述功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因选自由用于核苷酸活化聚糖生物合成的酶、十一烯焦磷酸糖基转移酶、O-抗原糖基转移酶、O-抗原聚合酶、O-抗原链长决定蛋白和N-聚糖差向异构酶及它们的组合组成的组，任选地选自由gne基因和wzy基因组成的组,
i.其中gne基因编码UDP-半乳糖/UDP-N-乙酰半乳糖胺差向异构酶，任选地来自空肠弯曲杆菌的差向异构酶，所述gne基因任选地包含SEQ ID NO：6或由SEQ ID NO：6组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；
ii.其中wzy基因编码APP、任选地APP2的O-抗原聚合酶，所述wzy基因任选地包含SEQID NO：7或由SEQ ID NO：7组成，或包含SEQ ID NO：8的密码子优化的wzy基因或由SEQ IDNO：8的密码子优化的wzy基因组成，或具有与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8的核酸序列杂交。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的细菌宿主细胞，其中Apx毒素，任选地至少Apx毒素I、II和III的至少一个中和表位位于所述细菌宿主外细胞表面上并与膜蛋白结合，任选地选自由溶细胞素A、三聚体自转运体粘附素、AIDA-I、EaeA、外膜蛋白(OMP)和大肠杆菌的OmpA组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的细菌宿主细胞，其中
(a)异源功能性APP rfb基因簇，
(b)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因；和/或
(c)Apx毒素的至少一个中和表位经密码子优化用于细菌宿主细胞。
10.根据权利要求9所述的细菌宿主细胞，其中所述异源功能性APP rfb基因簇(a)经密码子优化用于所述细菌宿主细胞。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主是大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，或肠道沙门氏菌，任选地肠道沙门氏菌肠亚种，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344，其中：
(a)所述异源功能性APP rfb基因簇选自APP1至18rfb基因簇，任选地是APP2或APP8rfb基因簇；
(b)所述调节异源APP rfb基因簇转录的异源启动子是卡那霉素或proD启动子；
(c)所述用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是wzy基因，任选地密码子优化的wzy基因，和/或gne基因，这两种基因任选地整合到细菌宿主细胞的基因组中或位于质粒上；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III的中和表位中的至少一个，任选地与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的溶细胞素A结合，或从宿主细胞分泌；
其中(i)APP2或APP8 rfb基因簇，(ii)gne基因和/或(iii)wzy基因，任选地APP2 rfb基因簇和wzy基因经密码子优化用于细菌宿主细胞大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，或肠道沙门氏菌，任选地肠道沙门氏菌肠亚种，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型。
12.根据权利要求11所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主是肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型菌株SL1344，其中
(a)所述密码子优化的异源功能性APP rfb基因簇是APP2 rfb基因簇，任选地(i)包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成；(ii)与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3具有至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；
(iii)在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列杂交；和/或
(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的，
所述细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇至少部分或完全缺失；
(b)所述调节异源APP2 rfb基因簇转录的任选地异源启动子是卡那霉素启动子；
(c)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是gne基因和/或wzy基因，它们任选地整合到细菌宿主细胞的基因组中；
i.其中gne基因，任选地空肠弯曲杆菌的gne基因，任选地包含SEQ ID NO：6或由SEQ IDNO：6组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；
ii.其中wzy基因任选地包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或者由SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8组成，或具有与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的核酸序列杂交；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III，任选地至少Apx毒素II和III的至少2个中和表位，任选地所述表位与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的溶细胞素A结合。
13.根据权利要求11所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主是大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，其中
(a)所述异源功能性APP rfb基因簇是APP2 rfb基因簇，任选地密码子优化的，任选地(i)包含SEQ ID NO：3或由SEQ ID NO：3组成；
(ii)具有与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；
(iii)在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的核酸序列杂交；和/或
(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的，
所述细菌宿主细胞的内源性rfb基因簇至少部分或完全缺失；
(b)调节异源APP2 rfb基因簇转录的异源启动子是卡那霉素或proD启动子，任选地卡那霉素启动子；
(c)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是gne基因，任选地整合到细菌宿主细胞的基因组中或位于质粒上，
其中gne基因，任选地空肠弯曲杆菌的gne基因，任选地包含SEQ ID NO：6或由SEQ IDNO：6组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III，任选地至少Apx毒素II和III的至少一个中和表位，任选地所述表位与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的的溶细胞素A结合，或从宿主细胞分泌；
其中APP2 rfb基因簇任选地经密码子优化用于大肠杆菌。
14.根据权利要求11所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主是肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型，任选地肠道沙门氏菌肠亚种鼠伤寒血清型SL1344菌株或大肠杆菌，任选地大肠杆菌_5，其中
(a)异源功能性APP rfb基因簇是APP8 rfb基因簇，任选地经密码子优化，任选地(i)包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成；(ii)与SEQ ID NO：4具有至少70％、80％、90％、95％或98％的核酸序列一致性，任选地在整个序列上；(iii)在严格条件下与SEQ ID NO：4的核酸序列杂交；和/或(iv)相对于(i)至(iii)中任一项的核酸序列是简并的，
(b)调节异源APP2 rfb基因簇转录的任选地异源启动子是卡那霉素或proD启动子，任选地卡那霉素启动子；
(c)用于功能性表达辅助APP O-抗原合成的酶的至少一种另外的基因是wzy和/或gne基因，任选地经密码子优化，任选地这两种基因整合到细菌宿主细胞的基因组中；
i.其中gne基因，任选地空肠弯曲杆菌的gne基因，任选地包含SEQ ID NO：6或由SEQ IDNO：6组成，或具有与SEQ ID NO：6至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：6的核酸序列杂交；
ii.其中所述wzy基因，任选地经密码子优化，任选地包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8或由SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8组成，或具有与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8至少70％、80％、90％、95％或98％一致性的核酸序列，任选地在整个序列上，和/或在严格条件下与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的核酸序列杂交；
(d)和任选地包含Apx毒素I、II和III，任选地至少Apx毒素II和III的至少2个中和表位，任选地所述表位与膜蛋白结合，任选地与大肠杆菌的溶细胞素A结合。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的细菌宿主细胞，其中所述细菌宿主是活的或灭活的。
16.一种组合物，任选地包含至少一种权利要求1至15中任一项所述的细菌宿主细胞的药物组合物。
17.根据权利要求15所述的组合物或药物组合物，其包含细菌宿主细胞，所述细菌宿主细胞表达来自APP的至少两种不同的O-抗原，任选地O-抗原选自APPl至APP18，任选地选自APPl、2、5、7、8、10、12、14和18的APP O-抗原的组合。
18.权利要求1至16中任一项所述的细菌宿主细胞或权利要求16至17中任一项所述的组合物用于预防和/或治疗哺乳动物，任选地猪(Sus)或家猪(Sus scrofa domesticus)中胸膜肺炎放线杆菌(APP)感染，任选地APP2感染。
19.根据权利要求18所述的细菌宿主细胞的用途，其中所述细菌宿主通过鼻内、口服、口鼻、舌下、皮下、皮内、经皮、结膜或肌内施用。
20.一种治疗方法，包括向有需要的哺乳动物受试者施用生理有效剂量的权利要求1至15中任一项所述的细菌宿主细胞或权利要求16至17中任一项所述的组合物，用于治疗和/或预防APP感染，任选地用于预防APP感染。
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