JP2023517111A - 糖鎖改変細菌を含むワクチン - Google Patents
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Abstract
Description
(a)異種機能的アクチノバシラス・プルロニューモニエ(APP)rfb遺伝子クラスターであり、該異種機能的APP rfb遺伝子クラスターは、細菌宿主細胞の脂質Aコアに結合し細菌宿主外表面上に位置するAPP O抗原を生成し、該細菌宿主細胞の内因性rfb遺伝子クラスターは機能的でない、遺伝子クラスター;
(b)任意選択で、内因性rfb遺伝子クラスターに対する内因性プロモーターよりも強力な異種APP rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための異種プロモーター;
(c)任意選択で、APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子;
(d)任意選択で、Apx毒素の少なくとも1種の中和性エピトープ、任意選択でApx毒素I、II及びIIIの少なくとも1種の中和性エピトープであり、任意選択で細菌宿主細胞外表面上に位置するか、且つ/又は該細胞から分泌される、中和性エピトープ
を含み、
任意選択で、(a)、(c)及び(d)のうちの少なくとも1つが細菌宿主細胞に対してコドン最適化されている、細菌宿主細胞の提供により解決される。
(i)配列番号1、配列番号3若しくは配列番号4を含むか又はこれからなり;
(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号1、配列番号3若しくは配列番号4に対して少なくとも70、80、90、95又は98%の核酸配列同一性を有し;
(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号1、配列番号3又は配列番号4の核酸配列にハイブリダイズし;且つ/或いは
(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、
APP2又はAPP8 rfb遺伝子クラスターである。
i.このとき、gne遺伝子はUDP-ガラクトース/UDP-N-アセチルグルコサミンエピメラーゼ、任意選択で、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)由来のエピメラーゼをコードし、gne遺伝子は、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一であり、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を有し;
ii.このとき、wzy遺伝子は、APPの、任意選択でAPP2のO抗原ポリメラーゼをコードし、wzy遺伝子は、任意選択で、配列番号7若しくは配列番号8のコドン最適化wzy遺伝子を含むか又はこれからなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号7若しくは配列番号8に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一であり、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号7若しくは配列番号8の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を有する。
(a)異種機能的APP rfb遺伝子クラスターは、APP1~18 rfb遺伝子クラスターから選択され、任意選択でAPP2又はAPP8 rfb遺伝子クラスターであり;
(b)異種APP rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための異種プロモーターが、カナマイシン又はproDプロモーターであり;
(c)APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子が、wzy遺伝子、任意選択でコドン最適化されたwzy、及び/又はgne遺伝子であり、両方の遺伝子が任意選択で細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれるか又はプラスミド上に位置し;
(d)任意選択で膜タンパク質に結合するか、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合するか、又は宿主細胞から分泌される、Apx毒素I、II及びIIIの中和性エピトープのうちの少なくとも1種を任意選択で含み;
このとき、(i)APP2又はAPP8 rfb遺伝子クラスター、(ii)gne遺伝子及び/又は(iii)wzy遺伝子、任意選択でAPP2 rfb遺伝子クラスター及びwzy遺伝子が、細菌宿主細胞大腸菌、任意選択でE.coli_5、又はサルモネラ菌、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウムに対してコドン最適化されている。
(a)コドン最適化異種機能的APP rfb遺伝子クラスターは、任意選択で(i)配列番号3を含むか又は配列番号3からなり;(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号1若しくは配列番号3に対して少なくとも70、80、90、95又は98%の核酸配列同一性を有し;(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号1又は配列番号3の核酸配列にハイブリダイズし;且つ/或いは(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、APP2 rfb遺伝子クラスターであり、
細菌宿主細胞の内因性rfb遺伝子クラスターは少なくとも部分的又は完全に欠失しており;
(b)異種APP2 rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための任意的な異種プロモーターがカナマイシンプロモーターであり;
(c)APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子が、任意選択で細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれている、gne遺伝子及び/又はwzy遺伝子であり;
i.このとき、gne遺伝子、任意選択でカンピロバクター・ジェジュニのgne遺伝子は、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズし;
ii.このとき、wzy遺伝子は、任意選択で、配列番号7若しくは配列番号8を含むか又は配列番号7若しくは配列番号8からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号7若しくは配列番号8に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号7若しくは配列番号8の核酸配列にハイブリダイズし;
(d)任意選択で膜タンパク質、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合している、Apx毒素I、II及びIIIの、任意選択で少なくともApx毒素II及びIIIの少なくとも2種の中和性エピトープを任意選択で含む。
(a)異種機能的APP rfb遺伝子クラスターが、任意選択で
(i)配列番号3を含むか又は配列番号3からなり;(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号1若しくは配列番号3に対して少なくとも70、80、90、95又は98%の核酸配列同一性を有し;(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号1又は配列番号3の核酸配列にハイブリダイズし;及び/又は(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、APP2 rfb遺伝子クラスターであり、
細菌宿主細胞の内因性rfb遺伝子クラスターは少なくとも部分的又は完全に欠失しており;
(b)異種APP2 rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための異種プロモーターが、カナマイシン又はproDプロモーター、任意選択でカナマイシンプロモーターであり;
(c)APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子が、任意選択で細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれるか又はプラスミド上に位置する、gne遺伝子であり;
このとき、gne遺伝子、任意選択でカンピロバクター・ジェジュニのgne遺伝子は、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズし;
(d)任意選択で膜タンパク質に結合しているか、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合しているか、又は宿主細胞から分泌される、Apx毒素I、II及びIIIの、任意選択で少なくともApx毒素II及びIIIの中和性エピトープのうちの少なくとも1種を任意選択で含み;
このとき、APP2 rfb遺伝子クラスターは、任意選択で大腸菌に対してコドン最適化されている。
(a)異種機能的APP rfb遺伝子クラスターは、任意選択でコドン最適化され、任意選択で(i)配列番号4を含むか若しくは配列番号4からなり;(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号4に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%の核酸配列同一性を有し;(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号4の核酸配列にハイブリダイズし;且つ/又は(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、APP8 rfb遺伝子クラスターであり、
(b)異種APP2 rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための任意的な異種プロモーターが、カナマイシン又はproDプロモーター、任意選択でカナマイシンプロモーターであり;
(c)APP O抗原合成の酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子が、任意選択でコドン最適化された、wzy及び/又はgne遺伝子であり、任意選択で両方の遺伝子が細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれ;
i.このとき、gne遺伝子、任意選択でカンピロバクター・ジェジュニのgne遺伝子は、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズし;
ii.このとき、任意選択でコドン最適化された、wzy遺伝子は、任意選択で、配列番号7若しくは配列番号8を含むか又は配列番号7若しくは配列番号8からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号7若しくは配列番号8に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号7若しくは配列番号8の核酸配列にハイブリダイズし;
(d)任意選択で膜タンパク質、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合している、Apx毒素I、II及びIIIの、任意選択で少なくともApx毒素II及びIIIの少なくとも2種の中和性エピトープを任意選択で含む。
実験例で用いられる細菌株及びその供給源を列記する:
上記のTable 1(表1)及びTable 2(表2)に列記される細菌株及びプラスミドを、ルリア・ベルターニ(LB)培地(10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物、5g/L NaCl)、TB培地(12g/Lトリプトン、24g/L酵母抽出物、0.017M KH2PO4、0.072M K2HPO4)又はBHI+NAD(2mg/Lβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を添加した37g/Lブレインハートインフュージョン培地(BHI;正確な組成は、Sigma Aldrich社cat.nr.53286を参照されたい))中で生育させた。
1)APP2 O抗原生合成クラスターを発現するワクチン株の生成
1.1)大腸菌及びSL1344でのAPP2 O抗原生合成クラスターの組込み
第1工程では、アクチノバシラス・プルロニューモニエ血清型2(APP2)株(P1875)を配列決定し、O抗原生合成クラスター(rfbクラスター)を、Xu等、2010、J.Bacteriol.、Vol.192(21)、5625~5636頁に従って特定した。本刊行物中で用いられる全てのAPP血清型のrfbクラスターが、erpA遺伝子とrpsU遺伝子との間に位置することが示された。図1、Table 4(表4)及びSeq.1は、本研究の配列決定されたAPP2株に関する遺伝子構成及び注釈付き遺伝子/タンパク質を示す。
糖鎖改変E.coli_5株及びSL1344株でのAPP2 O抗原の提示を改善するために、rfbクラスターのプロモーター領域をカナマイシン耐性遺伝子で交換し、このうち、カナマイシンプロモーターが、下流遺伝子の転写を誘導するために利用される。このために、オリゴヌクレオチドEc_SL/Kan_fw及びEc_SL/Kan_rev並びに鋳型としてのpKD4を用いてPCR断片を生成し、コードされるカナマイシンプロモーター並びに5'及び3'コードFRT部位を有する耐性遺伝子を増幅した。更に、オリゴヌクレオチドが、開始コドン前及び終止コドン後のerpA遺伝子に対して相同な相同組み換え配列を導入した。1644bpのサイズを有する得られた生成物を、第2のPCR反応のためにオリゴヌクレオチドEc_SL/Kan_fw_elo及びEc_SL/Kan_rev_eloと共に用いて、組込み効率を高めるために、相同組み換え配列を伸長した。このDNA断片並びにSL1344Δrfb::APP2.LPSに関してpKD46(Datsenko等、2000、PNAS、Vol.97(12)、6640~6645頁)及びE.coli_5Δrfb::APP2LPS株に関してpLAMBDA46のλ-組み換え系をコードする温度感受性ヘルパープラスミドを導入した。λ-組み換え系は、erpAの開始及び終止コドンでのそれぞれの部位における相同隣接領域を認識し、erpA遺伝子を「組み換え除去」し、FRT部位が隣接したカナマイシンプロモーター及び耐性遺伝子をそれぞれの部位へと組み込んだ。導入されたカナマイシン耐性遺伝子は、陽性クローン(組込み成功)の選択を可能にした。これらの陽性候補を、erpAの欠失及びPCR断片の組込みに関して、PCRにより確認した。温度感受性ヘルパープラスミドは、数ラウンドのインキュベーションにわたって生育温度を上昇させることにより、細胞から失われた。最終的な菌株E.coli_5Δrfb::kanR-APP2.LPS及びSL1344Δrfb::kanR-APP2.LPSにおけるO抗原提示を、免疫ブロッティングにより試験した(図8)。分析の手順及び結果を、1.6の下に記載する。
APP2 O抗原クラスタータンパク質/酵素発現を改善し、最終的に脂質A上でのAPP2 O抗原提示を増加させるために、遺伝子コード配列のヌクレオチド3文字コドンを、SL1344及びE.coli_5に対して最適化することができるであろう。これは、A.プルロニューモニエで優先されるがSL1344及びE.coli_5では好まれない可能性がある望ましくない3文字の使用を減少させる。本研究では、コドン最適化を、CROにより行い、大腸菌発現レベルに対して行った。サルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウムSL1344に対して同じことが言えるか否かは、SL1344内因性rfbクラスターへの同じコドン最適化APP2 rfbクラスターの組込みにより示される必要があった。
APP2 rfbクラスターを発現する作製された菌株において見て取れる通り、リポ多糖の典型的な「ラダー」パターンは、弱くのみ存在するか、又は検出可能でなかった(図8)。代わりに、単一サブユニットオリゴ糖としてのO抗原の強い蓄積が脂質A上に観察された。このことは、O抗原ポリメラーゼ(Wzy)が、LPSグリカンを効率的に組み立てられないことを示した。APP2 O抗原特異的wzyを、プラスミド上にコードされるWzyを発現するために選んだ。wzyは、APP2クラスター中の6番目の遺伝子としてXu等、2010、J.Bacteriol.、Vol.192(21)、5625~5636頁により注釈付けされ、Seq.1及び図1においてsetAとrfbXとの間に位置する仮想的タンパク質に対応する。NCBIタンパク質データベースに対する仮想的タンパク質配列のBlast分析は、29%の同一性を有するラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)のWzy(遺伝子座AZY91860)、22%の同一性を有するオエノコッカス・オエニ(Oenococcus oeni)の多糖ポリメラーゼ(遺伝子座WP_071436899)及び24%の同一性を有するストレプトコッカス属種DD12(Streptococcus sp.DD12)の多糖ポリメラーゼ(遺伝子座KXR76217)を特定した。これらの知見に基づいて、仮想的タンパク質が、APP2 rfbクラスターのO抗原ポリメラーゼWzyを表し得ることが想定された。5'NdeI及び3'EcoRI制限切断部位を有するプラスミドpDOC_E.coli_5_Δrfb::APP2.LPS/kanRから潜在的wzy遺伝子を増幅するために、オリゴヌクレオチド5'NdeI_wzy/3'EcoRI_wzyを用いた(PCR産物の断片サイズは1138bpであった)。wzyの発現のために、アラビノース誘導可能プロモーターを有するベクターpEC415を選んだ。pEC415へとwzyをクローニングするために、ベクターを線形化し、オリゴヌクレオチド3'EcoRI_pEC415fw/5'NdeI_pEC415revを用いるPCRにより増幅及び改変した(5419bpの断片)。再び、EcoRI及びNdeI切断部位を、断片末端に導入した。PCRにより作製されたEcoRI-wzy-NdeI断片及びEcoRI-pEC415-NdeI断片を、それぞれの制限エンドヌクレアーゼを用いて消化し、ライゲーションした。配列(pEC415-wzy)の確認後、APP2 rfbクラスターを発現する細胞での試験のために、プラスミドを更に用いた。
遺伝子改変SL1344へとプラスミド上のgne及び/又はwzyを導入した後にAPP2 O抗原合成の改善が見られたので、これらの遺伝子を、APP2 rfbクラスターを発現する菌株のゲノムに組み込んだ。APP2 LPSの発現レベルを比較するために、gne単独及びコドン最適化wzy(APP2のwzy(cod.opt.)、Seq.8)に融合させたgneを組み込んだ。組込み部位として、O抗原リガーゼrfaLの下流領域を、組み込まれたgne及びwzy(cod.opt.)を同様に転写する目的でrfaLプロモーターを用いるために選んだ。一般的設計(図6)は、FRT部位が隣接した、2種類の酵素(gne、wzy-cod.opt.)のそれぞれ及び抗生物質耐性カセットcat(クロラムフェニコール耐性カセット)をコードする2種類(図6A)~3種類(図6B)の個別のPCR断片の生成に基づく。
全細胞細菌に基づくワクチンに関して、抗生物質耐性を有しないことが推奨される。したがって、APP2 rfb発現を強化するために導入されたカナマイシン耐性は、ゲノムから欠失させる必要があった。しかし、カナマイシンプロモーターによる転写増大の利点は、未来の細菌ワクチン株で用いられる場合がある。第1工程では、SL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat細胞に温度感受性プラスミドpCP20(Cherepanov等、1995、Gene、Vol.158、9~14頁)を導入することにより、カナマイシン及びクロラムフェニコール耐性カセットを「フリップアウト」させた。それぞれの位置でのカナマイシン及びクロラムフェニコール耐性カセットの「フリップアウト」事象後には、1つのFRT部位のみがゲノム中に残った。培養温度を上昇させて、陽性クローンを、フリッパーゼコードプラスミドに対して逆選択した。PCRにより、pCP20の非存在及びカナマイシン並びにクロラムフェニコール耐性マーカーの非存在を確認した。コドン最適化APP2 rfbクラスターの上流にカナマイシンプロモーター(kP)を組み込ませるために、隣接FRT部位を有するクロラムフェニコール耐性カセット及びそれに続くカナマイシン耐性カセットの373bpプロモーター領域を含有する1414bp構築物を合成した(図7、Seq.45)。APP2 rfbクラスターの上流に配列22を導入するために、オリゴヌクレオチドEc_SL/Kan_fw及びEc_SL/Kan_rev並びに鋳型としての配列24を用いてPCR断片を生成し、それによりkP組込みカセットを増幅し、rfbクラスターの上流領域に対して相同組み換え配列を追加した。得られた生成物を、第2のPCR反応のためにオリゴヌクレオチドEc_SL/Kan_fw_elo及びEc_SL/Kan_rev_eloと共に用いて、組込み効率の増加のための相同組み換え配列を伸長した(断片サイズ1671bp)。このDNA断片及びSL1344Δrfb::APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)に対するλ-組み換え系をコードする温度感受性ヘルパープラスミドpKD46(Datsenko等、2000、PNAS、Vol.97(12)、6640~6645頁)を導入した。λ-組み換え系は、rfbクラスターの上流の相同隣接領域を認識し、それぞれの部位へと、カナマイシンプロモーターに融合した隣接FRT部位を有するクロラムフェニコール耐性遺伝子を組み込んだ。導入されたクロラムフェニコール耐性遺伝子は、陽性クローン(組込み成功)の選択を可能にした。これらの陽性候補を、PCR断片の組込みに関して確認した。温度感受性ヘルパープラスミドは、数ラウンドのインキュベーションにわたって生育温度を上昇させることにより、細胞から失われた。クロラムフェニコール耐性カセットを除去するために、作製した菌株SL1344Δrfb::cat/kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)にpCP20を形質転換し、上記の通りにマーカーをフリップアウトさせた。生じた菌株SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)を、そのAPP2 O抗原生成に関して分析し、その親菌株と比較した(図8)。
1OD600細胞当量)を4~12%ビスTrisゲルにロードし、MESバッファー中でサイズにより分子を分離した。免疫ブロッティング及び銀染色のために、ゲルを更に加工した。免疫ブロットを介してLPS合成を分析するために、LPSを、PVDFメンブレン上にゲルからトランスファーした。室温で2時間振盪しながら、ブロッキング溶液(PBS pH7.5/0.05%Tween/0.1%カゼイン)中でメンブレンをインキュベートした。続いて、メンブレンを、APP2 LPSに対して反応性のウサギ血清を1:2000希釈で含有する抗体結合性溶液(PBS pH7.5/0.05%Tween/0.05%カゼイン)中、4℃で一晩振盪しながらインキュベートした。免疫ブロットを、過剰量のPBS 0.05%TweenバッファーpH7.5を用いて5分間、3回洗浄した。その後、メンブレンを、1:2000希釈で二次ヤギ抗ウサギIgG-HRP抗体(BETHYL社Cat#A120-401P)を有する抗体結合性溶液中、室温で振盪しながら1時間インキュベートした。メンブレンを、過剰量のPBS 0.05%TweenバッファーpH7.5を用いて5分間、4回洗浄した。その後、特異的抗体結合を、メンブレンにECL溶液(GE healthcare社#RPN2105)を追加し、Stella8300(Raytest社)を用いて検出された光シグナルを記録することにより可視化した。銀染色のために、Tsai等、1982、Anal.Biochem.、Vol.119(1)、115~9頁により記載されたプロトコールを用いた。簡潔には、室温で40%EtOH/5%酢酸中においてゲルを一晩固定した。その後、ゲルを40%EtOH/5%酢酸中の0.7%過ヨウ素酸を用いて10分間処理し、続いてddH2Oを用いて15分間、3回洗浄した。染色溶液(0.187N水酸化ナトリウム、0.2N水酸化アンモニウム、0.667%硝酸銀)を用いてゲルを染色し、再びddH2Oを用いて10分間、3回十分に洗浄した。ゲル上のLPSを、顕色溶液(0.25mg/mlクエン酸一水和物、0.0185%ホルムアルデヒド溶液)を追加することにより可視化した。
宿主細菌への異種O抗原の記載された移植を様々なO抗原タイプに適用できることを証明するために、アクチノバシラス・プルロニューモニエ血清型8(AAP8)株(MIDG2331)のrfbクラスターを、SL1344へとゲノム組込みし、脂質A上でのAAP8 O抗原提示に関して試験した。
2)潜在的ワクチン接種候補としてのAPPのApx毒素の中和性エピトープのクローニング
2.1)ApxII及びApxIIIの可溶性中和性エピトープをコードするプラスミドの作製
APP感染に対する有効なワクチンに関して、不活性化毒素(Apxトキソイド)が最終的なワクチン製剤中に存在すると考えられる。これらの孔形成Apx毒素は、APPの主要な病原性因子に属し、感染の病因に強く寄与する(Bosse等、2002、Microbes Infect.、Vol.4(2)、225~235頁)。4種類の特定されたApx毒素(ApxI、II、III及びIV)は、活性化因子遺伝子及び分泌装置コード遺伝子を更にコードするapxオペロン中にそれらのプレ毒素構造形態でコードされる。4種類の毒素は、異なるAPP血清型では様々な組み合わせで発現される。APP血清型2は、ApxII、III及びIVをコードする(Beck等、1994、J.Clin.Microbiol.、Vol.32(11)、2749~2754頁)。この文献で、ApxII及びIIIの切断型が作製され、大腸菌で発現され、精製された。近年の刊行物において、ApxII及びIIIの中和性エピトープが、免疫応答を誘導できることが特定され、これらのエピトープに対して生成される抗体は、in vitroで保護的であった。Kim等、2010は、アミノ酸439~801aaを含有する、APP2由来のN末端HIS10タグ付き切断型ApxIIを記載した。RTX毒素IIA(ApxII)の配列を、データベースから回復し(GenBank:AF363362.1)、合成し、pMLBADベクターpMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)上にコードされる切断型HIS10タグ付きApxII(439~801aa)(Seq.47)を生成するために用いた。ApxIIIの配列を、データベースから回復し(GenBank:AF363363.1)、合成のための鋳型として用いた。以前の研究では、ApxIIIのN末端ドメインが、回復期ブタ血清により認識されたことが示され、N末端ドメインは、細胞傷害性中和活性を有し、ApxIIIにより誘導される好中球アポトーシスをin vitroで防止する(Seah等、2004、Vaccine、Vol.22(11-12)、1494~1497頁)。ApxIIIのN末端ドメイン(アミノ酸27~245)を、C末端HIS10タグを含めて合成し(Seq.48)、PCR反応においてプライマー5'XmaI-XhoI-APXIIIne-HIS-fw/3'APXIIIne-HIS-HindIII-rvを用いることにより、開始コドン及び5'XmaI/3'HindIII制限エンドヌクレアーゼ切断部位を導入するために、鋳型として用いた。得られた断片を、それぞれの酵素を用いて消化し、XmaI/HindIII処理済みpMLBADベクターへとライゲーションした(pMLBAD-ApxIII(27-245aa)-HIS9;クローニングの経過中に1つのHISエピトープは失われた。両方のプラスミドを、タンパク質発現試験及びブタワクチン接種試験のための精製のために、大腸菌BL21に導入した。HIS10-ApxII(439-801aa)を精製するために、LB+Tmp(10μg/ml)中で振盪しながら37℃で生育させたBL21 pMLBAD-HIS10-ApxII(439-801aa)の一晩培養物を、1L LB+Tmp中に0.1OD600まで希釈し、OD600がおよそ0.8~0.9となるまで37℃で振盪しながらインキュベートした。アラビノース(0.2%最終濃度)を追加し、タンパク質発現を誘導した。振盪機上、37℃で更に4時間、細胞をインキュベートし、続いて遠心分離により回収した(5000×g/4℃/10分間及び上清の廃棄)。細胞溶解のために、20mlの0.1mg/mlリゾチーム(1×PBS中)を追加した。超音波破砕・凍結融解ラウンドにより細胞を破壊した。簡潔には、細胞ペレットを、85%の振幅で超音波破砕し、液体窒素中で1分間凍結させ、37℃(振盪)で10分間融解した。この手順を3回繰り返した。細胞懸濁物を、10000×gで4℃にて5分間遠心分離した。上述の手順の間に、HIS10-ApxII(439-801aa)が凝集し、それにより遠心分離後にペレット画分中にタンパク質が見出されることが分かった。約20ml変性バッファー(6Mグアニジン塩酸塩、0.1M Tris-HCl pH8.0)をペレットに追加し、材料を4℃にて10000×gで20分間、再度遠心分離した。4mlの平衡化ニッケル-NTA樹脂を上清に追加し、材料を回転ホイール上で4℃にて1時間インキュベートした。その後、懸濁物を重力流カラムにロードした。樹脂を、10ml 1×PBSを用いて3回洗浄し、0.5Mイミダゾールを含有する5回の1ml変性バッファーを用いてタンパク質を溶出した。回収された材料を分析するために、60μlの各溶出画分を20μlの4×レムリバッファーと混合した。サンプルを95℃で5分間加熱し、10μlを4~12%ビスTrisゲルにロードし、MESバッファー中でサイズにより分子を分離した。クーマシー染色(図12A)及びHIS特異的抗体を用いる免疫ブロッティング(図12B)のために、ゲルを更に加工した。クーマシー染色のために、ゲルをクーマシー染色溶液(3mMクーマシーブリリアントブルーR 250、40%エタノール、10%酢酸)に重ね、室温で一晩、振盪しながらインキュベートした。ゲルの所望の脱染及びタンパク質の染色が観察されるまで、ゲルをクーマシー脱染溶液(30%エタノール、10%酢酸)中に繰り返し入れた。免疫ブロットを介して精製HIS10-ApxII(439-801aa)を検出するために、タンパク質をPVDFメンブレン上にゲルからトランスファーした。室温で2時間振盪しながら、ブロッキング溶液(PBS pH7.5/0.05%Tween/0.1%カゼイン)中でメンブレンをインキュベートした。続いて、メンブレンを、Tetra-HIS抗体(Qiagen社#34670)を1:2000希釈で含有する抗体結合性溶液(PBS pH7.5/0.05%Tween/0.05%カゼイン)中、4℃で一晩振盪しながらインキュベートした。メンブレンを、過剰量のPBS 0.05%TweenバッファーpH7.5を用いて5分間、3回洗浄した。その後、メンブレンを、1:2000希釈で二次ヤギ抗マウスIgG-HRP抗体(BETHYL社Cat#A90-116P)を有する抗体結合性溶液中、室温で振盪しながら1時間インキュベートした。メンブレンを、過剰量のPBS 0.05%TweenバッファーpH7.5を用いて5分間、4回洗浄した。その後、特異的抗体結合を、メンブレンにECL溶液(GE healthcare社#RPN2105)を追加し、Stella8300(Raytest社)を用いて検出された光シグナルを記録することにより可視化した。
その表面上にAPP2 LPS及びApx毒素の中和性エピトープを提示する生存サルモネラ属(Salmonella)ワクチン株を作製するために、対応する遺伝子をゲノムインテグレーションさせ、中和性エピトープの表面提示を得た。Xu等、2018、PlosOne、Vol.13(1)は、C末端HIS6タグを有する切断型ApxI(628-845aa)、切断型ApxII(612-801aa)及び切断型ApxIII(626-860aa)に連結された、特異的免疫応答を誘導する、細胞表面上に発現される孔形成溶血性タンパク質であるClyAからなる融合構築物を記載した。マウスのワクチン接種及び負荷研究では、群が、異なるAPP血清型を用いる負荷後に、免疫グロブリン及びサイトカインレベルの上昇並びに生存率の増加を示した。構築物の配列は公衆に利用可能であり、以下の通りに改変された。合成会社により提供されたアルゴリズムを用いて、ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6のコドン使用頻度を、大腸菌発現系に対して最適化した。強力な転写率のために、合成プロモーターproD(Davis等、2010、Nucleic acids research、Vol.39(3)、1121~1141頁)の配列を、開始コドンの前に組み込んだ。ゲノムへの成功裏の組込みを選択するために、FRT部位が隣接したクロラムフェニコール耐性カセット(cat)(pKD3に基づく;Datsenko等、2000、PNAS、Vol.97(12)、6640~6645頁)を、融合構築物の終止コドンの後に付加した。ゲノムへの相同インテグレーションのために、構築物の上流及び下流で、遺伝子間rfaK-rfaL領域に対する相同配列を選んだ(proDプロモーターの5'に213bp、クロラムフェニコール耐性カセットの後に250bpの付加)。完全な合成構築物を、図14に模式的に表す(Seq.49)。SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)へと融合構築物proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/catを組み込ませるために、配列32の隣接領域を、オリゴヌクレオチドFW_pliCint/REV_pagCintを用いるPCR及びそれに続くオリゴヌクレオチドeloFW_pliCint/eloREV_pagCintを用いる5'及び3'末端の伸長により変更した。この手順は、SL1344においてpliCの下流領域を有する83bp相同領域及びSL1344においてpagCの下流領域を有する87bp相同領域をつくり出した。この改変により、融合構築物proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/catを、pliCとpagCとの間の遺伝子間領域へと組み込むことができた。最終的な構築物を、SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)へと、γ-組み換え系をコードする温度感受性ヘルパープラスミドpKD46(Datsenko等、2000、PNAS、Vol.97(12)、6640~6645頁)と共に形質転換した。λ-組み換え系は、それぞれのゲノム部位で相同隣接領域を認識し、上述の組込み部位(SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-cat/pagC)へと融合構築物proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/catを組み換えた。APP2 rfbクラスターを欠損するがproD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6融合構築物を発現する対照株を作製するために、Seq.32を、オリゴヌクレオチドFW-rfaK_rfaL/REV_rfaL_rfaKを用いて増幅し、SL1344のrfaKとrfaLとの間の遺伝子間領域での組込みのための隣接相同領域を有する組込み構築物を含有する4513bp断片を生じた。この断片を、pKD46と共にSL1344Δrfbへと形質転換し、上記の通りの手順に従った。構築物proD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6/catを、遺伝子rfaKとrfaLとの間の遺伝子間領域に組み込んだ(SL1344Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaL/cat)。両方の菌株において、導入された抗生物質耐性カセットは、陽性クローン(組込み成功)の選択を可能にした。これらの陽性候補を、PCR断片の組込みに関して、PCRにより確認した。温度感受性ヘルパープラスミドは、数ラウンドのインキュベーションにわたって生育温度を上昇させることにより、細胞から失われた。クロラムフェニコール耐性カセットを除去するために、生成された菌株SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩproDClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-cat/pagC及びSL1344Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-cat/rfaLを、回文FRT部位を認識するフリッパーゼをコードする温度感受性プラスミドpCP20(Cherepanov等、1995、Gene、Vol.158、9~14頁)を用いて形質転換した。「フリップアウト」事象後、1つのFRTがゲノム中に残った。再び、培養温度を上昇させて、陽性クローンを、フリッパーゼコードプラスミドに対して逆選択した。最終的なPCRが、全てのヘルパープラスミドの非存在、クロラムフェニコール耐性マーカーの非存在及びproD-ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6の組込みを確認した。得られた菌株SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)pliC-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-pagC及びSL1344Δrfb rfaK-ΩproD-ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6-rfaLを、それらのAPP2 O抗原生成並びにClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6発現に関して分析した。ClyA-ApxI(628-845aa)-ApxII(612-801aa)-ApxIII(626-860aa)-HIS6の発現を確認するために、SL1344Δrfb::kP-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)及びSL1344Δrfb全細胞抽出物を、免疫ブロット及びクーマシー染色により分析した。
た(図15Aのロードスキーム)。クーマシー染色(図15B)及びHISエピトープを検出するためのウエスタンブロッティング(図15C)のために、ゲルを更に加工した。クーマシー染色のために、ゲルをクーマシー染色溶液(3mMクーマシーブリリアントブルーR 250、40%エタノール、10%酢酸)に重ね、室温で一晩、振盪しながらインキュベートした。ゲルの所望の脱染及びタンパク質の染色が観察されるまで、ゲルをクーマシー脱染溶液(30%エタノール、10%酢酸)中に繰り返し入れた。免疫ブロットを介してClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6、HIS10-APXII(439-801aa)及びAPXIII(27-245aa)-HIS9を検出するために、タンパク質をPVDFメンブレン上にゲルからトランスファーした。室温で2時間振盪しながら、ブロッキング溶液(PBS pH7.5/0.05%Tween/0.1%カゼイン)中でメンブレンをインキュベートした。続いて、メンブレンを、Tetra-HIS抗体(Qiagen社#34670)を1:2000希釈で含有する抗体結合性溶液(PBS pH7.5/0.05%Tween/0.05%カゼイン)中、4℃で一晩振盪しながらインキュベートした。免疫ブロットを、過剰量のPBS 0.05%TweenバッファーpH7.5を用いて5分間、3回洗浄した。その後、メンブレンを、1:2000希釈で二次ヤギ抗マウスIgG-HRP抗体(BETHYL社Cat#A90-116P)を有する抗体結合性溶液中、室温で振盪しながら1時間インキュベートした。メンブレンを、過剰量のPBS 0.05%TweenバッファーpH7.5を用いて5分間、4回洗浄した。その後、特異的抗体結合を、メンブレンにECL溶液(GE healthcare社#RPN2105)を追加し、Stella8300(Raytest社)を用いて検出された光シグナルを記録することにより可視化した。SL1344Δrfb::Kan-APP2.LPS rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/cat(潜在的なロード工程のエラー、図15B、レーン10)を除いて、クーマシー染色ゲル上でSL1344及びその誘導体を比較する場合、同量の細胞当量がロードされた(図15B、レーン4~14)。APP2全細胞抽出物のクーマシー分析は、SL1344細胞とも異なる全体的なタンパク質染色の低下を明らかにした。精製HIS10-APXII(439-801aa)が、50kDa付近のかすかなバンドとして見て取れ(図15B、レーン1)、これはウエスタンブロット分析で用いたHIS抗体により認識される(図15C、レーン1)。また、APXIII(27-245aa)-HIS9は、25kDa付近(図15B、レーン2)で検出可能であった。HIS免疫ブロットでは、非常に強いシグナルを、このタンパク質に対してモニタリングした(図15C、レーン2)。ClyA-ApxI(aa626-845)-ApxII(aa612-801)-ApxIII(aa626-860)-HIS6を発現する細胞(図15C、レーン13、14)は、104kDa付近の計算上の分子量よりも高い115kDaを超えるHIS免疫ブロットでのシグナルを示した。これは、この膜貫通タンパク質に対する変更された泳動パターンを生じるSDS-PAGEパラメーターに起因し得る。また、115kDa未満の更なるバンドが検出され、これは融合構築物のタンパク質分解切断に起因し得る。検出されたシグナルは、融合構築物を欠損する全ての他の試験された対照細胞では不在であった。
臨床試験
3.1)組み換えAPP2 O抗原及び不活性化APP2細菌を提示する不活性化ワクチン株を用いる子ブタでの免疫化研究
この最初の免疫化試験の目標は、APP2 rfbクラスターをコードする不活性化E.coli_5及びSL1344を用いるブタの鼻内/経口又は筋内免疫化後に、APP2 LPSの安全性及び免疫原性を試験することであった(試験レイアウトに関して、Table 6を参照されたい)。
第2の免疫化試験では、細胞表面上での改善されたAPP2 O抗原提示を有するAPP2 rfbクラスターをコードする生存SL1344の安全性及び免疫原性を、ブタで試験した(試験レイアウトに関して、Table 7(表7)を参照されたい)。群1はSL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS(cod.opt.)rfaL-Ωgne-wzy(cod.opt.)/catを用い、群2は未処理対照(抗原適用なし)として維持した。
この研究の目的は、その表面上にAPP2 O抗原を提示する開発された糖鎖改変SL1344ワクチン株を用いて免疫化されたブタにおいてAPP2感染を予防する有効性を調べることであった(群の概要に関して、Table 9(表9)を参照されたい)。
この研究の目的は、筋内注入されるApxII及びIIIの中和性エピトープと組み合わせて、経口的及び鼻内的に適用された場合に、不活性化APP2ワクチン株(wzy及びgne発現が誘導されたSL1344Δrfb::kanR-APP2.LPS pEC415-wzy pMLBAD-gne)の有効性を再現することであった(群1)。更に、有効性を、市販ワクチンPorcilis(登録商標)APPを用いて処理された動物(群2)と比較した。手順は、3.3章に記載される実験と同等であった。ワクチンを、SD0及び21に投与した。両方の群を、非ワクチン接種動物(群3)と比較した。SD42においてブタに感染用量のAPP血清型2(HK361、NCTC10976)を用いて負荷し、SD48に安楽死させた。動物を、臨床的徴候について定期的にモニタリングし(負荷後6日間の間、少なくとも1日2回)、直腸温度測定を、1日1回又は2回行った。
Claims (20)
- ワクチン使用のためのグラム陰性細菌宿主細胞であって、
(a)異種機能的アクチノバシラス・プルロニューモニエ(APP)rfb遺伝子クラスターであり、該異種機能的APP rfb遺伝子クラスターが、細菌宿主細胞の脂質Aコアに結合し細菌宿主外表面上に位置するAPP O抗原を生成し、並びに該細菌宿主細胞の内因性rfb遺伝子クラスターが機能的でない、異種機能的APP rfb遺伝子クラスター;
(b)任意選択で、該内因性rfb遺伝子クラスターに対する内因性プロモーターよりも強力な、該異種APP rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための異種プロモーター;
(c)任意選択で、該APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子;
(d)任意選択で、Apx毒素の少なくとも1種の中和性エピトープ、任意選択で、Apx毒素I、II及びIIIIの少なくとも1種の中和性エピトープであり、任意選択で該細菌宿主細胞外表面上に位置するか、且つ/又は該細胞から分泌される、中和性エピトープ
を含み、
任意選択で、(a)、(c)及び(d)のうちの少なくとも1つが該細菌宿主細胞に対してコドン最適化されている、細菌宿主細胞。 - 前記細菌宿主細胞が、腸内細菌科、バークホルデリア科、シュードモナス科、ビブリオ科、任意選択で、バークホルデリア・タイランデンシス、緑膿菌、ビブリオ・ナトリエゲンス、コレラ菌、大腸菌、任意選択でE.coli_5、サルモネラ菌、任意選択で、サルモネラ菌亜種エンテリカ、任意選択で、血清型チフィムリウム、エンテリティディス、ハイデルベルク、ガリナルム、ハーダー、アゴナ、ケンタッキー及びインファンティスからなる群より選択されるサルモネラ菌亜種エンテリカ、並びにサルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウムSL1344からなる群より選択される、請求項1に記載の細菌宿主細胞。
- 前記異種rfb遺伝子クラスターが、
(i)配列番号1、配列番号3若しくは配列番号4を含むか又はこれからなり;
(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号1、配列番号3若しくは配列番号4に対して少なくとも70、80、90、95又は98%の核酸配列同一性を有し;
(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号1、配列番号3又は配列番号4の核酸配列にハイブリダイズし;且つ/或いは
(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、
APP1~18 rfb遺伝子クラスターから選択され、任意選択で、APP2又はAPP8 rfb遺伝子クラスターである、請求項1又は2に記載の細菌宿主細胞。 - 前記異種機能的APP rfb遺伝子クラスターが、APP1~18のO抗原、任意選択で、APP2又はAPP8 O抗原を生成し、該APP rfb遺伝子クラスターが、任意選択で、配列番号2、50~61、若しくは配列番号5、62~72のうちのいずれか1種のアミノ酸を含むか又はこれらからなる少なくとも1種のタンパク質、或いはこれらの配列に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%のアミノ酸配列同一性を有する少なくとも1種のタンパク質を発現する、請求項1から3のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主細胞の前記内因性rfb遺伝子クラスターが、少なくとも部分的に、任意選択で完全に欠失している、請求項1から4のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記異種APP rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための前記異種プロモーターが、カナマイシンプロモーター、proDプロモーター、j23101プロモーター、proCプロモーター、STER_RS05525プロモーター、STER_RS01225プロモーター、STER_RS04515プロモーター、STER_RS05020プロモーター、STER_RS06870プロモーター、STER_RS00780プロモーター、P32プロモーターからなる、任意選択で、カナマイシンプロモーター、proDプロモーター、j23101プロモーター、STER_RS04515プロモーター及びP32プロモーターからなる、任意選択で、カナマイシンプロモーター及びproDプロモーターからなる群より選択されるプロモーターである、請求項1から5のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。
- 前記APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子が、ヌクレオチド活性化グリカン生合成のための酵素、ウンデカプレニルピロリン酸グリコシルトランスフェラーゼ、O抗原グリコシルトランスフェラーゼ、O抗原ポリメラーゼ、O抗原鎖長決定因子タンパク質、及びN-グリカンエピメラーゼ並びにそれらの組み合わせからなる群より選択され、任意選択で、gne遺伝子及びwzy遺伝子からなる群より選択され、
i.該gne遺伝子はUDP-ガラクトース/UDP-N-アセチルグルコサミンエピメラーゼ、任意選択で、カンピロバクター・ジェジュニ由来のエピメラーゼをコードし、該gne遺伝子は、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一であり、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を有し;
ii.該wzy遺伝子は、APPの、任意選択でAPP2のO抗原ポリメラーゼをコードし、該wzy遺伝子は、任意選択で、配列番号7若しくは配列番号8のコドン最適化wzyを含むか又はこれからなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号7若しくは配列番号8に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一であり、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号7若しくは配列番号8の核酸配列にハイブリダイズする核酸配列を有する、
請求項1から6のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。 - Apx毒素の少なくとも1種の中和性エピトープ、任意選択で少なくともApx毒素I、II及びIIIが、前記細菌宿主細胞外表面上に位置し、任意選択で、細胞溶解素A、三量体自己輸送体アドヘシン、AIDA-I、EaeA、外膜タンパク質(OMP)、及び大腸菌のOmpAからなる群より選択される膜タンパク質に結合している、請求項1から7のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。
- (a)前記異種機能的APP rfb遺伝子クラスター、
(b)前記APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための少なくとも1種の更なる遺伝子、及び/又は
(c)Apx毒素の少なくとも1種の中和性エピトープ
が、前記細菌宿主細胞に対してコドン最適化されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。 - 前記異種機能的APP rfb遺伝子クラスター(a)が前記細菌宿主細胞に対してコドン最適化されている、請求項9に記載の使用のための細菌宿主細胞。
- 前記細菌宿主が、大腸菌、任意選択でE.coli_5、又はサルモネラ菌、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウム、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウムSL1344であり、
(a)前記異種機能的APP rfb遺伝子クラスターが、APP1~18 rfb遺伝子クラスターから選択され、任意選択でAPP2又はAPP8 rfb遺伝子クラスターであり;
(b)該異種APP rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための前記異種プロモーターがカナマイシン又はproDプロモーターであり;
(c)前記APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための前記少なくとも1種の更なる遺伝子が、wzy遺伝子、任意選択でコドン最適化されたwzy遺伝子、及び/又はgne遺伝子であり、両方の遺伝子が、任意選択で、該細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれるか又はプラスミド上に位置し;
(d)任意選択で膜タンパク質に結合するか、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合するか、又は該宿主細胞から分泌される、Apx毒素I、II及びIIIの中和性エピトープのうちの少なくとも1種を任意選択で含み;
(i)該APP2又はAPP8 rfb遺伝子クラスター、(ii)該gne遺伝子及び/又は(iii)該wzy遺伝子、任意選択で該APP2 rfb遺伝子クラスター及び該wzy遺伝子が、該細菌宿主細胞大腸菌、任意選択でE.coli_5、又はサルモネラ菌、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウムに対してコドン最適化されている、請求項1から10のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。 - 前記細菌宿主が、サルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウム、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウムSL1344株であり、
(a)前記コドン最適化異種機能的APP rfb遺伝子クラスターが、任意選択で(i)配列番号3を含むか又は配列番号3からなり;(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号1若しくは配列番号3に対して少なくとも70、80、90、95又は98%の核酸配列同一性を有し;
(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号1又は配列番号3の核酸配列にハイブリダイズし;且つ/或いは
(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、
APP2 rfb遺伝子クラスターであり、
該細菌宿主細胞の内因性rfb遺伝子クラスターは少なくとも部分的又は完全に欠失しており;
(b)該異種APP2 rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための前記任意的な異種プロモーターがカナマイシンプロモーターであり;
(c)前記APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための前記少なくとも1種の更なる遺伝子が、任意選択で該細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれている、gne遺伝子及び/又はwzy遺伝子であり;
i.該gne遺伝子、任意選択でカンピロバクター・ジェジュニのgne遺伝子が、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズし;
ii.該wzy遺伝子が、任意選択で、配列番号7若しくは配列番号8を含むか又は配列番号7若しくは配列番号8からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号7若しくは配列番号8に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号7若しくは配列番号8の核酸配列にハイブリダイズし;
(d)任意選択で膜タンパク質、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合している、Apx毒素I、II及びIIIの、任意選択で少なくともApx毒素II及びIIIの少なくとも2種の中和性エピトープを任意選択で含む、
請求項11に記載の細菌宿主細胞。 - 前記細菌宿主が、大腸菌、任意選択でE.coli_5であり、
(a)前記異種機能的APP rfb遺伝子クラスターが、任意選択でコドン最適化され、任意選択で(i)配列番号3を含むか又は配列番号3からなり;
(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号1若しくは配列番号3に対して少なくとも70、80、90、95又は98%の核酸配列同一性を有し;
(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号1又は配列番号3の核酸配列にハイブリダイズし;且つ/或いは
(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、
APP2 rfb遺伝子クラスターであり、
該細菌宿主細胞の内因性rfb遺伝子クラスターが少なくとも部分的又は完全に欠失しており;
(b)該異種APP2 rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための前記異種プロモーターが、カナマイシン又はproDプロモーター、任意選択でカナマイシンプロモーターであり;
(c)前記APP O抗原合成を補助する酵素を機能的に発現するための前記少なくとも1種の更なる遺伝子が、任意選択で該細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれるか又はプラスミド上に位置する、gne遺伝子であり;
該gne遺伝子、任意選択でカンピロバクター・ジェジュニのgne遺伝子が、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズし;
(d)任意選択で膜タンパク質に結合しているか、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合しているか、又は該宿主細胞から分泌される、Apx毒素I、II及びIIIの、任意選択で少なくともApx毒素II及びIIIの中和性エピトープのうちの少なくとも1種を任意選択で含み;
該APP2 rfb遺伝子クラスターは、任意選択で大腸菌に対してコドン最適化されている、請求項11に記載の細菌宿主細胞。 - 前記細菌宿主が、サルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウム、任意選択でサルモネラ菌亜種エンテリカ血清型チフィムリウムSL1344株又は大腸菌、任意選択でE.coli_5であり、
(a)前記異種機能的APP rfb遺伝子クラスターが、任意選択でコドン最適化され、任意選択で(i)配列番号4を含むか若しくは配列番号4からなり;(ii)任意選択で配列全体にわたって、配列番号4に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%の核酸配列同一性を有し;(iii)ストリンジェントな条件下で配列番号4の核酸配列にハイブリダイズし;且つ/又は(iv)(i)~(iii)のうちのいずれかの核酸配列に関して縮重している、APP8 rfb遺伝子クラスターであり、
(b)該異種APP2 rfb遺伝子クラスターの転写を調節するための前記任意的な異種プロモーターが、カナマイシン又はproDプロモーター、任意選択でカナマイシンプロモーターであり;
(c)前記APP O抗原合成の酵素を機能的に発現するための前記少なくとも1種の更なる遺伝子が、任意選択でコドン最適化された、wzy及び/又はgne遺伝子であり、任意選択で両方の遺伝子が該細菌宿主細胞のゲノムに組み込まれ;
i.該gne遺伝子、任意選択でカンピロバクター・ジェジュニのgne遺伝子が、任意選択で、配列番号6を含むか若しくは配列番号6からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号6に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号6の核酸配列にハイブリダイズし;
ii.任意選択でコドン最適化された、該wzy遺伝子が、任意選択で、配列番号7若しくは配列番号8を含むか又は配列番号7若しくは配列番号8からなるか、或いは、任意選択で配列全体にわたって、配列番号7若しくは配列番号8に対して少なくとも70、80、90、95若しくは98%同一な核酸配列を有し、且つ/又はストリンジェントな条件下で配列番号7若しくは配列番号8の核酸配列にハイブリダイズし;
(d)任意選択で膜タンパク質、任意選択で大腸菌の細胞溶解素Aに結合している、Apx毒素I、II及びIIIの、任意選択で少なくともApx毒素II及びIIIの少なくとも2種の中和性エピトープを任意選択で含む、
請求項11に記載の細菌宿主細胞。 - 前記細菌宿主が、生存しているか又は不活性化される、請求項1から14のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞。
- 請求項1から15のいずれか一項に記載の少なくとも1種の細菌宿主細胞を含む、組成物、任意選択で医薬組成物。
- APP由来の少なくとも2種の異なるO抗原、任意選択でAPP1~APP18から選択されるO抗原、任意選択でAPP1、2、5、7、8、10、12、14及び18からなる群より選択されるAPP O抗原の組み合わせを発現する細菌宿主細胞を含む、請求項15に記載の組成物又は医薬組成物。
- アクチノバシラス・プルロニューモニエ(APP)感染の、任意選択で、哺乳動物での、任意選択でブタ(イノシシ属)又は家畜ブタ(スース・スクローファ・ドメスティクス)でのAPP2感染の、予防及び/又は療法での使用のための、請求項1から16のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞又は請求項16若しくは17に記載の組成物。
- 前記細菌宿主が、鼻内的、経口的、口鼻的、舌下的、皮下的、皮内的、経皮的、結膜的又は筋内的に投与される、請求項18に記載の使用のための細菌宿主細胞。
- APP感染の治療及び/又は予防のための、任意選択でAPP感染の予防のための、それを必要とする哺乳動物被験体へと、生理学的有効量の請求項1から15のいずれか一項に記載の細菌宿主細胞又は請求項16若しくは17に記載の組成物を投与する工程を含む、治療方法。
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