JP2001510986A

JP2001510986A - ヘリコバクター・ピロリ生ワクチン

Info

Publication number: JP2001510986A
Application number: JP51794498A
Authority: JP
Inventors: メイヤー，トーマス，エフ．; ハアス，ライネール; ツェングェクスイン，ヤン; ゴメス―ドゥアルテ，オスカー; ルーカス，ベルナデッテ
Original assignee: マックス―プランク―ゲゼルシャフトツールフェルデルングデルヴィッセンシャフテンエー．ヴェー．
Priority date: 1996-10-11
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2001-08-07
Also published as: CN1246867A; NO991692L; DE69738641D1; AU734635B2; ATE392429T1; BR9713254A; IL129366A0; CA2268033A1; PL332575A1; TR199901450T2; EP0835928A1; KR20000049090A; EP0931093A1; KR100510928B1; AU4208497A; WO1998016552A1; CN1215167C; NZ335050A; NO991692D0; EP0931093B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)による感染に対する防御免疫を提供する新規な組換え生ワクチン、および最適化ワクチン用のヘリコバクター・ピロリ抗原のスクリーニング方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】ヘリコバクター・ピロリ生ワクチン本発明は、ヘリコバクター・ピロリ(Hellcobacter pylori)による感染に対する防御免疫を提供する新規な組換え生ワクチン、および最適化ワクチン用のヘリコバクター・ピロリ抗原のスクリーニング方法に関する。ヘリコバクター菌は、胃炎、消化性潰瘍形成および胃癌の発症に関連するグラム陰性細菌病原体である。ヘリコバクター菌のいくつかの種、特にヘリコバクター・ピロリ(H．pylori)、ヘリコバクター・ヘイルマニー(H．heilmanii)およびヘリコバクター・フェリス(H．felis)は胃にコロニーを形成する。ヘリコバクター・ピロリがヒト感染に最も一般的に関連する種であるが、ヘリコバクター・ヘイルマニーおよびヘリコバクター・フェリスもまたヒトに感染することが見いだされた。ヘリコバクター・ピロリの高い感染率は産業化された国々だけでなく第３世界の国々にも観察される。ヘリコバクター・ピロリについて記述された全てのビルレンス因子の中で、ウレアーゼは無菌（gnobiotic）のブタおよびヌードマウスにおけるコロニー形成に必須であることが知られている。ウレアーゼは２つの構造サブユニット（UreAおよびUreB）から成る酵素である。これまでに成された研究は、組換えUreBおよびコレラ毒素を用いた経口免疫感作はヘリコバクター・フェリスおよびヘリコバクター・ピロリの胃内コロニー形成からマウスを防御できることを示した(Michettiら，Gastroenterology 107(1994)，1002-1011) 。しかし、幾つかの症例では、組換えUreB抗原の経口投与によっては不完全な防御しか得ることができない。部分的防御を与えることが示された他のヘリコバクター・ピロリ抗原は、87kDの空胞細胞毒（vacuolar cytotoxin）VacA(CoverおよびBlaser，J．Blol．Chem．267(1992)，10570;Marchettiら，Science 267(1995) ，1655)ならびに13kDおよび58kDの熱ショックタンパク質HspAおよびHspB(Ferrer oら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92(1995)，6499)である。弱毒化病原体、例えばサルモネラ菌(Salmonella)等の細菌は、効果的な生ワクチンであることが公知である。ヒトにおける良好なワクチンとしての弱毒化サルモネラ菌の効果が最初に示されたのは、化学的に突然変異させた腸チフス菌(Sal monella typhi)Ty21a株を用いた研究によってであった(GermanierおよびFurer， J．Infect．Dis．141(1975)，553-558)。この効果は成人のボランティアに対して(Gilmanら，J．Infect．Dis．136(1977)，717-723)、後にはエジプトにおける大規模な実地試験において子供に対して試験され(Whadanら，J．Infect．Dis．1 45(1982)，292-295)、上首尾であった。経口投与されたTy21aワクチンは、３年間の監視の間、ワクチンを投与したエジプト人の子供の96%を防御することができた。その時から新しい弱毒化サルモネラ菌生ベクターワクチンが開発された(H oneら，Vaccine 9(1991)，810-816)。それらの研究では、染色体内に組み込まれた、はっきり規定された突然変異によって、経口投与後に強い免疫応答を誘導できる非ビルレント株がもたらされた(Tacketら，Vaccine 10(1992)，443-446;およびTacketら，Infect．Immun．60(1992)，536-541)。弱毒化サルモネラ菌生ワクチンの他の利点は、以前の不活性化大規模（wholesale）腸チフスワクチンに較べて安全であること、投与が容易であること、長期間の防御が可能であること、および副作用がないこと、を含む(Plotkin S.A.，Mortimer E.A．Jr．(編)，V accines．Philadelphia:WB Saunders(1988)，333-361に記載のLevineら，Typhoi d Fever Vaccines)。動物モデルとしてマウスを用いる可能性が高いため、ヒトにおける腸チフス菌の感染によく似ていると思われるネズミチフス菌(S．typhimurium)の突然変異体が抗原を運ぶために広く用いられてきた。最も一般的に用いられているネズミチフス菌の弱毒化は、芳香族アミノ酸の合成に影響を及ぼす遺伝子の部位特異的突然変異誘発からなる。アロ(aro)突然変異体と称するそのような菌株は、これらの構築物を用いた動物モデルおよびヒトにおける試用で示されたように、無視できる病原性しか有しない(HoisethおよびStocker，Nature 291(1981)，238-239;T acketら，(1992)，前出)。異種抗原を運ぶためにサルモネラ菌生ワクチンの強力な免疫原性が利用された。弱毒化サルモネラ菌における特定の抗原の発現は、マウスに、幾つかの細菌病原体に対する防御を付与した。ヘリコバクター菌抗原を発現することができ、そしてワクチン接種された動物を防御することができる組換え生ワクチンの使用はこれまで記述されていない。ヘリコバクター菌感染の治療のための弱毒化生ワクチンの使用もまた、これまで自明とされてはいない。その理由は、ヘリコバクター菌感染の経過においては、病原体自体に対する強い免疫応答が誘導されるが、しかしこれは防御免疫をもたらさないからである。したがって、ヘリコバクター菌抗原をコードするＤＮＡ分子を発現することができる組換え弱毒化細菌細胞を抗原の担体として用いた時に防御免疫反応が達成されることは、非常に驚くべきことであった。明らかに、ヘリコバクター菌抗原を発現する組換え弱毒化細菌細胞は異種ヘリコバクター菌抗原に対して、ヘリコバクター菌自身がその同種抗原に対して生じるのとは質的に異なった免疫応答を生じることができる。驚くべきことに、非防御的免疫応答が、ヘリコバクター菌感染から防御する免疫応答にこのように変化するのである。この予期せぬ観察は、防御抗原(protective angigen)のスクリーニングのための担体として組換え弱毒化病原体（特にサルモネラ属のような細菌細胞）を使用すること；そのようにして同定された防御抗原をヘリコバクター菌感染に対する任意のワクチンに応用すること；ならびにヒトおよび他の哺乳動物におけるヘリコバクター菌感染に対する免疫感作のための防御抗原の担体として組換え弱毒化細菌を使用すること、を可能とする。したがって本発明の主題は、ヘリコバクター菌抗原をコードする少なくとも１つの異種核酸分子を含む組換え弱毒化病原体であって、標的細胞中で該核酸分子を発現することができる、または該核酸分子の発現を引き起こすことができる該病原体である。このましくは上記核酸分子はＤＮＡ分子である。この弱毒化病原体は、感染を引き起こすことができ、そして好ましくは実際の病原体に対して効果的な免疫学的防御を引き起こすことができるが、それ自体はもはや病原性ではない微生物の株である。この弱毒化病原体は細菌、ウイルス、真菌、または寄生生物でありうる。好ましくは、それは細菌である。例えば、ネズミチフス菌または腸チフス菌等のサルモネラ菌、コレラ菌(Vibrio cholerae)( Mekalanosら，Nature 306(1983)，551-557)、フレクスナー赤痢菌(S．flexneri) 等の赤痢菌属(Shigella)の種(Sizemoreら，Science 270(1995)，299-302;Mounie rら，EMBO J．11(1992)，1991-1999)、リステリア菌(L．monocytogenes)等のリステリア属(Listeria)(MilonおよびCossart，Trends in Microbiology 3(1995) ，451-453)、大腸菌(Escherichia coli)、ストレプトコッカス・ゴルドニー(S．gordonii)等の連鎖球菌(Streptococcus)(Medagliniら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 92（1995）6868-6872)またはカルメット-ゲラン杆菌(Bacille calme tte Guerin)等のミコバクテリウム属の菌（Flynn，Cell．Mol．Biol．40 Suppl. 1(1994)，31-36）が挙げられる。より好ましくは、上記病原体は弱毒化したコレラ菌、フレクスナー赤痢菌、大腸菌またはサルモネラ菌等の腸内細菌である。最も好ましくは上記弱毒化病原体はサルモネラ菌細胞、例えばサルモネラ菌アロ突然変異体細胞である。しかし、弱毒化病原体は弱毒化ワクシニアウイルス、アデノウイルス、またはポックスウイルス等のウイルスであることができる。上記病原体に挿入される核酸分子はヘリコバクター菌抗原、好ましくはヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ヘイルマニーまたはヘリコバクター・ピロリ抗原、より好ましくはヘリコバクター・ピロリ抗原をコードする。ヘリコバクター菌抗原は、天然のヘリコバクター菌ポリペプチド、その免疫学的に反応性の断片、または天然ポリペプチドの免疫学的に反応性の変異型、またはその断片であることができる。さらに、ヘリコバクター菌抗原は、天然のヘリコバクター菌抗原の三次構造を刺激する防御性の炭水化物、またはペプチドミモトープ(mim otope)でありうる。ペプチドミモトープは細菌細胞の表面に提示されたペプチドライブラリーから得ることができる(PCT/EP96/01130参照)。もちろん、形質転換細胞は異なるヘリコバクター菌抗原をコードする幾つかのＤＮＡ分子も含むことができる。ヘリコバクター菌抗原をコードする核酸分子は染色体外ベクター、例えばプラスミドの上に位置させても、および／または病原体の細胞染色体中に組み込んでも良い。病原体をワクチンとして用いる場合は、染色体への組み込みが通常は好ましい。弱毒化細菌を用いて該細菌細胞中で上記核酸分子を直接転写および翻訳することができる。またはＤＮＡ分子が真核標的細胞の機構によって転写および／または翻訳されるように、該核酸分子を感染した標的細胞に運ぶことができる。この間接的細菌ワクチン接種法（本明細書では遺伝子ワクチン接種と称する）は、担体として赤痢菌を用いて実施して上首尾であった(Sizemore，D.R.，Branstrom， A.A.およびSadoff，J.C．(1995),「ＤＮＡ媒介免疫感作のためのＤＮＡデリバリービヒクルとしての弱毒化赤痢菌」，Science 270:299-302)。本発明の１つの好ましい実施態様においては、ヘリコバクター菌抗原はウレアーゼ、ウレアーゼサブユニット、その免疫学的に反応性の変異型またはその断片、またはそのペプチドミモトープである。さらに好ましい実施態様においては、ヘリコバクター菌抗原はヘリコバクター菌由来の分泌ポリペプチド、その免疫学的に反応性の変異型または断片、またはそのペプチドミモトープである。このような分泌ポリペプチド、特にアドヘシン(adhesin)をコードするヘリコバクター菌遺伝子の同定方法は、国際特許出願PCT/EP96/02544（参考としてここに組み入れる）に開示されている。この方法は以下の工程を含む。ａ）分泌活性のマーカーに結合させた誘導性トランスポゾンを含む宿主生物中にヘリコバクター・ピロリＤＮＡの遺伝子ライブラリー（bank）を調製し、ｂ）ヘリコバクター・ピロリＤＮＡ中へのトランスポゾンの挿入を誘導し、そしてｃ）上記マーカーを用いて分泌遺伝子を含むクローンの選択を実施し、そして場合によりさらにｄ）分泌活性を有する遺伝子を含むクローンのＤＮＡを用いてヘリコバクター・ピロリの再形質転換を実施し、ここで上記ＤＮＡを染色体に組み込むことによって同質遺伝子性ヘリコバクター・ピロリ突然変異株が作製され、そしてｅ）接着欠陥性ヘリコバクター・ピロリ突然変異株を検出するための選択を実施する。上記の方法によって得られる抗原の適切な例は、抗原AlpA、AlpB、その免疫学的に反応性の変異型または断片、またはそのペプチドミモトープからなる群から選択される。抗原AlpAおよびAlpBの核酸およびアミノ酸配列は国際特許出願PCT/ EP96/02545およびPCT/EP96/04124（これらは参考としてここに組み入れている）に開示されている。さらに、AlpBの核酸およびアミノ酸配列を配列番号１および２に、またAlpAの核酸およびアミノ酸配列を配列番号３および４に示す。しかし、例えば自己分解的放出によって表面に提示され、そして免疫学的防御を付与する細胞内抗原を使用することも考えられる。本発明の組換え病原体におけるヘリコバクター菌抗原の提示は、異なった方法で達成できる。組換え病原体においては、１個または複数の抗原が構成的、誘導的または相変異的(phase variable)な方法で合成されうる。発現系が知られているヘリコバクター菌抗原の構成的または誘導的合成については、Sambrookら，Mo lecular Cloning，A Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laborator y Pressに記述されているものを参照することができる。特に好ましいのは、抗原が相変異性の発現系において提示されることである。ハイブリッド生ワクチンにおける外来抗原の産生および提示のためのそのような相変異性発現系は、EP-B-0 565 548（参考としてここに組み入れている）に開示されている。そのような相変異性発現系においては、ヘリコバクター菌抗原をコードする核酸分子は発現シグナルの制御下にある。この発現シグナルは、上記病原体中で実質的に不活性であり、かつ該病原体中の核酸（例えばＤＮＡ）再編成 (reorganization)機構、例えば特異的ＤＮＡ逆位(inversion)プロセス、特異的ＤＮＡ欠失プロセス、特異的ＤＮＡ複製プロセスまたは特異的スリップトストランドミスペアリング(slipped-strand-mispairing)機構、等によって引き起こされる自然(spontaneous)再編成によって活性化されうるものである。相変異性発現系を有する組換え細胞は、２つの亜集団ＡおよびＢを形成することができる。これらの亜集団への分割は、組換え核酸の自然再編成によって起こる。ここで亜集団Ａは感染が可能で、かつそれ自体で免疫学的に活性であり、他方、亜集団Ａから再生される亜集団Ｂは少なくとも１つの異種ヘリコバクター菌抗原を産生し、この付加的抗原については免疫学的に作用する。ヘリコバクター菌抗原をコードする発現シグナルの活性化は核酸再編成によって直接的に達成されうる。または、ヘリコバクター菌抗原をコードする遺伝子の発現を制御するタンパク質をコードする遺伝子の活性化によって間接的に達成されうる。間接的活性化とは、カスケード系によってヘリコバクター菌抗原の産生を可能とする系を意味する。この系は、例えば、ＤＮＡ再編成によって直接制御される遺伝子が、ヘリコバクター菌遺伝子の前に位置するプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼをコードするか、または別な特異的な方法でヘリコバクター菌遺伝子の発現を誘導する遺伝子調節エレメントをコードすることによって実現される系である。本発明の特に好ましい実施態様においては、ヘリコバクター菌抗原をコードする遺伝子のための発現シグナルはバクテリオファージプロモーター（例えばＴ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター）であり、そして該発現シグナルの活性化は核酸再編成によって引き起こされ、病原体における対応するバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの産生をもたらす。相変異性発現系は、ヘリコバクター菌抗原をあらかじめ選択された発現レベルで提供するように適合させることができる。これは、例えば、核酸再編成機構によって、および／またはさらなる遺伝子調節エレメントの挿入によって活性化される発現シグナルのヌクレオチド配列を改変することによって達成できる。ヘリコバクター菌抗原は、本発明の病原体の細胞内および細胞外に産生させることができる。例えば、細胞外分泌系としてはＩｇＡ-プロテアーゼ系等の自動輸送体(autotransporter)系（例えばEP-A-0 254 090参照）または大腸菌AIDA-1 アドヘシン系（Benzら，Mol．Microbiol．6(1992)，1539）が適している。他の適切な外膜輸送体系は、RTX-トキシン輸送体、例えば大腸菌ヘモリシン(hemolys in)輸送系(Hessら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93(1996)，11458-11463)等である。本発明の病原体は、ヘリコバクター菌抗原をコードする核酸分子の他に、免疫応答に量的または質的に影響を及ぼす免疫変調性(immunomodulatory)ポリペプチドをコードする第２の異種核酸（例えばＤＮＡ）分子を含むことができる。このような免疫変調性ポリペプチドの例は、免疫刺激性ペプチド、IL-2、IL-6または IL-12等のサイトカイン、ケモカイン、コレラトキシンＢまたはアドヘシン等の毒素である。本発明はまた、活性成分として上記の組換え弱毒化病原体を含み、さらに場合により製薬上許容される希釈剤、担体およびアジュバントを含む医薬組成物に関する。好ましくは、この組成物は生ワクチンである。ワクチン接種経路はワクチンベクターの選択によって決まる。投与は１回でもよいし、または間隔をおいて繰り返し行なってもよい。適切な投与量はワクチンベクター自体または投与経路、等の種々のパラメーターに依存する。通常、投与量は１回の接種あたり約10⁶ から10¹²細胞(CFU)、好ましくは約10⁸から10¹⁰細胞(CFU)を含む。粘膜表面への投与（例：眼球、鼻腔内、経口、胃、腸、直腸、膣または尿道）、または非経口経路による投与（例：皮下、皮膚内、筋肉内、静脈内、または腹腔内）が選択できる。生ワクチンの調製方法は、製薬上有効量の弱毒化病原体を製薬上許容される希釈剤、担体および／またはアジュバントと共に製剤化することからなる。上記医薬組成物は、例えば水またはミルクなどの適切な液体担体の懸濁液、カプセル、錠剤、等の任意の適切な形態で提供することができる。本発明の好ましい実施態様においては、医薬組成物は使用にさきだって液体担体に懸濁される、凍結乾燥物である。さらに、本発明は上に規定した組換え弱毒化病原体を調製する方法に関する。この方法は、ａ）ヘリコバクター菌抗原をコードする核酸分子を弱毒化病原体に挿入して、標的細胞中で該核酸分子を発現することができる、または該核酸分子の発現を引き起こすことができる組換え弱毒化病原体（例えば、形質転換細菌細胞）を獲得し；そしてｂ）適切な条件下で該組換え弱毒化病原体を培養する、工程を含んでなる。上記病原体が細菌細胞である場合、ヘリコバクター菌抗原をコードする核酸分子を染色体外プラスミド上に位置させることができる。しかし、該核酸分子を病原体の染色体中に挿入することも可能である。さらに、本発明は哺乳動物宿主中に防御免疫応答を引き起こすヘリコバクター菌抗原を同定する方法に関する。この方法は下記の工程を含む。すなわち、ａ）弱毒化病原体中にヘリコバクター菌の発現遺伝子ライブラリーを供給し、そして；ｂ）哺乳動物宿主にヘリコバクター菌感染に対する防御免疫を付与する能力について該遺伝子ライブラリーのクローンをスクリーニングする。好ましくは、この同定方法は全てのヘリコバクター菌抗原の安定な発現を可能とする相変異性発現系を用いて実施される。次に、マウス等の試験動物の経口免疫感作のための「プール」として組換えクローンを利用することができる。次に、ヘリコバクター菌（例えば、マウスに適合させたヘリコバクター・ピロリ株）を用いたチャレンジ感染によって防御抗原としてのこれらのクローンの可能性を確認する。したがって、最適化ヘリコバクター・ピロリワクチン抗原を直接選択する可能性があるのである。下記の図および配列表によって本発明をさらに説明する。図１：ウレアーゼ発現ベクターpYZ97の図式的説明を示す。ウレアーゼサブユニットUreAおよびUreBをコードする遺伝子は、Ｔ７プロモーターφ10の転写制御下にある。Ｔ７プロモーターとウレアーゼ遺伝子の間にリボソーム結合部位(RBS)がある。さらに、このプラスミドは複製起点(ori)、β ラクタマーゼ耐性遺伝子(bla)、および4個のＴ７ターミネーターを連続して示している。 T7プロモーターによる発現とは別に、プラスミドpYZ97上の隠れた(cr yptic)プロモーター（これはＴ７プロモーターの上流に位置する）によってウレアーゼＡおよびＢサブユニットの構成的な低レベルの発現ももたらされ得る。図２：プラスミドpYZ97上のウレアーゼ発現のための転写調節領域のヌクレオチド配列、およびウレアーゼサブユニットＡのアミノ酸配列の開始部分を示す。図３：細菌の染色体中に組み込むことができるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ(T7RNA P)発現カセットpYZ88、pYZ84およびpYZ114の図式的説明を示す。高発現カセットpYZ88においては、ラムダＰＬプロモーターがT7RNAP遺伝子の上流に、逆向きに位置している。温度感受性リプレッサーcI 857の遺伝子(cI)がこのプロモーターの制御下にある。バクテリオファージfd のターミネーター(fdT)はcI遺伝子の上流に位置している。gin遺伝子 (Mertens，EMBO J．3(1984)，2415-2421)はＤＮＡ再編成機構の制御酵素をコードしている。ｔＲＮＡ ArgをコードするＤＮＡ配列がgin遺伝子の下流に位置している。相Ａにおいて、T7RNAP遺伝子の発現に関与するＰＬプロモーターはcI857 遺伝子およびgin遺伝子の方向に向いている。この結果、28℃という許容温度において活性なリプレッサーが形成され、ＰＬプロモーターからの転写を減少させる。より高温ではＰＬプロモーターの転写は増大する。なぜなら、そのような外部作用のもとではこのリプレッサーは少なくとも部分的に不活性化されるからである。転写におけるこの温度依存性増大は、次のgin遺伝子の発現においても対応する増大を引き起こす。この遺伝子は制御酵素としてＰＬプロモーターの逆位および相Ｂ（ここでT 7RNAP遺伝子が発現される）への推移を触媒する。高発現系pYZ88においては、もう１つのfdT転写ターミネーターがカナマイシン耐性遺伝子(km)とこの遺伝子のプロモーターの間に位置している。これによって通常T7RNAP発現の低下に寄与するアンチセンスＲＮＡ（T7R NAP遺伝子と逆方向を向いている）の合成が低下する。これはT7RNAPの高発現をもたらす。中程度発現系pYZ84においては、転写ターミネーター(fdT)はＰＬプロモーターとT7RNAP遺伝子開始点の間に位置している。これによってT7RNAP ｍＲＮＡの発現が低下する。さらに、アンチセンスＲＮＡがT7RNAPの翻訳に影響する。それゆえ、中程度の発現しか起こらない。低発現系pYZ114には、ＰＬにおける100bpの欠失がさらに導入されている（△ＰＬ）。これによってＰＬプロモーターの活性が大幅に低下し、これはT7RNAPの発現を一層低下させ、その結果UreA/B遺伝子発現の低下がもたらされる。この構築物においては、pYZ97上の隠れたプロモーターの効果がすでに観察されている。図４：ワクチン接種したマウス腸液中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体のELISA の結果を示す。図５：ワクチン接種したマウス血清中の抗ヘリコバクター・ピロリ抗体のELISA の結果を示す。図６：ヘリコバクター・ピロリチャレンジ後のワクチン接種マウス胃組織中のウレアーゼ活性を示す。配列番号１および２は、ヘリコバクター・ピロリのアドヘシン遺伝子AlpBのヌクレオチド配列およびそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を示す。配列番号３および４は、ヘリコバクター・ピロリのアドヘシン遺伝子AlpAのヌタレオチド配列およびそれによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を示す。配列番号５および６は、プラスミドpYZ97上のウレアーゼ発現のための転写調節領域のヌクレオチド配列およびウレアーゼサブユニットＡのアミノ酸配列の開始部分を示す。実験の部実施例1 ureA 遺伝子およびureB遺伝子のクローニング University of Amsterdamで単離されJos van Putten博士より提供して戴いた臨床試料Pl(以前の69A)の染色体ＤＮＡから、ウレアーゼをコードする構造遺伝子(ureAおよびureB)の遺伝子クローニングを行った。増幅用のプライマー対YZ01 9(5'-GGAATTCCATATGAAACTGACTCCCAAAGAG-3')およびRH132(5'-CTGACGTCGACTAGAAA ATGCTAAAGAG-3')を用いてPCR手法により遺伝子を単離した。プライマーの配列は、GenBank(受託番号M60398、X57132)から推定した。プライマーYZ019のＤＮＡ配列は、公表済み配列のヌクレオチド2659〜2679を包含し、更に、翻訳調節配列( 下流ボックス；Sprengart，M．L．et al.，1990，Nuc．Acid．Rcs．18:1719-172 3)およびNdeIに対する切断部位を含有していた。プライマーRH132のＤＮＡ配列は、公表済み配列のヌクレオチド5071〜5088およびSalIに対する切断部位を包含していた。増幅産物はサイズが2.4kbpであり、ureA遺伝子およびureB遺伝子の全コーディング領域を含有するものであったが、Helicobacter染色体由来のもとの転写開始および終結配列は含まれていなかった。NdeIおよびSalIを用いて精製PC R断片を消化し、T7発現プラスミドpYZ57の対応するクローニング部位に挿入し、プラスミドpYZ97を得た。 pYZ57は、元はプラスミドpT7-7より誘導したものであり、Taborに記載されている(1990，Current protocols in Molecular Biology，16.2.1-16.2.11，Geene Publishing and Wiley-Interscience，New York)。次の手法によりpT7-7のバックボーンの異なる部位に2つのターミネーター断片を導入した。（1）縦列T7ターミネーター：pEP12から2.2kbpEcoRI/HindIII断片を切り出し(Br unschwig & Darzins，1992，Gene，111:35-41)、この精製断片を、予め消化させておいたpBAに連結させた(Mauer，J．et al.，1997，J．Bacteriol．179:794-80 4)。HindIIIおよびClaIを用いて連結産物を消化した。続いて、得られた2.2kbp EcoRI/ClaI断片を、予め消化させておいたpT7-7中に挿入した。（2）T1ターミネーター：プラスミドpDS3EcoRV(ハイデルベルクZMBHのH．Bujard 博士より提供して戴いた)から230bp HpaI/NdeI断片を切り出した。次に、この断片をKlenowで更に処理して平滑末端を得た。予めBglIIで消化され、続いてK lenow処理により平滑末端化された上記のpT7-7誘導体中に、精製rrnBT1断片を挿入した。図1は、S．typhimurium中におけるウレアーゼサブユニットUreAおよびU reBをコードするウレアーゼ遺伝子の発現に使用される完成されたベクターpYZ97 を示している。図1に示されているように、ウレアーゼ遺伝子は、T7プロモーターφ10により調節可能である。リボソーム結合部位(RBS)は、T7プロモーターとウレアーゼ遺伝子との間に位置する。更に、プラスミドには、複製起点(ori)およびβ-ラクタマーゼ抵抗性遺伝子(bla)が配置されている。 T7プロモーターにより調節される発現のほかに、ウレアーゼAおよびBサブユニットの中レベルの構成的発現がSalmonella RNAポリメラーゼにより駆動されるプロモーターから起こる。このプロモーターは、プラスミドpYZ97上においてT7プロモーターの上流に位置する。詳細な分子分析を行うために、pYZ97の精製されたBglII/HindIII断片をpCR-Script^TMSK(+)キット(Stratagene)中にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定処理にかけた。配列データから、種々のエレメント：すなわち、ureA遺伝子の一部分、下流ボックス、RBS、T7プロモーター、およびT1 ターミネーター(rrnBT1)が完全な形で確認された(図2ならびに配列番号5および6 を参照されたい)。また、配列分析から、T1ターミネーター領域とSalmonella RN Aポリメラーゼプロモーターが局在しているT7プロモーター領域との間の領域が判明した。配列データは、この構成プロモーターが構造予測から推定されたヌクレオチド222〜245(Lisser & Margalit，1993，Nuc．Acid．Res．21:1507-1516) の間に位置することを示している。実施例2 生ワクチン投与による免疫学的防御材料および方法細菌株：組換えH．pyloriウレアーゼプラスミド構築物のための受容株としてS ．typhimurium SL3261生ベクターワクチン株を使用した。S．typhimurium SL326 1は、S．typhimurium SL1344野生型株から誘導されたaroAトランスポゾン突然変異体である。S．typhimurium SL3261は、経口投与後において野生型S．typhimur iumによる感染に対してマウスを防御する非感染性株である(Hoiseth and Stockc r （1981）Supra)。S．typhimurium SL3261およびその誘導体を表1に示す。誘導体にはそれぞれ、ウレアーゼ発現プラスミドpYZ97(染色体外)とT7RNAP発現カセットpYZ88、pYZ84、またはpYZ144(染色体中に組み込まれている)とが含まれている。Luriaブロスまたは寒天を用いて28℃で細菌を増殖させた。血清プレート上において37℃で増殖させたH．pylori野生型株をチャレンジ実験用として使用した。マウスの免疫感作：Interfauna(独国Tuttlingen)から購入した4週齢Balb/cマウスを動物施設中で2週間順応させてから実験に使用した。すべてのマウスの眼窩後から150μlの血液を採取して免疫する前の血清を得た。免疫感作の1週間後および3週間後、免疫されたすべてのマウスの眼窩後から採血した。本研究では対照を含む8つのグループで５匹ずつマウスを使用した(表2)。未処理の対照グループであるグループAについては、サルモネラで免疫もしなければ野生型H．pyloriでチャレンジもしなかった。残りのグループはいずれも経口免疫を行った。陰性の対照グループであるグループBについては、サルモネラは投与しなかったがH．pyloriによるチャレンジは行った。グループC〜Gに属するマウスについては、サルモネラワクチン株で免疫し、H．pyloriでチャレンジした。最後のグループHについては、コレラ毒素と組合せて組換えウレアーゼBを投与し、チャレンジも行った。免疫感作を行う前の一晩は固形飼料を与えずに放置し、4時間は水も与えなかった。ステンレス鋼カテーテル管を用いて100μlの3％重炭酸ナトリウムを経口投与し、胃のpHを中和した。次に、グループBに属するマウスに100μlのPBSを投与し、グループC〜Gに属するマウスに、1.0×10¹⁰CFUのサルモネラを含有する体積100μlの液を投与した。グループHに属するマウスには、組換えH．pyloriウレアーゼBとコレラ毒素の混合物100μlを週に一度４回投与した。各免疫感作を行った後、マウスへの水および飼料の提供を再開した。 H．pyloriチャレンジ：最初の経口免疫の4週間後、グループB〜Hに属するマウスをH．pyloriでチャレンジした。固形飼料を与えずに一晩放置し、チャレンジを行う前の4時間は水を与えなかった。ステンレス鋼カテーテル管を用いて100μ lの3％重炭酸ナトリウムをマウスに経口投与し、続いて、5.0×10⁹CFU/mlのヘリコバクターピロリを経口投与した。チャレンジ後、マウスへの水および飼料の提供を再開した。マウスからの血液および組織の回収：最初の免疫感作の12週間後、飼料を与えずにマウスを一晩放置し、続いて、防御および免疫応答の分析を行うために屠殺した。メトキシフルオランでマウスを麻酔して末期心臓からの採血を行った後で頸部脱臼により屠殺した。無菌状態で注意深く各マウスから脾臓および胃を取り出し、後続の処理を行うまでは別々の無菌容器中の氷上に置いた。更に腸液を単離するために大腸および小腸を取り出した。胃の処理およびウレアーゼ活性の測定：マウス胃中のH．pyloriの定着の度合いは、組織中の活性ウレアーゼの有無により測定した。Jatrox試験(独国Weiters tadt せてPBSで洗浄し、直ちに、胃の洞部分の半分を、ウレアーゼ活性測定用の基質の入ったエッペンドルフ管中に配置した。管を室温で4時間インキュベートした後、550nmにおける吸光度を測定した。胃組織の残りの部分は後続の処理のために-20℃で保存した。免疫感作もチャレンジも行っていない未処理のマウスの胃から得られたウレアーゼ活性値を使用して、H．pylori感染がないこと、従って防御が行われないことを示すベースラインを作成した。結果：対照のマウス(グループBおよびC)では、H．pyloriによる100％の感染が観測された。組換え弱毒化病原体(グループD、E、F、およびG)で免疫されたマウスでは、0％〜60％の感染(100％〜40％の防御)が観測された。免疫防御が体液性抗UreA およびUreB応答と相関しなかったことは、体液性免疫のほかに細胞性免疫もH．p ylori感染を防御するうえで極めて重要であることを示唆するものである。これらの結果は、S．typhimurium弱毒化株により送達されるUrcAおよびUreBを用いてマウスに経口免疫を行うことがH．pyloriの定着に対して高レベルの防御を誘発するのに有効であることを示している。組換えウレアーゼBとコレラ毒素とで免疫されたマウスでは、本発明に係る組換え弱毒化病原体を投与した場合よりも本実験条件下においてかなり高レベルのウレアーゼ活性が観測された。ウレアーゼ試験の結果は表3に示した。実施例3 urcA/urcB サブユニットを発現する種々の組換えS．typhimurium株の構成および分子分析免疫化実験のために使用したS．typhimurium株についての説明 S．typhimurium SL3261(pYZ97)(構築物A)：S．typhimurium SL3261生ワクチンベクター株は、組換えウレアーゼプラスミド構築物pYZ97用の受容株として使用した。 S．typhimurium SL3261::YZ系(pYZ97)(構築物B)：これらのキャリヤー株は、図3に略図で示されているT7 ＲＮＡポリメラーゼ(T7RNAP)発現カセットを備えた S．typhimurium SL3261の誘導体である。この発現カセットは、先のYanらの発明に開示されているように2相方式(オン／オフ)で発現されるT7RNAPに対する遺伝子をコードする。（「ハイブリッド生ワクチン中における外来抗原の産生および提示のための2相系」、PCT/EP91/02478）カセットは細菌の染色体中に一体化することが可能であり、pYZ97のようなT7RNAP依存性発現プラスミドを活性化するための最適量のT7RNAPを有するオン位置の細胞を提供する。 YZ84カセットの基本は、ファージMuインベルターゼGinにより反転される断片上に配置された反転可能なλPLプロモーターにある(Yan & Meyer，1996，J．Bio technol．44:197-201)。PLプロモーターの向きに依存して、gin遺伝子(オフ位置 )またはT7RNAP遺伝子(オン位置)のいずれかが発現される。次の調節エレメントをYZ84中に組み込んだ。（1）28℃でPLプロモーターを抑制し37℃で解離する温度感受性cI_tsλリプレッサー(cI)。（2）ファージfdターミネーター(fdT)は、反転可能な断片上のPLプロモーターの適度な反転速度を得るためにgin遺伝子の発現を低減させる。 2相発現系により、ウレアーゼサブユニットAおよびBのような外来抗原の高い発現率が得られる。外来抗原の発現率が高いとSalmonellaキャリヤーの生存度が低下するため、免疫応答が減少し、結果として防御能力が低下することは周知である。2相系は、大量の外来抗原を発現する組換えSalmonellaの生存性を改良する自然な能力を有する。構築物Bでは、ureAおよびureB遺伝子の発現は、主に、強いT7プロモーターの制御下にあり、結果としてウレアーゼサブユニットが多く産生される。T7RNAP発現カセットがオフ位置にあり、かつT7RNAPが存在しない場合、ureAおよびureB遺伝子は、Salmonellaプロモーターにより適度なレンジで構成的に発現される。免疫化実験のために使用した種々のS．typhimurium株により産生されたureA/ure Bサブユニットの分析最初に、Salmonella構築物AおよびBをSDS-ポリアクリルアミドゲルにより分析してUrcAおよびUreBの発現について調べた。100μg/mlアンピシリンが補足された液体Luriaブロス中において37℃で最初に一晩培養を行って組換え株を増殖させた。対数増殖期に遠心分離により細菌を回収し、細胞ペレットを10mMトリスHC lおよび10mM EDTA(pH8.0)中に再び懸濁させ、すべてのプローブ中でA₅₉₀=1.0に標準化すべく細胞密度を調節した。細菌懸濁液を同体積のSDS-サンプル緩衝液(S ambrook，J．et al．1989．Molecular cloning:a laboratory manual．2^nded．C old Spring Harbor Laboratory Prcss，Cold Spring Harbor，N.Y.)と混合し、5 分間煮沸した。20μlの懸濁液を2つのSDS-10％ポリアクリルアミドゲル上に充填し、一方はCoomassie青色染色剤で染色し、他方は、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットし、更に、免疫ブロットを行うための処理を施した。移動されたタンパク質を有するニトロセルロース膜を、10(v/w)％脱脂乳を含有するトリス緩衝塩類溶液(TBS)(トリスHCl 100mM、NaCl 150mM、pH7.2)中において室温で4 5分間ブロックした。TBS-0.05(v/v)％ Tween-20で3回洗浄した後、ウサギ抗UrcB 抗体(AK201)を5(w/v)％脱脂乳-TBSで1:2000倍に希釈してストリップに添加し、4 ℃で一晩インキュベートした。アフィニティークロマトグラフィーにより精製された組換えウレアーゼBサブユニットで免疫されたウサギから血清を得た。0.05( v/v)％Tween-20を含有するPBSで10分間かけて膜を3回洗浄し、更に、ヤギ抗ウサギIgG抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートを含有する5(w/v )％脱脂乳-TBS中において室温で45分間インキュベートした。上述したように0.2 (v/v)％Tween-20で3回洗浄した後、ECLキット(独国Amersham)を供給業者の勧告に従って使用して膜を顕色させた。構築物A：構築物A(S.typhimurium SL3261株(pYZ97))の全細胞溶解物のCoomass ie染色ゲル中に67kDaおよび30kDaのタンパク質が観測されたが、これらのサイズはそれぞれ、UrcBおよびUreAのサイズと非常に良い相関を有している。このようなタンパク質は、S．typhimurium SL3261株を含有する対照レーン中には存在しなかった。ウサギ抗UreB抗体を用いて同じタンパク質サンプルを免疫ブロット分析したところ、Coomassie染色ゲル中に観測された67kDaタンパク質がUreBであることが確認された。37℃においてそれぞれ2、6、および11時間のインキュベーションを行うことにより、様々な増殖期においてS．typhimurium株SL3261(pYZ97 )由来のureBの発現を調べた。静止期を含めてすべての増殖期においてureBの発現が観測されたが、初期の増殖期においてより高い発現が観測された。株SL3261 (pYZ97)を用いて得られた結果は、UreAおよびUrcBタンパク質がSalmonellaに対して毒性がなく、細菌の任意の増殖期において37℃で発現できることを示している。構築物B：構築物Bを用いて類似の分析を行った。SDS-PAGE分析において両方の構築物の比較を行うことにより、構築物AがureAおよびureBの中程度の発現を呈するのに対して、構築物Bはより効率的な生産体(producer)であることが分かる。構築物Bの細菌増殖の過程で、ureAおよびureBの発現は、抗生物質の選択を行わない場合でさえもより長期間にわたり一定して高い。このことから、構築物A と比較して構築物Bの例外的な産生能力が確認される。要約すると、我々の得たデータは、H．pylori由来のUreAおよびUrcBが、細菌に悪影響を及ぼすことなくS．typhimurium中で発現可能であること、従って、動物防御実験においてSalmonellaキャリヤーにより送達される場合に好適であることを示している。プラスミド安定性プラスミド安定性は、このようなプラスミド中にクローニングされた遺伝子によりコードされる抗原の安定な発現を確保するために不可欠である。 in vitroプラスミド安定性。プラスミドpYZ97上には存在するがプラスミドのないS．typhimurium SL3261株中には存在しないアンピシリン耐性マーカーをプラスミド安定性の指標として使用した。既に記載されているように、LB液体培地中において28℃で100世代までS．typhimurium株SL3261を増殖させた(Summers，D ．K.およびD．J．Sherrat．1984．Cell．36:1097-1103)。単純LB-寒天プレートおよび100μg/mlアンピシリンが補足されたLB-寒天プレート上に等しい数の細菌希釈物をプレーティングすることによって10世代ごとにSalmonellaのコロニー形成単位(CFU)の合計数からアンピシリン耐性CFUの数を決定した。 in vivoプラスミド安定性。5.0×10⁹CFUのS．typhimurium SL3261(pYZ97)でマウスを経口感染させた2日後および7日後に、マウス脾臓から得られる合計CFUおよびアンピシリン耐性CFUを調べることによってin vivoプラスミド安定性を分析した。感染2日後および7日後にメトキシフルオラン麻酔下でマウスを屠殺し、後続の処理のために無菌状態下で脾臓を摘出した。ペトリ皿中で脾臓を切開して細かい片にし、1mlの氷冷ddH₂Oと混合し、18ゲージニードルに数回通して脾臓細胞を懸濁させた。次に、100μg/mlアンピシリンを含有したLB-寒天プレートおよび含有していないLB-寒天プレート上に細胞懸濁液をプレーティングした。プレートを37℃で一晩インキュベートし、翌日、コロニー数をかぞえた。 5.0×10⁹CFUのS．typhimurium SL3261(pYZ97)の1回の経口投与によりマウスを感染させた後、in vivoプラスミド安定性を分析した。感染2日後および7日後に、マウス脾臓を採取し、LB-寒天プレート上にプレーティングし、合計CFUおよびアンピシリン耐性CFUを調べた。48時間後、2.0×10⁴アンピシリン耐性CFUが脾臓から単離された(表4)。免疫化の7日後、CFUカウントは56まで低下したが、この場合もすべてがアンピシリン耐性であった。これらのデータは、プラスミドpYZ9 7がin vitroおよびin vivoの条件下においてSalmonella中で安定であり、H．pyl oriによるマウス胃定着に対する防御抗原としてウレアーゼサブユニットを評価するために好適であることを示している。感染7日後のSalmonella株SL3261の回収率が低いことから、この株が弱毒化されており、ウレアーゼをマウスに送達するために安全に利用できることが確認される。 ^a5.0×10⁹CFUのS．typhimurium株SL3261(pYZ97)をマウスに経口接種した2日後および7日後に、抗生物質を含まないLBプレート上で単離されたマウス脾臓由来のS ．typhimuriumのCFUの数。^b マウス脾臓から単離されたCFUの合計数に対するアンピシリン耐性CFUのパーセント。 ^aウレアーゼ活性は平均値±標準偏差である。^b ストレプトマイシン耐性H.pylori株P76のCFUの決定は、200μg/mlのストレプトマイシンが補足された血清プレート上に胃洞部のセクションをプレーティングすることによって行った。H.pyloriは、コロニー形態、ウレアーゼ活性、および光学顕微鏡観察に基づいて識別した。値はCFU±標準誤差に対応する。^c H.pylori由来のureAおよびureBを発現するS．typhimurium SL3261(pYZ97)で免疫されたマウスであり、これについては材料および方法に説明されている。実施例４ H ．pyloriマウスモデルにおけるureA/ureBサブユニットを発現する種々の組換え S．typhimurium株を用いた防御実験実験に使用したHelicobacter pylori株についての説明 Haasらの発明(「Helicobacter pylori由来の分泌遺伝子を識別する方法」、PCT/ EP96/02544)に開示されているように、ウレアーゼ欠損H．pylori P11株は、TnMa x5ミニトランスポゾンを用いたトランスポゾンシャトル突然変異により発生させたP1の誘導体である。TnMax5のインサートをureA遺伝子の3’末端に配置し、ure AおよびureBの両方の遺伝子の転写カップリングに起因してこれらの遺伝子の欠損発現を生じるようにした。マウス適応H．pylori P49株は、もともとはJ．G．Fox博士(MIT，Boston，MA) によりネコ分離株から形成されたものであった。H．pylori P76株は、P．Nedens kov-Sorensen(1990，J．Infect．Dis．161:365-366)により報告されているように、ストレプトマイシン耐性H．pylori株NCTC11637由来の染色体ＤＮＡの相同的組換えを行うことによって発生させたP49のストレプトマイシン耐性誘導体である。 H．pylori株はいずれも、必要に応じて200μg/mlのストレプトマイシンが補足された血清プレート(Odenbreit，S．et al．1996．J．Bacteriol．178:6960-696 7)上において、微好気性雰囲気下(5%O₂、85%N₂、および10%CO₂)、37℃で増殖させた。マウスを用いた予防的免疫化実験 Salmonellaにより送達されるUreAおよびBがH．pyloriによる胃定着からマウスを守る能力を試験するために、免疫化実験を行った。合計して５つの独立した免疫化実験を行った。各実験はそれぞれ、５匹のマウスを含む５つのグループから成っていた。これらのグループは次の通りである。（１）未処理の対照グループは、Salmonellaで免疫されていおらず、しかも野生型H．pylori P49もしくはストレプトマイシン耐性誘導体株P76でチャレンジされていないマウスであった。（２）PBS対照グループは、PBSを投与しH．pyloriによる経口的チャレンジを受けた非免疫化マウスであった。（３）Salmonella対照グループは、弱毒化S．typhimurium SL3261株単独で免役され、H．pyloriによりチャレンジされたマウスであった。（５）ワクチングループは、UreAおよびUreBを発現する適切な組換えS．typhimurium構築物(A+B)で免疫され、H．pyloriによりチャレンジされたマウスであった。免疫化を行う前、固形飼料を与えずにマウスを一晩放置し、４時間は水も与えなかった。ステンレス鋼カテーテル管を用いて100μｌの3%重炭酸ナトリウムを経口投与し、胃のpHを中和した。胃を中和した直後、PBS対照グループに属するマウスに100μｌのPBSを投与し、Salmonella対照グループおよびSalmonellaワクチングループに属するマウスにそれぞれ、5.0×10⁹CFUのS．typhimurium株SL326 1および種々の組換え構築物を100μｌの合計体積で投与した。免疫化を行った後、マウスへの水および飼料の提供を再開した。経口免疫化の４週間後、PBS対照グループ、Salmonella対照グループ、およびワクチングループに属するマウスを、1×10⁹CFUのH．pyloriによりチャレンジした。チャレンジを行う前、固形飼料を与えずにマウスを一晩放置し、４時間は水も与えなかった。ステンレス鋼カテーテル管を用いて100μｌの3%重炭酸ナトリウムを経口投与し、続いて、1×10⁹CFU/mlのH．pylori株P49またはP76を経口投与した。チャレンジを行った後、マウスへの水および飼料の提供を再開した。実施例５ H．pyloriマウスモデルにおけるureA/ureBサブユニットを発現する種々の組換え S．typhimurium株を用いた防御実験の免疫学的分析血清学的分析を行うためのマウスからの血液および腸液の回収血清および腸液を用いてすべてのマウスからの抗体応答を評価した。免疫化を行う前および免疫化の３週間後、更にHelicobacter感染の前に、150μｌの血液を眼後窩から回収した。最終の採血は、Salmonella免疫化の11週間後(チャレンジ感染の６週間後)に、メトキシフルオラン麻酔の状態で末端の心臓穿刺によって行った。実験の最後にマウスから小腸を取り出して、先の説明に多少の変更を加えて処理した(Elson，C．O．et al 1984．J．Immunol． Meth．67:101-108)。簡単に述べると、0.1mg/mlの大豆トリプシンインヒビター( Sigma)を含有するpH7.5の50mM EDTA(Riedel)2mlを通過させることにより、腸の内容物を除去した。0.15M NaClを用いて体積を5mlに調節した。サンプルを激しく攪拌し、2,500rpmで10分間遠心処理し(独国Heraeus)、50μｌの100mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)(Serva)を含有する95%エタノールで上清を補足し、続いて、4℃において13,000rpmで20分間遠心処理した(Hermes)。50μｌの 100mM PMSFおよび50μｌの2%アジ化ナトリウム(Merck)で上清を補足し、氷上に1 5分間置いた後で250μｌの7%ウシ血清アルブミン(Biomol)を添加した。後で使用するまで-20℃でサンプルを凍結させた。 ELISAによるマウス血清および腸粘膜中の抗ウレアーゼ抗体の分析 Salmonellaを用いて経口免疫化を行うとIgA抗体応答が誘発されることは周知である。S．typhimurium構築物A+Bで免疫されたマウス中および対照マウス中におけるウレアーゼサブユニットに対するIgA応答をELISAにより評価した。超音波処理装置(Branson，Danbury，Conn.)を用いて45秒間にわたり５秒間隔(35%パルス)で５回超音波処理することによって、H．pylori P1およびそのウレアーゼ欠損突然変異体の誘導体株P11の可溶性抽出物をリン酸緩衝塩類溶液として調製した。この懸濁液を4℃において13,000rpmで10分間遠心処理し(独国Heraeus)、完全な状態の細胞を除去した。BioRadキットを用いてタンパク質含有量を測定した後、上清を抗原として使用した。50μｇ/mlの抗原を含有するpH9.6の炭酸ナトリウム-重炭酸塩緩衝液の50μｌアリコートで96ウェルマイクロタイタープレート( 独国Nunc)を被覆し、4℃で一晩インキュベートした。1.0(w/v)%脱脂乳を含有するトリス緩衝塩類溶液(TBS)中においてウエルを室温で45分間ブロックし、TBS-0 .05% Tween-20で３回洗浄した。アッセイは三つ組で行い、血清または消化管洗浄液を使用して、0.5(w/v)%脱脂乳-TBS中、それぞれ1:100または1:2で希釈した液50μｌをウエルに添加し、4℃で一晩放置した。次に、TBS-0.05% Tween-20でウェルを３回洗浄し、ヤギ抗マウスIgA西洋わさびぺルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma)の1:3000希釈液をすべてのウェルに添加し、4℃で一晩放置した。オルトフェニレンジアミン基質を含有する酢酸ナトリウム緩衝液および過酸化水素を用いて、37℃で30分インキュベートすることにより着色反応を進行させた。10N H₂SO₄を用いて反応を停止させ、ELISAリーダー(Digiscan，Asys Hitech GmbH，オーストリア)でA₄₉₂を測定した。粘膜抗体：(構築物A)実験終了時(H．pyloriチャレンジの６週間後)、各屠殺マウスから腸液を採取し、H．pylori野生型(P1)およびウレアーゼ欠損突然変異株( P11)の全細胞抽出物を使用して抗ウレアーゼ抗体が存在するかを試験した。図４に示されているように、野生型H．pylori抽出物に対するIgA抗体応答は、非免疫化マウスまたは未処理マウスに対して免疫化マウスの方が10倍高かった。ウレアーゼ欠損のH．pylori突然変異体に対する粘膜IgA抗体応答は、いずれのグループのマウスでも非常に低かったが、このことは、免疫されたマウス中の腸IgA抗体応答のほとんどがウレアーゼに対するものであることを示している。血清抗体：(構築物A)免疫化前、免疫化の３週間後(チャレンジ前)、および免疫化の10週間後(H．pyloriチャレンジの６週間後)に、野生型およびウレアーゼ欠損H．pyloriに対する血清IgA抗体のレベルを調べた。図５のパネルAに示されているように、ウレアーゼ発現S．typhimurium構築物Aで免疫されたマウスにおける抗野生型H．pylori抗体のレベルは、免疫化前の血清と比べて、免疫化の３週間後では約20倍高く、10週間後では34倍高かった。ウレアーゼ欠損H．pylori 株に対する血清IgA抗体応答は、３週間後および10週間後において、Salmonella 構築物Aで免疫したマウスを含むすべてのグループのマウスでも低かったが(図５のパネルB)、このことは、免疫化マウス中のIgA抗体応答のほとんどがウレアーゼサブユニットに対して指揮されるものであることを示している。野生型H．pyl oriに対する低い血清抗体応答は、免疫されていないマウスでも10週で観測されたが、このことは、３週間早くH．pyloriチャレンジをしてもこれらのマウスで特異的抗体応答を誘発するのに十分であることを示している。S．typhimurium S L3261で３週間免疫されたマウス(Salmonella対照グループ)では、野生型H．pylo riに対するIgA応答は中程度の増加を示したが、このことは、H．pyloriに対して交差反応抗体を誘導することのできる抗原がSalmonella中に存在することから説明可能である。これとは対照的に、免疫されたマウスにおいてウレアーゼ欠損H．pyl ori株に対する抗体応答は、免疫されていないマウスの抗体応答と同程度に低い( 図５のパネルB)。この結果は、免疫されたマウス中で観測される抗体応答のほとんどがウレアーゼに対するものであることを示している。PBS投与のマウスまたはS．typhimurium SL3261で免疫されたマウスから10週間に採取された血清では、ウレアーゼ陰性突然変異体に対して低い抗体応答が観測されたが、このことは、観測された抗体応答が、チャレンジの間３週間早くこれらのマウスに与えられたH．pylori抗原に対する特異的免疫応答に基づくものであることを示している。ウレアーゼを発現するSalmonellaまたは発現しないSalmonellaで免疫されたマウスでは３週間後にウレアーゼ欠損H．pylori株に対して低い抗体応答が観測されたが、PBSの投与されたマウスでは応答は見られなかった。これにより、それぞれSalmonellaおよびH．pylori由来のタンパク質の間の交差反応エピトープが存在することが確認される。(構築物B)：構築物Bで免疫されたマウスの血清学的分析でも類似の結果が得られたが、このことは、組換えSalmonellaによる抗原の産生を高めても抗体応答の顕著な増大は得られないことを意味する。免疫ブロッティングによるマウス血清中の抗ウレアーゼ抗体の分析 H．pyloriに対するマウス特異的免疫応答の誘発に必要なS．typhimurium由来のUreAおよびUreBの発現を分析した。Salmonella構築物Aで免疫されたマウスおよび対照マウスの血清中の抗UreA抗体および抗UreB抗体を調べることによって、 UreAおよびUreBのin vivo発現の確認を行った。野生型H．pylori株P1からH．pyl ori全細胞抗原を調製した。３つの血清プレートから細菌を回収し、PBS中に再び懸濁し、5,000gで10分間遠心処理を行って回収した。細胞ペレットを10mMトリス -HClおよび10mM EDTA(pH8.0)中に再び懸濁させ、すべてのプローブ中でA₅₉₀=1.0 に標準化すべく細胞密度を調節した。細菌懸濁液を同体積のSDS-サンプル緩衝液 (Sambrook，1989)と混合し、５分間煮沸した。20μｌのペレットをSDS-10%ポリアクリルアミドゲル上に充填した。タンパク質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロットし、ストリップに裁断し、10(v/w)%脱脂乳を含有するトリス緩衝塩類溶液(TBS)(トリスHCl 100mM、NaCl 150nm、pH7.2)中において室温で45分間ブロックした。TBS-0.05(v/ v)% Tween-20で３回洗浄した後、マウス血清を5(w/v)%脱脂乳-TBSで1:80に希釈してストリップに添加し、4℃で一晩インキュベートした。免疫されていないマウスおよびSalmonellaで免疫されたマウスから血清を得た。３回洗浄した後、ヤギ抗マウスIgG西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート(Sigma)を5(w/v)%脱脂乳-TBSで1:3000に希釈した液と共にストリップをインキュベートした。ECL化学発光検出キット(独国Amersham)を供給業者の説明書に従って使用してブロットを発光させた。免疫化の３週間後でH．pyloriのチャレンジ前に、免疫されたマウスおよび免疫されていないマウスから血清を採取し、UreAおよびUreBを発現する野生型H．p yloriP1株の全細胞溶解物に対して試験を行った。それぞれUreBおよびUreAに対応する67kDaおよび30kDaのサイズのタンパク質が、構築物Aを用いて免疫された免疫化マウスから得られた血清で認識された。免疫されていないマウスまたはSa lmonellaだけで免疫されたマウスから得られた血清を用いて試験したストリップでは、これらのバンドは観測されなかった。このことは、Salmonellaワクチン株により発現されたウレアーゼは、野生型H．pylori株のUreAおよびUreBの両方に対して特異的な抗体応答を誘発することができることを示している。構築物Bに関しても同様な結果が得られた。実施例６ H ．pyloriマウスモデルにおいてureA/ureBサブユニットを発現する種々の組換え S．typhimurium株を用いて前処理されたマウス中でのH．pylori定着の測定胃の処理およびウレアーゼ活性の測定ウレアーゼ試験：H．pyloriによる胃定着に対する防御の分析を、マウス胃の洞部分におけるウレアーゼ活性を試験することによって実施した。ウレアーゼ活性の測定は非常に信頼性が高く、感度が良く、しかも、H．pylori感染の存在を試験する特異的な方法であり(消化性潰瘍疾患におけるH．pyloriに関連したNIH の同意の得られた進歩．1994．消化性潰瘍疾患におけるH．pyl ori．JAMA．272:65)、更に、臨床面(Kawanishi，M．，S．et al 1995．J．Gastr oenterol．30:16-20;Kamija，S．et al 1993．Eur．J．Epidemiol．9:450-452;C onti-Nibali，S．et al 1990．Am．J．Gastroenterol．85:1573-1757)および動物研究(Gottfried，M．R．et al 1990．Am．J．Gastroenterol．85:813-818)において慣例的に使用されている。Jatrox試験(独国Weiters aで免疫化を行った11週間後、マウスを屠殺し、無菌状態で注意深く胃を摘出した。無菌容器の氷冷PBS中に胃を配置し、無菌ブレードを用いて多少湾曲した線に沿って切開することにより粘膜を露呈させた。PBSを用いて胃を洗浄することにより食物の残りを除去し、更に、体の領域から洞領域を単離すべく解剖を行った。直ちに、胃の洞部分の半分を、Jatrox試験からのウレアーゼ基質500μｌの入ったエッペンドルフ管の内部に配置した。胃のサンプルを室温で４時間インキュベートし、550nmにおける吸光度(A₅₅₀)を測定した。免疫化もチャレンジも行わなかった未処理のマウスの胃から得られたウレアーゼ活性の値を使用してベースラインを求めた。ベースラインは、試験した５匹の未処理のマウスの胃から得られたウレアーゼ活性値の平均にこの平均の標準偏差の２倍を加えたものに対応させた。ベースラインよりも高いウレアーゼ活性値の場合はH．pylori定着が陽性であると考え、ベースラインより低い値の場合はH．pylori定着が陰性であると考えた。培養実験：ストレプトマイシン耐性H．pylori株P76でチャレンジしたマウスから得られた胃の洞領域の左側部分を、200μg/mlのストレプトマイシンが補足された血清プレート上にプレーティングし、標準条件下でインキュベートした。インキュベーションの３日後、コロニーの形態、顕微鏡的観察、およびウレアーゼ活性に基づいて、細菌がH．pyloriであることを確認した。プレート上で増殖したH．pyloriのコロニー形成単位(CFU)の数は、各マウスの胃のサンプルごとに求めた。ウレアーゼ試験(構築物A対B):約5.0×10⁹CFUのSalmonellaで免役し、1.0×10⁹ CFUのH．pylori株P49でチャレンジされたマウス、ならびに対照のマウスを麻酔状態で屠殺し、胃の洞領域の切片を採取してウレアーゼ活性を測定した。図６に示されているように、Salmonella構築物Aにより送達されるUreA およびBで免疫されたマウスの100%がベースラインより低いウレアーゼ活性を示したが、このことはH．pylori定着がないことを示している。これとは対照的に、免疫されていないマウスおよびS．typhimurium株SL3261単独で免疫されたマウスの100%がベースラインよりかなり高いウレアーゼ活性測定値を示したが、このことはH．pyloriによる胃定着があることを示している。免疫化もチャレンジも行われなかった未処理のマウスグループは、ウレアーゼ活性のベースラインを設定するために使用した。構築物B系のSalmonellaはベースラインを超えるウレアーゼ活性を有したが、これはH．pyloriチャレンジ株による胃定着があることを示している。しかしながら、このグループのウレアーゼ活性は対照の場合よりも低く、従って、Salmon ella構築物B系で免疫されたマウスが部分的な防御状態にあることが示唆される( 図6)。Salmonella構築物AおよびBはいずれも、類似した抗体応答を媒介するが、ただし、ureAおよびureBの発現は異なる。このことから、発現されたウレアーゼ抗原の量が最適防御を得るのに適していると結論される。構築物A：H．pyloriによる胃定着とウレアーゼ活性とを相関付けるために、マウスをSalmonella構築物Aで経口免疫化し、かつストレプトマイシン耐性H．pylo riP76株でチャレンジすることにより、新しい防御実験を行った。ウレアーゼ活性値は、確認されたH．pyloriのCFUの数と相関があった。ウレアーゼ発現Salmon ellaで免疫された５匹のマウスのうちの２匹についてはH．pylori CFUが検出されず、免疫された５匹のマウスのCFUの平均数はわずか62であった。これとは対照的に、免疫されなかったマウスのCFUの数は2,737であり、これは44倍高い定着性に対応する。これらのデータから、ウレアーゼ発現Salmonellaで免疫されたマウスがマウスの胃におけるH．pylori定着をなくすかまたは顕著に低下させることが分かる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＦＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ツェングェクスイン，ヤンドイツ連邦共和国ディー―72076 タビンゲン，フィッチェンヴェッグ６ (72)発明者ゴメス―ドゥアルテ，オスカードイツ連邦共和国ディー―72076 タビンゲン，エドゥアード―スプランゲール― ストラーセ 34 (72)発明者ルーカス，ベルナデッテドイツ連邦共和国ディー―72076 タビンゲン，エドゥアード―スプランゲール― ストラーセ 26

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘリコバクター菌(Helicobacter)抗原をコードする少なくとも１つの異種核酸分子を含んでなる組換え弱毒化微生物病原体であって、標的細胞中で該核酸分子を発現することができる、または該核酸分子の発現を引き起こすことができる該病原体。２．腸内細菌細胞、特にサルモネラ菌(Salmonella)細胞である、請求項１に記載の病原体。３．サルモネラ・アロ(Salmonella aro)突然変異細胞である、請求項１または２に記載の病原体。４．ヘリコバクター菌抗原がウレアーゼ、ウレアーゼサブユニット、その免疫学的に反応性の断片、またはそのペプチドミモトープ(mimotope)である、請求項１から３のいずれかに記載の病原体。５．ヘリコバクター菌抗原がウレアーゼ、ヘリコバクター菌由来の分泌ポリペプチド、その免疫学的に反応性の断片、またはそのペプチドミモトープである、請求項１から３のいずれかに記載の病原体。６．ヘリコバクター菌抗原が抗原AlpA、AlpB、その免疫学的に反応性の断片、またはそのペプチドミモトープからなる群から選択される、請求項１から３および５のいずれかに記載の病原体。７．ヘリコバクター菌抗原をコードする該核酸分子が相変異的に(phase variabl y)に発現されうる、請求項１から６のいずれかに記載の病原体。８．ヘリコバクター菌抗原をコードする該核酸分子が、該病原体中で実質的に不活性であり、かつ該病原体中の核酸再編成(reorganization)機構によって引き起こされる核酸再編成によって活性化されうる発現シグナルの制御下にある、請求項７に記載の病原体。９．該発現シグナルがバクテリオファージプロモーターであり、そして該活性化が該病原体中における対応するバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの産生をもたらすＤＮＡ再編成によって引き起こされる、請求項８に記載の病原体。 10．免疫変調性(immunomodulatory)ポリペプチドをコードする少なくとも１つの第２核酸分子をさらに含む請求項１から９のいずれかに記載の病原体であって、該第２核酸分子を発現することができる該病原体。 11．請求項１から10のいずれかに記載の病原体を活性成分として含み、さらに場合により薬学上許容される希釈剤、担体およびアジュバントを含む、医薬組成物。 12．粘膜表面への投与、または非経口投与に適する生ワクチンである、請求項11 に記載の組成物。 13．薬学上有効量の請求項１から10のいずれかに記載の弱毒化病原体を薬学上許容される希釈剤、担体および／またはアジュバントと共に製剤化することを含む、生ワクチンの製造方法。請求項１に記載の方法。 14．請求項１から10のいずれかに記載の組換え弱毒化病原体の製造方法であって、下記の工程を含む該方法：ａ）ヘリコバクター菌抗原をコードする核酸分子を弱毒化病原体に挿入して、標的細胞中で該核酸分子を発現することができる、または該核酸分子の発現を引き起こすことができる組換え弱毒化病原体を獲得し；そしてｂ）適切な条件下で該組換え弱毒化病原体を培養する。 15．ヘリコバクター菌抗原をコードする該核酸分子を染色体外プラスミド上に位置させる、または染色体中に挿入する、請求項14に記載の方法。 16．哺乳動物宿主中に防御免疫応答を引き起こすヘリコバクター菌抗原を同定する方法であって、下記の工程を含む方法：ａ）弱毒化病原体中にヘリコバクター菌の発現遺伝子ライブラリーを供給し、そして；ｂ）哺乳動物宿主にヘリコバクター感染に対する防御免疫を付与する能力について該遺伝子ライブラリーのクローンをスクリーニングする。