DE4041045A1

DE4041045A1 - Zweiphasen-systeme fuer die produktion und praesentation von fremdantigen in hybriden lebendimpfstoffen

Info

Publication number: DE4041045A1
Application number: DE4041045A
Authority: DE
Inventors: Thomas Dipl Biol Dr Meyer; Johannes Dipl Biol Dr Pohlner; Frank U Dipl Biol Reuss; Zhengxin Yan
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1990-12-20
Filing date: 1990-12-20
Publication date: 1992-07-02
Also published as: EP0565548B1; US6255097B1; DE69119785D1; JPH06504434A; ES2087512T3; ATE138269T1; DK0565548T3; EP0565548A1; DE69119785T2; WO1992011027A1; GR3020495T3

Description

Die medizinisch geläufige Methode, wirksamen Schutz gegen Infektionskrankheiten des Menschen und der Tiere zu erzeu gen, beruht auf dem Prinzip der aktiven Immunisierung unter Verwendung von erregerspezifischen Antigenen. So existieren z. B. prophylaktische Schutzimpfungen gegen eine Reihe von Krankheiten des Menschen, die von Bakterien oder Viren her vorgerufen werden. Aber auch Schutzimpfungen gegen Pilze und Parasiten sind prinzipiell möglich.

Die Schutzwirkung solcher Impfstoffe beruht darauf, daß wichtige Antigene, die im allgemeinen vom Erreger stammen oder von diesem abgeleitet sind, durch Injektion oder son stige geeignete Verabreichung in Kontakt mit dem Immunsystem von Mensch bzw. Tier gebracht werden, so daß eine spezifisch gegen die verabreichten Antigene gerichtete Immunantwort in duziert wird. Dabei ist es Sinn und Zweck, die verabreichten Antigene derart auszuwählen und gegenüber dem Immunsystem zu präsentieren, daß die induzierte Immunantwort gegen den Er reger gerichtet ist und somit eine nachträgliche Infektion verhindert wird. Die induzierte Immunantwort kann sowohl hu moraler (auf Antikörpern basierender), zellulärer oder bei der Natur sein.

Der Antigen enthaltende bzw. bildende Impfstoff kann unter schiedlich aufgebaut bzw. zusammengesetzt sein (vgl. Bloom, Nature, 342 : 115-120, 1989). Eine einfache Methode besteht darin, abgetötete Erreger als Impfstoff zu benutzen. Verbes serungen werden oftmals dadurch erzielt, daß nur einige iso lierte Komponenten des Erregers, die wichtige Antigene re präsentieren, in den Impfstoff eingesetzt werden. Neuere Impfstoffe enthalten darüber hinaus oftmals nur einige we nige wohl-definierte (z. B. vom Erreger gereinigte bzw. gen technologisch bzw. anderweitig hergestellte) Komponenten, die durch geeignete Präsentation als Antigen wirksam werden. Darüber hinaus ist jedwedliche Kombination der genannten Möglichkeiten denkbar. Gemeinsam ist diesen Impfstoffen, daß sie aus totem Antigen-Material bestehen.

Im Gegensatz zu diesen Totimpfstoffen ist seit langem auch die Möglichkeit bekannt, mit biologisch intakten Erregern (sogenannten Lebendimpfstoffen) zu immunisieren und wirksa men Schutz zu vermitteln. Hierunter fallen z. B. die Impfung mit lebenden Viren (Zanetti, Immunology Today, 8 : 18-25, 1987) und BCG-Bakterien (Lotte, Adv. Tuberc. Res. 32 : 107-193, 1984) sowie die orale Immunisierung mit lebenden Ty21a Salmonellen (Germanier, J. Infect. Dis. 131 : 553-558, 1975). Das Prinzip derartiger Lebendimpfstoffe beruht auf der Ver wendung eines abgeschwächten (bzw. für eine bestimmte Spe zies nicht virulenten, immunologisch verwandten) Erreger stamms, der zwar infektionsfähig und wirksamen Immunschutz gegenüber dem eigentlichen Erreger hervorrufen kann, aber selbst nicht mehr pathogen ist. Erfahrung in der Anwendung von Lebendimpfstoffen liegt vor allem in bezug auf Viren und Bakterien vor; im Prinzip könnten jedoch ähnliche Impfstoffe auch auf der Basis von Pilzen bzw. Parasiten entwickelt wer den. Lebendimpfstoffe besitzen oftmals Vorteile gegenüber vergleichbaren Totimpfstoffen, indem sie z. B. einen besseren Immunschutz vermitteln, sicherer bzw. kostengünstiger sind.

Neuere Entwicklungen haben nun darüber hinaus gezeigt, daß es möglich ist, Lebendimpfstoffe gentechnologisch so zu ver ändern, daß sie nicht nur ihre eigenen Antigene gegenüber dem Immunsystem präsentieren, sondern auch zusätzliche Anti gene, die von einer anderen Erreger-Spezies abstammen. Mit derartigen hybriden Lebendimpfstoffen wird es möglich, Im munschutz nicht nur gegen den Erreger zu erzielen, von dem der Lebendimpfstoff abgeleitet oder mit dem sie verwandt ist, sondern auch gegen Erreger, gegen die die Immunantwort gegen das zusätzliche Antigen gerichtet ist. Je nach Spezies auf der der Lebendimpfstoff basiert, können ein oder mehrere zusätzliche Antigene gegenüber dem Immunsystem präsentiert werden und so Immunschutz gegen zusätzliche Erreger-Spezies vermitteln. Dies ist praktisch bereits realisierbar mit vi ralen wie auch bakteriellen Lebendimpfstoffen (vgl. Dougan, J. Gen. Microbiol., 135 : 1397-1406, 1989). Im Gegensatz zu bakteriellen oder anderen zellulären Lebendimpfstoffen liegt es allerdings in der Natur viraler Lebendimpfstoffe (wie auch der Viren allgemein), daß sie ihre genetische Informa tion nur nach Infektion einer Zelle zum Ausdruck bringen können. In diesem Fall erfordert daher die Bildung von zu sätzlichem Antigen durch einen viralen Lebendimpfstoff die Infektion von Zellen des zu schützenden Individuums. Die Präsentation von zusätzlichem Antigen gegenüber dem Immun system kann einerseits über die infizierte Zelle selbst er folgen oder über den viralen Lebendimpfstoff, indem er zu sätzliches Antigen in seiner Verpackung trägt.

Ein wesentliches Problem bei der Konstruktion und Verwendung derartiger hybrider Lebendimpfstoffe ist jedoch der Umstand, daß die Produktion zusätzlicher Antigene oftmals die biolo gischen Eigenschaften des Lebendimpfstoffs verändert bzw. die Impfwirkung destabilisiert, so daß der erwünschte Im munschutz nicht oder nur vermindert eintritt. Dies kann ins besondere dann der Fall sein, wenn das zusätzliche Antigen in großen Mengen produziert wird, wie dies andererseits für die Induktion einer guten Immunanwort oftmals erforderlich wäre und/oder, wenn das zusätzliche Antigen anderweitig to xisch für den Lebendimpfstoff an sich ist. Anders ausge drückt: Der hybride Lebendimpfstoff verhält sich, indem er ein oder mehrere zusätzliche Antigene produziert, bezüglich des Infektionsverlaufs und somit seines Immunisierungspoten tials anders als der ursprüngliche Lebendimpfstoff. Dies be dingt auch, daß je nach Art der zusätzlichen, von dem Le bendimpfstoff erzeugten Antigene nicht auf die Infektionsei genschaften und die Wirksamkeit der Immunisierung des Le bendimpfstoffs geschlossen werden kann, sofern es überhaupt möglich ist, eine wirksame Immunantwort zu erzielen.

Derzeitige Versuche, diesem Problem in bakteriellen Systemen Abhilfe zu schaffen, verfolgen das Ziel, die Bildung zusätz licher Antigene in einem Lebendimpfstoff durch äußere Ein flüsse zu steuern, d. h. die Gene, die für die Bildung zu sätzlicher Antigene kodieren, unter die Kontrolle eines in duzierbaren Promotors zu stellen. Die zusätzlichen Antigene des Lebendimpfstoffs würden folglich nur in Abhängigkeit ih rer äußeren Einflüsse bzw. der Umgebung gebildet werden. Derartige äußere Einflüsse können z. B. eine bestimmte Sub stanz oder eine bestimmte Temperatur sein (z. B. lac-System: De Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 21-25, 1983; P_l- System: Remaut, Gene, 15 : 81-93, 1981). Ideal wäre, daß die für die Bildung der Antigene erforderlichen äußeren Ein flüsse nur dort herrschen, wo der Lebendimpfstoff mit dem Immunsystem in Kontakt tritt, nicht aber im Verlauf des In fektionsvorgangs, damit der für die Immunantwort notwendige Infektionsprozeß nicht gestört wird. Dies ist jedoch prak tisch kaum realisierbar, nicht nur weil Infektionsvorgang und Kontaktaufnahme mit dem Immunsystem biologisch gekoppelt sind, sondern auch weil die Bedingungen am Wirkort des Le bendimpfstoffs, d. h. in bestimmten Körperbereichen des Impf lings, weder örtlich noch zeitlich mit den verfügbaren Mit teln gezielt kontrolliert werden können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein geneti sches Element in die Konstruktion hybrider Lebendimpfstoffe einzubringen, das einerseits die Produktion von ausreichend großen Mengen zusätzlichen Antigens am immunologischen Wirk ort ermöglicht, andererseits den Verlauf der Infektion durch den hybriden Lebendimpfstoff und somit den zu erwartenden Immunschutz nicht beeinträchtigt. Diese Aufgabe wurde ge löst, indem die Bildung der zusätzlichen Antigene des hybri den Lebendimpfstoffs von zufälligen genetischen Ereignissen, die mit relativ großer Häufigkeit erfolgen, abhängig gemacht wurde. Dieses Prinzip bedingt die Existenz zweier Subpopula tionen/Phasen, die dem Lebendimpfstoff entspringen, nämlich des hybriden Lebendimpfstoffes an sich (Subpopulation/Phase A), der kein zusätzliches Antigen produziert und sich des halb ohne Änderung seiner Eigenschaften im Verhältnis zum Ursprungsstamm vermehrt und zu einen normalen Infektionsver lauf wie auch einer normalen Immunantwort befähigt ist und einer Subpopulation/Phase B, die diese Eigenschaften mögli cherweise verloren hat, aber aus Subpopulation A immer neu regeneriert wird und große Mengen des zusätzlichen Antigens am Wirkort freisetzt (vgl. Fig. 1). Subpopulation A besitzt daher die Aufgabe, einen einwandfreien Infektionsverlauf zu gewährleisten, während Subpopulation B dazu dient, eine wirksame Immunantwort gegen die zusätzlich gebildeten Anti gene aufzubauen.

Zufällige Ereignisse, die zur Bildung von Subpopulationen führen, sind in der Natur bekannt und können meist auf Ver änderungen in der DNA, sogenannte (programmierte) DNA-Reor ganisationen, zurückgeführt werden (Borst, Science, 235 : 658-667, 1987). Prinzipiell lassen sich alle in der Natur beob achteten Mechanismen der DNA-Reorganisation für die ge stellte Aufgabe verwenden, vorausgesetzt sie lassen sich in dem hybriden Lebendimpfstoff mit einer geeigneten Häufigkeit reproduzieren. Vorzugsweise liegt die Häufigkeit der Bildung von Subpopulation B bei 0,1% bis 50% pro Zelle und Zellge neration; in besonderen Fällen kann die Häufigkeit jedoch höher bzw. tiefer liegen. Insbesondere geeignet für die An wendung in einem hybriden Lebendimpfstoff sind einfache Me chanismen der DNA-Reorganisation, die an spezifischer Stelle erfolgen, wie die Inversion (Craig, Cell, 41 : 649-650, 1985) oder die Deletion durch Resolution von Transposon-Kointegra ten (Grindley, Annual Rev. Biochem., 54 : 863-896, 1985) eines DNA-Segments. Aber auch andere ortsspezifische DNA-Reorgani sationen oder solche DNA-Reorganisationen, die auf "slipped- strand-mispairing" (Levinson, Mol. Biol. Evol. 4 : 203-221, 1987; Stern, Cell, 47 : 61-71, 1986) beruhen, erscheinen für die genannte Aufgabe geeignet.

Sinn der genannten spontan eintretenden DNA-Reorganisation in einem Lebendimpfstoff muß es sein, daß sie direkt oder indirekt zur Produktion von zusätzlichem Antigen, d. h. zur Bildung der Antigen produzierenden Subpopulation B führt. Dies geschieht sehr einfach z. B. dadurch, daß ein Expres sionssignal (beispielsweise der Promotor) eines Gens durch die DNA-Reorganisation derart vor das Gen positioniert wird, daß dieses Gen von einem nicht-exprimierten in einen expri mierten Zustand übergeht. Beliebige Varianten dieses Prin zips sind möglich; aber sie haben alle zum Ziel, daß durch DNA-Reorganisation eine Änderung der Expression eines Gens herbeigeführt wird (vgl. Fig. 2 und Fig. 3). Gewöhnlich ist es sinnvoll, Gene durch DNA-Reorganisation anzuschalten, möglich ist aber auch das Gegenteil.

Das durch DNA-Reorganisation angeschaltete Gen kann einer seits (Modell I) das für ein zusätzliches Antigen kodieren de Gen oder (falls es sich bei dem zusätzlichen Antigen nicht um ein Protein, sondern um ein enzymatisches Synthese produkt, z. B. ein Karbohydrat, handelt) ein für die Antigen synthese benötigtes Gen sein, oder andererseits (Modell II) ein Gen, das für ein Protein kodiert, das die Expression des eigentlichen Antigen kodierenden Gens kontrolliert. Bei Mo dell I handelt es sich also um ein System, das durch DNA-Re organisation die Synthese des zusätzlichen Antigens oder eines für die Synthese benötigte Enzyms unmittelbar kodiert, während Modell II ein System darstellt, das die Produktion des zusätzlichen Antigens über ein Kaskadensystem ermöglicht (vgl. Fig. 2 und Fig. 3). Das Kaskadensystem kann z. B. da durch realisiert werden, daß das unmittelbar durch DNA-Reor ganisation gesteuerte Gen für eine RNA-Polymerase kodiert, die spezifisch für den dem Antigen kodierenden Gen vorge schalteten Promotor ist, oder einen Genregulator, der auf andere spezifische Weise die Expression des Antigen kodie renden Gens induziert (z. B. T7-Polymerase: Studier, Meth. Enzymol. 185 : 60-89, 1990; lac-System: De Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 21-25, 1983). Auch hier sind wiederum be liebige Variationsmöglichkeiten, die die Natur bietet, gege ben. Während Modell I zunächst geringere Komplexität be sitzt, bietet die Anwendung von Modell II Vorteile, indem aufgrund des verstärkenden Effekts der Kaskade nach einem einzigen DNA-Reorganisationsvorgangs hohe Expressionsstärken erzielt werden können. Außerdem lassen sich mit diesem Mo dell zugleich mehrere Gene, die für unterschiedliche zusätz liche Antigene innerhalb eines hybriden Lebendimpfstoffs ko dieren, anschalten.

Die Realisation des beschriebenen Systems gestaltet sich technisch besonders einfach in bakteriellen Lebendimpfstof fen. Das zur DNA-Reorganisation befähigte genetische Element kann in Bakterien z. B. auf einem Plasmid gehalten oder mit tels eines Phagen, eines Transposons oder durch homologe Re kombination in das Genom eingeführt werden. Im Falle des Kaskadenmodells II können auf ähnliche Weise die Antigen ko dierenden Gene, die mit besonderen Stellen zur Bindung der Genprodukte des zur DNA-Reorganisation befähigten Elements ausgerüstet sind, unter Anwendung der herkömmlichen Techni ken eingebracht werden.

Je nach Prinzip der zugrundeliegenden DNA-Reorganisation werden Enzyme (hier "Steuerenzyme" genannt) benötigt, die die Zelle bereitstellen muß, damit DNA-Reorganisation über haupt stattfindet. Im Falle einer Inversion nach dem Prinzip des Phagen Mu wird beispielsweise eine Invertase neben zel lulären Faktoren benötigt (Kahmann, Cell, 41 : 771-780, 1985); im Falle einer Deletion entsprechend dem Mechanismus der Re solution von Transposon-Kointegraten wird beispielsweise das Enzym Resolvase benötigt (Reed, Cell, 25 : 713-719, 1981); die Bildung replikativer Zirkel entsprechend der Replikation fi lamentöser Phagen benötigt u. a. das Gen 2 Produkt des Phagen (Meyer, Nature, 296 : 828-832, 1982). Diese Enzyme sowie die DNA-Struktur, an der sie angreifen (hier "Ziel-Stellen" ge nannt; z. B.: Mertens, EMBO J., 7 : 1219-1227, 1988), bieten einen geeigneten Ansatzpunkt, die Häufigkeit, mit der DNA- Reorganisationen zur Bildung des zusätzlichen Antigens ab laufen, zu regulieren, und somit das Verhältnis der Popula tionen A und B zu bestimmen. Durch gentechnische Manipula tion der Expression der Steuerenzyme bzw. der Ziel-Stellen ist es möglich, dieses Verhältnis exakt auf das gewünschte Verhältnis der Populationen einzustellen. Es ist allerdings auch denkbar, die Steuerenzyme wiederum einer übergeordneten regulatorischen Kontrolle zu unterwerfen, um so das Verhält nis der Populationen A und B von externen Einflüssen (z. B. in Abhängigkeit von der Temperatur) zu verändern (vgl. Fig. 2). Auch hier ergeben sich nach Belieben und dem Stand der Molekularbiologie entsprechend Variationsmöglichkeiten.

Zur Konstruktion von genetischen Elementen, die DNA-Reorga nisation unterlaufen, dienen die geläufigen Methoden der Mo lekularbiologie. Darüber hinaus ist es von Vorteil, derar tige genetische Elemente zunächst in Zellen zu klonieren, die keine Steuerenzyme bilden, um sie somit für Manipula tions- und Konstruktionszwecke stabil zu erhalten. Nach ih rer Fertigstellung können derartige Elemente mit den gängi gen Methoden der Molekularbiologie in das Genom des Lebend impfstoffs eingeschleust werden oder extrachromosomal als Plasmid erhalten werden. Gleiches gilt für die Gene, die Steuerenzyme kodieren, sowie in bezug auf mittelbar oder un mittelbar Antigen kodierende Gene im Falle des Modell II.

Der fertiggestellte hybride Lebendimpfstoff wird auf ge eignete Weise (z. B. durch orale Gabe bzw. durch Injektion) dem zu schützenden Individuum verabreicht. Die verabreichte Dosis des hybriden Lebendimpfstoffs entspricht gewöhnlich der für den entsprechenden nicht-hybriden Lebendimpfstoff.

Beispiele Beispiel 1 Konstruktion eines invertierbaren DNA-Elements für die Pro duktion von CT-B Antigen (Vibrio cholerae Toxin B-Unter einheit) in Salmonellen

Die genetische Organisation des hier beschriebenen inver tierbaren DNA-Elements ist in Fig. 4 dargestellt. Das Ele ment ist auf dem Plasmid pYZ17 enhalten und wurde unter Ver wendung folgender Gene bzw. sonstiger Nukleotidsequenzen konstruiert:

Das gin Gen entstammt dem Plasmid pLMugin-X16 (Mertens, EMBO J. 3 : 2415-2421, 1984) und wurde von dort zunächst als parti ell gespaltenes PvuI-Fragment, das die im gin Gen selbst enthaltene PvuI-Spaltstelle als einzige ungespaltene PvuI- Spaltstelle noch enthielt, ausgeschnitten. Dieses PvuI- Fragment wurde an seinen Enden mit EcoRI-Linkern versehen und nach Spaltung mit EcoRI und BamHI als ein BamHI/EcoRI- Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde an der BamHI- Schnittstelle mit einem synthetischen BamHI/ClaI-Fragment

(5′-GGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTG-3′)

Terminators des Bakteriophagen fd verbunden, so daß ein kombiniertes EcoRI/ClaI-Fragment entstand.

Das cI857-Gen Fragment wurde aus das Plasmid pRK248 (Bernard, Gene, 5 : 59-76, 1979) durch partielle Spaltung mit HindII und anschließende Ligation mit einem XhoI-Linker als ein XhoI/Cla-Fragment isoliert.

Das EcoRI/ClaI-gin-Fragment wurde über die ClaI-Schnitt stelle mit dem cI857-Gen Fragment zusammenligiert und als ein EcoRI/XhoI-Fragment in ein Derivat (pYZ13) des Plasmids pBT192 (Zahm, Mol. Gen. Genet., 194 : 188-194, 1984), das eine zusätzliche (EcoRI/ClaI/XhoI/BglII) Polylinkerregion trägt, eingebaut.

Der P_l Promotor wurde als ein XhoII-Fragment aus dem Plasmid pLC2833 (Remaut, Gene 22 : 103-113, 1983) isoliert und an bei den Enden mit zwei synthetischen BclI/XhoI Oligonukleotiden

(5′-GATCATTTACCGTTTCCTGTAAACCGAGGTTTTGGATAAC-3′),

die den IR Sequenzen ("Inverted Repeats") entsprechen, über die BclI- Schnittstelle verbunden. Das resultierende Fragment, beste hend aus der Folge "IR-P_l-IR", wurde in den singulären XhoI- Schnitt von Plasmid pfdA4 (Geider, Gene 33 : 341-349, 1985) insertiert.

Der rrnB T1 transkriptionelle Terminator wurde als ein SalI/XhoI-Fragment mit der Nukleotidsequenz XhoI 5′-

SalI erhalten.

Das promotorlose CT-B kodierende ctxB Genfragment wurde aus Plasmid pTK1 (Klauser, EMBO J. 8 : 1991-1999, 1990) nach Spal tung mit ClaI und anschließender Kopplung mit einem BglII- Linker als ein BglII/SalI-Fragment isoliert.

Das Plasmid pYZ17 wurde aus den obengenannten Komponenten in folgender Weise zusammengebaut:

Das SalI/XhoI T1 Terminator-Fragment wurde in den singulären XhoI-Schnitt von Plasmid pYZ13 insertiert und auf die Orien tierung des verbliebenen intakten XhoI-Schnitts getestet. Derivate von pYZ13, die den verbliebenen XhoI-Schnitt distal zum cI857-Gen des pYZ13 trugen, wurden pYZ15 genannt. In den verbliebenen XhoI-Schnitt von pYZ15 wurde das XhoI IR-P_l-IR Fragment eingeführt, so daß der P_l-Promotor zum cI857-Gen orientiert war. Dieses Plasmid (pYZ16) wurde anhand eines asymmetrischen EcoRI-Schnitts identifiziert (Fig. 4). Schließlich wurde das in pYZ16 enthaltene neo^r-Gen durch das ctxB-Fragment durch Spaltung mit BglII/SalI und an schließende Ligation ersetzt, um pYZ17 zu ergeben (Fig. 4). Da pYZ17 neben dem EcoRI-Schnitt innerhalb des invertierba ren P_l Promoterfragments einen weiteren EcoRI-Schnitt stromabwärts von gin besitzt, läßt sich die Orientierung des Promotors sehr leicht durch Spaltung mit EcoRI bestimmen, bzw. die Inversion des Promotors verfolgen. Die Auftrennung der EcoRI-Spaltprodukte in einem Agarosegel ergibt zwei Ban den definierter Größe der Phase A des Plasmids pYZ17 ent sprechend von etwa 4960 bp und 1840 bp bzw. zwei Banden de finierter Größe der Phase B desselben Plasmids entsprechend von 4630 bp und 2170 bp.

Die Konstruktion und Analyse der beschriebenen Plasmide er folgte nach den bei Sambrock (Molecular Cloning, 2nd. Ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ) beschriebenen Me thoden. Zur Erläuterung der Funktion des invertierbaren Ele ments auf dem Plasmid pYZ17 siehe Legende zu Fig. 4. Fig. 5 zeigt den Nachweis der Bildung von CT-B Antigen durch das invertierbare Element des Plasmids pYZ17 in S.typhimurium SL3235 in Vergleich zu dem Plasmid pTK1 (Klauser, EMBO J, 9 : 1991-1999, 1990).

Beispiel 2 Orale Immunisierung von BALB/c Mäusen gegen CT-B Antigen unter Verwendung eines Zweiphasen-Salmonella typhimurium Lebendimpfstoffs

Salmonella typhimurium SL3235 (Hoiseth, Nature 291 : 238-239, 1981) wurde nach dem MgCl₂/CaCl₂-Verfahren (Lederberg, J. Bacteriol., 119 : 1072-1074, 1974) in separaten Ansätzen durch die Plasmide pYZ17 und pTK1 transformiert. Die Transforman ten wurde in 15% glycerin-haltigem LB-Medium eingefroren und bei -75°C bewahrt. Vor dem Immunisierungsexperiment wur den diese Stämme zunächst auf LB-Platten mit Ampicillin (100 mg/ml) über Nacht bei 28°C inkubiert. Einzelkolonien wurden sodann in 10 ml flüssigem LB-Medium mit Ampicillin (50 mg/ml) inokuliert und über Nacht bei 28°C kultiviert. 5 ml dieser Übernachtkulturen wurden nun zu 20 ml 28°C warmen LB-Medium mit Ampicillin (50 mg/ml) gegeben und 4 weitere Stunden bei 28°C inkubiert. Die kultivierten Bakterien wur den danach durch Zentrifugation geerntet, in 10 ml Saline (0,8% NaCl) gewaschen und schließlich in 2 ml Saline sus pendiert.

Die zur Immunisierung benutzten Mäuse (BALB/c) erhielten 16 Stunden vor der Impfung keine Nahrung, sondern nur Wasser. Alle Mäuse erhielten je eine orale Gabe von 0,2 ml 50% ge sättigter Na₂HCO₃ Lösung. Die Mäuse wurden sodann in Gruppen zu je 5 aufgeteilt und erhielten 30 Minuten danach jeweils 0,2 ml der bereiteten Bakteriensuspension pro Maus mit einer abgestumpften Impfkanüle gastral verabreicht: S.typhimurium SL3235 (Gruppe 1), S.typhimurium SL3235/pTK1 (Gruppe 2) bzw. S.typhimurium SL3235/pYZ17 (Gruppe 3). Die orale Immunisie rung erfolgte in 3 Intervallen (Tag 0, 7 und 14) mit jeweils gleichen Dosen. Am Tag 20 wurden Serum und Darmflüssigkeit gesammelt (Manning, FEMS Microbiol. Lett., 28 : 317-321, 1985). Die entnommene Darmflüssigkeit wurde mit Proteasein hibitor versetzt (Elson, J. Immunol. Meth., 67 : 101-108, 1984). Die Proben der Mäuse wurden wurden gruppenweise ver einigt und mittels klassenspezifischer Ziegen-anti-Maus-An tikörper im ELISA-Test bezüglich ihres spezifischen Antikör per-Titers bestimmt (Elson, J. Immunol. Meth., 67 : 101-108, 1984). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Figuren und Tabellen

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren in Verbindung mit der Beschreibung und den Beispielen erläutert.

Fig. 1 Schematische Darstellung der spontanen Bildung zweier Subpopulationen/Phasen (A und B) eines zellulären Le bendimpfstoffs.

Die Figur zeigt idealisiert die exponentielle Vermehrung einer Zelle des Lebendimpfstoffs (z. B. eines Bakteriums), die ein erfindungsgemäßes genetisches Element trägt, das zur spontanen Bildung zweier Subpopulationen/Phasen A (offene Ellypsen) und B (geschlossene Ellypsen) führt. Während Zellen in der Phase A vermehrungsfähig und daher infektionsfä hig bleiben, bilden spontan entstandene Zellen der Phase B große Mengen zusätzliches Antigen, welches einerseits zur Induktion einer zusätzlichen Immunantwort führt, andererseits aber die weitere Vermehrung der Phase B möglicherweise hemmt. In dem dargestellten Fall beträgt Häufigkeit der Bil dung der Phase B etwa 20%.

Fig. 2 Beispiel einer spezifischen DNA-Deletion im Sinne des Modells I der Erfindung unter Berücksichtigung der Rolle des Steuerenzyms.

X stellt das Antigen kodierende Gen dar, das in Phase A von seinem Promotor (P_x) durch ein transkriptionsterminierendes Segment (U) getrennt ist und daher nicht exprimiert wird, während in Phase B der Promotor unmittelbar vor dem Gen X positioniert ist, so daß dieses exprimiert wird. Die Dele tion des DNA-Segments U erfolgt durch ortsspezifische Rekom bination an den Stellen IRS ("interne Resolutionsstellen" des Transposons Tn3) durch das Enzym Resolvase (TnpR des Transposons Tn3; hier: geschlossenes, nach unten gerichtetes Dreieck). Dabei ist wichtig, daß die beiden IRS-Stellen, de ren Nukleotidsequenz definiert ist, gleich orientiert und vorzugsweise innerhalb einiger 100 bis 1000 Basenpaare auf demselben DNA-Molekül lokalisiert sind. Die Häufigkeit des Deletionsereignisses kann durch eine Reihe von Faktoren festgelegt werden, beispielsweise durch leichte Sequenzver änderungen eines oder beider IRS-Stellen oder durch die in der Zelle vorliegende Menge an Resolvase. Die vorliegende Menge dieses Enzyms wiederum hängt von der Effizienz der Ex pression des Resolvase kodierenden Gens R ab. Sofern dieses Gen in Verbindung mit seinem Promotor (P_R) einen Operator (O_R) besitzt, auf dem Transkriptionsregulatoren binden kön nen, ist es prinzipiell möglich, die Häufigkeit der DNA-Re organisation (Deletion des Segments U) über die Expressions stärke des Steuerenzym kodierenden Gens (R) durch äußere Einflüsse, z. B. die Temperatur, zu regulieren.

Fig. 3 Beispiel einer spezifischen DNA-Inversion im Sinne des Modells II der Erfindung.

Die Gene X und Y stellen Antigen kodierende Gene dar, die z. B. auf einem Plasmid eines hybriden bakteriellen Lebend impfstoffs in beliebiger Anordnung enthalten sind. Diesen Genen sind Promotoren (P_x und P_y) vorgeschaltet, die für be stimmte RNA-Polymerasen (z. B. die Polymerase des Phagen T7) spezifisch sind, die von dem Lebendimpfstoff/der Bakteri enzelle an sich nicht gebildet werden. In Phase A können die Gene X und Y nicht exprimiert werden, da die spezifische Po lymerase fehlt. Allerdings enthält der Lebendimpfstoff/die Bakterienzelle das Gen (S), das für diese Polymerase ko diert. Das Gen S kann nun z. B. durch DNA-Inversion aktiviert werden, indem durch die Inversion eines Segments der Promo tor P_s unmittelbar vor das Polymerasegen S positioniert wird, so daß dieses exprimiert wird. Die Inversion des Pro motor enthaltenden DNA-Segments wird (z. B. in Analogie zum G Segment des Bakteriophagen Mu) durch ein Enzym (Gin/Invertase) katalysiert, das an wohldefinierten Ziel- Stellen (IR/"inverted repeats"), die auf der DNA entgegenge setzte Orientierung besitzen, angreift. Die Häufigkeit, mit der die Inversion des Promotor tragenden Fragments erfolgt, hängt von mehreren Faktoren ab (u. a. der Menge der in der Zelle vorhandenen Invertase und der Struktur der IR-Stellen, an denen sie angreift) und kann durch gentechnische Manipu lation individuell eingestellt bzw. verändert werden. In diesem Beispiel initiiert also die ortsspezifische Inversion eines DNA-Segments eine Kaskade, die letztlich die Aktivie rung der Antigen kodierenden Gene X und Y bewirkt.

Fig. 4 Beispiel eines erfindungsgemäßen genetischen Ele ments für einen bakteriellen Lebendimpfstoff und dessen Wir kungsweise.

In der Figur bedeuten die Zeichnungen A und B die beiden Phasen eines invertierbaren Elements, entsprechend wie die ses nach Einführung in einen Bakterienstamm in den Subpopu lationen A bzw. B vorliegen kann. Das dargestellte Element entspricht im wesentlichen dem Modell I (unmittelbare Ex pression des Antigen-Gens) und besitzt eine übergeordnete regulatorische Kontrollfunktion, die von der Temperatur als äußerem Einfluß abhängt. In Phase A ist der für die Expres sion des Antigen-Gens verantwortliche Promotor P_l (PL) in die Richtung des cI857-Gens, das für einen übergeordneten temperatursensitiven Repressor kodiert, und des gin-Gens, das für das Steuerenzym kodiert, gerichtet. Dies hat zur Folge, daß bei der permissiven Temperatur von 28°C funk tionsfähiger Repressor gebildet wird, der die Transkription vom P_l-Promotor (PL) vermindert. Bei erhöhter Temperatur (z. B. 37°C) erhöht sich die Transkription des P_l-Promotors (PL), da der Repressor unter derartigem äußeren Einfluß min destens partiell inaktiviert ist. Die temperaturabhängige Erhöhung der Transkription bedingt auch eine entsprechende Erhöhung der Expression des nachgeschalteten gin-Gens, das als Steuerenzym die Inversion des Promotors an die Ziel- Stellen katalysiert. Demnach erhöht sich durch erhöhte Tem peratur auch die Häufigkeit der Inversion des Promotors und damit der Übergang des invertierbaren Elements in Phase B. Allerdings ist auch bei erniedrigter Temperatur die Inver sion nicht völlig unterbunden, da das gin-Gen ohnehin immer leicht exprimiert wird, und darüber hinaus auch weil gewöhn lich die als Lebendimpfstoff benutzte Wirtszelle selbst ein aktives gin-ähnliches Gen besitzt.

Die Inversion des Promotors bedingt einerseits, daß weniger Repressor und weniger Steuerenzym gebildet werden, und ande rerseits, daß das Antigen kodierende Gen (CT-B) mittels des invertierten Promotors sowie aufgrund der geringeren Bildung des cI Repressors stark exprimiert wird.

In dem genannten Beispiel ist das invertierbare Element in dem Salmonella typhimurium Lebendimpfstoff (SL3235) auf dem Plasmid pYZ17 enthalten. Da dieses Plasmid in mehreren Ko pien pro Bakterienzelle vorliegt, können in einer einzigen Bakterienzelle sowohl Elemente der Phase A als auch der Phase B vorliegen. Dadurch ergeben sich zusätzliche Wechsel wirkungen zwischen den Plasmiden der Phasen A und B, die eine Auftrennung des Lebendimpfstoffs nicht nur in zwei Sub populationen, sondern auch dazwischenliegende Intermediate bewirken. Falls erwünscht kann dies leicht durch Integration des invertierbaren Elements in das Chromosom des Lebendimpf stoffs bzw. durch Klonierung des Elements auf einem "single copy" Plasmid bewerkstelligt werden.

Zur weiteren Funktionsanalyse des im Plasmid pYZ17 enthalte nen invertierbaren Elements auf dem Plasmid pYZ17 siehe auch Fig. 5 und Tab. 1. In der Zeichnung bedeuten: Eco, EcoRI Re striktionsschnittstellen zur Analyse des Phasenzustandes den invertierbaren Elements; gin (im Text auch gin), das Steuerenzym (Invertase) kodierende Gen; T, Transkriptions terminatoren zur Verminderung der Genexpression; cI (im Text genauer mit cI857 bezeichnet), das den temperatursensitiven Regulator (Repressor) kodierende Gen; IR, die Ziel-Stellen der Invertase ("inverted repeats"); PL (im Text auch mit P_l bezeichnet), der invertierbare, durch den cI857-Repressor temperaturregulierbare Promotor; CT-B, das Antigen (V.cholerae Toxin B-Untereinheit) kodierende Gen (ctxB).

Fig. 5 Diese Figur zeigt eine Immunoblot-(Western)-Analyse der Bildung von CT-B Antigen in hybriden S.typhimurium SL3235 Zellen. In der Figur sind in Spur 1 20 ng gereinigtes CT-B Antigen von Sigma als Referenz bzw. in Spuren 2 bis 6 Bakterienlysate entsprechend 2,5 × 10⁷ Zellen dargestellt;
Spur 2, S.typhimurium SL3235 gezüchtet bei 37°C; Spur 3, S.typhimurium SL3235 (pTK1) gezüchtet bei 28°C; Spur 4, S.typhimurium SL3235 (pTK1) gezüchtet bei 37°C; Spur 5, S.typhimurium SL3235 (pYZ17) gezüchtet bei 28°C; Spur 6, S.typhimurium SL3235 (pYZ17) gezüchtet bei 37°C.

Position "a" bezeichnet eine unspezifische Kreuzreaktion im Blot, Po sition "b" den Vorläufer des CT-B Antigen und Position "c" das reife CT-B Antigen. Die Gewinnung der Proben und die Durchführung des Immunoblots erfolgten nach Klauser (EMBO J. 9 : 1991-1999, 1990).

Es ist ersichtlich, daß S.typhimurium SL3235 (pYZ17) bei 28°C im Gegensatz zu 37°C nur sehr wenig CT-B Antigen produ ziert. Es ist weiterhin ersichtlich, daß im Gegensatz hierzu die Bildung von CT-B Antigen im Vergleichstamm S.typhimurium SL3235 (pTK1) temperaturunabhängig ist und daß in diesem Stamm im Verhältnis zu S.typhimurium SL3235 (pYZ17), der bei 37°C gezüchtet wurde, weniger CT-B Vorläuferprotein ange häuft wird. Letzteres spiegelt die Bildung von wenig CT-B Antigen in Subpopulation A und viel CT-B Antigen in Subpopu lation B in S.typhimurium SL3235 (pYZ17), der bei 37°C ge züchtet wurde, wider: Die Bildung von viel CT-B in nur weni gen Zellen führt zu einem Stau in der Umwandlung von Vorläu fer in reifes CT-B Antigen.

Tab. 1 Humorale Immunantwort nach Immunisierung von BALB/c Mäusen nach oraler Immunisierung mit hybriden Salmonella typhimurium SL3235 Stämmen.

Die Ergebnisse des in Beispiel 2 dargestellten Experiments sind wiedergegeben. Die angegebenen Antikörpertiter entspre chen denjenigen Verdünnungsstufen der Proben, die gerade noch einen positiven Nachweis im ELISA-Test ergeben.

Tabelle 1

Claims

1. Hybrider Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er zwei Subpopulationen (A und B) aufweist, wobei Popula tion A infektionsfähig ist und an sich immunogen wirkt, während Subpopulation B, die von Subpopulation A regene riert wird, zusätzliches Antigen produziert und in bezug auf dieses zusätzliche Antigen immunogen wirkt.

2. Lebendimpfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Subpopulation B in einer Häufigkeit von 0,1% bis 50% pro Zelle und Zellgeneration vorliegt.

3. Lebendimpfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß er eine rekombinante DNA umfaßt, die die Subpopulation A und B erzeugt.

4. Lebendimpfstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA in einem zellulären Lebendimpf stoff enthalten ist.

5. Lebendimpfstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA in einem viralen Lebendimpf stoff enthalten ist und nach Infektion einer Zelle zum Ausdruck gebracht wird.

6. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA in einer oder mehreren Kopien in dem zellulären Lebendimpfstoff enthalten ist.

7. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA in dem zellulären Lebendimpf stoff auf einem Plasmid enthalten ist.

8. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinante DNA im Chromosom des zellulären Le bendimpfstoffs enthalten ist.

9. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der zelluläre Lebendimpfstoff ein Bakterium oder eine eukaryontische Zelle (z. B. eine Pilzzelle) dar stellt.

10. Lebendimpfstoff nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Bakterium oder die eukaryontische Zelle einen attenuierten Krankheitserreger darstellt.

11. Verfahren zur Herstellung eines hybriden Lebendimpfstof fes, dadurch gekennzeichnet, daß man den Lebendimpfstoff in zwei Subpopulationen (A und B) aufspaltet, wobei Po pulation A infektionsfähig ist und an sich immunogen wirkt, während Subpopulation B, die von Subpopulation A regeneriert wird, zusätzliches Antigen produziert und in bezug auf dieses zusätzliche Antigen immunogen wirkt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufspaltung des Lebendimpfstoffs in zwei Subpopula tionen durch spontane DNA-Reorganisation in der DNA des Lebendimpfstoffs erfolgt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation auf einem spezifischen DNA-Inver sionsvorgang beruht.

14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation auf einem spezifischen DNA-Dele tionsvorgang beruht.

15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation auf einem spezifischen DNA-Repli kationsvorgang beruht.

16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation auf "slipped-strand-mispairing" beruht.

17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die spontane DNA-Reorganisation durch ein Steuerenzym katalysiert wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Häufigkeit der spontanen DNA-Reorganisation durch Regulation des Steuerenzyms übergeordnet kontrolliert wird.

19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Erzeugung der Subpopulation B mit einer Häufigkeit zwischen 0,1% und 50% pro Zelle und Zellgeneration er folgt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation unmittelbar zur Bildung von zusätzlichem Antigen in Subpopulation B führt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation eine Kaska denreaktion initiiert und mittelbar zur Bildung von zu sätzlichem Antigen in Subpopulation B führt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Kaskade durch Bildung einer spezifischen Polymerase initiiert wird, wobei letztere unmittelbar oder mittel bar die Expression des/der Antigen kodierenden Gen(e) bewirkt.

23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Kaskade durch Bildung eines spezifischen Genregula tors initiiert wird, der unmittelbar oder mittelbar die Expression der/des Antigen kodierenden Gen(e) bewirkt.

24. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Lebendimpfstoff nach Anspruch 1 erzeugt.

25. Rekombinante DNA nach Anspruch 24, dadurch gekennzeich net, daß sie in einem zellulären Lebendimpfstoff enthal ten ist.

26. Rekombinante DNA nach Anspruch 24, dadurch gekennzeich net. daß sie in einem viralen Lebendimpfstoff enthalten ist und nach Infektion einer Zelle zum Ausdruck gebracht wird.

27. Rekombinante DNA nach Anspruch 25, dadurch gekennzeich net, daß sie in ein oder mehreren Kopien in dem zellulä ren Lebendimpfstoff enthalten ist.

28. Rekombinante DNA nach Anspruch 25, dadurch gekennzeich net, daß sie in dem zellulären Lebendimpfstoff auf einem Plasmid enthalten ist.

29. Rekombinante DNA nach Anspruch 25, dadurch gekennzeich net, daß sie im Chromosom des zellulären Lebendimpf stoffs enthalten ist.

30. Verfahren zur Immunisierung eines Säugers mit einem hy briden Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Lebendimpfstoff gemäß einem der Ansprüche 1-10 einsetzt.