DE4041045A1 - Zweiphasen-systeme fuer die produktion und praesentation von fremdantigen in hybriden lebendimpfstoffen - Google Patents
Zweiphasen-systeme fuer die produktion und praesentation von fremdantigen in hybriden lebendimpfstoffenInfo
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Description
Die medizinisch geläufige Methode, wirksamen Schutz gegen
Infektionskrankheiten des Menschen und der Tiere zu erzeu
gen, beruht auf dem Prinzip der aktiven Immunisierung unter
Verwendung von erregerspezifischen Antigenen. So existieren
z. B. prophylaktische Schutzimpfungen gegen eine Reihe von
Krankheiten des Menschen, die von Bakterien oder Viren her
vorgerufen werden. Aber auch Schutzimpfungen gegen Pilze und
Parasiten sind prinzipiell möglich.
Die Schutzwirkung solcher Impfstoffe beruht darauf, daß
wichtige Antigene, die im allgemeinen vom Erreger stammen
oder von diesem abgeleitet sind, durch Injektion oder son
stige geeignete Verabreichung in Kontakt mit dem Immunsystem
von Mensch bzw. Tier gebracht werden, so daß eine spezifisch
gegen die verabreichten Antigene gerichtete Immunantwort in
duziert wird. Dabei ist es Sinn und Zweck, die verabreichten
Antigene derart auszuwählen und gegenüber dem Immunsystem zu
präsentieren, daß die induzierte Immunantwort gegen den Er
reger gerichtet ist und somit eine nachträgliche Infektion
verhindert wird. Die induzierte Immunantwort kann sowohl hu
moraler (auf Antikörpern basierender), zellulärer oder bei
der Natur sein.
Der Antigen enthaltende bzw. bildende Impfstoff kann unter
schiedlich aufgebaut bzw. zusammengesetzt sein (vgl. Bloom,
Nature, 342 : 115-120, 1989). Eine einfache Methode besteht
darin, abgetötete Erreger als Impfstoff zu benutzen. Verbes
serungen werden oftmals dadurch erzielt, daß nur einige iso
lierte Komponenten des Erregers, die wichtige Antigene re
präsentieren, in den Impfstoff eingesetzt werden. Neuere
Impfstoffe enthalten darüber hinaus oftmals nur einige we
nige wohl-definierte (z. B. vom Erreger gereinigte bzw. gen
technologisch bzw. anderweitig hergestellte) Komponenten,
die durch geeignete Präsentation als Antigen wirksam werden.
Darüber hinaus ist jedwedliche Kombination der genannten
Möglichkeiten denkbar. Gemeinsam ist diesen Impfstoffen, daß
sie aus totem Antigen-Material bestehen.
Im Gegensatz zu diesen Totimpfstoffen ist seit langem auch
die Möglichkeit bekannt, mit biologisch intakten Erregern
(sogenannten Lebendimpfstoffen) zu immunisieren und wirksa
men Schutz zu vermitteln. Hierunter fallen z. B. die Impfung
mit lebenden Viren (Zanetti, Immunology Today, 8 : 18-25,
1987) und BCG-Bakterien (Lotte, Adv. Tuberc. Res. 32 : 107-193,
1984) sowie die orale Immunisierung mit lebenden Ty21a
Salmonellen (Germanier, J. Infect. Dis. 131 : 553-558, 1975).
Das Prinzip derartiger Lebendimpfstoffe beruht auf der Ver
wendung eines abgeschwächten (bzw. für eine bestimmte Spe
zies nicht virulenten, immunologisch verwandten) Erreger
stamms, der zwar infektionsfähig und wirksamen Immunschutz
gegenüber dem eigentlichen Erreger hervorrufen kann, aber
selbst nicht mehr pathogen ist. Erfahrung in der Anwendung
von Lebendimpfstoffen liegt vor allem in bezug auf Viren und
Bakterien vor; im Prinzip könnten jedoch ähnliche Impfstoffe
auch auf der Basis von Pilzen bzw. Parasiten entwickelt wer
den. Lebendimpfstoffe besitzen oftmals Vorteile gegenüber
vergleichbaren Totimpfstoffen, indem sie z. B. einen besseren
Immunschutz vermitteln, sicherer bzw. kostengünstiger sind.
Neuere Entwicklungen haben nun darüber hinaus gezeigt, daß
es möglich ist, Lebendimpfstoffe gentechnologisch so zu ver
ändern, daß sie nicht nur ihre eigenen Antigene gegenüber
dem Immunsystem präsentieren, sondern auch zusätzliche Anti
gene, die von einer anderen Erreger-Spezies abstammen. Mit
derartigen hybriden Lebendimpfstoffen wird es möglich, Im
munschutz nicht nur gegen den Erreger zu erzielen, von dem
der Lebendimpfstoff abgeleitet oder mit dem sie verwandt
ist, sondern auch gegen Erreger, gegen die die Immunantwort
gegen das zusätzliche Antigen gerichtet ist. Je nach Spezies
auf der der Lebendimpfstoff basiert, können ein oder mehrere
zusätzliche Antigene gegenüber dem Immunsystem präsentiert
werden und so Immunschutz gegen zusätzliche Erreger-Spezies
vermitteln. Dies ist praktisch bereits realisierbar mit vi
ralen wie auch bakteriellen Lebendimpfstoffen (vgl. Dougan,
J. Gen. Microbiol., 135 : 1397-1406, 1989). Im Gegensatz zu
bakteriellen oder anderen zellulären Lebendimpfstoffen liegt
es allerdings in der Natur viraler Lebendimpfstoffe (wie
auch der Viren allgemein), daß sie ihre genetische Informa
tion nur nach Infektion einer Zelle zum Ausdruck bringen
können. In diesem Fall erfordert daher die Bildung von zu
sätzlichem Antigen durch einen viralen Lebendimpfstoff die
Infektion von Zellen des zu schützenden Individuums. Die
Präsentation von zusätzlichem Antigen gegenüber dem Immun
system kann einerseits über die infizierte Zelle selbst er
folgen oder über den viralen Lebendimpfstoff, indem er zu
sätzliches Antigen in seiner Verpackung trägt.
Ein wesentliches Problem bei der Konstruktion und Verwendung
derartiger hybrider Lebendimpfstoffe ist jedoch der Umstand,
daß die Produktion zusätzlicher Antigene oftmals die biolo
gischen Eigenschaften des Lebendimpfstoffs verändert bzw.
die Impfwirkung destabilisiert, so daß der erwünschte Im
munschutz nicht oder nur vermindert eintritt. Dies kann ins
besondere dann der Fall sein, wenn das zusätzliche Antigen
in großen Mengen produziert wird, wie dies andererseits für
die Induktion einer guten Immunanwort oftmals erforderlich
wäre und/oder, wenn das zusätzliche Antigen anderweitig to
xisch für den Lebendimpfstoff an sich ist. Anders ausge
drückt: Der hybride Lebendimpfstoff verhält sich, indem er
ein oder mehrere zusätzliche Antigene produziert, bezüglich
des Infektionsverlaufs und somit seines Immunisierungspoten
tials anders als der ursprüngliche Lebendimpfstoff. Dies be
dingt auch, daß je nach Art der zusätzlichen, von dem Le
bendimpfstoff erzeugten Antigene nicht auf die Infektionsei
genschaften und die Wirksamkeit der Immunisierung des Le
bendimpfstoffs geschlossen werden kann, sofern es überhaupt
möglich ist, eine wirksame Immunantwort zu erzielen.
Derzeitige Versuche, diesem Problem in bakteriellen Systemen
Abhilfe zu schaffen, verfolgen das Ziel, die Bildung zusätz
licher Antigene in einem Lebendimpfstoff durch äußere Ein
flüsse zu steuern, d. h. die Gene, die für die Bildung zu
sätzlicher Antigene kodieren, unter die Kontrolle eines in
duzierbaren Promotors zu stellen. Die zusätzlichen Antigene
des Lebendimpfstoffs würden folglich nur in Abhängigkeit ih
rer äußeren Einflüsse bzw. der Umgebung gebildet werden.
Derartige äußere Einflüsse können z. B. eine bestimmte Sub
stanz oder eine bestimmte Temperatur sein (z. B. lac-System:
De Boer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80 : 21-25, 1983; Pl-
System: Remaut, Gene, 15 : 81-93, 1981). Ideal wäre, daß die
für die Bildung der Antigene erforderlichen äußeren Ein
flüsse nur dort herrschen, wo der Lebendimpfstoff mit dem
Immunsystem in Kontakt tritt, nicht aber im Verlauf des In
fektionsvorgangs, damit der für die Immunantwort notwendige
Infektionsprozeß nicht gestört wird. Dies ist jedoch prak
tisch kaum realisierbar, nicht nur weil Infektionsvorgang
und Kontaktaufnahme mit dem Immunsystem biologisch gekoppelt
sind, sondern auch weil die Bedingungen am Wirkort des Le
bendimpfstoffs, d. h. in bestimmten Körperbereichen des Impf
lings, weder örtlich noch zeitlich mit den verfügbaren Mit
teln gezielt kontrolliert werden können.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein geneti
sches Element in die Konstruktion hybrider Lebendimpfstoffe
einzubringen, das einerseits die Produktion von ausreichend
großen Mengen zusätzlichen Antigens am immunologischen Wirk
ort ermöglicht, andererseits den Verlauf der Infektion durch
den hybriden Lebendimpfstoff und somit den zu erwartenden
Immunschutz nicht beeinträchtigt. Diese Aufgabe wurde ge
löst, indem die Bildung der zusätzlichen Antigene des hybri
den Lebendimpfstoffs von zufälligen genetischen Ereignissen,
die mit relativ großer Häufigkeit erfolgen, abhängig gemacht
wurde. Dieses Prinzip bedingt die Existenz zweier Subpopula
tionen/Phasen, die dem Lebendimpfstoff entspringen, nämlich
des hybriden Lebendimpfstoffes an sich (Subpopulation/Phase
A), der kein zusätzliches Antigen produziert und sich des
halb ohne Änderung seiner Eigenschaften im Verhältnis zum
Ursprungsstamm vermehrt und zu einen normalen Infektionsver
lauf wie auch einer normalen Immunantwort befähigt ist und
einer Subpopulation/Phase B, die diese Eigenschaften mögli
cherweise verloren hat, aber aus Subpopulation A immer neu
regeneriert wird und große Mengen des zusätzlichen Antigens
am Wirkort freisetzt (vgl. Fig. 1). Subpopulation A besitzt
daher die Aufgabe, einen einwandfreien Infektionsverlauf zu
gewährleisten, während Subpopulation B dazu dient, eine
wirksame Immunantwort gegen die zusätzlich gebildeten Anti
gene aufzubauen.
Zufällige Ereignisse, die zur Bildung von Subpopulationen
führen, sind in der Natur bekannt und können meist auf Ver
änderungen in der DNA, sogenannte (programmierte) DNA-Reor
ganisationen, zurückgeführt werden (Borst, Science, 235 : 658-667,
1987). Prinzipiell lassen sich alle in der Natur beob
achteten Mechanismen der DNA-Reorganisation für die ge
stellte Aufgabe verwenden, vorausgesetzt sie lassen sich in
dem hybriden Lebendimpfstoff mit einer geeigneten Häufigkeit
reproduzieren. Vorzugsweise liegt die Häufigkeit der Bildung
von Subpopulation B bei 0,1% bis 50% pro Zelle und Zellge
neration; in besonderen Fällen kann die Häufigkeit jedoch
höher bzw. tiefer liegen. Insbesondere geeignet für die An
wendung in einem hybriden Lebendimpfstoff sind einfache Me
chanismen der DNA-Reorganisation, die an spezifischer Stelle
erfolgen, wie die Inversion (Craig, Cell, 41 : 649-650, 1985)
oder die Deletion durch Resolution von Transposon-Kointegra
ten (Grindley, Annual Rev. Biochem., 54 : 863-896, 1985) eines
DNA-Segments. Aber auch andere ortsspezifische DNA-Reorgani
sationen oder solche DNA-Reorganisationen, die auf "slipped-
strand-mispairing" (Levinson, Mol. Biol. Evol. 4 : 203-221,
1987; Stern, Cell, 47 : 61-71, 1986) beruhen, erscheinen für
die genannte Aufgabe geeignet.
Sinn der genannten spontan eintretenden DNA-Reorganisation
in einem Lebendimpfstoff muß es sein, daß sie direkt oder
indirekt zur Produktion von zusätzlichem Antigen, d. h. zur
Bildung der Antigen produzierenden Subpopulation B führt.
Dies geschieht sehr einfach z. B. dadurch, daß ein Expres
sionssignal (beispielsweise der Promotor) eines Gens durch
die DNA-Reorganisation derart vor das Gen positioniert wird,
daß dieses Gen von einem nicht-exprimierten in einen expri
mierten Zustand übergeht. Beliebige Varianten dieses Prin
zips sind möglich; aber sie haben alle zum Ziel, daß durch
DNA-Reorganisation eine Änderung der Expression eines Gens
herbeigeführt wird (vgl. Fig. 2 und Fig. 3). Gewöhnlich ist
es sinnvoll, Gene durch DNA-Reorganisation anzuschalten,
möglich ist aber auch das Gegenteil.
Das durch DNA-Reorganisation angeschaltete Gen kann einer
seits (Modell I) das für ein zusätzliches Antigen kodieren
de Gen oder (falls es sich bei dem zusätzlichen Antigen
nicht um ein Protein, sondern um ein enzymatisches Synthese
produkt, z. B. ein Karbohydrat, handelt) ein für die Antigen
synthese benötigtes Gen sein, oder andererseits (Modell II)
ein Gen, das für ein Protein kodiert, das die Expression des
eigentlichen Antigen kodierenden Gens kontrolliert. Bei Mo
dell I handelt es sich also um ein System, das durch DNA-Re
organisation die Synthese des zusätzlichen Antigens oder
eines für die Synthese benötigte Enzyms unmittelbar kodiert,
während Modell II ein System darstellt, das die Produktion
des zusätzlichen Antigens über ein Kaskadensystem ermöglicht
(vgl. Fig. 2 und Fig. 3). Das Kaskadensystem kann z. B. da
durch realisiert werden, daß das unmittelbar durch DNA-Reor
ganisation gesteuerte Gen für eine RNA-Polymerase kodiert,
die spezifisch für den dem Antigen kodierenden Gen vorge
schalteten Promotor ist, oder einen Genregulator, der auf
andere spezifische Weise die Expression des Antigen kodie
renden Gens induziert (z. B. T7-Polymerase: Studier, Meth.
Enzymol. 185 : 60-89, 1990; lac-System: De Boer, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 80 : 21-25, 1983). Auch hier sind wiederum be
liebige Variationsmöglichkeiten, die die Natur bietet, gege
ben. Während Modell I zunächst geringere Komplexität be
sitzt, bietet die Anwendung von Modell II Vorteile, indem
aufgrund des verstärkenden Effekts der Kaskade nach einem
einzigen DNA-Reorganisationsvorgangs hohe Expressionsstärken
erzielt werden können. Außerdem lassen sich mit diesem Mo
dell zugleich mehrere Gene, die für unterschiedliche zusätz
liche Antigene innerhalb eines hybriden Lebendimpfstoffs ko
dieren, anschalten.
Die Realisation des beschriebenen Systems gestaltet sich
technisch besonders einfach in bakteriellen Lebendimpfstof
fen. Das zur DNA-Reorganisation befähigte genetische Element
kann in Bakterien z. B. auf einem Plasmid gehalten oder mit
tels eines Phagen, eines Transposons oder durch homologe Re
kombination in das Genom eingeführt werden. Im Falle des
Kaskadenmodells II können auf ähnliche Weise die Antigen ko
dierenden Gene, die mit besonderen Stellen zur Bindung der
Genprodukte des zur DNA-Reorganisation befähigten Elements
ausgerüstet sind, unter Anwendung der herkömmlichen Techni
ken eingebracht werden.
Je nach Prinzip der zugrundeliegenden DNA-Reorganisation
werden Enzyme (hier "Steuerenzyme" genannt) benötigt, die
die Zelle bereitstellen muß, damit DNA-Reorganisation über
haupt stattfindet. Im Falle einer Inversion nach dem Prinzip
des Phagen Mu wird beispielsweise eine Invertase neben zel
lulären Faktoren benötigt (Kahmann, Cell, 41 : 771-780, 1985);
im Falle einer Deletion entsprechend dem Mechanismus der Re
solution von Transposon-Kointegraten wird beispielsweise das
Enzym Resolvase benötigt (Reed, Cell, 25 : 713-719, 1981); die
Bildung replikativer Zirkel entsprechend der Replikation fi
lamentöser Phagen benötigt u. a. das Gen 2 Produkt des Phagen
(Meyer, Nature, 296 : 828-832, 1982). Diese Enzyme sowie die
DNA-Struktur, an der sie angreifen (hier "Ziel-Stellen" ge
nannt; z. B.: Mertens, EMBO J., 7 : 1219-1227, 1988), bieten
einen geeigneten Ansatzpunkt, die Häufigkeit, mit der DNA-
Reorganisationen zur Bildung des zusätzlichen Antigens ab
laufen, zu regulieren, und somit das Verhältnis der Popula
tionen A und B zu bestimmen. Durch gentechnische Manipula
tion der Expression der Steuerenzyme bzw. der Ziel-Stellen
ist es möglich, dieses Verhältnis exakt auf das gewünschte
Verhältnis der Populationen einzustellen. Es ist allerdings
auch denkbar, die Steuerenzyme wiederum einer übergeordneten
regulatorischen Kontrolle zu unterwerfen, um so das Verhält
nis der Populationen A und B von externen Einflüssen (z. B.
in Abhängigkeit von der Temperatur) zu verändern (vgl.
Fig. 2). Auch hier ergeben sich nach Belieben und dem Stand
der Molekularbiologie entsprechend Variationsmöglichkeiten.
Zur Konstruktion von genetischen Elementen, die DNA-Reorga
nisation unterlaufen, dienen die geläufigen Methoden der Mo
lekularbiologie. Darüber hinaus ist es von Vorteil, derar
tige genetische Elemente zunächst in Zellen zu klonieren,
die keine Steuerenzyme bilden, um sie somit für Manipula
tions- und Konstruktionszwecke stabil zu erhalten. Nach ih
rer Fertigstellung können derartige Elemente mit den gängi
gen Methoden der Molekularbiologie in das Genom des Lebend
impfstoffs eingeschleust werden oder extrachromosomal als
Plasmid erhalten werden. Gleiches gilt für die Gene, die
Steuerenzyme kodieren, sowie in bezug auf mittelbar oder un
mittelbar Antigen kodierende Gene im Falle des Modell II.
Der fertiggestellte hybride Lebendimpfstoff wird auf ge
eignete Weise (z. B. durch orale Gabe bzw. durch Injektion)
dem zu schützenden Individuum verabreicht. Die verabreichte
Dosis des hybriden Lebendimpfstoffs entspricht gewöhnlich
der für den entsprechenden nicht-hybriden Lebendimpfstoff.
Die genetische Organisation des hier beschriebenen inver
tierbaren DNA-Elements ist in Fig. 4 dargestellt. Das Ele
ment ist auf dem Plasmid pYZ17 enhalten und wurde unter Ver
wendung folgender Gene bzw. sonstiger Nukleotidsequenzen
konstruiert:
Das gin Gen entstammt dem Plasmid pLMugin-X16 (Mertens, EMBO
J. 3 : 2415-2421, 1984) und wurde von dort zunächst als parti
ell gespaltenes PvuI-Fragment, das die im gin Gen selbst
enthaltene PvuI-Spaltstelle als einzige ungespaltene PvuI-
Spaltstelle noch enthielt, ausgeschnitten. Dieses PvuI-
Fragment wurde an seinen Enden mit EcoRI-Linkern versehen
und nach Spaltung mit EcoRI und BamHI als ein BamHI/EcoRI-
Fragment isoliert. Dieses Fragment wurde an der BamHI-
Schnittstelle mit einem synthetischen BamHI/ClaI-Fragment
(5′-GGATAAACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGATTTTCAACGTG-3′)
Terminators des Bakteriophagen fd verbunden, so
daß ein kombiniertes EcoRI/ClaI-Fragment entstand.
Das cI857-Gen Fragment wurde aus das Plasmid pRK248
(Bernard, Gene, 5 : 59-76, 1979) durch partielle Spaltung mit
HindII und anschließende Ligation mit einem XhoI-Linker als
ein XhoI/Cla-Fragment isoliert.
Das EcoRI/ClaI-gin-Fragment wurde über die ClaI-Schnitt
stelle mit dem cI857-Gen Fragment zusammenligiert und als
ein EcoRI/XhoI-Fragment in ein Derivat (pYZ13) des Plasmids
pBT192 (Zahm, Mol. Gen. Genet., 194 : 188-194, 1984), das eine
zusätzliche (EcoRI/ClaI/XhoI/BglII) Polylinkerregion trägt,
eingebaut.
Der Pl Promotor wurde als ein XhoII-Fragment aus dem Plasmid
pLC2833 (Remaut, Gene 22 : 103-113, 1983) isoliert und an bei
den Enden mit zwei synthetischen BclI/XhoI Oligonukleotiden
(5′-GATCATTTACCGTTTCCTGTAAACCGAGGTTTTGGATAAC-3′),
die den IR
Sequenzen ("Inverted Repeats") entsprechen, über die BclI-
Schnittstelle verbunden. Das resultierende Fragment, beste
hend aus der Folge "IR-Pl-IR", wurde in den singulären XhoI-
Schnitt von Plasmid pfdA4 (Geider, Gene 33 : 341-349, 1985)
insertiert.
Der rrnB T1 transkriptionelle Terminator wurde als ein
SalI/XhoI-Fragment mit der Nukleotidsequenz XhoI 5′-
SalI erhalten.
Das promotorlose CT-B kodierende ctxB Genfragment wurde aus
Plasmid pTK1 (Klauser, EMBO J. 8 : 1991-1999, 1990) nach Spal
tung mit ClaI und anschließender Kopplung mit einem BglII-
Linker als ein BglII/SalI-Fragment isoliert.
Das Plasmid pYZ17 wurde aus den obengenannten Komponenten in
folgender Weise zusammengebaut:
Das SalI/XhoI T1 Terminator-Fragment wurde in den singulären
XhoI-Schnitt von Plasmid pYZ13 insertiert und auf die Orien
tierung des verbliebenen intakten XhoI-Schnitts getestet.
Derivate von pYZ13, die den verbliebenen XhoI-Schnitt distal
zum cI857-Gen des pYZ13 trugen, wurden pYZ15 genannt. In den
verbliebenen XhoI-Schnitt von pYZ15 wurde das XhoI IR-Pl-IR
Fragment eingeführt, so daß der Pl-Promotor zum cI857-Gen
orientiert war. Dieses Plasmid (pYZ16) wurde anhand eines
asymmetrischen EcoRI-Schnitts identifiziert (Fig. 4).
Schließlich wurde das in pYZ16 enthaltene neor-Gen durch das
ctxB-Fragment durch Spaltung mit BglII/SalI und an
schließende Ligation ersetzt, um pYZ17 zu ergeben (Fig. 4).
Da pYZ17 neben dem EcoRI-Schnitt innerhalb des invertierba
ren Pl Promoterfragments einen weiteren EcoRI-Schnitt
stromabwärts von gin besitzt, läßt sich die Orientierung des
Promotors sehr leicht durch Spaltung mit EcoRI bestimmen,
bzw. die Inversion des Promotors verfolgen. Die Auftrennung
der EcoRI-Spaltprodukte in einem Agarosegel ergibt zwei Ban
den definierter Größe der Phase A des Plasmids pYZ17 ent
sprechend von etwa 4960 bp und 1840 bp bzw. zwei Banden de
finierter Größe der Phase B desselben Plasmids entsprechend
von 4630 bp und 2170 bp.
Die Konstruktion und Analyse der beschriebenen Plasmide er
folgte nach den bei Sambrock (Molecular Cloning, 2nd. Ed.,
1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press ) beschriebenen Me
thoden. Zur Erläuterung der Funktion des invertierbaren Ele
ments auf dem Plasmid pYZ17 siehe Legende zu Fig. 4. Fig. 5
zeigt den Nachweis der Bildung von CT-B Antigen durch das
invertierbare Element des Plasmids pYZ17 in S.typhimurium
SL3235 in Vergleich zu dem Plasmid pTK1 (Klauser, EMBO J,
9 : 1991-1999, 1990).
Salmonella typhimurium SL3235 (Hoiseth, Nature 291 : 238-239,
1981) wurde nach dem MgCl2/CaCl2-Verfahren (Lederberg, J.
Bacteriol., 119 : 1072-1074, 1974) in separaten Ansätzen durch
die Plasmide pYZ17 und pTK1 transformiert. Die Transforman
ten wurde in 15% glycerin-haltigem LB-Medium eingefroren
und bei -75°C bewahrt. Vor dem Immunisierungsexperiment wur
den diese Stämme zunächst auf LB-Platten mit Ampicillin
(100 mg/ml) über Nacht bei 28°C inkubiert. Einzelkolonien
wurden sodann in 10 ml flüssigem LB-Medium mit Ampicillin
(50 mg/ml) inokuliert und über Nacht bei 28°C kultiviert. 5
ml dieser Übernachtkulturen wurden nun zu 20 ml 28°C warmen
LB-Medium mit Ampicillin (50 mg/ml) gegeben und 4 weitere
Stunden bei 28°C inkubiert. Die kultivierten Bakterien wur
den danach durch Zentrifugation geerntet, in 10 ml Saline
(0,8% NaCl) gewaschen und schließlich in 2 ml Saline sus
pendiert.
Die zur Immunisierung benutzten Mäuse (BALB/c) erhielten 16
Stunden vor der Impfung keine Nahrung, sondern nur Wasser.
Alle Mäuse erhielten je eine orale Gabe von 0,2 ml 50% ge
sättigter Na2HCO3 Lösung. Die Mäuse wurden sodann in Gruppen
zu je 5 aufgeteilt und erhielten 30 Minuten danach jeweils
0,2 ml der bereiteten Bakteriensuspension pro Maus mit einer
abgestumpften Impfkanüle gastral verabreicht: S.typhimurium
SL3235 (Gruppe 1), S.typhimurium SL3235/pTK1 (Gruppe 2) bzw.
S.typhimurium SL3235/pYZ17 (Gruppe 3). Die orale Immunisie
rung erfolgte in 3 Intervallen (Tag 0, 7 und 14) mit jeweils
gleichen Dosen. Am Tag 20 wurden Serum und Darmflüssigkeit
gesammelt (Manning, FEMS Microbiol. Lett., 28 : 317-321,
1985). Die entnommene Darmflüssigkeit wurde mit Proteasein
hibitor versetzt (Elson, J. Immunol. Meth., 67 : 101-108,
1984). Die Proben der Mäuse wurden wurden gruppenweise ver
einigt und mittels klassenspezifischer Ziegen-anti-Maus-An
tikörper im ELISA-Test bezüglich ihres spezifischen Antikör
per-Titers bestimmt (Elson, J. Immunol. Meth., 67 : 101-108,
1984). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren in Verbindung
mit der Beschreibung und den Beispielen erläutert.
Fig. 1 Schematische Darstellung der spontanen Bildung
zweier Subpopulationen/Phasen (A und B) eines zellulären Le
bendimpfstoffs.
Die Figur zeigt idealisiert die exponentielle Vermehrung
einer Zelle des Lebendimpfstoffs (z. B. eines Bakteriums),
die ein erfindungsgemäßes genetisches Element trägt, das zur
spontanen Bildung zweier Subpopulationen/Phasen A (offene
Ellypsen) und B (geschlossene Ellypsen) führt. Während Zellen
in der Phase A vermehrungsfähig und daher infektionsfä
hig bleiben, bilden spontan entstandene Zellen der Phase B
große Mengen zusätzliches Antigen, welches einerseits zur
Induktion einer zusätzlichen Immunantwort führt, andererseits
aber die weitere Vermehrung der Phase B möglicherweise
hemmt. In dem dargestellten Fall beträgt Häufigkeit der Bil
dung der Phase B etwa 20%.
Fig. 2 Beispiel einer spezifischen DNA-Deletion im Sinne
des Modells I der Erfindung unter Berücksichtigung der Rolle
des Steuerenzyms.
X stellt das Antigen kodierende Gen dar, das in Phase A von
seinem Promotor (Px) durch ein transkriptionsterminierendes
Segment (U) getrennt ist und daher nicht exprimiert wird,
während in Phase B der Promotor unmittelbar vor dem Gen X
positioniert ist, so daß dieses exprimiert wird. Die Dele
tion des DNA-Segments U erfolgt durch ortsspezifische Rekom
bination an den Stellen IRS ("interne Resolutionsstellen"
des Transposons Tn3) durch das Enzym Resolvase (TnpR des
Transposons Tn3; hier: geschlossenes, nach unten gerichtetes
Dreieck). Dabei ist wichtig, daß die beiden IRS-Stellen, de
ren Nukleotidsequenz definiert ist, gleich orientiert und
vorzugsweise innerhalb einiger 100 bis 1000 Basenpaare auf
demselben DNA-Molekül lokalisiert sind. Die Häufigkeit des
Deletionsereignisses kann durch eine Reihe von Faktoren
festgelegt werden, beispielsweise durch leichte Sequenzver
änderungen eines oder beider IRS-Stellen oder durch die in
der Zelle vorliegende Menge an Resolvase. Die vorliegende
Menge dieses Enzyms wiederum hängt von der Effizienz der Ex
pression des Resolvase kodierenden Gens R ab. Sofern dieses
Gen in Verbindung mit seinem Promotor (PR) einen Operator
(OR) besitzt, auf dem Transkriptionsregulatoren binden kön
nen, ist es prinzipiell möglich, die Häufigkeit der DNA-Re
organisation (Deletion des Segments U) über die Expressions
stärke des Steuerenzym kodierenden Gens (R) durch äußere
Einflüsse, z. B. die Temperatur, zu regulieren.
Fig. 3 Beispiel einer spezifischen DNA-Inversion im Sinne
des Modells II der Erfindung.
Die Gene X und Y stellen Antigen kodierende Gene dar, die
z. B. auf einem Plasmid eines hybriden bakteriellen Lebend
impfstoffs in beliebiger Anordnung enthalten sind. Diesen
Genen sind Promotoren (Px und Py) vorgeschaltet, die für be
stimmte RNA-Polymerasen (z. B. die Polymerase des Phagen T7)
spezifisch sind, die von dem Lebendimpfstoff/der Bakteri
enzelle an sich nicht gebildet werden. In Phase A können die
Gene X und Y nicht exprimiert werden, da die spezifische Po
lymerase fehlt. Allerdings enthält der Lebendimpfstoff/die
Bakterienzelle das Gen (S), das für diese Polymerase ko
diert. Das Gen S kann nun z. B. durch DNA-Inversion aktiviert
werden, indem durch die Inversion eines Segments der Promo
tor Ps unmittelbar vor das Polymerasegen S positioniert
wird, so daß dieses exprimiert wird. Die Inversion des Pro
motor enthaltenden DNA-Segments wird (z. B. in Analogie zum G
Segment des Bakteriophagen Mu) durch ein Enzym
(Gin/Invertase) katalysiert, das an wohldefinierten Ziel-
Stellen (IR/"inverted repeats"), die auf der DNA entgegenge
setzte Orientierung besitzen, angreift. Die Häufigkeit, mit
der die Inversion des Promotor tragenden Fragments erfolgt,
hängt von mehreren Faktoren ab (u. a. der Menge der in der
Zelle vorhandenen Invertase und der Struktur der IR-Stellen,
an denen sie angreift) und kann durch gentechnische Manipu
lation individuell eingestellt bzw. verändert werden. In
diesem Beispiel initiiert also die ortsspezifische Inversion
eines DNA-Segments eine Kaskade, die letztlich die Aktivie
rung der Antigen kodierenden Gene X und Y bewirkt.
Fig. 4 Beispiel eines erfindungsgemäßen genetischen Ele
ments für einen bakteriellen Lebendimpfstoff und dessen Wir
kungsweise.
In der Figur bedeuten die Zeichnungen A und B die beiden
Phasen eines invertierbaren Elements, entsprechend wie die
ses nach Einführung in einen Bakterienstamm in den Subpopu
lationen A bzw. B vorliegen kann. Das dargestellte Element
entspricht im wesentlichen dem Modell I (unmittelbare Ex
pression des Antigen-Gens) und besitzt eine übergeordnete
regulatorische Kontrollfunktion, die von der Temperatur als
äußerem Einfluß abhängt. In Phase A ist der für die Expres
sion des Antigen-Gens verantwortliche Promotor Pl (PL) in
die Richtung des cI857-Gens, das für einen übergeordneten
temperatursensitiven Repressor kodiert, und des gin-Gens,
das für das Steuerenzym kodiert, gerichtet. Dies hat zur
Folge, daß bei der permissiven Temperatur von 28°C funk
tionsfähiger Repressor gebildet wird, der die Transkription
vom Pl-Promotor (PL) vermindert. Bei erhöhter Temperatur
(z. B. 37°C) erhöht sich die Transkription des Pl-Promotors
(PL), da der Repressor unter derartigem äußeren Einfluß min
destens partiell inaktiviert ist. Die temperaturabhängige
Erhöhung der Transkription bedingt auch eine entsprechende
Erhöhung der Expression des nachgeschalteten gin-Gens, das
als Steuerenzym die Inversion des Promotors an die Ziel-
Stellen katalysiert. Demnach erhöht sich durch erhöhte Tem
peratur auch die Häufigkeit der Inversion des Promotors und
damit der Übergang des invertierbaren Elements in Phase B.
Allerdings ist auch bei erniedrigter Temperatur die Inver
sion nicht völlig unterbunden, da das gin-Gen ohnehin immer
leicht exprimiert wird, und darüber hinaus auch weil gewöhn
lich die als Lebendimpfstoff benutzte Wirtszelle selbst ein
aktives gin-ähnliches Gen besitzt.
Die Inversion des Promotors bedingt einerseits, daß weniger
Repressor und weniger Steuerenzym gebildet werden, und ande
rerseits, daß das Antigen kodierende Gen (CT-B) mittels des
invertierten Promotors sowie aufgrund der geringeren Bildung
des cI Repressors stark exprimiert wird.
In dem genannten Beispiel ist das invertierbare Element in
dem Salmonella typhimurium Lebendimpfstoff (SL3235) auf dem
Plasmid pYZ17 enthalten. Da dieses Plasmid in mehreren Ko
pien pro Bakterienzelle vorliegt, können in einer einzigen
Bakterienzelle sowohl Elemente der Phase A als auch der
Phase B vorliegen. Dadurch ergeben sich zusätzliche Wechsel
wirkungen zwischen den Plasmiden der Phasen A und B, die
eine Auftrennung des Lebendimpfstoffs nicht nur in zwei Sub
populationen, sondern auch dazwischenliegende Intermediate
bewirken. Falls erwünscht kann dies leicht durch Integration
des invertierbaren Elements in das Chromosom des Lebendimpf
stoffs bzw. durch Klonierung des Elements auf einem "single
copy" Plasmid bewerkstelligt werden.
Zur weiteren Funktionsanalyse des im Plasmid pYZ17 enthalte
nen invertierbaren Elements auf dem Plasmid pYZ17 siehe auch
Fig. 5 und Tab. 1. In der Zeichnung bedeuten: Eco, EcoRI Re
striktionsschnittstellen zur Analyse des Phasenzustandes den
invertierbaren Elements; gin (im Text auch gin), das
Steuerenzym (Invertase) kodierende Gen; T, Transkriptions
terminatoren zur Verminderung der Genexpression; cI (im Text
genauer mit cI857 bezeichnet), das den temperatursensitiven
Regulator (Repressor) kodierende Gen; IR, die Ziel-Stellen
der Invertase ("inverted repeats"); PL (im Text auch mit Pl
bezeichnet), der invertierbare, durch den cI857-Repressor
temperaturregulierbare Promotor; CT-B, das Antigen
(V.cholerae Toxin B-Untereinheit) kodierende Gen (ctxB).
Fig. 5 Diese Figur zeigt eine Immunoblot-(Western)-Analyse
der Bildung von CT-B Antigen in hybriden S.typhimurium
SL3235 Zellen. In der Figur sind in Spur 1 20 ng gereinigtes
CT-B Antigen von Sigma als Referenz bzw. in Spuren 2 bis 6
Bakterienlysate entsprechend 2,5 × 107 Zellen dargestellt;
Spur 2, S.typhimurium SL3235 gezüchtet bei 37°C; Spur 3, S.typhimurium SL3235 (pTK1) gezüchtet bei 28°C; Spur 4, S.typhimurium SL3235 (pTK1) gezüchtet bei 37°C; Spur 5, S.typhimurium SL3235 (pYZ17) gezüchtet bei 28°C; Spur 6, S.typhimurium SL3235 (pYZ17) gezüchtet bei 37°C.
Spur 2, S.typhimurium SL3235 gezüchtet bei 37°C; Spur 3, S.typhimurium SL3235 (pTK1) gezüchtet bei 28°C; Spur 4, S.typhimurium SL3235 (pTK1) gezüchtet bei 37°C; Spur 5, S.typhimurium SL3235 (pYZ17) gezüchtet bei 28°C; Spur 6, S.typhimurium SL3235 (pYZ17) gezüchtet bei 37°C.
Position "a" bezeichnet eine unspezifische Kreuzreaktion im Blot, Po
sition "b" den Vorläufer des CT-B Antigen und Position "c"
das reife CT-B Antigen. Die Gewinnung der Proben und die
Durchführung des Immunoblots erfolgten nach Klauser (EMBO J.
9 : 1991-1999, 1990).
Es ist ersichtlich, daß S.typhimurium SL3235 (pYZ17) bei
28°C im Gegensatz zu 37°C nur sehr wenig CT-B Antigen produ
ziert. Es ist weiterhin ersichtlich, daß im Gegensatz hierzu
die Bildung von CT-B Antigen im Vergleichstamm S.typhimurium
SL3235 (pTK1) temperaturunabhängig ist und daß in diesem
Stamm im Verhältnis zu S.typhimurium SL3235 (pYZ17), der bei
37°C gezüchtet wurde, weniger CT-B Vorläuferprotein ange
häuft wird. Letzteres spiegelt die Bildung von wenig CT-B
Antigen in Subpopulation A und viel CT-B Antigen in Subpopu
lation B in S.typhimurium SL3235 (pYZ17), der bei 37°C ge
züchtet wurde, wider: Die Bildung von viel CT-B in nur weni
gen Zellen führt zu einem Stau in der Umwandlung von Vorläu
fer in reifes CT-B Antigen.
Tab. 1 Humorale Immunantwort nach Immunisierung von BALB/c
Mäusen nach oraler Immunisierung mit hybriden Salmonella
typhimurium SL3235 Stämmen.
Die Ergebnisse des in Beispiel 2 dargestellten Experiments
sind wiedergegeben. Die angegebenen Antikörpertiter entspre
chen denjenigen Verdünnungsstufen der Proben, die gerade
noch einen positiven Nachweis im ELISA-Test ergeben.
Claims (30)
1. Hybrider Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß er
zwei Subpopulationen (A und B) aufweist, wobei Popula
tion A infektionsfähig ist und an sich immunogen wirkt,
während Subpopulation B, die von Subpopulation A regene
riert wird, zusätzliches Antigen produziert und in bezug
auf dieses zusätzliche Antigen immunogen wirkt.
2. Lebendimpfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Subpopulation B in einer Häufigkeit von 0,1% bis
50% pro Zelle und Zellgeneration vorliegt.
3. Lebendimpfstoff nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß er eine rekombinante DNA umfaßt, die die
Subpopulation A und B erzeugt.
4. Lebendimpfstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die rekombinante DNA in einem zellulären Lebendimpf
stoff enthalten ist.
5. Lebendimpfstoff nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die rekombinante DNA in einem viralen Lebendimpf
stoff enthalten ist und nach Infektion einer Zelle zum
Ausdruck gebracht wird.
6. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die rekombinante DNA in einer oder mehreren Kopien
in dem zellulären Lebendimpfstoff enthalten ist.
7. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die rekombinante DNA in dem zellulären Lebendimpf
stoff auf einem Plasmid enthalten ist.
8. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die rekombinante DNA im Chromosom des zellulären Le
bendimpfstoffs enthalten ist.
9. Lebendimpfstoff nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der zelluläre Lebendimpfstoff ein Bakterium oder
eine eukaryontische Zelle (z. B. eine Pilzzelle) dar
stellt.
10. Lebendimpfstoff nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß das Bakterium oder die eukaryontische Zelle einen
attenuierten Krankheitserreger darstellt.
11. Verfahren zur Herstellung eines hybriden Lebendimpfstof
fes, dadurch gekennzeichnet, daß man den Lebendimpfstoff
in zwei Subpopulationen (A und B) aufspaltet, wobei Po
pulation A infektionsfähig ist und an sich immunogen
wirkt, während Subpopulation B, die von Subpopulation A
regeneriert wird, zusätzliches Antigen produziert und in
bezug auf dieses zusätzliche Antigen immunogen wirkt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß
die Aufspaltung des Lebendimpfstoffs in zwei Subpopula
tionen durch spontane DNA-Reorganisation in der DNA des
Lebendimpfstoffs erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die DNA-Reorganisation auf einem spezifischen DNA-Inver
sionsvorgang beruht.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die DNA-Reorganisation auf einem spezifischen DNA-Dele
tionsvorgang beruht.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die DNA-Reorganisation auf einem spezifischen DNA-Repli
kationsvorgang beruht.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die DNA-Reorganisation auf "slipped-strand-mispairing"
beruht.
17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die spontane DNA-Reorganisation durch ein Steuerenzym
katalysiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß
die Häufigkeit der spontanen DNA-Reorganisation durch
Regulation des Steuerenzyms übergeordnet kontrolliert
wird.
19. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
die Erzeugung der Subpopulation B mit einer Häufigkeit
zwischen 0,1% und 50% pro Zelle und Zellgeneration er
folgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation unmittelbar
zur Bildung von zusätzlichem Antigen in Subpopulation B
führt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 19, dadurch
gekennzeichnet, daß die DNA-Reorganisation eine Kaska
denreaktion initiiert und mittelbar zur Bildung von zu
sätzlichem Antigen in Subpopulation B führt.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß
die Kaskade durch Bildung einer spezifischen Polymerase
initiiert wird, wobei letztere unmittelbar oder mittel
bar die Expression des/der Antigen kodierenden Gen(e)
bewirkt.
23. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß
die Kaskade durch Bildung eines spezifischen Genregula
tors initiiert wird, der unmittelbar oder mittelbar die
Expression der/des Antigen kodierenden Gen(e) bewirkt.
24. Rekombinante DNA, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen
Lebendimpfstoff nach Anspruch 1 erzeugt.
25. Rekombinante DNA nach Anspruch 24, dadurch gekennzeich
net, daß sie in einem zellulären Lebendimpfstoff enthal
ten ist.
26. Rekombinante DNA nach Anspruch 24, dadurch gekennzeich
net. daß sie in einem viralen Lebendimpfstoff enthalten
ist und nach Infektion einer Zelle zum Ausdruck gebracht
wird.
27. Rekombinante DNA nach Anspruch 25, dadurch gekennzeich
net, daß sie in ein oder mehreren Kopien in dem zellulä
ren Lebendimpfstoff enthalten ist.
28. Rekombinante DNA nach Anspruch 25, dadurch gekennzeich
net, daß sie in dem zellulären Lebendimpfstoff auf einem
Plasmid enthalten ist.
29. Rekombinante DNA nach Anspruch 25, dadurch gekennzeich
net, daß sie im Chromosom des zellulären Lebendimpf
stoffs enthalten ist.
30. Verfahren zur Immunisierung eines Säugers mit einem hy
briden Lebendimpfstoff, dadurch gekennzeichnet, daß man
einen Lebendimpfstoff gemäß einem der Ansprüche 1-10
einsetzt.
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