DE69533334T3

DE69533334T3 - Impfstoff zum Auflösen einer Immunreaktion auf ein tumorspezifisches Antigen

Info

Publication number: DE69533334T3
Application number: DE69533334.8T
Authority: DE
Inventors: Yvonne Paterson
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1994-11-08
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 2014-11-13
Anticipated expiration: 2015-11-04
Also published as: JPH10509448A; EP0790835A4; ATE272407T1; JP3995712B2; US20030202985A1; CA2204666A1; US6565852B1; DE69533334D1; EP0790835A1; WO1996014087A1; CA2204666C; US7135188B2; DE69533334T2; US6051237A; EP0790835B2; JP2007254485A; EP0790835B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Das Stimulieren einer Immunreaktion ist abhängig von der Gegenwart von Antigenen, die vom Wirts-Immunsystem als fremd erkannt werden. Die Entdeckung der Existenz von tumorspezifischen Antigenen hat jetzt die Möglichkeit, das Immunsystem eines Wirts zu verwenden, um in das Tumorwachstum einzugreifen, erhöht. Verschiedene Mechanismen, die sich der humoralen und zellulären Waffen des Immunsystems bedienen, werden gegenwärtig für die Krebsimmuntherapie untersucht.
Elemente der zellulären Immunreaktion sind in der Lage, Tumorzellen spezifisch zu erkennen und zu zerstören. Die Isolierung von cytotoxischen T-Zellen (CTC) aus tumorinfiltrierenden Zellpopulationen oder aus peripherem Blut legt nahe, dass solche Zellen eine wichtige Rolle bei der natürlichem Immunabwehr gegen Krebs spielen (Cheever et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 1993, 690: 101–112). insbesondere von CD+8 T-Zellen (TCD8+), die die Moleküle der Klasse 1 der Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-tragenden Peptide aus 8 bis 10 Resten, die aus Proteinen abstammen, die in den Cytosolen lokalisiert sind, erkennen, wird angenommen, daß sie eine wichtige Rolle bei dieser Reaktion spielen. Es gibt jetzt zahlreiche Beispiele sowohl für Maus- als auch menschliche TCD8+-Zellen, die spezifisch Tumorzellen erkennen und eine therapeutische Aktivität nach der Adoptivübertragung aufweisen, wobei in einigen Fällen vollständige Remission induziert wird. Trotz des Potentials von T-Zellen, Tumore auszulöschen, ist es jedoch wegen des fortschreitenden Wachstums der meisten Krebsarten offensichtlich, dass viele Tumore der Erkennung durch TCD8+ in vivo entkommen. Die Induktion von ausreichenden T-Zellen in vivo war nicht sehr effektiv. Obgleich bei einer Vielzahl von Tumoren festgestellt wurde, dass sie immunogen sind, wurde die Stimulation einer effektiven Antitumor-Immunreaktion nicht festgestellt.
Eine Erklärung für dieses Phänomen besteht darin, dass Tumore in der Lage sein können, antigenspezifische Signale an T-Zellen, aber nicht die costimulierenden Signale abzugeben, die für die vollständige Aktivierung von T-Zellen erforderlich sind. Costimulierung von T-Zellen tritt auf, wenn ein Oberflächenmolekül, B7, das auf den Zellen vorhanden ist, mit einem T-Zellmolekül, bekannt als CD28, wechselwirkt. Es wurde beobachtet, dass T-Zellen, die das antigenspezifische Signal (aber nicht B7) aufnehmen, unreaktiv werden. Viele Tumorzellen tragen kein B7-Protein, weshalb B7 zu den Krebszellen zugerechnet wurde (Travis, J., Science, 1993, 259, 310–311). Es wurde gezeigt, dass das Exprimieren des Costimulatorliganden B7 auf Melanomzellen die Abstoßung eines Rattenmelanoms in vivo induziert (Townsend, S. E., und Allison, J. P., Science 1993, 259, 368–370). Es wurde festgestellt, dass diese Abstoßung durch CD8+ T-Zellen vermittelt wird; CD4+ T-Zellen waren nicht beteiligt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die B7-Expression die Tumorzellen zur effektiven Antigenproduktion befähigt, was zu ihrer Auslöschung in vivo führt.
Die Wirkungen der lokalisierten Absonderung von Cytokinen auf die Tumorweiterentwicklung wurden auch untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Absonderung von niedrigen Gehalten an Interleukin-2 (IL-2) in einer Mäuse-Fibrosarkom-Zelllinie, die mit dem menschlichen IL-2-Gen, das über einen retroviralen Vektor eingeführt wurde, transfiziert wurde, die Tumorbildung dieser Zellen außer Kraft setzt, und eine langandauernde schützende Immunreaktion gegen die nachfolgende Herausforderung mit einer tumorbildenden Dosis der Stammzellen induziert (Gansbacher et al., J. Exp. Med. 1990, 172, 1217–1224). In einer anderen Untersuchung wurden Zellen aus einem spontan wachsenden Rattennierentumor erzeugt, um große Dosen an Interleukin-4 (IL-4) lokal abzusondern (Golumbek et al., Science 1991, 254, 713–716). Tiere, die mit diesen Tumorzellen injiziert wurden, haben die mit IL-4 transfizierten Tumore in einer vorwiegend T-Zellen-unabhängigen Art abgestoßen. Diese Tiere entwickelten jedoch eine T-Zellen-abhängige systemische Immunität gegenüber dem Stammtumor. Die systemische Immunität war tumorspezifisch und wurde durch CD8+ T-Zellen vermittelt. Diese Experimente legen nahe, dass es möglich sein könnte, die Stammtumore durch Erzeugen einer systemischen Immunreaktion durch Injizieren der genetisch entwickelten Tumorzellen zu heilen.
Es gibt auch Hinweise darauf, die nahelegen, dass einige Tumorzellen niedrige Gehalte an Klasse I-Molekülen in vivo und in vitro exprimieren. Intrazelluläre Antigene müssen vor der Bindung an CD+8 T-Zellen durch Haupthistokompatibilitätskomplex(MHC)-Klasse I-Moleküle behandelt werden. Die Wirksamkeit der Antigenverarbeitung von 26 verschiedenen menschlichen Tumorlinien wurde untersucht (Restifo et al., J. of Exp. Med. 1993, 177, 265–272). Drei verschiedene Zelllinien, alles menschliche Kleinzellen-Lungenkarzinome, waren einheitlich nicht in der Lage, endogen synthetisierte Proteine für die Präsentation an T-Zellen zu verarbeiten. Pulsregistrierende Experimente zeigten, dass MHC-Klasse I-Moleküle nicht von diesen Zelllinien aus dem endoplasmatischen Retikulum zur Zelloberfläche transportiert wurden. Die Northern Blot-Analyse zeigte, dass diese Zellen wenig oder kein mRNA enthielten, das MHC-kodierte Proteosome und Transportergene kodiert. Die Behandlung mit Interferon γ verstärkte das Exprimieren dieser mRNAs und kehrte die beobachteten funktionellen und biochemischen Defizite um. Somit wurden potentielle therapeutische Anwendungen vorgeschlagen, welche das Verstärken der Antigenverarbeitung auf der Stufe der Transkription von MHC-kodierten Proteosomen und Transportergenen umfassen. Das Immunisieren von Patienten mit rekombinanten BCG (Bazillus Calmette-Guèrin)- oder Salmonella-Bakterien, die ein Gen tragen, das ein Antigenpeptid kodiert, wurde auch als orale Tumorimmuntherapie vorgeschlagen (Bonn et al., Annu. Rev. Immunol. 1994, 12, 337–65). Es wurde gezeigt, dass oral verabreichter lebender, attenuierter rekombinanter Salmonellenimpfstoff, welcher die vollständige Länge von P. Berghei Circumsporozit-Antigen exprimiert, Mäuse gegen Malaria schützt. Diese Immunreaktion wurde durch die Induktion von CD8+ T-Zellen vermittelt (Aggarwal et al., J. of Exp. Med. 1990, 172, 1083–1090). Es wurde vorgeschlagen, dass die lebende attenuierte Salmonellenrekombinante bei der Untersuchung anderer Krankheiten, in denen die CTC-vermittelte Immunität wichtig sein kann, nützlich sein kann, doch wurden keine anderen Experimente veröffentlicht. BCG wurde auch als neuartiger lebender Impfstoffträger vorgesehen, welcher sich als nützlich beim Stimulieren sowohl von humoraler als auch zellulärer Immunreaktion auf eine große Vielzahl an viralen, bakteriellen und Protozeen-Antigenen bewiesen hat (Stover et al., Nature 1991, 351, 456–460).
Int. J. Cancer, 1992, Brassuer et al., beschreiben die Verwendung von MAGE-1 als Marker für Brustkrebs.
J. National Cancer Inst., 1975, Bast et al., beschreiben lebensfähige Listeria monocytogenes in einem Impfstoff zur Verwendung bei der Rückbildung von Tumoren und Schutz gegen Tumore.
Infection and Immunity, 1992, Barry et al., beschreiben, daß eine nichttödliche Infektion stattfinden muss, wenn lebensfähiges Listeria monocytogenes als schützender Impfstoff gegen anschließende Reize durch Listeria monocytogenes verwendet werden soll.
Das US-Patent 4 777 239 beschreibt 17 Peptide, welche bei der Diagnose und Therapie von HPV-Infektionen, einschließlich daraus resultierendem Krebs, verwendet werden können.
Das US-Patent 4 816 253 beschreibt einen getöteten Mutantenstamm von Listeria monocytogenes, welcher als Immunreaktion-verstärkendes Mittel, das in der Krebsimmuntherapie nützlich ist, verwendet werden kann.
Das US-Patent 5 342 774 beschreibt das Vorliegen von MAGE und MZ2-E in Tumorzellen.
J. Immunology, 1992, Schafer et al., beschreiben lebensfähiges Listeria monocytogenes, das β-Galactosidase exprimiert.
WO 93/15212 beschreibt die Verwendung eines attenuierten Mutanten von Listeria monocytogenes zur Verwendung in einem Impfstoff gegen Viren, Bakterien und Parasiten.
Infection and Immunity, 1979, Dustoor et al., beschreiben die Verwendung von lebenden Listeria monocytogenes, um das Tumorwachstum zu inhibieren.
Es wurde nun festgestellt, dass die Immunreaktion auf ein tumorspezifisches Antigen durch Verabreichung eines Impfstoffvektors induziert werden kann, der eine rekombinante Form des intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes umfasst, welches ein tumorspezifisches Antigen oder Fragment davon exprimiert und sezerniert. Es wurde festgestellt, dass dieser Impfstoffvektor nützlich ist bei der Verkleinerung der Größe von existierenden Tumoren und beim Inhibieren der Bildung von primären Tumoren. Keine andere Stimulierung und anschließende Antigenerzeugung war erforderlich, um diese Reaktion zu induzieren.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Impfstoff (Vakazin) zur Behandlung von Krebs oder zur Hemmung der Bildung von Tumoren durch Auslösen einer Immunreaktion auf ein tumorspezifisches Antigen in einem menschlichen Wirt zur Verfügung gestellt, wobei der Impfstoff rekombinantes Listeria monocytogenes umfasst, das durch homologe Rekombination hergestellt wurde, und in der Lage ist, ein tumorspezifisches Antigen oder ein Fragment davon zu exprimieren oder sezerbieren, wobei die homologe Rekombination im Listeria monocytogenes-Chromosom stattfindet, und die Bakteriumgene, die für das Wachstum und die Verbreitung von Listeria monocytogenes erforderlich sind, nicht spaltet.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung bei der Herstellung eines Impfstoffs (Vakazins) zur Behandlung von Krebs oder zur Hemmung der Bildung von Tumoren durch Induzierung einer Immunreaktion auf ein tumorspezifisches Antigen zur Verfügung gestellt, wobei der Impfstoff ein rekombinantes Listeria monocytogenes umfasst, das durch homologe Rekombination hergestellt wird, und das in der Lage ist, ein tumorspezifisches Antigen oder ein Fragment davon zu exprimieren und sezernieren, wobei die homologe Rekombination im Listeria monocytogenes-Chromosom stattfindet, und die bakteriellen Gene, die für das Wachstum und die Verbreitung von Listeria monocytogenes erforderlich sind, nicht spaltet.
Vorzugsweise wird der Impfstoff in einen pharmazeutisch geeigneten Träger eingebracht.
Normalerweise ist die rekombinante Form von Listeria monocytogenes in der Lage, die tumorspezifischen Antigene bcr/abl, HPVE6, E7, MZ2-E, MAGE-1 oder MUC-1 zu exprimieren.
In bevorzugten Ausführungsformen ist der Tumor ausgewählt aus Leukämie, Gebärmutterhalskrebs, Melanom, Brustkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 bis 4 zeigen Liniendiagramme aus Experimenten, bei denen Mäuse entweder mit Kochsalzlösung (•), L. monocytogenes
oder rekombinantem L. monocytogenes, das so transformiert wurde, dass es Influenza Nucleoprotein (LM-NP) (♦) exprimiert, immunisiert wurden und anschließend entweder mit CT26 oder RENCA, welche mit dem gleichen Influenza-Nucleoprotein(LMNP)-Gen transfiziert worden waren, das verwendet wurde, um L. monocytogenes-Vektor (CT26-NP bzw. RNCA-MP) zu transformieren, oder mit der CT26- oder RENCA-Stammlinie, gereizt wurden.
1 zeigt Daten aus den Experimenten, bei denen Mäuse in jeder Immunisierungsgruppe mit Stamm-RENCA gereizt wurden.
2 zeigt Daten aus Experimenten, in denen Mäuse in jeder Immunisierungsgruppe mit Stamm-CT26 gereizt wurden.
3 zeigt Daten aus Experimenten, in denen Mäuse aus jeder Immunisierungsgruppe mit RENCA gereizt wurden, das mit dem gleichen NP transfiziert worden war, das verwendet wurde, um L. monocytogenes (RENCA-NP) zu transformieren.
4 zeigt Daten aus Experimenten, worin Mäuse aus jeder Immunisierungsgruppe mit CT26 gereizt wurden, das mit dem gleichen NP transfiziert worden war, das verwendet wurde, um L. monocytogenes (CT26-NP) zu transformieren.
5 ist ein Balkendiagramm, das Daten aus Experimenten zeigt, in denen gezeigt wurde, dass CTL, erzeugt durch Immunisieren von Balb/c-Mäusen mit LM-NP die Tumorzellen CT26 und RENCA, die NP in vitro exprimieren, töten kann. 5A zeigt Effektoren, die mit A/PR/8 stimuliert wurden. 5B zeigt Effektoren, die mit Peptiden stimuliert wurden.
6 ist ein Balkendiagramm, das Daten aus Experimenten zeigt, bei denen gezeigt wurde, dass das Immunisieren mit LM-NP das Eliminieren des RNCA-NP-Tumorwachstums hervorruft.
7 ist ein Balkendiagramm, das Daten aus Experimenten zeigt, in denen gezeigt wird, dass die Immunisierung mit LM-NP den Stillstand des CT26-NP-Tumorwachstums bewirkt.
8 ist ein Balkendiagramm, das Daten aus Experimenten zeigt, in denen gezeigt wurde, dass das Inhibieren des Tumorwachstums durch CD8+ T-Zellen bewirkt wird.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Es wurde gezeigt, dass die Immunreaktion auf L. monocytogenes eine TH1-, CD4+ T-Zellen- und CD8+ T-Zellenreaktion war, wobei nur sehr wenig humorale Reaktionen erzeugt wurden. Rekombinante Formen des Wildform-Bakteriums wurden entwickelt, welche die fremden Proteine β-Galactosidase (Schafer et al., J. Immunol., 1992, 149, 53–59), Influenza-Nucleoprotein und HIV gag und nef-Genprodukt exprimieren. Rekombinante Verfahren wurden entwickelt, um diese Proteine stabil in das Listeriachromosom so einzubringen, dass sie vom Bakterium ausgeschieden werden. Alle diese rekombinanten Vektoren verursachen starke, antigenspezifische CTC-Reaktionen in vivo. Somit dient dieses Bakterium als idealer Impfstoffvektor zum Verstärken der CTC-Reaktion auf tumorspezifische Proteine und als einzigartiges System, um die zelluläre Immunreaktion als Impfstoff gegen Krebs zu starten.
Die Verabreichung eines lebenden Vektors, wie beispielsweise L. monocytogenes, führt zu einer langandauernden zellulären Immunität, welche häufig nicht mit abgetöteten Präparaten oder löslichen Proteinen und Hilfsmitteln induziert werden kann. Ein einzigartiges Merkmal des Lebenszyklus von L. monocytogenes ist, dass er in Wirtszellen eindringt und von einem Phagosom aufgenommen wird, aus dem er austritt und dann lebt und sich im Cytoplasma repliziert. Tilney, L. G. und D. A. Portnoy, J. Cell Biol., 1989, 109, 1597. Somit stellt der L. monocytogenes-Vektor die Fähigkeit zur Verfügung, fremde Proteine und Fragmente der Proteine auf den Klasse I-MHC-eingeschränkten Weg zu führen. L. monocytogenes, das zusätzlich ein effektiverer Vektor ist, und das ein gram-positiver Organismus ist, ist auch viel sicherer als viele andere lebende Vektoren, da es gegenüber den meisten Antibiotika, einschließlich Penicillin, sehr empfänglich ist. Es hat auch nicht die Probleme, die mit der Toxizität von Endotoxin verbunden sind, die bei gram-negativen Vektoren, wie beispielsweise Salmonella sp. auftreten. Vorher vorhandene Immunität, die eine wirksame Verstärkung durch einen Vektor, welcher schon im weiten Bereich als Impfstoff verwendet wird, beispielsweise Vaccinia oder BCG, verhindern könnte, ist wahrscheinlich kein Problem bei L. monocytogenes, welcher vorher noch nicht in der Impfstoffentwicklung verwendet wurde. Mutantenstämme von L. monocytogenes, welche nicht-virulent, aber immer noch schützend sind, sind auch erhältlich, um als potentielle Impfstoffkandidaten getestet zu werden.
Unter Verwendung eines Ratten-Modellsystems wurde festgestellt, dass L. monocytogenes eine Immunreaktion gegen ein Protein auslösen kann, das durch Tumorzellen exprimiert wird. Diese Immunreaktion verursacht das Abstoßen transferierter Tumorzellen bei gesunden, immunisierten Mäusen und bewirkt Tumorwachstum in Mäusen, in welchen das Tumorwachstum schon ausgelöst wurde. Siehe 3 bis 7.
Die Fähigkeit eines Impfstoffs, der rekombinantes L. monocytogenes umfasst, spezifische schützende Immunität gegen das Wachstum von CT26, einen kolorektalen Karzinomtumor der Maus, und RENCA, ein Rattennierenkarzinom, zu verleihen, wurde untersucht. In vorläufigen Experimenten wurde L. monocytogenes so verändert, dass es Nucleoprotein (NP) aus A/PR/8/34 als Fusionsprotein mit einem hauptsächlich abgeschiedenen Listerialprotein, Listeriolysin O (LLO), das Produkt des Hämolysingens, ausscheidet. LLO wird normalerweise durch L. monocytogenes in einer Wirtsvakuole exprimiert und abgeschieden, und wird benötigt, damit das Bakterium in das Cytoplasma ausweichen kann. Die Fähigkeit der NP-ausscheidenden L. monocytogenes-Rekombinanten, den Klasse I-Weg der Antigenverarbeitung zur Erkennung durch überwiegend influenzaspezifische T-Zellen aus den drei Mausstämmen zu dirigieren, wurde getestet. Es wurde festgestellt, dass die LLO-NP-Fusionsproteine in geeigneter Weise für die Präsentation von den drei MHC-Klasse I-Haploarten verarbeitet werden, auf die die A/PR/8/34-Reaktion begrenzt ist, d. h. von K^d, D^b und K^k. Es wurde gezeigt, dass die Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit variierenden Dosen von LM-NP zu einer starken Anti-NP CTC-Reaktion führt.
In weiteren Experimenten wurden die Mäuse in drei Gruppen aufgeteilt. Eine Gruppe wurde mit einem Zehntel der LD₅₀ von L. monocytogenes der Wildform immunisiert, eine Gruppe wurde mit steriler Kochsalzlösung immunisiert, und die dritte Gruppe wurde mit rekombinantem L. monocytogenes-Impfstoffvektor immunisiert, welcher transformiert war, um Influenza-Nucleoproteine (LM-NP) auszuscheiden. Nach zwei Wochen erhielt jede Gruppe die gleiche auffrischende Immunisierung. Es wurde festgestellt, dass dieses Immunisierungsschema starke CTC-Reaktionen gegen Influenza-Nucleoprotein bewirkte. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere einer jeden Gruppe subkutan mit einer Krebszellen-zerstörenden Dosis von entweder CT26 oder RENCA, welche mit dem gleichen Influenza-Nucleoproteingen transfiziert worden waren, das verwendet wurde, um L. monocytogenes-Vektor (CT26-NP bzw. RENCA-NP) zu transfizieren, oder mit der CT26 oder RENCA-Stammlinie, gereizt. Das Tumorwachstum wurde aufgezeichnet. Wie in den 3 und 4 gezeigt ist, waren Tiere, welche LM-NP als Impfstoff erhalten hatten, und welche mit dem relevanten Tumorzellen-exprimierenden NP gereizt wurden, vor weiterer Tumorbildung geschützt. In der CT26-NP-Gruppe zeigten nach 25 Tagen 6 der Tiere kein nachweisbares Tumorwachstum. 3 hatten Tumore von weniger als 5,0 mm, und eines hatte einen Tumor von 9,0 mm (siehe 4). In der RENCA-NP-Gruppe zeigte keines der Tiere irgendwelche Anzeichen von Tumorwachstum (siehe 3). Im Gegensatz dazu entwickelten alle Mäuse in den anderen Gruppe Tumore zwischen 1,5 und 3,0 cm (siehe 1 und 2).
Die Fähigkeit von LM-NP, Rückbildung und Zerstörung von vorhandenen Tumoren zu bewirken, wurde auch gezeigt. Tumorzellen (entweder CT26- oder RENCA-Zellen) wurden subkutan in Mäuse injiziert. Nach der Bildung von messbaren Tumoren wurden die Mäuse in drei separate Gruppen aufgeteilt. Eine erste Gruppe von Mäusen erhielt LM-NP; eine zweite Mäusegruppe erhielt die Wildform Listeria monocytogenes, und eine dritte Gruppe Mäuse erhielt keine weitere Behandlung. Den Mäusen in den Gruppen 1 und 2 wurde eine nachfolgende Auffrischung mit entweder LM-NP bzw. die Wildform von Listeria monocytogenes verabreicht. Wie in den 6 und 7 gezeigt, zeigten nur die Mäuse, die den LM-NP-Impfstoff erhielten, Rückbildung des Tumorwachstums bis zu einem Punkt, wo der Tumor nicht länger sichtbar war.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung erfordern, dass ein tumorspezifisches Antigen für den Krebs bekannt oder identifiziert ist. Eine Anzahl solcher Antigene wurde identifiziert. Sie enthalten das Antigen bcr/abl in Leukämie, HPVE6 und E7 im onkogenen Virus, der mit Gebärmutterkrebs verbunden ist, MAGE1 und MZ2-E in Melanomen, sowie MUC-1 in Brust- und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Es wird für Fachleute auf diesem Gebiet nach dieser Beschreibung jedoch offensichtlich sein, dass die Erfindung auf jedes andere Tumorantigen anwendbar ist.
Beispielsweise ist das chronische myeloische Leukämie-CML-Antigen p210^bcr-abl, das in 90 bis 95% der CML-Patienten exprimiert wird, ein tumorspezifisches Antigen aufgrund seiner einzigartigen junktionalen Sequenz. Die Rekombinanten von L. monocytogenes, welche Oligopeptide aus der J-Region von p210^bcr-abl ausscheiden, werden durch jede Technik konstruiert, welche die Insertion von Fremdgenen direkt in das Bakteriumchromosom und die Ausscheidung des Genprodukts unter Verwendung der LLO-Signalsequenz ermöglicht. Das rekombinante L. monocytogenes kann dann als Impfstoff entweder allein oder in Gegenwart eines pharmazeutisch geeigneten Trägers verabreicht werden, um gegen CML, das durch retrovirale Expression von p210^bcr-abl ausgelöst wird, zu schützen. Ein Fachmann auf diesem Gebiet kann nach dieser Beschreibung routinemäßig diesen Ansatz auf andere Tumorantigene ausdehnen.
Sehr stabile transformierende Substanzen, welche eine Anzahl großer viraler Proteine ausscheiden, wurden routinemäßig unter Verwendung von Verfahren hergestellt, die für Fachleute auf dem Gebiet Routine sind. Einige Verfahren zur Herstellung von rekombinantem L. monocytogenes sind bekannt.
Beispielsweise wird die Integration in das Listerialchromosom als Ergebnis einer Transposon-Insertion von Sun et al., Infection and Immunity, 1990, 58, 3770–3778, bei der Konstruktion von DP-L967 beschrieben. Transposon-Mutagenese hat den Vorteil, dass eine stabile Genominsertionsmutante gebildet werden kann, aber den Nachteil, dass die Position im Genom, wo das Fremdgen eingebaut wurde, unbekannt ist.
Das Klonen des Gens in einen prfA(–)enthaltenden Vektor und die Verwendung dieses Plasmids, um eine prfA(–)Listerialmutante zu vervollständigen, wurde verwendet, um DP-L2028 zu konstruieren. DP-L2028 ist der Influenza-NP-exprimierende Stamm, der in den Tumorschutzexperimenten verwendet wurde.
Einige Wege wurden eingeschlagen, um das Tumorantigen in Listeria sp. zu exprimieren, was für einen Fachmann auf dem Gebiet auf der Basis dieser Beschreibung offensichtlich sein wird. Ein Beispiel ist, ein Fusionsprotein des ausgewählten Tumorantigens und ein Listerialprotein, wie beispielsweise Lysteriolysin O oder PI-PLC, zu erzeugen. Ein anderer Weg geht über die Verwendung einer Signalsequenz für ein ausgeschiedenes Listeralprotein, wie beispielsweise Hämolysin oder Phosphorlipase, das strangabwärts auf einem Listerialpromotor verwendet wird. Die Promotoren verschiedener L. monocytogenes-Gene können verwendet werden, um Fremdantigene zu exprimieren. Darüber hinaus können diese Gene verwendet werden, um Fusionsproteine mit Fremdantigenen zu erzeugen. Beispielsweise können Promotoren für die Gene hly, actA, plcA, plcB und mpl, welche die Listerialproteine Hämolysin, actA (ein Oberflächenprotein, das für die Wirtszellen-Actin-Anordnung erforderlich ist und für die Zell-zu-Zellverbreitung des Bakteriums essentiell ist), phosphotidylinositspezifische Phospholipase, Phospholipase C bzw. Metalloprotease kodieren, verwendet werden.
Diese Rekombinanten werden durch Einführung in das Listeriachromosom durch homologe Rekombination mit einem wärmeempfindlichen Plasmid erzeugt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um stabile Transformanden zu erzeugen, die das interessierende Protein ausscheiden. Anders als im Falle der Transposon-Mutagenese ist die Insertionsstelle bekannt. Dieses Verfahren ermöglicht die Routineinsertion eines jeden interessierenden Gens in das Chromosom von L. monocytogenes, welches dann unter der Kontrolle eines L. monocytogenes-Promotors exprimiert wird. Ein solcher Promotor, der Hämolysin-Promotor, reguliert die Expression von hly, dem Listerialgen, welches LLO, ein häufig synthetisiertes und ausgeschiedenes Protein, kodiert. Es wurde gezeigt, dass der Einschluss der LLO-Signalsequenz die Ausscheidung des exprimierten Proteins außerhalb der bakteriellen Zellwand ermöglicht. Die Konstruktion dieser stabilen Rekombinanten von L. monocytogenes verwendet eine Region seines Chromosoms, die als Stelle für die Insertion wirken kann, ohne die bakteriellen Gene zu zerstören, die für das Wachstum und die Verbreitung des Organismus wichtig sind (Camilli et al., Mol. Microbiol., 1993, 8, 143–157). Diese Homologieregion wird in den Shuttle-Vektor pKSV7, ein wärmeempfindliches Plasmid, das sowohl in E. coli als auch im L. monocytogenes wirkt, eingeführt. Eine EcoR1-Stelle in der Nähe des Zentrums wird dann verwendet, um eine Serie von DNA-Fragmenten zwischen den beiden Hälften dieser Region einzuführen. Nach Zugabe eines Polylinkers wird die Promotorsequenz des Listeria-Hämolysingens eingeführt. Zusammen mit dem Promotor sind die strangabwärts gerichtete Sequenzinformation für die ersten 26 Aminosäuren des LLO-Proteins (die Signalsequenz) und vier zusätzliche Aminosäuren enthalten, um einen korrekte Verlauf der Signalsequenz zu gewährleisten. Die Transkriptions-Terminations-Sequenz des Hämolysingens ist auch enthalten, um eine stabile und regulierte Synthese aller synthetisierten Transkripte zu gwährleisten. Diese Hämolysin-Regulatorsequenzen werden verwendet, um die häufige Synthese und Abscheidung eines jeden nebeneinander liegenden strangabwärts gerichteten Gens zu fördern. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können an einen Wirt entweder allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger in einer effektiven Menge verabreicht werden, um eine Immunreaktion gegenüber einem tumorspezifischen Antigen auszulösen. Der Begriff ”Wirt” bedeutet irgendeinen Organismus, der in der Lage ist, Krebszellen zu enthalten, vorzugsweise ein Mensch. Der Begriff ”effektive Menge” bedeutet eine Konzentration von rekombinantem L. monocytogenes, das in der Lage ist, ein tumorspezifisches Antigen zu exprimieren, das in der Lage ist, eine immunreaktion in T-Zellen auszulösen, die Zellen auslöscht, die dieses Antigen enthalten. Solche Mengen können routinemäßig von Fachleuten nach dieser Beschreibung bestimmt werden. Der Begriff ”pharmazeutisch geeigneter Träger” bedeutet, ist aber nicht eingeschränkt auf steriles, destilliertes Wasser, Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Lösungen oder hydrogencarbonatgepufferte Lösungen. Der ausgewählte pharmazeutisch geeignete Träger und die Menge an verwendetem Träger sind abhängig von der Art der Verabreichung. Die Verabreichung kann oral, parenteral, intranasal, intramuskulär, intravaskulär, intrarektal, intraperitoneal oder irgendeine andere gut bekannte Art der Verabreichung sein. Der Verabreichungsweg kann gemäß den verschiedenen Tumoren ausgewählt werden. Beispielsweise kann für die Behandlung von Krebs des Verdauungstrakts die orale Verabreichung verwendet werden. Für die Behandlung von kolorektalem Krebs kann die intrarektale Immunisierung verwendet werden. Für die Behandlung von Eierstock- oder Bauchspeicheldrüsenkrebs kann die intraperitoneale Verabreichung verwendet werden. Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können in Form von Elixieren, Kapseln oder Suspensionen für die orale Verabreichung, oder von sterilen Flüssigkeiten für die parenterale oder intravaskuläre Verabreichung verwendet werden. Die Impfstoffe können gefroren, bei 4°C, bei Raumtemperatur oder lyophilisiert aufbewahrt werden.
Die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung können an einen Wirt entweder allein oder zusammen mit einer anderen Krebstherapie verabreicht werden, um die Bildung von Tumoren zu inhibieren oder zu unterdrücken.
Somit können die erfindungsgemäßen Impfstoffe verwendet werden, um Menschen mit hohem Krebsrisiko aufgrund familiärer genetischer Bedingungen oder anderer Umstände, die sie gegenüber bestimmten Krebsarten anfällig machen, beispielsweise Gebärmutterhalskrebs bei Frauen, deren Ehemänner Papilloma-Viren haben, zu schützen. Darüber hinaus können die Impfstoffe als Krebsimmuntherapie nach partieller Geschwulstverkleinerung des Tumorwachstums durch Operation, herkömmlicher Chemotherapie oder Bestrahlung verwendet werden. Nach solchen Behandlungen kann rekombinantes L. monocytogenes, das das Tumorantigen exprimiert und sezerniert, verabreicht werden. Die CTC-Reaktion auf das Tumorantigen, die durch den Impfstoff erzeugt wird, wird verbliebene Metastasen zerstören und die Remission des Krebses verlängern. Es wird auch angenommen, dass die erfindungsgemäßen Impfstoffe verwendet werden können, um das Wachstum von vorher entwickelten Tumoren zu beeinflussen.
Die folgenden Beispiele sollen Möglichkeiten veranschaulichen und die Erfindung in keiner Weise einschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1
Eine Sequenz, die die ersten 420 Aminosäuren von Lysteriolysin O (LLO) kodiert, und dessen Promotor, zusammen mit einigen strangaufwärts gerichteten Regulatorsequenzen, wurden aus chromosomaler DNA von L. monocytogenes (Wildformstamm 10403s) PCR-amplifiziert, und mit PCR-amplifizierter DNA, die NP kodiert, das vom Plasmid pAPR502 abstammt, ligiert (Young, J. F., U. Desselberger, P. Graves, P. Palese und A. Shatzman, ”Cloning and Expression of infuenza virus genes”, The Origin of Pandemic Influenza Viruses, W. G. Laver, Herausg., Elsevier, New York, 1983, S. 129). Diese Konstruktion führte zu einer eingerahmten Fusion plus der Zugabe von zwei Aminosäuren an der Stelle der Fusionsverbindung. Die Fusion wurde in das Shuttle-Plasmid pAM401 geklont, ein Shuttle-Vektor, der in der Lage ist, sowohl gram-positive als auch gram-negative Bakterien zu replizieren, die ein gram-positives Chloramphenicol-Widerstandsgen und ein gram-negatives Tetracyclin-Widerstandsgen enthalten (Wirth, R., F. Y. An und D. B. Clewell, J. Bacteriol, 1986, 165, 831). Das erhaltene Plasmid, pDP1659, wurde in die Wildform von L. monocytogenes (Stamm 10403s) durch Elektroporation eingeführt, um den L. monocytogenes-Stamm DP-L1659 zu erhalten. Dieser rekombinante Stamm war offensichtlich in der Lage, ein Fusionsprotein der vorbestimmten Größe (105 kD) herzustellen und zu erzeugen, was durch Western-Blot-Analyse der ausgeschiedenen Proteine in den überstehenden Lösungen der Kultur unter Verwendung von Anti-LLO-polyklonalem Antiserum und Anti-NP-monoklonalem Antikörper bestimmt wurde. Die Gegenwart des Fusionsgens unter der Kotrolle des LLO-Promotors in einem Vervielfältigungsplasmid führte zu reduzierter Ausscheidung des chromosomal kodierten LLO, aber nicht bis zu dem Ausmaß, dass das Entweichen der Bakterien aus der Vakuole oder nachfolgendes intracytoplasmisches Wachstum verhindert wurde. Dieser Stamm war jedoch in Abwesenheit von Chloramphenicol nicht stabil.
Um den L. monocytogenes Stamm DP-L2028 zu erzeugen, welcher in vivo stabil ist, und der in den Beispielen 2 bis 6 verwendet wurde, wurde das Plasmid pDP 1659 durch Einführung des prfA-Gens aus 10403s modifiziert und dann verwendet, um einen prfA-L. monocytogenes-Mutanten DP-L1075 zu transformieren. Dies führte zum L. monocytogenes-Stamm DP-L2028, welcher das LLO-NP-Fusionsprotein stabil in vivo und in vitro ausscheidet.
Beispiel 2: Behandlung von Mäusen mit LM-NP
Einhundertzwanzig Balb/c-Mäuse wurden in drei Gruppen von je 40 aufgeteilt. Eine Gruppe wurde mit einem Zehntel der LD50 der Wildform von L. monocytogenes immunisiert; eine Gruppe wurde mit steriler Kochsalzlösung und die dritte mit rekombinantem L. monocytogenes-Impfstoffvektor, der transformiert war, um Influenza-Nucleoprotein (LM-NP) auszuscheiden, immunisiert. Nach zwei Wochen erhielt jede Gruppe eine gleiche Auffrischungsimmunisierung. Dieser Immunisierungsplan wurde festgelegt, um eine starke CTC-Reaktion gegen Influenza-Nucleoprotein zu erzeugen. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden die Tiere in jeder Gruppe subkutan entweder mit CT26 oder RENCA, das mit dem gleichen Influenza-Nucleoproteingen transfiziert worden war, das verwendet wurde, um den L. monocytogenes-Vektor zu transformieren (CT26-NP bzw. RENCA-NP), oder mit der parentalen CT26- oder RENCA-Linie gereizt. Jeder Maus wurden 5 × 10⁵ Tumorzellen verabreicht, was das 50-fache der tumorerzeugenden Dosis ist. Das Tumorwachstum wurde alle zwei Tage in diesen sechs Tiergruppen aufgezeichnet. Die Ergebnisse aus dieser Untersuchung sind in den 1 bis 4 gezeigt. Die einzige Gruppe, die gegenüber der tumorerzeugenden Dosis geschützt war, waren die Tiere, welche LM-NP als Impfstoff erhielten, und die mit dem relevantem Tumorzellen-exprimierenden NP gereizt wurden. in der CT26-NP-Gruppe zeigten 6 der Tiere nach 25 Tagen kein nachweisbares Tumorwachstum; 3 hatten Tumore von weniger als 5,0 mm und eines hatte einen Tumor von 9,0 mm. In der RENCA-NP-Gruppe zeigte kein Tier irgendein Zeichen von Tumorwachstum. Im Gegensatz dazu hatten alle Mäuse in den anderen Gruppen Tumore zwischen 1,5 und 3,0 cm.
Um das fremde NP-Gen zu behalten, wird CT26-NP normalerweise auf dem antibiotischen G418 gehalten. Es wird angenommen, dass die kleine Anzahl an CT26-NP-Tumorzellen, die in den mit LM-NP immunisierten Mäusen wuchsen, Zellen sind, welche das NP-Gen in Abwesenheit von G418 verloren hatten.
Beispiel 3: CTL, erzeugt durch Immunisieren von Balb/c-Mäusen mit LM-NP, kann die Tumorzellen CT26 und RENCA täten, die NP in vitro exprimieren
Mäuse wurden mit 0,1 der LD₅₀ von LM-NP immunisiert. Zwei Wochen später wurden die Mäuse getötet, und Primärkulturen wurden auf Milzzellen entweder mit Influenza-infizierten (A/PR8/34) Splenocyten (5A) oder mit einem synthetischen Peptid, 147–158, von dem bekannt ist, das es das immundominante Epitop des NP-Proteins (5B) darstellt, aufgebracht. Nach viertägigem Kultivieren wurde die cytolytische Aktivität beider Populationen gegen CT26-NP, RENCA-NP und die Stammzelllinien CT26 und RENCA gemessen. Eine positive Kontrolle war eingeschlossen (P815, eine Mastozytom-Tumorzelllinie, von der bekannt ist, dass sie in Gegenwart des Peptids oder bei Infektion mit A/PR8/34 effizient durch H-2^d gespaltenes CTL aufgelöst wird). Wie 5A zeigt, wurden RENCA-NP und CT26-NP, aber nicht die Stammlinien durch NP-spezifische Effektoren, die durch Immunisieren mit LM-NP und Vermehren mit A/PR8/34 induziert werden, aufgelöst. In 5B zeigt ein gleiches Experiment, in dem die Effektoren mit Peptid vermehrt wurden, gleiche Ergebnisse.
Beispiel 4: Immunisierung durch LM-NP bewirkt die Eliminierung des RENCA-Tumorwachstums
In diesem Experiment verursachte die Immunisierung mit LM-NP nach dem Auslösen des Tumorwachstums die Rückbildung und Zerstörung des Tumors. Tumorzellen (5 × 10⁵) wurden subkutan an 30 Mäuse verabreicht. Am 13. Tag nach dem Wachsen von messbaren Tumoren (5 mm) in den Mäusen, wurden diese in jeweils drei Gruppen von 10 Mäusen aufgeteilt. 10 Mäuse erhielten LM-NP, 10 Mäuse erhielten die Wildform von Listeria monocytogenes, und 10 Mäuse erhielten keine weitere Behandlung. Am 23. Tag wurden die Mäuse wieder mit LM-NP oder der Wildform von Listeria monocytogenes immunisiert. Wie 6 zeigt, zeigen nur die Mäuse, die den LM-NP-Impfstoff erhalten hatten, eine Rückbildung des Tumorwachstums bis zu dem Punkt, wo der Tumor in 9 von 10 Mäusen nicht mehr sichtbar war.
Beispiel 5: Immunisierung durch LM-NP bewirkt den Wachstumsstillstand von CT26-NP-Tumoren
Das Experiment, das in Beispiel 4 beschrieben wurde, wurde auch mit kolorektalen CT26-NP-Tumorzellen durchgeführt. CT26-NP ist ein viel schneller wachsender Tumor und ist auch beim Exprimieren von NP instabiler. Nichtsdestoweniger wurde in diesem Experiment festgestellt, dass die Immunisierung durch LM-NP, nachdem das Tumorwachstum ausgelöst war, das Tumorwachstum anhielt. Tumorzellen (5 × 10⁵) wurden subkutan an 30 Mäuse verabreicht. Am 10. Tag, nachdem messbare Tumore (5 mm) in den Mäusen gewachsen waren, wurden sie in drei Gruppen von je 10 Mäusen aufgeteilt. 10 Mäuse erhielten LM-NP, 10 Mäuse erhielten die Wildform von Listeria monocytogenes, und 10 Mäuse erhielten keine weitere Behandlung. Am 17. Tag wurden die Mäuse wieder mit entweder LM-NP oder der Wildform von Listeria monocytogenes immunsiert. Wie 7 zeigt, zeigen nur die Mäuse, die den LM-NP-Impfstoff erhalten hatten, eine Veränderung im Tumorwachstum. Die Rückbildung des Wachstums wurde jedoch anders als im Falle von RENCA nicht in so vielen Mäusen beobachtet. Das kann darauf zurückzuführen sein, dass am Tag 17 die Instabilität der CT26-NP-Tumorzellen bei vielen der Tumorzellen zum Verlust des NP-Antigens führte.
Beispiel 6: Inhibieren des Tumorwachstums wird durch CD8+ T-Zellen bewirkt
In diesem Experiment wurden 30 Mäuse mit LM-NP unter Verwendung der gleichen Vorschrift wie in Beispiel 2 immunisiert. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden 10 Mäuse von CD8+-Zellen durch Immunisierung mit Antikörper 2,43 (spezifisch für das CD8-Molekül) befreit; 10 Mäuse wurden von CD4+ Zellen durch Immunisierung mit GK 1,5 (spezifisch für das CD4-Molekül) befreit; und bei 10 Mäusen wurde das vollständige T-Zell-Repertoir belassen. (Die Vorschrift für die Zerstörung von CD8+- oder CD4+ T-Zellen war die, die von A. Kruisbeek, Current Protocols In Immunology, Coligan et al., Herausg., John Wiley & Sons, Inc., 1994, V. 1, 4.1.1–4.1.2) beschrieben wurde. Nach der T-Zellenzerstörung wurden die Mäuse subkutan mit 5 × 10⁵ CT26-NP-Zellen pro Maus gereizt. Als Vergleichsprobe wurden auch 10 unbehandelte Mäuse mit der gleichen Dosis gereizt. Wie 8 zeigt, zeigt die Gruppe an Mäusen, in denen die CD8+ T-Zell-Untereinheit entfernt wurde, das gleiche Tumorwachstum wie die Vergleichs(unbehandelte)-Gruppe von Mäusen. Die Mäuse, in denen die CD4+ T-Zell-Untereinheit entfernt worden war, zeigten einen geringeren Schutz gegen das Tumorwachstum, was anzeigt, das die CD4+ Zellen eine Nebenreaktion bei der Kontrolle des Tumorwachstums spielen; und die Mäuse mit einem vollständigen T-Zellenrepertoir zeigen Schutz gegenüber Tumorwachstum, der durch den LM-NP-Impfstoff induziert wird.

Claims

Vakzin zur Behandlung von Krebs oder zur Hemmung der Bildung von Tumoren durch Induzieren einer Immunantwort auf ein tumorspezifisches Antigen in einem menschlichen Wirt, wobei das Vakzin eine rekombinante Listeria-monocytogenes-Bakterie umfasst, die durch homologe Rekombination produziert wurde und ein tumorspezifisches Antigen oder ein Fragment davon exprimieren und sezernieren kann, wobei die homologe Rekombination in dem Listeria-monocytogenes-Chromosom erfolgt und Bakteriengene, die für das Wachstum und die Ausbreitung von Listeria monocytogenes erforderlich sind, nicht spaltet.
Vakzin nach Anspruch 1, das sich in einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff befindet.
Vakzin nach Anspruch 1 oder 2, wobei die rekombinante Form von Listeria monocytogenes das tumorspezifische Antigen bcr/abl, HPVE6, E7, MZ2-E, MAGE-1 oder MUC-1 exprimieren kann.
Vakzin nach Anspruch 3, wobei das tumorspezifische Antigen oder das Fragment aus Leukämie, Gebärmutterhalskrebs, Melanom, Brustkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs ausgewählt ist.
Verwendung einer rekombinanten Listeria-monocytogenes-Bakterie, die durch homologe Rekombination produziert wurde und ein tumorspezifisches Antigen oder ein Fragment davon exprimieren und sezernieren kann, wobei die homologe Rekombination in dem Lisieria-monocytogenes-Chromosom erfolgt und Bakteriengene, die für das Wachstum und die Ausbreitung von Listeria monocytogenes erforderlich sind, nicht spaltet, bei der Herstellung eines Vakzins zur Behandlung von Krebs oder zur Hemmung der Bildung von Tumoren durch Induzieren einer Immunantwort auf ein tumorspezifisches Antigen in einem menschlichen Wirt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Vakzin sich in einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff befindet.
Verwendung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die rekombinante Form von Listeria monocytogenes das tumorspezifische Antigen bcr/abl, HPVE6, E7, MZ2-E, MAGE-1 oder MUC-1 exprimieren kann.
Verwendung nach Anspruch 7 zur Unterdrückung der Bildung von Tumoren, wobei das tumorspezifische Antigen oder das Fragment aus Leukämie, Gebärmutterhalskrebs, Melanom, Brustkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs ausgewählt ist.