AT502275A1

AT502275A1 - Immunantwort-induzierende zusammensetzungen

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Publication number: AT502275A1
Application number: AT0133205A
Authority: AT
Original assignee: Greenhills Biotechnology Res D
Priority date: 2005-08-08
Filing date: 2005-08-08
Publication date: 2007-02-15
Also published as: US20090123495A1; WO2007016715A3; AU2006279236A1; WO2007016715A2; CA2615687A1; EP1912670A2; US20110268764A1; AT502275B1; AT502275B8

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Antigen umfassende pharmazeutische Zusammensetzungen.
Zur Vorbereitung eines menschlichen oder tierischen Immunsystems zur Abwehr des Körpers gegen ein bestimmtes Pathogen, üblicherweise ein Bakterium, ein Virus oder ein Toxin, wird eine Vakzine verwendet. Je nach infektiösem Agens, gegen das die Vakzine hergestellt wird, kann diese ein abgeschwächtes Bakterium oder Virus, das seine Virulenz verloren hat, oder ein Toxoid, ein modifiziertes, abgeschwächtes Toxin oder ein Teilchen aus dem Infektionskeim sein. Das Immunsystem erkennt die Vakzineteilchen als fremd, reagiert auf sie und erinnert sich an sie. Während eines Kontakts mit der virulenten Version des Agens werden die Immunzellen präpariert, um den Fremdsubstanzen entgegenzuwirken und das Agens zu neutralisieren.

Abgeschwächte Lebendvirus-Vakzine werden gegen Tollwut und Pocken verwendet; getötete Viren werden gegen das Poliovirus und Influenza eingesetzt; Toxoide sind für Diphtherie und Tetanus bekannt.
Grippe-Virionen bestehen aus einem das Einzelstrang-RNA-Genom enthaltenden inneren Ribonucleoprotein-Kern (einem helixförmigen Nucleocapsid) und einer innen mit einem Matrixprotein<(>Ml<)>ausgekleideten äusseren Lipoprotein-Hülle.

Das seg entierte Genom des Influenza-A-Virus besteht aus acht Molekülen (sieben für Influenza C) von linearen Einzelstrang-RNAs mit negativer Polarität, die für 11 Polypeptide codieren, darunter: die RNAabhängigen RNA-Polymerase-Proteine (PB2, PBl und PA) und Nucleoprotein (NP) , die das Nucleocapsid bilden; die MatrixmembranProteine (Ml, M2); zwei Oberflächen-Glycoproteine, die aus der lipidhaltigen Hülle ragen: Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase(NA); das nicht strukturelle Protein NS1, das nucleare Exportprotein (NEP) und das proapoptotische Protein PB1-F2. Die Transkription und Replikation des Genoms findet im Nucleus statt, und die Zusammenlagerung erfolgt mittels Knospung an der Plasmamembran.

Die Viren können Gene während gemischter Infektionen neu gruppieren.
Das Influenzavirus adsorbiert sich über HA an Sialyloligosaccharide in Glycoproteinen und Glycolipiden der Zellmembran. Im Anschluss an die Endozytose des Virions erfolgt eine Konformationsänderung im HA-Molekül innerhalb des Zellendosoms, wodurch die Membranfusion erleichtert und das Ablösen der Hülle ausgelöst wird. Das Nucleocapsid wandert zum Nucleus, wo die vi-
NACHGEREICHT .
- 2 rale mRNA transkribiert wird.

Die virale mRNA wird durch einen Einzelmechanismus transkribiert, bei dem die virale Endonuclease das mit Kappe ausgebildete 5 '-Ende von zellulären heterologen mRNAs abspaltet, die dann als Primer für die Transkription von viralen RNA-Matrizen durch die virale Transkriptase dienen. mRNA-Trans ripte enden an den Stellen 15 bis 22 Basen von den Enden ihrer Matrizen, wo Oligo- (U) -Sequenzen als Signale für die Anlagerung von Poly- (A) -Trakten agieren. Von den so erzeugten acht viralen RNA-Molekülen sind sechs monocistronische Informationen, die direkt in die HA, NA, NP darstellenden Proteine und die viralen Polymerase-Proteine PB2, PB1 und PA translatiert werden. An den beiden anderen Transkripten erfolgt eine Spleissung, die jeweils zwei mRNAS liefert, welche zur Produktion von Ml, M2, NS1, NEP in verschiedene Leserahmen translatiert werden.

Mit anderen Worten: die acht viralen RNA-Segmente codieren für elf Proteine: neun strukturelle und zwei nicht strukturelle.
Dendritische Zellen (DC) sind die potentesten Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und in der Lage, Immunantworten gegen fremde mikrobielle Antigene, aber auch gegen Autoantigene zu induzieren. Letztere sind für die Induktion von Antitumor-Immunantworten relevant. Viren sind sehr potente Aktivatoren von DCs, da eine Hauptaufgabe von DCs in der Bekämpfung von Virusinfektionen liegt. Aus diesem Grund könnten Viren oder virusverwandte Strukturen als immunstimulatorische Adjuvanzien für Impfzwecke eingesetzt werden. Ein Beispiel für eine Virusfamilie mit hoher proinflammatorischer Kapazität sind Influenza-A-Viren.

Die Infektion von menschlichen DCs mit diesem Virus stimuliert eine starke proliferative und zytotoxische Immunantwort gegen virale Antigene (Bhardwaj, N. et al., J. Clin Invest., 94: 797-807, 1994). Die immunstimulatorische Kapazität einer Influenza-A-Virusinfektion führt bei gleichzeitiger Verabreichung mit dem Virus sogar zur Induktion einer starken T-Zellen-Immunität gegen ein nicht immunogenes Protein (Brimnes et al., J. Ex. Med. 198 (1), 2003: 133-144).
Die US 2004/0109877 AI und WO 99/64068 beschreiben abgeschwächte Viren mit einer modifizierten Interferon- (IFN) -antagonistischen Aktivität. IFNs sind Substanzen, die in Zielzellen einen antiviralen Zustand hervorrufen.

Ein Beispiel darin bezieht sich auf Influenzaviren mit einem teilweise mutierten NS1Gen oder einem kompletten Knock-out des NSl-Gens (das Virus wird
NACHGEREICHT auch als "delNSl" oder "NS1/99" bezeichnet) . Aufgrund der IFNantagonistischen Aktivität kann sich das Virus unter Umgehung der auf IFNs basierenden angeborenen Immunität der Zellen durch Inhibition entweder der Aktivität oder der Produktion von IFN in einer Zelle vermehren und ist daher für die Pathogenität des Virus verantwortlich. Mutationen oder Knock-outs von NS1 führen im Allgemeinen zu einem Anstieg von IFNs und daher zu einer geringeren Vervielfältigung des Virus. Ein Anstieg der IFN-Konzentration zeigt auch eine antivirale Wirkung gegenüber anderen Viren. Daher wurde die Verwendung solcher, abgeschwächter Viren als Vakzine gegen eine breites Spektr-um/von Viren und Antigenen vorgeschlagen.

Dabei umfassen weitere Verwendungen die Einführung von Fremdantigenen in das abgeschwächte Virus durch rekombinante Methoden.
NS1<(>Fig. 7; Aminosäuresequenz: NCBI-Datenbank Zugangsnr. : MNIV1; NS1 Nucleotidsequenz: NCBI-Datenbank Zugangsnr.: J02150) erwies sich als Antagonist von Typ-I-IFN (Garcia-Sastre, A. et al., Virology, 252 : 324-30, 1998), NF-[kappa]B (Wang, J. Virol. 74(24): 11566-11573 (2000) ) und der Interferon-induzierten, durch doppelsträngige RNA aktivierten Kinase PKR (Bergmann, M. et al., J. Virol., 74: 6203-6, 2000).
Das Alpha/Beta-Interferonsystem (IFN- /ss) ist ein bedeutender Bestandteil der wirtseigenen Immunantwort auf eine Virusinfektion (Basler et al., Int. Rev. Immunol. 21: 305-338, 2002). IFN<(>d.h.

IFN-ss und mehrere IFN-[alpha]-Typen) wird als Reaktion auf eine Virusinfektion aufgrund der Aktivierung mehrerer Faktoren einschliesslich der IFN-regulatorischen Faktorproteine, NF-[kappa]B und AP-1 Familienmitglieder synthetisiert. In der Folge induziert die Virusinfektion die transkriptorische Aufregulierung von IFNGenen. Sekretierte IFNs senden ein Signal über einen gemeinsamen Rezeptor, der einen JAK/STAT-Signalpfad aktiviert, welcher zur transkriptorischen Aufregulierung von zahlreichen auf IFN reagierenden Genen, von denen eine Anzahl für antivirale Proteine codiert, und zur Induktion eines antiviralen Zustande in den Zellen führt. Zu den als Reaktion auf IFN induzierten antiviralen Proteinen gehören PKR, 2' ,5'-01igoadenylatsynthetase (OAS) und die Mx-Proteine (Clemens et al., Int. J. Biochem.

Cell Biol. 29:945-949, 1997; Floyd-Smith et al., Science 212:1030-1032, 1981<;>Haller et al., Rev. Sei. Technol. 17:220-230, 1998).
Es wurde gezeigt, dass das 230-Aminosäure (aa) umfassende
NACHGEREICHT NSl-Protein eine RNA-Bindungsdomäne aus den Aminosäuren 1-73 umfasst. NS1 kann snRNA, Poly(A) und dsRNA als Dimer binden und besitzt eine weitere Effektor-Domäne am Carboxy-Ende zur Regulierung der zellulären mRNA-Reifung (Wang et al., RNS 5 (1999): 195-205) .
Die US 2003/0157131 und WO 99/64571 schlagen die Verwendung eines abgeschwächten Influenza-A-Virus mit einem Interferon-induzierenden Phenotyp enthaltend ein Knock-out des NSl-Gensegments als Vakzine vor, verabreicht vor Wildtyp-Influenzainfektionen.

In einer Interferon-freien Umgebung sind diese Viren nur replikationsfähig.
Die WO 99/64570 beschreibt Verfahren zum Züchten von NSl-defizienten Influenza-A- und -B-Viren in Interferon-defizienten Umgebungen, z.B. befruchteten, unter 12 Tage alten Hühnereiern oder Zelllinien mit IFN-Mangelproduktion, wie Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) oder VERO-Zellen.
Die Anzahl von zur Zeit für humane Anwendung zugelassenen Adjuvantien ist sehr eingeschränkt und praktisch auf Aluminiumsalze und MF59 (Singh et al., Nature Biotech. 17: 1075-1081, 1999) beschränkt. Auch wenn viel mehr immunstimulierende Verbindungen wie öl-in-Wasser-Emulsionen bekannt sind, ist ihre Anwendung aufgrund von Nebenwirkungen wie Toxizität (z.B. das kanzerogene Freund' sehe Adjuvans) eingeschränkt. Die Entwicklung von bzw.

Suche nach Adjuvantien zur Anwendung bei Menschen, Säugern, anderen Tieren oder auch Zellkulturen ist daher für verschiedene Applikationen notwendig.
Die vorliegende Erfindung schafft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen ein Antigen, umfassend:
(a) das Antigen und
(b) ein Adjuvans in Form eines apathogenen Virus.
Viele Viren haben Mechanismen entwickelt, um der Wirts-IFNAntwort entgegenzuwirken, und bei manchen Viren einschliesslich dem Vaccinia-Virus, Adenovirus und Hepatitis-C-Virus wurde von mehrfachen IFN-antagonistischen Aktivitäten berichtet (Beattie et al., J. Virol. 69:499-505, 1995; Brandt et al., J. Virol. 74: 850-856, 2001; Davies et al., J. Virol. 67:1688-1692, 1993; Francois et al., J. Virol. 74:5587-5596, 2000; Gale et al., Virology 230:217-227, 1997; Kitajewski et al., Cell 45:195-200, 1986; Leonard et al., J.

Virol. 71:5095-5101, 1997; Taylor et
NACHGEREICHT al., Science 285:107-110, 1998; Taylor et al., J. Virol. 75: 1265-1273; 2001) . Ein apathogenes Virus in einer Zusammensetzung gemäss der vorliegenden Erfindung enthält keinen (aktiven) IFNAntagonisten, entweder von Natur aus oder durch Entfernen mittels genetischer Methoden. Das erfindungsgemäss zu verwendende apathogene Virus ist selbstverständlich nicht pathogen, d.h. es belastet das Individuum, das die erfindungsgemässe pharmakologische Zusammensetzung erhält, nicht mit einer Virusinfektion. Verfahren zum Entfernen der Aktivität von IFN-Antagonisten in Viren sind zum Beispiel (allgemein) in Sambrook et al. (Molecular Clonlng: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989), Ausubel et al.

(Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. und Wiley and Sons, New York, 1994<)>und dgl. offenbart. Bei den negativsträngigen RNA-Viren wurden mehrere verschiedene IFN-subvertierende Strategien identifiziert, die auf eine Vielfalt von Komponenten des IFN-Systems abzielen. Das NSl-Protein des Influenzavirus verhindert beispielsweise die Produktion von IFN durch Inhibition der Aktivierung der Transkriptionsfaktoren IFN-Regulationsfaktor 3 und NF-[kappa]B und blockiert die Aktivierung der IFN-induzierten antiviralen Proteine PKR und OAS (Bergmann et al., J. Virol. 74:6203-6206, 2000; Garcia-Sastre et al., Virology 252:324-330, 1998; Talon et al., J. Virol. 74:7989-7996, 200; Wang et al., J. Virol. 74: 11566-11573, 2000) . Bei den Paramyxoviren werden verschiedene Mechanismen von verschiedenen Viren eingesetzt (Young et al., Virology 269:383-390, 2000).

Beispielsweise wurde bereits früher gezeigt, dass die "V"-Proteine mehrerer Paramyxoviren die IFNSignalisierung hemmen, doch variieren die Ziele unterschiedlicher V-Proteine (Kubota et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 283:255-259, 2001; Parisien et al., Virology 283:230-239, 2001). Im Fall des Sendai-Virus wurde berichtet, dass die "C"-Proteine, eine Gruppe von vier Carboxy-coterminalen Proteinen, die IFN-Signalisierung sowohl in infizierten Zellen als auch bei alleiniger Expression blockieren (Garcin et al., J. Virol. 74:88238830, 2000; Garcin et al., J. Virol. 73:6559-6565, 1999; Gotoh, FEBS Lett. 459:205-210, 1999; Kato et al., J. Virol. 75:38023810, 2001<;>Komatsu et al., J. Virol. 74:2477-2480, 2000).

Im Gegensatz dazu produziert das Respiratory-Syncytial-Virus, das weder für ein C- noch für ein V-Protein codiert, zwei nicht strukturelle Proteine, nämlich NS1 und NS2, von denen es heisst,
NACHGEREICHT dass sie gemeinsam gegen die antivirale Wirkung von IFN wirken<(>Bessert et al., J. Virol. 76:4287-4293, 2002; Schlender et al., J. Virol. 74:8234-8242, 2000). Ebola-Virus, ein nicht seg entiertes Negativstrang-RNA-Virus der Familie der Filoviridae, das eine Genomstruktur ähnlich jener der Paramyxoviren besitzt<(>Klenk et al., Marburg and Ebola Viruses, S. 827-831 in R. G. Webster und A. Granoff (Herausg.), Encyclopaedia of Virology, Band 2, Academic Press, New York, N.Y., 1994), codiert ebenfalls für mindestens ein Protein, nämlich VP35, welches der Wirts-IFNAntwort entgegenwirkt (Basler et al., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 97:12289-12294, 2000).
Virale IFN-Antagonisten erwiesen sich als bedeutende Virulenzfaktoren bei mehreren Viren einschliesslich dem Herpes-Simplex-Virus Typ 1, dem Vaccinia-Virus, Influenzavirus und SendaiVirus. In einer Analyse von Viren mit Mutationen in Genen, die für Proteine des Herpex-Simplex-Virus Typ-1 ICP34.5 (Chou et al., Science 250:1262-1266, 1990; Markowitz et al., J. Virol. 71:5560-5569, 1997<)>, des Vaccinia-Virus E3L (Brandt et al., J. Virol. 75:850-856, 2001), des Influenzavirus NS1 (Garcia-Sastre et al., Virology 252:324-330, 1998; Talon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4309-4314, 2000) und des Sendai-Virus C(Durbin et al., Virology 261:319-330, 1999; Garcin et al., Virology 238:424-431, 1997<)>codieren, wurde die wichtige Rolle für jeden dieser IFN-Antagonisten bei der viralen Pathogenität bei Mäusen nachgewiesen.

Da IFN-Antagonisten wichtige Virulenzfaktoren sind, sollte ihre Identifizierung und Charakterisierung wichtige Einblicke in die Viruspathogenese geben.
Viren, die beim Menschen apathogen wirken, von Natur aus keinen PKR- oder IFN-Antagonisten enthalten und daher als Adjuvans verwendet werden könnten, sind das Reovirus (Stong et al., EMBO J. 15. Juni 1998; 17 (12) -.3351-62) und VSV (Stojdl et al.,' J. Virol. Okt. 2000<;>74 (20) : 9580-5) . Ein weiteres Beispiel für ein Virus, das beim Menschen nicht pathogen ist und einen deletierten IFN-Antagonisten aufweist, ist das "Newcastle-Disease"Virus, dem das V-Protein fehlt (Huang et al., J. Virol. Aug. 2003; 77<(>16<)>:8676-85<)>.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemässen Zusammensetzung ist das apathogene Virus ausgewählt aus apathogenem Vaccinia-Virus, Adenovirus, Hepatitis-CVirus, Newcastle-Disease-Virus, Paramyxovirus, Sendai-Virus, Respiratory-Syncytial-Virus, Filoviridae, Herpex-simplex-Virus Typ
NACHGEREICHT 1, Reovirus, Influenzavirus oder VSV.
Noch bevorzugter ist eine erfindungsgemässe Zusammensetzung, worin das apathogene Virus ein gentechnisch hergestelltes Virus ist, das eine Mutation, eine Trunkation, ein Knock-out oder eine reduzierte Expression eines viralen endogenen Interferon-Antagonist-Gens oder endogenen Immunsuppressor-Gens umfasst (das im Wildtyp oder in einer hinterlegten Variante des spezifischen Virus vorhanden ist) . Diese Mutationen führen zu einem apathogenen Phenotyp des Virus und verstärken die Immunantwort über die Induktion von Zytokinen.

Das wurde für das Influenzavirus gezeigt (Ferko et al., J. Virol. 2004, Stasakova et al., J. Gen. Virol. 2004) .
Beispiele für abgeschwächte Viren, denen der IFN- (oder PKR-) Antagonist fehlt und die als Vakzine-Adjuvanzien verwendet werden können, sind folgende: i) Das Herpes-Virus Myb34.5 (Nakamura et al., J. Clin. Invest. 2002, 109:871), dem der PKR-Antagonist fehlt, ii) Das Vaccinia-Virus MVA (Modified Virus Ankara), dem das EL3-Protein fehlt (Hornemann et al., J. Virol. Aug. 2003; 77 (15) :8394-407) .

Daher ist das Virus in einer erfindungsgemässen Zusammensetzung vorzugsweise ausgewählt aus dem Herpes-Virus Myb34.5, dem Vaccinia-Virus MVA oder dem Newcastle-Disease-Virus, dem das V-Protein fehlt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung als Adjuvans ein gentechnisch hergestelltes Influenzavirus mit einem mutierten oder trunkierten NSl-Protein oder einem Knock-out oder einer reduzierten Expression des NSl-Gensegments .
Vorzugsweise ist die Expression des NSl-Proteins mindestens 5-mal, vorzugsweise mindestens 10-mal niedriger als bei einem Wildtyp-Virus.

Die reduzierte Expression von NS1 genügt im Allgemeinen, um die Funktion von NS1 auszuschalten.
Vorzugsweise wird die Reduktion der NSl-Expression durch Mutationen in den 3 ' -terminalen und/oder 5 ' -nicht-codierenden Nucleotiden des Segments 8, vorzugsweise durch Mutationen im NS1ORF, noch bevorzugter durch Substitution der nicht codierenden Sequenzen des Segments 8 durch nicht codierende Regionen des NASegments, erzielt. Die Reduktion von NS1 wird durch Mutationen in den 3 ' -terminalen und 5 '-nicht-codierenden Nucleotiden des Segments 8 erreicht. Darüber hinaus kann die reduzierte Expression durch Modifikation der Expression von NS1-ORF erzielt wer-
NACHGEREICHT den. Beispielsweise wird bei Verwendung einer Stopp-Start-Sequenz für bicistonische Nachrichten NSl-ORF nach dem ORF des NS2 im Segment exprimiert.

Die nicht codierenden Regionen des NASegments des Virus können als Ersatz für die nicht codierenden Sequenzen des Segments 8 verwendet werden. Darüber hinaus kann die nicht codierende Region des Segments 8 des Influenza-B-Virus verwendet werden. Zufallsmutationen sind nach einer Analyse ihrer Wirkung ebenfalls möglich.
In der erfindungsgemässen Zusammensetzung verstärkt das Adjuvans in Form eines modifizierten Influenzavirus die Immunantwort des Antigens. Als Antigen kann jede Art Substanz verwendet werden, gegen die eine Immunreaktion im Lebewesen oder in der Zellkultur erwünscht ist. Derartige Antigene sind zum Beispiel Teile von pathogenen Organismen wie unterschiedlichen Viren, Bakterien oder Pilzen. Der Ausdruck "unterschiedliche Viren" bezieht sich hierin auf andere Viren als das genetisch hergestellte Virus, welches das Adjuvans bildet.

Durch die Mutation, Trunkation, das Knock-out oder die reduzierte Expression eines Interferons oder Immunsuppressors, die normalerweise vom Wildtyp-Virus produziert würden, wird das Virus in seiner Pathogenität und Fähigkeit, mit dem Immunsystem eines Wirts oder der Immunantwort einer adäquaten Zellkultur zurecht zu kommen, stark reduziert.
Vorzugsweise ist das Adjuvans in der erfindungsgemässen Zusammensetzung ein gentechnisch hergestelltes Influenzavirus mit einem mutierten oder trunkierten NSl-Protein oder einem Knockout oder einer reduzierten Expression des NSl-Gensegments. Das NSl-Protein ist ein gutes Target als Influenza-endogenes-Interferon-<(>IFN<)>-Antagonist.

Ein solches genetisch verändertes Influenzavirus zeigt eine stark reduzierte Pathogenität in dem Masse, als es in normalen Gewebezellen in Anwesenheit von Interferon schwierig zu kultivieren ist und somit einen abgeschwächten Phenotyp aufweist.
Ein Beispiel für ein erfindungsgemässes Adjuvans ist das delNSl-Virus. Das delNSl ist ein von Influenza abgeleiteter Stamm, dem der offene Leserahmen des nicht strukturellen Proteins NS1 fehlt. Im Stand der Technik wurde nachgewiesen, dass es mehrere Indikatoren von Immunantworten, wie Interferone (IFN), NF-[kappa]B, PKR und andere Zytokine der angeborenen Immunantwort simuliert<(>Ferko et al., J. Virol. 2004, siehe oben). Typ-I-IFN spielt eine Rolle bei der Reifung von dendritischen Zellen und
NACHGEREICHT beim Primen einer Antigen-spezifischen CD8+- und CD4+-T-ZellenAntwort.

NF-[kappa]B ist ein zentrales Schlüsselprotein bei der Immunantwort. Man glaubt, dass sich die Aktivierung von PKR vorteilhaft auf den Abbau von Immuntoleranzen auswirkt, ein Problem, das die Immunantwort gegen endogene Tumor-assoziierte Antigene aufhebt (Leitner, W. et al., Nat. Med., 9;33-9, 2003). Daher eignet sich das delNSl-Virus besonders zur Stimulation von DCs.

Auch wenn IFNs die Ausbreitung von delNSl-Viren hemmen, wird der immunsteigernde Effekt im Zeitrahmen einer Anwendung als Adjuvans nicht geschmälert.
Basierend auf der Wirksamkeit des delNSl schafft die vorliegende Erfindung vorzugsweise eine wie oben definierte Zusammensetzung, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus eine Deletion des gesamten NSl-Gensegments enthält.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine wie oben beschriebene Zusammensetzung, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus ein trunkiertes NSl-Protein mit einer Deletion am C-Ende enthält, während weniger als die ersten 40, 50 oder 60, insbesondere 70 oder 80, ganz besonders 90, 100, 110, 120, 124 oder 126 Aminosäuren des Wildtyp-NSl-Genprodukts beibehalten sind.

Solche Modifikationen des NSl-Proteins bilden Phenotypen, die Intermediäre eines Virus mit einem völlig funktionellen NSl-Protein und dem delNSl darstellen. Das NSl-Protein enthält eine RNA-Bindungsstelle aus den Aminosäuren 1 bis 73 (Wang et al., RNA 5 (1999): 195-205) und eine Effektorfunktion am C-Ende, die die zelluläre mRNA-Reifung reguliert. Deletionen in dieser Region umfassende Mutanten werden in ihrer Funktionalität besonders behindert. Die RNA-Bindungskapazität des NSl-Proteins betrifft die Interferon-Empfänglichkeit des Virus. Alle diese mutanten Viren, die NSl-Mutationen im Bereich von einer vollständigen NSl-Deletion (delNSl) bis zum nur 126 Aminosäuren enthaltenden NSl-Protein umfassen, können in Medien mit sehr wenig IFN, wie 8-12 Tage alten befruchteten Hühnereiern, wachsen.

Die Viren zeigen eine ausreichend niedrige Virulenz für eine Anwendung als A juvanzien ohne Gefährdung des Patienten, Tiers oder der Zellkultur.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von natürlich vorkommenden mutanten Influenzaviren A oder B mit trunkierten NSl-Proteinen in einer erfindungsgemässen Zusammensetzung.

Was die Influenza-A-Viren betrifft, so schliessen diese
NACHGEREICHT Viren mit einer NS1 von 124 Aminosäuren (Norton et al., 1987, Virology 156:204-213) mit ein, sind aber nicht auf diese be-' schränkt.
Bezüglich der Influenza-B-Viren, so schliessen diese Viren mit einer NSl-Trunkationsmutante mit 127 Aminosäuren, abgeleitet vom N-Terminus<(>B/201) (Norton et al., 1987, Virology 156: 204213<)>und Viren mit einer NSl-Trunkationsmutante mit 90 Aminosäuren, abgeleitet vom N-Terminus (B/AWBY-234) (Tobita et al., 1990, Virology 174: 314-19) mit ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung von natürlich vorkommenden Mutanten analog zu NS1/38, NS1/80, NS1/124 (Egorov et al., 1998, J.

Virol. 72(8): 6437-41)sowie den natürlich vorkommenden Mutanten A/Turkey/ORE/71, B/201 oder B/AWBY-234.
Daher umfasst eine bevorzugte erfindungsgemässe Zusammensetzung das gentechnisch hergestellte Influenzavirus, das die NS1124-Mutation enthält, die nur die N-terminalen 124 Aminosäuren des NSl-Proteins enthält, d.h. die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 124 des NSl-Proteins wie sie in der NCBI-Datenbank, Zugangsnr. MNIV1 offenbart ist.
Eine andere bevorzugte erfindungsgemässe Zusammensetzung ist eine wie oben beschriebene Zusammensetzung, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus die NSl-80-Mutation enthält, die nur die N-terminalen 80 Aminosäuren des NSl-Proteins enthält, d.h. die Sequenz der Aminosäuren 1 bis 80 des NSl-Proteins.

Die Wirksamkeit dieser Influenzamutanten als Adjuvans ist in den Beispielen beschrieben.
Besonders bevorzugt ist eine erfindungsgemässe Zusammensetzung, worin dem NSl-Protein des gentechnisch hergestellten Influenzavirus eine funktioneile RNA-Bindungsdomäne fehlt. Die RNA-Bindungsdomäne eines Wildtyp-Influenza-NSl-Proteins ist als die ersten 73 N-terminalen Aminosäuren definiert. Auch wenn die RNA-Bindung relativ unspezifisch ist und ein Mangel an einer signifikanten Menge von Aminosäuren oder RNA-Bindungselementen für die Verhinderung einer RNA-Bindung ausreichend wäre, wurden mehrere Schlüssel-Aminosäuren identifiziert, deren Fehlen im NSlProtein zu einem Verlust der RNA-Bindungskapazität desselben führt. Solche Aminosäuren sind zum Beispiel Arg 38(oder R38)und Lys41<(>oder K41) im NSl-Protein von Influenza A.

Ein Beispiel für ein NSl-Protein im Rahmen der vorliegenden Erfindung
NACHGEREICHT wäre ein NS-Protein, dem der C-terminale Teil fehlt und in dem ein N-terminaler Teil von weniger als 41 Aminosäuren beibehalten ist. Virus-RNA ist ein effizienter Stimulator von Antigene aufweisenden Zellen. Somit reduziert die Bindung und Maskierung dieser RNAs durch die RNA-Bindungsdomäne des NSl-Proteins die Immunantwort. Ein Verlust einer dieser Schlüssel-Aminosäurereste setzt das Mutantenfragment von NS1 ausser Gefecht und nimmt ihm die Fähigkeit, in zelluläre RNA-bezogene Prozesse wie die RNAReifung einzugreifen.

Ein Influenzavirus mit einer solchen Mutation zeigt eine sehr geringe Virulenz und einen abgeschwächten Phenotyp.
Eine weitere genetische Modifikationen zur Erzeugung eines schwach virulenten Virus mit Target-regulierenden, nicht codierenden NSl-Gen-Sequenzen ist in Bergmann et al., Virus Res. Sept. 1996; 44(1): 23-31, oder Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 15. Juni 1991; 88(12): 5177-81, offenbart. Dieses Verfahren gestattet die Konstruktion eines Virus mit einem geringen NSl-Protein-Expressionsniveau, wobei aber der offene Leserahmen von NS1 intakt bleibt.
In einer weiters bevorzugten Ausführungsform gemäss der Erfindung ist das Virus ein abgeschwächtes Virus. Abgeschwächte Viren werden durch Verfahren erhalten, die ein Virus abschwächen und es weniger heftig machen, so dass es zu keiner Erkrankung kommt.

Mutationen im NS1 wie oben beschrieben schwächen das Virus von selbst ab, wenn keine anderen virulenten Faktoren eingeführt werden, die den Verlust eines effizienten Wildtyp-NSlGenprodukts kompensieren, und die Möglichkeit von Virus-Rückmutationen ist ausgeschaltet. Solche abgeschwächten Viren können in Vakzine-Formulierungen verwendet werden.
Eine weitere genetische Modifikation zur Schaffung eines Virus mit gering virulenten Target-regulierenden nicht codierenden Neuraminidase- (NA) -Gens-Sequenzen ist in Bergmann et al., Virus Res. Sept. 1996; 44(1): 23-31 offenbart. Ein Beispiel für eine Modifikation von NA-3'- und -5 '-nicht-codierenden Sequenzen ist die Substitution von NA-3'- und -5 ' -nicht-codierenden Sequenzen durch NS1-3'- und -5 ' -nicht-codierende Sequenzen (Muster et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 15. Juni 1991; 88(12): 5177-81).

Ein solches modifiziertes Virus ist abgeschwächt und immunogen. Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auch auf eine Zusammensetzung wie oben definiert, worin das gentechnisch herge-
NACHGEREICHT stellte Influenzavirus abgeschwächt ist, indem die nicht codierenden Sequenzen des Neuraminidase- (NA) -Gens durch nicht codierende Sequenzen des NSl-Gens oder andere genetische Modifikationen des Virus ersetzt werden. Ein weiteres bevorzugtes abgeschwächtes Influenzavirus, das in der erfindungsgemässen Zusammensetzung verwendet wird, wird durch Ersetzen der nicht codierenden Sequenz des NSl-Gens durch jene anderer Gensegmente abgeschwächt .
Vorzugsweise ist das Influenzavirus in der erfindungsgemässen Zusammensetzung ein Influenza-A-Virus oder ein Influenza-B-Virus.

Heutzutage ist es allgemeine Praxis, diese Influenzastämme durch Umkehrgenetik zu modifizieren, und das Wachstum dieser Stämme ist auf dem Fachmann bekannten speziellen Medien leicht zu handhaben.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird das Antigen in der wie oben definierten Zusammensetzung dem Virus beigemischt. So kann der Fachmann leicht eine erfindungsgemässe Zusammensetzung für jede gewünschte Anwendung unmittelbar vor der Anwendung herstellen. Daher kann das Adjuvans getrennt vom Antigen aufbewahrt werden, gegen das eine Immunität gewünscht wird. Diese Art der Herstellung ist sehr effizient, wie in den Beispielen gezeigt ist.
In einer anderen erfindungsgemässen Zusammensetzung liegt das Antigen als Komplex mit dem genetisch modifizieren Virus oder kovalent an dieses gebunden vor.

Der Vorteil bei dieser Präparation liegt darin, dass beide Verbindungen in einem Schritt aufbereitet werden können, d.h. sie können gleichzeitig analysiert werden, wenn eine Bestimmung der antigenen und viralen Belastung zu veranlassen ist, oder sie können gleichzeitig mittels chromatographischer Methoden gereinigt werden.
Eine weitere bevorzugte erfindungsgemässe Zusammensetzung umfasst mindestens ein zusätzliches Adjuvans.

Solche zusätzliche Adjuvantien erhöhen die Immunantwort gegen das Antigen noch weiter und sind beispielsweise Aluminiumsalze, Mikroemulsionen, Lipidteilchen, Oligonucleotide, wie von Singh et al. offenbart (Singh et al., Nature Biotech. 17: 1075-1081, 1999).
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine wie oben definierte Zusammensetzung, worin das mindestens eine zusätzliche Adjuvans ausgewählt ist aus Mineralgelen, Aluminiumhydroxid, oberflächenaktiven Substanzen, Lysolecithin, PluronicPolyolen, Polyanionen oder ölemulsionen oder einer Kombination
NACHGEREICHT
- 13 derselben. Die Wahl des zusätzlichen Adjuvans hängt natürlich von der beabsichtigen Verwendung ab.

Die Anwendung von billigen, aber toxischen Adjuvanzien ist zum Beispiel für bestimmte Lebewesen nicht ratsam, auch wenn die Toxizität von einem bestimmten Organismus abhängig sein kann und von keiner Toxizität bis zu hoher Toxizität variieren kann.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemässen Zusammensetzung umfasst weiters Puffersubstanzen. Puffersubstanzen können vom Fachmann gewählt werden, um in einer Lösung der erfindungsgemässen Zusammensetzung physiologische Bedingungen herzustellen. Eigenschaften wie pH-Wert und Ionenstärke sowie Ionengehalt können je nach Wunsch gewählt werden.
Eine weitere bevorzugte erfindungsgemässe Zusammensetzung umfasst einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Der Ausdruck "Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, z.B.

Wasser, Kochsalzlösung, einen Exzipienten oder ein Vehikel, mit denen die Zusammensetzung verabreicht werden kann. Für eine feste Zusammensetzung können die Träger in der pharmazeutischen Zusammensetzung ein Bindemittel wie mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon (Polyvidon oder Povidon) , Tragantgummi, Gelatine, Stärke, Lactose oder Lactosemonohydrat; ein zerfallsförderndes Mittel wie Alginsäure, Maisstärke und dgl.; ein Gleitmittel oder oberflächenaktives Mittel wie Magnesiumstearat oder Natriumlaurylsulphat; ein Fliessmittel wie kolloidales Siliziumdioxid<;>ein Süssungsmittel wie Saccharose oder Saccharin umfassen.
In einer bevorzugten erfindungsgemässen Zusammensetzung ist das Antigen ausgewählt aus Tumorantigenen oder Antigenen von infektiösen Pathogenen wie verschiedenen Viren, Bakterien, Parasiten oder Pilzen.

Im Allgemeinen können sogar bei Verbindungen, die von sich aus nicht antigen sind, d.h. in einem Organismus keine Immunantwort durch B- und T-Zellen hervorrufen, ein Organismus oder Kulturen von Immunzellen bei Verwendung in einer erfindungsgemässen Zusammensetzung gegen diese Verbindungen immunisiert werden.
Noch bevorzugter ist eine wie oben beschriebene Zusammensetzung, worin das Antigen ausgewählt ist aus gpl60, gpl20 oder gp41 von HIV, HA und NA des Influenzavirus, Antigenen von endogenen Retroviren, Antigenen des humanen Papillomavirus, insbesondere E6- und E7-Protein, Melanom gplOO, Survivin, Her2neu, NY-ESO, Tuberkulose-Antigenen, Hepatitis-Antigenen, Polio-Anti-
NACHGEREICHT >. .. ...
- 14 genen, etc..
Eine bevorzugte erfindungsgemässe Zusammensetzung kann zur Modulation der Immunantwort weiters ein Zytokin enthalten.

Durch die Auswahl der entsprechenden Zytokine ist es beispielsweise möglich, entweder CD4+-T-Zellen für eine vorwiegend humorale, d.h. Antikörper-vermittelte, Immunantwort oder CD8+-T-Zellen für eine Zell-vermittelte Immunantwort zu stimulieren, oder um DCs anzuziehen.
Eine andere Ausführungsform besteht darin, ein immunstimulatorisches Zytokin im Virus oder im delNSl-Virus zu exprimieren. Das kann durch genetische Manipulation des Virus, z.B. durch Einführen eines für dieses Zytokin codierenden Oligonucleotids in das Virus bewerkstelligt werden.

Eine erfindungsgemässe Zusammensetzung kann daher ein Virus mit einer genetischen Sequenz für ein immunstimulatorisches Zytokin umfassen.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemässen Zusammensetzung vor, welches den Schritt des Mischens des Antigens mit dem eine Mutation, eine Trunkation, ein Knock-out oder eine reduzierte Expression eines endogenen Interferon-Antagonist-Gens oder endogenen Immunsuppressors enthaltenden Virus umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Formulierung zur Einnahme, die eine wie oben beschriebene Zusammensetzung und einen geeigneten Träger umfasst. Eine solche pharmazeutische Formulierung weist die erfindungsgemässe pharmazeutische Zusammensetzung in zur Verabfolgung oder Applikation geeigneter Form auf.

Geeignete feste Träger zur Einnahme sind dem Fachmann gut bekannt, und einige Beispiele dafür sind oben angeführt. Für orale Verabreichung geeignete therapeutische Formulierungen, z.B. Tabletten und Pillen, können durch Pressen oder Formen, gegebenenfalls mit einem oder mehr zusätzlichen Ingredienzien, erhalten werden. Presstabletten können durch Mischen des bzw. der Bestandteil (e) und Pressen dieser Mischung zu Tabletten geeigneter Grösse in einer entsprechenden Vorrichtung hergestellt werden. Vor dem Mischen kann die Zusammensetzung mit einem Bindemittel, Gleitmittel, einem inerten Verdünnungsmittel und/oder einem zerfallsfördernden Mittel gemischt werden, und weitere gegebenenfalls vorhandene Bestandteile können mit einem Verdünnungsmittel, einem Gleitmittel und/oder einem oberflächenaktiven Mittel gemischt werden.

Alternativ kann die erfindungs-
NACHGEREICHT gemässe Zusammensetzung in flüssiger Form für orale Anwendung formuliert werden. So kann die pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Sirups, Kapseln, Suppositorien, Pulver, insbesondere lyophilisierten Pulvern zur Rekonstitution mit einem Träger für orale Verabreichung etc. formuliert werden. Eine derartige Formulierung kann weiters einen Stabilisator oder ein Konservierungsmittel enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung besteht in einer pharmazeutischen Formulierung für intranasale Verabreichung, umfassend eine wie oben definierte Zusammensetzung und einen geeigneten Träger in Form von Nasentropfen oder für intranasale Gabe mit Hilfe einer Sprayvorrichtung.

Nasentropfen sind einfach zu verwenden und stellen eine praktische Möglichkeit zur Verabreichung der erfindungsgemässen Zusammensetzung dar.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung für subkutane, intramuskuläre, intravaskuläre oder intraperitoneale Injektion, umfassend eine wie oben definierte Zusammensetzung und einen geeigneten stabilisierenden Träger.

Injektionen bieten einen Eintrittsweg, der die Applikation der erfindungsgemässen pharmazeutischen Formulierung garantiert und für die systemische Anwendung der Adjuvantien verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung einer wie oben definierten pharmazeutischen Formulierung zur Verfügung, welches den Schritt des Mischens einer erfindungsgemässen Zusammensetzung mit einem geeigneten Träger umfasst.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung eines apathogenen Virus, vorzugsweise eines abgeschwächten NSl-defizienten Influenza-A-Virus wie oben beschrieben,

als immunmodulierendes Adjuvans zur Induktion einer immunsteigernden Wirkung eines Antigens oder zur Überwindung einer pathogeninduzierten I munsuppression oder einer Krebs-induzierten Immunsuppression oder zur Herstellung eines solchen immunmodulierenden Adjuvans. Demgemäss kann das NSl-defiziente InfluenzaA-Virus, dem entweder das NSl-Gen fehlt oder das starke Mutationen/Trunkationen im NSl-Gen oder eine reduzierte NSl-Expression wie oben beschrieben aufweist (was unter "NSl-Defizienz" verstanden wird) , einem Lebewesen oder einer Zellkultur zusammen mit einem Antigen verabreicht werden, um die Immunreaktion gegen
NACHGEREICHT das Antigen zu verstärken. Es können natürlich auch andere apathogene Viren als die oben genannten verwendet werden.

Insbesondere zusammen mit der Verwendung von Krebs-Antigenen ist es möglich, Immunzellen zu stimulieren, damit sie gegen Krebszellen reaktiv werden, wodurch eine Krebs-induzierte Immunsuppression überwunden wird. Derart behandelte Immunzellen, z.B. dendritische Zellen, T-Zellen oder B-Zellen, können entweder in vivo oder ex vivo behandelt und wieder in ein Lebewesen eingeführt werden. Demgemäss kann eine pathogeninduzierte Immunsuppression durch Verwendung eines Antigens des Pathogens überwunden werden. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur invitro-Aktivierung von dendritischen Zellen mit einem spezifischen Antigen zur Verfügung, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass dendritische Zellen mit einer Zusammensetzung umfassend ein Antigen und ein apathogenes Virus als Adjuvans wie oben beschrieben in vitro kontaktiert werden.

Dendritische Zellen können aus Zellkulturen oder aus Lebewesen gewonnen werden und mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren (siehe Sambrook et al., oben, Ausubel et al., oben) und den in den Beispielen angeführten Verfahren gegenüber dem Antigen reaktionsfähig gemacht werden. Das apathogene Virus liefert ein weiteres Stimulans zur Verbesserung der Konditionierung von dendritischen Zellen. Vorzugsweise sind die dendritischen Zellen unreife dendritische Zellen. Diese Zellen zeichnen sich durch eine hohe endozytische Aktivität und ein geringes T-Zellen-Aktivierungspotential aus. Dendritische Zellen suchen die Umgebung ständig nach Viren und Bakterien ab. Sobald sie mit einem solchen Antigen in Berührung gekommen sind, werden sie zu reifen dendritischen Zellen aktiviert.

Solche dendritische Zellen können T-Helferzellen aktivieren, um eine Immunantwort in einer diese Zellen enthaltenden Zellkultur oder einem Lebewesen zu beschleunigen.
Vorzugsweise erfolgt die Kontaktierung der erfindungsgemässen Zusammensetzung und der dendritischen Zellen 10 Minuten bis 8 Stunden, vorzugsweise 10 bis 60 Minuten lang.
In einem anderen bevorzugten Verfahren ist das zur Kontaktierung verwendete spezifische Antigen ein isoliertes Tumoroder Virusantigen, ein rekombinantes Tumor- oder Virusantigen oder ein Tumor- oder Viruslysat. Mit diesen Antigenen können die dendritischen Zellen gegenüber mehreren molekularen Einheiten reaktionsfähig gemacht werden, die diese Antigene [upsilon]ütfidHLlug ell
NACHGEREICHT . . . . . .
- 17 -
Substanzen enthalten.

Das Viruslysat wird vorzugsweise durch Infektion von Tumorzellen mit dem apathogenen Virus, vorzugsweise dem NSl-defizienten Influenzavirus, wie oben beschrieben erhalten.
Weiters stellt die vorliegende Erfindung gemäss dem oben beschriebenen Verfahren erhältliche dendritische Zellen zur Verfügung. Solche dendritische Zellen können zur Stimulation von THelferzellen in einer Zellkultur oder bei einem Patienten gegen ein spezifisches Antigen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist anhand der folgenden Beispiele und Figuren näher beschrieben, auf die sie jedoch nicht eingeschränkt ist.
F i g u r e n:
Figur 1: Unreife, Monozyten-abgeleitete DCs werden zusammen mit autologen T-Zellen nach der Infektion mit delNSl oder NSl124 (MOI = 2) kultiviert. Bilder werden 12 h und 24 h nach der Infektion gemacht.

Es wird die Färbung gegen das Nucleoprotein (NP) von Influenza (grün) und die Zellkern-DNA (rot) gezeigt. In allen infizierten DCs sind apoptotische Körper zu sehen (Pfeile) , zwischen den beiden Viren ist kein Unterschied festzustellen. Die Färbung erfolgte mit zwei verschiedenen Spenderzellenfes ist ein Versuch dargestellt.
Figur 2: Annexin-V-Färbung von unreifen Monozyten-abgeleiteten DCs 5 h nach der Infektion mit delNSl, NS1-124 oder PR8 (MOI = 2) zum Nachweis eines Phosphatidylserin-Schalters als frühen Marker von Apoptose. Graues Histogramm: scheininfizierte Zellen; offenes Histogramm: virus-infizierte Zellen. Es ist ein repräsentativer Versuch von sechs verschiedenen Spendern gezeigt.
Figur 3: (A) Oberflächenmarkerexpression von unreifen Monozyten-abgeleiteten DCs 30 h nach der Infektion mit delNSl, NS1124 und PR8 (MOI = 2) .

Es ist die Intensität der Färbung mit den aufgezeigten Antikörpern gezeigt; scheininfizierte Zellen
(graues Histogramm), delNSl (-), NSl-124 ( ) und PR8 (-) .
Die Ergebnisse wurden nach Untersuchung von mindestens 10.000 Zellen erhalten. Es ist ein repräsentativer Versuch von sechs verschiedenen Spendern gezeigt.
(B) Oberflächenmarkerexpression von unreifen Monozyten-abgeleiteten DCs 24 h nach der Transfektion mit Gesamt-vRNA oder Inkubation mit Virusprotein. Es ist die Intensität der Färbung mit
NACHGEREICHT den aufgezeigten Antikörpern gezeigt; scheininfizierte Zellen<(>graues Histogramm), vRNA-transfizierte Zellen (-) und mit Virusprotein gepulste Zellen ( ). Die Ergebnisse wurden nach
Untersuchung von mindestens 10.000 Zellen erhalten.

Es ist ein repräsentativer Versuch von drei verschiedenen Spendern gezeigt.
Figur 4: Wirkung einer delNSl- oder NSl-124-Infektion von MODCs, die nach der Induktion einer zytotoxischen Antitumor-Immunantwort mit Tumorzelllysaten gepulst wurden. Als Tumorlysat wurden durch ein Einfrier-Auftau-Verfahren zerstörte Panel-Zellen genommen. T-Zellen wurden zweimal mit gepulsten DCs stimuliert und infiziert. Eine CTL-Analyse erfolgte mittels eines Standard-Europium-Assays. Die Zytotoxizität wurde unter Verwendung<(>A<)>eines spezifischen Targets (Panel) oder (B) eines unspezifischen Targets (K-562-Zellen) bestimmt. T-: T-Zellen, die nicht mit DCs stimuliert wurden. T+ Panel: T-Zellen, die mit mit dem Tumorlysat geprimten DCs stimuliert wurden; T+ Pancl+delNSl: T-Zellen, die mit mit dem Pancl-Lysat geprimten DCs stimuliert und dann mit dem delNSl-Virus infiziert wurden.

T+ Pancl+NS-124: T-Zellen, die mit mit dem Pancl-Lysat geprimten DCs stimuliert und dann mit dem NS-124-Virus infiziert wurden. Die Ergebnisse in Prozent spezifischer Lyse stellen den Mittelwert von Dreifachmessungen dar. Repräsentative Ergebnisse eines von vier Versuchen von verschiedenen Spendern.
Figur 5: Wirkung von virusinduzierter Tumorzelllyse auf die Stimulation einer Antitumor-Immunantwort. Virolysate wurden unter Verwendung von delNSl oder NS1-124 für die Lyse von PanelZellen erhalten. Virolysate oder herkömmliche Onkolysate wurden zum Pulsen von MODCs verwendet. T-Zellen wurden zweimal mit gepulsten DCs stimuliert, die mit dem Onkolysat oder dem Virolysat gepulst waren. CTL-Analysen erfolgten mittels eines StandardEuropium-Assays.

Die Zytotoxizität wurde unter Verwendung (A) eines spezifischen Targets (Panel) oder (B) eines unspezifischen Targets<(>K-562-Zellen) bestimmt. T-: T-Zellen, die nicht mit DCs stimuliert wurden. T+ Panel: T-Zellen, die mit mit herkömmlichem Tumorlysat geprimten DCs stimuliert wurden; T+ Pancl+delNSl: TZellen, die mit mit dem Pancl-Lysat geprimten DCs stimuliert wurden, welches durch Infektion mit dem delNSl-Virus erhalten wurde. T+ Pancl+NS-124: T-Zellen, die mit mit dem Pancl-Lysat geprimten DCs stimuliert wurden, welches durch Infektion mit dem NS-124-Virus erhalten wurde. Die Ergebnisse in Prozent spezifi-
NACHGEREICHT scher Lyse stellen den Mittelwert von Dreifachmessungen dar.

Repräsentative Ergebnisse eines von vier Versuchen von verschiedenen Spendern.
Figur 6: Sechs Mäuse pro Gruppe wurden i.p. mit trivalenten (Hl, H3, B) Influenza-inaktivierten Vakzine-Antigenen (Vakzine) in einer Dosis von 15 bzw. 5 [mu]g pro Lebewesen allein oder in Kombination mit 6,5 log A/PR/8/34- oder delNS-Influenza-Lebendviren immunisiert. Drei Wochen später wurden Serumproben mittels ELISA auf die Anwesenheit von Antikörpern (IgG) gegen die Influenza-B-Komponente getestet. Durch Mischen des inaktivierten Virusantigens mit dem Lebendvirus wurde die Produktion von Antikörpern in der delNS-Gruppe mindestens um das 4-fache erhöht. Diese Wirkung war in beiden Gruppen von Mäusen ausgeprägt, die mit unterschiedlichen Dosen der inaktivierten Vakzine geimpft worden waren.

Gleichzeitig war der Immunadjuvanseffekt des A/PR/8/34-Virus viel schwächer und nur in der Gruppe von Tieren nachweisbar, die eine hohe Dosis der inaktivierten Vakzine erhalten hatte.
Figur 7: Aminosäuresequenz des nicht strukturellen Proteins NS1 des Influenza-A-Virus (Stamm A/PR/8/34)
B e i s p i e l e :
Die dargestellten Beispiele liefern Resultate über die immunstimulierende Kapazität von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (MODCs) nach der Behandlung mit NSl-Deletions- oder NS T unka ionsviren. Es zeigt sich, dass die NSl-modifizierten Viren eine potente Zytokinantwort in diesen Zellen induzieren und sogar die Reifung der dendritischen Zellen verbessern.

Ausserdem steht die delNSl-Infektion von mit Tumorzelllysat stimulierten DCs in Beziehung zu einer verstärkten zytotoxischen TZellen-Antwort, die spezifisch für tumorbezogene Antigene ist.
Beispiel 1: Materialien und Methoden
Zellen und Viren:
Funktionelle DCs können ex vivo aus peripheren Blutmonozyten oder aus von Knochenmark stammenden Zellen hergestellt werden. Für die Tumor-Vakzination werden die DCs mit definierten HLA-restriktierten Tumor-assoziierten Antigenen (TAA) oder mit einem Tumorzelllysat (Onkolysat) ex vivo stimuliert und anschliessend
NACHGEREICHT dem den Tumor aufweisenden Patienten reinfundiert oder reinjiziert. Klinische Phase-I-Studien zeigten, dass diese Art der Immuntherapie möglich und nur mit wenigen Nebenwirkungen beim Menschen verbunden ist. Reaktionsraten im ersten klinischen Phase-I-Versuch wurden jedoch nur in seltenen Fällen beobachtet.

Es ist aber eine grosse Herausforderung, die Wirksamkeit einer Vakzination auf CD-Basis zu verbessern.
Die humane Pankreas-Zelllinie Panel (ATCC) und die humane Erytroleukämie-Zelllinie K562 wurden in RPMI-1640-Medium (GibcoLife Technologies, USA) enthaltend 10 % fötales Kälberserum (PCS) und versetzt mit 5 mg/ml Gentamicin kultiviert. Auf serumfreiem Medium wachstumsfähige Vero-Zellen (ATCC) wurden in serumfreiem OPTIPRO-Medium (Invitrogen) gehalten. InfluenzaA/PR/8-Viren (PR8) und NSl-Deletionsviren wurden wie beschrieben unter Verwendung des auf dem Helfervirus basierenden Transfektionssystems hergestellt, d.h. der offene Leserahmen des NSlGens ist deletiert (Egorov, A. J. Virol., 72: 6437-41, 1998). Das PR8-wt-Virus enthält ein transfiziertes NS-wt-Gensegment und codiert für ein Wildtyp-NSl-Protein aus 230 Aminosäuren.

Das delNSl-Virus enthält eine vollständige Deletion im NS-Gensegment (Garcia-Sastre, A. , Virology, 252: 324-30, 1998); NS1-80 und NS1-124 sind PR8-abgeleitete Mutanten, die nur für die N-terminalen 80 und 124 Aminosäuren (aa) des NSl-Proteins codieren. Das für das NSl-80-NS-Segment codierende Plasmid wurde unter Verwendung eines Plasmids, welches für das durch einen poll-Promotor transkribierte Segment 8 codiert, und des Primer-Paars 3'NS269: 5'CATGGTCATTTTAAGTGCCTCATC-3' und 5'NS-TRG-415: 5'TAGTGAAAGCGAACTTCAGTG-3' konstruiert. Das für das NSl-124-Segment codierende Plasmid wurde unter Verwendung des oben genannten, für das Segment 8 des Wildtyp-Virus codierenden Plasmids und der Primer-Paare 3'NS400T: 5 ' atccatgatcgcctggtccattc-5 'und 5'NS-TRG-415 konstruiert.

Zur Ausbreitung der Viren wurden Vero-Zellen mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,1 infiziert und in OPTIPRO-Medium enthaltend 5 [mu]g/ml Trypsin (Sigma) bei 37 [deg.]C 2 bis 3 Tage lang kultiviert. Die Viruskonzentrationen wurden mittels PlaqueAssays auf Vero-Zellen bestimmt.
Virusinfektion und -replikation; Generierung von vRNA und Ganzvirusprotein; Tansfektion von viraler RNA:
Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen (MODC) wurden mit
NACHGEREICHT PBS gewaschen und mit PR8-wt- und NSl-Deletionsviren mit einer MOI von 0,1 infiziert. Nach 30-minütiger Inkubation wurde das Inokulum entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen, mit OPTIPRO-Medium enthaltend 2,5 [mu]g/ml Trypsin (Sigma) überlagert und bei 37[deg.]C 48 h lang inkubiert.

Die Überstände wurden in Plaque-Assays auf Vero-Zellen nach infektiösen Virusteilchen untersucht. vRNA wurde aus dem durch Zentrifugieren gereinigten Virus gewonnen. RNA wurde mit dem QUIA-Ap-RNA-Extraktionskit (Quiagen) gemäss dem Protokoll des Herstellers isoliert. Zur Transfektion von viraler RNA wurden 5 Tage alte, unreife MODCs nach Austausch des Mediums mit mit Lipofektamin komplexierter RNA 2 Stunden lang inkubiert. Das gesamte Virusprotein wurde mittels Standardverfahren aus dem durch Zentrifugieren gereinigten Virus extrahiert. Der Reinigungsgrad wurde mittels SDS-Gel-Gelektrophorese bestimmt.

Die Menge an Virusprotein wurde mittels Bradford-Analyse bestimmt.
Isolierung und Generierung von unreifen und reifen DCs:
Periphere mononucleare Zellen (PBMC) wurden mittels standardisierter Gradientenzentrifugation mit Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Schweden) aus 100 ml EDTA-Vollblut gewonnen. Danach wurden CD14-positive Zellen durch magnetische Sortierung unter Verwendung der VARIOMACS-Methode (Miltenyi BiotecGmbH, Bergisch-Gladbach, Deutschland) gemäss dem Protokoll des Herstellers abgetrennt.

Isolierte CD14+-Zellen wurden in einer Konzentration von 1 x 10<6>Zellen/ml in standardisierten Kulturflaschen (Costar, Cambridge; MA) 5 Tage lang in RPMI-1640-Medium (GibcoLife Technologies, USA) enthaltend 10 % fötales Kälberserum (PCS) und versetzt mit 5 mg/ml Gentamicin bei 37[deg.]C in einer befeuchteten, 5 %igen C02-Atmosphäre in Anwesenheit von jeweils 1000 E/ml rekombinantem humanem (rh) Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF) (Leukomax; AESCA, Traiskirchen, Österreich) und rh-Interleukin-4 (IL-4) (BPH, Hannover, Deutschland) kultiviert.

Am Tag 2 wurden rh GM-CSF und rh IL-4 in einer Konzentration von 1000 E/ml erneut zu den Kulturen gegeben.
Herstellung von Tumor- und Virolysaten:
Generierung von Onkolysaten: Panel (etwa 10<8>Zellen) wurden nach Lösen aus der Flasche zweimal mit PBS und in 2 ml PBS, ly-
NACHGEREICHT siert durch fünf Gefrier- und Auftau-Zyklen, gewaschen. Generierung von Virolysaten: Tumorzellen wurden mit einer MOI = 1 mit Influenza A (PR8 oder delNSl) infiziert und in RPMI 1640 kultiviert. 16 Stunden später wurden die Zellen aus der Flasche gelöst und in 2 ml PBS durch fünf Gefrier- und Auftau-Zyklen lysiert. Die Proteinkonzentration wurde gemäss Bradford bestimmt.
Herstellung von T-Zellen und Co-Kultur:
PBMCs wurden wie oben hergestellt. CD14 mit negativer Ladung wurden mit Hilfe von Magnetkugeln in einer CD3+-Fraktion abgetrennt.

Diese Fraktion wurde für die Co-Kultur verwendet. 1 x 10<6>gepulste DCs wurden mit 5 x 10<6>T-Zellen (CD3+) in RPMI-1640-Medium enthaltend 10 % fötales Kälberserum (PCS) und versetzt mit 5 mg/ml Gentamicin (GibcoLife Technologies, USA) 7 Tage lang gemischt.
Stimulation von virusinfizierten MODCs zur Induktion einer CTL-
Antwort:
Unreife DCs wurden mit dem durch das unter Material und Methoden beschriebene Gefrier-Auftau-Verfahren erhaltenen Tumorlysat inkubiert. Danach wurden unreife DCs mit delNSl- und NS1125-Viren mit einer MOI = 0,5 infiziert. Die DCs wurden dann mit peripheren Blut-T-Zellen co-kultiviert.

Dann wurde der Grad der spezifischen T-Zellen-Stimulation in einem Europium-Assay gegen das spezifische Target Panc-1 ermittelt.
Stimulation von MODCs mit Virolysat versus Onkolysat zur Induktion einer CTL-Antwort:
Die so erhaltenen unreifen DCs wurde am Tag 5 mit Tumorlysat oder Virolysat (100 [mu]g/ml) gepulst, das nach 12 Stunden wieder ausgewaschen wurde. Anschliessend wurde die Kultur gewaschen und 36 Stunden lang in RPMI 1640 enthaltend 1000 ng/ml TNF-alpha zur Beschleunigung der DC-Reifung 24 Stunden lang inkubiert. 4 Stunden vor der Co-Kultur wurden 1000 E/ml IFN-gamma (Imukin*<)>und IPS(Alexis Cooperation, Lausen, Schweiz) zugegeben. Die DCs wurden dann mit peripheren Blut-T-Zellen co-kultiviert.

Dann wurde der Grad der spezifischen T-Zellen-Stimulation in einem Europium-Assay gegen das spezifische Target Panc-1 bzw. gegen K562-Zellen ermittelt.
NACHGEREICHT Repulsation:
1 x 10<6>frische, gepulste DCs wurde mit 5 x 10<6>T-Zellen aus der Co-Kultur vermischt. Die Co-Kultur-Zellen wurden vor dem Mischen mit frischen DCs zweimal mit Medium gewaschen.
Durchflusszytometer-Analyse:
Der Phenotyp von unreifen und reifen dendritischen Zellen wurde mittels einer Ein- oder Zweifarben-Fluoreszenzanalyse bestimmt. Zellen (3 x 10<5>) wurden in 50 [mu]l Assaypuffer (PBS, 2 % PCS und 1 % Natriumazid) resuspendiert und 30 min lang bei 4[deg.]C mit 10 [mu]l entsprechenden, mit Fluoreszeinisothiocyanat (FUC<)>oder Phykoerythrin (PE) markierten mAbs inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen zweimal gewaschen und in 500 [mu]l Assaypuffer resuspendiert.

Die Zellfluoreszenz wurde in einem EPICS XL-MCL Durchflusszytometer (Coulter, Miami, FL, USA<)>analysiert. Für jede Probe wurden 10000 Ereignisse erfasst, und es wurde der Prozentanteil an positiven Zellen berichtet. Zur Charakterisierung der DCs wurden für Human-IgGlIsotyp, -CD3, -CD14, -CD80, -CD86, -CD83, -MHC Klasse I, -MHC Klasse II (Immunotech, Wien,Österreich) und -CD40 (PharMingen, PD) spezifische monoklonale Antikörper verwendet. Zum Nachweis von Apoptose wurde der Annexin-V-Apoptose-Detektionskit (Genzyme Diagnostics) verwendet. Unreife DCs wurden 5 h lang mit delNSl oder PR8 mit einer MOI = 2 i.p. infiziert. Die Zellen wurden gewaschen und gefärbt, um die Phosphatidylserin-Exposition am äusseren Segel der Zellmembran als frühen apoptotischen Marker gemäss den Instruktionen des Herstellers nachzuweisen.

Apoptotische Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen und quantitativ bestimmt .
Immunfluoreszenzfärbung:
Zellen wurden mittels Zytospin auf Objektträgern fixiert und mit 3,7 % Paraformaldehyd 10 min lang bei Raumtemperatur festgehalten. Die Objektträger wurden fünfmal mit PBS gewaschen und mit 0,5 % Triton X 20 min lang permeabilisiert. Primärer MausAntikörper gegen das Nucleoprotein (NP) von Influenza A<(>R.u.P. Margaritella) wurde bei einer Verdünnung von 1:100 in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin verwendet und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit Alexa(R) Fluor 488 Esel-Antimaus-IgG (Molecular Probes, Eugene, OR) und Propi-
NACHGEREICHT diumiodid zur Kernfärbung 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden nochmals mit PBS gewaschen und mit SlowFade(R) Light(Molecular Probes) montiert und versiegelt.

Mit einem Konvokal-Mikroskop Zeiss LSM 510 wurden Bilder gemacht.
Zytotoxizitätsassay (Europium-Freisetzungsassay) :
Die generierten CD8-positiven T-Lymphozyten wurden zuerst wie oben beschrieben isoliert und dann mit Tumor/Virolysat-gepulsten autologen DCs 5 bis 7 Tage ohne Zytokine co-kultiviert. Danach wurden ihre funktionellen Eigenschaften mit einem standardisierten Europium-Freisetzungsassay hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur spezifischen Lyse getestet. Dazu wurden 5 x 10<6>Zielzellen (Panel) mit Europium markiert. Die markierten Zielzellen wurden in einem Verhältnis von 50:1 bis 3:1 mit allogenen T-Lymphozyten (Effektorzellen) gemischt. Nach 4 Stunden Inkubation bei 37 [deg.]C wurde der Rückstand zur Bestimmung der freigesetzten Menge an Europium in einem Delfia-Fluorometer (Victor 2, Wallac, USA) analysiert.

Der prozentuelle Lyseanteil wurde wie folgt berechnet: (experimentelle Freisetzung - spontane Freisetzung)/ (Gesamtfreisetzung - spontante Freisetzung) x 100. Als Kontroll-Targets für NK-Zellen wurden K562-Zellen verwendet.
Zytokin-Nachweis nach Infektion mit Influenza A PR8 und delNSl:
Unreife DCs wurden mit Virus infiziert (MOI = 2) und 24 Stunden lang mit und ohne autologen CD3-positiven T-Lymphozyten in einem Verhältnis von 1:5 in RPMI-1640-Medium enthaltend 20 % fötales Kälberserum (PCS) kultiviert.

Der Überstand wurde dann auf TNF-alpha, IL-10, IL-6 (DPC Immulite, Los Angeles, USA<)>, IL-2, IL-4, IL-12(p70), IFN-gamma (Upstate, USA), IFN-alpha und IFN-beta gescreent (ELISA Kit, PBL Biomedical Laboratories<)>.
Beispiel 2: Induktion von Zytokinen durch NSl-Deletionsmutant<[beta]>n
Da beabsichtigt war, die Wirkung von NSl-Deletionsviren als Adjuvans zu untersuchen, wurde anfänglich die durch die Viren in professionell Antigen-aufweisenden Zellen wie dendritischen Zellen induzierte Zytokin-Antwort analysiert. Zuerst wurden unreife Monozyten-abgeleitete dendritische Zellen (MODCs) von 4 verschiedenen Probanden mit dem NSl-Deletionsvirus delNSl, NS1-124 oder PR8-Wildtypvirus (MOI = 2) infiziert. delNSl enthält überhaupt kein NSl-Protein und ist ein replikationsdefizientes Virus
NACHGEREICHT (Garcia-Sastre et al., 1998).

NS1-124 ist eine abgeschwächte NSl-Mutante und enthält die N-terminalen 124 aa von NS1. Es wurde die virusinduzierte Induktion von Zytokinen 24 Stunden nach der Infektion (Tabelle 1) bestimmt. Trotzdem die Aktivität von Zytokinen komplex ist und häufig nicht auf eine einzige Funktion eingeengt werden kann, lag der Schwerpunkt bei diesem Assay auf den Zytokinen der angeborenen "unspezifischen" Immunantwort, wie TNF, IL-6, Typ I IFN (IFN-alpha), da die Funktion unreifer DCs zu aktivieren ist und das Immunsystem zu Beginn der Infektion aktiviert. Polarisierende Zytokine des spezifischen Immunsystems, wie IL-10, IFN-gamma und IP-10, waren ebenfalls mit eingeschlossen. IL-10 wird mit der Induktion einer starken B-ZellenImmunantwort assoziiert. IFN-gamma und IP-10 lenken das Immunsystem auf eine zytotoxische T-Zelle.

Die Infektion von DCs mit beiden NSl-Deletionsviren induzierte eine massive Zytokin-Antwort sämtlicher proinflammatorischer Zytokine des angeborenen Immunsystems (TNF, IL-6, IFN-alpha) im Vergleich zu nicht infizierten dendritischen Zellen. Wichtig dabei ist, dass die Induktion dieser Zytokine durch die NSl-Deletionsviren signifikant(4- bis 100-mal) höher war als mit dem Wildtyp-Virus. Die Stimulation von IFN-alpha neigte beim delNSl-Virus etwas stärker zu sein als beim NSl-124-Virus. Wie nicht anders zu erwarten, gibt es starke interindividuelle Unterschiede bei der Virus-Zytokinstimulation. Polarisierende Zytokine wie IFN-gamma oder IL-10 wurden in unreifen MODCs nicht induziert. Das mag wenig überraschend sein, da die Induktion einer polarisierten T-ZellenAntwort nicht Aufgabe von unreifen dendritischen Zellen ist.

IP10 wurde jedoch von beiden Deletionsviren gut induziert.
NACHGEREICHT
- 26 Tabelle 1: Zytokinproduktion in virusinfizierten DCs
Zytokin* Proband Vi rus daL Sl NS1-124 PR8 nicht infiz .
TNF-alpha 1 2220 2061 234 11
2 4571 4591 665 46
3 5897 5353 1284 21
4 4363 2978 212 23
IL-6 1 1467 1275 541 9
2 1049 849 85 0
3 332 112 59 n .n.
4 670 565 124 n.n.
IL-10 1 0 0 0 0
2 0 0 0 0
3 0 0 6 n.n.
4 0 0 0 n.n.
IFN-alpha 1 1689 698 12 0
2 737 525 0 0
3 711 520 0 0
4 3385 1882 176 0
IFN-beta 1 64 165 187
2 730 373 n.n.
3 513 597 n .n.
IFN-gamma 1 0 0 0
2 0 0 n.n.
3 0 0 n.n.
4 0 0 n .n.
IP10 1 342 466 163
2 561 821 n.n.
3 639 529 n .n.
4 1383 826 n.n.
<EMI ID=26.1>

*) Konzentrationen in pg/ml
In einer weiteren Analyse wurde ermittelt, ob eine einzige Viruskomponente wie Ganzvirus-RNA oder Ganzvirusprotein für die Zytokinstimulation verantwortlich sein könnte.

Für diesen Assay wurde die Untersuchung von TNF und IFN-alpha gewählt, da diese Zytokine am potentesten durch die mutanten Viren stimuliert wurden (Tabelle 2) . Weder die Ganzvirus-RNA noch das Ganzvirusprotein konnten für eine Zytokin-Antwort verantwortlich sein, die signifikant höher als bei nicht infizierten Zellen war, obwohl das Ganzvirusprotein tendenziell etwas höher lag als die Kontrolle.

Diese Daten zeigen, dass Ganzviren, aber keine Einzel-
NACHGEREICHT komponenten für das Zytokin-Aktivierungsmuster, das während der Virusstimulation beobachtet wurde, anwesend sein müssen.
Tabelle 2: Zytokinproduktion in unreifen MODCs transfiziert mit vRNA / inkubiert mit Virusprotein / infiziert mit Virus
TNF* IFN-alpha* scheintransfiziert 13,8 0
Virus-RNA (6 [mu]g transfiz.) 28,5 0
Virus-Gesamtprotein (50 [mu]g) 6 0 delNSl (MOI = 2)
<EMI ID=27.1>
4262 1707
') Konzentrationen in pg/ml
Die Hauptaufgabe von dendritischen Zellen besteht in der Aktivierung von Lymphozyten. Daher wurde das Zytokinprofil von infizierten MODCs in Co-Kultivierung mit CD8-positiven Lymphozyten analysiert. Der Schwerpunkt lag auf der T-Zellen-Untergruppe, da diese Zellen für die Induktion einer Antitumor-Immunantwort besonders wichtig sind.

Fünf Tage alte, unreife MODCs wurden verwendet, um die Ergebnisse mit dem oben beschriebenen Assay vergleichen zu können. Die wichtigsten bekannten polarisierenden Zytokine, die die Stimulation von T-Zellen wie IL-4 und IL-10 (Stimulation von Th-2-Zellen) und IL-2 und IFN-gamma (Stimulation von Th-1-Zellen) fördern, wurden in den Co-Kultur-Versuch mit eingeschlossen. Die Zytokin-Antwort nicht infizierter DCs, die mit T-Zellen co-kultiviert werden, ist etwas stärker als die Zytokin-Antwort nicht infizierter unreifer DCs allein (Tabelle 3) . Es wird angenommen, dass diese schwache Zytokin-Antwort bereits eine DC-Aktivierung anzeigt. Auch hier stand die Virusinfektion mit einem massiven Anstieg der Zytokin-Antwort im Vergleich zu nicht infizierten co-kultivierten dendritischen Zellen in Verbindung.

Bei diesem Versuch wurde ein drittes delNSl-mutantes Virus mit einer intermediären Deletion (NS1-80) mit eingeschlossen. Es zeigte sich, dass dieses Virus solide T-Zellen-Immunantworten beim Tier hervorrief. Im Gegensatz zur Virusstimulation von unreifen dendritischen Zellen produzieren co-kultivierte virusinfizierte dendritische Zellen beachtliche Gehalte von IFNGamma, aber auch niedrige Gehalte an 11-2 und 11-10. Interessanterweise war IFN-alpha signifikant höher als bei unreifen DCs.
NACHGEREICHT Andere Zytokine des angeborenen Immunsystems (TNF, IL-6) wurden in der virusinfizierten Co-Kultur gleichermassen induziert wie in unreifen CD-Kulturen.

Somit lässt das Zytokinprofil vermuten, dass die Infektion mit Viren DCs stark aktiviert und eine gegen T-Zellen gerichtete zytotoxische Immunantwort unterstützt.
Tabelle 3: Zytokinproduktion in mit T-Zellen co-kultivierten virusinfizierten DCs
Zytokin * Proband Virus delNSl NS1-80 NS1-124 nicht infiz .
TNF-alpha 1 3501 1902 2503 n.n.
2 1732 1028 1919 50
3 889 919 919 n.n.
4 3456 1171 3881 n.n.
IL-2 1 48 83 51 0
2 63 107 73 n.n.
3 70 131 103 n.n.
4 99 250 181 n.n.
IL-4 1 0 0 0 0
2 0 0 0 n.n.
3 0 0 0 n.n.
4 0 0 0 n.n.
IL-6 1 538 306 446 52
2 1133 518 630 n.n.
3 156 144 163 38
4 2848 935 2146 n.n.
IL-10 1 49 50 51 16
2 65 52 61 n.n.
3 22 27 22 n.n.
4 299 331 300 n.n.
IL-12 p70 1 0 0 0 0
2 0 0 0 n.n.
3 0 0 0 n.n.
4 0 0 0 n.n.
IFN-alpha 1 4790 5623 5494 77
2 6342 5442 5942 n.n.
3 3506 4516 4162 n.n.
4 1414 1467 1502 n.n.
IFN-beta 1 226 241 284 54
2 162 189 186 n.n.
3 145 58 137

n.n.
<EMI ID=28.1>

NACHGEREICHT IFN-g.a[iota]r[iota]ma 1 384 507 406 0
2 396 445 417 n.n.
3 788 763 902 n.n.
4 483 617 512 n.n.
<EMI ID=29.1>

*) Konzentrationen in pg/ml
Beispiel 3: NSl-Deletionsmutanten infizieren MODCs abortiv und induzieren Apoptose in MODCs
Zur Untersuchung, ob sich ein Virus in MODCs repliziert, wurden Zellen mit entweder delNSl oder NS1-124 infiziert. Die Generierung von Virusprotein wurde mittels Immunhistochemie bestimmt. Dieser Versuch wurde im Co-Kultursystem unter Verwendung von DCs und autologen CD8-positiven T-Zellen durchgeführt, um die Situation in einem Lymphknoten nachzuahmen. Eine positive Färbung auf Virusproteine wurde bei mit delNSl-Virus infizierten DCs und bei mit NSl-124-Virus infizierten DCs beobachtet (Fig. 1) . Interessanterweise hafteten die T-Zellen an virusinfizierten DCs in einer rosettenartigen Konfiguration.

Dieses Phänomen wurde bei nicht infizierten DCs nicht beobachtet. Das könnte mit der Expression von HA durch DCs und der Anhaftung von Lymphozyten erklärt werden. Alternativ könnte es auf die Wechselwirkung von aktivierten Lymphozyten mit DCs zurückgehen.
Der virusinduzierte vollständige zytopathische Effekt (CPE) wurde üblicherweise bei DCs nach 24 bis 48 Stunden beobachtet. CPE entsprach der Apoptose, wie durch Annexin-V-Färbung festgestellt wurde (Fig. 2) .

Im Überstand von delNSl-Deletionsvirusinfizierten MODCs wurden keine Infektionstiter gefunden, was darauf hindeutet, dass die Infektion nicht produktiv ist und dass MODCs durch NSl-Deletionsmutanten abortiv infiziert werden.
Beispiel 4: Induktion von R[beta]ifungsmarkern durch NSl-Deletionsmarker
Es wurde die Fähigkeit der delNSl-Deletionsmutanten delNSl und NS1-124, die Reifung in dendritischen Zellen zu induzieren, bewertet. Daher wurde der virusinduzierte Anstieg der Reifungsmarker CD83, CD80 und CD86 auf der Oberfläche von unreifen dendritischen Zellen zusätzlich zur Expression oder Oberflächenexpression auf MODCs wie CD40, MHC Klasse I und MHC Klasse II bestimmt. Untersucht wurden fünf verschiedene Probanden. Trotz interindividueller Unterschiede gab es ein klares Expressions-
NACHGEREICHT profil. Fig. 3a zeigt einen repräsentativen Versuch.

Auch hier gab es keinen Unterschied bei den beiden Deletionsviren. Die stärkste Induktion (etwa 10-fach) wurde bei CD86 und MHCII beobachtet. Eine geringe Induktion zeigte sich bei CD83 und CD80. CD40 und HMC Klasse 1 wurden in unreifen MODCs leicht niederreguliert. Die Niederregulierung bei diesen für die Antigenpräsentation in unreifen MODCs relevanten Molekülen entspricht dem Unvermögen dieser Zellen, polarisierende Zytokine wie IL-2 oder IFN-gamma zu induzieren, wie oben besprochen (Tabelle 1) .
Es wurde weiters untersucht, ob Subkomponenten des Virus wie Ganzvirus-RNA oder Ganzvirusprotein für die Induktion der Oberflächenmarker verantwortlich sind (Fig. 3b) . Subkomponenten des Virus zeigten ein anderes Bild als das Ganzvirus.

Die Transfektion von Ganzvirus-RNA, transfiziert in unreife MODCs, induzierte hohe Gehalte von CD86 und CD40 sowie niedrige Gehalte von CD83, CD80, MHC Klasse I und MHC Klasse II. Das Transfektionsverfahren allein zeigte keinerlei Wirkung auf diese Moleküle. Ganzvirusprotein reduzierte die Expression von CD40, CD86, HLA Klasse I, HLA Klasse II und zeigte keinerlei Wirkung auf CD83 und CD80. Das Virusprotein könnte somit für die virusvermittelte Wirkung auf CD40 und MHC Klasse I verantwortlich sein. Virale RNA könnte für die virusinduzierte Induktion von Reifungsmarkern verantwortlich sein.
Beispiel 5: DelNSl-Virusinfektion von MODCs verstärkt deren immunstimulierende Kapazität
Es wurde ermittelt, ob die Virusinfektion von MODCs und die damit verbundene Zytokinstimulation in Zusammenhang mit einem Anstieg der Funktionskapazität von MODCs steht.

Als Funktionsassay wurde die Induktion einer zytotoxischen T-Zellen-Antwort durch mit dem Lysat von Tumorzelllinien stimulierte MODCs verwendet. Unreife MODCs wurden mit einem allogenen Onkolysat, generiert aus der Pancl-Tumor-Zelllinie, inkubiert und anschliessend entweder mit delNSl oder mit dem NSl-124-mutanten Virus infiziert. Dann wurden DCs mit dem aus der Panel-Tumorzelllinie generierten allogenen Okolysat inkubiert. Die DCs wurden dann mit autologen peripheren Blut-T-Zellen co-kultiviert. Keine Zytokine wurden zugesetzt. Der Grad der spezifischen T-Zellen-Stimulation wurde dann in einem Europium-Assay gegen das spezifische Target Panc-1 bestimmt. Fig. 4A zeigt einen repräsentativen Versuch von
NACHGEREICHT 00 000 0000 000 00 000
- 31 vier verschiedenen Spendern.

Virusinfizierte MODCs waren potenter bei der Induktion einer Immunantwort gegen die Tumorzelllinie als nicht infizierte MODCs. Um auszuschliessen, dass die beobachtete zytotoxische Wirkung auf Panel-Zellen durch stimulierte NK-Zellen bedingt war, wurden K562-Zellen als Target verwendet<(>Fig. 4B<)>. Bei diesem Versuch wurde keine Zytotoxizität beobachtet .
Beispiel 6: Virolysat versus Onkolysat bei der Kapazität, DCs zu stimulieren
Es wurde gezeigt, dass die delNSl-Viren und teilweisen NSlDeletionsviren die Onkolyse in einem Mäuse-Tumormodell induzierten. Diese Beobachtung begründete NSl-deletionsmutante Prototypen für onkolytische Viren als therapeutische Mittel.

Es wurde festgestellt, ob ein Zusammenhang zwischen der Virolyse von Tumorzellen mit einem NSl-Deletionsvirus und der erhöhten immunologischen Kapazität des Lysats bei der Stimulation von MODCs gegenüber Tumorzelllysen bestand, die in Abwesenheit eines immunstimulierenden Mittels generiert wurden.
Unreife Monozyten-abgeleitete DCs wurden mittels Virolyse unter Verwendung von delNSl oder NS-124 oder durch das mittels eines Einfrier/Auftau-Verfahrens erhaltene Onkolysat inkubiert. Als Tumorzelllinie wurde Panel verwendet. Durch das Lysat stimulierte DCs wurden dann mit autologen peripheren Blut-T-Zellen co-kultiviert. Es wurden keine Zytokine zugegeben. Dann wurde der Grad der spezifischen T-Zellen-Stimulation in einem Europium-Assay gegen das spezifische Target Panc-1 bestimmt.

Fig. 5A zeigt einen von drei repräsentativen Versuchen unter Verwendung von drei verschiedenen Spendern für DCs und T-Zellen. Das Virolysat hatte die Tendenz, DCs etwas besser zu stimulieren als das herkömmliche Onkolysat. Die Wirkung war jedoch nicht so ausgeprägt, wie sie bei der direkten Infektion von dendritischen Zellen mit den Viren beobachtet wurde. Wiederum wurde jegliche NKvermittelte Zelltötung unter Verwendung von K562 als Targets ausgeschlossen<(>Fig. 4B) . Ausserdem zeigte eine Zytometrie keine CD-56-pos. Zellen, was wiederum darauf hindeutete, dass NKZellen nicht an der zytotoxischen Wirkung beteiligt waren.
D i s k u s s i o n
Es ist wohl bekannt, dass Viren eine potente IiuiuiuidiiLwöft
IiuiuiuidiiLwöft
NACHGEREICHT gegen Antigene induzieren, die vom Virusgenom exprimiert werden.

Diese Antigene können endogene Virusantigene, aber auch Fremdantigene sein, die gentechnisch in das Virusgenom eingeführt wurden.
Hier wird gezeigt, dass Virusvakzine-Prototypen wie die Influenza-NSl-Deletionsviren in der Lage sind, eine Immunantwort auch dann zu verstärken, wenn Antigene in trans vorgesehen und nicht vom Virus exprimiert werden (in eis) . Auf diese Weise funktioniert das NSl-Deletionsvirus als Adjuvans-ähnliches Mittel.
Die Verstärkung einer CD8-restringierten zytotoxischen TZellen-Antwort durch das Virus wurde unter Verwendung von humanen dendritischen Zellen nachgewiesen. Die Induktion von B-Zellen durch das Virusadjuvans wurde in humanen dendritischen Zellen in einem murinen Mausmodell gezeigt.

Diese Antigen-spezifische immunstimulatorische Wirkung auf das delNSl-Virus steht in Zusammenhang mit einer profunden Stimulation und Aktivierung von dendritischen Zellen durch das delNSl-Virus, wie durch die Induktion von Zytokinen und Aktivierungsmarkern nachgewiesen wurde. Man glaubt, dass die Aktivierung von DCs sowohl für eine T-Zellen- als auch für eine B-Zellen-Immunantwort relevant ist.
Interessanterweise wurde diese Aktivierung nicht durch irgendeine Viruskomponente allein, sondern durch das Ganzvirus erreicht. Einzelne Viruskomponenten konnten einen gewissen Grad an Immunstimulation wie die isolierte Verstärkung von Aktivierungsmarkern herbeiführen (Fig. 3b) , waren aber nicht imstande, die konzertierte Reihe von viraler DC-Stimulation zu induzieren (Tabellen 1-3) .

Daher ist die Funktionskapazität der DCs für die gesamte Gruppe von virusinduzierten Zytokinen und Aktivierungsmarkern, nicht aber einzelne Komponenten essentiell.
Die Daten belegen auch, dass das DC-bezogene Zytokinmuster von der Anwesenheit von T-Zellen abhängt. Während viral induzierte DCs in Abwesenheit von T-Zellen in erster Linie Zytokine des angeborenen Immunsystems produzieren, produzieren DCs in Anwesenheit von T-Zellen polarisierende Zytokine. In beiden Szenarien steigert die Virusinfektion die Zytokinproduktion gewaltig. Da polarisierende Zytokine, die durch die Co-Kultur induziert wurden, eine Th-1-Antwort stark begünstigen, sind NSl-Deletionsviren für die Induktion einer starken CTL-Zellantwort bestens vorbereitet und könnten als spezifische CTL-Immunverstärker fungieren.

Wichtig ist, dass die Zvtokinstimulation durch NSl-Dele-
NACHGEREICHT tionsviren im Vergleich zum Wildtyp-Virus verbessert ist. So bestätigt sich, dass NS1 als immunsuppressiver Faktor bei der Induktion der angeborenen Immunantwort fungiert. Zum Beispiel führt eine Infektion von murinen Knochenmark-abgeleiteten DCs mit dem delNSl-Virus zur Reifung von DCs und steht mit einem höheren Grad an NF-[kappa]B-Aktivierung und Induktion der NF-[kappa]B-abhängigen Zytokine TNF, IL-6 und IL-lb in Verbindung als Wildtyp-Viren(Lopez et al., J. Inf. Dis., 2003). Die stärkere Induktion von IFN-alpha durch delNSl-Viren gegenüber Wildtyp-Viren war auch bei humanen Plasmozytoid-DCs (Diebold et al., Nature 424: 324-238, 2003)und bei LPS-induzierten oder reifen Monozyten-abgeleiteten DCs(Efferson et al., J.

Virol. 77: 7411-7424, 2003) zu sehen.
Es ist ein wichtiger Aspekt für die klinische Anwendung, dass das erfindungsgemäss verwendete Virus abgeschwächt ist und in Tierversuchen die Merkmale von Vakzine-Stämmen zeigt<(>Talon, J., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97: 4309-14, 2000). Diese Eigenschaften deuten darauf hin, dass die Anwendung eines Influenzavirus mit einem deletierten NSl-Gen beim Menschen möglich ist. Zuvor wurde gezeigt, dass die immunsteigernde Wirkung von NSlDeletionsviren zur Induktion von viralen Epitopen und Chimären Epitopen, die vom Virus exprimiert werden, verwendet werden kann. Der neue Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die proinflammatorisc e Kapazität des Virus auch zur Verstärkung einer Immunantwort auf Fremdantigene eingesetzt werden kann, die in den virusinfizierten Zellen reifen, für die das Virusgenom aber nicht codiert.

Diese in-trans-Stimulation macht das Virus in einem gewissen Sinn zu einer Art ImmunstimulationsAdjuvans. Eine solche Anwendung würde eine mögliche klinische Anwendung von abgeschwächten oder replikationsdefekten Viren stark erweitern.
Die in diesem Assay verwendeten Verfahren der DC-Kultivierung werden für auf Volltumorlysaten basierenden Impfungen bei solidem Krebs verwendet. Die vorliegenden Daten zeigen nunmehr, dass abgeschwächte RNA-Viren wie die NSl-Deletionsviren ein vernünftiges Adjuvans zur Erhöhung der Wirkung solcher auf DCs basierender Krebsvakzinen darstellen könnten. Diesbezüglich ist es von grosser Bedeutung, dass die NSl-Deletionsviren RNA-Viren sind, bei denen das Gen, welches die immunstimulierende Wirkung der Virus-RNA blockiert, deletiert ist (Garcia-Sastre, A. Virology, 219: 375-84, 2001).

Auf diese Weise ste.ht mfthr RNA ftiF die
NACHGEREICHT Immunstimulation zur Verfügung. Das ist günstig für eine Vakzine gegen Krebs, da Leitner, W. et al., (Nat. Med., 9: 33-9, 2003<)>gezeigt haben, dass durch die Zugabe von dsRNA zu einer VakzineFormel diese Selbsttoleranz in einem Tumor-Tiermodell in vivo wirkungsvoll überwunden werden kann. Da die meisten Tumor-assoziierten Antigene Selbstantigene sind, stellt die Selbsttoleranz ein bedeutendes Problem dar. Während eine reine DNA-Vakzine, die für endogene TAA codiert, keine Wirkung zeigte, konnte die Kombination der DNA-Vakzine mit einer ein RNA-Replikon generierenden dsRNA die immunologische Toleranz gegenüber TAA brechen und induzierte eine schützende Immunantwort. Die Tumorvakzine auf Basis des RNA-Replikons wurde mit dem Aktivierungs-PKR und -RNAseL gekoppelt.

Diese Proteine sind beide wichtige Effektorproteine innerhalb des Typ-I-IFN-Pfades. Daher ist die Induktion einer Typ-I-IFN-Antwort und PKR wie mit den NSl-Deletionsmutanten beobachtet ein bedeutender Schritt zur Überwindung der Selbsttoleranz .
Maligne Tumore stellen eine Region lokaler Immunsuppression dar, da maligne Krebszellen selbst immunsuppressive Zytokine wie TGFss oder IL-10 produzieren können. Hier wurde nachgewiesen, dass die Infektion der malignen Zelle mit dem Virus (Fig. 5) die Immunantwort von stimulierten DCs gegen Tumor-assoziierte Antigene verstärken kann. Diese Daten zeigen, dass ein Virus die Tumor-assoziierte Immunsuppression überwinden kann. So agiert das delNSl-Virus als immunmodulierendes Mittel.

Aufgrund der oben genannten Eigenschaften von NSl-Deletionsviren, wie PKR-Induktion und hoher Gehalt an Virus-RNA, könnten solche Prototypen besonders wertvoll bei der Ausübung derartiger immunmodulierender Wirkungen bei Krebs sein.
Erst kürzlich wurde gezeigt, dass die Expression von dsRNA in einer Zelle auch eine ähnliche Wirkung ausüben kann. Aufgrund der oben genannten Daten übt jedoch auch hier wieder ein Ganzvirus eine tiefer gehende Wirkung aus als RNA allein. Darüber hinaus können Tumorzellen in vivo mit RNA nicht leicht transduziert werden. Daher könnte ein Lebendvirus im klinischen Kontext zur Ausübung dieser RNA-basierenden immunstärkenden Wirkung substantiell sein.

Da sich gezeigt hat, dass das delNSl-Virus sogar die Lyse von suszeptiblen Tumorzellen induzieren kann, ist ein derartiger Virus-Prototyp ideal zur Antagonisierung von tumorinduzierter Immunsuppression.
NACHGEREICHT

Claims

ara 35 - Patentansprüche:

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen ein Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass

(a) das Antigen und

(b) ein Adjuvans in Form eines Influenzavirus ohne aktiven Interferonantagonisten enthalten ist.

1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen ein Antigen, umfassend

(a) das Antigen und

(b) ein Adjuvans in Form eines apathogenen Virus.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Influenzavirus ein gentechnisch hergestelltes Virus ist, das eine Mutation, eine Trunkation, ein Knock-out oder eine reduzierte Expression eines endogenen Interferon-Antagonist-Gens umfasst.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das apathogene Virus ausgewählt ist aus apathogenem Vaccinia-Virus, Adenovirus, Hepatitis-C-Virus, Newcastle-Disease-Virus, Paramyxovirus, SendaiVirus, Respiratory-Syncytial-Virus, Filoviridae, Herpex-simplexVirus Typ 1, Reovirus, Influenzavirus oder VSV, insbesondere Reovirus, VSV oder Influenzavirus.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, worin das Adjuvans ein gentechnisch hergestelltes Influenzavirus mit einem mutierten oder trunkierten NSl-Protein oder einem Knock-out oder einer reduzierten Expression des NSl-Gensegments ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das apathogene Virus ein gentechnisch hergestelltes Virus ist, das eine Mutation, eine Trunkation, ein Knock-out oder eine reduzierte Expression eines endogenen Interferon-Antagonist-Gens oder endogenen Immunsuppressor-Gens umfasst.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin die Expression des NSl-Proteins mindestens 5-, vorzugsweise 10-mal geringer als bei einem Wildtyp-Virus ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das gentechnisch hergestellte Virus ausgewählt ist aus dem Herpesvirus Myb34.5, dem Vaccinia-Virus MVA oder dem Newcastle-Disease-Virus, dem das V-

Protein fehlt.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder 4, worin die Reduktion der NSl-Expression durch Mutationen in den 3 ' -terminalen und/o der 5 ' -nicht-codierenden Nucleotiden des Segments 8, vorzugsweise durch Mutationen im NSl-ORF, noch bevorzugter durch Substitution der nicht codierenden Sequenzen des Segments 8 durch nicht codierende Regionen des NA-Segments, erzielt wird.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 3, worin das Adjuvans ein gentechnisch hergestelltes Influenzavirus mit einem mutierten oder trunkierten NSl-Protein oder einem Knock-out oder einer reduzierten Expression des NSl-Gensegments ist.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus eine Deletion des gesamten NSl-Gensegments enthält.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, worin die Expression des NSl-Proteins mindestens 5-, vorzugsweise 10-mal geringer als bei einem Wildtyp-Virus ist.

7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus ein trunkiertes NSlProtein mit einer C-terminalen Deletion enthält, während die ersten 60, insbesondere 80, ganz besonders 126 Aminosäuren des Wildtyp-NSl-Genprodukts beibehalten sind.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, worin die Reduktion der NSl-Expression durch Mutationen in den 3 ' -terminalen und/o der 5 -nicht-codierenden Nucleotiden des Segments 8, vorzugsweise durch Mutationen im NSl-ORF, noch bevorzugter durch Substitution der nicht codierenden Sequenzen des Segments 8 durch nicht codierende Regionen des NA-Segments, erzielt wird.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus die NSl-124-Mutation enthält, die nur die N-terminalen 124 Aminosäuren des NSl-Proteins enthält.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus eine Deletion des gesamten NSl-Gensegments enthält.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus die NSl-80-Mutation enthält, die nur die N-terminalen 80 Aminosäuren des NSl-Prote-

NACHGEREICHT R 45301

-<>36"'-

A 1332/2005 ins enthält.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus ein trunkiertes NSlProtein mit einer C-terminalen Deletion enthält, während die

NACHGEREICHT ersten 60, insbesondere 80, ganz besonders 126 Aminosäuren des Wildtyp-NSl-Genprodukts beibehalten sind.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, worn dem NSl-Protein des gentechnisch hergestellten Influenzavirus ene funktioneile RNA-Bindungsdomäne fehlt.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus die NSl-124-Mutation enthält, die nur die N-terminalen 124 Aminosäuren des NSl-Proteins enthält.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, worin das Virus ein abgeschwächtes Virus ist.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin das gentechnisch hergestellte Influenzavirus die NSl-80-Mutation enthält, die nur die N-terminalen 80 Aminosäuren des NSl-Proteins enthält.

12 Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 10, worn das Adjuvans ein gentechnisch hergestelltes Influenzavirusst, das durch Ersetzen der nicht codierenden Sequenzen des NSl-Gens durch jene anderer Gensegmente abgeschwächt ist.

12. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, worin dem NSl-Protein des gentechnisch hergestellten Influenzavirus eine funktioneile RNA-Bindungsdomäne fehlt.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 3 bis 10 oder 12, worin das Influenzavirus ein abgeschwächtes Influenza-A-Vrus oder ein abgeschwächtes Influenza-B-Virus ist.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, worin das Virus ein abgeschwächtes Virus ist.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worn das Antigen dem Virus beigemischt wird.

14. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 12, worin das Adjuvans ein gentechnisch hergestelltes Influenzavirus ist, das durch Ersetzen der nicht codierenden Sequenzen des NSl-Gens durch jene anderer Gensegmente abgeschwächt ist.

15 Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin das Antigen mit demVirus komplexiert oder von diesem getrenntst

15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 5 bis 12 oder 14, worin das Influenzavirus ein abgeschwächtes Influenza-A-Virus oder ein abgeschwächtes Influenza-B-Virus ist.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, umfassend mindestens ein zusätzliches Adjuvans.

16. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin das Antigen dem Virus beigemischt wird.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin das mindestens ene zusätzlicheAdjuvans ausgewählt ist aus Mineralgelen, Alumnumhydroxid, oberflächenaktiven Substanzen, Lysolecithin, PluromcPolyolen, Polyanionen oder ölemulsionen oder einer Kombnaton derselben.

17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin das Antigen mit dem Virus komplexiert oder an dieses kovalent gebunden ist.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, weters umfassend Puffersubstanzen.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend mindestens ein zusätzliches Adjuvans.

19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 18, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, worin das mindestens eine zusätzliche Adjuvans ausgewählt ist aus Mineralgelen, Aluminiumhydroxid, oberflächenaktiven Substanzen, Lysolecithin, PluronicPolyolen, Polyanionen oder ölemulsionen oder einer Kombination derselben.

20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin das Antigen ausgewählt ist aus Tumorantigenen oder Antigenen vonnfektiösen Pathogenen wie verschiedenen Viren, Bakterien, Parasten oder Pilzen.

20. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, weiters umfassend PufferSubstanzen.

21 Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worn das Antigen ausgewählt ist aus gpl60, gP120 oder gP41 von HIV,

HA und NA des Influenzavirus, Antigenen von endogenen Retrovren, Antigenen des humanen Papillomavirus, insbesondere E6- und

E7-Protein, Melanom gP100, Survivin, Her2neu, NY-ESO, Tuberkulose-Antigenen, Hepatitis-Antigenen, Polio-Antigenen.

21. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 20, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

22. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, umfassend ein Zytokin.

NACHGEREICHT R 45301

R 45301 - 37 - A 1332/2005

22. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Antigen ausgewählt ist aus Tumorantigenen oder Antigenen von in-

NACHGEREICHT

- 37 fektiösen Pathogenen wie verschiedenen Viren, Bakterien, Parasiten oder Pilzen.

23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, worin das Virus eine genetische Sequenz für ein immunstimulato[pi]sches Zytokin umfasst.

23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 22, worin das Antigen ausgewählt ist aus gpl60, gpl20 oder gp41 von HIV, HA und NA des Influenzavirus, Antigenen von endogenen Retroviren, Antigenen des humanen Papillomavirus, insbesondere E6- und E7-Protein, Melanom gplOO, Survivin, Her2neu, NY-ESO, Tuberkulose-Antigenen, Hepatitis-Antigenen, Polio-Antigenen.

24 verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach den<A>n sprachen 1 bis 23, weiches den Schritt des Mischens des Antgens mit de, eine Mutation, eine Trunkation, ein Knock-out oder ene Reduzierte Expression eines endogenen Interferon-Antagomst-Gens enthaltenden Virus umfasst. _

24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, umfassend ein Zytokin.

25 Pharmazeutische Formulierung zur Einnahme, umfassend ene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 und einen geei[sigma]neten Träger. .

25. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 24, worin das Virus eine genetische Sequenz für ein immunstimulatorisches Zytokin umfasst.

26 Pharmazeutische Formulierung für intranasale Verabrechung umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bs und einen geeigneten Träger in Form von Nasentropfen oder f<ü>r intranasale Gabe mit Hilfe einer Sprayvorrichtung.

26. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung nach den Ansprüchen 1 bis 25, welches den Schritt des Mischens des Antigens mit dem eine Mutation, eine Trunkation, ein Knock-out oder eine reduzierte Expression eines endogenen Interferon-Antagonist-Gens oder endogenen Immunsuppressors enthaltenden Virus umfasst.

27 Pharmazeutische Formulierung für subkutane, intramuskul<ä>re, intravaskuläre oder intraperitoneale Injektion, umfassend ene Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 und enen geeigneten stabilisierenden Träger.

27. Pharmazeutische Formulierung zur Einnahme, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 25 und einen geeigneten Träger.

28 Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulerung nach den Ansprüchen 25 bis 27, welches den Schrtt des M<i[not]>schens einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bs mit einem geeigneten Träger umfasst.

28. Pharmazeutische Formulierung für intranasale Verabreichung, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 25 und einen geeigneten Träger in Form von Nasentropfen oder für intranasale Gabe mit Hilfe einer Sprayvorrichtung.

29 Verwendung eines Influenzavirus ohne aktiven Interferonanta[sigma]onisten, vorzugsweise[Lambda]o[iota]hnnoeMNSoilPrrootreeinn,, zur Herstellung eines

Unmodu.ierenden Adjuvans zur Induktion einer imunstegernden Wirkung eines Antigens oder zur Oberwindung einer pathogenmduzierten Immunsuppression oder einer Krebs-induzierten Immunsup-

Dression. . , " -[eta] [Lambda]_

29. Pharmazeutische Formulierung für subkutane, intramuskuläre, intravaskuläre oder intraperitoneale Injektion, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 25 und einen geeigneten stabilisierenden Träger.

30 Verfahren zur in-vitro-Aktivierung von dendritischen Zellenmi; einem spezifischen Antigen, dadurch ***(TM)*<1>?^ **An_ dendritische Zellen mit einer Zusammensetzung nach enem der An sprüche 1 bis 23 in vitro kontaktiert werden.

30. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung nach den Ansprüchen 27 bis 29, welches den Schritt des Mischens einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 25 mit einem geeigneten Träger umfasst.

31 Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzechnet, dass de Kontaktierung 10 Minuten bis 8 Stunden, vorzugsweise 10 bs

Minuten, lang erfolgt. , . .

31. Verwendung eines apathogenen Virus, vorzugsweise wie für eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 15 spezifiziert, vorzugsweise eines abgeschwächten NSl-defizienten Influenza-A-Virus, zur Herstellung eines immunmodulierenden Adjuvans zur Induktion einer immunsteigernden Wirkung eines Antigens oder zur Überwindung einer pathogeninduzierten Immunsuppression oder einer Krebs-induzierten Immunsuppression.

NACHGEREICHT

32 Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, dadurch gekennzechnet, dass das spezifische Antigen ein isoliertes Tumor- oder Vrusantigen, ein rekombinantes Tumor- oder Virusantigen oder en Tumor- oder Viruslysat ist.

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NACHGEREICHf R 45301 <EMI ID=42.1> - 38 A 1332 /2005

32. Verfahren zur in-vitro-Aktivierung von dendritischen Zellen mit einem spezifischen Antigen, dadurch gekennzeichnet, dass dendritische Zellen mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 25 in vitro kontaktiert werden.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Viruslysat durch Infektion von Tumorzellen mit dem Influenzavirus ohne aktiven Interferonantagonisten, vorzugsweise ohne NSl Protein, erhalten wird.

33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontaktierung 10 Minuten bis 8 Stunden, vorzugsweise 10 bis 60 Minuten, lang erfolgt.

34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, dass das spezifische Antigen ein isoliertes Tumor- oder Virusantigen, ein rekombinantes Tumor- oder Virusantigen oder ein Tumor- oder Viruslysat ist.

35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass das Viruslysat durch Infektion von Tumorzellen mit dem apathogenen Virus, vorzugsweise dem NSl-defizienten Influenzavirus, erhalten wird.

36. Dendritische Zellen, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 35 erhältlich sind.

NACHGEREICHT R 45301 Patentansprüche :

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A 1332/20Q5

34. Dendritische Zellen, die durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 33 erhältlich sind. <EMI ID=42.1> - 38 A 1332/2005

NACHGEREICHT