DE202015010019U1

DE202015010019U1 - Stabilisierung von für Poly (A) -Sequenzen kodierende DNA-Sequenzen

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Publication number: DE202015010019U1
Application number: DE202015010019.8U
Authority: DE
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2015-07-06
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2025-07-07
Also published as: AU2015286820A1; WO2016005324A1; EP3594337A1; US20170166905A1; PT3167059T; CA2954706C; HUE046120T2; US20200392518A1; DE202015010020U1; JP2020188758A; EP3167059A1; TR201910424T4; SI3167059T1; WO2016005004A1; JP2017522050A; US10717982B2; AU2021277776A1; CA2954706A1; AU2015286820A8; JP6759196B2

Abstract

MRNA, die eine 5'-UTR, eine Protein-kodierende Region und eine 3'-UTR umfasst und die durch in-vitro-Transkription unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls als Matrize erhältlich ist, wobei das Nukleinsäuremolekül in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung umfasst:
(a) einen Promotor;
(b) eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein virales Antigen kodiert; und
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die, wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Nukleotidsequenz von aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript kodiert, in der eine Polyadenylsequenz mit 30 oder 40 Adenosin-Nukleotiden von einer Linker-Sequenz, die eine konsekutive Sequenz von Nukleotiden ist und andere Nukleotide als Adenosin-Nukleotide enthält, und einer weiteren Polyadenylsequenz mit 70 bzw. 60 Adenosinen gefolgt wird (A30L70 bzw. A40L60);
zur Verwendung als Vakzine;
wobei die mRNA als Lipoplex oder mit DEAE assoziiert intramuskulär verabreicht wird.

Description

Die Verwendung von RNA bietet eine attraktive Alternative zur DNA, um die potenziellen Sicherheitsrisiken zu umgehen, die mit dem therapeutischen Einsatz von DNA verbunden sind. In-vitrotranskribierte RNA (IVT-RNA) ist für therapeutische Ansätze von besonderem Interesse. Zu den Vorteilen der therapeutischen Verwendung von RNA gehören die vorübergehende Expression und der nicht-transformierende Charakter. Die RNA muss nicht in den Zellkern gelangen, um exprimiert zu werden, und kann sich auch nicht in das Wirtsgenom integrieren, wodurch die Gefahr der Onkogenese beseitigt ist. Wird sie zur Impfung verwendet, kann die Injektion von RNA in vivo sowohl eine zelluläre als auch eine humorale Immunantwort auslösen. Die Verwendung von RNA für klinische Anwendungen ist jedoch insbesondere durch die kurze Halbwertszeit von RNA stark eingeschränkt.
IVT-Vektoren können in standardisierter Weise als Matrize für die In-vitro-Transkription verwendet werden. Derartige IVT-Vektoren können die folgende Struktur aufweisen: einen 5'-RNA-Polymerase-Promotor, der die RNA-Transkription ermöglicht, gefolgt von einem Gen von Interesse, das entweder 3' und/oder 5' von untranslatierten Regionen (UTR) flankiert wird, und einer 3'-Polyadenylkassette, die A-Nukleotide enthält. Vor der In-vitro-Transkription wird das zirkuläre Plasmid stromabwärts der Polyadenylkassette mit Restriktionsenzymen vom Typ II linearisiert (die Erkennungssequenz entspricht der Schnittstelle). Die Polyadenylkassette entspricht also der späteren Poly(A)-Sequenz im Transkript.
Die 3' -Poly(A)-Sequenz der RNA ist wichtig für den Kernexport, die RNA-Stabilität und die Translationseffizienz der eukaryotischen Messenger-RNA (mRNA). Die 3'-Poly(A)-Sequenz wird mit der Zeit verkürzt, und wenn sie kurz genug ist, wird die RNA enzymatisch abgebaut.
Wir haben bereits gezeigt, dass eine 3'-Poly(A)-Sequenz mit einer Länge von 120 Nukleotiden (A120) eine maßgebliche Wirkung auf die RNA-Stabilität und die Translationseffizienz hat und somit für die Wirksamkeit der RNA insgesamt von Vorteil ist.
Es wurde jedoch beobachtet, dass die DNA-Sequenz, die für die 3'-Poly(A)-Sequenz (3'-Polyadenylkassette) kodiert, d. h. ein Abschnitt mit aufeinanderfolgenden dA:dT-Basenpaaren, bei der Vermehrung in E. coli in einigen bakteriellen Subklonen verkürzt wird. Folglich muss vor der Herstellung der Plasmid-DNA als Ausgangsmaterial für die In-vitro-Transkription eine große Anzahl bakterieller Klone getestet werden, z. B. durch Bestimmung der Länge der 3'-Polyadenylkassette mittels geeigneter Restriktionsanalyse, um einen einzigen Klon mit einer 3'-Polyadenylkassette der richtigen Länge zu erhalten, der für eine 3'-Poly(A)-Sequenz der richtigen Länge kodiert.
Es war die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine 3'-Polyadenylkassette zu finden, die eine konstante Vermehrung mit der kodierenden Plasmid-DNA in E. coli zeigt und die für eine 3'-Poly(A)-Sequenz kodiert, die die Wirkungen im Hinblick auf die Unterstützung der RNA-Stabilität und der Translationseffizienz beibehält.
Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch den Gegenstand der Ansprüche gelöst.
Gemäß der Erfindung wurde festgestellt, dass eine Unterbrechung der 3'-Polyadenylkassette (Poly(dA:dT)-Region) durch eine zufällige 10-Nukleotidsequenz mit gleichmäßiger Verteilung der 4 Nukleotide (Linker) nur einen geringen Einfluss auf die Funktionalität der kodierten RNA hat, aber die Stabilität der 3'-Polyadenylkassette in E. coli erhöht. Außerdem führten weder die Sequenz noch die Position des Linkers innerhalb der 3'-Poly(A)-Sequenz zu einer Verringerung der Translationseffizienz und Stabilität der in vitro transkribierten RNA (IVT-RNA).
Zur Stabilitätsprüfung der IVT-Vektorregion, die für die 3'-Poly(A)-Sequenz kodiert, wurde das SIINFEKL-Peptid stromaufwärts der Poly(dA:dT)-Region kloniert. Dieses Konstrukt wies eine Poly(dA:dT)-Instabilität (d. h. einen Prozentsatz der Klone bei Vermehrung mit verkürztem Poly(dA:dT)) von 50-60 % auf. Eine detaillierte Analyse mit Hilfe der beschriebenen Restriktionsanalysemethode ergab, dass die Region an Position 30-50 besonders empfindlich auf die Verkürzung der Poly(dA:dT)-Strecke reagiert. Die Einführung einer zufälligen 10-Nukleotidsequenz in diese empfindliche Region führte zu einer Erhöhung der Poly(dA:dT)-Stabilität. Konstrukte mit 30 oder 40 Adenosin-Nukleotiden, gefolgt von der Linker-Sequenz und weiteren 70 bzw. 60 Adenosinen (A30L70 und A40L60), führten in E. coli zu einer Poly(dA:dT)-Instabilität von nur 3-4 %. Die Ergebnisse wurden bestätigt, indem die Konstrukte in verschiedenen E. coli-Stämmen getestet wurden.
Die Funktionalität der IVT-RNA, die von der DNA mit den stabilisierten Poly(dA:dT)-Schwänzen kodiert wird, wurde in verschiedenen Assays getestet. Die Elektroporation der IVT-RNA in somatische Zelllinien, aber auch in Immunzellen, wie etwa unreife dendritische Zellen, zeigte über einen Zeitraum von 72 Stunden keinen Unterschied in der Translationskapazität im Vergleich zu A120. Die Injektion von Luciferase-kodierender IVT-RNA in Mäuse bestätigte eine gleichmäßige Proteintranslation unabhängig vom eingefügten Typ der 3'-Poly(A)-Sequenz.
Die Auswirkung der verschiedenen 3'-Poly(A)-Sequenzen auf die immunologische Antwort wurde durch den Vergleich der Anzahl antigenspezifischer CD8+ T-Zellen nach Injektion von SIINFEKL IVT-RNA analysiert. Die Versuche ergaben keinen Unterschied zwischen A120 und seinen stabilisierten Versionen A30L70 und A40L60.
Insgesamt zeigen wir, dass das Einfügen einer zufälligen 10-Nukleotidsequenz zwischen Position 30 und 50 einer Poly(dA:dT)-Region zu einer mehr als 10-fachen Sequenzstabilisierung in E. coli führt. Die entsprechende modifizierte 3'-Poly(A)-Sequenz der von der Matrizen-DNA transkribierten RNA hat die gleiche Funktionalität, d. h. Stabilität und Translationseffizienz in vivo und in vitro wie das klassische A120. Außerdem wird die immunologische Antwort durch die Verwendung einer modifizierten Poly(A)-Sequenz nicht verändert.
Kurzfassung der Erfindung
In einem Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung umfasst:

(a) einen Promotor;
(b) eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz oder eine Nukleinsäuresequenz zum Einführen einer transkribierbaren Nukleinsäuresequenz; und
(c) eine Nukleinsäuresequenz, die, wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript kodiert, wobei die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript eine Polyadenylsequenz ist, die innerhalb der Polyadenylsequenz eine Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält.

In einer Ausführungsform ist die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, eine Sequenz, vorzugsweise eine beliebige Sequenz, von 2 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden, wobei das erste und das letzte Nukleotid der Sequenz von 2 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden ein anderes Nukleotid als ein A-Nukleotid ist.
Mit anderen Worten, das Nukleinsäuremolekül der Erfindung enthält eine 3'-Polyadenylkassette (Poly(dA:dT)-Region), die mindestens eine Unterbrechung durch eine Sequenz enthält, die nicht für eine Sequenz kodiert, die ausschließlich aus A-Resten besteht, d. h. die Poly(dA:dT)-Region ist durch einen oder mehrere Strecken von Basenpaaren unterbrochen, die andere Basenpaare als (dA:dT) umfassen. Daher kodiert die Nukleinsäuresequenz (c), wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript, wobei die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript eine Polyadenylsequenz ist, wobei mindestens ein Abschnitt der Polyadenylsequenz durch eine Sequenz ersetzt wird, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, wie etwa eine Sequenz von 2 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden, wobei das erste und das letzte Nukleotid der Sequenz von 2 oder mehr Nukleotiden ein anderes Nukleotid als ein A-Nukleotid ist. Mit anderen Worten, die Nukleinsäuresequenz (c) kodiert, wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Polyadenylsequenz, die innerhalb der Polyadenylsequenz einen oder mehrere Sequenzstrecken von einem oder mehreren Nukleotiden eingestreut enthält, wobei die Sequenzstrecken jeweils nicht ein A-Nukleotid oder eine Strecke von A-Nukleotiden sind, d. h. eine Oligo-A-Sequenz oder eine Poly-A-Sequenz.
In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül ein DNA-Molekül. In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül ein Expressionsvektor oder ein Plasmid wie etwa ein IVT-Vektor.
In einer Ausführungsform weist die Nukleinsäuresequenz (c) bei einer Vermehrung des Nukleinsäuremoleküls in E. coli eine höhere Stabilität auf als ein Nukleinsäuremolekül, das anstelle der Nukleinsäuresequenz (c) eine Nukleinsäuresequenz (c)' umfasst, die, wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Polyadenylsequenz der gleichen Länge wie die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript kodiert.
In einer Ausführungsform umfasst die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden mindestens 90 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 100 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 110 Nukleotide. In einer Ausführungsform umfasst die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden etwa 120 Nukleotide. In besonderen Ausführungsformen umfasst die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden bis zu 200, vorzugsweise bis zu 150 und insbesondere bis zu 130 Nukleotide. In einer Ausführungsform sind mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 92 %, vorzugsweise mindestens 95 %, 97 % oder 98 % der Nukleotide der Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden A-Nukleotide in der Polyadenylsequenz (ohne A-Nukleotide in der Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthalten).
In einer Ausführungsform befindet sich die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, innerhalb einer Region von Position 21 bis Position 80, vorzugsweise von Position 21 bis Position 60, noch bevorzugter von Position 31 bis Position 50 der Polyadenylsequenz.
In einer Ausführungsform gehen der Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, mindestens 20 A-Reste, vorzugsweise mindestens 30, 40 oder 50 A-Reste in der Polyadenylsequenz voraus. In bestimmten Ausführungsformen gehen der Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, bis zu 80 A-Reste, vorzugsweise bis zu 70 oder 60 A-Reste in der Polyadenylsequenz voraus.
In einer Ausführungsform folgen der Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, mindestens 20 A-Reste, vorzugsweise mindestens 30, 40, 50, 60 oder 70 A-Reste in der Polyadenylsequenz. In bestimmten Ausführungsformen folgen der Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, bis zu 100 A-Reste, vorzugsweise bis zu 80 A-Reste in der Polyadenylsequenz.
In einer Ausführungsform gehen der Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, 20 bis 50, vorzugsweise 30 bis 40 A-Reste in der Polyadenylsequenz voraus, und es folgen ihr 30 bis 80, vorzugsweise 40 bis 70 A-Reste in der Polyadenylsequenz.
In einer Ausführungsform weist die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, eine Länge von mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 8, vorzugsweise mindestens 10, noch bevorzugter mindestens 15 Nukleotiden auf.
In einer Ausführungsform weist die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, eine Länge von nicht mehr als 50, vorzugsweise nicht mehr als 30, noch bevorzugter nicht mehr als 20 Nukleotiden auf.
In einer Ausführungsform umfasst die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 2, vorzugsweise keine aufeinanderfolgenden A-Reste.
In einer Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzen (b) und (c) unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert werden, um ein gemeinsames Transkript zu ergeben.
In einer Ausführungsform befindet sich die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript an dem 3'-Ende.
In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein geschlossenes ringförmiges Molekül oder ein lineares Molekül.
In einer Ausführungsform umfasst die transkribierbare Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Peptid oder ein Protein kodiert, und die Nukleinsäuresequenz zum Einführen einer transkribierbaren Nukleinsäuresequenz ist eine multiple Klonierungsstelle.
In einer Ausführungsform umfasst das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ferner ein oder mehrere Elemente, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus: (i) einem Reportergen; (ii) einem selektierbaren Marker; und (iii) einem Replikationsursprung.
In einer Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, insbesondere nach einer Linearisierung, zur In-vitro-Transkription von RNA, insbesondere mRNA geeignet.
Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die von der Nukleinsäuresequenz (c), d. h. der Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, transkribiert wird, vorzugsweise aktiv, um die Translationseffizienz und/oder die Stabilität der Nukleinsäuresequenz zu erhöhen, die von der transkribierbaren Nukleinsäuresequenz (b) transkribiert wird.
Vor der In-vitro-Transkription werden zirkuläre IVT-Vektoren im Allgemeinen stromabwärts der Polyadenylkassette mit Restriktionsenzymen vom Typ II linearisiert (die Erkennungssequenz entspricht der Spaltstelle). Die Polyadenylkassette entspricht also der späteren Poly(A)-Sequenz in dem Transkript. Infolge dieses Verfahrens verbleiben einige Nukleotide nach der Linearisierung als Teil der Enzymspaltstelle und verlängern oder maskieren die Poly(A)-Sequenz am 3'-Ende. Es wurde jedoch festgestellt, dass RNA mit einer Poly(A)-Sequenz mit offenem Ende effizienter translatiert wird als RNA mit einer Poly(A)-Sequenz mit einem maskierten Terminus.
Folglich ermöglichen die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung, wenn sie als Expressionsvektoren verwendet werden, vorzugsweise die Transkription von RNA mit einer Poly(A)-Sequenz, die vorzugsweise ein offenes Ende in der RNA aufweist, d. h. keine anderen Nukleotide als A-Nukleotide flankieren die Poly(A)-Sequenz an ihrem 3'-Ende. Eine Poly(A)-Sequenz mit offenem Ende in der RNA kann durch Einführen einer Typ-IIS-Restriktionsspaltstelle in einen Expressionsvektor erreicht werden, der die Transkription von RNA unter der Kontrolle eines 5'-RNA-Polymerase-Promotors ermöglicht und der eine Polyadenylkassette enthält, wobei sich die Erkennungssequenz stromabwärts der Polyadenylkassette befindet, während sich die Spaltstelle stromaufwärts und somit innerhalb der Polyadenylkassette befindet. Die Restriktionsspaltung an der Typ-IIS-Restriktionsspaltstelle ermöglicht die Linearisierung eines Plasmids innerhalb der Polyadenylkassette. Das linearisierte Plasmid kann dann als Matrize für die In-vitro-Transkription verwendet werden, wobei das resultierende Transkript in einer unmaskierten Poly(A)-Sequenz endet.
Folglich ist es in einer Ausführungsform bevorzugt, dass das Nukleinsäuremolekül der Erfindung, vorzugsweise enzymatisch oder auf andere biochemische Weise, innerhalb der Nukleinsäuresequenz (c) so gespalten werden kann, dass die Spaltung zu einem Nukleinsäuremolekül führt, das in der 5'→3 ‚-Transkriptionsrichtung den Promotor (a), die Nukleinsäuresequenz (b), und mindestens einen Teil der Nukleinsäuresequenz (c) umfasst, wobei der mindestens eine Teil der Nukleinsäuresequenz (c), wenn er unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden im Transkript kodiert und wobei in dem Transkript das 3‘-terminale Nukleotid ein A-Nukleotid der Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden ist.
Vorzugsweise weist das Nukleinsäuremolekül nach der Spaltung an dem Ende des Strangs, der als Matrize für die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden dient, ein T-Nukleotid auf, das Teil der Nukleinsäuresequenz ist, die als Matrize für die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden im Transkript dient.
Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung ist vorzugsweise ein geschlossenes ringförmiges Molekül vor der Spaltung und ein lineares Molekül nach der Spaltung.
Vorzugsweise erfolgt die Spaltung mit Hilfe einer Restriktionsschnittstelle, die vorzugsweise eine Restriktionsschnittstelle für eine Typ-IIS-Restriktionsendonuklease ist.
In einer Ausführungsform befindet sich die Erkennungssequenz für die Typ-IIS-Restriktionsendonuklease 5-26 Basenpaare, vorzugsweise 24-26 Basenpaare, stromabwärts vom 3'-Ende der Nukleinsäuresequenz (c) .
In einer Ausführungsform liegt ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung in einer geschlossenen zirkulären Konformation vor und eignet sich vorzugsweise für die In-vitro-Transkription von RNA, insbesondere mRNA, vor allem nach Linearisierung.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, das durch Linearisierung eines oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküls, vorzugsweise durch Spaltung innerhalb der Nukleinsäuresequenz (c), erhältlich ist, und RNA, die durch Transkription, vorzugsweise In-vitro-Transkription, mit oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen unter der Kontrolle des Promotors (a) erhältlich ist.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Vermehren eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend:

(i) Bereitstellen eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung, und
(ii) Vermehren des Nukleinsäuremoleküls in E. coli.

In einer Ausführungsform umfasst das Vermehren des Nukleinsäuremoleküls in E. coli ein Transformieren von E. coli mit dem Nukleinsäuremolekül und ein Kultivieren der transformierten E. coli.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren der Erfindung ferner ein Isolieren des Nukleinsäuremoleküls von E. coli nach der Vermehrung.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten von RNA, umfassend:

(i) Vermehren eines Nukleinsäuremoleküls gemäß einem Verfahren der Erfindung zum Vermehren eines Nukleinsäuremoleküls, und
(ii) In-vitro-Transkribieren von RNA unter Verwendung des Nukleinsäuremoleküls als Matrize.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Erhalten eines Peptids oder Proteins, umfassend:

(i) Erhalten von mRNA, die für das Peptid oder Protein kodiert, gemäß einem Verfahren der Erfindung zum Erhalten von RNA, und
(ii) Translatieren der mRNA.

In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Erhalten von RNA oder das Verfahren zum Erhalten eines Peptids oder Proteins ferner, vor der Transkription des Nukleinsäuremoleküls, eine Spaltung des Nukleinsäuremoleküls.
In einer Ausführungsform erfolgt die Spaltung innerhalb der Nukleinsäuresequenz (c) in der Weise, dass die Transkription der so erhaltenen Nukleinsäure ein Transkript erzeugt, das an seinem 3'-terminalen Ende die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden aufweist, wobei das 3'-terminale Nukleotid des Transkripts ein A-Nukleotid der Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden ist.
In allen Aspekten der erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt die Spaltung vorzugsweise mit Hilfe einer Restriktionsschnittstelle, die vorzugsweise eine Restriktionsschnittstelle für eine Typ-IIS-Restriktionsendonuklease ist.
In einer Ausführungsform beträgt die Erkennungssequenz für die Typ-IIS-Restriktionsendonuklease 5-26 Basenpaare, vorzugsweise 24-26 Basenpaare, stromabwärts von dem 3' -Ende der Nukleinsäuresequenz (c).
Die Erfindung betrifft auch RNA, die durch die Verfahren gemäß der Erfindung zum Erhalten von RNA erhältlich ist.
Die Erfindung kann beispielsweise zur Steigerung der Expression rekombinanter Proteine bei der zellulären Transkription und Expression eingesetzt werden. Insbesondere ist es möglich, bei der Herstellung rekombinanter Proteine erfindungsgemäße Expressionsvektoren für die Transkription rekombinanter Nukleinsäuren und die Expression rekombinanter Proteine in zellbasierten Systemen zu verwenden. Dazu gehört beispielsweise die Herstellung von rekombinanten Antikörpern, Hormonen, Zytokinen, Enzymen und dergleichen. Dadurch lassen sich unter anderem die Produktionskosten senken.
Es ist auch möglich, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle für gentherapeutische Anwendungen zu verwenden. Folglich kann ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Gentherapievektor sein und zur Expression eines Transgens verwendet werden. Zu diesem Zweck können beliebige Vektorsysteme auf der Basis von Nukleinsäuren (DNA/RNA) verwendet werden (zum Beispiel Plasmide, Adenoviren, Pockenvirus-Vektoren, Influenza-Virus-Vektoren, Alphavirus-Vektoren und dergleichen). Zellen können mit diesen Vektoren in vitro, zum Beispiel in Lymphozyten oder dendritischen Zellen, oder auch in vivo durch direkte Verabreichung transfiziert werden.
Die erfindungsgemäße RNA (erhalten unter Verwendung eines hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküls als Transkriptionsmatrize) kann zum Beispiel zur transienten Expression von Genen eingesetzt werden, wobei mögliche Anwendungsgebiete RNA-basierte Impfstoffe sind, die in vitro in Zellen transfiziert oder direkt in vivo verabreicht werden, zur transienten Expression von funktionellen rekombinanten Proteinen in vitro, um beispielsweise Differenzierungsprozesse in Zellen zu initiieren oder Funktionen von Proteinen zu untersuchen, sowie zur transienten Expression von funktionellen rekombinanten Proteinen wie Erythropoietin, Hormonen, Gerinnungshemmern etc. , in vivo, insbesondere als Pharmazeutika.
Die erfindungsgemäße RNA kann insbesondere zur Transfektion von Antigen-präsentierenden Zellen und damit als Werkzeug zur Bereitstellung des zu präsentierenden Antigens und zur Beladung der Antigen-präsentierenden Zellen verwendet werden, wobei das zu präsentierende Antigen dem von der RNA exprimierten oder davon abgeleiteten Peptid oder Protein entspricht, insbesondere durch intrazelluläre Prozessierung, wie etwa Spaltung, d. h. das zu präsentierende Antigen ist zum Beispiel ein Fragment des von der RNA exprimierten Peptids oder Proteins. Solche Antigen-präsentierenden Zellen können zur Stimulierung von T-Zellen, insbesondere von CD4+ und/oder CD8+ T-Zellen, verwendet werden.
Entsprechend bezieht sich die Erfindung in einem weiteren Aspekt auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen RNA zum Transfizieren einer Wirtszelle. In einer Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Verwendung der erfindungsgemäßen RNA zur Impfung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Obwohl die vorliegende Erfindung im Folgenden ausführlich beschrieben wird, ist sie nicht auf die hierin beschriebenen bestimmten Verfahren, Protokolle und Reagenzien beschränkt, da diese variieren können. Es versteht sich auch, dass die hierin verwendete Terminologie nur zur Beschreibung bestimmter Ausführungsformen dient und nicht dazu gedacht ist, den Umfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken, der nur durch die beigefügten Ansprüche begrenzt wird. Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann allgemein verstanden wird.
Im Folgenden werden die Elemente der vorliegenden Erfindung beschrieben. Diese Elemente sind mit spezifischen Ausführungsformen aufgeführt, es sollte jedoch verstanden werden, dass sie in beliebiger Weise und in beliebiger Anzahl kombiniert werden können, um zusätzliche Ausführungsformen zu schaffen. Die verschiedenen beschriebenen Beispiele und bevorzugten Ausführungsformen sind nicht so auszulegen, dass die vorliegende Erfindung nur auf die ausdrücklich beschriebenen Ausführungsformen beschränkt ist. Diese Beschreibung sollte so verstanden werden, dass sie Ausführungsformen unterstützt und umfasst, die die ausdrücklich beschriebenen Ausführungsformen mit einer beliebigen Anzahl der offenbarten und/oder bevorzugten Elemente kombinieren. Darüber hinaus sollten alle Permutationen und Kombinationen aller in dieser Anmeldung beschriebenen Elemente als durch die Beschreibung der vorliegenden Anmeldung offenbart angesehen werden, sofern aus dem Kontext nichts anderes hervorgeht. Wenn zum Beispiel in einer bevorzugten Ausführungsform einer Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, mindestens 20 A-Reste in der Polyadenylsequenz vorausgehen, und wenn in einer anderen bevorzugten Ausführungsform einer Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, mindestens 20 A-Reste in der Polyadenylsequenz folgen, ist es eine in Betracht gezogene bevorzugte Ausführungsform, dass einer Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, mindestens 20 A-Reste in der Polyadenylsequenz vorausgehen und folgen.
Vorzugsweise sind die hierin verwendeten Begriffe so definiert wie in „A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommedations)“, H. G. W. Leuenberger, B. Nagel, und H. Kölbl, Eds. Helvetica Chimica Acta, CH-40Basel, Schweiz, (1995) beschrieben.
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung werden, sofern nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren der Chemie, Biochemie, Zellbiologie, Immunologie und rekombinanten DNA-Techniken angewandt, die in der einschlägigen Literatur erläutert werden (vgl. z. B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989) .
In der gesamten Beschreibung und den nachfolgenden Ansprüchen sind, sofern der Kontext nichts anderes erfordert, das Wort „umfassen“ und Varianten wie „umfasst“ und „umfassend“ so zu verstehen, dass sie die Einbeziehung eines bestimmten Elements, einer ganzen Zahl oder eines Schritts oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten bedeuten, nicht aber den Ausschluss eines anderen Elements, einer ganzen Zahl oder eines Schritts oder einer Gruppe von Elementen, ganzen Zahlen oder Schritten. Die Begriffe „ein/e“ und „der/die/das“ und ähnliche Bezugnahmen im Kontext der Beschreibung der Erfindung (vor allem im Kontext der Ansprüche) sind so auszulegen, dass sie sowohl den Singular als auch den Plural umfassen, soweit hierin nicht anders angegeben oder klar durch den Kontext widerlegt ist. Die Erwähnung von Wertebereichen soll lediglich als abgekürzte Methode dienen, um auf jeden einzelnen Wert, der in den Bereich fällt, hinzuweisen. Sofern hierin nicht anders angegeben, wird jeder einzelne Wert so in die Beschreibung aufgenommen, als ob er darin einzeln aufgeführt wäre. Alle hierin beschriebenen Verfahren können in einer geeigneten Reihenfolge durchgeführt werden, soweit hierin nicht anders angegeben oder anderweitig klar durch den Kontext widerlegt ist. Die Verwendung eines oder aller Beispiele oder beispielhafter Sprache (z. B. „wie etwa“), die hierin bereitgestellt werden, ist lediglich zum besseren Verständnis der Erfindung auszulegen und erlegt dem Umfang der sonst beanspruchten Erfindung keine Grenzen auf. Keine Formulierung in der Beschreibung sollte als Hinweis auf ein nicht beanspruchtes Element ausgelegt werden, das für die Ausführung der Erfindung wesentlich ist.
Im Text dieser Patentschrift wird auf mehrere Dokumente verwiesen. Alle hierin zitierten Dokumente (einschließlich aller Patente, Patentanmeldungen, wissenschaftlichen Veröffentlichungen, Herstellerspezifikationen, Anleitungen usw.), ob oben oder unten, werden hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit einbezogen. Nichts hierin ist als Zugeständnis auszulegen, dass die Erfindung nicht berechtigt ist, einer solchen Offenbarung aufgrund der Tatsache, dass sie früher gemacht wurde, vorauszugehen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt Nukleinsäuremoleküle wie etwa DNA-Plasmide, die als RNA-Expressionsvektoren nützlich sind und eine modifizierte 3'-Poly(dA:dT)-Kassette (die für eine modifizierte 3'-Poly(A)-Sequenz kodiert) umfassen, die eine konstante Vermehrung zeigt, ohne in E. coli einer Verkürzung zu unterliegen.
E. coli ist ein gramnegatives, fakultativ anaerobes, stäbchenförmiges Bakterium der Gattung Escherichia, das häufig im unteren Darm von warmblütigen Organismen vorkommt. Das Bakterium lässt sich leicht und kostengünstig im Labor züchten und wird seit über 60 Jahren intensiv erforscht. E. coli ist der am meisten untersuchte prokaryotische Modellorganismus und eine wichtige Spezies in den Bereichen Biotechnologie und Mikrobiologie, wo es als Wirtsorganismus für die meisten Arbeiten mit rekombinanter DNA dient. Zu den E. coli-Stämmen im Sinne der Erfindung gehören: AG1, AB1157, B2155, BL21, BNN93, BNN97, BW26434, C600, CSH50, D1210, DB3.1, DH1, DH5α, DH10B, DH12S, DM1, E. cloni(r), E. coli K12 ER2738, ER2566, ER2267, HB101, IJ1126, IJ1127, JM83, JM101, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109, JM110, JM2.300, LE392, Mach1, MC1061, MC4100, MFDpir, MG1655, OmniMAX2, RR1, RV308, SOLR, SS320, STBL2, STBL3, STBL4, SURE, SURE2, TG1, TOP10, Top10F', W3110, WM3064, XL1-Blue, XL2-Blue, XL1-Red und XL10-Gold.
Gemäß der Erfindung bezieht sich ein Nukleinsäuremolekül oder eine Nukleinsäuresequenz auf eine Nukleinsäure, vorzugsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA). Zu den Nukleinsäuren gehören gemäß der Erfindung genomische DNA, cDNA, mRNA, rekombinant hergestellte und chemisch synthetisierte Moleküle. Gemäß der Erfindung kann eine Nukleinsäure in Form eines einsträngigen oder doppelsträngigen, linearen oder kovalent geschlossenen ringförmigen Moleküls vorliegen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „RNA“ auf ein Molekül, das Ribonukleotidreste umfasst und vorzugsweise vollständig oder im Wesentlichen aus Ribonukleotidresten besteht. Der Begriff „Ribonukleotid“ bezieht sich auf ein Nukleotid mit einer Hydroxylgruppe in der 2'-Position einer β-D-Ribofuranosylgruppe. Der Begriff „RNA“ umfasst doppelsträngige RNA, einzelsträngige RNA, isolierte RNA, wie etwa teilweise oder vollständig gereinigte RNA, im Wesentlichen reine RNA, synthetische RNA und rekombinant erzeugte RNA, wie etwa modifizierte RNA, die sich von natürlich vorkommender RNA durch Addition, Deletion, Substitution und/oder Veränderung eines oder mehrerer Nukleotide unterscheidet. Solche Veränderungen können das Hinzufügen von Nicht-Nukleotid-Material umfassen, wie etwa an dem Ende bzw. den Enden einer RNA oder im Inneren, zum Beispiel an einem oder mehreren Nukleotiden der RNA. Nukleotide in RNA-Molekülen können auch Nicht-Standard-Nukleotide umfassen, wie etwa nicht natürlich vorkommende Nukleotide oder chemisch synthetisierte Nukleotide oder Desoxynukleotide. Diese veränderten RNAs können als Analoga bezeichnet werden, insbesondere als Analoga von natürlich vorkommenden RNAs. Zur RNA im Sinne der Erfindung gehört auch die mRNA.
Der Begriff „mRNA“ bedeutet „Messenger-RNA“ und bezieht sich auf ein Transkript, das unter Verwendung einer DNA-Matrize erzeugt wird und für ein Peptid oder Protein kodiert. Typischerweise umfasst mRNA eine 5'-UTR, eine proteincodierende Region und eine 3'-UTR. mRNA kann durch In-vitro-Transkription aus einer DNA-Matrize erzeugt werden. Die Methodik der In-vitro-Transkription ist dem Fachmann bekannt. So gibt es beispielsweise eine Vielzahl von im Handel erhältlichen In-vitro-Transkriptionskits. Gemäß der Erfindung kann die mRNA zusätzlich zu den Modifikationen gemäß der Erfindung durch weitere stabilisierende Modifikationen und Capping modifiziert werden.
In einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff „Modifikation“ auf die Ausstattung einer RNA mit einem 5'-Cap oder einem 5'-Cap-Analogon. Der Begriff „5'-Cap“ bezieht sich auf eine Cap-Struktur am 5' -Ende eines mRNA-Moleküls und besteht im Allgemeinen aus einem Guanosin-Nukleotid, das über eine ungewöhnliche 5'-5'-Triphosphatbindung mit der mRNA verbunden ist. In einer Ausführungsform ist dieses Guanosin an der 7-Position methyliert. Der Begriff „herkömmliches 5'-Cap“ bezieht sich auf ein natürlich vorkommendes RNA-5'-Cap, vorzugsweise auf das 7-Methylguanosin-Cap (m⁷G). Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „5' -Cap“ ein 5'-Cap-Analogon, das der RNA-Cap-Struktur ähnelt und so modifiziert ist, dass es die Fähigkeit besitzt, RNA zu stabilisieren, wenn es daran gebunden ist, vorzugsweise in vivo und/oder in einer Zelle. Das Versehen einer RNA mit einem 5'-Cap oder einem 5'-Cap-Analogon kann durch In-vitro-Transkription einer DNA-Matrize in Gegenwart des 5' -Caps oder 5' -Cap-Analogons erfolgen, wobei das 5'-Cap kotranskriptiv in den erzeugten RNA-Strang eingebaut wird, oder die RNA kann beispielsweise durch In-vitro-Transkription erzeugt werden, und das 5'-Cap kann posttranskriptiv unter Verwendung von Capping-Enzymen, beispielsweise Capping-Enzymen des Vaccinia-Virus, erzeugt werden.
Der Begriff „Nukleinsäure“ im Sinne der Erfindung umfasst auch eine chemische Derivatisierung einer Nukleinsäure an einer Nukleotidbase, am Zucker oder am Phosphat sowie Nukleinsäuren, die nicht-natürliche Nukleotide und Nukleotidanaloga enthalten.
Gemäß der Erfindung bezieht sich eine „Nukleinsäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz abgeleitet ist“ auf eine Nukleinsäure, die im Vergleich zu der Nukleinsäure, von der sie abgeleitet ist, einzelne oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -additionen enthält. Vorzugsweise besteht ein gewisser Grad an Homologie zwischen den Nukleinsäuren, und die Nukleotidsequenzen der Nukleinsäuren stimmen in signifikanter Weise direkt oder komplementär überein. Gemäß der Erfindung besitzt eine von einer Nukleinsäure abgeleitete Nukleinsäure eine funktionelle Eigenschaft der Nukleinsäure, von der sie abgeleitet ist. Zu diesen funktionellen Eigenschaften gehört insbesondere die Fähigkeit, in einer funktionellen Verknüpfung mit einer in RNA transkribierbaren Nukleinsäure (transkribierbare Nukleinsäuresequenz) die Stabilität und/oder Translationseffizienz der aus dieser Nukleinsäure gebildeten RNA im gesamten RNA-Molekül zu erhöhen.
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Begriff „funktionelle Verknüpfung“ oder „funktionell verknüpft“ auf eine Verbindung innerhalb einer funktionellen Beziehung. Eine Nukleinsäure ist „funktionell verknüpft“, wenn sie mit einer anderen Nukleinsäuresequenz funktionell in Beziehung steht. Ein Promotor ist beispielsweise funktionell mit einer kodierenden Sequenz verknüpft, wenn er die Transkription der genannten kodierenden Sequenz beeinflusst. Funktionell verknüpfte Nukleinsäuren liegen typischerweise nebeneinander, gegebenenfalls durch weitere Nukleinsäuresequenzen getrennt, und werden in bestimmten Ausführungsformen durch RNA-Polymerase zu einem einzigen RNA-Molekül transkribiert (gemeinsames Transkript).
Die beschriebenen Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung sind vorzugsweise isoliert. Der Begriff „isolierte Nukleinsäure“ bedeutet gemäß der Erfindung, dass die Nukleinsäure (i) in vitro amplifiziert wurde, zum Beispiel durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR), (ii) rekombinant durch Klonierung hergestellt wurde, (iii) gereinigt wurde, zum Beispiel durch Spaltung und gel-elektrophoretische Fraktionierung, oder (iv) synthetisiert wurde, zum Beispiel durch chemische Synthese. Eine isolierte Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure, die durch rekombinante DNA-Techniken manipuliert werden kann.
Eine Nukleinsäure ist „komplementär“ zu einer anderen Nukleinsäure, wenn die beiden Sequenzen miteinander hybridisieren und einen stabilen Duplex bilden können, wobei die Hybridisierung vorzugsweise unter Bedingungen durchgeführt wird, die eine spezifische Hybridisierung zwischen den Polynukleotiden ermöglichen (stringente Bedingungen). Stringente Bedingungen sind zum Beispiel beschrieben in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. (Hrsg.), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989 oder Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, Inc., New York, und beziehen sich zum Beispiel auf eine Hybridisierung bei 65°C in Hybridisierungspuffer (3,5 x SSC, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin, 2,5mM NaH₂PO₄ (pH7), 0,5% SDS, 2mM EDTA). SSC ist 0,15 M Natriumchlorid/0,15 M Natriumcitrat, pH 7. Nach der Hybridisierung wird die Membran, auf die die DNA übertragen wurde, z. B. in 2 x SSC bei Raumtemperatur und anschließend in 0,1 - 0,5 x SSC/0,1 x SDS bei Temperaturen bis 68°C gewaschen.
Gemäß der Erfindung weisen homologe Nukleinsäuren Nukleotide auf, die zu mindestens 60 %, mindestens 70 %, mindestens 80 %, mindestens 90 %, vorzugsweise zu mindestens 95 %, mindestens 98 % oder mindestens 99 %, identisch sind.
Der Begriff „% identisch“ soll sich auf einen Prozentsatz von Nukleotiden beziehen, die in einem optimalen Alignment zwischen zwei zu vergleichenden Sequenzen identisch sind, wobei dieser Prozentsatz rein statistisch ist und die Unterschiede zwischen den beiden Sequenzen zufällig über die gesamte Länge der Sequenz verteilt sein können und die zu vergleichende Sequenz im Vergleich zur Referenzsequenz Hinzufügungen oder Deletionen enthalten kann, um eine optimale Zuordnung zweier Sequenzen zu erhalten. Vergleiche zwischen zwei Sequenzen werden in der Regel durchgeführt, indem die Sequenzen nach einer optimalen Zuordnung in Bezug auf ein Segment oder „Vergleichsfenster“ verglichen werden, um lokale Regionen der entsprechenden Sequenzen zu identifizieren. Die optimale Zuordnung für einen Vergleich kann manuell oder mit Hilfe des lokalen Homologie-Algorithmus von Smith und Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, mit Hilfe des lokalen Homologie-Algorithmus von Neddleman und Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, und mit Hilfe des Ähnlichkeitssuchalgorithmus von Pearson und Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 oder mit Hilfe von Computerprogrammen, die diese Algorithmen verwenden (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin), ausgeführt werden.
Die prozentuale Identität wird ermittelt, indem die Anzahl der identischen Positionen, an denen die zu vergleichenden Sequenzen übereinstimmen, durch die Anzahl der verglichenen Positionen geteilt und dieses Ergebnis mit 100 multipliziert wird.
Es kann zum Beispiel das BLAST-Programm „BLAST 2 sequences“ verwendet werden, das auf der Website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi zur Verfügung steht.
Mit „3'-Ende einer Nukleinsäure“ ist gemäß der Erfindung das Ende gemeint, das eine freie Hydroxygruppe aufweist. In einer schematischen Darstellung von doppelsträngigen Nukleinsäuren, insbesondere von DNA, befindet sich das 3' -Ende immer auf der rechten Seite. Mit „5'-Ende einer Nukleinsäure“ ist gemäß der Erfindung das Ende gemeint, das eine freie Phosphatgruppe aufweist. In einer schematischen Darstellung von doppelsträngigen Nukleinsäuren, insbesondere von DNA, befindet sich das 5'-Ende immer auf der linken Seite.

5'-Ende 5'--P-NNNNNNN-OH-3' 3'-Ende

3'-HO-NNNNNNN-P--5'
In bestimmten Ausführungsformen ist eine erfindungsgemäße Nukleinsäure funktionell mit Expressionskontrollsequenzen verknüpft, die homolog oder heterolog in Bezug auf die Nukleinsäure sein können.
Eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz, insbesondere eine für ein Peptid oder Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, und eine Expressionskontrollsequenz sind „funktionell“ miteinander verknüpft, wenn sie so kovalent miteinander verbunden sind, dass die Transkription oder Expression der transkribierbaren und insbesondere kodierenden Nukleinsäuresequenz unter der Kontrolle oder dem Einfluss der Expressionskontrollsequenz steht. Wenn die Nukleinsäuresequenz in ein funktionelles Peptid oder Protein translatiert werden soll, führt die Induktion einer Expressionskontrollsequenz, die funktionell mit der kodierenden Sequenz verbunden ist, zur Transkription der kodierenden Sequenz, ohne dass es zu einem Frame-Shift in der kodierenden Sequenz kommt oder die kodierende Sequenz nicht in das gewünschte Peptid oder Protein translatiert werden kann.
Der Begriff „Expressionskontrollsequenz“ umfasst gemäß der Erfindung Promotoren, Ribosomen-bindende Sequenzen und andere Kontrollelemente, die die Transkription eines Gens oder die Translation der abgeleiteten RNA kontrollieren. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung können die Expressionskontrollsequenzen reguliert werden. Die genaue Struktur der Expressionskontrollsequenzen kann je nach Spezies oder Zelltyp variieren, umfasst jedoch in der Regel 5'-untranskribierte sowie 5'- und 3'-untranslatierte Sequenzen, die an der Initiierung der Transkription bzw. Translation beteiligt sind, wie etwa die TATA-Box, die Capping-Sequenz, die CAAT-Sequenz und dergleichen. Insbesondere umfassen 5'-untranskribierte Expressionskontrollsequenzen eine Promotorregion, die eine Promotorsequenz für die Transkriptionskontrolle des funktionell verknüpften Gens umfasst. Expressionskontrollsequenzen können auch Enhancer-Sequenzen oder stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenzen umfassen.
Die hierin spezifizierten Nukleinsäuresequenzen, insbesondere transkribierbare und kodierende Nukleinsäuresequenzen, können mit beliebigen Expressionskontrollsequenzen, insbesondere Promotoren, kombiniert werden, die homolog oder heterolog zu den Nukleinsäuresequenzen sein können, wobei sich der Begriff „homolog“ darauf bezieht, dass eine Nukleinsäuresequenz auch auf natürliche Weise funktionell mit der Expressionskontrollsequenz verknüpft ist, und sich der Begriff „heterolog“ darauf bezieht, dass eine Nukleinsäuresequenz nicht auf natürliche Weise funktionell mit der Expressionskontrollsequenz verknüpft ist.
Der Begriff „Promotor“ oder „Promotorregion“ bezieht sich auf eine DNA-Sequenz stromaufwärts (5') der kodierenden Sequenz eines Gens, die die Expression der kodierenden Sequenz steuert, indem sie eine Erkennungs- und Bindungsstelle für die RNA-Polymerase bereitstellt. Die Promotorregion kann weitere Erkennungs- oder Bindungsstellen für weitere Faktoren enthalten, die an der Regulierung der Transkription des Gens beteiligt sind. Ein Promotor kann die Transkription eines prokaryotischen oder eukaryotischen Gens steuern. Ein Promotor kann „induzierbar“ sein und die Transkription als Reaktion auf einen Induktor auslösen, oder er kann „konstitutiv“ sein, wenn die Transkription nicht durch einen Induktor gesteuert wird. Ein induzierbarer Promotor wird nur in sehr geringem Umfang oder gar nicht exprimiert, wenn kein Induktor vorhanden ist. In Anwesenheit des Induktors wird das Gen „eingeschaltet“ oder der Transkriptionsgrad erhöht. Dies wird in der Regel durch die Bindung eines spezifischen Transkriptionsfaktors vermittelt.
Beispiele für erfindungsgemäß bevorzugte Promotoren sind Promotoren für SP6-, T3- oder T7-Polymerase.
Gemäß der Erfindung wird der Begriff „Expression“ in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst die Produktion von RNA oder von RNA und Protein. Er umfasst auch die partielle Expression von Nukleinsäuren. Außerdem kann die Expression vorübergehend oder stabil sein. In Bezug auf RNA bezieht sich der Begriff „Expression“ oder „Translation“ auf den Prozess in den Ribosomen einer Zelle, bei dem ein Strang der Messenger-RNA den Zusammenbau einer Aminosäuresequenz zur Herstellung eines Peptids oder Proteins steuert.
Der Begriff „Nukleinsäuresequenzen, die zu einem gemeinsamen Transkript transkribiert werden können“ bedeutet, dass die Nukleinsäuresequenzen funktionell so miteinander verknüpft sind, dass, gegebenenfalls nach Linearisierung wie etwa Restriktionsenzymspaltung des Nukleinsäuremoleküls, das die Nukleinsäuresequenzen umfasst, insbesondere eines geschlossenen ringförmigen Nukleinsäuremoleküls, die Transkription unter der Kontrolle eines Promotors zu einem RNA-Molekül führt, das die Transkripte der Nukleinsäuresequenzen kovalent aneinander gebunden und gegebenenfalls durch dazwischen liegende Sequenzen getrennt enthält.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „Transkription“ auf einen Prozess, bei dem der genetische Code einer DNA-Sequenz in RNA transkribiert wird. Anschließend kann die RNA in ein Protein übersetzt werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Transkription“ die „In-vitro-Transkription“, wobei sich der Begriff „In-vitro-Transkription“ auf einen Prozess bezieht, bei dem RNA, insbesondere mRNA, in vitro in einem zellfreien System synthetisiert wird. Vorzugsweise werden Klonierungsvektoren für die Erzeugung von Transkripten eingesetzt. Diese Klonierungsvektoren werden im Allgemeinen als Transkriptionsvektoren bezeichnet und sind gemäß der vorliegenden Erfindung von dem Begriff „Vektor“ umfasst. Gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der RNA vorzugsweise um in vitro transkribierte RNA (IVT-RNA), die durch In-vitro-Transkription einer geeigneten DNA-Matrize erhalten werden kann. Der Promotor zur Steuerung der Transkription kann ein beliebiger Promotor für eine beliebige RNA-Polymerase sein. Eine DNA-Matrize für die In-vitro-Transkription kann durch Klonierung einer Nukleinsäure, insbesondere cDNA, und deren Einführung in einen geeigneten Vektor für die In-vitro-Transkription erhalten werden. Die cDNA kann durch reverse Transkription von RNA erhalten werden.
Der Begriff „aus einer Nukleinsäuresequenz transkribierte Nukleinsäuresequenz“ bezieht sich auf RNA, gegebenenfalls als Teil eines vollständigen RNA-Moleküls, das ein Transkriptionsprodukt der letztgenannten Nukleinsäuresequenz ist.
Der Begriff „Nukleinsäuresequenz, die aktiv ist, um die Translationseffizienz und/oder Stabilität einer Nukleinsäuresequenz zu erhöhen“ bedeutet, dass die erste Nukleinsäuresequenz in der Lage ist, in einem gemeinsamen Transkript mit der zweiten Nukleinsäuresequenz die Translationseffizienz und/oder Stabilität der zweiten Nukleinsäuresequenz so zu verändern, dass die Translationseffizienz und/oder Stabilität im Vergleich zur Translationseffizienz und/oder Stabilität der zweiten Nukleinsäuresequenz ohne die erste Nukleinsäuresequenz erhöht wird. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff „Translationseffizienz“ auf die Menge des von einem RNA-Molekül innerhalb eines bestimmten Zeitraums erzeugten Translationsprodukts und der Begriff „Stabilität“ auf die Halbwertszeit eines RNA-Moleküls.
Es hat sich gezeigt, dass eine doppelte 3'-untranslatierte Region (UTR), insbesondere des menschlichen beta-Globin-Gens, in einem RNA-Molekül die Translationseffizienz in einer Weise verbessert, die deutlich über den Gesamteffekt hinausgeht, der bei zwei einzelnen UTRs zu erwarten wäre.
Die Modifizierung und damit Stabilisierung und/oder Erhöhung der Translationseffizienz von RNA kann gemäß der Erfindung erreicht werden, indem Expressionsnukleinsäuremoleküle der Erfindung bei Verwendung als Expressionsvektoren genetisch so modifiziert werden, dass sie die Transkription von RNA mit zwei oder mehr 3'-untranslatierten Regionen an ihrem 3'-Ende ermöglichen, und vorzugsweise zwischen der Sequenz, die für ein Peptid oder Protein kodiert (offener Leserahmen), und der Poly(A)-Sequenz oder der Poly(A)-Sequenz, die eine Sequenz aus einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält.
Dementsprechend kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül vorzugsweise zwischen der Nukleinsäuresequenz (b) und der Nukleinsäuresequenz (c) zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen umfassen, wobei jede der zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen der 3'-untranslatierten Region eines Gens entspricht oder davon abgeleitet ist. Die zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen können identisch oder unterschiedlich sein. In bevorzugten Ausführungsformen sind die zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen unabhängig voneinander von einem Gen abgeleitet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Globin-Genen wie alpha2-Globin, alphal-Globin, beta-Globin und Wachstumshormon besteht, vorzugsweise menschliches beta-Globin.
Die 3'-untranslatierte Region bezieht sich auf eine Region, die sich am 3'-Ende eines Gens stromabwärts des Terminationscodons einer proteinkodierenden Region befindet und die transkribiert, aber nicht in eine Aminosäuresequenz übersetzt wird.
Gemäß der Erfindung gilt eine erste Polynukleotidregion als stromabwärts von einer zweiten Polynukleotidregion gelegen, wenn das 5'-Ende der ersten Polynukleotidregion der Teil der ersten Polynukleotidregion ist, der dem 3'-Ende der zweiten Polynukleotidregion am nächsten liegt.
Die 3'-untranslatierte Region erstreckt sich in der Regel von dem Terminationscodon für ein Translationsprodukt bis zu der Poly(A)-Sequenz, die normalerweise nach dem Transkriptionsprozess angehängt wird. Die 3'-untranslatierten Regionen der mRNA von Säugetieren haben typischerweise eine Homologieregion, die als AAUAAA-Hexanukleotidsequenz bekannt ist. Bei dieser Sequenz handelt es sich vermutlich um das Poly(A)-Anheftungssignal, das sich häufig 10 bis 30 Basen stromaufwärts der Poly(A)-Anheftungsstelle befindet.
3'-untranslatierte Regionen können eine oder mehrere Inverted Repeats enthalten, die sich zu Stem-Loop-Strukturen falten können, die als Barrieren für Exoribonukleasen wirken oder mit Proteinen interagieren, von denen bekannt ist, dass sie die RNA-Stabilität erhöhen (z. B. RNA-bindende Proteine).
5'- und/oder 3'-untranslatierte Regionen können gemäß der Erfindung funktionell mit einer transkribierbaren und insbesondere kodierenden Nukleinsäure verbunden sein, so dass diese Regionen mit der Nukleinsäure so assoziiert werden, dass die Stabilität und/oder die Translationseffizienz der von der transkribierbaren Nukleinsäure transkribierten RNA erhöht wird.
Die 3'-untranslatierten Regionen von Immunglobulin-mRNAs sind relativ kurz (weniger als etwa 300 Nukleotide), während die 3'-untranslatierten Regionen anderer Gene relativ lang sind. Zum Beispiel ist die 3'-untranslatierte Region von tPA etwa 800 Nukleotide lang, die von Faktor VIII etwa 1800 Nukleotide und die von Erythropoietin etwa 560 Nukleotide lang.
Gemäß der Erfindung kann bestimmt werden, ob eine 3'-untranslatierte Region oder eine davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz die Stabilität und/oder Translationseffizienz von RNA erhöht, indem die 3'-untranslatierte Region oder die davon abgeleitete Nukleinsäuresequenz in die 3'-untranslatierte Region eines Gens eingebaut wird und gemessen wird, ob der Einbau die Menge an synthetisiertem Protein erhöht.
Das Vorstehende gilt entsprechend für den Fall, dass gemäß der Erfindung eine Nukleinsäure zwei oder mehr 3'-untranslatierte Regionen umfasst, die vorzugsweise sequentiell mit oder ohne einen Linker dazwischen gekoppelt sind, vorzugsweise in einer „Kopf-Schwanz-Beziehung“ (d. h. die 3'-untranslatierten Regionen haben die gleiche Ausrichtung, vorzugsweise die in einer Nukleinsäure natürlich vorkommende Ausrichtung).
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Begriff „Gen“ auf eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, die für die Produktion eines oder mehrerer zellulärer Produkte und/oder für die Realisierung einer oder mehrerer interzellulärer oder intrazellulärer Funktionen verantwortlich ist. Genauer gesagt, bezieht sich der Begriff auf einen DNA-Abschnitt, der eine Nukleinsäure enthält, die für ein spezifisches Protein oder ein funktionelles oder strukturelles RNA-Molekül kodiert.
Polyadenylierung ist das Anfügen einer Poly(A)-Sequenz oder eines Schwanzes an eine primäre Transkript-RNA. Die Poly(A)-Sequenz besteht aus mehreren Adenosinmonophosphaten. Mit anderen Worten, es handelt sich um ein Stück der RNA, das nur Adeninbasen enthält. In Eukaryoten ist die Polyadenylierung Teil des Prozesses, bei dem reife Messenger-RNA (mRNA) für die Translation entsteht. Sie ist also ein Teil des größeren Prozesses der Genexpression. Der Prozess der Polyadenylierung beginnt, wenn die Transkription eines Gens abgeschlossen ist oder endet. Das äußerste 3'-Segment der neu gebildeten prä-mRNA wird zunächst von einer Reihe von Proteinen abgespalten; diese Proteine synthetisieren dann die Poly(A)-Sequenz am 3'-Ende der RNA. Die Poly(A)-Sequenz ist wichtig für den Kernexport, die Übersetzung und die Stabilität der mRNA. Die Sequenz wird mit der Zeit verkürzt, und wenn sie kurz genug ist, wird die mRNA enzymatisch abgebaut.
Die Begriffe „Polyadenylsequenz“, „Poly(A)-Sequenz“ oder „Poly(A)-Schwanz“ beziehen sich auf eine Sequenz von Adenylresten, die sich normalerweise am 3'-Ende eines RNA-Moleküls befindet. Die Erfindung sieht vor, dass eine solche Sequenz während der RNA-Transkription über eine DNA-Matrize auf der Grundlage wiederholter Thymidylreste in dem Strang, der zum kodierenden Strang komplementär ist, angehängt wird, während diese Sequenz normalerweise nicht in der DNA kodiert ist, sondern nach der Transkription im Zellkern durch eine matrizenunabhängige RNA-Polymerase an das freie 3'-Ende der RNA angehängt wird. Der Begriff „A-Nukleotide“ oder „A“ bezieht sich auf Adenylreste.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Nukleinsäuremolekül gemäß der Erfindung ein Vektor. Der Begriff „Vektor“ wird hier in seiner allgemeinsten Bedeutung verwendet und umfasst alle Zwischenträger für eine Nukleinsäure, die es beispielsweise ermöglichen, die Nukleinsäure in prokaryotische und/oder eukaryotische Wirtszellen einzubringen und gegebenenfalls in ein Genom zu integrieren. Solche Vektoren werden vorzugsweise in der Zelle repliziert und/oder exprimiert. Zu den Vektoren gehören Plasmide, Phagemide oder Virusgenome. Der Begriff „Plasmid“, wie er hier verwendet wird, bezieht sich im Allgemeinen auf ein Konstrukt aus extrachromosomalem genetischem Material, in der Regel ein zirkuläres DNA-Duplex, das sich unabhängig von chromosomaler DNA replizieren kann.
Im Rahmen der Erfindung bezieht sich der Begriff „Wirtszelle“ auf jede Zelle, die mit einer exogenen Nukleinsäure transformiert oder transfiziert werden kann. Der Begriff „Wirtszelle“ umfasst gemäß der Erfindung prokaryotische (z. B. E. coli) oder eukaryotische Zellen (z. B. Hefezellen und Insektenzellen). Besonders bevorzugt werden Säugetierzellen wie Zellen von Menschen, Mäusen, Hamstern, Schweinen, Ziegen und Primaten. Die Zellen können aus einer Vielzahl von Gewebetypen gewonnen werden und umfassen Primärzellen und Zelllinien. Spezifische Beispiele sind Keratinozyten, periphere Blutleukozyten, Knochenmarkstammzellen und embryonale Stammzellen. In anderen Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage. Eine Nukleinsäure kann in der Wirtszelle in einer oder in mehreren Kopien vorhanden sein und wird in einer Ausführungsform in der Wirtszelle exprimiert.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff „Peptid“ Oligo- und Polypeptide und bezieht sich auf Substanzen, die zwei oder mehr, vorzugsweise 3 oder mehr, vorzugsweise 4 oder mehr, vorzugsweise 6 oder mehr, vorzugsweise 8 oder mehr, vorzugsweise 10 oder mehr, vorzugsweise 13 oder mehr, vorzugsweise 16 oder mehr, vorzugsweise 20 oder mehr und bis zu vorzugsweise 50, vorzugsweise 100 oder vorzugsweise 150, aufeinanderfolgende Aminosäuren umfassen, die über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.
Der Begriff „Protein“ bezieht sich auf große Peptide, vorzugsweise Peptide mit mindestens 151 Aminosäuren, aber die Begriffe „Peptid“ und „Protein“ werden hier in der Regel als Synonyme verwendet. Die Begriffe „Peptid“ und „Protein“ umfassen gemäß der Erfindung Stoffe, die nicht nur Aminosäurekomponenten, sondern auch Nicht-Aminosäurekomponenten wie Zucker und Phosphatstrukturen enthalten, sowie Stoffe, die Bindungen wie Ester-, Thioether- oder Disulfidbindungen enthalten.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäure wie RNA für ein Peptid oder Protein kodieren. Dementsprechend kann eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz oder ein Transkript davon einen offenen Leserahmen (ORF für Open Reading Frame) enthalten, der für ein Peptid oder Protein kodiert. Die Nukleinsäure kann das kodierte Peptid oder Protein exprimieren. Bei der Nukleinsäure kann es sich beispielsweise um eine Nukleinsäure handeln, die ein Antigen oder ein pharmazeutisch aktives Peptid oder Protein wie eine immunologisch aktive Verbindung (die vorzugsweise kein Antigen ist) kodiert und exprimiert.
Gemäß der Erfindung bedeutet der Begriff „Nukleinsäure, die für ein Peptid oder Protein kodiert“, dass die Nukleinsäure, wenn sie in der geeigneten Umgebung, vorzugsweise innerhalb einer Zelle, vorhanden ist, den Zusammenbau von Aminosäuren zur Herstellung des Peptids oder Proteins während des Translationsprozesses steuern kann. Vorzugsweise ist die RNA gemäß der Erfindung in der Lage, mit der zellulären Translationsmaschinerie zu interagieren, was die Translation des Peptids oder Proteins ermöglicht.
Gemäß der Erfindung umfasst die RNA in einer Ausführungsform pharmazeutisch aktive RNA oder besteht aus dieser. Eine „pharmazeutisch aktive RNA“ kann eine RNA sein, die für ein pharmazeutisch aktives Peptid oder Protein kodiert.
Ein „pharmazeutisch aktives Peptid oder Protein“ hat eine positive oder vorteilhafte Wirkung auf den Zustand oder den Krankheitszustand eines Subjekts, wenn es dem Subjekt in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht wird. Vorzugsweise hat ein pharmazeutisch aktives Peptid oder Protein heilende oder lindernde Eigenschaften und kann verabreicht werden, um ein oder mehrere Symptome einer Krankheit oder Störung zu bessern, zu lindern, umzukehren, ihr Auftreten zu verzögern oder ihren Schweregrad zu verringern. Ein pharmazeutisch aktives Peptid oder Protein kann prophylaktische Eigenschaften haben und verwendet werden, um den Ausbruch einer Krankheit zu verzögern oder den Schweregrad einer solchen Krankheit oder eines pathologischen Zustands zu verringern. Der Begriff „pharmazeutisch aktives Peptid oder Protein“ umfasst ganze Proteine oder Polypeptide und kann sich auch auf pharmazeutisch aktive Fragmente davon beziehen. Er kann auch pharmazeutisch aktive Analoga eines Peptids oder Proteins einschließen. Der Begriff „pharmazeutisch aktives Peptid oder Protein“ umfasst Peptide und Proteine, die Antigene sind, d. h., die Verabreichung des Peptids oder Proteins an ein Subjekt löst eine Immunantwort in einem Subjekt aus, die therapeutisch oder teilweise oder vollständig schützend sein kann.
Beispiele für pharmazeutisch aktive Proteine sind unter anderem Zytokine und Proteine des Immunsystems wie immunologisch wirksame Verbindungen (z. B. Interleukine, Kolonie-stimulierender Faktor (CSF), Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Erythropoietin, Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interferone, Integrine, Adressine, Seletine, Homing-Rezeptoren, T-Zell-Rezeptoren, Immunglobuline, lösliche Antigene des Haupthistokompatibilitätskomplexes, immunologisch aktive Antigene wie bakterielle, parasitäre oder virale Antigene, Allergene, Autoantigene, Antikörper), Hormone (Insulin, Schilddrüsenhormone, Katecholamine, Gonadotropine, trophische Hormone, Prolaktin, Oxytocin, Dopamin, Rindersomatotropin, Leptine und dergleichen), Wachstumshormone (z. B. menschliches Wachstumshormon), Wachstumsfaktoren (z. B. epidermaler Wachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, insulinähnlicher Wachstumsfaktor und dergleichen), Wachstumsfaktorrezeptoren, Enzyme (Gewebeplasminogenaktivator, Streptokinase, cholesterinbiosynthetische oder -abbauende, steriodogene Enzyme, Kinasen, Phosphodiesterasen, Methylasen, Demethylasen, Dehydrogenasen, Cellulasen, Proteasen, Lipasen, Phospholipasen, Aromatasen, Cytochrome, Adenylat- oder Guanylatcyclasen, Neuramidasen und dergleichen), Rezeptoren (Steroidhormonrezeptoren, Peptidrezeptoren), Bindungsproteine (Wachstumshormon- oder Wachstumsfaktorbindungsproteine und dergleichen), Transkriptions- und Translationsfaktoren, Tumorwachstum unterdrückende Proteine (z. B. Proteine, die die Angiogenese hemmen), Strukturproteine (wie Kollagen, Fibroin, Fibrinogen, Elastin, Tubulin, Aktin und Myosin), Blutproteine (Thrombin, Serumalbumin, Faktor VII, Faktor VIII, Insulin, Faktor IX, Faktor X, Gewebeplasminogenaktivator, Protein C, von-Wilebrand-Faktor, Antithrombin III, Glukozerebrosidase, Erythropoietin, Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (GCSF) oder modifizierter Faktor VIII, Antikoagulanzien und dergleichen.
In einer Ausführungsform ist das pharmazeutisch aktive Protein gemäß der Erfindung ein Zytokin, das an der Regulierung der lymphoiden Homöostase beteiligt ist, vorzugsweise ein Zytokin, das an der Entwicklung, dem Priming, der Expansion, der Differenzierung und/oder dem Überleben von T-Zellen beteiligt ist und diese vorzugsweise induziert oder fördert. In einer Ausführungsform ist das Zytokin ein Interleukin. In einer Ausführungsform ist das pharmazeutisch aktive Protein gemäß der Erfindung ein Interleukin, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IL-2, IL-7, IL-12, IL-15 und IL-21.
Der Begriff „immunologisch wirksame Verbindung“ bezieht sich auf jede Verbindung, die eine Immunantwort verändert, vorzugsweise durch Induktion und/oder Unterdrückung der Reifung von Immunzellen, Induktion und/oder Unterdrückung der Zytokinbiosynthese und/oder Veränderung der humoralen Immunität durch Stimulierung der Antikörperproduktion durch B-Zellen. Immunologisch wirksame Verbindungen besitzen eine starke immunstimulierende Wirkung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf antivirale und antitumorale Wirkung, und können auch andere Aspekte der Immunantwort herunterregulieren, zum Beispiel die Immunantwort weg von einer TH2-Immunantwort verlagern, was für die Behandlung eines breiten Spektrums von TH2-vermittelten Krankheiten nützlich ist.
Immunologisch wirksame Verbindungen können als Impfstoff-Adjuvantien nützlich sein.
Wenn es gemäß der vorliegenden Erfindung erwünscht ist, eine Immunantwort durch die Verwendung von RNA, wie hier beschrieben, auszulösen oder zu verstärken, kann die Immunantwort durch die RNA ausgelöst oder verstärkt werden. So können beispielsweise Proteine oder Peptide, die von den RNAs kodiert werden, oder deren Prozessionsprodukte von Proteinen des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden, die auf Antigen-präsentierenden Zellen exprimiert werden. Der MHC-Peptidkomplex kann dann von Immunzellen wie T-Zellen erkannt werden, was zu deren Aktivierung führt.
Der Begriff „Krankheit“ bezieht sich auf einen anormalen Zustand, der den Körper eines Individuums beeinträchtigt. Eine Krankheit wird häufig als ein medizinischer Zustand verstanden, der mit spezifischen Symptomen und Anzeichen einhergeht. Eine Krankheit kann durch Faktoren verursacht werden, die ursprünglich aus einer externen Quelle stammen, wie z. B. Infektionskrankheiten, oder sie kann durch interne Funktionsstörungen verursacht werden, wie z. B. Autoimmunerkrankungen.
Gemäß der Erfindung bezieht sich der Begriff „Krankheit“ auch auf Krebserkrankungen. Die Begriffe „Krebserkrankung“ oder „Krebs“ (medizinischer Begriff: bösartiges Neoplasma) beziehen sich auf eine Klasse von Krankheiten, bei denen eine Gruppe von Zellen unkontrolliertes Wachstum (Teilung über das normale Maß hinaus), Invasion (Eindringen in und Zerstörung von angrenzendem Gewebe) und manchmal Metastasierung (Ausbreitung auf andere Stellen im Körper über Lymphe oder Blut) zeigt. Diese drei bösartigen Eigenschaften von Krebserkrankungen unterscheiden sie von gutartigen Tumoren, die selbstbegrenzt sind und nicht eindringen oder metastasieren. Die meisten Krebsarten bilden einen Tumor, d. h. eine Schwellung oder Läsion, die durch ein abnormales Wachstum von Zellen (sogenannte neoplastische Zellen oder Tumorzellen) entsteht, einige jedoch, wie Leukämie, nicht. Beispiele für Krebserkrankungen sind unter anderem Karzinom, Lymphom, Blastom, Sarkom, Glioma und Leukämie. Zu diesen Krebsarten gehören insbesondere Knochenkrebs, Blutkrebs, Lungenkrebs, Leberkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Hautkrebs, Kopf- oder Halskrebs, malignes Melanom der Haut oder des Augeninneren, Gebärmutterkrebs, Eierstockkrebs, Enddarmkrebs, Krebs im Analbereich, Magenkrebs, Dickdarmkrebs, Brustkrebs, Prostatakrebs, Gebärmutterkrebs, Karzinom der Geschlechts- und Fortpflanzungsorgane, Morbus Hodgkin, Speiseröhrenkrebs, Dünndarmkrebs, Krebs des endokrinen Systems, Schilddrüsenkrebs, Nebenschilddrüsenkrebs, Nebennierenkrebs, Sarkom der Weichteile, Blasenkrebs, Nierenkrebs, Nierenzellkarzinom, Nierenbeckenkarzinom, Neubildungen des Zentralnervensystems (ZNS), neuroektodermaler Krebs, Tumore der Wirbelsäule, Gliom, Meningiom und Hypophysenadenom. Der Begriff „Krebs“ gemäß der Erfindung umfasst auch Krebsmetastasen.
Der Begriff „Infektionskrankheit“ bezieht sich auf jede Krankheit, die von Mensch zu Mensch oder von Organismus zu Organismus übertragen werden kann und durch einen mikrobiellen Erreger (z. B. Erkältung) verursacht wird. Beispiele für Infektionskrankheiten umfassen virale Infektionskrankheiten wie AIDS (HIV), Hepatitis A, B oder C, Herpes, Herpes zoster (Windpocken), Röteln (Rötelnvirus), Gelbfieber, Dengue usw., Flaviviren, Influenzaviren, hämorrhagische Infektionskrankheiten (Marburg- oder Ebolavirus) und das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS), bakterielle Infektionskrankheiten wie die Legionärskrankheit (Legionella), sexuell übertragbare Krankheiten (z. B. Chlamydien oder Tripper); Magengeschwüre (Helicobacter), Cholera (Vibrio), Tuberkulose, Diphtherie, Infektionen durch E. coli, Staphylokokken, Salmonellen oder Streptokokken (Tetanus) ; Infektionen durch Protozoen-Erreger wie Malaria, Schlafkrankheit, Leishmaniose; Toxoplasmose, d. h. Infektionen durch Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania und Toxoplasma; oder Pilzinfektionen, die z. B. durch Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis oder Candida albicans verursacht werden.
Der Begriff „Autoimmunerkrankung“ bezieht sich auf jede Krankheit, bei der der Körper eine immunogene (d. h. durch das Immunsystem hervorgerufene) Reaktion auf einen Bestandteil seines eigenen Gewebes zeigt. Mit anderen Worten: Das Immunsystem verliert seine Fähigkeit, ein bestimmtes Gewebe oder System innerhalb des Körpers als körpereigen zu erkennen und greift es an, als sei es fremd. Autoimmunkrankheiten lassen sich in solche einteilen, bei denen vorwiegend ein Organ betroffen ist (z. B. hämolytische Anämie und Anti-Immunthyreoiditis), und solche, bei denen der Autoimmunkrankheitsprozess über viele Gewebe verstreut ist (z. B. systemischer Lupus erythematodes). So wird beispielsweise angenommen, dass Multiple Sklerose durch T-Zellen verursacht wird, die die Hüllen angreifen, welche die Nervenfasern des Gehirns und des Rückenmarks umgeben. Dies führt zu Koordinationsverlust, Schwäche und verschwommenem Sehen. Autoimmunerkrankungen sind in der Fachwelt bekannt und umfassen beispielsweise Hashimoto-Thyreoiditis, Morbus Grave, Lupus, Multiple Sklerose, rheumatische Arthritis, hämolytische Anämie, Antiimmun-Thyreoiditis, systemischer Lupus erythematodes, Zöliakie, Morbus Crohn, Colitis, Diabetes, Sklerodermie, Psoriasis und dergleichen.
Gemäß der Erfindung kann eine Immunantwort stimuliert werden, indem eine geeignete mRNA, die für ein Antigen oder ein Fragment davon, z. B. ein krankheitsassoziiertes Antigen, kodiert, in ein Subjekt eingebracht wird.
Der Begriff „Antigen“ bezieht sich auf ein Agens, das ein Epitop enthält, gegen das eine Immunantwort erzeugt werden soll. Der Begriff „Antigen“ umfasst insbesondere Proteine, Peptide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, insbesondere RNA und DNA, und Nukleotide. Der Begriff „Antigen“ umfasst auch Agenzien, die erst durch Transformation (z. B. intermediär im Molekül oder durch Ergänzung mit Körperprotein) antigen - und sensibilisierend - werden. Ein Antigen kann vorzugsweise von Zellen des Immunsystems präsentiert werden, wie etwa von Antigen-präsentierenden Zellen wie dendritischen Zellen oder Makrophagen. Darüber hinaus ist ein Antigen oder ein Prozessierungsprodukt davon vorzugsweise durch einen T- oder B-Zell-Rezeptor oder durch ein Immunglobulinmolekül wie einen Antikörper erkennbar. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Antigen ein krankheitsassoziiertes Antigen, wie etwa ein tumorassoziiertes Antigen, ein virales Antigen oder ein bakterielles Antigen.
Der Begriff „krankheitsassoziiertes Antigen“ wird im weitesten Sinne verwendet, um jedes Antigen zu bezeichnen, das mit einer Krankheit assoziiert ist. Ein krankheitsassoziiertes Antigen ist ein Molekül, das Epitope enthält, die das Immunsystem eines Wirts dazu anregen, eine zelluläre antigenspezifische Immunantwort und/oder eine humorale Antikörperreaktion gegen die Krankheit auszulösen. Das krankheitsassoziierte Antigen kann daher für therapeutische Zwecke verwendet werden. Krankheitsassoziierte Antigene sind vorzugsweise mit einer Infektion durch Mikroben, typischerweise mikrobielle Antigene, oder mit Krebs, typischerweise Tumoren, assoziiert.
Der Begriff „Krankheit, an der ein Antigen beteiligt ist“ bezieht sich auf jede Krankheit, an der ein Antigen beteiligt ist, d. h. eine Krankheit, die durch das Vorhandensein eines Antigens gekennzeichnet ist. Bei der Krankheit, an der ein Antigen beteiligt ist, kann es sich um eine Infektionskrankheit, eine Autoimmunerkrankung, eine Krebserkrankung oder einfach um Krebs handeln. Wie bereits erwähnt, kann es sich bei dem Antigen um ein krankheitsassoziiertes Antigen handeln, wie etwa ein tumorassoziiertes Antigen, ein virales Antigen oder ein bakterielles Antigen.
In einer Ausführungsform ist ein krankheitsassoziiertes Antigen ein tumorassoziiertes Antigen. In dieser Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung bei der Behandlung von Krebs oder Krebsmetastasen nützlich sein. Vorzugsweise ist das kranke Organ oder Gewebe dadurch gekennzeichnet, dass kranke Zellen wie Krebszellen ein krankheitsassoziiertes Antigen exprimieren und/oder dadurch gekennzeichnet sind, dass ein krankheitsassoziiertes Antigen mit ihrer Oberfläche assoziiert ist. Die Immunisierung mit intakten oder im Wesentlichen intakten tumorassoziierten Antigenen oder Fragmenten davon, wie etwa MHC-Klasse-I- und -Klasse-II-Peptiden oder Nukleinsäuren, insbesondere mRNA, die für ein solches Antigen oder Fragment kodieren, ermöglicht es, eine Reaktion vom Typ MHC-Klasse-I und/oder MHC-Klasse-II auszulösen und somit T-Zellen wie zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten, die in der Lage sind, Krebszellen zu lysieren, und/oder CD4+ T-Zellen zu stimulieren. Eine solche Immunisierung kann auch eine humorale Immunantwort (B-Zellen-Reaktion) auslösen, die zur Bildung von Antikörpern gegen das tumorassoziierte Antigen führt. Darüber hinaus können Antigen-präsentierende Zellen (APC) wie dendritische Zellen (DCs) durch Transfektion mit Nukleinsäuren, die für Tumorantigene kodieren, in vitro mit MHC-Klasse-I-präsentierten Peptiden beladen und einem Patienten verabreicht werden. In einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff „tumorassoziiertes Antigen“ auf einen Bestandteil von Krebszellen, der aus dem Zytoplasma, der Zelloberfläche und dem Zellkern stammen kann. Insbesondere handelt es sich um solche Antigene, die vorzugsweise in großer Menge intrazellulär oder als Oberflächenantigene auf Tumorzellen produziert werden. Beispiele für Tumorantigene sind HER2, EGFR, VEGF, CAMPATH1-Antigen, CD22, CA-125, HLA-DR, Hodgkin-Lymphom oder Mucin-1, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein tumorassoziiertes Antigen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise jedes Antigen, das für Tumore oder Krebserkrankungen sowie für Tumor- oder Krebszellen hinsichtlich Typ und/oder Expressionsniveau charakteristisch ist. In einer Ausführungsform bezieht sich der Begriff „tumorassoziiertes Antigen“ auf Proteine, die unter normalen Bedingungen, d. h. bei einem gesunden Subjekt, spezifisch in einer begrenzten Anzahl von Organen und/oder Geweben oder in bestimmten Entwicklungsstadien exprimiert werden, zum Beispiel kann das tumorassoziierte Antigen unter normalen Bedingungen spezifisch im Magengewebe, vorzugsweise in der Magenschleimhaut, in den Fortpflanzungsorganen, z. B. in Hoden, in trophoblastischem Gewebe, z. B. in der Plazenta, oder in Keimbahnzellen exprimiert werden und in einem oder mehreren Tumor- oder Krebsgeweben exprimiert oder aberrant exprimiert werden. In diesem Kontext bedeutet „eine begrenzte Anzahl“ vorzugsweise nicht mehr als 3, noch bevorzugter nicht mehr als 2 oder 1. Zu den tumorassoziierten Antigenen im Rahmen der vorliegenden Erfindung gehören zum Beispiel Differenzierungsantigene, vorzugsweise zelltypspezifische Differenzierungsantigene, d. h. Proteine, die unter normalen Bedingungen spezifisch in einem bestimmten Zelltyp in einem bestimmten Differenzierungsstadium exprimiert werden, Krebs-/Hodenantigene, d. h. Proteine, die unter normalen Bedingungen spezifisch in Hoden und manchmal in der Plazenta exprimiert werden, und keimbahnspezifische Antigene. Im Kontext der vorliegenden Erfindung wird das tumorassoziierte Antigen vorzugsweise nicht oder nur selten in normalen Geweben exprimiert oder ist in Tumorzellen mutiert. Vorzugsweise identifiziert das tumorassoziierte Antigen oder die abweichende Expression des tumorassoziierten Antigens Krebszellen. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist das tumorassoziierte Antigen, das von einer Krebszelle in einem Subjekt, z. B. einem Patienten mit einer Krebserkrankung, exprimiert wird, vorzugsweise ein Eigenprotein des Subjekts. In bevorzugten Ausführungsformen wird das tumorassoziierte Antigen im Kontext der vorliegenden Erfindung unter normalen Bedingungen spezifisch in einem Gewebe oder Organ exprimiert, das nicht essentiell ist, d. h. in Geweben oder Organen, die bei einer Schädigung durch das Immunsystem nicht zum Tod des Subjekts führen, oder in Organen oder Strukturen des Körpers, die für das Immunsystem nicht oder nur schwer zugänglich sind. Vorzugsweise wird ein tumorassoziiertes Antigen von einer Krebszelle, in der es exprimiert wird, im Kontext von MHC-Molekülen präsentiert.
Beispiele für Differenzierungsantigene, die idealerweise die Kriterien für tumorassoziierte Antigene im Sinne der vorliegenden Erfindung als Zielstrukturen in der Tumorimmuntherapie, insbesondere in der Tumorvakzinierung, erfüllen, sind die Zelloberflächenproteine der Claudin-Familie, wie CLDN6 und CLDN18.2. Diese Differenzierungsantigene werden in Tumoren unterschiedlicher Herkunft exprimiert und eignen sich aufgrund ihrer selektiven Expression (keine Expression in toxizitätsrelevantem Normalgewebe) und ihrer Lokalisation an der Plasmamembran besonders gut als Zielstrukturen im Rahmen einer Antikörper-vermittelten Krebsimmuntherapie.
Weitere Beispiele für Antigene, die für die vorliegende Erfindung nützlich sein können, sind p53, ART-4, BAGE, beta-Catenin/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (oder hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE A, vorzugsweise MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE A11 oder MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pml/RARa, PRAME, Proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 oder RU2, SAGE, SART-1 oder SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE und WT, vorzugsweise WT-1.
Der Begriff „virales Antigen“ bezieht sich auf jeden viralen Bestandteil, der antigene Eigenschaften hat, d. h. in der Lage ist, eine Immunantwort bei einem Individuum hervorzurufen. Das virale Antigen kann ein virales Ribonukleoprotein oder ein Hüllprotein sein.
Der Begriff „bakterielles Antigen“ bezieht sich auf jeden bakteriellen Bestandteil, der antigene Eigenschaften hat, d. h. in der Lage ist, eine Immunantwort bei einem Individuum hervorzurufen. Das bakterielle Antigen kann aus der Zellwand oder der Zytoplasmamembran des Bakteriums stammen.
Der hier verwendete Begriff „Immunantwort“ bezieht sich auf eine Reaktion des Immunsystems, wie etwa auf immunogene Organismen, wie Bakterien oder Viren, Zellen oder Substanzen. Der Begriff „Immunantwort“ umfasst die angeborene Immunantwort und die adaptive Immunantwort. Vorzugsweise bezieht sich die Immunantwort auf eine Aktivierung von Immunzellen, eine Induktion der ZytokinBiosynthese und/oder der Antikörperproduktion. Vorzugsweise umfasst die Immunantwort die Schritte der Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen, wie dendritischen Zellen und/oder Makrophagen, der Präsentation eines Antigens oder eines Fragments davon durch die Antigen-präsentierenden Zellen und der Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen aufgrund dieser Präsentation.
Der Begriff „behandeln“ oder „Behandlung“ bezieht sich auf jede Behandlung, die den Gesundheitszustand verbessert und/oder die Lebensspanne eines Individuums verlängert (erhöht). Die Behandlung kann die Krankheit bei einem Individuum beseitigen, die Entwicklung einer Krankheit bei einem Individuum aufhalten oder verlangsamen, die Entwicklung einer Krankheit bei einem Individuum hemmen oder verlangsamen, die Häufigkeit oder den Schweregrad von Symptomen bei einem Individuum verringern und/oder das Wiederauftreten bei einem Individuum, das gegenwärtig eine Krankheit hat oder früher eine Krankheit hatte, verringern.
Der Begriff „Behandlung einer Krankheit“ umfasst insbesondere die Heilung, die Verkürzung der Dauer, die Linderung, die Verlangsamung oder die Verhinderung des Fortschreitens oder der Verschlimmerung einer Krankheit oder ihrer Symptome.
Der Begriff „Immuntherapie“ bezieht sich auf eine Behandlung, die vorzugsweise eine spezifische Immunreaktion und/oder Immunef-fektorfunktion(en) beinhaltet.
Der Begriff „Immunisierung“ oder „Impfung“ beschreibt den Prozess der Behandlung eines Subjekts aus therapeutischen oder prophylaktischen Gründen.
Der Begriff „Subjekt“ oder „Individuum“, wie er hierin verwendet wird, bezieht sich vorzugsweise auf Säugetiere. Säugetiere im Kontext der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise Menschen, nichtmenschliche Primaten, domestizierte Tiere wie Hunde, Katzen, Schafe, Rinder, Ziegen, Schweine, Pferde usw., Labortiere wie Mäuse, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen usw. sowie Tiere in Gefangenschaft, wie Tiere in Zoos. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Subjekt ein Mensch.
Der Begriff „Antigen-präsentierende Zelle“ (APC) bezieht sich auf eine Zelle aus einer Vielzahl von Zellen, die in der Lage ist, mindestens ein Antigen oder Antigenfragment auf (oder an) ihrer Zelloberfläche zu zeigen, aufzunehmen und/oder zu präsentieren. Antigen-präsentierende Zellen können in professionelle Antigen-präsentierende Zellen und nicht professionelle Antigen-präsentierende Zellen unterteilt werden.
Der Begriff „professionelle Antigen-präsentierende Zellen“ bezieht sich auf Antigen-präsentierende Zellen, die die für die Interaktion mit naiven T-Zellen erforderlichen Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes der Klasse II (MHC-Klasse II) konstitutiv exprimieren. Wenn eine T-Zelle mit dem MHC-Klasse-II-Molekülkomplex auf der Membran der Antigen-präsentierenden Zelle in Wechselwirkung tritt, produziert die Antigen-präsentierende Zelle ein Co-Stimulationsmolekül, das die Aktivierung der T-Zelle auslöst. Zu den professionellen Antigen-präsentierenden Zellen gehören dendritische Zellen und Makrophagen.
Der Begriff „nicht professionelle Antigen-präsentierende Zellen“ bezieht sich auf Antigen-präsentierende Zellen, die nicht konstitutiv MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren, aber auf Stimulation durch bestimmte Zytokine wie Interferon gamma. Beispiele für nicht professionelle Antigen-präsentierende Zellen sind Fibroblasten, Thymusepithelzellen, Schilddrüsenepithelzellen, Gliazellen, Betazellen der Bauchspeicheldrüse oder vaskuläre Endothelzellen.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden einem Patienten Nukleinsäuren, wie etwa RNA, durch Ex-vivo-Methoden verabreicht, d. h. durch Entnahme von Zellen aus einem Patienten, genetische Veränderung dieser Zellen und Wiedereinführung der veränderten Zellen in den Patienten. Transfektions- und Transduktionsverfahren sind dem Fachmann bekannt.
Erfindungsgemäß bezeichnet der Begriff „Transfektion“ das Einbringen einer oder mehrerer Nukleinsäuren in einen Organismus oder in eine Wirtszelle. Um erfindungsgemäß Nukleinsäuren in vitro oder in vivo in Zellen einzubringen, können verschiedene Verfahren angewendet werden. Zu diesen Verfahren gehören die Transfektion von Nukleinsäure-CaPO₄-Präzipitaten, die Transfektion von mit DEAE assoziierten Nukleinsäuren, die Transfektion oder Infektion mit Viren, die die interessierenden Nukleinsäuren tragen, die durch Liposomen vermittelte Transfektion und dergleichen.
Gemäß der Erfindung können die Nukleinsäuren auf bestimmte Zellen gerichtet sein. In solchen Ausführungsformen kann ein Träger, der zur Verabreichung einer Nukleinsäure an eine Zelle verwendet wird (z. B. ein Retrovirus oder ein Liposom), ein gebundenes Zielmolekül aufweisen. Beispielsweise kann ein Molekül wie ein Antikörper, der für ein Oberflächenmembranprotein auf der Zielzelle spezifisch ist, oder ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle in den Nukleinsäureträger eingebaut oder daran gebunden werden. Ist die Verabreichung einer Nukleinsäure durch Liposomen erwünscht, können Proteine, die an ein mit der Endozytose assoziiertes Oberflächenmembranprotein binden, in die Liposomenformulierung eingebaut werden, um das Targeting und/oder die Absorption zu ermöglichen.
Zu solchen Proteinen gehören Kapsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sind, Antikörper gegen Proteine, die internalisiert werden, Proteine, die auf eine intrazelluläre Stelle abzielen, und dergleichen.
„Reporter“ bezieht sich auf ein Molekül, in der Regel ein Peptid oder Protein, das von einem Reportergen kodiert und in einem Reporterassay gemessen wird. Herkömmliche Systeme verwenden in der Regel einen enzymatischen Reporter und messen die Aktivität dieses Reporters.
Der Begriff „multiple Klonierungsstelle“ bezieht sich auf eine Nukleinsäureregion, die Restriktionsenzymstellen enthält, von denen eine beliebige für die Spaltung zum Beispiel eines Vektors und das Einfügen einer Nukleinsäure verwendet werden kann.
Gemäß der Erfindung sind zwei Elemente wie Nukleotide oder Aminosäuren aufeinanderfolgend, wenn sie direkt und ohne Unterbrechung aneinandergrenzen. Zum Beispiel bezieht sich eine Sequenz von x aufeinanderfolgenden Nukleotiden N auf die Sequenz (N)_x.
„Restriktionsendonuklease“ oder „Restriktionsenzym“ bezieht sich auf eine Klasse von Enzymen, die Phosphodiesterbindungen in beiden Strängen eines DNA-Moleküls innerhalb spezifischer Basensequenzen spalten. Sie erkennen spezifische Bindungsstellen, die als Erkennungssequenzen bezeichnet werden, auf einem doppelsträngigen DNA-Molekül. Die Stellen, an denen die Phosphodiesterbindungen in der DNA von den Enzymen gespalten werden, werden als Spaltstellen bezeichnet. Bei Enzymen des Typs IIS befindet sich die Spaltstelle in einem bestimmten Abstand von der DNA-Bindungsstelle. Gemäß der Erfindung umfasst der Begriff „Restriktionsendonuklease“ zum Beispiel die Enzyme SapI, EciI, BpiI, AarI, AloI, BaeI, BbvCI, PpiI und PsrI, BsrDI, BtsI, EarI, BmrI, BsaI, BsmBI, FauI, BbsI, BciVI, BfuAI, BspMI, BseRI, EciI, BtgZI, BpuEI, BsgI, MmeI, CspCI, BaeI, BsaMI, Mva1269I, PctI, Bse3DI, BseMI, Bst6I, Eam1104I, Ksp6321, BfiI, Bso31I, BspTNI, Eco31I, Esp3I, BfuI, Acc36I, AarI, Eco57I, Eco57MI, GsuI, AloI, Hin4I, PpiI, und PsrI.
Der Begriff „Stabilität“ der RNA bezieht sich auf die „Halbwertszeit“ der RNA. „Halbwertszeit“ bezieht sich auf die Zeitspanne, die benötigt wird, um die Hälfte der Aktivität, Menge oder Anzahl der Moleküle zu eliminieren. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist die Halbwertszeit einer RNA ein Indikator für die Stabilität der genannten RNA.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuren wie RNA können, insbesondere wenn sie für die hierin beschriebenen Behandlungen verwendet werden, in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Kits vorliegen, das die Nukleinsäure und gegebenenfalls einen oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzungen sind vorzugsweise steril und enthalten eine wirksame Menge der Nukleinsäure.
Pharmazeutische Zusammensetzungen werden in der Regel in einer einheitlichen Darreichungsform bereitgestellt und können auf eine in der Technik bekannte Weise hergestellt werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann z. B. in Form einer Lösung oder Suspension vorliegen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann Salze, Puffersubstanzen, Konservierungsmittel, Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe enthalten, die vorzugsweise alle pharmazeutisch verträglich sind. Der Begriff „pharmazeutisch verträglich“ bezieht sich auf die Ungiftigkeit eines Stoffes, der die Wirkung des oder der Wirkstoffe der pharmazeutischen Zusammensetzung nicht beeinträchtigt.
Salze, die nicht pharmazeutisch verträglich sind, können für die Herstellung pharmazeutisch verträglicher Salze verwendet werden und sind in der Erfindung enthalten. Zu den pharmazeutisch verträglichen Salzen dieser Art gehören in nicht einschränkender Weise solche, die aus den folgenden Säuren hergestellt werden: Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Phosphor-, Malein-, Essig-, Salicyl-, Zitronen-, Ameisen-, Malon-, Bernsteinsäure und dergleichen. Pharmazeutisch verträgliche Salze können auch als Alkali- oder Erdalkalisalze, wie Natrium-, Kalium- oder Calciumsalze, hergestellt werden.
Geeignete Puffersubstanzen zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen Essigsäure in einem Salz, Zitronensäure in einem Salz, Borsäure in einem Salz und Phosphorsäure in einem Salz.
Geeignete Konservierungsmittel zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen Benzalkoniumchlorid, Chlorbutanol, Paraben und Thimerosal.
Der Begriff „Träger“ bezieht sich auf eine organische oder anorganische Komponente natürlicher oder nicht natürlicher (synthetischer) Natur, mit der der Wirkstoff kombiniert wird, um die Anwendung zu erleichtern, zu verbessern oder zu ermöglichen. Gemäß der Erfindung umfasst der Begriff „Träger“ auch einen oder mehrere kompatible feste oder flüssige Füllstoffe, Verdünnungsmittel oder Verkapselungsstoffe, die für die Verabreichung an einen Patienten geeignet sind.
Mögliche Trägersubstanzen für die parenterale Verabreichung sind z. B. steriles Wasser, Glukoselösungen, Ringer, Ringerlactat, sterile Natriumchloridlösung, Polyalkylenglykole, hydrierte Naphthaline und insbesondere biokompatible Lactidpolymere, Lactid/Glycolid-Copolymere oder Polyoxyethylen/Polyoxypropylen-Copolymere.
Der hier verwendete Begriff „Hilfsstoff“ soll alle Stoffe bezeichnen, die in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden sein können und keine Wirkstoffe sind, wie z. B. Träger, Bindemittel, Schmierstoffe, Verdickungsmittel, oberflächenaktive Stoffe, Konservierungsmittel, Emulgatoren, Puffer, Aromastoffe oder Farbstoffe.
Die hier beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf jedem herkömmlichen Weg verabreicht werden, wie etwa durch parenterale Verabreichung, einschließlich durch Injektion oder Infusion. Die Verabreichung erfolgt vorzugsweise parenteral, z. B. intravenös, intraarteriell, subkutan, in den Lymphknoten, intradermal oder intramuskulär.
Für die parenterale Verabreichung geeignete Zusammensetzungen bestehen in der Regel aus einer sterilen wässrigen oder nicht-wässrigen Zubereitung des Wirkstoffs, die vorzugsweise isotonisch zum Blut des Empfängers ist. Beispiele für kompatible Träger und Lösungsmittel sind Ringerlösung und isotonische Natriumchloridlösung. Darüber hinaus werden in der Regel sterile, feste Öle als Lösungs- oder Suspensionsmedium verwendet.
Die hier beschriebenen Mittel und Zusammensetzungen werden vorzugsweise in wirksamen Mengen verabreicht. Eine „wirksame Menge“ bezieht sich auf die Menge, die allein oder zusammen mit weiteren Dosen eine gewünschte Reaktion oder einen gewünschten Effekt erzielt. Im Falle der Behandlung einer bestimmten Krankheit oder eines bestimmten Zustands bezieht sich die gewünschte Reaktion vorzugsweise auf die Hemmung des Krankheitsverlaufs. Dies umfasst die Verlangsamung des Fortschreitens der Krankheit und insbesondere die Unterbrechung oder Umkehrung des Fortschreitens der Krankheit. Die gewünschte Reaktion bei der Behandlung einer Krankheit oder eines Zustands kann auch eine Verzögerung des Ausbruchs oder eine Verhinderung des Ausbruchs der Krankheit oder des Zustands sein.
Die wirksame Menge eines hierin beschriebenen Mittels oder einer Zusammensetzung hängt von dem zu behandelnden Zustand, dem Schweregrad der Krankheit, den individuellen Parametern des Patienten, einschließlich Alter, physiologischem Zustand, Größe und Gewicht, der Dauer der Behandlung, der Art der Begleittherapie (falls vorhanden), dem spezifischen Verabreichungsweg und ähnlichen Faktoren ab. Folglich können die verabreichten Dosen der hier beschriebenen Mittel von mehreren dieser Parameter abhängen. Reagiert ein Patient mit einer Anfangsdosis nicht ausreichend, können höhere Dosen (oder effektiv höhere Dosen, die durch einen anderen, lokaleren Verabreichungsweg erreicht werden) verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Figuren und Beispiele, die nur zur Veranschaulichung und nicht als Einschränkung zu verstehen sind, ausführlich beschrieben. Auf der Grundlage der Beschreibung und der Beispiele sind dem Fachmann weitere Ausführungsformen zugänglich und liegen ebenfalls im Umfang der Erfindung.
Figurenliste

1: Halbautomatische Untersuchung der Poly(dA:dT)-Stabilität 96 E. coli-Klone, die eine Plasmid-DNA mit einer Poly(dA:dT)-Region tragen, wurden ausgewählt und in 1,4 ml in einer 96-WellPlatte für 14-16 h (37°C, 225 U/min) beimpft. Die bakteriellen Kultursuspensionen wurden geerntet und die Plasmid-DNA wurde mit einem Nucleospin-96-Well-Kit (Macherey & Nagel) gemäß dem Herstellerprotokoll gereinigt. Die Plasmid-DNA-Konzentration wurde durch UV-Spektroskopie (Nanodrop 2000, Thermo Scientific) bestimmt. Die Poly(dA:dT)-Integrität wurde durch Sacl-Restriktionsanalyse (New England Biolabs) bestimmt. Die resultierenden Fragmente wurden auf einer automatisierten Kapillargel-Elektrophorese (Qiagen) aufgetrennt. A) Beispiel für die Poly(dA:dT)-Analyse von 8 Klonen. Die Banden des internen Größenmarkers bei 25 bp und 500 bp sind mit schwarzen Sternchen markiert. Die erwarteten Banden für eine Poly(dA:dT)-Sequenz der korrekten Länge bei 142 bp und 270 bp sind durch schwarze Pfeile gekennzeichnet. Klon 1 und Klon 4 weisen eine zusätzliche Bande auf, die aus einer verkürzten Poly(dA:dT)-Sequenz resultiert, markiert mit roten Sternchen. B) Beispiel einer Vektorkarte, die für eine mRNA kodiert, bestehend aus einer 5'-untranslatierten Region (5UTR), einem Gen von Interesse (GOI), der 3'-untranslatierten Region (3UTR) und dem Poly(A)-Schwanz (A120). Die Sacl-Restriktionsstellen sind dargestellt und die Längen der Fragmente nach Inkubation mit SacI sind angegeben.
2: Stabilität unterschiedlicher Poly(dA:dT)-Konstrukte Die Plasmid-DNA von 96 E. coli-Klonen jedes Poly(dA:dT)-Konstrukts wurde gereinigt und eine Sacl-Restriktionsanalyse durchgeführt. Konstrukt-Namen: A+Zahlen: Anzahl der Adenosine 5' der Linker-Sequenz + L: Linker-Sequenz + Zahl: Anzahl der Adenosine 3' der Linker-Sequenz. Klone mit verkürzter Poly(dA:dT)-Sequenz wurden bestimmt und sind als Prozentsatz der Gesamtzahl der E. coli-Klone angegeben.
3: Stabilität von Poly(dA:dT)-Konstrukten in unterschiedlichen E. coli-Stämmen Die E. coli-Stämme TOP10, DH5α und XL1-blue wurden für die Prüfung der Poly(dA:dT)-Integrität mittels SacI-Restriktionsanalyse verwendet. Es wurden 96 Klone für die Konstrukte A120, A30L70 und A40L60 getestet. Die Anzahl der Klone mit verkürzter Poly(dA:dT)-Sequenz ist in Prozent der Gesamtzahl angegeben.
4: Funktionelle In-vitro-Charakterisierung von unterschiedlichen Poly(A)-Schwänzen Die Plasmide, die für das Glühwürmchen-Luciferase-Gen kodieren und entweder A120, A30L70 oder A40L60 enthalten, wurden stromabwärts des Poly(dA:dT) mit einem Klasse-IIS-Restriktionsenzym linearisiert, wodurch eine Matrize ohne zusätzliche Nukleotide hinter dem Poly(dA:dT) erzeugt wurde. Die linearisierte Plasmid-DNA wurde mit Hilfe von carboxylierten magnetischen Beads (Invitrogen) gereinigt, spektrophotometrisch quantifiziert und einer In-vitro-Transkription unterzogen. Für In-vitro-Transkriptionen wurden T7-RNA-Polymerase (Fermentas), der entsprechende Reaktionspuffer und 6 mM NTPs verwendet. Für ein effizientes Capping der RNA wurde die GTP-Konzentration auf 1,5 mM gesenkt, und 6 mM β-S-ARCA(D2) wurden der Reaktion zugesetzt und für 2,5 Stunden bei 37°C inkubiert. Die RNA wurde über carboxylierte magnetische Beads (Invitrogen) gereinigt, und die RNA-Konzentration und -Qualität wurden durch Spektrophotometrie und Analyse auf einem 2100 Bionanalyzer (Agilent) bewertet. A)-C) 1 × 10⁶ humane unreife dendritische Zellen (iDC), humane Fibroblasten (CCD) oder murine Myoblastomzellen (C2C12) wurden mit jeweils 10 pmol RNA gemischt und einer Elektroporation unterzogen. 5 × 10⁴ Zellen wurden in X-VIVO15-Medium (Lonza) mit Zusätzen in 24-Well-Schalen ausgesät. 2, 4, 8, 24, 48 und 72 Stunden nach der Aussaat wurden die Aktivitäten der Glühwürmchen-Luciferase durch Zugabe von Luciferin (Promega) in einem Fluoreszenz-Reader (TECAN) bestimmt.
5: Funktionelle In-vivo-Charakterisierung von unterschiedlichen Poly(A)-Schwänzen BALB/c-Mäusen (n=5) wurden intravenös RNA-Lipoplexe injiziert, die 20 µg RNA enthielten, die für Luciferase (Luc-RNA) kodiert und die verschiedenen Poly(A)-Schwänze A120, A30L70 oder A40L60 trägt. Aufnahme und Translation von Luc-RNA wurden durch In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung mit dem IVIS Lumina-Bildgebungssystem (Caliper Life Sciences) bewertet. Kurz gesagt, eine wässrige Lösung von D-Luciferin (150 mg/kg Körpergewicht) (BD Biosciences) wurde i.p. 6 Stunden nach Verabreichung der RNA-Lipoplexe injiziert. 5 Minuten danach wurden die emittierten Photonen quantifiziert (Integrationszeit von 1 Minute). Die In-vivo-Biolumineszenz in den interessierenden Regionen wurde als durchschnittliche Strahldichte (Photonen/sec/cm²/sr) unter Verwendung der Software IVIS Living Image 4.0 quantifiziert. Die Intensität des transmittierten Lichts, das von luciferaseexprimierenden Zellen im Tier stammt, wurde als Farbskala-Bild dargestellt, wobei Blau das am wenigsten intensive und Rot das intensivste Biolumineszenzsignal darstellt. Graustufen-Referenzbilder von Mäusen wurden unter LED-Beleuchtung mit wenig Licht aufgenommen. Die Bilder wurden mit der Software Living Image 4.0 überlagert. Das Luciferase-Signal wurde über 48 Stunden beobachtet. A) Dargestellt ist die Luciferase-Aktivität in der Milz der Mäuse. B) Quantifizierung des kumulativen Luciferasesignals, das über 48 Stunden beobachtet wurde.
6: Vergleich der immunologischen Reaktion von verschiedenen Poly(A)-Schwänzen C57BL/6-Mäuse (n=5) wurden in Duplikaten an den Tagen 0 und 3 intravenös mit RNA-Lipoplexen immunisiert, die 20 µg RNA enthielten, die für das SIINFEKL-Peptid kodierten und die verschiedenen Poly-A-Schwänze A120, A30L70 oder A40L60 trugen. Die Häufigkeit der antigenspezifischen CD8+ T-Zellen wurde im peripheren Blut mittels SIINFEKL-MHC-Tetramer-Färbung 5 Tage nach der letzten Immunisierung (Tag 8) bestimmt. Kurz gesagt, hypotonisch lysierte Blutproben wurden bei 4 °C mit Anti-CD8-Antikörpern (Invitrogen) und H-2 K^b/SIINFEKL-Tetramer (Beckman-Coulter) inkubiert und gewaschen, um ungebundene Antikörper vor der durchflusszytometrischen Analyse zu entfernen. Die durchflusszytometrischen Daten wurden mit einem analytischen FACS-Calibur-Durchflusszytometer erfasst und mit der Software FlowJo (Tree Star) ausgewertet. Das RNA-Profil wurde mit dem 2100 Bioanalyzer von RNA gewonnen, die für Luciferase kodiert und die Poly(A)-Schwänze A40L60, A30L70 bzw. A120 trägt. (A) Gating-Strategie für antigenspezifische CD8+ T-Zellen. (B) Häufigkeit der antigenspezifischen CD8+ T-Zellen in CD8+ T-Zellen.

Beispiele
Beispiel 1: Halbautomatische Untersuchung der Poly(dA:dT)-Stabilität
Es wurde ein halbautomatisches Verfahren entwickelt, um eine große Anzahl von E. coli-Klonen auf die Unversehrtheit der kritischen Poly(dA:dT)-Sequenzregion zu untersuchen, die auf dem Plasmid kodiert ist, das von einzelnen E. coli-Klonen getragen wird. Für das Screening eines spezifischen Poly(dA:dT)-Konstrukts wurden 96 E. coli-Klone beimpft und in einer 96-Well-Platte bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, und die Plasmide wurden auf einer vakuumbasierten Reinigungsplattform für 96-Well-Platten gereinigt. Die getesteten Plasmid-DNAs enthielten drei Sacl-Restriktionsstellen, die den Vektor zweimal in der 3-UTR (3'-untranslatierte Region) und einmal stromabwärts der Poly(dA:dT)-Sequenz schnitten. Die Sacl-Restriktion führte immer zu zwei spezifischen Banden von 142 bp und 270 bp Größe, die die Berechnung der Länge des Poly(dA:dT) ermöglichten. Die dritte Bande repräsentierte das Vektorrückgrat und das Antigen mit einer Größe, die vom eingefügten Antigen (GOI = Gene Of Interest) abhing. Eine beispielhafte Vektorkarte mit den Positionen der Restriktionsstellen und den Längen der Fragmente ist in dargestellt.
Zur Überwachung einer großen Anzahl von Klonen wurden Proben des SacI-Restriktionsverdaus auf ein halbautomatisches Kapillarelektrophoresesystem aufgetragen und Bandenmuster zwischen 25 bp und 500 bp in hoher Auflösung analysiert (1A zeigt ein Beispiel für eine Restriktionsanalyse von 8 Klonen). Die Banden des internen Größenstandards bei 25bp und 500bp sind mit schwarzen Sternchen (*) gekennzeichnet. Die Banden, die ein intaktes Poly(dA:dT) bei 142bp und 270bp darstellen, sind mit schwarzen Pfeilen (->) gekennzeichnet. Klon 1 und Klon 4 zeigen eine Subpopulation mit einer verkürzten Poly(dA:dT)-Region, die zu einer zusätzlichen Bande zwischen 142 bp und 270 bp führt (markiert mit roten Sternchen (*)). Die Instabilität der Poly(dA:dT)-Sequenz wird als das Verhältnis von Klonen mit verkürzter Poly(dA:dT)-Sequenz zu Klonen mit intakter Poly(dA:dT)-Sequenz angegeben.
Beispiel 2: Stabilitätsprüfung unterschiedlicher Poly(d.A:dT)-Konstrukte

Als Modellantigen wurde das SIINFEKL-Peptid gewählt, da in früheren Experimenten die Poly(dA:dT)-Instabilität dieses Antigens reproduzierbar zwischen 50-60 % bestimmt wurde und somit ein großes experimentelles Fenster für Stabilitätstests bietet. Es wurden 10 verschiedene Poly(dA:dT)-Konstrukte entworfen und direkt hinter das SIINFEKL-Peptid fusioniert. Ein 10-Nukleotid-Linker (L) wurde an verschiedenen Positionen der Poly(dA:dT)-Sequenz in den Poly(dA:dT)-Strang eingefügt. Die Linker-Sequenz (GCATATGACT) wurde so gewählt, dass sie einen ausgewogenen Beitrag aller 4 Nukleotide (2xG, 2xC, 3xT und 3xA) enthält. 4 Konstrukte wurden mit dem Linker in der Mitte des Poly(dA:dT) entworfen, beginnend mit 45 Adenosinresten (45 x A) auf jeder Seite (A45L45) mit einer schrittweisen Erhöhung von 5 x A auf beiden Seiten und endend mit 60 x A auf jeder Seite des Linkers (A50L50, A55L55 bzw. A60L60). Die 6 übrigen Konstrukte enthielten wie A50L50 insgesamt 100 x A. Allerdings wurde der Linker nach 20 x A eingefügt, gefolgt von der Linker-Sequenz und weiteren 80 x A (A20L80). Dementsprechend wurde der Linker nach 30 x A (A30L70) , 40 x A (A40L60) , 60 x A (A60L40), 70 x A (A70L30) bzw. 80 x A (A80L20) eingefügt. Von jedem der 10 Konstrukte wurden 96 Klone mit der beschriebenen Restriktionsanalysemethode auf Poly(dA:dT)-Integrität untersucht. Alle 10 Linker-haltigen Konstrukte zeigten einen positiven Effekt auf die Poly(dA:dT)-Stabilität im Vergleich zu A120 (siehe 2). Die ermittelten Stabilitätsdaten sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Das Konstrukt A45L45 zeigte eine mehr als 6-fach höhere Stabilität im Vergleich zur Kontrolle A120, jedoch führte die schrittweise Erhöhung der Gesamtlänge des Poly(dA:dT) zu einer höheren Instabilität, die sich in einer nur noch 1,66-fachen Stabilisierung von A60L60 widerspiegelte. Die Stabilisierung von Konstrukten mit 100 x A und der Linker-Sequenz an unterschiedlichen Positionen der Poly(dA:dT)-Sequenz reichte vom 2,9-fachen für A20L80 bis zum 13-fachen für A40L60. Überraschenderweise zeigten A30L70 und A40L60 eine besonders hohe Stabilisierung der Poly(dA:dT)-Region. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass das Einfügen einer zufälligen 10-Nukleotidsequenz eine stabilisierende Wirkung auf die Poly(dA:dT)-Integrität hat. Insbesondere die Region zwischen Position 30 und Position 50 der Poly(dA:dT)-Region ist besonders empfindlich gegenüber Poly(dA:dT)-Verkürzungen. Die Einführung von Linker-Sequenzen in diesem Sequenzbereich führte zu einer weiteren Erhöhung der Poly(dA:dT)-Stabilität um mindestens das 2-Fache im Vergleich zu den anderen Konstrukten (siehe Tabelle 1 und 2). Tabelle 1: Zusammenfassung der Poly(dA:dT)-Stabilitätstests. Dargestellt ist der Prozentsatz der Klone mit verkürzter Poly(dA:dT)-Sequenz und die daraus resultierende Stabilisierung der Poly(dA:dT)-Sequenz im Vergleich zu PolyA120.

Poly(dA:dT)-Konstrukt	Spaltung [% der getesteten Klone]	Stabilisierung [-faches von A120]
A120	55,9	1

A45L45	8,8	6,4
A50L50	10,7	5,2
A55L55	21,1	2,7
A60L60	33,7	1,7

A60L40	8,9	6,3
A70L30	13,8	4,0
A80L20	13,6	4,1

A40L60	4,3	13,0
A30L70	4,4	12,7
A20L80	19,3	2,9

Beispiel 3: Stabilität von Poly(dA:dT)-Konstrukten in unterschiedlichen E. coli-Stämmen
In weiteren Experimenten wurde die Spezifität und Funktionalität der überlegenen Stabilität der Konstrukte A30L70 und A40L60 getestet. Die Möglichkeit, dass die beobachteten Ergebnisse der Stabilitätstests auf den getesteten E. coli-Stamm TOP10 beschränkt sind, wurde durch Einbeziehung von zwei anderen E. coli-Stämmen in die Tests bewertet. Die Tests für A30L70 und A40L60 wurden jeweils mit DH5α, XL1-blue und TOP10 als Kontrolle wiederholt. Diese Stämme wurden ausgewählt, weil sie i) eine hohe genetische Vielfalt aufweisen (siehe Tabelle 2) und ii) E. coli-Stämme repräsentieren, die in molekularbiologischen Labors weit verbreitet sind.

Die Instabilität von A120 wurde für DH5α mit 42 % und für XL1-blue mit 61,8 % gemessen und wurde daher als vergleichbar mit der für den E. coli-Stamm TOP10 festgestellten Instabilität angesehen (siehe 3). Sowohl A30L70 als auch A40L60 zeigten eine Instabilität zwischen 3 und 4 %, nur bei A40L60 in TOP10 war die Instabilität mit 6,8 % leicht erhöht. Die Prüfung von 3 verschiedenen E. coli-Laborstämmen bestätigte die Ergebnisse zur Poly(dA:dT)-Stabilisierung. Als allgemeines Prinzip für die genetische Stabilisierung von Poly(dA:dT)-Sequenzen in verschiedenen E. coli-Stämmen wurde die Einführung einer 10-Nukleotid-Linkersequenz in der spaltbaren Region an Position 30-50 identifiziert. Tabelle 2: Genotypen der getesteten E. coll-Stämme

Stamm	Genotyp
TOP10	F-, mcrA, Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC), φ80lacZΔM15, ΔlacX74, nupG, recA1, araD139, Δ(ara-leu)7697, galK galU rpSL(Str^R), endAl, λ^-
DH5α	F^-, endA1, glnV44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96, deoR, nupG, φ80, lacZΔMl5, Δ(lacZYA-argF)Ul69, hsdR17 (r_K ^- m_K ⁺) , X-
XLl-blue	endAl, gyrA96 (nal^R), thi-1, recA1, relA1, lac, glnV44, F' [: : Tn10, proAB⁺, lacI^q, Δ(lacZ)Ml5], hsdR17 (r_K ^- m_K ⁺)

Beispiel 4: Funktionelle In-vitro-Charakterisierung von unterschiedlichen Poly(A)-Schwänzen
Um die Auswirkungen der identifizierten stabilisierten Poly(A)-Schwänze A30L70 und A40L60 auf die Funktionalität der RNA-Moleküle zu klären, wurden Experimente auf der Basis von Luciferase-Reportern durchgeführt. Die Konstrukte A30L70, A40L60 und A120 wurden an ein Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen fusioniert, und die jeweilige Messenger-RNA wurde durch In-vitro-Transkription erzeugt. Die RNA-Moleküle wiesen eine vergleichbare Integrität auf und wurden für die Elektroporation in Zellen verwendet (siehe Tabelle 3). Die RNAs wurden in menschliche unreife dendritische Zellen elektroporiert, die aus menschlichem Blut isoliert wurden und die Zielzellen für den mRNA-Tumorimpfstoffansatz des Unternehmens darstellen. Die Luciferase-Translation wurde über einen Zeitraum von 72 Stunden überwacht. Die 3 verschiedenen mRNA-Moleküle wurden mit nur geringen Unterschieden gleichmäßig exprimiert (4A). Um zu beweisen, dass die Funktionalität von mRNAs im Allgemeinen nicht von der Art der Poly (A) -Schwänze beeinflusst wird, wurde das Experiment in einer menschlichen Fibroblasten-Zelllinie (CCD-Zellen) und einer murinen Myoblasten-Zelllinie (C2Cl2) wiederholt (4B+C). Obwohl ein zelltypspezifisches Muster der mRNA-Translation im Laufe der Zeit beobachtet wurde, zeigten weder die menschlichen noch die murinen Zelllinien Unterschiede in der Proteinexpression durch mRNAs mit unterschiedlichen Poly(A)-Schwänzen. Tabelle 3: Integrität von Luciferase-kodierenden IVT-RNAs

RNA Integrität [%]

hAg-Kozak-Luciferase-2hBgUTR-A40L60 79

hAg-Kozak-Luciferase-2hBgUTR-A30L70 81

hAg-Kozak-Luciferase-2hBgUTR-A120 83
Diese Ergebnisse zeigen, dass die gewählten Poly(A)-Schwänze nur einen geringen Einfluss auf die gesamte mRNA-Funktionalität in vitro haben. Daher ermöglichen Linker-Sequenz-Insertionen in die Poly(dA:dT)-Region an Position 30 bzw. Position 40 eine wesentliche genetische Stabilisierung, indem sie die volle Funktionalität der jeweiligen RNA-Moleküle aufrechterhalten.
Beispiel 5: Funktionelle In-vivo-Charakterisierung von unterschiedlichen Poly(A)-Schwänzen
Für die systemische In-vivo-Anwendung von mRNA zur Impfung werden RNA-Lipoplexe durch Formulierung der RNA zusammen mit Lipiden hergestellt und intravenös verabreicht. Die RNA-Lipoplexe sollen in die Milz gelangen und von unreifen dendritischen Zellen aufgenommen werden, die die entsprechende mRNA übersetzen. Ziel war es, die beiden stabilisierten Poly(A)-Schwänze, d. h. A30L70 und A40L60, in einem Mausexperiment zu testen, um eine funktionelle Proteinexpression in vivo sicherzustellen. RNA mit A120 diente als Expressionskontrolle. Drei Gruppen von BALB/c-Mäusen mit je 5 Tieren wurden intravenös RNA-Lipoplexe injiziert, die für Glühwürmchen-Luciferase kodierende RNAs enthielten, die für die funktionellen In-vitro-Tests (Tabelle 3) mit den verschiedenen Poly(A)-Schwänzen (A30L70, A40L60 und A120) verwendet worden waren. Die Expression von Glühwürmchen-Luciferase wurde über 48 Stunden mit einem In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebungssystem überwacht (5A). Die Quantifizierung der kumulativen Luciferasesignale ist in 5B dargestellt. Weder der Ort noch die Intensität des Luciferasesignals unterschieden sich signifikant zwischen den RNAs mit unterschiedlichen Poly(A)-Schwänzen, was beweist, dass beide stabilisierten Poly(A)-Schwänze für systemische In-vivo-Anwendungen geeignet sind.
Beispiel 6: Immunologische Antwort auf verschiedene Poly(A)-Schwänze
In einer letzten Versuchsreihe wurde geprüft, ob die stabilisierten Poly(A)-Schwänze, A30L70 und A40L60, einen Einfluss auf die durch den mRNA-Impfstoff ausgelöste spezifische Immunantwort haben. Die stabilisierten Poly(A)-Schwänze und die Kontrolle A120 wurden daher wie bei den Stabilitätstests zuvor an das SIINFEKL-Peptid fusioniert. Die 3 RNAs mit den Poly(A)-Schwänzen A30L70, A40L60 und A120 wurden durch In-vitro-Transkription erzeugt und zeigten eine vergleichbare Qualität und Integrität (Tabelle 4). 3 Gruppen von C57/BL6-Mäusen, jeweils zweimal 5 Tiere, wurden an Tag 0 und Tag 3 intravenös mit RNA-Lipoplexen injiziert, die die verschiedenen SIINFEKL-RNAs enthielten. Die RNA-induzierte Immunantwort wurde durch Bestimmung der Häufigkeit antigenspezifischer CD8+ T-Zellen 5 Tage nach der letzten Immunisierung (Tag 8) mittels SIINFEKL-MHC-Tetramer-Färbung analysiert. Die entsprechende Gating-Strategie bei der FACS-Analyse ist in 6A dargestellt. Der Vergleich der antigenspezifischen CD8+ T-Zellfrequenzen zeigte, dass die RNAs mit allen getesteten Poly(A)-Schwänzen eine Immunantwort auslösten. Dabei wurden weder innerhalb der gleichen Gruppe (2 x 5 Tiere für jede RNA) noch zwischen den drei Gruppen, die die verschiedenen IVT-RNAs erhielten, signifikante Unterschiede festgestellt, was zeigt, dass die stabilisierten Poly(A)-Schwänze die durch die mRNA induzierte spezifische Immunantwort nicht beeinflussten (6B). Tabelle 4: Integrität von SIINFEKL kodierenden IVT-RNAs

IVT-RNA Integrität [%]

hAg-Kozak-sec-SIINFEKL-MITD-2hBgUTR-A40L60 82

hAg-Kozak-sec-SIINFEKL-MITD-2hBgUTR-A30L70 81

hAg-Kozak-sec-SIINFEKL-MITD-2hBgUTR-A120 83
Durch die Etablierung einer restriktionsbasierten Analysemethode können wir hier zeigen, dass die Poly(dA:dT)-Region, die für den Poly(A)-Schwanz einer mRNA kodiert, in gängigen E. coli-Stämmen genetisch instabil ist. Diese Instabilität führt zu arbeitsintensiven Screening-Maßnahmen, um Klone mit einer stabilen Poly(dA:dT)-Sequenz zu erhalten. Wir haben gezeigt, dass die Einfügung einer 10-Nukleotid-Linkersequenz diesen Sequenzabschnitt stabilisiert. Dabei wurde die Position 30 bis 50 als besonders empfindlich gegenüber Poly(dA:dT)-Verkürzungen identifiziert. Linker-Insertionen in dieser speziellen Region erhöhten die Stabilität um mindestens den Faktor 2 im Vergleich zu Insertionen an anderen Positionen. Die Stabilitätstests wurden in mehreren häufig verwendeten E. coli-Stämmen bestätigt. Die Sequenzeinfügungen veränderten die Funktionalität der jeweiligen in vitro transkribierten RNAs nicht, wie in mehreren Zelllinien und durch Vergleich der In-vivo-Aktivität in Mäusen nachgewiesen wurde. Zuletzt wurde die RNA-induzierte Immunantwort durch die Veränderung des Poly(A)-Schwanzes nicht beeinflusst. Insgesamt haben wir ein Werkzeug zur genetischen Stabilisierung der Poly(dA:dT)-Region identifiziert, das die Handhabung mit der entsprechenden Plasmid-DNA erleichtert und dadurch weder die In-vitro- und In-vivo-Funktionalität der RNA noch die Induktion einer RNA-spezifischen Immunantwort beeinflusst .
Die Erfindung stellt insbesondere das folgende bereit:

1. Nukleinsäuremolekül, umfassend in der 5' →3' -Transkriptionsrichtung:
1. (a) einen Promotor;
2. (b) eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz oder eine Nukleinsäuresequenz zum Einführen einer transkribierbaren Nukleinsäuresequenz; und
3. (c) eine Nukleinsäuresequenz, die, wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript kodiert, wobei die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript eine Polyadenylsequenz ist, die innerhalb der Polyadenylsequenz eine Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden umfasst, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält.
2. Nukleinsäuremolekül nach Gegenstand 1, wobei die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, eine Sequenz, vorzugsweise eine beliebige Sequenz, von 2 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden ist, wobei das erste und das letzte Nukleotid der Sequenz von 2 oder mehr aufeinanderfolgenden Nukleotiden ein anderes Nukleotid als ein A-Nukleotid ist.
3. Nukleinsäuremolekül nach Gegenstand 1 oder 2, wobei die Nukleinsäuresequenz (c) bei einer Vermehrung des Nukleinsäuremoleküls in Escherichia coli eine höhere Stabilität aufweist als ein Nukleinsäuremolekül, das anstelle der Nukleinsäuresequenz (c) eine Nukleinsäuresequenz (c)' umfasst, die, wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Polyadenylsequenz der gleichen Länge wie die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript kodiert.
4. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 3, wobei die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden mindestens 90 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 100 Nukleotide umfasst.
5. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 4, wobei sich die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, innerhalb einer Region von Position 21 bis Position 80, vorzugsweise von Position 21 bis Position 60, noch bevorzugter von Position 31 bis Position 50 der Polyadenylsequenz befindet.
6. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 5, wobei der Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, mindestens 20 A-Reste in der Polyadenylsequenz vorausgehen und/oder mindestens 20 A-Reste in der Polyadenylsequenz folgen.
7. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 6, wobei die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, eine Länge von mindestens 3, mindestens 4, mindestens 5, mindestens 6, mindestens 8, vorzugsweise mindestens 10, noch bevorzugter mindestens 15 Nukleotiden aufweist.
8. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 7, wobei die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, eine Länge von nicht mehr als 50, vorzugsweise nicht mehr als 30, noch bevorzugter nicht mehr als 20 Nukleotiden aufweist.
9. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 8, wobei die Sequenz von einem oder mehreren aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die andere Nukleotide als A-Nukleotide enthält, nicht mehr als 3, vorzugsweise nicht mehr als 2, vorzugsweise keine aufeinanderfolgenden A-Reste umfasst.
10. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 9, wobei die Nukleinsäuresequenzen (b) und (c) unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert werden können, um ein gemeinsames Transkript zu ergeben.
11. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 10, wobei sich die Nukleotidsequenz von mindestens 80 aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript an dem 3'-Ende befindet.
12. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 11, welches ein geschlossenes ringförmiges Molekül oder ein lineares Molekül ist.
13. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 12, wobei die transkribierbare Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Peptid oder ein Protein kodiert, und die Nukleinsäuresequenz zum Einführen einer transkribierbaren Nukleinsäuresequenz eine multiple Klonierungsstelle ist.
14. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 13, ferner umfassend ein oder mehrere Elemente, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus: (i) einem Reportergen; (ii) einem selektierbaren Marker; und (iii) einem Replikationsursprung.
15. Nukleinsäuremolekül nach einem der Gegenstände 1 bis 14, welches, insbesondere nach einer Linearisierung, für eine In-vitro-Transkription von RNA, insbesondere mRNA, geeignet ist.
16. RNA, die durch Transkription, vorzugsweise In-vitro-Transkription, unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Gegenstände 1 bis 15 als Matrize erhältlich ist.
17. Verfahren zum Vermehren eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend:
1. (i) Bereitstellen eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Gegenstände 1 bis 15, und
2. (ii) Vermehren des Nukleinsäuremoleküls in Escherichia coli.
18. Verfahren nach Gegenstand 17, wobei das Vermehren des Nukleinsäuremoleküls in Escherichia coli ein Transformieren von Escherichia coli mit dem Nukleinsäuremolekül und ein Kultivieren der transformierten Escherichia coli umfasst.
19. Verfahren nach Gegenstand 17 oder 18, das ferner ein Isolieren des Nukleinsäuremoleküls von Escherichia coli nach der Vermehrung umfasst.
20. Verfahren zum Erhalten von RNA, umfassend:
1. (i) Vermehren eines Nukleinsäuremoleküls gemäß dem Verfahren nach einem der Gegenstände 17 bis 19, und
2. (ii) In-vitro-Transkribieren von RNA unter Verwendung des Nukleinsäuremoleküls als Matrize.
21. Verfahren zum Erhalten eines Peptids oder Proteins, umfassend:
1. (i) Erhalten von mRNA, die für das Peptid oder Protein kodiert, gemäß dem Verfahren nach Gegenstand 20, und
2. (ii) Translation der mRNA.
22. Verfahren nach Gegenstand 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass es ferner, vor der Transkription des Nukleinsäuremoleküls, eine Spaltung des Nukleinsäuremoleküls umfasst.
23. Verwendung der RNA nach Gegenstand 16 zum Transfizieren einer Wirtszelle.
24. Verwendung nach Gegenstand 23, wobei die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle ist, insbesondere eine dendritische Zelle, ein Monozyt oder ein Makrophage.
25. Verwendung der RNA nach Gegenstand 16 zur Impfung.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989 [0061]
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. (Hrsg.), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 1989 [0074]
Smith und Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482 [0076]
Neddleman und Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443 [0076]
Pearson und Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 [0076]

Claims

MRNA, die eine 5'-UTR, eine Protein-kodierende Region und eine 3'-UTR umfasst und die durch in-vitro-Transkription unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls als Matrize erhältlich ist, wobei das Nukleinsäuremolekül in der 5'-3'-Transkriptionsrichtung umfasst: (a) einen Promotor; (b) eine transkribierbare Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein virales Antigen kodiert; und (c) eine Nukleinsäuresequenz, die, wenn sie unter der Kontrolle des Promotors (a) transkribiert wird, für eine Nukleotidsequenz von aufeinanderfolgenden Nukleotiden in dem Transkript kodiert, in der eine Polyadenylsequenz mit 30 oder 40 Adenosin-Nukleotiden von einer Linker-Sequenz, die eine konsekutive Sequenz von Nukleotiden ist und andere Nukleotide als Adenosin-Nukleotide enthält, und einer weiteren Polyadenylsequenz mit 70 bzw. 60 Adenosinen gefolgt wird (A30L70 bzw. A40L60); zur Verwendung als Vakzine; wobei die mRNA als Lipoplex oder mit DEAE assoziiert intramuskulär verabreicht wird.
MRNA nach Anspruch 1, welche die Struktur hAg-Kozak-sec-SIINFEKL-MITD-2hBgUTR-A40L60 oder hAg-Kozak-sec-SIINFEKL-MITD-2hBgUTR-A30L70 aufweist.
MRNA nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Linker die Sequenz GCATATGACT hat.
MRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäuresequenz, die für ein virales Antigen kodiert, für das Peptid SIINFEKL kodiert.
MRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Nukleinsäuremolekül zwischen der Nukleinsäuresequenz (b) und der Nukleinsäuresequenz (c) zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen umfasst, wobei jede der zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen der 3'-untranslatierten Region eines Gens entspricht oder davon abgeleitet ist, wobei das Gen aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Globin-Genen wie alpha2-Globin, alphal-Globin, beta-Globin und Wachstumshormon, vorzugsweise menschliches beta-Globin.
MRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die mRNA ein 5'-Cap aufweist.
MRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die mRNA eine Kozak-Sequenz umfasst.
MRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die mRNA Nukleotidanaloga enthält.
Zelle, die die mRNA nach einem der Ansprüche 1 bis 8 enthält.
Zelle nach Anspruch 9, wobei die Zelle eine humane Zelle ist.
Pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend die mRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und gegebenenfalls ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.
Kit, umfassend die mRNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 und gegebenenfalls ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.
Zelle nach Anspruch 9 oder 10, oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 11 zur Verwendung als Vakzine.