CN117701602A - 在宿主细胞中稳定存在的多段化PolyA多核苷酸及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在宿主细胞中稳定存在的多段化PolyA多核苷酸及其应用。本发明首先提供一种多段化PolyA多核苷酸，其包括两段以上的PolyA序列片段，相邻PolyA序列片段之间通过linker连接，其中，每一PolyA序列片段由多个连续的A组成，每一linker由1‑24nt且不全部为A的核苷酸残基组成。本发明的多段化PolyA多核苷酸可以在宿主细胞例如大肠杆菌传代过程中稳定存在，可以更好地应用到mRNA疫苗或药物生产中转录模板制备所涉及的质粒发酵中。

Description

在宿主细胞中稳定存在的多段化PolyA多核苷酸及其应用
技术领域
本发明是关于一种含有PolyA的多核苷酸及其应用，尤其涉及一种可以在宿主细胞如大肠杆菌中稳定存在的具有多段化PolyA序列的多核苷酸及其应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
在应对新型冠状病毒传播感染的各种方案中，疫苗是一种非常有效的大面积防范新冠病毒进一步扩张的措施，特别是mRNA疫苗，由于其研发、生产周期短的优势迅速崛起并且在未来医药领域的发展中有着巨大的潜力。目前mRNA的生产主要是通过体外转录实现的，体外转录所得到的mRNA需要经过加帽和加尾才能在体内发挥生理功能。
目前mRNA加尾的方式主要有两种：酶法和模板法。酶法是将体外转录产物利用PolyA聚合酶进行加尾反应，是天然细胞存在的加尾机制，但是在研究或生产过程中有一定局限性。额外的加尾反应使生产工艺变得更为复杂，且加尾的数量只能控制在一个范围而无法精准，此外所生产的mRNA尾长存在差异也是一个局限因素。模板法则是将一定数量的PolyA序列构建到转录模板上，这样可以在转录的过程加尾，实现了工艺简化的同时又规避了无法确定PolyA具体数量的问题。
现有技术将一定数量PolyA尾加到转录模板上，针对不同的量级有两种常见的方法：PCR法和质粒法。PCR法是指将PolyA利用引物通过PCR加到转录模板上，最终的转录模板是PCR产物，这种方法由于受到PCR体系的限制，适合小体量生产mRNA。质粒法是将设计好的PolyA序列直接构建到质粒上，质粒上包含T7启动子、5'UTR、目的基因序列、3'UTR和构建的PolyA序列，通过质粒在宿主细胞例如大肠杆菌中快速复制可以短时间生产大量的转录模板，使得mRNA的生产达到工业化量级。但是PolyA序列构建到质粒上之后，质粒在宿主细胞中复制时容易发生重组，使PolyA序列发生变化，从而使生产出来的mRNA所带有的PolyA尾序列不可控，这直接影响着mRNA药物或疫苗的药效。
为提高宿主细胞中PolyA序列的稳定性，目前主要是利用可减少重组的菌株来培养质粒或者对PolyA序列进行修饰，从而使PolyA序列在复制过程中稳定。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可在宿主细胞中稳定复制的具有PolyA序列的多核苷酸。
本发明主要是将不同的一定长度的非PolyA序列(linker)插入到PolyA序列的不同位置处，使得PolyA序列形成多段化，而得到一种具有多段化PolyA序列的多核苷酸(本发明中简称多段化PolyA多核苷酸)。本发明将带有多段化PolyA多核苷酸的质粒转入宿主细胞如大肠杆菌后放大发酵，依然可以维持在高稳定水平即在宿主细胞传代过程中不发生重组，可以提高PolyA序列在宿主细胞如大肠杆菌中的稳定性，不同有效长度的稳定多段化PolyA多核苷酸则可以满足不同目的基因的不同表达需求。本发明提供的多段化PolyA多核苷酸可以显著降低质粒构建难度，同时可以更好地应用到mRNA疫苗或药物生产中转录模板制备所涉及的质粒发酵中。稳定的多段化PolyA多核苷酸可以极大提高质粒发酵过程中PolyA序列的丢失，从而保证mRNA疫苗或药物的药效。
具体而言，一方面，本发明提供了一种多段化PolyA多核苷酸，其包括两段以上的PolyA序列片段，相邻PolyA序列片段之间通过linker连接，其中，每一PolyA序列片段由多个连续的A组成，每一linker由1-24nt且不全部为A的核苷酸残基组成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸，其包括两段、三段、四段或五段PolyA序列片段。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸，其选自具有以下结构的多核苷酸中的一种或多种：
PolyA序列片段1-linker1-PolyA序列片段2；
PolyA序列片段1-linker1-PolyA序列片段2-linker2-PolyA序列片段3；
PolyA序列片段1-linker1-PolyA序列片段2-linker2-PolyA序列片段3-linker3-PolyA序列片段4。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，各PolyA序列片段各自独立地由10-100个连续的A组成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，各PolyA序列片段各自独立地由30-100个，例如30、40、50、60、70、80、90或100个连续的A组成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，PolyA序列片段1由30-60个连续的A组成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，所有PolyA序列片段的总A个数为30-300，优选为60-240，更优选为100-200。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，各linker各自独立地由1-18nt优选为1-12nt且不全部为A的核苷酸残基组成。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，各linker各自独立地由G组成，或是G含量为linker序列中总碱基的20％-33％。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，各linker各自独立地选自以下序列所示核苷酸：
G；
C；
GGGGGG；
ATGCAT；
GCATATGACT(SEQ ID No.53)；
CAGTAATGAC(SEQ ID No.54)；
AGTCATATGC(SEQ ID No.55)；
GTCATTACTG(SEQ ID No.56)；
TGTCAGATAC(SEQ ID No.57)；
GCTCATATGC(SEQ ID No.58)；
GCATATATGC(SEQ ID No.59)；
CGCCATTAGAGG(SEQ ID No.60)；
ATGCATGATATC(SEQ ID No.61)；
TGCAACATCGAT(SEQ ID No.62)；
CCTCTAATGGCG(SEQ ID No.63)；
CAACCCCTGATTGTGTCCGCATCT(SEQ ID No.64)。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，所有linker的长度之和为1-48nt，更优选为2-24nt。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸中，所有linker的长度之和占多核苷酸总长度的20％以下，优选15％以下，进一步优选10％以下，更进一步优选5％以下。
根据本发明的具体实施方案，本发明的多段化PolyA多核苷酸，其包括序列为SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ IDNO.25、SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ IDNO.31、SEQ ID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ IDNO.37、SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ IDNO.49、SEQ ID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的序列中的任意一种的多核苷酸中的一种或多种。
另一方面，本发明还提供了一种载体，其包含本发明所述的多段化PolyA多核苷酸。可以采用本领域中任何可行的方法将本发明所述的多段化PolyA多核苷酸插入到质粒载体上，从而构建得到本发明的插入有所述多段化PolyA多核苷酸的载体。具体构建时，可根据需要在所述多段化PolyA多核苷酸末端增加酶切位点。
另一方面，本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本发明所述的多段化PolyA多核苷酸或本发明所述的载体(插入有所述多段化PolyA多核苷酸的载体)。
另一方面，本发明还提供了所述的多段化PolyA多核苷酸、所述的载体、所述的宿主细胞在体外转录生产目标mRNA中的应用。所述目标mRNA带有由本发明所述的多段化PolyA多核苷酸转录而形成的聚A尾。
从而，本发明还提供一种mRNA，其包含由本发明所述的多段化PolyA多核苷酸体外转录而形成的聚A尾。所述的聚A尾即对应本发明所述的多段化PolyA多核苷酸的mRNA序列。
根据本发明的具体实施方案，所述目标mRNA是用于生产mRNA疫苗或药物。本发明提供的多段化PolyA多核苷酸可以更好地应用到mRNA疫苗或药物生产中转录模板制备所涉及的质粒发酵中。稳定的多段化PolyA多核苷酸可以极大提高质粒发酵过程中PolyA序列的丢失，从而保证mRNA疫苗或药物的药效。
另一方面，本发明还提供了一种多段化PolyA多核苷酸在宿主细胞中的稳定性鉴定方法，该方法包括：
1)将本发明所述的多段化PolyA多核苷酸克隆至通用质粒载体，得到插入多段化PolyA多核苷酸的质粒载体；
2)将插入多段化PolyA多核苷酸的质粒载体转入宿主细胞例如大肠杆菌中获得重组细胞，将重组细胞铺在固体平板上获得单菌落，挑取单菌落进行PCR初步鉴定，筛选未发生重组的稳定性菌落；其中，优选地，PCR产物利用2％-3％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；
3)将初步鉴定筛选到的未发生重组的稳定性菌进行放大发酵培养，培养液进行梯度稀释后涂布在固体平板上，进行菌落PCR以鉴定传代稳定性。
在本发明的一些具体实施方案中，本发明的多段化PolyA多核苷酸在宿主细胞中的稳定性鉴定方法包括：
1)通过基因合成制备带有上述序列的基因片段，构建到pUC-GW-kana通用质粒上且合成相应的通用引物；
2)利用质粒作为模板进行梯度退火PCR鉴定最适退火温度；
3)将所述质粒通过大肠杆菌常规转化转入大肠杆菌中(包括但不限于DH5α、stbl2、stbl3、stable)，转化后分别涂布在不同的kana抗性(50μg/ml终浓度，此后所述kana抗性均为此浓度，不再赘述)的LB平板上，30-37℃培养12-20h；
4)挑取每个平板上的单菌落于20μl kana抗性的液体培养基中，充分混匀制备成菌落悬液；
5)配制鉴定包括所述序列稳定性的菌落PCR反应体系，所述菌落PCR体系以20μl计，包括以下组分：RNA-free水7μl；引物1、引物2各0.5μl；Enzyme Mix 10μl；菌落溶液2μl；
6)鉴定步骤5)中所得的PCR产物，通过2-3％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。通过分析电泳结果来判断对应PolyA序列在大肠杆菌中的稳定性；
7)当重组率低于15％时，选取未发生重组的菌液吸取5μl悬浮菌液转接到100mlkana抗性的培养基中置于30℃、220rpm的摇床中放大培养12-16h后稀释104涂布到kana抗性的固体平板上，平板倒置培养在30℃培养箱中20h，重复步骤4)-步骤6)的操作进一步验证PolyA序列在放大过程中的稳定性；
8)将进一步验证时得到的平板单克隆转接到3ml Kana抗性培养基中30-37℃摇床中培养12-20h后进行质粒小提，将小提质粒委派权威生物公司进行测序，通过测序结果进行序列比对分析，可以进一步作为序列稳定性的另一方面的证据。
本发明的具体实验表明，本发明提供的多段化PolyA多核苷酸可以显著降低在大肠杆菌传代过程中由于同源重组而使PolyA序列改变或丢失的现象，从而可极大提高所生产mRNA的质量。不同有效长度的PolyA序列可以应对不同目的基因表达需求，在大肠杆菌中稳定传代也为质粒放大生产发酵提供了可能，给生产工艺的简化和产量的提高都带来了极大便利。本发明提供的多段化PolyA多核苷酸可以更好地应用到mRNA疫苗或药物生产中转录模板制备所涉及的质粒发酵中。
附图说明
图1为本发明的多段化PolyA多核苷酸的设计结构示意图。
图2为pUC-GW-kana的质粒图谱。
图3显示以带有序列SEQ ID No.1所示序列的通用质粒pUC-GW-kana为模板探究引物cgacggccagtgaattgac(SEQ ID No.65)和cagctatgaccatgctcgag(SEQ ID No.66)最适退火温度的结果。
图4显示本发明的部分多段化PolyA多核苷酸在大肠杆菌stbl3中的稳定性比较结果。
图5显示本发明的部分多段化PolyA多核苷酸在大肠杆菌stbl2中的稳定性比较结果。
图6显示本发明的部分多段化PolyA多核苷酸在大肠杆菌stbl2中发酵放大后的菌株进行质粒小提后的测序比对结果。
图7显示基于图4和图5中所述的数据，将序列特征拆解为linker数量、位置、长度以及G、C、T的含量分别与多段化PolyA多核苷酸稳定性之间的相关性分析结果。
图8显示将本发明的部分多段化PolyA多核苷酸通过质粒法或PCR法添加到编码表达GFP的DNA模板上，进行IVT得到相应mRNA后转染细胞293T/17的荧光显微镜镜检结果。
图9显示将图8中所述细胞样品处理后通过流式细胞仪检测结果(图中表内为具体检测数据)。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。下文各实验中所用各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
除非另外专门定义，本文使用的所有技术和科学术语都与相关领域普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
本发明提供了一种多段化PolyA多核苷酸，其结构设计参见图1所示。具体而言，本发明提供了如表1中SEQ ID No.1-SEQ ID No.52所示的多段化PolyA多核苷酸。
表1
在本发明中，所述多段化PolyA多核苷酸需要构建到通用载体上，之后进行转化和鉴定。本发明对于通用载体没有特殊限定，优选使用kana抗性的通用质粒pUC-WG-kana。在本发明中，所述的pUC-GW-kana质粒图谱如图2所示。多段化PolyA多核苷酸需要构建到通用载体上的EcoRVⅠ插入位点处。合成质粒储存和运输一般为干粉状态，使用时优选用超纯水进行溶解。水溶后质粒的浓度优选为10ng/μl，更优选为1ng/μl。本发明对所述超纯水没有特殊限定，采用常规实验室超纯水即可。
本发明在获得所述合成质粒后，将所述合成质粒转入不同宿主细胞获得重组细胞，针对不同的重组细胞，分别进行菌落PCR检定合成质粒相应序列的稳定性。在本发明中，所述不同宿主细胞优选为大肠杆菌感受态细胞(包括但不限于DH5α、stbl2、stbl3、stable)；本发明对所述转入的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转入方法即可。本发明在获得重组细胞后，优选地进行阳性重组细胞的稳定序列鉴定。在本发明中，所述阳性重组细胞的筛选优选地在kana抗性的固体培养基上进行。在本发明中，挑选所述kana抗性的固体培养基上的单菌落于一定体积的培养基中充分溶解，得到单菌落的稀释液。本发明对所述的溶解单菌落的方法没有特殊限定，采用本领域常规的挑菌转接操作即可。得到菌落稀释液后吸取少量菌液进行菌落PCR，当与目的条带相符的条带数量超过75％，则选取扩增条带与目的条带相符的菌液接种到100ml kana抗性的液体培养基中进一步传代培养。在本发明中，所述菌落PCR的引物F序列：cgacggccagt gaattgac(SEQ ID No.65)；所述菌落PCR的引物R的序列：cagctatgaccatgctcgag(SEQ ID No.66)。在本发明中，所述菌落PCR的扩增程序优选如下：预变性98℃10min；变性98℃300s，退火66.5℃15s，延伸72℃30s，30个循环；最后延伸72℃，5min。在本发明中，所述菌落PCR的体系优选如下：HotStart PCRGenotyping Master Mix(With Dye)10μl；引物F 0.5μl；引物R 0.5μl；菌液2μl；水7μl。
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度优选为10μmol/L。在本发明中，所述HotStart PCR Genotyping Master Mix(With Dye)包含以下组分：DNAPolymerase、dNTPs、Mg2+和核酸染料。本发明在所述PCR扩增结束后，优选地通过琼脂糖凝胶电泳鉴定并分析与目的条带大小相符的单菌落。本发明对所述的琼脂糖凝胶电泳没有特殊限定，采用本领域常规的凝胶配制和电泳方法即可。优选用3％的琼脂糖凝胶，130V跑30min。当与目的条带大小相符的条带比例超过50％时，选取任意与目的条带大小相符的菌株转接到100ml kana抗性的液体培养基中进行菌株培养。本发明对于所述的kana抗性液体培养基没有特殊限定，采用本领域常规的kana抗性液体培养基即可。本发明对所述的菌株转接培养方法没有特殊限定，采用本领域常规的菌株转接培养方法即可。优选用30℃、220rpm的摇床环境进行培养，优选培养16h。培养结束后取5μl菌液进行梯度稀释，分别稀释到104、105、106倍后涂布到kana抗性的固体培养基上，30℃培养箱中进行过夜培养。本发明对所述的菌液稀释没有特殊限定，采用本领域常规的菌液梯度稀释方法即可。过夜培养后选取单菌落数量在100-300个之间的平板进行下一步的菌落PCR鉴定。鉴定方法步骤同上所述，分别为挑菌、稀释菌液、配制PCR体系、按照特定程序进行反应、琼脂糖凝胶电泳鉴定。所用引物、程序、电泳方法皆同上。除此之外，将合适的平板上挑取单克隆培养到3ml Kana抗性的培养基中进行质粒小提测序，测序结果比对也可以作为另一种稳定性分析证据。根据鉴定结果，可以计算稳定序列质粒在大肠杆菌中放大培养过程中的重组率。重组率计算公式为：重组率＝1-与目的条带大小相符条带数量/总样本量。
本发明中通过上述的检测实验获取所有的结果之后，优选出部分重组率极低也即极为稳定的多段化polyA序列重组到可以表达eGFP的载体上，或者通过合成带有相应稳定多段化polyA序列的引物，利用PCR将polyA序列添加到编码eGFP的序列上，通过体外转录的方法制备相应的mRNA，转染到细胞293T/17中进行细胞水平的翻译验证。通过倒置荧光显微镜镜检定性分析以及流式细胞仪对荧光强度进行定量，从而分析出不同polyA序列对翻译能力的影响。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
多段化PolyA多核苷酸的设计与合成：
1)合成基因SEQ ID No.1-SEQ ID No.52的目的DNA片段，上述序列组成设计示意图如图1所示，并构建到通用载体pUC-GW-kana上的EcoRV I位点处，通用载体图谱见图2；
2)菌落PCR通用引物最适退火温度的检测；
3)将目的基因转化到大肠杆菌感受态stbl2或stbl3中并在kana抗性的液体培养基中进行培养；
4)菌落PCR初步鉴定；
5)将鉴定符合要求的菌液进行转接培养和梯度稀释涂布鉴定并分析；
6)放大后菌株中目的质粒的测序分析；
7)统计并分析所有序列的稳定性数据。
最适退火温度检测步骤如下：
将酶、引物和质粒模板从-20℃取出置于冰水混合物上化冻，直至这些物料全部化冻完全，没有明显固体冰块。开始配制PCR反应体系，具体体系如下：
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度为10μmol/L；所述DNA模板(带有SEQID No.1所示序列的质粒)的浓度为1ng/μl。在本发明中，所述引物F的序列如下：cgacggccagtgaattgac(SEQ ID No.65)；所述引物R的序列如下：cagctatgaccatgctcgag(SEQ ID No.66)。反应配制完成后分装到19个不同的PCR管中，每管20μl。将不同的管依次置于PCR仪上统一横排之上，设置梯度退火PCR程序进行最适退火温度探究和检测。
在本发明中，上述梯度退火PCR的扩增程序优选如下：预变性98℃10min；变性98℃30s，退火55.7-66.5℃15s，延伸72℃30s，30个循环；最后延伸72℃，5min。该程序可以使PCR仪中横排每一个孔对应不同的退火温度，而其他变温程序完全一致，可以短时间得到相同体系仅改变退火温度的产物差异，从而分析得到引物的最适退火温度。
待上述程序结束后，配制3％琼脂糖凝胶(称取3g琼脂糖加入100ml的TAE溶液中)，在完成PCR反应的PCR管中加入0.5μl溴酚蓝，震荡混匀，然后按照不同温度顺序依次点样，设置电泳仪程序130V，Run 30min后进行显色，检测结果如图3所示。为了减少非特异性条带对检测结果的影响，选用非特异性条带最少的退火温度66.5℃进行后续的实验检测。
质粒转化步骤如下：
取好对应数量的洁净的1.5ml EP管于EP管架上，写上对应待转质粒的标记信息，将合成基因干粉(分别包括SEQ ID No.1-SEQ ID No.52中一条序列的合成基因质粒)管取出在高速离心机上10000G离心1min，在操作台中用无酶水稀释到10ng/μl，之后插于冰上预冷5min，同时，取出感受态stbl2和stbl3在冰上化冻，待感受态细胞没有明显冰屑后，分装到取好的1.5ml EP管中，每管50μl，取对应标记的预冷好的合成质粒添加到感受态细胞中，每管添加1ng。用枪头轻轻吸打混匀后在冰上孵育30min，之后将EP管置于预先加热42℃的水浴锅中热激，需要将菌体没过液面充分受热。热激45s后取出轻柔的插于冰面以下。孵育2min，加入950μl LB液体培养基，至于30℃摇床220rpm复苏1h。分别取50μl、100μl、150μl菌体涂布在kana抗性的固体平板上。30℃培养箱培养20-24h，挑选出单菌落明显且数量约100-300个的平板进行鉴定。
菌落PCR步骤如下：
单菌落挑取：取出PCR管架，摆好对应数量的八连管，把LB培养基倒入排枪槽中，然后用排枪加50μl LB培养基到八连管中，用镊子拿已灭菌的小白枪头挑取平板上的单菌落并放到八连管中，轻轻晃动PCR管架使枪头上的菌都充分混合在培养基中，取出小白枪头，同时盖上八连管的盖子并在管盖上用抗酒精的记号笔做好标记，置于30℃摇床中培养混匀2h，且在记录本上写好相关记录(日期、编号号等)。从摇床中取出后在掌上离心机上瞬离后轻轻用手指弹掉气泡再瞬离15s后存4℃备用。
菌落PCR反应：配制好如下PCR反应体系，把配好的反应液加到96孔板中，用排枪加1μl菌液到其中，另外需要增设一组原始基因质粒作为模板的反应作为正对照，水作模板的反应作为负对照。按照PCR程序进行扩增：
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度为10μmol/L；所述DNA模板的浓度为1ng/μl。在本发明中，所述引物F的序列如下：cgacggccagtgaattgac(SEQ ID No.65)；所述引物R的序列如下：cagctatgaccatgctcgag(SEQ ID No.66)。在本发明中，所述PCR的扩增程序优选如下：预变性98℃10min；变性98℃30s，退火66.5℃15s，延伸72℃30s，30个循环；最后延伸72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳：先配制3％琼脂糖凝胶(称取3g琼脂糖加入100ml的TAE溶液中)，在完成PCR反应的八连管中加入0.5μl溴酚蓝，震荡混匀，然后点样，电泳好的琼脂糖凝胶拍照、保存。
重组率定义和分析：根据琼脂糖凝胶电泳条带图来判断稳定序列的重组率，菌落PCR条带大小与正对照(PCR模板为对应质粒)相当且无杂带则统计为非重组菌株，反之，则统计为重组菌株。重组率＝统计的重组菌株数量/总检测菌株数量。
重组率分析后的优选序列质粒的放大后稳定性检测：基于上述筛选，筛选出初筛重组率低于15％的部分序列(包括SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ IDNo.47、SEQ ID No.51)进一步放大检测。选取菌落PCR鉴定的稳定菌株，吸取菌液10μl转接到100ml kana抗性的LB液体培养基中，30℃/220rpm培养16h。分别稀释104、105、106倍涂布到kana抗性的固体培养基上。30℃培养箱培养20h，选取菌落较为均匀的平板挑取单菌落若干进行稳定性检测，检测方法同上。
部分质粒转化到stbl3菌株中重组率检测结果如图4所示，部分质粒转化到stbl2菌株中的检测结果以及稳定菌株放大发酵后的检测结果如图5所示。为了更加精准的判定序列的稳定，将放大后的菌株进行委外测序，测序比对结果如图6所示。基于图4和图5的大量检测结果，为了更直观的分析多段化polyA稳定性与序列性质的关系，利用matplotlib.pyplot进行数据处理，将序列特征拆解为linker数量、位置、长度以及G、C、T的含量分别与多段化PolyA多核苷酸稳定性进行相关性分析，其结果如图7所示。
实施例2
部分多段化polyA序列翻译验证
1)通过PCR的方法获取线性化的载体骨架以及与骨架具有同源末端的多段化的polyA序列；
2)通过同源重组将线性化的骨架与polyA序列进行连接；
3)将连接产物转化到大肠杆菌stbl2中并涂布在kana抗性的LB固体筛选培养基上，30℃培养箱过夜培养实现初步的重组子筛选；
4)通过测序确认最终正确的重组子；
5)线性化重组子以及PCR加尾获得相应转录模板；
6)体外转录制备对应mRNA；
7)细胞翻译验证。
骨架线性化与polyA序列的PCR获取步骤如下：
PCR反应：通过基因合成得到具有T7启动子、5'UTR、eGFP编码区以及3'UTR序列的kana抗性质粒，作为上述目的载体构建的骨架。通过PCR的方法进行线性化，反应体系为：Max DNA Polymerase 10μl；引物F 0.5μl；引物R 0.5μl；质粒模板0.5μl；水8.5μl。
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度为10μmol/L；所述DNA模板的浓度为1ng/μl。在本发明中，线性化载体骨架所述引物F的序列如下：TGAGGGTCTAGAACTAGTGTCG(SEQ ID No.67)；所述引物R的序列如下：CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAG(SEQ ID No.68)；所用质粒模板为带有上述骨架序列的合成基因。
扩增带有骨架同源序列的polyA片段所用PCR体系同上，所用引物F的序列如下：CTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG(SEQ ID No.69)；所用引物R的序列如下：CGACACTAGTTCTAGACCCTCA(SEQ ID No.70)；所用质粒模板为带有多段化稳定polyA序列的合成基因，基因两端包括骨架同源序列，5'端侧翼序列为：CTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG(SEQ ID No.71)，3'端侧翼序列为：CGACACTAGTTCTAGACCCTCA(SEQ ID No.72)。所选择构建的多段化polyA序列包括A30L70、A30L170、A30L270、A30G70、A40L80。
在本发明中，上述PCR的扩增程序优选如下：预变性98℃10min；变性98℃30s，退火55℃15s，延伸72℃30s，30个循环；最后延伸72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳：先配制1％琼脂糖凝胶(称取1g琼脂糖加入100ml的TAE溶液中)，在完成PCR反应的PCR管中加入0.5μl溴酚蓝，震荡混匀，然后点样，在样品附近的泳道点上DNA marker，电泳好的琼脂糖凝胶拍照、保存。
目的条带的分析：将凝胶进行显色，对目的条带与marker相应大小的条带进行比较分析，确认目的条带清晰且大小无误。如果条带大小不正确或没有检测到条带，则重复上述步骤。
目的条带的体外重组步骤如下：
重组体系的配制：利用上述PCR产物配置体外重组体系，骨架PCR产物2μl，polyA的PCR产物2μl，T5 Exonuclease 0.1μl，4buffer 0.5μl，ddH2O 0.4μl。体系配置全程均在冰上完成，配置完成后用移液器轻微混匀在冰上孵育5min，孵育完成后加入大肠杆菌感受态细胞优选用stbl2感受态50μl，轻微吸打后继续在冰上孵育30min，然后置于42℃水浴锅热激45s后重新放回冰上孵育2min。取出加入950μl液体LB培养基后放在30℃摇床复苏1h，涂布在kana抗性的固体LB培养基上，30℃培养箱培养20h。
最终正确重组子的筛选：将上述涂布后培养基培养20h后挑取若干单菌落分别转接到3ml kana抗性的液体LB培养基中30℃培养16h提取质粒，并进行测序，将测序结果与设计序列进行比对，比对结果无误的质粒进行编号和分装进行保存。
质粒法制备转录模板步骤如下：
重组质粒的线性化：将构建好的重组质粒利用设计好的ⅡS型限制性内切酶的酶切位点进行线性化，本发明中优选利用BspQⅠ进行酶切，酶切体系如下：重组质粒100μg(1μg/μl)，NEBufferTMr3.1 500μl，BspQⅠ30μl(10000unit/ml)以及无菌水4.37ml混合均匀后在50℃的金属浴中孵育1h，孵育结束后利用Cycle Pure Kit试剂盒进行纯化，操作方法参考试剂盒说明书。
线性化产物的检测：将上述线性化产物进行纯化后，取出2μl利用nanodrop微量分光光度计进行浓度测定，记录产物浓度且取400ng混合10×DNA loading buffer进行琼脂糖凝胶电泳检测。条带单一清晰且大小无误，做好标记储存于-20℃或用于下一步体外转录。
PCR法制备转录模板步骤如下：
PCR体系的配制：通过基因合成得到具有T7启动子、5'UTR、eGFP编码区以及3'UTR序列的kana抗性质粒，通过PCR的方法将上述连续序列加polyA尾巴，反应体系为：
在本发明中，所述引物F和引物R的初始浓度为10μmol/L；所述DNA模板的浓度为1ng/μl。在本发明中，所述引物F的序列如下：GTACAGAAGCTAATACGACTCAC(SEQ ID No.73)；所述引物R的序列如下：TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAG(SEQ ID No.74)或TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAG(SEQ ID No.75)或TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTCATATGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTCCTACTCAGGCTTTATT(SEQ ID No.76)；所用质粒模板为上述具有T7启动子、5'UTR、eGFP编码区以及3'UTR序列的合成基因。
在本发明中，上述PCR的扩增程序优选如下：预变性98℃10min；变性98℃30s，退火55℃15s，延伸72℃30s，30个循环；最后延伸72℃，5min。
PCR产物的纯化：称取0.5g琼脂糖于50ml 1×TAE中，在微波炉中加热至看不见明显固体后加入5μl核酸染料充分混匀，倒入提前准备好的制胶器中，制备出400μl孔的回收胶，常温静置30民待胶体完全凝结，拔出梳子，置于电泳仪中点入全部混合DNAloadingbuffer后的上述PCR产物，130V跑30min后，将胶转移到蓝光仪上对目的条带进行分析，确认条带清晰且大小无误后取出小刀利用酒精消毒把目的条带切下置于EP管中。后续利用试剂盒Gel Extraction Kit进行纯化，具体操作参考试剂盒说明书。
纯化后产物的检测：将上述PCR产物进行纯化后，取出2μl利用nanodrop微量分光光度计进行浓度测定，记录产物浓度且取400ng混合10×DNA loading buffer进行琼脂糖凝胶电泳检测。条带单一清晰且大小无误，做好标记储存于-20℃或用于下一步体外转录。
体外转录制备mRNA
配制转录体系：将不同模板分别配置体外转录体系进行相应的mRNA制备，具体反应体系如下：
配制好上述体系后，置于PCR仪中设置程序为37℃反应4h后，往反应体系中加入2μl DNAseⅠ继续置于37℃环境反应45min后取出，利用试剂盒MEGAcleanTM Kit进行纯化，具体纯化步骤可以参考试剂盒说明书。
mRNA的检测：将上述纯化的mRNA取出2μl利用nanodrop微量分光光度计进行浓度测定，记录产物浓度且取400ng混合10×RNA loading buffer进行琼脂糖凝胶电泳检测。条带单一清晰且大小无误，做好标记储存于-20℃或用于下一步检测实验。
带有不同多段化polyA序列的mRNA表达GFP的细胞翻译验证
细胞和转染试剂的准备：
转染所用的宿主细胞为293T，提前接种细胞到24孔板中，使其在转染时能达到70-90％的汇合度。在转染前0.5-4h利用5％血清的opti-MEMTM培养基进行换液。后续转染需要用转染试剂盒LipofectamineTM3000进行，具体步骤如下：
利用opti-MEMTM培养基同时以一定的比例稀释mRNA和转染试剂LipofectamineTM3000，再将被稀释的LipofectamineTM3000与mRNA按照一比一的比例混合，稀释液配制体系如下：1)opti-MEMTM培养基25μl，LipofectamineTM3000 1.5μl；
2)opti-MEMTM培养基50μl，对应mRNA 1μg。孵育十五分钟后滴入预先准备好的含有宿主细胞的孔板中，二氧化碳培养箱中培养6-24h换液为完全培养基，并且进行相应检测。
倒置荧光显微镜的镜检：将培养24h后的细胞培养板从二氧化碳培养箱中取出，置于倒置荧光显微镜的镜头下，设置好对应通道和检测参数，先利用低倍镜观察视野中的荧光情况，镜头停留在细胞均匀荧光较强的视野中可换用高倍镜进行观察以及拍照，保存图片且进行命名储存和记录，检测结果见图8。
流式细胞仪检测：将上述镜检无误的细胞利用胰蛋白酶进行常温消化1min后，利用完全培养基终止消化反应，利用移液器吸出到1.5ml尖底EP管中进行1000g离心，去掉上清再利用PBS清洗两次后，利用流式细胞仪进行样品检测，利用FITC通道检测平均荧光强度，利用空白细胞(非mRNA转染)作为负对照。将检测结果进行比较，分析出不同mRNA细胞表达的荧光强度，检测结果见图9。
由上述实施例可知，本发明提供的多段化PolyA多核苷酸可以在大肠杆菌传代过程中稳定存在。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种多段化PolyA多核苷酸，其包括两段以上的PolyA序列片段，相邻PolyA序列片段之间通过linker连接，其中，每一PolyA序列片段由多个连续的A组成，每一linker由1-24nt且不全部为A的核苷酸残基组成。
2.根据权利要求1所述的多段化PolyA多核苷酸，其选自具有以下结构的多核苷酸中的一种或多种：
PolyA序列片段1-linker1-PolyA序列片段2；
PolyA序列片段1-linker1-PolyA序列片段2-linker2-PolyA序列片段3；
PolyA序列片段1-linker1-PolyA序列片段2-linker2-PolyA序列片段3-linker3-PolyA序列片段4。
3.根据权利要求1或2所述的多段化PolyA多核苷酸，其中，各PolyA序列片段各自独立地由10-100个连续的A组成；
优选地，PolyA序列片段1由30-60个连续的A组成；
优选地，各PolyA序列片段各自独立地由30、40、50、60、70、80、90或100个连续的A组成；
优选地，多段化PolyA多核苷酸中所有PolyA序列片段的总A个数为30-300，优选为60-240，更优选为100-200。
4.根据权利要求1所述的多段化PolyA多核苷酸，其中，每一linker由1-12nt且不全部为A的核苷酸残基组成；
优选地，每一linker由G组成，或是G含量为linker序列中总碱基的20％-33％。
5.根据权利要求1-3任一项所述的多段化PolyA多核苷酸，其中，每一linker独立地选自以下序列所示核苷酸：
G；
C；
GGGGGG；
ATGCAT；
GCATATGACT；
CAGTAATGAC；
AGTCATATGC；
GTCATTACTG；
TGTCAGATAC；
GCTCATATGC；
GCATATATGC；
CGCCATTAGAGG；
ATGCATGATATC；
TGCAACATCGAT；
CCTCTAATGGCG；
CAACCCCTGATTGTGTCCGCATCT；
优选地，每一多段化PolyA多核苷酸中，所有linker的长度之和为1-48nt，更优选为2-24nt。
6.根据权利要求1-5任一项所述的多段化PolyA多核苷酸，其包括序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.25、SEQID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29、SEQ ID NO.30、SEQ ID NO.31、SEQID NO.32、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36、SEQ ID NO.37、SEQID NO.38、SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40、SEQ ID NO.41、SEQ ID NO.42、SEQ ID NO.43、SEQID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49、SEQID NO.50、SEQ ID NO.51、SEQ ID NO.52所示的序列中的任意一种的多核苷酸中的一种或多种。
7.一种载体，其包含权利要求1-6任一项所述的多段化PolyA多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求1-6任一项所述的多段化PolyA多核苷酸或权利要求7所述的载体。
9.权利要求1-6任一项所述的多段化PolyA多核苷酸、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞在体外转录生产目标mRNA中的应用；优选地，所述目标mRNA是用于生产mRNA疫苗或药物。
10.一种mRNA，其包含由权利要求1-6任一项所述的多段化PolyA多核苷酸体外转录而形成的聚A尾。
11.一种多段化PolyA多核苷酸在宿主细胞中的稳定性鉴定方法，该方法包括：
1)将权利要求1-6任一项所述的多段化PolyA多核苷酸克隆至通用质粒载体，得到插入多段化PolyA多核苷酸的质粒载体；
2)将插入多段化PolyA多核苷酸的质粒载体转入宿主细胞例如大肠杆菌中获得重组细胞，将重组细胞铺在固体平板上获得单菌落，挑取单菌落进行PCR初步鉴定，筛选未发生重组的稳定性菌落；其中，优选地，PCR产物利用2％-3％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定；
3)将初步鉴定筛选到的未发生重组的稳定性菌进行放大发酵培养，培养液进行梯度稀释后涂布在固体平板上，进行菌落PCR以鉴定传代稳定性。
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WO2016005004A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
CA2963840A1 (en) * 2014-10-09 2016-04-14 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Long poly(a) plasmids and methods for introduction of long poly(a) sequences into the plasmid
WO2019036513A1 (en) * 2017-08-15 2019-02-21 Intellia Therapeutics, Inc. STABILIZED NUCLEIC ACIDS ENCODING MESSENGER RIBONUCLEIC ACID (MRNA)
WO2020236597A1 (en) * 2019-05-17 2020-11-26 Massachusetts Institute Of Technology Engineered post-poly a signal rna and uses thereof

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