KR20230167309A - 신규한 변형 폴리아데닌 서열 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생물학적 시료 내에서 장기간 구조 안정성이 유지되는 변형된(modified) 폴리 A 서열 및 이를 인코딩하는 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 변형된 폴리 A 서열 및 이를 인코딩하는 DNA 서열은 최적 범위의 전체 길이(full-length)를 가지고 적절한 위치에 비-아데닌(non-A) 염기를 규칙적으로 포함함으로써, 박테리아 내에서도 길이가 거의 감소되지 않아 유전물질로서의 생물학적 기능이 견고하게 유지된다. 아울러 본 발명은 인 비보 및 인 비트로에서 단백질을 가장 효율적으로 발현할 수 있는 최적의 폴리 A 테일 구조를 통해 치료적 유효량의 목적 단백질을 안정적으로 생산하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 생물학적 시료 내에서 장기간 동안 길이의 감소가 최소화되고 구조적 안정성이 유지될 수 있도록 변형이 가해진 신규한 폴리 A 서열 및 이를 인코딩하는 DNA 분자에 관한 것이다.
폴리아데닐화란 아데닌 염기가 반복적으로 연결된 선형의 폴리 A 다량체가 RNA 분자의 말단에 첨가되는 것을 말하며, 진핵세포에서 폴리아데닐화는 전사 및 번역을 거쳐 단백질을 합성하는 일련의 과정에서 중요한 부분을 차지한다. 폴리 A 테일은 핵에서의 방출, mRNA의 번역 및 이의 안정성에 있어 핵심적인 역할을 하는데, 시간의 경과에 따라 폴리 A 테일의 길이가 짧아지면 RNA 분자는 효소에 의해 분해됨으로써 단백질 합성이 저하되거나 중단된다.
따라서, 다양한 유전자 전달체 또는 숙주 세포 내에서 RNA 분자가 안정성을 유지하도록 장기간 동안 길이가 유지되거나 전장 서열이 단축되는 주기가 연장된 변형(modified) 폴리 A 서열의 개발은 유전 공학, 목적 단백질의 재조합적 생산 또는 유전자 백신 등의 분야에서 그 요구가 나날이 증가하고 있다.
그러나, 폴리 A 서열을 인코딩하는 DNA 서열인 연속적인 dA:dT 염기쌍은 많은 박테리아 내에서 빠른 시간 안에 짧아지므로, E. coli와 같은 원핵세포 내에서 증식(propagation)을 통해 연속적인 dA:dT를 함유하는 DNA 주형을 생산하고자 할 때 많은 제약이 따른다. 이에, 플라스미드를 통해 박테리아 내에 도입되었을 때 효율적으로 안정성이 유지될 수 있도록 폴리 A 서열 인코딩 DNA 서열에 적절한 변형을 가하는 것은 중요한 문제이다.
한편, 유전자 백신은 항원 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 mRNA를 면역원(immunogen)으로 하여 암, 감염성 질환, 자가면역질환 및 염증성 질환 등의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 유전자 치료 등에 있어 DNA가 RNA에 비해 상대적으로 안정하고 다루기 쉬운 것으로 알려져 있으나, DNA는 대상체의 유전체 내로 전달될 경우 원치 않은 위치에 삽입되어 숙주의 유전자가 손상될 수 있으며, 숙주의 면역반응에 의해 생성된 항-DNA 항체에 의해 손상될 수 있을 뿐 아니라, 전사에 영향을 주는 다양한 변수에 의해 목적하는 항원 단백질의 발현 수준이 제한적이라는 단점이 있다. 이에 비하여 mRNA는 핵에서의 전사과정 없이 세포질 내에서 바로 단백질을 합성하고 숙주세포의 유전자 구조를 손상시킬 위험이 없을 뿐 아니라 반감기가 짧아 장기 유전자 변형을 유도하지 않아 DNA와 비교하여 안정적이며 대량 생산이 용이하다는 장점을 가진다.
이에, 본 발명자들은 일정한 범위의 전체 길이(full-length)를 가지면서 적절한 위치에 비-아데닌(non-A) 염기를 규칙적으로 포함함으로써 장기간 동안 길이가 유지되고 목적 단백질의 발현 효율도 비약적으로 상승시키는 새로운 변형 폴리 A 서열-인코딩 DNA 서열을 발굴하고자 하였다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 생물학적 시료, 특히 박테리아 내에서 폴리 A 서열의 전체 서열의 길이가 장기간 동안 안정적으로 유지되면서 목적 단백질의 생산 효율도 현저히 개선될 수 있는 최적 형태의 변형(modified) 폴리 A 서열 또는 이를 인코딩하는 DNA 서열의 구조를 탐색하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 70-230개의 아데닌 및 비-아데닌(non-A) 염기를 포함하면서, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기 간의 비가 3:1 내지 30:1, 구체적으로는 5:1 내지 30:1, 보다 구체적으로는 8:1 내지 20:1인 폴리 A 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용할 경우 생물학적 시료 내, 예를 들어 E.coli와 같은 박테리아 내에서도 그 길이가 장기간 유지될 뿐 아니라 이의 전사 결과물인 mRNA에 의한 목적 단백질의 발현 효율도 비약적으로 향상됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 변형된 폴리아데닌 서열(modified poly-adenyl sequence)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변형된 폴리아데닌 서열을 포함하는 RNA 분자 또는 이를 인코딩하는 DNA 분자 및 이를 유효성분으로 포함하는 면역원성 조성물 또는 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 변형된 폴리아데닌 서열을 포함하는 RNA 분자 또는 이를 인코딩하는 DNA 분자 및 이를 유효성분으로 포함하는 목적 단백질의 발현 및/또는 기능 조절용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 70개 내지 230개의 염기를 포함하며, 아데닌과 비-아데닌(non-A) 염기의 비(ratio)가 3:1 내지 30:1인 변형된 폴리아데닌 서열(modified poly-adenyl sequence)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명자들은 생물학적 시료, 특히 박테리아 내에서 폴리 A 서열의 전체 서열의 길이가 장기간 동안 안정적으로 유지되면서 목적 단백질의 생산 효율도 현저히 개선될 수 있는 최적 형태의 변형(modified) 폴리 A 서열 또는 이를 인코딩하는 DNA 서열의 구조를 탐색하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 70-230개의 아데닌 및 비-아데닌(non-A) 염기를 포함하면서, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기 간의 비가 3:1 내지 30:1, 구체적으로는 5:1 내지 30:1, 보다 구체적으로는 8:1 내지 20:1인 폴리 A 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용할 경우 생물학적 시료 내, 예를 들어 E.coli와 같은 박테리아 내에서도 그 길이가 장기간 유지될 뿐 아니라 이의 전사 결과물인 mRNA에 의한 목적 단백질의 발현 효율도 비약적으로 향상됨을 발견하였다.
본 명세서에서 용어“생물학적 시료”는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 있는 모든 시료로서 다양한 진핵세포, 원핵세포, 조직, 기관 및 이들의 배양액을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로는 상기 생물학적 시료는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 삽입된 유전자 전달체로 형질전환된 세포 및 이의 배양액이며, 보다 구체적으로는 원핵세포 또는 이의 배양액이고, 가장 구체적으로는 E.coli 또는 이의 배양액이다.
본 명세서에서 용어“유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 및 세포 수준에서,“유전자 전달”은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가지므로, 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.
본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어 변형된 폴리아데닌 서열로 전사될 수 있는 이중 가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드이다.
본 명세서에서 용어“폴리아데닌 서열”,“폴리 A 서열”또는“폴리 A 테일(poly(A) tail)”은 RNA 분자의 3' 말단에 위치하여 효소에 의한 분해로부터 RNA 분자를 보호하는 아데닌-반복 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 폴리 A 테일의 길이는 mRNA의 안정성 뿐 아니라 단백질의 변역(translation)에도 영향을 준다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 3개 내지 30개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치한다. 보다 구체적으로는, 상기 비-아데닌 염기는 3개 내지 20개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치하고, 보다 더 구체적으로는 3개 내지 15개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치하며, 보다 더 구체적으로는 3개 내지 10개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치하고, 보다 더 구체적으로는 5개 내지 10개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치하며, 가장 구체적으로는 8개 내지 10개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치한다.
본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 비-아데닌 염기는 3개, 5개, 6개, 8개, 10개, 15개, 20개 또는 30개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치한다. 상기 비-아데닌 염기는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개가 존재할 수도 있으며, 복수개가 연속적으로 존재할 수도 있다. 연속적인 아데닌 서열 사이 복수개의 비-아데닌 염기가 존재할 경우 2개 또는 3개가 연속적으로 존재할 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개 또는 2개가 연속적으로 위치한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 동일한 비-아데닌 염기가 적용될 경우 상기 비-아데닌 염기는 구아닌(Guanine)일 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 이중 가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드인 경우 (dG:dC)이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 상이한 2개의 비-아데닌 염기가 적용될 경우 상기 비-아데닌 염기는 구아닌(Guanine), 시토신(Cytosine) 및 티민(Thymine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 염기의 조합일 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 이중 가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오타이드인 경우 각각 (dG:dC), (dC:dG) 및 (dT:dA)로 구성된 군으로부터 선택되는 2개 이상의 염기의 조합일 수 있다. 이 경우 상이한 2개 이상의 비-아데닌 염기는 일정한 수의 아데닌 염기를 간격으로 하여 무작위적으로 배치될 수도 있고 교차하여 배치될 수도 있다. 보다 구체적으로는, 구아닌, 시토신 및 티민으로 구성된 군으로부터 선택되는 2개의 염기의 조합일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 5:1 내지 30:1이며, 보다 구체적으로는 8:1 내지 20:1이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 5:1 내지 20:1이며, 보다 구체적으로는 5:1 내지 15:1이고, 보다 더 구체적으로는 5:1 내지 10:1이다.
보다 구체적으로는, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 3:1, 5:1, 8:1, 10:1, 10:2, 10:3, 15:1, 15:2, 20:1, 30:1 및 30:2로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 구체적으로는, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 8:1 또는 10:1이다.
단일 또는 연속적인 비-아데닌 염기의 수 및 이들 사이에 존재하는 연속적인 아데닌 염기의 수는 본 발명의 변형된 폴리아데닌 전체 서열 내에서 전술한 함량비(예를 들어 3:1 내지 30:1)를 만족하는 한 어떠한 형태로도 배열될 수 있다. 따라서 아데닌과 비-아데닌이 반드시 전장 서열 전반에 거쳐 동일한 비율로 반복될 필요는 없으며 예를 들어 A(10) - non-A(1) - A(15) - non A(2) - A(5) - non-A(1) - A(6) - non-A(2)와 같이 불균일하게 반복되면서 전체 ratio(A : non-A)가 전술한 함량비 범위에 포함(6:1)되는 구성도 모두 본 발명의 양태에 포함된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 폴리 A 서열은 74개 내지 190개의 염기를 포함하며, 보다 구체적으로는 80개 내지 190개의 염기를 포함하고, 보다 더 구체적으로는 90개 내지 190개의 염기를 포함하며, 보다 더 구체적으로는 100개 내지 190개의 염기를 포함하고, 보다 더 구체적으로는 109개 내지 186개의 염기를 포함하며, 가장 구체적으로는 109개 내지 150개 염기를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 발현조절서열; 상기 발현조절서열과 작동적으로 연결된 전사 가능 뉴클레오타이드 서열; 및 전술한 본 발명의 변형된 폴리아데닌 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 DNA 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어“발현조절서열”은 발현시키고자 하는 표적 핵산분자에 작동적으로 결합되어 이의 발현 개시를 조절하는 프로모터, 시그널 서열, 전사조절인자 결합 위치의 어레이를 포괄하는 의미이다. 보다 구체적으로는, 상기 발현조절서열은 프로모터를 의미한다.
본 명세서에서 용어“프로모터”는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열로서, 작동적으로 결합되는 대상 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 핵산 서열을 의미한다. 프로모터는 임의로 전사 개시 부위로부터 수천 염기쌍 만큼의 거리에 위치할 수 있는, 원위 인핸서 또는 리프레서 요소를 포함할 수 있다. 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 발현조절 서열과 표적 핵산서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 표적 핵산분자의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 발현조절서열은 T7 프로모터, T3 프로모터 및 SP6 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자를 제공한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 RNA 분자 중 우라실(U)의 전체 또는 일부가 하기 화학식 1로 표시되는 변형된 U(modified U)로 치환된다:
화학식 1
상기 화학식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는 C1-C3 알콕시이고, X 및 A는 탄소 또는 질소이며 서로 상이하고, 는 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다.
본 명세서에서 용어“알킬”은 직쇄 또는 분쇄의 포화 탄화수소기를 의미하며, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필 등을 포함한다. C1-C3 알킬은 탄소수 1 내지 3의 알킬 유니트를 가지는 알킬기를 의미하며, C1-C3 알킬이 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
본 명세서에서 용어“알콕시”는 알코올에서 수소가 제거되어 형성된 라디칼을 의미하며, C1-C3 알콕시가 치환된 경우 치환체의 탄소수는 포함되지 않은 것이다.
옥텟 규칙(octet rule)에 의할 때, X 또는 A가 질소인 경우, X 또는 A가 각각 참여하는 결합인 가 단일결합임은 자명하다.
본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 화학식에서 X는 질소이고 A는 탄소이며 R1 및 R2는 수소이다. X는 질소이고 A는 탄소이며 R1 및 R2가 수소인 화학식 1 화합물은 슈도우리딘(pseudouridine)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식에서 X는 질소이고 A는 탄소이며 R1은 C1 알킬(메틸)이고 R2는 수소이다. X는 질소이고 A는 탄소이며 R1 및 R2는 수소인 화학식 1 화합물은 N1-메틸-슈도우리딘(N1-methyl-pseudouridine)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식에서 X는 탄소이고, A는 질소이며, R1은 C1 알콕시(메톡시)이고, R2는 수소이다. X는 탄소, A는 질소, R1은 메톡시, R2는 수소인 화학식 1 화합물은 5-메톡시우리딘(5-methoxyuridine)이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 mRNA 분자를 제공한다:
(a) 목적 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
(b) 70개 내지 230개의 염기를 포함하며, 아데닌과 비-아데닌(non-A) 염기의 비(ratio)가 3:1 내지 30:1인 변형된 폴리아데닌 서열(modified poly-adenyl sequence).
본 발명은 최적 형태로 변형된 폴리 A 서열을 포함함으로써 숙주 세포에서 목적 단백질을 안정적으로 발현시킬 수 있는 mRNA 분자를 제공할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 변형된 폴리 A 서열 및 이를 구성하는 아데닌과 비-아데닌(non-A) 염기의 배열에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
단, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개 내지 3개가 연속적으로 위치하며, 보다 구체적으로는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개가 위치한다. 후술하는 실시예에서 보는 바와 같이, 본 발명자들은 폴리 A 서열 사이에 서열에 비-아데닌 염기가 2개씩 연속적(m=2)으로 도입되었을 때 폴리 A의 구조가 더 안정하게 유지되지만, 이를 통해 전사된 IVT mRNA의 경우 비-아데닌 염기가 1개씩(m=1) 도입되었을 때 단백질 발현 효율이 더 높음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어“발현시키다”는 대상체가 외래(exogenous) 유전자를 발현하게 하거나 또는 내인성(endogenous) 유전자의 자연적 발현량을 증가시키기 위해 유전자 전달체를 이용하여 인위적으로 이를 도입함으로써 유전자가 대상체 세포 내에서 염색체외 인자로서 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 따라서, 용어“발현”은“형질전환(transformation)”, "형질감염(transfection)" 또는 "형질도입(transduction)"과 동일한 의미이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 목적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 양 말단에 5'-UTR 및 3'-UTR이 결합되어 있다.
보다 구체적으로는, 상기 5'-UTR은 5'-cap이 결합되어 있다.
본 명세서에서 용어“UTR(untranslated region)는 mRNA 내에서 목적 단백질을 암호화하는 코딩 서열의 양 말단에 결합된 비번역 부위를 의미하며, 코딩 서열의 업스트림에 존재하는 5'-UTR 및 다운스트림에 존재하는 3'-UTR이 있다. 용어“5’-cap”은 5'-UTR에 연결되어 elF4E(eukaryote translation initiation factor 4E)와 결합함으로써 40S 리보솜 서브유닛을 mRNA에 결합시켜 mRNA의 5' 시작 부위로부터 단백질 합성을 개시하는 역할을 할 뿐 아니라 핵산 분해효소로부터 mRNA를 보호하는 역할을 하는 mRNA의 구성요소를 의미한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 RNA 분자 중 우라실(U)의 전체 또는 일부가 하기 화학식 1로 표시되는 변형된 U(modified U)로 치환된다:
화학식 1
화학식 1의 변형 염기에 대해서는 이미 상술하였으므로, 과도한 중복을 피하기 위해 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 DNA 분자, 또는 RNA 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 DNA 분자, 또는 RNA 분자를 포함하는 목적 단백질의 발현 및/또는 기능 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 DNA 분자, 또는 RNA 분자를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어“면역원성 조성물”은 본 발명의 DNA 또는 RNA 분자에 의해 발현되는 목적 항원(antigen) 또는 면역원(immunogen)에 대한 적응성 면역반응(adaptive immune response)을 유발시키는 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상체에 투여된 후 표적 항원 또는 면역원에 대한 항체 생성을 유발하는 조성물을 포함한다.
이러한 면역원성 조성물은 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 백신 뿐 아니라 인간 이외의 동물 내에서 안정적으로 자가항원 발현을 유도함으로써 자가면역질환을 재연하는 동물모델을 제작하거나, 또는 숙주 동물을 이용한 치료용 항체의 생산 등에 유용하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어“자가면역질환(autoimmune disease)”은 과도하거나 원치않는 체액성 면역반응 또는 세포성 면역반응에 의해 신체 내 조직이나 기관이 손상되거나 기능을 상실하는 모든 병적 상태를 포괄하는 의미이다.
본 명세서에서 용어“동물모델”은 자가면역질환 등의 특정 질환의 형질, 표현형 또는 증상을 가지도록 직접 또는 간접적으로 인위적 변형이 가해진 비-인간 동물을 의미하며, 구체적으로는 자가항원 단백질을 인코딩하는 본 발명의 mRNA 분자가 도입되어 자가항체의 생성에 의해 진행되는 전반적인 생물학적 과정을 재연하는 동물을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 포유류의 면역 체계에 의해 생성된, 항원의 에피토프에 결합하는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하여 해당 항원을 특이적으로 인식하는 면역글로불린 단백질을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 전술한 본 발명의 면역원성 조성물을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 DNA 분자 또는 RNA 분자를 포함하는 면역원성 조성물은 이에 의해 유도되는 면역반응을 통해 예방, 치료 또는 개선될 수 있는 다양한 질환에 대한 유전자 백신 조성물로 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어“백신”은 표적 항원 또는 면역원에 대하여 방어 면역 반응을 유도함으로써 환자의 면역체계가 생성시킨 표적 항원 또는 면역원에 특이적인 항체를 통해 체내에 생성되거나 유입된 병원성 물질 또는 병변 조직을 제거 또는 감소시키는 조성물을 의미하는 것으로, 예방용 백신 및 치료용 백신을 모두 포괄하는 의미이다.
본 발명은 DNA 백신 뿐 아니라 mRNA 기반 백신으로 적용될 수도 있다. mRNA는 극소량의 주형 DNA만 확보되면 1-2주 안으로 대량생산이 가능하며 mRNA의 인비트로 생산에는 생물학적 반응기가 불필요하고 감염원을 직접 다룰 필요 없이 항원 유전자를 신속하고 안전하게 합성함으로써 급속도로 확산되는 감염성 질환에 보다 용이하게 대응할 수 있다.
본 명세서에서 용어“예방”은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어“치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물을 대상체에 투여하면 목적하는 항원 단백질이 안정적으로 발현됨으로써 이에 대한 면역반응이 효율적으로 유도되어 대상 질환의 감염을 차단하거나, 이에 의한 증상을 억제, 제거 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 치료용 백신 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.
본 명세서에서 용어“투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.
본 발명에서 용어“치료적 유효량”은 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에“예방적 유효량”을 포함하는 의미이다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적 조성물의 일종으로, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 정맥, 근육, 피하 또는 복강 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 생물학적 시료 내에서 장기간 구조 안정성이 유지되는 변형된(modified) 폴리 A 서열 및 이를 인코딩하는 DNA 서열을 제공한다.
(b) 본 발명의 변형된 폴리 A 서열 및 이를 인코딩하는 DNA 서열은 최적 범위의 전체 길이(full-length)를 가지고 적절한 위치에 비-아데닌(non-A) 염기를 규칙적으로 포함함으로써, 박테리아 내에서도 길이가 거의 감소되지 않아 유전물질로서의 생물학적 기능이 견고하게 유지된다.
(b) 아울러 본 발명은 인 비보 및 인 비트로에서 단백질을 가장 효율적으로 발현할 수 있는 최적의 폴리 A 테일 구조를 통해 치료적 유효량의 목적 단백질을 안정적으로 생산하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 IVT mRNA 합성을 위한 DNA 벡터의 모식도를 보여주는 그림이다. 짙은 회색은 프로모터 영역, 연두색은 비번역 부위(UTR), 파란색은 코딩 서열, 붉은색은 폴리(A) 서열을 각각 나타내며, B는 비-아데닌, B’는 비-아데닌에 상보적인 DNA를 나타낸다. 좌측은 순수 폴리(dA:dT) 서열만을 포함한 벡터 DNA의 염기서열이며, 우측은 폴리(dA:dT) 서열 내에 비-아데닌 염기(B) 및 이의 상보적 염기(B’)가 도입된 벡터 DNA를 각각 나타낸다.
도 2는 폴리(dA:dT) 서열의 전체 길이에 따른 DNA 벡터의 E. coli에서의 서열 구조 안정성을 조사한 결과(도 2a) 및 E. coli의 재접종(re-seeding) 후에 이러한 안정성이 유지되는 지를 확인한 결과(도 2b)를 각각 보여주는 그림이다. 각 그래프의 붉은 선은 클로닝을 통해 벡터에 도입시킨 폴리(dA:dT) 서열 길이가 안정하게 유지되었을 때의 길이를 의미하며, 안정성이 유지되지 못하여 폴리(dA:dT) 서열 길이가 짧아지면 붉은 선 아래 dot가 위치하게 된다.
도 3은 다양한 길이의 폴리(dA:dT) 서열 내에 다양한 비율의 비-아데닌 염기 및 이의 상보적 염기를 도입한 벡터로부터 전사된 IVT(in vitro transcribed) mRNA 기반 단백질 발현 효율을 측정한 결과를 보여주는 그림으로, 변이 염기(pUTP)가 포함된 mRNA을 이용하여 18시간 시점(도 3a)과 24시간 시점(도 3b) 및 96시간까지의 각 시점별로 측정한 결과(도 3c 및 3d)를 루시퍼라제 어세이를 통해 보여주는 그림이다. 도 3e는 HeLa 세포를 이용하여 변이 염기(pseudouridine)가 포함되지 않은 비변형 IVT mRNA의 단백질 발현 효율을 측정한 결과이며, 도 3f는 HeLa 세포와 RAW 264.7 세포를 이용하여 변이 염기(pUTP)가 포함된 IVT mRNA의 단백질 발현 효율을 측정한 결과이고, 도 3g는 변이 염기(pUTP)가 포함되고 EPO(erythropoietin)를 코딩하는 IVT mRNA의 단백질 발현능을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 각 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 4는 폴리(dA:dT) 서열 내에 비-아데닌 염기와 이의 상보적 염기가 1개씩 또는 2개씩 (m=1,2) 도입되었을 시 E.coli 에서의 폴리(dA:dT) 서열 구조의 안정성(도 4a) 및 이로부터 전사된 IVT mRNA 기반 단백질 발현 효율(도 4b)을 측정한 결과를 각각 보여주는 그림이다. 도 4b의 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 5는 폴리(dA:dT) 서열 내에 삽입된 비-아데닌(non-A) 염기 간의 거리에 따른 폴리(dA:dT) 서열 구조 안정성(도 5a) 및 이로부터 전사된 IVT mRNA 기반 단백질 발현 효율(도 5b 및 5c)을 비교한 결과를 보여주는 그림이다. 도 5b 및 5c의 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 6은 폴리(dA:dT) 서열 내에 삽입된 비-아데닌(non-A) 염기의 종류에 따른 폴리(dA:dT) 서열 구조 안정성(도 6a) 및 이로부터 전사된 IVT mRNA 기반 단백질 발현 효율(도 6b)을 비교한 결과를 보여주는 그림이다. A(10)GC(1)-142는 2종의 비-아데닌 염기인 구아닌(Guanine)과 시토신(Cytosine) 단일 염기(m=1)가 10개의 아데닌 염기(n=10)사이 교차로 배치된 총 길이 142개 구조를, A(10)GU(1)-142는 비-아데닌 염기로서 구아닌과 우라실(Uracil) 단일 염기(m=1)가 10개의 아데닌 염기(n=10)사이 교차로 배치된 총 길이 142개의 구조를 각각 나타낸다. 도 6b의 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 2는 폴리(dA:dT) 서열의 전체 길이에 따른 DNA 벡터의 E. coli에서의 서열 구조 안정성을 조사한 결과(도 2a) 및 E. coli의 재접종(re-seeding) 후에 이러한 안정성이 유지되는 지를 확인한 결과(도 2b)를 각각 보여주는 그림이다. 각 그래프의 붉은 선은 클로닝을 통해 벡터에 도입시킨 폴리(dA:dT) 서열 길이가 안정하게 유지되었을 때의 길이를 의미하며, 안정성이 유지되지 못하여 폴리(dA:dT) 서열 길이가 짧아지면 붉은 선 아래 dot가 위치하게 된다.
도 3은 다양한 길이의 폴리(dA:dT) 서열 내에 다양한 비율의 비-아데닌 염기 및 이의 상보적 염기를 도입한 벡터로부터 전사된 IVT(in vitro transcribed) mRNA 기반 단백질 발현 효율을 측정한 결과를 보여주는 그림으로, 변이 염기(pUTP)가 포함된 mRNA을 이용하여 18시간 시점(도 3a)과 24시간 시점(도 3b) 및 96시간까지의 각 시점별로 측정한 결과(도 3c 및 3d)를 루시퍼라제 어세이를 통해 보여주는 그림이다. 도 3e는 HeLa 세포를 이용하여 변이 염기(pseudouridine)가 포함되지 않은 비변형 IVT mRNA의 단백질 발현 효율을 측정한 결과이며, 도 3f는 HeLa 세포와 RAW 264.7 세포를 이용하여 변이 염기(pUTP)가 포함된 IVT mRNA의 단백질 발현 효율을 측정한 결과이고, 도 3g는 변이 염기(pUTP)가 포함되고 EPO(erythropoietin)를 코딩하는 IVT mRNA의 단백질 발현능을 측정한 결과를 보여주는 그림이다. 각 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 4는 폴리(dA:dT) 서열 내에 비-아데닌 염기와 이의 상보적 염기가 1개씩 또는 2개씩 (m=1,2) 도입되었을 시 E.coli 에서의 폴리(dA:dT) 서열 구조의 안정성(도 4a) 및 이로부터 전사된 IVT mRNA 기반 단백질 발현 효율(도 4b)을 측정한 결과를 각각 보여주는 그림이다. 도 4b의 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 5는 폴리(dA:dT) 서열 내에 삽입된 비-아데닌(non-A) 염기 간의 거리에 따른 폴리(dA:dT) 서열 구조 안정성(도 5a) 및 이로부터 전사된 IVT mRNA 기반 단백질 발현 효율(도 5b 및 5c)을 비교한 결과를 보여주는 그림이다. 도 5b 및 5c의 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
도 6은 폴리(dA:dT) 서열 내에 삽입된 비-아데닌(non-A) 염기의 종류에 따른 폴리(dA:dT) 서열 구조 안정성(도 6a) 및 이로부터 전사된 IVT mRNA 기반 단백질 발현 효율(도 6b)을 비교한 결과를 보여주는 그림이다. A(10)GC(1)-142는 2종의 비-아데닌 염기인 구아닌(Guanine)과 시토신(Cytosine) 단일 염기(m=1)가 10개의 아데닌 염기(n=10)사이 교차로 배치된 총 길이 142개 구조를, A(10)GU(1)-142는 비-아데닌 염기로서 구아닌과 우라실(Uracil) 단일 염기(m=1)가 10개의 아데닌 염기(n=10)사이 교차로 배치된 총 길이 142개의 구조를 각각 나타낸다. 도 6b의 에러바는 평균의 표준 오차를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
IVT mRNA 합성을 위한 pDNA 주형 제조 및
E.coli
에의 형질전환
Poly(dT:dA)가 삽입된 pDNA를 제조하기 위해, 다음과 같이 실험을 수행하였다. 먼저, 모델 단백질(반딧불이 루시퍼라제)또는 EPO(erythropoietin)을 코딩하는 ORF(open reading frame) 및 3’UTR을 포함하는 DNA 벡터(루시퍼라제-pcDNA3 또는 EPO-pcDNA3)를 주형으로 PCR을 수행하여 벡터 인서트(insert)를 제작하였다. PCR은 하기 표 1의 조건 하에서 TOPsimple™ PCR DryMIX-Forte(enzynomics, 한국)를 사용하여 수행하였고, 증폭된 PCR 반응 산물은 AccuPrep® PCR 정제키트(Bioneer, 한국)를 사용하여 정제하였다.
| PCR 혼합물 | PCR 사이클 | ||||
| PCR 혼합물(FORTE) | 1 tube | 초기 변성 | 95℃ | 5분 | 1 사이클 |
| DW | 17μl | 변성 | 95℃ | 30초 | 30사이클 |
| pLuc (3~5 ng/μl) or pEPO | 1μl | 어닐링 | 59℃ | 30초 | |
| FP (10 pmole/μl) | 1μl | 연장 | 72℃ | 1분/kb | |
| RP (10 pmole/μl) | 1μl | 최종 연장 | 72℃ | 5분 | 1사이클 |
이 때, 정방향 프라이머(FP)는 향후 벡터에 삽입하기 위해 도입되는 벡터 DNA 끝부분에 존재하는 20-nt의 동일 염기서열을 포함하는 것을 사용하였다. 또한, 폴리(T) 서열 및 향후 벡터에 삽입하기 위한 20-nt의 동일 염기서열 포함하는 역방향 프라이머(RP)를 사용하여 3’UTR 바로 옆 3’에 폴리(T) 테일(poly(T) tail) 서열 및 동일 염기서열이 도입된 DNA 주형을 제조하였다. 즉, 상기 정방향/역방향 프라이머는 다음 구성에 기반한 것을 사용하였다.
정방향 프라이머1: 5’-동일 염기서열(homologous DNA sequence)-DNA 벡터와 특이적으로 결합하는 프라이머 서열
역방향 프라미어1: 5’-동일 염기서열(homologous DNA sequence)-폴리(T) - DNA 벡터와 특이적으로 결합하는 프라이머 서열 - 3’
본 발명에서 상기 역방향 프라이머의 폴리(T) 서열로 폴리(T) 서열만으로 이루어진 프라이머, 폴리(T) 서열의 적정 수의 폴리(T) 서열마다 non-T(C/G)가 1~3개가 혼입된 프라이머를 사용하였다. 이를 통해 벡터에 도입되는 폴리(dT:dA)의 적정 간격마다 다른 염기서열 1~3개가 혼입되도록 하였다.
상기 방법을 통해 제조된 인서트는 T7 프로모터부터 5’UTR서열을 포함하는 선형 벡터에 삽입되었다. 이때 선형 벡터는 DNA 벡터(GFP-pUC)를 주형으로 PCR을 수행하여 제작하였다. PCR은 TOPsimple™ PCR DryMIX-Forte(enzynomics, 한국)을 사용하여 수행하였고, 구체적인 PCR 조건은 상기 표 1과 같다. 증폭된 PCR 반응산물은 AccuPrep® PCR Purification Kit(Bioneer, 한국)를 사용하여 정제하였다.
이 때, 정방향/역방향 프라이머는 인서트를 삽입하기 위해 도입되는 인서트 끝부분에 존재하는 20-nt의 동일 염기서열을 포함하는 것을 사용하였다. 또한, 이를 통해 제조되는 선형 벡터는 주형 DNA 벡터(GFP-pUC)의 T7 프로모터부터 5’UTR 서열을 포함하도록 하였다. 즉, 상기 선형 벡터의 제조에 이용한 정방향/역방향 프라이머는 다음 구성에 기반한 것을 사용하였다.
정방향 프라이머2: 5’-동일 염기서열(homologous DNA sequence)-DNA 벡터와 특이적으로 결합하는 프라이머 서열
역방향 프라미어2: 5’-동일 염기서열(homologous DNA sequence)-DNA 벡터와 특이적으로 결합하는 프라이머 서열-3’
상기 과정을 통해 제조된 선형 벡터와 인서트는 1:3 비율로 섞고 T4 중합효소를 사용하여 SLIC(Sequence-& Ligation-Independent Cloning) 방법으로 클로닝을 진행하였다. SLIC 진행을 위한 구체적인 혼합물의 조건은 하기 표 2와 같다. 혼합물을 상온에서 2분 30초간 반응시킨 후 얼음에서 10분 안정화 과정을 거쳐 선형 벡터와 인서트의 어닐링(annealing)을 유도하였다. 이어서, 상기 혼합물을 컴피턴트 세포(competent cell, JUMBO Value 108 HIT-DH5α, RBCBioscience)에 형질전환을 진행했다. 형질전환된 컴피턴트 세포는 고체배지에 도말(spreading)하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.
배양 후, 형성되는 콜로니에 형질전환된 벡터 내의 Poly(dT:dA)의 길이가 제대로 유지되었는지 확인하기 위하여 단일 콜로니 여러개를 수집하여 콜로니 PCR을 진행하였다. 이때 콜로니 PCR의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 Poly(dT:dA)의 앞 뒤 서열로 구성하여 콜로니 PCR의 증폭산물의 길이 확인을 통해 벡터 내에서 Poly(dT:dA)의 길이가 안정적으로 유지되는지 여부를 평가할 수 있도록 하였다. 자세한 Poly(dT:dA) 길이 확인의 방법은 하기 실시예에서 후술하였다.
| 선형벡터 | a mole |
| Insert | b mole |
| 10x BSA | 1μl |
| 10x Buffer | 1μl |
| DW | up to 10μl |
| T4 polymerase (3 unit/μl) | 0.5μl |
본 발명에서 사용한 모든 프라이머 서열을 하기 표 3에 정리하였으며, 모든 서열은 IDT(유전자 합성서비스)로부터 제공받아 사용하였다.
| 프라이머 | 서열 | 서열번호 |
| 정방향-루시퍼라제-pcDNA3 | 5’-AAATATAAGAgccaccatggaagacgc-3’ | 4 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(1)-76> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 5 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(1)-142> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 6 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(1)-186> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 7 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)C(1)-142> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 8 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(15)G(1)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 9 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(15)G(2)-142> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 10 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(20)G(1)-142> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 11 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(30)G(1)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 12 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(30)G(2)-142> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 13 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(5)G(1)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 14 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(3)G(1)-142> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 15 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(2)-142> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCCTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3’ | 16 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(3)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCCCTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 17 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(1)-109> |
5’-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 18 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(1)-120> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 19 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(1)-123> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 20 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)G(1)-131> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 21 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(8)G(1)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 22 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)U(1)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTATTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 23 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)GC(1)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTGTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 24 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A(10)GU(1)-142> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTCTTTTTTTTTTATTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 25 |
| 역방향-루시퍼라제-pcDNA3 <A30LA70> |
5′-TGATTTGCGTCGACACTAGTGGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGTCATATGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCAATGCGATGCAATTTCCTCATTTTATTAGG-3′ | 26 |
| 정방향-GFP-UC | 5′-CTAGTGTCGACGCAAATCAGTTCT-3′ | 27 |
| 역방향-GFP-UC | 5′-cCATGGTGGCTCTTATATTTCTTCTTAC-3′ | 28 |
Poly(dA:dT) 길이의 확인
상기 실시예에서 제조한 pDNA 주형으로 형질전환 후 고체 배지에 도말하여 배양된 단일 콜로니 일부를 멸균된 파이펫 팁(tip)으로 찍어 PCR 튜브에 넣고 콜로니 PCR을 진행하였다. 이때 사용한 정방향/역방향 프라이머는 클로닝된 pDNA의 poly(dA:dT) 서열 앞/뒤 서열에 특이적으로 결합하는 서열로 구성하였다. 상기 콜로니 PCR 후 형성되는 PCR 산물의 길이를 PAGE gel(15%)에 200V 전압으로 40분간 전기영동하여 poly(dA:dT) 서열의 길이를 확인하였다. 더불어, poly(dA:dT) 서열길이는 클로닝된 pDNA를 추출하여 생어(Sanger) 시퀀싱을 통해 재확인하였다. 콜로니 PCR 및 생어 시퀀싱을 통해 poly(dA:dT)의 길이가 확인된 벡터로 형질전환된 E.coli는 50% 글리세롤에 스톡(stock)으로 저장하였다.
Poly(dA:dT)가 도입된 pDNA로 형질전환된
E.coli
스톡의 재접종(reseeding) 후 Poly(dA:dT) 길이 안정성 유지 여부의 확인
상기 실시예에서 Poly(dA:dT)의 길이가 확인된 벡터로 형질전환된 E.coli 스톡의 재접종 후의 Poly(dA:dT) 길이 유지 여부를 확인하기 위해 저장된 E.coli를 다시 한번 고체배지에 도말(spreading)하고 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 후, 형성되는 콜로니 내에서 형질전환된 벡터 내의 Poly(dT:dA) 길이가 제대로 유지되는지를 확인하고자 상기 실시예에서 기술한 poly(dA:dT) 서열 앞/뒤 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머를 이용한 콜로니 PCR을 실시하였다. 상기 콜로니 PCR 후 형성되는 PCR 산물의 길이를 PAGE 겔(15%)에 200V 전압으로 40분간 전기영동하여 poly(dA:dT) 서열의 길이를 확인하였다.
콜로니의 액체 배양을 진행한 후 DNA를 추출하여 생어 시퀀싱으로 폴리(dA:dT) 서열 길이 유지 여부를 측정한 결과, A90이 도입된 벡터로 형질전환된 E.coli 중 폴리(dA:dT) 서열 길이가 유지된 것은 3개 콜로니에 불과하였고, A219가 도입된 벡터로 형질전환된 E.coli 중에는 폴리(dA:dT) 서열 길이가 유지된 것이 하나도 발견되지 않았다. 이를 통해 폴리(dA:dT) 서열의 길이가 증가함에 따라 E.coli에서의 DNA 벡터의 안정성이 감소됨을 알 수 있었다. 반면, 폴리(dA:dT) 서열 사이에 비-아데닌 염기와 이의 상보염기(dB:dB’)가 삽입된 벡터로 형질전환된 E.coli에서는 폴리(dA:dT) 서열 길이가 보다 잘 유지됨을 확인하였다(도 2a). 구체적으로, A(10)G(1)-76의 경우 75%의 단일 콜로니에서 안정한 폴리(dA:dT) 서열 길이가 유지되었으며, A(10)G(1)-142의 경우 80% 이상의 단일 콜로니에서 안정한 폴리(dA:dT) 서열 길이가 유지되었다(도 2a). 하지만, A(10)G(1)-219의 경우 1개의 콜로니를 제외하고 모두 폴리(dA:dT) 서열 길이가 유지되지 않아 폴리(dA:dT) 서열 사이에 1개의 (dB:dB’)가 도입되었을 시 폴리(dA:dT)의 전체 길이가 219개를 초과할 경우 서열 구조 안정성이 저하됨을 알 수 있었다(도 2a). 이를 통해, 폴리(dA:dT) 서열에 (dB:dB’)가 1개씩 도입된 경우 E.coli에서 안정성을 유지할 수 있는 폴리(dA:dT) 서열의 총 길이 범위는 76 - 219개임을 확인할 수 있었다.
한편, A(10)G(1)-142로 클로닝을 진행한 벡터로 형질전환시킨 일부 콜로니에서 도입시킨 폴리(dA:dT) 서열 길이보다 더 긴 폴리(dA:dT) 서열 길이가 확인되었는데, 이는 벡터 클로닝 시 사용된 프라이머 중 일부 디자인한 길이보다 길게 합성된 올리고가 클로닝으로 벡터에 삽입된 것으로 판단된다.
한편, 전체 길이와 안정성이 확인된 폴리(dA:dT) 서열이 E.coli 스톡(stock)에서 구조 안정성이 유지되는지 여부를 추가적으로 확인하기 위해 E.coli 스톡을 고체배지에 재접종하여 배양한 후 형성된 여러 개의 단일 콜로니에서의 폴리(dA:dT) 서열 길이를 측정하였다(도 2b). 도 2b의 붉은 선은 E.coli 스톡에서 확인된 폴리(dA:dT) 서열 길이를 의미하며, 폴리(dA:dT) 서열 길이가 안정하게 유지되었을 시 붉은 선 상에 dot가 위치하게 되고, 폴리(dA:dT) 서열 길이가 짧아지게 되면 붉은 선 아래 dot가 위치하게 된다. 콜로니의 액체 배양 후 DNA를 추출하여 생어 시퀀싱으로 폴리(dA:dT) 서열 길이를 확인한 결과, E.coli의 재접종 후 형성된 콜로니에서 폴리(dA:dT) 서열 구조는 A(10)G(1)-76, A(10)G(1)-123, A(10)G(1)-131 및 A(10)G(1)-142에서 완벽하게 유지됨을 확인할 수 있었다(도 2b). A(10)G(1)-186의 경우에도 폴리(dA:dT) 서열 길이가 유지되는 콜로니가 관찰됨으로서, 폴리(dA:dT) 서열에 (dB:dB’)가 1개 이상 도입된 경우 폴리(dA:dT) 서열 전체 길이 186개까지는 안정성이 유지됨을 확인하였다. 반면, (dB:dB’)가 전혀 삽입되지 않은 순수 폴리(dA:dT)로서 전체 서열 길이가 90개인 A90의 경우 재접종 후 폴리(dA:dT) 서열 길이가 유지된 콜로니가 전무하였다. 이를 통해 비-아데닌 염기쌍의 도입 없이는 E.coli에서 폴리(dA:dT) 구조가 유지될 수 없음을 확인하였다.
각 pDNA를 주형으로 IVT mRNA 제조
상기 실시예에서 제조한 pDNA 주형을 사용하여 인 비트로 전사(IVT)를 수행하여 IVT mRNA를 합성하였다. IVT를 수행함에 있어 상기 실시예에서 제조한 pDNA을 BsaI enzyme으로 선형화한 것을 주형으로 사용하였다. 구체적으로, pDNA을 효소와 섞은 혼합물을 37℃에서 1시간 반응시키고 난 후 65℃에서 20분간 효소를 비활성화시켰다. pDNA의 선형화를 위한 구체적인 혼합물의 조건은 하기 표 4에 나타내었다.
| pDNA | 1μg |
| 10x IV buffer | 1μl |
| Bsa I(20unit/) | μl |
| DW | μl |
| total | μl |
앞서, 상기 실시예에서 제조된 모든 pDNA는 poly(dA:dT)서열의 3’에 BsaI enzyme site가 도입되게 제조하였다. 따라서, BsaI 효소를 처리하여 선형화된 주형 DNA의 3’ 말단은 도입된 다양한 형태의 poly(dA:dT) 서열로 구성되어 있다.
상기 반응을 통해 선형화된 주형 DNA를 사용하여 T7 RNA 중합효소, rATP, rCTP, rGTP, rUTP (또는 pseudouridine-5’-triphosphate) 및 캡 유사체(cap analogue)를 포함하는 반응 용액(MEGAscript™ T7 Transcription Kit (Ambion, USA)을 사용하여 인 비트로 전사를 수행하고, DNA 분해효소(DNase) 처리로 주형 DNA를 제거하고 mRNA만을 회수하였다. 구체적으로, 반응용액을 튜브에 넣고 37℃에서 2시간 동안 배양한 뒤, Turbo DNaseI을 1μl 추가하여 37℃에서 15분간 반응시키고, 반응산물을 RNeasy Mini Kit(Qiagen, USA)을 사용하여 정제하였다. 반응용액을 구성하는 모든 성분 및 이의 용량, 농도는 하기 표 5와 같다. 이를 통해 합성된 mRNA는 캡 유사체를 전사 반응에 첨가함으로써 생산된 5’-cap을 5’말단에 포함하였다.
IVT mRNA의 단백질 발현 능력 평가
상기 실시예에서 제조한 서로 다른 poly(A) 테일을 가지는 IVT mRNA의 단백질 발현 능력을 확인하기 위해, HEK 293T 세포, Hela 세포, 또는 RAW 264.7 세포를 96-웰 플레이트에 웰당 2.5 x 104개 (HEK 293T 세포), 1 x 104개 (Hela 세포), 2 x 104개 (RAW 264.7 세포)로 시딩하고, 형질주입 시약(Lipofectamine™ 2000, Invitrogen, USA)을 사용하여 세포를 70ng mRNA/well의 용량의 각 IVT mRNA로 형질주입시켰다. 형질주입 후 시간별 세포 내 반딧불이 루시퍼라제 발현 효율을 루시퍼라제 어세이 시스템(Bright-Glo™ Ruciferase Assay System, Promega, USA)으로 측정하였다. 또한, EPO (erythropoietin)를 암호화하는 IVT mRNA의 형질 주입 후의 EPO의 발현을 측정하기 위해서 형질 주입 24시간이 지난 후 세포 배양 media를 수거하여 Human EPO ELISA Kit (invitrogen, BMS2035-s)를 이용하여 ELISA assay를 수행하였다.
폴리(dA:dT) 서열 사이에 (dB:dB’)가 삽입된 벡터를 주형으로 하여 제조된 IVT mRNA의 폴리 (A) 서열은 상응하는 (dB:dB’) 수 만큼의 비-아데닌 염기가 삽입되게 된다. 아울러, 30개 아데닌 및 70개 아데닌의 연속 서열 사이에 10개의 비-아데닌과 아데닌의 혼성 서열이 삽입된 IVT mRNA인 A30LA70를 양성 대조군으로 사용하였다.
변이 염기(pUTP)가 포함된 IVT mRNA의 293T 세포에서의 발현 분석
도 3a에서 보는 바와 같이, 18시간 경과 후 본 발명의 변형 폴리 (A) 서열을 가지면서 변이 염기인 pUTP(pseudouridine)를 포함하는 IVT mRNA의 단백질 발현능은 종래에 성공적인 폴리 (A) 서열로서 보고된 A30LA70 대비 동등하거나 우수함을 확인할 수 있었다. 특히, 연속된 아데닌 서열 사이에 1개씩의 비-아데닌이 혼입된되고 폴리(A) 테일의 전체 길이가 76-186개인 본 발병의 IVT mRNA는 A30LA70 대비 동등하거나(A(10)G(1)-76) 현저히 우수하였다(A(10)G(1)-142 및 A(10)G(1)-186).
폴리(A) 테일의 최적의 전체 길이에 대한 보다 정확한 탐색을 위해 추가적인 변형 폴리 (A) 서열로서 A(10)G(1)-109; A(10)G(1)-120; 및 A(10)G(1)-131을 포함시켜 상술한 방법과 동일한 과정으로 24시간 경과 후의 루시퍼라제 발현량을 분석한 결과, 폴리(A) 테일의 전체 길이가 109 - 186개의 범위에서 양성 대조군인 A30LA70를 크게 능가하는 발현 효율을 나타내었다(도 3b).
아울러, 본 발명의 변형 폴리 (A) 서열을 가지면서 IVT mRNA의 단백질 발현능을 시간대 별(5, 9, 18, 26, 48, 72 및 96시간)로 측정한 결과, 다양한 측정 시점에서도 일관되게 양성 대조군인 A30LA70 대비 본 발명의 변형 폴리(A) 서열의 단백질 발현능이 동등하거나 우수함을 추가적으로 확인하였으며(도 3c), 시간대 별 루시퍼라제 발현양의 측정 결과의 AUC(area under the curve) 값은 도 3d에 나타내었다.
비변형 IVT mRNA의 Hela 및 293T 세포에서의 발현 분석
변이 염기의 포함 여부에 따른 발현 효율 변화를 다각적으로 검증하기 위하여, 본 발명자들은 pUTP로 변형되지 않은 다양한 길이의 IVT mRNA 각각 0.7μg/ml를 Hela 세포에 리포펙타민 2000을 이용하여 형질도입한 뒤 24시간 후 단백질의 발현량을 측정하였다. 그 결과, Hela 세포에서도 우수한 발현 효율을 보여 모든 길이에서 양성 대조군인 A30LA70 대비 동등하거나 우수함을 확인할 수 있었다(도 3e). 이를 통해 pseudouridine 등의 변이 염기가 적용되지 않아도 본 발명의 변형 폴리(A) 테일을 가지는 IVT mRNA은 현저히 우수한 단백질 발현 효율을 보이며, 폴리(A) 테일의 전체 길이가 109-186개인 경우 A30LA70 대비 동등 이상의 발현능을 보임을 알 수 있었다.
변형 IVT mRNA의 Hela 및 RAW 264.7 세포에서의 발현 분석
숙주 세포에 따른 발현 효율 변화를 다각적으로 검증하기 위하여, 본 발명자들은 Hela 세포와 RAW 264.7 세포에 pUTP를 포함하는 다양한 길이의 변형 IVT mRNA 각 0.7μg/ml를 리포펙타민 2000을 이용하여 형질도입한 뒤 24시간 후 단백질 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 3f에서 보는 바와 같이 모든 길이에서 높은 루시퍼라제 발현 수준을 보였으며, 특히 폴리(A) 테일의 전체 길이가 109-186개인 경우 A30LA70 대비 동등 이상의 발현능이 관찰됨으로써, 본 발명의 변형 폴리(A) 테일-도입 IVT mRNA는 세포의 종류에 따른 발현 편차 없이 다양한 세포에서 우수한 효능을 일관되게 발휘함을 알 수 있었다.
변형 IVT mRNA의 EPO 발현 분석
표적 단백질의 종류에 따른 발현 효율 변화를 다각적으로 검증하기 위하여, 본 발명자들은 루시퍼라제가 아닌 EPO(erythropoietin)를 인코딩하는 IVT mRNA 각 각 0.7μg/ml를 Hela 세포에 리포펙타민 2000을 이용하여 형질도입한 뒤 24시간 후 각 폴리(A) 구조에 따른 상대적 단백질 발현량을 분석하였다. 그 결과, 도 3g에서 보는 바와 같이 실험된 모든 길이에서 높은 EPO 발현 수준을 보였으며, 특히 A30LA70 대비 동등하거나(A(10)G(1)-76), 현저히 우수한 발현능을 보였다(‘A(10)G(1)-120, A(10)G(1)-131, A(10)G(1)-142).
삽입되는 비-아데닌 염기의 수에 따른 안정성 및 단백질 u현 효율 평가
본 발명자들은 10개 내지 30개의 폴리(dA:dT) 서열마다 비-아데닌 염기 및 이의 상보염기(dB:dB’)가 1개씩(m=1) 또는 2개가 연속되어(m=2) 도입되었을 때 각각 E. coli 에서의 폴리(dA:dT) 서열 구조의 안정성을 확인하고자 하였다. E.coli 스톡을 고체배지에 재접종하여 배양한 후 형성된 여러 개의 단일 콜로니의 배양액에서 추출한 DNA에 대해 생어 시퀀싱을 수행한 결과, 폴리(dA:dT) 서열에 (dB:dB’)가 1개씩 (m=1) 도입되었을 때 보다 2개씩 연속적(m=2)으로 도입되었을 때 더 안정하게 유지됨을 확인하였다(도 4a). 구체적으로, A(30)G(1)에 비해 A(30)G(2)의 구조가 보다 안정적으로 유지되었다.
아울러, 본 발명자들은 폴리(dA:dT) 서열 내에 (dB:dB’)의 도입 개수에 따른 IVT mRNA의 단백질 발현 효율을 비교하고자 하였다. 폴리(dA:dT) 서열 사이에 1개 또는 2개의 연속적인 (dB:dB’)가 삽입된 벡터를 주형으로 하여 제조된 IVT mRNA의 폴리 (A) 서열은 상응하는 (dB:dB’) 수 만큼의 비-아데닌 염기가 삽입되게 되며, 루시퍼라제 어세이 결과 폴리(dA:dT) 서열에 (dB:dB’)가 2개씩 연속적(m=2)으로 도입되었을 때 보다 1개씩 (m=1) 도입되었을 때 IVT mRNA의 단백질 발현 효율이 더 높음을 확인하였다(도 4b). 이는 (dB:dB’)가 1개씩(m=1) 도입된 벡터보다 2개씩 연속(m=2)으로 도입된 벡터가 E. coli에서의 폴리(dA:dT) 서열 구조 안정성은 높지만 이를 주형으로 제조된 IVT mRNA의 단백질 발현능은 m=1에 비해 m=2가 떨어짐을 보여주는 결과이다.
삽입되는 비-아데닌 염기 간의 거리에 따른 안정성 및 단백질 발현 효율 평가
본 발명자들은 폴리(dA:dT) 서열 내에 삽입되는 비-아데닌 염기 및 이의 상보염기 간의 거리, 즉 (dB:dB’) 사이에 존재하는 연속되는 폴리(dA:dT)의 서열 길이(n=10, 15, 30)에 따른 E. coli에서의 폴리(dA:dT) 서열 구조 안정성을 평가하고자 하였다. E.coli 스톡을 고체배지에 재접종하여 배양한 후 형성된 여러 개의 단일 콜로니에서의 폴리(dA:dT) 서열 길이를 생어 시퀀싱을 통해 확인한 결과, 동일한 전체 길이의 폴리(dA:dT)에서 (dB:dB’)들 사이에 위치하는 연속되는 폴리(dA:dT)의 서열 길이가 길어질수록 안정성이 떨어짐을 확인하였다(도 5a).
아울러, 본 발명자들은 폴리(dA:dT) 서열 내에 삽입된 (dB:dB’) 사이에 존재하는 연속되는 폴리(dA:dT)의 서열 길이(n=5, 10, 15, 20)에 따른, 상응하는 IVT mRNA의 단백질 발현 효율을 비교하였다. 루시퍼라제 어세이 결과 폴리(dA:dT) 서열에 (dB:dB’)가 1개씩(m=1) 존재할 경우 5≤n≤20일 때 효율적으로 단백질을 발현하였으며 특히 n=10일 때 단백질 발현량이 가장 높았다(도 5b).
비-아데닌 서열 사이에 삽입되는 폴리(dA:dT) 서열의 최적의 길이에 대한 보다 구체적인 탐색을 위해 추가적으로 A(5)G(1)-142; A(8)G(1)-142; 및 A(10)G(1)-142에 대해 상술한 방법과 동일한 과정으로 24시간 경과 후의 루시퍼라제 발현량을 분석한 결과, n=8인 A(8)G(1)-142가 가장 높은 단백질 발현량을 보였으며, 이를 통해 5≤n≤10일 때 단백질 발현량이 극대화됨을 알 수 있었다(도 5c).
삽입되는 비-아데닌 염기의 종류에 따른 안정성 및 단백질 발현 효율 평가
본 발명의 변형 폴리 (A) 구조 내 아데닌 염기 사이에 도입된 비-아데닌 염기와 이의 상보의 염기의 종류에 따른 E. coli에서의 벡터 내 폴리(dA:dT) 서열 구조의 안정성을 평가하고자, 폴리(dA:dT) 서열 구조의 총 길이와 안정성이 확인된 E.coli 스톡을 고체배지에 재접종하여 배양한 후 형성된 여러 개의 단일 콜로니에서의 폴리(dA:dT) 서열 길이 유지여부를 확인하였다(도 6a). 도 6a의 붉은 선은 E.coli 스톡에서 확인된 폴리(dA:dT) 서열의 길이를 나타낸다. E. coli 스톡의 재접종 후 형성된 콜로니의 콜로니 PCR 후 확인된 폴리(dA:dT) 서열 길이가 안정하게 유지되었을 시 붉은 선 상에 dot가 위치하게 되며, 폴리(dA:dT) 서열 길이가 안정하게 유지되지 않고 짧아지면 붉은 선 아래 dot가 위치하게 된다. 폴리(dA:dT) 서열 길이는 콜로니의 액체 배양을 진행한 후 DNA를 추출하여 생어 시퀀싱(sanger sequencing)으로 재확인하였다. 그 결과, 폴리(dA:dT) 서열 내 아데닌 염기 중간중간에 비-아데닌 염기와 이의 상보염기로 (dG:dC)가 일괄적으로 도입된 구조는 높은 안정성을 보여준 데 반해, (dC:dG)나 (dT:dA)가 일괄 도입된 구조는 폴리(dA:dT) 서열 구조의 안정성을 개선시키지 못함을 관찰하였다. 이를 통해, 한 가지 종류의 비-아데닌 염기와 이의 상보염기를 폴리(dA:dT)에 도입시킬 시, (dG:dC)가 도입된 경우 폴리(dA:dT) 서열 구조를 효율적으로 안정화시킬 수 있음을 확인하였다. 하지만, (dC:dG) 또는 (dT:dA)가 일괄 도입되어 낮아진 폴리(dA:dT) 서열 구조의 안정성은 비-아데닌 염기 영역을 (dC:dG)와 (dG:dC)를 교차하여 배치하거나 (dT:dA)와 (dG:dC)를 교차하여 배치할 경우 다시 개선됨을 확인하였다. 이는, 비-아데닌 염기와 이의 상보염기로 (dC:dG)나 (dT:dA)를 폴리(dA:dT)에 도입시키고자 할 때, (dG:dC)의 혼입이 벡터 안정성을 개선시킬 수 있음을 나타낸다. 이는, 폴리(dA:dT) 서열 구조의 안정성을 높이기 위한 목적으로 비-아데닌 염기를 도입함에 있어 그 종류와 도입패턴에 따라 폴리(dA:dT) 서열 구조 안정성이 달라질 수 있음을 의미한다.
비-아데닌 염기 및 이의 상보염기(dB:dB’)가 1개씩(m=1) 도입된 경우의 단백질 발현 효율을 비교하고자 루시퍼라제 어세이를 수행하였다. 변형 폴리(dA:dT) 서열을 도입한 벡터를 주형으로부터 전사된 IVT mRNA의 poly (A) 테일 구조는 중간중간 비-아데닌이 1개씩 혼입되게 되며, 상기 IVT mRNA가 루시퍼라제를 암호화하도록 설계하여 발현량을 분석한 결과, 폴리(A) 서열의 아데닌 염기 사이에 비-아데닌 염기로 G, C 또는 U가 1개씩 도입된 IVT mRNA는 비슷한 정도의 발현양을 보이는 것을 확인하였으나, 비-아데닌 염기로 G/C를 교차 도입시키거나, G/U를 교차도입시킬 경우 단일 종류의 비-아데닌 염기를 일괄 도입시킨 IVT mRNA에 비해 발현 효율이 보다 더 향상되는 것을 관찰하였다(도 6b). 이를 통해 폴리(dA:dT) 서열에 비-아데닌 염기를 단일 염기가 아닌 다양한 종류를 도입할 경우 단백질 발현능이 추가적으로 개선되는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (19)
- 70개 내지 230개의 염기를 포함하며, 아데닌과 비-아데닌(non-A) 염기의 비(ratio)가 3:1 내지 30:1인 변형된 폴리아데닌 서열(modified poly-adenyl sequence)을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 3개 내지 30개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개 내지 3개가 연속적으로 위치하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제 3 항에 있어서, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개 또는 2개가 연속적으로 위치하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제 1 항에 있어서, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 5:1 내지 30:1인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 제 5 항에 있어서, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 3:1, 5:1, 8:1, 10:1, 10:2, 10:3, 15:1, 15:2, 20:1, 30:1 및 30:2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드.
- 발현조절서열; 상기 발현조절서열과 작동적으로 연결된 전사 가능 뉴클레오타이드 서열; 및 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 변형된 폴리아데닌 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 DNA 분자.
- 제 7 항에 있어서, 상기 발현조절서열은 T7 프로모터, T3 프로모터 및 SP6 프로모터로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 DNA 분자.
- 제 7 항의 DNA 분자로부터 전사된 RNA 분자.
- 제 9 항에 있어서, 상기 RNA 분자 중 우라실(U)의 전체 또는 일부가 하기 화학식 1로 표시되는 변형된 U(modified U)로 치환된 것을 특징으로 하는 RNA 분자:
화학식 1
상기 화학식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는 C1-C3 알콕시이고, X 및 A는 탄소 또는 질소이며 서로 상이하고, 는 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다.
- 다음을 포함하는 mRNA 분자:
(a) 목적 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및
(b) 70개 내지 230개의 염기를 포함하며, 아데닌과 비-아데닌(non-A) 염기의 비(ratio)가 3:1 내지 30:1인 변형된 폴리아데닌 서열(modified poly-adenyl sequence).
- 제 11 항에 있어서, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 3개 내지 30개의 연속적인 아데닌 서열 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 mRNA 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개 내지 3개가 연속적으로 위치하는 것을 특징으로 하는 mRNA 분자.
- 제 13 항에 있어서, 상기 비-아데닌(non-A) 염기는 연속적인 아데닌 서열 사이에 1개 또는 2개가 위치하는 것을 특징으로 하는 mRNA 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 5:1 내지 30:1인 것을 특징으로 하는 mRNA 분자.
- 제 15 항에 있어서, 상기 아데닌과 비-아데닌 염기의 비는 3:1, 5:1, 10:1, 10:2, 10:3, 15:1, 15:2, 20:1, 30:1 및 30:2로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 mRNA 분자.
- 제 11 항에 있어서, 상기 RNA 분자 중 우라실(U)의 전체 또는 일부가 하기 화학식 1로 표시되는 변형된 U(modified U)로 치환된 것을 특징으로 하는 mRNA 분자:
화학식 1
상기 화학식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, C1-C3 알킬 또는 C1-C3 알콕시이고, X 및 A는 탄소 또는 질소이며 서로 상이하고, 는 단일결합 또는 이중결합을 나타낸다.
- 제 7 항의 DNA 분자, 제 9 항의 RNA 분자 또는 제 11 항의 mRNA 분자를 포함하는 면역원성 조성물.
- 제 18 항의 면역원성 조성물을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물.
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