JP7277506B2 - Rnaの安定化のための3’utr配列 - Google Patents
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Description
(a) プロモーター;
(b) 転写可能な核酸配列又は転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列;並びに
(c) 転写中の3’非翻訳領域を、プロモーター(a)の制御下で転写される際にコードする核酸配列であって、前記3’非翻訳領域が以下からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸配列:
(c-1) FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-2) LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-3) CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-4) AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-5) PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-6) MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-7) HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
並びに
(c-8) (c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)及び(c-7)の2つ以上の核酸配列、断片及び/又は変異体の任意の組み合わせ。
(a) 5’非翻訳領域;
(b) ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列;並びに
(C) 以下からなる群より選択される核酸配列を含む3’非翻訳領域:
(c-1) FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-2) LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-3) CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-4) AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-5) PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-6) MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-7) HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
及び
(c-8) (c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)及び(c-7)の2つ以上の核酸配列、断片及び/又は変異体の任意の組み合わせ。
(i) 本発明の核酸分子を提供すること、及び
(ii) 核酸分子を鋳型として用いてRNAを転写すること
を含む、RNAを得る方法に関する。
(i) 本発明のRNAを得る方法に従って、ペプチド又はタンパク質をコードするRNAを得ること、及び
(ii) RNAを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法に関する。
(I) 転写される際に3’非翻訳領域をコードする核酸配列(b)を、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む転写可能な核酸配列(a)の3’末端でカップリングすること、及び
(ii) 得られた核酸を転写すること
を含み、
前記3’非翻訳領域が、
(b-1) FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-2) LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-3) CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-4) AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-5) PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-6) MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-7) HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
及び
(b-8)(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)及び(b-7)の2つ以上の核酸配列、断片及び/又は変異体の任意の組み合わせ
からなる群より選択される核酸配列を含む、RNAを得る方法に関する。
(i) 本発明のRNAを得る方法によりRNAを得ること、及び
(ii) RNAを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法に関する。
第1のドメインは、抗原を認識して結合する結合ドメインである。
第2のドメインは、共刺激ドメインである。共刺激ドメインは、標的部分へのCARの結合の際の細胞傷害性リンパ球の増殖及び生存を増強する働きをする。共刺激ドメインの同一性は、それがCARによる標的部分の結合の際に細胞増殖及び生存を増強する能力を有する点のみに限定される。適切な共刺激ドメインには、腫瘍壊死因子(TNF)受容体ファミリーのメンバーであるCD28、CD137(4-1BB)、TNFR受容体のスーパーファミリーのメンバーであるCD134(OX40)、及び活性化T細胞上に発現されるCD28スーパーファミリーの共刺激分子であるCD278(ICOS)が含まれる。当業者は、本発明に悪影響を及ぼすことなく、前記共刺激ドメインの配列変異体を使用することができ、変異体がモデル化されるドメインと同じか又は同様の活性を有することを理解するであろう。このような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約80%の配列同一性を有するであろう。本発明のいくつかの実施態様において、CARコンストラクトは、2つの共刺激ドメインを含む。特定の組み合わせは4つの上記ドメインのすべての可能な変形を含むが、特定の例には、CD28+CD137(4-1BB)及びCD28+CD134(OX40)が含まれる。
第3のドメインは、活性化シグナル伝達ドメイン(又はT細胞シグナル伝達ドメイン)である。活性化シグナル伝達ドメインは、CARと抗原との結合の際に細胞傷害性リンパ球を活性化する働きをする。活性化シグナル伝達ドメインの同一性は、それがCARによる抗原の結合の際に、選択された細胞傷害性リンパ球の活性化を誘導する能力を有する点のみに限定される。適切な活性化シグナル伝達ドメインには、T細胞CD3[ゼータ]鎖及びFc受容体ガンマ]が含まれる。当業者は、本発明に悪影響を及ぼすことなく、前記活性化シグナル伝達ドメインの配列変異体を使用することができ、変異体がモデル化されるドメインと同じか又は同様の活性を有することを理解するであろう。このような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約80%の配列同一性を有するであろう。
[実施態様1]
転写の5’ → 3’方向に、
(a) プロモーター;
(b) 転写可能な核酸配列又は転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列;並びに
(c) 転写物中の3’非翻訳領域を、プロモーター(a)の制御下で転写される際にコードする核酸配列であって、前記3’非翻訳領域が以下からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸配列:
(c-1) FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-2) LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-3) CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-4) AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-5) PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-6)MT-RNR1の非コードRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-7) HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
及び
(c-8) (c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)及び(c-7)の2つ以上の核酸配列、断片及び/又は変異体の任意の組み合わせ
を含む核酸分子。
[実施態様2]
プロモーター(a)の制御下にある核酸配列(b)及び(c)が、転写されて、転写可能な核酸配列(b)から転写された核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに、核酸配列(c)から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる、実施態様1に記載の核酸分子。
[実施態様3]
AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-4)が、配列番号86から89より選択される核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様1又は2に記載の核酸分子。
[実施態様4]
AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-4)が、配列番号86の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様1から3のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様5]
MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-6)が、配列番号105から121より選択される核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様1から4のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様6]
MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-6)が、配列番号115の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様1から5のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様7]
核酸配列(c-8)が、(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)及び(c-7)の2つ以上の同じか又は異なる核酸配列、断片及び/又は変異体の組み合わせを含む、実施態様1から6のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様8]
核酸配列(c-8)が、AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-4)と、MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-6)との組み合わせを含む、実施態様1から7のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様9]
AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-4)が、MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-6)に対して5’に位置する、実施態様8に記載の核酸分子。
[実施態様10]
AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-4)と、MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片(c-6)との組み合わせが、配列番号174の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様8又は9に記載の核酸分子。
[実施態様11]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、プロモーター(a)の制御下で転写される際にコードする核酸配列(d)をさらに含む、実施態様1から10のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様12]
前記ポリアデニル配列が、少なくとも20個のAヌクレオチド、好ましくは少なくとも40個、少なくとも80個、少なくとも100又は少なくとも120個のAヌクレオチド、好ましくは連続Aヌクレオチドを含む、実施態様11に記載の核酸分子。
[実施態様13]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、2個以上の連続ヌクレオチドの、好ましくは任意の配列であり、2個以上の連続ヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドが、Aヌクレオチド以外のヌクレオチドである、実施態様11又は12に記載の核酸分子。
[実施態様14]
前記核酸配列(d)が、ヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含むポリアデニル配列である核酸配列を、プロモーター(a)の制御下で転写される際にコードする核酸配列であり、かつ、大腸菌内で前記核酸分子が増殖すると、Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含むポリアデニル配列である前記核酸配列と同じ長さのポリアデニル配列を、プロモーター(a)の制御下で転写される際にコードする核酸配列(d)’を前記核酸配列(d)の代わりに含む核酸分子と比較して、より高い安定性を示す、実施態様11から13のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様15]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列が、少なくとも80個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも90又は100個のヌクレオチドを含む、実施態様11から14のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様16]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、前記ポリアデニル配列の21位から80位、好ましくは21位から60位、さらに好ましくは31位から50位の領域内に位置する、実施態様11から15のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様17]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、前記ポリアデニル配列中の少なくとも20個のA残基の前及び/又は後ろにある、実施態様11から16のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様18]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも8個、好ましくは少なくとも10個、さらに好ましくは少なくとも15個のヌクレオチドの長さを有する、実施態様11から17のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様19]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、50個以下、好ましくは30個以下、さらに好ましくは20個以下のヌクレオチドの長さを有する、実施態様11から18のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様20]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、3個を超えない、好ましくは2個以下の、好ましくは連続していないA残基を含む、実施態様11から19のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様21]
プロモーター(a)の制御下にある核酸配列(b)、(c)及び(d)が、転写されて、共通転写物を生じることができる、実施態様11から20のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様22]
核酸配列(c)及び任意選択的に(d)から転写された核酸配列が、転写可能な核酸配列(b)から転写された核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに活性である、実施態様21に記載の核酸分子。
[実施態様23]
転写物中、Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列が3’末端に位置する、実施態様11から22のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様24]
閉環状分子又は線状分子である、実施態様1から23のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様25]
転写可能な核酸配列が、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列が、マルチクローニングサイトである、実施態様1から24のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様26]
(i)レポーター遺伝子;(ii)選択マーカー、及び(iii)複製開始点からなる群より選択される1以上の要素をさらに含む、実施態様1から25のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様27]
特に線状化後、RNA、特にmRNAのin vitro転写に適している、実施態様1から26のいずれか一項に記載の核酸分子。
[実施態様28]
鋳型として実施態様1から27のいずれか一項に記載の核酸分子を用いる転写、特にin vitro転写により得られるRNA。
[実施態様29]
5’ → 3’方向に、
(a) 5’非翻訳領域;
(b) ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列;並びに
(C) 以下からなる群より選択される核酸配列を含む3’非翻訳領域:
(c-1) FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-2) LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-3) CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-4) AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-5) PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-6) MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(c-7) HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
及び
(c-8) (c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)及び(c-7)の2つ以上の核酸配列、断片及び/又は変異体の任意の組み合わせ
を含む、RNA。
[実施態様30]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列(d)をさらに含む、実施態様29に記載のRNA。
[実施態様31]
前記核酸配列(d)が前記RNAの3’末端に位置する、実施態様30に記載のRNA。
[実施態様32]
核酸配列(c)及び任意選択的に(d)が、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに活性である、実施態様29から31のいずれか一項に記載のRNA。
[実施態様33]
5’キャップ(e)をさらに含む、実施態様29から32のいずれか一項に記載のRNA。
[実施態様34]
(i)実施態様1から27のいずれか一項に記載の核酸分子を提供すること、及び
(ii)鋳型として前記核酸分子を用いてRNAを転写すること
を含む、RNAを得る方法。
[実施態様35]
(i) 実施態様34の方法に従って、ペプチド又はタンパク質をコードするRNAを得ること、及び
(ii) 前記RNAを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
[実施態様36]
核酸分子の転写の前に、核酸分子の切断をさらに含むことを特徴とする、実施態様34又は35に記載の方法。
[実施態様37]
(i) 転写される際に3’非翻訳領域をコードする核酸配列(b)を、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む転写可能な核酸配列(a)の3’末端でカップリングすること、及び、
(ii) 得られた核酸を転写すること
を含み、
前記3’非翻訳領域が、
(b-1) FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-2) LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-3) CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-4) AESの3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-5) PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-6) MT-RNR1のノンコーディングRNAの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
(b-7) HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片;
及び
(b-8) (b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)及び(b-7)の2つ以上の核酸配列、断片及び/又は変異体の任意の組み合わせ
からなる群より選択される核酸配列を含む、RNAを得る方法。
[実施態様38]
核酸配列(a)及び(b)が、転写されて、転写可能な核酸配列(a)から転写された核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに、核酸配列(b)から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる、実施態様37に記載の方法。
[実施態様39]
Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、1個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、転写される際にコードする核酸配列(c)を、核酸配列(b)の3’末端でカップリングすることをさらに含む、実施態様37又は38に記載の方法。
[実施態様40]
核酸配列(a)、(b)及び(c)が、転写されて、転写可能な核酸配列(a)から転写された核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに、核酸配列(b)及び任意選択的に(c)から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる、実施態様39に記載の方法。
[実施態様41]
実施態様37から40のいずれか一項に記載の方法によってRNAを得ること、及び
(ii)前記RNAを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
[実施態様42]
転写がin vitroで行われる、実施態様34から41のいずれか一項に記載の方法。
[実施態様43]
実施態様34、36から40及び42のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるRNA。
[実施態様44]
実施態様28から33及び43のいずれか一項に記載のRNAを翻訳することを含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
[実施態様45]
宿主細胞をトランスフェクトするための、実施態様28から33及び43のいずれか一項に記載のRNAの使用。
[実施態様46]
宿主細胞が抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球又はマクロファージである、実施態様45に記載の使用。
[実施態様47]
ワクチン接種のための、実施態様28から33及び43のいずれか一項に記載のRNAの使用。
[実施態様48]
体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラミングするための、実施態様28から33及び43のいずれか一項に記載のRNAの使用。
本発明者らは、mRNAを安定させる新規配列要素を同定するために、in vitro転写RNAの選択的環境としてhiDCを用いるin vivo選択プロセスを開発した。出発RNAライブラリーは、hiDC由来の天然に存在するmRNA配列を用いて構築した。RNA単離の前に、細胞を、転写阻害剤アクチノマイシンD(ActD)の存在下で5時間増殖させて、安定したRNAを予め選択した。その後、残りのmRNAを抽出し、200~800ヌクレオチドの断片に短縮し、逆転写し、hAg 5’UTR配列と、選択プロセスの基礎として選択されたレポーター遺伝子とを有するベクター中で、3’-UTRとしてクローン化した。それに続くライブラリーのmRNA転写に使用されるDNA鋳型をPCRで増幅し、その間に5’プライマーを介しT7プロモーターを、3’プライマーを介しA60ポリAテールを導入した。次いで、数ラウンドのライブラリーのin vitro転写の、対応するRNAのhiDCへのエレクトロポレーション、及び規定の時点後の安定した配列の抽出および増幅からなるin vitro選択プロセスに、転写されたmRNAを導入した。選択配列の増幅は、cDNA合成後、特異的プライマーを用いるPCRで行った。それに続いて、得られたPCR産物を新たなmRNAライブラリーの鋳型として使用した。これは、残りのRNAをラウンド1では24時間後、ラウンド2と3では48時間後、ラウンド4と5では72時間後、最後にラウンド6では96時間後、1週間後及び2週間後(エレクトロポレーションの際に細胞を3つの部分に分け、所定の時点で個別に収穫した)に抽出して、6ラウンド行われた。
1から5ラウンド後の選択プロセスのモニタリングは、対応するRNAプールの平均半減期の有意な増加を示したが、これは、安定化3’-UTR要素の濃縮を示す(表1)。しかし、安定性の増加は、後のラウンドになるほど顕著ではなかった。したがって、RNAを96時間後、1週間後及び2週間後に細胞から抽出した最後の第6ラウンドの後、選択プロセスを停止した。選択配列を特徴付けるために、350個を超える個々のクローン、すなわち第5ラウンドから108個、第6/96時間ラウンドから88個、第6/1週間ラウンドから110個、及び第6/2週間ラウンドから96個を配列決定した。それらのゲノム起源を同定するために、すべての配列を互いに比較し、BLAST処理した。ここでは特に、配列が内因性の5’-又は3’UTRに由来するのか、又はコード領域に由来するのかを検討した。最後に、hiDCにおける発現レベルをNextBio(Illumina)からダウンロードした。全部で、7つの群を同定することができ、それらは、(i)複数の配列が見出されたもの、(ii)内因性RNAの3’UTRに由来するか、又は内因性非コードRNAに由来するもの、及び(iii)hiDCにおいて明確に発現したものであった(表2)。これらは、次の遺伝子に由来する:IgGのFc断片、受容体、輸送体、アルファ(B、FCGRT、NM_001136019)、リンパ球特異的タンパク質1(D、LSP1、NM_002339)、ケモカインリガンド22(Chemokine ligand 22)(E、CCL22、NM_002990)、スプリットのアミノ末端エンハンサー(F、AES、NM_198969)、ホスホリパーゼDのファミリーメンバー3(G、PLD3、NM_001031696)、ミトコンドリアコード化12SRNA(I、MT_RNR1、NC_012920)、主要組織適合複合体クラスII DRベータ4(J、HLA-DRB4、NM_021983)。簡潔にするために、以下では、これらの要素の略語として括弧内の大文字BからIを使用することに留意されたい。重要なこととして、すべての場合において、ある1つの配列を有する複数のクローンは、正確な5’及び3’末端が異なり、これは、それらが異なる開始クローンに由来し、プロセス中に単に人工的に濃縮されているわけではないことを証明している(スクリーニングで同定された完全な配列表については、別添を参照のこと)。
同定した配列要素の特徴付けのために、各群の代表候補が1つ選択された(配列の詳細は別添に記している)。次いで、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するベクター中で3’-UTRとして、この配列をクローン化した。このルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルは、細胞への移行時に経時的に分析することができる。タンパク質について観察された発現パターンから、RNAの相対的安定性及び翻訳効率が正確に推測され得ることが以前に証明されている(Kuhn 2010 Gene Ther)。この実験で使用した特異的レポーターluc2CPmutは、不安定化した形態のルシフェラーゼ(Promega)である。これにより、RNAの安定性のわずかな変化さえも検出することが可能になる。その後、これらのベクターに由来するin vitro転写RNAを、RNA安定性及び翻訳効率に関して、本発明者らの至適基準mRNA、すなわち2hBg 3’-UTRを含有するものと比較した。コントロールサンプルとして、3’-UTRを含まないin vitro転写RNA(すなわち、インサートをクローニングするために使用される配列のみを含有する)及び、単一のベータグロビン要素のみを有するもの(1hB)を使用した。
UTR含有ベクターから開始して、転写される領域を、T7プロモーターを含有する5’プライマーと、60ヌクレオチドのポリ(A)テールを有する3’プライマーとを用いてPCRにより増幅した。AGENCOURT AMPURE XP(Beckman Coulter)を用いて、PCR断片のクリーンナップを行った。0.6容量のビーズを、各PCR反応に加え、混合した。RT PCRでの15分間のインキュベーションの後、ビーズに結合したPCR産物を過剰のプライマー、ヌクレオチド、塩及び酵素から磁気スタンドによって分離した。ビーズを80%エタノールで30秒間2回洗浄して、不純物をさらに除去した。所望のPCR産物を最終的に30μLのddH2Oで2回溶出し、対応するRNAのin vitro転写用の鋳型として使用した。in vitro転写のために、T7 RNAポリメラーゼ(Fermentas)、それぞれの反応緩衝液及び6mMのNTPを使用した。RNAの効率的なキャッピングのために、GTP濃度を1.5mMに低下させ、6mMのβ-S-ARCA(D2)を反応物に添加し、37℃で2.5時間インキュベートした。RNAをカルボキシル化磁気ビーズ(Invitrogen)によって精製し、2100Bionanalyzer(Agilent)での分光測光及び分析によりRNA濃度及び品質を評価した。
すべての新たな配列は、スクリーニング手法でのそれらの同定と一致して、RNA安定性に関して2hBgと比較して、それと非常に類似した特性を示した(最高がI群(mtRNR1))(図3;表3)。重要なこととして、各個々の要素は、3’-UTRを含まないRNAと比較しても、さらにベータグロビン要素の単一コピーのみを有するRNAと比較しても、RNA安定化を与えた。翻訳効率は、RNA安定性と経時的に発現した総タンパク質との間の直接的な相関関係によって観察されるように、有意な影響を受けなかった。
さらなる実験では、各群の単一の配列を対にして互いに組み合わせた(図2)。この背後にある理論的根拠は、2つの3’-UTRの組み合わせがRNAの安定性及び翻訳効率にさらなる効果を及ぼすという、本発明者らの以前の所見であった(Holtkamp et al. 2006)。RNAの安定性及び翻訳効率は、測定されたルシフェラーゼ値をスプラインで補間することによって算出し、このスプラインの最も急な上昇勾配を、翻訳効率及び安定性としてのシグナルの半減期として定義した。補間したスプラインの積分は、総タンパク質発現と解釈される。合計で64の組み合わせ、すなわち7つの新たに同定された配列及びヒトベータグロビン3’-UTRの、可能な全組み合わせをクローン化した(表6)。上記のように、これらの鋳型DNAからRNAを調製し、その後hiDCにエレクトロポレーションした。コントロールとして、個々の要素を含有するRNAも含めた。7つの新たな要素の大部分について、他の要素との少なくとも1つの組み合わせが、単一の要素よりも高い安定性を有するRNAを与えることが観察された(表7から表13)。興味深いことに、殆どの場合、I要素(mtRNR1)との組み合わせがRNAの半減期を増加させた。ここで、このRNAの安定性は、2hBg 3’-UTRを有するRNAと比較して、概して高かった(表7から表13)。殆どすべての組み合わせが、RNAの翻訳効率にプラス効果を及ぼした。総じて、RNA安定性及び翻訳効率に対する組み合わせ効果は、総タンパク質発現の最大1.74倍の増加をもたらす。したがって、本発明者らは、安定性及び/又は翻訳効率が高まったRNAを生じる2つの異なる要素の組み合わせの他に、(233個ヌクレオチド未満の長さを有する)単一要素を同定することができたが、しかし同時に、2hBgに関して上述したような1つの要素の同一のコピーを2つ有することの問題を回避した。
不安定化した形態のルシフェラーゼで得られた結果を確認するために、先の実験を、標準的なルシフェラーゼ(Promega)と、次の選択された3’-UTR:mtRNR1(I)、mtRNR1-AES(IF)、AES-mtRNR1(FI)、mtRNR1-hBg(IhBg)及びhBg-mtRNR1(IhBg)を有するRNAで繰り返した。図4と表14に示すように、新たな要素が個々に又は組み合わさって、2hBg要素と同様にmRNA安定性及び/又は翻訳効率を高めることを立証する、上で観察されたのと同等の結果が得られた。
また、新たに選択された3’-UTR mtRNR1及びAESを、異なる細胞型及び細胞株においてhiDC特異性があるかどうかを調べるために試験した。これらの配列を、ヒト線維芽細胞(HFF)、マウス筋芽細胞(C2C12)(図5)、及びT細胞(図6)において試験し、配列がこれらの細胞においても安定化しているかどうかを評価した。
HFF及びC2C12細胞を採取し、エレクトロポレーション用に調製した。次に2.0μgのIVT-RNAを、示された3’UTRを含有する、GFPをコードする1.0μgのRNAと一緒にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を分割した。ウェルあたり5000個の細胞を合計7つの時点(2、4、8、24、48及び72時間)のために96ウェルプレートに三連で分配し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウェルあたり2E+05細胞を6ウェルプレートに播種し、24時間後にFACSで採取した(GFPシグナル)。これは、トランスフェクション効率のモニタリングを可能にした。トランスフェクション効率は、72から90%の間で異なっており、半減期の算出に組み込むことができた。HFF及びC2C12、並びにT細胞で得られた結果により、hiDCで以前に得られた結果が確認された。IとFとの組み合わせは特に、半減期に関して、2hBgと比較して2~3倍勝っていた。さらに、FIは、本発明者らの至適基準と比較して、経時的にC2C12細胞における3倍勝る翻訳効率及び2倍勝るタンパク質産生を示した。これらの結果は、I及びFはhiDC特異的ではないが、他の細胞におけるmRNA安定性及び翻訳効率も高めることを示した。
タンパク質補充療法を含むいくつかの用途では、修飾ヌクレオチドを有するmRNAが、その免疫原性の低さのために、非修飾mRNAよりも好ましい(Kariko et al., 2008)。しかしながら、塩基修飾は、対応するRNA結合タンパク質との相互作用に直接影響を及ぼすことによって、又はRNAの二次構造形成を変化させることによって、mRNAの安定性に効果を生じる可能性がある。したがって、選択された3’UTRは、修飾mRNAとの関連で異なる挙動を示すかもしれない。したがって、本発明者らは、FとIの組み合わせを、hiDC、HFF、CD8+及びCD4+T細胞において、また、マウスMEF、C2C12及びbmDCにおいて、m1Y修飾mRNAとの関連で、2hBgUTRと比較した。レポーターとして、ルシフェラーゼを使用した(コンストラクト設計については図7A参照)。修飾mRNAの生成のために、IVT反応において、Uをm1Yで完全に置換した。すべての実験において、非修飾RNAをコントロールとして含めた。得られたmRNAの完全性は、UTPとm1YTPとの交換によって影響されなかった(図7B)。表15に記載の設定を用いて細胞をエレクトロポレーションし、ルシフェラーゼレベルを3、6、12、24、48、72、96時間時点で測定した。
非修飾ルシフェラーゼmRNAのエレクトロポレーションは、以下のように、先に見られた効果を再現することができた。すべての細胞型で、FI要素は、RNA安定性を伝達することにおいて2hBgコントロールと同等又はそれに勝っていた(表16A)。マウスDC及びヒトT細胞において、mRNA半減期は、2つの3’UTR間で同等であったが、FI要素は、HFF細胞においてmRNA半減期を1.69倍まで増加させた。総タンパク質量は、すべての細胞株において増加し、HFF細胞で顕著であった(2.45倍)。
修飾mRNAについても、FI要素は、hiDCにおける2hBgと比較したmRNA半減期の増加をもたらし、総タンパク質量は2倍を超えて増加した(表16B)。他の細胞型の結果も、以下のように、非修飾mRNAで得られた結果と同様である。FI要素は、HFF、MEF及びC2C12細胞に関するすべての実験において、2hBgに勝り、T細胞及びマウスDCにおいては同等であった(表16B)。したがって、U修飾は、FI要素がmRNAを安定化する能力を変化させない。
これまで、トランスフェクション法としてエレクトロポレーションを用いてすべての実験を行った。エレクトロポレーションでは、送達されるmRNAは、リポフェクションによるトランスフェクションの際に採られるエンドソーム取り込み経路を回避して、細胞質に直接到達する。FI要素がこれらの条件下でも機能するかどうかを確認するために、トランスフェクション試薬としてRNAiMAXを用い、先の実験で使用したのと同じFI及び2hBg含有ルシフェラーゼmRNAで細胞をリポフェクションした。リポフェクションでも、FI要素はルシフェラーゼ発現を増加させたが、RNAがエレクトロポレーション(タブ16C)により送達された実験と比較して増加はあまり顕著ではなかった(表16C)。したがって、トランスフェクション法は、FI要素の安定化効果に影響を及ぼさない。
in vivoでのFI 3’UTRを含有するmRNAからのタンパク質発現を評価するために、先の実験で使用したのと同じFI及び2hBg含有ルシフェラーゼmRNAをF12を用いて製剤化し、BALB/cマウスにi.v.で投与した。図8に示すように、ルシフェラーゼ発現は、双方の3’UTRで同等であった。抗原特異的免疫応答も同等程度まで誘導され、FI 3’UTR含有mRNAの効果は、脾臓の方がわずかに強かった。
アルファウイルスゲノムに由来するin vitro転写自己複製RNA(レプリコンRNA)は、強力なワクチンベクターである。レプリコンRNAは、レプリコンRNAの細胞質複製(レプリカーゼ)に必要な酵素複合体の最初の3分の2をコードする。このレプリカーゼは、サブゲノムRNAのレプリカーゼ依存的合成のためのサブゲノムプロモーターとして作用するRNAの内部構造を認識する。ワクチン接種のための導入遺伝子又は抗原は、このサブゲノムRNA上にコードされ、レプリコン全体よりも有意に短い。全体として、ゲノムRNA(すなわち全長レプリコンRNA)とサブゲノムRNAの双方が、細胞mRNAを再構成する。双方ともUTRに隣接しており、双方ともキャップされ、ポリアデニル化されている。キャッピング及びポリアデニル化の原因となる酵素は、レプリカーゼ酵素複合体に含有されている。UTR内の保存配列エレメント(CSE)は、5’CSEの場合はレプリカーゼのORFと重複しているが、レプリカーゼの結合に必要であり、マイナス鎖合成(3’CSE)又はプラス鎖合成(5’CSE).のためのプロモーターとして作用する。
非複製in vitro転写mRNAについて同定され、検証された新規安定化UTRがレプリコンRNAのより高い安定性をもたらし、その結果より高い導入遺伝子発現をもたらすか否かを評価するために、本発明者らは、それぞれの配列をレプリコンRNA鋳型ベクターにクローン化した。3’CSEはポリAテールのすぐ隣に位置する必要があるため、本発明者らは、不安定化ルシフェラーゼ(Luc2CP)をコードするレプリコンの3’CSEのすぐ上流に新規UTRを挿入した。レプリコンRNAは、IVT mRNAに類似している線状化鋳型プラスミドのin vitro転写によって合成された。レプリコンRNAをエレクトロポレーションにより細胞(BHK21及びHFF)に導入し、ルシフェラーゼ発現を評価した。図9に示すように、挿入されたすべてのUTRは、使用した双方の細胞株においてLuc2CPの翻訳を増加させた。興味深いことに、「IF」UTRの組み合わせは、翻訳の顕著な増加をもたらした。
新規の安定化UTR要素を同定するために適用された選択手順の結果、一定のサイズ範囲の配列が得られた。延長された5’及び3’末端を有する同じ配列の同定は、必要とされる最短の長さに関する最初の示唆を与えた。しかし、各要素がその安定化効果を発揮するのに必要な最小限の領域は、さらに短くてもよい。さらに、配列のわずかな変化は依然として機能的であり得、すなわち個々のヌクレオチドの同一性は、FI要素の安定化特性にとって最も重要ではない可能性がある。要素がどの程度までヌクレオチド交換に影響されないかを確認するために、元のFI要素と97.5%、95.0%、92.5%及び90.0%の相同性を有する3’UTR配列のhiDCにおける総タンパク質発現及びmRNA半減期を試験した。変更するヌクレオチドは、全配列長にわたってランダムに選択した(配列208~211、ランダム修飾)。3’UTRとしてこれらの修飾された要素を有するルシフェラーゼmRNAを、in vitro転写し、hiDCにエレクトロポレーションし、その発現を3、6、24、48及び72時間後のルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡した。修飾FI要素を有するルシフェラーゼmRNAは、同じ総タンパク質量をもたらし、ほぼ同じ半減期を有した(表17)。
上記のような程度の増加を伴うランダム置換に加えて、FI要素の二次構造を破壊する可能性のあるヌクレオチド置換を合理的に導入することによって修飾FI要素の別のセットを作製した。複数の天然3’UTR配列については、それらの二次構造が重要であることが知られているが、それは、その二次構造がmRNAの安定性に影響を及ぼす調節タンパク質の結合部位を提供するからである(Addess et al., 1997; Putland et al., 2002; Crucs et al., 2000; Adams et al., 2003)。互いに完全に相補的な2つの8nt配列がFI要素に存在し、一方はFに、もう一方はI要素に存在する(図10)。これらの2つの領域の塩基対形成は、殆どのmfold予測においても見られる。mFold(Zuker、2003)は、入力配列の二次構造予測を可能にするコンピュータプログラムである。この特定の二次構造要素の重要性を調べるために、塩基対形成を消滅するように配列を変更した(配列212、8nt突然変異)。この比較的長い相補的配列の他に、FI 3’UTRに対するmfold予測で、出力折り畳みの大部分に存在する構造要素をスクリーニングした。したがって、in vitroで形成する可能性が高いはずである。これらの折り畳みの塩基対形成に関与するヌクレオチドを、それらの塩基対形成パートナーと交換することによって、元のFI配列と97.5%、95.0%、92.5% 及び90.0%相同性へと変化させ、それにより配列の二次構造を保持した(配列217~220、構造保持修飾)。さらに、二本鎖部分の一方の鎖のみで同じ配列を交換し、それにより意図的に二次構造を破壊した。このような場合、元の配列に対する同一性は、それぞれ98.75%、97.50%、96.25%及び95.00%であった(配列213~216、構造不安定化修飾)。
記載の修飾3’UTR要素を有するルシフェラーゼRNAを、in vitro転写し、hiDCにエレクトロポレーションし、その発現を3、6、24、48及び72時間後のルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡した。
いずれの修飾方法でも、mRNA半減期への有意な影響は観察されなかった。したがって、FI要素の安定化特性は、ヌクレオチドが少なくとも10.0%まで変異したヌクレオチド配列又は二次構造の変化に対しては、影響されないようである。また、FI配列の修飾の際の総タンパク質量の低下は観察されなかった(表18A及びB)。
示した通り、FI要素は、mRNA安定性及び翻訳効率に関して、2hBg 3’UTRと同等又はそれに勝っている。FI要素のもう一つの利点は、その非反復配列であるが、hBg 3’UTRの2つのコピーは、場合によっては問題を引き起こす可能性がある。
これは、RNA転写用のDNA鋳型がPCRによって増幅されるとき、最も明白である。そのような場合、3’UTRのまさに3’末端に結合する3’プライマーオリゴを用いて全長ポリAテールを付加する(図11A)。2hBgUTRの場合、PCR中にトランケーションされた副産物が出現し、これは、UTRにおいて1hBg反復のみを有するmRNAからなることが配列決定後に判明した(図11B)。転写後、mRNAにおけるトランケーションも見える(図11C)。この現象は、2hBgUTR要素を含有するコンストラクトを用いた殆どのPCR反応で起こり、プライマーアニーリング温度、緩衝液組成、プライマー配列又は代替ポリメラーゼを含む最適化努力によって完全になくすことができるものではない。3’UTRとポリAテールとの間にユニークなリンカー配列を挿入した後でさえ、問題は残る。重要なことに、サイドピーク(side-peak)の強度はPCR反応収率と相関したが、これは、問題の原因と思われる、各PCRサイクルとともに増加するトランケーションされた短いPCR断片のミスプライミングを示している。したがって、2hBg 3’-UTRを有するRNAをコードするDNA鋳型について十分な条件を同定することはできなかった。
対照的に、FI要素を有するDNA鋳型のPCRは、トランケーションされた副産物を生じず(図11D)、また、得られたmRNAは、Bioanalyzerプロファイルにおいてさらなるピークを示さなかった(図11E)。したがって、FI要素は、PCR鋳型の完全性及び対応するRNA品質に関し、2hBgUTRと比較した3’UTRとしてのかなりの改善の要素となる。
新規の安定化UTR要素を同定するために適用された選択手順の結果、一定のサイズ範囲の配列が得られた。延長された5’及び3’末端を有する同じ配列の同定は、必要とされる最短の長さに関する最初の示唆を与えた。しかし、各要素がその安定化効果を発揮するのに必要な最小限の領域は、さらに短くてもよい。
この目的のために、F及びI要素の双方について、それぞれ5’及び/又は3’末端で短縮された元の要素の異なる断片をカバーする短縮UTRを含有する5つのルシフェラーゼレポーターコンストラクトを設計した(それぞれ図12上部パネルA及びB参照)。これらのレポーターコンストラクトを、in vitro転写し、hiDCにエレクトロポレーションし、その発現をエレクトロポレーションから3、6、24、48及び72時間後のルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡した。得られた発現曲線で、1と設定された各完全長を含有するRNAを用いた、相対的なRNA半減期について分析した(それぞれ図12下部パネルA及びB参照)。
F要素については、試験したいずれのサブ配列においても有意に減少したmRNA半減期は観察されず、mRNAの安定化の役割において、F要素に沿った種々のサブ配列の重複的かつ非協調的関与が示された。同様の結果がI要素について得られたが、中央領域(nt37~107)のみが3’UTRとして使用された場合、能力のわずかな低下が観察された。
これらの結果を大局的に見るために、完全長の個々のF及びI要素、並びにFIの組み合わせを、出発ライブラリー(長さ257nt)から無作為に選択した3’ UTRと比較した。これは、出発DNAプールをクローニングすることと、1つのランダムクローンを選択することによって得られた。上記の通り、各UTRを有する、ルシフェラーゼをコードするRNAを、hiDCにエレクトロポレーションし、ルシフェラーゼ発現を経時的に測定し、相対的半減期及び総タンパク質発現を算出した。F、I、及びFI要素と比較して、ランダムに選択された3’UTRを有するRNAは、有意により安定性が低い(図13、上のパネル)。選択されたUTRの効果は、総タンパク質発現についてさらに顕著である(図13、下のパネル)。これは、上記のようなF及びI要素の断片の効果が、選択された配列に特異的であり、単に3’ UTR配列の存在によって引き起こされるのではないことをはっきりと示している。これは、選択中のプールのRNA安定性の観察された増加と一致する(上記参照)。
40000個の細胞を2ウェルプレートに播種し、各0.08μgのB18R、E3及びK3(EKB) 、並びにmiRNA 302a-dと367とからなるmiRNA混合物0.17μg(1:1:1:1:1:1)を含む、再プログラミングTF OCT4、SOX2、KLF4、cMYC、NANOG及びLIN28(OSKMNL)(1:1:1:1:1:1)をコードする非修飾in vitro転写(IVT)-RNA0.33μgからなるmRNA混合物で、3日間(3x)又は4日間(4x)連続してリポフェクションした。したがって、RNAコンストラクトは、ヒトβ-グロビン3’UTR(2hBg)、F-I要素(FI)又はI-F要素(IF)のタンデム反復からなる3’UTRにおいてのみ異なっていた。細胞をヒト胚性幹(hES)細胞培地で培養し、RNAiMAXを用いたリポフェクションを製造者の指示書に従って実施した。9日目以降、コロニー形成が観察され、コロニーの分析がd11で行われた(タイムラインの概要は図14Aを参照)。確立したコロニーをAP Staining Kitを用いて11日目にアルカリホスファターゼ(AP)染色した。概観については、代表的な染色を図14Bに示す。FI要素の取り込みは、より多量のAP陽性コロニー(暗)をもたらすことが明らかになった。AP染色されたコロニーを数え、概観からの結果を以下の通りに確認した。先に使用した2hBg-UTRと比較して、FI-UTRでの置換は、細胞を3回リポフェクションした場合、3~4倍過剰のコロニーをもたらす。IF-UTRでの置換は、2倍過剰になる。4回のトランスフェクションでは、これらの効果はそれほど顕著ではない。ここでは、IF-UTRでは改善が見られない。本プロセスは4回のトランスフェクションで飽和状態にあるように見える一方、ここでのコロニーの数は、コロニーの過剰増殖のためにいくらか偏っている(図14C参照)。FI-UTRを含有するRNAを使用して得られたiPS細胞コロニーのコロニー形態は、はっきりと区別できるコロニー及び明確に画定された境界内にきつく充填された小さな細胞を含むhES細胞様であった(図14D)。これらのコロニーは、AP(図14E)及びhES細胞表面マーカーTRA-1-60(図14F)について陽性に染色することができた。TRA-1-60生体染色は、製造者の指示書に従い、Stain-Alive TRA-1-60抗体(Stemgent)を用いて行った。コロニーの代表的な写真を示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞をペレット化し、全RNAを単離し、hESマーカーOCT4(内因性)、NANOG(内因性)、LIN28(内因性)、TERT及びREX1のmRNA発現をqRT-PCRによって定量した。mRNA発現は、HPRTの発現に対して正規化され、入力細胞の転写物レベルと比較した折り畳み誘導として示されている。3つのリポフェクション後のコロニーの分析を図14Gに示す。すべての分析されたマーカーは、再プログラミングされた細胞の多能性を示す入力細胞と比較して、高度に発現された。FI含有合成mRNAの優位性は、2hBg-及びIF含有mRNAを用いた再プログラミングと比較して、より高い内因性マーカー発現によって確認された。
これらの結果は、2hBg-UTRをFI-UTRに置き換えることにより、より迅速かつ効率的なRNAベースの再プログラミング技術が得られることを示している。これはおそらく、FI要素による置換に起因する再プログラミング転写因子のより長く、かつより高い発現に基づく。IFコンストラクトではIF要素の利点が観察されなかったことから、FI要素の方向付けが不可欠であると考えられる。FI含有mRNAによる細胞の再プログラミングの成功は、hES細胞様形態、hES細胞表面のAP活性及び発現、並びに得られたiPS細胞コロニーの内因性マーカーによって確認された。
表1 選択の進行をモニターするための、リアルタイム逆転写酵素PCR(RT-PCR)実験のデータから算出したmRNA半減期(時間)エレクトロポレーションから8、24、及び48時間後にmRNAを定量した。実験I(左)では、各サンプルを1回のみ分析した。従って、標準偏差は与えられていない。
この表には、使用したすべての細胞型のエレクトロポレーションプロトコールの詳細がまとめられている。細胞数の下に記載されている量の細胞を、X-VIVO15培地(Lonza)入りのエレクトロポレーションキュベット又は96ウェルエレクトロポレーションプレート(フォーマットの下に記載)中で、μg又はpmol単位で記載されている量のRNAと混合した。エレクトロポレーションは、指定された長さ及びVの下に記載の電圧でパルスを印加することにより実施した。その後、細胞懸濁液を増殖培地中で希釈し、細胞/時点の下に記載の密度で96ウェルに分配した。
エレクトロポレーション時に非修飾及び修飾RNAを、リポフェクション時に非修飾RNAを含有する2hBgUTRに対する、FI要素の半減期及び総タンパク質。
3’UTRとしてFI又は2hBgを含有するホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドを、クラスIIS制限酵素でポリ(dA:dT)の下流に線状化し、それによってポリ(dA:dT)を越えて付加的なヌクレオチドを持たない鋳型を作製した。線状プラスミドDNAをカルボキシル化磁気ビーズ(Invitrogen)を用いて精製し、分光測定で定量し、in vitro転写に供した。vitro転写のために、RNase阻害剤及びピロホスファターゼを補充した自家製T7 RNAポリメラーゼを、125mM Hepes pH8.35、34mM MgOAc2、10mM DTT及び2mM Spermidin緩衝液中の7.5mM NTPとともに使用した。RNAの効率的なキャッピングのために、6mMのβ-S-ARCA(D2)を反応に添加し、初期GTP濃度を1.5mMまで低下させ、37℃で2.5時間の流加プロセスにおいて7.5mMに調整した。RNAをカルボキシル化磁気ビーズ(Invitrogen)によって精製し、2100 Bioanalyzer(Agilent)での分光測光及び分析によりRNA濃度及び品質を評価した。
B群
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UUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-1WoD6_For2
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACU
GACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCU
GCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-1WoD10_For2
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACU
GACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCU
GCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-2WoG5_For2
GCGGGUCUUCCUGGAAUCUGAACAUUCGUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGA
CUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGC
CUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGAC
C
>Rn6-96h-2pl-G8_F
GUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGG
CCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCC
GCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-1WoE7_For2
CAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGC
UCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGC
CGGUGUGACC
>Rn6-1Wo_A12_b
CCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGACCCAUGAGACUGACUUCC
CACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUC
CAUUGCCGGUGUGACUGC
>Rn6-1WoG11_For2
CUUCCAUCCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCGGGUCUUCCUGGAAUCUGACCAUUCGU
UGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCC
CAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGC
CUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCCC
>Rn6-1WoH5_For2
CUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCC
ACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCC
AUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-1WoH4_For2
AAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCU
CUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCC
GGUGUGACC
>Rn6-2WoB4_For2
CUCCAGCUCGCUUCCAUUUGCUUGCAGAAGUUCUCGCUGUGCUCACGAAGCUUGCGCUCC
UUGGAGGCCUCAGCAACAGCAUCAUCAAGCUGAGCUUCCAGCUCUUUCCUGAGCUUCUCA
GCUCUCCGCAUUUCCUGCCGCAUGGCGUCCACCUUCUGCGUGGCCACCUCCAUCUCCUCC
UCCUUGUCUCGCAGCUGCCGGGACACCUUCUGCGCUAAGAUGGGAUACGGCAUUGAGGGA
UCAAUGUGUAAGGAUCCGAUCUGCUUCUGGCCUCACUGAGUCUGAAGAGCUGUUAACUAC
CAUGGCCAGUCCUCCCUGAGUCUGACCAUCUUCCAUCCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCU
GCGGGUCUUCCUGGAAUCUGACCAUUCGUUGUCUGCUAUGUCCGUCCUCACCAAGACUGA
CUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGC
CUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGAC
C
>Rn6-96h-2pl-A5_F
CUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGC
CUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUG
UGACC
>Rn6-1WoC8_For2
CCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUG
CUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUG
ACGGUGUGACC
>Rn5D1_For2
UAACUACCAUGGCCAGUCCUCCCUGAGUCUGACCAUCUUCCAUCCUGCUGCUGCUGCUGC
UGCUGCGGGUCUUCCUGGAAUCUGACCAUUCGUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGA
CUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGC
CUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGUUGAUCCAUUGCCGGUG
UGACC
>Rn6-2WoG10_For2
CCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUG
CUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGUUGAUCCAUUG
UCGGUGUGACC
>Rn6-1Wo_E4_b
CCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUG
CUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUG
CCGGUGUGACC
>Rn6-2WoF3_For2
CUGCUAUGCCUGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAU
GAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCAAUGCACUGGCACAGCCCCGCCUU
GCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-96h-2pl-B10
CUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAU
GAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUU
GCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-96h-2pl-C10
GCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGA
GACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGC
CGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-1WoB6_For2
UCUUCCUGGAAUCUGACCAUUCGUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCC
UGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUC
CCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-96h-2pl-D6_F
CUGGAAUCUGACCAUUCGUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUG
CUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCAC
UGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-96h-2pl-E6_F
CUGGAAUCUGACCAUUCGUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUG
CUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCAC
UGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-2WoF10_For2
GGAAUCUGACCAUUCGUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCU
UUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUG
CACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>Rn6-1WoG9_For2
CCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUG
CUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCAUAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUG
CCGGUGUGACC
>Rn6-96hC12_For2
CUUCCUGGAAUCUGACCAUUCGUUGUCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCU
GCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCC
CCACUGCACUGGCAUAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUUCCGGUGUGACC
D群
>Rn6-1WoF2_For2
CAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAUUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACC
CUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUC
UGCCCUUCCACUCUCUGACC
>Rn6-2WoD8_For2
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUG
ACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUA
GCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC
>Rn6-1WoD5_For2
CUCGCUUCCUGGGUCUGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACCCUCCAUGUACCCAGGGGAGAUU
CCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGAC
CUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGC
CUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCACCGCCC
>Rn5-2pl-D3_For2
UCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGA
CCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAG
CUUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGG
>Rn6-2WoA8_For2
CGCUUCCUGGGUCUGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACCCUCCACGUACCCAGGGGAGAUUCC
AGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCU
ACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCU
CUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCACCG
>Rn6-2WoD7_For2
CAUGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGC
UUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUU
UGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCG
>Rn6-2WoB8_For2
CUCGCUUCCUGGGUCUGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACCCUCCAUGUACCCAGGGGAGAUU
CCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGAC
CUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGC
CUCUCUGCCCCCCCGAU
>Rn6-96h-2pl-H6_F
CCCAGCUCCCUAGGCGUCCCAUCUCGCUUCCUGGGUCUGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACC
CUCCAUGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGU
UGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCC
UUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUUUGACCCCCAUCUUA
>Rn6-96h-2pl-F10
GGCCACCGGGCAUGGGAAGUAUGAGAAGGUGCUUGUGGAAGGGGGCCCGGCUCCCUAGGC
GUCCCAUCUCGCUUCCUGGGUCUGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACCCUCCAUGUACCCAGG
GAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAG
CAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCC
UUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC
>Rn5H3_For2
UGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUU
CCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUG
CUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCACCACCCCC
>Rn5G7_For2
CCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAU
GCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCU
CUGACCACAGCCCC
>Rn6-1WoG5_For2
CCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUG
AUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACU
CUCUGACCACCGCCCCCGCC
>Rn6-1WoA8_For2
CCGGCUGGCACCCUCCAUGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCC
UGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCC
GCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCA
CCGCCCCC
>Rn6-96h_D3_b
GCCGGCUGGCACCCUCCAUGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCC
CUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUAGCCUCUUUGAUGCCAUC
CGCUGCCACCUCCUUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGAC
CACCGCCCCC
>Rn6-96hC11_For2
UCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGA
CCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAG
CCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCACCACCCC
>Rn5H1_For2
GCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUA
CCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUC
UCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCC
>Rn6-1WoG2_For2
UCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGA
CCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAG
CCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCC
>Rn6-1WoG7_For2
CGGCUCCCUAGGCGUCCCAUCUCGCUUCCUGGGUCUGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACCCU
CCAUGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUG
CUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUU
UUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCACUGCCCC
>Rn6-96hB11_For2
UGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACCCUCCAUGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCA
CCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUU
GAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCAC
UCUCUGACCACUACCCC
>Rn6-2WoF8_For2
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUG
ACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUA
GCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCACUGCCCC
>Rn6-96h_A9_b
CCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCC
UCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCU
UCCACUCUCUGACC
>Rn6-1WoH3_For2
CAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACC
UACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCC
UCUCUGCCCUUCCACUCUCUGAACACC
E群
>Rn6-2WoE2_For2
GAGCCUACUCUGAUGACCGUGGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCC
CUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUC
CUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUGACCCCUC
GAACCCAUCCUA
>Rn6-1WoD3_For2
GAGCCUACUCUGAUGACCGUGGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGCGCCCUACCUCC
CUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUC
CAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUGAC
CCCUCUAACCC
>Rn6-2WoG7_For2
GCCUACUCUGAUGACCGUGGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCU
GCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCA
UCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCCACUGCCAUCUCCCCCCC
>Rn6-2WoH2_For2
GAGCCUACUCUGAUGACCGUGGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCC
CUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUC
CAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUUACUGCCAUCUCCCCCCUGAC
CCC
>Rn6-2WoC1_For2
GAAGAGCCUACUCUGAUGACCGUGGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACC
UCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAU
CUCCAUCCCUGUGGCUGUCAUCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCU
GACCCCUCUAACCCAUCCUCUGCCUCCCUCCCUGCAGUCAGAGGGUCCUGUUCCCAACCA
>Rn6-1Wo_C12_b
UGUGGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUAAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCU
CCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCA
CCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUGACCCC
>Rn6-1WoE12_For2
GCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCC
GCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCU
UGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCC
>Rn6-2WoF5_For2
AGAGCCUACUCUGAUGACCGUGGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUC
CCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCU
CCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUGA
CCCCUCUAACCCAUCCUCUGCCUCCCUCCCUGCAGUCAGAGGGUCCUGUUCCCAUCAGCG
AUUCCCCUGCUUAAACCCUUCCAUGACUCCCCACUGCCCUAAGCUGAGGUCAGUCUCCCA
AGCCUGACAU
>Rn5-2pl-H3_For2
UAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCU
GUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUGACCCCUCUA
ACCCAUCCUCUGCCUCCCUCCCUGCAGUCAGAGGGUCCUGUUCCCAUCAGCGAUUCCCCU
GCUUAAACCCUUCCAUGACAGCCC
>Rn6-2WoA3_For2
UCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCAC
UGCCAUCUCCCCCCUGACCCCUCUAACCCAUCCUCUGCCUCCCUCCCUGCAGUCAGAGGG
UCCUGUUCCCAUCAGCGAUUCCCCUGCUUAAGCCCUUCCAUGACUCCCC
>Rn6-96hF12_For2
CUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGA
UCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCC
UGACCCCUCUAACCCAUCCUCUGCCUCCCUCCCUGCAGUCAGAGGGUCCUGUUCCCAUCA
GCGAUUCCCCUGCUUAAACCCUUCCAUGACUCCCCAA
>Rn6-96hE11_For2
GCCUACUCUGAUGACCGUGGCCUUGGGUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCU
GCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGUCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCA
UCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUGACCC
CUCUAACCCAUCCUCUGCCUCCCUCCCUGCAGUCAGAGGGUCCUGUUCCCAUCAGCGAUU
CCCCUGCUUAAACCCUUCCAUGACUCCCCUCU
>Rn6-96h-2pl-A11
CUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCC
CUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCC
CCCCUGACCCC
F群
>Rn6-1WoB5_For2
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUC
CCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCU
AGUUCCAGACACCUCC
>Rn6-2WoE11_a
CCGGCCCUUCCCCCGUUUUGAACAUGUGUAACCGACAGUCUGCCUGGGCCACAGCCCUCU
CACCCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGCACCCCGAG
UCUCCCCCGACCCCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUC
UGCUAGUUCCAGACACCCCCGCG
>Rn6-96h_E3_b
CCUUCCCCCGUUUUGAACAUGUGUAACCGACAGUCUGCCUGGGCCACAGCCCUCUCACCC
UGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGCCCUGGGCACCCCGAGUCUCC
CCCGACCCCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUA
GUUCCAGACACCUCCAC
>Rn6-96h-2pl-B6_F
UCUGCCUGGGCCACAGCCCUCUCACCCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCU
UUCCCGUCCUGGGCACCCCGAGUCUCCCCCGACCCCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUC
CACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCACGCCCACCUGGUCCUCU
CCCAUCGCCCACAAAAGGGGGGGCACGAGGGACGAGCUUAGCUGAGCUGGGAGGAGCAGG
GUGAGGGUGGGCGACCCAGGAUUCCCCCACCCC
G群
>Rn5_D5_b
UGACACCUCAGCUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUG
GGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUC
CCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCC
CACCUCUACCUCCACCCCA
>Rn5B2_For2
CUCAGCUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGG
CCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCA
CCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUC
UACCUCCACUCCC
>Rn5G3_For2
UCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCU
CUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAG
GCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCC
>Rn6-96hF11_For2
GGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGG
UCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCU
CUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCC
>Rn6-96h-2pl-D8_F
GCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCC
GCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCU
CCGCCCCC
>Rn5C4_For2
CGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCC
CAUUGUGGCUCCUUAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUUUACCUCCACCCCUAC
>Rn6-2WoD3_For2
CUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAG
GCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCC
GCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCU
CCACCCCCAC
>Rn6-96h-2pl-C6_F
CUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAG
GCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCC
GCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCU
CCACCCCCAAC
>Rn6-96h-2pl-C7_F
CUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAG
GCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCC
GCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCU
CCACCCCCAAC
>Rn6-96h-2pl-F8_F
CGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCU
GGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUG
UCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCA
CACC
>Rn6-96hH9_For2
UCCUGAGGGACUGGGACUCCCCUUACAGCCAUGACCUUGACACCUCAGCUGACAGCGUGG
GCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCC
CCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGC
CCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACGCCCAC
>Rn5_F10_b
CUGAGGGACUGGGACUCCCCUUACAGCCAUGACCUUGACACCUCAGCUGACAGCGUGGGC
AACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCC
CGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCC
CAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACACCU
>Rn6-2WoF11_For2
UGCGGAGCCAGCUGGAGGCCAUUUUCCUGAGGGACUGGGACUCCCCUUACAGCCAUGACC
UUGACACCUCAGCUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGU
GGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGU
CCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUC
CCACCUCUACCUCCACCC
>Rn6-1WoA9_For2
CUGGAGGCCAUUUUCCUGAGGGACUGGGACUCCCCUUACAGCCAUGACCUUGACACCUCA
GCUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAA
GGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCC
CGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACC
UCCCCCCAC
>Rn6-1WoF9_For2
CUGGGACUCCCCUUACAGCCAUGACCUUGACACCUCAGCUGACAGCGUGGGCAACGCCUG
CCGCCUGCUCUGAGGCCCAAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACC
CAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGC
CUCCUUAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCC
I群
>Rn5_A7_b
GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGUAAACAGCAGUGAUU
AACUUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUU
CGUGCCAGCCACC
>Rn5_B6_b
CUUUCUAUUAGCUCUUAGUAAGAUUACACAUGCAAGCAUCCCCGUUCCAGUGAGUUCACC
CUCUAAAUCACCACGAUAAAAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAAC
GCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAA
AGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCUACC
>Rn5D4_For2
GUUCCAGUGAGUUCACCCUCUAAAUCACCACGAUCAAAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCA
GCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAAC
CUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGU
GCCAGCCACC
>Rn5D2_For2
AAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCC
CCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACU
AACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn6-1Wo_D7_b
UCAAAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCAACAAUGCAGCUCAAAAACGCUUAGCCUAGCCAC
ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUA
CACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn6-96h-2pl-A9_F
UACACAUGCAAGCAUCCCCGUUCCAGUGAGUUCACCCUCUAAAUCACCACGAUCAAAAGG
GACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCAC
GGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACC
CCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn6-2WoH3_For2
CAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAAC
AGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGU
UGGUCAAUUUCGUGCCAACCACC
>Rn6-96hG11_For2
AAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCC
CCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACU
AACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAACCACC
>Rn5E1_For2
CAAGCACGCAACAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGC
AGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGG
UCAAUUUCGUGCCAACCACC
>Rn6-1WoA11_For2
CAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCAUGGGAAAC
AGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGU
UGGUCAAUUUCGUGCCAGCUCACC
>Rn6-2WoE7_For2
CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGC
AGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGG
UCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>Rn6-96h-2pl-B5_F
CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGC
AGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGG
UCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn5H2_For2
CACGAUCAAAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAG
CCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAA
GCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn6-1WoF11_For2
UAAAUCACCACGAUCAAAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCU
UAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGU
UUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn6-2WoB11_For2
AGCCUUUCUAUUAGCUCUUAGUAAGAUUACACAUGCAAGCAUCCCCGUUCCAGUGAGUUC
ACCCUCUAAAUCACCACGAUCAAAAGGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAA
AACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAAC
GAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn6-1WoA3_For2
GGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCA
CGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC
CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
>Rn6-1Wo_D2_b
GGGACAAGCAUCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCA
CGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC
CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACC
J群
>Rn5A1_For2
UUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGA
GAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCC
CUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCA
UCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUC
CUUCUGUGCCACU
>Rn5B1_For2
UUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGA
GAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCC
CUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCA
UCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUC
CUUCUGUGCCACU
>Rn5_A10_b
CCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGAC
CUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUG
GCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUC
CAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCU
GUGCCACAAA
>Rn5_G1_b
CCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGAC
CUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUG
GCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUC
CAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCU
GUGCCACAAA
>Rn6-1WoF5_For2
CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCU
CCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCC
UCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUU
UUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCC
>Rn6-2WoA5_For2
UGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAGGAGAGACCUUUCUCCG
GACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCA
GCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUG
UGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCA
>Rn6-2WoA7_For2
GUGAAGAUGACCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUU
CCCCGCUUGGCUCUCCUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGG
UUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCU
GAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAA
UGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUGCUGUGCCA
>Rn6-2WoG2_For2
UCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGCUGCUACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAA
UGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGC
AGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAUGCUUCCUGCCUCCCAUGCA
UCUGUACUCCUGCUGUGCCACAAACAC
>Rn6-2WoH10_For2
UCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGCUGCUACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAA
UGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGC
AGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAUGCUUCCUGCCUCCCAUGCA
UCUGUACUCCUGCUGUGCCACAAACAC
>Rn6-96h-2pl-G7_F
GCUACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACC
UUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU
UUACCUAAUGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUGCGU
>Rn5-2pl-B2_For2
AGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCC
ACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGU
CCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGC
CCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAUGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCU
GUACUCCUG
>Rn5-2pl-D1_For2
AGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCC
ACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGU
CCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGC
CCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAUGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCU
GUACUCCUG
>Rn6-1WoA5_For2
UGAAGAUGACCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUC
CCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGUUCAGCAG
CUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAAGUCCC
AGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAUGCUUCCU
GCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUG
>Rn6-1Wo_G10_b
UGAAGAUGACCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUC
CCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGU
UCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUG
AAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAU
GCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCC
>Rn6-2WoE4_For2
CCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGG
CUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAGCU
CUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAAGUCCCAG
CAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAUGCUUCCUGC
CCCCC
>Rn6-96hG12_For2
GUGAAGAUGACCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUU
CCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGG
UUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCU
GAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAA
UGCUUCCUGCCCCCCAU
>Rn6-96h-2pl-C12
AGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCC
ACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGU
CCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGC
CCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCC
>Rn6-96h-2pl-A6_F
CUGAAGUGAAGAUGACCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAA
CACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCU
ACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUU
GGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUA
CCUAAUGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCU
>Rn6-96h-2pl-H5_F
CUGAAGUGAAGAUGACCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAA
CACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCU
ACUGGUUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUU
GGCCUGAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUA
CCUAAUGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCU
>Rn6-2WoG1_For2
AAGAUGACCACAUUCAAGGAAGAACCUUCUGCCCCAGCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCC
CGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUC
AGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCUGAA
GUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAUGC
UUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUGC
>Rn6-96h-2pl-D11
CCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGG
UUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCU
GAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAA
UGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCU
>Rn6-96h-2pl-F9_F
CCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGG
UUCAGCAGCUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCUUGUGGCUGCCUCAGCUCGUACCUUUGGCCU
GAAGUCCCAGCAUUAAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAA
UGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCU
>hBg:
GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUC
UTRなし:
>
>BB
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>BD
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC
>BE
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCC
>BF
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC
>BG
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCCUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC
>BhBg
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCGAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUC
>BI
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>BJ
UGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACCCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCC
>DB
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>DD
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC
>DE
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCC
>DF
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC
>DG
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC
>DhBg
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCGAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUC
>DI
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>DJ
UUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCC
>EB
GCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCCAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC
>ED
GCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC
>EE
GCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCGCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCC
>EF
GCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC
>EG
>GCCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCCCUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC
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>FI UTR 97,5%相同性(ランダム修飾)
CUGGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCACCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAUCGAAUGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 95%相同性(ランダム修飾)
CUCGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCACCACCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACCUCCACGUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGUAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAUCGAAUGUCUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGAUCAAUUACGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 92,5%相同性(ランダム修飾)
CUCGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCACCACCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACCUCCACGUGCCCCACUCACCACCUUUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAUGCACGCAGCAAUGCAGAUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGUAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAUCGAAUGUCUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGAUCAAUUACGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 90%相同性(ランダム修飾)
GUCGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCAGCACCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCACCACCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACCUCCACGUGCCCCACCCACCACCUUUGCUAGUUCCAGAGACCUCCCAUGCACGCAGCAAUGCAGAUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCGCCACGGGAAACAGUAGUGAUCAACCUUUAGCUAUAAUCGAAUGUCUAACUAAGCUAUUCUAACCACAGGGUUGAUCAAUUACGUGCCAGCCAGACC
>FI 8nt突然変異
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>FI UTR 98.75%相同性(構造不安定化修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUGGUCCGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 97.5%相同性(構造不安定化修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUGGACCGUACGGCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 96,25%相同性(ランダム修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGCCGUGGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 95%相同性(構造不安定化修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGGGCUGGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 97,5%相同性(構造保持修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUGGUCCGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCGGACCUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 95%(構造保持修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUGGACCGUACGGCGAGUCUCCCCCGACCUCGCCUCGGUCCUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 92,5%(構造保持修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGCCGUGGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCAGCCCUCGGUCCUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGCAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
>FI UTR 90%(構造保持修飾)
CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGGGCUGGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCAGCCCUCGGUCCUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCAGCCCAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
Claims (41)
- 転写の5’→3’方向に、
(a) プロモーター;
(b) 転写可能な核酸配列又は転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列;並びに
(c) プロモーター(a)の制御下で転写される際に、転写物中の3’非翻訳領域をコードする核酸配列であって、(b)の核酸配列と天然では連結されておらず、前記3’非翻訳領域が、
(i)(c-6) 配列番号105から121からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMitochondrially Encoded 12S RNA(MT-RNR1)の非コードRNAの核酸配列;又は
(ii)(c-8) (c-6)、並びに、以下からなる群より選択される1以上の核酸配列の任意の組み合わせ
(c-1) 配列番号1から50からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるFc Fragment Of IgG,Receptor,Transporter,Alpha(FCGRT)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-2) 配列番号51から72からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるリンパ球特異的タンパク質1(LSP1)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-3) 配列番号73から85からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるChemokine Ligand 22(CCL22)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-5) 配列番号90から104からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるPhospholipase D Family Member 3(PLD3)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-6) 配列番号105から121からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMitochondrially Encoded 12S RNA(MT-RNR1)の非コードRNAの核酸配列;及び
(c-7) 配列番号122から143からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMajor Histocompatibility Complex Class II DR Beta 4(HLA-DRB4)の3’非翻訳領域の核酸配列;または、
(iii)(c-6)および(c-4)の組合せであって、
(c-4)は、配列番号86から89からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるAmino-Terminal Enhancer Of Split(AES)の3’非翻訳領域の核酸配列であり、
(c-6)が、(c-4)に対して5’に位置する、前記組合せ;
を含む、核酸配列
を含む核酸分子であって、
プロモーター(a)の制御下にある核酸配列(b)及び(c)が、転写されて共通転写物を生じることができ、核酸配列(c)から転写された核酸配列は、転写可能な核酸配列(b)から転写された核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに活性である、核酸分子。 - MT-RNR1の非コードRNAの核酸配列は、配列番号115の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
AESの3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号86の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号27の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号52の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号79の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号96の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号126の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;
請求項1に記載の核酸分子。 - (c-6)及び(c-4)の組み合わせは、配列番号195の核酸配列、若しくは、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む、請求項1に記載の核酸分子。
- プロモーター(a)の制御下で転写される際に、ポリアデニル配列である核酸配列をコードする核酸配列(d)をさらに含む、請求項1または2に記載の核酸分子。
- ポリアデニル配列は、ポリアデニル配列内に、Aヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する1又は複数の連続ヌクレオチドの配列を含む、請求項4に記載の核酸分子。
- 閉環状分子又は線状分子である、請求項1から5のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 転写可能な核酸配列が、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列が、マルチクローニングサイトである、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸分子。
- (i)レポーター遺伝子;(ii)選択マーカー、及び(iii)複製開始点からなる群より選択される1以上の要素をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸分子。
- 鋳型として請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸分子を用いる転写により得られるRNA。
- 転写は、in vitro転写である、請求項9に記載のRNA。
- 5’→3’方向に、
(a) 5’非翻訳領域;
(b) ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列;並びに
(c) (b)の核酸配列と天然では連結されていない、3’非翻訳領域であって、前記3’非翻訳領域は、:
(i)(c-6) 配列番号105から121からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMitochondrially Encoded 12S RNA(MT-RNR1)の非コードRNAの核酸配列、又は、
(ii)(c-8) (c-6)、並びに、以下からなる群より選択される1以上の核酸配列の任意の組み合わせ
(c-1) 配列番号1から50からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるFc Fragment Of IgG,Receptor,Transporter,Alpha(FCGRT)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-2) 配列番号51から72からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるリンパ球特異的タンパク質1(LSP1)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-3) 配列番号73から85からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるChemokine Ligand 22(CCL22)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-5) 配列番号90から104からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるPhospholipase D Family Member 3(PLD3)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(c-6) 配列番号105から121からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMitochondrially Encoded 12S RNA(MT-RNR1)の非コードRNAの核酸配列;及び
(c-7) 配列番号122から143からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMajor Histocompatibility Complex Class II DR Beta 4(HLA-DRB4)の3’非翻訳領域の核酸配列;または、
(iii)(c-6)および(c-4)の組合せであって、
(c-4)は、配列番号86から89からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるAmino-Terminal Enhancer Of Split(AES)の3’非翻訳領域の核酸配列であり、
(c-6)が、(c-4)に対して5’に位置する、組合せ;
を含む、3’非翻訳領域
を含み、
核酸配列(c)は、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに活性である、
RNA。 - MT-RNR1の非コードRNAの核酸配列は、配列番号115の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
AESの3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号86の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号27の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号52の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号79の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号96の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号126の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;
請求項11に記載のRNA。 - ポリアデニル配列である核酸配列(d)をさらに含む、請求項11又は12に記載のRNA。
- 前記ポリアデニル配列(d)は、ポリアデニル配列内にAヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する1個以上の連続ヌクレオチドの配列を含む、
請求項13に記載のRNA。 - 前記核酸配列(d)が前記RNAの3’末端に位置し、及び/又は、
核酸配列(c)及び(d)は、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに活性である、
請求項13又は14に記載のRNA。 - 5’キャップ(e)をさらに含む、請求項11から15のいずれか一項に記載のRNA。
- (i) 請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸分子を提供すること、及び
(ii) 鋳型として前記核酸分子を用いて、in vitroでRNAに転写すること
を含む、RNAを得る方法。 - (i) 請求項17の方法に従って、ペプチド又はタンパク質をコードするRNAを得ること、及び
(ii) in vitroで前記RNAを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。 - 核酸分子の転写の前に、核酸分子の切断をさらに含むことを特徴とする、請求項17又は18に記載の方法。
- (i) 転写される際に3’非翻訳領域をコードする核酸配列(b)を、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む転写可能な核酸配列(a)の3’末端でカップリングすることであって、
核酸配列(a)は、核酸配列(b)と天然では連結されていない、カップリングすること、及び、
(ii) in vitroで、得られた核酸を転写すること
を含む、RNAを得る方法であって、
前記3’非翻訳領域が、
(iia)(b-6) 配列番号105から121からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMitochondrially Encoded 12S RNA(MT-RNR1)の非コードRNAの核酸配列、又は、
(iib)(b-8) (b-6)、並びに、以下からなる群より選択される1以上の核酸配列の任意の組み合わせ
(b-1) 配列番号1から50からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるFc Fragment Of IgG,Receptor,Transporter,Alpha(FCGRT)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(b-2) 配列番号51から72からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるリンパ球特異的タンパク質1(LSP1)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(b-3) 配列番号73から85からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるChemokine Ligand 22(CCL22)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(b-5) 配列番号90から104からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるPhospholipase D Family Member 3(PLD3)の3’非翻訳領域の核酸配列;
(b-6) 配列番号105から121からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMitochondrially Encoded 12S RNA(MT-RNR1)の非コードRNAの核酸配列;及び
(b-7) 配列番号122から143からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるMajor Histocompatibility Complex Class II DR Beta 4(HLA-DRB4)の3’非翻訳領域の核酸配列;または、
(iii)(b-6)および(b-4)の組合せであって、
(b-4)は、配列番号86から89からなる群より選択される核酸配列、又は、前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体
を含む又はからなるAmino-Terminal Enhancer Of Split(AES)の3‘非翻訳領域の核酸配列であり、
(b-6)が、(b-4)に対して5’に位置する、組合せ;
を含み、
核酸配列(a)及び(b)は、転写されて共通転写物を生じることができ、核酸配列(b)から転写された核酸配列は、転写可能な核酸配列(a)から転写された核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに活性である、
方法。 - AESの3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号86の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
FCGRTの3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号27の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
LSP1の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号52の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
CCL22の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号79の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
PLD3の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号96の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
MT-RNR1の非コードRNAの核酸配列は、配列番号115の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;及び/又は、
HLA-DRB4の3’非翻訳領域の核酸配列は、配列番号126の核酸配列、若しくは前記核酸配列と少なくとも90%同一である前記核酸配列の変異体を含む又はからなる;
請求項20に記載の方法。 - 転写された際にポリアデニル配列である核酸配列をコードする核酸配列(c)を、核酸配列(b)の3’末端でカップリングすることをさらに含む、
請求項20又は21に記載の方法。 - ポリアデニル配列は、ポリアデニル配列内にAヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する1個以上の連続ヌクレオチドの配列を含む、請求項22に記載の方法。
- 核酸配列(a)、(b)及び(c)が、転写されて共通転写物を生じることができ、核酸配列(b)及び(c)から転写された核酸配列は、転写可能な核酸配列(a)から転写された核酸配列の翻訳効率及び/又は安定性を高めるほどに活性である、請求項22又は23に記載の方法。
- (i)AESの3’非翻訳領域の核酸配列は、
配列番号86の1から68位、1から102位、35から102位、35から136位又は68から136位の核酸配列、又は
配列番号86の1から68位、1から102位、35から102位、35から136位又は68から136位の核酸配列に対して少なくとも90%同一である核酸配列
を含む又はからなる;及び/又は
(ii)MT-RNR1の非コードRNAの核酸配列は、
配列番号115の1から71位、1から107位、37から107位、37から142位又は71から142位の核酸配列、又は
配列番号115の1から71位、1から107位、37から107位、37から142位又は71から142位の核酸配列に対して少なくとも90%同一である、核酸配列
を含む又はからなる、
請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項9から16のいずれか一項に記載のRNA、又は請求項20から24のいずれか一項に記載の方法。 - (i) 請求項17及び19から25のいずれか一項に記載の方法によってRNAを得ること、及び
(ii) in vitroで、前記RNAを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。 - 請求項17及び19から25のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるRNA。
- in vitroで、請求項9から16及び27のいずれか一項に記載のRNAを翻訳することを含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
- 宿主細胞をトランスフェクトする方法における使用のための、請求項9から16及び27のいずれか一項に記載のRNA。
- 宿主細胞が抗原提示細胞である、請求項29に記載のRNA。
- 宿主細胞が樹状細胞、単球又はマクロファージである、請求項29又は30に記載のRNA。
- ワクチン接種の方法における使用のための、請求項9から16及び27のいずれか一項に記載のRNA。
- 体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラミングする方法における使用のための、請求項9から16及び27のいずれか一項に記載のRNA。
- 請求項9から16及び27のいずれか一項に記載のRNA、又は、請求項29から33のいずれか一項に記載の使用のためのRNAを含む、薬学的組成物。
- 1以上の薬学的に許容される担体、希釈剤及び/又は賦形剤をさらに含む、請求項34に記載の薬学的組成物。
- 薬学的組成物は、ワクチン組成物である、請求項34又は35に記載の薬学的組成物。
- 請求項9から16及び27のいずれか一項に記載のRNA、又は、請求項29から33のいずれか一項に記載の使用のためのRNAを含む、キット。
- 請求項29に定義される方法によってトランスフェクトされた宿主細胞。
- 宿主細胞は、抗原提示細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞は、樹状細胞、単球又はマクロファージである、請求項38又は39に記載の宿主細胞。
- 請求項33に定義される方法によって再プログラミングされた幹細胞。
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