JP7084302B2 - Ｒｎａの安定化のための３’ｕｔｒ配列 - Google Patents

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Description

ＲＮＡの使用は、ＤＮＡの治療的な使用と関連する潜在的安全リスクを回避するために、ＤＮＡの魅力的な代替物を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）は、治療的手法において特に注目される。ＲＮＡの治療的な使用の利点には、一過性発現及び非形質転換特性が含まれる。ＲＮＡは、発現するのに核に入る必要がなく、さらに宿主ゲノムに組み込むこともできず、したがって発がんのリスクを排除する。ワクチン接種のために使用される場合、ＲＮＡの注入は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞性及び液性免疫応答の両方を誘導し得る。しかしながら、ＲＮＡの臨床応用への使用は、特にＲＮＡの短い半減期によって大きく制限される。
ＩＶＴベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用鋳型として標準化された方法で使用することができる。このようなＩＶＴベクターは、ＲＮＡ転写を可能にする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、続いて３’及び／又は５’のいずれかが非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接している目的の遺伝子、並びにＡヌクレオチドを含有する３’ポリアデニルカセットという構造を有し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に先立って、環状プラスミドは、ポリアデニルカセットの下流でＩＩ型制限酵素によって線状化される（認識配列は切断部位に対応する）。したがって、ポリアデニルカセットは、転写物中の後半のポリ（Ａ）配列に相当する。
ヒト未成熟樹状細胞（ｈｉＤＣ）は、がん治療のための免疫療法を開発及び改善するために広く使用されている。特定の腫瘍抗原（ＴＡ）をコードするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）－ｍＲＮＡをロードすることにより、ｈｉＤＣは、効果的な抗腫瘍応答を誘導することができる。しかしながら、ＲＮＡベースのがんワクチンを用いた有効な免疫応答の前提条件は、ＲＮＡの高い安定性及び翻訳効率である。両者は、５’－ＣＡＰ、３’ポリ（Ａ）テール、並びに５’及び３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の構造修飾によって改善され得る。ＵＴＲ内の配列エレメントは、翻訳効率（主に５’－ＵＴＲ）及びＲＮＡ安定性（主に３’－ＵＴＲ）に影響を及ぼす。
以前の研究で本発明者らは、ヒトベータグロビン３’－ＵＴＲ（現在は２ｈＢｇと呼ばれ、以前は２βｇＵＴＲとも呼ばれていた）の２つの連続したコピーが転写物の安定性と翻訳効率の向上に寄与していることを実証している(Holtkamp (2006) Blood 108:4009-4017)。しかしながら、最終的にＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用鋳型として使用される、プラスミドＤＮＡ中のヒトベータグロビン３’－ＵＴＲ配列の２つの同一コピーの存在は、大腸菌におけるＲＮＡの伝播中の組換えの危険性を有する。同様に、特にＰＣＲに基づく増幅を用いるクローニング手法は、非常に困難である。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用鋳型として使用される、３’末端に２ｈＢｇを有するＲＮＡコード領域のＰＣＲに基づく増幅についても同様である。なぜなら、ここでヒトベータグロビン３’－ＵＴＲの１コピーの省略をもたらすミスプライミングが観察されているからである。これらの問題を回避するために、本発明者らは、２ｈＢｇ配列と少なくとも同様に、理想的にはそれ以上に、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡに対して安定化効果を有する新規配列を同定しようとした。
本発明の目的は、安定性及び／又は翻訳効率が向上したＲＮＡ並びにそのようなＲＮＡを得るための手段を提供することであった。治療において前記ＲＮＡを使用することにより、より高い段階の発現を得ることが可能なはずである。
この目的は、請求項の主題によって、本発明に従って達成される。
本発明は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの安定化及びｍＲＮＡ翻訳の増加に関する。本発明は具体的には、転写安定性及び／又は翻訳効率の向上をもたらす、ＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの修飾に関する。
本発明によれば、ＲＮＡ分子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）における特定の配列が安定性及び翻訳効率を改善することが実証された。
本発明に従って修飾されたＲＮＡを樹状細胞（ＤＣ）のトランスフェクションにおいて使用することにより、例えば、トランスフェクトされた細胞上の抗原特異的ペプチド／ＭＨＣ複合体の密度を高めること、並びにその複合体の、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して増殖する能力を高めることが可能であろう。したがって本発明は、一実施態様では、本発明に記載のＲＮＡ修飾によって修飾されたＲＮＡを使用することにより、ＤＣ又はＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣワクチンをトランスフェクトするためのＲＮＡワクチンを最適化するための方策に関する。
本発明によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡ転写用鋳型として好ましくは働く発現ベクターを遺伝子修飾することにより、ＲＮＡの修飾、それにより安定化及び／又は翻訳効率の向上が好ましくは達成される。これらの発現ベクターは、好ましくはペプチド又はタンパク質をコードする配列（オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に本発明に記載の３’非翻訳領域を有するＲＮＡの転写を可能にする。
これらのベクターは、好ましくは前記ＲＮＡ中にオープンエンドを有するポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡの転写も可能にし得る。すなわちＲＮＡの３’末端において前記ポリ（Ａ）配列に隣接するＡヌクレオチド以外のヌクレオチドはない。ＲＮＡを５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で転写させることができ、かつ、ポリアデニルカセットを含有する発現ベクターにＩＩＳ型制限切断部位を導入することによって、ＲＮＡ中にオープンエンド型ポリ（Ａ）配列を得ることができ、その認識配列はポリアデニルカセットの３’に位置し、一方、切断部位は上流に、したがってポリアデニルカセット内に位置する。ＩＩＳ型制限切断部位における制限切断は、ポリアデニルカセット内でプラスミドを線状化することを可能にする。ひいては、線状プラスミドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用鋳型として使用することができ、得られた転写物は、マスクされていないポリ（Ａ）配列になる。さらに、４個のヌクレオチド（リンカー）の均等な分布を有するランダムヌクレオチド配列による３’ポリアデニルカセットの任意選択的な破壊は、大腸菌における３’ポリアデニルカセットの安定性を高める。
一態様において、本発明は、転写の５’ → ３’方向に以下を含む核酸分子に関する。
（ａ） プロモーター；
（ｂ） 転写可能な核酸配列又は転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；並びに
（ｃ） 転写中の３’非翻訳領域を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列であって、前記３’非翻訳領域が以下からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸配列：
（ｃ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
並びに
（ｃ－８） （ｃ－１）、（ｃ－２）、（ｃ－３）、（ｃ－４）、（ｃ－５）、（ｃ－６）及び（ｃ－７）の２つ以上の核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせ。
一実施態様では、プロモーター（ａ）の制御下にある核酸配列（ｂ）及び（ｃ）は、転写されて、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに、核酸配列（ｃ）から転写された核酸配列が活性である共通転写物(common transcript)を生じることができる。
一実施態様において、核酸配列（ｂ）及び（ｃ）は、天然では連結されていない。
一実施態様において、ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）は、配列番号８６から８９より選択される核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む。
一実施態様において、ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）は、配列番号８６の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む。
一実施態様において、ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）は、配列番号１０５から１２１より選択される核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む。
一実施態様において、ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）は、配列番号１１５の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む。
一実施態様において、核酸配列（ｃ－８）は、（ｃ－１）、（ｃ－２）、（ｃ－３）、（ｃ－４）、（ｃ－５）、（ｃ－６）及び（ｃ－７）の２つ以上の同じか又は異なる核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせを含む。さまざまな実施態様において、核酸配列（ｃ－８）は、（ｃ－１）と（ｃ－２）、（ｃ－１）と（ｃ－３）、（ｃ－１）と（ｃ－４）、（ｃ－１）と（ｃ－５）、（ｃ－１）と（ｃ－６）、（ｃ－１）と（ｃ－７）、（ｃ－２）と（ｃ－３）、（ｃ－２）と（ｃ－４）、（ｃ－２）と（ｃ－５）、（ｃ－２）と（ｃ－６）、（ｃ－２）と（ｃ－７）、（ｃ－３）と（ｃ－４）、（ｃ－３）と（ｃ－５）、（ｃ－３）と（ｃ－６）、（ｃ－３）と（ｃ－７）、（ｃ－４）と（ｃ－５）、（ｃ－４）と（ｃ－６）、（ｃ－４）と（ｃ－７）、（ｃ－５）と（ｃ－６）、（ｃ－５）と（ｃ－７）又は（ｃ－６）と（ｃ－７）の組み合わせを含む。
一実施態様において、核酸配列（ｃ－８）は、ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）と、ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）との組み合わせを含む。一実施態様において、ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）は、ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）に対して５’に位置する。一実施態様において、ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）とＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）との組み合わせは、配列番号１７４の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む。
一実施態様において、本発明の核酸分子は、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列（ｄ）をさらに含む。一実施態様において、前記ポリアデニル配列は、少なくとも２０のＡヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０、少なくとも８０、少なくとも１００又は少なくとも１２０個のＡヌクレオチド、好ましくは連続Ａヌクレオチドを含む。一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、２個以上の連続ヌクレオチドの、好ましくは任意の配列であり、２個以上の連続ヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドである。一実施態様において、前記核酸配列（ｄ）は、ヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含むポリアデニル配列である核酸配列を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列であり、かつ、大腸菌内で前記核酸分子が増殖すると、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含むポリアデニル配列である前記核酸配列と同じ長さのポリアデニル配列を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列（ｄ）’を前記核酸配列（ｄ）の代わりに含む核酸分子と比較して、より高い安定性を示す。一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列は、少なくとも８０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも９０又は１００個のヌクレオチドを含む。一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列は、少なくとも９０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１１０個のヌクレオチドを含む。一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列は、約１２０個のヌクレオチドを含む。特定の実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列は、２００個まで、好ましくは１５０個まで、特に１３０個までのヌクレオチドを含む。一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列のヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９５％、９７％又は９８％は、前記ポリアデニル配列中のＡヌクレオチドである（Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列中のＡヌクレオチドは含まない）。
一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、前記ポリアデニル配列の２１位から８０位、好ましくは２１位から６０位、さらに好ましくは３１位から５０位の領域内に位置する。
一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基、好ましくは少なくとも３０、４０又は５０個のＡ残基の後にある。特定の実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、前記ポリアデニル配列中の８０個までのＡ残基、好ましくは７０又は６０個までのＡ残基の後にある。
一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列に、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基、好ましくは少なくとも３０、４０、５０、６０又は７０個のＡ残基が続く。特定の実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列に、前記ポリアデニル配列中の１００個までのＡ残基、好ましくは８０個までのＡ残基が続く。
一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、前記ポリアデニル配列中の２０から５０個、好ましくは３０から４０個のＡ残基の後にあり、これに３０から８０個、好ましくは４０から７０個のＡ残基が続く。
一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する。
一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、５０個以下、好ましくは３０個以下、さらに好ましくは２０個以下のヌクレオチドの長さを有する。
一実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列は、３個を超えない、好ましくは２個以下の、好ましくは連続していないＡ残基を含む。
一実施態様において、プロモーター（ａ）の制御下にある核酸配列（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、転写されて、共通転写物を生じることができる。一実施態様において、核酸配列（ｃ）及び任意選択的に（ｄ）から転写された核酸配列は、転写可能な核酸配列（ｂ）．から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに活性である。
一実施態様では、転写物中、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列は、３’末端に位置する。
一実施態様において、本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子である。一実施態様において、前記核酸分子は、ＩＶＴベクターなどの発現ベクター又はプラスミドである。
一実施態様において、本発明の核酸分子は、閉環状分子又は線状分子である。
一実施態様において、転写可能な核酸配列は、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列は、マルチクローニングサイトである。
一実施態様において、本発明の核酸分子は、（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー、及び（ｉｉｉ）複製開始点からなる群より選択される１以上の要素をさらに含む。
一実施態様において、本発明の核酸分子は、特に線状化後、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適している。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に先立って、環状ＩＶＴベクターは通常、ポリアデニルカセットの下流でＩＩ型制限酵素によって線状化される（認識配列は切断部位に相当する）。したがって、ポリアデニルカセットは、転写物中の後半のポリ（Ａ）配列に相当する。この手順の結果、一部のヌクレオチドは、線状化後に酵素切断部位の一部として残り、３’末端でポリ（Ａ）配列を伸長又はマスクする。しかし、オープンエンドポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡは、マスクされた末端を伴うポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳されることが見出された。
したがって、発現ベクターとして使用される場合の本発明の核酸分子は、好ましくは前記ＲＮＡ中にオープンエンドを有するポリ（Ａ）配列を有するＲＮＡの転写も可能にし得る。すなわちＲＮＡの３’末端において前記ポリ（Ａ）配列に隣接するＡヌクレオチド以外のヌクレオチドはない。ＲＮＡを５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で転写させることができ、かつ、ポリアデニルカセットを含有する発現ベクターに、ＩＩＳ型制限切断部位を導入することによってＲＮＡ中のオープンエンド型ポリ（Ａ）配列を得ることができ、その認識配列はポリアデニルカセットの下流に位置し、一方、切断部位は上流に、したがってポリアデニルカセット内に位置する。ＩＩＳ型制限切断部位における制限切断は、ポリアデニルカセット内でプラスミドを線状化することを可能にする。ひいては、線状プラスミドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用鋳型として使用することができ、得られた転写物は、マスクされていないポリ（Ａ）配列になる。
したがって、一実施態様では、本発明の核酸分子は、核酸配列（ｄ）内で、前記切断が５’ → ３’方向の転写においてプロモーター（ａ）、核酸配列（ｂ）及び（ｃ）、並びに核酸配列（ｄ）の少なくとも一部を含む核酸分子をもたらすように、好ましくは酵素的に又は別の生化学的方法で切断され得ることが好ましく、この場合核酸配列（ｄ）の少なくとも一部は、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードし、転写物中、３’末端ヌクレオチドは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列のＡヌクレオチドである。
好ましくは、切断後、核酸分子は、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列用の鋳型として働く鎖の末端に、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアテニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列用の鋳型として働く核酸配列の一部であるＴヌクレオチドを有する。
本発明の核酸分子は、好ましくは、切断前は閉環状分子であり、切断後は線状分子である。
好ましくは、切断は、好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限切断部位である制限切断部位を用いて行われる。
一実施態様において、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、核酸配列（ｄ）の３’末端の下流の５～２６塩基対、好ましくは２４～２６塩基対に位置する。
一実施態様において、本発明の核酸分子は、閉環構造であり、特に線状化後のＲＮＡ、特にｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に好ましくは適している。
さらなる態様において、本発明は、上記核酸分子の線状化により、好ましくは核酸配列（ｄ）内での切断により得られる核酸分子に関し、かつ、プロモーター（ａ）の制御下で上記核酸分子を用いる転写、好ましくはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られるＲＮＡに関する。
したがって、一態様における本発明は、５’ → ３’方向に以下を含むＲＮＡに関する。
（ａ） ５’非翻訳領域；
（ｂ） ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列；並びに
（Ｃ） 以下からなる群より選択される核酸配列を含む３’非翻訳領域：
（ｃ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
及び
（ｃ－８） （ｃ－１）、（ｃ－２）、（ｃ－３）、（ｃ－４）、（ｃ－５）、（ｃ－６）及び（ｃ－７）の２つ以上の核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせ。
一実施態様において、核酸配列（ｂ）及び（ｃ）は、天然では連結されていない。
一実施態様では、ＲＮＡは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列（ｄ）をさらに含む。一実施態様において、前記核酸配列（ｄ）は、前記ＲＮＡの３’末端に位置する。
一実施態様において、核酸配列（ｃ）及び任意選択的に（ｄ）は、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに活性である。
一実施態様では、ＲＮＡは、５’キャップ（ｅ）をさらに含む。
３’非翻訳領域及び、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列の実施態様は、本発明の核酸分子について上に記載した通りである。
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ） 本発明の核酸分子を提供すること、及び
（ｉｉ） 核酸分子を鋳型として用いてＲＮＡを転写すること
を含む、ＲＮＡを得る方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ） 本発明のＲＮＡを得る方法に従って、ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡを得ること、及び
（ｉｉ） ＲＮＡを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法に関する。
一実施態様において、ＲＮＡを得る方法又はペプチド若しくはタンパク質を得る方法は、核酸分子の転写の前に核酸分子の切断をさらに含む。
さらなる態様では、本発明は、
（Ｉ） 転写される際に３’非翻訳領域をコードする核酸配列（ｂ）を、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む転写可能な核酸配列（ａ）の３’末端でカップリングすること、及び
（ｉｉ） 得られた核酸を転写すること
を含み、
前記３’非翻訳領域が、
（ｂ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
及び
（ｂ－８）（ｂ－１）、（ｂ－２）、（ｂ－３）、（ｂ－４）、（ｂ－５）、（ｂ－６）及び（ｂ－７）の２つ以上の核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせ
からなる群より選択される核酸配列を含む、ＲＮＡを得る方法に関する。
一実施態様では、核酸配列（ａ）及び（ｂ）は、転写されて、転写可能な核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに、核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる。
一実施態様において、核酸配列（ａ）及び（ｂ）は、天然では連結されていない。
一実施態様において、本発明の方法は、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、転写される際にコードする核酸配列（ｃ）を、核酸配列（ｂ）の３’末端でカップリングすることをさらに含む。
一実施態様では、核酸配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、転写されて、転写可能な核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに、核酸配列（ｂ）及び任意選択的に（ｃ）から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる。
３’非翻訳領域及び、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列の実施態様は、本発明の核酸分子について上に記載した通りである。
さらなる態様では、本発明は、
（ｉ） 本発明のＲＮＡを得る方法によりＲＮＡを得ること、及び
（ｉｉ） ＲＮＡを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法に関する。
本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。本発明の方法のいずれかの一実施態様では、転写はｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。
一実施態様において、ＲＮＡを得る方法又はペプチド若しくはタンパク質を得る方法は、核酸分子の転写の前に核酸分子の切断をさらに含む。
一実施態様において、切断は、このようにして得られた核酸の転写が、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列を３’末端に有する転写物を生じるように、ポリアデニル配列内にＡヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列を任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、転写される際にコードする核酸配列内にあり、この場合前記転写物の３’末端ヌクレオチドは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列のＡヌクレオチドである。
本発明の方法の全態様において、切断は、好ましくはＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの切断部位である制限切断部位を用いて、好ましくは行われる。
一実施態様において、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、転写される際にコードする核酸配列の３’末端の下流の５～２６塩基対、好ましくは２４～２６塩基対である。
本発明はまた、ＲＮＡを得る本発明の方法によって得られるＲＮＡに関する。
本発明は、例えば細胞の転写及び発現における組換えタンパク質の発現を増加させるために利用することができる。より具体的には、組換えタンパク質を生産する場合、組換え核酸の転写及び細胞ベースの系における組換えタンパク質の発現のために本発明の発現ベクターを使用することが可能である。これには、例えば組換え抗体、ホルモン、サイトカイン、酵素等の調製が含まれる。これにより、とりわけ生産コストを削減することができる。
遺伝子治療の用途に本発明の核酸分子を使用することも可能である。したがって、本発明の核酸分子は、遺伝子治療ベクターであり得、導入遺伝子の発現のために使用され得る。この目的で、任意の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）ベースのベクター系（例えばプラスミド、アデノウイルス、ポックスウイルスベクター、インフルエンザウイルスベクター、アルファウイルスベクター等）を使用することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えばリンパ球若しくは樹状細胞において、又は直接投与によってｉｎ ｖｉｖｏで、これらのベクターで細胞をトランスフェクトすることができる。
（例えば本明細書に記載の核酸分子を転写鋳型として用いて得られた）本発明のＲＮＡは、例えば遺伝子の一過性発現に（考えられる利用分野としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞にトランスフェクトされるか又はｉｎ ｖｉｖｏで直接投与されるＲＮＡベースのワクチンがある）、例えば細胞において分化プロセスを開始するため又はタンパク質の機能を研究するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの機能性組換えタンパク質の一過性発現に、及びｉｎ ｖｉｖｏでの機能性組換えタンパク質（エリスロポエチン、ホルモン、凝固阻害剤等）の一過性発現に、特に医薬品として用いることができる。
本発明のＲＮＡは、特に抗原提示細胞をトランスフェクトするために、したがって提示される抗原を送達するためのツールとして、また、抗原提示細胞にロードするために使用することができ、前記提示される抗原は、前記ＲＮＡから発現されるペプチド又はタンパク質に対応するか又はそれに由来し、特に切断などの細胞内プロセシングを経ており、すなわち提示される抗原は、例えばＲＮＡから発現されるペプチド又はタンパク質の断片である。このような抗原提示細胞は、Ｔ細胞、特にＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激するために使用することができる。
したがって、さらなる態様において、本発明は、宿主細胞をトランスフェクトするための本発明のＲＮＡの使用に関する。一実施態様において、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球又はマクロファージである。
さらなる態様において、本発明は、治療、特にワクチンのための本発明のＲＮＡの使用に関する。
さらなる態様において、本発明は、本発明のＲＮＡを含むワクチン組成物などの医薬組成物に関する。
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の用途のための本発明のＲＮＡに関する。
本発明は、下記に詳細に記載されているが、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコール、及び試薬に限定されるものではなく、変更可能であることを理解されたい。また、本明細書で用いる用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことを理解されたい。特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。
以下、本発明の要素について説明する。これらの要素は特定の実施態様と共に列挙されているが、追加の実施態様を作るために任意の方法で任意の数で組み合わせることができるものとする。さまざまに記載された実施例及び好ましい実施態様は、明示的に記載された実施態様のみに本発明を限定するためのものではないと解釈されるものとする。この説明は、明示的に記載された実施態様をいかなる数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施態様もサポートし包含すると理解されるものとする。さらに、本出願に記述された全要素のいかなる並並べ替え及び組み合わせも、文脈上別段の指定がない限り、本出願の本明細書によって開示されるものとみなされる。例えば、好ましい実施態様であれば、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列は、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基の後にあり、別の好ましい実施態様であれば、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列の後に、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基が続き、好ましい実施態様とみなされるのは、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列の前後に前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基があるものである。
好ましくは、本明細書で使用される用語は、「A multilingual glossary of biotechnological terms:（ＩＵＰＡＣ推薦))」、H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載されている。
本発明の実施は、別途指示がない限り、当該分野の文献で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、及び組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, J. Sambrookら編, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989を参照）。
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通じて、文脈上他に要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変化形は、記載されている要素、完全体若しくは工程又は要素、完全体若しくは工程の群の包含を意味するが、他の任意の要素、完全体若しくは工程又は要素、完全体若しくは工程の群も除外しない。本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び類似の言及は、本明細書に別途指示がない限り又は文脈上明らかに矛盾がない限り、単数と複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲に入る各個々の値に個別に言及する略式の方法とすることを単に意図するものである。本明細書に別途指示がない限り、各個々の値は、本明細書にあたかも個別に列挙されているかのように、本明細書に援用される。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別途指示がない限り又は文脈上明らかに矛盾がない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される一切の例又は例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、単に本発明をよりよく説明するためのものであり、別段に請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、本発明の実施に不可欠な任意の請求されていない要素を示すものとして解釈されないものとする。
本明細書の本文を通じて、複数の文献が引用されている。本明細書に引用された各文献（特許、特許出願、科学出版物、メーカー仕様書、使用説明書等、すべてを含む）は、上記下記を問わず、参照によりその全体が本明細書に援用される。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によって、かかる開示に先行する資格がないと認めるものとして解釈されるべきではない。
本発明は、修飾された３’非翻訳領域（ＵＴＲ）をコードする核酸配列をＲＮＡ中に含む、ＲＮＡ発現ベクターとして有用なＤＮＡプラスミドなどの核酸分子がＲＮＡに安定化効果を及ぼし、かつ／又はＲＮＡの翻訳効率を高めることを記述する。
用語「転写物中の３’非翻訳領域を、転写される際にコードする核酸配列」は、前記３’非翻訳領域をコードする鋳型鎖を含有する核酸配列に関する。好ましくは、前記核酸配列は、生成されたＲＮＡ転写物の前記３’非翻訳領域と同じ核酸配列を含むコード鎖を含む（但しチミンはウラシルに置き換えられている）。したがって、本発明によれば、「転写物中の３’非翻訳領域を、転写される際にコードする核酸配列」は、一実施態様では、本明細書中で特定されるような３’非翻訳領域を含むコード鎖を含む（但しチミンはウラシルに置き換えられている）。
「ＦＣＧＲＴ」という用語は、ＩｇＧのＦｃ断片、受容体、輸送体、アルファ (Fc fragment of IgG, receptor, transporter, alpha)を指し、ＦＣＧＲＴ遺伝子を含む。この遺伝子は、単量体免疫グロブリンＧのＦｃ領域に結合する受容体をコードする。コードされたタンパク質は、胎盤を介して母親から胎児へ免疫グロブリンＧ抗体を移入する。このタンパク質はまた、抗体を分解から保護するために免疫グロブリンＧに結合する。
「ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片」という用語は、配列表の配列番号１から５０からなる群より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。一実施態様では、この用語は、配列番号１から５０からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号２７の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号２７の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
「ＬＳＰ１」という用語は、リンパ球特異的タンパク質１(Lymphocyte-Specific Protein 1)を指し、ＬＳＰ１遺伝子を含む。この遺伝子は、細胞内のＦ－アクチン結合タンパク質をコードする。このタンパク質は、リンパ球、好中球、マクロファージ、及び内皮において発現され、好中球の運動性、フィブリノゲンマトリックスタンパク質への接着及び経内皮遊走を調節し得る。
「ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片」という用語は、配列表の配列番号５１から７２からなる群より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。一実施態様では、この用語は、配列番号５１から７２からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号５２の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号５２の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
「ＣＣＬ２２」という用語は、ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド２２（Chemokine (C-C Motif) Ligand 22）を指し、ＣＣＬ２２遺伝子を含む。この遺伝子の産物は、ケモカイン受容体ＣＣＲ４に結合する。このケモカインは、活性化Ｔリンパ球の炎症部位への輸送及び活性化Ｔリンパ球生理学の他の態様において役割を果たし得る。
「ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片」という用語は、配列表の配列番号７３から８５からなる群より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。一実施態様では、この用語は、配列番号７３から８５からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号７９の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号７９の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
「ＡＥＳ」という用語は、スプリット遺伝子のアミノ末端エンハンサー(Amino-Terminal Enhancer Of Split)を指し、ＡＥＳ遺伝子を含む。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、ｇｒｏｕｃｈｏ／ＴＬＥファミリーのタンパク質に属し、ホモオリゴマーとして、又は他のファミリーメンバーとのヘテロオリゴマーとして機能して、他のファミリーメンバー遺伝子の発現を圧倒的に抑制することができる。
「ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片」という用語は、配列表の配列番号８６から８９より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸若しくはその断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。一実施態様では、この用語は、配列番号８６から８９からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号８６の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号８６の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号８６の１から６８位、１から１０２位、３５から１０２位、３５から１３６位又は６８から１３６位の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号８６の１から６８位、１から１０２位、３５から１０２位、３５から１３６位又は６８から１３６位の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
「ＰＬＤ３」という用語は、ホスホリパーゼＤファミリー、メンバー３(Phospholipase D Family, Member 3)を指し、ＰＬＤ３遺伝子を含む。この遺伝子は、膜リン脂質の加水分解を触媒する酵素のホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）ファミリーのメンバーをコードする。コードされたタンパク質は、１回通過ＩＩ型膜タンパク質であり、２つのＰＬＤホスホジエステラーゼドメインを含有する。このタンパク質は、アミロイドベータ前駆体タンパク質のプロセシングに影響を及ぼす。この遺伝子の突然変異は、アルツハイマー病のリスクと関連している。
「ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片」という用語は、配列表の配列番号９０から１０４からなる群より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。一実施態様では、この用語は、配列番号９０から１０４からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号９６の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号９６の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
「ＭＴ＿ＲＮＲ１」という用語は、ミトコンドリアコード化１２Ｓ ＲＮＡ（Mitochondrially Encoded 12S RNA）を指し、ＭＴ＿ＲＮＲ１遺伝子を含む。このＲＮＡ遺伝子は、Ｍｔ＿ｒＲＮＡクラスに属する。ＭＴ－ＲＮＲ１に関連する疾患には、拘束性心筋症及び聴覚神経障害が含まれる。その関連経路には、真核生物におけるリボソーム生合成及びＣＦＴＲ翻訳忠実性（クラスＩ変異）がある。
「ＭＴ＿ＲＮＲ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片」という用語は、配列表の配列番号１０５から１２１からなる群より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。一実施態様では、この用語は、配列番号１０５から１２１からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号１１５の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号１１５の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号１１５の１から７１位、１から１０７位、３７から１０７位、３７から１４２位又は７１から１４２位の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号１１５の１から７１位、１から１０７位、３７から１０７位、３７から１４２位又は７１から１４２位の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
「ＨＬＡ－ＤＲＢ４」という用語は、主要組織適合複合体クラスＩＩ、ＤＲベータ４(Major Histocompatibility Complex, Class II, DR Beta 4)を指し、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子を含む。ＨＬＡ－ＤＲＢ４は、ＨＬＡクラスＩＩベータ鎖パラログに属する。このクラスＩＩ分子は、アルファ（ＤＲＡ）鎖とベータ（ＤＲＢ）鎖とからなるヘテロダイマーであり、双方とも膜中に固定されている。これは、細胞外タンパク質由来のペプチドを提示することによって、免疫系において中心的な役割を果たす。クラスＩＩ分子は、抗原提示細胞（ＡＰＣ：Ｂリンパ球、樹状細胞、マクロファージ）において発現される。
「ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片」という用語は、配列表の配列番号１２２から１４３からなる群より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。一実施態様では、この用語は、配列番号１２２から１４３からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号１２６の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号１２６の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
特定の遺伝子の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片、又は前記核酸配列の変異体若しくは断片に関して「２つ以上の核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせ」という用語は、２つ以上、３つ以上又は４つ以上、好ましくは６つまで又は５つまでの前記核酸配列、断片及び／又は変異体が、任意選択的にリンカーによって間隔を置いてヘッドトゥーテールで並んでいることを意味する。一実施態様において、２つ以上の核酸配列、断片、及び／又は変異体の組み合わせは、２つ以上の異なる及び／又は２つ以上の同じ核酸配列、断片、及び／又は変異体を含む。一実施態様において、２つ以上の核酸配列、断片、及び／又は変異体の組み合わせは、同じ及び／又は異なる遺伝子の３’非翻訳領域の２つ以上の異なる核酸配列、断片、及び／又は変異体を含む。
一実施態様では、この用語は、配列番号１４４から２２０、好ましくは１７４及び２０８から２２０からなる群より選択される核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。一実施態様において、この用語は、配列番号１４４から２２０、好ましくは配列番号１７４及び２０８から２２０からなる群より選択される核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列若しくはその断片、又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を指す。特に好ましい実施態様では、この用語は、配列番号１７４の核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列に、又は配列番号１７４の核酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％同一である核酸配列を含む、好ましくはそれからなる核酸配列を指す。
本発明によれば「リンカー」という用語は、２つの核酸配列の間に加えられ、前記２つの核酸配列を連結する核酸配列を指す。リンカー配列に関して特に限定はない。
本発明によれば、核酸分子又は核酸配列は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換えで調製されたもの、化学合成分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖又は二本鎖及び線状又は共有結合閉環状分子の形態であってもよい。
本発明の文脈では、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくはリボヌクレオチド残基で完全に又は実質的に構成される分子を指す。「リボヌクレオチド」という用語は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを指す。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ（例えば部分又は完全精製ＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、及び組換え産生ＲＮＡ、例えば１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は改変による、天然ＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡ）を含む。このような改変は、ＲＮＡの末端への、又は内部的な、例えばＲＮＡの１個以上のヌクレオチドにおける非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチド又は化学合成ヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドなどの非標準ヌクレオチドを含み得る。これらの改変ＲＮＡは、アナログ、特に天然ＲＮＡのアナログと呼ぶことができる。本発明によれば、ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含む。
用語「ｍＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を用いて生成される、ペプチド又はタンパク質をコードする転写物を指す。典型的には、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、タンパク質コード領域、３’－ＵＴＲ、及びポリ（Ａ）配列を含む。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成され得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写法は、当業者に既知である。例えば、さまざまなｉｎ ｖｉｔｒｏ転写キットが市販されている。本発明によれば、ｍＲＮＡは、本発明による修飾に加えて、さらに安定化修飾及びキャッピングによって修飾され得る。
本発明の一実施態様において、ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡ、例えば一本鎖自己複製ＲＮＡである。一実施態様において、自己複製ＲＮＡは、ポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡである。一実施態様において、自己複製ＲＮＡは、ウイルスＲＮＡ又はウイルスＲＮＡに由来するＲＮＡである。一実施態様において、自己複製ＲＮＡは、アルファウイルスゲノムＲＮＡ又はアルファウイルスゲノムＲＮＡに由来する。一実施態様において、自己複製ＲＮＡは、ウイルス遺伝子発現ベクターである。一実施態様において、ウイルスは、セムリキ森林ウイルスである。一実施態様において、自己複製ＲＮＡは、１以上の導入遺伝子を含有する。一実施態様において、ＲＮＡがウイルスＲＮＡであるか又はウイルスＲＮＡに由来する場合、導入遺伝子は、構造タンパク質をコードするウイルス配列などのウイルス配列を部分的又は完全に置換し得る。一実施態様において、自己複製ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡである。
用語「５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見出されるキャップ構造を指し、一般に、異常な５’から５’トリホスフェート連結（5’ to 5’ triphosphate linkage）を介してｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施態様において、このグアノシンは、７位でメチル化される。「従来の５’キャップ」という用語は、天然ＲＮＡ ５’キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明の文脈において、用語「５’キャップ」は、ＲＮＡキャップ構造に似ており、好ましくはｉｎ ｖｉｖｏ及び／又は細胞内で、ＲＮＡが付着している場合にＲＮＡを安定させる能力を有するように修飾された５’ キャップアナログを含む。５’キャップ又は５’キャップアナログを有するＲＮＡを提供することは、前記５’キャップ又は５’キャップアナログの存在下でのＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって達成することができ、前記５’キャップは生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれているか、又はＲＮＡは例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成され得、５’キャップはキャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いて転写後に生成され得る。
本発明の用語「核酸」は、ヌクレオチド塩基上、糖上又はリン酸塩上の核酸、並びに非天然ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを含有する核酸の化学的誘導体化も含む。
「断片」又は「核酸配列の断片」は、核酸配列の一部、すなわち５’－及び／又は３’末端において短縮された核酸配列を表す配列を指す。好ましくは、ＲＮＡ分子中の前記核酸配列を置換する場合の断片は、ＲＮＡ安定性及び／又は翻訳効率を保持する。好ましくは、核酸配列の断片は、前記核酸配列からのヌクレオチド残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。
本発明による、例えば核酸及びアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、コンフォメーション、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体及び種ホモログ、特にこれらの天然に存在するものを含む。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常な配列の変化を指し、その重要性は多くの場合不明である。完全な遺伝子配列決定は通常、所与の遺伝子について複数の対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所定の核酸又はアミノ酸配列のものとは異なる起源の種(species of origin)を有する核酸又はアミノ酸配列である。
本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較して、単一又は複数のヌクレオチド欠失、付加、突然変異及び／又は挿入を含む。欠失には、１個以上のヌクレオチドの参照核酸からの除去が含まれる。付加変異体は、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個又はそれ以上のヌクレオチドなど、１個以上のヌクレオチドの５’及び／又は３’末端融合体を含む。突然変異は、配列中の少なくとも１個のヌクレオチドが除去され、別のヌクレオチドがその場所（例えばトランスバーション及びトランジション）、無塩基部位、架橋部位、及び化学的に改変又は修飾された塩基に挿入される置換を含み得るが、これらに限定されない。挿入には、参照核酸への少なくとも１個のヌクレオチドの付加が含まれる。
核酸分子に関して、用語「変異体」は、縮重核酸配列を含み、本発明による縮重核酸は、遺伝コードの縮重が原因でコドン配列が参照核酸と異なる核酸である。
好ましくは、所定の核酸配列と前記所定の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％であろう。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０個、少なくとも約５０個、少なくとも約７０個、少なくとも約９０個、少なくとも約１００個、少なくとも約１５０個、少なくとも約２００個、少なくとも約２５０個、少なくとも約３００個、又は少なくとも約４００個のヌクレオチドの領域について与えられる。好ましい実施態様において、同一性の程度は、参照核酸配列の全長について与えられる。
「配列類似性」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換を示すアミノ酸のパーセンテージを示す。２つのポリペプチド配列又は核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸又はヌクレオチドのパーセンテージを示す。
用語「％同一」は、特に、比較される２つの配列間の最適なアラインメントが同一であるヌクレオチドのパーセンテージを指し、前記パーセンテージは純粋に統計的であり、２つの配列間の差は無作為に配列の全長にわたって分布し、比較される配列は、２つの配列間の最適なアラインメントを得るために、参照配列と比較して付加又は欠失を含むことができる。２つの配列の比較は通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメントの後にセグメント又は「比較ウインドウ」について前記配列を比較することによって実施される。比較のための最適なアライメントは、手動で、又はSmith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482による局所相同性アルゴリズムを用いて、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443による局所相同性アルゴリズムを用いて、及びPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444による類似性探索アルゴリズムを用いて、又は前記アルゴリズムを使ったコンピュータープログラム（575 Science Drive, Madison, WisのGenetics Computer GroupのWisconsin Genetics Software PackageにあるGAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 及びTFASTA）を用いて行うことができる。
同一性パーセンテージは、比較される配列が対応する同一位置の数を決定し、この数を比較される位置の数で割って、この結果に１００を掛けることによって得られる。
例えば、ウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgiで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ ２配列」を使用することができる。
核酸は、２つの配列が互いに相補的である場合、別の核酸に「ハイブリダイズすることができる」、又は「ハイブリダイズする」。２つの配列が互いに安定な二本鎖を形成することができる場合、核酸はもう一方の核酸に「相補的」である。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で、好ましくは実施される。ストリンジェントな条件は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrookら編, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989又はCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら編, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに記載されており、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中で６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ 塩化ナトリウム／０．１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば室温で２×ＳＳＣ中で、その後６８℃までの温度で０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。
相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合を形成することができる（例えばワトソン－クリック塩基対形成）、核酸分子中の連続残基のパーセンテージを示す（例えば１０個のうち５、６、７、８、９、１０個は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％及び１００％相補的である）。「完全に相補的」は、核酸配列のすべての隣接残基が、第２の核酸配列の同数の連続残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明の相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらにいっそう好ましくは少なくとも９０％又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％である。最も好ましくは、本発明の相補性の程度は、１００％である。
用語「誘導体」は、ヌクレオチド塩基上、糖上又はリン酸上の核酸の任意の化学的誘導体化を含む。用語「誘導体」はまた、非天然ヌクレオチドとヌクレオチドアナログとを含有する核酸を含む。好ましくは、核酸の誘導体化は、その安定性を高める。
特定の核酸配列又は特定の核酸配列に対して特定の同一性を有する核酸配列の断片又は変異体は、好ましくは前記特定配列の少なくとも１の機能特性を有し、好ましくは前記特定配列と機能的に同等である（例えば特定の核酸配列のものと同一又は類似の特性を示す核酸配列）。
１つの重要な特性は、ＲＮＡ分子の安定性及び／又は翻訳効率を保持又は改善することであり、特に、ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡ（転写可能な核酸配列）又は核酸に転写され得る核酸への機能的連結、この核酸から産生されたＲＮＡの、及び完全ＲＮＡ分子中のペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の安定性及び／又は翻訳効率を高める能力を含む。
一実施態様において、特定の核酸配列が別の核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに活性である場合、特定の核酸配列又は特定の核酸配列に対して特定の同一性を有する核酸配列の断片又は変異体もまた、別の核酸配列（それが特定の核酸配列を置換する場合）の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに活性である。特定の核酸配列又は特定の核酸配列に対して特定の同一性を有する核酸配列の断片又は変異体は、特定の核酸配列と同じくらい活性であるか若しくはそれよりも活性であり得、又は特定の核酸配列の、若しくは特定の核酸配列に対して特定の同一性を有する核酸の断片若しくは変異体の活性は、特定の核酸配列の活性の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％であり得る。
本発明によれば、「機能的連結」又は「機能的に連結された（されている）」は、機能的関係の範囲内での結合を指す。核酸が別の核酸配列と機能的に関連している場合、その核酸は、「機能的に連結」されている。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、前記コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、典型的には、互いに隣接し、必要な場合にはさらなる核酸配列によって分離され、特定の実施態様では、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて単一のＲＮＡ分子（共通転写物）を生じる。好ましくは、特定の配列に対する変異体である配列は、それがＲＮＡ分子中の特定の配列を置換する際、ＲＮＡ安定性及び／又は翻訳効率を保持する。
本発明によれば、「核酸配列に由来する核酸配列」は、それが由来する核酸の変異体である核酸を指す。
「核酸の３’末端」は、本発明によれば、遊離ヒドロキシ基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図表示において、３’末端は常に右側にある。「核酸の５’末端」は、本発明によれば、遊離リン酸基を有する末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図表示において、５’末端は常に左側にある。
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特定の実施態様では、核酸は、本発明によれば核酸に対して相同であっても異種であってもよい発現制御配列に機能的に連結されている。
転写可能な核酸配列（特にペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列）及び発現制御配列は、それらが、転写可能配列、特にコード核酸配列の転写又は発現が発現制御配列の制御下又は影響下にあるように相互に共有結合している場合、相互に「機能的に」連結されている。核酸配列が機能性ペプチド又はタンパク質に翻訳される場合、コード配列に機能的に連結された発現制御配列の導入は、前記コード配列の転写を、コード配列又は所望のペプチド若しくはタンパク質に翻訳することができないコード配列のフレームシフトを引き起こすことなく、もたらす。
用語「発現制御配列」は、本発明によれば、遺伝子の転写又はそれに由来するＲＮＡの翻訳を制御するプロモーター、リボソーム結合配列、及び他の制御要素を含む。本発明の特定の実施態様では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞タイプに依存して変化し得るが、通常は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等の転写及び翻訳の開始にそれぞれ関与する５’非転写、並びに５’－及び３’非翻訳配列を含む。さらに具体的には、５’非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列又は上流アクチベーターを含み得る。
本明細書に記載されている核酸配列、特に転写可能配列及びコード核酸配列は、任意の発現制御配列、特に前記核酸配列と相同又は異種であり得るプロモーターと組み合わされてもよく、用語「相同」は、核酸配列が天然では発現制御配列に機能的にも連結されているという事実を指し、「異種」という用語は、核酸配列が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないという事実を意味する。
「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、遺伝子のコード配列の上流（５’）のＤＮＡ配列を指し、ＲＮＡポリメラーゼの認識及び結合部位を提供することによって、前記コード配列の発現を制御する。プロモーター領域は、前記遺伝子の転写調節に関与するさらなる因子のさらなる認識又は結合部位を含み得る。プロモーターは、原核生物又は真核生物遺伝子の転写を制御することができる。プロモーターは、「誘導性」であり得、誘導物質に応答して転写を開始するか、又は誘導物質によって転写が制御されない場合には「構成的」であり得る。誘導物質が存在しない場合、誘導性プロモーターは、ごくわずかな程度にしか発現しないか、全く発現しない。誘導物質の存在下で、遺伝子は、「スイッチ・オン」されるか、又は転写レベルが上昇する。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。
本発明による好ましいプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ３又はＴ７ポリメラーゼのプロモーターである。
本発明によれば、「発現」という用語は、最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの産生又はＲＮＡ及びタンパク質の産生を含む。それは、核酸の部分発現も含む。さらに、発現は、一過性であっても安定であってもよい。ＲＮＡに関して、「発現」又は「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖がアミノ酸の配列の組み立てを指示してペプチド又はタンパク質を作製する、細胞のリボソームにおけるプロセスを指す。
「転写されて、共通転写物を生じることができる核酸配列」という用語は、前記核酸配列が、必要な場合には前記核酸配列を含む核酸分子、特に閉環状核酸分子の制限酵素の切断などの線状化後に、プロモーターの制御下での転写が、必要な場合には間に位置する配列によって分離されている、互いに共有結合された前記核酸配列の転写物を含むＲＮＡ分子をもたらすように、互いに機能的に連結されていることを意味する。
本発明の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝子コードがＲＮＡに転写されるプロセスを指す。続いて、ＲＮＡは、タンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」を含み、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写」という用語はＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系でｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されるプロセスを指す。好ましくは、転写物の生成のためにクローニングベクターが適用される。このようなクローニングベクターは一般に、転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、ＲＮＡは好ましくは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得ることができる。転写を制御するためのプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼのための任意のプロモーターとすることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングと、それをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のための適切なベクターへ導入することによって得ることができる。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得ることができる。
「核酸配列から転写された核酸配列」という用語は、必要な場合には、前者の核酸配列の転写産物である完全ＲＮＡ分子の一部としてのＲＮＡを指す。
「核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるために活性である核酸配列」という用語は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列との共通転写物中、前記第２の核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性が前記第１の核酸配列なしでの前記第２の核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性と比較して高められるように、前記翻訳効率及び／又は安定性を修飾することができることを意味する。これに関連して、「翻訳効率」という用語は、特定の期間内にＲＮＡ分子によって提供される翻訳産物の量を指し、「安定性」という用語は、ＲＮＡ分子の半減期を指す。
本発明の発現核酸分子を、ＲＮＡの３’末端で、好ましくはペプチド又はタンパク質をコードする配列（オープンリーディングフレーム）とポリ（Ａ）配列との間に、本明細書に記載の３’非翻訳領域を有するＲＮＡの転写を可能にするように発現ベクターとして使用する場合に遺伝子修飾することによって、ＲＮＡの修飾、並びにそれにより安定化及び／又は翻訳効率の向上が本発明に従って達成され得る。
「３’非翻訳領域」という用語は、タンパク質コード領域の終止コドンの下流の、遺伝子の３’末端に位置し、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されない領域、又はＲＮＡ分子中の対応する領域を指す。
本発明によれば、第１のポリヌクレオチド領域の５’末端が前記第２のポリヌクレオチド領域の３’末端に最も近い前記第１のポリヌクレオチド領域の一部である場合、第１のポリヌクレオチド領域は、第２のポリヌクレオチド領域の下流に位置すると考えられる。
３’非翻訳領域は典型的には、翻訳産物の終止コドンから、転写プロセス後に通例付加されるポリ（Ａ）配列に及ぶ。哺乳動物ｍＲＮＡの３’非翻訳領域は典型的には、ＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として知られる相同領域を有する。この配列は、おそらくポリ（Ａ）付加シグナルであり、ポリ（Ａ）付加部位の１０から３０塩基上流に位置することが多い。
３’非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働くか又はＲＮＡの安定性を高めることが知られているタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステム－ループ構造が生じるように折りたたむことができる１つ以上の逆方向反復を含み得る。
５’及び／又は３’非翻訳領域は、本発明によれば、前記転写可能な核酸から転写されたＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率が高められるように、転写可能な核酸、特にコード核酸と機能的に連結されて、これらの領域が核酸と結合される。
免疫グロブリンｍＲＮＡの３’非翻訳領域は比較的短く（約３００ヌクレオチド未満）、一方、他の遺伝子の３’非翻訳領域は比較的長い。例えば、ＰＡの３’非翻訳領域は約８００個のヌクレオチドの長さであり、第ＶＩＩＩ因子のそれは約１８００個のヌクレオチドの長さであり、エリスロポエチンのそれは約５６０個のヌクレオチドの長さである。
本発明によれば、３’非翻訳領域又はそれに由来する核酸配列がＲＮＡの安定性及び／又は翻訳効率を高めるか否かは、３’非翻訳領域又はそれに由来する核酸配列を遺伝子の３’非翻訳領域に組み込むこと、及び前記組み込みが合成されたタンパク質の量を増加させるかどうかを測定することにより、決定することができる。
したがって本発明によれば、上記は、核酸が、好ましくは「ヘッドトゥーテールの関係」で、間にリンカーが有る無しに関わらず、好ましくは連続してつながっている２以上の３’非翻訳領域を含む場合に当てはまる（すなわち、３’非翻訳領域は、同じ配向、好ましくは核酸の天然配向を有する）。
本発明によれば、「遺伝子」という用語は、１以上の細胞産物の生産及び／又は１以上の細胞間若しくは細胞内機能の獲得を担う特定の核酸配列を指す。より具体的には、前記用語は、特定のタンパク質又は機能的若しくは構造的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＤＮＡセクションを指す。
ポリアデニル化は、一次転写ＲＮＡにポリ（Ａ）配列又はテールを付加することである。ポリ（Ａ）配列は、複数のアデノシン一リン酸からなる。換言すれば、それは、アデニン塩基のみを有するＲＮＡのストレッチである。真核生物では、ポリアデニル化は、翻訳のための成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産生するプロセスの一部である。したがって、それは、遺伝子発現のより大きなプロセスの一部を形成する。ポリアデニル化のプロセスは、遺伝子転写の終了又は終結時に始まる。新たに作製されたｐｒｅ－ｍＲＮＡの３’最末端部分は、最初にタンパク質のセットによって切断される。その後、これらのタンパク質は、ＲＮＡの３’末端でポリ（Ａ）配列を合成する。ポリ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの核外輸送、翻訳及び安定性にとって重要である。この配列は経時的に短縮され、十分に短くなれば、ｍＲＮＡは酵素的に分解される。
「ポリアデニル配列」、「ポリ（Ａ）配列」又は「ポリ（Ａ）テール」という用語は、 ＲＮＡ分子の３’末端に通例位置するアデニル残基の配列を指す。本発明は、コード鎖に相補的な鎖中の反復チミジル残基に基づいて、ＤＮＡ鋳型を用いてＲＮＡ転写中に付着されるこのような配列を提供するが、前記配列は通常、ＤＮＡにコードされていないが、細胞核に転写された後に鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡの遊離３’末端に付着される。本発明によれば、一実施態様では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも４０個、好ましくは少なくとも８０個、好ましくは少なくとも１００個、好ましくは５００個まで、好ましくは４００個まで、好ましくは３００個まで、好ましくは２００個まで、特に１５０個までのＡヌクレオチド、好ましくは連続Ａヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを有する。「Ａヌクレオチド」又は「Ａ」という用語は、アデニル残基を指す。
好ましい実施態様において、本発明の核酸分子は、ベクターである。用語「ベクター」は、本明細書では最も一般的な意味で使用され、任意の核酸のための中間媒体、例えば前記核酸を原核細胞及び／又は真核生物の宿主細胞に導入し、適切な場合にはゲノムに組み込むことができるものを含む。このようなベクターは好ましくは、細胞内で複製及び／又は発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド又はウイルスゲノムを含む。本明細書で用いる用語「プラスミド」は一般に、染色体ＤＮＡとは無関係に複製することができる染色体外遺伝物質のコンストラクト、通常は環状ＤＮＡ二重鎖を指す。
本明細書に記載の核酸は、組換え及び／又は単離された分子であってもよい。
本明細書で用いる「単離された分子」は、他の細胞物質などの他の分子を実質的に含まない分子を指すことが意図される。本発明によれば、用語「単離された核酸」は、核酸が（ｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増殖され、（ｉｉ）クローニングによって組換え産生され、（ｉｉｉ）例えば切断及びゲル電気泳動分画によって精製され、又は（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されていることを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作に利用可能な核酸である。
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子工学によって作られた」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え体」は、天然には存在しない。
本明細書で使用される「天然（に存在する）」という用語は、物体が自然界に見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、天然の供給源から単離することができ、実験室でヒトによって意図的に修飾されていないペプチド又は核酸は、天然に存在する。
本発明によれば、用語「宿主細胞」は、外因性核酸で形質転換又はトランスフェクトされ得る任意の細胞を指す。用語「宿主細胞」は、本発明によれば、原核生物（例えば大腸菌）又は真核細胞（例えば酵母細胞及び昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長類由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。これらの細胞は、多様な組織型に由来し、初代細胞及び細胞系を含む。特定の例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞、及び胚性幹細胞が含まれる。他の実施態様において、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球又はマクロファージである。核酸は、宿主細胞中に単一又は複数のコピーで存在してもよく、一実施態様では宿主細胞中で発現される。
大腸菌は、通常温血生物の下部腸管で見出される、グラム陰性で通性嫌気性の、大腸菌属の棒状細菌である。この細菌は、実験室環境で容易かつ安価に増殖することができ、６０年以上にわたって徹底的に研究されている。大腸菌は、最も広く研究されている原核生物のモデル生物であり、かつ、バイオテクノロジ―及び微生物学の分野において重要な種であり、組換えＤＮＡを用いた研究の大半で宿主生物として役立っている。本発明による大腸菌株には、ＡＧ１、ＡＢ１１５７、Ｂ２１５５、ＢＬ２１、ＢＮＮ９３、ＢＮＮ９７、ＢＷ２６４３４、Ｃ６００、ＣＳＨ５０、Ｄ１２１０、ＤＢ３．１、ＤＨ１、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＤＨ１２Ｓ、ＤＭ１、大腸菌（ｒ）、大腸菌Ｋ１２ ＥＲ２７３８、ＥＲ２５６６、ＥＲ２２６７、ＨＢ１０１、ＩＪ１１２６、ＩＪ１１２７、ＪＭ８３、ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０６、ＪＭ１０７、ＪＭ１０８、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＪＭ２．３００、ＬＥ３９２、Ｍａｃｈ１、ＭＣ１０６１、ＭＣ４１００、ＭＦＤｐｉｒ、ＭＧ１６５５、ＯｍｎｉＭＡＸ２、ＲＲ１、ＲＶ３０８、ＳＯＬＲ、ＳＳ３２０、ＳＴＢＬ２、ＳＴＢＬ３、ＳＴＢＬ４、ＳＵＲＥ、ＳＵＲＥ２、ＴＧ１、ＴＯＰ１０、Ｔｏｐ１０Ｆ’、Ｗ３１１０、ＷＭ３０６４、ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、ＸＬ２－Ｂｌｕｅ、ＸＬ１－Ｒｅｄ、及びＸＬ１０－Ｇｏｌｄが含まれる。
本発明によれば、用語「ペプチド」は、オリゴペプチド及びポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して相互に連結した２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上、好ましくは５０個まで、好ましくは１００個まで又は好ましくは１５０個までの連続アミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では通常同義語として使用される。
用語「ペプチド」及び「タンパク質」は、本発明によれば、アミノ酸成分だけでなく、糖及びリン酸構造などの非アミノ酸成分も含有する物質を含み、かつ、エステル、チオエーテル又はジスルフィド結合などの結合を含む物質も含む。
本発明によれば、ＲＮＡなどの核酸は、ペプチド又はタンパク質をコードすることができる。したがって、転写可能な核酸配列又はその転写物は、ペプチド又はタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。前記核酸は、コードされたペプチド又はタンパク質を発現し得る。例えば、前記核酸は、免疫学的に活性な化合物（好ましくは抗原ではない）などの抗原又は薬学的に活性なペプチド若しくはタンパク質をコードし発現する核酸であってもよい。
本発明によれば、「ペプチド又はタンパク質をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳プロセス中にアミノ酸の配列の組み立てを指示して、ペプチド又はタンパク質を産生することができることを意味する。好ましくは、本発明によるＲＮＡは、ペプチド又はタンパク質の翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用することができる。
本発明によれば、一実施態様において、ＲＮＡは、薬学的に活性なＲＮＡを含むか又はそれからなる。「薬学的に活性なＲＮＡ」は、薬学的に活性なペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡであり得る。
「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、治療有効量で対象に投与された場合に、対象の状態又は病状にプラス又は有利な効果を及ぼす。好ましくは、薬学的に活性なペプチド又はタンパク質は、治癒的又は緩和的な特性を有し、疾患又は障害の１以上の症状の改善、除去、緩和、逆行、発症の遅延又はその重症度の軽減のために投与され得る。薬学的に活性なペプチド又はタンパク質は、予防的特性を有し得、疾患の発症を遅らせるか、又はそのような疾患又は病的状態の重症度を軽減するために使用され得る。用語「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、タンパク質又はポリペプチド全体を含み、その薬学的に活性な断片を指すこともできる。それはまた、ペプチド又はタンパク質の薬学的に活性なアナログも含み得る。用語「薬学的に活性なペプチド又はタンパク質」は、抗原であるペプチド及びタンパク質を含み、すなわちペプチド又はタンパク質は、対象において治療的であるか又は部分的若しくは完全に防御的であり得る免疫応答を誘発する。
薬学的に活性なタンパク質の例には、限定されないが、サイトカイン及び免疫系タンパク質、例えば免疫学的活性化合物（例えばインターロイキン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インテグリン、アドレシン、セレクチン（ｓｅｌｅｔｉｎ）、ホーミング受容体、Ｔ細胞受容体、免疫グロブリン、可溶性主要組織適合性複合体抗原、免疫学的活性抗原（例えば細菌性、寄生性又はウイルス抗原、アレルゲン、自己抗原、抗体）、ホルモン（インスリン、甲状腺ホルモン、カテコールアミン、ゴナドトロピン、刺激ホルモン、プロラクチン、オキシトシン、ドーパミン、ウシソマトトロピン、レプチン等）、成長ホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、成長因子（例えば上皮増殖因子、神経成長因子、インスリン様増殖因子等）、成長因子受容体、酵素（組織プラスミノーゲン活性化因子、ストレプトキナーゼ、コレステロール生合成又は分解酵素、ステロイド産生酵素、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、脱水素酵素、セルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、アロマターゼ、シトクロム、アデニル酸又はグアニル酸、シクラーゼ、ノイラミダーゼ（neuramidase）等）、受容体（ステロイドホルモン受容体、ペプチド受容体）、結合タンパク質（成長ホルモン又は成長因子結合タンパク質等）、転写及び翻訳因子、腫瘍成長抑制タンパク質（例えば血管新生を阻害するタンパク質）、構造タンパク質（例えばコラーゲン、フィブロイン、フィブリノーゲン、エラスチン、チューブリン、アクチン、及びミオシン）、血液タンパク質（トロンビン、血清アルブミン、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、インスリン、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、プロテインＣ、フォンウィレブランド因子、アンチトロンビンＩＩＩ、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）又は修飾第ＶＩＩＩ因子、抗凝結剤等が含まれる。
一実施態様において、本発明の薬学的に活性なタンパク質は、リンパ球ホメオスタシスの調節に関与するサイトカイン、好ましくは、Ｔ細胞の発生、プライミング、増殖、分化及び／又は生存に関与し、好ましくはこれらを誘導又は増強するサイトカインである。一実施態様において、サイトカインは、インターロイキンである。一実施態様において、本発明の薬学的に活性なタンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１からなる群より選択されるインターロイキンである。
「免疫学的活性化合物」という用語は、好ましくは免疫細胞の成熟を誘導及び／若しくは抑制すること、サイトカイン生合成を誘導及び／若しくは抑制すること、並びに／又はＢ細胞による抗体産生を刺激することによって液性免疫を変化させることによる、免疫応答を変化させる化合物を指す。免疫学的活性化合物は、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を含むがこれらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、かつ、例えば免疫応答をＴＨ２免疫応答から遠ざけるように免疫応答の他の局面を下方制御することもでき、広範囲のＴＨ２介在性疾患の治療のために有用である。免疫学的活性化合物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。
本発明によると、本明細書に記載のＲＮＡを使用することによって免疫応答を誘導又は増強することが望ましい場合、免疫応答は、ＲＮＡによって誘発又は増強され得る。例えば、ＲＮＡ又はそのプロセシング産物(procession product)によってコードされるタンパク質又はペプチドは、 抗原提示細胞上で発現される主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質によって提示され得る。ＭＨＣペプチド複合体は、Ｔ細胞などの免疫細胞によって認識され、その活性化をもたらす。
一実施態様において、疾患関連抗原などの抗原をコードするＲＮＡは、特に抗原関連疾患を有する哺乳動物を治療することが望ましい場合、哺乳動物に投与される。ＲＮＡは、哺乳動物の抗原提示細胞（単球、マクロファージ、樹状細胞又は他の細胞）に取り込まれる。ＲＮＡの抗原の翻訳産物が形成され、Ｔ細胞による認識のために、産物が細胞表面に提示される。一実施態様において、抗原に向けられたＣＡＲ操作されたＴ細胞による認識のために、抗原が細胞表面に提示される。一実施態様において、Ｔ細胞受容体を介したＴ細胞による認識のために、ＭＨＣ分子との関連で、抗原又は任意選択のそのプロセシング（procession）によって産生される産物が細胞表面上に提示される。
あるいは、本発明は、抗原を発現するＲＮＡが、エクスビボで抗原提示細胞、例えば患者から採った抗原提示細胞に導入される実施態様を想定しており、場合によって、クローン的に増殖されたエクスビボ抗原提示細胞が同じ患者に移植され戻される。トランスフェクションされた細胞は、当該技術分野で既知の任意の手段を用いて、好ましくは滅菌形態で静脈内、腔内、腹腔内又は腫瘍内投与により患者に再導入され得る。
本発明の方法は、抗原をコードするＲＮＡを発現させるための抗原提示細胞を伴い得る。このために、本発明の方法は、樹状細胞などの抗原提示細胞への抗原をコードするＲＮＡの導入を伴い得る。樹状細胞などの抗原提示細胞のトランスフェクションのために、抗原をコードするＲＮＡを含む薬学的組成物を使用することができる。ＲＮＡを樹状又は他の抗原提示細胞に標的化する送達媒体を患者に投与して、ｉｎ ｖｉｖｏで起こるトランスフェクションをもたらすことができる。
本発明によれば、全身投与後の脾臓において、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞に高い選択性でＲＮＡを送達する、抗原をコードするＲＮＡの製剤を使用することが好ましい。例えば、粒子の正味電荷がゼロに近い又は負である、規定の粒子サイズを有するナノ粒子ＲＮＡ製剤（例えばＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥ又はＤＯＴＭＡ及びコレステロールを含むリポプレックスといった、ＲＮＡ及びリポソームからの電気的に中性又は負電荷のリポプレックスなど）は、全身投与後に脾臓ＤＣにおいて実質的なＲＮＡ発現を導く。標的細胞（脾臓）における強い発現が決定されたが、他の器官における発現は低かった。
本明細書で使用される場合、用語「ナノ粒子」は、典型的には１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径の、全身投与、特に非経口投与に適した直径を有する任意の粒子、特に核酸の粒子を指す。いくつかの実施態様において、ナノ粒子は、６００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施態様において、ナノ粒子は、４００ｎｍ未満の直径を有する。
本明細書で使用される場合、用語「ナノ粒子製剤」又は類似の用語は、少なくとも１のナノ粒子を含有する任意の物質を指す。いくつかの実施態様において、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の均一な集合体である。いくつかの実施態様において、ナノ粒子組成物は、分散体又はエマルションである。一般に、少なくとも２種の非混和性材料を組み合わせると、分散体又はエマルションが形成される。
用語「リポプレックス」又は「核酸リポプレックス」、特に「ＲＮＡリポプレックス」は、脂質と核酸との複合体、特にＲＮＡを指す。リポプレックスは、しばしば中性の「ヘルパー」脂質も含むカチオン性リポソームが核酸と混合されると自然に形成される。
本発明で、例えば正電荷、負電荷若しくは中性電荷又はカチオン性化合物、負電荷化合物若しくは中性化合物などのように電荷をいう場合、これは一般に、言及した電荷が、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで存在することを意味する。例えば、用語「カチオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する脂質を意味する。「中性脂質」という用語は、正味の正又は負の電荷を持たない脂質を意味し、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで非荷電又は中性の両性イオンの形態で存在し得る。本明細書において「生理学的ｐＨ」とは、約７．５のｐＨを意味する。
例えば核酸が封入若しくはカプセル化された小胞を形成することによる、本発明における使用が企図されている脂質担体などのナノ粒子担体には、例えば核酸と複合体を形成するか、又はＲＮＡなどの核酸が結合することができる任意の物質又は媒体が含まれる。これは、裸の核酸と比較して、核酸の安定性の向上をもたらし得る。特に、血液中の核酸の安定性を高めることができる。
カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、及び正電荷を有する他の物質は、負電荷の核酸と複合体を形成し得る。これらのカチオン性分子は、核酸を複合体化するのに使用することができ、したがって、例えば、それぞれいわゆるリポプレックス又はポリプレックスを形成し、これらの複合体は核酸を細胞に送達することが示されている。
本発明における使用のためのナノ粒子状核酸調製物は、種々のプロトコールよって、種々の核酸複合体形成化合物から得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー又は両親媒性物質（amphipile）が、典型的な複合体形成剤である。一実施態様において、複合体形成化合物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリ－Ｌ－アルギニン又はヒストンからなる群から選択される少なくとも１種の薬剤を含む。
本発明によれば、プロタミンはカチオン性キャリア剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンが豊富であり、さまざまな動物（魚など）の精子細胞中の体細胞ヒストンに代わって、特にＤＮＡと結合している比較的低分子量の、種々の強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性であり、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、主に加水分解時にアルギニンを生じる魚精子に見られるタンパク質を指す。精製された形態では、インスリンの長時間作用型製剤に用いられ、ヘパリンの抗凝固作用を中和する。
本発明によれば、本明細書中で使用される「プロタミン」という用語は、アミノ酸配列の断片及び前記アミノ酸配列又はその断片の多量体型を含む、天然又は生物源から得られたか又はそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列を含むことを意味する。さらに、この用語は、人工的で、特定の目的のために特別に設計され、天然又は生物源から単離することができない（合成）ポリペプチドを包含する。
本発明に従って使用されるプロタミンは、硫酸プロタミン(sulfated protamine)又は塩酸プロタミン(hydrochloride protamine)であり得る。好ましい実施態様では、本明細書に記載のナノ粒子の製造に使用されるプロタミン源は、等張塩溶液中に１０ｍｇ／ｍｌ（５０００ヘパリン中和単位／ｍｌ）を超えるプロタミンを含有するプロタミン５０００である。
リポソームは通常、リン脂質などの小胞形成脂質の二重層を１つ以上の有し、薬物をカプセル化することができる微視的な脂質小胞である。本発明においては、多層小胞（ＭＬＶ）、小単層小胞（ＳＵＶ）、大単層小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多胞体小胞（ＭＶ）及び大型多胞体小胞（ＬＭＶ）、並びに当該分野で既知の他の二重層形態を含むがこれらに限定されない、さまざまな種類のリポソームを用いることができる。リポソームのサイズ及び層状性は、調製方法に依存し、使用される小胞の種類の選択は、好ましい投与様式に依存する。単層からなるラメラ相、六方及び逆六方相、立方相、ミセル及び逆ミセルを含む、脂質が水性媒体中に存在し得る超分子組織のいくつかの他の形態がある。これらの相は、ＤＮＡ又はＲＮＡとの組み合わせでも得られ、ＲＮＡ及びＤＮＡとの相互作用は、相状態に実質的に影響を及ぼし得る。記載した相は、本発明のナノ粒子核酸製剤中に存在してもよい。
核酸及びリポソームからの核酸リポプレックスの形成のために、想定される核酸リポプレックスを提供する限り、リポソームを形成する任意の適切な方法を使用することができる。リポソームは、逆相蒸発法（ＲＥＶ）、エタノール注入法、脱水－再水和法（ＤＲＶ）、超音波処理又は他の適切な方法などの標準的な方法を用いて形成され得る。
リポソーム形成後、実質的に均質なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得るために、リポソームを大きさに従って分けることができる。
二重層形成脂質は典型的には、２つの炭化水素鎖、特にアシル鎖、及び極性又は非極性の頭部基を有する。二重層形成脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸(phosphatide acid)、ホスファチジルイノシトール及びスフィンゴミエリンなどの天然又は合成起源のリン脂質のいずれかから構成され、ここで２つの炭化水素鎖は、典型的には長さが約１４～２２個の炭素原子であり、かつ変動する不飽和度を有する。本発明の組成物における使用に適した他の脂質には、糖脂質及びコレステロールなどのステロール、並びにリポソームにも使用できるそのさまざまなアナログが含まれる。
カチオン性脂質は典型的には、ステロール、アシル又はジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体として正味の正電荷を有する。脂質の頭部基は典型的には、正電荷を帯びる。カチオン性脂質は、好ましくは１～価の正電荷、さらに好ましくは１～３価の正電荷、さらに一層好ましくは１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例には、限定されないが、１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１，２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジミリストイルオキシプロピルｌ－１，３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、及び２，３－ジオレオイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれる。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、及びＤＯＳＰＡが好ましい。最も好ましいのは、ＤＯＴＭＡである。
また、本明細書に記載のナノ粒子は、構造安定性などの観点から、中性脂質をさらに含むことが好ましい。中性脂質は、核酸－脂質複合体の送達効率の観点から適宜選択することができる。中性脂質の例には、限定されないが、１，２－ジ－（９Ｚ－オクタデセノイルｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン（sphingoemyelin）、セファリン、ステロール、及びセレブロシドが含まれる。ＤＯＰＥ及び／又はＤＯＰＣが好ましい。最も好ましいのは、ＤＯＰＥである。カチオン性リポソームがカチオン性脂質と中性脂質の両方を含む場合、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、リポソームの安定性などの観点から適宜決定することができる。
一実施態様によれば、本明細書に記載のナノ粒子は、リン脂質を含み得る。リン脂質は、グリセロリン脂質であってもよい。グリセロリン脂質の例には、次の３種類の脂質：（ｉ）双性イオン性リン脂質、例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、卵黄ホスファチジルコリン、天然、部分水素添加又は完全水素添加大豆由来ＰＣ、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）スフィンゴミエリン（ＳＭ）など；（ｉｉ）負電荷脂質、例えばホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）ジパルミトイル（dipalmipoyl）ＰＧ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；コンジュゲートが双性イオン性リン脂質を負に荷電させる合成誘導体（メトキシ－ポリエチレン、グリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ－ＤＳＰＥ）など；（ｉｉｉ）カチオン性リン脂質、例えばホスファチジルコリン又はスフィンゴミエリン（リン酸一エステルがＯ－メチル化されてカチオン性脂質を形成するものが含まれるが、これらに限定されない。
核酸の脂質担体との会合は、例えば、核酸が担体の間隙空間を埋めて、担体が核酸を物理的に捕捉することによって、又は共有、イオン若しくは水素結合によって、又は非特異的な結合による吸着によって生じ得る。結合の様式がどのようなものであれ、核酸は、その治療的な、すなわち抗原をコードする特性を保持しなければならない。
「疾患」という用語は、個体の体に影響を与える異常な状態を指す。疾患は通常、特定の症状及び兆候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症など、元々は外部源からの要因に起因するか、又は自己免疫疾患など、内的な機能不全に起因する。
本発明によれば、用語「疾患」はまた、がん疾患を指す。用語「がん疾患」又は「がん」（医学用語：悪性新生物）は、細胞の群が、制御できない増殖（正常限度を超える分裂）、浸潤（隣接組織への侵入及び破壊）、時には転移（リンパ又は血液を通って体の他の場所への広がるｔこと）を示している、疾患の分類を指す。がんのこれらの３つの悪性特性は、自己限定的であり、浸潤又は転移しない良性腫瘍とがんとを区別する。大部分のがんは、腫瘍、すなわち細胞（新生物細胞又は腫瘍細胞と呼ばれる）の異常増殖によって形成される腫脹又は病変を形成するが、白血病のように、そうでないものもある。がんの例には、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、神経膠腫、及び白血病が含まれる。より具体的には、そのようながんの例には、骨がん、血液がん、肝臓がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頚部がん、皮膚又は眼球内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、結腸がん、乳がん、前立腺がん、子宮がん、生殖器の癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織の肉腫、膀胱がん、腎臓がん、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、神経外胚葉性がん、脊髄腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、及び下垂体腺腫が含まれる。本発明による用語「がん」はまた、がん転移も含む。
「感染性疾患」という用語は、個体から個体又は生物体から生物体に伝播することができ、微生物媒介物によって引き起こされる任意の疾患（例えば感冒）を指す。感染症の例には、ウイルス感染症、例えばＡＩＤＳ（ＨＩＶ）、Ａ型、Ｂ型又はＣ型肝炎、ヘルペス、帯状ヘルペス（水痘）、ドイツの麻疹（風疹ウイルス）、黄熱病、デング熱など、フラビウイルス、インフルエンザウイルス、出血性感染症（マールブルグ又はエボラウイルス）、及び重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）など、細菌感染症、例えばレジオネラ症（レジオネラ属菌）、性感染症（例えばクラジミア又は淋病）、胃潰瘍（ヘリコバクター属菌）、コレラ（ビブリオ属菌）、結核、ジフテリア、大腸菌、ブドウ球菌、サルモネラ又はレンサ球菌（破傷風）による感染症など；病原虫による感染症、例えばマラリア、眠り病、リーシュマニア症；トキソプラズマ症、すなわちマラリア原虫、トリパノソーマ、リーシュマニア、及びトキソプラズマによる感染症；真菌感染症、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、コクシジオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチチジス又はカンジダ・アルビカンスによって引き起こされるものが含まれる。
「自己免疫疾患」という用語は、体がそれ自体の組織のいくつかの構成成分に対する免疫原性（すなわち免疫系）応答を生成する任意の疾患を指す。言い換えれば、免疫系が、体内のある組織又は系を自己と認識する能力を失い、それを異質のものであるかのように標的にして、攻撃する。自己免疫疾患は、主に１つの器官が冒されるもの（例えば溶血性貧血及び抗免疫甲状腺炎）と、自己免疫疾患プロセスが多くの組織を通って拡散するもの（例えば全身性紅斑性狼瘡）に分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳及び脊髄の神経線維を囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。これは、調整の喪失、脱力、かすみ目をもたらす。自己免疫疾患は、当該技術分野で既知であり、例えば橋本甲状腺炎、グレーヴス病、狼瘡、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性紅斑性狼瘡、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、乾癬等を含む。
本発明によれば、免疫応答は、抗原又はその断片、例えば疾患関連抗原をコードする適切なｍＲＮＡを対象に導入することによって刺激することができる。
用語「抗原」は、免疫応答が生成されるべきエピトープを含む作用物質を指す。用語「抗原」は、特にタンパク質、ペプチド、多糖類、核酸、特にＲＮＡ及びＤＮＡ、並びにヌクレオチドを含む。用語「抗原」はまた、形質転換のみによって（例えば分子内で中程度に、又は体タンパク質で完全に）抗原性になり、かつ、感作させる作用剤も含まれる。抗原は好ましくは、樹状細胞又はマクロファージのような抗原提示細胞などの免疫系の細胞によって提示可能である。さらに、抗原又はそのプロセシング産物は好ましくは、Ｔ若しくはＢ細胞受容体によって、又は抗体などの免疫グロブリン分子によって認識可能である。好ましい実施態様では、抗原は、疾患関連抗原、例えば腫瘍関連抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原である。
用語「疾患関連抗原」は、疾患に関連する任意の抗原を指す最も広い意味で使用される。疾患関連抗原は、宿主の免疫系を刺激して細胞性抗原特異的免疫応答及び／又は疾患に対する液性抗体応答を作るエピトープを含む分子である。したがって疾患関連抗原は、治療目的のために使用され得る。疾患関連抗原は好ましくは、微生物、典型的には微生物抗原による感染に関連するか、又はがん、典型的には腫瘍に関連する。
「抗原関連疾患」という用語は、抗原に影響を与える任意の疾患、例えば抗原の存在及び／又は発現を特徴とする疾患を指す。抗原関疾患は、感染症、自己免疫疾患又はがん疾患（すなわち簡単には、がん）であり得る。前述の通り、抗原は、疾患関連抗原、例えば腫瘍関連抗原、ウイルス抗原又は細菌抗原であり得る。
一実施態様において、疾患関連抗原は、腫瘍関連抗原である。この実施態様では、本発明は、がん又はがん転移の治療に有用であり得る。好ましくは、罹患臓器又は組織は、疾患関連抗原を発現し、かつ／又は疾患関連抗原と表面との会合を特徴とするがん細胞などの罹患細胞によって特徴付けられる。インタクト又は実質的にインタクトな腫瘍関連抗原又はその断片、例えばＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩペプチド、又はそのような抗原若しくは断片をコードする核酸、特にｍＲＮＡを用いた免疫は、ＭＨＣクラスＩ及び／又はクラスＩＩを誘発することを可能にし、したがってがん細胞及び／又はＣＤ４＋Ｔ細胞を溶解することができるＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球などのＴ細胞を刺激する。このような免疫はまた、液性免疫応答（Ｂ細胞応答）を誘発し得、腫瘍関連抗原に対する抗体の産生をもたらす。さらに、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍抗原をコードする核酸によるトランスフェクションによってＭＨＣクラスＩ提示ペプチドを負荷し、患者に投与することができる。一実施態様において、用語「腫瘍関連抗原」は、細胞質、細胞表面及び細胞核に由来するがん細胞の構成成分を指す。特に、それは、細胞内で、又は腫瘍細胞上で表面抗原として、好ましくは大量に産生される抗原を指す。腫瘍抗原の例には、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＡＭＰＡＴＨ１抗原、ＣＤ２２、ＣＡ－１２５、ＨＬＡ－ＤＲ、ホジキンリンパ腫又はムチン１が含まれるが、これらに限定されない。
本発明によれば、腫瘍関連抗原は好ましくは、型及び／又は発現レベルに関して、腫瘍又はがんに対して、かつ、腫瘍細胞又はがん細胞に対して特徴的である任意の抗原を含む。一実施態様において、用語「腫瘍関連抗原」は、正常な状態下すなわち健康な対象では、限定された数の器官及び／又は組織内において、又は特定の発生段階において特異的に発現されるタンパク質を指し、例えば、腫瘍関連抗原は、正常な状態下では、胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官（例えば精巣）、絨毛性組織（例えば胎盤）又は生殖系列細胞において特異的に発現される場合があり、１以上の腫瘍又はがん組織において発現又は異常発現される。この文脈において、「限られた数」は、好ましくは３以下、さらに好ましくは２以下又は１を意味する。本発明の文脈における腫瘍関連抗原には、例えば分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常な条件下では特定の分化段階にある特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、がん／精巣抗原、すなわち正常状態下では精巣及び、任意選択的に胎盤において特異的に発現されるタンパク質、並びに生殖系列特異的抗原を含む。本発明の文脈において、腫瘍抗原は、正常組織においては好ましくは発現されないか又は稀にしか発現されず、又は腫瘍細胞において突然変異される。好ましくは、腫瘍抗原又は腫瘍抗原の異常発現によって、がん細胞が識別される。本発明の文脈において、対象、例えばがん疾患に罹患している患者においてがん細胞により発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記対象における自己タンパク質である。好ましい実施態様において、本発明の文脈における腫瘍抗原は、正常な状態下では、必須でない組織若しくは臓器、すなわち免疫系により損傷された場合に対象の死亡をもたらさない組織若しくは臓器において、又は免疫系がアクセスできないか若しくは殆どアクセスできない臓器若しくは身体構造において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍関連抗原は、それが発現されるがん細胞によってＭＨＣ分子の状態で提示される。
腫瘍免疫療法、特に腫瘍ワクチン接種における標的構造として本発明によって意図される腫瘍関連抗原の基準を理想的に満たす分化抗原の例はとして、ＣＬＤＮ６及びＣＬＤＮ１８．２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質がある。これらの分化抗原は、種々の起源の腫瘍において発現され、その選択的発現（毒性に関連する正常組織における発現なし）及び原形質膜への局在化のために、抗体媒介性がん免疫療法に関連する標的構造として特に適している。
本発明に有用でありうる腫瘍抗原のさらなる例としては、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－カテニン／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ（又はｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１又はＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、－２、－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１又はＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１又はＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、ＳＵＲＶＩＶＩＮ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、及びＷＴ、好ましくはＷＴ－１がある。
用語「ウイルス抗原」は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を引き起こすことができる任意のウイルス成分を指す。ウイルス抗原は、ウイルスリボ核タンパク質又はエンベロープタンパク質であり得る。
用語「細菌抗原」は、抗原特性を有する、すなわち個体において免疫応答を引き起こすことができる任意の細菌成分を指す。細菌抗原は、細菌の細胞壁又は細胞質膜に由来し得る。
「抗原プロセシング」は、前記抗原の断片であるプロセシング産物への抗原の分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）及び細胞、好ましくは抗原提示細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合を介した）を指す。
本明細書で使用される「免疫応答」という用語は、免疫原性生物（例えば細菌若しくはウイルス細胞又は物質）に対する免疫系の反応を指す。「免疫応答」という用語には、自然免疫応答及び適応免疫応答が含まれる。好ましくは、免疫応答は、免疫細胞の活性化、サイトカイン生合成の誘導及び／又は抗体産生を指す。免疫応答は、抗原提示細胞（例えば樹状細胞及び／又はマクロファージ）の活性化、前記抗原提示細胞による抗原又はその断片の提示、及びこの提示による細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の段階を含むことが好ましい。
「治療する」又は「治療」という用語は、健康状態を改善し、かつ／又は個体の寿命を延長する（増加させる）任意の処置を指す。前記治療は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の進行を停止又は遅延させ、個体における疾患の進行を阻害又は遅延させ、個体における症状の頻度又は重症度を低下させ、かつ／又は現在罹患しているか又は以前罹患していた個体における再発を減らし得る。
特に、「疾患の治療」という用語は、疾患又はその症状の治癒、持続時間の短縮、緩和、減速、又は進行若しくは悪化の阻害を含む。
用語「免疫療法」は、好ましくは特異的免疫反応及び／又は免疫エフェクター機能を含む治療を指す。
用語「免疫化」又は「ワクチン接種」は、治療上又は予防上の理由で対象を治療するプロセスをいう。
本明細書で使用される用語「対象」又は「個体」は、好ましくは哺乳動物を指す。例えば、本発明の文脈における哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等の家畜、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等の実験動物、並びに捕獲された動物、例えば動物園の動物である。好ましい実施態様において、対象は、ヒトである。
用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、その細胞表面上（又は細胞表面）に少なくとも１の抗原又は抗原性断片をディスプレイ、獲得及び／又は提示することができる種々の細胞のうちの１つの細胞を指す。抗原提示細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞と非プロフェッショナル抗原提示細胞に区別することができる。
用語「プロフェッショナル抗原提示細胞」は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要な主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣクラスＩＩ）分子を恒常的に発現する抗原提示細胞を指す。Ｔ細胞が抗原提示細胞の膜上のＭＨＣクラスＩＩ分子複合体と相互作用する場合、抗原提示細胞は、Ｔ細胞の活性化を誘導する共刺激分子を産生する。プロフェッショナル抗原提示細胞は、樹状細胞及びマクロファージを含む。
「非プロフェッショナル抗原提示細胞」という用語は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を恒常的に発現しないが、インターフェロンガンマなどの特定のサイトカインによる刺激を受けた抗原提示細胞を指す。代表的な非プロフェッショナル抗原提示細胞には、線維芽細胞、胸腺上皮性細網細胞、甲状腺上皮細胞、グリア細胞、膵ベータ細胞又は血管内皮細胞が含まれる。
用語「主要組織適合複合体」及び略語「ＭＨＣ」は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物において生じる遺伝子の複合体を指す。ＭＨＣタンパク質又は分子は、免疫反応においてリンパ球と抗原提示細胞又は疾患細胞との間のシグナル伝達にとって重要であり、ＭＨＣタンパク質又は分子はペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現され、自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば、侵入してくる微生物の断片）の両方をＴ細胞にディスプレイする。
本発明によれば、用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、「キメラＴ細胞受容体」及び「人工Ｔ細胞受容体」という用語と同義である。
これらの用語は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞へのモノクローナル抗体の特異性のような、任意の特異性を与える、操作された受容体を指す。このようにして、養子細胞移入のために多数のがん特異的Ｔ細胞を生成することができる。したがって、ＣＡＲは、例えばＴ細胞自体のＴ細胞受容体の代わりに、又はそれに加えて、Ｔ細胞上に存在してもよい。そのようなＴ細胞は、標的細胞の認識のための抗原のプロセシング及び提示を必ずしも必要とせず、むしろ、好ましくは特異性で標的細胞上に存在する任意の抗原を認識することができる。好ましくは、前記ＣＡＲは、細胞の表面上に発現される。本発明において、ＣＡＲを含むＴ細胞は、本明細書で使用する「Ｔ細胞」という用語に含まれる。
本発明によれば、用語「ＣＡＲ」（又は「キメラ抗原受容体」）は、標的細胞（例えばがん細胞）上の標的構造（例えば抗原）を認識する、すなわちそれに結合する（例えば標的細胞の表面上に発現された抗原への抗原結合ドメインの結合による）分子の単一分子又は複合体を含む人工受容体を指し、細胞表面上に前記ＣＡＲを発現するＴ細胞などの免疫エフェクター細胞に特異性を付与し得る。好ましくは、ＣＡＲによる標的構造の認識は、前記ＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす。ＣＡＲは、本明細書に記載の１以上のドメインを含む１以上のタンパク質ユニットを含むことができる。用語「ＣＡＲ」は、Ｔ細胞受容体を含まない。
一実施態様では、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をＣＤ３ゼータ膜貫通及びエンドドメインに融合させる。このような分子は、標的細胞上のその抗原標的のｓｃＦｖによる認識及び標的抗原を発現する標的細胞の死滅に応答してゼータシグナルの伝達をもたらす。使用されてもよい抗原認識ドメインには、とりわけＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ一本鎖が含まれる。実際に、高親和性で所与の標的に結合する殆どのものは、抗原認識ドメインとして使用することができる。
抗原認識に続いて、受容体がクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。この点において、「Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン」は、抗原が結合された後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達するドメイン、好ましくはエンドドメインである。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分はＣＤ３ゼータである。
キメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ操作されたＴ細胞による養子細胞移入療法は、事実上あらゆる腫瘍抗原を標的とするようにＣＡＲ修飾Ｔ細胞を操作することができるため、有望な抗がん治療法である。例えば、患者のＴ細胞を、患者の腫瘍細胞上の抗原に特異的に向けられるＣＡＲを発現するように遺伝子操作（遺伝子修飾）し、その後患者に注入して戻すことができる。
本発明によれば、ＣＡＲは、Ｔ細胞受容体の機能に取って代わることができ、特に細胞溶解活性などの反応性をＴ細胞などの細胞に付与することができる。しかしながら、抗原ペプチド－ＭＨＣ複合体へのＴ細胞受容体の結合とは対照的に、ＣＡＲは、抗原に、特に細胞表面上に発現される場合に、結合することができる。
本発明によれば、ＣＡＲは一般に、３つのドメインを含むことができる。
第１のドメインは、抗原を認識して結合する結合ドメインである。
第２のドメインは、共刺激ドメインである。共刺激ドメインは、標的部分へのＣＡＲの結合の際の細胞傷害性リンパ球の増殖及び生存を増強する働きをする。共刺激ドメインの同一性は、それがＣＡＲによる標的部分の結合の際に細胞増殖及び生存を増強する能力を有する点のみに限定される。適切な共刺激ドメインには、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーであるＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＴＮＦＲ受容体のスーパーファミリーのメンバーであるＣＤ１３４（ＯＸ４０）、及び活性化Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８スーパーファミリーの共刺激分子であるＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）が含まれる。当業者は、本発明に悪影響を及ぼすことなく、前記共刺激ドメインの配列変異体を使用することができ、変異体がモデル化されるドメインと同じか又は同様の活性を有することを理解するであろう。このような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するであろう。本発明のいくつかの実施態様において、ＣＡＲコンストラクトは、２つの共刺激ドメインを含む。特定の組み合わせは４つの上記ドメインのすべての可能な変形を含むが、特定の例には、ＣＤ２８＋ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及びＣＤ２８＋ＣＤ１３４（ＯＸ４０）が含まれる。
第３のドメインは、活性化シグナル伝達ドメイン（又はＴ細胞シグナル伝達ドメイン）である。活性化シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲと抗原との結合の際に細胞傷害性リンパ球を活性化する働きをする。活性化シグナル伝達ドメインの同一性は、それがＣＡＲによる抗原の結合の際に、選択された細胞傷害性リンパ球の活性化を誘導する能力を有する点のみに限定される。適切な活性化シグナル伝達ドメインには、Ｔ細胞ＣＤ３［ゼータ］鎖及びＦｃ受容体ガンマ］が含まれる。当業者は、本発明に悪影響を及ぼすことなく、前記活性化シグナル伝達ドメインの配列変異体を使用することができ、変異体がモデル化されるドメインと同じか又は同様の活性を有することを理解するであろう。このような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有するであろう。
ＣＡＲは、融合タンパク質の形態で、３つのドメインを一緒に含むことができる。このような融合タンパク質は一般に、Ｎ末端からＣ末端方向に連結されている、結合ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン及び活性化シグナル伝達ドメインを含む。しかしながら、ＣＡＲはこの配置に限定されず、他の配置も許容可能であり、結合ドメイン、活性化シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激ドメインを含む。結合ドメインは抗原に結合するために空いていなければならないため、融合タンパク質中の結合ドメインの配置は一般に、細胞外領域のディスプレイができるようなものであることが理解される。同様に、共刺激及び活性化シグナル伝達ドメインは細胞傷害性リンパ球の活性及び増殖を誘導する働きをするため、融合タンパク質は一般に、細胞の内部にこれら２つのドメインをディスプレイする。ＩＣＡＲは、融合タンパク質の細胞表面への適切な輸送を確実にするシグナルペプチド、融合タンパク質が完全な膜タンパク質として維持されることを確実にする膜貫通ドメイン、及び結合ドメインに柔軟性を与え、抗原への強い結合を可能にするヒンジドメイン（又はスペーサー領域）などの追加の要素を含む。
本発明のＣＡＲシステムに関連して使用される細胞は、好ましくはＴ細胞、特に、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から好ましくは選択される細胞傷害性リンパ球である。活性化すると、これらの細胞傷害性リンパ球の各々が、標的細胞の破壊を誘発する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれか又は両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。まず、活性化するとＴ細胞は、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシン等の細胞毒素を放出する。パーフォリン及びグラニュライシンは標的細胞に孔を形成し、グランザイムは細胞に入り、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘導するカスパーゼカスケードカスケードを細胞質に起こす。次に、Ｔ細胞と標的細胞との間のＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して、アポトーシスが誘導され得る。細胞傷害性リンパ球は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞又は同種細胞を使用することもできる。
非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクション、トランスポゾンベースの系及びウイルスベースの系を含めたさまざまな方法が、Ｔ細胞にＣＡＲコンストラクトを導入するのに使用され得る。非ウイルスベースのＤＮＡトランスフェクションは、挿入突然変異誘発のリスクが低い。トランスポゾンベースの系は、組み込み要素を含有しないプラスミドよりも効率的に導入遺伝子を組み込むことができる。ウイルスベースの系には、γ－レトロウイルス及びレンチウイルスベクターの使用が含まれる。γ－レトロウイルスは、比較的生産しやすく、効率的かつ永久的にＴ細胞に形質導入され、初代ヒトＴ細胞における組込みの観点から安全であることが事前に証明されている。レンチウイルスベクターはまた、Ｔ細胞に効率的かつ永久的に形質導入されるが、製造コストが比較的高い。それはまた、レトロウイルスベースの系より潜在的に安全である。
本明細書に記載のＲＮＡ（例えば本明細書に記載の核酸分子を転写鋳型として使用して得られる）は、体細胞を幹様細胞、すなわち幹細胞特性を有する細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで再プログラミング又は脱分化する際にも有用である。これは、細胞における再プログラミング又は脱分化プロセスを開始するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの再プログラミング因子の一過性発現を含み得る。したがって、一実施態様では、本明細書に記載のＲＮＡなどの核酸によってコードされるペプチド又はタンパク質は、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを可能にする因子である。幹様細胞は、胚芽又は胎児を生成することなく、本発明に従って提供され得る。幹細胞特性、特に多能性を有する細胞への、体細胞の脱分化は、体細胞の脱分化を誘導する因子（再プログラミング転写因子（ｒＴＦ）ともいう）をコードするＲＮＡを体細胞へ導入し、その体細胞を培養して細胞を脱分化させることにより、達成される。脱分化された後、細胞は、ニューロン、造血、筋肉、上皮及びその他の細胞型など、同じか又は異なる体細胞型に再分化するように誘導され得る。したがって、このような幹様細胞は、「細胞療法」による変性疾患の治療のための医療用途を有し、心臓、神経、内分泌系、血管、網膜、皮膚、筋骨格障害及びその他疾患の治療における新規治療ストラテジーにおいて有用であり得る。
したがって、本発明はまた、（ｉ）体細胞を含む細胞集団を提供する工程、（ｉｉ）体細胞の幹細胞特性を有する細胞への再プログラミングを可能にする１以上の因子を発現することができる本発明のＲＮＡを体細胞に導入する工程、及び（ｉｉｉ）幹細胞特性を有する細胞の発達を可能にする工程を含む、幹細胞特性を有する細胞を提供する方法を指す。一実施態様において、この方法は、体細胞の幹細胞特性を有する細胞への再プログラミングを増強するｍｉＲＮＡを体細胞に導入することをさらに含む。
一実施態様において、１以上の因子は、ＯＣＴ４及びＳＯＸ２を含む。１以上の因子は、ＫＬＦ４及び／又はｃ－ＭＹＣ及び／又はＮＡＮＯＧ及び／又はＬＩＮ２８をさらに含み得る。一実施態様において、１以上の因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを含み、ＬＩＮ２８及び任意選択的にＮＡＮＯＧをさらに含み得る。一実施態様において、１以上の因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８を含む。
一実施態様において、本方法は、少なくとも１のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で体細胞を培養する工程をさらに含み、この場合少なくとも１のヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、好ましくはバルプロ酸、酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ及び／又はスクリプタイド（ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）を含む。
一実施態様において、工程（ｉｉｉ）は、胚性幹細胞培養条件下で体細胞を培養することを含む。
一実施態様において、幹細胞特性は、胚性幹細胞形態を含む。
一実施態様において、幹細胞特性を有する細胞は正常核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、かつ／又は胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する。
一実施態様において、幹細胞特性を有する細胞は、多能性状態を示す。
一実施態様において、幹細胞特性を有する細胞は、全３つの一次胚葉の高度派生物(advanced derivative)へと分化する発達能を有する。
一実施態様において、体細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は真皮線維芽細胞などの線維芽細胞である。好ましくは、体細胞は、ヒト細胞である。
一実施態様において、ＲＮＡは、エレクトロポレーション又はリポフェクションによって体細胞に導入される。一実施態様において、ＲＮＡは、体細胞に反復導入される。
一実施態様において、本明細書に開示の特定の因子を発現することができるＲＮＡの体細胞への導入は、前記因子の、長時間、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、さらに好ましくは少なくとも１２日間の発現をもたらす。このような長期発現を達成するには、ＲＮＡは、好ましくはエレクトロポレーションを用いて２回以上、周期的に（すなわち反復的に）細胞に導入される。好ましくは、ＲＮＡを、少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回、さらに好ましくは少なくとも４回、さらに一層好ましくは少なくとも５回、好ましくは６回まで、さらに好ましくは７回まで、又はさらには８、９又は１０回まで、好ましくは少なくとも１０日間、好ましくは少なくとも１１日間、さらに好ましくは少なくとも１２日間にわたり細胞に導入し、１以上の因子の発現を長期間維持する。好ましくは、ＲＮＡの反復導入の間に経過する時間は、２４時間から１２０時間、好ましくは４８時間から９６時間である。一実施態様において、ＲＮＡの反復導入の間に経過する時間は、７２時間以下、好ましくは４８時間又は３６時間以下である。一実施態様において、次のエレクトロポレーションの前に、細胞をその前のエレクトロポレーションから回復させる。いずれの場合でも、因子は、再プログラミングプロセスをサポートする量及び期間で細胞内で発現されるように選択されるものとする。
「幹細胞」は、自己再生能、未分化維持能、及び分化能を有する細胞である。幹細胞は、それが自然に存在する動物の少なくとも生涯にわたって、無制限に分裂することができる。幹細胞は、最終分化しておらず、分化経路の最終段階にいるのではない。幹細胞が分裂すると、各娘細胞は、幹細胞のままでいるか、又は最終分化に向かう経路に踏み出すことができる。
全能性幹細胞は、全能性分化特性を有し、完全な生物体に成長することができる細胞である。この特性は、精子による卵母細胞の受精後の８細胞期までの細胞が持っている。これらの細胞が単離され、子宮に移植されると、それらは完全な生物体に成長することができる。
多能性幹細胞は、外胚葉、中胚葉及び内胚葉の層に由来するさまざまな細胞及び組織に成長することができる細胞である。受精後４～５日で発生した胚盤胞内の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞は、「胚性幹細胞」と呼ばれ、さまざまな他の組織細胞に分化することができるが、新たな生物体を形成することはできない。
多能性幹細胞は普通は、その起源の組織及び臓器に特化した細胞型のみに分化する幹細胞である。多能性幹細胞は、胎児期、新生児期及び成体期のさまざまな組織及び器官の成長及び発達だけでなく、成体組織のホメオスタシスの維持及び組織損傷時の再生誘導機能にも関与する。組織特異的多能性細胞は、集合的に「成体幹細胞」と呼ばれる。
「胚性幹細胞」又は「ＥＳＣ」は、胚に存在するか又は胚から単離された幹細胞である。それは、多能性であり、生物体に存在する１つ一つの細胞に分化する能力、すなわち多分化能を有し、複数の細胞型に分化する能力を有する。
本明細書で使用される場合、「胚」とは、発生の初期段階にある動物をいう。これらの段階は、３つの胚葉が区別され、確立される着床及び原腸形成によって、また、それぞれの臓器及び臓器系への胚芽層の分化によって特徴付けられる。３つの胚葉は、内胚葉、外胚葉及び中胚葉である。
「胚盤胞」は、発生した卵子が切断され、流体が満たされた空洞を囲む球状の細胞層が形成されている、または形成されている成長初期段階の胚である。この球状細胞層は、栄養外胚葉である。栄養外胚葉の内部には、内部細胞塊（ＩＣＭ）と呼ばれる細胞のクラスターがある。栄養外胚葉は胎盤の前駆体であり、ＩＣＭは胚の前駆体である。
成体幹細胞は、体細胞幹細胞とも呼ばれ、成体で見出される幹細胞である。成体幹細胞は、分化した組織で見出され、それ自体を再生することができ、いくつかの制限を加えて、その由来組織の特殊な細胞型を得ることができる。例としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、及び神経幹細胞が挙げられる。
「分化細胞」は、より特殊化された形態又は機能への前進的成長変化を経た成熟細胞である。細胞分化は、細胞が明らかに特殊化した細胞型に成熟するにつれて細胞が受けるプロセスである。分化した細胞は、明確な特徴を有し、特定の機能を担い、より分化していない細胞よりも分裂しにくい。
例えば未成熟、胚又は単細胞などの「未分化」細胞は通例、非特異的な外観を有し、複数の非特異的活動を行い得るが、分化細胞が通例果たす機能は、全く果たさないことはないにしても、わずかしか果たさない。
「体細胞」は、任意の及びすべての分化細胞を指し、幹細胞、生殖細胞又は配偶子は含まない。好ましくは、本明細書で使用される「体細胞」は、最終分化細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「コミットした(committed)」とは、特定の機能に永続的にコミットしたと考えられる細胞をいう。コミットした細胞は、「最終分化細胞」とも呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「分化」とは、特定の形態又は機能についての細胞の適合を指す。細胞では、分化が、よりコミットした細胞をもたらす。
本明細書で使用される場合、「脱分化」とは、形態又は機能の特殊化の喪失を指す。細胞において、脱分化が、より弱くコミットした細胞をもたらす。
本明細書で使用される「再プログラミング」とは、細胞の遺伝子プログラムのリセットを指す。再プログラムされた細胞は、好ましくは多能性を示す。
用語「脱分化した」及び「再プログラムされた」又は同様の用語は、幹細胞特性を有する体細胞由来細胞を意味するために互換的に使用される。しかしながら、前記用語は、本明細書に開示の主題を機械的又は機能的な考慮によって限定することを意図するものではない。
「幹細胞特性の発生を誘導するＲＮＡ」又は「幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを可能にする１以上の因子を発現することができるＲＮＡ」という用語は、体細胞に導入された場合、細胞を脱分化へ誘導するＲＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「生殖細胞」とは、精母細胞若しくは卵母細胞などの生殖細胞又は生殖細胞に発達する細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「多能性」は、胎盤の細胞又は子宮の他の支持細胞以外の任意の細胞型を生じさせることができる細胞を指す。
「幹細胞の特徴を有する細胞」、「幹細胞特性を有する細胞」又は「幹様細胞」などの用語は、分化した体細胞非幹細胞に由来するが幹細胞に典型的な１つ以上の特徴を示す細胞、特に胚性幹細胞を指す。そのような特徴には、コンパクトなコロニー、高い核対細胞質比、及び顕著な核小体、正常核型、テロメラーゼ活性の発現、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーの発現、及び／又は胚性幹細胞に特徴的な遺伝子の発現が含まれる。胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーは、例えばステージ特異的胚抗原（stage-specific embryonic antigen）３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１、及びＴＲＡ－２－４９／６Ｅからなる群より選択される。胚性幹細胞に特徴的な遺伝子は、例えば内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、成長及び分化因子３（ＧＤＦ３）、発現低下タンパク質１（reduced expression）１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群より選択される。一実施態様において、幹細胞に典型的な１つ以上の特徴には、多能性が含まれる。
本発明の一態様において、幹細胞特性は、胚性幹細胞形態を含み、前記胚性幹細胞形態は好ましくは、コンパクトコロニー、高い核対細胞質比、及び顕著な核小体からなる群より選択される形態学的基準を含む。特定の実施態様において、幹細胞特性を有する細胞は正常核型を有し、テロメラーゼ活性を発現し、胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーを発現し、かつ／又は胚性幹細胞に特徴的な遺伝子を発現する。胚性幹細胞に特徴的な細胞表面マーカーは、ステージ特異的胚抗原３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１及びＴＲＡ－２－４９／６Ｅからなる群より選択することができ、また、胚性幹細胞に特徴的な遺伝子は、内因性ＯＣＴ４、内因性ＮＡＮＯＧ、成長及び分化因子３（ＧＤＦ３）、発現低下タンパク質（ＲＥＸ１）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、及びテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）からなる群より選択することができる。
好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、脱分化及び／又は再プログラミングされた体細胞である。好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、多能性状態などの胚性幹細胞の本質的な特徴を示す。好ましくは、幹細胞特性を有する細胞は、全３つの一次胚葉の高度派生物へと分化する発達能を有する。一実施態様において、一次胚葉は内胚葉であり、高度派生物は腸様（gut-like）上皮組織である。一実施態様において、一次胚葉は中胚葉であり、高度派生物は横紋筋及び／又は軟骨組織である。さらなる一実施態様において、一次胚葉は外胚葉であり、高度派生物は神経組織及び／又は表皮組織である。一つの好ましい実施態様において、幹細胞特性を有する細胞は、神経細胞及び／又は心臓細胞へと分化する発達能を有する。
一実施態様において、体細胞は、間葉表現型を持つ胚性幹細胞由来体細胞である。好ましい実施態様では、体細胞は、胎児線維芽細胞若しくは出生後線維芽細胞などの線維芽細胞又はケラチノサイト、好ましくは毛包由来ケラチノサイトである。さらなる実施態様では、線維芽細胞は、肺線維芽細胞、包皮線維芽細胞又は真皮線維芽細胞である。特定の実施態様では、線維芽細胞は、カタログ番号ＣＣＬ－１８６でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された線維芽細胞であるか、カタログ番号ＣＲＬ－２０９７でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された線維芽細胞であるか、若しくはカタログ番号ＣＲＬ－２５２２でアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された線維芽細胞であるか、又はカタログ番号ＰＣ５０１Ａ－ＨＦＦでＳｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって配布されている線維芽細胞である一実施態様において、線維芽細胞は、成人ヒト皮膚線維芽細胞である。好ましくは、体細胞は、ヒト細胞である。本発明によれば、体細胞は、遺伝子修飾されていてもよい。
本発明の「因子」という用語は、ＲＮＡによるその発現と併せて使用する場合、タンパク質及びペプチド、並びにその誘導体及び変異体を含む。例えば、「因子」という用語は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを含む。
これらの因子は、例えば哺乳類及びげっ歯類など、任意の動物種のものであってよい。哺乳類の例には、ヒト及び非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されない。霊長類には、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、及び任意の他の新旧世界ザルが含まれるが、これらに限定されない。げっ歯類には、マウス、ラット、モルモット、ハムスター及びスナネズミが含まれるが、これらに限定されない。
本発明によると、幹細胞特性を有する細胞への体細胞の再プログラミングを可能にすることができる１以上の因子は、（ｉ）ＯＣＴ４及びＳＯＸ２、（ｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、並びにＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の一方又は両方、（ｉｉｉ）ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、並びにＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣの一方又は両方からなる群より選択される因子の集合（assembly）を含む。一実施態様において、ＲＮＡによって発現され得る前記１以上の因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８、又はＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４及びｃ－ＭＹＣを含む。好ましくは、ＲＮＡは、エレクトロポレーション又はマイクロインジェクションによって前記細胞に導入される。好ましくは、本発明は、例えば体細胞を胚性幹細胞培養条件下で、好ましくは多分化能性幹細胞を未分化状態に維持するのに適した条件下で培養することにより、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にすることをさらに含む。
ＯＣＴ４は、真核ＰＯＵ転写因子類の転写因子であり、胚性幹細胞の多能性の指標である。それは、母方発現オクタマー（Octomer）結合タンパク質である。これは、卵母細胞、芽細胞の内部細胞塊、及び始原生殖細胞に存在することが観察されている。遺伝子ＰＯＵ５Ｆ１は、ＯＣＴ４タンパク質をコードする。この遺伝子名の同義語には、ＯＣＴ３、ＯＣＴ４、ＯＴＦ３及びＭＧＣ２２４８７が含まれる。胚性幹細胞が未分化のままであるためには、特定の濃度でのＯＣＴ４の存在が必要である。好ましくは、「ＯＣＴ４タンパク質」又は単に「ＯＣＴ４」は、ヒトＯＣＴ４を指す。
Ｓｏｘ２は、単一のＨＭＧ ＤＮＡ結合ドメインを持つ転写因子をコードするＳｏｘ（ＳＲＹ関連ＨＭＧボックス）遺伝子ファミリーのメンバーである。ＳＯＸ２は分化能を阻害することによって神経前駆細胞を制御することが見出されている。この因子の抑制は、脳室帯からの剥離をもたらし、その後細胞周期からの離脱が起こる。これらの細胞はまた、前駆細胞及び初期神経細胞分化マーカーの喪失により、前駆細胞の特性を失い始める。好ましくは、「ＳＯＸ２タンパク質」又は単に「ＳＯＸ２」は、ヒトＳＯＸ２を指す。
ＮＡＮＯＧは、ＮＫ－２型ホメオドメイン遺伝子であり、胚性幹細胞の再生及び分化に不可欠な遺伝子の発現を調節することにより、幹細胞の多分化能を維持するのに重要な役割を果たすといわれている。ＮＡＮＯＧは、そのＣ末端に埋め込まれた２つの並外れて強い活性化ドメインを有する転写活性化因子として挙動する。ＮＡＮＯＧ発現の減少は、胚性幹細胞の分化を誘導する。好ましくは、「ＮＡＮＯＧタンパク質」又は単に「ＮＡＮＯＧ」は、ヒトＮＡＮＯＧを指す。
ＬＩＮ２８は、ＲＮＡ結合モチーフの珍しいペアリング、すなわちコールドショックドメインと一対のレトロウイルス型ＣＣＨＣジンクフィンガーとを持つ、保存された細胞質タンパク質である。哺乳動物では、これが、多様なタイプの未分化細胞に豊富に存在する。多能性哺乳動物細胞では、ＬＩＮ２８がポリ（Ａ）結合タンパク質とのＲＮａｓｅ感受性複合体中、及びスクロース勾配のポリソーム画分中に観察されることから、これが、ｍＲＮＡの翻訳に関連することが示唆される。好ましくは、「ＬＩＮ２８タンパク質」又は単に「ＬＩＮ２８」は、ヒトＬＩＮ２８を指す。
クルッペル様因子（ＫＬＦ４）は、さまざまな組織、例えば結腸、胃及び皮膚の分裂終了上皮細胞において強く発現されるジンクフィンガー転写因子である。ＫＬＦ４は、これらの細胞の最終分化にとって不可欠であり、細胞周期調節に関与する。好ましくは、「ＫＬＦ４タンパク質」又は単に「ＫＬＦ４」は、ヒトＫＬＦ４を指す。
ＭＹＣ（ｃＭＹＣ）は、さまざまなヒトのがんにおいて過剰発現されるがん原遺伝子である。これは、特異的に突然変異させるか、過剰発現させると、細胞増殖を増加させ、がん遺伝子として機能する。ＭＹＣ遺伝子は、エンハンサーボックス配列（Ｅボックス）への結合及びヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）の動員によって全遺伝子の１５％の発現を調節する転写因子をコードする。ＭＹＣは、転写因子のＭＹＣファミリーに属し、このファミリーにはＮ－ＭＹＣ及びＬ－ＭＹＣ遺伝子も含まれる。ＭＹＣファミリー転写因子は、ｂＨＬＨ／ＬＺ（塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックスロイシンジッパー）ドメインを含有する。好ましくは、「ｃＭＹＣタンパク質」又は単に「ｃＭＹＣ」は、ヒトｃＭＹＣを指す。
本明細書における具体的因子、例えばＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ４又はｃ－ＭＹＣへの言及は、これらの因子のあらゆる変異体も包含すると理解すべきである。特に、細胞によって自然に発現されるこれらの因子のすべてのスプライス変異体、翻訳後修飾変異体、コンフォメーション、アイソフォーム及び種ホモログも包含すると理解すべきである。
用語「ｍｉＲＮＡ」（マイクロＲＮＡ）は、ＥＳＣ自己再生／分化及び細胞周期の進行に関するものを含む多くの細胞機能を標的ｍＲＮＡの分解を誘導し、かつ／又は翻訳を防ぐことによって調節する真核細胞に見られる、２１－２３ヌクレオチド長の非コードＲＮＡを指す。ｍｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）上の相補的配列に結合する転写後調節因子であり、通常翻訳抑制又は標的分解及び遺伝子サイレンシングを起こす。適切な組み合わせのｍｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで幹細胞特性を有する細胞への体細胞の直接的な細胞再プログラミングを誘導することができることが見出されている。例えば、ｍｉＲＮＡクラスター３０２－３６７が体細胞再プログラミングを増強することが観察されている。
好ましくは、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にする工程は、体細胞を胚性幹細胞培養条件下で、好ましくは多分化能性幹細胞を未分化状態に維持するのに適した条件下で培養することを含む。
好ましくは、幹細胞特性を有する細胞の発生を可能にするために、細胞は、１種以上のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤及び／又は１種以上のヒストンデアセチラーゼ阻害剤の存在下で培養される。好ましい化合物は、５’－アザシチジン（５’－ａｚａＣ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、デキサメタゾン、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、酪酸ナトリウム（ＮａＢｕ）、スクリプタイド（Scriptaid）及びバルプロ酸（ＶＰＡ）からなる群より選択される。好ましくは、細胞は、バルプロ酸（ＶＰＡ）の存在下で、好ましくは０．５から１０ｍＭ、さらに好ましくは１から５ｍＭ、最も好ましくは約２ｍＭの濃度で培養される。
本発明の方法は、任意のタイプの体細胞の脱分化を達成するために使用することができる。使用され得る細胞には、本発明の方法によって脱分化又は再プログラムすることができる細胞、特に、完全又は部分的に分化した細胞、さらに好ましくは最終分化した細胞が含まれる。好ましくは、体細胞は、前胚性、胚性、胎児性、及び出生後の多細胞生物に由来する二倍体細胞である。使用され得る細胞の例には、限定されないが、胎児及び新生児線維芽細胞又は成人線維芽細胞などの線維芽細胞、ケラチノサイト、特に初代ケラチノサイト、さらに好ましくは毛髪に由来するケラチノサイト、脂肪細胞、上皮細胞、表皮細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、心臓細胞、食道細胞、筋細胞、メラニン細胞、造血細胞、骨細胞、マクロファージ、単球及び単核細胞が含まれる。
本発明の方法を用いることができる細胞は、任意の動物種、例えば哺乳類及びげっ歯類のものであってよい。本発明によって脱分化及び再分化することができる哺乳動物細胞の例には、限定されないが、ヒト及び非ヒト霊長類細胞が含まれる。本発明を実施することができる霊長類細胞には、限定されないが、ヒト、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、及び任意の他の新旧世界ザルが含まれる。本発明を実施することができるげっ歯類細胞には、限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター及びスナネズミの細胞が含まれる。
本発明に従って調製された脱分化細胞は、多分化能性幹細胞と同じ要件の多くを示すと予想され、胚性幹細胞に使用される条件下、例えばＥＳ細胞培地又は胚細胞の増殖を助ける任意の培地で増殖及び維持することができる。胚性幹細胞は、培養液中の照射マウス胚線維芽細胞又はヒト線維芽細胞（例えばヒト包皮線維芽細胞、ヒト皮膚線維芽細胞、ヒト子宮内膜線維芽細胞、ヒト卵管線維芽細胞）などの不活性化胎児線維芽細胞上で維持すると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでその多能性を保持する。一実施態様において、ヒトフィーダー細胞は、直接分化によって再プログラムされた細胞の同じ培養物に由来する自己フィーダー細胞であってもよい。
さらに、ヒト胚性幹細胞は、マウス胎児線維芽細胞によって条件付けされた培地中のマトリゲル上でうまく増殖させることができる。ヒト幹細胞は、長期間培養液中で培養することができ、特定の培養条件下では未分化のままである。
特定の実施態様では、細胞培養条件は、細胞の分化を阻害し得るか、さもなければ細胞の脱分化を増強する（例えば、非ＥＳ細胞、栄養外胚葉又は他の細胞型への細胞の分化を防ぐ）ことができる因子と細胞を接触させることを含み得る。
本発明に従って調製された脱分化細胞は、細胞の表現型の変化をモニターすることと、それらの遺伝子及びタンパク質発現を特徴付けることとを含む方法によって評価することができる。遺伝子発現は、ＲＴ－ＰＣＲによって決定することができ、翻訳産物は、免疫細胞化学及びウェスタンブロット法によって決定することができる。特に、脱分化細胞は、遺伝子発現のパターンを決定するために、かつ、再プログラムされた細胞が未分化多能性制御細胞、例えば胚性幹細胞の予期される発現パターンと同様の遺伝子発現のパターンを示すか否かを決定するために、トランスクリプトミックスを含む、当該技術分野で周知の技術を用いて特徴付けされ得る。
この点に関して、脱分化細胞の以下の遺伝子の発現を評価することができる：ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、成長及び分化因子３（ＧＤＦ３）、発現低下タンパク質１（ＲＥＸ１）、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）、胚細胞特異的遺伝子１（ＥＳＧ１）、発生多能性関連２（ＤＰＰＡ２）、ＤＰＰＡ４、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）、胚抗原３（ＳＳＥＡ－３）、ＳＳＥＡ－４、腫瘍関連抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、ＴＲＡ－１－８１、及びＴＲＡ－２－４９／６Ｅ。
再プログラムされた細胞と比較され得る未分化又は胚性幹細胞は、分化した体細胞と同じ種由来でよい。あるいは、再プログラムされた細胞と比較され得る未分化又は胚性幹細胞は、分化した体細胞と異なる種由来であってもよい。
いくつかの実施態様において、未分化細胞中で特異的に発現する特定の遺伝子が再プログラムされた細胞中でも発現する場合、再プログラムされた細胞と未分化細胞（例えば胚性幹細胞）との間に遺伝子発現パターンにおける類似性が存在する。例えば、分化した体細胞において通常は検出できない特定の遺伝子（例えばテロメラーゼ）を用いて、再プログラムの程度をモニターすることができる。同様に、特定の遺伝子については、発現ないことによって再プログラミングの程度を評価することができる。
テロメラーゼ活性の誘導によって特徴付けられる自己再生能は、脱分化細胞においてモニターすることができる、幹細胞のもう一つの特徴である。
核型分析は、有糸分裂細胞からの染色体スプレッド、スペクトル核型決定、テロメア長のアッセイ、全ゲノムハイブリダイゼーション又はその他当該技術分野で周知の技術を用いて実施することができる。
本発明を用いて、適切な因子をコードするＲＮＡが、１以上の体細胞に、例えばエレクトロポレーションによって組み込まれる。組み込み後、細胞は、脱分化細胞の維持を助ける条件（すなわち幹細胞培養条件）で好ましくは培養される。その後、脱分化細胞を増殖及び誘導し、細胞療法に必要な異なるタイプの体細胞に再分化させることができる。本発明により得られた脱分化細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで１以上の所望の体細胞型に分化するように誘導することができる。
好ましくは、本発明により得られた脱分化細胞は、３つの胚性胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉及び外胚葉のいずれかからの細胞を生じ得る。例えば、脱分化細胞は、骨格筋、骨格、皮膚の真皮、結合組織、泌尿生殖器系、心臓、血液（リンパ細胞）、及び脾臓（中胚葉）、胃、結腸、肝臓、膵臓、膀胱；尿路の内側、気管の上皮部分、肺、咽頭、甲状腺、副甲状腺、腸（内胚葉）；又は中枢神経系、網膜及び水晶体、脳及び感覚神経節、並びに脳及び感覚神経、色素細胞、頭部結合組織、表皮、毛髪、乳腺（外胚葉）に分化し得る。当該技術分野で既知の技術を用いて、本発明に従って得られた脱分化細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで再分化することができる。
本発明の一実施態様では、本発明の方法から生じる再プログラミングされた細胞を用いて、分化した子孫を産生することができる。したがって、一態様において本発明は、（ｉ）本発明の方法を用いて再プログラムされた細胞を得ること；及び（ｉｉ）再プログラムされた細胞の分化を誘導して分化した細胞を産生することを含む、分化細胞を産生するための方法を提供する。工程（ｉｉ）は、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでも実施することができる。さらに分化は、添加され得るか、又はｉｎ ｓｉｔｕ、例えば再プログラムされた細胞が導入された体、臓器又は組織中に存在し得る適切な分化因子の存在によって誘導され得る。分化した細胞は、細胞、組織及び／又は臓器移植の分野で有利に使用される細胞、組織及び／又は臓器を得るために使用することができる。所望であれば、遺伝子修飾は、例えば再プログラミングの前に体細胞に導入することができる。本発明の分化細胞は好ましくは、胚性幹細胞又は胚性生殖細胞の多分化能を有さず、本質的に組織特異的な部分的に又は完全に分化した細胞である。
本発明の方法の１つの利点は、本発明によって得られた再プログラミングされた細胞が細胞株の事前の選択又は精製又は樹立なしに分化され得ることである。したがって、特定の実施態様において、再プログラムされた細胞を含む不均一な細胞の集団は、所望の細胞型に分化される。一実施態様において、本発明の方法から得られた細胞の混合物を１以上の分化因子に曝露し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。
本明細書に開示された方法によって得られた再プログラムされた細胞を分化させる方法は、再プログラムされた細胞の透過処理の工程を含んでもよい。例えば、本明細書に記載された再プログラミング技術又は再プログラムされた細胞を含む細胞の不均一混合物によって生成された細胞を、１以上の分化因子又は細胞抽出物又は分化因子を含む他の調製物に曝露される前に透過処理してもよい。
例えば、分化細胞は、未分化の再プログラムされた細胞を少なくとも１の分化因子の存在下で培養し、培養物から分化細胞を選択することによって得ることができる。分化細胞の選択は、分化細胞上に存在する特定の細胞マーカーの発現などの表現型に基づくが、又は機能アッセイ（例えば特定の分化した細胞型の１以上の機能を実行する能力）によってもよい。
別の実施態様では、本発明に従って再プログラムされた細胞は、それらのＤＮＡ配列の付加、欠失又は修飾によって遺伝子修飾される。
本発明に従って調製された再プログラム若しくは脱分化された細胞、又は再プログラム若しくは脱分化された細胞に由来する細胞は、研究及び治療において有用である。再プログラムされた多能性細胞は、皮膚、軟骨組織、骨格筋（bone skeletal muscle）、心筋、腎臓、肝臓、血液及び造血、血管前駆体及び血管内皮、膵ベータ、ニューロン、グリア、網膜、神経、腸、肺及び肝臓細胞を含むがこれらに限定されない体内の細胞のいずれかに分化することができる。
再プログラムされた細胞は、再生／修復治療に有用であり、それを必要としている患者に移植することができる。一実施態様において、該細胞は、患者の自己細胞である。
本発明に従って提供される再プログラミングされた細胞は、例えば心臓、神経、内分泌、血管、網膜、皮膚、筋骨格障害及び他の疾患の治療における治療戦略において使用することができる。
例えば、限定を意図していないが、本発明の再プログラムされた細胞は、年齢又はがん放射線療法及び化学療法などの切除療法が原因で自然細胞が枯渇した動物において細胞を補充するために使用することができる。別の非限定的な例では、本発明の再プログラムされた細胞は、臓器再生及び組織修復において有用である。本発明の一実施態様では、再プログラムされた細胞を使用して、ジストロフィーの筋肉（dystrophic muscle）及び心筋梗塞などの虚血事象によって損傷された筋肉を含む損傷された筋肉組織を再活性化することができる。本発明の別の実施態様では、本明細書に開示の再プログラムされた細胞は、外傷性損傷又は外科手術後に、ヒトを含む動物における傷跡を改善するために使用され得る。この実施態様では、本発明の再プログラムされた細胞は、静脈内などに全身投与され、損傷細胞によって分泌される循環サイトカインによって見出された、新たに外傷を受けた組織の部位に移動する。本発明の別の実施態様において、再プログラムされた細胞は、修復又は再生が必要な治療部位に局所的に投与されてもよい。
本発明の一態様において、ＲＮＡなどの核酸は、エクスビボ法、すなわち患者から細胞を取り出し、前記細胞を遺伝子修飾し、修飾された細胞を患者に再導入することによって患者に投与される。トランスフェクション及び形質導入の方法は、当業者に既知である。
用語「トランスフェクション」は、核酸、特にＲＮＡの細胞への導入を指す。本発明の場合、用語「トランスフェクション」はまた、細胞への核酸の導入又は該細胞による核酸の取り込みを含み、ここで細胞は対象、例えば患者に存在し得る。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで存在することができ、例えば細胞は、患者の臓器、組織及び／又は生物体の一部を形成し得る。本発明によれば、トランスフェクションは、一過性又は安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの用途では、トランスフェクトされた遺伝物質が一時的にしか発現されなくても、十分である。トランスフェクション法で導入された核酸は核ゲノムに通常組み込まれていないため、外来核酸は、有糸分裂によって希釈されるか、又は分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈度を大きく低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞及びその娘細胞のゲノムに残っていることが望ましい場合、安定トランスフェクションが行われなければならない。ＲＮＡは、そのコードしているタンパク質を一過性に発現するように、細胞にトランスフェクトすることができる。
本発明によれば、核酸を細胞に導入、すなわち移入又はトランスフェクトするのに有用な任意の技術を使用することができる。好ましくは、ＲＮＡは、標準的技術によってトランスフェクトされる。そのような技術には、エレクトロポレーション、リポフェクション及びマイクロインジェクションが含まれる。本発明の１つの特に好ましい実施態様では、ＲＮＡをエレクトロポレーションによって細胞に導入する。エレクトロポレーション又は電気透過処理（electropermeabilization）とは、外部から印加された電場によって引き起こされる細胞原形質膜の電気伝導率及び透過性の有意な増加を指す。これは通常、細胞に何らかの物質を導入する方法として、分子生物学において用いられる．本発明によれば、タンパク質又はペプチドをコードする核酸の細胞への導入が前記タンパク質又はペプチドの発現をもたらすことが好ましい。
本発明によれば、核酸を特定の細胞に向けることができる。そのような実施態様では、細胞（例えばレトロウイルス又はリポソーム）に核酸を投与するために使用される担体は、結合標的分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体などの分子、又は標的細胞上の受容体のリガンドは、核酸担体に組み込まれるか又は結合され得る。リポソームによる核酸の投与が望ましい場合、標的化及び／又は吸収を可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込むことができる。このようなタンパク質には、特定の細胞型に特異的なカプシドタンパク質又はその断片、内部移行タンパク質に対する抗体、細胞内部位を標的とするタンパク質等が含まれる。
「レポーター」は、レポーター遺伝子によってコードされ、レポーターアッセイで測定される分子、典型的にはペプチド又はタンパク質を指す。従来の系では通常、酵素レポーターを使用し、前記レポーターの活性を測定する。
「多重クローニング部位」という用語は、制限酵素部位を含む核酸領域を指し、そのいずれか１つを、例えばベクターの切断及び核酸の挿入に使用することができる。
本発明によれば、ヌクレオチド又はアミノ酸などの２つの要素は、それらが互いに直接隣接していれば、中断することなく連続している。例えば、連続するｘ個のヌクレオチドの配列Ｎは、配列（Ｎ）ｘを指す。
「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、特定の塩基配列内のＤＮＡ分子の両方の鎖におけるホスホジエステル結合を切断する酵素のクラスを指す。それは、二本鎖ＤＮＡ分子上の認識配列と呼ばれる特異的結合部位を認識する。ＤＮＡ中の前記ホスホジエステル結合が前記酵素によって切断される部位は、切断部位と呼ばれる。ＩＩＳ型酵素の場合、切断部位は、規定のＤＮＡ結合部位からの距離に位置する。本発明によれば、用語「制限エンドヌクレアーゼ」は、例えば酵素ＳａｐＩ、ＥｃｉＩ、ＢｐｉＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｖＣＩ、ＰｐｉＩ及びＰｓｒＩ、ＢｓｒＤ１、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｍＢＩ、ＦａｕＩ、ＢｂｓＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｅＲＩ、ＥｃｉＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓｇＩ、ＭｍｅＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＭＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＰｃｔＩ、Ｂｓｅ３ＤＩ、ＢｓｅＭＩ、Ｂｓｔ６Ｉ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｋｓｐ６３２Ｉ、ＢｆｉＩ、Ｂｓｏ３１Ｉ、ＢｓｐＴＮＩ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＢｆｕＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＡａｒＩ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、ＧｓｕＩ、ＡｌｏＩ、Ｈｉｎ４Ｉ、ＰｐｉＩ及びＰｓｒＩを含む。
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」を指す。「半減期」は、分子の活性、量又は数の半分を除去するのに必要な時間を指す。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性を示す。
本明細書に記載されるＲＮＡなどの核酸は、特に本明細書に記載の治療のために使用される場合、核酸及び任意選択的に１種以上の薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む薬学的組成物又はキットの形態で存在し得る。
薬学的組成物は、好ましくは無菌であり、有効量の核酸を含有する。
薬学的組成物は通常、同一の剤形で提供され、当該技術分野で既知の方法で調製することができる。薬学的組成物は、例えば溶液又は懸濁液の形態であってもよい。
薬学的組成物は、好ましくは薬学的に許容される塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含むことができる。「薬学的に許容される」という用語は、薬学的組成物の活性成分の作用を妨害しない物質の非毒性を指す。
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用することができ、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸等から調製されるものを非限定的に含む。薬学的に許容される塩はまた、アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩又はカルシウム塩として調製することができる。
薬学的組成物における使用に適した緩衝物質には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸及び塩中のリン酸が含まれる。
薬学的組成物における使用に適した防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン及びチメロサールが含まれる。
「担体」という用語は、適用を容易にし、増強し又は可能にするために活性成分と組み合わされる、天然又は非天然（合成）性の有機又は無機成分を指す。本発明によれば、用語「担体」には、患者への投与に適している、１種以上の適合性のある固体又は液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化物質も含まれる。
非経口投与用の可能な担体物質は、例えば滅菌水、グルコース溶液、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、及び特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー又はポリオキシエチレン／ポリオキシ－プロピレンコポリマーである。
本明細書で使用される場合、用語「賦形剤」は、薬学的組成物中に存在し、例えば担体、結合剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤又は着色剤等の活性成分ではない物質を含む。
本明細書に記載の薬学的組成物は、任意の一般的な経路、例えば注射又は注入を含む非経口投与によって投与することができる。投与は、好ましくは非経口的、例えば静脈内、動脈内、皮下、リンパ節内、皮内又は筋肉内である。
非経口投与に適した組成物は通常、好ましくはレシピエントの血液と等張である活性化合物の滅菌水性又は非水性調製物を含む。適合性の担体及び溶媒の例は、リンゲル液及び等張塩化ナトリウム溶液である。さらに通常は、無菌の不揮発性油が、溶液又は懸濁培地として使用される。
本明細書に記載の薬剤及び組成物は、好ましくは有効量で投与される。「有効量」は、所望の反応又は所望の効果を単独で又はさらなる用量と合せて得る量を指す。特定の疾患又は特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害を指す。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を中断又は逆行させることを含む。疾患又は状態の治療における所望の反応は、前記疾患又は前記状態の発症の遅延または発症の予防であってもよい。
本明細書に記載の薬剤又は組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重篤度、個々の患者のパラメーター（例えば年齢、生理学的状態、サイズ及び体重）、治療期間、付随する治療（存在する場合）、特定の投与経路、並びに類似の要因に依存する。したがって、本明細書に記載の薬剤の投与量は、これらのパラメーターのいくつかに依存し得る。患者における反応が初回用では不十分である場合、より高用量（又はより局所的な異なる投与経路によって得られる、より効果が高い用量）を使用することができる。
本発明は、以下の図面及び実施例によって詳細に説明されるが、それは限定ではなく例示として解釈されるべきである。これらの説明及び実施例に基づいて、さらなる実施態様が当業者には理解可能であるが、それらも同様に本発明の範囲内である。
［実施態様１］
転写の５’ → ３’方向に、
（ａ） プロモーター；
（ｂ） 転写可能な核酸配列又は転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；並びに
（ｃ） 転写物中の３’非翻訳領域を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列であって、前記３’非翻訳領域が以下からなる群より選択される核酸配列を含む、核酸配列：
（ｃ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－６）ＭＴ－ＲＮＲ１の非コードＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
及び
（ｃ－８） （ｃ－１）、（ｃ－２）、（ｃ－３）、（ｃ－４）、（ｃ－５）、（ｃ－６）及び（ｃ－７）の２つ以上の核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせ
を含む核酸分子。
［実施態様２］
プロモーター（ａ）の制御下にある核酸配列（ｂ）及び（ｃ）が、転写されて、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに、核酸配列（ｃ）から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる、実施態様１に記載の核酸分子。
［実施態様３］
ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）が、配列番号８６から８９より選択される核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様１又は２に記載の核酸分子。
［実施態様４］
ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）が、配列番号８６の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様１から３のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様５］
ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）が、配列番号１０５から１２１より選択される核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様１から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様６］
ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）が、配列番号１１５の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様７］
核酸配列（ｃ－８）が、（ｃ－１）、（ｃ－２）、（ｃ－３）、（ｃ－４）、（ｃ－５）、（ｃ－６）及び（ｃ－７）の２つ以上の同じか又は異なる核酸配列、断片及び／又は変異体の組み合わせを含む、実施態様１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様８］
核酸配列（ｃ－８）が、ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）と、ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）との組み合わせを含む、実施態様１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様９］
ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）が、ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）に対して５’に位置する、実施態様８に記載の核酸分子。
［実施態様１０］
ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－４）と、ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片（ｃ－６）との組み合わせが、配列番号１７４の核酸配列からなる群より選択される核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片を含む、実施態様８又は９に記載の核酸分子。
［実施態様１１］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列（ｄ）をさらに含む、実施態様１から１０のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様１２］
前記ポリアデニル配列が、少なくとも２０個のＡヌクレオチド、好ましくは少なくとも４０個、少なくとも８０個、少なくとも１００又は少なくとも１２０個のＡヌクレオチド、好ましくは連続Ａヌクレオチドを含む、実施態様１１に記載の核酸分子。
［実施態様１３］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、２個以上の連続ヌクレオチドの、好ましくは任意の配列であり、２個以上の連続ヌクレオチドの前記配列の最初と最後のヌクレオチドが、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドである、実施態様１１又は１２に記載の核酸分子。
［実施態様１４］
前記核酸配列（ｄ）が、ヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含むポリアデニル配列である核酸配列を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列であり、かつ、大腸菌内で前記核酸分子が増殖すると、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含むポリアデニル配列である前記核酸配列と同じ長さのポリアデニル配列を、プロモーター（ａ）の制御下で転写される際にコードする核酸配列（ｄ）’を前記核酸配列（ｄ）の代わりに含む核酸分子と比較して、より高い安定性を示す、実施態様１１から１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様１５］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列が、少なくとも８０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも９０又は１００個のヌクレオチドを含む、実施態様１１から１４のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様１６］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、前記ポリアデニル配列の２１位から８０位、好ましくは２１位から６０位、さらに好ましくは３１位から５０位の領域内に位置する、実施態様１１から１５のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様１７］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、前記ポリアデニル配列中の少なくとも２０個のＡ残基の前及び／又は後ろにある、実施態様１１から１６のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様１８］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、さらに好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドの長さを有する、実施態様１１から１７のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様１９］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、５０個以下、好ましくは３０個以下、さらに好ましくは２０個以下のヌクレオチドの長さを有する、実施態様１１から１８のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２０］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの前記配列が、３個を超えない、好ましくは２個以下の、好ましくは連続していないＡ残基を含む、実施態様１１から１９のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２１］
プロモーター（ａ）の制御下にある核酸配列（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が、転写されて、共通転写物を生じることができる、実施態様１１から２０のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２２］
核酸配列（ｃ）及び任意選択的に（ｄ）から転写された核酸配列が、転写可能な核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに活性である、実施態様２１に記載の核酸分子。
［実施態様２３］
転写物中、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である前記核酸配列が３’末端に位置する、実施態様１１から２２のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２４］
閉環状分子又は線状分子である、実施態様１から２３のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２５］
転写可能な核酸配列が、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列が、マルチクローニングサイトである、実施態様１から２４のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２６］
（ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー、及び（ｉｉｉ）複製開始点からなる群より選択される１以上の要素をさらに含む、実施態様１から２５のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２７］
特に線状化後、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に適している、実施態様１から２６のいずれか一項に記載の核酸分子。
［実施態様２８］
鋳型として実施態様１から２７のいずれか一項に記載の核酸分子を用いる転写、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られるＲＮＡ。
［実施態様２９］
５’ → ３’方向に、
（ａ） ５’非翻訳領域；
（ｂ） ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列；並びに
（Ｃ） 以下からなる群より選択される核酸配列を含む３’非翻訳領域：
（ｃ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｃ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
及び
（ｃ－８） （ｃ－１）、（ｃ－２）、（ｃ－３）、（ｃ－４）、（ｃ－５）、（ｃ－６）及び（ｃ－７）の２つ以上の核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせ
を含む、ＲＮＡ。
［実施態様３０］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列（ｄ）をさらに含む、実施態様２９に記載のＲＮＡ。
［実施態様３１］
前記核酸配列（ｄ）が前記ＲＮＡの３’末端に位置する、実施態様３０に記載のＲＮＡ。
［実施態様３２］
核酸配列（ｃ）及び任意選択的に（ｄ）が、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに活性である、実施態様２９から３１のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［実施態様３３］
５’キャップ（ｅ）をさらに含む、実施態様２９から３２のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
［実施態様３４］
（ｉ）実施態様１から２７のいずれか一項に記載の核酸分子を提供すること、及び
（ｉｉ）鋳型として前記核酸分子を用いてＲＮＡを転写すること
を含む、ＲＮＡを得る方法。
［実施態様３５］
（ｉ） 実施態様３４の方法に従って、ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡを得ること、及び
（ｉｉ） 前記ＲＮＡを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
［実施態様３６］
核酸分子の転写の前に、核酸分子の切断をさらに含むことを特徴とする、実施態様３４又は３５に記載の方法。
［実施態様３７］
（ｉ） 転写される際に３’非翻訳領域をコードする核酸配列（ｂ）を、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む転写可能な核酸配列（ａ）の３’末端でカップリングすること、及び、
（ｉｉ） 得られた核酸を転写すること
を含み、
前記３’非翻訳領域が、
（ｂ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
（ｂ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、その断片又は前記核酸配列の変異体若しくは断片；
及び
（ｂ－８） （ｂ－１）、（ｂ－２）、（ｂ－３）、（ｂ－４）、（ｂ－５）、（ｂ－６）及び（ｂ－７）の２つ以上の核酸配列、断片及び／又は変異体の任意の組み合わせ
からなる群より選択される核酸配列を含む、ＲＮＡを得る方法。
［実施態様３８］
核酸配列（ａ）及び（ｂ）が、転写されて、転写可能な核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに、核酸配列（ｂ）から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる、実施態様３７に記載の方法。
［実施態様３９］
Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する、１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に任意選択的に含むポリアデニル配列である核酸配列を、転写される際にコードする核酸配列（ｃ）を、核酸配列（ｂ）の３’末端でカップリングすることをさらに含む、実施態様３７又は３８に記載の方法。
［実施態様４０］
核酸配列（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）が、転写されて、転写可能な核酸配列（ａ）から転写された核酸配列の翻訳効率及び／又は安定性を高めるほどに、核酸配列（ｂ）及び任意選択的に（ｃ）から転写された核酸配列が活性である共通転写物を生じることができる、実施態様３９に記載の方法。
［実施態様４１］
実施態様３７から４０のいずれか一項に記載の方法によってＲＮＡを得ること、及び
（ｉｉ）前記ＲＮＡを翻訳すること
を含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
［実施態様４２］
転写がｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、実施態様３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
［実施態様４３］
実施態様３４、３６から４０及び４２のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるＲＮＡ。
［実施態様４４］
実施態様２８から３３及び４３のいずれか一項に記載のＲＮＡを翻訳することを含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
［実施態様４５］
宿主細胞をトランスフェクトするための、実施態様２８から３３及び４３のいずれか一項に記載のＲＮＡの使用。
［実施態様４６］
宿主細胞が抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球又はマクロファージである、実施態様４５に記載の使用。
［実施態様４７］
ワクチン接種のための、実施態様２８から３３及び４３のいずれか一項に記載のＲＮＡの使用。
［実施態様４８］
体細胞を幹細胞特性を有する細胞に再プログラミングするための、実施態様２８から３３及び４３のいずれか一項に記載のＲＮＡの使用。
ｉｎ ｖｉｖｏ選択プロセスの概要 出発ライブラリーを調製するために、ヒトの未成熟樹状細胞を、転写阻害剤であるアクチノマイシンＤの存在下で５時間増殖させ、安定したＲＮＡを予め選択した。残りの細胞ｍＲＮＡを抽出し、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて精製し、次にＮｕｃｌｅａｓｅ Ｐ１（Ｒｏｃｈｅ）で断片化した。このために、１０μｇのＲＮＡを、８μＬの５０ｍＭ ＮａＡｃ緩衝液（ｐＨ５．５）中の０．３ＵのＮＰ－１と４５分間、２４μＬの総反応体積でインキュベートした。ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製を経て、断片をｃＤＮＡに逆転写する準備が整った。規定のプライマー配列とＮｏｔＩ制限部位とを有する六量体プライマー及びＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｐｒｅｍｉｕｍ第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用し、そのプロトコールに従って第１及び第２の鎖合成を行った。５’オーバーハングを埋め、かつ、３’オーバーハングを除去するために、次にｃＤＮＡを１２．５ＵのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと１５℃で５分間インキュベートした。５μＬの０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０を添加して反応を停止させ、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてｃＤＮＡを精製した。ＮｏｔＩ（ＮＥＢ）を用いたｃＤＮＡライブラリーの消化は、平滑で粘着性の末端を有する断片を産生した。さらに、１５０ｂｐｓより小さいすべての断片を確実に除去するために、ゲル調製物による断片のサイズ選択を行った。ライブラリーのクローニングのために、パネルＡに示したようなベクターを、ＥｃｏＲＶ及びＮｏｔＩで消化して、平滑で粘着性の末端をそれぞれ残した。次の工程で、ライブラリーをＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いてベクターにライゲートした。表４の、ＰｈｕｓｉｏｎＴＭＨｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いるＰＣＲ用の鋳型として、ライゲーション混合物をそのまま使用した。表５にあるように、精製後、Ｔ７転写の鋳型としてＰＣＲ産物を用いた。インキュベーションは３７℃で行った。３０分経過毎に、０．７５μＬの１００ｍＭ ＧＴＰを反応に加えた。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（２Ｕ／μＬ、Ａｍｂｉｏｎ）を添加し、３７℃でさらに１５分間インキュベートすることにより、２．５時間後に反応を停止した。最終的にＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）により反応をクリーンナップした。ＲＮＡライブラリーはその後、以前に記載されたように（Ｋｕｈｎら、２０１０）、ｈｉＤＣへのＲＮＡのエレクトロポレーションから始める選択手順のために使用することができる。選択のための培養の後、ＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、製造者の指示書に従ってＲＮＡの抽出及び精製を行った。次にＲＮＡを、製造者の指示書に従ってＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｄＴ１８プライマーを使用するｃＤＮＡ合成の鋳型として使用した。次にｃＤＮＡを上記のようなＰＣＲの鋳型として使用した。最後に、ＰＣＲ産物は、次の選択ラウンド（パネルＢ）を開始するのに、Ｔ７転写の鋳型として使用することができる（上記参照）。ＤＮＡ／ｃＤＮＡ及びＲＮＡサンプルの品質管理は、それぞれアガロースゲル及びＡＧＩＬＥＮＴ ２１００バイオアナライザーによって行った。 ｌｕｃ２ＣＰｍｕｔベクター内のサンプルの外観の略図 （Ａ）単一要素又は２つの（上流及び下流の）要素を、３’－ＵＴＲとして所与のベクターにクローン化した。コントロールサンプルＮＥＧ（３’ＵＴＲを挿入しないネガティブコントロール）、ｈＢｇ及び２ｈＢｇも示す。選択ラウンドのためのＲＮＡの調製。（Ｂ）ｈｉＤＣにおけるエレクトロポレーションのために、ベクターを、Ｔ７プロモーター及びポリ（Ａ）テールを含む伸長プライマーを用いるＰＣＲの鋳型として使用した。次に、ＰＣＲ産物をＴ７－ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成の鋳型として使用して、それぞれのＩＶＴ－ＲＮＡを産生した。 選択された配列がｌｕｃ２ＣＰｍｕｔをコードするＲＮＡの安定性に及ぼす影響 ヒト未成熟樹状細胞（ＮＥＧは図２に記載の通り）へのエレクトロポレーションの際の本発明者らの至適基準（gold-standard）である２ｈＢｇと比較した、３’ＵＴＲに選択された配列を含有するＲＮＡのルシフェラーゼ活性、半減期及び総タンパク質の経時変化を示す結果。上のパネルは、３’ＵＴＲを有する、示した３つの例示的ＲＮＡの経時変化を示す。左下のパネルには、それぞれの３’ＵＴＲを有する、示したＲＮＡの半減期が、２ｈＢｇのＲＮＡと比較して示されている。同様に、２ｈＢＧを有するＲＮＡと比較した相対総タンパク質発現が右下パネルに示されている。 レポーター遺伝子としてのｌｕｃ２ｍｕｔと、新たに選択された３’－ＵＴＲとを用いた代表的なルシフェラーゼ活性 図示されている３’ＵＴＲを有するＲＮＡのヒト未成熟樹状細胞へのエレクトロポレーションの後、ルシフェラーゼ活性を７２時間かけて測定した。 線維芽細胞へのＩＶＴ－ＲＮＡを用いたエレクトロポレーションの代表的な結果 左パネル：ｌｕｃ２ＣＰｍｕｔベースのベクター。右パネル：ｌｕｃ２ｍｕｔベースのベクター。 Ｔ細胞へのＩＶＴ－ＲＮＡを用いたエレクトロポレーションの代表的な結果 一番左のパネルは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＦＩ ３’ＵＴＲを有するＲＮＡの相対総タンパク質発現を、２ｈＢＧを有するＲＮＡと比較して示している。同様に、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＦＩ ３’ＵＴＲを有するＲＮＡの相対的翻訳効率及びｍＲＮＡ半減期を、２ｈＢＧを有するＲＮＡと比較して、中央及び右端のパネルにそれぞれ示している。 修飾されたヌクレオチドを有するＲＮＡを試験するためのＲＮＡアーキテクチャ－及び完全性 Ａ：ルシフェラーゼアッセイに用いたＲＮＡは、ここに示すように構築した。５’キャップとして、β－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）を用いた。５’ＵＴＲとして、Ｋｏｚａｋ配列を含むヒトアルファグロビン５’ＵＴＲを用いた。ホタルルシフェラーゼ遺伝子の後、比較される２つの３’ＵＴＲをクローン化した。ポリＡテールとして、Ａ３０Ｌ７０配列を用いた。 Ｂ：トランスフェクションの前に、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）でＲＮＡの完全性をチェックした。すべてのＲＮＡは、十分に高くかつ同等の完全性を有しており、したがって実験に使用することができた。 ｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡ安定性及び機能性に対するＦＩ ３’ＵＴＲの効果 ＦＩ ３’ＵＴＲ又は２ｈＢｇ ３’ＵＴＲを含有するルシフェラーゼ及びｇｐ７０ ｍＲＮＡをＦ１２とともに製剤化し、ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｖ．投与した。ルシフェラーゼｍＲＮＡ投与後、６時間後及び２４時間後に発現をモニターし、０日目及び６日目にｇｐ７０ ｍＲＮＡを投与し、１０日目にＣＤ８及びｇｐ７０ ｔｅｔ＋染色により免疫活性化を分析した。 Ａ） ＦＩ ３’ＵＴＲ又は２ｈＢｇ ３’ＵＴＲを含有する非修飾及びｍ１Ｙ修飾ｍＲＮＡの注射の６時間後及び２４時間後のルシフェラーゼ発現レベルを示す。ＦＩ ３’ＵＴＲ又は２ｈＢｇ ３’ＵＴＲを含有する非修飾及びｍ１Ｙ修飾ｍＲＮＡの双方とも、２ｈＢｇ ３’ＵＴＲ含有の対応するｍＲＮＡと同等の発現レベルを示している。 Ｂ） ＦＩ ３’ＵＴＲ又は２ｈＢｇ ３’ＵＴＲを含有するｇｐ７０ ｍＲＮＡに応答するｇｐ７０特異的ＣＤ８ Ｔ細胞のパーセンテージを示す。２つの３’ＵＴＲは、ＦＩ ３’ＵＴＲを含有するｇｐ７０ ｍＲＮＡを受け取ったマウスの脾臓における抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な増加を伴って、２回の免疫化後に抗原特異的免疫を誘導するのにも同様に良好に機能する。 統計：一方向ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙのポストテスト、＊ｐ＜０．０５ 自己複製ＲＮＡの安定性に対する安定化ＵＴＲの効果 非細胞傷害性セムリキ森林ウイルス由来の自己複製（レプリコン）ＲＮＡの３’保存配列要素のすぐ上流に、不安定化ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２ＣＰ）をクローン化した。レプリコンＲＮＡは、対応する線状プラスミドからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製され、細胞にエレクトロポレーションされた。ルシフェラーゼ発現は、発光基質を９６時間から１２０時間添加することによって測定した。（Ａ）ＢＨＫ２１細胞を用いた代表的な実験におけるルシフェラーゼ発現の経時変化。（Ａ）ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）を用いた代表的な実験におけるルシフェラーゼ発現の経時変化。放出されたＩ型インターフェロンの細胞傷害性を減少させるために、ワクシニアウイルスＢ１８Ｒ ｍＲＮＡを各サンプルにコトランスフェクトした。プロテインキナーゼＲ活性化を阻害し、翻訳の全体レベルを高めるために、ワクシニアウイルスＥ３ ｍＲＮＡを各サンプルに同時トランスフェクションした。 ＦＩ要素内の相同性ストレッチ 下線を引いた配列ストレッチは、互いに塩基対であることが予測された。「８ｎｔ突然変異」コンストラクトについては、第１の要素を第２の要素との相互作用を破壊するように、ａａａｇｇｇｃｕへと突然変異させた。 ２ｈＢｇＵＴＲを用いたＰＣＲ鋳型ベースのＩＶＴにおけるアーチファクト Ａ：ＰＣＲによるＩＶＴ鋳型作成の略図５’プライマーはＴ７プロモーターの上流でアニールし、３’プライマーは１２０ｎｔポリＡテールを含有し、かつ、プラスミドコードされたポリＡ及び３’ＵＴＲの一部までアニールする。２ｈＢｇＵＴＲの場合、最初の反復までアニーリングすることによるミスプライミングが起こり得る。Ｂ：２ｈＢｇＵＴＲを含有する、プラスミド由来のＰＣＲ産物赤い矢印は副産物を示しており、１ｈＢｇのトランケーションを表す。Ｃ：したがって、このようなＰＣＲ産物から転写されたＲＮＡは、短縮された副産物を生じる（矢印）。Ｄ：３’ＵＴＲとしてＦＩ要素を含有する、プラスミド由来のＰＣＲ産物を得る。副産物は見えない。Ｅ：得られるｍＲＮＡは、さらなる副ピークを全く伴わずに、期待される高い完全性を有する。 トランケートされたＵＴＲ要素の略図及び対応するｍＲＮＡコンストラクトの半減期 図Ａの上のパネルは、トランケートされた変異体によって占められた、配列番号８６のＦ要素の完全長配列の核酸位置に対する、トランケートされたＵＴＲ要素の略図を示す。 図Ａの下のパネルは、配列番号８６のＦ要素の完全長配列を含むｍＲＮＡに対する、トランケートされたＵＴＲを含むｍＲＮＡの相対的半減期を示す。ルシフェラーゼレポーターをコードするｍＲＮＡをｈｉＤＣにエレクトロポレーションし、それらの発現をルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡し、相対的ＲＮＡ半減期を決定した。 図Ｂの上のパネルは、トランケートされた変異体によって占められた、配列番号１１５のＩ要素の完全長配列の核酸位置に対する、トランケートされたＵＴＲ要素の略図を示す。 図Ｂの下のパネルは、配列番号１１５のＩ要素の完全長配列を含むｍＲＮＡに対する、トランケートされたＵＴＲを含むｍＲＮＡの相対的半減期を示す。ルシフェラーゼレポーターをコードするｍＲＮＡをｈｉＤＣにエレクトロポレーションし、それらの発現をルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡し、相対的ＲＮＡ半減期を決定した。 ランダムＵＴＲに対するＦ、Ｉ又はＦＩ要素を含むｍＲＮＡコンストラクトの相対的半減期及びタンパク質発現 図１３は、ランダムＵＴＲに対するＦ、Ｉ又はＦＩ要素を含むｍＲＮＡコンストラクトの相対的半減期及びタンパク質発現を示す。この完全長の個々のＦ及びＩ要素、並びにＦＩの組み合わせをランダム３’ ＵＴＲ（長さ２５７ｎｔ）に対して比較した。全要素は、ルシフェラーゼをコードするコンストラクトにクローン化され、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡに転写され、ｈｉＤＣにエレクトロポレーションされ、ルシフェラーゼ発現が経時的に測定され、相対的半減期及び総タンパク質発現が算出された。 細胞再プログラミングのためのＵＴＲ要素 図１４Ａは、初代ヒト包皮線維芽細胞の再プログラミングのタイムラインを示す。４００００個の細胞を２ウェルプレートに播種し、各０．０８μｇのＢ１８Ｒ、Ｅ３及びＫ３（ＥＫＢ）、並びにｍｉＲＮＡ ３０２ａ－ｄと３６７とからなるｍｉＲＮＡ混合物０．１７μｇ（１：１：１：１：１：１）を含む、再プログラミングＴＦ ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＳＫＭＮＬ）（１：１：１：１：１：１）をコードする非修飾ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）－ＲＮＡ０．３３μｇからなるｍＲＮＡ混合物で、３日間（３ｘ）又は４日間（４ｘ）連続してリポフェクションした。したがって、ＲＮＡコンストラクトは、ヒトβ－グロビン３’ＵＴＲ（２ｈＢｇ）、Ｆ－Ｉ要素（ＦＩ）又はＩ－Ｆ要素（ＩＦ）のタンデム反復からなる３’ＵＴＲにおいてのみ異なっていた。９日目以降、コロニー形成が観察され、コロニーの分析がｄ１１で行われた。 図１４Ｂは、樹立したコロニーのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色を示す。 図１４Ｃは、対応する棒グラフで、ＡＰ陽性コロニーの計数を表す。 図１４Ｄは、ＦＩ－ＵＴＲを含有するＲＮＡを用いて得られたｉＰＳ細胞コロニーの形態を示す。それは、はっきりと区別できるコロニー及び明確に画定された境界内にきつく充填された小さな細胞を含むｈＥＳ細胞様であった。 図１４Ｅは、Ｄと同様に調製されたコロニーの、ＡＰに対して陽性に染色されたものを４倍及び１０倍の倍率で示している。 図１４Ｆは、Ｄと同様に調製されたコロニーの、ｈＥＳ細胞表面マーカーＴＲＡ－１－６０の生体染色（live staining）を示す。 図１４Ｇは、コロニーをペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ｑＲＴ－ＰＣＲで定量することによって評価した、ｈＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴ及びＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現を示す。
実施例１： ｍＲＮＡを安定させる配列要素の同定
本発明者らは、ｍＲＮＡを安定させる新規配列要素を同定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡの選択的環境としてｈｉＤＣを用いるｉｎ ｖｉｖｏ選択プロセスを開発した。出発ＲＮＡライブラリーは、ｈｉＤＣ由来の天然に存在するｍＲＮＡ配列を用いて構築した。ＲＮＡ単離の前に、細胞を、転写阻害剤アクチノマイシンＤ（ＡｃｔＤ）の存在下で５時間増殖させて、安定したＲＮＡを予め選択した。その後、残りのｍＲＮＡを抽出し、２００～８００ヌクレオチドの断片に短縮し、逆転写し、ｈＡｇ ５’ＵＴＲ配列と、選択プロセスの基礎として選択されたレポーター遺伝子とを有するベクター中で、３’－ＵＴＲとしてクローン化した。それに続くライブラリーのｍＲＮＡ転写に使用されるＤＮＡ鋳型をＰＣＲで増幅し、その間に５’プライマーを介しＴ７プロモーターを、３’プライマーを介しＡ６０ポリＡテールを導入した。次いで、数ラウンドのライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の、対応するＲＮＡのｈｉＤＣへのエレクトロポレーション、及び規定の時点後の安定した配列の抽出および増幅からなるｉｎ ｖｉｔｒｏ選択プロセスに、転写されたｍＲＮＡを導入した。選択配列の増幅は、ｃＤＮＡ合成後、特異的プライマーを用いるＰＣＲで行った。それに続いて、得られたＰＣＲ産物を新たなｍＲＮＡライブラリーの鋳型として使用した。これは、残りのＲＮＡをラウンド１では２４時間後、ラウンド２と３では４８時間後、ラウンド４と５では７２時間後、最後にラウンド６では９６時間後、１週間後及び２週間後（エレクトロポレーションの際に細胞を３つの部分に分け、所定の時点で個別に収穫した）に抽出して、６ラウンド行われた。
１から５ラウンド後の選択プロセスのモニタリングは、対応するＲＮＡプールの平均半減期の有意な増加を示したが、これは、安定化３’－ＵＴＲ要素の濃縮を示す（表１）。しかし、安定性の増加は、後のラウンドになるほど顕著ではなかった。したがって、ＲＮＡを９６時間後、１週間後及び２週間後に細胞から抽出した最後の第６ラウンドの後、選択プロセスを停止した。選択配列を特徴付けるために、３５０個を超える個々のクローン、すなわち第５ラウンドから１０８個、第６／９６時間ラウンドから８８個、第６／１週間ラウンドから１１０個、及び第６／２週間ラウンドから９６個を配列決定した。それらのゲノム起源を同定するために、すべての配列を互いに比較し、ＢＬＡＳＴ処理した。ここでは特に、配列が内因性の５’－又は３’ＵＴＲに由来するのか、又はコード領域に由来するのかを検討した。最後に、ｈｉＤＣにおける発現レベルをＮｅｘｔＢｉｏ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）からダウンロードした。全部で、７つの群を同定することができ、それらは、（ｉ）複数の配列が見出されたもの、（ｉｉ）内因性ＲＮＡの３’ＵＴＲに由来するか、又は内因性非コードＲＮＡに由来するもの、及び（ｉｉｉ）ｈｉＤＣにおいて明確に発現したものであった（表２）。これらは、次の遺伝子に由来する：ＩｇＧのＦｃ断片、受容体、輸送体、アルファ（Ｂ、ＦＣＧＲＴ、ＮＭ＿００１１３６０１９）、リンパ球特異的タンパク質１（Ｄ、ＬＳＰ１、ＮＭ＿００２３３９）、ケモカインリガンド２２（Chemokine ligand 22）（Ｅ、ＣＣＬ２２、ＮＭ＿００２９９０）、スプリットのアミノ末端エンハンサー（Ｆ、ＡＥＳ、ＮＭ＿１９８９６９）、ホスホリパーゼＤのファミリーメンバー３（Ｇ、ＰＬＤ３、ＮＭ＿００１０３１６９６）、ミトコンドリアコード化１２ＳＲＮＡ（Ｉ、ＭＴ＿ＲＮＲ１、ＮＣ＿０１２９２０）、主要組織適合複合体クラスＩＩ ＤＲベータ４（Ｊ、ＨＬＡ－ＤＲＢ４、ＮＭ＿０２１９８３）。簡潔にするために、以下では、これらの要素の略語として括弧内の大文字ＢからＩを使用することに留意されたい。重要なこととして、すべての場合において、ある１つの配列を有する複数のクローンは、正確な５’及び３’末端が異なり、これは、それらが異なる開始クローンに由来し、プロセス中に単に人工的に濃縮されているわけではないことを証明している（スクリーニングで同定された完全な配列表については、別添を参照のこと）。
実施例２： 同定した個々の配列要素の特徴付け
同定した配列要素の特徴付けのために、各群の代表候補が１つ選択された（配列の詳細は別添に記している）。次いで、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するベクター中で３’－ＵＴＲとして、この配列をクローン化した。このルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルは、細胞への移行時に経時的に分析することができる。タンパク質について観察された発現パターンから、ＲＮＡの相対的安定性及び翻訳効率が正確に推測され得ることが以前に証明されている（Ｋｕｈｎ ２０１０ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ）。この実験で使用した特異的レポーターｌｕｃ２ＣＰｍｕｔは、不安定化した形態のルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）である。これにより、ＲＮＡの安定性のわずかな変化さえも検出することが可能になる。その後、これらのベクターに由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡを、ＲＮＡ安定性及び翻訳効率に関して、本発明者らの至適基準ｍＲＮＡ、すなわち２ｈＢｇ ３’－ＵＴＲを含有するものと比較した。コントロールサンプルとして、３’－ＵＴＲを含まないｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（すなわち、インサートをクローニングするために使用される配列のみを含有する）及び、単一のベータグロビン要素のみを有するもの（１ｈＢ）を使用した。
ＵＴＲ含有ベクターから開始して、転写される領域を、Ｔ７プロモーターを含有する５’プライマーと、６０ヌクレオチドのポリ（Ａ）テールを有する３’プライマーとを用いてＰＣＲにより増幅した。ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ ＡＭＰＵＲＥ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ＰＣＲ断片のクリーンナップを行った。０．６容量のビーズを、各ＰＣＲ反応に加え、混合した。ＲＴ ＰＣＲでの１５分間のインキュベーションの後、ビーズに結合したＰＣＲ産物を過剰のプライマー、ヌクレオチド、塩及び酵素から磁気スタンドによって分離した。ビーズを８０％エタノールで３０秒間２回洗浄して、不純物をさらに除去した。所望のＰＣＲ産物を最終的に３０μＬのｄｄＨ２Ｏで２回溶出し、対応するＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型として使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、それぞれの反応緩衝液及び６ｍＭのＮＴＰを使用した。ＲＮＡの効率的なキャッピングのために、ＧＴＰ濃度を１．５ｍＭに低下させ、６ｍＭのβ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）を反応物に添加し、３７℃で２．５時間インキュベートした。ＲＮＡをカルボキシル化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって精製し、２１００Ｂｉｏｎａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分光測光及び分析によりＲＮＡ濃度及び品質を評価した。
すべての新たな配列は、スクリーニング手法でのそれらの同定と一致して、ＲＮＡ安定性に関して２ｈＢｇと比較して、それと非常に類似した特性を示した（最高がＩ群（ｍｔＲＮＲ１））（図３；表３）。重要なこととして、各個々の要素は、３’－ＵＴＲを含まないＲＮＡと比較しても、さらにベータグロビン要素の単一コピーのみを有するＲＮＡと比較しても、ＲＮＡ安定化を与えた。翻訳効率は、ＲＮＡ安定性と経時的に発現した総タンパク質との間の直接的な相関関係によって観察されるように、有意な影響を受けなかった。
実施例３： 個々の配列要素の組み合わせ
さらなる実験では、各群の単一の配列を対にして互いに組み合わせた（図２）。この背後にある理論的根拠は、２つの３’－ＵＴＲの組み合わせがＲＮＡの安定性及び翻訳効率にさらなる効果を及ぼすという、本発明者らの以前の所見であった（Holtkamp et al. 2006）。ＲＮＡの安定性及び翻訳効率は、測定されたルシフェラーゼ値をスプラインで補間することによって算出し、このスプラインの最も急な上昇勾配を、翻訳効率及び安定性としてのシグナルの半減期として定義した。補間したスプラインの積分は、総タンパク質発現と解釈される。合計で６４の組み合わせ、すなわち７つの新たに同定された配列及びヒトベータグロビン３’－ＵＴＲの、可能な全組み合わせをクローン化した（表６）。上記のように、これらの鋳型ＤＮＡからＲＮＡを調製し、その後ｈｉＤＣにエレクトロポレーションした。コントロールとして、個々の要素を含有するＲＮＡも含めた。７つの新たな要素の大部分について、他の要素との少なくとも１つの組み合わせが、単一の要素よりも高い安定性を有するＲＮＡを与えることが観察された（表７から表１３）。興味深いことに、殆どの場合、Ｉ要素（ｍｔＲＮＲ１）との組み合わせがＲＮＡの半減期を増加させた。ここで、このＲＮＡの安定性は、２ｈＢｇ ３’－ＵＴＲを有するＲＮＡと比較して、概して高かった（表７から表１３）。殆どすべての組み合わせが、ＲＮＡの翻訳効率にプラス効果を及ぼした。総じて、ＲＮＡ安定性及び翻訳効率に対する組み合わせ効果は、総タンパク質発現の最大１．７４倍の増加をもたらす。したがって、本発明者らは、安定性及び／又は翻訳効率が高まったＲＮＡを生じる２つの異なる要素の組み合わせの他に、（２３３個ヌクレオチド未満の長さを有する）単一要素を同定することができたが、しかし同時に、２ｈＢｇに関して上述したような１つの要素の同一のコピーを２つ有することの問題を回避した。
不安定化した形態のルシフェラーゼで得られた結果を確認するために、先の実験を、標準的なルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と、次の選択された３’－ＵＴＲ：ｍｔＲＮＲ１（Ｉ）、ｍｔＲＮＲ１－ＡＥＳ（ＩＦ）、ＡＥＳ－ｍｔＲＮＲ１（ＦＩ）、ｍｔＲＮＲ１－ｈＢｇ（ＩｈＢｇ）及びｈＢｇ－ｍｔＲＮＲ１（ＩｈＢｇ）を有するＲＮＡで繰り返した。図４と表１４に示すように、新たな要素が個々に又は組み合わさって、２ｈＢｇ要素と同様にｍＲＮＡ安定性及び／又は翻訳効率を高めることを立証する、上で観察されたのと同等の結果が得られた。
実施例４： 他の細胞型における選択配列要素を有するｍＲＮＡの分析
また、新たに選択された３’－ＵＴＲ ｍｔＲＮＲ１及びＡＥＳを、異なる細胞型及び細胞株においてｈｉＤＣ特異性があるかどうかを調べるために試験した。これらの配列を、ヒト線維芽細胞（ＨＦＦ）、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）（図５）、及びＴ細胞（図６）において試験し、配列がこれらの細胞においても安定化しているかどうかを評価した。
ＨＦＦ及びＣ２Ｃ１２細胞を採取し、エレクトロポレーション用に調製した。次に２．０μｇのＩＶＴ－ＲＮＡを、示された３’ＵＴＲを含有する、ＧＦＰをコードする１．０μｇのＲＮＡと一緒にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を分割した。ウェルあたり５０００個の細胞を合計７つの時点（２、４、８、２４、４８及び７２時間）のために９６ウェルプレートに三連で分配し、ルシフェラーゼ活性を測定した。ウェルあたり２Ｅ＋０５細胞を６ウェルプレートに播種し、２４時間後にＦＡＣＳで採取した（ＧＦＰシグナル）。これは、トランスフェクション効率のモニタリングを可能にした。トランスフェクション効率は、７２から９０％の間で異なっており、半減期の算出に組み込むことができた。ＨＦＦ及びＣ２Ｃ１２、並びにＴ細胞で得られた結果により、ｈｉＤＣで以前に得られた結果が確認された。ＩとＦとの組み合わせは特に、半減期に関して、２ｈＢｇと比較して２～３倍勝っていた。さらに、ＦＩは、本発明者らの至適基準と比較して、経時的にＣ２Ｃ１２細胞における３倍勝る翻訳効率及び２倍勝るタンパク質産生を示した。これらの結果は、Ｉ及びＦはｈｉＤＣ特異的ではないが、他の細胞におけるｍＲＮＡ安定性及び翻訳効率も高めることを示した。
実施例５： ＦＩ ３’ＵＴＲは、修飾ｍＲＮＡからの発現を増加させる。
タンパク質補充療法を含むいくつかの用途では、修飾ヌクレオチドを有するｍＲＮＡが、その免疫原性の低さのために、非修飾ｍＲＮＡよりも好ましい（Kariko et al., 2008）。しかしながら、塩基修飾は、対応するＲＮＡ結合タンパク質との相互作用に直接影響を及ぼすことによって、又はＲＮＡの二次構造形成を変化させることによって、ｍＲＮＡの安定性に効果を生じる可能性がある。したがって、選択された３’ＵＴＲは、修飾ｍＲＮＡとの関連で異なる挙動を示すかもしれない。したがって、本発明者らは、ＦとＩの組み合わせを、ｈｉＤＣ、ＨＦＦ、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞において、また、マウスＭＥＦ、Ｃ２Ｃ１２及びｂｍＤＣにおいて、ｍ１Ｙ修飾ｍＲＮＡとの関連で、２ｈＢｇＵＴＲと比較した。レポーターとして、ルシフェラーゼを使用した（コンストラクト設計については図７Ａ参照）。修飾ｍＲＮＡの生成のために、ＩＶＴ反応において、Ｕをｍ１Ｙで完全に置換した。すべての実験において、非修飾ＲＮＡをコントロールとして含めた。得られたｍＲＮＡの完全性は、ＵＴＰとｍ１ＹＴＰとの交換によって影響されなかった（図７Ｂ）。表１５に記載の設定を用いて細胞をエレクトロポレーションし、ルシフェラーゼレベルを３、６、１２、２４、４８、７２、９６時間時点で測定した。
非修飾ルシフェラーゼｍＲＮＡのエレクトロポレーションは、以下のように、先に見られた効果を再現することができた。すべての細胞型で、ＦＩ要素は、ＲＮＡ安定性を伝達することにおいて２ｈＢｇコントロールと同等又はそれに勝っていた（表１６Ａ）。マウスＤＣ及びヒトＴ細胞において、ｍＲＮＡ半減期は、２つの３’ＵＴＲ間で同等であったが、ＦＩ要素は、ＨＦＦ細胞においてｍＲＮＡ半減期を１．６９倍まで増加させた。総タンパク質量は、すべての細胞株において増加し、ＨＦＦ細胞で顕著であった（２．４５倍）。
修飾ｍＲＮＡについても、ＦＩ要素は、ｈｉＤＣにおける２ｈＢｇと比較したｍＲＮＡ半減期の増加をもたらし、総タンパク質量は２倍を超えて増加した（表１６Ｂ）。他の細胞型の結果も、以下のように、非修飾ｍＲＮＡで得られた結果と同様である。ＦＩ要素は、ＨＦＦ、ＭＥＦ及びＣ２Ｃ１２細胞に関するすべての実験において、２ｈＢｇに勝り、Ｔ細胞及びマウスＤＣにおいては同等であった（表１６Ｂ）。したがって、Ｕ修飾は、ＦＩ要素がｍＲＮＡを安定化する能力を変化させない。
実施例６： ＦＩ ３’ＵＴＲは、トランスフェクション法にかかわらずｍＲＮＡからの発現を増加させる。
これまで、トランスフェクション法としてエレクトロポレーションを用いてすべての実験を行った。エレクトロポレーションでは、送達されるｍＲＮＡは、リポフェクションによるトランスフェクションの際に採られるエンドソーム取り込み経路を回避して、細胞質に直接到達する。ＦＩ要素がこれらの条件下でも機能するかどうかを確認するために、トランスフェクション試薬としてＲＮＡｉＭＡＸを用い、先の実験で使用したのと同じＦＩ及び２ｈＢｇ含有ルシフェラーゼｍＲＮＡで細胞をリポフェクションした。リポフェクションでも、ＦＩ要素はルシフェラーゼ発現を増加させたが、ＲＮＡがエレクトロポレーション（タブ１６Ｃ）により送達された実験と比較して増加はあまり顕著ではなかった（表１６Ｃ）。したがって、トランスフェクション法は、ＦＩ要素の安定化効果に影響を及ぼさない。
実施例７： ＦＩ ３’ＵＴＲ及び２ｈＢｇＵＴＲ含有ｍＲＮＡは、同等のタンパク質発現及びｉｎ ｖｉｖｏ免疫活性化をもたらす。
ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＩ ３’ＵＴＲを含有するｍＲＮＡからのタンパク質発現を評価するために、先の実験で使用したのと同じＦＩ及び２ｈＢｇ含有ルシフェラーゼｍＲＮＡをＦ１２を用いて製剤化し、ＢＡＬＢ／ｃマウスにｉ．ｖ．で投与した。図８に示すように、ルシフェラーゼ発現は、双方の３’ＵＴＲで同等であった。抗原特異的免疫応答も同等程度まで誘導され、ＦＩ ３’ＵＴＲ含有ｍＲＮＡの効果は、脾臓の方がわずかに強かった。
実施例８： ＩＦ ＵＴＲは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの自己複製の安定性の増加をもたらす。
アルファウイルスゲノムに由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ転写自己複製ＲＮＡ（レプリコンＲＮＡ）は、強力なワクチンベクターである。レプリコンＲＮＡは、レプリコンＲＮＡの細胞質複製（レプリカーゼ）に必要な酵素複合体の最初の３分の２をコードする。このレプリカーゼは、サブゲノムＲＮＡのレプリカーゼ依存的合成のためのサブゲノムプロモーターとして作用するＲＮＡの内部構造を認識する。ワクチン接種のための導入遺伝子又は抗原は、このサブゲノムＲＮＡ上にコードされ、レプリコン全体よりも有意に短い。全体として、ゲノムＲＮＡ（すなわち全長レプリコンＲＮＡ）とサブゲノムＲＮＡの双方が、細胞ｍＲＮＡを再構成する。双方ともＵＴＲに隣接しており、双方ともキャップされ、ポリアデニル化されている。キャッピング及びポリアデニル化の原因となる酵素は、レプリカーゼ酵素複合体に含有されている。ＵＴＲ内の保存配列エレメント（ＣＳＥ）は、５’ＣＳＥの場合はレプリカーゼのＯＲＦと重複しているが、レプリカーゼの結合に必要であり、マイナス鎖合成（３’ＣＳＥ）又はプラス鎖合成（５’ＣＳＥ）．のためのプロモーターとして作用する。
非複製ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡについて同定され、検証された新規安定化ＵＴＲがレプリコンＲＮＡのより高い安定性をもたらし、その結果より高い導入遺伝子発現をもたらすか否かを評価するために、本発明者らは、それぞれの配列をレプリコンＲＮＡ鋳型ベクターにクローン化した。３’ＣＳＥはポリＡテールのすぐ隣に位置する必要があるため、本発明者らは、不安定化ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ２ＣＰ）をコードするレプリコンの３’ＣＳＥのすぐ上流に新規ＵＴＲを挿入した。レプリコンＲＮＡは、ＩＶＴ ｍＲＮＡに類似している線状化鋳型プラスミドのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成された。レプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションにより細胞（ＢＨＫ２１及びＨＦＦ）に導入し、ルシフェラーゼ発現を評価した。図９に示すように、挿入されたすべてのＵＴＲは、使用した双方の細胞株においてＬｕｃ２ＣＰの翻訳を増加させた。興味深いことに、「ＩＦ」ＵＴＲの組み合わせは、翻訳の顕著な増加をもたらした。
実施例９： ９０％まで相同性のあるヌクレオチド交換は、ＦＩ要素の安定化特性に影響を及ぼさない。
新規の安定化ＵＴＲ要素を同定するために適用された選択手順の結果、一定のサイズ範囲の配列が得られた。延長された５’及び３’末端を有する同じ配列の同定は、必要とされる最短の長さに関する最初の示唆を与えた。しかし、各要素がその安定化効果を発揮するのに必要な最小限の領域は、さらに短くてもよい。さらに、配列のわずかな変化は依然として機能的であり得、すなわち個々のヌクレオチドの同一性は、ＦＩ要素の安定化特性にとって最も重要ではない可能性がある。要素がどの程度までヌクレオチド交換に影響されないかを確認するために、元のＦＩ要素と９７．５％、９５．０％、９２．５％及び９０．０％の相同性を有する３’ＵＴＲ配列のｈｉＤＣにおける総タンパク質発現及びｍＲＮＡ半減期を試験した。変更するヌクレオチドは、全配列長にわたってランダムに選択した（配列２０８～２１１、ランダム修飾）。３’ＵＴＲとしてこれらの修飾された要素を有するルシフェラーゼｍＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、ｈｉＤＣにエレクトロポレーションし、その発現を３、６、２４、４８及び７２時間後のルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡した。修飾ＦＩ要素を有するルシフェラーゼｍＲＮＡは、同じ総タンパク質量をもたらし、ほぼ同じ半減期を有した（表１７）。
上記のような程度の増加を伴うランダム置換に加えて、ＦＩ要素の二次構造を破壊する可能性のあるヌクレオチド置換を合理的に導入することによって修飾ＦＩ要素の別のセットを作製した。複数の天然３’ＵＴＲ配列については、それらの二次構造が重要であることが知られているが、それは、その二次構造がｍＲＮＡの安定性に影響を及ぼす調節タンパク質の結合部位を提供するからである(Addess et al., 1997; Putland et al., 2002; Crucs et al., 2000; Adams et al., 2003)。互いに完全に相補的な２つの８ｎｔ配列がＦＩ要素に存在し、一方はＦに、もう一方はＩ要素に存在する（図１０）。これらの２つの領域の塩基対形成は、殆どのｍｆｏｌｄ予測においても見られる。ｍＦｏｌｄ（Ｚｕｋｅｒ、２００３）は、入力配列の二次構造予測を可能にするコンピュータプログラムである。この特定の二次構造要素の重要性を調べるために、塩基対形成を消滅するように配列を変更した（配列２１２、８ｎｔ突然変異）。この比較的長い相補的配列の他に、ＦＩ ３’ＵＴＲに対するｍｆｏｌｄ予測で、出力折り畳みの大部分に存在する構造要素をスクリーニングした。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形成する可能性が高いはずである。これらの折り畳みの塩基対形成に関与するヌクレオチドを、それらの塩基対形成パートナーと交換することによって、元のＦＩ配列と９７．５％、９５．０％、９２．５％ 及び９０．０％相同性へと変化させ、それにより配列の二次構造を保持した（配列２１７～２２０、構造保持修飾）。さらに、二本鎖部分の一方の鎖のみで同じ配列を交換し、それにより意図的に二次構造を破壊した。このような場合、元の配列に対する同一性は、それぞれ９８．７５％、９７．５０％、９６．２５％及び９５．００％であった（配列２１３～２１６、構造不安定化修飾）。
記載の修飾３’ＵＴＲ要素を有するルシフェラーゼＲＮＡを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、ｈｉＤＣにエレクトロポレーションし、その発現を３、６、２４、４８及び７２時間後のルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡した。
いずれの修飾方法でも、ｍＲＮＡ半減期への有意な影響は観察されなかった。したがって、ＦＩ要素の安定化特性は、ヌクレオチドが少なくとも１０．０％まで変異したヌクレオチド配列又は二次構造の変化に対しては、影響されないようである。また、ＦＩ配列の修飾の際の総タンパク質量の低下は観察されなかった（表１８Ａ及びＢ）。
実施例１０： ２ｈＢｇに代わるＦＩ要素の使用は、ＲＮＡコード領域のＰＣＲに基づく増幅のミスプライミングを回避する。
示した通り、ＦＩ要素は、ｍＲＮＡ安定性及び翻訳効率に関して、２ｈＢｇ ３’ＵＴＲと同等又はそれに勝っている。ＦＩ要素のもう一つの利点は、その非反復配列であるが、ｈＢｇ ３’ＵＴＲの２つのコピーは、場合によっては問題を引き起こす可能性がある。
これは、ＲＮＡ転写用のＤＮＡ鋳型がＰＣＲによって増幅されるとき、最も明白である。そのような場合、３’ＵＴＲのまさに３’末端に結合する３’プライマーオリゴを用いて全長ポリＡテールを付加する（図１１Ａ）。２ｈＢｇＵＴＲの場合、ＰＣＲ中にトランケーションされた副産物が出現し、これは、ＵＴＲにおいて１ｈＢｇ反復のみを有するｍＲＮＡからなることが配列決定後に判明した（図１１Ｂ）。転写後、ｍＲＮＡにおけるトランケーションも見える（図１１Ｃ）。この現象は、２ｈＢｇＵＴＲ要素を含有するコンストラクトを用いた殆どのＰＣＲ反応で起こり、プライマーアニーリング温度、緩衝液組成、プライマー配列又は代替ポリメラーゼを含む最適化努力によって完全になくすことができるものではない。３’ＵＴＲとポリＡテールとの間にユニークなリンカー配列を挿入した後でさえ、問題は残る。重要なことに、サイドピーク(side-peak)の強度はＰＣＲ反応収率と相関したが、これは、問題の原因と思われる、各ＰＣＲサイクルとともに増加するトランケーションされた短いＰＣＲ断片のミスプライミングを示している。したがって、２ｈＢｇ ３’－ＵＴＲを有するＲＮＡをコードするＤＮＡ鋳型について十分な条件を同定することはできなかった。
対照的に、ＦＩ要素を有するＤＮＡ鋳型のＰＣＲは、トランケーションされた副産物を生じず（図１１Ｄ）、また、得られたｍＲＮＡは、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒプロファイルにおいてさらなるピークを示さなかった（図１１Ｅ）。したがって、ＦＩ要素は、ＰＣＲ鋳型の完全性及び対応するＲＮＡ品質に関し、２ｈＢｇＵＴＲと比較した３’ＵＴＲとしてのかなりの改善の要素となる。
実施例１１： Ｆ及びＩ要素の亜断片のＲＮＡ安定化特性
新規の安定化ＵＴＲ要素を同定するために適用された選択手順の結果、一定のサイズ範囲の配列が得られた。延長された５’及び３’末端を有する同じ配列の同定は、必要とされる最短の長さに関する最初の示唆を与えた。しかし、各要素がその安定化効果を発揮するのに必要な最小限の領域は、さらに短くてもよい。
この目的のために、Ｆ及びＩ要素の双方について、それぞれ５’及び／又は３’末端で短縮された元の要素の異なる断片をカバーする短縮ＵＴＲを含有する５つのルシフェラーゼレポーターコンストラクトを設計した（それぞれ図１２上部パネルＡ及びＢ参照）。これらのレポーターコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写し、ｈｉＤＣにエレクトロポレーションし、その発現をエレクトロポレーションから３、６、２４、４８及び７２時間後のルシフェラーゼ測定によって経時的に追跡した。得られた発現曲線で、１と設定された各完全長を含有するＲＮＡを用いた、相対的なＲＮＡ半減期について分析した（それぞれ図１２下部パネルＡ及びＢ参照）。
Ｆ要素については、試験したいずれのサブ配列においても有意に減少したｍＲＮＡ半減期は観察されず、ｍＲＮＡの安定化の役割において、Ｆ要素に沿った種々のサブ配列の重複的かつ非協調的関与が示された。同様の結果がＩ要素について得られたが、中央領域（ｎｔ３７～１０７）のみが３’ＵＴＲとして使用された場合、能力のわずかな低下が観察された。
これらの結果を大局的に見るために、完全長の個々のＦ及びＩ要素、並びにＦＩの組み合わせを、出発ライブラリー（長さ２５７ｎｔ）から無作為に選択した３’ ＵＴＲと比較した。これは、出発ＤＮＡプールをクローニングすることと、１つのランダムクローンを選択することによって得られた。上記の通り、各ＵＴＲを有する、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡを、ｈｉＤＣにエレクトロポレーションし、ルシフェラーゼ発現を経時的に測定し、相対的半減期及び総タンパク質発現を算出した。Ｆ、Ｉ、及びＦＩ要素と比較して、ランダムに選択された３’ＵＴＲを有するＲＮＡは、有意により安定性が低い（図１３、上のパネル）。選択されたＵＴＲの効果は、総タンパク質発現についてさらに顕著である（図１３、下のパネル）。これは、上記のようなＦ及びＩ要素の断片の効果が、選択された配列に特異的であり、単に３’ ＵＴＲ配列の存在によって引き起こされるのではないことをはっきりと示している。これは、選択中のプールのＲＮＡ安定性の観察された増加と一致する（上記参照）。
実施例１２： 幹細胞再プログラミングのための安定化ＵＴＲ要素の使用
４００００個の細胞を２ウェルプレートに播種し、各０．０８μｇのＢ１８Ｒ、Ｅ３及びＫ３（ＥＫＢ） 、並びにｍｉＲＮＡ ３０２ａ－ｄと３６７とからなるｍｉＲＮＡ混合物０．１７μｇ（１：１：１：１：１：１）を含む、再プログラミングＴＦ ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ｃＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８（ＯＳＫＭＮＬ）（１：１：１：１：１：１）をコードする非修飾ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）－ＲＮＡ０．３３μｇからなるｍＲＮＡ混合物で、３日間（３ｘ）又は４日間（４ｘ）連続してリポフェクションした。したがって、ＲＮＡコンストラクトは、ヒトβ－グロビン３’ＵＴＲ（２ｈＢｇ）、Ｆ－Ｉ要素（ＦＩ）又はＩ－Ｆ要素（ＩＦ）のタンデム反復からなる３’ＵＴＲにおいてのみ異なっていた。細胞をヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞培地で培養し、ＲＮＡｉＭＡＸを用いたリポフェクションを製造者の指示書に従って実施した。９日目以降、コロニー形成が観察され、コロニーの分析がｄ１１で行われた（タイムラインの概要は図１４Ａを参照）。確立したコロニーをＡＰ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて１１日目にアルカリホスファターゼ（ＡＰ）染色した。概観については、代表的な染色を図１４Ｂに示す。ＦＩ要素の取り込みは、より多量のＡＰ陽性コロニー（暗）をもたらすことが明らかになった。ＡＰ染色されたコロニーを数え、概観からの結果を以下の通りに確認した。先に使用した２ｈＢｇ－ＵＴＲと比較して、ＦＩ－ＵＴＲでの置換は、細胞を３回リポフェクションした場合、３～４倍過剰のコロニーをもたらす。ＩＦ－ＵＴＲでの置換は、２倍過剰になる。４回のトランスフェクションでは、これらの効果はそれほど顕著ではない。ここでは、ＩＦ－ＵＴＲでは改善が見られない。本プロセスは４回のトランスフェクションで飽和状態にあるように見える一方、ここでのコロニーの数は、コロニーの過剰増殖のためにいくらか偏っている（図１４Ｃ参照）。ＦＩ－ＵＴＲを含有するＲＮＡを使用して得られたｉＰＳ細胞コロニーのコロニー形態は、はっきりと区別できるコロニー及び明確に画定された境界内にきつく充填された小さな細胞を含むｈＥＳ細胞様であった（図１４Ｄ）。これらのコロニーは、ＡＰ（図１４Ｅ）及びｈＥＳ細胞表面マーカーＴＲＡ－１－６０（図１４Ｆ）について陽性に染色することができた。ＴＲＡ－１－６０生体染色は、製造者の指示書に従い、Ｓｔａｉｎ－Ａｌｉｖｅ ＴＲＡ－１－６０抗体（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を用いて行った。コロニーの代表的な写真を示す。コロニーの多能性をさらに評価するために、細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離し、ｈＥＳマーカーＯＣＴ４（内因性）、ＮＡＮＯＧ（内因性）、ＬＩＮ２８（内因性）、ＴＥＲＴ及びＲＥＸ１のｍＲＮＡ発現をｑＲＴ－ＰＣＲによって定量した。ｍＲＮＡ発現は、ＨＰＲＴの発現に対して正規化され、入力細胞の転写物レベルと比較した折り畳み誘導として示されている。３つのリポフェクション後のコロニーの分析を図１４Ｇに示す。すべての分析されたマーカーは、再プログラミングされた細胞の多能性を示す入力細胞と比較して、高度に発現された。ＦＩ含有合成ｍＲＮＡの優位性は、２ｈＢｇ－及びＩＦ含有ｍＲＮＡを用いた再プログラミングと比較して、より高い内因性マーカー発現によって確認された。
これらの結果は、２ｈＢｇ－ＵＴＲをＦＩ－ＵＴＲに置き換えることにより、より迅速かつ効率的なＲＮＡベースの再プログラミング技術が得られることを示している。これはおそらく、ＦＩ要素による置換に起因する再プログラミング転写因子のより長く、かつより高い発現に基づく。ＩＦコンストラクトではＩＦ要素の利点が観察されなかったことから、ＦＩ要素の方向付けが不可欠であると考えられる。ＦＩ含有ｍＲＮＡによる細胞の再プログラミングの成功は、ｈＥＳ細胞様形態、ｈＥＳ細胞表面のＡＰ活性及び発現、並びに得られたｉＰＳ細胞コロニーの内因性マーカーによって確認された。
表
表１ 選択の進行をモニターするための、リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）実験のデータから算出したｍＲＮＡ半減期（時間）エレクトロポレーションから８、２４、及び４８時間後にｍＲＮＡを定量した。実験Ｉ（左）では、各サンプルを１回のみ分析した。従って、標準偏差は与えられていない。
Figure 0007084302000002
表２ ＢＬＡＳＴ配列の３’－ＵＴＲ内の結合領域（ＢＲ）を有する７つの主要群の概要群の略称、群で同定されたクローンの数（ｎｏ．）、各略称でのゲノム起源（Ａｂｂｒ．）、ＮＣＢＩコード、及びコード領域に関する配列内の位置を示す。ＮｅｘｔＢｉｏによれば、すべての配列は、ｈｉＤＣにおいてアップレギュレートされる。
Figure 0007084302000003
表３ 半減期及び総タンパク質の経時的変化に関して、本発明者らの至適基準２ｈＢｇに対して算出された値。群の名称とそれぞれの遺伝子を示す。
Figure 0007084302000004
表４ ライブラリーの増幅及びその後の選択ラウンドのＰＣＲ条件
Figure 0007084302000005
表５ ＩＶＴ－Ｔ７転写反応
Figure 0007084302000006
表６ クローン化され、本発明者らの至適基準２ｈＢｇ（右下角）と比較された組み合わせ２回クローン化された単一要素がハイライトされている。
Figure 0007084302000007
表７ 単一要素として、又は下流要素である他の群の配列の１つと組み合わせた上流要素としてクローン化されたＦＣＧＲＴ（Ｂ群）の結果太字の値は、＞１．０である。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000008
表８ 単一要素として、又は下流要素である他の群の配列の１つと組み合わせた上流要素としてクローン化されたＬＳＰ１（Ｄ群）の結果太字の値は、＞１．０である。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000009
表９ 単一要素として、又は下流要素である他の群の配列の１つと組み合わせた上流要素としてクローン化されたＣＣＬ２２（Ｅ群）の結果太字の値は、＞１．０である。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000010
表１０ 単一要素として、又は下流要素である他の群の配列の１つと組み合わせた上流要素としてクローン化されたＡＥＳ（Ｆ群）の結果太字の値は、＞１．０である。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000011
表１１ 単一要素として、又は下流要素である他の群の配列の１つと組み合わせた上流要素としてクローン化されたＰＬＤ３（Ｇ群）の結果太字の値は、＞１．０である。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000012
表１２ 単一要素として、又は下流要素である他の群の配列の１つと組み合わせた上流要素としてクローン化されたｍｔＲＮＲ１（Ｉ群）の結果太字の値は。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000013
表１３ 単一要素として、又は下流要素である他の群の配列の１つと組み合わせた上流要素としてクローン化されたＨＬＡ－ＤＲＢ４（Ｊ群）の結果太字の値は、＞１．０である。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000014
表１４ レポーター遺伝子としてのｌｕｃ２ｍｕｔと、新たに選択された３’－ＵＴＲとをｈｉＤＣへのエレクトロポレーション後に用いた代表的な結果。ルシフェラーゼ活性は、９６時間かけて測定された。値は、２ｈＢｇに対するものである。
Figure 0007084302000015
表１５ エレクトロポレーション設定
この表には、使用したすべての細胞型のエレクトロポレーションプロトコールの詳細がまとめられている。細胞数の下に記載されている量の細胞を、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）入りのエレクトロポレーションキュベット又は９６ウェルエレクトロポレーションプレート（フォーマットの下に記載）中で、μｇ又はｐｍｏｌ単位で記載されている量のＲＮＡと混合した。エレクトロポレーションは、指定された長さ及びＶの下に記載の電圧でパルスを印加することにより実施した。その後、細胞懸濁液を増殖培地中で希釈し、細胞／時点の下に記載の密度で９６ウェルに分配した。
Figure 0007084302000016
表１６
エレクトロポレーション時に非修飾及び修飾ＲＮＡを、リポフェクション時に非修飾ＲＮＡを含有する２ｈＢｇＵＴＲに対する、ＦＩ要素の半減期及び総タンパク質。
３’ＵＴＲとしてＦＩ又は２ｈＢｇを含有するホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドを、クラスＩＩＳ制限酵素でポリ（ｄＡ：ｄＴ）の下流に線状化し、それによってポリ（ｄＡ：ｄＴ）を越えて付加的なヌクレオチドを持たない鋳型を作製した。線状プラスミドＤＮＡをカルボキシル化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製し、分光測定で定量し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写に供した。ｖｉｔｒｏ転写のために、ＲＮａｓｅ阻害剤及びピロホスファターゼを補充した自家製Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを、１２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ８．３５、３４ｍＭ ＭｇＯＡｃ２、１０ｍＭ ＤＴＴ及び２ｍＭ Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎ緩衝液中の７．５ｍＭ ＮＴＰとともに使用した。ＲＮＡの効率的なキャッピングのために、６ｍＭのβ－Ｓ－ＡＲＣＡ（Ｄ２）を反応に添加し、初期ＧＴＰ濃度を１．５ｍＭまで低下させ、３７℃で２．５時間の流加プロセスにおいて７．５ｍＭに調整した。ＲＮＡをカルボキシル化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって精製し、２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）での分光測光及び分析によりＲＮＡ濃度及び品質を評価した。
Ａ）ＦＩ要素を含有する非修飾ｍＲＮＡの半減期が、複数のヒト及びマウス細胞株において、２ｈＢｇ ３’ＵＴＲを含有するものよりも長いか同等であることを示す。表１５に記載した量のヒト線維芽細胞（ＨＦＦ）、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、筋芽細胞腫細胞（Ｃ２Ｃ１２）、並びにマウスＤＣを、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中のＲＮＡの各量（表１５）と混合し、エレクトロポレーションに供した。表示されている数の細胞を、添加剤を含む１００μｌの適切な増殖培地入りの９６ウェルディッシュに播種した。播種から２、６、２４、４８、７２及び９６時間後、ホタルルシフェラーゼ活性を、蛍光リーダー（ＴＥＣＡＮ）において、ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加により決定した。
Ｂ）ＦＩ要素を含有する,ｍ１Ｙ修飾ｍＲＮＡの半減期が、異なるヒト及びマウス細胞株において２ｈＢｇ ３’ＵＴＲを含有するものよりも長いか同等であることを示す。表１５に記載した量のヒト未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、筋芽細胞腫細胞（Ｃ２Ｃ１２）、並びにマウスＤＣを、Ｘ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中のｍ１Ｙ修飾ＲＮＡの各量（表１５）と混合し、エレクトロポレーションに供した。表示されている数の細胞を、添加剤を含む１００μｌの適切な増殖培地入りの９６ウェルディッシュに播種した。播種から２、６、２４、４８、７２及び９６時間後、蛍光リーダー（ＴＥＣＡＮ）において、ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加によりホタルルシフェラーゼ活性を決定した。
Ｃ）ＦＩ要素を含有する非修飾ｍＲＮＡの半減期が、ＲＮＡをリポフェクションによりトランスフェクトした場合でも、異なる細胞株において，２ｈＢｇ ３’ＵＴＲを含有するものよりも長いか同等であることを示す。５０ｎｇ ＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸ０．２μｌとともに１５～３０分間インキュベートし、９６ウェル中の１Ｅ０４ ＨＦＦ、ＭＥＦ又はＣ２Ｃ１２細胞上に得た。ルシフェラーゼレベルは、３、６、１２、２４、４８、７２及び９６時間時点で、蛍光リーダー（ＴＥＣＡＮ）において、ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）の添加により測定した。
Figure 0007084302000017
表１７： ３’ＵＴＲとして元のＦＩ配列と指定された相同性を有するＦＩ要素又はＦＩ要素の変異体のいずれかを含有するホタルルシフェラーゼをコードする、１０μｇのＲＮＡを、９６ウェルフォーマット中のｈｉＤＣにエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼ発現を３、６、２４、４８及び７２時間後にわたり追跡し、得られた発現曲線からＲＮＡ半減期及びＲＮＡから翻訳された総タンパク質量を算出した。
Figure 0007084302000018
表１８： ３’ＵＴＲとして、構造を保持又は破壊する突然変異体を含有し、かつ、元のＦＩ配列と指定された相同性を有するＦＩ要素又はＦＩ要素の変異体のいずれかを含有する、ホタルルシフェラーゼをコードする１０μｇのＲＮＡを、９６ウェルフォーマット中のｈｉＤＣにエレクトロポレーションした。ルシフェラーゼ発現を３、６、２４、４８及び７２時間後にわたり追跡し、得られた発現曲線からＲＮＡ半減期及び総タンパク質量を算出した。
Figure 0007084302000019
本明細書に記載の配列は、以下の通りである。
Ｂ群
＞Ｒｎ５－２ｐｌ－Ａ４＿Ｆｏｒ２
ＣＡＵＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＧＧＧＵＣＵＵＣＣＵＧＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＵＵＣＧＵＵＧＵＣ
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＞Ｒｎ５－２ｐｌ－Ａ３＿Ｆｏｒ２
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＞Ｒｎ５Ｃ５＿Ｆｏｒ２
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＞Ｒｎ５Ｅ６＿Ｆｏｒ２
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＞Ｒｎ６－１ＷｏＣ３＿Ｆｏｒ２
ＧＣＵＧＣＵＧＣＧＧＧＵＣＵＵＣＣＵＧＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＵＵＣＧＵＵＧＵＣＵＧＣＵＡＵＧＣＣＣＧＵＣＣＵＣＡＣＣＡＡ
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＞Ｒｎ６－１ＷｏＢ１２＿Ｆｏｒ２
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＞Ｒｎ６－１ＷｏＢ１＿Ｆｏｒ２
ＵＣＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＵＧＣＧＧＧＵＣＵＵＣＣＵＧＧＡＡＵＣＵＧＡＣＣＡＵＵＣＧＵＵＧＵＣＵＧ
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＞Ｒｎ６－１ＷｏＦ３＿Ｆｏｒ２
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９７，５％相同性（ランダム修飾）
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９５％相同性（ランダム修飾）
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９２，５％相同性（ランダム修飾）
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９０％相同性（ランダム修飾）
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＞ＦＩ ８ｎｔ突然変異
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９８．７５％相同性（構造不安定化修飾）
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９７．５％相同性（構造不安定化修飾）
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９６，２５％相同性（ランダム修飾）
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９５％相同性（構造不安定化修飾）
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＞ＦＩ ＵＴＲ ９７，５％相同性（構造保持修飾）
ＣＵＧＧＵＡＣＵＧＣＡＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＣＧＵＧＧＵＣＣＧＵＡＣＣＣＣＧＡＧＵＣＵＣＣＣＣＣＧＡＣＣＵＣＧＧＧＵＣＧＧＡＣＣＵＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＧＣＣＣＣＡＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＣＡＧＡＣＡＣＣＵＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＣＧＣＵＵＡＧＣＣＵＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＵＧＡＵＵＡＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＡＡＡＣＧＡＡＡＧＵＵＵＡＡＣＵＡＡＧＣＵＡＵＡＣＵＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＵＵＧＧＵＣＡＡＵＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣ

＞ＦＩ ＵＴＲ ９５％（構造保持修飾）
ＣＵＧＧＵＡＣＵＧＣＡＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＣＧＵＧＧＡＣＣＧＵＡＣＧＧＣＧＡＧＵＣＵＣＣＣＣＣＧＡＣＣＵＣＧＣＣＵＣＧＧＵＣＣＵＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＧＣＣＣＣＡＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＣＡＧＡＣＡＣＣＵＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＣＧＣＵＵＡＧＣＣＵＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＵＧＡＵＵＡＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＡＡＡＣＧＡＡＡＧＵＵＵＡＡＣＵＡＡＧＣＵＡＵＡＣＵＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＵＵＧＧＵＣＡＡＵＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣ

＞ＦＩ ＵＴＲ ９２，５％（構造保持修飾）
ＣＵＧＧＵＡＣＵＧＣＡＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＵＵＵＧＣＣＧＵＧＧＡＣＣＧＵＡＣＧＧＧＣＵＧＵＣＵＣＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣＣＣＵＣＧＧＵＣＣＵＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＧＣＣＣＣＡＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＣＡＧＡＣＡＣＣＵＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＣＧＣＵＵＡＧＣＣＵＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＵＧＡＵＵＡＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＡＡＡＣＧＡＡＡＧＵＵＵＡＡＣＵＡＡＧＣＵＡＵＡＣＵＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＵＵＧＧＵＣＡＡＵＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣ

＞ＦＩ ＵＴＲ ９０％（構造保持修飾）
ＣＵＧＧＵＡＣＵＧＣＡＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＵＵＵＧＧＧＣＵＧＧＡＣＣＧＵＡＣＧＧＧＣＵＧＵＣＵＣＣＣＣＣＧＡＣＣＡＧＣＣＣＵＣＧＧＵＣＣＵＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＧＣＣＣＣＡＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＣＡＧＡＣＡＣＣＵＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＣＧＣＵＵＡＧＣＣＵＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＵＧＡＵＵＡＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＡＡＡＣＧＡＡＡＧＵＵＵＡＡＣＵＡＡＧＣＵＡＵＡＣＵＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＵＵＧＧＵＣＡＡＵＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣ

Claims (26)

  1. 転写の５’ → ３’方向に、
    （ａ） プロモーター；
    （ｂ） 転写可能な核酸配列又は転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列；並びに
    （ｃ） プロモーター（ａ）の制御下で転写される際に、転写物中の３’非翻訳領域をコードする核酸配列であって、（ｂ）の核酸配列と天然では連結されておらず、前記３’非翻訳領域が
    （ｃ－８）ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列と、以下：
    （ｃ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、及び
    （ｃ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、
    からなる群より選択される１以上の核酸配列との、任意の組み合わせ
    を含む、核酸配列を含む核酸分子。
  2. プロモーター（ａ）の制御下で転写される際に、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含んでもよいポリアデニル配列である核酸配列をコードする核酸配列（ｄ）をさらに含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記ポリアデニル配列が、少なくとも２０個、少なくとも４０個、少なくとも８０個、少なくとも１００又は少なくとも１２０個のＡヌクレオチドを含む、請求項２に記載の核酸分子。
  4. 前記Ａヌクレオチドは、連続Ａヌクレオチドを含む、請求項３に記載の核酸分子。
  5. プロモーター（ａ）の制御下にある核酸配列（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）が、転写されて、共通転写物を生じることができる、請求項２から４のいずれか一項に記載の核酸分子。
  6. 閉環状分子又は線状分子である、請求項１から５のいずれか一項に記載の核酸分子。
  7. 転写可能な核酸配列が、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含み、転写可能な核酸配列を導入するための核酸配列が、マルチクローニングサイトである、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸分子。
  8. （ｉ）レポーター遺伝子；（ｉｉ）選択マーカー、及び（ｉｉｉ）複製開始点からなる群より選択される１以上の要素をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の核酸分子。
  9. 鋳型として請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子を用いる転写により得られるＲＮＡ。
  10. 鋳型として請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により得られる、請求項９に記載のＲＮＡ。
  11. ５’ → ３’方向に、
    （ａ） ５’非翻訳領域；
    （ｂ） ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列；並びに
    （ｃ） （ｂ）の核酸配列と天然では連結されていない３’非翻訳領域であって、
    （ｃ－８）ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列と、以下：
    （ｃ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｃ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、及び
    （ｃ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、
    からなる群より選択される１以上の核酸配列との、任意の組み合わせ
    を含む３’非翻訳領域
    を含む、ＲＮＡ。
  12. Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有する１個以上の連続ヌクレオチドの配列をポリアデニル配列内に含んでもよいポリ（Ａ）配列である核酸配列（ｄ）をさらに含む、請求項１１に記載のＲＮＡ。
  13. 前記核酸配列（ｄ）が前記ＲＮＡの３’末端に位置する、請求項１２に記載のＲＮＡ。
  14. ５’キャップ（ｅ）をさらに含む、請求項１２又は１３に記載のＲＮＡ。
  15. （ｉ）請求項１から８のいずれか一項に記載の核酸分子を提供すること、及び
    （ｉｉ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、鋳型として前記核酸分子を用いてＲＮＡに転写すること
    を含む、ＲＮＡを得る方法。
  16. （ｉ） 請求項１５に記載の方法に従って、ペプチド又はタンパク質をコードするＲＮＡを得ること、及び
    （ｉｉ） 前記ＲＮＡを翻訳すること
    を含む、ペプチド又はタンパク質を得る、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  17. 核酸分子の転写の前に、核酸分子の切断をさらに含むことを特徴とする、請求項１５又は１６に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  18. （ｉ） 転写される際に、（ａ）の核酸配列と天然では連結されていない３’非翻訳領域をコードする核酸配列（ｂ）を、ペプチド又はタンパク質をコードする核酸配列を含む転写可能な核酸配列（ａ）の３’末端でカップリングすること、及び、
    （ｉｉ） ｉｎ ｖｉｔｒｏで、得られた核酸を転写すること
    を含み、
    前記３’非翻訳領域が、
    （ｂ－８）ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列と、以下：
    （ｂ－１） ＦＣＧＲＴの３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｂ－２） ＬＳＰ１の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｂ－３） ＣＣＬ２２の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｂ－４） ＡＥＳの３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｂ－５） ＰＬＤ３の３’非翻訳領域の核酸配列、
    （ｂ－６） ＭＴ－ＲＮＲ１のノンコーディングＲＮＡの核酸配列、及び
    （ｂ－７） ＨＬＡ－ＤＲＢ４の３’非翻訳領域の核酸配列、
    からなる群より選択される１以上の核酸配列との、任意の組み合わせ
    を含む、ＲＮＡを得る方法。
  19. （ｉ）請求項１８に記載の方法によってＲＮＡを得ること、及び
    （ｉｉ）前記ＲＮＡを翻訳すること
    を含む、ペプチド又はタンパク質を得る、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法。
  20. 請求項１５、１７、及び１８のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるＲＮＡ。
  21. 請求項９から１４及び２０のいずれか一項に記載のＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳することを含む、ペプチド又はタンパク質を得る方法。
  22. 宿主細胞をトランスフェクトする方法における使用のための、請求項９から１４及び２０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
  23. 宿主細胞が抗原提示細胞である、請求項２２に記載のＲＮＡ。
  24. 抗原提示細胞は、樹状細胞、単球又はマクロファージである、請求項２３に記載のＲＮＡ。
  25. 請求項９から１４及び２０のいずれか一項に記載のＲＮＡを含む、ワクチン接種のための医薬組成物。
  26. 幹細胞特性を有する細胞に体細胞を再プログラミングする方法における使用のための、請求項９から１４及び２０のいずれか一項に記載のＲＮＡ。
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Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017059902A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
US11253601B2 (en) 2016-07-11 2022-02-22 Translate Bio Ma, Inc. Nucleic acid conjugates and uses thereof
KR20200036025A (ko) * 2017-08-15 2020-04-06 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 메신저 리보핵산(mRNA)을 암호화하는 안정화된 핵산
WO2019154985A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment using cytokine encoding rna
EP3827014A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH Il2 agonists
WO2020150152A1 (en) 2019-01-14 2020-07-23 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with a pd-1 axis binding antagonist and an rna vaccine
EP3920960B1 (en) 2019-02-08 2024-04-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Treatment involving car-engineered t cells and cytokines
CU20210078A7 (es) 2019-03-18 2022-04-07 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Variantes de interleucina-2 (il2) y receptor de interleucina-2 (il2r) para la activación específica de células efectoras inmunitarias
WO2020200481A1 (en) 2019-04-05 2020-10-08 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Treatment involving interleukin-2 (il2) and interferon (ifn)
TW202115105A (zh) 2019-06-24 2021-04-16 德商拜恩迪克Ｒｎａ製藥有限公司 Ｉｌ２激動劑
JP2022546417A (ja) * 2019-08-29 2022-11-04 チューリッヒ大学 最小ｍＲＮＡおよびその使用
WO2021081261A1 (en) * 2019-10-22 2021-04-29 The Regents Of The University Of California Modulation of engineered immune cell receptor translation using noncoding sequence elements
JP2023512654A (ja) 2020-01-31 2023-03-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｄ－１軸結合アンタゴニストおよびｒｎａワクチンを用いてネオエピトープ特異的ｔ細胞を誘導する方法
WO2021160346A1 (en) 2020-02-13 2021-08-19 Institut Pasteur Nucleic acid vaccine against the sars-cov-2 coronavirus
EP4121101A1 (en) 2020-03-16 2023-01-25 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Antigen-specific t cell receptors and t cell epitopes
KR102462990B1 (ko) * 2020-03-17 2022-11-07 에이비온 주식회사 인비트로 트랜스크립트 mRNA 및 이를 함유하는 약학조성물
MX2022012105A (es) 2020-03-30 2022-10-18 BioNTech SE Composiciones de arn que se dirigen a claudina-18.2.
WO2021197589A1 (en) 2020-03-31 2021-10-07 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination
WO2021213924A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 BioNTech SE Coronavirus vaccine
MX2022013264A (es) 2020-04-22 2023-01-24 Pfizer Vacuna contra el coronavirus.
CA3182579A1 (en) 2020-07-07 2022-01-13 Ugur Sahin Therapeutic rna for hpv-positive cancer
US20220122690A1 (en) 2020-07-17 2022-04-21 Genentech, Inc. Attention-based neural network to predict peptide binding, presentation, and immunogenicity
JP2023536340A (ja) 2020-08-06 2023-08-24 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア コロナウイルスｓタンパク質のための結合剤
IL300997A (en) 2020-09-08 2023-04-01 Genentech Inc Systems and methods for the production of pharmaceutical preparations using peristaltic pumps and restraints
TW202227478A (zh) 2020-09-15 2022-07-16 德商拜恩迪克公司 對細胞靶向遞送的藥劑及方法
CN117177766A (zh) 2020-10-26 2023-12-05 佩奇大学 疫苗平台
MX2023005386A (es) 2020-11-11 2023-05-23 BioNTech SE Anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteina de muerte programada-1 y su uso en medicina.
WO2022106860A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Pécsi Tudományegyetem Recombinant peptides for use in therapy
MX2023006126A (es) 2020-12-09 2023-07-28 BioNTech SE Produccion de arn.
TW202245808A (zh) * 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
CN114717230A (zh) * 2021-01-05 2022-07-08 麦塞拿治疗(香港)有限公司 成纤维细胞生长因子mRNA的无细胞和无载体体外RNA转录方法和核酸分子
KR20240009419A (ko) 2021-04-20 2024-01-22 비온테크 에스이 바이러스 백신
EP4330278A1 (en) 2021-04-26 2024-03-06 Institut Pasteur Human neutralizing monoclonal antibodies against sars-cov-2 and uses thereof
IL308196A (en) 2021-05-04 2024-01-01 BioNTech SE Technologies for the early detection of interesting variants
IL309021A (en) 2021-06-08 2024-01-01 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Agents and methods for activation and targeting of immune effector cells
AU2022297171A1 (en) * 2021-06-24 2024-01-18 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Non-natural 5’-untranslated region and 3’-untranslated region and use thereof
CN117642429A (zh) 2021-07-15 2024-03-01 生物技术欧洲股份公司 用于治疗cldn6阳性癌症的编码cldn6和cds结合元件的试剂
EP4379055A1 (en) * 2021-07-27 2024-06-05 SK Bioscience Co., Ltd. Mrna for protein expression and template therefor
IL309952A (en) 2021-07-29 2024-03-01 BioNTech SE Compositions and methods for treating melanoma
CA3227081A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Irena RABE In vitro transcription technologies
WO2023030635A1 (en) 2021-09-02 2023-03-09 BioNTech SE Potency assay for therapeutic potential of coding nucleic acid
WO2023051926A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 BioNTech SE Treatment involving non-immunogenic rna for antigen vaccination and pd-1 axis binding antagonists
WO2023057979A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 Precision NanoSystems ULC Rna vaccine lipid nanoparticles
WO2023061550A1 (en) 2021-10-11 2023-04-20 BioNTech SE Therapeutic rna for lung cancer
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
TW202333803A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性ｒｎａ（一）
WO2023064612A2 (en) 2021-10-15 2023-04-20 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of viral antigens and related methods
WO2023066496A1 (en) 2021-10-21 2023-04-27 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023067124A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4285933A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4286004A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4169578A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
AU2022369405A1 (en) 2021-10-22 2024-05-09 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4286394A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4286003A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
WO2023067123A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
WO2023067193A2 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Compositions for administration of different doses of rna
EP4169579A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Disulfide oligosaccharide compounds and complexes
EP4169580A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4186528A1 (en) 2021-11-30 2023-05-31 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
EP4285932A1 (en) 2022-05-30 2023-12-06 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
WO2023067125A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
WO2023067126A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 BioNTech SE Oligosaccharide compounds and complexes
EP4169534A1 (en) 2021-10-22 2023-04-26 BioNTech SE Oligosaccharide complexes and uses
WO2023073190A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 BioNTech SE Rna constructs and uses thereof
WO2023083434A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 BioNTech SE Rna encoding peptidoglycan hydrolase and use thereof for treating bacterial infection
GB2615177A (en) 2021-11-29 2023-08-02 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023105005A1 (en) 2021-12-09 2023-06-15 BioNTech SE Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
WO2024046572A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 BioNTech SE Chimeric antigen receptor-modified cells for the treatment of cldn6 expressing cancer
WO2023126053A1 (en) 2021-12-28 2023-07-06 BioNTech SE Lipid-based formulations for administration of rna
WO2023147090A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods
WO2023147091A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023214801A1 (ko) * 2022-05-03 2023-11-09 단국대학교 산학협력단 단백질의 발현 수준 및 발현 위치 조절을 위한 utr 서열 및 이를 포함하는 mrna 서열
US11932693B2 (en) 2022-05-12 2024-03-19 BioNTech SE Monoclonal antibodies directed against programmed death-1 protein and their use in medicine
WO2023218431A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2023230295A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 BioNTech SE Rna compositions for delivery of monkeypox antigens and related methods
WO2023232747A1 (en) 2022-05-30 2023-12-07 BioNTech SE Complexes for delivery of nucleic acids
WO2023237726A1 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Pantarhei Oncology B.V. An intracellular tumor-specific variant of human zona pellucida glycoprotein 3 and nucleic acids coding therefor for use in the treatment of cancer
WO2024002985A1 (en) 2022-06-26 2024-01-04 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2024017479A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 BioNTech SE Multifunctional cells transiently expressing an immune receptor and one or more cytokines, their use and methods for their production
WO2024028445A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024027910A1 (en) 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
CN117660494A (zh) * 2022-09-07 2024-03-08 远大赛威信生命科学(南京)有限公司 用于表达水痘-带状疱疹病毒抗原蛋白的mRNA及其用途
WO2024056856A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 BioNTech SE Systems and compositions comprising trans-amplifying rna vectors with mirna
WO2024064934A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium csp antigens and related methods
WO2024063788A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024064931A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of liver stage antigens and related methods
WO2024063789A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024068674A1 (en) 2022-09-26 2024-04-04 BioNTech SE Nucleic acid complexes and uses thereof
WO2024074634A1 (en) * 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024074211A1 (en) * 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024086575A1 (en) 2022-10-17 2024-04-25 BioNTech SE Combination vaccines against coronavirus infection, influenza infection, and/or rsv infection
WO2024084462A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 BioNTech SE Nucleic acid complexes and uses thereof
WO2024083345A1 (en) 2022-10-21 2024-04-25 BioNTech SE Methods and uses associated with liquid compositions
WO2024107754A1 (en) 2022-11-15 2024-05-23 Genentech, Inc. Selection of diverse candidate peptides for peptide therapeutics
CN117535295B (zh) * 2024-01-09 2024-04-26 艾斯拓康医药科技(北京)有限公司 一种优化的3`utr序列及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050032730A1 (en) 2001-06-05 2005-02-10 Florian Von Der Mulbe Pharmaceutical composition containing a stabilised mRNA optimised for translation in its coding regions

Family Cites Families (123)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
EP0513849B1 (en) 1987-05-20 1998-08-19 Novartis AG Method of preparing transgenic Zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
RU2126047C1 (ru) * 1987-05-29 1999-02-10 Новартис Аг Способ получения растений zea mays l., устойчивых к повреждениям, вызываемым насекомыми
US5804381A (en) 1996-10-03 1998-09-08 Cornell Research Foundation Isolated nucleic acid molecule encoding an esophageal cancer associated antigen, the antigen itself, and uses thereof
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
ATE212670T1 (de) 1990-06-18 2002-02-15 Monsanto Technology Llc Erhöhter stärkegehalt in pflanzen
US6235525B1 (en) 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
PT677112E (pt) 1992-12-28 2003-08-29 Stichting Scheikundig Onderzoe Metodo de obtencao de plantas transgenicas apresentando um padrao de frutanos modificado
NL9300646A (nl) * 1992-12-28 1994-07-18 Stichting Scheikundig Onderzoe Werkwijze voor het verkrijgen van transgene planten welke een gemodificeerd fructaan-patroon vertonen.
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
ES2205209T3 (es) 1996-04-26 2004-05-01 Rijksuniversiteit Te Leiden Procedimientos de seleccion y de produccion de epitopos peptidicos de linfocitos t y vacunas que contienen los indicados epitopos seleccionados.
WO1998010748A1 (en) 1996-09-13 1998-03-19 The School Of Pharmacy Liposomes
EP0839912A1 (en) 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US6074645A (en) 1996-11-12 2000-06-13 City Of Hope Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus
BR9813981A (pt) 1997-11-06 2000-09-26 Roche Diagnostics Gmbh Antìgenos de tumor especìficos, métodos para a sua produção e seu uso imunização de diagnóstico
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
CA2345440A1 (en) 1998-10-05 2000-04-13 Charles A. Nicolette Genes differentially expressed in cancer cells to design cancer vaccines
WO2000050592A1 (en) * 1999-02-24 2000-08-31 Genetics Institute, Inc. Secreted proteins and polynucleotides encoding them
AU4700100A (en) 1999-05-06 2000-11-21 Wake Forest University Compositions and methods for identifying antigens which elicit an immune response
EP1261704B1 (en) 1999-11-30 2009-07-01 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules encoding cancer associated antigens, the antigens per se, and uses thereof
US7462354B2 (en) 1999-12-28 2008-12-09 Pharmexa Inc. Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby
AU780064B2 (en) 1999-12-28 2005-02-24 Epimmune, Inc. Optimized minigenes and peptides encoded thereby
AR044724A1 (es) 2000-03-27 2005-10-05 Syngenta Participations Ag Promotores del virus de la rizadura amarilla del cestrum
US20040052763A1 (en) 2000-06-07 2004-03-18 Mond James J. Immunostimulatory RNA/DNA hybrid molecules
US6472176B2 (en) 2000-12-14 2002-10-29 Genvec, Inc. Polynucleotide encoding chimeric protein and related vector, cell, and method of expression thereof
EP1444326A4 (en) * 2001-08-24 2006-06-28 Advanced Cell Tech Inc SCREENING ASSAYS FOR IDENTIFICATION OF AGENTS INDUCING DIFFERENTIATION, AND PRODUCTION OF CELLS DIFFERENTIATED FOR CELL THERAPY
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
AUPS054702A0 (en) 2002-02-14 2002-03-07 Immunaid Pty Ltd Cancer therapy
KR20050016410A (ko) * 2002-05-17 2005-02-21 베일러 칼리지 오브 메디신 도세탁셀 약제민감성 및 약제내성을 예측하는 특징적인유전자 발현 패턴
ATE519115T1 (de) 2002-06-13 2011-08-15 Merck Patent Gmbh Verfahren für die identifizierung von allo- antigenen und ihre verwendung für krebstherapie und transplantation
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US7393653B2 (en) * 2002-09-06 2008-07-01 The Burnham Institute Methods of modulating cell death based on the Bit1/AES regulatory pathway
JP4430543B2 (ja) * 2002-10-09 2010-03-10 シーアイディー カンパニー リミテッド 日本脳炎ウイルスの全長のゲノムＲＮＡ及び該ＪＥＶゲノムＲＮＡに対する感染性を有するＪＥＶｃＤＮＡ及びその用途
DE10344799A1 (de) 2003-09-26 2005-04-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
ES2574231T3 (es) 2003-10-15 2016-06-16 Syncore Biotechnology Co., Ltd Uso de liposomas catiónicos que comprenden paclitaxel
JP4931593B2 (ja) 2003-10-24 2012-05-16 イミュネイド ピーティーワイ リミテッド 治療の方法
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
DE102004023187A1 (de) 2004-05-11 2005-12-01 Ganymed Pharmaceuticals Ag Identifizierung von Oberflächen-assoziierten Antigenen für die Tumordiagnose und -therapie
DE102004057303A1 (de) 2004-11-26 2006-06-01 Merck Patent Gmbh Stabile Kristallmodifikationen von DOTAP Chlorid
MX2007008010A (es) 2004-12-29 2007-09-07 Mannkind Corp Metodos para desviar celulas cd4+ en la induccion de una inmuno respuesta.
GB0507997D0 (en) 2005-02-01 2005-05-25 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs
PT2161336E (pt) 2005-05-09 2013-10-03 Ono Pharmaceutical Co Anticorpos monoclonais humanos para morte programada 1 (pd-1) e métodos de tratamento do cancro utilizando anticorpos anti- pd-1 sozinhos ou em combinação com outros agentes imunoterapêuticos¿
KR101607288B1 (ko) 2005-07-01 2016-04-05 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
EP2578685B1 (en) 2005-08-23 2019-04-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
DE102005041616B4 (de) 2005-09-01 2011-03-17 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Melanom-assoziierte MHC Klasse I assoziierte Oligopeptide und für diese kodierende Polynukleotide und deren Verwendungen
EP1762575A1 (en) 2005-09-12 2007-03-14 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy
DE102005046490A1 (de) * 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
US9017965B2 (en) * 2005-12-12 2015-04-28 King Faisal Specialist Hospital & Research Centre Hybrid 3′ untranslated regions suitable for efficient protein expression in mammalian cells
JP2009532664A (ja) 2006-02-27 2009-09-10 アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・フォー・アンド・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティ 癌の治療のためのノボペプチドの同定および使用
CA2639070A1 (en) * 2006-04-13 2007-11-01 Oncomethylime Sciences S.A. Novel tumour suppressor
CA2663521A1 (en) 2006-09-20 2008-07-17 The Johns Hopkins University Combinatorial therapy of cancer and infectious diseases with anti-b7-h1 antibodies
DE102006060824B4 (de) 2006-12-21 2011-06-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Nachweis von individuellen T-Zell-Reaktionsmustern gegen Tumor-assoziierte Antigene (TAA) in Tumorpatienten als Basis für die individuelle therapeutische Vakzinierung von Patienten
CA2947292C (en) 2006-12-27 2019-07-23 Emory University Compositions and methods for the treatment of infections and tumors
EP2135080A4 (en) * 2007-03-08 2010-12-01 Switchgear Genomics FUNCTIONAL ARRAYS FOR CHARACTERIZATION WITH HIGH PASSAGE OF REGULATORY ELEMENTS IN NONTRANSLATED SURFACES OF GENES
US8140270B2 (en) 2007-03-22 2012-03-20 National Center For Genome Resources Methods and systems for medical sequencing analysis
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
ES2616355T3 (es) 2007-06-18 2017-06-12 Merck Sharp & Dohme B.V. Anticuerpos para el receptor humano de muerte programada PD-1
EP2535419A3 (en) 2007-09-26 2013-05-29 Intrexon Corporation Synthetic 5'UTRs, expression vectors, and methods for increasing transgene expression
EP2060583A1 (en) 2007-10-23 2009-05-20 Ganymed Pharmaceuticals AG Identification of tumor-associated markers for diagnosis and therapy
SG189692A1 (en) 2008-03-24 2013-05-31 4Sc Discovery Gmbh Novel substituted imidazoquinolines
ES2712505T3 (es) 2008-04-17 2019-05-13 Pds Biotechnology Corp Estimulación de una respuesta inmunitaria por enantiómeros de lípidos catiónicos
WO2010037402A1 (en) 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
DE102008061522A1 (de) 2008-12-10 2010-06-17 Biontech Ag Verwendung von Flt3-Ligand zur Verstärkung von Immunreaktionen bei RNA-Immunisierung
US20120195936A1 (en) 2009-07-31 2012-08-02 Ethris Gmbh Rna with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
WO2011075838A1 (en) * 2009-12-21 2011-06-30 Audigen Inc. Method of treating or preventing hearing loss
EP3023788B1 (en) 2010-05-14 2020-02-12 The General Hospital Corporation Compositions of tumor specific neoantigens for use in treating tumours
DK3590949T3 (da) 2010-10-01 2022-07-11 Modernatx Inc Ribonukleinsyrer indeholdende n1-methyl-pseudouracil og anvendelse heraf
US8710200B2 (en) 2011-03-31 2014-04-29 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids encoding a modified erythropoietin and their expression
DE102011102734A1 (de) 2011-05-20 2012-11-22 WMF Württembergische Metallwarenfabrik Aktiengesellschaft Vorrichtung zum Aufschäumen von Milch, Getränkebereiter mit dieser Vorrichtung und Verfahren zum Aufschäumen von Milch
EP2771349B1 (en) 2011-09-16 2020-02-26 Iogenetics, LLC. Bioinformatic processes for determination of peptide binding
RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
US20130156849A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
RU2491343C1 (ru) * 2011-12-23 2013-08-27 Общество с ограниченной ответственностью "Биотехнологический центр трансгенеза в фарминдустрии "Трансгенфарм" Генетические конструкции ltf3, ltf5, ltf7, ltf10, ltf11 для получения рекомбинантного лактоферрина человека (варианты)
US20150030576A1 (en) 2012-01-10 2015-01-29 Moderna Therapeutics, Inc. Methods and compositions for targeting agents into and across the blood-brain barrier
WO2013120497A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
WO2013124701A2 (en) 2012-02-20 2013-08-29 Universita' Degli Studi Di Milano New homo- and heterodimeric smac mimetic compounds as apoptosis inducers
JP6295512B2 (ja) * 2012-03-15 2018-03-20 株式会社豊田中央研究所 酵母における外来遺伝子の発現産物の生産方法、酵母における発現調節剤及びその利用
JP6298039B2 (ja) * 2012-03-27 2018-03-20 キュアバック アーゲー 人工核酸分子
SG10201607968WA (en) * 2012-03-27 2016-12-29 Curevac Ag Artificial nucleic acid molecules for improved protein or peptide expression
KR20140139101A (ko) * 2012-03-27 2014-12-04 큐어백 게엠바하 5''top utr을 포함하는 인공 핵산 분자
US20130255281A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 General Electric Company System and method for cooling electrical components
WO2013151667A1 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides
EP2872653B1 (en) 2012-07-12 2019-03-13 Persimmune, Inc. Personalized cancer vaccines and adoptive immune cell therapies
CA3116898C (en) * 2012-08-17 2022-09-27 Dow Agrosciences Llc Use of a maize untranslated region for transgene expression in plants
US20150307542A1 (en) 2012-10-03 2015-10-29 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
JP6510416B2 (ja) 2012-11-01 2019-05-08 ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド 細胞中でタンパク質を発現するための方法および生成物
RS63237B1 (sr) 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx Inc Terminalno modifikovana rnk
US20160022840A1 (en) 2013-03-09 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Heterologous untranslated regions for mrna
US20160024181A1 (en) 2013-03-13 2016-01-28 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
EP2971161B1 (en) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
US20160017313A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
US10138507B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Modernatx, Inc. Manufacturing methods for production of RNA transcripts
WO2014144039A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
EP2983702A2 (en) 2013-04-07 2016-02-17 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for personalized neoplasia vaccines
WO2014184684A2 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 Oslo Universitetssykehus Hf Methods and biomarkers for detection of hematological cancers
RU2535871C1 (ru) * 2013-07-10 2014-12-20 Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ") Плазмида для экспрессии в клетке китайского хомячка, клетка китайского хомячка - продуцент белка с Gla-доменом и способ получения белка с Gla-доменом
WO2015014375A1 (en) 2013-07-30 2015-02-05 Biontech Ag Tumor antigens for determining cancer therapy
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US20160194625A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3043826A4 (en) 2013-09-13 2017-05-24 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide compositions containing amino acids
EP3049065A1 (en) 2013-09-26 2016-08-03 BioNTech AG Particles comprising a shell with rna
US10385088B2 (en) 2013-10-02 2019-08-20 Modernatx, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
US20160264614A1 (en) 2013-10-02 2016-09-15 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
WO2015058780A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Biontech Ag Method and kit for determining whether a subject shows an immune response
EP3076994A4 (en) 2013-12-06 2017-06-07 Modernatx, Inc. Targeted adaptive vaccines
US20150167017A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
RU2717986C2 (ru) * 2013-12-30 2020-03-27 Куревак Аг Искусственные молекулы нуклеиновой кислоты
JP6584414B2 (ja) * 2013-12-30 2019-10-02 キュアバック アーゲー 人工核酸分子
AU2014381849A1 (en) 2014-02-05 2016-08-25 Biontech Ag A cannula, an injection or infusion device and methods of using the cannula or the injection or infusion device
MX2016011686A (es) 2014-03-09 2016-11-07 Univ Pennsylvania Composiciones utiles en el tratamiento de deficiencia de la ornitina transcarbamilasa (otc).
SI3134131T1 (sl) 2014-04-23 2022-04-29 Modernatx, Inc. Cepiva na osnovi nukleinskih kislin
WO2015172843A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Biontech Diagnostics Gmbh Methods and kits for the diagnosis of cancer
WO2016005004A1 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
WO2016062323A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Biontech Ag Methods and compositions for diagnosis and treatment of cancer
EP3230458B1 (en) * 2014-12-12 2020-02-19 CureVac AG Artificial nucleic acid molecules for improved protein expression
BR112017009835A2 (pt) 2014-12-30 2017-12-26 Curevac Ag moléculas de ácido nucleico artificiais
WO2016155809A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Lipid particle formulations for delivery of rna and water-soluble therapeutically effective compounds to a target cell
WO2017059902A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050032730A1 (en) 2001-06-05 2005-02-10 Florian Von Der Mulbe Pharmaceutical composition containing a stabilised mRNA optimised for translation in its coding regions

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BLOOD, 2006, Vol.108, pp.4009-4017
European Journal of Immunogenetics, 2000, Vol.27, pp.231-240
J. Immunol., 2012, Vol.188, pp.2437-2444
Mol Endocrinol, 2015, Vol.29, pp.1067-1079
pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector Protocol, 2016
pMIR-REPORT(TM) System Protocol, 2008

Also Published As

Publication number Publication date
CN108291230B (zh) 2022-12-20
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