BR122021025194B1 - Molécula de ácido nucleico, método para obter rna, rna, método para obter um peptídeo ou proteína e usos in vitro ou ex vivo do rna - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se à estabilização de rna, em particular mrna, e um aumento na tradução de mrna. a presente invenção particularmente refere-se a uma modificação de rna, em particular rna transcrito in vitro, resultando em estabilidade de transcrito aumentada e/ou eficiência de tradução. de acordo com a invenção, demonstrou-se que determinadas sequências na região não traduzida 3? (utr) de uma molécula de rna melhora a estabilidade e eficiência de tradução.

Description

DIVIDIDO DO BR 11 2018 003486-0 DEPOSITADO EM 05/10/2016

[0001] O uso de RNA oferece uma alternativa atrativa para DNA a fim de contornar os riscos de segurança potenciais conectados com o uso terapêutico de DNA. O RNA transcrito in vitro (IVT-RNA) é de particular interesse nas abordagens terapêuticas. As vantagens de um uso terapêutico de RNA incluem expressão temporária e um caráter sem transformação. O RNA não precisa entrar no núcleo para ser expresso e, além disso, não pode se integrar no genoma do hospedeiro, eliminando assim o risco de oncogênese. Quando usada para vacinação, a injeção de RNA pode tanto induzir respostas imunes celulares como humorais in vivo. No entanto, o uso de RNA para aplicações clínicas é muito limitado, especialmente pela meia-vida curta do RNA.

[0002] Vetores IVT podem ser usados de maneira padronizada como modelo para transcrição in vitro. Esses vetores IVT podem ter a seguinte estrutura: um promotor de RNA polimerase 5’ que permite a transcrição de RNA, seguido por um gene de interesse que é flanqueado 3’ e/ou 5’ por regiões não traduzidas (UTR), e um cassete de poliadenila 3’ contendo nucleotídeos A. Antes da transcrição in vitro, o plasmídeo circular é linearizado a jusante do cassete de poliadenila por enzimas de restrição tipo II (a sequência de reconhecimento corresponde ao sítio de clivagem). O cassete de poliadenila corresponde assim à sequência de poli(A) posterior no transcrito.

[0003] As células dendríticas imaturas (hiDCs) são amplamente usadas para desenvolver e aprimorar imunoterapias para o tratamento de câncer. Carregado com (IVT)-mRNA transcrito in vitro que codifica um antígeno específico de tumor (TA), hiDCs são capazes de induzir uma resposta antitumoral efetiva. No entanto, um pré-requisito para uma resposta imune efetiva com o uso de vacinas contra câncer baseadas em RNA é alta estabilidade e eficiência de tradução do RNA. Ambas podem pode ser aprimoradas por modificações estruturais do 5’-CAP, da cauda 3’ poli (A), bem como regiões 5’ e 3’ não traduzidas (UTRs). Elementos de sequência dentro das UTRs afetam a eficiência de tradução (principalmente 5’-UTR) e estabilidade de RNA (principalmente 3’-UTR).

[0004] No trabalho anterior nós demonstramos que duas cópias consecutivas da beta-globina humana 3’-UTR (agora chamada 2hBg; também anteriormente 2βgUTR) contribuem para maior estabilidade e eficiência de transcrição do transcrito (Holtkamp (2006) Blood 108:4009-4017). No entanto, a presença de duas cópias idênticas da sequência de beta-globina humana 3’-UTR no DNA plasmidial, que é enfim usada como modelo para a transcrição in vitro de RNA, suporta o risco de recombinação durante sua propagação em E. coli. De maneira similar, qualquer abordagem de clonagem, especialmente com o uso de amplificação baseada em PCR, é muito difícil. O mesmo é verdadeiro para amplificação baseada em PCR da região codificadora de RNA com a 2hBg na extremidade 3’ para ser usado como modelo para a transcrição in vitro, porque aqui foi observado erro de incorporação de nucleotídeos (mispriming), o que leva à omissão de uma cópia da beta-globina humana 3’-UTR. Para evitar esses problemas, buscou-se identificar as novas sequências que têm um efeito estabilizador sobre o mRNA transcrito in vitro, pelo menos similar, até idealmente melhor do que a sequência de 2hBg.

[0005] Foi um objetivo da presente invenção fornecer RNA com estabilidade aumentada e/ou eficiência de tradução e meios para obter esse RNA. Deve ser possível obter graus de expressão aumentada pelo uso do dito RNA na terapia.

[0006] Este objetivo é obtido de acordo com a invenção pela matéria em questão das reivindicações.

[0007] A presente invenção refere-se à estabilização de RNA, em particular mRNA, e um aumento na tradução de mRNA. A presente invenção particularmente refere-se a uma modificação de RNA, em particular RNA transcrito in vitro, resultando em estabilidade de transcrito aumentada e/ou eficiência de tradução.

[0008] De acordo com a invenção, demonstrou-se que determinadas sequências na região não traduzida 3’ (UTR) de uma molécula de RNA melhora a estabilidade e eficiência de tradução.

[0009] Como o uso de RNA modificado de acordo com a invenção na transfecção de células dendríticas (DCs), será possível, por exemplo, aumentar a densidade de complexos de peptídeos antígeno-específicos/MHC sobre as células transfectadas e sua capacidade para estimular e expandir células T CD4+ e CD8+ antígeno-específicas. Portanto, a invenção em uma realização refere-se a uma estratégia para otimizar vacinas de RNA para transfectar DC ou vacinas DC transfectadas com RNA usando RNA que foi modificado pelas modificações de RNA descritas de acordo com a invenção.

[0010] De acordo com a invenção, modificação e, assim, a estabilização e/ou aumento na eficiência de tradução de RNA é preferencialmente obtida por vetores de expressão com modificação genética que preferencialmente serve como modelo para a transcrição de RNA in vitro. Estes vetores de expressão permitem a transcrição de RNA com uma região não traduzida 3’ descrita de acordo com a invenção e, preferencialmente, entre a sequência que codifica um peptídeo ou proteína (quadro aberto de leitura) e a sequência de poli(A).

[0011] Esses vetores também podem permitir a transcrição de RNA com uma sequência de poli(A) que tem preferencialmente uma extremidade aberta no dito RNA, isto é, nenhum nucleotídeo diferente de nucleotídeos A flanqueia a dita sequência de poli(A) na sua extremidade 3’. Uma sequência de poli(A) aberta no RNA pode ser obtida através da introdução de um sítio de clivagem de restrição tipo IIS em um vetor de expressão que permite que o RNA seja transcrito sob o controle de um promotor de RNA polimerase 5’, e que contém um cassete de poliadenila, em que a sequência de reconhecimento está localizada 3’ do cassete, enquanto que o sítio de clivagem está localizado a montante e, desta forma, dentro do cassete de poliadenila. Clivagem de restrição no sítio de clivagem de restrição tipo IIS permite que um plasmídeo seja linearizado para dentro do cassete de poliadenila. O plasmídeo linearizado pode então ser usado como molde para transcrição in vitro, o que resulta em uma extremidade de transcrito em uma sequência de poli(A) revelada. Além disso, uma ruptura opcional do cassete de poliadenila 3’ por uma sequência de nucleotídeos aleatória, com uma distribuição igual dos 4 nucleotídeos (ligante), aumenta a estabilidade do cassete de poliadenila 3’ em E.coli.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[0012] Em um aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que compreende na direção 5’ ^ 3’ de transcrição: (a) um promotor; (b) uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita ou uma sequência de ácido nucleico para introdução de uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita; e (c) uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica uma região não traduzida 3’ no transcrito, a dita região não traduzida 3’ compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir do grupo que consiste em: (c-1) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de FCGRT, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-2) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de LSP1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-3) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de CCL22, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-5) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de PLD3, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-7) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de HLA-DRB4, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, e (c-8) qualquer combinação de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos, fragmentos e/ou variantes em (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) e (c- 7).

[0013] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (b) e (c) sob o controle do promotor (a) podem ser transcritas para resultar em um transcrito comum no qual a sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (c) está ativa, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (b).

[0014] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (b) e (c) não estão naturalmente ligadas.

[0015] Em uma realização, (c-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NOs: 86 a 89, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento.

[0016] Em uma realização, (c-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 86, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento.

[0017] Em uma realização, (c-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NOs: 105 a 121, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento.

[0018] Em uma realização, (c-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 115, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento.

[0019] Em uma realização, a sequência de ácido nucleico (c-8) compreende uma combinação de duas ou mais sequências de ácido nucleico idênticas ou diferentes, fragmentos e/ou variantes em (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c- 5), (c-6) e (c-7). Em várias realizações, a sequência de ácido nucleico (c-8) compreende uma combinação de (c-1) e (c-2), (c-1) e (c-3), (c-1) e (c-4), (c-1) e (c-5), (c-1) e (c-6), (c-1) e (c-7), (c-2) e (c-3), (c-2) e (c-4), (c-2) e (c-5), (c-2) e (c- 6), (c-2) e (c-7), (c-3) e (c-4), (c-3) e (c-5), (c-3) e (c-6), (c-3) e (c-7), (c-4) e (c- 5), (c-4) e (c-6), (c-4) e (c-7), (c-5) e (c-6), (c-5) e (c-7) ou (c-6) e (c-7).

[0020] Em uma realização, a sequência de ácido nucleico (c-8) compreende uma combinação de (c-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, e (c-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, (c-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento está localizada 5’ para (c-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, a combinação de (c-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, e (c-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT- RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento compreende uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento.

[0021] Em uma realização, a molécula de ácido nucleico da invenção ainda compreende (d) uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes dos nucleotídeos A. Em uma realização, a dita sequência de poliadenila compreende pelo menos 20 nucleotídeos A, preferencialmente pelo menos 40, pelo menos 80, pelo menos 100 ou pelo menos 120 nucleotídeos A, preferencialmente nucleotídeos A consecutivos. Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é uma sequência, preferencialmente uma sequência arbitrária, de 2 ou mais nucleotídeos consecutivos, em que o primeiro e o último nucleotídeo da dita sequência de 2 ou mais nucleotídeos consecutivos é um nucleotídeo diferente de um nucleotídeo A. Em uma realização, a dita sequência de ácido nucleico (d) é uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila que compreende dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A e que apresenta maior estabilidade mediante a propagação da molécula do ácido nucleico em Escherichia coli em comparação a uma molécula de ácido nucleico que compreende, em vez da dita sequência de ácido nucleico (d) uma sequência de ácido nucleico (d)’ que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica uma sequência de poliadenila do mesmo comprimento que a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila que compreende dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A. Em uma realização, a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A compreende pelo menos 80 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 90 ou 100 nucleotídeos. Em uma realização, a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A compreende pelo menos 90 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 100 nucleotídeos, preferencialmente pelo menos 110 nucleotídeos. Em uma realização, dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência opcionalmente compreendendo dentro da sequência uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos compreende cerca de 120 nucleotídeos. Em realizações particulares, a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A compreende pelo menos 200, preferencialmente pelo menos 150 e, em particular, até 130 nucleotídeos. Em uma realização, pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 92%, preferencialmente pelo menos 95%, 97% ou 98% dos nucleotídeos da dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A na dita sequência de poliadenila (não incluindo nucleotídeos A na dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A).

[0022] Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A está localizada dentro de uma região a partir da posição 21 até a posição 80, preferencialmente a partir da posição 21 até a posição 60, mais preferencialmente da posição 31 até a posição 50 da dita sequência de poliadenila.

[0023] Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é precedida por pelo menos 20 resíduos A, preferencialmente pelo menos 30, ou 40 a 50 resíduos A na dita sequência de poliadenila. Em realizações particulares, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é precedida por até 80 resíduos A, preferencialmente até 70 ou 60 resíduos A na dita sequência de poliadenila.

[0024] Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é seguida por pelo menos 20 resíduos A, preferencialmente pelo menos 30, 40, 50, 60 ou 70 resíduos A na dita sequência de poliadenila. Em realizações particulares, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é seguida por até 100 resíduos A, preferencialmente até 80 resíduos A na dita sequência de poliadenila.

[0025] Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é precedida por 20 até 50, preferencialmente 30 a 40 resíduos A na dita sequência de poliadenila e é seguida por 30 a 80, preferencialmente 40 a 70 resíduos A na dita sequência de poliadenila.

[0026] Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A tem um comprimento de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 8, preferencialmente pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos.

[0027] Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A tem um comprimento de não mais que 50, preferencialmente não mais que 30, mais preferencialmente não mais que 20 nucleotídeos.

[0028] Em uma realização, a dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A não compreendem mais que 3, preferencialmente não mais que 2, preferencialmente nenhum resíduo A consecutivo.

[0029] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (b), (c) e (d) sob o controle do promotor (a) podem ser transcritas para resultar em um transcrito comum. Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos transcritas a partir das sequências de ácidos nucleicos (c) e opcionalmente (d) são ativas, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (b).

[0030] Em uma realização, no transcrito a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A está localizada na extremidade 3’.

[0031] Em uma realização, a molécula de ácido nucleico da invenção é uma molécula de DNA. Em uma realização, a dita molécula de ácido nucleico é um vetor de expressão ou plasmídeo como um vetor IVT.

[0032] Em uma realização, a molécula de ácido nucleico da invenção é uma molécula circular fechada ou uma molécula circular.

[0033] Em uma realização, a sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína e a sequência de ácido nucleico para introdução de uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita é um sítio de clonagem múltiplo.

[0034] Em uma realização, a molécula de ácido nucleico da invenção ainda compreende um ou mais membros selecionados a partir do grupo que consiste em: (i) um gene repórter; (ii) um marcador selecionável; e (iii) uma origem de replicação.

[0035] Em uma realização, a molécula de ácido nucleico da invenção é adequada, em particular, após a linearização, para transcrição in vitro de RNA, em particular, mRNA.

[0036] Antes da transcrição in vitro, os vetores circulares IVT são geralmente linearizados a jusante do cassete de poliadenila por enzimas de restrição tipo II (a sequência de reconhecimento corresponde ao sítio de clivagem). O cassete de poliadenila corresponde assim à sequência de poli(A) posterior no transcrito. Como resultado deste procedimento, alguns nucleotídeos permanecem como parte do sítio de clivagem enzimática após a linearização e se estendem ou mascaram a sequência de poli(A) na extremidade 3’. No entanto, descobriu-se que o RNA que tem uma sequência de poli(A) aberta é traduzida de forma mais eficiente do que o RNA que tem uma sequência de poli(A) com uma terminação mascarada.

[0037] Consequentemente, as moléculas de ácido nucleico da invenção quando usadas como vetores de expressão preferencialmente permitem a transcrição de RNA com uma sequência de poli(A) que tem preferencialmente uma extremidade aberta no dito RNA, isto é, nenhum nucleotídeo diferente de nucleotídeos A flanqueia a dita sequência de poli(A) na sua extremidade 3’. Uma sequência de poli(A) aberta no RNA pode ser obtida através da introdução de um sítio de clivagem de restrição tipo IIS em um vetor de expressão que permite que o RNA seja transcrito sob o controle de um promotor de RNA polimerase 5’, e que contém um cassete de poliadenila, em que a sequência de reconhecimento está localizada a jusante do cassete de poliadenila, enquanto que o sítio de clivagem está localizado a montante e, desta forma, dentro do cassete de poliadenila. Clivagem de restrição no sítio de clivagem de restrição tipo IIS permite que um plasmídeo seja linearizado para dentro do cassete de poliadenila. O plasmídeo linearizado pode então ser usado como molde para transcrição in vitro, o que resulta em uma extremidade de transcrito em uma sequência de poli(A) revelada.

[0038] Consequentemente, em uma realização, é preferencial que a molécula de ácido nucleico a invenção possa ser clivada, preferencialmente enzimaticamente ou em outra maneira bioquímica, dentro da sequência de ácido nucleico (d) de tal forma que a dita clivagem resulte em uma molécula de ácido nucleico que compreende, na direção 5’ ^ 3’ de transcrição, o promotor (a), as sequências de ácidos nucleicos (b) e (c), e pelo menos uma parte da sequência de ácido nucleico (d), em que pelo menos uma parte da sequência de ácido nucleico (d), quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A e em que no transcrito o nucleotídeo 3’-terminal é um nucleotídeo A da dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A.

[0039] Preferencialmente, após a clivagem, a molécula de ácido nucleico, no final da fita que serve como molde para a sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, tem um nucleotídeo T que é parte da sequência de ácido nucleico que serve como molde para a sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A.

[0040] A molécula de ácido nucleico da invenção é preferencialmente um molécula circular fechada antes da clivagem e uma molécula linear após a clivagem.

[0041] Preferencialmente, a clivagem é realizada com o auxílio de um sítio de clivagem de restrição que é preferencialmente um sítio de clivagem de restrição para uma endonucleases de restrição tipo IIS.

[0042] Em uma realização, a sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição tipo IIS está localizada em 5 a 26 pares de bases, preferencialmente 24 a 26 pares de bases, a jusante da extremidade 3' da sequência de ácido nucleico (d).

[0043] Em uma realização, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção está em uma conformação circular fechada e, preferencialmente, adequada para transcrição in vitro de RNA, em particular, mRNA, em particular, após a linearização.

[0044] Em aspectos adicionais, a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que pode ser obtida por linearização de uma molécula de ácido nucleico descrita acima, preferencialmente por clivagem dentro da sequência de ácido nucleico (d), e ao RNA que pode ser obtido por transcrição, preferencialmente transcrição in vitro, com as moléculas de ácido nucleico descritas acima, sob o controle do promotor (a).

[0045] Desta forma, a invenção em um aspecto refere-se ao RNA que compreende na direção 5’ ^ 3’: (a) uma região não traduzida 5’; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína; e (c) uma região não traduzida 3’, a dita região não traduzida 3’ compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir do grupo que consiste em: (c-1) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de FCGRT, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-2) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de LSP1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-3) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de CCL22, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-5) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de PLD3, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (c-7) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de HLA-DRB4, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, e (c-8) qualquer combinação de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos, fragmentos e/ou variantes em (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) e (c- 7).

[0046] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (b) e (c) não estão naturalmente ligadas.

[0047] Em uma realização, o RNA ainda compreende (d) uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A. Em uma realização, a dita sequência de ácido nucleico (d) está localizada na extremidade 3’ do dito RNA.

[0048] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (c) e opcionalmente (d) são ativas, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína.

[0049] Em uma realização, o RNA ainda compreende (e) um Capeamento 5’.

[0050] Realizações da região não traduzida 3’ e a sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A são conforme descrito acima para as moléculas de ácido nucleico da invenção.

[0051] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para obter RNA, que compreende: (i) fornecer uma molécula de ácido nucleico da invenção, e (ii) transcrever o RNA com o uso da molécula de ácido nucleico como molde.

[0052] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para obter um peptídeo ou proteína, que compreende: (iii) obter o RNA que codifica o peptídeo ou proteína de acordo com o método para obter o RNA da invenção, e (iv) traduzir o RNA.

[0053] Em uma realização, a método para obter o RNA ou o método para obter um peptídeo ou proteína compreende ainda, antes da transcrição da molécula de ácido nucleico, clivagem da molécula de ácido nucleico.

[0054] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para obter RNA, que compreende: (i) acoplar uma sequência de ácido nucleico (b) que, quando transcrita, codifica uma região não traduzida 3’, na extremidade 3’ de uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (a) que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína, e (ii) transcrever o ácido nucleico obtido, a dita região não traduzida 3’ compreendendo uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir do grupo que consiste em: (b-1) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de FCGRT, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (b-2) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de LSP1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (b-3) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de CCL22, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (b-4) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (b-5) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de PLD3, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (b-6) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, (b-7) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de HLA-DRB4, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento, e (b-8) qualquer combinação de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos, fragmentos e/ou variantes em (b-1), (b-2), (b-3), (b-4), (b-5), (b-6) e (b-7).

[0055] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (a) e (b) podem ser transcritas para resultar em um transcrito comum no qual a sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (b) está ativa, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (a).

[0056] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (a) e (b) não estão naturalmente ligadas.

[0057] Em uma realização, a método ainda compreende acoplar uma sequência de ácido nucleico (c) que, quando transcrita, codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, na extremidade 3’ da sequência de ácido nucleico (b).

[0058] Em uma realização, as sequências de ácidos nucleicos (a), (b) e (c) podem ser transcritas para resultar em um transcrito comum no qual as sequências de ácidos nucleicos transcritas a partir das sequência de ácidos nucleicos (b) e, opcionalmente, (c) estão ativas, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (a).

[0059] Realizações da região não traduzida 3’ e a sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A são conforme descrito acima para as moléculas de ácido nucleico da invenção.

[0060] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para obter um peptídeo ou proteína, que compreende: (i) obter o RNA pelo método de obtenção de RNA da invenção, e (ii) traduzir o RNA.

[0061] Os métodos da invenção podem ser realizados in vitro ou in vivo. Em uma realização de qualquer um dos métodos da invenção, a transcrição é realizada in vitro.

[0062] Em uma realização, a método para obter o RNA ou o método para obter um peptídeo ou proteína compreende ainda, antes da transcrição da molécula de ácido nucleico, clivagem da molécula de ácido nucleico.

[0063] Em uma realização, a clivagem está dentro da sequência de ácido nucleico que, quando transcrita, codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, de tal forma que a transcrição do ácido nucleico obtido desta maneira gera um transcrito que tem na sua extremidade 3’-terminal a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, em que o nucleotídeo 3’-terminal do dito transcrito é um nucleotídeo A da sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A.

[0064] Em todos os aspectos dos métodos de acordo com a invenção, a clivagem é preferencialmente realizada com o auxílio de um sítio de clivagem de restrição que é preferencialmente um sítio de clivagem de restrição para uma endonucleases de restrição tipo IIS.

[0065] Em uma realização, a sequência de reconhecimento para a endonuclease de restrição tipo IIS tem 5 a 26 pares de bases, preferencialmente 24 a 26 pares de bases, a jusante da extremidade 3’ da sequência de ácido nucleico que, quando transcrita, codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila opcionalmente compreendendo dentro da sequência de poliadenila uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A.

[0066] A invenção também se refere ao RNA que pode ser obtido pelos métodos de acordo com a invenção para obter RNA.

[0067] A invenção pode ser utilizada, por exemplo, para aumentar a expressão de proteínas recombinantes na transcrição e expressão celular. Mais especificamente, é possível, ao produzir proteínas recombinantes, usar vetores de expressão da invenção para transcrição de ácidos nucleicos recombinantes e expressão de proteínas recombinantes em sistemas baseados em células. Isto inclui, por exemplo, a preparação de anticorpos recombinantes, hormônios, citocinas, enzimas, e similares. Isto permite, entre outros, que os custos de produção sejam reduzidos.

[0068] Também é possível usar as moléculas de ácido nucleico da invenção para aplicações de terapia genética. Consequentemente, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser um vetor de terapia gênica e usado para expressão de um transgene. Para este fim, qualquer sistema de vetor baseado em ácido nucleico (DNA/RNA) (por exemplo, plasmídeos, adenovírus, vetores de poxvirus, vetores de vírus influenza, vetores de alphavirus, e similares) podem ser usados. Podem ser células transfectadas com estes vetores in vitro, por exemplo, em linfócitos ou células dendríticas, ou então in vivo por administração direta.

[0069] O RNA da invenção (por exemplo, obtido com o uso de uma molécula de ácido nucleico descrita no presente pedido como um modelo de transcrição) pode ser empregado, por exemplo, por expressão temporária de genes, com possíveis campos de aplicação sendo vacinas baseadas em RNA, os quais são transfectados em células in vitro ou administrados diretamente in vivo, expressão temporária de proteínas recombinantes funcionais in vitro, por exemplo, a fim de iniciar processos de diferenciação em células ou para estudar funções das proteínas, e expressão temporária de proteínas recombinantes funcionais como eritropoietina, hormônios, inibidores da coagulação, etc., in vivo, em particular, como produtos farmacêuticos.

[0070] O RNA da invenção pode ser usado em particular para transfectar células apresentadoras de antígenos e, desta forma, como uma ferramenta para fornecer o antígeno a ser apresentado e para carregar as células apresentadoras de antígenos, com o dito antígeno a ser apresentado correspondente ao peptídeo ou proteína expressa a partir do dito RNA ou sendo derivados a partir do mesmo, em particular, por meio de processamento intracelular como clivagem, isto é, o antígeno a ser apresentado é, por exemplo, um fragmento do peptídeo ou proteína expressa a partir do RNA. Essas células apresentadoras de antígenos podem ser usadas para estimular células T, em particular, células T CD4+ e/ou CD8+.

[0071] Consequentemente, em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um uso do RNA da invenção para transfectar uma célula hospedeira. Em uma realização, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígeno, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago.

[0072] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um uso do RNA da invenção para terapia, em particular, para vacinação.

[0073] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica como uma composição de vacina que compreende o RNA da invenção.

[0074] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se ao RNA da invenção para usos descritos no presente pedido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0075] Embora a presente invenção seja descrita em detalhes abaixo, entende-se que essa invenção não está limitada às metodologia particulares, protocolos e reagentes descritos no presente pedido, uma vez que esses podem variar. Deve-se também entender que a terminologia usada no presente pedido é para o propósito de descrever somente realizações específicas, e não tem a intenção de limitar o escopo da presente invenção que será limitada somente pelas reivindicações anexas. A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados no presente pedido têm os mesmos significados como geralmente entendido por um técnico no assunto.

[0076] A seguir, serão descritos os elementos da presente invenção. Estes elementos são listados com realizações específicas, no entanto, deve-se entender que eles podem ser combinados de qualquer maneira e em qualquer número para criar realizações adicionais. Os exemplos descritos de diversas maneiras e realizações preferenciais não devem ser interpretados de modo a limitar a presente invenção somente para realizações explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida como suporte e engloba realizações que combinam as realizações explicitamente descritas com qualquer número dos elementos divulgados e/ou preferenciais. Além disso, quaisquer permutações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido devem ser consideradas divulgadas pela descrição do presente pedido a menos que o contexto indique de outro modo. Por exemplo, se em uma realização preferencial uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é precedida por pelo menos 20 resíduos A na dita sequência de poliadenila e se em outra realização preferencial uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é seguida por pelo menos 20 resíduos A na dita sequência de poliadenila, é uma realização preferencial contemplada que uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é precedida e seguida por pelo menos 20 resíduos A na dita sequência de poliadenila.

[0077] Preferencialmente, os termos usados no presente pedido são definidos conforme descrito em “A multilingual glossary of biotechnological terms: (Recomendações IUPAC)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel e H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça, (1995).

[0078] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado de outra forma, os métodos convencionais de química, bioquímica, biologia celular, imunologia e técnicas de DNA recombinante que são explicados na literatura do campo (cf., por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

[0079] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra “compreende” e variações como “compreendem” ou “que compreende” deverão ser entendida para implicar a inclusão de um membro declarado, número inteiro, etapa ou grupo de membros, números inteiros ou etapas mas não a exclusão de qualquer outro membro, número inteiro, etapa ou grupo de membros, números inteiros ou etapas. Os termos “um” e “uma” e “o/a” e referência similar usada no contexto de descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações) devem ser interpretados para abranger tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de outra forma no presente pedido ou claramente dito ao contrário pelo contexto. A menção de faixas de valores no presente pedido é meramente destinada a servir como um método abreviado de referência individual para cada valor separado abrangidos dentro da faixa. A menos que indicado de outra forma no presente pedido, cada valor individual é incorporado na especificação como se fosse individualmente mencionado no presente pedido. Todos os métodos descritos no presente pedido podem ser realizados em qualquer ordem adequada a menos que indicado de outra forma no presente pedido ou claramente dito ao contrário pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagens exemplares (por exemplo, “como”), fornecidos no presente pedido destinam-se apenas a melhor ilustrar a invenção e não colocam uma limitação no escopo da invenção, a menos que reivindicado de outra forma. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando qualquer elemento essencial não reivindicado para a prática da invenção.

[0080] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um desses documentos citados no presente pedido (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, etc), se acima ou abaixo, são integralmente incorporados ao presente pedido como referência. Nada no presente pedido será interpretado como uma admissão de que a invenção não é intitulada para preceder essa divulgação em virtude da invenção anterior.

[0081] A presente invenção descreve essas moléculas de ácido nucleico como plasmídeos de DNA úteis como vetores de expressão de RNA que compreendem sequências de ácidos nucleicos que codificam regiões não traduzidas 3’ modificadas (UTRs) no RNA que têm um efeito estabilizador sobre o RNA e/ou que aumenta a eficiência de tradução do RNA.

[0082] O termo “sequência de ácido nucleico que, quando transcrita, codifica uma região não traduzida 3’ no transcrito” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que contém uma fita molde que codifica a dita região não traduzida 3’. Preferencialmente, a dita sequência de ácido nucleico compreende uma fita codificadora que compreende a mesma sequência de ácido nucleico que a dita região não traduzida 3’ do transcrito de RNA produzido (embora com a timina substituída por uracila). Desta forma, de acordo com a invenção uma “sequência de ácido nucleico que, quando transcrita, codifica uma região não traduzida 3’ no transcrito”, em uma realização, compreende uma fita codificadora que compreende uma região não traduzida 3’ conforme especificado no presente pedido (embora com a timina substituída por uracila).

[0083] O termo “FCGRT” refere-se ao fragmento Fc de IgG, receptores, transportadores, alfa e inclui o gene FCGRT. Este gene codifica um receptor que liga a região Fc de imunoglobulina monomérica G. A proteína codificada transfere anticorpos imunoglobulina G da mãe para o feto através da placenta. Essa proteína também se liga à imunoglobulina G para proteger o anticorpo da degradação.

[0084] O termo “sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de FCGRT, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 50 da listagem de sequências ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 50. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27.

[0085] O termo “LSP1” refere-se a Proteína 1 Específica de Linfócitos e inclui o gene LSP1. Este gene codifica uma proteína de ligação a F- actina intracelular. A proteína é expressa em linfócitos, neutrófilos, macrófagos e endotélio e pode regular a motilidade do neutrófilo, adesão às proteínas da matriz de fibrinogênio e migração transendotelial.

[0086] O termo “sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de LSP1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 51 a 72 da listagem de sequências ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 51 a 72. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 52 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 52.

[0087] O termo “CCL22” refere-se à Quimiocina (motivo C-C) Ligante 22 e inclui o gene CCL22. O produto deste gene se liga ao receptor de quimiocina CCR4. Esta quimiocina pode desempenhar um papel no tráfico de linfócitos T ativados para sítios inflamatórios e outros aspectos da fisiologia de linfócitos T ativados.

[0088] O termo “sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de CCL22, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 73 a 85 da listagem de sequências ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 73 a 85. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 79.

[0089] O termo “AES” refere-se ao Enhancer de Split AminoTerminal e inclui o gene AES. A proteína codificada por este gene pertence ao grupo da família de proteínas TLE, pode funcionar como um homo-oligômero ou como um hetero-oligômero com outros membros da família para reprimir de forma dominante a expressão de outros genes membros da família.

[0090] O termo “sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 86 a 89 da listagem de sequências ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 86 a 89. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 86 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 86. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136, ou posições 68 a 136 de SEQ ID NO: 86 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136, ou posições 68 a 136 de SEQ ID NO: 86.

[0091] O termo “PLD3” refere-se à Família de Fosfolipase D, Membro 3 e inclui o gene PLD3. Este gene codifica um membro da família de enzimas fosfolipase D (PLD) que catalisa a hidrólise de fosfolipídeos da membrana. A proteína codificada é uma proteína de membrana tipo II de passagem única e contém dois domínios fosfodiesterase PLD. Esta proteína influencia o processamento da proteína precursora amiloide-beta. Mutações nesse gene estão associadas com o risco da doença de Alzheimer.

[0092] O termo “sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de PLD3, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 90 a 104 da listagem de sequências ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 90 a 104. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 96 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 96.

[0093] O termo “MT_RNR1” refere-se ao RNA 12S codificado na mitocôndria e inclui o gene MT_RNR1. Este gene de RNA pertence à classe Mt_rRNA. Doenças associadas com MT-RNR1 incluem cardiomiopatia restritiva e neuropatia auditiva. Entre suas vias relacionadas estão a biogênese de ribossomo em eucariontes e fidelidade de tradução de CFTR (mutações classe I).

[0094] O termo “sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de MT_RNR1, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 105 a 121 da listagem de sequências ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 105 a 121. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 115 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 115. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142, ou posições 71 a 142 de SEQ ID NO: 115 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142, ou posições 71 a 142 de SEQ ID NO: 115.

[0095] O termo “HLA-DRB4” refere-se ao Complexo Principal de Histocompatibilidade, Classe II, DR Beta 4 e inclui o gene HLA-DRB4. HLA- DRB4 pertence aos parálogos de cadeia beta HLA classe II. Esta molécula de classe II é um heterodímero que consiste em uma cadeia alfa (DRA) e uma beta (DRB), ambas ancoradas na membrana. Ela desempenha um papel central no sistema imune, apresentando peptídeos derivados de proteínas extracelulares. As moléculas de classe II são expressas em células apresentadoras de antígenos (APC: linfócitos B, células dendríticas, macrófagos).

[0096] O termo “sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de HLA-DRB4, um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento” refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 122 a 143 da listagem de sequências ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 122 a 143. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 126 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 126.

[0097] O termo “qualquer combinação de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos, fragmentos e/ou variantes” em relação às sequências de ácidos nucleicos das regiões 3’ não traduzidas de determinados genes, fragmentos dos mesmos, ou variantes das sequências de ácidos nucleicos ou fragmentos significa que 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais e preferencialmente até 6 ou até 5 das ditas sequências de ácidos nucleicos, fragmentos e/ou variantes estão alinhadas da caecã até a cauda, opcionalmente espaçadas por ligantes. Em uma realização, a combinação de duas ou mais das sequências de ácidos nucleicos, fragmentos e/ou variantes compreende duas ou mais sequências diferentes e/ou duas ou mais sequências de ácidos nucleicos idênticas, fragmentos e/ou variantes. Em uma realização, a combinação de duas ou mais das sequências de ácidos nucleicos, fragmentos e/ou variantes compreende duas ou mais sequências de ácidos nucleicos diferentes, fragmentos e/ou suas variantes da região não traduzida 3’ dos mesmos e/ou diferentes genes.

[0098] Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica a uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 220, preferencialmente SEQ ID NOs: 174 e 208 a 220. Em uma realização, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1 a 220, preferencialmente SEQ ID NOs: 174 e 208 a 220, ou um fragmento da mesma, ou uma variante da dita sequência de ácido nucleico ou fragmento. Em uma realização particularmente preferencial, o termo refere-se a uma sequência de ácido nucleico que compreende, preferencialmente que consiste na sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174 ou que compreende, preferencialmente que consiste em uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% idêntica à sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174.

[0099] O termo “ligante”, de acordo com a invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico adicionada entre duas sequências de ácidos nucleicos para conectar as duas ditas sequências de ácidos nucleicos. Não há qualquer limitação particular no que se refere à sequência ligante.

[0100] De acordo com a invenção, uma molécula de ácido nucleico ou uma sequência de ácido nucleico refere-se a um ácido nucleico que é preferencialmente ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA). De acordo com a invenção, ácidos nucleicos compreendem DNA genômico, cDNA, mRNA, preparados de modo recombinante e moléculas sintetizadas quimicamente. De acordo com a invenção, um ácido nucleico pode estar sob a forma de uma molécula de fita simples ou de fita dupla e linear ou covalentemente fechada.

[0101] No contexto da presente invenção, o termo “RNA” refere-se a uma molécula que compreende resíduos de ribonucleotídeos e preferencialmente sendo inteiramente ou substancialmente compostos de resíduos de ribonucleotídeos. O termo “ribonucleotídeo” refere-se a um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2’ de um grupo β-D-ribofuranosil. O termo “RNA” compreende RNA de fita dupla, RNA de fita simples, RNA isolado como RNA parcialmente ou completamente purificado, RNA essencialmente puro, RNA sintético e RNA gerado de modo recombinante como RNA modificado que difere do RNA que ocorre naturalmente por adição, deleção, substituição e/ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Essas alterações podem incluir adição de material não nucleotídeo, como a(s) extremidade(s) de um RNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Os nucleotídeos nas moléculas de RNA também podem compreender nucleotídeos não padrão, como nucleotídeos que não ocorrem naturalmente ou nucleotídeos sintetizados quimicamente ou desoxinucleotídeos. Estes RNAs alterados podem ser citados como análogos, particularmente análogos de RNAs que ocorrem naturalmente. De acordo com a invenção, RNA inclui mRNA.

[0102] O termo “mRNA” significa “RNA mensageiro” e refere-se a um transcrito que é gerado pelo uso de um molde de DNA e codifica um peptídeo ou proteína. Tipicamente, mRNA compreende uma proteína 5’-UTR, uma região codificadora de proteína, uma região 3’-UTR, e uma sequência de poli(A). O mRNA pode ser gerado por transcrição in vitro a partir de um molde de DNA. A metodologia de transcrição in vitro é conhecida pelo técnico no assunto. Por exemplo, existe uma variedade de kits de transcrição in vitro comercialmente disponíveis. De acordo com a invenção, o mRNA pode ser ainda modificado por estabilização de modificações e por capeamento, além das modificações de acordo com a invenção.

[0103] Em uma realização da presente invenção, o RNA é RNA autorreplicante como RNA autorreplicante de fita simples. Em uma realização, o RNA autorreplicante é RNA de fita simples de sentido positivo. Em uma realização, o RNA autorreplicante e RNA viral ou RNA derivado do RNA viral. Em uma realização, o RNA autorreplicante é RNA genômico alfaviral ou é derivado de RNA genômico alfaviral. Em uma realização, o RNA autorreplicante é um vetor de expressão de gene viral. Em uma realização, o vírus é Semliki forest vírus. Em uma realização, o RNA autorreplicante contém um ou mais transgenes. Em uma realização, se o RNA é RNA viral ou derivado do RNA viral, os transgenes podem substituir parcialmente ou completamente as sequências virais como sequências virais que codificam proteínas estruturais. Em uma realização, o RNA autorreplicante é um RNA transcrito in vitro.

[0104] O termo “capeamento 5’” refere-se a uma estrutura de capeamento encontrada na extremidade 5’ de uma molécula de mRNA e geralmente consiste em um nucleotídeo guanosina conectado ao mRNA através de uma ligação trifosfato 5’ para 5’ não usual. Em uma realização, essa guanosina é metilada na posição 7. O termo “capeamento 5’ convencional” refere-se a um capeamento 5’ de RNA que ocorre naturalmente, preferencialmente para o capeamento de 7-metilguanosina (m7G). No contexto da presente invenção, o termo “capeamento 5’” inclui um análogo de capeamento 5’ que se assemelha à estrutura de capeamento de RNA e é modificado para possuir a capacidade de estabilizar o RNA se fixado a este, preferencialmente in vivo e/ou em uma célula. Fornecer um RNA com um capeamento 5’ ou análogo de capeamento 5’ pode ser obtido por transcrição in vitro de um molde de DNA na presença do dito capeamento 5’ ou análogo de capeamento 5’, em que o dito capeamento 5’ é cotranscricionalmente incorporado na fita de RNA gerada, ou o RNA pode ser gerado, por exemplo, por transcrição in vitro, e o capeamento 5’ pode ser gerado pós-transcricionalmente com o uso de enzimas de capeamento, por exemplo, enzimas de capeamento do vírus vaccinia.

[0105] O termo “ácido nucleico” de acordo com a invenção também compreende uma derivatização química de um ácido nucleico em uma base de nucleotídeos, em açúcar ou em fosfato, e ácidos nucleicos contendo nucleotídeos não naturais e análogos de nucleotídeos.

[0106] “Fragmento” ou “fragmento em uma sequência de ácido nucleico” refere-se a uma parte de uma sequência de ácido nucleico, isto é, uma sequência que representa a sequência de ácido nucleico encurtada nas extremidades 5’ e/ou 3’. Preferencialmente, um fragmento quando substitui a dita sequência de ácido nucleico em uma molécula de RNA mantém a estabilidade e/ou eficiência de tradução do RNA. Preferencialmente, um fragmento de uma sequência de ácido nucleico compreende pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% dos resíduos de nucleotídeos da dita sequência de ácido nucleico.

[0107] O termo “variante” em relação a, por exemplo, um ácido nucleico e sequências de aminoácidos, de acordo com a invenção inclui quaisquer variantes, em particular, mutantes, variantes de splicing, conformações, Isoformas, variantes alélicas, variantes de espécies e homólogos de espécies, em particular, aquelas que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica refere-se a uma alteração na sequência normal de um gene, a significância da qual é frequentemente pouco clara. O sequenciamento gênico completo muitas vezes identifica várias variantes alélicas para um dado gene. Uma espécie homóloga é uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos com uma espécie de origem diferente daquela de uma determinada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos.

[0108] De acordo com a invenção, variantes de ácido nucleico incluem deleções de nucleotídeos únicas ou múltiplas, adições, mutações e/ou inserções em comparação com o ácido nucleico de referência. Deleções incluem remoção de um ou mais nucleotídeos a partir do ácido nucleico de referência. Além disso, variantes compreendem fusões 5’ e/ou 3’-terminal de um ou mais nucleotídeos, como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais nucleotídeos. Mutações podem incluir, mas não se limitam a substituições, em que pelo menos um nucleotídeo na sequência é removido e outro nucleotídeo é inserido em seu lugar (como transversões e transições), sítios não básicos, sítios reticulados e bases quimicamente alteradas ou modificadas. Inserções incluem a adição de pelo menos um nucleotídeo no ácido nucleico de referência.

[0109] Em relação às moléculas de ácido nucleico, o termo “variante” inclui sequências de ácidos nucleicos degenerados, em que um ácido nucleico degenerado de acordo com a invenção é um ácido nucleico que difere de um ácido nucleico de referência na sequência do códon devido à degenerescência do código genético.

[0110] Preferencialmente, o grau de identidade entre uma dada sequência de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico que é uma variante da dita dada sequência de ácido nucleico será de pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% ou com a máxima preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. O grau de identidade é dado preferencialmente para uma região com pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 50, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 90, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 150, pelo menos cerca de 200, pelo menos cerca de 250, pelo menos cerca de 300, ou pelo menos cerca de 400 nucleotídeos. Em realizações preferenciais, o grau de identidade é dado para todo o comprimento da sequência de ácido nucleico de referência.

[0111] “Similaridade de sequência” indica a porcentagem dos aminoácidos que são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. “Identidade de sequência” entre duas sequências de polipeptídeos ou de ácidos nucleicos indica a percentagem de aminoácidos ou nucleotídeos que são idênticos entre as sequências.

[0112] O termo “% idêntica” destina-se a se referir, em particular, a uma percentagem de nucleotídeos que são idênticos em um alinhamento ótimo entre duas sequências a serem comparadas, com a dita porcentagem sendo meramente estatística, e as diferenças entre as duas sequências podem ser distribuídas aleatoriamente ao longo de todo o comprimento da sequência e a sequência a ser comparada pode compreender adições ou deleções em comparação com a sequência de referência, a fim de obter o melhor alinhamento duas sequências. Comparações de duas sequências são geralmente realizadas comparando as ditas sequências, após o melhor alinhamento, em relação a um segmento ou “janela de comparação”, a fim de identificar regiões locais de sequências correspondentes. O melhor alinhamento para uma comparação pode ser realizado manualmente ou com o auxílio do algoritmo de homologia local por Smith e Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, com o auxílio do algoritmo de homologia locais por Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, e com o auxílio do algoritmo de busca de similaridade por Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 ou com o auxílio de programas de computador com o uso dos ditos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0113] A porcentagem de identidade é obtida determinando o número de posições idênticas em que as sequências a serem comparadas correspondem, dividindo este número pelo número de posições comparadas e multiplicando esse resultado por 100.

[0114] Por exemplo, as “sequências BLAST 2” do programa BLAST que estão disponíveis no website http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi podem ser usadas.

[0115] Um ácido nucleico é “capaz de hibridizar” ou “hibridiza” a outro ácido nucleico se duas sequências são complementares entre si. Um ácido nucleico é “complementar” a outro ácido nucleico se as duas sequências são capazes de formar um duplex estável, um com o outro. De acordo com a invenção, a hibridização é preferencialmente realizada em condições que permitam a hibridização específica entre polinucleotídeos (condições estringentes). Condições estringentes são descritas, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989 ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., Nova York e referem-se, por exemplo, à hibridização a 65°C em tampão de hibridização (3,5 x SSC, Ficoll 0,02%, polivinilpirrolidona 0,02%, albumina de soro bovino 0,02%, NaH2PO4 2,5 mM (pH 7), SDS 0,5%, EDTA 2 mM). SSC é cloreto de sódio 0,15 M/citrato de sódio 0,15 M, pH 7. Após hibridização, a membrana para a qual o DNA foi transferido é lavada, por exemplo, em 2 x CCD à temperatura ambiente e, em seguida, em 0,1-0,5 x SSC/0,1 x SDS em temperaturas de até 68°C.

[0116] Uma porcentagem de complementaridade indica a porcentagem dos resíduos contíguos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, pareamento de bases de Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 dos 10 sendo 10%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares). “Perfeitamente complementares” ou “totalmente complementares” significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico terão pontes de hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácido nucleico. Preferencialmente, o grau de complementaridade de acordo com a invenção é de pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% ou com a máxima preferência pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%. Com a máxima preferência, o grau de complementaridade de acordo com a invenção é 100%.

[0117] O termo “derivado” compreende qualquer derivatização química de um ácido nucleico em uma base de nucleotídeos, em açúcar ou em fosfato. O termo “derivado” também compreende ácidos nucleicos que contêm nucleotídeos e análogos de nucleotídeos que não ocorrem naturalmente. Preferencialmente, uma derivatização de um ácido nucleico aumenta sua estabilidade.

[0118] Fragmentos ou variantes de sequências de ácidos nucleicos específicas ou sequências de ácidos nucleicos que têm um grau de identidade particular às sequências de ácidos nucleicos específicas, preferencialmente têm pelo menos uma propriedade funcional das ditas sequências específicas e preferencialmente são funcionalmente equivalentes às ditas sequências específicas, por exemplo, sequências de ácidos nucleicos que exibem propriedades idênticas ou similares àquelas das sequências de ácidos nucleicos específicas.

[0119] Uma propriedade importante é manter ou aprimorar a estabilidade de uma molécula de RNA e/ou eficiência de tradução e inclui, em particular, a capacidade para aumentar, em uma ligação funcional a um ácido nucleico que pode ser transcrito em RNA (sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita) ou uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína, a estabilidade e/ou a eficiência de tradução do RNA produzido a partir deste ácido nucleico ou da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína na molécula de RNA completa.

[0120] Em uma realização, se uma sequência de ácido nucleico específica está ativa de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade de outra sequência de ácido nucleico, um fragmento ou variante da sequência de ácido nucleico específica ou da sequência de ácido nucleico que tem um grau particular de identidade à sequência de ácido nucleico específica também está ativa, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da outra sequência de ácido nucleico (quando ela substitui a sequência de ácido nucleico específica). Um fragmento ou variante da sequência de ácido nucleico específica ou uma sequência de ácido nucleico que tem um grau de identidade particular à sequência de ácido nucleico específica pode ser tão ativa como ou mais ativa que a sequência de ácido nucleico específica, ou a atividade de um fragmento ou variante da sequência de ácido nucleico específica ou uma sequência de ácido nucleico que tem um grau de identidade particular à sequência de ácido nucleico específica pode ter de pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% da atividade da sequência de ácido nucleico específica.

[0121] De acordo com a invenção, “ligação funcional” ou “funcionalmente ligada” refere-se a uma conexão dentro de uma relação funcional. Um ácido nucleico é “ligado de maneira funcional” se ele está relacionado de maneira funcional a outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é funcionalmente ligado a uma sequência codificadora se ela influencia a transcrição da dita sequência codificadora. Ácidos nucleicos funcionalmente ligados normalmente são adjacentes entre si, quando apropriado separados por outras sequências de ácidos nucleicos e, em realizações particulares, são transcritos por RNA polimerase para resultar em uma única molécula de RNA (transcrito comum). Preferencialmente, uma sequência que é uma variante em relação a uma sequência específica, quando ela substitui a sequência específica em uma molécula de RNA, mantém a estabilidade e/ou eficiência de tradução do RNA.

[0122] De acordo com a invenção, uma “sequência de ácido nucleico que é derivada de uma sequência de ácido nucleico” refere-se a um ácido nucleico que é uma variante do ácido nucleico a partir do qual é derivada.

[0123] “Extremidade 3’ de um ácido nucleico” refere-se, de acordo com a invenção, a essa extremidade que tem um grupo hidróxi livre. Em uma representação esquemática de ácidos nucleicos de fita dupla, em particular DNA, a extremidade 3’ é sempre do lado direito. “Extremidade 5’ de um ácido nucleico” refere-se, de acordo com a invenção, a essa extremidade que tem um grupo fosfato livre. Em uma representação esquemática de ácidos nucleicos de fita dupla, em particular DNA, a extremidade 5’ é sempre do lado esquerdo. extremidade 5’ 5’--P-NNNNNNN-OH-3’ extremidade 3’ 3’-HO-NNNNNNN-P--5’

[0124] Em realizações particulares, um ácido nucleico é funcionalmente ligado de acordo com a invenção a sequências de controle de expressão que podem ser homólogas ou heterólogas em relação ao ácido nucleico.

[0125] Uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita, em particular, uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína, e uma sequência de controle de expressão são “funcionalmente” ligadas entre si se elas estão ligadas covalentemente entre si de tal modo que a transcrição ou expressão da sequência que pode ser transcrita e, em particular, que codifica a sequência de ácido nucleico está sob o controle ou sob a influência da sequência de controle de expressão. Se a sequência de ácido nucleico será traduzida em um peptídeo ou proteína funcional, a indução de uma sequência de controle de expressão funcionalmente ligada à sequência codificadora resulta na transcrição da dita sequência codificadora, sem causar uma mudança no quadro da sequência codificadora ou da sequência codificadora sendo incapaz de ser traduzida para o peptídeo ou proteína desejada.

[0126] O termo “sequência de controle de expressão” compreende de acordo com a invenção promotores, sequências de ligação de ribossomos e outros elementos de controle que controlam transcrição de um gene ou tradução do RNA derivado. Em realizações particulares da invenção, as sequências de controle de expressão podem ser reguladas. A estrutura precisa de sequências de controle de expressão pode variar dependendo das espécies ou do tipo de célula mas geralmente inclui sequências 5’ não transcritas e 5’ e 3’ não traduzidas envolvidas na iniciação da transcrição ou tradução respectivamente, como TATA box, sequência de capeamento, sequência CAAT e similares. Mais especificamente, sequências de controle de expressão 5’ não transcritas incluem uma região promotora que engloba uma sequência promotora para controle de transcrição do gene ligado de maneira funcional. Sequências de controle de expressão também podem incluir sequências enhancer ou sequências ativadoras a montante.

[0127] As sequências de ácido nucleico especificadas no presente pedido, em particular, em particular as sequências de ácido nucleico que podem ser transcritas e codificadoras, podem ser combinadas com quaisquer sequências de controle de expressão, em particular promotoras, que podem ser homólogas ou heterólogas às ditas sequências de ácidos nucleicos, com o termo “homólogo” referindo-se ao fato de que uma sequência de ácido nucleico também está funcionalmente ligada naturalmente à sequência de controle de expressão, e o termo “heterólogo”, referindo-se ao fato de que uma sequência de ácido nucleico não está naturalmente funcionalmente ligada à sequência de controle de expressão.

[0128] O termo “promotor” ou “região promotora” refere-se a uma sequência de DNA a montante (5’) da sequência codificadora de um gene, que controla a expressão da dita sequência codificadora, fornecendo um sítio de reconhecimento e de ligação para a RNA polimerase. Região promotora pode incluir sítios de reconhecimento ou de ligação adicionais para outros fatores envolvidos na regulação da transcrição do dito gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procarionte ou eucarionte. Um promotor pode ser “induzível” e iniciar a transcrição em resposta a um indutor, ou pode ser “constitutivo” se a transcrição não é controlada por um indutor. Um promotor induzível é expresso somente a uma medida muito pequena ou não é expresso, se um indutor estiver ausente. Na presença de indutor, o gene é ligado ou o nível de transcrição é aumentado. Isto é geralmente mediado por ligação de um fator de transcrição específico.

[0129] Exemplos de promotores preferenciais de acordo com a invenção são promotores para polimerase SP6, T3 ou T7.

[0130] De acordo com a invenção, o termo “expressão” é usado no seu sentido mais geral e compreende a produção de RNA ou de RNA e proteína. Compreende também expressão parcial de ácidos nucleicos. Além disso, a expressão pode ser temporária ou estável. Em relação ao RNA, o termo “expressão” ou “tradução” refere-se ao processo nos ribossomos de uma célula pelo qual uma fita de RNA mensageiro direciona a montagem de uma sequência de aminoácidos para fazer um peptídeo ou proteína.

[0131] O termo “sequências de ácidos nucleicos que podem ser transcritas para resultar em um transcrito comum” significa que as ditas sequências de ácido nucleico estão funcionalmente ligadas entre si de tal modo que, quando apropriado após linearização como clivagem de enzima de restrição da molécula de ácido nucleico que compreende as ditas sequências de ácido nucleico, em particular, de uma molécula de ácido nucleico circular fechada, a transcrição sob o controle de um promotor resulta em uma molécula de RNA que compreende os transcritos das ditas sequências de ácidos nucleicos ligadas covalentemente entre si, quando apropriado, separadas por sequências localizadas entre elas.

[0132] No contexto da presente invenção, o termo “transcrição” refere-se a um processo, em que o código genético em uma sequência de DNA é transcrito em RNA. Subsequentemente, o RNA pode ser traduzido em proteína. De acordo com a presente invenção, o termo “transcrição” compreende transcrição “in vitro”, em que o termo transcrição “in vitro” refere-se a um processo em que o RNA, em particular mRNA é sintetizado in vitro em um sistema livre de células. Preferencialmente, vetores de clonagem são aplicados para a geração de transcritos. Estes vetores de clonagem são geralmente designados como vetores de transcrição e estão de acordo com a presente invenção englobados pelo termo “vetor”. De acordo com a presente invenção, o RNA preferencialmente é RNA transcrito in vitro (IVT-RNA) e pode ser obtido por transcrição in vitro de um molde de DNA apropriado. O promotor para controlar a transcrição pode ser qualquer promotor para qualquer RNA polimerase. Um molde de DNA para transcrição in vitro pode ser obtido por clonagem de um ácido nucleico, em particular cDNA, e introduzir o mesmo em um vetor apropriado para transcrição in vitro. O cDNA pode ser obtido por transcrição reversa de RNA.

[0133] O termo “sequência de ácido nucleico transcrita a partir de uma sequência de ácido nucleico” refere-se ao RNA, quando apropriado, como parte de uma molécula de RNA completa, que é um produto de transcrição da última sequência de ácido nucleico.

[0134] O termo “sequência de ácido nucleico que está ativa para aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade de uma sequência de ácido nucleico” significa que a primeira sequência de ácido nucleico é capaz de modificar, em um transcrito comum com a segunda sequência de ácido nucleico, a eficiência de tradução e/ou estabilidade da dita segunda sequência de ácido nucleico de tal forma que a dita eficiência de tradução e/ou estabilidade é aumentada em comparação com a eficiência de tradução e/ou estabilidade da dita segunda sequência de ácido nucleico sem a dita primeira sequência de ácido nucleico. Neste contexto, o termo “eficiência de tradução” refere-se à quantidade de produto de tradução fornecido por uma molécula de RNA dentro de um determinado período de tempo, e o termo “estabilidade” refere-se à meia-vida de uma molécula de RNA.

[0135] Modificação, e, assim, estabilização e/ou aumento na eficiência de tradução de RNA pode ser obtida de acordo com a invenção por modificação genética da expressão de moléculas de ácido nucleico da invenção quando usadas como vetores de expressão de tal modo que eles permitem a transcrição de RNA com regiões não traduzidas 3’, conforme descrito no presente pedido na sua extremidade 3’ e, preferencialmente, entre a sequência codificadora para um peptídeo ou proteína (quadro aberto de leitura) e a sequência de poli(A).

[0136] O termo “região não traduzida 3” refere-se a uma região que está localizada na extremidade 3' de um gene, a jusante do códon de terminação de uma região codificadora de proteínas, e que é transcrita, mas não é traduzida para uma sequência de aminoácidos, ou para a região correspondente em uma molécula de RNA.

[0137] De acordo com a invenção, uma primeira região de polinucleotídeo é considerada como estando localizada a jusante de uma segunda região marcada se a extremidade 5’ da dita primeira região do polinucleotídeo é a parte da dita primeira região do polinucleotídeo mais próxima da extremidade 3’ da dita segunda região do polinucleotídeo.

[0138] A região não traduzida 3’ tipicamente se estende a partir do códon de terminação para um produto de tradução para a sequência de poli(A) que geralmente é fixada após o processo de transcrição. As regiões não traduzidas 3’ de mRNA de mamífero tipicamente têm uma região de homologia conhecida como a sequência de hexanucleotídeo AAUAAA. Esta sequência é provavelmente o sinal de fixação de poli (A) e frequentemente está localizada de 10 a 30 bases a montante do sítio de fixação de poli (A).

[0139] As regiões não traduzidas 3’ podem conter uma ou mais repetições invertidas que podem se dobrar para resultar em estruturas haste- alça que agem como barreiras para exoribonucleases ou interagem com proteínas conhecidas para aumentar a estabilidade do RNA (por exemplo, proteínas que se ligam ao RNA).

[0140] Regiões não traduzidas 5’ e/ou 3’ podem, de acordo com a invenção, ser funcionalmente ligadas a um ácido nucleico que pode ser transcrito e, em particular, codificador, de modo que essas regiões sejam associadas ao ácido nucleico de tal modo que a estabilidade e/ou a eficiência de tradução de tradução do RNA transcrito a partir do dito ácido nucleico que pode ser transcrito seja aumentada.

[0141] As regiões não traduzidas 3’ de mRNAs de imunoglobulina são relativamente curtas (menos que cerca de 300 nucleotídeos), enquanto que as regiões não traduzidas 3’ de outros genes são relativamente longas. Por exemplo, a região não traduzida 3’ de tPA tem cerca de 800 nucleotídeos de comprimento, a do factor VIII tem cerca de 1800 nucleotídeos de comprimento e a da eritropoetina tem cerca de 560 nucleotídeos de comprimento.

[0142] Ela pode ser determinada de acordo com a invenção, se a região não traduzida 3’ ou uma sequência de ácido nucleico derivada da mesma aumentar a estabilidade e/ou a eficiência de tradução de RNA, por incorporação da região não traduzida 3’ ou da sequência de ácido nucleico derivada da região não traduzida 3’ de um gene e medindo se a dita incorporação aumenta a quantidade de proteína sintetizada.

[0143] O disposto acima se aplica consequentemente para o caso em que, de acordo com a invenção um ácido nucleico compreende duas ou mais regiões não traduzidas 3’, que são preferencialmente acopladas sequencialmente com ou sem um ligante entre elas, preferencialmente em uma relação “cabeça até cauda” (isto é, as regiões não traduzidas têm a mesma orientação, preferencialmente a orientação que ocorre naturalmente em um ácido nucleico).

[0144] De acordo com a invenção, o termo “gene” refere-se a uma sequência de ácido nucleico particular que é responsável pela produção de um ou mais produtos celulares e/ou para obter uma ou mais funções intercelulares ou intracelulares. Mais especificamente, o dito termo refere-se a uma seção de DNA que compreende um ácido nucleico codificador para uma proteína específica ou uma molécula de RNA funcional ou estrutural.

[0145] Poliadenilação é a adição de uma sequência de poli(A) ou cauda a um RNA transcrito primário. A sequência de poli(A) consiste em várias monofosfato adenosinas. Em outras palavras, ela é um trecho de RNA que tem somente bases adenina. Nos eucariontes, a poliadenilação é parte do processo que produz RNA mensageiro maduro (mRNA) para tradução. Portanto, ela faz parte do processo de expressão gênica. O processo de poliadenilação começa como a transcrição de um gene que inicia ou termina. O segmento mais 3’ do pré-mRNA recém-produzido é primeiro clivado por um conjunto de proteínas; estas proteínas então sintetizam a sequência de poli(A) na extremidade 3’ dos RNAs. A sequência de poli(A) é importante para a exportação nuclear, tradução e estabilidade de mRNA. A sequência é encurtada ao longo do tempo, e, quando é suficientemente curta, o mRNA é enzimaticamente degradado.

[0146] Os termos “sequência de poliadenila”, “sequência de poli(A)” ou “cauda poli(A)” referem-se a uma sequência de resíduos de adenila que geralmente está localizada na extremidade 3’ de uma molécula de RNA. A invenção fornece para tal uma sequência a ser fixada durante a transcrição de RNA por meio de um molde de DNA com base nos resíduos de timidila repetidos na fita complementar à fita codificadora, considerando que a dita sequência não é normalmente codificada no DNA, mas é fixada à extremidade 3’ livre do RNA por uma RNA polimerase independente de molde após a transcrição no núcleo. Acordo com a invenção, em uma realização, uma sequência de poli(A) tem pelo menos 20, preferencialmente pelo menos 40, preferencialmente pelo menos 80, preferencialmente pelo menos 100 e preferencialmente até 500, preferencialmente até 400, preferencialmente até 300, preferencialmente até 200, e, em particular, até 150, nucleotídeos A, preferencialmente nucleotídeos A consecutivos, e, em particular, cerca de 120 nucleotídeos A. O termo “nucleotídeos A” ou “A” refere-se a resíduos de adenila.

[0147] Em uma realização preferencial, uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção é um vetor. O termo “vetor” é usado no presente pedido em seu significado mais geral e compreende qualquer veículo intermediário para um ácido nucleico que, por exemplo, permite que o dito ácido nucleico seja introduzido nas células hospedeiras procariontes e/ou eucariontes e, quando apropriado, seja integrado em um genoma. Esses vetores são preferencialmente replicados e/ou expressos na célula. Vetores compreendem plasmídeos, fagomídeos ou genomas de vírus. O termo “plasmídeo”, como usado no presente pedido, geralmente refere-se a um constructo de material genético extracromossômico, normalmente um DNA circular duplex, que pode se replicar independentemente do DNA cromossômico.

[0148] Os ácidos nucleicos descritos no presente pedido podem ser moléculas recombinantes e/ou isoladas.

[0149] Uma “molécula isolada”, como usado no presente pedido, destina-se a se referir a uma molécula que é substancialmente livre de outras moléculas, como outros materiais celulares. O termo “ácido nucleico isolado” significa, de acordo com a invenção, que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) produzido de modo recombinante por clonagem, (iii) purificado, por exemplo, por clivagem e fracionamento eletroforético em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, por síntese química. Ácido nucleico isolado é um ácido nucleico disponível para manipulação por técnicas de DNA recombinante.

[0150] O termo “recombinante” no contexto da presente invenção significa “feito através da engenharia genética”. Preferencialmente, um “objeto" recombinante”, como uma célula recombinante no contexto da presente invenção é o que não ocorre naturalmente.

[0151] O termo “que ocorre naturalmente”, como usado no presente pedido, refere-se ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, um peptídeo ou ácido nucleico que está presente em um organismo (incluindo vírus) e pode ser isolado a partir de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmente modificado pelo homem em laboratório é de ocorrência natural.

[0152] De acordo com a invenção, o termo “célula hospedeira” refere-se a qualquer célula que pode ser transformada ou transfectada com um ácido nucleico exógeno. O termo “célula hospedeira” compreende, de acordo com a invenção, células procariontes (por exemplo, E.coli) ou eucariontes (por exemplo, células de levedura e células de inseto). Preferência particular é dada a células de mamíferos como células de humanos, camundongos, hamsters, porcos, cabras, primatas. As células podem ser derivadas a partir de uma multiplicidade de tipos de tecidos e compreende células primárias e linhagens celulares. Exemplos específicos incluem queratinócitos, leucócitos do sangue periférico, células-tronco da medula óssea e células-tronco embrionárias. Em outras realizações, a célula hospedeira é uma célula apresentadora de antígeno, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago. Um ácido nucleico pode estar presente na célula hospedeira em uma única cópia ou em várias cópias e, em uma realização, é expresso na célula hospedeira.

[0153] E.coli é uma bactéria gram-negativa com formato de bastão, facultativamente anaeróbica, do gênero Escherichia que é comumente encontrada no intestino inferior de animais de sangue quente. A bactéria pode ser cultivada facilmente e de forma barata em um ambiente de laboratório, e tem sido intensamente investigada há mais de 60 anos. E.coli é o organismo de modelo procarionte mais amplamente estudado, e uma espécie importante nos campos de biotecnologia e microbiologia, onde serviu como organismo hospedeiro para a maioria dos trabalhos com DNA recombinante. Linhagens de E. coli de acordo com a invenção incluem: AG1, AB1157, B2155, BL21, BNN93, BNN97, BW26434, C600, CSH50, D1210, DB3.1, DH1, DH5α, DH10B, DH12S, DM1, E. cloni(r), E.coli K12 ER2738, ER2566, ER2267, HB101, IJ1126, IJ1127, JM83, JM101, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109, JM110, JM2.300, LE392, Mach1, MC1061, MC4100, MFDpir, MG1655, OmniMAX2, RR1, RV308, SOLR, SS320, STBL2, STBL3, STBL4, SURE, SURE2, TG1, TOP10, Top10F’, W3110, WM3064, XL1-Blue, XL2-Blue, XL1-Red e XL10-Gold.

[0154] De acordo com a presente invenção, o termo “peptídeo” compreende oligo- e polipeptídeos e refere-se a substâncias que compreendem dois ou mais, preferencialmente 3 ou mais, preferencialmente 4 ou mais, preferencialmente 6 ou mais, preferencialmente 8 ou mais, preferencialmente 10 ou mais, preferencialmente 13 ou mais, preferencialmente 16 ou mais, preferencialmente 20 ou mais e até preferencialmente 50, preferencialmente 100 ou preferencialmente 150 aminoácidos consecutivos ligados uns aos outros através de pontes peptídicas. O termo “proteína” refere-se a grandes peptídeos, preferencialmente peptídeos que têm que têm pelo menos 151 aminoácidos, mas os termos “peptídeo” e “proteína” são geralmente usados no presente pedido como sinônimos.

[0155] Os termos “peptídeo” e “proteína” compreendem, de acordo com a invenção, substâncias que contêm não apenas omponentes aminoácidos, mas também componentes não aminoácidos como estruturas de açúcares e fosfato, e também compreendem substâncias que contêm ligações como éster, tioéter ou pontes bissulfeto.

[0156] De acordo com a presente invenção, um ácido nucleico como RNA pode codificar um peptídeo ou proteína. Consequentemente, uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita ou um transcrito da mesma pode conter um quadro aberto de leitura (ORF) que codifica um peptídeo ou proteína. O dito ácido nucleico pode expressar o peptídeo ou proteína codificada. Por exemplo, o dito ácido nucleico pode ser um ácido nucleico que codifica e que expressa um antígeno ou um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa como um composto imunologicamente ativo (que preferencialmente não é um antígeno).

[0157] De acordo com a invenção, o termo “ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína” significa que o ácido nucleico, se presente no ambiente apropriado, preferencialmente dentro de uma célula, pode direcionar a montagem de aminoácidos para produzir o peptídeo ou proteína durante o processo de tradução. Preferencialmente, o RNA de acordo com a invenção é capaz de interagir com a maquinaria de tradução celular, permitindo a tradução tdo peptídeo ou proteína.

[0158] De acordo com a invenção, em uma realização, o RNA compreende ou consiste em RNA farmaceuticamente ativo. Um “RNA farmaceuticamente ativo” pode ser RNA que codifica um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa.

[0159] Um “peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa” tem um efeito positivo ou vantajoso sobre a condição ou estado da doença de um sujeito, quando administrado ao sujeito em uma quantidade terapeuticamente efetiva. Preferencialmente, um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa tem propriedades curativas ou paliativas e pode ser administrada para melhorar, aliviar, reverter, retardar o princípio ou diminuir a gravidade de um ou mais sintomas de uma doença ou disfunção. Um peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa pode ter propriedades profiláticas e podem ser usada para retardar o princípio da uma doença ou para diminuir a gravidade dessa doença ou condição patológica. O termo “peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativa” inclui proteínas ou polipeptídeos inteiros, e também pode se referir a fragmentos farmaceuticamente ativos dos mesmos. Também pode incluir análogos farmaceuticamente ativos de um peptídeo ou proteína. O termo “peptídeo ou proteína farmaceuticamente ativo” inclui peptídeos e proteínas que são antígenos, isto é, o peptídeo ou proteína obtém uma resposta imune em um sujeito que pode ser terapêutica, ou parcialmente ou totalmente protetora.

[0160] Exemplos de proteínas farmaceuticamente ativas incluem, mas não se limitam a, citocinas e proteínas do sistema imune, como compostos imunologicamente ativos (por exemplo, interleucinas, fator estimulante de colônia (CSF), fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulante de colônia de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), eritropoietina, fator de necrose tumoral (TNF), interferons, integrinas, adressinas, seletinas, receptores de alojamento, receptores de células T, imunoglobulinas, antígenos solúveis do complexo principal de histocompatibilidade, antígenos imunologicamente ativos, como antígenos bacterianos, parasíticos ou virais, alergênios, autoantígenos, anticorpos), hormônios (insulina, hormônio da tireoide, catecolaminas, gonadotrofinas, hormônios tróficos, prolactina, oxitocina, dopamina, somatotropina bovina, leptinas e similares), hormônios de crescimento (por exemplo, hormônio do crescimento humano), fatores de crescimento (por exemplo, fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento do nervo, fator de crescimento similar à insulina, e similares), receptores do fator de crescimento, enzimas, ativador do plasminogênio tecidual, estreptoquinase, colesterol biossintético ou degradativo, enzimas esteriodogênicas, quinases, fosfodiesterases, metilases, de-metilases, desidrogenases, celulases, proteases, lipases, fosfolipases, aromatases, citocromos, adenilato ou guanilasto ciclases, neuramidases, e similares), receptores (receptores do hormônio esteroide, receptores de peptídeo), proteínas de ligação (hormônio de crescimento, proteínas de ligação do fator de crescimento, e similares), fatores de transcrição e tradução, proteínas de supressão de crescimento do tumor (por exemplo, proteínas que inibem angiogênese), proteínas estruturais (como colágeno, fibroína, fibrinogênio, elastina, tubulina, actina e miosina), proteínas do sangue (trombina, albumina no soro, Fator VII, Fator VIII, insulina, Fator IX, Fator X, ativador do plasminogênio tecidual, proteína C, fator de von Wilebrand, antitrombina III, glicocerebrosidase, fator estimulante de colônia de granulócitos de eritropoietina (GCSF) ou Fator VIII modificado, anticoagulantes, e similares.

[0161] Em uma realização, a proteína farmaceuticamente ativa de acordo com a invenção é uma citocina que está envolvida na regulação da homeostase linfoide, preferencialmente uma citocina que está envolvida e preferencialmente induz ou melhora o desenvolvimento, preparação, expansão, diferenciação e/ou sobrevida de células T. Em uma realização, a citocina é uma interleucina. Em uma realização, a proteína farmaceuticamente ativa de acordo com a invenção é selecionada a partir do grupo que consiste em IL-2, IL-7, IL- 12, IL-15 e IL-21.

[0162] O termo “composto imunologicamente ativo” refere-se a qualquer composto que altera uma resposta imune, preferencialmente por indução e/ou supressão de maturação de células imunes, indução e/ou supressão de biossíntese de citocinas, e/ou alteração de imunidade humoral estimulando a produção de anticorpo por células B. Compostos imunologicamente ativos possuem atividade imunoestimulante potente, incluindo, mas não se limitando a, atividade antiviral e antitumoral, e também podem infrarregular outros aspectos da resposta imune, por exemplo, mudando a resposta imune longe de uma resposta imune TH2, que é útil para tratar uma grande variedade de doenças mediadas por TH2. Compostos imunologicamente ativos podem ser úteis como vacinas adjuvantes.

[0163] Se, de acordo com a presente invenção, é desejado induzir ou melhorar uma resposta imune usando RNA, conforme descrito no presente pedido, a resposta imune pode ser acionada ou melhorada pelo RNA. Por exemplo, peptídeos ou proteínas codificadas pelos RNAs ou produtos de processo dos mesmos podem ser apresentados por proteínas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) expressas em células apresentadoras de antígenos. O complexo de peptídeo de MHC pode, então, ser reconhecido por células imunes como células T, que levam à sua ativação.

[0164] Em uma realização, o RNA que codifica um antígeno, como um antígeno associado à doença é administrado a um mamífero, em particular, se tratar um mamífero que tem uma doença, envolvendo o antígeno é desejado. O RNA é absorvido nas células apresentadoras de antígenos (monócitos, macrófagos, células dendríticas outras células). Um produto de tradução antigênica do RNA é formado e o produto é exibido na superfície das células para reconhecimento por células T. Em uma realização, o antígeno é exibido na superfície celular para reconhecimento por células T de CAR elaborado geneticamente direcionadas ao antígeno. Em uma realização, o antígeno ou um produto produzido por processo opcional do mesmo é exibido na superfície celular no contexto de moléculas MHC para reconhecimento por células T através de seu receptor de células T.

[0165] De maneira alternativa, a presente invenção prevê realizações em que o RNA que expressa um antígeno é introduzido em células apresentadoras de antígenos ex vivo, por exemplo, células apresentadoras de antígenos retiradas de um paciente, e as células apresentadoras de antígenos, opcionalmente propagadas por clonagem ex vivo, são transplantadas de volta para o mesmo paciente. Células transfectadas podem ser reintroduzidas no paciente com o uso de quaisquer meios conhecidos na técnica, preferencialmente na forma estéril por administração intravenosa, intracavitária, intraperitoneal ou intratumor.

[0166] Os métodos da invenção podem envolver uma célula apresentadora de antígeno para expressar o RNA que codifica o antígeno. Para este fim, os métodos da invenção podem envolver a introdução de RNA que codifica antígenos em células apresentadoras de antígenos como células dendríticas. Para transfecção de células apresentadoras de antígenos, como células dendríticas pode ser usada uma composição farmacêutica que compreende RNA que codifica o antígeno. Um veículo de distribuição que direciona o RNA a uma célula dendrítica ou outra apresentadora de antígeno pode ser administrado a um paciente, resultando em transfecção que ocorre in vivo.

[0167] De acordo com a invenção é preferencial usar formulações do RNA que codifica um antígeno que distribui o RNA com alta seletividade a células apresentadoras de antígenos, como células dendríticas (DCs) no baço após administração sistêmica. Por exemplo, as formulações de RNA nanoparticulados com tamanho de partícula definido em que a carga líquida das partículas é próxima de zero ou negativa, como lipoplexos eletro-neutros ou carregados negativamente a partir de RNA e lipossomos, por exemplo, lipoplexos que compreendem DOTMA e DOPE ou DOTMA e Colesterol, levam a expressão de RNA substancial em DCs de baço após administração sistêmica. Uma forte expressão nas células alvo (baço) foi determinada enquanto a expressão em outros órgãos foi baixa.

[0168] Conforme usado no presente pedido, o termo “nanopartícula” refere-se a qualquer partícula que tem um diâmetro que produz a partícula adequada para administração sistêmica, em particular, parenteral, em particular, de ácidos nucleicos, tipicamente um diâmetro menor que 1000 nanômetros (nm). Em algumas realizações, uma nanopartícula tem um diâmetro menor que 600 nm. Em algumas realizações, uma nanopartícula tem um diâmetro menor que 400 nm.

[0169] Como usado no presente pedido, o termo “formulação nanoparticulada” ou termos similares referem-se a qualquer substância que contém pelo menos uma nanopartícula. Em algumas realizações, uma composição nanoparticulada é uma coleção uniforme de nanopartículas. Em algumas realizações, composições nanoparticuladas são dispersões ou emulsões. Em geral, uma dispersão ou emulsão é formada quando pelo menos dois materiais imiscíveis são combinados.

[0170] O termo “lipoplexo” ou “lipoplexo de ácido nucleico”, em particular, “lipoplexo de RNA”, refere-se a um complexo de lipídios e ácidos nucleicos, em particular, RNA. Lipoplexos são formados espontaneamente quando lipossomos catiônicos, que com frequência também incluem um lipídeo “auxiliar” neutro, são misturados com ácidos nucleicos.

[0171] Se a presente invenção refere-se a uma carga como uma carga positiva, carga negativa ou carga neutra ou um composto catiônico, composto negativo ou composto neutro, isto geralmente significa que a carga mencionada está presente em um pH selecionado, como um pH fisiológico. Por exemplo, o termo “lipídeo catiônico” significa um lipídeo que tem uma carga positiva líquida em um pH selecionado, como um pH fisiológico. O termo “lipídeo neutro” significa um lipídeo que não tem carga positiva ou negativa líquida e pode estar presente sob a forma de um íon anfotérico não carregado ou neutro em um pH selecionado, como um pH fisiológico. Por “pH fisiológico” no presente pedido entende-se um pH de cerca de 7,5.

[0172] O carreador nanoparticulado, como carreadores de lipídeos contemplados para uso na presente invenção incluem quaisquer substâncias ou veículos com o quais ácidos nucleicos como RNA podem ser associados, por exemplo, formando complexos com o ácido nucleico ou formando vesículas na qual o ácido nucleico é fechado ou encapsulado. Isto pode resultar em estabilidade aumentada do ácido nucleico em comparação ao ácido nucleico nu. Em particular, a estabilidade do ácido nucleico no sangue pode ser aumentada.

[0173] Lipídeos catiônicos, polímeros catiônicos e outras substâncias com cargas positivas podem formar complexos com ácidos nucleicos carregados negativamente. Estas moléculas catiônicas podem ser usadas para complexos de ácidos nucleicos, através disso formando, por exemplo, os chamados lipoplexos ou poliplexos, respectivamente, e estes complexos mostraram distribuir ácidos nucleicos nas células.

[0174] Preparações de ácido nucleico nanoparticuladas para uso na presente invenção podem ser obtidas por vários protocolos e a partir de vários compostos complexantes de ácido nucleico. Lipídeos, polímeros, oligômeros ou anfifiles são agentes complexantes típicos. Em uma realização, o composto complexante compreendem pelo menos um agente selecionado a partir do grupo que consiste em protamina, polietileneimina, uma poli-L-lisina, uma poli-L- arginina ou uma histona.

[0175] De acordo com a invenção, a protamina é útil como agente carreador catiônico. O termo “protamina” refere-se a qualquer uma de várias proteínas fortemente básicas de peso molecular relativamente baixo, que são ricas em arginina e são encontradas especialmente associadas ao DNA no lugar de histonas somáticas nas células de esperma de vários animais (como peixes). Em particular, o termo “protamina” refere-se a proteínas encontradas no esperma de peixe que são fortemente básicas, são solúveis em água, não são coagulados pelo calor, e principalmente produzem mediante hidrólise. Na forma purificada, elas são usadas em uma formulação de longa duração de insulina e para neutralizar os efeitos anticoagulantes da heparina.

[0176] De acordo com a invenção, o termo “protamina”, como usado no presente pedido, entende-se compreender qualquer sequência de ácido amino protamina obtida ou derivada a partir de fontes nativas ou biológicas incluindo fragmentos das mesmas e formas multiméricas da dita sequência de aminoácidos ou fragmento da mesma. Além disso, o termo engloba (sintetizado) polipeptídeos que são artificiais e especificamente projetados para propósitos específicos e não podem ser isolados de fontes nativas ou biológicas.

[0177] A protamina usada de acordo com a presente invenção pode ser protamina sulfatada ou cloridrato de protamina. Em uma realização preferencial, a fonte de protamina usada para a produção das nanopartículas descritas no presente pedido é protamina 5000 que contém protamina em mais de 10 mg/mL (5000 unidades neutralizantes de heparina por mL) em uma solução salina isotônica.

[0178] Lipossomos são vesículas lipídicas microscópicas, com frequência tendo um ou mais bicamadas de um lipídeo formador de vesícula, como um fosfolipídeo, e são capazes de encapsular uma droga. Diferentes tipos de lipossomos podem ser empregados no contexto da presente invenção, incluindo, sem estar limitado a isto, vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequenas (SUV), vesículas unilamelares grande (LUV), lipossomas estericamente estabilizados (SSL), vesículas multivesiculares (MV), e vesículas multivesiculares grande (LMV) bem como outras formas de bicamada conhecidas na técnica. O tamanho e a lamelaridade do lipossomo dependerá do modo de preparação e a seleção do tipo de vesículas a ser usada dependerá do modo de administração preferencial. Existem diversas outras formas de organização supramolecular na qual lipídeos podem estar presentes em um meio aquoso, que compreende fases lamelares, fases hexagonais e hexagonais inversa, fases cúbicas, micelas, micelas reversas compostas de monocamadas. Estas fases também podem ser obtidas na combinação com DNA ou RNA, e a interação com RNA e DNA podem afetar substancialmente o estado da fase. As fases descritas podem estar presentes nas formulações de ácidos nucleicos nanoparticulados da presente invenção.

[0179] Para formação de lipoplexos de ácido nucleico a partir de ácidos nucleicos e lipossomos, qualquer método adequado de formação de lipossomos pode ser usado contanto que forneça o lipoplexo de ácido nucleico contemplado. Os lipossomas podem ser formados com o uso de métodos padrão, como o método de evaporação reversa (REV), o método de injeção de etanol, o método de desidratação-reidratação (DRV), sonicação ou outros métodos adequados.

[0180] Após formação de lipossomo, os lipossomos podem ser medidos para se obter uma população de lipossomos que têm uma faixa de tamanho substancialmente homogênea.

[0181] Os lipídeos formadores de bicamada tipicamente têm duas cadeias de hidrocarbonetos, particularmente cadeias acila, e um grupo principal, tanto polar como não polar. Os lipídeos são compostas tanto de lipídeos que ocorrem naturalmente como de origem sintética, incluindo os fosfolipídeos, como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfátido fosfatidilinisitol e esfingomielina, onde as duas cadeias de hidrocarbonetos têm tipicamente entre cerca de 14 a 22 átomos de carbono de comprimento, e têm variados graus de insaturação. Outros lipídeos adequados para uso na composição da presente invenção incluem glicolipídeos e esteróis, como colesterol e seus vários análogos que também podem ser usados nos lipossomos.

[0182] Lipídios catiônicos tipicamente têm um componente lipofílico, como um esterol, uma cadeia acila ou diacila, e têm uma carga positiva líquida total. O grupo principal do lipídeo tipicamente carrega a carga positiva. O lipídeo catiônico tem preferencialmente uma carga positiva de 1 a 10 valências, mais preferencialmente uma carga positiva de 1 a 3 valências, e mais preferencialmente uma carga positiva de 1 valência. Exemplos de lipídeos catiônicos incluem, mas não se limitam a 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamônio propano (DOTMA); dimetildioctadecilamônio (DDAB); 1,2-dioleoil-3- trimetilamônio-propano (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamônio-propano (DODAP) 1,2-diacilóxi-3-dimetilamônio propanos; 1,2-dialcilóxi-3-dimetilamônio propanos; cloreto de dioctadecildimetil amônio (DODAC), 1,2-dimiristoiloxipropil- 1,3-dimetilhidroxietil amônio (DMRIE), e 2,3-dioleoilóxi-N-[2(espermina carboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminio trifluoroacetato (DOSPA). Preferenciais são DOTMA, DOTAP, DODAC e DOSPA. Da máxima preferência é DOTMA.

[0183] Além disso, as nanopartículas descritas no presente pedido, ainda incluem preferencialmente um lipídeo neutro em vista da estabilidade estrutural, e similares. O lipídeo neutro pode ser selecionado de maneira apropriada, em vista da eficiência de distribuição do complexo ácido nucleico- lipídeo. Exemplos de lipídeos neutros incluem, mas não se limitam a, 1,2-di-(9Z- octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3- fosfocolina (DOPC), diacilfosfatidil colina, diacilfosfatidil etanol amina, ceramida, esfingoemielina, cefalina, esterol e cerebrosídeo. Preferencial é DOPE e/ou DOPC. Da máxima preferência é DOPE. No caso em que um lipossomo catiônico inclui tanto um lipídeo catiônico como um lipídeo neutro, a razão molar do lipídeo catiônico para o lipídeo neutro pode ser determinada de maneira apropriada, em vista da estabilidade do lipossomo, e similares.

[0184] De acordo com uma realização, as nanopartículas descritas no presente pedido podem compreender fosfolipídeos. Os fosfolipídeos podem ser um glicerofosfolipídeo. Exemplos de glicerofosfolipídeos incluem, sem estar limitado a isto, a três tipos de lipídeos: (i) fosfolipídeos zwiteriônico, que inclui, por exemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidilcolina de gema de ovo, PC derivada de soja em natural, forma parcialmente hidrogenada ou totalmente hidrogenada, dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC), esfingomielina (SM); (ii) fosfolipídeos carregados negativamente: que incluem, por exemplo, fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), dipalmipoil PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); derivados sintéticos na qual o conjugado se torna um fosfolipídeo zwiteriônico carregado negativamente como é o caso de metóxi-polietilenoglicol- distearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE); e (iii) fosfolipídeos catiônicos, que incluem, por exemplo, fosfatidilcolina ou esfingomielina das quais o fosfomonoéster foi O-metilatado para formar os lipídeos catiônicos.

[0185] Pode ocorrer associação de ácido nucleico ao carreador lipídico, por exemplo, pelo ácido nucleico que preenche espaços intersticiais do carreador, de modo que o carreador captura fisicamente o ácido nucleico ou por ligação iônica, covalente, iônica ou de hidrogênio, ou por meio de adsorção por ligações não específicas. Qualquer que seja o modo de associação, o ácido nucleico deve manter a sua terapêutica, isto é, propriedades que codificam o antígeno.

[0186] O termo “doença” refere-se a uma condição anormal que afeta o corpo de um indivíduo. Uma doença é com frequência interpretada como uma condição médica associada a sintomas e sinais específicos. Uma doença pode ser causada por fatores originalmente a partir de uma fonte externa, como doenças infecciosas ou pode ser causada por disfunções internas, como doenças autoimunes.

[0187] De acordo com a invenção, o termo “doença” também se refere a doenças cancerosas. Os termos “doença de câncer” ou “câncer” (termo médico: neoplasma maligno) referem-se a uma classe de doenças em que um grupo de células exibe crescimento descontrolado (divisão para além dos limites normais), invasão (intrusão e destruição de tecidos adjacentes), e às vezes metástase (dispersão para outros locais no corpo através da linfa ou do sangue). Estas três propriedades malignas dos cânceres os diferencia dos tumores benignos, que são autolimitados e não invadem ou sofrem metástase. A maioria dos cânceres forma um tumor, isto é, um inchaço ou lesão formado por um crescimento anormal de células (chamado de células neoplásicas ou células tumorais), mas alguns, como leucemia, não. Exemplos de cânceres incluem, mas não se limitam a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, glioma e leucemia. Mais particularmente, exemplos desses cânceres incluem câncer ósseo, câncer no sangue, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer pancreático, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer da região anal, câncer de estômago, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de próstata, câncer uterino, carcinoma dos órgãos sexuais e reprodutivos, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da tireoide, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecidos moles, câncer da bexiga, câncer do rim, carcinoma de células renais, carcinoma da pelve renal, neoplasmas do sistema nervoso central (CNS), câncer neuroectodérmico, tumores do eixo espinhal, glioma, meningioma e adenoma pituitário. O termo “câncer” de acordo com a invenção também compreende metástases de câncer.

[0188] O termo “doença infecciosa” refere-se a qualquer doença que pode ser transmitida de indivíduo para indivíduo ou de organismo para organismo, e é causada por um agente microbiano (por exemplo, resfriado comum). Exemplos de doenças infecciosas incluem doenças infecciosas virais, como AIDS (HIV), hepatite A, B ou C, herpes, herpes zoster (catapora), sarampo Alemão (vírus da rubéola), febre amarela, dengue etc. flavivírus, vírus influenza, doença infecciosa hemorrágica (vírus de Marburg ou Ebóla), e síndrome respiratória aguda severa (SARS), doenças infecciosas bacterianas, como doença de Legionnaire (Legionella), doenças sexualmente transmitidas (por exemplo, clamídia ou gonorreia), úlcera gástrica (Helicobacter), cólera (Vibrio), tuberculose, difteria, infecções por E.coli, Staphylococci, Salmonella ou Streptococci (tétano); infecções por patógenos protozoários como malária, doença do sono, leishmaniose; toxoplasmose, isto é, infecções por Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania e Toxoplasma; ou infecções fúngicas, que são causadas, por exemplo, por Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis ou Candida albicans.

[0189] O termo “doença autoimune” refere-se a qualquer doença em que o corpo produz uma resposta imunogênica (isto é, sistema imune) para algum constituinte de seu próprio tecido. Em outras palavras, o sistema imune perde sua capacidade de reconhecer algum tecido ou sistema dentro do corpo como próprio e direciona e ataca como se fosse estranho. Doenças autoimunes podem ser classificadas dentro daquelas em que predominantemente um organismo é afetado (por exemplo, anemia hemolítica e tireoidite anti-imune), e aquelas em que o processo de doença autoimune é difundido através de muitos tecidos (por exemplo, o lúpus eritematoso sistêmico). Por exemplo, pensa-se que a esclerose múltipla é causada por células T que atacam as bainhas que circundam as fibras nervosas do cérebro e da medula espinhal. Isto resulta em perda de coordenação, fraqueza, e visão embaçada. Doenças autoimunes são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, tireoidite de Hashimoto, doença de Grave, lúpus, esclerose múltipla, artrite reumática, anemia hemolítica, tireoidite anti-imune, lúpus eritematoso sistêmico, doença celíaca, doença de Crohn, colite, diabetes, escleroderma, psoríase, e similares.

[0190] De acordo com a invenção, uma resposta imune pode ser estimulada introduzindo em um sujeito um mRNA adequado que codifica um antígeno ou um fragmento do mesmo, por exemplo, um antígeno associado à doença.

[0191] O termo “antígeno” refere-se a um agente que compreende um epítopo contra o qual uma resposta imune será gerada. O termo “antígeno” inclui, em particular, proteínas, peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, especialmente RNA e DNA, e nucleotídeos. O termo “antígeno” também inclui agentes, que se tornam antigênicos - e sensibilizam - somente através de transformação (por exemplo, intermediariamente na molécula ou por conclusão com proteína corporal). Um antígeno é preferencialmente apresentável por células do sistema imune, como células apresentadoras de antígenos, similares a células dendríticas ou macrófagos. Além disso, um antígeno ou um produto de processo do mesmo é preferencialmente reconhecível por um receptor de células T ou B, ou por uma molécula de imunoglobulina como um anticorpo. Em uma realização preferencial, o antígeno é um antígeno associado à doença, como um antígeno associado ao tumor, um antígeno viral, ou um antígeno bacteriano.

[0192] O termo “antígeno associado à doença” é usado no sentido mais amplo para se referir a qualquer antígeno associado a uma doença. Um antígeno associado à doença é uma molécula que contém epítopos que estimularão um sistema imune do hospedeiro a produzir uma resposta imune antígeno-específica e/ou uma resposta de anticorpo humoral contra a doença. O antígeno associado à doença pode, portanto, ser usado para propósitos terapêuticos. Antígenos associados à doença são preferencialmente associados à infecção por micróbios, tipicamente antígenos microbianos, ou associado ao câncer, tipicamente tumores.

[0193] O termo “doença envolvendo um antígeno” refere-se a qualquer doença que implica um antígeno, por exemplo, uma doença que é caracterizada pela presença e/ou expressão de um antígeno. A doença envolvendo um antígeno pode ser uma doença infecciosa, uma doença autoimune, ou uma doença de câncer ou simplesmente câncer. Conforme mencionado acima, o antígeno pode ser um antígeno associado à doença, como um antígeno associado ao tumor, um antígeno viral, ou um antígeno bacteriano.

[0194] Em uma realização, um antígeno associado à doença é um antígeno associado ao tumor. Nesta realização, a presente invenção pode ser útil no tratamento de câncer ou metástase de câncer. Preferencialmente, o órgão ou tecido doente é caracterizado por células doentes, como células cancerosas que expressam um antígeno associado à doença e/ou sendo caracterizado por associação de um antígeno associado à doença com sua superfície. A imunização com antígenos associados ao tumor intactos ou substancialmente intactos ou fragmentos dos mesmos, como peptídeos ou ácidos nucleicos de MHC classe I e classe II, em particular, mRNA, que codifica esse antígeno ou fragmento torna-o possível de obter uma resposta tipo MHC classe I e/ou classe II e, assim, estimular células T como linfócitos T citotóxicos CD8+ que são capazes de lisar células cancerosas e/ou de células T CD4+. Essa imunização também pode obter uma resposta imune humoral (resposta de células B), resultando na produção de anticorpos contra o antígeno associado ao tumor. Além disso, células apresentadoras de antígenos (APC), como células dendríticas (DCs) podem ser carregadas com peptídeos apresentados de MHC classe I por transfecção com ácidos nucleicos que codificam antígenos tumorais in vitro e administradas a um paciente. Em uma realização, o termo “antígeno associado ao tumor” refere-se a um constituinte de células cancerosas que pode ser derivado a partir do citoplasma, da superfície celular e do núcleo celular. Em particular, refere-se aos antígenos que são produzidos, preferencialmente em grande quantidade, intracelularmente ou como antígenos de superfície nas células tumorais. Exemplos de antígenos tumorais incluem HER2, EGFR, VEGF, CAMPATH1-antígeno, CD22, CA-125, HLA-DR, linfoma de Hodgkin ou mucina- 1, mas não se limitam a isto.

[0195] De acordo com a presente invenção, um antígeno associado ao tumor preferencialmente compreende qualquer antígeno que é característico para tumores ou cânceres, bem como para tumores ou células cancerosas em relação ao tipo e/ou do nível de expressão. Em uma realização, o termo “antígeno associado ao tumor” refere-se a proteínas que estão sob condições normais, isto é, em um sujeito saudável, especificamente expressas em um número limitado de órgãos e/ou tecidos ou em estágios específicos de desenvolvimento, por exemplo, o antígeno associado ao tumor pode ser sob condições normais especificamente expressos no tecido do estômago, preferencialmente na mucosa gástrica, nos órgãos reprodutivos, por exemplo, nos testículos, no tecido trofoblástico, por exemplo, na placenta, ou em células de linhagem germinativa e são expressos ou aberrantemente expressos em um ou mais tecidos tumorais ou cancerosos. Neste contexto, “um número limitado” preferencialmente significa não mais que 3, mais preferencialmente não mais que 2 ou 1. Os antígenos associados ao tumor no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, antígenos de diferenciação, preferencialmente antígenos de diferenciação específicos de tipo celular, isto é, proteínas que são sob condições normais especificamente expressas em um determinado tipo celular em um determinado estágio de diferenciação, antígenos de câncer/testículo, isto é, proteínas que são sob condições normais especificamente expressas nos testículos e algumas vezes na placenta, e antígenos específicos de linhagem germinativa. No contexto da presente invenção, o antígeno associado ao tumor não é preferencialmente expresso ou é somente raramente expresso em tecidos normais ou é mutado em células tumorais. Preferencialmente, o antígeno associado ao tumor ou a expressão aberrante do antígeno associado ao tumor identifica células cancerosas. No contexto da presente invenção, o antígeno associado ao tumor que é expresso por uma célula cancerosa em um sujeito, por exemplo, um paciente que sofre de uma doença cancerosa, é preferencialmente uma autoproteína no dito sujeito. Em realizações preferenciais, o antígeno associado ao tumor no contexto da presente invenção é expresso sob condições normais especificamente em um tecido ou órgão que não é essencial, isto é, tecidos ou órgãos que quando danificados pelo sistema imunológico não leva à morte do sujeito, ou em órgãos ou estruturas do corpo que não são acessíveis ou apenas dificilmente acessíveis pelo sistema imune. Preferencialmente, um antígeno associado ao tumor é apresentado no contexto de moléculas MHC por uma célula cancerosa na qual ele é expresso.

[0196] Exemplos para diferenciação de antígenos que preenchem de maneira ideal os critérios para antígenos associados ao tumor, conforme contemplado pela presente invenção como estruturas alvo em imunoterapia tumoral, em particular, na vacinação tumoral são proteínas de superfície celular da família, Claudina, como CLDN6 e CLDN18.2. Estes antígenos de diferenciação são expressos em tumores de várias origens, e são particularmente adequados como estruturas alvo em conexão com imunoterapia de câncer mediada por anticorpos devido à sua expressão seletiva (sem expressão em uma toxicidade relevante ao tecido normal) e localização para a membrana plasmática.

[0197] Exemplos para antígenos que podem ser úteis na presente invenção são p53, ART-4, BAGE, beta-catenina/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV- E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (ou hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, preferencialmente MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11 ou MAGE- A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 menor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 ou RU2, SAGE, SART-1 ou SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE e WT, preferencialmente WT-1.

[0198] O termo “antígeno viral” refere-se a qualquer componente viral que tem propriedades antigênicas, isto é, sendo capaz de provocar uma resposta imune em um indivíduo. O antígeno viral pode ser uma ribonucleoproteína viral ou uma proteína de envelope.

[0199] O termo “antígeno bacteriano” refere-se a qualquer componente bacteriano que tem propriedades antigênicas, isto é, sendo capaz de provocar uma resposta imune em um indivíduo. O antígeno bacteriano pode ser derivado a partir da parede celular ou membrana do citoplasma da bactéria.

[0200] “Processamento de antígeno” refere-se à degradação de um antígeno nos produtos do processo que são fragmentos do dito antígeno (por exemplo, a degradação de uma proteína em peptídeos) e a associação de um ou mais destes fragmentos (por exemplo, através de ligação) com moléculas MHC para apresentação pelas células, preferencialmente células apresentadoras de antígenos para células T específicas.

[0201] O termo “resposta imune”, como usado no presente pedido, refere-se a uma reação do sistema imune, como para organismos imunogênicos, como bactérias ou vírus, células ou substâncias. O termo “resposta imune” inclui a resposta imune inata e a resposta imune adaptativa. Preferencialmente, a resposta imune está relacionado a uma ativação de células imunes, indução de biossíntese de citocinas e/ou produção de anticorpos. É preferencial que a resposta imune, compreenda as etapas de ativação de células apresentadoras de antígeno, como células dendríticas e/ou macrófagos, apresentação de um antígeno ou fragmento do mesmo pelas ditas células apresentadoras de antígenos e ativação de células T citotóxicas devido a esta apresentação.

[0202] O termo “tratar” ou “tratamento” refere-se a qualquer tratamento que aprimora o estado de saúde e/ou prolonga (aumenta) o expectativa de vida de um indivíduo. O dito tratamento pode eliminar a doença em um indivíduo, interromper ou retardar o desenvolvimento de uma doença em um indivíduo, inibir ou retardar o desenvolvimento de uma doença em um indivíduo, diminuir a frequência ou a severidade de sintomas em um indivíduo e/ou diminuir a recorrência em um indivíduo que tem atualmente ou que tinha anteriormente uma doença.

[0203] Em particular, o termo “tratamento de uma doença” inclui curar, encurtar a duração, melhorar, retardar ou inibir a progressão ou agravamento de uma doença ou dos sintomas da mesma.

[0204] O termo “imunoterapia” refere-se a um tratamento preferencialmente envolvendo uma reação imune específica e/ou função(ões) efetora(s) imune(s).

[0205] O termo “imunização” ou “vacinação” descreve o processo de tratamento de um sujeito para razões terapêuticas ou profiláticas.

[0206] O termo “sujeito” ou “indivíduo”, como usado no presente pedido, preferencialmente refere-se a mamíferos. Por exemplo, mamíferos no contexto da presente invenção são humanos, primatas não humanos, animais domésticos como cães, gatos, ovelhas, gado, cabras, porcos, cavalos etc., animais de laboratório como camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia, etc., bem como animais em cativeiro como animais de jardins zoológicos. Em uma realização preferencial, o sujeito é um humano.

[0207] O termo “célula apresentadora de antígeno” (APC) refere-se a uma célula de uma variedade de células capazes de exibir, adquirir e/ou apresentar pelo menos um antígeno ou fragmento antigênico sobre (ou na) sua superfície celular. Células apresentadoras de antígenos podem ser distinguidos em células apresentadoras de antígenos profissionais e células apresentadoras de antígenos não profissionais.

[0208] O termo “células apresentadoras de antígenos profissionais” refere-se a células apresentadoras de antígenos que expressam constitutivamente as moléculas classe II do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC classe II) necessárias para interação com células T virgens. Se uma célula T interage com o complexo da molécula classe de MHC na membrana da célula apresentadora de antígeno, a célula apresentadora de antígeno produz uma molécula coestimulatória que induz a ativação de células T. Células apresentadoras de antígenos profissionais compreendem células dendríticas e macrófagos.

[0209] O termo “células apresentadoras de antígenos não profissionais” refere-se a células apresentadoras de antígenos que não expressam constitutivamente moléculas de MHC classe II, mas mediante estimulação por certas citocinas como interferon-gama. Células apresentadoras de antígenos não profissionais, exemplares incluem fibroblastos, células epiteliais tímicas, células epiteliais da tireoide, células gliais, células beta pancreáticas ou células endoteliais vasculares.

[0210] O termo “complexo principal de histocompatibilidade” e a abreviação “MHC” incluem moléculas MHC classe I e MHC classe II e referem- se a um complexo de genes que ocorre em todos os vertebrados. Proteínas ou moléculas MHC são importantes para sinalização entre linfócitos e células apresentadoras de antígenos ou células doentes em reações imunes, em que as proteínas ou moléculas MHC se ligam a peptídeos e apresentam os mesmos para reconhecimento por receptores de células T. As proteínas codificadas pelo MHC são expressas na superfície das células e exibem ambos os autoantígenos (fragmentos peptídicos da própria célula) e não autoantígenos (por exemplo, fragmentos de microrganismos invasores) para uma célula T.

[0211] De acordo com a invenção o termo “receptor de antígeno quimérico (CAR)” é sinônimo dos termos “receptor de células T quiméricas” e “receptor de células T artificial”.

[0212] Estes termos referem-se a receptores elaborados geneticamente, que conferem uma especificidade de arbitrariedade, como a especificidade de um anticorpo monoclonal sobre uma célula efetora imune, como células T. Desta forma, um grande número de células T específicas para câncer pode ser gerado para transferência de células adotivas. Desta forma, um CAR pode estar presente em células T, por exemplo, ao invés de ou em adição ao receptor de células T próprio das células T. Essa células T não exigem necessariamente o processamento e apresentação de um antígeno para reconhecimento das células alvo, mas de preferência podem reconhecer preferencialmente com especificidade qualquer antígeno presente em uma célula alvo. Preferencialmente, o dito CAR é expresso na superfície das células. Para o propósito da presente invenção, as células T que compreendem um CAR são compreendidas pelo termo “células T”, como usado no presente pedido.

[0213] De acordo com a invenção, o termo “CAR” (ou “receptor de antígeno quimérico”) refere-se a um receptor artificial que compreende uma molécula única ou um complexo de moléculas que reconhece, isto é, liga-se a, uma estrutura alvo (por exemplo,um antígeno) em uma célula alvo como uma célula cancerosa (por exemplo, por ligação de um domínio de ligação ao antígeno a um antígeno expresso na superfície das células alvo) e pode conferir especificidade sobre uma célula efetora imune, como uma célula T que expressa o dito CAR na superfície celular. Preferencialmente, o reconhecimento da estrutura alvo por um CAR resulta em ativação de uma célula efetora imune que expressa o dito CAR. Um CAR pode compreender uma ou mais unidades de proteína das ditas unidades de proteína que compreendem um ou mais domínios, conforme descrito no presente pedido. O termo “CAR” não inclui receptores de células T.

[0214] Em uma realização, um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado a partir de um anticorpo monoclonal é fusionado à transmembrana e endodomínio CD3-zeta. Essas moléculas resultam na transmissão de um sinal zeta em resposta ao reconhecimento pelo scFv de seu antígeno alvo em uma célula alvo e morte das células alvo que expressam o antígeno alvo. Os domínios de reconhecimento de antígenos que também podem ser usados incluem entre outros cadeias únicas alfa e beta do receptor de células T (TCR). Na realidade, quase tudo que se liga a um determinado alvo com alta afinidade pode ser usado como um domínio de reconhecimento de antígeno.

[0215] Após reconhecimento do antígeno, o agrupamento de receptores e um sinal são transmitidos para a célula. A este respeito, um “domínio de sinalização de células T” é um domínio, preferencialmente um endodomínio, que transmite um sinal de ativação à célula T depois que o antígeno é ligado. O mais comumente usado componente de endodomínio é CD3-zeta.

[0216] A terapia de transferência de células adotivas com células T elaboradas geneticamente que expressam receptores de antígenos quiméricos é uma terapêutica anticâncer promissora, visto que células T modificadas por CAR podem ser elaboradas geneticamente para direcionar virtualmente qualquer antígeno tumoral. Por exemplo, as células T do paciente podem ser elaboradas geneticamente (modificadas geneticamente) para expressar CARs especificamente direcionados para antígenos nas células tumorais do paciente, em seguida, infundidas de volta no paciente.

[0217] De acordo com a invenção, um CAR pode substituir a função de um receptor de células T e, em particular, podem conferir reatividade como atividade citolítica para uma célula como uma célula T. No entanto, em contraste à ligação do receptor de células T a um complexo peptídeo de antígeno-MHC, um CAR pode se ligar a um antígeno, em particular quando expresso na superfície celular.

[0218] De acordo com a invenção, os CARs geralmente podem incluir três domínios.

[0219] O primeiro domínio é o domínio de ligação que reconhece e liga o antígeno.

[0220] O segundo domínio é o domínio de coestimulação. O domínio de coestimulação serve para melhorar a proliferação e a sobrevivência dos linfócitos citotóxicos mediante ligação do CAR a um componente direcionado. A identidade do domínio de coestimulação é limitado somente porque ele tem a capacidade de melhorar a proliferação celular e a sobrevivência mediante ligação do componente direcionado pelo CAR. Domínios de coestimulação adequados incluem CD28, CD137 (4-1BB), um membro da família do receptor de fator de necrose tumoral (TNF), CD134 (OX40), um membro da superfamília de receptores TNFR, e CD278 (ICOS), uma molécula coestimulatória da superfamília-CD28 expressa nas células T ativadas. O técnico no assunto entenderá que variantes da sequência destes domínios de coestimulação registrados podem ser usadas sem impactar adversamente a invenção, onde as variantes têm a mesma atividade ou similar, como o domínio no qual elas são modeladas. Essas variantes terão pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos do domínio a partir do qual elas são derivadas. Em algumas realizações da invenção, os constructos CAR compreendem dois domínios de coestimulação. Enquanto as combinações particulares incluem todas as variações possíveis dos quatro domínios registrados, exemplos específicos incluem CD28+CD137 (4-1 BB) e CD28+CD134 (OX40).

[0221] O terceiro domínio é o domínio de sinalização de ativação (ou domínio de sinalização de células T). O domínio de sinalização de ativação serve para ativar linfócitos citotóxicos mediante ligação do CAR ao antígeno. A identidade do domínio de sinalização de ativação é limitada somente porque ela tem a capacidade de induzir ativação dos linfócitos citotóxicos selecionados mediante ligação do antígeno pelo CAR. Os domínios de sinalização de ativação adequados incluem a cadeia CD3(zeta) de células T e o receptor Fc (gama). O técnico no assunto entenderá que variantes da sequência destes domínios de sinalização de ativação registrados podem ser usadas sem impactar adversamente a invenção, onde as variantes têm a mesma atividade ou similar, como o domínio no qual elas são modeladas. Essas variantes terão pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos do domínio a partir do qual elas são derivadas.

[0222] CARs podem compreender os três domínios, juntos sob a forma de uma proteína de fusão. Essas proteínas de fusão geralmente compreenderão um domínio de ligação, um ou mais domínios de coestimulação, e um domínio de sinalização de ativação, ligados em uma direção N-terminal para C-terminal. No entanto, os CARs não são limitados a esta disposição e outras disposições são aceitáveis e incluem um domínio de ligação, um domínio de sinalização de ativação, e um ou mais domínios de coestimulação. Deve-se entender que devido ao domínio de ligação estar livre para ligação ao antígeno, a colocação do domínio de ligação na proteína de fusão geralmente será de modo que é obtida a exibição da região no exterior da célula. Da mesma maneira, devido ao fato da coestimulação e dos domínios de sinalização de ativação servirem para induzir a atividade e proliferação dos linfócitos citotóxicos, a proteína de fusão geralmente exibirá estes dois domínios no interior da célula. Os CARs podem incluir elementos adicionais, como um peptídeo sinal para assegurar a exportação adequada da proteína de fusão para a superfície das células, um domínio transmembrana para assegurar que a proteína de fusão seja mantida como uma proteína de membrana integral e um domínio dobradiça (ou região espaçadora) que conferere flexibilidade ao domínio de ligação e permite forte ligação ao antígeno.

[0223] As células usadas em conjunto com o sistema CAR da presente invenção são preferencialmente células T, em particular, linfócitos citotóxicos, preferencialmente selecionados a partir de células T citotóxicas, células exterminadoras naturais (Natural Killer - NK) e células exterminadoras ativadas por linfocinas (LAK). Após ativação, cada um destes linfócitos citotóxicos aciona a destruição de células alvo. Por exemplo, células T citotóxicas acionam a destruição de células alvo por um ou ambos dos seguintes meios. Primeiro, mediante ativação de células T libera citotoxinas como perforina, granzimas e granulisina. A perforina e granulisina criam poros na célula alvo, e as granzimas entram na célula e acionam uma cascata de caspase no citoplasma, que induz a apoptose (morte celular programada) da célula. Segundo, a apoptose pode ser induzida através de interação de ligante Fas-Fas entre as células T e células alvo. Os linfócitos citotóxicos serão preferencialmente células autólogas, embora células heterólogas ou células alogênicas possam ser usadas.

[0224] Uma variedade de métodos pode ser usada para introduzir constructos CAR em células T, incluindo transfecção de DNA não baseada em vírus, sistemas baseados em transposon e sistemas baseados em vírus. A transfecção de DNA não baseada em vírus tem baixo risco de mutagênese insercional. Os sistemas baseados em transposon podem integrar transgenes de forma mais eficiente do que plasmídeos que não contêm um elemento de integração. Os sistemas baseados em vírus incluem o uso de vetores Y-retrovírus e lentivirais. Os Y-retrovírus são relativamente fáceis de se produzir, eficientemente e permanentemente transduzem células T, e têm preliminarmente segurança comprovada a partir de um ponto de vista de integração em células T humanas primárias. Vetores lentivirais também transduzem eficientemente e permanentemente células T mas são mais caros para fabricação. Eles também são potencialmente mais seguros do que sistemas baseados em retrovírus.

[0225] O RNA descrito no presente pedido (por exemplo, obtido com o uso de uma molécula de ácido nucleico descrita no presente pedido como um molde de transcrição) também é útil na reprogramação ou desdiferenciação de células somáticas em células similares às tronco, isto é, células que têm características de célula-tronco, in vitro ou in vivo. Isto pode envolver a expressão temporária de fatores de reprogramação in vitro ou in vivo, a fim de iniciar a reprogramação ou processos de desdiferenciação em células. Desta forma, em uma realização, o peptídeo ou proteína codificada por um ácido nucleico como RNA descrito no presente pedido é um fator que permite a reprogramação de células somáticas para células que têm características de célula-tronco. Células similares às tronco podem ser fornecidas de acordo com a invenção, sem gerar embriões ou fetos. Desdiferenciação de células somáticas para células que têm características de célula-tronco, em particular, pluripotencialidade, pode ser efetuada introduzindo fatores que codificam RNA que induzem a desdiferenciação de células somáticas em células somáticas (também denominado de fatores de transcrição de reprogramação (rTF)) e o cultivo de células somáticas que permitem que as células se desdiferenciem. Depois de serem desdiferenciadas, as células podem ser induzidas para se rediferenciarem no mesmo ou em um tipo de células somáticas diferente como, neuronal, hematopoiético, muscular, epitelial e outros tipos de células. Desta forma, células similares às tronco têm aplicações médicas para tratamento de doenças degenerativas por “terapia celular” e podem ser usadas em novas estratégias terapêuticas no tratamento de disfunções cardíacas, neurológicas, endocrinológicas, vasculares retinais, dermatológicas, musculoesqueléticas, e outras doenças.

[0226] Consequentemente, a invenção também se refere a um método para fornecer células que têm características de células-tronco que compreendem as etapas de (i) fornecer uma população celular que compreende células somáticas, (ii) introduzir o RNA da invenção capaz de expressar um ou mais fatores que permitem a reprogramação das células somáticas para células que têm características de células-tronco em células somáticas, e (iii) permitir o desenvolvimento de células que têm características de células-tronco. Em uma realização, o método ainda compreende introduzir nas células somáticas miRNA que melhora a reprogramação das células somáticas para células que têm características de células-tronco.

[0227] Em uma realização, um ou mais fatores incluem OCT4 e SOX2. Um ou mais fatores podem ainda compreender KLF4 e/ou c-MYC e/ou NANOG e/ou LIN28. Em uma realização, um ou mais fatores compreendem OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC e podem ainda compreender LIN28 e opcionalmente NANOG. Em uma realização, um ou mais fatores incluem OCT4, SOX2, NANOG e LIN28.

[0228] Em uma realização, a método ainda compreende a etapa de cultivo das células somáticas na presença de pelo menos um inibidor de histona desacetilase, em que pelo menos um inibidor de histona desacetilase preferencialmente compreende ácido valpróico, butirato de sódio, tricostatina A e/ou Scriptaid.

[0229] Em uma realização, a etapa iii) compreende cultivar as células somáticas sob condições de cultura de células-tronco embrionárias.

[0230] Em uma realização, as características das células-tronco compreendem uma morfologia de célula-tronco embrionária.

[0231] Em uma realização, as células que têm características de células-tronco têm cariótipos normais, expressam atividade de telomerase, expressam marcadores de superfície celular que são características para células-tronco embrionárias e/ou expressam genes que são característicos para células-tronco embrionárias.

[0232] Em uma realização, as células que têm características de células-tronco exibem um estado pluripotente.

[0233] Em uma realização, as células que têm características de células-tronco têm o potencial de desenvolvimento para se diferenciar em derivativos avançado de todas as três camadas germinativas primárias.

[0234] Em uma realização, as células somáticas são fibroblastos como fibroblastos pulmonares, fibroblastos de prepúcio ou fibroblastos dérmicos. Preferencialmente, as células somáticas são células humanas.

[0235] Em uma realização, o RNA é introduzido em células somáticas por eletroporação ou lipofecção. Em uma realização, o RNA é introduzido nas células somáticas repetitivamente.

[0236] Em uma realização, a introdução de RNA capaz de expressar determinados fatores conforme divulgado no presente pedido em células somáticas resulta na expressão dos ditos fatores por um período prolongado período de tempo, preferencialmente por pelo menos 10 dias, preferencialmente por pelo menos 11 dias e mais preferencialmente por pelo menos 12 dias. Para obter essa expressão de longo prazo, o RNA é preferencialmente periodicamente (isto é, repetitivamente) introduzidos nas células mais de uma vez, preferencialmente com o uso de eletroporação. Preferencialmente, o RNA é introduzido nas células pelo menos duas vezes, mais preferencialmente pelo menos 3 vezes, mais preferencialmente pelo menos 4 vezes, ainda mais preferencialmente pelo menos 5 vezes até preferencialmente 6 vezes, mais preferencialmente até 7 vezes ou ainda até 8, 9 ou 10 vezes, preferencialmente, durante um período de tempo de pelo menos 10 dias, preferencialmente por pelo menos 11 dias e mais preferencialmente por pelo menos 12 dias para assegurar a expressão de um ou mais fatores para um período prolongado de tempo. Preferencialmente, os períodos de tempo decorridos entre as repetidas introduções do RNA são de 24 horas a 120 horas, preferencialmente 48 horas a 96 horas. Em uma realização, os períodos de tempo decorridos entre as repetidas introduções do RNA não são mais do que 72 horas, preferencialmente não mais do que 48 horas ou 36 horas. Em uma realização, antes da eletroporação seguinte, permite-se que as células se recuperem da eletroporação anterior. Em qualquer caso, as condições devem ser selecionadas de modo que os fatores sejam expressos em células em quantidades e períodos de tempo que suportem o processo de reprogramação.

[0237] Uma “célula-tronco” é uma célula com a capacidade de autorrenovação, para permanecer indiferenciada, e tornar-se diferenciada. Uma célula-tronco pode se dividir sem limite, pelo menos pelo tempo de vida do animal no qual naturalmente reside. Uma célula-tronco não é terminalmente diferenciada; ela não está no estágio final de uma via de diferenciação. Quando uma célula-tronco se divide, cada célula-filha pode permanecer tanto em uma célula-tronco como embarcar em um curso que leva à diferenciação terminal.

[0238] Células-tronco totipotentes são células que têm propriedades de diferenciação totipotenciais e são capazes de se desenvolver em um organismo completo. Esta propriedade é possuída por células até o estágio de 8 células, após a fertilização do oócito pelo espermatozoide. Quando estas células são isoladas e transplantadas para o útero, podem se desenvolver em um organismo completo.

[0239] Células-tronco pluripotentes são células capazes de se desenvolver em várias células e tecidos derivados a partir das camadas ectodérmica, mesodérmica e endodérmica. Células-tronco pluripotentes que são derivadas a partir da massa celular interna de blastocistos, geradas 4-5 dias após a fertilização são chamadas “células-tronco embrionárias” e podem se diferenciar em várias outras células de tecido, mas não podem formar novos organismos vivos.

[0240] As células-tronco multipotentes são células-tronco que normalmente se diferenciam apenas em tipos celulares específicos para seus tecidos e órgãos de origem. Células-tronco multipotentes estão envolvidas não somente no crescimento e desenvolvimento de vários tecidos e órgãos durante o período fetal, neonatal e adulto, mas também na manutenção da homeostase do tecido adulto e na função de induzir a regeneração após o dano tecidual. Células multipotentes específicas para tecido são coletivamente chamadas de “células-tronco adultas”.

[0241] Uma “célula-tronco embrionária” ou “ESC” é um célula- tronco que está presente ou isolado a partir de um embrião. Pode ser pluripotente, tendo a capacidade de se diferenciar em cada uma e todas as células presentes no organismo, ou multipotente com a capacidade de se diferenciar em mais de um tipo de célula.

[0242] Como usado no presente pedido, “embrião” refere-se a um animal nos estágios iniciais de seu desenvolvimento. Estes estágios são caracterizados por implantação e gastrulação, onde as três camadas germinativas são definidas e estabelecidas, e por diferenciação das camadas germinativas nos respectivos órgãos e sistemas de órgãos. As três camadas germinativas são o endoderma, ectoderma e mesoderma.

[0243] Um “blastocisto” é um embrião em um estágio inicial de desenvolvimento em que o óvulo fertilizado foi submetido a clivagem, e uma camada de células esféricas que circunda uma cavidade cheia de fluido está se formando, ou foi formada. Esta camada de células esféricas é o trofectoderma. Dentro do trofectoderma está um agrupamento de células designado de massa celular interna (ICM). O trofectoderma é o precursor da placenta, e o ICM é o precursor do embrião.

[0244] Uma célula-tronco adulta, também chamada de célula tronco somática, é uma célula-tronco encontrada em um adulto. Uma célula-tronco adulta é encontrada em um tecido diferenciado, pode renovar-se, e pode se diferenciar, com algumas limitações, para produzir tipos de células especializadas de seu tecido de origem. Exemplos incluem as células-tronco mesenquimais, células-tronco hematopoéticas e células haste neurais.

[0245] Uma “célula diferenciada” é uma célula madura que foi submetida a alterações de desenvolvimento progressivo para uma forma ou função mais especializada. Diferenciação celular é o processo em que uma célula se submete de madura para um tipo de célula evidentemente especializado. Células diferenciadas têm características distintas, realizam funções específicas, e são menos propensas a se dividir do que suas contrapartes menos diferenciadas.

[0246] Uma “célula indiferenciada”, por exemplo, uma célula imatura, embrionária ou primitiva, tipicamente tem uma aparência não específica, pode realizar múltiplas atividades específicas, e pode realizar deficientemente, se de modo algum, em funções tipicamente realizadas por células diferenciadas.

[0247] “Célula somática” refere-se a qualquer uma e todas as células diferenciadas e não inclui células-tronco, células germinativas ou gametas. Preferencialmente, “célula somática”, como usado no presente pedido, refere-se a uma célula terminalmente diferenciada.

[0248] Como usado no presente pedido, “comprometida” refere-se a células que são consideradas serem permanentemente comprometidas em uma função específica. As células comprometidas também são citadas como “células terminalmente diferenciadas”.

[0249] Como usado no presente pedido, “diferenciação” refere-se à adaptação de células para uma forma ou função particular. Nas células, a diferenciação leva a uma célula mais comprometida.

[0250] Como usado no presente pedido, “desdiferenciação” refere- se à perda de especialização em forma ou função. Nas células, desdiferenciação leva a uma célula menos comprometida.

[0251] Como usado no presente pedido “reprogramação” refere-se à redefinição do programa genético de uma célula. Uma célula reprogramada preferencialmente exibe pluripotencialidade.

[0252] Os termos “desdiferenciadas” e “reprogramadas” ou termos similares são usados de forma intercambiável no presente pedido para denotar células derivadas de células somáticas que têm características de células- tronco. No entanto, os ditos termos não se destinam a limitar a matéria em questão divulgada no presente pedido por considerações mecanicistas ou funcionais.

[0253] O termo “RNA que induz o desenvolvimento de características de células-tronco” ou “RNA capaz de expressar um ou mais fatores que permitem a reprogramação das células somáticas para células que têm características de células-tronco” refere-se ao RNA que quando introduzido em uma célula somática induz a célula a se diferenciar.

[0254] Como usado no presente pedido, “célula germinativa” refere- se a uma célula reprodutiva como um espermatócito ou um oócito, ou uma célula que irá se desenvolver em uma célula reprodutiva.

[0255] Como usado no presente pedido, “pluripotente” refere-se a células que podem dar origem a qualquer tipo celular exceto as células da placenta ou outras células de suporte do útero.

[0256] Termos como “célula que tem características de célula- tronco”, “célula que tem propriedades de célula-tronco” ou “célula similar a tronco” são usados no presente pedido para designar as células que, embora elas sejam derivadas de células não-tronco somáticas, exibem uma ou mais características típicas de células-tronco, em particular células-tronco embrionárias. Esses recursos incluem uma morfologia de célula-tronco embrionária como colônias compactas, de alta razão de núcleo para citoplasma e nucléolos proeminentes, cariótipos normais, expressão de atividade de telomerase, expressão de marcadores de superfície celular que são característicos para células-tronco embrionárias e/ou expressão de genes que são característicos para células-tronco embrionárias. Os marcadores de superfície celular que são característicos para as células-tronco embrionárias são, por exemplo, selecionados a partir do grupo que consiste em antígeno embrionário estágio específico-3 (SSEA-3), SSEA-4, antígeno relacionado ao tumor-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81 e TRA-2-49/6E. Os genes que são característicos para células-tronco embrionárias são selecionados, por exemplo, a partir do grupo que consiste em OCT4 endógeno, NANOG, fator de crescimento e diferenciação 3 (GDF3), expressão reduzida 1 (REX1), fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF4), gene específico para célula embrionária 1 (ESG1), gene associado à pluripotência do desenvolvimento 2 (DPPA2), DPPA4 e transcriptase reversa telomerase (TERT). Em uma realização, uma ou mais características típicas de células-tronco incluem pluripotência.

[0257] Em uma realização da invenção, as características das células-tronco compreendem uma morfologia de célula-tronco embrionária, em que a dita morfologia de célula-tronco embrionária preferencialmente compreende ciritérios morfológicos selecionados a partir do grupo que consiste em colônias compactas, de alta razão de núcleo para citoplasma e nucléolos proeminentes. Em certas realizações, as células que têm características de células-tronco têm cariótipos normais, expressam atividade de telomerase, expressam marcadores de superfície celular que são características para células-tronco embrionárias e/ou expressam genes que são característicos para células-tronco embrionárias. Os marcadores de superfície celular que são característicos para células-tronco embrionárias podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em antígeno embrionário estágio específico-3 (SSEA-3), SSEA-4, antígeno relacionado ao tumor-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81 e TRA-2- 49/6E e os genes que são característicos para células-tronco embrionárias podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em OCT4, NANOG endógeno, fator de crescimento e diferenciação 3 (GDF3), expressão reduzida 1 (REX1), fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF4), genes específico de células embrionárias 1 (ESG1), associado à pluripotência do desenvolvimento 2 (DPPA2), DPPA4 e transcriptase reversa telomerase (TERT).

[0258] Preferencialmente, as células que têm características de células-tronco são células somáticas desdiferenciadas e/ou reprogramadas. Preferencialmente, as células que têm características de células-tronco exibem as características essenciais de células-tronco embrionárias como um estado pluripotente. Preferencialmente, as células que têm características de células- tronco têm o potencial de desenvolvimento para se diferenciar em derivativos avançados de todas as três camadas germinais primárias. Em uma realização, a camada germinativa primária é a endoderme e a derivada avançada é tecido epitelial similar ao trato gastrointestinal (gut). Em uma realização adicional, a camada germinativa primária é a mesoderma e a derivada avançada é o músculo estriados e/ou cartilagem. Ainda em uma realização adicional, a camada germinativa primária é a ectoderma e a derivada avançada é o tecido neural e/ou tecido epidermal. Em uma realização preferencial, as células que têm características de células-tronco têm o potencial de desenvolvimento para se diferenciar em células neuronais e/ou de células cardíacas.

[0259] Em uma realização, as células somáticas são células-tronco embrionárias derivadas de células somáticas com um fenótipo mesenquimal. Em uma realização preferencial, as células somáticas são fibroblastos como fibroblastos fetais ou fibroblastos pós-natais, queratinócitos, preferencialmente folículo piloso derivado de queratinócitos. Em realizações adicionais, os fibroblastos são fibroblastos pulmonares, fibroblastos de prepúcio ou fibroblastos dérmicos. Em realizações particulares, os fibroblastos são fibroblastos conforme depositados na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC) sob o Catálogo n° CCL-186, conforme depositado na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC) sob o Catálogo n° CRL-2097 ou conforme depositado na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC) sob o Catálogo n° CRL-2522 ou conforme distribuído pela System Biosciences sob o catálogo n° PC501A-HFF. Em uma realização, os fibroblastos são fibroblastos dérmicos humanos adultos. Preferencialmente, as células somáticas são células humanas. De acordo com a presente invenção, as células somáticas podem ser modificadas geneticamente.

[0260] O termo “fator” de acordo com a invenção quando usado em conjunto com a expressão do mesmo por RNA inclui proteínas e peptídeos bem como derivados e variantes do mesmo. Por exemplo, o termo “factor” compreende OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 e c-MYC.

[0261] Os fatores podem ser de qualquer espécie animal, por exemplo, mamíferos e roedores. Exemplos de não mamíferos incluem, mas não se limitam a, humanos e primatas não humanos. Primatas incluem, mas não se limitam a seres humanos, chimpanzés, babuínos, macacos cinomolgos, e quaisquer outros macacos do Novo ou Velho Mundo. Roedores incluem, mas não se limitam a camundongo, rato, porquinho da Índia, hamster e gerbil.

[0262] De acordo com a presente invenção, um ou mais fatores capazes de permitir a reprogramação de células somáticas para células que têm características de células-tronco compreendem um conjunto de fatores selecionados a partir do grupo que consiste em (i) OCT4 e SOX2, (ii) OCT4, SOX2, e um ou ambos dentre NANOG e LIN28, (iii) OCT4, SOX2 e um ou ambos dentre KLF4 e c-MYC. Em uma realização, os ditos um ou mais fatores capazes de serem expressos pelo RNA compreendem OCT4, SOX2, NANOG e LIN28 ou OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC. Preferencialmente, o RNA é introduzido nas ditas células somáticas por eletroporação ou microinjeção. Preferencialmente, a invenção ainda compreende permitir o desenvolvimento de células que têm características de células-tronco, por exemplo, cultivando a célula somática sob condições de cultura de células-tronco embrionárias, preferencialmente condições adequadas para manter células-tronco pluripotentes em um estado indiferenciado.

[0263] OCT4 é um fator de transcrição dos fatores de transcrição POU eucariontes e um indicador de pluripotência de células-tronco embrionárias. É uma proteína de ligação a Octômeros maternalmente expressa. Observou-se que estão presentes em oócitos, na massa celular de blastócitos e também na célula germinativa primordial. O gene POU5F1 codifica a proteína OCT4. Sinônimos para o nome do gene incluem OCT3, OCT4, OTF3 e MGC22487. A presença de OCT4 em concentrações específicas é necessária para células tronco embrionárias haste para permanecerem indiferenciadas. Preferencialmente, “proteína OCT4” ou simplesmente “OCT4” refere-se a OCT4 humana.

[0264] Sox2 é um membro da família de genes Sox (box HMG relacionado a SRY) que codifica fatores de transcrição com um único domínio de ligação ao DNA de HMG. Descobriu-se que SOX2 controla células progenitoras neurais inibindo sua capacidade de se diferenciar. A repressão do fator resulta em delaminação da zona ventricular, que é seguida por uma saída do ciclo celular. Estas células também começam a perder o seu caráter progenitor através da perda de progenitor e de marcadores de diferenciação neuronais precoce. Preferencialmente, “proteína SOX2” ou simplesmente “SOX2” refere- se a SOX2 humana.

[0265] NANOG é um gene homeodomínio tipo NK-2, e tem sido proposto para desempenhar um papel chave na manutenção da pluripotência de células-tronco, presumivelmente, regulando a expressão de genes críticos para renovação e diferenciação de células-tronco embrionárias. NANOG se comporta como um ativador de transcrição com dois domínios de ativação extraordinariamente fortes incorporados em sua terminação C. A redução de expressão de NANOG induz a diferenciação de células-tronco embrionárias. Preferencialmente, “proteína NANOG” ou simplesmente “NANOG” refere-se a NANOG humana.

[0266] LIN28 é uma proteína citoplasmática conservada, com um pareamento incomum de motivos de ligação a RMA: um domínio de choque frio e um par de dedos de zinco CCHC tipo retrovirais. Em mamíferos, é abundante em diversos tipos de células indiferenciadas. Em células de mamíferos pluripotentes, LIN28 é observada em complexos sensíveis a RNase com Proteína de Ligação a Poli(A), e em frações polissomais de gradientes de sacarose, sugerindo que é associada a tradução de mRNAs. Preferencialmente, “proteína LIN28” ou simplesmente “LIN28” refere-se a LIN28 humana.

[0267] Fator similar a Krueppel (KLF4) é um fator de transcrição dedo de zinco, que é fortemente expresso em células epiteliais pós-mitóticas de diferentes tecidos, por exemplo, o cólon, o estômago e a pele. O KLF4 é essencial para a diferenciação de terminal destas células e envolvido na regulação do ciclo celular. Preferencialmente, “proteína KLF4” ou simplesmente “KLF4” refere-se a KLF4 humana.

[0268] MYC (cMYC) é um proto-oncogene, que é superexpresso em uma ampla variedade de cânceres humanos . Quando ele é especificamente mutado ou superexpresso, aumenta a proliferação celular e funciona como um oncogene. O gene MYC codifica um fator de transcrição que regula a expressão de 15% de todos os genes através da ligação em sequências Enhancer Box (caixas E) e recrutamento de histona acetiltransferases (HATs). MYC pertence à família MYC de fatores de transcrição, que também inclui os genes N-MYC e L- MYC. Os fatores de transcrição da família MYC contêm o domínio bHLH/LZ (Zíper de Leucina Hélice-Alça-Hélice). Preferencialmente, a “proteína cMYC” ou simplesmente “cMYC” refere-se a cMYC humano.

[0269] Uma referência a fatores específicos no presente pedido, como OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 ou c-MYC deve ser entendido de modo a incluir todas as variantes destes fatores. Em particular, será entendido de modo a incluir também todas as variantes de splicing, variantes modificadas pós-tradução, conformações, isoformas e espécies homólogas desses fatores que são naturalmente expressos por células.

[0270] O termo “miRNA” (microRNA) refere-se a RNAs não codificadores com 21 a 23 nucleotídeos de comprimento encontrados em células eucariontes que, induzindo a degradação e/ou prevenindo a tradução de mRNAs alvos, modulam uma infinidade de funções celulares, incluindo os relacionadas à autorrenovação/diferenciação do ESC e a progressão do ciclo celular. miRNAs são reguladores pós-transcricionais que se ligam a sequências complementares nos transcritos de RNA mensageiro alvo (mRNAs), geralmente resultando na repressão da tradução ou degradação alvo e silenciamento gênico. Descobriu- se que miRNAs na combinação correta são capazes de induzir reprogramação celular direta de células somáticas para células que têm características de células-tronco in vitro. Por exemplo, observou-se que o agrupamento de miRNA 302-367 melhora a reprogramação de células somáticas.

[0271] Preferencialmente, a etapa para permitir o desenvolvimento de células que têm características de células-tronco compreende cultivar as células somáticas sob condições de cultura de células-tronco embrionárias, preferencialmente condições adequadas para manter as células-tronco pluripotentes em um estado indiferenciado.

[0272] Preferencialmente, para permitir o desenvolvimento de células que têm características de células-tronco, as células são cultivadas na presença de um ou mais inibidores de DNA metiltransferase e/ou um ou mais inibidores de histona desacetilase. Compostos preferenciais são selecionados a partir do grupo que consiste em 5’-azacitidina (5’-azaC), ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA), dexametasona, tricostatina A (TSA), butirato de sódio (NaBu), Scriptaid e ácido valproico (VPA). Preferencialmente, as células são cultivadas na presença de ácido valproico (VPA), preferencialmente em uma concentração entre 0,5 e 10 mM, mais preferencialmente entre 1 e 5 mM, com a máxima preferência em uma concentração de cerca de 2 mM.

[0273] Os métodos da presente invenção podem ser usados para efetuar a desdiferenciação de qualquer tipo de célula somática. As células que podem ser usadas incluem células que podem ser desdiferenciadas ou reprogramadas pelos métodos da presente invenção, em particular, as células que são totalmente ou parcialmente diferenciadas, mais preferencialmente terminalmente diferenciadas. Preferencialmente, a célula somática é uma célula diploide derivada de organismos pré-embrionários, embrionários, fetais e multicelulares pós-natal. Exemplos de células que podem ser usadas incluem, mas não se limitam a fibroblastos, como fibroblastos fetais e neonatais ou fibroblastos adultos, queratinócitos, em particular queratinócitos primários, mais preferencialmente queratinócitos derivados do cabelo, células adiposas, células epiteliais, células epidérmicas, condrócitos, células do cumulus, células neurais, células da glia, astrócitos, células cardíacas, células esofágicas, células musculares, melanócitos, células hematopoiéticas, osteócitos, macrófagos, monócitos e células mononucleares.

[0274] As células com as quais os métodos da invenção podem ser usados podem ser de qualquer espécie animal, por exemplo, mamíferos e roedores. Exemplos de células de mamíferos que podem ser desdiferenciadas e rediferenciadas pela presente invenção incluem, mas não se limitam a células humanas e de primatas não humanos. Células de primatas com as quais a invenção pode ser realizada incluem, mas não se limitam a células de humanos, chimpanzés, babuínos, macacos cinomolgos, e quaisquer outros macacos do Novo ou Velho Mundo. Células de roedores com as quais a invenção pode ser realizada incluem, mas não se limitam a de camundongo, rato, porquinho da Índia, hamster e células gerbil.

[0275] Espera-se que células desdiferenciadas preparadas de acordo com a presente invenção exibam muitos dos mesmos requisitos que células-tronco pluripotentes e podem ser expandidas e mantidas em condições usadas para células tronco embrionárias, por exemplo, meio de células ES ou qualquer meio que suporta o crescimento das células embrionárias. Células- tronco embrionárias conservam a sua pluripotência in vitro quando mantidas em fibroblastos fetais inativados como fibroblastos embrionários de camundongo irradiados ou fibroblastos humanos (por exemplo, fibroblastos do prepúcio humano, fibroblastos de pele humana, fibroblastos do endométrio humano, fibroblastos do oviduto humano) em cultura. Em uma realização, as células alimentadoras humanas podem ser células alimentadoras autólogas derivadas da mesma cultura de células reprogramadas por diferenciação direta.

[0276] Além disso, células-tronco embrionárias humanas podem ser propagadas com sucesso em Matrigel em um meio condicionado por fibroblastos fetais de camundongo. Células-tronco humanas podem ser cultivadas em cultura por período prolongado de tempo e permanecem indiferenciadas sob condições de cultura específicas.

[0277] Em certas realizações, as condições de cultura celular podem incluir colocar as células em contato com fatores que podem inibir a diferenciação ou, de outra forma, potencializar a desdiferenciação de células, por exemplo, prevenindo a diferenciação de células em células não ES, trofectoderma ou outros tipos de células.

[0278] Células desdiferenciadas preparadas de acordo com a presente invenção podem ser avaliadas por métodos que incluem monitoramento de alterações no fenótipo das células e caracterização de seus genes e expressão de proteínas. A expressão do gene pode ser determinada por RT-PCR, e produtos de tradução podem ser determinados por imunocitoquímica e Western blotting. Em particular, células desdiferenciadas podem ser caracterizadas por determinar o padrão de expressão gênica e se as células reprogramadas exibem um padrão de expressão gênica similar ao padrão de expressão esperado de células de controle indiferenciadas pluripotentes como células-tronco embrionárias com o uso de técnicas bem conhecidas na técnica incluindo transcriptomas.

[0279] A expressão dos seguintes genes de células desdiferenciadas pode ser avaliada a este respeito: OCT4, NANOG, fator de crescimento e diferenciação 3 (GDF3), expressão reduzida 1 (REX1), fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF4), gene específico para células embrionárias 1 (ESG1), associado à pluripotência do desenvolvimento 2 (DPPA2), DPPA4, transcriptase reversa telomerase (TERT), antígeno embrionário 3 (SSEA-3), SSEA-4, antígeno relacionado ao tumor-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81 e TRA-2- 49/6E.

[0280] As células-tronco indiferenciadas ou embrionárias para a qual as células reprogramadas podem ser comparadas podem ser da mesma espécie que as células somáticas diferenciadas. De maneira alternativa, as células-tronco indiferenciadas ou embrionárias para a qual as células reprogramadas podem ser comparadas podem ser de uma espécie diferente das células somáticas diferenciadas.

[0281] Em algumas realizações, uma similaridade no padrão de expressão gênica existe entre uma célula reprogramada e uma célula indiferenciada, por exemplo, célula-tronco embrionária, se determinados genes expressos especificamente em uma célula indiferenciada também são expressos na célula reprogramada. Por exemplo, determinados genes, por exemplo, telomerase, que são tipicamente indetectáveis em células somáticas diferenciadas podem ser usados para monitorar a extensão da reprogramação. Da mesma forma, para certos genes, a ausência de expressão pode ser usada para avaliar a extensão da reprogramação.

[0282] A capacidade de autorrenovação, marcada por indução da atividade de telomerase, é outra característica de células-tronco que pode ser monitorada em células desdiferenciadas.

[0283] A análise cariotípica pode ser realizada por meio da dispersão do cromossomo a partir das células mitóticas, cariotipagem espectral, ensaios de comprimento do telômero, hibridização genômica total, ou outras técnicas bem conhecidas.

[0284] Usando a presente invenção, os fatores apropriados que codificam RNA são incorporados em uma ou mais células somáticas, por exemplo, por eletroporação. Após a incorporação, as células são cultivadas preferencialmente com o uso de condições que suportam a manutenção de células desdiferenciadas (isto é, condições de cultura de células-tronco). As células desdiferenciadas podem então ser expandidas e induzidas para se rediferenciarem em tipos diferentes de células somáticas que são necessárias para terapia celular. As células desdiferenciadas obtidas de acordo com a presente invenção podem ser induzida para se diferenciarem em um ou mais tipos de células somáticas desejados in vitro ou in vivo.

[0285] Preferencialmente, as células desdiferenciadas obtidas de acordo com a presente invenção podem dar origem a células a partir de qualquer uma das três camadas germinativas embrionárias, isto é, endoderma, mesoderma e ectoderma. Por exemplo, as células desdiferenciadas podem se diferenciar em músculo esquelético, esqueleto, derme da pele, tecido conjuntivo, sistema urogenital, coração, sangue (células linfáticas) e baço (mesoderma), estômago, cólon, fígado, pâncreas, bexiga urinária, revestimento da uretra, partes epiteliais da traqueia, pulmões, faringe, tireoide, paratireoide, intestino (endoderme); ou sistema nervoso central, retina e cristalino, cranial e sensorial, gânglios e nervos, células de pigmento, tecido conjuntivo da cabeça, epiderme, cabelos, glândulas mamárias (ectoderme). As células desdiferenciadas obtidas de acordo com a presente invenção podem ser rediferenciadas in vitro ou in vivo com o uso de técnicas conhecidas.

[0286] Em uma realização da presente invenção, as células reprogramadas resultantes dos métodos desta invenção são usadas para produzir progênie diferenciada. Desta forma, em um aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir células diferenciadas, que compreendem: (i) obter células reprogramadas com o uso dos métodos desta invenção; e (ii) induzir a diferenciação das células reprogramadas para produzir células diferenciadas. A etapa (ii) pode ser realizada in vivo ou in vitro. Além disso, a diferenciação pode ser induzida através da presença de fatores de diferenciação apropriados que podem ser tanto adicionados como estarem presentes in situ, por exemplo, em um organismo, órgão ou tecido em que as células reprogramadas foram introduzidas. As células diferenciadas podem ser usadas para derivar células, tecidos e/ou órgãos que são vantajosamente usados na área de transplante de célula, de tecido e/ou de órgãos. Se desejável, as modificações genéticas podem ser introduzidas, por exemplo, em células somáticas antes da reprogramação. As células diferenciadas da presente invenção preferencialmente não possuem a pluripotência de uma célula-tronco embrionária, ou uma célula germinativa embrionária, e são, em sua essência, células parcialmente ou totalmente diferenciadas tecido-específicas.

[0287] Uma vantagem dos métodos da presente invenção é que as células reprogramadas obtidas pela presente invenção podem ser diferenciadas antes da seleção, purificação ou estabelecimento de uma linhagem celular. Consequentemente em certas realizações, uma população heterogênea de células que compreende células reprogramadas são diferenciadas em um tipo celular desejado. Em uma realização, uma mistura de células obtida a partir dos métodos da presente invenção é exposta a um ou mais fatores de diferenciação e cultivada in vitro.

[0288] Métodos de diferenciação de células reprogramadas obtidas pelos métodos divulgados no presente pode compreender uma etapa de permeabilização da célula reprogramada. Por exemplo, células geradas por técnicas de reprogramação descritas no presente pedido ou, alternativamente, uma mistura heterogênea de células que compreende células reprogramadas, podem ser permeabilizadas antes da exposição a um ou mais fatores de diferenciação ou um extrato celular ou outra preparação que compreende fatores de diferenciação.

[0289] Por exemplo, células diferenciadas podem ser obtidas cultivando células reprogramadas indiferenciadas na presença de pelo menos um fator de diferenciação e selecionando células diferenciadas partir da cultura. A seleção de células diferenciadas pode estar baseada no fenótipo, como a expressão de certos marcadores celulares presentes em células diferenciadas ou por ensaios funcionais (por exemplo, a capacidade para realizar uma ou mais funções de um tipo celular diferenciado particular).

[0290] Em outra realização, as células reprogramadas de acordo com a presente invenção são geneticamente modificados através da adição, deleção ou modificação de suas sequências de DNA.

[0291] As células reprogramadas ou desdiferenciadas preparadas de acordo com a presente invenção ou células derivadas a partir das células reprogramadas ou desdiferenciadas são úteis na pesquisa e na terapia. Células pluripotentes reprogramadas podem ser diferenciadas em qualquer uma das células do corpo, incluindo, sem limitação, células da pele, cartilagem, osso, músculo esquelético, músculo cardíaco, renais, hepáticas, sangue e formadoras de sangue, precursoras vasculares e endoteliais vasculares, beta pancreáticas, neurônios, da glia, da retina, intestinais, neuronais, do pulmão e do fígado.

[0292] As células reprogramadas são úteis para terapia regenerativa/reparativa e podem ser transplantadas para um paciente com necessidade. Em uma realização, as células são autólogas com o paciente.

[0293] As células reprogramadas fornecidas de acordo com a presente invenção podem ser usadas, por exemplo, em estratégias terapêuticas no tratamento de doenças cardíacas, neurológicas, endócrinas, vasculares, da retina, dermatológicas, disfunções músculo-esqueléticas e outras.

[0294] Por exemplo, e não como uma limitação, as células reprogramadas da presente invenção podem ser usadas para repor células em animais cujas células naturais foram depletadas devido à idade ou terapia de ablação como radioterapia e quimioterapia de câncer. Em outro exemplo não limitante, as células reprogramadas da presente invenção são úteis na regeneração de órgãos e reparo de tecidos. Em uma realização da presente invenção, células reprogramadas podem ser usadas para revigorar o tecido muscular danificado, incluindo músculos distróficos e músculos danificados por eventos isquêmicos, como infartos do miocárdio. Em outra realização da presente invenção, as células reprogramadas divulgadas no presente pedido podem ser usadas para melhorar cicatrizes em animais, incluindo humanos, após uma lesão traumática ou cirurgia. Nesta realização, as células reprogramadas da presente invenção são administradas sistemicamente, como por via intravenosa, e migram para o local do tecido recém-traumatizado recrutadas por citocinas circulantes secretadas pelas células danificadas. Em outra realização da presente invenção, as células reprogramadas podem ser administradas localmente para um local de tratamento com necessidade, reparo ou regeneração.

[0295] Em uma realização da invenção, ácidos nucleicos como RNA são administrados a um paciente por métodos ex vivo, isto é, removendo as células de um paciente, modificando geneticamente as ditas células e reintroduzindo as células modificadas no paciente. Métodos de transfecção e transdução são conhecidos pelo técnico no assunto.

[0296] O termo “transfecção” refere-se à introdução de ácidos nucleicos, em particular, RNA, em uma célula. Para os propósitos da presente invenção, o termo “transfecção” também inclui a introdução de um ácido nucleico em uma célula ou a absorção de um ácido nucleico por essa célula, em que a célula pode estar presente em um sujeito, por exemplo, um paciente. Desta forma, de acordo com a presente invenção, uma célula para transfecção de um ácido nucleico descrito no presente pedido pode estar presente in vitro ou in vivo, por exemplo, a célula pode fazer parte de um órgão, um tecido e/ou um organismo de um paciente. De acordo com a invenção, a transfecção pode ser temporária ou estável. Para algumas aplicações de transfecção, é suficiente que o material genético transfectado seja apenas temporariamente expresso. Visto que o ácido nucleico introduzido no processo de transfecção geralmente não é integrado no genoma nuclear, o ácido nucleico estranho será diluído através de mitose ou degradado. Células que permitem a amplificação epissomal de ácidos nucleicos reduzem significativamente a taxa de diluição. Se for desejado que o ácido nucleico transfectado realmente permaneça no genoma da célula e suas células filhas, a transfecção estável deve ocorrer. O RNA pode ser transfectado para as células para expressar temporariamente sua proteína codificada.

[0297] De acordo com a presente invenção, pode ser usada uma técnica útil para introduzir, isto é, transferir ou transfectar ácidos nucleicos para as células. Preferencialmente, o RNA é transfectado para as células por técnicas padrão. Essas técnicas incluem eletroporação, lipofecção e microinjeção. Em uma realização particularmente preferencial da presente invenção, o RNA é introduzido nas células por eletroporação. A eletroporação ou eletropermeabilização refere-se a um aumento significativo na condutividade elétrica e permeabilidade da membrana plasmática da célula causada por um campo elétrico aplicado externamente. É normalmente usado em biologia molecular como uma forma de introduzir alguma substância em uma célula. De acordo com a invenção é preferencial que a introdução do ácido nucleico que codifica uma proteína ou peptídeo nas células resulte na expressão das dita proteína ou peptídeo.

[0298] De acordo com a invenção, os ácidos nucleicos podem ser direcionados para células particulares. Nessas realizações, um carreador usado para administrar um ácido nucleico para uma célula (por exemplo, um retrovírus ou um lipossomo) pode ter uma molécula de direcionamento ligada. Por exemplo, uma molécula como um anticorpo específico para uma proteína de membrana de superfície na célula alvo ou um ligante para um receptor na célula alvo pode ser incorporada ou ligada ao carreador de ácido nucleico. Se é desejada a administração de um ácido nucleico por lipossomos, proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície associada com endocitose podem ser incorporadas na formulação de lipossomo a fim de permitir direcionamento e/ou absorção. Essas proteínas incluem proteínas de capsídeo ou fragmentos das mesmas que são específicas para um tipo celular particular, anticorpos para proteínas que são internalizadas, proteínas que se direcionam a um local intracelular, e similares.

[0299] “Repórter” refere-se a uma molécula, tipicamente um peptídeo ou proteína, que é codificada por um gene repórter e medida em uma ensaio repórter. Os sistemas convencionais geralmente empregam um repórter enzimático e medem a atividade do dito repórter.

[0300] O termo “sítio de clonagem múltiplo” refere-se a uma região de ácido nucleico contendo sítios de enzima de restrição, qualquer um dos quais pode ser usadas para clivagem, por exemplo, de um vetor e inserção de um ácido nucleico.

[0301] De acordo com a invenção, dois elementos como nucleotídeos ou aminoácidos são consecutivos, se eles estiverem diretamente adjacentes entre si, sem qualquer interrupção. Por exemplo, uma sequência de x nucleotídeos consecutivos N refere-se à sequência (N)x.

[0302] “Endonuclease de restrição” ou “enzima de restrição” refere- se a uma classe de enzimas que cliva ligações fosfodiéster em ambas as fitas de uma molécula de DNA dentro de sequências de bases específicas. Elas reconhecem sítios de ligação específicos, citados como sequências de reconhecimento, em uma molécula de DNA de fita dupla. Os sítios nos quais as ditas ligações fosfodiéster no DNA são clivados pelas ditas enzimas são citados como sítios de clivagem. No caso de enzimas tipo IIS, o sítio de clivagem está localizado a uma distância do sítio de ligação de DNA. De acordo com a invenção, o termo “endonuclease de restrição” compreende, por exemplo, as enzimas SapI, EciI, BpiI, AarI, AloI, BaeI, BbvCI, PpiI and PsrI, BsrD1, BtsI, EarI, BmrI, BsaI, BsmBI, FauI, BbsI, BciVI, BfuAI, BspMI, BseRI, EciI, BtgZI, BpuEI, BsgI, MmeI, CspCI, BaeI, BsaMI, Mva1269I, PctI, Bse3DI, BseMI, Bst6I, Eam1104I, Ksp632I, BfiI, Bso31I, BspTNI, Eco31I, Esp3I, BfuI, Acc36I, AarI, Eco57I, Eco57MI, GsuI, AloI, Hin4I, PpiI e PsrI.

[0303] O termo “estabilidade” de RNA refere-se à “meia-vida” de RNA. “Meia-vida” abrange o período de tempo que é necessário para eliminar metade da atividade, quantidade ou número de moléculas. No contexto da presente invenção, a meia-vida de um RNA é indicativo para a estabilidade do dito RNA.

[0304] Os ácidos nucleicos como RNA descritos no presente pedido, em particular, quando usados para o tratamento descrito no presente pedido, podem estar presentes sob a forma de uma composição farmacêutica ou kit que compreende o ácido nucleico e, opcionalmente, um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis, diluentes e/ou excipientes.

[0305] Composições farmacêuticas são preferencialmente estéreis e contêm uma quantidade efetiva dos ácidos nucleicos.

[0306] As composições farmacêuticas geralmente são fornecidas em uma forma de dosagem uniforme e podem ser preparadas de uma maneira conhecida na técnica. A composição farmacêutica pode estar, por exemplo, sob a forma de uma solução ou suspensão.

[0307] A composição farmacêutica pode compreender sais, substâncias tampão, conservantes, carreadores, diluentes e/ou excipientes, todos os quais são preferencialmente farmaceuticamente aceitáveis. O termo “farmaceuticamente aceitável” refere-se a não toxicidade de um material que não interfere com a ação do(s) componente(s) ativo(s) da composição farmacêutica.

[0308] Sais que não são farmaceuticamente compatíveis podem ser usados para preparar sais farmaceuticamente aceitáveis e estão incluídos na invenção. Sais farmaceuticamente aceitáveis deste tipo compreendem, de uma maneira sem limitação, aqueles preparados a partir dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malônico, succínico, e similares. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser preparados como sais de metais alcalinos ou sais de metais alcalino-terrosos, como sais de sódio, sais de potássio ou sais de cálcio.

[0309] As substâncias tampão adequadas para uso na composição farmacêutica incluem ácido acético em um sal, ácido cítrico em um sal, ácido bórico em um sal e ácido fosfórico em um sal.

[0310] Conservantes adequados para uso na composição farmacêutica incluem cloreto de benzalcônio, clorobutanol, parabeno e timerosal.

[0311] O termo “carreador” refere-se a um componente orgânico ou inorgânico, de uma espécie natural ou não natural (sintética), com o qual o componente ativo é combinado a fim de facilitar, melhorar ou permitir aplicação. De acordo com a invenção, o termo “carreador” também inclui um ou mais filtros sólidos ou líquidos compatíveis, diluentes ou substâncias encapsuladoras que são adequadas para a administração a um paciente.

[0312] Possíveis substâncias carreadoras para administração parenteral são, por exemplo, água estéril, soluções de glicose, Ringer, lactato de Ringer, solução estéril de cloreto de sódio, polialquileno glicóis, naftalenos hidrogenados e, em particular, polímeros lactídeo biocompatíveis, copolímeros lactídeo/glicolídeo ou copolímeros polioxietileno/polioxipropileno.

[0313] O termo “excipiente” quando usado no presente pedido destina-se a indicar todas as substâncias que podem estar presentes em uma composição farmacêutica e que não são ingredientes ativos como, por exemplo, carreadores, ligantes, lubrificantes, espessantes, agentes ativos de superfície, conservantes, emulsificantes, tampões, agentes aromatizantes ou corantes.

[0314] As composições farmacêuticas descritas no presente pedido podem ser administradas por qualquer rota convencional, como por administração parenteral, incluindo por injeção ou infusão. A administração é preferencialmente por via parenteral, por exemplo, por via endovenosa, intraarterial, subcutânea, no linfonodo, por via intradérmica ou intramuscular.

[0315] Composições adequadas para administração parenteral geralmente compreendem uma preparação aquosa ou não aquosa estéril do composto ativo, que é preferencialmente isotônica para o sangue do receptor. Exemplos de carreadores compatíveis e solventes são solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, geralmente óleos fixos, estéreis são usados como meio de suspensão ou solução.

[0316] Os agentes e composições descritos no presente pedido são preferencialmente administrados em quantidades efetivas. Uma “quantidade efetiva” refere-se à quantidade que atinge uma reação desejada ou um efeito desejado sozinho ou em conjunto com doses adicionais. No caso de tratamento de uma doença particular ou de uma condição particular, a reação desejada preferencialmente refere-se à inibição do curso da doença. Isto compreende reduzir o progresso da doença e, em particular, interromper ou reverter o progresso da doença. A reação desejada em um tratamento de uma doença ou de uma condição também pode ser atraso do princípio ou uma prevenção do princípio da dita doença ou da dita condição.

[0317] Uma quantidade efetiva de um agente ou composição descrito no presente pedido dependerá da condição a ser tratada, da gravidade da doença, dos parâmetros individuais do paciente, incluindo idade, condição fisiológica, tamanho e peso, da duração do tratamento, do tipo de uma terapia de acompanhamento (se presente), da rota específica da administração e fatores similares. Consequentemente, as doses administradas dos agentes descritos no presente pedido podem depender de diversos destes parâmetros. No caso de uma reação em um paciente ser insuficiente com uma dose inicial, podem ser usadas doses maiores (ou doses efetivamente mais altas obtidas por uma rota de administração diferente, mais localizada).

[0318] A presente invenção é descrita em detalhes pelas seguintes figuras e exemplos que devem ser interpretados por meio de ilustração e não apenas a título de limitação. Com base na descrição e nos exemplos, realizações adicionais estão acessíveis ao técnico no assunto e estão também dentro do escopo da invenção.

FIGURAS

[0319] Figura 1: Visão geral do processo de seleção in vivo.

[0320] Para preparar a biblioteca inicial, células dendríticas imaturas humanas foram cultivadas na presença de Actinomicina D, um inibidor de transcrição, por cinco horas para pré-seleção de RNAs estáveis. O mRNA celular restante foi extraído e purificado com o uso do Kit Poly (A) Purist (Ambion) e depois fragmentado com Nuclease P1 (Roche). Para isso, 10 μg de RNA foram incubados por 45 minutos com 0,3 U NP-1 em 8μL de tampão NaAc 50 mM (pH 5,5) em um volume de reação total de 24 μL. Após purificação com colunas RNeasy (Qiagen), os fragmentos estavam prontos para serem transcritos de forma reversa em cDNA. A síntese da primeira e da segunda fita foi feita com o uso do Kit RevertAid Premium 1st strand cDNA synthesis (Fermentas) e seguindo o seu protocolo, e um primer hexâmero com uma sequência de primer definida e um sítio de restrição NotI. Para preencher saliências em 5’ e remover saliências em 3’, o cDNA foi incubado com 12,5 U de T4 DNA polimerase por 5 minutos a 15°C. A reação foi encerrada adicionando 5 μL de EDTA 0,5 mM, pH 8,0 e o cDNA foi purificado com o uso de colunas NucleoBond (Macherey-Nagel). A digestão da biblioteca de cDNA com NotI (NEB) produziu fragmentos com extremidades cegas e pegajosas. Os fragmentos foram adicionalmente selecionados por tamanho através de preparação de gel para garantir a remoção de todos os fragmentos menores que 150 bps. Para a clonagem da biblioteca, o vetor conforme mostrado no painel A foi digerido com EcoRV e NotI deixando uma extremidade cega e pegajosa, respectivamente. Na etapa seguinte, a biblioteca foi ligada ao vetor com o uso de ligase T4 DNA (Fermentas). A mistura de ligação foi usada diretamente como molde para PCR, conforme indicado na Tabela 4 com o uso de DNA Polimerase Phusion™ Hot Start High-Fidelity (Finnzymes). Após purificação, o produto de PCR foi usado como molde para a transcrição T7, conforme mostrado na Tabela 5. A incubação foi feita a 37°C. Após cada 30 minutos 0,75 μL de GTP 100 mM foram adicionados à reação. A reação foi interrompida após 2,5 horas adicionando TURBO DNase (2U/μL, Ambion) e incubanda por mais 15 minutos a 37°C. A reação foi finalmente limpa através de colunas RNeasy (Qiagen). A biblioteca de RNA pode então ser usada para o procedimento de seleção começando com eletroporação do RNA em hiDCs conforme descrito anteriormente (Kuhn et al, 2010). Após o cultivo para seleção, a extração e a purificação do RNA foram feitas com o uso de colunas RNeasy (Qiagen) e seguindo as instruções do fabricante. O RNA foi usado em seguida como molde para a síntese de cDNA com o uso de transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen) e seguindo as instruções do fabricante e um primer dT18. O cDNA foi usado como molde para PCR conforme descrito acima. Finalmente, os produtos de PCR puderam ser usados como molde para a transcrição T7 (consulte acima) para iniciar a rodada seguinte de seleção (painel B). Os controles de qualidade das amostras de DNA/cDNA e RNA foram feitos através de gel de agarose e bioanalyzer AGILENT 2100, respectivamente.

[0321] Figura 2: Esquema da aparência da amostra dentro do vetor luc2CPmut: (A) Um único elemento ou dois elementos (a montante e a jusante) foram clonados como 3'-UTRs no vetor conforme dado. São mostradas também são amostras de controle NEG (controle negativo sem inserção de 3’ UTR), hBg e 2hBg. Preparação de RNA para rodadas de seleção. (B) Para eletroporação em hiDCs, o vetor foi usado como molde para PCR com o uso de primers alongados que compreendem o promotor T7 e a cauda poli (A). O produto de PCR foi usado em seguida como molde para a síntese de T7 in vitro para produzir o respectivo IVT-RNA.

[0322] Figura 3: Efeito das sequências selecionadas sobre a estabilidade de RNAs que codificam luc2CPmut.

[0323] Os resultados mostram a atividade de luciferase, meia-vida e proteína total ao longo do tempo do RNA contendo as sequências selecionadas como 3’ UTR em comparação ao nosso padrão ouro 2hBg após eletroporação em células dendríticas imaturas humanas (NEG é conforme definido na Figura 2). O painel superior fornece a evolução temporal de três RNAs exemplares com 3’ UTRs conforme indicado. No painel esquerdo inferior, é mostrada a meia-vida dos RNAs com a respectiva 3’ UTR conforme indicado em relação a um RNA com 2hBg. De maneira similar, a expressão relativa da proteína total em comparação ao RNA com 2hBG é fornecida no painel direito inferior.

[0324] Figura 4: Atividade de luciferase representativa com o uso de luc2mut como gene repórter e 3’-UTRs recém-selecionadas.

[0325] Após eletroporação de RNAs com 3’ UTR conforme indicado em células dendríticas imaturas humanas, a atividade da luciferase foi medida ao longo de 72 horas.

[0326] Figura 5: Resultados representativos de eletroporação com IVT-RNAs em fibroblastos.

[0327] Painel esquerdo: vetor baseado em luc2CPmut. painel direito: vetor baseado em luc2mut.

[0328] Figura 6: Resultados representativos de eletroporação com IVT-RNAs em células T.

[0329] O painel mais à esquerda mostra a expressão da proteína total relativa de um RNA com a FI 3’ UTR em comparação ao RNA com 2hBG em células T CD4+ e CD8+. De maneira similar, a eficiência de tradução relativa e a meia-vida do mRNA de um RNA com a FI 3’ UTR em comparação ao RNA com 2hBG em células T CD4+ e CD8+ é dado no painel do meio e no painel mais à direita, respectivamente.

[0330] Figura 7: Arquitetura e integridade do RNA para testar RNAs com nucleotídeos modificados.

[0331] A: Os RNAs usados nos ensaios de Luciferase foram construídos conforme representados no presente pedido. Como capeamento 5’ foi usado β-S-ARCA (D2). Como 5'UTR, 5'UTR de alfa-globina humana foi usada, incluindo a sequência Kozak. Após o gene Luciferase de vagalume, as duas 3’ UTRs a serem comparadas foram clonadas. Como cauda poli A, uma sequência A30L70 foi usada.

[0332] B: Antes da transfecção, os RNAs foram verificados quanto à sua integridade em um Bioanalyzer 2100 (Agilent). Todos os RNAs tinham uma integridade suficientemente alta e também comparável e, portanto, puderam ser usados nos experimentos.

[0333] Figura 8: Efeito da FI 3’ UTR na estabilidade e funcionalidade do RNA in vivo.

[0334] O mRNA de Luciferase e o mRNA de gp70 que contêm FI 3’ UTR ou 2hBg 3’ UTR foram formulados com F12 e administrado por via intra venosa em camundongos BALB/c. Após a administração do mRNA de Luciferase, a expressão foi monitorada após 6 e 24 horas; o mRNA de gp70 foi administrado no dia 0 e no dia 6 e a ativação imune foi analisada no dia 10 através de coloração CD8 e gp70 tet +.

[0335] Mostra os níveis de expressão de Luciferase em 6 e 24 horas após a injeção de mRNA não modificado e modificado com m1Y contendo o FI 3’ UTR ou 2hBg 3’ UTR. Ambos os mRNA de Luciferase não modificados e modificados com m1Y contendo FI 3’ UTR mostram níveis de expressão comparáveis como o mRNA correspondente contendo 2hBg 3’ UTR.

[0336] Mostra a porcentagem de células T CD8 específicas para gp70 em resposta ao mRNA gp70 contendo FI 3’ UTR ou 2hBg 3’ UTR. As duas 3’ UTRs têm desempenho igualmente bom na indução de imunidade específica ao antígeno após duas imunizações, com um aumento significativo de células T CD8 específicas para o antígeno no baço daqueles camundongos que receberam mRNA gp70 contendo FI 3’ UTR.

[0337] Estatística: ANOVA unidirecional e pós-teste de Tukey, *p < 0,05.

[0338] Figura 9: Efeito da estabilização de UTRs na estabilidade do RNA autorreplicante.

[0339] A Luciferase Desestabilizada (Luc2CP) foi clonada imediatamente a montante do elemento da sequência 3’ conservada de um RNA autorreplicante derivado do RNA do vírus Semliki Forest não citotóxico (replicon). O replicon do RNA foi preparado por transcrição in vitro a partir de um plasmídeo linearizado correspondente e eletroporado nas células. A expressão da luciferase foi medida por adição de substrato luminescente por 96 a 120 horas. (A) Evolução temporal da expressão de luciferase em um experimento representativo com células BHK21. (B) Evolução temporal da expressão de luciferase em um experimento representativo com fibroblastos de prepúcio humano (HFF). Para reduzir a citotoxicidade dos interferons tipo I liberados, o mRNA B18Rdo vírus Vaccinia foi cotransfectado em cada amostra. Para inibir a ativação da proteína quinase R e aumentar o nível geral de tradução, o mRNA E3 do vírus Vaccinia foi cotransfectado em cada amostra.

[0340] Figura 10: trechos de homologia no elemento FI.

[0341] Os trechos de sequências sublinhados foram previstos por pares de bases uns com os outros. Para o constructo “mutação de 8 nucleotídeos”, o primeiro elemento foi mutado para aaagggcu para interromper as interações com o segundo elemento.

[0342] Figura 11: Artefatos em IVT baseado no molde de PCR com o uso de 2hBgUTR.

[0343] A: Representação esquemática da geração do molde IVT através de PCR. O primer 5’ se anela a montante do promotor T7, o primer 3' contém uma cauda poli A de 120 nt e se anela à poli A codificada pelo plasmídeo e parte da 3’ UTR. No caso de 2hBgUTR, um erro de incorporação por anelamento para primeira repetição pode ocorrer. B: Os produtos de PCR de um plasmídeo contendo 2hBgUTR. A seta vermelha representa o produto secundário, representando um truncamento de 1hBg. C: O RNA transcrito a partir desse produto de PCR, também apresenta, dessa forma, um subproduto encurtado (seta). D: Produtos de PCR de um plasmídeo contendo o elemento FI como 3’ UTR. Nenhum produto lateral é visível. E: O mRNA resultante é de alta integridade esperada sem picos laterais adicionais.

[0344] Figura 12: Representação esquemática dos elementos UTR truncados e meia-vida dos constructos de mRNA correspondentes.

[0345] O painel superior da figura A mostra uma representação esquemática dos elementos UTR truncados em referência às posições do ácido nucleico da sequência de comprimento total do elemento F de SEQ ID NO: coberto por essas variantes truncadas.

[0346] O painel inferior da figura A mostra a meia-vida relativa do mRNA que compreende a UTR truncada em referência ao mRNA que compreende a sequência de comprimento total do elemento F de SEQ ID NO: 86. Os mRNAs que codificam um repórter da Luciferase foram eletroporados nos hiDCs e sua expressão foi seguida ao longo do tempo por medições da Luciferase para determinar a meia-vida relativa do RNA.

[0347] O painel superior da figura B mostra uma representação esquemática dos elementos UTR truncados em referência às posições do ácido nucleico da sequência de comprimento total do elemento I de SEQ ID NO: 115 coberto por essas variantes truncadas.

[0348] O painel inferior da figura B mostra a meia-vida relativa do mRNA que compreende a UTR truncada em referência ao mRNA que compreende a sequência de comprimento total do elemento I de SEQ ID NO: 115. Os mRNAs que codificam um repórter da Luciferase foram eletroporados nos hiDCs e sua expressão foi seguida ao longo do tempo por medições da Luciferase para determinar a meia-vida relativa do RNA.

[0349] Figura 13: Meia-vida relativa e expressão proteica a partir de constructos de mRNA que compreendem elementos F, I ou FI para UTRs aleatórias.

[0350] A Figura 13 mostra a meia-vida relativa e a expressão proteica a partir de constructos de mRNA que compreendem elementos F, I ou FI para UTRs aleatórias. Para este comprimento inteiro, os elementos individuais F e I, bem como a combinação FI, foram comparados com uma 3’ UTR aleatória (257 nucleotídeos de comprimento). Todos os elementos foram clonados em constructos que codificam a luciferase, transcritos in vitro para o mRNA, eletroporadas nos hiDCs, a expressão da luciferase foi medida ao longo do tempo e as médias relativas da meia-vida e expressão proteica total foram calculadas.

[0351] Figura 14: Elementos UTR para reprogramação celular.

[0352] A Figura 14A mostra a linha de tempo para a reprogramação de fibroblastos primários de prepúcio humano. 40.000 células foram plaqueadas em uma a placa de 12 poços e lipofectadas por três (3x) ou quatro (4x) dias consecutivos com misturas de mRNA que eram compostas por 0,33μg de RNA transcrito in vitro (IVT) não modificado que codifica a reprogramação TF OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG e LIN28 (OSKMNL) (1:1:1:1:1:1) com 0,08 μg de cada B18R, E3 e K3 (EKB) e 0,17μg de uma mistura de miRNA composta por miRNAs 302a-d e 367 (1:1:1:1:1:1). Os constructos de RNA, assim, somente diferiram em suas 3’ UTR consistindo de uma repetição em tandem 3’ UTR de β-globina humana (2hBg), do elemento F-I- (FI) ou elemento I-F (IF). A partir do dia 9, a formação da colônia foi observada e a análise das colônias foi realizada no dia 11.

[0353] A Figura 14B mostra uma coloração de fosfatase alcalina (AP) das colônias estabelecidas e a figura 14C mostra um gráfico de barras correspondente que representa os números contados das colônias positivas para AP.

[0354] A Figura 14D mostra a morfologia das colônias de células iPS resultantes com o uso do RNAs contendo FI-UTR. Era uma célula similar a hES com células bem compactadas em colônias distintas e bordas bem definidas.

[0355] A Figura 14E mostra as colônias preparadas como em D em coloração, positivas para AP em ampliação de quatro e dez vezes.

[0356] A Figura 14F mostra colônias preparadas como em D em uma coloração ao vivo do marcador de superfície celular hES, TRA-1-60.

[0357] A Figura 14G mostra a expressão do mRNA dos marcadores de hES OCT4 (endógeno), NANOG (endógeno), LIN28 (endógeno), TERT e REX1 avaliada pela peletização das colônias, isolando o RNA total e quantificando por qRT-PCR.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 IDENTIFICAÇÃO DE ELEMENTOS DE SEQUÊNCIA QUE ESTABILIZAM MRNAS

[0358] Para identificar novos elementos de sequência que estabilizam mRNAs, desenvolvemos um processo de seleção in vivo com o uso de hiDCs como ambiente seletivo para o RNA transcrito in vitro. A biblioteca de RNA de partida foi construída com o uso de sequências de mRNA que ocorrem naturalmente derivadas de hiDCs. Antes do isolamento do RNA, as células foram cultivadas por 5 horas na presença do inibidor de transcrição Actinomycin D (ActD) para pré selecionar os RNAs estáveis. O mRNA restante foi então extraído e reduzido a fragmentos de 200 a 800 nucleotídeos, transcritos de forma reversa e clonados como 3’-UTR em um vetor portador uma sequência hAg 5’UTR e um gene repórter, que foi escolhido como base da seleção processo. O molde de DNA usado para a subsequente transcrição da biblioteca de mRNA foi amplificado através de PCR, durante o qual um promotor T7 foi introduzido através do primer 5’ e uma cauda poli a A60 através do primer 3’. O mRNA transcrito foi então introduzido no processo de seleção in vivo, que compreende várias rodadas de transcrição in vitro da biblioteca, eletroporação dos RNAs correspondentes em hiDCs e extração e amplificação de sequências estáveis após períodos de tempo definidos. A amplificação das sequências selecionadas foi realizada através de PCR com primers específicos, após a síntese de cDNA. Os produtos de PCR resultantes foram posteriormente usados como moldes para a nova biblioteca de mRNA. Isso foi feito para seis rodadas, com a extração dos RNAs restantes após 24 horas na 1a ronda, 48 horas nas rodadas 2 e 3, 72 horas nas rodadas 4 e 5 e, finalmente, 96 horas, bem como uma e duas semanas na rodada 6 (após a eletroporação, as células foram divididas em três partes e depois coletadas individualmente nos períodos de tempo indicados).

[0359] O monitoramento do processo de seleção após as rodadas 1 a 5 demonstrou um aumento significativo da meia-vida média do grupo de RNA correspondente, o que é indicativo de um enriquecimento de elementos estabilizadores de 3’-UTR (Tabela 1). No entanto, o aumento de estabilidade foi menos pronunciado com rodadas mais elevadas. Portanto, o processo de seleção foi interrompido após uma sexta rodada final, na qual o RNA foi extraído das células após 96 horas, uma semana e duas semanas. Para caracterizar as sequências selecionadas, mais de 350 clones individuais foram sequenciados, 108 da rodada 5, 88 da rodada 6/96 horas, 110 da rodada 6/1 semana e 96 da rodada 6/2 semanas. Todas as sequências foram comparadas entre si, bem como BLASTed (inseridas no BLAST) para identificar sua origem genômica. Aqui, foi especialmente analisado, se as sequências foram derivadas de UTRs endógenas de 5’ ou 3’ ou da região de codificadora. Finalmente, seu nível de expressão em hiDCs foi descarregado do NextBio (Illumina). No total, sete grupos podem ser identificados, (i) para os quais foram encontradas múltiplas sequências, (ii) que se originaram das 3’-UTRs de RNA endógenos ou de um RNA não codificador endógeno e (iii) que foram claramente expressas em hiDCs (Tabela 2). Estes são derivados dos seguintes genes: fragmento Fc de IgG, receptor, transportador, alpha (B, FCGRT, NM_001136019), Proteína específica de linfócitos 1 (D, LSP1, NM_002339), Ligante de quimiocina 22 (E, CCL22, NM_002990), enhancer de split amino-terminal (F, AES, NM_198969), Fosfolipase D membro da família 3 (G, PLD3, NM_001031696), RNA 12S codificado na mitocôndria (I, MT_RNR1, NC_012920), Complexo principal de histocompatibilidade classe II DR beta 4 (J, HLA-DRB4, NM_021983). Note que, por simplicidade, as letras maiúsculas B a I entre parênteses são usadas a seguir como abreviaturas para esses elementos. De modo importante, em todos os casos, os clones para uma sequência diferem em seus extremos exatos de 5’ e 3’, demonstrando que estes vêm de diferentes clones de partida e não são simplesmente enriquecidos artificialmente por o processo (consulte os appendices para uma lista completa de todas as sequências identificadas na triagem).

EXEMPLO 2 CARACTERIZAÇÃO DOS ELEMENTOS DE SEQUÊNCIA INDIVIDUAIS IDENTIFICADOS

[0360] Para a caracterização dos elementos de sequência identificados, um candidato representativo de cada grupo foi escolhido (as sequências detalhadas são marcadas no apêndice). Esta sequência foi então clonada como 3’-UTR em um vetor com um gene repórter da luciferase, cujo nível de expressão pode ser analisado ao longo do tempo após a transferência para as células. Foi previamente demonstrado que, a partir do padrão de expressão observado para a proteína, a estabilidade relativa e a eficiência de tradução do RNA podem ser inferidas com precisão (Kuhn 2010 Gene Ther.). O repórter específico usado neste experimento, luc2CPmut, é uma forma desestabilizada da luciferase (Promega). Isso permite detectar mesmo pequenas mudanças na estabilidade do RNA. O RNA transcrito in vitro proveniente destes vetores foi então comparado com o nosso mRNA padrão ouro, isto é, contendo 2hBg 3’-UTR, em relação à estabilidade do RNA e eficiência de tradução. Como amostras de controle, um RNA transcrito in vitro sem um 3’-UTR (isto é, apenas contendo sequências usadas para clonagem das inserções) e um com apenas um único elemento Beta-globina (1hB) foram usados.

[0361] Começando com os vetores contendo UTR, a região a ser transcrita foi amplificada por PCR com o uso de um primer 5’ contendo o promotor T7 e um primer 3’ com uma cauda poli A de 60 nucleotídeos. A limpeza de fragmentos de PCR foi feita com o uso do AGENCOURT AMPURE XP (Beckman Coulter). 0,6 volumes de microesferas foram adicionados e misturados a cada reação de PCR. Após uma incubação de 15 minutos em RT PCR, Os produtos de PCR ligados às microesferas foram separados através de suporte magnético a partir de primers, nucleotídeos, sais e enzimas em excesso. As microesferas foram lavadas duas vezes por 30 segundos com 80% de etanol para remover ainda mais os contaminantes. Os produtos de PCR desejados foram finalmente eluídos duas vezes com 30 μL de ddH2O e usados como molde para a transcrição in vitro dos RNAs correspondentes. Para as transcrições in vitro, T7 RNA polimerase (Fermentas), o respectivo tampão de reação e NTP 6 mM foram usados. Para o capeamento eficiente do RNA, a concentração de GTP foi reduzida para 1,5 mM e foram adicionados 6 mM de β-S-ARCA (D2) à reação e incubados por 2,5 horas a 37°C. O RNA foi purificado através de microesferas magnéticas carboxiladas (Invitrogen) e a concentração e qualidade do RNA foram avaliadas por espectrofotometria e análise em um Bionanalyzer 2100 (Agilent).

[0362] De acordo com a sua identificação na abordagem de triagem, todas as novas sequências apresentaram características muito similares em comparação ao 2hBg em relação à estabilidade do RNA com o grupo I (mtRNR1) como melhor (Figura 3; Tabela 3). De modo importante, cada elemento individual conferiu estabilização ao RNA em comparação ao RNA sem 3’-UTR e até mesmo em comparação ao RNA com apenas uma cópia do elemento Beta-globina. A eficiência da tradução não foi significativamente afetada, conforme observado pela correlação direta entre a estabilidade do RNA e a proteína total expressada ao longo do tempo.

EXEMPLO 3 COMBINAÇÃO DE ELEMENTOS DE SEQUÊNCIA INDIVIDUAIS

[0363] Em um experimento adicional, as sequências únicas de cada grupo foram combinadas entre si de uma modo pareado (Figura 2). O raciocínio por trás disso foi nossa observação anterior de que a combinação de duas 3’-UTRs teve um efeito adicional sobre a estabilidade e eficiência da tradução do RNA (Holtkamp et al. 2006). A estabilidade e a eficiência da tradução do RNA foram calculadas em R interpolando os valores da Luciferase medidos com um spline, a partir da qual a inclinação ascendente mais pronunciada foi definida como eficiência de tradução e a meia-vida do sinal como estabilidade. A integral do spline interpolada é interpretada como expressão de proteína total. No total, 64 combinações foram clonadas, isto é, todas as combinações possíveis das sete sequências recentemente identificadas e da 3’-UTR de beta-globina humana (Tabela 6). Conforme descrito acima, o RNA foi preparado a partir desses moldes de DNA, e então eletroporado em hiDCs. Como controles, os RNAs contendo os elementos individuais também foram incluídos. Para a maioria dos sete novos elementos, observou-se que pelo menos uma combinação com outro elemento proporciona um RNA com maior estabilidade do que apenas com o único elemento (Tabela 7 a Tabela 13). Interessantemente, na maioria dos casos, a combinação com o elemento I (mtRNR1) aumentou a meia-vida do RNA. Aqui, a estabilidade do RNA foi geralmente ainda maior em comparação ao RNA com o 2hBg 3’-UTR (Tabela 7 a Tabela 13). Quase todas as combinações tiveram um efeito positivo sobre a eficiência de tradução do RNA. No total, os efeitos combinados sobre a estabilidade do RNA e eficiência de tradução resultam em um aumento da expressão total da proteína de até 1,74 vezes. Dessa forma, podemos identificar elementos únicos (com comprimentos abaixo de 233 nucleotídeos), bem como combinações de dois elementos diferentes que dão origem a RNAs com maior estabilidade e/ou eficiência de tradução, mas ao mesmo tempo evitando os problemas com duas cópias idênticas de um elemento conforme descrito acima para 2hBg.

[0364] Para verificar os resultados obtidos com a forma desestabilizada de luciferase, os experimentos anteriores foram repetidas com RNAs portando a luciferase padrão (Promega), e as seguintes 3’-UTR selecionadas: mtRNR1 (I), mtRNR1-AES (IF), AES-mtRNR1 (FI), mtRNR1- hBg (IhBg) e hBg-mtRNR1 (IhBg). Conforme mostrado na Figura 4 e Tabela 14, os resultados equivalentes observados acima podem ser obtidos, verificando que os novos elementos, individualmente ou em combinação, aumentam a estabilidade do mRNA e/ou a eficiência de tradução de forma similar ao elemento 2hBg.

EXEMPLO 4 ANÁLISE DE MRNAS PORTANDO ELEMENTOS DE SEQUÊNCIA SELECIONADOS EM OUTROS TIPOS DE CÉLULAS

[0365] Os recém selecionados 3’-UTRs mtRNR1 e AES também foram testados em diferentes tipos de células e linhagens celulares para ver se há uma especificidade de hiDC. As sequências foram testadas em fibroblastos humanos (HFF), mioblastos murinos (C2C12) (Figura 5) e células T (Figura 6) para avaliar se eles também estão estabilizando nessas células.

[0366] As células HFF e C2C12 foram coletadas e preparadas para eletroporação. 2,0 μg de IVT-RNA foram submetidos a eletroporação em seguida, juntamente com 1,0 μg de RNA que codifica GFP contendo os 3’ UTR indicados. Após a eletroporação, as células foram separadas. 5000 células por poço foram distribuídas em uma placa de 96 poços em triplicata para um total de 7 períodos de tempo (2, 4, 8, 24, 48 e 72 horas) para medir a atividade da luciferase. 2E+05 células por poço foram plaqueadas em placas de 6 poços para coleta para FACS após 24 horas (sinal GFP). Isso permitiu o monitoramento das eficiências de transfecção. Estes diferiram entre 72 e 90% e poderiam ser incluídos no cálculo da meia-vida. Os resultados obtidos com HFF e C2C12, bem como as células T confirmaram os resultados obtidos anteriormente com o hiDC. A combinação de I com F foi em particular de 2 a 3 vezes melhor para a meia-vida em comparação ao 2hBg. Além disso, FI mostrou uma eficiência de tradução 3 vezes maior em células C2C12 e uma produção de proteína 2 vezes melhor ao longo do tempo em comparação ao nosso padrão ouro. Estes resultados mostraram que I e F não são específicos de hiDC, mas também aumentam a estabilidade do mRNA e a eficiência de tradução em outras células.

EXEMPLO 5 O FI 3’ UTR AUMENTA A EXPRESSÃO DO MRNA MODIFICADO

[0367] Para algumas aplicações, incluindo a terapia de substituição de proteínas, os mRNAs com nucleotídeos modificados são preferíveis aos não modificados devido à sua imunogenicidade diminuída (Kariko et al., 2008). No entanto, as modificações de base podem ter um efeito sobre a estabilidade de um mRNA por quer influencia direta da interação com uma proteína de ligação ao RNA correspondente ou alterando a formação de estrutura secundária do RNA. Consequentemente, as 3’ UTR selecionadas podem comportar-se de forma diferente no contexto de mRNAs modificados. Portanto, comparamos a combinação de F e I com o 2hBgUTR no contexto do mRNA modificado com m1Y em células hiDCs, HFFs, T CD8+ e T CD4+ em MEFs, C2C12 e bmDCs de murino. Como repórter, a Luciferase foi usada (consulte a Figura 7A para o desenho do constructo). Para a geração de mRNAs modificados, U foi completamente substituído por m1Y na reação IVT. Em todos os experimentos, o RNA não modificado foi incluído como controle. As integridades dos mRNAs obtidos não foram afetados pela troca de UTP para m1YTP (Figura 7B). As células foram eletroporadas com o uso das configurações descritas na Tabela 15, e os níveis de Luciferase foram medidos às 3, 6, 12, 24, 48, 72 e 96 horas.

[0368] A eletroporação do mRNA da Luciferase não modificado pode reproduzir os efeitos observados anteriormente: Em todos os tipos celulares, o elemento FI foi igual ou superior ao controle 2hBg na estabilidade do RNA transportador (Tabela 16A). Enquanto nas DC de murino e nas células T humanas as meia-vidas do mRNA eram comparáveis entre os dois 3’ UTR, o elemento FI aumentava a meia-vida do mRNA até 1,69 vezes nas células HFF. A quantidade de proteína total foi aumentada em todas as linhagens celulares, mais proeminentemente em células HFF (2,45 vezes).

[0369] Com o mRNA modificado, o elemento FI também conduziu a um aumento da meia-vida do mRNA em comparação ao 2hBg nos hiDCs, a quantidade total de proteína aumentou mais do que duas vezes (Tabela 16B). Os resultados em outros tipos de células também são similares aos obtidos com mRNA não modificado: o elemento FI foi superior a 2hBg em todas os experimentos envolvendo células HFF, MEF e C2C12 e comparáveis em células T e DC de murino (Tabela 16B). Portanto, a modificação de U não altera a capacidade do elemento FI para estabilizar o mRNA.

EXEMPLO 6 O FI 3’ UTR AUMENTA A EXPRESSÃO DO MRNA EM RELAÇÃO AO MÉTODO DE TRANSFECÇÃO

[0370] Até o momento, todos os experimentos foram realizados com eletroporação como método de transfecção. Com a eletroporação, o mRNA liberado chega diretamente no citoplasma, sob evasão de uma rota de absorção endossomal, que é tomada após transfecção através de lipofecção. Para ver se o elemento FI também funciona nestas condições, as células foram lipofectadas com o mesmo FI e 2hBg contendo mRNA da Luciferase conforme usado nos experimentos anteriores com o uso de RNAiMAX como um reagente de transfecção. Além disso, após a lipofecção, o elemento FI aumentou a expressão da luciferase, embora o aumento tenha sido menos pronunciado em comparação aos experimentos onde o RNA foi administrado através de eletroporação (Tabela 16C). Portanto, o método de transfecção não tem impacto no efeito estabilizador do elemento FI.

EXEMPLO 7 FI 3’ UTR E O 2HBGUTR CONTENDO MRNA LEVAM À EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS E ATIVAÇÃO IMUNE IN VIVO COMPARÁVEIS

[0371] Para avaliar a expressão da proteína a partir do mRNA contendo o FI 3’ UTR in vivo, os mesmos mRNAs da Luciferase contendo FI e 2hBg que foram usados em experimentos anteriores foram formulados com F12 e administrados por via intravenosa em camundongos BALB/c. Conforme mostrado na Figura 8, a expressão da luciferase foi comparável tanto para ambas as 3’ UTRs. A resposta imune específica do antígeno também foi induzida em uma extensão comparável, com o efeito do FI 3’ UTR contendo mRNA sendo ligeiramente mais forte no baço.

EXEMPLO 8 SE A UTR CONTINUA A AUMENTAR A ESTABILIDADE DO RNA AUTO-REPLICATIVO IN VITRO

[0372] O ARN auto-replicante transcrito in vitro (replicon de RNA) derivado de genomas alfa virais são potentes vetores de vacina. O replicon de RNA codifica nos dois primeiros terços o complexo enzimático necessário para a replicação citoplasmática (replicase) do RNA do replicon. Esta replicase reconhece uma estrutura interna de RNA que atua como promotor subgenômico para a síntese dependente de replicase de RNAs subgenômicos. Transgenes ou antígenos para vacinação são codificados neste RNA subgenômico que é significativamente mais curto do que todo o replicon. Em geral, tanto o RNA genômico (ou seja, o RNA do replicon de comprimento total) e o RNA subgenômico se assemelham ao mRNA celular. Ambos são flanqueados por UTRs, ambos são capeados e poli-adenilados. As enzimas responsáveis pelo capeamento e a poli-adenilação estão contidas no complexo da enzima replicase. Os elementos conservados da sequência (CSE) dentro das UTRs - sobreposição com o ORF da replicase no caso do 5’CSE - são necessários para a ligação da replicase e atuam como promotores para síntese de cadeia negativa (3’CSE) ou síntese da fita extra ( 5’CSE).

[0373] Para avaliar se as novas UTRs de estabilização identificadas e validadas para o mRNA não replicante transcrito in vitro proporcionam maior estabilidade e, por assim, uma maior expressão de transgene, do RNA do replicon, clonamos as respectivas sequências em vetores de molde de RNA do replicon. Conforme 3’CSE precisa estar localizado imediatamente ao lado da cauda poli-A, inserimos as novas UTRs imediatamente a montante do 3’CSE de um replicon que codifica a luciferase desestabilizada (Luc2CP). O replicon do RNA foi sintetizado por transcrição in vitro de plasmídeos moldes linearizados similares ao IVT mRNA. O replicon do RNA foi introduzido nas células (BHK21 e HFF) por eletroporação, e a expressão da luciferase foi avaliada. Conforme mostrado na Figura 9, todas as UTRs inseridas aumentaram a tradução do Luc2CP em ambas as linhagens celulares usadas. Interessantemente, a combinação “IF” UTR resultou em um aumento notável de tradução.

EXEMPLO 9 TROCA DE NUCLEOTÍDEOS COM MAIS DE 90% DE HOMOLOGIA NÃO TÊM IMPACTO NAS PROPRIEDADES ESTABILIZANTES DO ELEMENTO FI

[0374] Devido ao procedimento de seleção que foi aplicado para identificar novos elementos UTR estabilizadores, foram obtidas sequências em certa faixa de tamanho. A identificação das mesmas sequências com extremidades 5’ e 3’ prolongadas forneceu uma primeira indicação para o comprimento mínimo necessário. No entanto, a região mínima necessária para que cada elemento exerça seu efeito estabilizador pode ser ainda mais curta. Além disso, pequenas variações das sequências podem ainda ser funcionais, isto é, a identidade de qualquer nucleotídeo individual pode não ser de extrema importância para as propriedades estabilizadoras do elemento FI. Para verificar em que grau os elementos são robustos contra as trocas de nucleotídeos, as sequências de 3’ UTR com 97,5%, 95,0%, 92,5% e 90,0% de homologia com o elemento FI original foram testadas quanto à expressão total da proteína e meia- vida do mRNA em hiDCs. Os nucleotídeos que foram alterados foram escolhidos aleatoriamente em todo o comprimento da sequência (sequências 208-211, modificações aleatórias). Os mRNAs da Luciferase com estes elementos modificados como 3’ UTR foram transcritos in vitro, eletroporados em hiDCs e sua expressão foi seguida ao longo do tempo por medições da Luciferase após 3, 6, 24, 48 e 72 horas. Os mRNAs da Luciferase com o elemento FI modificado renderam a mesma quantidade total de proteína e tiveram aproximadamente a mesma meia-vida (Tabela 17).

[0375] Adicionalmente às substituições aleatórias com graus crescentes conforme descrito acima, outro conjunto de elementos FI modificados foi gerado por introdução racional de substituições de nucleotídeos que são susceptíveis a perturbar a estrutura secundária do elemento FI. Para múltiplas sequências 3’ UTR naturais, sabe-se que sua estrutura secundária é importante porque fornece locais de ligação para proteínas reguladoras, que influenciam a estabilidade do mRNA (Addess et al., 1997; Putland et al., 2002; Crucs et al., 2000; Adams et al., 2003) Duas sequências com 8nt que são perfeitamente complementares entre si estão presentes no elemento FI, uma no elemento F e outra no elemento I (Figura 10). O pareamento de bases destas duas regiões também pode ser visto na maioria das previsões de mfold. mFold (Zuker, 2003) é um programa de computador que permite previsões estruturais secundárias de sequências de entrada. Para verificar a importância deste elemento de estrutura secundária específica, a sequência foi alterada de modo a abolir o pareamento de bases (sequência 212, mutação 8nt). Além dessas sequências complementares bem longas, as previsões de mfold para o FI 3’ UTR foram selecionadas para os elementos estruturais presentes na maioria do número de vezes de saída, o que deve, portanto, ter uma alta probabilidade de formação in vivo. Os nucleotídeos envolvidos no pareamento de bases destes númers de vezes foram alterados para 97,5%, 95,0%, 92,5% e 90,0% de homologia com as sequências FI originais, trocando-as com seus pares de bases, mantendo assim a estrutura secundária da sequência (sequências 217-220, estrutura que retém modificações). Além disso, as mesmas sequências foram trocadas em apenas uma fita da parte de fita dupla, destruindo deliberadamente a estrutura secundária. Nesses casos, a identidade para a sequência original foi de 98,75%, 97,50%, 96,25% e 95,00%, respectivamente (sequências 213-216, modificações desestabilizadoras da estrutura).

[0376] Os RNAs da luciferase com os elementos 3’ UTR modificados descritos foram transcritos in vitro, eletroporados em hiDCs e sua expressão foi seguida ao longo do tempo por medições da Luciferase após 3, 6, 24, 48 e 72 horas.

[0377] Com nenhuma das estratégias de modificação, qualquer impacto significativo na meia-vida do mRNA pode ser observado. Portanto, as propriedades estabilizadoras do elemento FI parecem ser robustas contra alterações na sua sequência de nucleotídeos ou estrutura secundária pelo menos até 10,0% de nucleotídeos variados. Além disso, nenhum declínio na quantidade total de proteína pôde ser observado após a modificação da sequência FI (Tabelas 18 A e B).

EXEMPLO 10 O USO DO ELEMENTO FI AO INVÉS DE 2HBG EVITA ERRO DE INCORPORAÇÃO NA PCR BASEADA NA AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO CODIFICADORA DO RNA

[0378] Conforme foi mostrado, o elemento FI é igual ou superior ao 2hBg 3’ UTR em relação à estabilidade e eficiência de tradução do mRNA. Outra vantagem do elemento FI é sua sequência não repetitiva, enquanto as duas cópias do hBg 3’ UTR podem causar problemas em alguns casos.

[0379] Isto se torna mais óbvio, quando o modelo de DNA para transcrição de RNA é amplificado por PCR. Nesses casos, a cauda de poli A de comprimento total é adicionada com primer oligo 3’ que se liga na extremidade 3’ da 3’ UTR (Figura 11A). No caso do 2hBgUTR, surgem produtos laterais truncados durante a PCR, que após a sequência acabam por consistir em mRNA com apenas uma repetição 1hBg na UTR (Figura 11B). Após a transcrição, o truncamento também é visível no mRNA (Figura 11C). Esse fenômeno ocorre na maioria das reações de PCR com constructos contendo o elemento 2hBgUTR e não pode ser completamente abolida através de esforços de otimização, incluindo temperatura de anelamento de primers, composição de tampão, sequência do primer ou polimerases alternativas. Mesmo após a inserção de uma sequência de ligação exclusiva entre a 3’ UTR e a cauda poli A, o problema permanece. Importantemente, a força do pico lateral correlacionou-se com o rendimento da reação de PCR, indicando erro de incorporação de fragmentos de PCR truncados curtos, que aumentam com cada ciclo de PCR, como causa provável do problema. Portanto, não foram identificadas condições satisfatórias para moldes de DNA que codificam RNAs com o 2hBg 3’-UTR.

[0380] Em contraste, a PCR dos moldes de DNA com o elemento FI não produziu quaisquer produtos laterais truncados (Figura 11D), e também o mRNA resultante não mostrou pico adicional no perfil do Bioanalyzer (Figura 11E). Portanto, o elemento FI constitui uma melhora considerável como um 3’ UTR em comparação com o 2hBgUTR em relação à integridade do molde de PCR e qualidade de RNA correspondente.

EXEMPLO 11 PROPRIEDADES DE ESTABILIZAÇÃO DO RNA DE SUBFRAGAMENTOS DOS ELEMENTOS F E I

[0381] Devido ao procedimento de seleção que foi aplicado para identificar novos elementos de UTR estabilizantes, foram obtidas sequências em certa faixa de tamanho. A identificação das mesmas sequências com extremidades 5’ e 3’ prolongadas deu uma primeira indicação para o comprimento mínimo necessário. No entanto, a região mínima necessária para que cada elemento exerça o seu efeito estabilizador pode até ser mais curta.

[0382] Para esta finalidade, os constructos repórter da Luciferase do elemento F e I foram desenhados, cada uma contendo uma UTR encurtada cobrindo um fragmento diferente do elemento original encurtado na extremidade 5’ e/ou 3’ (consulte a Figura 12 painéis superiores A e B, respectivamente). Esses constructos repórter foram transcritas in vitro, eletroporadas em hiDCs e sua expressão foi seguida ao longo do tempo por medições da Luciferase 3, 6, 24, 48 e 72 horas após a eletroporação. As curvas de expressão resultantes foram analisadas para a meia-vida relativa do RNA com o RNA contendo o respectivo conjunto de comprimento total para 1 (consulte a Figura 12 painéis inferiores A e B, respectivamente).

[0383] Para o elemento F, não pôde ser observada uma meia-vida de mRNA significativamente diminuída para qualquer subsequência testada, indicando um envolvimento redundante e não cooperativo de várias subsequências ao longo do elemento F em seu papel estabilizador. Um resultado similar poderia ser obtido para o elemento I, embora aqui uma ligeira queda de desempenho pôde ser observada quando somente a região central (nt37-107) era usada como 3’ UTR.

[0384] Para colocar esses resultados em perspectiva, os elementos F e I individuais inteiros, bem como a combinação FI, foram comparados com 3’ UTR selecionadas aleatoriamente da biblioteca inicial (257n de comprimento). Isto foi obtido pela clonagem do conjunto de DNA inicial e selecionando um único clone aleatório. Conforme descrito acima, os RNAs que codificam a luciferase com as respectivas sequências de UTR foram submetidos a eletroporação em hiDCs, expressão de luciferase medida ao longo do tempo e a meia-vida relativa e expressão de proteína total calculada. Comparado com os elementos F, I e FI, o RNA com a 3’ UTR selecionada aleatoriamente é significativamente menos estável (Figura 13, painel superior). O efeito das UTR selecionadas é ainda mais pronunciado para a expressão total da proteína (Figura 13, painel inferior). Isso indica claramente que o efeito dos fragmentos dos elementos F e I conforme descrito acima são específicos para as sequências selecionadas e não simplesmente causados pela presença de uma sequência 3’ UTR. Isto está em linha com o aumento observado na estabilidade do RNA no pool durante a seleção (consulte acima).

EXEMPLO 12 USO DE ESTABILIZAÇÃO DE ELEMENTOS UTR PARA REPROGRAMAÇÃO DE CÉLULAS

[0385] 40.000 células foram plaqueadas em placa de 12 poços e lipofectadas por três (3x) ou quatro (4x) dias consecutivos com misturas de mRNA que eram compostas por 0,33 μg de (IVT)-RNA não modificado in vitro transcrito que codifica a reprogramação TF OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG e LIN28 (OSKMNL) (1:1:1:1:1:1) com 0,08 μg de cada B18R, E3 e K3 (EKB) e 0,17μg de uma mistura de miRNA composta por miRNAs 302a- d e 367 (1:1:1:1:1:1). Os constructos de RNA, portanto, apenas diferiram em sua 3’ UTR consistindo de uma repetição em tandem da 3’ UTR de β-globina humana (2hBg), do elemento F-I (FI) ou do elemento I-F (IF). As células foram cultivadas em meio celular e membrana embrionária humana (hES) e lipofectadas com o uso de RNAiMAX, realizada de acordo com as instruções do fabricante. A partir do dia 9, a formação de colônias foi observada e a análise das colônias foi realizada no dia 11 (consulte a Figura 14A para visão geral da linha de tempo). As colônias estabelecidas foram coradas para a fosfatase alcalina (AP) no dia 11 com o uso de um kit de coloração AP. Para uma visão geral, as colorações representativas são mostradas na Figura 14B. Tornou-se óbvio que a incorporação do elemento FI resulta em maiores quantidades de colônias AP positivas (escuras). As colônias coradas para AP foram contadas e os resultados da visão geral foram confirmados: Em comparação com o 2hBg-UTR usado anteriormente, a substituição com o FI- UTR leva a um excesso de colônias de 3 a 4 vezes quando as células foram lipofectadas 3 vezes. A substituição com IF-UTR resulta em um excesso de 2 vezes. Com quatro transfecções, esses efeitos são menos pronunciados. Nenhuma melhoria é observada aqui com a IF-UTR. Por um lado, o processo parece estar em uma saturação com quatro transfecções, enquanto que, por outro lado, a contagem de colônias é, de certo modo, tendenciosa devido ao crescimento excessivo de colônias (consulte a Figura 14C). A morfologia das colônias de células iPS resultantes com o uso de RNAs que continham o FI- UTR era similar à células hES com células pequenas bem compactadas em colônias distintas e bordas bem definidas (Figura 14D). Essas colônias puderam ser coradas para AP positivas (Figura 14E) e o marcador de superfície da célula hES TRA-1-60 (Figura 14F). A coloração TRA-1-60 ao vivo foi realizada com o anticorpo TRA-1-60 da Stain-Alive (Stemgent) de acordo com as instruções do fabricante. Imagens representativas de colônias são mostradas. Para avaliar ainda mais a pluripotência das colônias, as células foram peletizadas, o RNA total isolado e a expressão de mRNA dos marcadores de hES OCT4 (endógenos), NANOG (endógeno), LIN28 (endógeno), TERT e REX1 foram quantificados por qRT-PCR. A expressão de mRNA foi normalizada para a de HPRT e é mostrada como número de vezes de indução em comparação aos níveis de transcrição das células de entrada. A análise das colônias após 3 lipofecções é mostrada na Figura 14G. Todos os marcadores analisados foram altamente expressos em comparação com células de entrada indicando pluripotência de células reprogramadas. A superioridade do mRNA sintético contendo FI foi confirmada por uma expressão de marcador endógeno superior em comparação com a reprogramação com mRNAs contendo 2hBg e IF.

[0386] Estes resultados mostram que a substituição do 2hBg-UTR pelo FI-UTR resulta em uma tecnologia de reprogramação baseada em RNA mais rápida e eficiente. Provavelmente, isso se baseia na expressão mais longa e superior de fatores de transcrição de reprogramação resultantes da substituição com o elemento FI. A orientação do elemento FI parece assim indispensável, uma vez que o benefício não foi observado com os constructos IF. A reprogramação bem-sucedida de células por mRNAs contendo FI foi confirmada por morfologia da célula de hES, atividade AP e a expressão da superfície celular de hES e marcadores endógenos de colônias de células iPS resultantes. TABELAS TABELA 1

[0387] Meia-vida de mRNA em horas (h), calculada a partir de dados de experimentos de transcriptase reversa em tempo real-PCR (RT-PCR), para monitorar o progresso de seleção. Os mRNAs foram quantificados 8, 24 e 48 horas após a eletroporação. No experimento I (à esquerda), cada amostra foi analisada somente uma vez. Consequentemente, nenhum desvio padrão é dado. TABELA 2 TABELA 3

[0388] Valores calculados em relação ao nosso padrão-ouro 2hBg para meia-vida e proteína total ao longo do tempo. São mostrados nome do grupo e o respectivo gene. TABELA 4 CONDIÇÕES DE PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DA BIBLIOTECA E SUBSEQUENTES RODADAS DE SELEÇÃOTABELA 5 IVT-T7-REAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO TABELA 6

[0389] Combinações clonadas e comparadas com o nosso padrão- ouro 2hBg (canto inferior direito). Elementos únicos clonados duas vezes são destacados. TABELA 7

[0390] Resultado de FCGRT (grupo B) clonado como elemento único ou a montante combinado com uma das outras sequências de grupo como elemento a jusante. Valores em negrito são > 1,0. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 8

[0391] Resultado de LSP1 (grupo D) clonado como elemento único ou a montante combinado com uma das outras sequências de grupo como elemento a jusante. Valores em negrito são > 1,0. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 9

[0392] Resultado de CCL22 (grupo E) clonado como elemento único ou a montante combinado com uma das outras sequências de grupo como elemento a jusante. Valores em negrito são > 1,0. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 10

[0393] Resultado de AES (grupo F) clonado como elemento único ou a montante combinado com uma das outras sequências de grupo como elemento a jusante. Valores em negrito são > 1,0. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 11

[0394] Resultado de PLD3 (grupo G) clonado como elemento único ou a montante combinado com uma das outras sequências de grupo como elemento a jusante. Valores em negrito são > 1,0. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 12

[0395] Resultado de mtRNR1 (grupo I) clonado como elemento único ou a montante combinado com uma das outras sequências de grupo como elemento a jusante. Valores em negrito são. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 13

[0396] Resultado de HLA-DRB4 (grupo J) clonado como elemento único ou a montante combinado com uma das outras sequências de grupo como elemento a jusante. Valores em negrito são > 1,0. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 14

[0397] Resultados representativos com o uso de luc2mut como gene repórter e 3’-UTRs recém selecionadas depois de eletroporação em hiDC. A atividade de luciferase foi medida ao longo de 96 h. Valores são relativos a 2hBg. TABELA 15 CONFIGURAÇÕES DA ELETROPORAÇÃO

[0398] A tabela resume os detalhes do protocolo de eletroporação para todos os tipos de células usadas. A quantidade de células indicada mediante a contagem de células foi misturada com a quantidade de RNA declarado em μg ou pmol tanto em cadinhos de eletroporação como em placas de eletroporação de 96 poços (conforme indicado sob formato) em meio X- VIVO15 (Lonza). A eletroporação foi realizada aplicando um pulso com o comprimento designado e a tensão listada em V. Posteriormente, a suspensão celular foi diluída em meio de crescimento e distribuída em 96 poços com a densidade listada em células/ponto no tempo. TABELA 16 MEIAS-VIDAS E PROTEÍNA TOTAL DE ELEMENTO FI EM RELAÇÃO A 2HBGUTR CONTENDO MRNA NÃO MODIFICADO E MODIFICADO MEDIANTE ELETROPORAÇÃO E RNA NÃO MODIFICADO MEDIANTE LIPOFECÇÃO

[0399] Plasmídeos que codificam o gene de luciferase de vagalume contendo tanto FI como 2hBg como 3’UTR foram linearizados a jusante do poli(dA:dT) com uma enzima de restrição classeIIS gerando um molde sem nenhum nucleotídeo adicional além do poli:(dA:dT). DNA de plasmídeo linearizado foi purificado com o uso de microesferas carboxiladas (Invitrogen), quantificadas espectrofotometricamente e submetidas a transcrições in vitro. Para transcrições in vitro feitas internamente, RNA polimerase T7 suplementada com inibidores de RNase e pirofosfatase foram usados com NTPs 7,5 mM em um HEPES 125 mM, pH 8,35, MgOAc2 34 mM, DTT 10 mM e tampão Espermidina 2 mM. Para capeamento eficiente do RNA 6 mM de β-S-ARCA(D2) foram adicionados à reação e a concentração de GTP inicial foi reduzida para 1,5 mM, que foi ajustada para 7,5 mM em um processo de alimentção em batelada durante 2,5 h a 37°C. O RNA foi purificado através de microesferas magnéticas carboxiladas (Invitrogen) e a concentração de RNA e a qualidade foram avaliadas por espectrofotometria e análise em um 2100 Bioanalyzer (Agilent): A) Mostra que as Meias-vidas de mRNAs não modificados contendo o elemento FI são superiores ou comparáveis àquelas contendo o 2hBg 3'UTR em diversas linhagens celulares humanas e murinas. A quantidade de fibroblastos humanos (HFFs), células T CD8+ e CD4+, fibroblasto embrionário murino (MEF), células de mioblastoma (C2C12) e DCs murinas conforme listado na Tabela 15 foram misturadas com a respectiva quantidade de RNA (Tabela 15) em meio X-VIVO15 (Lonza) e submetidas a eletroporação. O número indicado de células foi plaqueado em 96 poços em 100 μL de meio de crescimento apropriado com aditivos. Em 2, 6, 24, 48, 72 e 96 horas após a semear, as atividades de luciferase de vagalume foram determinadas por adição de Luciferina (Promega) em um leitor de fluorescência (TECAN); B) Mostra que as Meias-vidas de mRNAs modificados m1Y contendo o elemento FI são superiores ou comparáveis àquelas contendo o 2hBg 3'UTR em diferentes linhagens celulares humanas e murinas. A quantidade de células dendríticas imaturas humanas (iDC), fibroblastos humanos (HFFs), células T CD8+ e CD4+, fibroblasto embrionário murino (MEF), células de mioblastoma (C2C12) e DCs murinas conforme listado na Tabela 15 foram misturadas com a respectiva quantidade de RNA modificado m1Y (Tabela 15) em meio X-VIVO15 (Lonza) e submetidas a eletroporação. O número indicado de células foi plaqueado em 96 poços em 100 μL de meio de crescimento apropriado com aditivos. Em 2, 6, 24, 48, 72 e 96 horas após a semear, as atividades de luciferase de vagalume foram determinadas por adição de Luciferina (Promega) em um leitor de fluorescência (TECAN); e C) Mostra que as Meias-vidas de mRNAs não modificados contendo o elemento FI são superiores ou comparáveis àquelas contendo o 2hBg 3’UTR em diferentes linhagens celulares também quando o RNA foi transfectado através de lipofecção. 50 ng de RNA foi incubado por 15 a 30 min com RNAiMAX e dado nas células 1E04 HFF, MEF ou C2C12 em 96 poços. Os níveis de luciferase foram medidos em 3, 6, 12, 24, 48, 72 e 96 h por adição de Luciferina (Promega) em um leitor de fluorescência (TECAN). TABELA 17

[0400] 10 μg de RNA que codificam luciferase de vagalume contendo o elemento FI como variações do elemento FI com a designada homologia à sequência FI original como 3’UTRs foram eletroporados em hiDCs em um formato de 96 poços. A expressão de luciferase foi seguida ao longo do tempo em 3, 6, 24, 48 e 72h, e a partir da curva de expressão resultante, a meia-vida de mRNA e a quantidade de proteína total traduzida a partir do RNA foram calculadas. TABELA 18

[0401] 10 μg de RNA que codificam a luciferase de vagalume contendo tanto o elemento FI como variações do elemento FI contendo estrutura que mantém ou destrói mutações e com a designada homologia à sequência FI original como 3’UTRs foram eletroporadas em hiDCs em um formato de 96 poços. A expressão de luciferase foi seguida ao longo do tempo em 3, 6, 24, 48 e 72h, e a partir da curva de expressão resultante, a meia-vida de mRNA e a quantidade de proteína total foram calculadas. AS SEQUÊNCIAS DESCRITAS NO PRESENTE PEDIDO SÃO AS SEGUINTES GRUPO B >Rn5-2pl-A4_For2 CAUCCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCGGGUCUUCCUGG AAUCUGACCAUUCGUUGUC UGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUG CUACUGCCCGGGCCCAUG AGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCAC UGGCACAGCCCCGCCUUG CCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC >Rn5-2pl-A3_For2 GCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCGGGUCUUCCUGGAAUCUG ACCAUUCGUUGUCUGCUAU GCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUG CCCGGGCCCAUGAGACUG ACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCAC AGCCCCGCCUUGCCGCUG CUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC >Rn5C5_For2 UUCCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCUGCGGGUCUUCCU AGAAUCUGACCAUUCGUUG UCUGCUAUGCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUU UGCUACUGCCCGGGCCCA UGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGC ACUGGCACAGCCCCGCCU UGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGAGACC >Rn5E6_For2 UGCUGCUGCUGCUGCGGGUCUUCCUGGAAUCUGACCAUUCG UUGUCUGCUAUGCCCGUCC UCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCC CAUGAGACUGACUUCCCA CUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCACAGCCCCGC CUUGCCGCUGCUGAUCCA UUGCCGGCGGACA >Rn6-1WoC3_For2 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UCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGC UUCCUGUUGCCAGCAUGA CCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUU UGCUCCUGGACCCUUUAG CCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCACCACCCC >Rn5H1_For2 GCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCC UGUUGCCAGCAUGACCUA CCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCU CCUGGACCCUUUAGCCUC UCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCC >Rn6-1WoG2_For2 UCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGC UUCCUGUUGCCAGCAUGA CCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUU UGCUCCUGGACCCUUUAG CCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCCCC >Rn6-1WoG7_For2 CGGCUCCCUAGGCGUCCCAUCUCGCUUCCUGGGUCUGCAGG UCCAGCCGGCUGGCACCCU CCAUGUACCCAGGGGAGAUUCCAGCCAGACACCCGCCCCCCG GCCCUGGCUAAGAAGUUG CUUCCUGUUGCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCC AUCCGCUGCCACCUCCUU UUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUG ACCACUGCCCC >Rn6-96hB11_For2 UGCAGGUCCAGCCGGCUGGCACCCUCCAUGUACCCAGGGGA GAUUCCAGCCAGACACCCA CCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUCCUGUUGCCAGCAU GACCUACCCUCGCCUCUUU GAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCCUGGACCCUUUA GCCUCUCUGCCCUUCCAC UCUCUGACCACUACCCC >Rn6-2WoF8_For2 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CUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGG GCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCAC GGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCA GGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC >GhBg CUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCG AUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCU CUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGU GGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCC CUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCU GGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUC >GI CUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCG AUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCU CUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGU GGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACG GGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUA UACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC >GJ CUGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCG AUCCAGUGGGCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCU CUGGGUCACGGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGU GGCUCCUCAGGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGA GACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAU GUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGC AUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAC GCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCC >hBgB GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCU GCCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCC CAUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGC ACAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC >hBgD GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCU UCCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUU GCCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCU UUUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC >hBgE GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCG CCUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAG CUGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCA UCCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCC CCCC >hBgF GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCC UGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACC CCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGC CCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC >hBgG GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCC UGACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGG GCAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCAC GGUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCA GGCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC >hBghBg GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCG AGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCC UAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUG GAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUC >hBgI GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCC AAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGG GAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUA CUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC >hBgJ GAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCC UUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUU GAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCC UUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGA GACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAU GUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGC AUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAAC GCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCC >IB CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCAC ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUA ACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCUG CCCGUCCUCACCAAGACUGACUGCCUGCUGCUUUGCUACUGCCCGGGCCC AUGAGACUGACUUCCCACUGCUCUGCCUGCCUCUCCCCACUGCACUGGCA CAGCCCCGCCUUGCCGCUGCUGAUCCAUUGCCGGUGUGACC >ID CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCAC ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUA ACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCUU CCAGCCAGACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUG CCAGCAUGACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUU UUGCUCCUGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC >IE CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCAC ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUA ACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGC CUUGGCUCCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGC UGCUCCCCGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAU CCCUGUGGCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCC CCC >IF CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCAC ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUA ACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCCU GGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCC CGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCC CCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC >IG CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCAC ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUA ACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCCU GACAGCGUGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGG CAGGCCAAGGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACG GUCCCUGUCCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAG GCUCUCUCCCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC >IhBg CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCAC ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUA ACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCGA GAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCU AAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGG AUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUC >II CAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCAC ACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUA ACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCCA AGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGG 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GCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGA AGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU UUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCUUCCAGCCA GACACCCGCCCCCCGGCCCUGGCUAAGAAGUUGCUUCCUGUUGCCAGCAU GACCUACCCUCGCCUCUUUGAUGCCAUCCGCUGCCACCUCCUUUUGCUCC UGGACCCUUUAGCCUCUCUGCCCUUCCACUCUCUGACCCC >JE CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUC CACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCU GCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGA AGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU UUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCGCCUUGGCU CCUCCAGGAAGGCUCAGGAGCCCUACCUCCCUGCCAUUAUAGCUGCUCCC CGCCAGAAGCCUGUGCCAACUCUCUGCAUUCCCUGAUCUCCAUCCCUGUG GCUGUCACCCUUGGUCACCUCCGUGCUGUCACUGCCAUCUCCCCCC >JF CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUC CACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCU GCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGA AGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU UUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCCUGGUACUG CAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCU CCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCA CCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCC >JG CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUC CACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCU GCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGA AGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU UUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCCUGACAGCG UGGGCAACGCCUGCCGCCUGCUCUGAGGCCCGAUCCAGUGGGCAGGCCAA GGCCUGCUGGGCCCCCGCGGACCCAGGUGCUCUGGGUCACGGUCCCUGU CCCCGCACCCCCGCUUCUGUCUGCCCCAUUGUGGCUCCUCAGGCUCUCUC CCCUGCUCUCCCACCUCUACCUCCACCCCCAC >JhBg CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUC CACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCU GCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGA AGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU UUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCGAGAGCUCG CUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAA CUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCC UAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUC >JI CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUC CACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCU GCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGA AGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU UUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCCAAGCACGCA GCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCA GUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCA GGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC >JJ CUUUGCAGGAUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUC CACAAGAGAGACCUUUCUCCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCU GCAGAAAAUGUCCUCCCCUGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGA AGUCCCAGCAUUGAUGGCAGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCU UUACCUAACGCUUCCUGCCUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCCCUUUGCAGG AUGAAACACUUCCCCGCUUGGCUCUCAUUCUUCCACAAGAGAGACCUUUCU CCGGACCUGGUUGCUACUGGUUCAGCAACUCUGCAGAAAAUGUCCUCCCC UGUGGCUGCCUCAGCUCAUGCCUUUGGCCUGAAGUCCCAGCAUUGAUGGC AGCCCCUCAUCUUCCAAGUUUUGUGCUCCCCUUUACCUAACGCUUCCUGC CUCCCAUGCAUCUGUACUCCUCC >FI UTR 97,5% de homologia (modificações aleatórias) CUGGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUC CUGGGUACCCCGAGUCACCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACC UCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCAC GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAUCGAAUGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 95% de homologia (modificações aleatórias) CUCGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUC CUGGGUACCCCGAGUCACCACCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACC UCCACGUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCAC GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GUAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAUCGAAUGUCUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGAUCAAUUACGUGCCAGCCACACC > FI UTR 92,5% de homologia (modificações aleatórias) CUCGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUC CUGGGUACCCCGAGUCACCACCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACC UCCACGUGCCCCACUCACCACCUUUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAUGCAC GCAGCAAUGCAGAUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GUAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAUCGAAUGUCUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGAUCAAUUACGUGCCAGCCACACC > FI UTR 90% de homologia (modificações aleatórias) GUCGUACUGCAUGGACGCAAUGCUAGCAGCACCUUUCCCGUC CUGGGUACCCCGAGUCACCACCGACCUCGGGUCCCAGGUAUCGUCCCACC UCCACGUGCCCCACCCACCACCUUUGCUAGUUCCAGAGACCUCCCAUGCAC GCAGCAAUGCAGAUCAAAACGCUUAGCAUAGCCACACCGCCACGGGAAACA GUAGUGAUCAACCUUUAGCUAUAAUCGAAUGUCUAACUAAGCUAUUCUAAC CACAGGGUUGAUCAAUUACGUGCCAGCCAGACC > FI mutação 8nt CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCAAAGGGCUC CUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACC UCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCAC GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 98,75% de homologia (modificações desestabilizadoras de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUG GUCCGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACC UCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCAC GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 97,5% de homologia (modificações desestabilizadoras de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUG GACCGUACGGCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACC UCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCAC GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 96,25% de homologia (modificações desestabilizadoras de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGCCGU GGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCAC CUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCA CGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAAC AGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 95% de homologia (modificações desestabilizadoras de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGGGCU GGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCAC CUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCA CGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAAC AGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 97,5% de homologia (modificações de retenção de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUG GUCCGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCGGACCUAUGCUCCCACC UCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCAC GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 95% (modificações de retenção de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUG GACCGUACGGCGAGUCUCCCCCGACCUCGCCUCGGUCCUAUGCUCCCACC UCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCAC GCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACA GCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 92,5% (modificações de retenção de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGCCGU GGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCAGCCCUCGGUCCUAUGCUCCCAC CUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCA CGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGCAAAC AGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC > FI UTR 90% (modificações de retenção de estrutura) CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUGGGCU GGACCGUACGGGCUGUCUCCCCCGACCAGCCCUCGGUCCUAUGCUCCCAC CUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCA CGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCAGCCCAAAC AGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAAC CCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC

Claims (30)

1. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por compreender na direção 5’ ^ 3’ de transcrição: (a) um promotor; (b) uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita ou uma sequência de ácido nucleico para introdução de uma sequência ácido nucleico que pode ser transcrita; e (c) uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica para uma região não traduzida 3’ no transcrito, dita região não traduzida 3’ compreendendo uma sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de Enhancer de Split Amino-Terminal (AES) e/ou uma sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de RNA 12S codificado na mitocôndria (MT-RNR1), em que (i) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES compreende uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136 ou posições 68 a 136 da SEQ ID NO: 86, (j) ) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT- RNR1 compreende uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142 ou posições 71 a 142 da SEQ ID NO: 115, e (k) i) a região não traduzida 3’ compreende uma combinação de uma sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e uma sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, em que a região não traduzida 3’ compreendendo uma combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174 ou um fragmento da mesma.

2. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por: (i) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES compreender uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136 ou posições 68 a 136 de SEQ ID NO: 86, e (ii) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT- RNR1 compreender a sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142 ou posições 71 a 142 de SEQ ID NO: 115.

3. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pelas sequências de ácidos nucleicos (b) e (c) sob o controle do promotor de (a) poderem ser transcritas para resultar em um transcrito comum no qual a sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (c) está ativa, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (b).

4. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pela sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES estar localizada a 5’ da sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1.

5. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreender a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174.

6. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreender um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174.

7. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por ainda compreender (d) uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila.

8. MOLÉCULA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela sequência de poliadenila compreender dentro da sequência de poliadenila, uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, em que (i) dita sequência de poliadenila compreende pelo menos 20 nucleotídeos A, pelo menos 40, pelo menos 80, pelo menos 100 ou pelo menos 120 nucleotídeos A, nucleotídeos A consecutivos; e/ou (ii) dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é uma sequência arbritária de 2 ou mais nucleotídeos consecutivos, em que o primeiro e o último nucleotídeo de dita sequência de 2 ou mais nucleotídeos consecutivos é um nucleotídeo diferente de um nucleotídeo A; e/ou (iii) dita sequência de ácido nucleico (d) ser uma sequência de ácido nucleico que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila que compreende dentro da sequência de poliadenila, uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A e que apresenta maior estabilidade mediante a propagação da dita molécula do ácido nucleico em Escherichia coli em comparação a uma molécula de ácido nucleico que compreende, em vez da dita sequência de ácido nucleico (d), uma sequência de ácido nucleico (d)’ que, quando transcrita sob o controle do promotor (a), codifica para uma sequência de poliadenila do mesmo comprimento que a dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila que compreende dentro da sequência de poliadenila, uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A; e/ou (iv) dita sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenila compreendendo dentro da sequência de poliadenila, uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, compreende pelo menos 80 nucleotídeos, pelo menos 90 ou 100 nucleotídeos; e/ou (v) dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A está localizada dentro de uma região a partir da posição 21 a posição 80, a partir da posição 21 a posição 60 ou a partir da posição 31 a posição 50 da dita sequência de poliadenila; e/ou (vi) dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A é precedida por pelo menos 20 resíduos A na dita sequência de poliadenila e/ou é seguida por pelo menos 20 resíduos A na dita sequência de poliadenila; e/ou (vii) dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A possui um comprimento de pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 8, pelo menos 10 ou pelo menos 15 nucleotídeos; e/ou (viii) dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A possui um comprimento de não mais que 50, não mais que 30 ou não mais que 20 nucleotídeos; e/ou (ix) dita sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A não compreendem mais que 3, não mais que 2 ou nenhum resíduo A consecutivo; e/ou (x) as sequências de ácidos nucleicos (b), (c) e (d) sob o controle do promotor (a) podem ser transcritas para resultar em um transcrito comum, em que as sequências de ácidos nucleicos transcritas a partir das sequências de ácidos nucleicos (c) e (d) estão ativas, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (b); e/ou (xi) no transcrito, dita sequência de poliadenila que é uma sequência de poliadenila compreendendo dentro da sequência de poliadenila, uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, está localizada na extremidade 3’.

9. MOLÉCULA, de acordo qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por compreender adicionalmente (d) uma sequência de ácido nucleico, a qual, quando transcrtira sob o controle do promotor (a), codifica uma sequencia de ácido nucleico que é uma sequência poliadenila, em que dita sequência de poliadenila compreende pelo menos 120 nucleotídeos A.

10. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por ser uma molécula circular fechada ou uma molécula linear.

11. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pela sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína e a sequência de ácido nucleico para introdução de uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita ser um sítio de clonagem múltiplo.

12. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por ainda compreender um ou mais membros selecionados partir do grupo que consiste em: (i) um gene repórter; (ii) um marcador selecionável; e (iii) uma origem de replicação.

13. MOLÉCULA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada por ser adequada, em particular, após linearização, para transcrição in vitro de RNA, em particular, mRNA.

14. MÉTODO PARA OBTER RNA, caracterizado por compreender: (A) (i) fornecer uma molécula de ácido nucleico, conforme defnida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e (ii) transcrever o RNA com o uso da molécula de ácido nucleico como molde, em que o método ainda compreende, anteriormente a transcrição da molécula de ácido nucleico, a clivagem da molécula de ácido nucleico; ou (B) (i) acoplar uma sequência de ácido nucleico (b) que, quando transcrita, codifica uma região não traduzida 3’, na extremidade 3’ de uma sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (a) que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína, e (C) ) transcrever o ácido nucleico obtido, em que a dita região não traduzida 3’ compreende uma sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de Enhancer de Split AminoTerminal (AES) e/ou uma sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de RNA 12S codificado na mitocôndria (MT-RNR1), em que a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES compreende uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136 ou posições 68 a 136 da SEQ ID NO: 86, a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 que compreende uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142 ou posições 71 a 142 da SEQ ID NO: 115, e a região não traduzida 3’ compreende uma combinação de uma sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e uma sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, em que a região não traduzida 3’ compreendendo uma combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreende uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174 ou um fragmento da mesma.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por, em (B): (i) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES compreender uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136 ou posições 68 a 136 de SEQ ID NO: 86, e (ii) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT- RNR1 compreender a sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142 ou posições 71 a 142 de SEQ ID NO: 115.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por, em (B), a combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreender a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por, em (B), a combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreender um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelas sequências de ácidos nucleicos (a) e (b) poderem ser transcritas para resultar em um transcrito comum no qual a sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico (b) está ativa, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (a), e/ou em que o método compreende ainda acoplar a sequência de acido nucleico (c), a qual, quando transcrita, codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenina compreendendo dentro da sequência de poliadenila, uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos de A, na extremidade 3’ da sequência de ácido nucleico (b), em que as sequências de ácidos nucleicos (a), (b) e (c) podem ser transcritas para resultar em um transcrito comum no qual as sequências de ácidos nucleicos transcritas a partir das sequências de ácidos nucleicos (b) e (c) estão ativas, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico transcrita a partir da sequência de ácido nucleico que pode ser transcrita (a), e/ou em que a transcrição ocorre in vitro.

19. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado por compreender ainda acoplar a sequência de acido nucleico (c), a qual, quando transcrita, codifica uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência de poliadenina, na extremidade 3’ da sequência de ácido nucleico (b), em que dita sequência de poliadenina compreende pelo menos 120 nucleotídeos A.

20. RNA, caracterizado por: (A) ser obtido por transcrição, particularmente transcrição in vitro, com o uso de uma molécula de ácido nucleico, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, como molde; ou (B) ser obtido pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19; ou (C) compreender na direção 5' ^ 3': (a) uma região não traduzida 5’; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína; e (c) uma região não traduzida 3’, dita região não traduzida 3’ compreendendo uma sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de Enhancer de Split Amino-Terminal (AES) ou uma sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de RNA 12S codificado na mitocôndria (MT-RNR1), em que (D) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES compreende uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136 ou posições 68 a 136 da SEQ ID NO: 86, (E) ) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT- RNR1 que compreende uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142 ou posições 71 a 142 da SEQ ID NO: 115, e (F) i) a região não traduzida 3’ compreende uma combinação de uma sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e uma sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1, em que a região não traduzida 3’ compreendendo uma combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174 ou um fragmento da mesma.

21. RNA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por, em (C): (i) a sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES compreender uma sequência de ácido nucleico de posições 1 a 68, posições 1 a 102, posições 35 a 102, posições 35 a 136 ou posições 68 a 136 de SEQ ID NO: 86, e (ii) a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT- RNR1 compreender a sequência de ácido nucleico de posições 1 a 71, posições 1 a 107, posições 37 a 107, posições 37 a 142 ou posições 71 a 142 de SEQ ID NO: 115.

22. RNA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por, em (C), a combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreender a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174.

23. RNA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por, em (C), a combinação da sequência de ácido nucleico da região não traduzida 3’ de AES e a sequência de ácido nucleico do RNA não codificador de MT-RNR1 compreender um fragmento da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 174.

24. RNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado por ainda compreender (d) uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência poliadenila compreendendo dentro da sequência de poliadenila, uma sequência de um ou mais nucleotídeos consecutivos contendo nucleotídeos diferentes de nucleotídeos A, em que dita sequência de ácido nucleico (d) está localizado na extremidade 3’ de dito RNA, e/ou as sequências de ácidos nucleicos (c) e (d) estão ativas, de modo a aumentar a eficiência de tradução e/ou a estabilidade da sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo ou proteína, e/ou em que o RNA compreende ainda (e) um 5’-cap; e/ou em que o RNA inclui bases alteradas ou modificadas quimicamente, nucleotídeos de ocorrência não natural ou nucleotídeos sintetizados quimicamente.

25. RNA, de acordo qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado por compreender adicionalmente (d) uma sequência de ácido nucleico que é uma sequência poliadenila, em que dita sequência de poliadenila compreende pelo menos 120 nucleotídeos A.

26. MÉTODO PARA OBTER UM PEPTÍDEO OU PROTEÍNA, caracterizado por compreender: (A) (i) obter RNA que codifica o peptídeo ou proteína de acordo com o método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 19, e (ii) traduzir o RNA; ou (B) traduzir o RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 25, em que nos casos (A) e (B), a transcrição ocorre in vitro.

27. USO IN VITRO OU EX VIVO DO RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado por ser para transfectar uma célula hospedeira.

28. USO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pela dita célula hospedeira ser uma célula apresentadora de antígeno, em particular, uma célula dendrítica, um monócito ou um macrófago.

29. USO IN VITRO OU EX VIVO DO RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado por ser para vacinação.

30. USO IN VITRO OU EX VIVO DO RNA, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 25, caracterizado por ser para reprogramar células somáticas para células que têm características de células-tronco.