CN117750974A - 病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及预防或治疗病毒感染的领域。特别地，本公开涉及用于针对病毒感染进行疫苗接种并诱导有效的病毒抗原特异性免疫应答(如抗体和/或T细胞应答)的药剂以及用于产生和使用这些药剂的方法。向受试者给药本文公开的诸如RNA的药剂可以保护受试者免受病毒感染。具体地，本公开涉及包含病毒蛋白的至少一部分的氨基酸序列，所述病毒蛋白具有在病毒蛋白的其他变体中发现的氨基酸修饰。给药编码一种或多种氨基酸序列的RNA可以提供针对多种病毒变体的保护。特别地，本文所述的方法和药剂可以用于预防或治疗冠状病毒感染，如SARS‑CoV‑2感染。

Description

病毒疫苗
技术领域
本公开涉及预防或治疗病毒感染的领域。特别地，本公开涉及用于针对病毒感染进行疫苗接种并诱导有效的病毒抗原特异性免疫应答(如抗体和/或T细胞应答)的药剂，以及产生和使用此类药剂的方法。向受试者给药本文公开的诸如RNA的药剂可以保护受试者免受病毒感染。具体地，本公开涉及包含病毒蛋白的至少一部分的氨基酸序列，所述病毒蛋白具有在病毒蛋白的其他变体中发现的氨基酸修饰。给药编码一种或多种氨基酸序列的RNA可以提供针对多种病毒变体的保护。本文所述的方法和药剂特别地用于预防或治疗冠状病毒感染，如SARS-CoV-2感染。
背景技术
随着病毒的复制，其基因进行随机的“拷贝错误”(即基因突变)。随着时间的推移，除病毒其他变化外，这些基因拷贝错误，会导致病毒表面蛋白或抗原的变化。基因突变可能导致病毒抗原“漂移”，这意味着突变病毒的表面看起来与原始病毒不同。当病毒漂移足够时，针对旧病毒株的疫苗和来自以前感染病毒的免疫力可能不再对新的漂移病毒株有效。然后一个人可能变得容易受到较新的突变病毒的攻击。
冠状病毒是正义单链RNA((+)ssRNA)包膜病毒，其编码总共4种结构蛋白，刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核壳蛋白(N)。刺突蛋白(S蛋白)负责受体识别，附着至细胞，通过内体途径感染以及由病毒和内体膜融合驱动的基因组释放。虽然不同家族成员之间的序列不同，但是在S蛋白内有保守区域和基序，使得可以将S蛋白分为两个子结构域：S1和S2。S2，具有其跨膜结构域，负责膜融合，而S1结构域识别病毒特异性受体并结合至靶宿主细胞。在几种冠状病毒分离株内，鉴定了受体结合结构域(RBD)并定义了S蛋白的一般结构(图1)。
SARS-CoV-2(严重急性呼吸综合征冠状病毒2)的基因序列已为WHO和公众所获得(MN908947.3)，并且该病毒被分类为β冠状病毒亚科。通过序列分析，系统发生树显示与严重急性呼吸综合症(SARS)病毒分离物的关系比与另一感染人的冠状病毒(即中东呼吸综合症(MERS)病毒)的关系更为密切。
SARS-CoV-2感染及导致的COVID-19疾病已在全球蔓延，影响到越来越多的国家。2020年3月11日，WHO将COVID-19的爆发定性为大流行病。截至2020年12月1日，全球已有超过6,300万例COVID-19确诊病例，超过140万人死亡，191个国家/地区受到影响。持续的大流行仍是对全球公共卫生和经济稳定的重大挑战。
由于对SARS-CoV-2没有先天免疫力，因此每个个体都有感染的风险。感染后，一些个体(但不是所有个体)会产生在中和抗体应答和细胞介导的免疫方面的保护性免疫力。然而，目前尚不清楚这种保护的程度和持续时间。根据WHO，80％的受感染个体无需住院治疗即可恢复，15％的受感染个体发展更严重的疾病，5％的受感染个体需要重症监护。年龄增长和基础疾病被认为是发展严重疾病的风险因素。
COVID-19通常表现为咳嗽和发热，胸片显示磨玻璃影(ground-class opacity)或斑片状阴影。但是，许多患者无发热或影像学变化，并且感染也可能无症状，这与控制传播有关。对于有症状的受试者，疾病发展可能导致急性呼吸窘迫综合征，需要通气，继而导致多器官衰竭和死亡。住院患者的常见症状(按频率从最高到最低)包括发烧、干咳、呼吸急促、疲劳、肌痛、恶心/呕吐或腹泻、头痛、虚弱和鼻漏。约3％的患有COVID-19个体会以嗅觉缺失(嗅觉丧失)或味觉缺失(味觉丧失)为唯一主要症状。
所有年龄都可能出现该疾病，但60岁以上人的病死率(CFR)明显升高。合并症(包括心血管疾病、糖尿病、高血压和慢性呼吸道疾病)也与CFR增高有关。在COVID-19患者中，由于职业暴露于受感染的患者，医护人员所占比例过高。
在大多数情况下，使用分子测试来检测SARS-CoV-2并确认感染。针对SARS-CoV-2病毒RNA的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测试方法是诊断COVID-19疑似病例的金标准体外方法。测试样本用拭子从鼻腔和/或咽喉采集。
SARS-CoV-2是一种RNA病毒，有四种结构蛋白。其中的刺突(spike)蛋白是一种表面蛋白，其结合宿主细胞上存在的血管紧张素转化酶2(ACE-2)。因此，刺突蛋白被认为是开发疫苗的相关抗原。
BNT162b2是一种用于预防COVID-19的mRNA疫苗，据证实其预防COVID-19的效力为95％或更高。该疫苗由编码全长SARS-CoV-2刺突糖蛋白(S)的5’加帽mRNA制成，包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。成品为含有BNT162b2作为活性物质的注射用分散体浓缩液(concentrate for dispersion for injection)。其他成分有：ALC-0315(4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)、ALC-0159(2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、氯化钾、磷酸二氢钾、氯化钠、磷酸氢二钠二水合物、蔗糖和注射用水。
S蛋白的序列基于“SARS-CoV-2分离株Wuhan-Hu-1”的序列选择，其在计划启动时可得：GenBank:MN908947.3(完整基因组)和GenBank:QHD43416.1(刺突表面糖蛋白)。活性物质由单链、5'加帽-密码子优化的mRNA组成，其翻译成SARS-CoV-2的刺突抗原。蛋白序列含有两个脯氨酸突变，这确保抗原性最佳的融合前构象(confirmation)(P2S)。RNA不含任何尿苷，而是使用修饰的N1-甲基假尿苷代替尿苷来进行RNA合成。RNA含有常规的结构元件，其经过优化以介导高RNA稳定性和翻译效率。LNP保护RNA免受RNAse降解，并能在肌肉内(IM)递送后转染宿主细胞。mRNA在宿主细胞中翻译成SARS-CoV-2 S蛋白。然后，S蛋白在细胞表面表达，在那里诱导适应性免疫应答。S蛋白被确定为针对病毒的中和抗体的靶标，因此认为是相关的疫苗成分。BNT162b2以两个30μg剂量的稀释疫苗溶液肌肉内(IM)给药，间隔21天给药。
最近出现的新型SARS-CoV-2流行变体引起对疫苗干预的地域和时间效力的极大关注。D614G是最早出现的变体之一，并迅速成为全球主导变体。此外，最近在英国进行的基因组监测发现，称为B.1.1.7(又称为VOC-202012/01或501Y.V1)的新谱系迅速扩张。B.1.1.7在刺突中带有三个氨基酸缺失和七个错义突变，包括ACE2受体结合结构域(RBD)中的D614G和N501Y。在多个国家的研究中，它已被证明本质上具有更强的传播性，估计增长率比其他SARS-CoV-2谱系高40-70％(Volz et al.,2021,Nature,https://doi.org/10.1038/s41586-021-03470-x；Washington et al.,2021,Cell https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.03.052)。
研究表明，BNT162b2疫苗引发的人血清交叉中和B.1.1.7变体，表明之前感染或疫苗接种野生型SARS-CoV-2仍可以提供针对B.1.1.7变体的保护(Muik A.et al.,2021,Science 371(6534):1152-1153)。
在丹麦，也有关于SARS-CoV-2在人与水貂之间传播的报道，这种变体称为水貂簇5或B.1.1.298，其带有两个氨基酸缺失和四个错义突变，包括RBD中的Y453F。
最近在美国加利福尼亚出现的其他变体命名为B.1.427/B.1.429，其含有刺突中的四个错义突变，其中一个是单个的L452R RBD突变。
首次在巴西和日本描述的从B.1.1.28谱系中产生的新变体称为P.2(具有3个刺突错义突变)和P.1(具有12个刺突错义突变)，其中RBD中含有E484K突变，这一点尤其关注，特别是P.1，还含有RBD中的K417T和N501Y突变。
B.1.351谱系(又称为501Y.V2)的多种毒株的出现首次在南非报道，随后蔓延到全球，这引起了极大关注。除了RBD之外的几种突变，这个谱系还带有三个RBD突变K417N、E484K和N501Y。据报道，使用BNT162b2诱导的血清，与USA-WA1/2020毒株的中和相比，B.1.1.7刺突和P.1刺突病毒的中和大致相同，并且B.1.351刺突病毒的中和稳健，但较低(Liu Y.et al.,2021,N Engl J Med.,doi:10.1056/NEJMc2102017.Epub ahead ofprint.PMID:33684280)。鉴于新变体的出现，它们看起来至少部分地逃避免疫应答，因此亟需有效针对SARS-CoV-2变体的疫苗。
本公开提供包括多种病毒蛋白变体表位的疫苗以及提供此类疫苗的方法。本文所述的策略基于将不同病毒变体的不同表位组合到有限数目的分子上，而不是重新配制现有疫苗，以包括不同病毒变体的不同病毒蛋白序列或编码核酸。这允许给药相对低剂量的活性成分，特别是mRNA，同时实现足够高剂量的每个表位以诱导有效的免疫应答。据设想，本文所述的疫苗能够激发广泛的中和抗体，因此适用于解决持续的SARS-CoV-2大流行。
发明内容
本发明整体上涉及一种疫苗，其中病毒蛋白的不同变体的表位组合在单个分子上。这样的分子包含病毒蛋白的至少一部分，其中所述病毒蛋白包含所述病毒蛋白的其他变体中存在的氨基酸修饰。所述修饰会产生(额外的)表位，其对这样的其他病毒蛋白变体是特异性的。因此，本文所述的修饰的病毒蛋白序列是多特异性病毒蛋白氨基酸序列。在一实施方案中，多特异性病毒蛋白氨基酸序列是修饰的全长病毒蛋白。在一实施方案中，多特异性病毒蛋白氨基酸序列是病毒蛋白的修饰的部分。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性病毒蛋白氨基酸序列可以包含来自多种(例如至少两种或更多种，包括例如至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种等)病毒蛋白变体的免疫反应性表位，例如，来自亲本病毒蛋白的免疫反应性表位，以及额外的，来自一种或多种与亲本病毒蛋白不同的病毒蛋白变体的免疫反应性表位。在各种实施方案中，本文提供的多特异性病毒蛋白氨基酸序列可以包含来自一种或多种与亲本病毒蛋白不同的病毒蛋白变体的所有免疫反应性表位((修饰的)氨基酸残基)，或其部分。在各种实施方案中，本文提供的多特异性病毒蛋白氨基酸序列可以包含多种(例如至少两种或更多种，包括例如至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种等)来自一种或多种与亲本病毒蛋白不同的病毒蛋白变体的免疫反应性表位((修饰)氨基酸残基)。
在一些实施方案中，包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的氨基酸序列由诸如DNA或RNA(特别是RNA)的核酸编码。在一些实施方案中，各自包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的多种氨基酸序列由诸如DNA或RNA(特别是RNA)的核酸编码。在一些实施方案中，各自包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的多种氨基酸序列由诸如DNA或RNA分子(特别是RNA分子)的多种核酸分子编码。
考虑到诸如RNA病毒的病毒的遗传多样性，本文所述的包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的氨基酸序列和编码这些氨基酸序列的核酸对于提供针对多种病毒变体的保护是特别有用的。本文所述的包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的氨基酸序列和编码这些氨基酸序列的核酸可以提供开发多样的和/或其他稳健的(例如，持续的，例如，在给药一个或多个剂量后约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或更多天后可检测到的)中和抗体和/或T细胞应答，例如，TH1型T细胞(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)应答的机会。本文所述的包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核酸预期会引起免疫应答，特别是抗体应答，其广泛且特异地中和多种(例如至少两种或更多种，包括例如至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种等)病毒变体毒株，并具有在有限数目的构建体中产生对一系列病毒变体毒株的保护性免疫应答的潜力。一般来说，有限数目的构建体包括一定数量的分子(蛋白和/或核酸分子)，其少于不同病毒蛋白变体的数目，例如1、2、3或4个分子，这样每个分子包含与多种病毒蛋白变体对应的表位序列。一般来说，本文所述的包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的氨基酸序列(即疫苗抗原)和编码这些氨基酸序列的核酸可用于受试者的免疫治疗。疫苗抗原包含病毒蛋白表位，其源自受试者中的多种病毒蛋白变体(因此是病毒变体毒株)，并且对针对受试者中的多种病毒蛋白变体(因此是病毒变体毒株)诱导免疫应答具有特异性。在一实施方案中，本发明包括给药编码一种或多种本文所述的疫苗抗原的核酸，如RNA，即疫苗RNA。在一实施方案中，本发明包括给药多个(例如2、3或4个)编码不同疫苗抗原的核酸分子(如RNA分子)。不同的疫苗抗原(可能基于相同的亲本病毒蛋白序列)可以包含不同的修饰(任选地来自不同的病毒株)，因此不同的免疫原性谱。可以给药编码疫苗抗原的RNA，以提供(通过适当的靶细胞表达RNA后)用于诱导，即刺激、引发和/或扩增免疫应答的抗原，例如抗体和/或免疫效应细胞，其靶向靶抗原(病毒蛋白，特别是不同的病毒蛋白变体)或其加工产物。在一实施方案中，本公开要诱导的免疫应答是B细胞介导的免疫应答，即抗体介导的免疫应答。额外地或可选地，在一实施方案中，本公开要诱导的免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一实施方案中，免疫应答是抗病毒免疫应答。在一实施方案中，免疫应答是针对多种病毒株的免疫应答。
在一方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定亲本病毒蛋白中的氨基酸位置，与一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置相比，所述氨基酸位置是修饰的；以及
b)提供包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，或编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一实施方案中，所述方法包括重复步骤b)以提供两种或更多种修饰的氨基酸序列，或者两种或更多种编码两种或更多种修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列基于相同的亲本病毒蛋白。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列中的氨基酸修饰至少部分不同。
在一实施方案中，提供核苷酸序列包括：
b')用其他密码子替代核苷酸序列的密码子，所述核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的突变的核苷酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸。
在一实施方案中，所述方法包括重复步骤b')以提供两种或更多种突变的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码两种或更多种修饰的氨基酸序列。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列基于相同的亲本病毒蛋白。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列中的氨基酸修饰至少部分不同。
在一方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定亲本病毒蛋白中的氨基酸位置，与一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置相比，所述氨基酸位置是修饰的；
b)用其他密码子替代第一核苷酸序列的密码子，所述第一核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的第一突变的核苷酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
c)用其他密码子替代第二核苷酸序列的密码子，所述第二核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的第二突变的核苷酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与c)中的氨基酸修饰不同。
在一实施方案中，所述方法可以包括一个或多个进一步替代密码子以获得编码至少部分不同的氨基酸修饰的突变的核苷酸序列这样的步骤。
在一实施方案中，第一核苷酸序列编码的氨基酸序列中包含的亲本病毒蛋白的至少一个片段与第二核苷酸序列编码的氨基酸序列中包含的亲本病毒蛋白的至少一个片段相同。
在一实施方案中，第一核苷酸序列编码的氨基酸序列与第二核苷酸序列编码的氨基酸序列相同。
在一实施方案中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列相同。
在一实施方案中，第一突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中的一个或多个修饰的氨基酸位置与第二突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中的修饰的氨基酸位置不同，即一个或多个不同位置是修饰的。
在一实施方案中，第一突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中修饰的氨基酸位置中的一个或多个氨基酸与第二突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中修饰的氨基酸位置中的一个或多个氨基酸互相不同，即一个或多个相同的位置是修饰的，但氨基酸残基不同。
在一实施方案中，包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列包含全长病毒蛋白的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述方法还包括提供包含编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。
在一实施方案中，所述方法还包括提供疫苗，其包含核酸，所述核酸包含编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一实施方案中，核酸是RNA。
在一实施方案中，所述方法是产生疫苗的方法。
在一实施方案中，疫苗是RNA疫苗。
在一实施方案中，疫苗具有降低的免疫逃逸的风险。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置是一种或多种病毒蛋白变体的氨基酸序列与亲本病毒蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸位置。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置是一种或多种病毒蛋白变体的氨基酸序列与野生型病毒蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸位置。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置是病毒的逃逸突变体的潜在位点。
在一实施方案中，病毒的逃逸突变体是病毒的抗体逃逸突变体。
在一实施方案中，病毒的逃逸突变体对针对病毒蛋白的抗体的中和具有抗性。
在一实施方案中，病毒的逃逸突变体的病毒蛋白表现出降低的抗体结合。
在一实施方案中，抗体用于治疗感染病毒的患者。
在一实施方案中，抗体在已经用针对病毒感染的疫苗治疗的患者中产生。
在一实施方案中，与野生型病毒蛋白相比，亲本病毒蛋白是修饰的。
在一实施方案中，在修饰的氨基酸序列中，与野生型病毒蛋白相比是修饰的亲本病毒蛋白中的氨基酸位置不是修饰的。
在一实施方案中，亲本病毒蛋白是亲本病毒株的病毒蛋白。
在一实施方案中，亲本病毒株是天然分离株，或者亲本病毒株是天然分离株的突变体。
在一实施方案中，亲本病毒株是流行或迅速传播的病毒变体毒株。
在一实施方案中，亲本病毒株是关注的变体的病毒变体。
在一实施方案中，与野生型病毒蛋白相比，一种或多种病毒蛋白变体是修饰的。
在一实施方案中，与亲本病毒蛋白相比，一种或多种病毒蛋白变体是修饰的。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，与野生型病毒蛋白和/或亲本病毒蛋白相比是修饰的一种或多种病毒蛋白变体中的氨基酸位置是修饰的。
在一实施方案中，一种或多种病毒蛋白变体的一种或多种(例如全部)是一种或多种病毒株的病毒蛋白。
在一实施方案中，一种或多种病毒株的一种或多种(例如全部)是天然分离株，或者一种或多种病毒株的一种或多种(例如全部)是天然分离株的突变体。
在一实施方案中，一种或多种病毒株的一种或多种(例如全部)是流行或迅速传播的病毒变体毒株。
在一实施方案中，一种或多种病毒株的一种或多种(例如全部)是关注的变体的病毒变体毒株。
在一实施方案中，亲本病毒株和一种或多种病毒株是流行或迅速传播的病毒变体毒株。
在一实施方案中，亲本病毒株和一种或多种病毒株是关注的变体的病毒变体毒株。
在一实施方案中，与野生型病毒蛋白相比，亲本病毒蛋白和一种或多种病毒蛋白变体是修饰的。
在一实施方案中，一种或多种病毒蛋白变体包含至少两种病毒株的病毒蛋白变体。
在一实施方案中，b)中的一种或多种病毒蛋白变体与c)中的一种或多种病毒蛋白变体不同。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，亲本病毒蛋白中与野生型病毒蛋白相比的氨基酸修饰不干扰所述修饰的氨基酸位置中的氨基酸修饰。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，亲本病毒蛋白中与野生型病毒蛋白相比的氨基酸修饰与所述修饰的氨基酸位置或者所述修饰的氨基酸位置中的氨基酸修饰在空间距离上并不接近。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，所述修饰的氨基酸位置中的修饰不导致重大(major)的结构重排。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置中的氨基酸是表面暴露的。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置包含一个或多个，例如至少两个氨基酸位置。所述修饰可以对应于一种或多种病毒蛋白变体/病毒株，并且可以包含与亲本病毒蛋白/病毒株相比在一种或多种病毒蛋白变体/病毒株中存在的所有修饰，或其部分。
在一实施方案中，b)和c)中的修饰的氨基酸位置各自包含一个或多个，例如至少两个氨基酸位置。
在一方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含第一核苷酸序列的核酸，所述第一核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
b)提供包含第二核苷酸序列的核酸，所述第二核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与a)中的氨基酸修饰不同。
在一实施方案中，所述方法可以包括一个或多个进一步提供编码至少部分不同的氨基酸修饰的核酸这样的步骤。
在一实施方案中，核酸是RNA。
进一步的实施方案如本文所述。
在一方面，本发明涉及一种医药制品，其包含：
a)核酸，其包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
b)核酸，其包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与a)中的氨基酸修饰不同。
在一实施方案中，医药制品可以包含一个或多个其他核酸，所述其他核酸编码至少部分不同的氨基酸修饰。
在一实施方案中，核酸是RNA。
在一实施方案中，RNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。
在一实施方案中，医药制品是药物组合物。
在一实施方案中，医药制品是疫苗。
在一实施方案中，医药制品是试剂盒。
在一实施方案中，医药制品还包含用于针对病毒感染进行疫苗接种的医药制品使用说明。
在一方面，本发明涉及医药制品，其用于制药用途。
在一实施方案中，制药用途包括针对病毒感染进行疫苗接种。
在一方面，本发明涉及一种在受试者诱导针对病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药医药制品。
在一实施方案中，所述方法是针对病毒感染的预防性治疗方法。
在一实施方案中，所述方法是针对病毒感染的疫苗接种方法。
上述方面的进一步实施方案如本文所述。
在一实施方案中，本文所述的病毒为SARS-CoV-2。在一实施方案中，本文所述的病毒蛋白为SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)。
在一方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定亲本SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)中的氨基酸位置，与一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置相比，所述氨基酸位置是修饰的；以及
b)提供包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，或编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一实施方案中，所述方法包括重复步骤b)以提供两种或更多种修饰的氨基酸序列，或者两种或更多种编码两种或更多种修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列基于相同的亲本SARS-CoV-2 S蛋白。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列中的氨基酸修饰至少部分不同。
在一实施方案中，提供核苷酸序列包括：
b')用其他密码子替代核苷酸序列的密码子，所述核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的突变的核苷酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸。
在一实施方案中，所述方法包括重复步骤b')以提供两种或更多种突变的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码两种或更多种修饰的氨基酸序列。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列基于相同的亲本SARS-CoV-2 S蛋白。
在一实施方案中，两种或更多种修饰的氨基酸序列中的氨基酸修饰至少部分不同。
在一方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定亲本SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)中的氨基酸位置，与一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置相比，所述氨基酸位置是修饰的；
b)用其他密码子替代第一核苷酸序列的密码子，所述第一核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的第一突变的核苷酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
c)用其他密码子替代第二核苷酸序列的密码子，所述第二核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的第二突变的核苷酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与c)中的氨基酸修饰不同。
在一实施方案中，所述方法可以包括一个或多个进一步替代密码子以获得编码至少部分不同的氨基酸修饰的突变的核苷酸序列这样的步骤。
在一实施方案中，第一核苷酸序列编码的氨基酸序列包含的亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段与第二核苷酸序列编码的氨基酸序列包含的亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段相同。
在一实施方案中，第一核苷酸序列编码的氨基酸序列与第二核苷酸序列编码的氨基酸序列相同。
在一实施方案中，第一核苷酸序列与第二核苷酸序列相同。
在一实施方案中，第一突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中的一个或多个修饰的氨基酸位置与第二突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中的修饰的氨基酸位置不同。
在一实施方案中，第一突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中修饰的氨基酸位置中的一个或多个氨基酸与第二突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中修饰的氨基酸位置中的的一个或多个氨基酸互相不同。
在一实施方案中，包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列包含SARS-CoV-2 S蛋白的N末端结构域(NTD)和/或受体结合结构域(RBD)的氨基酸序列。
在一实施方案中，包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列包含全长SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列。
在一实施方案中，所述方法还包括提供包含编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。
在一实施方案中，所述方法还包括提供疫苗，其包含核酸，所述核酸包含编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
在一实施方案中，核酸是RNA。
在一实施方案中，所述方法是产生SARS-CoV-2疫苗的方法。
在一实施方案中，疫苗是RNA疫苗。
在一实施方案中，疫苗具有降低的免疫逃逸的风险。
在一实施方案中，一个或多个修饰的氨基酸位置位于SARS-CoV-2 S蛋白的N末端结构域(NTD)和/或受体结合结构域(RBD)中。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置是一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的氨基酸序列与亲本SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸位置。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置是一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的氨基酸序列与野生型SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸位置。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置是SARS-CoV-2的逃逸突变体的潜在位点。
在一实施方案中，SARS-CoV-2的逃逸突变体是SARS-CoV-2的抗体逃逸突变体。
在一实施方案中，SARS-CoV-2的逃逸突变体对针对SARS-CoV-2 S蛋白的抗体的中和具有抗性。
在一实施方案中，SARS-CoV-2的逃逸突变体的SARS-CoV-2 S蛋白表现出降低的抗体结合。
在一实施方案中，抗体用于治疗感染SARS-CoV-2的患者。
在一实施方案中，抗体在已经用SARS-CoV-2疫苗治疗的患者中产生。
在一实施方案中，与野生型SARS-CoV-2 S蛋白相比，亲本SARS-CoV-2 S蛋白是修饰的。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，与野生型SARS-CoV-2 S蛋白相比是修饰的亲本SARS-CoV-2 S蛋白中的氨基酸位置不是修饰的。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2 S蛋白是亲本SARS-CoV-2毒株的S蛋白。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2毒株是天然分离株，或者亲本SARS-CoV-2毒株是天然分离株的突变体。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2毒株是流行或迅速传播的SARS-CoV-2变体毒株。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2毒株是关注的变体的SARS-CoV-2变体。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2毒株为B.1.1.7。
在一实施方案中，与野生型SARS-CoV-2 S蛋白相比，一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体是修饰的。
在一实施方案中，与亲本SARS-CoV-2 S蛋白相比，一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体是修饰的。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，与野生型SARS-CoV-2 S蛋白和/或亲本SARS-CoV-2 S蛋白相比是修饰的一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体中的氨基酸位置是修饰的。
在一实施方案中，一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体中的一种或多种(例如全部)是一种或多种SARS-CoV-2毒株的S蛋白。
在一实施方案中，一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种(例如全部)是天然分离株，或者一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种(例如全部)是天然分离株的突变体。
在一实施方案中，一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种(例如全部)是流行或迅速传播的SARS-CoV-2变体毒株。
在一实施方案中，一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种(例如全部)是关注的变体的SARS-CoV-2变体毒株。
在一实施方案中，一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种选自B.1.351、B.1.1.298、B.1.427/B.1.429、B.1.526和P1。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2毒株和一种或多种SARS-CoV-2毒株是流行或迅速传播的SARS-CoV-2变体毒株。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2毒株和一种或多种SARS-CoV-2毒株是关注的变体的SARS-CoV-2变体毒株。
在一实施方案中，与野生型SARS-CoV-2 S蛋白相比，亲本SARS-CoV-2 S蛋白和一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体是修饰的。
在一实施方案中，亲本SARS-CoV-2毒株是B.1.1.7，并且一种或多种SARS-CoV-2毒株选自B.1.351、B.1.1.298、B.1.427/B.1.429、B.1.526和P1。
在一实施方案中，一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体包含至少两种SARS-CoV-2毒株的SARS-CoV-2 S蛋白变体。
在一实施方案中，b)中的一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体与c)中的一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体不同。
在一实施方案中，b)中的一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体是B.1.427/B.1.429和B.1.526的SARS-CoV-2 S蛋白变体，并且c)中的一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体是B.1.351、P.1和B.1.1.298的SARS-CoV-2 S蛋白变体。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，亲本SARS-CoV-2 S蛋白中与野生型SARS-CoV-2 S蛋白相比的氨基酸修饰不干扰所述修饰的氨基酸位置中的氨基酸修饰。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，亲本SARS-CoV-2 S蛋白中与野生型SARS-CoV-2 S蛋白相比的氨基酸修饰与所述修饰的氨基酸位置或者修饰的氨基酸位置中的氨基酸修饰在空间距离上并不接近。
在一实施方案中，在所述修饰的氨基酸序列中，在修饰的氨基酸位置中的修饰不导致重大的结构重排。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置中的氨基酸是表面暴露的。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置包含一个或多个，例如至少两个氨基酸位置。所述修饰可以对应于一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体/SARS-CoV-2毒株，并且可以包含与亲本SARS-CoV-2 S蛋白/SARS-CoV-2毒株相比在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体/SARS-CoV-2毒株中存在的所有修饰，或其部分。
在一实施方案中，b)和c)中的修饰的氨基酸位置各自包含一个或多个，例如至少两个氨基酸位置。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置包含选自以下的两个或更多个：
18、20、26、80、138、144、190、215、246、253、417、439、452、453、477、484、501、570、701、716、
140、345、346、352、378、406、420、440、441、444、445、446、450、455、460、475、478、485、486、487、489、490、493、494、499、
142、145、146、147、150、152、154、156、157、158、164、247、248、249、250、251、252、254、255、258、365、369、370、374、376、384、405、408、415、421、443、447、448、456、472、473、476、496、498、500、504。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置中的修饰包含选自以下的两个或更多个：
18F、20N、26S、80Y、138Y、144F、190S、215A、246I、253G、417N、439K、452R、453F、477N、484K、501Y、570D、701V、716I、
140L、345A、346K、352S、378N、406Q、420、440K、441F、444、445A、446V、450K、455F、460I、475V、478I、485V、486L、487D、489、490S、493L、494P、499H，
142S、145H、146Y、147N、150R、152C、154Q、156A、157L、158G、164T、247G、248H、249S、250N、251S、252V、254F、255F、258L、365D、369C、370S、374L、376I、384L、405Y、408I、415N、421、443A、447V、448Y、456L、472V、473F、476S、496C、498H、500I、504D。
在一实施方案中，修饰的氨基酸位置中的修饰包含选自以下的两个或更多个：
L18F、T20N、P26S、D80Y、D138Y、Y144F、R190S、D215A、R246I、D253G、K417N、N439K、L452R、Y453F、S477N、E484K、N501Y、A570D、A701V、T716I、F140L、T345A、R346K、A352S、K378N、E406Q、D420、N440K、L441F、K444、V445A、G446V、N450K、L455F、N460I、A475V、T478I、G485V、F486L、N487D、Y489、F490S、Q493L、S494P、P499H、
G142S、Y145H、H146Y、K147N、K150R、W152C、E154Q、E156A、F157L、R158G、N164T、S247G、Y248H、L249S、T250N、P251S、G252V、S254F、S255F、W258L、Y365D、Y369C、N370S、F374L、T376I、P384L、D405Y、R408I、T415N、Y421、S443A、G447V、N448Y、F456L、I472V、Y473F、G476S、G496C、Q498H、T500I、G504D。
在一方面，本发明涉及一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含第一核苷酸序列的核酸，所述第一核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
b)提供包含第二核苷酸序列的核酸，所述第二核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与a)中的氨基酸修饰不同。
在一实施方案中，所述方法可以包括一个或多个进一步提供编码至少部分不同的氨基酸修饰的核酸这样的步骤。
在一实施方案中，核酸是RNA。
进一步的实施方案如本文所述。
在一方面，本发明涉及一种医药制品，其包含：
a)核酸，其包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
b)核酸，其包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本SARS-CoV-2 S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2 S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与a)中的氨基酸修饰不同。
在一实施方案中，医药制品可以包含一种或多种其他核酸，所述其他核酸编码至少部分不同的氨基酸修饰。
在一实施方案中，核酸是RNA。
在一实施方案中，RNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。
在一实施方案中，医药制品是药物组合物。
在一实施方案中，医药制品是疫苗。
在一实施方案中，医药制品是试剂盒。
在一实施方案中，医药制品还包含用于针对SARS-CoV-2感染进行疫苗接种的医药制品使用说明。
在一方面，本发明涉及医药制品，其用于制药用途。
在一实施方案中，制药用途包括针对SARS-CoV-2感染进行疫苗接种。
在一方面，本发明涉及一种在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药医药制品。
在一实施方案中，所述方法是针对SARS-CoV-2感染的预防性治疗方法。
在一实施方案中，所述方法是针对SARS-CoV-2感染的疫苗接种方法。
上述方面的进一步实施方案如本文所述。
本文所述的核酸可以是单链RNA，并且本文所述的医药制品(medicalpreparation)，例如疫苗，可以包含作为活性成分(active principle)的单链RNA，其可以在进入接受者细胞后翻译为相应的蛋白。除了编码抗原序列的野生型或密码子优化的序列，RNA还可以含有一种或多种在稳定性和翻译效率方面为RNA的最大效力优化的结构元件(5'帽、5'UTR、3'UTR、poly(A)-尾)。在一实施方案中，RNA含有所有这些元件。在一实施方案中，β-S-ARCA(D1)(m2 7,2'-OGppSpG)或m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG可以用作RNA原料药5'-端的特定加帽结构。如5'-UTR序列，可以使用人α-珠蛋白mRNA的5'-UTR序列，任选地具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率(例如SEQ ID NO:12)。如3'-UTR序列，可以使用置于编码序列和poly(A)-尾之间的源自“分裂的氨基末端增强子(amino terminal enhancer ofsplit)”(AES)mRNA(称作F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称作I)(如SEQ ID NO:13)的两个序列元件的组合(FI元件)以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。这些通过对赋予RNA稳定性并增加总蛋白表达的序列的离体选择过程进行鉴定(参见WO 2017/060314，援引加入本文)。或者，3'-UTR可以是人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3'-UTR。此外，可以使用长度为110个核苷酸的poly(A)-尾，其由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列(随机核苷酸)和另一70个腺苷残基组成(例如SEQ ID NO:14)。设计这个poly(A)-尾序列以增强RNA稳定性和翻译效率。
此外，可以将分泌信号肽(sec)融合至抗原编码区，优选以sec作为N末端标签翻译的方式。在一实施方案中，sec对应于S蛋白的分泌信号肽。通常用于融合蛋白的编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列可以用作GS/接头。
本文所述的RNA可以与蛋白和/或脂质(优选脂质)复合，以产生用于给药的RNA-颗粒。如果使用不同RNA的组合，可以将RNA一起或分别与蛋白和/或脂质复合以产生用于给药的RNA-颗粒。
在一实施方案中，本文所述的包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的疫苗抗原能够形成多聚复合物，特别是三聚复合物。在一实施方案中，包含本文所述的不同多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的疫苗抗原能够形成多聚复合物，特别是三聚复合物。因此，在本发明的实施方案中，包括向受试者提供包含本文所述的不同多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的疫苗抗原，例如，通过给药不同核酸，所述核酸编码包含不同多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的疫苗抗原，不同多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列能够形成多聚复合物，特别是三聚复合物。为此，本文所述的多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列可以包含允许形成多聚复合物的结构域，特别是多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的三聚复合物。在一实施方案中，允许形成多聚复合物的结构域包括三聚结构域，例如本文所述的三聚结构域，如SARS-CoV-2 S蛋白三聚结构域。在一实施方案中，三聚化通过在多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列添加三聚结构域，例如，T4-次要纤维蛋白(fibritin)衍生的“折叠子(foldon)”三聚结构域(如SEQ ID NO:10)，实现，特别是，如果多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列对应于不包含SARS-CoV-2 S蛋白三聚结构域的SARS-CoV-2 S蛋白的一部分。
在一实施方案中，包含本文所述的多特异性病毒蛋白氨基酸序列的疫苗抗原由编码序列编码，与野生型编码序列相比，所述编码序列是密码子优化的和/或G/C含量增加，其中密码子优化和/或G/C含量增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
在一实施方案中，包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的疫苗抗原由RNA编码。在特别优选的实施方案中，包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的疫苗抗原由分离的信使核糖核酸(mRNA)多核苷酸编码，其中所述分离的mRNA多核苷酸包含开放阅读框，所述开放阅读框编码包含疫苗抗原的多肽。在一实施方案中，分离的mRNA多核苷酸配制在至少一种脂质纳米颗粒中。例如，在一些实施方案中，这样的脂质纳米颗粒可以包含摩尔比为20-60％可电离的阳离子脂质、5-25％非阳离子脂质(例如，中性脂质)、25-55％固醇或类固醇以及0.5-15％聚合物缀合的脂质(例如，PEG-修饰的脂质)。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中包含的固醇或类固醇可以是或包含胆固醇。在一些实施方案中，中性脂质可以是或包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质可以是或包含PEG2000 DMG。在一些实施方案中，免疫原性组合物可以包含约1mg-10mg、或3mg-8mg、或4mg-6mg的总脂质含量。在一些实施方案中，这样的免疫原性组合物可以包含约5mg/mL-15mg/mL或7.5mg/mL-12.5mg/mL或9-11mg/mL的总脂质含量。在一些实施方案中，以有效量提供这样的分离的mRNA多核苷酸以在给药至少一个剂量的免疫原性组合物的受试者中诱导免疫应答。在一些实施方案中，在免疫原性组合物中提供的这样的分离的mRNA多核苷酸不是自我复制的RNA。
在一实施方案中，本文所述的RNA是修饰的RNA，特别是稳定的mRNA。在一实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替至少一个尿苷。在一实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替每个尿苷。在一实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替尿苷。
在一实施方案中，修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一实施方案中，RNA包含5’帽。
在一实施方案中，RNA包含5’UTR，其包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，RNA包含3’UTR，其包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或与SEQ IDNO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
在一实施方案中，RNA包含poly-A序列。
在一实施方案中，poly-A序列包含至少100个核苷酸。
在一实施方案中，poly-A序列包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:14的核苷酸序列组成。
在一实施方案中，RNA配制为或待配制为液体、固体或其组合。
在一实施方案中，RNA配制为或待配制为用于注射。
在一实施方案中，RNA配制为或待配制为用于肌肉内给药。
在一实施方案中，RNA配制为或待配制为颗粒。
在一实施方案中，颗粒为脂质纳米颗粒(LNP)或脂质复合物(lipoplex)(LPX)颗粒。
在一实施方案中，LNP颗粒包含((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)(((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate))、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(2-[(polyethyleneglycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)和胆固醇(cholesterol)。
在一实施方案中，RNA脂质复合物颗粒可通过混合RNA与脂质体获得。在一实施方案中，RNA脂质复合物颗粒可通过混合RNA与脂质获得。
在一实施方案中，RNA配制为或待配制为胶体。在一实施方案中，RNA配制为或待配制为颗粒，形成胶体的分散相。在一实施方案中，分散相中存在50％或更多、75％或更多或者85％或更多的RNA。在一实施方案中，RNA配制或待配制为包含RNA和脂质的颗粒。在一实施方案中，颗粒通过使溶于水相中的RNA暴露于溶于有机相中的脂质形成。在一实施方案中，有机相包含乙醇。在一实施方案中，颗粒通过使溶于水相中的RNA暴露于分散于水相中的脂质形成。在一实施方案中，分散于水相中的脂质形成脂质体。
在一实施方案中，RNA为mRNA或saRNA。
在一实施方案中，本文所述的组合物或医药制品为药物组合物。
在一实施方案中，本文所述的组合物或医药制品为疫苗。
在一实施方案中，药物组合物还包含一种或多种药学上可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。
在一实施方案中，本文所述的组合物或医药制品为试剂盒。
在一实施方案中，RNA和任选存在的颗粒形成组分在不同的小瓶中。
在一实施方案中，试剂盒还包含使用组合物或医药制品在受试者中诱导针对病毒例如冠状病毒的免疫应答的说明。
在一方面，本发明涉及本文所述的组合物或医药制品，其用于制药用途。
在一实施方案中，制药用途包括在受试者中诱导针对病毒例如冠状病毒的免疫应答。
在一实施方案中，制药用途包括病毒感染例如冠状病毒感染的治疗或预防性治疗。
在一实施方案中，本文所述的组合物或医药制品用于向人给药。
在一实施方案中，冠状病毒为β冠状病毒。
在一实施方案中，冠状病毒为沙贝病毒(sarbecovirus)。
在一实施方案中，冠状病毒为SARS-CoV-2。
在一方面，本发明涉及一种在受试者中诱导针对冠状病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者给药本文所述的组合物，例如包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的疫苗抗原或者编码疫苗抗原的核酸例如RNA。在一实施方案中，所述方法包括给药多个这样的疫苗抗原或核酸。
在一实施方案中，所述方法为针对冠状病毒进行疫苗接种的方法。
在一实施方案中，所述方法为用于冠状病毒感染的治疗或预防性治疗的方法。
在一实施方案中，受试者为人。
在一实施方案中，冠状病毒为β冠状病毒。
在一实施方案中，冠状病毒为沙贝病毒。
在一实施方案中，冠状病毒为SARS-CoV-2。
在本文所述的方法的一实施方案中，组合物为本文所述的组合物。
在一方面，本发明涉及本文所述的组合物或医药制品，其用于本文所述的方法。
在一方面，本发明涉及一种组合物，例如蛋白或核酸组合物，其可通过实施本文所述的方法获得。
附图说明
图1：SARS-CoV-2 S蛋白的S蛋白组织的示意图
S1亚基内的序列由信号序列(SS)和受体结合结构域(RBD)组成，受体结合结构域(RBD)是S蛋白内与结合至人细胞受体ACE2相关的关键亚基。S2亚基含有S2蛋白酶切割位点(S2’)，然后是用于膜融合的融合肽(FP)，具有中央螺旋(CH)结构域的七肽(heptad)重复(HR1和HR2)，跨膜结构域(TM)和胞质尾(CT)。
图2：用于开发SARS-CoV-2疫苗的预期构建体
本文所述的组合物可以基于不同的构建体，其已经基于完整和野生型S蛋白设计，其包含(1)在第一个七肽重复(HRP1)近距离内具有突变的完整蛋白，其包括保留中和敏感位点的稳定突变，(2)S1结构域或(3)仅RB结构域(RBD)。此外，为了稳定蛋白片段，将次要纤维蛋白结构域(F)融合至C-末端。所有构建体均以信号肽(SP)开始以确保高尔基体转运至细胞膜。
图3：可以基于其设计本文所述的构建体的RNA的一般结构
具有5′-帽、5′-和3′-非翻译区、具有内在分泌信号肽以及GS-接头的编码序列、以及poly(A)-尾的RNA疫苗的一般结构的示意图。请注意，与它们各自的序列长度相比，各个元件未完全按比例绘制。
UTR＝非翻译区；sec＝分泌信号肽；RBD＝受体结合结构域；GS＝甘氨酸-丝氨酸接头。
图4：可以基于其设计本文所述的构建体的RNA的一般结构
具有5′-帽、5′-和3′-非翻译区、具有内在分泌信号肽以及GS-接头的编码序列、以及poly(A)-尾的RNA原料药的一般结构的示意图。请注意，与它们各自的序列长度相比，各个元件未完全按比例绘制。GS＝甘氨酸-丝氨酸接头；UTR＝非翻译区；Sec＝分泌信号肽；RBD＝受体结合结构域。
图5：可以基于其设计本文所述的构建体的RNA的一般结构
具有5′-帽、5′-和3′-非翻译区、具有内在分泌信号肽以及GS-接头的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)RNA依赖性RNA聚合酶复制酶和SARS-CoV-2抗原的编码序列、以及poly(A)-尾的RNA疫苗的一般结构的示意图。请注意，与它们各自的序列长度相比，各个元件未完全按比例绘制。UTR＝非翻译区；Sec＝分泌信号肽；RBD＝受体结合结构域；GS＝甘氨酸-丝氨酸接头。
图6：基于B.1.1.7谱系刺突蛋白的示例性新型二价疫苗设计
具有一个RBD直立(erect)的SARS-CoV-2刺突蛋白的Cryo-EM结构，显示疫苗序列(A)S-Seq1和(B)S-Seq2的表面暴露突变位点。SARS-CoV-2的弗林蛋白酶(furin)切割的刺突蛋白的晶体结构(PDB ID：6ZGG)获得自RCSB PDB数据库，并使用PyMol v.2.4.1可视化。黄色位点表示谱系B.1.1.7突变所靶向的氨基酸残基。红色位点表示被其他非B.1.1.7谱系突变靶向的氨基酸残基。
图7：疫苗候选物在HEK293T细胞中的表达。
使用商业转染试剂转染编码BNT162b2和BNT162b2(α+SA)的0.15μg/mL modRNA (A和B)，或者分别编码BNT162b2、BNT162b2(α)和BNT162b2(α；L452R+E484Q)(C和D)的0.15μg/mLLNP配制的modRNA后，在HEK293T细胞中编码变体SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的RNA的表达。使用融合至小鼠Fc-标签的人重组ACE-2蛋白和荧光标记的抗小鼠二抗，通过流式细胞术检测变体S蛋白的表面表达。描述出每个疫苗候选物的全部HEK293T群中表达S蛋白的细胞的百分比(A和C)和中值荧光强度(MFI)(B和D)。所示数据为一式三份进行的HEK293T转染的平均值+SD。
图8：用mRNA疫苗候选物免疫一次后，Balb/C小鼠血清中的抗-S1(B.1.1.7)IgG抗体应答动力学，所述mRNA疫苗候选物编码不同的源自P2 S构建体的SARS-CoV-2α变体。
用编码BNT162b2(α)、BNT162b2(α+SA)的1μg LNP配制的modRNA和作为缓冲液对照的0.9％氯化钠免疫一次后在免疫后第7天(A)、第14天(B)、第21天(C)和第28天(D)的抗S1(B.1.1.7)IgG抗体滴度。E中示出血清中抗体应答的纵向轨迹(longitudinaltrajectory)。数据显示为所有动物一式两份测量的平均值±SEM(n＝5)。不同时间点的统计学分析见表8。
图9：用mRNA疫苗候选物免疫一次后，Balb/C小鼠血清中的抗-RBD(B.1.351)IgG抗体应答动力学，所述mRNA疫苗候选物编码不同的源自P2 S构建体的SARS-CoV-2α变体。
用编码BNT162b2(α)、BNT162b2(α+SA)的1μg LNP配制的modRNA和作为缓冲液对照的0.9％氯化钠免疫一次后在免疫后第7天(A)、第14天(B)、第21天(C)和第28天(D)的抗RBD(B.1.351)IgG抗体滴度。E中示出血清中抗体应答的纵向轨迹。数据显示为所有动物一式两份测量的平均值±SEM(n＝5)。不同时间点的统计学分析见表9。
图10：用mRNA疫苗候选物免疫一次后28天，Balb/C小鼠血清中50％假病毒中和(pVN50)滴度，所述mRNA疫苗候选物编码不同的源自P2 S构建体的SARS-CoV-2α变体。
用编码BNT162b2(α)、BNT162b2(α+SA)的1μg LNP配制的modRNA和作为缓冲液对照的0.9％氯化钠免疫一次后在免疫后28天的50％假病毒中和抗体(pVN50)滴度。分析中使用的VSV-SARS-CoV-2假病毒带有SARS-CoV-2 S蛋白，其对祖Wuhan毒株(Wuhan)，B.1.1.7(α)变体，或者B.1.351(β)变体具有特异性。对每个个体血清(每组n＝5)进行一式两份测试，并绘制几何平均pVN50滴度。对于低于检测限(LOD；12)的值，绘制LOD/2值。示出组几何平均滴度(横线和条(bar)上方的数值)，95％置信区间。
图11：用BNT16b2(α)或BNT162b2(α；L452R+E484Q)免疫一次后28天，Balb/C小鼠血清中50％假病毒中和(pVN50)滴度。
用编码BNT162b2(α)、BNT162b2(α；L452R+E484Q)的1μg LNP配制的modRNA或作为缓冲液对照的0.9％氯化钠免疫一次后在免疫后28天的50％假病毒中和抗体(pVN50)滴度。分析中使用的VSV-SARS-CoV-2假病毒带有SARS-CoV-2 S蛋白，其对B.1.1.7(α)变体、B.1.617.1(κ)变体或B.1.617.2(δ)变体具有特异性。对每个个体血清(每组n＝5)进行一式两份测试，并绘制几何平均pVN50滴度。对于低于检测限(LOD；12)的值，绘制LOD/2值。示出组几何平均滴度(横线和条上方的数值)，95％置信区间。
图12：用BNT16b2(α)或BNT162b2(α；L452R+E484Q)免疫一次后28天，通过多重分析测量的Balb/c小鼠血清中针对不同重组S蛋白的IgG应答。
用编码BNT162b2(α)、BNT162b2(α；L452R+E484Q)的1μg LNP配制的modRNA或作为缓冲液对照的0.9％氯化钠免疫一次后的ECL信号。分析了ECL信号的线性范围(不同图表中用虚线表示)，并且给出针对SARS-CoV-2 S(B.1.1.7；1∶5400血清稀释)(A)、SARS-CoV-2 S(B.1.1.529；BA.1；1∶1800血清稀释)(B)、SARS-CoV-2 S(BA.1+L452R；1∶1800血清稀释)(C)的应答。所示数据代表一式两份测量的单个动物的血清，横线表示组平均值±SEM(每组n＝5；仅缓冲液组n＝3)。不同时间点的统计学分析见表12。
具体实施方式
虽然下文详细描述了本公开，但是应当理解本公开并不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本公开的范围，本公开的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域技术人员通常理解的相同的含义。
优选地，本文使用的术语如"Amultilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)所述定义。
除非另有说明，否则本公开的实施会采用化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法，其在所述领域的文献中解释(参见，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中会描述本公开的元素。这些元素用具体实施方案列出，但是，应当理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生额外的实施方案。以前描述的实例和实施方案不应当理解为将本公开仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为公开并涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的公开元素的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则所有描述的元素的任何排列和组合都应当视为由本说明书公开。
在这个说明书的整个正文中引用了几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容均不应理解为承认本公开无权先于这类公开。
定义
在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语均具有其在本领域公认的含义。
术语“约”表示近似或接近，并且在一实施方案中在本文示出的数值或范围的上下文中表示列举或声称的数值或范围的±20％、±10％、±5％或±3％。
在描述本公开的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“这个”以及相似指称应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值如其在本文中单独列举地加入本说明书。除非本文另有说明或其他地方显然违背上下文，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本公开，并不对权利要求书的范围构成限制。本说明书中任何语言都不应当理解为表明对于本公开的实施必要的任何未要求保护的元素。
除非另有明确说明，否则在本文件的上下文中术语“包含”用来表示除了由“包含”引入的列表成员，还可以任选地存在其他成员。但是，作为本公开的具体实施方案，考虑术语“包含”涵盖不存在其他成员的可能性，即，为了这个实施方案的目的，“包含”可以理解为具有“由…组成”或“基本上由…组成”的含义。
如本文所用，术语“一个或多个”或者“至少一个”是指一个或多于一个，包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个，或者甚至更多个。
术语“两个或更多个”、“至少两个”、“多个”或“多”是指多于一个，包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个，或者甚至更多个。本文所用的术语如“降低”、“减少”、“抑制”或“损害”涉及总体降低或引起总体降低的能力，优选在水平上降低至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或甚至更多。这些术语包括完全或基本上完全抑制，即降低至0或基本上至0。
术语“多特异性”，当指病毒蛋白氨基酸序列时，例如“SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列”，是指基于所述病毒蛋白的氨基酸序列，其中通常存在于病毒蛋白的不同变体(如不同的天然存在的毒株)中的多个表位组合在单个氨基酸序列中。
术语如“增加”、“增强”或“超过”优选涉及增加或增强至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少80％、至少100％、至少200％、至少500％或甚至更多。
根据本公开，术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键互相连接的约2个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个以及多达约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“蛋白”或“多肽”是指大的肽，特别是具有至少约150个氨基酸的肽，但是术语“肽”、“蛋白”和“多肽”在本文中通常用作同义词。
当以治疗有效量提供给受试者时，“治疗性蛋白”对受试者的状况或疾病状态具有积极或有利的作用。在一实施方案中，治疗性蛋白具有治疗或姑息特性，并且可以将其给药以改善、减轻、缓解、逆转、延迟疾病或病症的一种或多种症状的发作或者减轻疾病或病症的一种或多种症状的严重程度。治疗性蛋白可以具有预防特性，并且可以用来延迟疾病的发作或者减轻这类疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白”包括完整的蛋白或肽，并且还可以指其治疗活性片段。其还可以包括蛋白的治疗活性变体。治疗活性蛋白的实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原和免疫刺激剂如细胞因子。
关于氨基酸序列(肽或蛋白)，“片段”或“部分”涉及氨基酸序列的一部分，即，代表在N-末端和/或C-末端变短的氨基酸序列的序列。可以例如通过缺少开放阅读框3'端的截短的开放阅读框的翻译获得在C-末端缩短的片段(N-末端片段)。可以例如通过缺少开放阅读框5'端的截短的开放阅读框的翻译获得在N-末端缩短的片段(C-末端片段)，只要截短的开放阅读框包含用来起始翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包含例如来自氨基酸序列的氨基酸残基的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
本文中的“变体”表示由于至少一个氨基酸修饰而与亲本氨基酸序列不同的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的修饰形式。优选地，与亲本氨基酸序列相比，变体氨基酸序列具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本相比，具有1至约20个氨基酸修饰，并且优选1至约10个或1至约5个氨基酸修饰。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然”表示在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白具有未被故意修饰的氨基酸序列的片段。
为了本公开的目的，氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。特别地，术语“变体”包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列中的特定位点，然而适当筛选所得产物的随机插入也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸的氨基-和/或羧基-末端融合，如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。氨基酸缺失变体的特征在于从序列去除一个或多个氨基酸，如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白的任何位置。在蛋白的N-末端和/或C-末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称作N-末端和/或C-末端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于去除序列中的至少一个残基并在其位置插入另一残基。优先考虑在同源蛋白或肽之间不保守的氨基酸序列位置中的修饰和/或用具有相似特性的其他氨基酸代替氨基酸。优选地，肽和蛋白变体中的氨基酸改变是保守的氨基酸改变，即，相似带电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守的氨基酸改变包括在它们的侧链中相关的氨基酸家族之一的取代。天然存在的氨基酸一般分为4个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)，碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香氨基酸。在一实施方案中，保守氨基酸取代涉及以下组内的取代：
甘氨酸、丙氨酸；
缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
天冬氨酸、谷氨酸；
天冬酰胺、谷氨酰胺；
丝氨酸、苏氨酸；
赖氨酸、精氨酸；以及
苯丙氨酸、酪氨酸。
优选地，给定氨基酸序列和所述给定氨基酸序列变体的氨基酸序列之间的相似性程度，优选相同性程度是至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选对参考氨基酸序列的整个长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，优选对至少约20、至少约40、至少约60、至少约80、至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个氨基酸给出相似性或相同性程度，在一些实施方案中，连续氨基酸。在一些实施方案中，对参考氨基酸序列的整个长度给出相似性或相同性程度。可以用本领域已知的工具进行确定序列相似性，优选序列相同性的比对，优选利用最佳序列比对，例如，利用Align，利用标准设置，优选EMBOSS::needle、Matrix:Blosum62、Gap Open 10.0、Gap Extend 0.5。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的核苷酸的百分比。
特别地，术语“％相同”、“％相同性”或相似术语是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比纯粹是统计上的，并且两个序列之间的差异可以但不必一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。通常在对区段或“比较窗口”最佳比对之后，通过比较序列进行两个序列的比较，以便鉴定相应序列的局部区域。可以手动或者借助于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法，借助于Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，借助于Pearsonand Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性搜索方法，或借助于使用所述算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)进行用于比较的最佳比对。在一些实施方案中，利用BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的百分比相同性，可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝align2seq)上获得。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTN算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)匹配/错配评分设置为1，-2；(v)缺口成本设置为线性；以及(vi)用于低复杂度区域的过滤器。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTP算法的算法参数包括：(i)期望阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)缺口成本设置为存在：11，延伸：1；以及(vi)条件成分评分矩阵调整。
通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用这个数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将这个结果乘以100，获得百分比相同性。
在一些实施方案中，对参考序列整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸给出相同性程度，在一些实施方案中，连续核苷酸。在一些实施方案中，对参考序列的整个长度给出相似性或相同性程度。
根据本公开，同源氨基酸序列表现出氨基酸残基的至少40％、特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％以及优选至少95％、至少98或至少99％相同性。
技术人员可以容易地制备本文描述的氨基酸序列变体，例如，通过重组DNA操作。例如，Sambrook等人(1989)详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白的DNA序列的操作。此外，本文描述的肽和氨基酸变体可以借助已知的肽合成技术容易地制备，例如，通过固相合成和相似方法。
在一实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。氨基酸序列的术语“功能片段”或“功能变体”是指表现出与其来源的氨基酸序列相同或相似的一种或多种功能特性的任何片段或变体，即，它是功能上等同的。关于抗原或抗原序列，一种特定功能是片段或变体来源的氨基酸序列表现出的一种或多种免疫原性活性。如本文所用，术语“功能片段”或“功能变体”特别是指这类变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且仍能够完成亲本分子或序列的一种或多种功能，例如，诱导免疫应答。在一实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变分子或序列的特征。在不同实施方案中，功能片段或功能变体的功能可以降低但仍显著存在，例如，功能变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。但是，在其他实施方案中，与亲本分子或序列相比，可以增强功能片段或功能变体的免疫原性。
氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)“源自”指定氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。优选地，源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定氨基酸序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员会理解，可以改变适合用于本文的抗原，从而它们的序列不同于其来源的天然存在的序列或天然序列，同时保留天然序列的可取活性。
如本文所用，“指导材料”或“说明”包括可以用来传达本发明的组合物和方法的可用性的出版物、记录、图表或任何其他表达介质。本发明的试剂盒的指导材料可以例如粘贴至包含本发明的组合物的容器，或者与包含组合物的容器一起运输。或者，指导材料可以与容器分开运输，目的是指导材料和化合物由接受者合作使用。
“分离的”表示从自然状态改变或去除。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如，宿主细胞。
在本发明的上下文中术语“重组”表示通过“遗传工程制备”。优选地，在本发明的上下文中“重组物体”如重组核酸不是天然存在的。
如本文所用的术语“天然存在”是指物体可以在自然中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中且可以分离自自然来源并且尚未被人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。
如本文所用的“生理pH”是指约7.5的pH。
术语“遗传修饰”或简单地“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA，引入细胞。为了本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞或这种细胞摄取核酸，其中所述细胞可以存在于受试者中，例如，患者。因此，根据本发明，用于转染本文所述核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如所述细胞可以形成器官的部分、组织和/或患者的生物体。根据本发明，转染可以是瞬时或稳定的。对于转染的一些应用，如果转染的遗传物质仅瞬时表达是足够的。可以将RNA转染入细胞以瞬时表达其编码的蛋白。因为转染过程中引入的核酸通常不整合入核基因组，外源核酸会通过有丝分裂稀释或降解。允许核酸的游离扩增的细胞大大降低稀释速率。如果期望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，必须进行稳定转染。这种稳定的转染可以通过使用基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常，将编码抗原的核酸瞬时转染入细胞。可以将RNA转染入细胞以瞬时表达其编码的蛋白。
冠状病毒
冠状病毒是有包膜的、正义的、单链RNA((+)ssRNA)病毒。它们具有已知RNA病毒中最大的基因组(26–32kb)，并且在系统发生上分为4个属(α、β、γ和δ)，而β冠状病毒进一步细分4个谱系(A、B、C和D)。冠状病毒感染广泛的鸟类和哺乳动物物种，包括人。一些人冠状病毒一般引起轻度呼吸道疾病，尽管在婴儿、老年人和免疫受损的人中严重程度可能更高。分别属于β冠状病毒谱系C和B的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)具有高致病性。在过去15年内，这两种病毒都从动物宿主进入了人类群体，并且导致高病死率的爆发。严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)(MN908947.3)属于β冠状病毒谱系B。它与SARS-CoV具有至少70％序列相似性。
一般来说，冠状病毒具有4种结构蛋白，即，包膜(E)、膜(M)、核壳(N)和刺突(S)。E和M蛋白在病毒装配中具有重要功能，而N蛋白对于病毒RNA合成是必需的。关键糖蛋白S负责病毒结合和进入靶细胞。S蛋白合成为单链无活性前体，在生成细胞中被弗林蛋白酶样宿主蛋白酶切割为两个非共价结合的亚基S1和S2。S1亚基包含受体结合结构域(RBD)，其识别宿主细胞受体。S2亚基包含融合肽、两个七肽重复和跨膜结构域，需要所有这些以通过经历大的构象重排来介导病毒和宿主细胞膜的融合。S1和S2亚基三聚化形成大的融合前刺突。
SARS-CoV-2的S前体蛋白可以被蛋白水解切割为S1(685aa)和S2(588aa)亚基。S1亚基包含受体结合结构域(RBD)，其介导病毒通过宿主血管紧张素转化酶2(ACE2)受体进入敏感细胞。
抗原
本文描述的氨基酸序列包含源自病毒蛋白(例如病毒表面蛋白，如SARS-CoV-2 S蛋白)的序列。病毒蛋白衍生的序列对应于病毒蛋白的至少一部分，所述病毒蛋白含有病毒蛋白其他变体(如其他毒株的病毒蛋白变体)中存在的氨基酸修饰。修饰产生(额外的)表位，其对这类其他病毒蛋白变体具有特异性。因此，本文描述的修饰的病毒蛋白序列是多特异性病毒蛋白氨基酸序列，因为它们含有多种病毒蛋白变体和/或病毒株所特有的(修饰的)氨基酸残基。本文还描述编码包含病毒蛋白衍生序列的氨基酸序列的核酸，如RNA。本文描述的氨基酸序列和核酸可以用于在受试者中诱导针对病毒蛋白，特别是不同病毒株的病毒蛋白的免疫应答。包含本文所描述的多特异性病毒蛋白氨基酸序列的氨基酸序列(即抗原性肽或蛋白)在本文中也称为“疫苗抗原”、“肽和蛋白抗原”、“抗原分子”或简称为“抗原”。多特异性病毒蛋白氨基酸序列在本文中也称为“抗原性肽或蛋白”或“抗原序列”。
SARS-CoV-2冠状病毒全长刺突(S)蛋白由1273个氨基酸组成，并且具有根据SEQID NO:1的氨基酸序列：
对于本公开的目的，上述序列视为野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列。本文给出的SARS-CoV-2 S蛋白中的位置编号相对于根据SEQ ID NO:1的氨基酸序列以及SARS-CoV-2 S蛋白变体中的相应位置。
可以以使原型融合前构象稳定的方式修饰根据SEQ ID NO:1的全长刺突(S)蛋白。可以通过在全长刺突蛋白中的AS残基986和987处引入两个连续的脯氨酸取代来获得融合前构象的稳定。具体地，以这样的方式获得刺突(S)蛋白稳定的蛋白变体，将位置986处的氨基酸残基交换为脯氨酸，并且将位置987处的氨基酸残基也交换为脯氨酸。在一实施方案中，SARS-CoV-2 S蛋白变体，其中原型融合前构象是稳定的，包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列：
在一些实施方案中，本文所描述的组合物和/或方法的特征在于，疫苗接种的受试者的血清在一组(例如，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种或更多种)SARS-CoV-2刺突变体中表现出中和活性。在一些实施方案中，这类SARS-CoV-2刺突变体包括N-末端结构域(NTD)和/或受体结合结构域(RBD)中的突变。在一些实施方案中，本文所描述的组合物的特征在于，包含多特异性SARS-CoV-2S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列包含一个或多个氨基酸修饰(因此，表位)，其对于一组(例如，至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少15种或更多种)SARS-CoV-2刺突变体是特征性的。在一些实施方案中，这类对于SARS-CoV-2刺突变体是特征性的修饰包括N-末端结构域(NTD)和/或受体结合结构域(RBD)中的突变。
N-末端结构域(NTD)中的修饰包括选自以下的位置处的修饰：
18、20、26、80、138、144、190、215、246、253、
140、
142、145、146、147、150、152、154、156、157、158、164、247、248、249、250、251、252、254、255、258。
N-末端结构域(NTD)中的特定修饰包括选自以下的修饰：
L18F、T20N、P26S、D80Y、D138Y、Y144F、R190S、D215A、R246I、D253G、F140L、
G142S、Y145H、H146Y、K147N、K150R、W152C、E154Q、E156A、F157L、R158G、N164T、S247G、Y248H、L249S、T250N、P251S、G252V、S254F、S255F、W258L。
受体结合结构域(RBD)中的修饰包括选自以下的位置处的修饰：
417、439、452、453、477、484、501、
345、346、352、378、406、420、440、441、444、445、446、450、455、460、475、478、485、486、487、489、490、493、494、499、
365、369、370、374、376、384、405、408、415、421、443、447、448、456、472、473、476、496、498、500、504。
受体结合结构域(RBD)中的特定修饰包括选自以下的修饰：
K417N、N439K、L452R、Y453F、S477N、E484K、N501Y、
T345A、R346K、A352S、K378N、E406Q、D420、N440K、L441F、K444、V445A、G446V、N450K、L455F、N460I、A475V、T478I、G485V、F486L、N487D、Y489、F490S、Q493L、S494P、P499H、
Y365D、Y369C、N370S、F374L、T376I、P384L、D405Y、R408I、T415N、Y421、S443A、G447V、N448Y、F456L、I472V、Y473F、G476S、G496C、Q498H、T500I、G504D。
在一些实施方案中，本文所描述的组合物的特征在于，包含多特异性SARS-CoV-2S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列基于亲本SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列(例如亲本SARS-CoV-2毒株的)，其与野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列相比(例如，与SEQ ID NO:1相比)包含一个或多个氨基酸修饰，并且与野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列相比(例如，与SEQ ID NO:1相比)，包含存在于一种或多种其他SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列(例如，一种或多种其他SARS-CoV-2毒株的)中的一个或多个进一步氨基酸修饰。因此，在一些实施方案中，本文所描述的组合物的特征在于，包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列可以包括与野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列相比(例如与SEQ ID NO:1相比)存在于亲本SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列中的一个或多个氨基酸修饰，以及与野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列相比(例如与SEQ ID NO:1相比)，存在于一种或多种其他SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列中一个或多个进一步氨基酸修饰。
例如，在一些实施方案中，本文所描述的组合物的特征可以在于，包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列可以基于毒株B.1.1.7的SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列作为亲本SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列，因此可以包括与野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列相比(例如与SEQ ID NO:1相比)，存在于亲本SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列中的氨基酸修饰，即H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。此外，包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列，与野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列相比(例如与SEQ ID NO:1相比)，可以包括存在于一种或多种其他SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列中，例如除了亲本毒株之外的一种或多种毒株的SARS-CoV-2S蛋白氨基酸序列的一个或多个氨基酸修饰。例如，除了亲本毒株之外的这类一种或多种毒株可以选自B.1.351、B.1.1.298、B.1.427/B.1.429、B.1.526和P.1。
在一实施方案中，包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列可以包括(除了存在于例如毒株B.1.1.7的亲本SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列中的氨基酸修饰之外)存在于B.1.526(NY)中的一个或多个氨基酸修饰以及存在于B.1.427/B.1.429(CAL)中的一个或多个氨基酸修饰。存在于B.1.526(NY)中的一个或多个氨基酸修饰可以是D253G和A701V。存在于B.1.427/B.1.429(CAL)中的一个或多个氨基酸修饰可以是L452R。进一步修饰可以包括L18F(存在时，例如在B.1.351和P.1中)、N439K和S477N。
在一实施方案中，包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列可以包括(除了存在于例如毒株B.1.1.7的亲本SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列中的氨基酸修饰之外)存在于B.1.351(SA)中的一个或多个氨基酸修饰。存在于B.1.351(SA)中的一个或多个氨基酸修饰可以是D80A、D215G、R246I、K417N和E484K。
上述两种不同的包含多特异性SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列的氨基酸序列(或编码核酸)可以组合使用以诱导至少毒株B.1.351、B.1.1.298、B.1.427/B.1.429、B.1.526和P.1的SARS-CoV-2刺突变体的中和活性。
本领域技术人员知道各种刺突变体和/或记录它们的资源。例如，以下毒株、它们的SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列，特别是其与野生型SARS-CoV-2 S蛋白氨基酸序列相比的修饰(例如与SEQ ID NO:1相比)可用于本文。
B.1.1.7(“关注的202012/01的变体”(VOC-202012/01)
B.1.1.7是SARS-CoV-2的变体，于2020年10月在英国COVID-19流行期间从上月采集的样本中首次检测到，并在12月中旬迅速开始传播。其与英国COVID-19感染率的显著增加有关；据认为这种增加至少部分是由于刺突糖蛋白受体结合结构域中N501Y的变化，N501Y是人细胞中的与ACE2结合所必需的。B.1.1.7变体由23个突变定义：13个非同义突变、4个缺失和6个同义突变(即有17个突变改变蛋白，6个不改变)。B.1.1.7中的刺突蛋白变化包括69-70缺失、144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
B.1.351(501.V2)
B.1.351谱系，俗称南非COVID-19变体，是SARS-CoV-2的变体。初步结果表明，这种变体可能具有增加的传播性。B.1.351变体由多种刺突蛋白变化定义，包括：L18F、D80A、D215G、242-244缺失、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G和A701V。在B.1.351基因组的刺突区有3个特别关注的突变：K417N、E484K和N501Y。
B.1.1.298(簇5)
B.1.1.298是在丹麦North Jutland发现的，据信是通过水貂养殖场从水貂传播给人。病毒刺突蛋白中的几种不同突变已经得到证实。特异性突变包括69–70缺失、Y453F、D614G、I692V、M1229I和任选存在的S1147L。
P.1(B.1.1.248)
B.1.1.248谱系称为巴西变体，是SARS-CoV-2的变体之一，已命名为P.1谱系。P.1具有多种S蛋白修饰[L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1027I、V1176F]，并且在某些关键RBD位置(K417、E484、N501)与来自南非的变体B.1.351相似。
B.1.427/B.1.429(CAL.20C)
谱系B.1.427/B.1429，也称为CAL.20C，由S蛋白中的以下修饰定义：S13I、W152C、L452R和D614G，其中L452R修饰是特别关注的。CDC已将B.1.427/B.1429列为“关注的变体”。
B.1.525
B.1.525带有与P.1和B.1.351变体中发现的相同E484K修饰，并且还带有B.1.1.7和B.1.1.298中发现的相同ΔH69/ΔV70缺失。其还带有D614G、Q677H和F888L修饰。
B.1.526
B.1.526在纽约地区检测为新出现的病毒分离谱系，与之前报道的变体具有共同的突变。这种谱系中最常见的刺突突变集合是L5F、T95I、D253G、E484K、D614G和A701V。
下表示出为VOI/VOC的流行SARS-CoV-2毒株的概述。
在一实施方案中，本文所描述的疫苗抗原包含氨基酸序列，基本上由氨基酸序列组成或者由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)的修饰的变体或其片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含氨基酸序列，基本上由氨基酸序列组成或者由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2刺突S1片段(S1)(SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)的S1亚基)的修饰的变体或其片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2049的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2049的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含氨基酸序列，基本上由氨基酸序列组成或者由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2的刺突蛋白(S)的S1亚基的受体结合结构域(RBD)的修饰的变体或其片段。SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列或其片段在本文中也称作“RBD”或“RBD结构域”。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸979-1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸979-1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
根据某些实施方案，将信号肽直接或通过接头融合至氨基酸序列，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2 S蛋白的修饰的变体或其片段，即，抗原肽或蛋白。因此，在一实施方案中，将信号肽融合至上述疫苗抗原包含的源自SARS-CoV-2 S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列。
这类信号肽是这类序列，其通常显示约15-30个氨基酸的长度，并且优选位于抗原肽或蛋白的N-末端，但不限于此。如本文定义的信号肽优选允许将所述RNA编码的抗原肽或蛋白转运至限定的细胞区室，优选细胞表面、内质网(ER)或内体-溶酶体区室。在一实施方案中，如本文定义的信号肽序列包括但不限于SARS-CoV-2 S蛋白的信号肽序列，特别是包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16或1-19的氨基酸序列或者其功能变体的序列。
在一实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列，与SEQID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码信号序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列，与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列的片段或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，编码信号序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列。
在一实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列，与SEQID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码信号序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-57的核苷酸序列，与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-57的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-57的核苷酸序列的片段或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-57的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，编码信号序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-57的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO:1的氨基酸1-19的氨基酸序列。
如本文定义的信号肽进一步包括但不限于免疫球蛋白的信号肽序列，例如免疫球蛋白重链可变区的信号肽序列，其中所述免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白。特别地，如本文定义的信号肽序列包括这类序列，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列或其功能变体。
在一实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，与SEQID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，信号序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码信号序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-119的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸54-119的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:32的核苷酸54-119的核苷酸序列的片段或与SEQ ID NO:32的核苷酸54-119的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，编码信号序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-119的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列。
优选使用这类信号肽以促进编码的抗原肽或蛋白的分泌。更优选地，将如本文定义的信号肽融合至如本文定义的编码的抗原肽或蛋白。
因此，在特别优选的实施方案中，本文描述的RNA包含至少一个编码抗原肽或蛋白以及信号肽的编码区，所述信号肽优选融合至抗原肽或蛋白，更优选融合至本文描述的抗原肽或蛋白的N-末端。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:1或7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1或7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQID NO:2、8或9的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1或7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1或7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:15、16、19、20、24或25的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:15、16、19、20、24或25的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-2049的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-2049的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:30的核苷酸54-716的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:30的核苷酸54-716的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:32的核苷酸54-725的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:32的核苷酸54-725的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
根据某些实施方案，将三聚结构域直接或通过接头(例如，甘氨酸/丝氨酸接头)融合至氨基酸序列，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2 S蛋白的修饰变体或其片段，即，抗原肽或蛋白。因此，在一实施方案中，将三聚结构域融合至上述疫苗抗原包含的源自SARS-CoV-2 S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列(可以任选地将其融合至上述信号肽)。
这类三聚结构域优选位于抗原肽或蛋白的C-末端，但不限于此。如本文定义的三聚结构域优选允许所述RNA编码的抗原肽或蛋白的三聚化。如本文定义的三聚结构域的实例包括但不限于折叠子(foldon)，T4次要纤维蛋白(fibritin)的天然三聚结构域。T4次要纤维蛋白的C-末端结构域(折叠子)对于次要纤维蛋白三聚体结构的形成必不可少，并且可以用作人工三聚结构域。在一实施方案中，如本文定义的三聚结构域包括但不限于这样的序列，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列或其功能变体。在一实施方案中，如本文定义的三聚结构域包括但不限于这样的序列，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或其功能变体。
在一实施方案中，三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，三聚结构域包含SEQID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码三聚结构域的RNA(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列，与SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列的片段或与SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，编码三聚结构域的RNA(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列。
在一实施方案中，三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:10的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码三聚结构域的RNA(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列，与SEQ ID NO:11的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:11的核苷酸序列的片段或与SEQ ID NO:11的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:10的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:10的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，编码三聚结构域的RNA(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
优选使用这类三聚结构域以促进编码的抗原肽或蛋白的三聚化。更优选地，将如本文定义的三聚结构域融合至如本文定义的抗原肽或蛋白。
因此，在特别优选的实施方案中，本文描述的RNA包含至少一个编码抗原肽或蛋白以及如本文定义的三聚结构域的编码区，所述三聚结构域优选融合至抗原肽或蛋白，更优选融合至抗原肽或蛋白的C-末端。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:30的核苷酸54-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:30的核苷酸54-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:32的核苷酸54-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:32的核苷酸54-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:30的核苷酸111-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:30的核苷酸111-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:32的核苷酸120-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:32的核苷酸120-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
根据某些实施方案，将跨膜结构域直接或通过接头(例如，甘氨酸/丝氨酸接头)融合至氨基酸序列，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2 S蛋白的修饰的变体或其片段，即，抗原肽或蛋白，。因此，在一实施方案中，将跨膜结构域融合至上述疫苗抗原包含的源自SARS-CoV-2 S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列(可以任选地将其融合至上述信号肽和/或三聚结构域)。
这类跨膜结构域优选位于抗原肽或蛋白的C-末端，但不限于此。优选地，这类跨膜结构域位于三聚结构域(如果存在)的C-末端，但不限于此。在一实施方案中，三聚结构域存在于氨基酸序列以及跨膜结构域之间，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2 S蛋白的修饰的变体或其片段，即，抗原肽或蛋白。
如本文定义的跨膜结构域优选允许抗原肽或蛋白锚定在细胞膜中。
在一实施方案中，如本文定义的跨膜结构域序列包括但不限于SARS-CoV-2 S蛋白的跨膜结构域序列，特别是包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列或其功能变体的序列。
在一实施方案中，跨膜结构域序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，跨膜结构域序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码跨膜结构域序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列，与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列的片段或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列的功能片段或与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一实施方案中，编码跨膜结构域序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:30的核苷酸54-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:30的核苷酸54-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:32的核苷酸54-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:32的核苷酸54-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:30的核苷酸111-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:30的核苷酸111-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ IDNO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:32的核苷酸120-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:32的核苷酸120-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，疫苗抗原包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含与SEQ ID NO:27的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者与SEQ IDNO:27的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，以上描述的疫苗抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为SARS-CoV-2冠状病毒刺突(S)蛋白的连续序列的修饰的变体，所述连续序列由或基本上由上述疫苗抗原包含的源自SARS-CoV-2 S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列组成。在一实施方案中，上述疫苗抗原包含氨基酸序列，所述氨基酸序列为不超过220个氨基酸、215个氨基酸、210个氨基酸或205个氨基酸的SARS-CoV-2冠状病毒刺突(S)蛋白的连续序列的修饰的变体。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，其为本文中描述为BNT162b1(RBP020.3)、BNT162b2(RBP020.1或RBP020.2)的RNA的修饰的变体。在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，其为本文中描述为RBP020.2的RNA的修饰的变体。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含与SEQ ID NO:21的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含与SEQ ID NO:19或20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含与SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。
如本文所用，术语“疫苗”是指在接种至受试者中时诱导免疫应答的组合物。在一些实施方案中，诱导的免疫应答提供保护性免疫。
在一实施方案中，在受试者的细胞中表达编码抗原分子的RNA以提供抗原分子。在一实施方案中，抗原分子的表达是在细胞表面或进入细胞外空间。在一实施方案中，抗原分子是在MHC的背景下呈递的。在一实施方案中，编码抗原分子的RNA在受试者的细胞中瞬时表达。在一实施方案中，在给药编码抗原分子的RNA之后，特别是在肌肉内给药编码抗原分子的RNA之后，在肌肉中表达编码抗原分子的RNA。在一实施方案中，在给药编码抗原分子的RNA之后，在脾中表达编码抗原分子的RNA。在一实施方案中，在给药编码抗原分子的RNA之后，在抗原呈递细胞中，优选在专职抗原呈递细胞中表达编码抗原分子的RNA。在一实施方案中，抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和B细胞。在一实施方案中，在给药编码抗原分子的RNA之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有编码抗原分子的RNA的表达。在一实施方案中，在给药编码抗原分子的RNA之后，脾中编码抗原分子的RNA的表达是肺中表达量的至少5倍。
在一些实施方案中，向受试者给药之后，特别是肌肉内给药之后，本文描述的方法和药剂，例如，mRNA组合物，导致将编码疫苗抗原的RNA递送至淋巴结和/或脾。在一些实施方案中，给药之后6小时或更晚，并且优选长达6天或更长时间，编码疫苗抗原的RNA在淋巴结和/或脾中可检测。
在一些实施方案中，向受试者给药之后，特别是肌肉内给药之后，本文描述的方法和药剂，例如，mRNA组合物，导致将编码疫苗抗原的RNA递送至B细胞滤泡、被膜下淋巴窦和/或T细胞区，特别是淋巴结的B细胞滤泡和/或被膜下淋巴窦。
在一些实施方案中，向受试者给药之后，特别是肌肉内给药之后，本文描述的方法和药剂，例如，mRNA组合物，导致将编码疫苗抗原的RNA递送至淋巴结的T细胞区和中间窦中的B细胞(CD19+)、被膜下淋巴窦巨噬细胞(CD169+)和/或树突细胞(CD11c+)，特别是淋巴结的B细胞(CD19+)和/或被膜下淋巴窦巨噬细胞(CD169+)。
在一些实施方案中，向受试者给药之后，特别是肌肉内给药之后，本文描述的方法和药剂，例如，mRNA组合物，导致将编码疫苗抗原的RNA递送至脾的白髓。
在一些实施方案中，向受试者给药之后，特别是肌肉内给药之后，本文描述的方法和药剂，例如，mRNA组合物，导致将编码疫苗抗原的RNA递送至B细胞，DC(CD11c+)，特别是B细胞周围的那些，和/或脾的巨噬细胞，特别是B细胞和/或DC(CD11c+)。
在一实施方案中，疫苗抗原在淋巴结和/或脾中表达，特别是在上述淋巴结和/或脾的细胞中表达。
抗原分子或其加工产物，例如，其片段，可以结合至免疫效应细胞携带的抗原受体如BCR或TCR，或者结合至抗体。
根据本发明，例如通过给药编码肽和蛋白抗原的RNA提供给受试者的肽或蛋白抗原，即，疫苗抗原，优选导致在提供肽或蛋白抗原的受试者中诱导免疫应答，例如，体液和/或细胞免疫应答。所述免疫应答优选针对靶抗原，特别是冠状病毒S蛋白，特别是SARS-CoV-2 S蛋白。
疫苗抗原可以包含靶抗原、其变体或其片段。在一实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上等同于靶抗原。术语“抗原的片段”或“抗原的变体”表示导致诱导免疫应答的物质，所述免疫应答靶向抗原，即靶抗原。因此，疫苗抗原可以对应于或可以包含靶抗原，可以对应于或可以包含靶抗原的片段，或者可以对应于或可以包含与靶抗原或其片段同源的抗原。疫苗抗原可以包含靶抗原的免疫原性片段或与靶抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。“抗原的免疫原性片段”优选涉及能够诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原片段。疫苗抗原可以是重组抗原。
术语“在免疫学上等同”表示在免疫学上等同的分子，如在免疫学上等同的氨基酸序列表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应，例如，在免疫学效应的类型方面。在本公开的上下文中，术语“在免疫学上等同”优选关于用于免疫的抗原或抗原变体的免疫学效应或特性使用。例如，如果所述氨基酸序列在暴露于受试者的免疫系统时诱导具有与参考氨基酸序列反应特异性的免疫反应，则该氨基酸序列在免疫学上等同于参考氨基酸序列。
如本文所用，“激活”或“刺激”是指已充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞如T细胞的状态。激活还可以与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子生成和可检测的效应物功能相关。此外，术语“激活的免疫效应细胞”是指经历细胞分裂的免疫效应细胞。
术语“初免”是指这样的过程，其中免疫效应细胞如T细胞与其特异性抗原首次接触并导致分化为效应细胞如效应T细胞。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体增加的过程。在本公开的上下文中，该术语优选用于免疫学应答的上下文，其中免疫效应细胞被抗原刺激、增殖、并且识别所述抗原的特定免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。
术语“抗原”涉及包含表位的物质，针对所述表位可以产生免疫应答。特别地，术语“抗原”包括蛋白和肽。在一实施方案中，抗原由免疫系统的细胞呈递，例如抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞。在一实施方案中，抗原或其加工产物如T-细胞表位与T-或B-细胞受体结合，或者与免疫球蛋白分子如抗体结合。因此，抗原或其加工产物可以与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性地反应。在一实施方案中，抗原是病毒抗原，如冠状病毒S蛋白，例如，SARS-CoV-2 S蛋白，并且表位源自这样的抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是冠状病毒S蛋白，例如，SARS-CoV-2 S蛋白。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面关联”表示分子如抗原与细胞的质膜关联并位于细胞的质膜上，其中至少一部分分子面向所述细胞的细胞外空间，并且可从所述细胞的外部接近，例如，通过位于细胞外部的抗体。在这个上下文中，一部分为优选至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。所述关联可以是直接或间接的。例如，所述关联可以是通过一个或多个跨膜结构域，一个或多个脂质锚定物，或者通过与可以在细胞质膜的外小叶上发现的任何其他蛋白、脂质、糖或其他结构相互作用。例如，与细胞表面关联的分子可以是具有细胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与另一蛋白(其为跨膜蛋白)相互作用而与细胞表面关联的蛋白。
“细胞表面”或“细胞的表面”按照其在本领域中的正常含义使用，因此包括可被蛋白和其他分子接近而结合的细胞外部。如果抗原位于细胞表面并且可被例如添加至细胞的抗原特异性抗体接近而结合，则抗原在所述细胞表面上表达。
本发明的上下文中的术语“细胞外部分”或“胞外域(exodomain)”是指分子如蛋白的一部分，其面向细胞的胞外空间并且优选从所述细胞外可接近，例如通过位于细胞外的结合分子如抗体。优选地，该术语是指一个或多个细胞外环或结构域或其片段。
术语“表位”是指免疫系统识别的分子如抗原的一部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可以包括所述抗原的连续或不连续部分，并且可以长度为约5-约100，如约5-约50，更优选约8-约30，最优选约8-约25个氨基酸，例如，表位可以优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一实施方案中，表位长度为约10-约25个氨基酸。术语“表位”包括T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的背景下呈递时被T细胞识别的蛋白的一部分或片段。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及所有脊椎动物中均存在的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导很重要，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们用于T细胞上的T细胞受体识别。MHC编码的蛋白在细胞表面上表达，并且向T细胞展示自身抗原(来自细胞自身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)。在MHC I类/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8-约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可能是有效的。在MHC II类/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10-约25个氨基酸，特别是约13-约18个氨基酸，而更长或更短的肽可能是有效的。
肽和蛋白抗原可以长度为2-100个氨基酸，包括例如，5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度可以为50个氨基酸以上。在一些实施方案中，肽的长度可以为100个氨基酸以上。
肽或蛋白抗原可以是任何肽和蛋白，其可以诱导或增加免疫系统发展对肽或蛋白的抗体和T细胞应答的能力。
在一实施方案中，疫苗抗原被免疫效应细胞识别。优选地，如果疫苗抗原被免疫效应细胞识别，其能够在适当的共刺激信号存在下诱导免疫效应细胞的刺激、引发(priming)和/或扩增，所述免疫效应细胞携带识别疫苗抗原的抗原受体。在本发明的实施方案的上下文中，疫苗抗原优选呈递或存在于细胞表面上，优选抗原呈递细胞。在一实施方案中，抗原是由患病细胞(如病毒感染的细胞)呈递的。在一实施方案中，抗原受体是TCR，其结合至在MHC的背景下呈递的抗原表位。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，TCR结合至细胞(如抗原呈递细胞)呈递的抗原导致所述T细胞的刺激、引发和/或扩增。在一实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，TCR对患病细胞上呈递的抗原的结合导致患病细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔蛋白和颗粒酶。
在一实施方案中，抗原受体是结合至抗原中表位的抗体或B细胞受体。在一实施方案中，抗体或B细胞受体结合至抗原的天然表位。
核酸
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”意图包括DNA和RNA如基因组DNA、cDNA、mRNA，重组产生和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(IVTRNA)或合成的RNA。根据本发明，多核苷酸优选是分离的。
核酸可以包含在载体中。如本文所用的术语“载体”包括技术人员已知的任何载体，包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体(如λ噬菌体)、病毒载体(如逆转录病毒、腺病毒或杆状病毒载体)或者人工染色体载体(如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC))。所述载体包括表达载体以及克隆载体。表达载体包含质粒以及病毒载体，并且一般包含期望的编码序列以及在特定宿主生物体(例如，细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或体外表达系统中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当DNA序列。克隆载体一般用来工程化和扩增某个期望的DNA片段，并且可以缺少表达期望的DNA片段所需要的功能序列。
在本发明的所有方面的一实施方案中，在细胞(如治疗的受试者的抗原呈递细胞)中表达编码疫苗抗原的RNA以提供疫苗抗原。
本文描述的核酸可以是重组和/或分离的分子。
在本公开中，术语“RNA”涉及包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖(β-D-ribofuranosyl)基团的2'位置具有羟基的核苷酸。RNA涵盖但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、替代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。这类改变可以指将非核苷酸物质添加至内部RNA分子或RNA的末端。本文中还考虑RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，认为这些改变的RNA是天然存在的RNA的类似物。
在本公开的某些实施方案中，RNA是与编码肽或蛋白的RNA转录物有关的信使RNA(mRNA)。如本领域中建立的，mRNA一般包含5'非翻译区(5'-UTR)、肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，所述RNA是通过体外转录或化学合成产生的。在一实施方案中，mRNA是利用DNA模板通过体外转录产生的，其中DNA是指包含脱氧核糖核苷酸的核酸。
在一实施方案中，RNA是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
在本公开的某些实施方案中，RNA是“复制子RNA”或简单地是“复制子”，特别是“自我复制RNA”或“自我扩增RNA”。在一特别优选的实施方案中，复制子或自我复制RNA源自或包含源自ssRNA病毒的元件，特别是正链ssRNA病毒如甲病毒。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在感染细胞的细胞质中复制(甲病毒生命周期的综述参见Joséet al.,FutureMicrobiol.,2009,vol.4,pp.837–856)。许多甲病毒的总基因组长度通常范围在11,000和12,000个核苷酸之间，并且基因组RNA通常具有5’-帽和3’poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。在基因组中通常有两个开放阅读框(ORF)。4个非结构蛋白(nsP1–nsP4)通常由在基因组5’末端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由第二ORF一起编码，所述第二ORF位于第一ORF下游并延伸至基因组的3’端附近。通常，第一ORF比第二ORF大，比例大概为2:1。在被甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，其为类似于真核信使RNA的RNA分子(mRNA；Gouldet al.,2010,Antiviral Res.,vol.87pp.111–124)。感染之后，即在病毒生命周期的早期，(+)链基因组RNA直接充当信使RNA，用于翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已建议将甲病毒衍生的载体用于将外来遗传信息递送至靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框被编码所关注的蛋白的开放阅读框代替。基于甲病毒的反式复制(trans-replication)系统依赖于两个单独的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，而另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此命名为反式复制系统)。反式复制需要在给定宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。
在一实施方案中，本文描述的RNA可以具有修饰的核苷。在一些实施方案中，所述RNA包含修饰的核苷，以代替至少一个(例如，每个)尿苷。
如本文所用，术语“尿嘧啶”描述可以在RNA的核酸中出现的核碱基之一。尿嘧啶的结构是：
如本文所用，术语“尿苷”描述可以在RNA中出现的核苷之一。尿苷的结构是：
UTP(尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：
假-UTP(假尿苷5’-三磷酸)具有以下结构：
“假尿苷”是修饰的核苷的一个实例，其是尿苷的异构体，其中尿嘧啶通过碳-碳键而不是氮-碳糖苷键连接至戊糖环。
另一示例性修饰的核苷是N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其具有以下结构：
N1-甲基-假-UTP具有以下结构：
另一示例性修饰的核苷是5-甲基-尿苷(m5U)，其具有以下结构：
在一些实施方案中，本文描述的RNA中的一个或多个尿苷被修饰的尿苷代替。在一些实施方案中，修饰的核苷是修饰的尿苷。
在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替至少一个尿苷。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷，以代替每个尿苷。
在一些实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，RNA可以包含一种以上类型的修饰的核苷，并且修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，修饰的核苷包含假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，代替RNA中的一个或多个(例如，全部)尿苷的修饰的核苷可以是以下任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲基酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷(2′-F-ara-uridine)、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷(2′-OH-ara-uridine)、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷或本领域已知的任何其他修饰的尿苷。
在一实施方案中，RNA包含其他修饰的核苷，或者包含进一步修饰的核苷，例如，修饰的胞苷。例如，在一实施方案中，在RNA中，5-甲基胞苷部分或完全，优选完全替代胞苷。在一实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷以及选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)中的一种或多种。在一实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在一些实施方案中，RNA包含5-甲基胞苷代替每个胞苷，以及N1-甲基-假尿苷(m1ψ)代替每个尿苷。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA包含5’-帽。在一实施方案中，本公开的RNA没有无帽的5'-三磷酸。在一实施方案中，RNA可以通过5'-帽类似物修饰。术语“5'-帽”是指在mRNA分子的5'端上发现的结构，并且一般由通过5'-至5'-三磷酸键连接至mRNA的鸟苷核苷酸组成。在一实施方案中，这个鸟苷在7-位置甲基化。提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA可以通过体外转录来实现，其中将5'-帽共转录表达至RNA链中，或者可以利用加帽酶转录后连接至RNA。
在一些实施方案中，RNA的构件(building block)帽是m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG(有时也称作m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG)，其具有以下结构：
以下是示例性Cap1 RNA，其包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG：
以下是另一示例性Cap1 RNA(没有帽类似物)：
在一些实施方案中，用“Cap0”结构修饰RNA，在一些实施方案中，使用帽类似物抗反向帽(anti-reverse cap)(ARCA Cap(m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G))，其具有以下结构：
以下是包含RNA和m2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G的示例性Cap0 RNA：
在一些实施方案中，利用具有以下结构的帽类似物β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)产生“Cap0”结构：
以下是包含β-S-ARCA(m2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA的示例性Cap0 RNA：
β-S-ARCA的“D1”非对映体或“β-S-ARCA(D1)”是β-S-ARCA的非对映体，与β-S-ARCA的D2非对映体(β-S-ARCA(D2))相比其在HPLC柱上首先洗脱，因此表现出较短的保留时间(参见WO 2011/015347，援引加入本文)。
特别优选的帽是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2'-OGppSpG)或m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA包含5'-UTR和/或3'-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中的区域，其转录但不翻译为氨基酸序列，或者涉及RNA分子(如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR)。如果存在，5'-UTR位于5'端，蛋白编码区的起始密码子的上游。5'-UTR位于5'-帽(如果存在)的下游，例如直接与5'-帽相邻。如果存在，3'-UTR位于3'端，蛋白编码区的终止密码子的下游，但是术语“3'-UTR”优选不包括poly(A)序列。因此，3'-UTR位于poly(A)序列(如果存在)的上游，例如直接与poly(A)序列相邻。
在一些实施方案中，RNA包含5’-UTR，所述5’-UTR包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA包含3’-UTR，所述3’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
特别优选的5’-UTR包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。特别优选的3’-UTR包含SEQID NO:13的核苷酸序列。
在一些实施方案中，根据本公开的RNA包含3'-poly(A)序列。
如本文所用，术语“poly(A)序列”或“poly-A尾”是指腺苷酸残基的不间断或间断序列，其通常位于RNA分子的3'端。Poly(A)序列是本领域技术人员已知的，并且可以跟随本文描述的RNA中的3’-UTR。不间断的poly(A)序列的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly(A)序列是典型的。本文公开的RNA可以具有转录之后通过不依赖于模板的RNA聚合酶连接至RNA的游离3'端的poly(A)序列，或者由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly(A)序列。
已证实约120个A核苷酸的poly(A)序列对转染的真核细胞中的RNA水平以及从存在于poly(A)序列上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白水平具有有益影响(Holtkamp etal.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)。
poly(A)序列可以具有任何长度。在一些实施方案中，poly(A)序列包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。在这种情况下，“基本上由…组成”表示poly(A)序列中的大多数核苷酸，通常poly(A)序列中核苷酸数量的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但是允许剩余的核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在这种情况下，“由…组成”表示poly(A)序列的所有核苷酸，即，poly(A)序列中核苷酸数量的100％是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如，在制备体外转录的RNA期间，连接poly(A)序列。编码poly(A)序列的DNA序列(编码链)称作poly(A)盒。
在一些实施方案中，DNA编码链中存在的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但是被4种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这类随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。在WO 2016/005324 A1中公开了这类盒，其援引加入本文。WO 2016/005324A1中公开的任何poly(A)盒均可以用于本发明。涵盖这样的poly(A)盒，其基本上由dA核苷酸组成，但是被具有均等分布的4种核苷酸(dA、dC、dG、dT)且具有例如5-50个核苷酸长度的随机序列中断，在DNA水平上在大肠杆菌(E.coli)中表现出质粒DNA的恒定增殖，并且在RNA水平上仍与支持RNA稳定性和翻译效率方面的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文描述的RNA分子中包含的poly(A)序列基本上由A核苷酸组成，但是被4种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这类随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。
在一些实施方案中，在poly(A)序列的3'端侧翼没有除A核苷酸以外的核苷酸，即，poly(A)序列在其3'端未被A以外的核苷酸掩盖或跟随。
在一些实施方案中，poly(A)序列可以包含至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列可以基本上由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列可以由至少20、至少30、至少40、至少80或至少100以及多达500、多达400、多达300、多达200或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly(A)序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly(A)序列包含约120个核苷酸。
在一些实施方案中，RNA包含poly(A)序列，所述poly(A)序列包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
特别优选的poly(A)序列包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
根据本公开，疫苗抗原优选作为单链、5'-加帽的mRNA给药，其在进入给药RNA的受试者的细胞时翻译为相应的蛋白。优选地，所述RNA包含在稳定性和翻译效率方面为RNA的最大效力优化的结构元件(5'-帽、5'-UTR、3'-UTR、poly(A)序列)。
在一实施方案中，β-S-ARCA(D1)用作RNA的5'端的特定加帽结构。在一实施方案中，m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG用作RNA的5'端的特定加帽结构。在一实施方案中，5'-UTR序列源自人α-珠蛋白mRNA，并且任选地具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。在一实施方案中，将源自“分裂的氨基末端增强子(amino terminal enhancer of split)”(AES)mRNA(称作F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称作I)的两个序列元件的组合(FI元件)置于编码序列和poly(A)序列之间以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。在一实施方案中，将源自人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3'-UTR置于编码序列和poly(A)序列之间以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。在一实施方案中，使用长度为110个核苷酸的poly(A)序列，其由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列和另一70个腺苷残基组成。设计这个poly(A)序列以增强RNA稳定性和翻译效率。
在本发明的所有方面的一实施方案中，在治疗的受试者的细胞中表达编码疫苗抗原的RNA以提供疫苗抗原。在本发明的所有方面的一实施方案中，在受试者的细胞中瞬时表达所述RNA。在本发明的所有方面的一实施方案中，所述RNA是体外转录的RNA。在本发明的所有方面的一实施方案中，疫苗抗原的表达在细胞表面。在本发明的所有方面的一实施方案中，疫苗抗原是在MHC的背景下表达和呈递的。在本发明的所有方面的一实施方案中，疫苗抗原的表达进入细胞外空间，即，疫苗抗原是分泌的。
在本公开的上下文中，术语“转录”涉及一个过程，其中将DNA序列中的遗传密码转录为RNA。随后，可以将RNA翻译为肽或蛋白。
根据本发明，术语“转录”包含“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及一个过程，其中RNA，特别是mRNA，在不含细胞的系统中体外合成，优选使用适当的细胞提取物。优选地，将克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体一般指定为转录载体，并且根据本发明涵盖在术语“载体”内。根据本发明，本发明中使用的RNA优选是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的特别实例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的适当载体来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过这个过程mRNA链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白。
在一实施方案中，给药本文描述的RNA之后，例如，配制为RNA脂质颗粒，将RNA的至少一部分递送至靶细胞。在一实施方案中，将RNA的至少一部分递送至靶细胞的胞质溶胶。在一实施方案中，通过靶细胞翻译RNA以产生其编码的肽或蛋白。在一实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞。在一实施方案中，靶细胞是树突细胞或巨噬细胞。本文描述的RNA颗粒(如RNA脂质颗粒)可以用于将RNA递送至这样的靶细胞。因此，本公开还涉及一种将RNA递送至受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括将本文描述的RNA颗粒给药受试者。在一实施方案中，将所述RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一实施方案中，通过靶细胞翻译RNA以产生所述RNA编码的肽或蛋白。
“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，以便用作模板用于在生物过程中合成其他聚合物或大分子，所述聚合物或大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此所致的生物学特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码该蛋白。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录模板的非编码链均可以称作编码该基因或者cDNA的蛋白或其他产物。
在一实施方案中，本文所描述的核酸组合物(例如包含脂质纳米颗粒包封的mRNA的组合物)的特征在于(例如，当给药受试者时)编码多肽的持续表达。例如，在一些实施方案中，这样的组合物的特征在于，当给药人时，它们在来自这样的人的生物样品(例如，血清)中实现可检测的多肽表达，并且在一些实施方案中，这样的表达持续至少36小时或更长的时间段，包括，例如，至少48小时、至少60小时、至少72小时、至少96小时、至少120小时、至少148小时或更长。
在一实施方案中，根据本发明给药的编码疫苗抗原的RNA是非免疫原性的。可以根据本发明给药编码免疫刺激剂的RNA以提供辅助作用。编码免疫刺激剂的RNA可以是标准RNA或非免疫原性RNA。
如本文所用的术语“非免疫原性RNA”是指这样的RNA，其在给药例如哺乳动物时不诱导免疫系统应答，或者诱导的应答比不同之处仅在于尚未进行使非免疫原性RNA成为非免疫原性的修饰和处理的相同RNA诱导的弱，即，比标准RNA(stdRNA)诱导的弱。在一优选实施方案中，通过将修饰的核苷掺入RNA并去除双链RNA(dsRNA)，使得在本文中也称作修饰的RNA(modRNA)的非免疫原性RNA成为非免疫原性，所述修饰的核苷抑制RNA介导的先天免疫受体激活。
为了通过掺入修饰的核苷使非免疫原性RNA成为非免疫原性，可以使用任何修饰的核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性。特别优选抑制RNA介导的先天免疫受体激活的修饰的核苷。在一实施方案中，修饰的核苷包括用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷。在一实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。在一实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟基甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟基甲基-尿苷甲基酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷以及5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。在一特别优选的实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，特别是N1-甲基-假尿苷。
在一实施方案中，用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷包括置换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。
在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(IVT)合成mRNA期间，由于酶的非常规活性，产生大量异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白合成抑制。可以利用无孔或多孔的C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)基质通过例如离子对反相HPLC从RNA(如IVT RNA)去除dsRNA。或者，可以使用基于酶的方法，使用特异性水解dsRNA但不水解ssRNA的大肠杆菌RNaseIII，从而从IVT RNA制品消除dsRNA污染物。此外，可以通过使用纤维素材料将dsRNA与ssRNA分开。在一实施方案中，使RNA制品与纤维素材料接触，并且在允许dsRNA结合至纤维素材料且不允许ssRNA结合至纤维素材料的条件下将ssRNA与纤维素材料分离。
当术语在本文中使用时，“去除”或“除去”是指第一物质群体(如非免疫原性RNA)的特征为与第二物质群体(如dsRNA)的附近分离，其中第一物质群体不必完全没有第二物质，并且第二物质群体不必完全没有第一物质。但是，与未分离的第一物质和第二物质的混合物相比，特征在于去除第二物质群体的第一物质群体具有可测量的更低含量的第二物质。
在一实施方案中，从非免疫原性RNA去除dsRNA包括去除dsRNA，从而非免疫原性RNA组合物中10％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、1％以下、0.5％以下、0.3％以下或0.1％以下的RNA是dsRNA。在一实施方案中，非免疫原性RNA不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA组合物包含核苷修饰的单链RNA的纯化制品。例如，在一些实施方案中，核苷修饰的单链RNA的纯化制品基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，纯化的制品是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％核苷修饰的单链RNA。
在一实施方案中，与具有相同序列的标准RNA相比，非免疫原性RNA在细胞中的翻译效率更高。在一实施方案中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强的倍数是2倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是3倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是4倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是5倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是6倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是7倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是8倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是9倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是10倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是15倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是20倍。
在一实施方案中，翻译增强的倍数是50倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是100倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是200倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是500倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是1000倍。在一实施方案中，翻译增强的倍数是2000倍。在一实施方案中，倍数是10-1000倍。在一实施方案中，倍数是10-100倍。在一实施方案中，倍数是10-200倍。在一实施方案中，倍数是10-300倍。在一实施方案中，倍数是10-500倍。在一实施方案中，倍数是20-1000倍。在一实施方案中，倍数是30-1000倍。在一实施方案中，倍数是50-1000倍。在一实施方案中，倍数是100-1000倍。在一实施方案中，倍数是200-1000倍。在一实施方案中，翻译增强了任何其他显著的量或量的范围。
在一实施方案中，与具有相同序列的标准RNA相比，非免疫原性RNA表现出明显更低的先天免疫原性。在一实施方案中，非免疫原性RNA表现出比其未修饰的对应物少2倍的先天免疫应答。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是3倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是4倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是5倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是6倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是7倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是8倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是9倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是10倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是15倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是20倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是50倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是100倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是200倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是500倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是1000倍。在一实施方案中，先天免疫原性减少的倍数是2000倍。
术语“表现出明显更少的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的减少。在一实施方案中，该术语是指减少，使得可以给药有效量的非免疫原性RNA而不触发可检测的先天免疫应答。在一实施方案中，该术语是指减少，使得可以重复给药非免疫原性RNA而不引发先天免疫应答，所述先天免疫应答足以可检测地减少所述非免疫原性RNA编码的蛋白的产生。在一实施方案中，所述减少使得可以重复给药非免疫原性RNA而不引发先天免疫应答，所述先天免疫应答足以消除所述非免疫原性RNA编码的蛋白的可检测的产生。
“免疫原性”是外来物质(如RNA)在人或其他动物体内引起免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统的组成部分，其是相对非特异性和即时的。它和适应性免疫系统一起是脊椎动物免疫系统的两个主要组成部分之一。
如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或者在生物体、细胞、组织或系统内部产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或者在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
如本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指两个或更多个元件或组件或结构域连接在一起。
密码子优化/G/C含量的增加
在一些实施方案中，本文描述的包含多特异性病毒蛋白氨基酸序列的氨基酸序列由这样的编码序列编码，其与野生型编码序列相比是密码子优化和/或其G/C含量增加的。这还包括实施方案，其中与野生型编码序列的相应序列区域相比，编码序列的一个或多个序列区域是密码子优化和/或G/C含量增加的。在一实施方案中，密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
术语“密码子优化”是指改变核酸分子的编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用，而优选不改变核酸分子编码的氨基酸序列。在本发明的上下文中，优选使用本文描述的RNA分子对编码区进行密码子优化以在待治疗的受试者中最佳表达。密码子优化是基于以下发现：翻译效率还由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，可以修饰RNA的序列，从而插入可获得频繁出现的tRNA的密码子以代替“稀有密码子”。
在本发明的一些实施方案中，与野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比，本文描述的RNA的编码区的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量增加，其中与野生型RNA编码的氨基酸序列相比，所述RNA编码的氨基酸序列优选是未修饰的。RNA序列的这种修饰是基于以下事实：待翻译的任何RNA区域的序列对于该mRNA的高效翻译都很重要。具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。关于几个密码子编码一个和相同氨基酸(所谓的遗传密码的简并性)的事实，可以确定对于稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。取决于RNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，对于RNA序列的修饰有各种可能性。特别地，包含A和/或U核苷酸的密码子可以通过用其他密码子替代这些密码子来修饰，所述其他密码子编码相同氨基酸但不含A和/或U或者包含较低量的A和/或U核苷酸。
在各种实施方案中，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，本文描述的RNA的编码区的G/C含量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。
给药的RNA的实施方案
在一些实施方案中，本公开提供包含编码多肽的开放阅读框的RNA(例如，mRNA)，所述多肽包含SARS-CoV-2 S蛋白的至少一部分，所述SARS-CoV-2 S蛋白的至少一部分被修饰为并入在其他SARS-CoV-2 S蛋白变体发现的氨基酸修饰。RNA可以包含编码具有不同所述修饰的多肽的多个不同的RNA分子。所述RNA适合于多肽的细胞内表达。在一些实施方案中，这样的编码多肽不包含对应于完整S蛋白的序列。在一些实施方案中，编码的多肽包含对应于受体结合结构域(RBD)的序列。在一些实施方案中，这类RNA(例如，mRNA)可以由(聚)阳离子聚合物、复合物(polyplex)、蛋白或肽复合。在一些实施方案中，这类RNA可以配制于脂质纳米颗粒(例如，本文描述的脂质纳米颗粒)中。在一些实施方案中，这类RNA(例如，mRNA)可以对于用作或用于免疫原性组合物(例如，疫苗)，和/或用于实现如本文描述的免疫效果(例如，产生SARS-CoV-2中和抗体，和/或T细胞应答(例如，CD4+和/或CD8+T细胞应答))特别有用和/或有效。在一些实施方案中，这类RNA(例如，mRNA)可以用于对人(包括，例如，已知暴露于SARS-CoV-2和/或被SARS-CoV-2感染的人，和/或未知已暴露于SARS-CoV-2的人)进行疫苗接种。
在一实施方案中，本文所描述的mRNA构建体包含编码对应于全长SARS-CoV-2刺突蛋白的氨基酸序列的核酸序列(例如，包括其中这类编码氨基酸序列可以包含至少一个或多个氨基酸取代的实施方案，例如，如本文描述的脯氨酸取代，和/或其中mRNA序列经密码子优化(例如针对哺乳动物，例如，人，受试者)的实施方案。在一实施方案中，编码对应于全长SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列的mRNA构建体对于在特定受试者群体(例如特定年龄群体，例如本文所描述的年龄群体)中用作或用于免疫原性组合物(例如疫苗)可能特别有用和/或有效。
在一些实施方案中，本文描述的组合物或医药制品包含RNA，其编码氨基酸序列，所述氨基酸序列是包含SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列的修饰的变体或者SARS-CoV-2 S蛋白的免疫原性片段。同样地，本文描述的方法包括给药这类RNA。
用于本文的活性平台可以基于编码抗原的RNA疫苗，以便诱导强健的中和抗体和伴随/相伴的T细胞应答，从而用优选的最小疫苗剂量实现保护性免疫。给药的RNA优选是体外转录的RNA。
特别优选三种不同的RNA平台，即未修饰的包含尿苷的mRNA(uRNA)、核苷修饰的mRNA(modRNA)和自我扩增RNA(saRNA)。在一特别优选的实施方案中，RNA是体外转录的RNA。
在下文中，描述了这三种不同RNA平台的实施方案，其中在描述其元件时使用的某些术语具有以下含义：
S1S2蛋白/S1S2 RBD:编码SARS-CoV-2的各(修饰的)抗原的序列
nsP1、nsP2、nsP3和nsP4:编码委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalitis virus，VEEV)RNA依赖性RNA聚合酶复制酶和亚基因组启动子以及支持复制和翻译的保守序列元件的野生型序列。
virUTR:编码部分亚基因组启动子以及复制和翻译支持序列元件的病毒非翻译区。
hAg-Kozak:人α-珠蛋白mRNA的5'-UTR序列，其具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。
Sec:Sec对应于内在的S1S2蛋白分泌信号肽(sec)，其指导新生多肽链易位至内质网。
甘氨酸-丝氨酸接头(GS):编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列，通常用于融合蛋白。
次要纤维蛋白:T4次要纤维蛋白的部分序列(折叠子)，用作人工三聚结构域。
TM:TM序列对应于S1S2蛋白的跨膜部分。
FI元件：3'-UTR是源自“分裂的氨基末端增强子”(AES)mRNA(称作F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称作I)的两个序列元件的组合。通过对赋予RNA稳定性和增加总蛋白表达的序列的离体选择过程鉴定了这些。
A30L70:长度为110个核苷酸的poly(A)-尾，由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列和另一段70个腺苷残基组成，设计为增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率。
一般来说，本文描述的疫苗RNA可以包含从5'至3'的以下结构之一：
Cap-5'-UTR-疫苗抗原-编码序列-3'-UTR-Poly(A)
或者
Cap-hAg-Kozak-疫苗抗原-编码序列-FI-A30L70。
一般来说，本文描述的疫苗抗原可以包含从N-末端至C-末端的以下结构之一：
信号序列-RBD-三聚结构域
或者
信号序列-RBD-三聚结构域-跨膜结构域。
RBD和三聚结构域可以通过接头分开，特别是GS接头如具有氨基酸序列GSPGSGSGS的接头。三聚结构域和跨膜结构域可以通过接头分开，特别是GS接头如具有氨基酸序列GSGSGS的接头。
信号序列可以是如本文描述的信号序列。RBD可以是如本文描述的(修饰的)RBD结构域。三聚结构域可以是如本文描述的三聚结构域。跨膜结构域可以是如本文描述的跨膜结构域。
在一实施方案中，
信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16或1-19的氨基酸序列或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，或者与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，
RBD包含与SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，
三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或者与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列；并且
跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列，或者与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，
信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16或1-19的氨基酸序列或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，
三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；并且
跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列。
本文所描述的RNA或编码本文所描述的疫苗抗原的RNA可以是包含未修饰的尿苷的mRNA(uRNA)、核苷修饰的mRNA(modRNA)或自我扩增RNA(saRNA)。在一实施方案中，本文所描述的RNA或编码本文所描述的疫苗抗原的RNA是核苷修饰的mRNA(modRNA)。
未修饰的尿苷信使RNA(uRNA)
未修饰的信使RNA(uRNA)原料药(drug substance)的活性成分是在进入细胞时翻译的单链mRNA。除了编码疫苗抗原的序列(即开放阅读框)，每个uRNA优选包含在稳定性和翻译效率方面为RNA的最大效力优化的常见结构元件(5′-帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)-尾)。优选的5’帽结构是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2'-OGppSpG)。优选的5′-UTR和3′-UTR分别包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列和SEQ ID NO:13的核苷酸序列。优选的poly(A)-尾包含SEQ IDNO:14的序列。
这个平台的不同实施方案是源自以下的序列和是以下的修饰的变体的序列：
RBL063.1(SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
RBL063.2(SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162a1；RBL063.3(SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:5)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
图3示意编码抗原的RNA的一般结构。
核苷修饰的信使RNA(modRNA)
核苷修饰的信使RNA(modRNA)原料药的活性成分也是在进入细胞时翻译的单链mRNA。如同uRNA，除了编码疫苗抗原的序列(即开放阅读框)，每个modRNA包含为RNA的最大效力优化的常见结构元件(5′-帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)-尾)。与uRNA相比，modRNA包含1-甲基-假尿苷代替尿苷。优选的5’帽结构是m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。优选的5′-UTR和3′-UTR分别包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列和SEQ ID NO:13的核苷酸序列。优选的poly(A)-尾包含SEQ ID NO:14的序列。将额外的纯化步骤应用于modRNA以减少体外转录反应期间产生的dsRNA污染物。
这个平台的不同实施方案是源自以下的序列，和是以下的修饰的变体的序列：
BNT162b2；RBP020.1(SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:7)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162b2；RBP020.2(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:7)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162b1；RBP020.3(SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:5)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，融合至次要纤维蛋白的S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
图4示意编码抗原的RNA的一般结构
BNT162b3c(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-GS-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，融合至次要纤维蛋白的S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)，所述次要纤维蛋白融合至S1S2蛋白的跨膜结构域(TM))；在抗原序列N-末端的内在S1S2蛋白分泌信号肽(aa 1-19)
BNT162b3d(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-GS-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，融合至次要纤维蛋白的S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)，所述次要纤维蛋白融合至S1S2蛋白的跨膜结构域(TM))；在抗原序列N-末端的免疫球蛋白分泌信号肽(aa 1-22)
自我扩增RNA(saRNA)
自我扩增mRNA(saRNA)原料药的活性成分是单链RNA，其在进入细胞时自我扩增，此后翻译疫苗抗原。与优选编码单一蛋白的uRNA和modRNA相反，saRNA的编码区包含两个开放阅读框(ORF)。5’-ORF编码RNA依赖性RNA聚合酶如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)RNA依赖性RNA聚合酶(复制酶)。复制酶ORF 3’后跟随着亚基因组启动子和编码抗原的第二ORF。此外，saRNA UTR包含自我扩增所需的5’和3’保守序列元件(CSE)。如uRNA，saRNA包含为RNA的最大效力优化的常见结构元件(5′-帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)-尾)。saRNA优选包含尿苷。优选的5’帽结构是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2'-OGppSpG)。
saRNA的细胞质递送启动甲病毒样的生命周期。然而，saRNA不编码基因组包装或细胞进入所需的甲病毒结构蛋白，因此产生有复制能力的病毒颗粒的可能很小或不可能。复制不涉及产生DNA的任何中间步骤。因此saRNA的使用/摄入不会对靶细胞内的基因组整合或其他永久性遗传修饰造成风险。此外，saRNA本身通过识别dsRNA中间体有效激活先天免疫应答来防止其持续复制。
这个平台的不同实施方案是源自以下的序列，和是以下的修饰的变体的序列：
RBS004.1(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
RBS004.2(SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162c1；RBS004.3(SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:5)
结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-RBD-GS-次要纤维蛋白-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
RBS004.4(SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28)
结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-RBD-GS-次要纤维蛋白-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
图5示意编码抗原的RNA的一般结构。
在一些实施方案中，本文描述的疫苗RNA包含核苷酸序列，其是选自以下的核苷酸序列的修饰的变体：SEQ ID NO:15、16、17、19、20、21、24、25、26、27、30和32的。本文描述的特别优选的疫苗RNA包含核苷酸序列，其是选自以下的核苷酸序列的修饰的变体：SEQ IDNO:15、17、19、21、25、26、30和32的核苷酸序列，如选自SEQ ID NO:17、19、21、26、30和32。
本文描述的RNA优选配制于脂质纳米颗粒(LNP)中。在一实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；以及RNA。在一实施方案中，阳离子脂质是ALC-0315，中性脂质是DSPC，类固醇是胆固醇，并且聚合物缀合的脂质是ALC-0159。优选的给药模式是肌肉内给药，更优选在水性冷冻保护剂缓冲液中用于肌肉内给药。药品优选是配制于脂质纳米颗粒(LNP)中的RNA的不含防腐剂的无菌分散体，其在水性冷冻保护剂缓冲液中用于肌肉内给药。
在不同的实施方案中，药品包含以下示出的组分，优选以下示出的比例或浓度：
[1]ALC-0315＝((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-癸酸己酯)/6-[N-6-(2-己基癸酰基氧基)己基-N-(4-羟基丁基)氨基]己基2-癸酸己酯(((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate)/6-[N-6-(2-hexyldecanoyloxy)hexyl-N-(4-hydroxybutyl)amino]hexyl 2-hexyldecanoate)
[2]ALC-0159＝2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺/2-[2-(ω-甲氧基(聚乙二醇2000)乙氧基]-N,N-双十四烷基乙酰胺(2-[(polyethylene glycol)-2000]-N,N-ditetradecylacetamide/2-[2-(ω-methoxy(polyethyleneglycol2000)ethoxy]-N,N-ditetradecylacetamide)
[3]DSPC＝1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)
q.s.＝适量(尽可能可以足够)
ALC-0315:
ALC-0159:
DSPC:
在一实施方案中，mRNA比总脂质(N/P)的比例在6.0和6.5之间，如约6.0或约6.3。
包含核酸的颗粒
本文描述的核酸(如编码疫苗抗原的RNA)可以配制为颗粒来给药。
在本公开的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体。在一实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米大小的结构，如分散在介质中的微米或纳米大小的致密结构。在一实施方案中，颗粒是包含核酸的颗粒，如包含DNA、RNA或其混合物的颗粒。
带正电荷的分子(如聚合物和脂质)与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。在一实施方案中，核酸颗粒是纳米颗粒。
如本公开所用，“纳米颗粒”是指具有适合肠胃外给药的平均直径的颗粒。
“核酸颗粒”可以用来将核酸递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可以由至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或者脂质样材料、至少一种阳离子聚合物(如鱼精蛋白)或其混合物以及核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米颗粒(LNP)和基于脂质复合物(LPX)的制剂。
不受任何理论的束缚，认为阳离子或阳离子可电离的脂质或者脂质样材料和/或阳离子聚合物与核酸结合在一起形成聚集体，并且这种聚集导致胶体稳定的颗粒。
在一实施方案中，本文描述的颗粒进一步包含除阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以外的至少一种脂质或脂质样材料，除阳离子聚合物以外的至少一种聚合物，或者它们的混合物。
在一些实施方案中，核酸颗粒包含一种以上类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可以互相相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构要素如分子结构、加帽、编码区或其他特征。
在一实施方案中，本文描述的核酸颗粒的平均直径可以为约30nm-约1000nm、约50nm-约800nm、约70nm-约600nm、约90nm-约400nm、约100nm-约300nm。
本文描述的核酸颗粒可以表现出约0.5以下、约0.4以下、约0.3以下或约0.2或更少的多分散性指数。举例来说，所述核酸颗粒可以表现出在约0.1至约0.3或约0.2至约0.3的范围内的多分散性指数。
关于RNA脂质颗粒，N/P比例给出脂质中的氮基团比RNA中的磷酸基团数量的比例。它与电荷比例相关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电荷，而磷酸基团带负电荷。当存在电荷平衡时，N/P比例取决于pH。脂质制剂通常以4以上，多至12的N/P比例形成，因为认为带正电荷的纳米颗粒有利于转染。在那种情况下，认为RNA完全结合至纳米颗粒。
本文描述的核酸颗粒可以使用广泛的方法制备，所述方法可以包括从至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物获得胶体，并且将胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。
如本文所用的术语“胶体”涉及其中分散的颗粒不沉淀的均匀混合物的类型。混合物中的不溶性颗粒是微观的，粒径在1-1000纳米之间。该混合物可以称为胶体或胶体悬浮液。有时术语“胶体”仅指混合物中的颗粒而不是整个悬浮液。
对于包含至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种阳离子聚合物的胶体的制备，常规用于制备脂质体囊泡并适当调整的方法可适用于本文。制备脂质体囊泡的最常用方法享有以下基本步骤：(i)将脂质溶于有机溶剂中，(ii)干燥所得的溶液，以及(iii)将干燥的脂质水合(使用各种水性介质)。
在膜水合方法中，首先将脂质溶于合适的有机溶剂中，然后干燥以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的水性介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可以包括额外的缩小步骤。
反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的可选方法，其涉及在水相和包含脂质的有机相之间形成油包水乳液。为了系统均质化，需要对这个混合物进行简短的超声处理。在减压下去除有机相产生乳状凝胶，其随后变为脂质体悬浮液。
术语“乙醇注射技术”是指这样的过程，其中通过针头将包含脂质的乙醇溶液快速注射至水性溶液中。这个行为将脂质分散在整个溶液中，并且促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成(如脂质体形成)。一般来说，本文描述的RNA脂质复合物颗粒可通过将RNA添加至胶体脂质体分散体来获得。在一实施方案中，利用乙醇注射技术，如下形成这种胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(如阳离子脂质)和额外脂质的乙醇溶液注射至水性溶液中。在一实施方案中，本文描述的RNA脂质复合物颗粒无需挤出步骤即可获得。
术语“挤出”是指产生具有固定的横截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的缩小，由此迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。
具有不含有机溶剂特征的其他方法也可以根据本公开用于制备胶体。
LNP通常包含4种组分：可电离的阳离子脂质、中性脂质如磷脂、类固醇如胆固醇和聚合物缀合的脂质如聚乙二醇(PEG)-脂质。每种组分负责有效载荷保护，并且实现有效的细胞内递送。LNP可以通过将溶于乙醇的脂质与水性缓冲液中的核酸快速混合来制备。
术语“平均直径”是指通过动态激光散射(DLS)并使用所谓的累积量算法进行数据分析而测得的颗粒的平均流体动力学直径，其结果是提供具有一定长度尺寸的所谓的Zaverage，以及无量纲的多分散性指数(PI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp 4814-4820,ISO 13321)。这里颗粒的“平均直径”、“直径”或“大小”与Zaverage的这个值同义使用。
“多分散性指数”优选基于动态光散射测量，通过“平均直径”的定义中提到的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可以将其作为纳米颗粒整体大小分布的度量。
以前已描述了不同类型的包含核酸的颗粒适合递送颗粒形式的核酸(例如Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒核酸递送媒介物，核酸的纳米颗粒包封物理上保护核酸免于降解，并且取决于特定化学，可以辅助细胞摄取和内体逃逸。
本公开描述了包含核酸、至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料和/或至少一种与核酸缔合的阳离子聚合物以形成核酸颗粒的颗粒，以及包含这类颗粒的组合物。所述核酸颗粒可以包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的核酸。本文描述的颗粒不是病毒颗粒，特别是传染性病毒颗粒，即，它们不能病毒式地感染细胞。
合适的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以及阳离子聚合物是形成核酸颗粒的那些，并且包括在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸缔合以形成核酸颗粒的任何组分。这类组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。
本文所述的一些实施方案涉及组合物、方法和用途，其涉及多于一种，例如2、3、4、5、6或甚至更多种核酸物质，例如RNA种类，例如a)核酸，其包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及b)核酸，其包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中亲本病毒蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含一种或多种病毒蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸。
在一些实施方案中，本发明提供一组核酸，其各自包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含亲本病毒蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中所述组的每个编码片段与该组的其他编码片段基本上相同，并且与亲本编码片段基本上相同，除了相对于在流行病毒变体中出现的亲本编码片段的修饰存在于所述组的编码片段中。
在颗粒制剂中，可以将每种核酸物质分别配制为单独的颗粒制剂。在这种情况下，每个单独的颗粒制剂包含一种核酸物质。单独的颗粒制剂可以作为分离的实体存在，例如在分离的容器中。通过分别将每种核酸物质(通常每种都以含核酸溶液的形式)与颗粒形成剂一起提供而获得这类制剂，从而允许形成颗粒。各个颗粒仅包含在形成颗粒时提供的特定核酸物质(单独的颗粒制剂)。
在一实施方案中，诸如药物组合物的组合物包含多于一种单独的颗粒制剂。各自的药物组合物称为混合颗粒制剂。通过如上所述分别形成单独的颗粒制剂，然后进行单独的颗粒制剂的混合步骤而获得本发明的混合颗粒制剂。通过混合步骤，可以获得包含含核酸颗粒的混合群体的制剂。单独的颗粒群体可以一起在一个容器中，包含单独的颗粒制剂的混合群体。
或者，可以将不同的核酸物质配制在一起作为组合的颗粒制剂。通过将不同RNA物质的组合制剂(通常为组合溶液)与颗粒形成剂一起提供而获得这类制剂，从而允许形成颗粒。与混合颗粒制剂相反，组合颗粒制剂通常包含颗粒，所述颗粒包含一种以上RNA物质。在组合的颗粒组合物中，不同RNA物质通常一起存在于单个颗粒中。
阳离子聚合物
鉴于它们高度的化学柔韧性，聚合物是用于基于纳米颗粒的递送的常用材料。通常，阳离子聚合物用来将带负电荷的核酸静电凝聚为纳米颗粒。这些带正电荷的基团通常由胺组成，所述胺在5.5-7.5的pH范围内改变它们的质子化状态，据认为这引起离子失衡，导致内体破裂。聚合物如聚-L-赖氨酸、聚酰胺胺(polyamidoamine)、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺以及天然存在的聚合物(如壳聚糖)全部已应用于核酸递送，并且适合作为本文的阳离子聚合物。此外，一些研究者已合成了专门用于核酸递送的聚合物。特别地，聚(β-氨基酯)由于其易于合成和生物可降解性而在核酸递送中获得了广泛应用。这类合成聚合物也适合作为本文的阳离子聚合物。
如本文所用，“聚合物”具有其通常的含义，即，包含通过共价键连接的一个或多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可以全部相同，或者在某些情况下，聚合物内可以存在一种以上类型的重复单元。在某些情况下，聚合物是生物衍生的，即，生物聚合物如蛋白。在某些情况下，聚合物中还可以存在额外的部分，例如靶向部分，如本文中描述的那些。
如果聚合物内存在一种以上类型的重复单元，则将该聚合物称为“共聚物”。应当理解本文中采用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，重复单元可以以随机顺序、交替顺序排列，或者作为“嵌段”共聚物，即，包含一个或多个区域，每个区域包含第一重复单元(例如，第一嵌段)，以及一个或多个区域，每个包含第二重复单元(例如，第二嵌段)，等等。嵌段共聚物可以具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数量的不同嵌段。
在某些实施方案中，聚合物是生物相容的。生物相容性聚合物是在中等浓度下通常不会导致显著的细胞死亡的聚合物。在某些实施方案中，生物相容性聚合物是生物可降解的，即，聚合物能够在生理环境内如体内化学和/或生物降解。
在某些实施方案中，聚合物可以是鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺，特别是鱼精蛋白。
术语“鱼精蛋白”是指富含精氨酸并发现在各种动物(如鱼)的精细胞中代替体细胞组蛋白特别与DNA关联的任何相对低分子量的强碱性蛋白。特别地，术语“鱼精蛋白”是指在鱼精子中发现的蛋白，其是强碱性的，在水中可溶，通过加热不凝结，并且在水解时主要产生精氨酸。在纯化形式中，它们用于胰岛素的长效制剂以及中和肝素的抗凝作用。
根据本公开，如本文所用的术语“鱼精蛋白”意指包含获得自或源自天然或生物来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列，包括其片段以及所述氨基酸序列的多聚体形式或其片段以及(合成的)多肽，所述多肽是人工的，专门设计用于特定目的，并且不可以从天然或生物来源分离。
在一实施方案中，聚亚烷基亚胺包含聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(PEI)。PEI的平均分子量优选0.75·102-107Da，优选1000-105Da，更优选10000-40000Da，更优选15000-30000Da，甚至更优选20000-25000Da。
根据本公开优选线性聚亚烷基亚胺如线性聚乙烯亚胺(PEI)。
预期用于本文的阳离子聚合物(包括聚阳离子聚合物)包括能够静电结合核酸的任何阳离子聚合物。在一实施方案中，预期用于本文的阳离子聚合物包括核酸可以与其缔合的任何阳离子聚合物，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包围或包封核酸的囊泡。
本文描述的颗粒还可以包含除阳离子聚合物以外的聚合物，即，非阳离子聚合物和/或阴离子聚合物。阴离子和中性聚合物在本文中统称为非阳离子聚合物。
脂质和脂质样材料
术语“脂质”和“脂质样材料”在本文中广泛定义为包含一个或多个疏水部分或基团以及任选地还包括一个或多个亲水部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也常称作两亲分子。脂质通常难溶于水。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装为有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，因为它们存在于水性环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中。可以通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂肪烃基团以及被一个或多个芳香族、脂环族或杂环基团取代的这类基团。亲水基团可以包含极性和/或带电荷的基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。
如本文所用，术语“两亲性”是指具有极性部分和非极性部分的分子。通常，两亲性化合物具有连接至长疏水尾的极性头。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。此外，极性部分可以具有形式上的正电荷或形式上的负电荷。或者，极性部分可以具有形式上的正电荷和负电荷，并且可以是两性离子或内盐。为了本公开的目的，两亲性化合物可以是但不限于一种或多种天然或非天然脂质和脂质样化合物。
术语“脂质样材料”、“脂质样化合物”或“脂质样分子”涉及在结构和/或功能上与脂质相关但在严格意义上可以不视为脂质的物质。例如，该术语包括在水性环境中存在于囊泡、多层/单层脂质体或膜中时能够形成两亲性层的化合物，并且包括表面活性剂或者具有亲水和疏水部分的合成化合物。一般来说，该术语是指分子，其包含具有不同结构组织的亲水和疏水部分，其可以与脂质结构组织相似或不相似。如本文所用，术语“脂质”解释为涵盖脂质和脂质样材料，除非本文另有说明或明显与上下文矛盾。
可以包括在两亲性层中的两亲性化合物的具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。
在某些实施方案中，两亲性化合物是脂质。术语“脂质”是指一组有机化合物，其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。一般来说，脂质可以分为8类：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(源自酮酰亚基的缩合)、固醇脂质和萜醇(prenol)脂质(源自异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称作甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖分子如脂肪酸和它们的衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯和磷脂)，以及包含固醇的代谢物如胆固醇。
脂肪酸或脂肪酸残基是由以羧酸基团终止的烃链形成的一组不同分子；这种排列赋予分子极性、亲水末端，以及不溶于水的非极性、疏水末端。通常长度为4-24个碳的碳链可以是饱和或不饱和的，并且可以连接至包含氧、卤素、氮和硫的官能团。如果脂肪酸包含双键，则可能具有顺式或反式几何异构现象，这显著影响分子的构型。顺式双键使脂肪酸链弯曲，这种作用与链中更多的双键混合在一起。脂肪酸类别中的其他主要脂质类别是脂肪酯和脂肪酰胺。
甘油脂包括单、二和三取代的甘油，最著名的是甘油的脂肪酸三酯，称作甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常被不同脂肪酸各自酯化。甘油脂的其他亚类由糖基甘油代表，其特征在于存在通过糖苷键连接至甘油的一个或多个糖残基。
甘油磷脂是两亲性分子(包含疏水区和亲水区)，其包含甘油核心，所述甘油核心通过酯键连接至两个脂肪酸衍生的“尾部”，并且通过磷酸酯键连接至一个“头部”基团。通常称作磷脂(尽管鞘磷脂也被分类为磷脂)的甘油磷脂的实例有磷脂酰胆碱(也称作PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。
鞘脂是一个复杂的化合物家族，其享有一个共同结构特征，鞘氨醇碱(sphingoidbase)骨架。哺乳动物中的主要鞘氨醇碱通常称作鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱)是鞘氨醇碱衍生物的主要亚类，其具有酰胺连接的脂肪酸。脂肪酸通常是饱和或单不饱和的，具有16-26个碳原子的链长度。哺乳动物的主要磷脂鞘酯是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺，真菌则具有植物神经酰胺磷酸肌醇和包含甘露糖的头基。鞘糖脂是一个多样化的分子家族，其包括一个或多个通过糖苷键连接至鞘氨醇碱的糖残基。这些的实例有简单和复杂的鞘糖脂如脑苷脂和神经节苷脂。
固醇脂质，如胆固醇及其衍生物，或者生育酚及其衍生物，与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。
糖脂描述其中脂肪酸直接连接至糖骨架，形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖取代甘油脂和甘油磷脂中存在的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性细菌中脂多糖的脂质A组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质A分子是葡糖胺的二糖，其由多达七个脂肪-酰基链衍生而成。在大肠杆菌生长中需要的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，用两个3-脱氧-D-甘露-辛酮糖酸(3-deoxy-D-manno-octulosonic acid,Kdo)残基糖基化的葡糖胺的六酰化二糖。
聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合成酶享有机理特征的迭代和多模块酶聚合乙酰基和丙酰基亚基合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢物和天然产物，并且具有很大的结构多样性。许多聚酮是环状分子，其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰。
根据本公开，脂质和脂质样材料可以是阳离子、阴离子或中性的。中性脂质或脂质样材料在所选pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在。
阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料
本文描述的核酸颗粒可以包含至少一种阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料作为颗粒形成剂。预期用于本文的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料包括能够静电结合核酸的任何阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料。在一实施方案中，预期用于本文的阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料可以与核酸缔合，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包围或包封核酸的囊泡。
如本文所用，“阳离子脂质”或“阳离子脂质样材料”是指具有净正电荷的脂质或脂质样材料。阳离子脂质或脂质样材料通过静电相互作用结合带负电荷的核酸。一般来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，如固醇、酰基链、二酰基或更多个酰基链，并且脂质的头基通常带有正电荷。
在某些实施方案中，阳离子脂质或脂质样材料仅在某些pH下，特别是在酸性pH下具有净正电荷，而在不同的，优选较高的pH如生理pH下，其优选没有净正电荷，优选没有电荷，即，其是中性的。与在生理pH下保持阳离子状态的颗粒相比，据认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。
为了本公开的目的，除非与语境矛盾，否则术语“阳离子脂质或脂质样材料”包含这类“阳离子可电离的”脂质或脂质样材料。
在一实施方案中，阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料包含头基，所述头基包括至少一个带正电荷或能够质子化的氮原子(N)。
阳离子脂质的实例包括但不限于1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium propane，DOTAP)；N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙胺(N,N-dimethyl-2,3-dioleyloxypropylamine，DODMA)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)、3-(N—(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(3-(N—(N′,N′-dimethylaminoethane)-carbamoyl)cholesterol，DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(dimethyldioctadecylammonium，DDAB)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane，DODAP)；1,2-二酰基氧基-3-二甲基铵丙烷(1,2-diacyloxy-3-dimethylammonium propane)；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷(1,2-dialkyloxy-3-dimethylammonium propane)；双十八烷基二甲基氯化铵(dioctadecyldimethyl ammonium chloride，DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(1,2-distearyloxy-N,N-dimethyl-3-aminopropane，DSDMA)、2,3-二(十四烷基氧基)丙基-(2-羟基乙基)-二甲基氨鎓(2,3-di(tetradecoxy)propyl-(2-hydroxyethyl)-dimethylazanium，DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(l,2-dimyristoyl-3-trimethylammonium propane，DMTAP)、1,2-二油基氧基丙基-3-二甲基-羟基乙基溴化铵(1,2-dioleyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethylammonium bromide，DORIE)、和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙胺鎓三氟乙酸盐(2,3-dioleoyloxy-N-[2(spermine carboxamide)ethyl]-N,N-dimethyl-l-propanamium trifluoroacetate，DOSPA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLinDMA)、1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(1,2-dilinolenyloxy-N,N-dimethylaminopropane，DLenDMA)、双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(dioctadecylamidoglycyl spermine，DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯基氧基)丙烷(3-dimethylamino-2-(cholest-5-en-3-beta-oxybutan-4-oxy)-1-(cis,cis-9,12-oc-tadecadienoxy)propane，CLinDMA)、2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9′,12′-十八碳二烯氧基)丙烷(2-[5′-(cholest-5-en-3-beta-oxy)-3′-oxapentoxy)-3-dimethyl-1-(cis,cis-9′,12′-octadecadienoxy)propane，CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(N,N-dimethyl-3,4-dioleyloxybenzylamine，DMOBA)、1,2-N,N′-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-N,N′-dioleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane，DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙胺(2,3-Dilinoleoyloxy-N,N-dimethylpropylamine，DLinDAP)、1,2-N,N′-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-N,N′-Dilinoleylcarbamyl-3-dimethylaminopropane，DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(1,2-Dilinoleoylcarbamyl-3-dimethylaminopropane，DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminomethyl-[1,3]-dioxolane，DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-dimethylaminoethyl-[1,3]-dioxolane，DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(2,2-dilinoleyl-4-(2-dimethylaminoethyl)-[1,3]-dioxolane，DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl-4-(dimethylamino)butanoate，DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物(N-(2-Hydroxyethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide，DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(cis-9-tetradecenyloxy)-1-propanaminium bromide，GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)-1-propanaminium bromide，GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物((±)-N-(3-aminopropyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide，GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙胺鎓溴化物(N-(2-Aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)-1-propanaminium bromide，βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-胺鎓(N-(4-carboxybenzyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)propan-1-aminium，DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(2-({8-[(3β)-cholest-5-en-3-yloxy]octyl}oxy)-N,N-dimethyl-3-[(9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-yloxy]propan-1-amine，Octyl-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dimyristoyl-3-dimethylammonium-propane，DMDAP)、1,2-二棕榈酰-3-二甲基铵-丙烷(1,2-dipalmitoyl-3-dimethylammonium-propane，DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(N1-[2-((1S)-1-[(3-aminopropyl)amino]-4-[di(3-amino-propyl)amino]butylcarboxamido)ethyl]-3,4-di[oleyloxy]-benzamide，MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine，DOEPC)、2,3-双(十二烷基氧基)-N-(2-羟基乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-溴化铵(2,3-bis(dodecyloxy)-N-(2-hydroxyethyl)-N,N-dimethylpropan-1-amonium bromide，DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺鎓溴化物(N-(2-aminoethyl)-N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-aminium bromide，DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8'-((((2(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(di((Z)-non-2-en-1-yl)8,8'-((((2(dimethylamino)ethyl)thio)carbonyl)azanediyl)dioctanoate，ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(dodecyloxy)propan-1-amine，DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-胺(N,N-dimethyl-2,3-bis(tetradecyloxy)propan-1-amine，DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(Di((Z)-non-2-en-1-yl)-9-((4-(dimethylaminobutanoyl)oxy)heptadecanedioate，L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(N-Dodecyl-3-((2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-{2-[(2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-2-{(2-dodecylcarbamoyl-ethyl)-[2-(2-dodecylcarbamoyl-ethylamino)-ethyl]-amino}-ethylamino)propionamide，脂质样材料(lipidoid)98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(1-[2-[bis(2-hydroxydodecyl)amino]ethyl-[2-[4-[2-[bis(2hydroxydodecyl)amino]ethyl]piperazin-1-yl]ethyl]amino]dodecan-2-ol，脂质样材料(lipidoid)C12-200)。
在一些实施方案中，阳离子脂质可以包含颗粒中存在的总脂质的约10摩尔(mol)％-约100摩尔％、约20摩尔％-约100摩尔％、约30摩尔％-约100摩尔％、约40摩尔％-约100摩尔％或约50摩尔％-约100摩尔％。
额外的指质或脂质样材料
本文描述的颗粒还可以包含除阳离子或阳离子可电离的脂质或脂质样材料以外的脂质或脂质样材料，即，非阳离子脂质或脂质样材料(包括非阳离子可电离的脂质或脂质样材料)。阴离子和中性脂质或脂质样材料在本文中统称为非阳离子脂质或脂质样材料。通过添加除可电离/阳离子脂质或脂质样材料以外的其他疏水部分如胆固醇和脂质来优化核酸颗粒的制剂，可以增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。
可以掺入额外的脂质或脂质样材料，其可以影响或不影响核酸颗粒的总电荷。在某些实施方案中，额外的脂质或脂质样材料是非阳离子脂质或脂质样材料。非阳离子脂质可以包含例如一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。如本文所用，“阴离子脂质”是指在所选pH下带负电荷的任何脂质。如本文所用，“中性脂质”是指在所选pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。在优选的实施方案中，额外的脂质包含以下中性脂质组分之一：(1)磷脂，(2)胆固醇或其衍生物；或者(3)磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的实例包括但不限于胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪固醇、胆固醇基-2'-羟基乙基醚、胆固醇基-4'-羟基丁基醚、生育酚及其衍生物，以及它们的混合物。
可以使用的具体磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol)、磷脂酸(phosphatidic acid)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine)或鞘磷脂(sphingomyelin)。这类磷脂特别包括二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)，如二硬脂酰基磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine，DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine，DPPC)、二花生四烯酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二二十二酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、二二十三酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，DTPC)、二二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine，POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-di-O-octadecenyl-sn-glycero-3-phosphocholine，18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-oleoyl-2-cholesterylhemisuccinoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1-hexadecyl-sn-glycero-3-phosphocholine，C16Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺(diacylphosphatidylethanolamine)，如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine，DSPE)、二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine，DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine，DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine，DLPE)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine，DPyPE)，以及具有不同疏水链的其他磷脂酰乙醇胺脂质。
在某些优选的实施方案中，额外的脂质是DSPC或DSPC和胆固醇。
在某些实施方案中，核酸颗粒包括阳离子脂质和额外的脂质。
在一实施方案中，本文描述的颗粒包括聚合物缀合的脂质如聚乙二醇化的脂质。术语“聚乙二醇化的脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化的脂质是本领域已知的。
不希望受理论束缚，与至少一种额外的脂质的量相比，至少一种阳离子脂质的量可能影响重要的核酸颗粒特征，如电荷、粒径、稳定性、组织选择性和核酸的生物活性。因此，在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外的脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。
在一些实施方案中，非阳离子脂质，特别是中性脂质(例如，一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以包含颗粒中存在的总脂质的约0摩尔％-约90摩尔％、约0摩尔％-约80摩尔％、约0摩尔％-约70摩尔％、约0摩尔％-约60摩尔％或约0摩尔％-约50摩尔％。
脂质复合物颗粒
在本公开的某些实施方案中，本文描述的RNA可以存在于RNA脂质复合物颗粒中。
在本公开的上下文中，术语“RNA脂质复合物颗粒”涉及包含脂质，特别是阳离子脂质和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质复合物颗粒的复合(complexation)和自发形成。带正电荷的脂质体一般可以利用阳离子脂质如DOTMA和额外的脂质如DOPE合成。在一实施方案中，RNA脂质复合物颗粒是纳米颗粒。
在某些实施方案中，RNA脂质复合物颗粒包括阳离子脂质和额外的脂质。在一示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA，额外的脂质是DOPE。
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外的脂质的摩尔比是约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。在具体实施方案中，所述摩尔比可以是约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1或约1:1。在一示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质比至少一种额外的脂质的摩尔比是约2:1。
本文描述的RNA脂质复合物颗粒的平均直径在一实施方案中可以为约200nm-约1000nm、约200nm-约800nm、约250-约700nm、约400-约600nm、约300nm-约500nm或约350nm-约400nm。在具体实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm或约1000nm。在一实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约250nm-约700nm。在另一实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约300nm-约500nm。在一示例性实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约400nm。
本文描述的RNA脂质复合物颗粒和包含RNA脂质复合物颗粒的组合物可用于在肠胃外给药之后，特别是静脉内给药之后，将RNA递送至靶组织。可以利用脂质体制备RNA脂质复合物颗粒，所述脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注射至水或合适的水相中来获得。在一实施方案中，所述水相具有酸性pH。在一实施方案中，所述水相包含乙酸，例如，约5mM的量。通过将脂质体与RNA混合，脂质体可以用于制备RNA脂质复合物颗粒。在一实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种额外的脂质。在一实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)和/或1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，DOTAP)。在一实施方案中，所述至少一种额外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)、胆固醇(cholesterol，Chol)和/或1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DOPC)。在一实施方案中，所述至少一种阳离子脂质包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)，而所述至少一种额外的脂质包含1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)。在一实施方案中，脂质体和RNA脂质复合物颗粒包含1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(1,2-di-O-octadecenyl-3-trimethylammonium propane，DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine，DOPE)。
WO 2013/143683中描述了靶向脾的RNA脂质复合物颗粒，其援引加入本文。已发现具有净负电荷的RNA脂质复合物颗粒可以用来优先靶向脾组织或脾细胞如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在给药RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质复合物颗粒可以用于在脾中表达RNA。在一实施方案中，在给药RNA脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生RNA积累和/或RNA表达。在一实施方案中，在给药RNA脂质复合物颗粒之后，在抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质复合物颗粒可以用于在这类抗原呈递细胞中表达RNA。在一实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
脂质纳米颗粒(LNP)
在一实施方案中，本文描述的核酸如RNA以脂质纳米颗粒(LNP)的形式给药。LNP可以包含能够形成颗粒的任何脂质，一个或多个核酸分子附着在所述脂质上，或者一个或多个核酸分子包封在所述脂质中。
在一实施方案中，LNP包含一种或多种阳离子脂质，以及一种或多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化的脂质。
在一实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；以及RNA，包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。
在一实施方案中，LNP包含40-55摩尔百分比、40-50摩尔百分比、41-49摩尔百分比、41-48摩尔百分比、42-48摩尔百分比、43-48摩尔百分比、44-48摩尔百分比、45-48摩尔百分比、46-48摩尔百分比、47-48摩尔百分比或47.2-47.8摩尔百分比的阳离子脂质。在一实施方案中，LNP包含约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0摩尔百分比的阳离子脂质。
在一实施方案中，中性脂质以5-15摩尔百分比、7-13摩尔百分比或9-11摩尔百分比的浓度存在。在一实施方案中，中性脂质以约9.5、10或10.5摩尔百分比的浓度存在。
在一实施方案中，类固醇以30-50摩尔百分比、35-45摩尔百分比或38-43摩尔百分比的浓度存在。在一实施方案中，类固醇以约40、41、42、43、44、45或46摩尔百分比的浓度存在。
在一实施方案中，LNP包含1-10摩尔百分比、1-5摩尔百分比或1-2.5摩尔百分比的聚合物缀合的脂质。
在一实施方案中，LNP包含40-50摩尔百分比的阳离子脂质；5-15摩尔百分比的中性脂质；35-45摩尔百分比的类固醇；1-10摩尔百分比的聚合物缀合的脂质；以及RNA，包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合。
在一实施方案中，基于脂质纳米颗粒中存在的脂质的总摩尔来确定摩尔百分比。
在一实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一实施方案中，中性脂质是DSPC。
在一实施方案中，类固醇是胆固醇。
在一实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化的脂质。在一实施方案中，聚乙二醇化的脂质具有以下结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地是包含10-30个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且w的平均值为30-60。在一实施方案中，R12和R13各自独立地是包含12-16个碳原子的直链、饱和的烷基链。在一实施方案中，w的平均值为40-55。在一实施方案中，平均w为约45。在一实施方案中，R12和R13各自独立地是包含约14个碳原子的直链、饱和的烷基链，并且w的平均值为约45。
在一实施方案中，聚乙二醇化的脂质是DMG-PEG 2000，例如，具有以下结构：
在一些实施方案中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接的键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；并且
x是0、1或2。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
其中：
A是3-8元环烷基或亚环烷基环；
在每次出现时，R6独立地是H、OH或C1-C24烷基；
n是1-15的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(IIIA)，并且在其他实施方案中，脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的其他实施方案中，脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
其中y和z各自独立地是1-12的整数。
在式(III)的任何前述实施方案中，L1或L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-O(C＝O)-。在前述任一项的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-(C＝O)O-。
在式(III)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，n是2-12的整数，例如2-8或2-4。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。
在式(III)的一些其他前述实施方案中，y和z各自独立地是2-10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4-9或4-6的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R6是H。在其他前述实施方案中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方案中，R6是OH。
在式(III)的一些实施方案中，G3是未取代的。在其他实施方案中，G3是取代的。在各种不同实施方案中，G3是线性C1-C24亚烷基或线性C1-C24亚烯基。
在式(III)的一些其他前述实施方案中，R1或R2或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
其中：
在每次出现时，R7a和R7b独立地是H或C1-C12烷基；并且
a是2-12的整数，
其中各自选择R7a、R7b和a，从而R1和R2各自独立地包含6-20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5-9或8-12的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R7的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，在每次出现时R7a是H。在前述其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或两者具有以下结构之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或–NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在各种不同实施方案中，式(III)的阳离子脂质具有下表所示的结构之一。
表2:式(III)的代表性化合物
在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，式(III)的脂质是化合物III-3。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是ALC-0159。
在一些实施方案中，阳离子脂质以约40-约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一实施方案中，中性脂质以约5-约15摩尔百分比的量存在于LNP中。在一实施方案中，类固醇以约35-约45摩尔百分比的量存在于LNP中。在一实施方案中，聚乙二醇化的脂质以约1-约10摩尔百分比的量存在于LNP中。
在一些实施方案中，LNP包含约40-约50摩尔百分比的量的化合物III-3，约5-约15摩尔百分比量的DSPC，约35-约45摩尔百分比量的胆固醇，以及约1-约10摩尔百分比量的ALC-0159。
在一些实施方案中，LNP包含约47.5摩尔百分比的量的化合物III-3，约10摩尔百分比量的DSPC，约40.7摩尔百分比量的胆固醇，以及约1.8摩尔百分比量的ALC-0159。
在各种不同实施方案中，阳离子脂质具有下表所示的结构之一。
表3：代表性阳离子脂质
在一些实施方案中，LNP包含上表所示的阳离子脂质(例如，式(B)或式(D)的阳离子脂质，特别是式(D)的阳离子脂质)，RNA，中性脂质，类固醇和聚乙二醇化的脂质。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化的脂质是DMG-PEG 2000。
在一实施方案中，LNP包含阳离子脂质，其是可电离的脂质样材料(lipidoid)。在一实施方案中，阳离子脂质具有以下结构：
N/P值优选是至少约4。在一些实施方案中，N/P值的范围为4-20、4-12、4-10、4-8或5-7。在一实施方案中，N/P值是约6。
本文描述的LNP的平均直径在一实施方案中可以是约30nm-约200nm或约60nm-约120nm。
RNA靶向
本公开的一些方面包括本文公开的RNA(例如，编码疫苗抗原和/或免疫刺激剂的RNA)的靶向递送。
在一实施方案中，本公开包括靶向肺。如果给药的RNA是编码疫苗抗原的RNA，则特别优选靶向肺。例如，通过吸入，通过给药可以配制为如本文描述的颗粒如脂质颗粒的RNA，可以将RNA递送至肺。
在一实施方案中，本公开包括靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更具体地是脾。如果给药的RNA是编码疫苗抗原的RNA，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更具体地是脾。
在一实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞。在一实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。
“淋巴系统”是循环系统的一部分，并且是免疫系统的重要部分，包含携带淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。主要或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成主要淋巴器官。包括淋巴结和脾在内的次级或外周淋巴器官维持成熟的幼稚淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
可以通过所谓的脂质复合物制剂将RNA递送至脾，其中RNA结合至包含阳离子脂质以及任选存在的额外的或辅助脂质的脂质体以形成可注射的纳米颗粒制剂。脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注射至水或合适的水相中来获得。RNA脂质复合物颗粒可以通过将脂质体与RNA混合来制备。WO 2013/143683中描述了靶向脾的RNA脂质复合物颗粒，其援引加入本文。已发现具有净负电荷的RNA脂质复合物颗粒可以用来优先靶向脾组织或脾细胞如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在给药RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质复合物颗粒可以用于在脾中表达RNA。在一实施方案中，在给药RNA脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中不发生或基本上不发生RNA积累和/或RNA表达。在一实施方案中，在给药RNA脂质复合物颗粒之后，在抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质复合物颗粒可以用于在这类抗原呈递细胞中表达RNA。在一实施方案中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。
本公开的RNA脂质复合物颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷和RNA中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷比RNA中存在的负电荷的比例。通过以下等式计算至少一种阳离子脂质中存在的正电荷比RNA中存在的负电荷的电荷比：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(摩尔))*(阳离子脂质中正电荷的总数)]/[(RNA浓度(摩尔))*(RNA中负电荷的总数)]。
本文描述的靶向脾的RNA脂质复合物颗粒在生理pH下优选具有净负电荷，如正电荷比负电荷的电荷比为约1.9:2-约1:2，或约1.6:2-约1:2，或约1.6:2-约1.1:2。在具体实施方案中，在生理pH下RNA脂质复合物颗粒中正电荷比负电荷的电荷比为约1.9:2.0、约1.8:2.0、约1.7:2.0、约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。
可以通过在将RNA优先递送至肝或肝组织的制剂中向受试者给药编码免疫刺激剂的RNA来向受试者提供免疫刺激剂。优选将RNA递送至这样的靶器官或组织，特别地，如果期望表达大量的免疫刺激剂和/或如果期望或需要全身存在免疫刺激剂，特别是大量。
RNA递送系统对肝有天生的偏好。这涉及基于脂质的颗粒，阳离子和中性纳米颗粒，特别是脂质纳米颗粒如脂质体、纳米胶束和生物缀合物中的亲脂性配体。肝积累是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体以及脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。
为了将RNA体内递送至肝，药物递送系统可以用来通过防止其降解将RNA运送至肝。例如，由聚(乙二醇)(PEG)包被的表面和包含mRNA的核心组成的复合物纳米胶束是可用的系统，因为纳米胶束在生理条件下提供优秀的RNA体内稳定性。此外，包含密集的PEG栅栏的复合物纳米胶束表面提供的隐形特性有效规避宿主免疫防御。
用于靶向肝的合适免疫刺激剂的实例有参与T细胞增殖和/或维持的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL2或IL7，其片段和变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白，如PK延长的细胞因子。
在另一实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA可以在将RNA优先递送至淋巴系统(特别是次级淋巴器官，更具体地是脾)的制剂中给药。优选将免疫刺激剂递送至这样的靶组织，特别地，如果期望在这种器官或组织中存在免疫刺激剂(例如，为了诱导免疫应答，特别是在T-细胞引发期间或为了激活常驻免疫细胞需要免疫刺激剂如细胞因子的情况下)，但是不期望免疫刺激剂全身存在，特别是大量存在(例如，因为免疫刺激剂具有全身毒性)。
合适的免疫刺激剂的实例有参与T细胞引发的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL12、IL15、IFN-α或IFN-β，其片段和变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白，如PK延长的细胞因子。
免疫刺激剂
在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA可以是非免疫原性的。在这个和其他实施方案中，编码疫苗抗原的RNA可以与免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA共同给药。如果将免疫刺激剂连接至药物动力学修饰基团(此后称作“药物动力学(PK)延长的”免疫刺激剂)，本文描述的方法和药剂特别有效。如果以编码免疫刺激剂的RNA的形式给药免疫刺激剂，本文描述的方法和药剂特别有效。在一实施方案中，为了全身可用性，将所述RNA靶向肝。肝细胞可以被高效转染，并且能够产生大量的蛋白。
“免疫刺激剂”是通过诱导任何免疫系统组分，特别是免疫效应细胞的激活或增加其活性来刺激免疫系统的任何物质。免疫刺激剂可以是促炎的。
根据一方面，免疫刺激剂是细胞因子或其变体。细胞因子的实例包括干扰素，如干扰素-α(IFN-α)或干扰素-γ(IFN-γ)，白介素，如IL2、IL7、IL12、IL15和IL23，集落刺激因子，如M-CSF和GM-CSF，以及肿瘤坏死因子。根据另一方面，免疫刺激剂包括佐剂型免疫刺激剂如APC Toll样受体激动剂或共刺激/细胞粘附膜蛋白。Toll样受体激动剂的实例包括共刺激/粘附蛋白如CD80、CD86和ICAM-1。
细胞因子是在细胞信号传导中很重要的一类小蛋白(～5–20kDa)。它们的释放对它们周围细胞的行为有影响。细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，但是一般不包括激素或生长因子(尽管一些在术语中重叠)。细胞因子由广泛的细胞产生，包括免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞，成纤维细胞和各种基质细胞。给定细胞因子可以由一种以上类型的细胞产生。细胞因子通过受体发挥作用，并且在免疫系统中特别重要；细胞因子调节体液和基于细胞的免疫应答之间的平衡，并且它们调节特定细胞群体的成熟、生长和反应性。一些细胞因子以复杂的方式增强或抑制其他细胞因子的作用。
根据本公开，细胞因子可以是天然存在的细胞因子或者其功能片段或变体。细胞因子可以是人细胞因子，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。一种特别优选的细胞因子是干扰素-α。
干扰素
干扰素(IFN)是宿主细胞响应几种病原体如病毒、细菌、寄生虫还有肿瘤细胞的存在而产生和释放的一组信号传导蛋白。在典型情况下，病毒感染的细胞会释放干扰素，引起附近的细胞增强它们的抗病毒防御。
基于它们通过其传导信号的受体的类型，干扰素通常分为三类：I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。
所有I型干扰素均结合至称作IFN-α/β受体(IFNAR)的特异性细胞表面受体复合物，其由IFNAR1和IFNAR2链组成。
人中存在的I型干扰素是IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω。一般来说，当身体识别已入侵的病毒时产生I型干扰素。它们由成纤维细胞和单核细胞产生。一旦释放，I型干扰素结合至靶细胞上的特异性受体，这导致蛋白表达，从而防止病毒产生和复制其RNA和DNA。
IFNα蛋白主要由浆细胞样树突细胞(pDC)产生。它们主要参与针对病毒感染的先天免疫。负责它们合成的基因有13个亚型，分别称作IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。这些基因一起发现在染色体9上的簇中。
IFNβ蛋白由成纤维细胞大量产生。它们具有抗病毒活性，主要参与先天免疫应答。已描述了两种类型的IFNβ，IFNβ1和IFNβ3。IFNβ1的天然和重组形式具有抗病毒、抗细菌和抗癌特性。
II型干扰素(人中的IFNγ)也称作免疫干扰素，并且被IL12激活。此外，II型干扰素由细胞毒性T细胞和T辅助细胞释放。
III型干扰素通过由IL10R2(也称作CRF2-4)和IFNLR1(也称作CRF2-12)组成的受体复合物传导信号。虽然比I型和II型IFN的发现时间更近，但是最近的信息证实III型IFN在某些类型的病毒或真菌感染中的重要性。
一般来说，I型和II型干扰素负责调节和激活免疫应答。
根据本公开，I型干扰素优选IFNα或IFNβ，更优选IFNα。
根据本公开，干扰素可以是天然存在的干扰素或者其功能片段或变体。干扰素可以是人干扰素，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。
白介素
白介素(IL)是一组细胞因子(分泌蛋白或信号分子)，基于区分的结构特征可以将其分为四大组。但是，它们的氨基酸序列相似性很弱(通常15–25％相同性)。人基因组编码超过50种白介素和相关蛋白。
根据本公开，白介素可以是天然存在的白介素或者其功能片段或变体。白介素可以是人白介素，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。
延长PK的基团
本文描述的免疫刺激剂多肽可以制备为融合或嵌合多肽，其包括免疫刺激剂部分和异源多肽(即，不是免疫刺激剂的多肽)。可以将免疫刺激剂融合至延长PK的基团，其增加循环半衰期。下文描述了延长PK的基团的非限制性实例。应当理解增加免疫刺激剂如细胞因子或其变体的循环半衰期的其他PK基团也适用于本公开。在某些实施方案中，延长PK的基团是血清白蛋白结构域(例如，小鼠血清白蛋白、人血清白蛋白)。
如本文所用，术语“PK”是“药物动力学”的首字母缩写，并且涵盖化合物的特性，包括例如受试者的吸收、分布、代谢和消除。如本文所用，“延长PK的基团”是指与生物活性分子融合或一起给药时增加生物活性分子的循环半衰期的蛋白、肽或部分。延长PK的基团的实例包括血清白蛋白(例如，HSA)，免疫球蛋白Fc或Fc片段及其变体，转铁蛋白及其变体以及人血清白蛋白(HSA)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549中公开的)。Kontermann,Expert Opin Biol Ther,2016Jul；16(7):903-15中公开了其他示例性延长PK的基团，其整体援引加入本文。如本文所用，“PK延长的”免疫刺激剂是指与延长PK的基团组合的免疫刺激剂部分。在一实施方案中，PK延长的免疫刺激剂是融合蛋白，其中免疫刺激剂部分连接或融合至延长PK的基团。
在某些实施方案中，相对于单独的免疫刺激剂(即，未融合至延长PK的基团的免疫刺激剂)，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期增加。在某些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期相对于单独的免疫刺激剂的血清半衰期长至少20、40、60、80、100、120、150、180、200、400、600、800或1000％。在某些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期是单独的免疫刺激剂的血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍。在某些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期是至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。
如本文所用，“半衰期”是指化合物如肽或蛋白的血清或血浆浓度在体内例如由于自然机制的降解和/或清除或螯合而减少50％所花费的时间。适合用于本文的PK延长的免疫刺激剂在体内是稳定的，并且其半衰期通过例如融合至抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白(例如，HSA或MSA)而增加。半衰期可以通过本身已知的任何方式确定，如通过药物动力学分析。合适的技术对于本领域技术人员是熟知的，并且例如一般可以包括以下步骤：向受试者合适地给药合适剂量的氨基酸序列或化合物；定期从所述受试者采集血液样品或其他样品；确定所述血液样品中氨基酸序列或化合物的水平或浓度；并且从由此获得的数据(的图)计算直至氨基酸序列或化合物的水平或浓度与剂量给药时的初始水平相比降低50％为止的时间。进一步的细节在例如标准手册中提供，如Kenneth,A.et al.,ChemicalStability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists and in Peters et al.,Pharmacokinetic Analysis:APractical Approach(1996)。还参考Gibaldi,M.et al.,Pharmacokinetics,2nd Rev.Edition,Marcel Dekker(1982)。
在某些实施方案中，延长PK的基团包括血清白蛋白或其片段，或者血清白蛋白的变体或其片段(为了本公开的目的，所有这些均包括在术语“白蛋白”中)。可以将本文描述的多肽融合至白蛋白(或者其片段或变体)以形成白蛋白融合蛋白。美国公开号20070048282中描述了这样的白蛋白融合蛋白。
如本文所用，“白蛋白融合蛋白”是指通过将白蛋白(或者其片段或变体)的至少一个分子与蛋白(如治疗性蛋白，特别是免疫刺激剂)的至少一个分子融合而形成的蛋白。可以通过翻译核酸产生白蛋白融合蛋白，在所述核酸中编码治疗性蛋白的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸符合读框地(in-frame)连接。一旦是白蛋白融合蛋白的一部分，治疗性蛋白和白蛋白可以各自称作白蛋白融合蛋白的“部分(portion)”、“区域”或“部分(moiety)”(例如，“治疗性蛋白部分”或“白蛋白部分”)。在高度优选的实施方案中，白蛋白融合蛋白包含至少一个分子的治疗性蛋白(包括但不限于治疗性蛋白的成熟形式)和至少一个分子的白蛋白(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在一实施方案中，白蛋白融合蛋白由宿主细胞如靶器官的细胞加工用于给药的RNA，例如肝细胞，并且分泌至循环中。用于RNA表达的宿主细胞的分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可以包括但不限于信号肽切割；二硫键的形成；适当折叠；碳水化合物的添加和加工(例如，N-和O-连接的糖基化)；特异性蛋白水解切割；和/或组装为多聚体蛋白。白蛋白融合蛋白优选由RNA以未加工形式编码，其特别在N-末端具有信号肽，并且在细胞分泌之后优选以加工形式存在，其中特别已切割掉信号肽。在最优选的实施方案中，“白蛋白融合蛋白的加工形式”是指已经历N-末端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，在本文中也称作“成熟的白蛋白融合蛋白”。
在优选的实施方案中，与不融合至白蛋白时的相同治疗性蛋白的血浆稳定性相比，包含治疗性蛋白的白蛋白融合蛋白具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常是指从体内给药治疗性蛋白并进入血流到治疗性蛋白降解并从血流清除进入最终从体内清除治疗性蛋白的器官(如肾或肝)的时间段。根据治疗性蛋白在血流中的半衰期计算血浆稳定性。治疗性蛋白在血流中的半衰期可以通过本领域已知的常见测定容易地确定。
如本文所用，“白蛋白”统指具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如，生物活性)的白蛋白或氨基酸序列，或者白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或者其片段或变体，特别是人白蛋白的成熟形式，或者来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或者这些分子的变体。白蛋白可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人、牛、羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于鸡和鲑鱼白蛋白。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以来自与治疗性蛋白不同的动物。
在某些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)，或者其片段或变体，如US 5,876,969、WO 2011/124718、WO 2013/075066和WO 2011/0514789中公开的那些。
术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，并且涵盖人血清白蛋白(以及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(以及其片段和变体)。
如本文所用，足以延长治疗性蛋白的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段是指长度和结构足以稳定或延长蛋白的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段，从而与非融合状态下的血浆稳定性相比，白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的血浆稳定性延长或延伸。
白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含白蛋白序列的全长，或者可以包括其一个或多个能够稳定或延长治疗活性或血浆稳定性的片段。这类片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包括来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可以包括白蛋白的特定结构域的一部分或全部。例如，可以使用跨越前两个免疫球蛋白样结构域的HSA的一个或多个片段。在一优选实施方案中，HSA片段是HSA的成熟形式。
一般来说，白蛋白片段或变体的长度为至少100个氨基酸，优选长度为至少150个氨基酸。
根据本公开，白蛋白可以是天然存在的白蛋白或者其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。
优选地，白蛋白融合蛋白包含白蛋白作为N-末端部分，以及治疗性蛋白作为C-末端部分。或者，还可以使用包含白蛋白作为C-末端部分，以及治疗性蛋白作为N-末端部分的白蛋白融合蛋白。在其他实施方案中，白蛋白融合蛋白具有融合至白蛋白的N-末端和C-末端的治疗性蛋白。在一优选实施方案中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是相同的治疗性蛋白。在另一优选实施方案中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白。在一实施方案中，不同的治疗性蛋白都是细胞因子。
在一实施方案中，治疗性蛋白通过肽接头连接至白蛋白。融合部分之间的接头肽可以在部分之间提供更大的物理间隔，因此使治疗性蛋白部分的可接近性最大化，例如，用于结合至其同源受体。接头肽可以由氨基酸组成，从而它是柔性的或更刚性的。接头序列可以蛋白酶或化学可切割的。
如本文所用，术语“Fc区”是指天然免疫球蛋白由其两条重链各自的Fc结构域(或Fc部分)形成的部分。如本文所用，术语“Fc结构域”是指单个免疫球蛋白(Ig)重链的一部分或片段，其中所述Fc结构域不含Fv结构域。在某些实施方案中，Fc结构域开始于木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区，并且终止于抗体的C-末端。因此，完整的Fc结构域至少包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc结构域包含以下至少一个：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或者其变体、部分或片段。在某些实施方案中，Fc结构域包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某些实施方案中，Fc结构域包含融合至CH3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域包含融合至CH3结构域(或其部分)的CH2结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域由CH3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。本文中的Fc结构域一般是指包含免疫球蛋白重链的Fc结构域的全部或部分的多肽。这包括但不限于包含完整CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽以及仅包含例如铰链、CH2和CH3结构域的这类肽的片段。Fc结构域可以源自任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域涵盖天然Fc和Fc变体分子。如本文所示，本领域普通技术人员会理解可以修饰任何Fc结构域，从而其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域不同。在某些实施方案中，Fc结构域具有降低的效应物功能(例如，FcγR结合)。
本文描述的多肽的Fc结构域可以源自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域可以包含源自IgG1分子的CH2和/或CH3结构域以及源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，Fc结构域可以包含嵌合铰链区，所述嵌合铰链区部分源自IgG1分子，并且部分源自IgG3分子。在另一实例中，Fc结构域可以包含嵌合铰链，所述嵌合铰链部分源自IgG1分子，并且部分源自IgG4分子。
在某些实施方案中，延长PK的基团包括Fc结构域或其片段，或者Fc结构域的变体或其片段(为了本公开的目的，所有这些均包括在术语“Fc结构域”中)。Fc结构域不含结合至抗原的可变区。适合用于本公开的Fc结构域可以获得自许多不同来源。在某些实施方案中，Fc结构域源自人免疫球蛋白。在某些实施方案中，Fc结构域来自人IgG1恒定区。但是，应当理解，Fc结构域可以源自另一哺乳动物物种的免疫球蛋白，包括例如，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如黑猩猩、猕猴)物种。
此外，Fc结构域(或者其片段或变体)可以源自任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
各种Fc结构域基因序列(例如，小鼠和人恒定区基因序列)可以公众可得的保藏物的形式获得。可以选择缺少特定效应物功能和/或具有特定修饰以减少免疫原性的包含Fc结构域序列的恒定区结构域。已公开了许多抗体和抗体编码基因的序列，并且可以利用本领域公知的技术从这些序列衍生合适的Fc结构域序列(例如铰链、CH2和/或CH3序列，或者其片段或变体)。
在某些实施方案中，延长PK的基团是血清白蛋白结合蛋白如US2005/0287153、US2007/0003549、US2007/0178082、US2007/0269422、US2010/0113339、WO2009/083804和WO2009/133208中描述的那些，它们整体援引加入本文。在某些实施方案中，延长PK的基团是转铁蛋白，如US 7,176,278和US 8,158,579中公开的，它们整体援引加入本文。在某些实施方案中，延长PK的基团是血清免疫球蛋白结合蛋白如US2007/0178082、US2014/0220017和US2017/0145062中公开的那些，它们整体援引加入本文。在某些实施方案中，延长PK的基团是结合至血清白蛋白的基于纤连蛋白(Fn)的支架结构域蛋白，如US2012/0094909中公开的那些，其整体援引加入本文。US2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于Fn3的延长PK的基团的非限制性实例有Fn3(HSA)，即，结合至人血清白蛋白的Fn3蛋白。
在某些方面，适合根据本公开使用的PK延长的免疫刺激剂可以采用一种或多种肽接头。如本文所用，术语“肽接头”是指在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或更多个结构域(例如，延长PK的部分和免疫刺激剂部分)的肽或多肽序列。例如，肽接头可以用来将免疫刺激剂连接至HSA结构域。
适合将延长PK的基团融合至例如免疫刺激剂的接头是本领域公知的。示例性接头包括甘氨酸-丝氨酸多肽接头、甘氨酸-脯氨酸多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸多肽接头，即，由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。
除上述异源多肽以外或代替上述异源多肽，本文描述的免疫刺激剂多肽可以包含编码“标记”或“报告分子”的序列。标记或报告基因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(hygromycin-B-hosphotransferase，HPH)、胸苷激酶(TK)、β-半乳糖苷酶和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。
药物组合物
本文描述的药剂(agent)可以在药物组合物或药物中给药，并且可以以任何合适的药物组合物的形式给药。
在一实施方案中，本文描述的药物组合物是用于在受试者中诱导针对病毒如冠状病毒的免疫应答的免疫原性组合物。例如，在一实施方案中，所述免疫原性组合物是疫苗。
在本发明的所有方面的一实施方案中，本文描述的组分如编码疫苗抗原的RNA可以在药物组合物中给药，所述药物组合物可以包含药学可接受的载剂，并且可以任选地包含一种或多种佐剂、稳定剂等。在一实施方案中，所述药物组合物用于治疗或预防性治疗，例如，用于治疗或预防病毒感染，如冠状病毒感染。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效物质，优选与药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂一起的制剂。通过向受试者给药所述药物组合物，所述药物组合物可用于治疗、预防或降低疾病或病症的严重程度。药物组合物在本领域中也称作药物制剂。
本公开的药物组合物可以包含一种或多种佐剂，或者可以与一种或多种佐剂一起给药。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含一组异质化合物如油乳剂(例如，弗氏佐剂)、矿物质(如明矾)、细菌产物(如百日咳杆菌毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。细胞因子可以是IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL12、IFNα、IFNγ、GM-CSF、LT-a。其他已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油(如，ISA51)。用于本公开的其他合适的佐剂包括脂肽，如Pam3Cys。
根据本公开的药物组合物一般以“药学有效量”和“药学可接受的制剂”应用。
术语“药学可接受的”是指物质的无毒性，其不与药物组合物的活性组分的作用相互作用。
术语“药学有效量”或“治疗有效量”是指单独或与进一步的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病过程。这包括减缓疾病的发展，以及特别地，中断或逆转疾病的发展。治疗疾病中的期望反应还可以是延迟所述疾病或所述疾病状况的发生或者防止所述疾病或所述疾病状况的发生。本文描述的组合物的有效量取决于待治疗的疾病状况，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、尺寸和体重，治疗的持续时间，伴随疗法的类型(如果存在)，给药的具体途径以及相似因素。因此，本文描述的组合物的给药剂量可以取决于许多这样的参数。在用初始剂量患者中的反应不足的情况下，可以使用更高剂量(或者通过不同的、更局部化的给药途径有效达到的更高剂量)。
本公开的药物组合物可以包含盐、缓冲剂、防腐剂和任选存在的其他治疗剂。在一实施方案中，本公开的药物组合物包含一种或多种药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯代丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
如本文所用的术语“赋形剂”是指可以存在于本公开的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、增香剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释(diluting)和/或稀释(thinning)剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载剂”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，其中组合了活性组分以促进、增强或实现药物组合物的给药。如本文所用的载剂可以是一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适合给药受试者。合适的载剂包括但不限于无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘以及特别的生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物。在一实施方案中，本公开的药物组合物包括等渗盐水。
用于治疗用途的药学可接受的载剂、赋形剂或稀释剂是药学领域公知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中进行了描述。
药物载剂、赋形剂或稀释剂可以根据预期的给药途径和标准药物实践进行选择。
在一实施方案中，本文描述的药物组合物可以静脉内、动脉内、皮下、皮内或肌肉内给药。在某些实施方案中，将药物组合物配制用于局部给药或全身给药。全身给药可以包括肠道给药，其包括通过胃肠道吸收，或者肠胃外给药。如本文所用，术语“肠胃外给药”是指以通过胃肠道以外的任何方式给药，如通过静脉内注射。在一优选实施方案中，将药物组合物配制用于肌肉内给药。在另一实施方案中，将药物组合物配制用于全身给药，例如，用于静脉内给药。
如本文所用的术语“共给药”表示向同一患者给药不同化合物或组合物(例如，编码不同疫苗抗原的RNA)的过程。不同化合物或组合物可以同时、基本上同时或顺序给药。
治疗
本发明提供在受试者中诱导针对病毒(特别是病毒的不同毒株)的适应性免疫应答的方法和药剂，其包括给药有效量的本文描述的编码疫苗抗原的组合物(例如包含疫苗抗原或核酸(例如RNA)的组合物)。
在一实施方案中，本文描述的方法和药剂在受试者中提供对冠状病毒、冠状病毒感染或者与冠状病毒相关的疾病或病症的免疫力。因此，本发明提供用于治疗或预防与冠状病毒相关的感染、疾病或病症的方法和药剂。
在一实施方案中，将本文描述的方法和药剂给予患有与病毒相关的感染、疾病或病症的受试者。在一实施方案中，将本文描述的方法和药剂给予有发展与病毒相关的感染、疾病或病症的风险的受试者。例如，可以将本文描述的方法和药剂给予有与病毒接触风险的受试者。在一实施方案中，将本文描述的方法和药剂给予生活、旅行或预期旅行至病毒流行的地理区域的受试者。在一实施方案中，将本文描述的方法和药剂给予与生活、旅行或预期旅行至病毒流行的地理区域的另一人接触或预期接触的受试者。在一实施方案中，将本文描述的方法和药剂给予已知通过其职业或其他接触而暴露于病毒的受试者。在一实施方案中，病毒是冠状病毒，如SARS-CoV-2。
对于用作疫苗的组合物，所述组合物必须在细胞、组织或受试者(例如，人)中诱导针对病毒抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述组合物在细胞、组织或受试者(例如，人)中诱导针对病毒抗原的免疫应答。在某些情况下，所述疫苗在哺乳动物中诱导保护性免疫应答。可以将本发明的治疗化合物或组合物预防性地(即，为了预防疾病或病症)或治疗性地(即，为了治疗疾病或病症)给药患有或有风险(或易于)发展疾病或病症的受试者。可以利用标准临床方法鉴定这类受试者。在本发明的上下文中，预防性给药发生在显示疾病的明显临床症状之前，从而预防疾病或病症或者延迟其发展。在医学领域的上下文中，术语“预防”涵盖减少疾病引起的死亡率或发病率负担的任何活动。预防可以发生在一级、二级和三级预防水平。虽然一级预防避免疾病的发展，但是预防的二级和三级水平涵盖旨在预防疾病发展和症状出现以及通过恢复功能和减少疾病相关并发症来减少已建立的疾病的负面影响的活动。
在一些实施方案中，本发明的免疫原性组合物或疫苗的给药可以通过单次给药进行或通过多次给药加强。
在一些实施方案中，每剂量可以给药0.1μg-300μg、0.5μg-200μg或1μg-100μg，如约1μg、约3μg、约10μg、约30μg、约50μg或约100μg本文描述的RNA的量。
在一些实施方案中，本文所述的方案包括至少一个剂量。在一些实施方案中，方案包括第一剂量和至少一个后续剂量。在一些实施方案中，第一剂量与至少一个后续剂量的量相同。在一些实施方案中，第一剂量与所有后续剂量的量相同。在一些实施方案中，第一剂量与至少一个后续剂量的量不同。在一些实施方案中，第一剂量与所有后续剂量的量不同。在一些实施方案中，方案包括两个剂量。在一些实施方案中，提供的方案由两个剂量组成。
在一实施方案中，本发明预想单剂量的给药。在一实施方案中，本发明预想初免剂量随后一个或多个加强剂量的给药。加强剂量或第一加强剂量可以在初免剂量给药之后7-28天或14-24天给药。
在一些实施方案中，每剂量可以给药60μg或更低、50μg或更低、40或更低或者30μg或更低的本文描述的RNA的量。
在一些实施方案中，每剂量可以给药至少0.25μg、至少0.5μg、至少1μg、至少2μg、至少3μg、至少4μg、至少5μg、至少10μg、至少20μg、至少30μg或至少40μg本文描述的RNA的量。
在一些实施方案中，每剂量可以给药0.25μg-60μg、0.5μg-55μg、1μg-50μg、5μg-40μg或10μg-30μg本文描述的RNA的量。
如果给药不同的RNA分子(例如，编码不同多特异性病毒蛋白氨基酸序列)，则本文给出的RNA的量或剂量可以与给药的不同RNA分子的组合量有关。可以同时或基本上同时给药不同的RNA分子。在一些实施方案中，向受试者给药的方案可以是或包含单剂量。在一些实施方案中，向受试者给药的方案可以包含多个剂量(例如，至少两个剂量、至少三个剂量或更多)。在一些实施方案中，向受试者给药的方案可以包含第一剂量和第二剂量，其至少间隔2周、至少间隔3周、至少间隔4周或更长时间。在一些实施方案中，这类剂量可以间隔至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月或更长时间。在一些实施方案中，剂量可以间隔几天给药，例如间隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60天或间隔更长时间。在一些实施方案中，剂量可以间隔约1-约3周给药，或间隔约1-约4周，或间隔约1-约5周，或间隔约1-约6周，或间隔约1-超过6周。在一些实施方案中，剂量可以相隔约7-约60天，例如约14-约48天等。在一些实施方案中，剂量之间的最小天数可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21天或更长时间。在一些实施方案中，剂量之间的最大天数可以为约60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21天或更短时间。在一些实施方案中，剂量可以间隔约21-约28天。在一些实施方案中，剂量可以间隔约19-约42天。在一些实施方案中，剂量可以间隔约7-约28天。在一些实施方案中，剂量可以为约14-约24天。在一些实施方案中，剂量可以为约19-约42天。
在一些实施方案中，疫苗接种方案包括第一剂量和第二剂量。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量至少间隔21天给药。
在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量至少间隔28天给药。
在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量(和/或其他后续剂量)可以通过肌肉内注射给药。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量可以在三角肌内给药。在一些实施方案中，第一剂量和第二剂量可以在相同的手臂给药。在一些实施方案中，将本文所述的mRNA组合物作为一系列两个剂量(例如，每个剂量0.3mL)给药(例如，通过肌肉内注射)，间隔21天。在一些实施方案中，每个剂量为约30ug。在一些实施方案中，每个剂量可以高于约30ug，例如约40ug、约50ug、约60ug。在一些实施方案中，每个剂量可以低于约30ug，例如约20ug、约10ug、约5ug等。在一些实施方案中，每个剂量为约3ug或更低，例如约1ug。在一些这类实施方案中，向16岁或以上的受试者(包括，例如16-85岁)的受试者给药本文所描述的mRNA组合物。在一些这类实施方案中，向18-55岁的受试者给药本文所描述的mRNA组合物。在一些这类实施方案中，向56-85岁的受试者给药本文所描述的mRNA组合物。在一些实施方案中，作为单剂量给药本文所描述的mRNA组合物(例如，通过肌肉内注射)。
在一实施方案中，每剂量给药约30μg本文描述的RNA的量。在一实施方案中，给药至少两个这样的剂量。例如，可以在给药第一剂量之后约21天给药第二剂量。
在一些实施方案中，本文描述的RNA疫苗的效力(例如，以两个剂量给药，其中第二剂量可以在给药第一剂量之后约21天给药，并且例如，以约30μg每剂量的量给药)在给药第二剂量之后开始7天(例如，如果在给药第一剂量之后21天给药第二剂量，则在给药第一剂量之后开始28天)是至少70％、至少80％、至少90或至少95％。在一些实施方案中，在至少50岁、至少55岁、至少60岁、至少65岁、至少70岁或更老的群体中观察到这样的效力。在一些实施方案中，本文描述的RNA疫苗的效力(例如，以两个剂量给药，其中第二剂量可以在给药第一剂量之后约21天给药，并且例如，以约30μg每剂量的量给药)在给药第二剂量之后开始7天(例如，如果在给药第一剂量之后21天给药第二剂量，则在给药第一剂量之后开始28天)在至少65岁如65-80、65-75或65-70岁的群体中是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％或至少95％。可以在长达1个月、2个月、3个月、6个月或更长的时间内观察到这样的效力。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和/或方法的特征在于，在给药第二剂量后7天，保护效力为至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一实施方案中，本文所述的组合物和/或方法的特征在于，在给药第二剂量后7天，保护效力为至少70％。在一实施方案中，本文所述的组合物和/或方法的特征在于，在给药第二剂量后7天，保护效力为至少80％。在一实施方案中，本文所述的组合物和/或方法的特征在于，在给药第二剂量后7天，保护效力为至少90％。在一实施方案中，本文所述的组合物和/或方法的特征在于，在给药第二剂量后7天，保护效力为至少95％。
在一实施方案中，疫苗效力定义为有感染证据的受试者数减少的百分比(疫苗接种的受试者对未疫苗接种的受试者)。
在一实施方案中，通过监测COVID-19的潜在病例评价效力。为了本文的目的，在任何时间，如果患者发展急性呼吸系统疾病，则可以认为该患者可能患有COVID-19疾病。评价可以包括鼻(中鼻甲)拭子，其可以利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测试以检测SARS-CoV-2。此外，可以评价临床信息和来自当地护理标准测试的结果。
在一些实施方案中，效力评价可以利用SARS-CoV-2相关病例的定义，其中：
·确诊的COVID-19：在症状期间或者在症状期之前或之后4天内存在至少1种以下症状和SARS-CoV-2NAAT(基于核酸扩增的测试)阳性：发烧；新的或增加的咳嗽；新的或增加的呼吸急促；寒战；新的或增加的肌肉疼痛；新的味觉或嗅觉丧失；喉咙痛；腹泻；呕吐。
可选地或额外地，在一些实施方案中，效力评价可以利用SARS-CoV-2相关病例的定义，其中可以考虑CDC定义的一个或多个以下额外症状：疲劳；头痛、鼻塞或流涕；恶心。
在一些实施方案中，效力评价可以利用SARS-CoV-2相关严重病例的定义
·确诊的严重COVID-19：确诊的COVID-19并存在以下至少1种：在静息状态下指示严重全身疾病的临床表现(例如，RR≥30次呼吸/分钟，HR≥125次搏动/分钟，在海平面的室内空气中SpO2≤93％，或PaO2/FiO2<300mm Hg)；呼吸衰竭(其可以定义为需要高流量氧气，无创通气，机械通气或ECMO)；休克的证据(例如，SBP<90mm Hg、DBP<60mm Hg或需要血管加压剂)；严重的急性肾、肝或神经功能障碍；进入ICU；死亡。
可选地或额外地，在一些实施方案中，血清学定义可以用于没有COVID-19临床表现的患者：例如，已证实血清转换为SARS-CoV-2而没有证实的COVID-19：例如，阳性N结合抗体导致具有先前阴性N结合抗体结果的患者。
在一些实施方案中，可以对血清样品进行任何或所有以下测定：SARS-CoV-2中和测定；S1结合IgG水平测定；RBD结合IgG水平测定；N结合抗体测定。
在一实施方案中，可以将本文描述的方法和药剂给予儿科群体。在各种实施方案中，儿科群体包括18岁以下的受试者或由18岁以下的受试者组成，例如，5至18岁以下，12至18岁以下，16至18岁以下，12至16岁以下或5至12岁以下。在各种实施方案中，儿科群体包括5岁以下的受试者或由5岁以下的受试者组成，例如，2至5岁以下，12至24个月以下，7至12个月以下或6个月以下。
在一实施方案中，儿科群体包括12至18岁以下的受试者或由12至18岁以下的受试者组成，包括16至18岁以下的受试者和/或12至16岁以下的受试者。在这个实施方案中，治疗可以包括间隔21天的2次疫苗接种，其中，在一实施方案中，疫苗以30μg RNA/剂量的量例如通过肌肉内给药来进行给药。
在一实施方案中，儿科群体包括5至18岁以下的受试者或由5至18岁以下的受试者组成，包括12至18岁以下的受试者和/或5至12岁以下的受试者。在这个实施方案中，治疗可以包括间隔21天的2次疫苗接种，其中，在各种实施方案中，疫苗以10μg、20μg或30μg RNA/剂量的量例如通过肌肉内给药来进行给药。
在一实施方案中，儿科群体包括5岁以下的受试者或由5岁以下的受试者组成，包括2至5岁以下的受试者，12至24个月以下的受试者，7至12个月以下的受试者，6至12个月以下的受试者和/或6个月以下的受试者。在这个实施方案中，治疗可以包括2次疫苗接种，例如，间隔21-42天，例如，间隔21天，其中，在各种实施方案中，疫苗以10μg、20μg或30μg RNA/剂量的量例如通过肌肉内给药来进行给药。
在一些实施方案中，用本文描述的RNA治疗的群体包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：年龄为至少50岁、至少55岁、至少60岁或至少65岁的受试者。在一些实施方案中，用本文描述的RNA治疗的群体包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：年龄为55-90岁、60-85岁或65-85岁的受试者。
在一些实施方案中，给药的剂量之间的时间段是至少7天、至少14天或至少21天。在一些实施方案中，给药的剂量之间的时间段是7天至28天，如14天至23天。
在一些实施方案中，可以向受试者给药不超过5个剂量、不超过4个剂量或不超过3个剂量的本文描述的RNA。
在一些实施方案中，本文描述的方法和药剂在受试者中提供对冠状病毒、冠状病毒感染或者与冠状病毒相关的疾病或病症的中和效应。
在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导阻断或中和冠状病毒的免疫应答。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导阻断或中和冠状病毒的抗体如IgG抗体的产生。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导阻断或中和冠状病毒S蛋白结合至ACE2的免疫应答。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导阻断或中和冠状病毒S蛋白结合至ACE2的抗体的产生。
如本文所用，术语“中和”是指其中结合剂如抗体结合至病毒的生物活性位点如受体结合蛋白，从而抑制细胞的病毒感染的事件。如本文所用，关于冠状病毒，特别是冠状病毒S蛋白的术语“中和”是指其中结合剂如抗体结合至S蛋白的RBD结构域，从而抑制细胞的病毒感染的事件。特别地，术语“中和”是指其中结合剂消除或显著降低所关注的病毒的毒力(例如感染细胞的能力)的事件。
对抗原攻击应答产生的免疫应答的类型一般可以通过参与应答的T辅助(Th)细胞的子集来区分。免疫应答可以大体上分为两个类型：Th1和Th2。Th1免疫激活针对细胞内感染如病毒优化，而Th2免疫应答针对体液(抗体)应答优化。Th1细胞产生白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)。Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13。在许多临床情况中最需要Th1免疫激活。专门引发Th2或体液免疫应答的疫苗组合物一般对大多数病毒性疾病无效。
在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导或促进Th1介导的免疫应答。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导或促进Th1介导的免疫应答典型的细胞因子谱。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导或促进白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNFα)和/或干扰素γ(IFNγ)的产生。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导或促进白介素2(IL-2)和干扰素γ(IFNγ)的产生。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中不诱导或促进Th2介导的免疫应答，或者在受试者中诱导或促进与Th1介导的免疫应答的诱导或促进相比显著较低程度的Th2介导的免疫应答。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中不诱导或促进Th2介导的免疫应答典型的细胞因子谱，或者在受试者中诱导或促进与Th1介导的免疫应答典型的细胞因子谱的诱导或促进相比显著较低程度的Th2介导的免疫应答典型的细胞因子谱。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂不诱导或促进IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和/或IL-13的产生，或者在受试者中诱导或促进与受试者中白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNFα)和/或干扰素γ(IFNγ)的诱导或促进相比显著较低程度的IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10和/或IL-13的产生。在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂不诱导或促进IL-4的产生，或者在受试者中诱导或促进与受试者中白介素2(IL-2)和干扰素γ(IFNγ)的诱导或促进相比显著较低程度的IL-4的产生。
在一些实施方案中，给予受试者之后，本文描述的方法和药剂在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向一组不同的S蛋白变体如SARS-CoV-2 S蛋白变体，特别是天然存在的S蛋白变体。在一些实施方案中，该组不同的S蛋白变体包含至少5种、至少10种、至少15种或甚至更多种S蛋白变体。在一些实施方案中，这样的S蛋白变体包含在RBD结构域中具有氨基酸修饰的变体和/或在RBD结构域外具有氨基酸修饰的变体，例如在NTD结构域中。这类氨基酸修饰如本文所描述。
在一实施方案中，本文描述的针对病毒疫苗接种，例如，使用本文描述的RNA，其可以以本文描述的量和方案给药，例如，以30μg/剂量的两个剂量给药，例如间隔21天给药，可以在一定时间段之后重复，例如，一旦观察到对病毒感染的保护作用减弱，使用与用于第一次疫苗接种的相同或不同的疫苗。此特定时间段可以是至少6个月、1年、2年等。在一实施方案中，与用于第一次疫苗接种相同的RNA用于第二次或进一步的疫苗接种，但是，以较低剂量或较低频率给药。例如，第一次疫苗接种可以包括使用约30μg/剂量的剂量疫苗接种，其中在一实施方案中，给药至少两个这样的剂量例如，第二剂量可以在给药第一剂量之后约21天给药)，并且第二次或进一步的疫苗接种可以包括使用少于约30μg/剂量的剂量疫苗接种，其中在一实施方案，仅给药一个这样的剂量。在一实施方案中，与用于第一次疫苗接种不同的RNA用于第二次或进一步的疫苗接种。在一实施方案中，将BNT162b2用于第一次疫苗接种，并将本文所描述的疫苗抗原(其具有第二次或进一步疫苗接种时流行的毒株中存在的修饰)用于第二次或进一步疫苗接种。在一实施方案中，将疫苗抗原(其具有第一次疫苗接种时流行的毒株中存在的修饰)用于第一次疫苗接种，并将疫苗抗原(其具有第二次或进一步疫苗接种时流行的毒株中存在的修饰)用于第二次或进一步疫苗接种。
在一实施方案中，疫苗接种方案包括使用至少两个剂量的本文描述的RNA的第一疫苗接种，例如，两个剂量的本文描述的RNA(其中第二剂量可以在给药第一剂量之后约21天给药)，以及使用单剂量或多剂量，例如两个剂量的本文描述的RNA的第二疫苗接种。在各种实施方案中，第二疫苗接种在给药第一疫苗接种之后，例如，在最初的两剂量方案之后，3-24个月、6-18个月、6-12个月或5-7个月给药。第二疫苗接种的每个剂量中使用的RNA的量可以与第一疫苗接种的每个剂量中使用的RNA的量相同或不同。在一实施方案中，第二疫苗接种的每个剂量中使用的RNA的量等于第一疫苗接种的每个剂量中使用的RNA的量。在一实施方案中，第二疫苗接种的每个剂量中使用的RNA的量和第一疫苗接种的每个剂量中使用的RNA的量是约30μg/剂量。在一实施方案中，与用于第一疫苗接种相同的RNA用于第二疫苗接种。
在一实施方案中，第二疫苗接种导致免疫应答的加强。
在一实施方案中，将本文描述的RNA与其他疫苗共给药。在一些实施方案中，将本文描述的RNA组合物与流感疫苗共给药。在一些实施方案中，将本文提供的RNA组合物和其他可注射的疫苗在不同时间给药。在一些实施方案中，将本文提供的RNA组合物与其他可注射的疫苗同时给药。在一些这样的实施方案中，将本文提供的RNA组合物和至少一种另一可注射的疫苗在不同注射部位给药。
术语“疾病”是指影响个体身体的异常状况。疾病通常理解为与特定症状或体征有关的医学状况。疾病可以由源自外部来源的因素引起，如传染病，或者其可以由内部功能失调引起，如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常更广泛地用来指引起患病个体的疼痛、功能障碍、窘迫、社会问题或死亡或者与个体接触的人的相似问题的任何状况。在这个更广泛的意义上，其有时包括损伤、残疾、病症、综合征、感染、分离的症状、偏差行为以及结构和功能的非典型变化，但是在其他上下文中和为了其他目的，这些可以认为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上，而且还在情感上影响个体，因为感染和患有许多疾病可以改变一个人的人生观和一个人的性格。
在本文中，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及为了对抗疾病状况如疾病或病症的目的而对受试者的管理和护理。该术语旨在包括对受试者遭受的给定疾病状况的全范围治疗，如给药治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延迟疾病、病症或疾病状况的发展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或疾病状况以及预防疾病状况，其中预防应理解为为了对抗疾病、疾病状况或病症的目的而对个体的管理和护理，并且包括给药活性化合物以预防症状或并发症的发生。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状态和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体中的疾病，阻止或减缓个体中疾病的发展，抑制或减缓个体中疾病的发展，减少个体中症状的频率或严重程度，和/或减少目前患有或以前患有疾病的个体中的复发。
术语“预防性治疗”或“预防治疗”涉及意图防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。它们是指可以患有或易患疾病或病症但是可能有或可能没有疾病或病症的人或另一哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，术语“个体”和“受试者”不表示特定年龄，因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在一些实施方案中，本文所述的受试者都是年轻的受试者(例如，小于25岁、20岁、18岁、15岁、10岁或更小)；可选地或额外地，在一些实施方案中，本文所描述的受试者是年老的受试者(例如，大于55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁或更老)。
在本公开的实施方案中，“个体”或“受试者”是“患者”。
术语“患者”表示治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。
在本公开的一实施方案中，目的是提供针对从其衍生病毒蛋白的至少一个片段的病毒(如冠状病毒)的免疫应答，以及预防或治疗病毒感染(如冠状病毒感染)。
可以将包含RNA的药物组合物给药受试者以在受试者中引发针对包含所述表位的抗原的免疫应答，其可以是治疗性的或者部分或完全保护性的，所述RNA编码包含表位的肽或蛋白。本领域技术人员会知道免疫疗法和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位免疫受试者产生对疾病的免疫保护性反应，其与待治疗的疾病在免疫学上相关。因此，本文描述的药物组合物可用于诱导或增强免疫应答。因此本文描述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
本文所描述的RNA构建体编码包含SARS-CoV-2 S蛋白的至少一部分的修饰的氨基酸序列的多肽，例如SARS-CoV-2 S蛋白的至少RBD部分，或全长或基本上全长的SARS-CoV-2编码的S蛋白，可以特别有用和/或有效地用作或用于免疫原性组合物(例如疫苗)，和/或用于实现本文所描述的免疫效果(例如，产生SARS-CoV-2中和抗体，和/或T细胞应答(例如，CD4+和/或CD8+T细胞应答))。
如本文所用，“免疫应答”是指对抗原或表达抗原的细胞的综合身体应答，并且是指细胞免疫应答和/或体液免疫应答。免疫系统分为更原始的先天免疫系统，以及脊椎动物的获得性或适应性免疫系统，各自包含体液和细胞组分。
“细胞介导的免疫”、“细胞免疫”、“细胞免疫应答”或相似术语表示包括针对特征是表达抗原的细胞，特别是特征是用MHC I类或MHC II类呈递抗原的细胞的细胞应答。细胞应答涉及免疫效应细胞，特别是称作T细胞或T淋巴细胞的细胞，其充当“助手”或“杀手”。辅助T细胞(也称作CD4+T细胞)通过调节免疫应答发挥中心作用，而杀伤细胞(也称作细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀死患病细胞如病毒感染的细胞，防止产生更多患病细胞。
免疫效应细胞包括对疫苗抗原有响应的任何细胞。这种响应性包括一种或多种免疫效应物功能的激活、分化、增殖、存活和/或指示。特别地，所述细胞包括具有溶解潜力的细胞，特别是淋巴样细胞，并且优选是T细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(NK)细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。当激活时，这些细胞毒性淋巴细胞中的每种触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下方式中的一种或两种触发靶细胞的破坏。第一，当激活时，T细胞释放细胞毒素如穿孔蛋白、颗粒酶和颗粒溶素。穿孔蛋白和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。第二，可以通过T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导凋亡。
在本发明的上下文中，术语“效应物功能”包括免疫系统的组分介导的任何功能，例如，其导致病原物质如病毒的中和和/或杀死患病细胞如病毒感染的细胞。在一实施方案中，本发明的上下文中的效应物功能是T细胞介导的效应物功能。这类功能在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下包括释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下包括消除细胞，即，特征是表达抗原的细胞，例如，通过凋亡或穿孔蛋白介导的细胞裂解，产生细胞因子如IFN-g和TNF-α，以及表达抗原的靶细胞的特异性细胞溶解性杀死。
在本发明的上下文中术语“免疫效应细胞”或“免疫反应细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应物功能的细胞。在一实施方案中，“免疫效应细胞”能够结合抗原，如在MHC的情况下在细胞上呈递或在细胞表面上表达并介导免疫应答的抗原。例如，免疫效应细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫效应细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+T细胞，最优选CD8+T细胞。根据本发明，术语“免疫效应细胞”还包括用合适的刺激可以成熟为免疫细胞(如T细胞，特别是T辅助细胞，或溶细胞性T细胞)的细胞。免疫效应细胞包含CD34+造血干细胞、未成熟和成熟的T细胞以及未成熟和成熟的B细胞。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为溶细胞性T细胞与免疫系统的克隆选择相似。
“淋巴样细胞”是能够产生免疫应答如细胞免疫应答的细胞，或者这种细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞，优选T淋巴细胞、原淋巴细胞(lymphoblast)和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文所述的免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是T细胞。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)，其包含溶细胞性T细胞。术语“抗原特异性T细胞”或相似术语涉及识别T细胞靶向的抗原并优选发挥T细胞的效应物功能的T细胞。
T细胞属于称作淋巴细胞的一组白细胞，并且在细胞介导的免疫中起中心作用。它们可以通过它们细胞表面上存在称作T细胞受体(TCR)的特殊受体与其他淋巴细胞类型如B细胞和自然杀伤细胞区分。胸腺是负责T细胞成熟的主要器官。已发现T细胞的几个不同子集，各自具有不同功能。
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞等。这些细胞也称作CD4+T细胞，因为它们在表面上表达CD4糖蛋白。当通过抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子用肽抗原呈递时，辅助T细胞活化。一旦活化，它们快速分裂并分泌调节或辅助主动免疫应答的称作细胞因子的小蛋白。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还涉及移植排斥。这些细胞也称作CD8+T细胞，因为它们在表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与MHC I类相关的抗原来识别它们的靶标，其存在于身体的几乎每个细胞表面上。
大部分T细胞具有作为几个蛋白的复合物存在的T细胞受体(TCR)。T细胞的TCR能够与结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子并呈递在靶细胞表面上的免疫原性肽(表位)相互作用。TCR的特异性结合触发T细胞内的信号级联，导致增殖并分化为成熟的效应T细胞。实际的T细胞受体包括两条不同的肽链，其产生自独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因并称作α-和β-TCR链。γδT细胞(γδT细胞)代表在它们的表面上具有不同T细胞受体(TCR)的一小部分T细胞。但是，在γδT细胞中，TCR由一条γ-链和一条δ-链构成。这组T细胞比αβT细胞更不常见(总T细胞的2％)。
“体液免疫”或“体液免疫应答”是免疫的一方面，其由细胞外液中发现的大分子如分泌的抗体、补体蛋白和某些抗微生物肽介导。其与细胞介导的免疫形成对比。其涉及抗体的方面通常称作抗体介导的免疫。
体液免疫是指抗体产生及其伴随的辅助过程，包括：Th2激活和细胞因子产生、生发中心形成和同种型转换、亲和力成熟和记忆细胞生成。其还指抗体的效应物功能，包括病原体中和、经典补体激活以及吞噬作用的调理素促进和病原体消除。
在体液免疫应答中，首先B细胞在骨髓中成熟并获得B-细胞受体(BCR)，所述B-细胞受体大量展示在细胞表面上。这些膜结合的蛋白复合物具有抗原检测特异性的抗体。每个B细胞具有结合抗原的独特抗体。成熟的B细胞从骨髓迁移至淋巴结或其他淋巴器官，在那里它们开始遇到病原体。当B细胞遇到抗原时，抗原结合至受体并通过胞吞作用吸收到B细胞内。抗原通过MHC-II蛋白加工并再次呈递在B细胞表面上。B细胞等待辅助T细胞(TH)结合至复合物。这种结合会激活TH细胞，然后其释放诱导B细胞快速分裂的细胞因子，产生数千个相同的B细胞克隆。这些子细胞成为浆细胞或记忆细胞。记忆B细胞在这里保持不活化；后来当这些记忆B细胞由于再感染而遇到相同抗原时，它们分裂并形成浆细胞。在另一方面，浆细胞产生大量抗体，所述抗体自由释放至循环系统中。这些抗体会遇到抗原并与它们结合。这会干扰宿主和外来细胞之间的化学相互作用，或者它们可以在它们的抗原位点之间形成桥，阻碍它们的正常功能，或者它们的存在会吸引巨噬细胞或杀伤细胞来攻击并吞噬它们。
术语“抗体”包括免疫球蛋白，其包含至少通过二硫键互相连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。VH和VL区可以进一步细分为高变性的区域，称作互补性决定区(CDR)，散布于更保守的、称作框架区(FR)的区域。每个VH和VL包括3个CDR和4个FR，从氨基-末端至羧基-末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。抗体与抗原结合，优选特异性地结合。
B细胞表达的抗体有时称作BCR(B细胞受体)或抗原受体。这类蛋白中包括的5个成员是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在于身体分泌物中的主要抗体，如唾液、泪液、乳汁、胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。在大多数受试者中，IgM是初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体应答中最有效的免疫球蛋白，并且在防御细菌和病毒中很重要。IgD是没有已知抗体功能的免疫球蛋白，但是可以充当抗原受体。IgE是一种免疫球蛋白，其通过在暴露于反应原时引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质来介导立即超敏反应。
如本文所用，“抗体重链”是指在它们天然存在的构象中，抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用，“抗体轻链”是指在它们天然存在的构象中，抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较小者，κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
本公开考虑可以是保护性、防护性、预防性和/或治疗性的免疫应答。如本文所用，“诱导免疫应答”可以表示在诱导之前不存在针对特定抗原的免疫应答，或者其可以表示在诱导之前有针对特定抗原的基础水平的免疫应答，其在诱导之后增强。因此，“诱导免疫应答”包括“增强免疫应答”。
术语“免疫疗法”涉及通过诱导或增强免疫应答来治疗疾病或疾病状况。术语“免疫疗法”包括抗原免疫或抗原疫苗接种。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述向个体给药抗原的过程，目的是例如出于治疗或预防原因诱导免疫应答。
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物激活的巨噬细胞非特异性地吞噬并通过水解和氧化攻击杀死巨噬细胞内的外来病原体，导致病原体降解。来自降解蛋白的肽展示在巨噬细胞表面上，在这里它们可以被T细胞识别，并且它们可以直接与B细胞表面上的抗体相互作用，导致T和B细胞激活并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指吞噬细胞的另一亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一实施方案中，树突细胞源自造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟的细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞激活潜力。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体如病毒和细菌。一旦它们与可呈递的抗原接触，它们会激活为成熟的树突细胞并开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将它们的蛋白降解为小片，并且在成熟时利用MHC分子将那些片段呈递在它们的细胞表面。同时，它们上调在T细胞激活中充当共受体的细胞表面受体如CD80、CD86和CD40，大大增强它们激活T细胞的能力。它们还上调趋化性受体CCR7，其诱导树突细胞通过血流到达脾或通过淋巴系统到达淋巴结。这里它们充当抗原呈递细胞，并且通过呈递抗原以及非抗原特异性共刺激信号来激活辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可以主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“抗原呈递细胞”(APC)是能够在其细胞表面上(或在其细胞表面)展示、获得和/或呈递至少一种抗原或抗原片段的各种细胞中的细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
术语“专职(professional)抗原呈递细胞”涉及组成性表达与幼稚T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合物II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHC II类分子复合物相互作用，则抗原呈递细胞产生共刺激分子，诱导T细胞的激活。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职(non-professional)抗原呈递细胞”涉及不组成性表达MHC II类分子，但是在受到某些细胞因子如干扰素-γ刺激时表达MHC II类分子的抗原呈递细胞。示例性非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰β细胞或血管内皮细胞。
“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，其是所述抗原的片段(例如，蛋白降解为肽)，并且这些片段中的一个或多个与MHC分子关联(例如，通过结合)用于通过细胞呈递，如特定T细胞的抗原呈递细胞。
术语“涉及抗原的疾病”是指牵涉抗原的任何疾病，例如以抗原的存在为特征的疾病。涉及抗原的疾病可以是传染病。如上文提到的，抗原可以是疾病相关抗原，如病毒抗原。在一实施方案中，涉及抗原的疾病是涉及表达抗原的细胞的疾病，优选在细胞表面上表达抗原。
术语“传染病”是指可以从个体传播至个体或从生物体传播至生物体的任何疾病，并且是由微生物物质引起的(例如普通感冒)。传染病是本领域已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生虫性疾病，所述疾病分别是由病毒、细菌和寄生虫引起的。在这方面，传染病可以是例如肝炎、性传播疾病(例如衣原体病或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(SARS)、禽流感和流感。
在本发明的一实施方案中，病毒是RNA病毒，特别是引起传染病的RNA病毒。
本文参考的文件和研究的引用并不意图承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
提出以下描述以使本领域普通技术人员能够制备和使用各种实施方案。特定设备、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文描述的实例的各种修改对于本领域技术人员会显而易见，并且在不背离各种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可以应用于其他实例和应用。因此，各种实施方案不是为了限制本文描述和示出的实例，而是与符合权利要求的范围一致。
实施例
实施例1：二价疫苗设计
为了对多个关注的已建立和进化的SARS-CoV-2变体产生广泛的中和体液免疫，建立了一种新的二价疫苗方法，所述SARS-CoV-2变体可能增加病毒的传播性或降低目前对原型Wuhan毒株有效的疫苗的效力。二价疫苗设计的基础形成了快速传播谱系B.1.1.7的刺突(S)糖蛋白序列[[亦称为关注的变体202012/01(VOC-202012/01)或20B/501Y.V1]，因为B.1.1.7变体正在成为全球主要的SARS-CoV-2变体。B.1.1.7变体在S糖蛋白中含有几个突变(表4)，并且已证明其本质上具有更高的传播性，其增长率估计比其他SARS-CoV-2谱系高40-70％(Volz et al.,Nature,2021；Washington et al.,Cell,2021)。在流行的关注的变体或感兴趣的变体中发现的SARS-CoV-2 S受体结合结构域(RBD)和/或N末端结构域(NTD)的刺突突变，即谱系B.1.351(亦称为20H/501Y.V2)、P.1、B.1.427/B.1.429(亦称为CAL.20C)、B.1.526(表4)，以及其他已经证实其赋予对中和单克隆抗体(nAb)或人COVID-19恢复期血清免疫逃逸的高流行突变，被引入并分布在两个B.1.1.7S序列中(表5，图6)。在一方面，在B.1.351谱系中发现的重要突变簇K417N、E484K和N501Y保持保守。在另一方面，以氨基酸交换间隔合理距离并且可能导致离散的构象表位的方式引入单点突变。例如，将位于靶向1类RBD的nAb的结合表位中的S477N突变与位于靶向2类或3类RBD的nAb的结合表位中的L452R和N439K突变组合(Barnes et al.,Nature,2020)。对于NTD，只考虑靶向表面暴露的氨基酸残基的额外突变，如L18F、D80A、D215G、R246I和D253G。再次，以氨基酸交换间隔合理距离并且可能导致离散的构象表位的方式引入这些突变。
表4:在SARS-CoV-2的关注变体和高流行率变体的刺突糖蛋白中发现的突变。对于谱系B.1.526，已知两个在RBD中有不同的关键氨基酸交换的亚谱系。del＝缺失
表5:基于B.1.1.7谱系刺突蛋白的示例性新的二价疫苗设计。其他非B.1.1.7谱系刺突突变以粗体显示
实施例2:体外测试
使用商业转染试剂或0.15μg/mL LNP配制的编码疫苗候选物BNT162b2、BNT162b2(α)、BNT162b2(α+SA)和BNT162b2(α；L452R+E484Q)的modRNA，以0.15μg/mL modRNA转染HEK293T细胞，一式三份。构建体的序列说明参见表6。转染后，将细胞孵育18h以表达疫苗候选物编码的S蛋白。随后，收获细胞并用融合至小鼠Fc标签的人重组ACE-2(hACE2-mFc)进行探测，并且用荧光标记的抗小鼠二抗检测ACE-2与HEK293T细胞表面异位表达的疫苗候选物的结合。假设疫苗编码的SARS-CoV-2变体S蛋白构建体具有相当的ACE-2亲和力，将FACS中测量的中值荧光强度(MFI)作为变体S蛋白表面表达的替代。
表6:所用疫苗构建体的序列信息
下划线氨基酸改变表示在亲本α疫苗序列之上引入的那些
简而言之，在转染前6小时，将0.4x106个HEK293T细胞接种到12孔板中。转染前，根据制造商的说明，使用LipofectamineTM MessengerMAXTM(ThermoFisher Scientific)配制编码疫苗候选物的modRNA，或者使用LNP配制的编码疫苗候选物的modRNA，以0.15μg/mLmodRNA一式三份转染细胞。在染色之前，将细胞在37℃和5％ CO2下孵育18小时。然后收集细胞，用活力染料(eBioscienceTM Fixable Viability Dye eFluorTM 450,ThermoFisherScientific)和hACE2-mFc(SinoBiological)孵育，随后在固定之前用Alexa647AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)二抗(Jackson ImmunoResearch)染色(Fixation Buffer,BioLegend)。使用BD FACSCelesta 2(BD)获取细胞，并用FlowJo V10.8(BD)分析数据。
所有疫苗候选物的编码S蛋白都在细胞表面表达，并且能够与SARS-CoV-2的宿主细胞进入受体-血管紧张素转换酶(ACE-2)结合，如使用hACE2-mFc作为检测试剂确定的(图7)。与用LNP配制的modRNA获得的表达水平相比(图7C，D)，LipofectamineTMMessengerMAXTM配制的modRNA的表达水平较低(图7A，B)，如SARS-CoV-2 S蛋白表达细胞的百分比和总转染的HEK293T群的MFI所观察到的。然而，用相同方法转染的疫苗候选物显示出大致相当的S蛋白表面表达水平[分别为BNT162b2、BNT162b2(α+SA)(图7A、B)和BNT162b2、BNT162b2(α)、BNT162b2(α；L452R+E484Q)(图7C、D)]。
实施例3:基于B.1.1.7(α)骨架使用多种变体突变的小鼠免疫原性研究
在第0天时，向三组5只雌性BALB/c小鼠注射一次1μg/动物的BNT162b2(α)、BNT162b2(α+SA)或者单独的生理盐水。疫苗序列基于添加来自SARS-CoV-2变体B.1.351(β，此处缩写为SA)的关键突变的B.1.1.7(α)毒株，详细信息见表7。以20μL剂量体积给予肌肉内注射(i.m.)。在第7、14、21和28天，采集血液以产生来自所有个体小鼠的血清样本。在免疫前进行预采血(Pre)，随机抽取5只小鼠进行采血。在第7、14、21和28天采集血液以生成所有个体小鼠的血清样本。对于免疫前预采血(Pre)，随机抽取5只小鼠进行采血。
表7:所用疫苗构建体的序列信息
下划线氨基酸改变表示在亲本α疫苗序列之上引入的那些
使用包括源自B.1.1.7或B.1.351变体的突变的蛋白对所有时间点进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。在第28天的研究结束时，使用基于VSV-SARS-CoV-2的假病毒中和测试对收集的血清样本进行中和抗体应答测试。
对于ELISA，在96孔板中测试血清样品，以评估S或RBD蛋白特异性抗体浓度，使用源自B.1.1.7或B.1.351病毒株的两种重组蛋白(Sino Biological；货号：40591-V08H12[S1(B.1.1.7)]；Sino Biological；货号：40592-V08H86[RBD(B.1.351)])。简而言之，将MaxiSorp板(Thermo Fisher)的每个孔用100ng重组蛋白或同种型对照包被。将板在4℃下孵育过夜。孵育后，用PBS+0.01％ Tween 20洗涤培养板三次(洗涤步骤)，并在37℃下用封闭缓冲液封闭1h。在洗涤步骤后，添加样品或抗体对照，并在37℃下再次孵育板1h。在将二抗添加至孔之前，再进行一次洗涤步骤。将辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗在37℃下孵育45min。在最后的洗涤步骤后，将TMB ONE(Biotrend Chemikalien GmbH)底物添加至孔中并在室温(RT)下孵育8min。如果孔中存在HRP偶联的抗体，则观察到从透明到蓝色的颜色变化，并通过添加25％硫酸(蓝色变为黄色)来终止反应。使用Epoch微孔板读数仪(450nm，参比620nm；BioTek)测量板的吸光度。
所有测试的构建体在所有不同时间点诱导特异性针对S1(B.1.1.7)(图8)和RBD(B.1.351)(图9)的IgG抗体，滴度在免疫后21天达到峰值。结果表明，在一个S蛋白序列(此处：α骨架)中包括多个变体突变原则上是适合疫苗接种的抗原。由于BNT162b2(α)是编码最接近评估的S1(B.1.1.7)重组蛋白的抗原的构建体，并用作骨架疫苗构建体，因此对理解用杂合构建体BNT162b2(α+SA)免疫是否会导致针对S1(B.1.1.7)的抗体滴度降低具有很高的意义。观察抗S1(B.1.1.7)IgG抗体测试的每时间点的单个数据点(图8)，与缓冲液对照相比，两种疫苗候选物都诱导了升高的滴度，BNT162b2(α+SA)诱导了针对B.1.1.7衍生的S1蛋白的较弱应答。与用BNT162b2(α)进行免疫相比，BNT162b2(α+SA)诱导了相似(在第7天)或较低的B.1.1.7S1特异性IgG滴度。聚焦于免疫组之间的显著差异(表8)，与BNT162b2(α)相比，BNT162b2(α+SA)在研究第14天和第28天引起的IgG滴度显著较低。结果表明，即使包括多个非α突变，杂合疫苗构建体仍然是很好的疫苗候选物，引发针对B.1.1.7(α)骨架病毒蛋白的结合抗体滴度。
表8:用编码P2 S构建体变体的不同mRNA疫苗候选物对Balb/c小鼠进行一次免疫后，抗S1(B.1.1.7)IgG抗体滴度的统计学显著性#总结
#显著性为****p<0.0001，***p≤0.001，**p≤0.01，*p≤0.05，ns＝不显著
观察抗RBD(B.1.351)IgG抗体测试的每时间点的单个数据点(图9)，与缓冲液对照相比，所有疫苗候选都诱导了明显升高的滴度。在本测定中，BNT162b2(α+SA)疫苗候选物最接近重组B.1.351变体RBD，并诱导针对抗原的最高应答(除了第28天)，结果表明，包括多个突变驱动向相应变体的免疫应答。与用BNT162b2(α)免疫相比，BNT162b2(α+SA)诱导相似或更高的IgG滴度。聚焦于免疫组之间的显著差异(表9)，与BNT162b2(α)相比，BNT162b2(α+SA)在研究第7天和第21天引发的滴度显著更高，表明当变体特异性突变包括在B.1.1.7(α)骨架中时，显示出明显有益的影响。结果显示，杂合疫苗构建体是很好的疫苗候选物，并且针对其他病毒株(此处为B.1.351特异性突变)实施的变体特异性突变导致免疫学益处。
表9:用编码P2 S构建体变体的不同mRNA疫苗候选物对Balb/c小鼠进行一次免疫后，抗RBD(B.1.351)IgG抗体滴度的统计学显著性#总结
#显著性为****p<0.0001，***p≤0.001，**p≤0.01，*p≤0.05，ns＝不显著
分析免疫后诱导抗体的中和功能，使用基于VSV/SARS-CoV-2的假病毒中和测试(pVNT)对免疫后28天采集的所有血液样本的血清进行测试。对于pVNT测定，将小鼠血清样本在96孔V型底板中一式两份连续稀释，并与限定数量的VSV/SARS-CoV-2假病毒颗粒一起孵育；用于假型化(pseudotyping)的S蛋白序列源自祖SARS-CoV-2Wuhan毒株(Wuhan)，B.1.1.7(α)变体(突变：Δ69/70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H)和B.1.351(β)变体(突变：L18F、D80A、D215G、Δ242–244、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V)。孵育后，为了使抗体与假病毒结合，将假病毒/血清稀释混合物添加至之前接种在96孔平底板中的Vero-76细胞中。在37℃和5％ CO2下，将板孵育16-24h。将不存在小鼠血清的假病毒与Vero-76细胞一起孵育作为阳性对照。将未用假病毒孵育的Vero-76细胞用作阴性对照。孵育后，去除上清液，用萤光素酶试剂(Promega)裂解细胞。在Plus微孔板读数仪(BMG Labtech)上记录发光，中和滴度按仍导致发光50％减少的最高血清稀释度的倒数计算。如果没有观察到中和，则报告为检测限(LOD)一半的任意滴度值。
所有用BNT162b2(α)和BNT162b2(α+SA)免疫的小鼠都显示出针对Wuhan假病毒的可检测的中和抗体滴度。然而，组几何平均50％假病毒中和抗体(pVN50)滴度相当低，从BNT162b2(α)免疫血清的48到BNT162b2(α+SA)免疫血清的24(图10A)。与Wuhan滴度相比，观察到针对α假病毒的pVN50滴度明显升高，特别是在来自用BNT162b2(α)免疫的动物血清样本中(图10B；几何平均滴度为182)，BNT162b2(α+SA)的几何平均滴度程度较低(几何平均滴度为43)。与Wuhan假病毒滴度相比，更高的α与以下事实相符，两种测试的疫苗候选物都编码作为抗原的α骨架衍生的刺突蛋白。与BNT162b2(α)相比，BNT162b2(α+SA)引发的α假病毒中和滴度较低，这可能是由于杂合疫苗在RBD中带有额外的“非α”突变[见表7；BNT162b2(α+SA)的K417N和E484K]，这可能引发针对B.1.1.7/α假病毒的较低效的中和抗体应答。最重要的是，在另一方面，与BNT162b2(α)疫苗相比，BNT162b2(α+SA)疫苗诱导了针对β假病毒的明显更高的pVN50滴度(图10C；组几何平均滴度为96与18)，表明实施的β变体特异性突变导致更多的β特异性抗体应答。
总之，在SARS-CoV-2P2 S疫苗构建体骨架中使用多种变体突变，会略微改变对与骨架中使用的氨基酸变化相对应的病毒抗原的免疫应答。
实施例4:包括基于B.1.1.7(α)背景最小变体突变的小鼠免疫原性研究
在第0天时，向三组5只雌性BALB/c小鼠注射一次1μg/动物的BNT162b2(α)、BNT162b2(α；L452R+E484Q)，或者单独的生理盐水。构建体的序列说明参见表10。以20μL剂量体积给予肌肉内注射(i.m.)。在第28天采集血液以产生来自所有个体小鼠的血清样本。
表10:所用疫苗构建体的序列信息
*参考源自SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1(GenBank MN908947.3)+K986P-V987P的BNT162b构建体的给定突变
为了了解各自免疫引发的病毒中和抗体应答，使用基于VSV/SARS-CoV-2的假病毒中和测试(pVNT)对血清样本进行检测。对于pVNT测定，将小鼠血清样本在96孔V型底板中一式两份连续稀释，并与限定数量的VSV/SARS-CoV-2假病毒颗粒一起孵育；用于假型化的S蛋白序列源自SARS-CoV-2B.1.1.7(α)变体(突变：Δ69/70、Δ144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H)、B.1.617.1(κ)变体(突变：L452R、E484Q、D614G、P681R)，或者B.1.617.2(δ)变体(突变：T19R、G142D、E156G、Δ157/158、K417N、L452R、T478K、D614G、P681R、D950N)。孵育后，为了使抗体与假病毒结合，将假病毒/血清稀释混合物添加至之前接种在96孔平底板中的Vero-76细胞中。在37℃和5％ CO2下，将板孵育16-24h。将不存在小鼠血清的假病毒与Vero-76细胞一起孵育作为阳性对照。将未用假病毒孵育的Vero-76细胞用作阴性对照。孵育后，去除上清液，用萤光素酶试剂(Promega)裂解细胞。在Plus微孔板读数仪(BMG Labtech)上记录发光，中和滴度按仍导致发光50％减少的最高血清稀释度的倒数计算。如果没有观察到中和，则报告为检测限(LOD)一半的任意滴度值。
用BNT162b2(α)或BNT162b2(α；L452R+E484Q)对小鼠进行免疫，诱导了针对α假病毒的大致相当的中和抗体滴度(几何平均pVN50滴度分别为291和221)。然而，值得注意的是，与BNT162b2(α)疫苗相比，编码α刺突抗原骨架以及额外的κ和δ变体突变L452R和E484Q的BNT162b2(α；L452R+E484Q)疫苗候选物倾向于诱导针对κ(几何平均滴度为192与110)和δ假病毒(几何平均滴度为127与84)的更高中和活性(图11)。
此外，通过进行多重分析，分析了用两种候选物疫苗接种后产生的抗体的结合能力。简言之，根据供应商的COVID-19血清学小鼠试剂盒通用方案进行多重测定，其采用夹心免疫测定技术(Meso Scale Diagnostics，LLC)。结合的鼠抗体可以用“Sulfo-Tag”偶联的二抗来检测。在最后步骤中使用多重读数仪器MESO QuickPlex SQ 120(Meso ScaleDiagnostics,LLC)，测量Sulfo-Tag发出的光。为了进行分析，多重测定包括表11中列出的重组蛋白。
表11:测定中包括的重组蛋白
*参考源自SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1(GenBank MN908947.3)+K986P-V987P的BNT162b构建体的给定突变
SARS-CoV-2 S(B.1.1.7)反映了同源测试系统，这意味着疫苗候选物骨架BNT162b2(α)与用于读出(read-out)的重组蛋白靶标相同，而用SARS-CoV-2 S(BA.1)重组蛋白的测试代表了异源测试系统。同样，SARS-CoV-2 S(BA.1+L452R)重组蛋白代表了异源测试系统，但其与BNT162b2(α；L452R+E484Q)疫苗候选物共有另一个相同的氨基酸。
对电化学发光(ECL)信号进行分析，所有用BNT162b2(α)或BNT162b2(α；L452R+E484Q)免疫的动物都产生了强烈的抗体结合滴度，与缓冲液对照组动物相比显著更高(图12，表12；使用单向ANOVA进行组平均值比较；Tukey多重比较检验)。用BNT162b2(α；L452R+E484Q)免疫导致针对所有测试抗原的更高滴度，但是包括L452R+E484Q突变诱导与SARS-CoV-2 S(BA.1+L452R)抗原结合的显著更高的抗体，所述抗原共有一个适用于抗体结合的相同的突变。值得注意的是，与作为骨架疫苗抗原的B.1.1.7S蛋白相比，针对BA.1S蛋白变体的抗体的结合总体上明显降低。
表12:Balb/c小鼠中一次免疫后，抗S IgG抗体滴度的统计学显著性#总结
#显著性为****p<0.0001，***p≤0.001，**p≤0.01，*p≤0.05，ns＝不显著
总之，结果表明，将病毒亚型中存在的突变包括于骨架构建体中，导致与相应病毒骨架相当的免疫原性疫苗构建体。包括对所含氨基酸的突变的抗原进行测试，表明抗体结合的轻微益处，支持这种定向抗原设计方法的可行性。

Claims (76)

1.一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定亲本SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)中的氨基酸位置，与一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置相比，所述氨基酸位置是修饰的；以及
b)提供包含所述亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中所述亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，或编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.权利要求1的方法，其包括重复步骤b)以提供两种或更多种修饰的氨基酸序列，或者两种或更多种编码两种或更多种修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.权利要求2的方法，其中所述两种或更多种修饰的氨基酸序列基于相同的亲本SARS-CoV-2S蛋白。
4.权利要求2或3的方法，其中所述两种或更多种修饰的氨基酸序列中的氨基酸修饰至少部分不同。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中提供核苷酸序列包括：
b')用其他密码子替代核苷酸序列的密码子，所述核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的突变的核苷酸序列，其中亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸。
6.权利要求5的方法，其包括重复步骤b')以提供两种或更多种突变的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码两种或更多种修饰的氨基酸序列。
7.权利要求6的方法，其中所述两种或更多种修饰的氨基酸序列基于相同的亲本SARS-CoV-2S蛋白。
8.权利要求6或7的方法，其中所述两种或更多种修饰的氨基酸序列中的氨基酸修饰至少部分不同。
9.一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)鉴定亲本SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)中的氨基酸位置，与一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置相比，所述氨基酸位置是修饰的；
b)用其他密码子替代第一核苷酸序列的密码子，所述第一核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的第一突变的核苷酸序列，其中亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
c)用其他密码子替代第二核苷酸序列的密码子，所述第二核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，以获得编码修饰的氨基酸序列的第二突变的核苷酸序列，其中亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与c)中的氨基酸修饰不同。
10.权利要求9的方法，其中第一核苷酸序列编码的氨基酸序列中包含的亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段与第二核苷酸序列编码的氨基酸序列中包含的亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段相同。
11.权利要求9或10的方法，其中第一核苷酸序列编码的氨基酸序列与第二核苷酸序列编码的氨基酸序列相同。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中第一核苷酸序列与第二核苷酸序列相同。
13.权利要求9-12中任一项的方法，其中第一突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中的一个或多个修饰的氨基酸位置与第二突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中的修饰的氨基酸位置不同。
14.权利要求9-13中任一项的方法，其中第一突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中修饰的氨基酸位置中的一个或多个氨基酸与第二突变的核苷酸序列编码的修饰的氨基酸序列中修饰的氨基酸位置中的一个或多个氨基酸互相不同。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白的N末端结构域(NTD)和/或受体结合结构域(RBD)的氨基酸序列。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列包含全长SARS-CoV-2S蛋白的氨基酸序列。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其还包括提供包含编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其还包括提供疫苗，其包含核酸，所述核酸包含编码修饰的氨基酸序列的核苷酸序列。
19.权利要求17或18的方法，其中所述核酸是RNA。
20.权利要求1-19中任一项的方法，所述方法是产生SARS-CoV-2疫苗的方法。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述疫苗是RNA疫苗。
22.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述疫苗具有降低的免疫逃逸的风险。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中一个或多个修饰的氨基酸位置位于SARS-CoV-2S蛋白的N末端结构域(NTD)和/或受体结合结构域(RBD)中。
24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置是一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的氨基酸序列与亲本SARS-CoV-2S蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸位置。
25.权利要求1-24中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置是一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的氨基酸序列与野生型SARS-CoV-2S蛋白的氨基酸序列不同的氨基酸位置。
26.权利要求1-25中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置是SARS-CoV-2的逃逸突变体的潜在位点。
27.权利要求26的方法，其中所述SARS-CoV-2的逃逸突变体是SARS-CoV-2的抗体逃逸突变体。
28.权利要求26或27的方法，其中所述SARS-CoV-2的逃逸突变体对针对SARS-CoV-2S蛋白的抗体的中和具有抗性。
29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述SARS-CoV-2的逃逸突变体的SARS-CoV-2S蛋白表现出降低的抗体结合。
30.权利要求27-29中任一项的方法，其中所述抗体用于治疗感染SARS-CoV-2的患者。
31.权利要求27-29中任一项的方法，其中所述抗体在已经用SARS-CoV-2疫苗治疗的患者中产生。
32.权利要求1-31中任一项的方法，其中与野生型SARS-CoV-2S蛋白相比，所述亲本SARS-CoV-2S蛋白是修饰的。
33.权利要求1-32中任一项的方法，其中在所述修饰的氨基酸序列中，与野生型SARS-CoV-2S蛋白相比是修饰的亲本SARS-CoV-2S蛋白中的氨基酸位置不是修饰的。
34.权利要求1-33中任一项的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2S蛋白是亲本SARS-CoV-2毒株的S蛋白。
35.权利要求34的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2毒株是天然分离株，或者所述亲本SARS-CoV-2毒株是天然分离株的突变体。
36.权利要求34或35的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2毒株是流行或迅速传播的SARS-CoV-2变体毒株。
37.权利要求34-36中任一项的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2毒株是关注的变体的SARS-CoV-2变体。
38.权利要求34-37中任一项的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2毒株为B.1.1.7。
39.权利要求1-38中任一项的方法，其中与野生型SARS-CoV-2S蛋白相比，一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体是修饰的。
40.权利要求1-39中任一项的方法，其中与亲本SARS-CoV-2S蛋白相比，一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体是修饰的。
41.权利要求1-40中任一项的方法，其中在所述修饰的氨基酸序列中，与野生型SARS-CoV-2S蛋白和/或亲本SARS-CoV-2S蛋白相比是修饰的一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体中的氨基酸位置是修饰的。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中所述一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体中的一种或多种是一种或多种SARS-CoV-2毒株的S蛋白。
43.权利要求42的方法，其中所述一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种是天然分离株，或者一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种是天然分离株的突变体。
44.权利要求42或43的方法，其中所述一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种是流行或迅速传播的SARS-CoV-2变体毒株。
45.权利要求42-44中任一项的方法，其中所述一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种是关注的变体的SARS-CoV-2变体毒株。
46.权利要求42-45中任一项的方法，其中所述一种或多种SARS-CoV-2毒株中的一种或多种选自B.1.351、B.1.1.298、B.1.427/B.1.429、B.1.526和P1。
47.权利要求42-46中任一项的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2毒株和一种或多种SARS-CoV-2毒株是流行或迅速传播的SARS-CoV-2变体毒株。
48.权利要求42-47中任一项的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2毒株和一种或多种SARS-CoV-2毒株是关注的变体的SARS-CoV-2变体毒株。
49.权利要求1-48中任一项的方法，其中与野生型SARS-CoV-2S蛋白相比，所述亲本SARS-CoV-2S蛋白和一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体是修饰的。
50.权利要求42-49中任一项的方法，其中所述亲本SARS-CoV-2毒株是B.1.1.7，并且所述一种或多种SARS-CoV-2毒株选自B.1.351、B.1.1.298、B.1.427/B.1.429、B.1.526和P1。
51.权利要求1-50中任一项的方法，其中所述一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体包含至少两种SARS-CoV-2毒株的SARS-CoV-2S蛋白变体。
52.权利要求9-51中任一项的方法，其中b)中的一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体与c)中的一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体不同。
53.权利要求9-52中任一项的方法，其中
b)中的一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体是B.1.427/B.1.429和B.1.526的SARS-CoV-2S蛋白变体，并且
c)中的一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体是B.1.351、P.1和B.1.1.298的SARS-CoV-2S蛋白变体。
54.权利要求1-53中任一项的方法，其中在所述修饰的氨基酸序列中，所述亲本SARS-CoV-2S蛋白中与野生型SARS-CoV-2S蛋白相比的氨基酸修饰不干扰所述修饰的氨基酸位置中的氨基酸修饰。
55.权利要求1-54中任一项的方法，其中在所述修饰的氨基酸序列中，所述亲本SARS-CoV-2S蛋白中与野生型SARS-CoV-2S蛋白相比的氨基酸修饰与所述修饰的氨基酸位置中的氨基酸修饰在空间距离上并不接近。
56.权利要求1-55中任一项的方法，其中在所述修饰的氨基酸序列中，所述修饰的氨基酸位置中的修饰不导致重大的结构重排。
57.权利要求1-56中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置中的氨基酸是表面暴露的。
58.权利要求1-57中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置包含至少两个氨基酸位置。
59.权利要求9-58中任一项的方法，其中b)和c)中的修饰的氨基酸位置各自包含至少两个氨基酸位置。
60.权利要求1-59中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置包含选自以下的两个或更多个：
18、20、26、80、138、144、190、215、246、253、417、439、452、453、477、484、501、570、701、716、
140、345、346、352、378、406、420、440、441、444、445、446、450、455、460、475、478、485、486、487、489、490、493、494、499、
142、145、146、147、150、152、154、156、157、158、164、247、248、249、250、251、252、254、255、258、365、369、370、374、376、384、405、408、415、421、443、447、448、456、472、473、476、496、498、500、504。
61.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置中的修饰包含选自以下的两个或更多个：
18F、20N、26S、80Y、138Y、144F、190S、215A、246I、253G、417N、439K、452R、453F、477N、484K、501Y、570D、701V、716I、
140L、345A、346K、352S、378N、406Q、420、440K、441F、444、445A、446V、450K、455F、460I、475V、478I、485V、486L、487D、489、490S、493L、494P、499H、142S、145H、146Y、147N、150R、152C、154Q、156A、157L、158G、164T、247G、248H、249S、250N、251S、252V、254F、255F、258L、365D、369C、370S、374L、376I、384L、405Y、408I、415N、421、443A、447V、448Y、456L、472V、473F、476S、496C、498H、500I、504D。
62.权利要求1-61中任一项的方法，其中所述修饰的氨基酸位置中的修饰包含选自以下的两个或更多个：
L18F、T20N、P26S、D80Y、D138Y、Y144F、R190S、D215A、R246I、D253G、K417N、N439K、L452R、Y453F、S477N、E484K、N501Y、A570D、A701V、T716I、
F140L、T345A、R346K、A352S、K378N、E406Q、D420、N440K、L441F、K444、V445A、G446V、N450K、L455F、N460I、A475V、T478I、G485V、F486L、N487D、Y489、F490S、Q493L、S494P、P499H、
G142S、Y145H、H146Y、K147N、K150R、W152C、E154Q、E156A、F157L、R158G、N164T、S247G、Y248H、L249S、T250N、P251S、G252V、S254F、S255F、W258L、Y365D、Y369C、N370S、F374L、T376I、P384L、D405Y、R408I、T415N、Y421、S443A、G447V、N448Y、F456L、I472V、Y473F、G476S、G496C、Q498H、T500I、G504D。
63.一种方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含第一核苷酸序列的核酸，所述第一核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中所述亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
b)提供包含第二核苷酸序列的核酸，所述第二核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中所述亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与a)中的氨基酸修饰不同。
64.权利要求63的方法，其中所述核酸是RNA。
65.一种医药制品，其包含：
a)核酸，其包含第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中所述亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸；以及
b)核酸，其包含第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列编码包含亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段的氨基酸序列，其中所述亲本SARS-CoV-2S蛋白的至少一个片段中的氨基酸位置被修饰为包含在一种或多种SARS-CoV-2S蛋白变体的相应氨基酸位置发现的氨基酸，
其中，b)中的氨基酸修饰至少部分与a)中的氨基酸修饰不同。
66.权利要求65的医药制品，其中所述核酸是RNA。
67.权利要求66的医药制品，其中所述RNA配制在脂质纳米颗粒(LNP)中。
68.权利要求65-67中任一项的医药制品，其是药物组合物。
69.权利要求65-67中任一项的医药制品，其是疫苗。
70.权利要求65-69中任一项的医药制品，其是试剂盒。
71.权利要求70的医药制品，其还包含用于针对SARS-CoV-2感染进行疫苗接种的医药制品使用说明。
72.权利要求65-71中任一项的医药制品，其用于制药用途。
73.权利要求72的医药制品，其中所述制药用途包括针对SARS-CoV-2感染进行疫苗接种。
74.一种在受试者中诱导针对SARS-CoV-2的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给药权利要求65-73中任一项的医药制品。
75.权利要求74的方法，所述方法是针对SARS-CoV-2感染的预防性治疗方法。
76.权利要求74或75的方法，所述方法是针对SARS-CoV-2感染的疫苗接种方法。
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