KR20220025195A - Rna의 안정화를 위한 3' utr 서열 - Google Patents

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슈테파니 페써
브리타 발라짜
팀 바이쎄르트
안드레아스 쿤
우구르 사힌
마르코 알렉산더 폴레가노프
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비온테크 에스이
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Abstract

본 발명은 RNA, 특히 mRNA의 안정화 및 mRNA 번역의 증가에 관한 것이다. 본 발명은 특히 증가된 전사 안정성 및/또는 번역 효율을 결과시키는 변형된 RNA, 특히 시험관내-전사된 RNA에 관한 것이다. 본 발명에 따라, RNA 분자의 3'-미번역 영역 (UTR) 내의 특정 서열들이 안정성 및 번역 효율을 개선시킨다는 것이 입증되었다.

Description

RNA의 안정화를 위한 3' UTR 서열{3' UTR SEQUENCES FOR STABILIZATION OF RNA}
RNA의 사용은 DNA의 치료 용도와 결부된 잠재적인 안전상의 위험성을 우회하는데 있어, DNA의 매력적인 대안책이 된다. 시험관내-전사된 RNA (IVT-RNA: in vitro-전사된 RNA)는 치료적 접근에 있어 특히 흥미롭다. RNA의 치료 용도에 있어서의 장점으로 일시적(transient) 발현 및 비-형질전환 특성을 들 수 있다. RNA는 발현을 위해 핵 내로 진입할 필요도 없을 뿐 아니라 숙주 게놈 내로 통합할 수 없기 때문에, 발암 위험성이 제거된다. 백신 접종에 사용될 경우, RNA의 주입은 세포성 및 체액성 면역 반응을 생체내(in vivo)에서 이끌어낼 수 있다. 그러나, 임상 용도에서의 RNA의 사용은 특히 RNA의 짧은 반감기로 인해 크게 제약을 받고 있는 실정이다.
IVT 벡터는 시험관내 전사에 있어 주형(template)으로서 표준화된 방식으로 사용될 수 있다. 이러한 IVT 벡터는 다음 구조를 가질 수 있다: RNA 전사를 가능케 하는 5' RNA 폴리머라제 프로모터, 이어서 미번역 영역들(UTR: untranslated regions)에 의해, 3' 및/또는 5'에 의해 플랭킹된 목적 유전자, 및 A 뉴클레오타이드를 함유하는 3' 폴리아데닐 카세트. 시험관내 전사에 앞서, 원형 플라스미드 는 플라스미드 II형 제한 효소들 (인식 서열은 절단 부위에 대응함)에 의해 폴리아데닐 카세트의 하류에서 선형화된다. 따라서 폴리아데닐 카세트는 전사체 내에서 나중에 폴리(A) 서열에 대응한다.
인간의 미성숙 수지상 세포들(hiDCs)은 암 치료를 위한 면역요법의 개발 및 향상에 광범하게 이용되고 있다. 특정한 종양 항원(TA)를 인코딩하는 시험관내 전사된 (IVT)-mRNA가 로딩된, hiDCs는 효과적인 항-종양 반응을 유도할 수 있다. 그러나, RNA-기반 암 백신을 이용하는 효과적인 면역 반응의 선결 조건은 RNA의 높은 안정성 및 번역 효율이다. 이들 두 가지 모두 5' 및 3' 미번역 영역들 (UTRs) 뿐만 아니라, 5'-CAP, 3' 폴리(A)-테일의 구조적 변형에 의해 개선될 수 있다. UTRs 내의 서열 멤버들은 번역 효율(주로 5'-UTR) 및 RNA 안정성 (주로 3'-UTR)에 영향을 미친다.
이전 연구에서 본 발명자들은 인간 베타-글로빈 3'-UTR (현재 2hBg라 칭해짐; 이전에는 2βgUTR이라고도 칭해짐)의 2개의 연속된 카피들이 보다 높은 전사 안정성 및 번역 효율에 기여한다는 것을 입증한 바 있다 (Holtkamp (2006) Blood 108:4009-4017). 그러나, RNA의 시험관내 전사시 궁극적으로 주형으로서 사용되는 플라스미드 DNA 내에 인간 베타-글로빈 3'-UTR 서열의 동일한 카피가 2개 존재한다는 것은 대장균에서의 그의 증식이 일어나는 동안 재조합 위험성을 일으킨다. 마찬가지 이유로, 클로닝 접근법, 특히 PCR-기반 증폭이 매우 어렵다. 이것은 시험관내 전사를 위한 주형으로 사용될 3'-말단에서 2hBg를 갖는 RNA-인코딩 영역의 PCR-기반 증폭의 경우에도 사실인데, 여기서 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 하나의 카피의 생략으로 이어지는, 미스프라이밍이 관찰된 바 있기 때문이다. 이러한 문제점들을 피하기 위해 본 발명자들은 시험관내 전사된 mRNA를 안정화하는 효과를 갖되 2hBg 서열와 적어도 유사한, 이상적으로는 2hBg 서열보다 더 나은 신규한 서열들을 동정하는 노력을 하였다.
본 발명의 목적은 안정성 및/또는 번역 효율이 증가된 RNA 및 이러한 RNA를 얻기 위한 수단을 제공하는 것이다. 상기 RNA를 치료에 이용함으로써 증가된 발현도를 얻을 수 있을 것이다.
이러한 목적은 청구범위에 기재된 본 발명에 따라 달성된다.
본 발명은 RNA, 특히 mRNA의 안정화, 및 mRNA 번역의 증가에 관한 것이다. 본 발명은 특히 전사 안정성 및/또는 번역 효율의 증가를 일으키는, RNA, 특히 시험관내-전사된 RNA의 변형에 관한 것이다
본 발명에 따라, RNA 분자의 3'-미번역 영역 (UTR)의 어떤 서열들이 안정성 및 번역 효율을 향상시키는 것으로 입증되었다.
수지상 세포 (DCs)의 형질감염(transfection)에 본 발명에 따라 변형된 RNA를 이용하면, 예컨대 형질감염된 세포 상의 항원-특이적 펩타이드/MHC 복합체의 밀도를 증가시키고 항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극 및 확장하는 이들의 능력을 증가시키는 것이 가능하다. 본 발명은 따라서 일 구체예에서, 본 발명에 따라 설명된 RNA 변형에 의해 변형된 RNA를 이용함으로써 DC 또는 RNA-형질감염된 DC 백신들을 형질감염시키기 위한 RNA 백신들의 최적화 전략에 관한 것이다.
본 발명에 따라, RNA의 변형, 및 그에 따른 안정화 및/또는 번역 효율 증가는 좋기로는 시험관내 RNA 전사의 주형 역할을 하는 발현 벡터들을 유전자 변형시킴으로써 달성된다. 이들 발현 벡터들은 본 발명에 따라 설명된 3'-미번역 영역을 갖는 RNA 및 좋기로는 펩타이드 또는 단백질 (오픈 리딩 프레임)을 코딩하는 서열과 폴리(A) 서열 사이의 영역을 갖는 RNA의 전사를 가능케한다.
이 벡터들은 또한 폴리(A) 서열을 갖는 RNA의 전사도 가능케 하는데 이는 좋기로는 상기 RNA 내에 개방 말단(open end)을 가지며, 즉, 그의 3' 말단에 상기 폴리(A) 서열에 플랭킹하는 A 뉴클레오타이드들 외에 다른 뉴클레오타이드들은 없음을 의미한다. RNA 내 개방-말단형 폴리(A) 서열은 5' RNA 폴리머라제 프로모터의 조절 하에 RNA를 전사시키고 폴리아데닐 카세트를 함유하며, 이 때 인식 서열은 상기 폴리아데닐 카세트의 3'에 위치하되 절단 부위가 상류에 위치함으로 해서 폴리아데닐 카세트 내에 위치하는 발현 벡터 내로 IIS형 제한효소 절단 부위를 도입함으로써 달성가능하다. IIS형 제한효소 절단 부위에서의 제한효소 절단은 폴리아데닐 카세트 내에서 플라스미드가 선형화하는 것을 가능케 한다. 선형화된 플라스미드는 이어서 시험관내 전사를 위한 주형으로서 사용가능하고, 결과적인 전사체는 마스크되지 않은 폴리(A) 서열로 종결된다. 또한, 4개의 뉴클레오타이드들 (링커)이 균등하게 분포하는 무작위 뉴클레오타이드 서열에 의한 3' 폴리아데닐 카세트의 임의적 파괴는 대장균 내에서의 3' 폴리아데닐 카세트의 안정성을 증가시킨다.
발명의 개요
일 측면에서, 본 발명은 5'→ 3'의 전사 방향으로 다음을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다;
(a) 프로모터;
(b) 전사가능한 핵산 서열 또는 전사가능한 핵산 서열을 도입하기 위한 핵산 서열; 및
(c) 상기 프로모터 (a)의 조절 하에 전사될 경우, 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 3'-미번역 영역을 전사체 내에 코딩하는 핵산 서열:
(c-1) FCGRT의 3'-미번역 영역의 핵산 서열 FCGRT, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-2) LSP1의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-3) CCL22의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-5) PLD3의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-7) HLA-DRB4의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
및
(c-8) 상기 (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) 및 (c-7) 하의 2개 이상의 핵산 서열들, 단편 및/또는 변이체들의 조합.
일 구체예에서, 핵산 서열 (b) 및 (c)는 프로모터 (a)의 조절 하에 전사되어 공통 전사체(common transcript)가 될 수 있는데, 상기 공통 전사체에서는 핵산 서열 (c)로부터 전사된 핵산 서열이 활성화되어, 전사가능한 핵산 서열 (b)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시킨다.
일 구체예에서, 핵산 서열 (b) 및 (c)는 자연적으로 링크되지 않는다.
일 구체예에서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NOs: 86 내지 89, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로부터 선택된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NO: 86의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NOs: 105 내지 121로부터 선택된 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NO: 115의, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 핵산 서열 (c-8)은 (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) 및 (c-7)의 동일 또는 상이한 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 2종 이상의 조합을 포함한다. 다양한 구체예에서, 핵산 서열 (c-8)은 (c-1) 및 (c-2), (c-1) 및 (c-3), (c-1) 및 (c-4), (c-1) 및 (c-5), (c-1) 및 (c-6), (c-1) 및 (c-7), (c-2) 및 (c-3), (c-2) 및 (c-4), (c-2) 및 (c-5), (c-2) 및 (c-6), (c-2) 및 (c-7), (c-3) 및 (c-4), (c-3) 및 (c-5), (c-3) 및 (c-6), (c-3) 및 (c-7), (c-4) 및 (c-5), (c-4) 및 (c-6), (c-4) 및 (c-7), (c-5) 및 (c-6), (c-5) 및 (c-7), 또는 (c-6) 및 (c-7)의 조합을 포함한다.
일 구체예에서, 핵산 서열 (c-8)은 (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체 및, (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체의 조합을 포함한다. 일 구체예에서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체의 5'에 위치한다. 일 구체예에서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체, 및 (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체의 조합은 SEQ ID NO: 174의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 프로모터 (a)의 조절 하에 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (d)를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 폴리아데닐 서열은 적어도 20 A 뉴클레오타이드들, 좋기로는 적어도 40, 적어도 80, 적어도 100 또는 적어도 120 A 뉴클레오타이드들, 좋기로는 연속적인 A 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열은, 2 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열, 좋기로는 임의(arbitrary) 서열로서, 이 때 상기 2 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열의 첫번째 뉴클레오타이드와 마지막 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드이다. 일 구체예에서, 상기 핵산 서열 (d)는: 프로모터 (a) 조절 하에 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하고, 상기 핵산 서열 (d) 대신 핵산 서열 (d)'을 포함하는 핵산 분자에 비해 대장균 내에서 상기 핵산 분자의 전파(propagation)시 더 높은 안정성을 나타내는 핵산 서열이다 (여기서 상기 핵산 서열 (d)'은 프로모터 (a)의 조절 하에 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열과 동일한 길이의 폴리아데닐 서열을 코딩하는 것임). 일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열은 적어도 80 뉴클레오타이드들, 좋기로는 적어도 90 또는 100 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열은 적어도 90 뉴클레오타이드들, 좋기로는 적어도 100 뉴클레오타이드들, 좋기로는 적어도 110 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열은 약 120 뉴클레오타이드들을 포함한다. 특정 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열은 최대 200, 좋기로는 최대 150, 및 특히 좋기로는 최대 130개의 뉴클레오타이드들을 포함한다. 일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열의 뉴클레오타이드들의 적어도 90%, 좋기로는 적어도 92%, 좋기로는 적어도 95%, 97% 또는 98%는 상기 폴리아데닐 서열 내의 A 뉴클레오타이드들이다 (A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열 내의 A 뉴클레오타이드들은 포함하지 않음).
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열은 상기 폴리아데닐 서열의 위치 21 내지 위치 80, 좋기로는 위치 21 내지 위치 60, 더욱 좋기로는 위치 31 내지 위치 50의 영역 내에 위치한다.
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열 앞에는 상기 폴리아데닐 서열 내 적어도 20 A 잔기들, 좋기로는 적어도 30, 40 또는 50 A 잔기들이 선행한다. 특정 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열 앞에는 상기 폴리아데닐 서열 내 최대 80 A 잔기들, 좋기로는 최대 70 또는 60 A 잔기들이 선행한다.
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열 뒤에는 상기 폴리아데닐 서열 내 적어도 20 A 잔기들, 좋기로는 적어도 30, 40, 50, 60 또는 70 A 잔기들이 후행한다. 특정 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열 뒤에는 상기 폴리아데닐 서열 내 최대 100 A 잔기들, 좋기로는 최대 80 A 잔기들이 후행한다.
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열 앞에는 상기 폴리아데닐 서열 내 20 내지 50, 좋기로는 30 내지 40 A 잔기들이 선행하고 그 뒤에는 상기 폴리아데닐 서열 내 30 내지 80, 좋기로는 40 내지 70 A 잔기들이 후행하는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열의 길이는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 8, 좋기로는 적어도 10, 더욱 좋기로는 적어도 15 뉴클레오타이드들인 것이 좋다.
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열의 길이는 50 이하, 좋기로는 30 이하, 더욱 좋기로는 20 이하의 뉴클레오타이드들인 것이 좋다.
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열은 연속 A 잔기들을 3개 이하, 좋기로는 2개 이하로 포함하는 것이 좋고, 바람직하게는 포함하지 않는 것이 좋다.
일 구체예에서, 핵산 서열 (b), (c) 및 (d)는 프로모터 (a)의 조절 하에 전사되어 공통 전사체를 생성할 수 있다. 일 구체예에서, 핵산 서열 (c) 및 임의로 (d)로부터 전사된 핵산 서열들은 전사가능한 핵산 서열 (b)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키도록 활성적이다.
일 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 전사체 내 상기 핵산 서열은 3' 말단에 위치한다.
일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 DNA 분자이다. 일 구체예에서, 상기 핵산 분자는 IVT 벡터와 같은 발현 벡터 또는 플라스미드이다.
일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 폐쇄형 원형 분자 또는 선형 분자이다.
일 구체예에서, 전사가능한 핵산 서열은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며 전사가능한 핵산 서열을 도입하기 위한 핵산 서열은 복수개의 클로닝 사이트이다.
일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는: (i) 리포터 유전자; (ii) 선별가능한 마커; 및 (iii) 복제 원점으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 멤버를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 특히 선형화된 후, RNA, 특히 mRNA의 시험관내 전사에 적합하다.
시험관내 전사에 앞서서, 원형 IVT 벡터들은 일반적으로 II형 제한 효소들에 의해 폴리아데닐 카세트의 하류에서 선형화된다 (인식 서열은 절단 사이트에 대응함). 따라서 폴리아데닐 카세트는 전사체 내의 후(later) 폴리(A) 서열에 대응한다. 이 공정의 결과로서, 일부 뉴클레오타이드들은 선형화 후 효소 절단 사이트의 일부로서 잔류하여 3' 말단에서 폴리(A) 서열을 확장 또는 마스킹한다. 그러나, 개방-말단형 폴리(A) 서열을 갖는 RNA가, 말단이 마스킹된 폴리(A) 서열을 갖는 RNA에 비해 더 효율적으로 번역된다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 핵산 분자들은 발현 벡터들로서 사용될 경우, 폴리(A) 서열을 갖는 RNA의 전사를 허용하며, 여기서 상기 RNA는 개방형 말단을 갖는다. 즉 그의 3' 말단에서 A 뉴클레오타이드를 제외하고는 어떠한 뉴클레오타이드들도 상기 폴리(A) 서열에 인접(flanking: 플랭킹)하지 않는다. RNA 내 개방-말단형 폴리(A) 서열은 5' RNA 폴리머라제 프로모터의 조절 하에 RNA의 전사를 허용하고, 폴리아데닐 카세트 (여기서, 인식 서열은 폴리아데닐 카세트의 하류에 위치하는 반면, 절단 사이트는 상류에 위치함으로 해서 폴리아데닐 카세트 내에 존재함)를 함유하는 발현 벡터 내로 IIS형 제한효소 절단 사이트를 도입함으로써 획득가능하다. IIS형 제한효소 절단 사이트에서의 제한효소 절단은 플라스미드로 하여금 폴리아데닐 카세트 내에서 선형화하는 것을 가능케 한다. 선형화된 플라스미드 이어서 시험관내 전사의 주형으로 사용가능하며, 결과적인 전사체는 마스킹되지 않은 폴리(A) 서열로 종결된다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 좋기로는 효소적으로 또는 그 밖의 생화학적 방식으로, 핵산 서열 (d) 내에서 절단되되, 상기 절단이 5'→ 3' 전사 방향으로 프로모터 (a), 핵산 서열 (b) 및 (c), 및 핵산 서열 (d)의 적어도 일부를 포함하는 핵산 분자를 결과시키는 것이 바람직하며, 여기서, 핵산 서열 (d)의 적어도 일부는, 프로모터 (a) 조절 하에 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열을 코딩하고, 여기서 전사체 내 3'-말단 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열의 A 뉴클레오타이드이다.
좋기로는, 절단 후, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열에 대해 주형 역할을 하는 스트랜드 말단에서, 핵산 분자는 A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열에 대해 주형 역할을산 서열의 일부인 T 뉴클레오타이드를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 분자는 좋기로는 절단 전에는 폐쇄형 원형 분자이고 절단 후에는 선형 분자이다.
좋기로는, 절단은 IIS형 제한효소 엔도뉴클리아제에 대한 제한효소 절단 사이트인 제한효소 절단 사이트의 도움을 받아 수행된다.
일 구체예에서, IIS형 제한효소 엔도뉴클리아제에 대한 인식 서열은 핵산 서열 (d)의 5-26 염기쌍, 좋기로는 24-26 염기쌍 하류에 위치하는 것이 좋다.
일 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 폐쇄된 원형 배치를 가지며 특히 선형화 후에 RNA, 특히 mRNA의 시험관내 전사에 적합한 것이 좋다.
추가 측면에서, 본 발명은 전술한 핵산 분자의 선형화에 의해, 좋기로는 핵산 서열 (d) 내의 절단에 의해 수득가능한 핵산 분자, 및 프로모터 (a)의 조절 하에 전술한 핵산 분자를 이용하여 전사, 좋기로는 시험관내 전사에 의해 수득가능한 RNA에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 일 측면에서 5'→ 3' 방향으로 다음을 포함하는 RNA에 관한 것이다:
(a) 5'-미번역 영역;
(b) 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산; 및
(c) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 3'-미번역 영역:
(c-1) FCGRT의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-2) LSP1의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-3) CCL223의 '-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-5) PLD3의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(c-7) HLA-DRB4의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
및
(c-8) (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) 및 (c-7)에 기재된 2 이상의 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 조합.
일 구체예에서, 핵산 서열 (b) 및 (c)는 자연적으로 링크되어 있지 않다.
일 구체예에서, RNA는 A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열 (d)를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 상기 핵산 서열 (d)는 상기 RNA의 3' 말단에 위치한다.
일 구체예에서, 핵산 서열 (c) 및 임의로 (d)는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적이다.
일 구체예에서, RNA는 추가로 (e) 5' Cap을 포함한다.
A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열 및 3'-미번역 영역의 구체예는 본 발명의 핵산 분자들에 대해 전술한 바와 같다.
추가 측면에서, 본 발명은 다음, 즉:
(i) 본 발명의 핵산 분자를 제공하는 단계, 및
(ii) 주형으로서 상기 핵산 분자를 이용하여 RNA를 전사하는 단계
를 포함하는, RNA의 수득 방법에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 다음, 즉:
(i) 본 발명의 RNA 수득 방법에 따라 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA를 수득하는 단계, 및
(ii) RNA를 번역하는 단계
를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 수득 방법에 관한 것이다.
일 구체예에서, RNA 수득 방법 또는 펩타이드 또는 단백질 수득 방법은 핵산 분자의 전사 단계에 앞서, 핵산 분자의 절단 단계를 추가로 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 다음, 즉:
(i) 전사될 경우, 3'-미번역 영역을 코딩하는 핵산 서열 (b)를 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 전사가능한 핵산 서열 (a)의 3' 말단에 커플링하는 단계, 및
(ii) 수득된 핵산을 전사하는 단계
를 포함하는 RNA의 수득 방법에 관한 것으로서,
여기서 상기 3'-미번역 영역은 다음으로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다:
(b-1) FCGRT의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(b-2) LSP1의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(b-3) CCL22의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(b-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(b-5) PLD3의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(b-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
(b-7) HLA-DRB4의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
및
(b-8) (b-1), (b-2), (b-3), (b-4), (b-5), (b-6) 및 (b-7)에 기재된 2 이상의 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 조합.
일 구체예에서, 핵산 서열 (a) 및 (b)는 전사되어 공통 전사체를 형성할 수 있으며, 여기서 핵산 서열 (b)로부터 전사된 핵산 서열은 전사가능한 핵산 서열 (a)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적이다.
일 구체예에서, 핵산 서열 (a) 및 (b)는 자연적으로 링크되지 않는다.
일 구체예에서, 이 방법은 전사될 경우 A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (c)를, 핵산 서열 (b)의 3' 말단에 커플링하는 것을 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 핵산 서열 (a), (b), 및 (c)가 전사되어, 핵산 서열 (b) 및 임의로, (c)로부터 전사된 핵산 서열이 전사가능한 핵산 서열 (a)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적인 것인, 공통 전사체를 생성할 수 있다.
A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열 및 3'-미번역 영역의 구체예들은 본 발명의 핵산 분자들에 대해 전술한 바와 같다.
추가 측면에서, 본 발명은:
(i) 본 발명의 RNA의 수득 방법베 의해 RNA를 수득하는 단계, 및
(ii) RNA를 번역하는 단계
를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 수득 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 시험관내 또는 생체내에서 수행가능하다. 본 발명의 방법의 일 구체예에서, 전사는 시험관내에서 수행된다.
일 구체예에서, RNA의 수득 방법 또는 펩타이드 또는 단백질의 수득 방법은 핵산 분자의 전사에 앞서, 핵산 분자의 절단을 추가로 포함한다.
일 구체예에서, 절단은 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열 내에 존재하되, 이러한 방식으로 수득된 핵산의 전사에 의해, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열을 그의 3'-말단에 갖는 전사체가 생성되도록 절단이 존재하고, 여기서 상기 전사체의 3'-말단 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열의 A 뉴클레오타이드인 것이다.
본 발명에 따른 방법들의 모든 측면에서, 절단은 좋기로는 IIS형 제한효소 엔도뉴클리아제의 좋기로는 제한효소 절단 사이트인 제한효소 절단 사이트의 도움 하에 수행되는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, IIS형 제한효소 엔도뉴클리아제에 대한 인식 서열은, 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열의 3' 말단의 하류의 5-26 염기쌍, 좋기로는 24-26 염기쌍이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 RNA 수득 방법에 의해 수득가능한 RNA에 관한 것이기도 하다.
본 발명은 예컨대 세포에서의 전사 및 발현시 재조합 단백질의 발현을 증가시키는데 이용될 수 있다. 보다 구체적으로, 재조합 단백질 생산시, 세포-기반 시스템에서 재조합 핵산의 전사 및 재조합 단백질의 발현을 위해 본 발명의 발현 벡터들을 이용할 수 있다. 이것은 예컨대, 재조합 항체, 호르몬, 시토카인, 효소 등의 제조를 포함한다. 이에 의해 무엇보다 제조 단가가 저감될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자들은 유전자 치료법 용도로 사용할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 핵산 분자는 유전자 치료용 벡터일 수 있고 형질도입 유전자(transgene)의 발현에 사용될 수도 있다. 이를 위해, 여하한 핵산 (DNA/RNA)-기반 벡터 시스템 (예를 들어 플라스미드, 아데노바이러스, 폭스바이러스 벡터, 인플루엔자 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등)을 사용할 수 있다. 이들 벡터들을 이용하여 세포들을 예컨대 림프구나 수지상 세포 내와 같은 시험관내 형질감염시키거나 또는 직접 투여에 의해 달리 생체내 투여할 수 있다.
본 발명의 RNA (예컨대, 전사 주형으로서 전술한 핵산 분자를 이용하여 수득된 것)는 예컨대, 세포내로 시험관내 형질감염되거나 또는 직접 생체내로 투여되는 RNA-기반 백신들의 가능한 응용 분야에서의 일시적 유전자 발현, 예컨대 세포내 분화 프로세스 개시 또는 단백질의 기능 연구를 위한, 기능성 재조합 단백질의 시험관내 일시적 발현, 및 에리쓰로포이에틴, 호르몬, 응집 저해제 등과 같은 기능성 재조합 단백질의 생체내 일시적 발현을 위해, 특히 의약으로서 사용가능하다.
본 발명의 RNA는 특히 항원-제시 세포를 형질감염하는데 사용가능하고, 따라서 제시하고자 하는 항원의 전달 및 항원-제시 세포의 로딩을 위한 도구로서 사용가능하며, 여기서 상기 제시하고자 하는 항원은 특히 절단과 같은 세포내 프로세싱 수단에 의해 상기 RNA로부터 발현된 펩타이드 또는 단백질에 대응하며, 즉, 제시하고자 하는 항원은 예컨대 RNA로부터 발현된 펩타이드 또는 단백질의 단편이다. 이러한 항원-제시 세포는 T 세포, 특히 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 자극하는데 이용될 수 있다
따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 숙주 세포를 형질감염시키기 위한 본 발명의 RNA의 용도에 관한 것이다. 일 구체예에서, 숙주 세포는 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구 또는 대식세포이다.
추가 측면에서, 본 발명은 치료법, 특히 백신 접종을 위한 본 발명의 RNA의 용도에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 RNA를 포함하는 백신 조성물과 같은 의약 조성물에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 전술한 용도를 위한 본 발명의 RNA에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
비록 본 발명을 하기에서 자세하게 설명할 것이나, 본 발명이 본 명세서에 기술된 변화 가능한 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 한정되는 것으로 이해되어서는 아니된다. 또한 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 구체적인 예를 설명하기 위함일 뿐이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 모든 사용된 기술 및 과학 용어는 당업계의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다.
이하, 본 발명의 구성요소에 대하여 설명한다. 이들 요소는 특정 구체적인 예와 함께 열거되지만, 추가 구체적인 예를 생성하기 위해 임의의 방식 및 임의의 수로 조합될 수 있다고 이해되어야 한다. 다양하게 기술된 구체적인 예들 및 바람직한 구체적인 예들은 본 발명을 명시적으로 설명된 구체적인 예들로만 제한 해석하지 않는다. 이 설명은 본 명세서에 개시된 및/또는 바람직한 요소들과 명시적으로 설명된 예를 결합한 구체적인 예를 뒷받침 및 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 나아가, 본 명세서에 기술된 모든 요소의 순열 및 조합은 문맥상 달리 나타내지 않는 한 본 출원의 명세서에 의해 개시되는 것으로 고려되어야 한다. 예컨대, 바람직한 일 구체예에서 A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열에 앞서 상기 폴리아데닐 서열 내 20 A 잔기들이 선행하고, 바람직한 또 다른 구체예에서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열 다음에 상기 폴리아데닐 서열 내 20 A 잔기들이 후행한다면, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열이 상기 폴리아데닐 서열 내 적어도 20 A 잔기들에 의해 선행 및 후행되는 바람직한 구체예인 것으로 간주된다.
좋기로는, 본 발명에서 사용된 용어는 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)"(H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kolbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, 1995)에 설명된 바에 의하여 정의된다.
본 발명의 실시는 달리 명시하지 않는 한, 당 분야의 문헌에서 설명되는 화학, 생화학, 세포 생물학, 면역학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법을 사용한다 (예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
후술하는 본 발명의 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다 (comprise)" 및 이의 파생어 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는 (comprising)"의 표현은 언급된 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 암시하지만, 그렇다고 그 밖의 다른 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹을 배제하는 것을 암시하는 것으로 이해되어서는 아니되며, 다만, 발명 대상이 언급된 요소, 정수 또는 단계 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것으로 이루어진(consists in) 경우에는 몇몇 구체적인 예에서, 이러한 다른 요소, 정수, 단계 또는 요소, 정수 또는 단계들의 그룹이 배제될 수도 있다. 본 발명을 기술하는 맥락에서 (특히 청구항의 측면에서) 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 참조는, 본 명세서에서 달리 요구되지 않거나 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 값들을 범위로 나타낸 것은 그 범위 내의 각각의 개별적인 값들을 일일이 열거하는 대신 이를 간결히 나타내기 위함이다. 본 명세서에서 다른 언급이 없는 한, 각 개별적인 값은 명세서에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 부합된다. 본 명세서에 설명된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 지시되지 않거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적 언어 (예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 발명을 더 잘 설명하기 위함이고 달리 청구된 본 발명의 범위를 제한하려고 하는 것이 아니다. 본 명세서의 어떠한 표현도 청구되지 않는 요소를 본 발명을 실시하는데 필수적인 것으로 가리키는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명은 RNA에 대해 안정화 효과 및/또는 RNA의 번역 효율 증가 효과를 갖는 RNA 내 변형된 3' 미번역 영역들 (UTRs)을 인코딩하는 핵산 서열들을 포함하는 RNA 발현 벡터들로서 유용한 DNA 플라스미드와 같은 핵산 분자를 설명한다.
"전사될 경우, 전사체 내 3'-미번역 영역을 코딩하는 핵산 서열"이라는 용어는 상기 3'-미번역 영역을 코딩하는 주형 스트랜드를 함유하는 핵산 서열과 관계가 있다. 좋기로는, 상기 핵산 서열은 생성된 RNA 전사체의 상기 3'-미번역 영역과 동일한 핵산 서열을 포함하는 코딩 스트랜드를 포함하는 것이 바람직하다 (비록 우라실 대신 티민으로 대체되어 있지만). 그러므로, 본 발명에 따라 일 구체예에서 "전사될 경우, 전사체내 3'-미번역 영역을 코딩하는 핵산 서열"은 본 명세서에 특정된 바와 같은 3'-미번역 영역을 포함하는 코딩 스트랜드를 포함한다 (비록 우라실 대신 티민으로 대체되어 있지만).
용어 "FCGRT"는 수용체, 트랜스포터, 알파, IgG의 Fc 단편에 관한 것으로서 FCGRT 유전자를 포함한다. 이 유전자는 모노머형 면역글로불린 G의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 태반을 통해 모체로부터 태아에게 면역글로불린 G 항체를 전달한다. 이 단백질은 또한 면역글로불린 G에 결합되어 항체가 분해되지 않도록 보호해준다.
"FCGRT의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체"라는 용어는 서열목록의 SEQ ID NOs: 1 내지 50로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 좋기로는 이들 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 1 내지 50로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 27의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
"LSP1"라는 용어는 림프구-특이적 단백질 1(Lymphocyte-Specific Protein 1)에 관한 것으로 LSP1 유전자를 포함한다. 이 유전자는 세포내 F-액틴 결합 단백질을 인코딩한다. 이 단백질은 림프구, 호중구, 대식세포 및 내피세포에서 발현되며 호중구 운동성, 피브리노겐 매트릭스 단백질에의 부착 및 경혈맥 이동을 조절할 수 있다.
"LSP1의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체"라는 용어는 서열목록의 SEQ ID NOs: 51 내지 72로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 좋기로는 이들 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 51 내지 72로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 52의 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 52의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
용어 "CCL22"는 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 22에 관한 것으로서 CCL22 유전자가 이에 포함된다. 이 유전자의 산물은 케모카인 수용체 CCR4에 결합한다. 이 케모카인은 활성화된 T 림프구를 염증성 사이트로 트래피킹하는 역할 및 활성화된 T 림프구 생리학의 다른 측면에 있어 일정 역할을 할 수 있다.
"CCL22의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체"라는 용어는 서열목록의 SEQ ID NOs: 73 내지 85로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 좋기로는 이들 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 73 내지 85로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 79의 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 79의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
용어 "AES"는 균열의 아미노-말단 인핸서(Amino-Terminal Enhancer Of Split)에 관한 것으로서 AES 유전자가 이에 포함된다. 이 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 단백질 그룹/TLE 패밀리에 속하며 다른 패밀리 멤버와 함께 호모올리고머 또는 헤테로올리고머로서 기능하여 다른 패밀리 멤버 유전자의 발현을 지배적으로 억제할 수 있다.
"AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체"라는 용어는 서열목록의 SEQ ID NOs: 86 내지 89로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 좋기로는 이들 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 86 내지 89로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 86의 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 86의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 86의 위치 1 내지 68, 위치 1 내지 102, 위치 35 내지 102, 위치 35 내지 136, 또는 위치 68 내지 136의 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 86의 위치 1 내지 68, 위치 1 내지 102, 위치 35 내지 102, 위치 35 내지 136, 또는 위치 68 내지 136의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
용어 "PLD3"는 포스포리파제 D 패밀리, 멤버 3에 관한 것으로, PLD3 유전자가 이에 포함된다. 이 유전자는 막의 인지질의 가수분해를 촉매하는 효소의 포스포리파제 D(PLD) 패밀리 멤버를 인코딩한다. 인코딩된 단백질은 단회-통과 II형 막 단백질이며 2개의 PLD 포스포디에스터라제 도메인을 함유한다. 이 단백질은 아밀로이드-베타 전구체 단백질의 프로세싱에 영향을 미친다. 이 유전자의 돌연변이는 알츠하이머병 위험성과 관련이 있다.
"PLD3의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체"이라는 용어는 서열목록의 SEQ ID NOs: 90 내지 104로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 좋기로는 이들 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 90 내지 104로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 96의 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 96의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
용어 "MT_RNR1"은 미토콘드리아에 의해 인코딩된 12S RNA에 관한 것으로 여기에는 MT_RNR1 유전자가 포함된다. 이 RNA 유전자는 Mt_rRNA 클래스에 속한다. MT-RNR1와 연관된 질환으로는 제한적 심근병증 및 청각 신경병증을 들 수 있다. 이와 관련된 경로로는 진핵세포에서의 리보좀 생체형성 및 CFTR 번역 신뢰성(클래스 I 돌연변이)를 들 수 있다.
"MT_RNR1의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체"라는 용어는 서열목록의 SEQ ID NOs: 105 내지 121로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 좋기로는 이들 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 105 내지 121로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 115의 위치 1 내지 71, 위치 1 내지 107, 위치 37 내지 107, 위치 37 내지 142, 또는 위치 71 내지 142의 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열, 또는 SEQ ID NO: 115의 위치 1 내지 71, 위치 1 내지 107, 위치 37 내지 107, 위치 37 내지 142, 또는 위치 71 내지 142의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 이러한 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
용어 "HLA-DRB4"는 주요 조직적합성 복합체, 클래스 II, DR 베타 4에 관한 것으로 HLA-DRB4 유전자가 이에 포함된다. HLA-DRB4는 belongs to the HLA 클래스 II 베타 사슬 파라로그에 속한다. 이 클래스 II 분자는 알파 (DRA) 및 베타 (DRB) 사슬 (양자 모두 막 내에 앵커링되어 있음)로 이루어진 헤테로다이머이다. 이것은 세포외 단백질로부터 유래된 펩타이드를 제시함으로써 면역계에서 중추적인 역할을 한다. 클래스 II 분자들은 항원 제시 세포(APC: B 림프구, 수지상 세포, 대식세포)에서 발현된다.
"HLA-DRB4의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체"이라는 용어는 서열목록의 SEQ ID NOs: 122 내지 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 좋기로는 이들 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 122 내지 143으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 핵산 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 126의 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이 서열로 이루어진 핵산 서열 또는, SEQ ID NO: 126의의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이러한 서열로 이루어진 핵산 서열에 ㄱ관한 것이다.
특정 유전자의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열들 또는 단편들의 변이체와 관련하여 "2 이상의 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 여하한 조합"이라는 용어는 2 이상, 3 이상 또는 4 이상 및 좋기로는 최대 6개 또는 최대 5개의 상기 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들이 헤드-투-테일로 정렬되어 있음을 의미하며 이 때 임의로 링커에 의해 이격되어 있을 수 있다. 일 구체예에서, 2 이상의 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들은 이상의 상이한 및/또는 2 이상의 동일한 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들을 포함한다. 일 구체예에서, 2 이상의 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 조합은 동일 및/또는 상이한 유전자들의 3'-미번역 영역의 2 이상의 상이한 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들을 포함한다.
일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 144 내지 220, 좋기로는 SEQ ID NOs: 174 및 208 내지 220로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나 좋기로는 이러한 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NOs: 144 내지 220, 좋기로는 SEQ ID NOs: 174 및 208 내지 220 또는 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이러한 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다. 특히 바람직한 일 구체예에서, 이 용어는 SEQ ID NO: 174의 핵산 서열을 포함하거나 또는 이러한 서열로 이루어진 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 174의 핵산 서열과 적어도 90%, 좋기로는 적어도 95%, 더욱 좋기로는 적어도 98% 동일한 핵산 서열을 포함하거나, 좋기로는 이러한 서열로 이루어진 핵산 서열에 관한 것이다.
본 발명에 따라, "링커"라는 용어는 2개의 핵산 서열들 사이에 부가되어 상기 2개의 핵산 서열들을 연결시키는 핵산 서열에 관한 것이다. 링커 서열과 관련하여서는 어떠한 제한도 없다.
본 발명에 있어서, 핵산 분자 또는 핵산 서열은 핵산 좋기로는 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)을 가리킨다. 본 발명에서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 제조 및 화학적으로 합성된 분자들을 포함한다. 본 발명에 있어서, 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥 형태이거나 선형 또는 공유적으로 폐쇄된 원형 분자의 형태일 수도 있다.
본 발명의 문맥상, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오타이드 잔기들을 포함하고 좋기로는 전적으로 또는 실제로 리보뉴클레오타이드 잔기들로 이루어진 분자에 관한 것이다. "리보뉴클레오타이드"는 β-D-리보퓨라노실기의 2'-위치에 히드록실기를 갖는 뉴클레오타이드에 관한다. 이 용어에는 이중사슬 RNA 단일사슬 RNA, 분리된 RNA 예컨대 부분 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합 생산된 RNA 및 하나 이상의 뉴클레오타이드의 부가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연발생적인 RNA와 차이가 나는 변형된 RNA 가 포괄된다. 이러한 변경에는 비뉴클레오타이드 물질의 예컨대 RNA의 말단(들)에 대한 또는 내부에로의 부가, 예컨대 RNA의 하나 이상의 뉴클레오타이드에서의 부가가 포함될 수 있다. RNA 분자 중의 뉴클레오타이드는 또한 비표준 뉴클레오타이드, 예컨대 비자연발생적인 뉴클레오타이드 또는 화학합성된 뉴클레오타이드 또는 데옥시뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이들 변경된 RNA는 유사체, 특히 자연발생적인 RNA의 유사체라 칭할 수 있다. 본 발며에 따라, RNA는 mRNA를 포괄한다.
용어 "mRNA"는 "메신저-RNA"를 의미하며 DNA 주형을 이용하여 생성되고 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 전사체에 관한 것이다. 전형적으로, mRNA는 comprises 5'-UTR, 단백질 코딩 영역, 3'-UTR, 및 폴리(A) 서열을 포함한다. mRNA는 DNA 주형으로부터 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있다. 시험관내 전사 방법론은 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 시험관내 전사 키트가 시중에 다양하게 판매되고 있다. 본 발명에 따라, mRNA는 본 발명에 따른 변형에 더해, 변형 및 캡핑을 추가로 안정화시킴으로서 변형될 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서, RNA는 예컨대 단일 사슬 자가-복제 RNA와 같은 자가-복제 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 포지티브 센스의 단일 사슬 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스성 RNA이거나 또는 바이러스 RNA로부터 유도된 RNA이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 알파바이러스 게놈 RNA이거나 알파바이러스 게놈 RNA로부터 유도된다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 바이러스 유전자 발현 벡터이다. 일 구체예에서, 바이러스는 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus)이다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 하나 이상의 트랜스 유전자를 함유한다. 일 구체예에서, 만일 RNA가 바이러스 RNA이거나 또는 바이러스 RNA로부터 유도된 경우, 트랜스유전자는 예컨대 구조 단백질을 인코딩하는 바이러스 서열들과 같은 바이러스 서열들을 부분적으로 또는 전적으로 대체할 수 있다. 일 구체예에서, 자가-복제 RNA는 시험관내 전사된 RNA이다.
용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에서 발견되는 캡 구조를 가리키며 일반적으로 흔치 않은 5'에서 5'로의 트리포스페이트 결합을 통해 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오타이드로 이루어져 있다. 일 구체예에서, 이 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. 용어 "통상적인 5'-캡"은 자연발생적인 RNA 5'-캡, 좋기로는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 칭한다. 본 발명의 문맥상, 용어 "5'-캡"에는 RNA 캡 구조와 유사하고 RNA에 결합될 경우, 좋기로는 생체내 및/또는 세포내에서 RNA를 안정화시키는 능력을 갖도록 변형된 5'-캡 유사체가 포함된다. RNA에 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체의 존재 하에 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있는데, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥 내로 공-전사적으로 혼입되거나 RNA가 예컨대 시험관내 전사에 의해 생성되고, 5'-캡이 캡핑 효소, 예컨대 백시니아 바이러스의 캡핑 효소를 이용하여 후전사적으로 생성될 수 있다.
본 발명에서 용어 "핵산"은 또한 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상의 핵산의 화학적 유도체, 및 비-천연 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 유사체를 함유하는 핵산도 포괄한다.
"단편" 또는 "핵산 서열의 단편"은 핵산 서열의 일부, 즉 5'- 및/또는 3'-말단(들)에서 단축된 핵산 서열을 나타내는 서열에 관한다. 좋기로는, 어떤 단편이 RNA 분자에서 상기 핵산 서열을 대체할 경우, RNA 안정성 및/또는 번역 효율을 유지하는 것이 바람직하다. 좋기로는, 핵산 서열의 단편은 상기 핵산 서열로부터의 뉴클레오타이드 잔기들의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다.
본 발명에 따라 예컨대, 핵산 및 아미노산 서열들과 관련된 용어 "변이체"는 변이체, 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 컨포메이션, 이소폼, 대립유전자 변이체, 종 변이체 및 종 동족체, 특히 자연적으로 존재하는 것들을 포함한다. 대립유전자 변이체는 어떤 유전자의 정상적인 서열에서의 변경에 관한 것으로, 그 유의성은 종종 불명확하다. 완전한 유전자 시퀀싱에 의해 주어진 유전자에 대한 수많은 대립유전자 변이체들이 종종 동정된다. 종 동족체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열의 그것과 상이한 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다.
본 발명에 따라, 핵산 변이체들은 기준 핵산과 비교하여 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 결실, 부가, 돌연변이 및/또는 삽입을 포함한다. 결실은 기준 핵산으로부터 1 이상의 뉴클레오타이드들의 제거를 포함한다. 부가 변이체는 1 이상의 뉴클레오타이드들, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드들의 5'- 및/또는 3'-말단 융합을 포함한다. 돌연변이는 서열 내 적어도 1개의 뉴클레오타이드들이 제거되고 다른 뉴클레오타이드가 그 대신 삽입(예컨대 염기전환 및 전이), 일염기(abasic) 사이트, 가교 사이트 및 화학적으로 변경 또는 변형된 염기로 치환되는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 삽입은 적어도 1개의 뉴클레오타이드가 기준 핵산 내로 부가되는 것을 포함한다.
핵산 분장 관련하여, "변이체"라는 용어는 축퇴 핵산 서열을 포함하며, 여기서 본 발명에 따른 축퇴 핵산은 유전자 코드의 축퇴로 인해 코돈 서열이 기준 핵산과 상이한 핵산이다.
좋기로는 주어진 핵산 서열과 상기 주어진 핵산 서열의 변이체 사이의 동일성 정도가 적어도 70%, 좋기로는 적어도 75%, 좋기로는 적어도 80%, 더욱 좋기로는 적어도 85%, 더더욱 좋기로는 적어도 90% 또는 가장 좋기로는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것이 바람직하다. 동일성 정도는 적어도 약 30, 적어도 약 50, 적어도 약 70, 적어도 약 90, 적어도 약 100, 적어도 약 150, 적어도 약 200, 적어도 약 250, 적어도 약 300, 또는 적어도 약 400 뉴클레오타이드들의 영역에 대하여 주어지는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예들에서, 동일성 정도는 기준 핵산 서열의 전장에 대하여 주어지는 것이 좋다.
"서열 유사성(Sequence similarity)"이라 함은 동일하거나 또는 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 가리킨다. 두 개의 폴리펩타이드 또는 핵산 서열들 간의 "서열 동일성(Sequence identity)"은 서열들 간에 동일한 아미노산들 또는 뉴클레오타이드들의 백분율을 나타낸다.
"% 동일(% identical)"이라는 용어는 특히 비교하고자 하는 2 서열들의 최적 정렬 상태에서 동일한 뉴클레오타이드들의 백분율을 가리키는 것으로 의도되며, 상기 백분율은 순수하게 통계적인 것이고, 2 서열들 간의 차이는 서열 전장에 걸쳐 무작위적으로 분포된 것일 수 있고 비교하고자 하는 서열은 2 서열들 간에 최적 정렬을 달성하기 위해, 기준 서열과 비교시 부가 또는 결실을 포함하는 것일 수 있다. 2 서열들의 비교는 대개 대응하는 서열들의 국소 영역들을 동정하기 위해, 세그먼트 또는 "비교창"과 관련하여 최적 정렬시킨 후, 상기 서열들을 비교함으로써 수행된다. 비교를 위한 최적 정렬은 수동으로 또는 문헌 [Smith 및 Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482]에 따른 국소 상동성 알고리듬의 도움, 또는 문헌 [Neddleman 및 Wunsch, 1970, J.　Mol. Biol. 48, 443]에 따른 국소 상동성 알고리듬의 도움, 또는 문헌 [Pearson 및 Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444]에 따른 유사성 검색 알고리듬의 도움 또는 상기 알고리듬(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N 및 TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575　Science Drive, Madison, Wis.)을 이용한 컴퓨터 프로그램의 도움을 받아 수행될 수 있다.
동일성 백분율은 비교하고자 하는 서열들과 대응하는 동일한 위치의 수를, 비교된 위치의 수로 나누고 그 결과에 100을 곱하여 구한다.
예를 들어, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi 웹사이트로부터 BLAST 프로그램 "BLAST 2 sequences"을 이용할 수 있다.
하나의 핵산은 다른 핵산에, 만일 이들 두 서열들이 서로 상보적이라면 "혼성화할 수 있거나" 또는 "혼성화"한다. 하나의 핵산은 다른 핵산에 만일 이들 두 서열들이 서로 안정한 듀플렉스를 형성할 수 있다면 그 다른 핵산에 대해 "상보적"이다. 본 발명에서, 혼성화는 폴리뉴클레오타이드들 간에 특이적인 혼성화를 허락하는 조건 하에서 수행되는 것이 좋다. 가혹한 조건은 예컨대 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 또는 [Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York]에 설명되어 있으며, 예컨대 혼성화 완충액(3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5 mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA) 중 65℃에서의 혼성화를 가리킨다. SSC는 0.15 M 염화나트륨/0.15 M 구연산나트륨, pH 7이다. 혼성화 후, DNA가 이송되는 막을 예컨대 실온에서 2 Х SSC로 세척한 다음 68℃ 이하의 온도에서 0.1-0.5 Х SSC/0.1 Х SDS로 세척한다.
상보성 백분율은 어떤 핵산 분자 내에서 제2의 핵산 서열과 수소 결합(예컨대, Watson-Crick 염기 페어링)을 형성할 수 있는 인접(contiguous) 잔기들의 백분율을 나타낸다 (예컨대, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개이면 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상동성임). "완전히 상보적" 또는 "전적으로 상보적"이라 함은 핵산 서열 내 모든 인접 잔기들이 제2의 핵산 서열 내의 동일한 갯수의 인접 잔기들과 수소 결합을 형성함을 의미한다. 좋기로는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 적어도 70%, 좋기로는 적어도 75%, 좋기로는 적어도 80%, 더욱 좋기로는 적어도 85%, 더더욱 좋기로는 적어도 90% 또는 가장 좋기로는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 가장 좋기로는, 본 발명에 따른 상보성 정도는 100%이다.
"유도체(derivative)"라는 용어는 뉴클레오타이드 염기, 당 또는 포스페이트 상에서 핵산의 여하한 화학적 유도화를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드들 및 뉴클레오타이드 유사체들을 함유하는 핵산도 포괄한다. 핵산의 유도화는 바람직하게는 그의 안정성을 증가시킨다.
특정 핵산 서열들 또는 특정 핵산 서열들에 대해 특정의 동일성 정도를 갖는 핵산 서열들의 단편 또는 변이체는 상기 특정 서열들의 적어도 하나의 기능적 특성을 갖는 것이 좋고 상기 특정 서열들, 예컨대 상기 특정 핵산 서열들의 그것과 동일 또는 유사한 특성을 나타내는 서열들과 기능적으로 동등한 것이 좋다.
한 가지 중요한 특성은 RNA 분자의 안정성 및/또는 번역 효율을 유지 또는 향상시키고 특히 RNA로 전사될 수 있는 핵산 (전사가능한 핵산 서열) 또는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 대한 기능기 연결을 증가시키는 능력, 이 핵산으로부터 생산된 RNA 또는 완전한 RNA 분자에서 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 안정성 및/또는 번역 효율을 포함한다.
일 구체예에서, 만일 특정 핵산 서열이 다른 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적이면, 그 특정 핵산 서열의 단편 또는 변이체 또는 그 특정 핵산 서열에 대해 특정 동일성 정도를 갖는 핵산 서열 역시도 다른 핵산 서열(그것이 특정 핵산 서열을 대체할 경우)의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적이다. 특정 핵산 서열의 단편 또는 변이체 또는 그 특정 핵산 서열에 대해 특정 동일성 정도를 갖는 핵산 서열은 그 특정 핵산 서열 또는 그 특정 핵산 서열의 단편 또는 변이체 또는 그 특정 핵산 서열에 대해 특정 동일성 정도를 갖는 핵산 서열만큼 활성적이거나 또는 더 활성적일 수 있고, 그 특정 핵산 서열의 활성의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 만큼 활성적일 수 있다.
본 발명에 따라, "기능적 연결(functional linkage)" 또는 "기능적으로 연결된"이라 함은 기능적 관계로 연결된 것에 관한 것이다. 어떤 핵산이 다른 핵산 서열과 기능적으로 관련되면 "기능적으로 연결된" 것이다. 예를 들어, 어떤 프로모터가 어떤 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 경우 그 프로모터는 상기 코딩 서열과 기능적으로 연결된 것이다. 기능적으로 연결된 핵산들은 일반적으로 서로 인접하며, 추가의 핵산 서열들에 의해 적절히 분리되거나 특정 구체예에서, RNA 폴리머라제에 의해 전사되어 단일 RNA 분자 (공통 전사체)가 생성된다. 특정 서열에 대하여 변이체인 어떤 서열이 RNA 분자 내에서 그 특정 서열을 대체할 경우, RNA 안정성 및/또는 번역 효율을 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, "핵산 서열로부터 유래된 핵산 서열"이라 함은 그것이 유래된 핵산의 변이체인 핵산을 가리킨다.
"핵산의 3' 말단"이라는 표현은 본 발명에 따라 유리 히드록시기를 갖는 말단을 가리킨다. 이중-가닥 핵산들, 특히 DNA의 다이아그램에서, 3' 말단은 항상 우측에 그려진다. "핵산의 5' 말단"은 본 발명에 따라 유리 포스페이트기를 갖는 말단을 가리킨다. 이중-가닥 핵산들, 특히 DNA의 다이아그램에서, 3' 말단은 항상 좌측에 그려진다.
5' 말단 5'--P-NNNNNNN-OH-3' 3' 말단
3'-HO-NNNNNNN-P--5'
특정 구체예에서, 핵산은 본 발명에 따라 그 핵산에 대해 동족이거나 이질적일 수 있는 발현 조절 서열들에 기능적으로 연결된다.
전사가능한 핵산 서열, 특히 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 및 발현 조절 서열은 만일 이들이 전사가능한 핵산 서열 및 특히 코딩 핵산 서열이 발현 조절 서열의 조절 하 또는 영향 하에 있는 방식으로 서로 공유적으로 연결된 경우, 서로 "기능적으로" 연결된 것이다. 만일 핵산 서열이 기능성 펩타이드 또는 단백질로 번역되는 경우, 코딩 서열에 기능적으로 연결된 발현 조절 서열의 유도에 의해 코딩 서열 내 프레임 쉬프트를 일으키지 않고 또는 코딩 서열이 소망되는 펩타이드나 단백질로 번역되지 못하는 일 없이,상기 코딩 서열의 전사가 일어난다.
"발현 조절 서열"이라는 용어는 본 발명에 따라 프로모터들, 리보좀-결합 서열들 및 유전자의 전사 또는 유래된 RNA의 번역을 조절하는 다른 조절 요소들을 포함한다. 본 발명의 특정 구체예에서, 발현 조절 서열들은 제어될 수 있다. 발현 조절 서열들의 정확한 구조는 종 또는 세포 종류에 따라 달라질 수 있지만 대체로 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등과 같이, 각각 전사 및 번역 개시와 연관된 5'-미전사 및 5'- 및 3'-미번역 서열들을 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-미전사 발현 조절 서열들은 기능적으로 연결된 유전자의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 발현 조절 서열들은 또한 인핸서 서열들 또는 상류 활성화제 서열들을 포함할 수도 있다.
본 발명에 명시된 핵산 서열들, 특히 전사가능한 핵산 서열들 및 코딩 핵산 서열들은, 상기 핵산 서열들과 동족성 또는 이종성일 수 있는 발현 조절 서열들, 특히 프로모터들과 조합될 수 있으며, 여기서 "동족성(homologous)"이라는 용어는 핵산 서열이 그 발현 조절 서열과 자연적으로 기능적으로도 연결되어 있다는 사실을 가리키고, "이종성(heterologous)"이라는 용어는 핵산 서열이 그 발현 조절 서열과 자연적으로 기능적으로 연결되지 않았다는 사실을 가리킨다.
"프로모터" 또는 "프로모터 영역"이라는 용어는 어떤 유전자의 코딩 서열의 상류 (5')의 DNA 서열을 가리키는 것으로, RNA 폴리머라제에 대한 인식 및 결합 사이트를 제공함으로써 상기 코딩 서열의 발현을 조절한다. 프로모터 영역은 상기 유전자의 전사 제어와 연관된 추가 인자들에 대한 추가의 인식 또는 결합 사이트를 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵 또는 진핵세포 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 프로모터는 인듀서에 반응하여 전사를 "유도할 수 있고" 전사를 개시하며, 또는 만일 전사가 인듀서에 의해 조절되지 않을 경우 "구성적(constitutive)"일 수도 있다. 유도가능한 프로모터는 만일 인듀서가 부재할 경우 매우 적은 적도로만 발현되거나 전혀 발현되지 않는다. 인듀서 존재 하에서, 유전자는 "스위치 온"되거나 또는 전사 수준이 증가된다. 이것은 대체로 특이적 전사 인자의 결합에 의해 매개된다.
본 발명에 따른 바람직한 프로모터의 예는 SP6, T3 또는 T7 폴리머라제에 대한 프로모터이다.
본 발명에서, 용어 "발현"은 그의 최광의로 사용되며 RNA의 생산 또는 RNA 및 단백질의 생산을 포함한다. 이것은 또한 핵산의 부분적 발현도 포함한다. 뿐만 아니라, 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 "번역"이라는 용어는 세포의 리포좀 내에서 메신저 RNA의 한 가닥이 아미노산 서열의 어셈블리를 지시하여 펩타이드 또는 단백질을 만드는 프로세스에 관한 것이다.
"공통 전사체를 생성하도록 전사될 수 있는 핵산 서열들"이라는 용어는 상기 핵산 서열들이 서로 기능적으로 연결되어, 적절한 경우 상기 핵산 서열들을 포함하는 핵산 분자, 특히 폐쇄형 원형 핵산 분자의 제한효소 절단과 같은 선형화 후, 프로모터의 조절 하에, 상호 공유결합된 상기 핵산 서열들의 전사체를 포함하는 RNA 분자(적절한 경우 사이사이에 위치한 서열들에 의해 이격됨)를 결과시키는 것을 의미한다.
본 발명의 문맥상, "전사"라는 용어는 DNA 서열의 유전자 코드가 RNA로 전사되는 프로세스에 관계된다. 후속적으로, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에서, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포괄하며, 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포 시스템에서 시험관내 합성되는 프로세스에 관한 것이다. 좋기로는 클로닝 벡터가 전사체의 생성에 적용되는 것이 바람직하다. 이들 클로닝 벡터들은 일반적으로 전사 벡터로서 설계되며 본 발명에 따라 용어 "벡터"에 포괄된다. 본 발명에서, RNA는 좋기로는 시험관내 전사된 RNA (IVT-RNA)인 것이 바람직하고 적절한 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 수득될 수 있다. 전사를 조절하기 위한 프로모터는 RNA 폴리머라제용의 임의의 프로모터일 수 있다. 시험관내 전사를 위한 DNA 주형은 핵산, 특히 cDNA의 클로닝, 및 이를 시험관내 전사를 위한 적절한 벡터 내로 도입함으로써 수득가능하다. RNA의 역전사에 의해 cDNA가 얻어질 수 있다.
"핵산 서열로부터 전사된 핵산 서열"이라는 용어는 RNA를 가리키며, 적절한 경우 완전한 RNA 분자의 전사 산물인, 완전한 RNA 분자의 일부를 가리킨다.
"핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키기 위해 활성적인 핵산 서열"이라는 표현은 제2 핵산 서열을 갖는 공통 전사체 내에서 제1 핵산 서열이, 상기 제2 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을, 상기 제1 핵산 서열이 없는 경우의 상기 제2 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성에 비해 증가시키는 방식으로 상기 제2 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 변형시킬 수 있음을 의미하는 것이다. 문맥상 용어 "번역 효율"은 특정 기간 동안 RNA 분자에 의해 제공되는 번역 산물의 양에 관한 것이고 용어 "안정성"은 RNA 분자의 반감기에 관한 것이다.
RNA의 번역 효율의 변형 및 그에 의한 안정화 및/또는 증가는 본 발명에 따라, 본 발명의 핵산 분자들이 발현 벡터로서 사용될 경우, 본 발명의 핵산 분자들이 그의 3' 말단에서 전술한 바와 같이 3'-미번역 영역들을 갖는 RNA의 전사를 허용하는 방식, 및 좋기로는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열 (오픈 리딩 프레임) 및 폴리(A) 서열 사이에서 전사를 허용하는 방식으로 본 발명의 핵산 분자들의 발현을 유전 변형함으로써 달성가능하다.
"3'-미번역 영역"이라는 용어는 유전자의 3' 말단, 단백질-인코딩 영역의 종결 코돈의 하류에 위치하고, 전사는 되지만 아미노산 서열로 번역되지 않은 영역 또는 RNA 분자의 대응 영역에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 제1 폴리뉴클레오타이드 영역은, 만일 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 영역의 5' 말단이 제2 폴리뉴클레오타이드 영역의 3' 말단에 가장 가까운 상기 제1 폴리뉴클레오타이드 영역의 일부라면, 상기 제2 폴리뉴클레오타이드 영역의 하류에 위치하는 것으로 간주된다.
3'-미번역 영역은 일반적으로, 번역 산물에 대한 종결 코돈으로부터 전사 프로세스 후에 대개 결합되는 폴리(A) 서열로 뻗어있다. 포유동물의 mRNA의 3'-미번역 영역들은 일반적으로 AAUAAA 헥사뉴클레오타이드 서열로 알려진 상동(homology) 영역을 갖는다. 이 서열은 폴리(A) 부착 시그널인 것으로 추정되며 종종 폴리(A) 부착 사이트의 10 내지 30 염기 상류에 위치한다.
3'-미번역 영역들은 엑소리보뉴클리아제에 대한 배리어로 작용하거나 RNA 안정성을 증가시키는 것으로 알려진 단백질(예컨대 RNA-결합 단백질)과 상호반응하는 스템-루프 구조를 만들도록 폴딩될 수 있는 1 이상의 역전된 반복체(inverted repeats)를 함유할 수 있다.
5'- 및/또는 3'-미번역 영역들은, 본 발명에 따라, 전사가능한 핵산 특히 코딩 핵산에 기능적으로 연결되어, 이들 영역들로 하여금 상기 전사가능한 핵산으로부터 전사된 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율이 증가되는 방식으로, 이들 영역들이 핵산과 연계되도록 할 수 있다.
면역글로불린 mRNAs의 3'-미번역 영역들은 비교적 짧은 반면 (약 300 뉴클레오타이드 미만), 다른 유전자의 3'-미번역 영역들은 비교적 길다. 예를 들어, tPA의 3'-미번역 영역은 약 800 뉴클레오타이드 길이이고, 인자 VIII은 약 1800 뉴클레오타이드 길이이며 에리쓰로포이에틴은 길이가 약 560 뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따라, 3'-미번역 영역 또는 그로부터 유래된 핵산 서열을 유전자의 3'-미번역 영역에 병합시킨 다음 상기 병합이 합성된 단백질의 양을 증가시키는지를 측정함으로써 3'-미번역 영역 또는 그로부터 유래된 핵산 서열이 RNA의 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시키는지 여부를 알아낼 수 있다.
전술한 내용은 따라서 본 발명에 따라 핵산이 그 내부에 링커 존재 또는 부재 하에 좋기로는 "헤드-투-테일 관계"로(즉, 3'-미번역 영역이 동일하게 배향되고, 좋기로는 핵산 내 자연발생적으로 배향된) 연속적으로 커플링되어 있는 3'-미번역 영역들을 2개 또는 3개 포함하는 핵산의 경우에도 적용된다.
본 발명에 따라 "유전자"라는 용어는 1 이상의 세포 산물을 생산하거나 및/또는 1 이상의 세포내 또는 세포간 기능을 달성하는데 책임이 있는 특정 핵산 서열을 가리킨다. 보다 구체적으로, 상기 용어는 특이적인 단백질 또는 기능성 또는 구조 RNA 분자를 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 섹션에 관한 것이다.
폴리아데닐화는 폴리(A) 서열 또는 테일을 일차(primary) 전사체 RNA에 부가하는 것이다. 폴리(A) 서열은 복수개의 아데노신 모노포스페이트로 구성된다. 달리 설명하면, 이것은 오직 아데닌 염기만을 갖는 RNA 스트레치(stretch)이다. 진핵세포에서 폴리아데닐화는 번역을 위한 성숙한 메신저 RNA (mRNA)를 생산하는 프로세스이다. 따라서, 이것은 유전자 발현의 보다 큰 프로세스의 일부를 형성한다. 폴리아데닐화 프로세스는 유전자의 전사가 마무리 또는 종결됨에 따라 개시된다. 새로 만들어진 프리-mRNA의 3'-최외곽(most) 세그먼트가 단백질 세트로부터 먼저 절단되어 나간다: 이들 단백질들은 이어서 RNA의 3' 말단에서 폴리(A) 서열을 합성한다. 폴리(A) 서열은 mRNA의 안정성, 번역 및 핵 이출(export)에 있어 중요하다. 서열은 시간이 경과함에 따라 짧아지며 충분히 짧아지면, mRNA는 효소적으로 분해된다.
"폴리아데닐 서열", "폴리(A) 서열" 또는 "폴리(A) 테일"이라는 용어는 일반적으로 RNA 분자의 3' 말단에 위치하는 아데닐 잔기들의 서열을 가리킨다. 본 발명은 이러한 서열로 하여금, 코딩 가닥에 상보적인 가닥에서 반복된 티미딜 잔기에 기반하여 DNA 주형에 의해 RNA 전사가 일어나는 동안 부착되도록 하며, 여기서 상기 서열은 정상적으로는 DNA에 의해 인코딩되지 않지만 핵에서 전사 후에, 주형-비의존성 RNA 폴리머라제에 의해 RNA의 자유 3' 말단에 부착된다. 본 발명에 따라, 일 구체예에서, 폴리(A) 서열은 적어도 20, 좋기로는 적어도 40, 좋기로는 적어도 80, 좋기로는 적어도 100 및 좋기로는 최대 500, 좋기로는 최대 400, 좋기로는 최대 300, 좋기로는 최대 200, 및 특히 최대 150개의, A 뉴클레오타이드들, 좋기로는 연속 A 뉴클레오타이드들, 및 특히 약 120개의 A 뉴클레오타이드들을 갖는 것이 바람직하다. "A 뉴클레오타이드들" 또는 "A"라는 용어는 아데닐 잔기들을 가리킨다.
바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터이다. 본 발명에서 "벡터"라는 용어는 그의 일반적인 의미로 사용되며 핵산을 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포 내로 도입시킬 수 있고, 적절한 경우 게놈 내로 일체화시킬 수 있는, 여하한 중간체 비히클이 이에 포괄된다. 이러한 벡터들은 좋기로는 세포 내에서 복제 및/또는 발현된다. 벡터들에는 플라스미드, 파지미드 또는 바이러스 게놈이 포함된다. 본 발명에서 "플라스미드"라는 용어는 일반적으로 염색체외 유전자 물질의 구조물, 대체로 염색체 DNA와 무관하게 복제될 수 있는, 원형 DNA 듀플렉스를 가리킨다.
본 발명에 설명된 핵산들은 재조합 및/또는 분리된 분자들일 수 있다.
본 발명에서 "분리된 분자"는 다른 세포 물질과 같은 다른 분자들이 실질적으로 없는 분자를 가리킨다. "분리된 핵산"이라 함은 본 발명에 따라 그 핵산이 (i) 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 시험관내 증폭되었거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나 (iii) 예컨대 절단 및 겔-전기천공 분획화에 의해 정제되거나, 또는 (iv) 예컨대 화학 합성법에 의해 합성된 핵산을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의해 조작가능한 핵산이다.
본 발명의 문맥상 "재조합"이라는 용어는 "유전자 조작을 통해 만들다"라는 의미이다. 본 발명의 문맥상 재조합 세포와 같은 "재조합 물체"는 자연적으로 발생하지 않는다.
본 발명에서 "자연발생적인"이라는 용어는 그 물체가 자연에서는 발견되지 않는다는 사실을 가리킨다. 예를 들어, 생명체(바이러스 포함)에 존재하고 자연의 공급원으로부터 분리가능하며 인간에 의해 실험실에서 인위적으로 변형된 바 없는 펩타이드 또는 핵산은 자연발생적이다.
본 발명에 따라, "숙주 세포"라는 용어는 외인성 핵산에 의해 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 세포를 가리킨다. 용어 "숙주 세포는 본 발명에 따라 원핵(예컨대 대장균) 또는 진핵세포(예컨대 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 영장류로부터의 세포와 같은 포유동물 세포가 바람직하다. 세포는 다양한 조직 종류로부터 유래될 수 있고 단일 세포 및 세포주를 포함한다. 특별한 예로는 각질세포, 말초혈액 백혈구, 골수 줄기세포 및 배아줄기세포를 들 수 있다. 또 다른 구체예에서, 숙주 세포는 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구 또는 대식세포이다. 핵산은 단일 또는 복수개 카피로 숙주 세포 내에 존재할 수 있고 일 구체예에서 숙주 세포에서 발현된다.
대장균(E.coli)은 온혈생물의 하부장에서 공통적으로 발견되는 에스케리치아속의 그램-음성, 통성 혐기성, 막대형 세균이다. 이 세균은 실험실 환경에서 저렴한 비용으로 잘 자라며, 60년 넘게 집중적으로 조사되어 왔다. 대장균은 가장 널리 연구된 원핵 모델 생물로서, 바이오테크 및 미생물학 분야에서 중요한 종으로, 이러한 분야에서 대장균은 재조합 DNA를 이용한 대다수의 연구에서 숙주 생물 역할을 하여왔다. 본 발명에 따른 대장균 균주들에는: AG1, AB1157, B2155, BL21, BNN93, BNN97, BW26434, C600, CSH50, D1210, DB3.1, DH1, DH5α, DH10B, DH12S, DM1, E. cloni(r), E.coli K12 ER2738, ER2566, ER2267, HB101, IJ1126, IJ1127, JM83, JM101, JM103, JM105, JM106, JM107, JM108, JM109, JM110, JM2.300, LE392, Mach1, MC1061, MC4100, MFDpir, MG1655, OmniMAX2, RR1, RV308, SOLR, SS320, STBL2, STBL3, STBL4, SURE, SURE2, TG1, TOP10, Top10F', W3110, WM3064, XL1-Blue, XL2-Blue, XL1-Red 및 XL10-Gold가 포함된다.
본 발명에 따라, "펩타이드"라는 용어는 올리고펩타이드와 폴리펩타이드를 포함하며, 2 이상, 좋기로는 3 이상, 좋기로는 4 이상, 좋기로는 6 이상, 좋기로는 8 이상, 좋기로는 10 이상, 좋기로는 13 이상, 좋기로는 16 이상, 좋기로는 20 이상, 및 좋기로는 최대 50, 좋기로는 최대 100 또는 좋기로는 최대 150개의, 연속 아미노산들이 펩타이드 결합을 통해 서로 연결되어 포함된 물질을 가리킨다. "단백질"이라는 용어는 대형 펩타이드, 좋기로는 적어도 151개의 아미노산을 갖는 펩타이드를 가리키지만, "펩타이드" 및 "단백질"이라는 용어는 흔히 동의어로서 사용된다.
용어 "펩타이드" 및 "단백질"은 본 발명에 따라 아미노산 성분들 뿐만 아니라 예컨대 당 및 포스페이트 구조물과 같은 비-아미노산 성분들 역시도 함유하며, 에스테르, 티오에테르 또는 디설파이드 결합과 같은 결합을 함유하는 물질도 포함한다.
본 발명에 따라, RNA와 같은 핵산은 펩타이드 또는 단백질을 인코딩할 수 있다. 따라서, 전사가능한 핵산 서열 또는 그의 전사체는 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유할 수 있다. 상기 핵산은 인코딩된 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산은 항원 및 약학적으로 활성인 펩타이드 또는 단백질 예컨대 면역학적 활성 화합물(좋기로는 항원이 아님)을 인코딩 및 발현하는 핵산일 수 있다.
본 발명에 따라, "펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 핵산"이라는 용어는 상기 핵산이, 적절한 환경, 좋기로는 세포 내에 존재할 경우, 아미노산 어셈블리로 하여금 번역 프로세스 중에 펩타이드 또는 단백질을 생산하도록 지시할 수 있음을 의미한다. 좋기로는 본 발명에 따른 RNA는 펩타이드 또는 단백질의 번역을 허용하는 세포의 번역 기구와 상호반응할 수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, 일 구체예에서, RNA는 약학적 활성 RNA를 포함하거나 이것으로 이루어진다. "약학적 활성 RNA"는 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 RNA일 수 있다.
"약학적 활성 펩타이드 또는 단백질"는 치료적 유효량으로 대상자에게 투여될 경우 대상자의 질병 또는 병태에 긍정적이거나 유리한 효과를 미친다. 좋기로는, 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 치유 또는 완화적 성질을 가지며 질병 또는 장애의 1 이상의 증상의 위중도를 경감, 완화, 저감, 역전, 개시 지연 또는 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질은 예방적 성질을 가질 수 있으며 이러한 질병 또는 병리학적 상태의 위중도를 감소시키거나 또는 질병의 개시를 지연시키는데 이용될 수 있다. 용어 "약학적 활성 펩타이드 또는 단백질"은 모든 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함하고, 또한 그들의 약학적 활성 조각들을 의미한다. 이는 또한 약학적 활성 펩타이드 또는 단백질 유사체를 포함한다. 용어 "약학적으로 활성화된 펩타이드 또는 단백질"은 항원인 펩타이드와 단백질을 더 포함하고, 즉 대상자에 상기 펩타이드 또는 단백질 투여는 치료적 또는 부분적 또는 완전히 보호될 수 있는 대상자에서 면역반응을 유도한다.
약학적 활성 단백질의 예로는 면역학적 활성 물질 (예를 들어, 인터루킨, 콜로니 자극인자 (CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (G-CSF), 과립대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 에리스로포이에틴, 종양 괴사 인자 (TNF), 인터페론, 인터그린, 어드레신, 셀레틴, 귀소 수용체, T 세포 수용체, 면역 글로불린 항체, 용해 가능한 주 조직적합성 복잡 항원, 박테리아성, 기생충성 또는 바이러스성 항원, 알레르기 유발 항원, 자기 항원, 항체와 같은 면역학적으로 활성화된 항원)과 같은 시토카인 및 면역계 단백질, 호르몬 (인슐린, 갑상선 호르몬, 카테콜아민, 생식선 자극호르몬, 영양호르몬, 프로락틴, 옥시토신, 도파민, 산유촉진단백질, 렙틴 등), 성장호르몬 (예를 들어, 인간 성장호르몬), 성장 인자 (예를 들어, 상피 성장 인자, 신경 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자 등), 성장 인자 수용체, 효소 (조직 플라스미노겐 활성인자, 스트렙토키나아제, 콜레스테롤 생합성 또는 분해성, 스테로이드 생성 효소, 키나아제, 포스포디에스테라제, 메틸화 효소, 탈메틸화 효소, 탈수소 효소, 셀룰라아제, 단백질 분해 효소, 리파아제, 포스포리파아제, 방향화 효소, 사이토크롬, 아데닐산염 또는 구아닐산염 고리화 효소, 뉴라미다아제 등), 수용체 (스테로이드 호르몬 수용체, 펩파이드 수용체), 결합 단백질 (성장호르몬 또는 성장 인자 결합 단백질 등), 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질 (예를 들어, 혈관신생을 방지하는 단백질), 구조 단백질 (콜라겐, 피브로인, 피브리노겐, 엘라스틴, 튜불린, 엑틴 및 미오신과 같은), 혈액 단백질 (트롬빈, 혈청 알부민, 제 Ⅶ 인자, 제 Ⅷ 인자, 인슐린, 제 Ⅸ 인자, 제 Ⅹ 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 단백질 C, von Wilebrand 인자, 안티트롬빈 Ⅲ, 글루코세레브로시다아제, 에리스로포이에틴 과립구 콜로니 자극인자 (GCSF) 또는 개질된 제 Ⅷ 인자, 항응고제 등) 등을 포함하나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체적인 예에서, 본 발명에 따른 약학적으로 활성화된 단백질은 림프 항상성 조절에 관여하는 시토킨, 바람직하게는 T 세포의 발달, 프라이밍, 팽창, 분화 및/또는 생존에 관여하고, 좋기로는 림프 항상성을 유도하거나 증강시키는 시토킨이다. 하나의 구체적인 예에서, 시토킨은 인터류킨이다. 하나의 구체적인 예에서, 본 발명에 따른 약학적 활성 단백질은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, 및 IL-21로 이루어진 군으로부터 선택된 인터류킨이다.
용어 "면역학적 활성 물질"은 좋기로는 면역 세포의 성숙을 유도 및/또는 억제함으로써, 시토킨 생합성을 유도 및/또는 억제함으로써, 및/또는 B 세포에 의한 항체 생성을 자극하여 체액성 면역을 변화시켜서 면역 반응을 변화시키는 임의의 물질에 관한 것이다. 면역학적 활성 물질은 항 바이러스성 및 항암 활성을 포함하지만 이에 한하지 않는 강력한 면역 자극 활성을 가지고, 또한 예를 들어 면역 반응을 TH2 면역 반응으로부터의 이동과 같은 면역 반응의 다른 측면들을 하향 조절할 수 있고, 이는 TH2 매개 질병의 광범위한 치료에 유용하다. 면역학적으로 활성화된 물질은 백신 첨가물로서 유용할 수 있다.
만일, 본 발명에 따라, 전술한 바와 같이 RNA를 이용함으로써 면역 반응을 유도 또는 증강시킬 것이 요구될 경우, 면역 반응은 RNA에 의해 촉발 또는 증강될 수 있다. 예를 들어, RNA 또는 그의 프로세션 산물에 의해 인코딩된 단백질 또는 펩타이드들은 항원 제시 세포들에서 발현되는 주요 조직적합 복합체(MHC) 단백질에 의해 제시될 수 있다. 이 경우 MHC 펩타이드 복합체는 활성화를 유도하는 T 세포와 같은 면역 세포에 의해 인식될 수 있다.
일 구체예에서, 특히, 항원과 관련된 질병에 걸린 포유동물을 치료하는 것이 요망될 경우, 질병-관련 항원과 같은 항원을 코딩하는 RNA를 포유동물에게 투여한다. RNA는 포유동물의 항원-제시 세포(단핵구, 대식세포, 수지상 세포 또는 기타 세포)에 흡수된다(taken up). RNA의 항원 번역 산물이 형성되고 이 산물은 T 세포에 의한 인식을 위해 세포 표면에 디스플레이된다. 일 구체예에서, 항원은 항원에 지향된 CAR-조작된 T 세포에 의한 인식을 위해 세포 표면 상에 디스플레이된다. 일 구체예에서, 항원 또는 그의 임의 프로세션에 의해 생성된 산물은 그들의 T 세포 수용체를 통한 T 세포의 인식을 위해 MHC 분자 관점에서 세포 표면 상에 디스플레이된다.
별법으로, 본 발명은 항원을 발현하는 RNA를 예컨대 환자로부터 채취한 항원-제시 세포와 같은 항원-제시 세포 내로 생체외(ex vivo) 도입하고, 임의로 생체외에서 복제 증식된 상기 항원-제시 세포들을 동일한 환자 체내로 이식시키는 구체예를 상정한다. 형질감염된 세포들은 공지 기술, 좋기로는 정맥내, 강내(intracavitary), 복강내 또는 종양내 투여에 의해 멸균 형태로 환자에게 재도입될 수 있다.
본 발명의 방법들에서는 항원을 인코딩하는 RNA의 발현을 위해 항원 제시 세포들이 연루될 수 있다. 이를 위해, 본 발명의 방법은 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포 내로 항원을 인코딩하는 RNA를 도입하는 것을 포함할 수 있다. 수지상 세포와 같은 항원의 형질감염을 위해 항원을 인코딩하는 RNA를 포함하는 약학적 조성물이 이용가능하다. RNA를 수지상 세포 또는 다른 항원 제시 세포에 표적시키는 전달 비히클을 환자에게 투여하여, 생체내에서 발생되는 형질감염을 일으킬 수 있다.
본 발명에 따라 전신 투여 후 비장 내에서 수지상 세포(DCs)와 같은 항원 제시 세포에게 RNA를 고도의 선택성으로 전달하는, 항원을 인코딩하는 RNA의 제형을 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 입자의 순전하가 제로 또는 음의 값에 가깝고 소정의 입자 크기를 갖는 나노미립자상 RNA 제형, 예컨대 RNA 및 리포좀으로부터의 전기-중성 또는 음하전되 리포플렉스, 예컨대 DOTMA 및 DOPE 또는 DOTMA 및 콜레스테롤을 포함하는 리포플렉스는 전신 투여 후 비장의 DCs에서 실질적인 RNA 발현을 이끌어낸다. 다른 장기에서의 발현은 낮은 반면 표적 세포(비장)에서는 강력한 발현이 확인되었다.
본 명세서에서, "나노입자"라는 용어는 특히 핵산을 전신 투여, 특히 비경구 투여하는데 적합한 입자 직경이 일반적으로 1000 나노미터(nm) 미만임을 가리키는 것이다. 일부 구체예에서, 나노입자의 직경은 600 nm 미만이다. 일부 구체예에서, 나노입자의 직경은 400 nm 미만이다.
본 발명에서, "나노입자 제형(nanoparticulate formulation)"이라는 용어 또는 이와 유사한 용어들은 적어도 하나의 나노입자를 함유하는 물질을 가리킨다. 일부 구체예에서, 나노입자상 조성물은 나노입자들의 균일한 집합체이다. 일부 구체예에서 나노입자상 조성물은 분산액(dispersion) 또는 에멀젼(emulsion)이다. 일반적으로, 분산액 또는 에멀젼은 적어도 2종의 섞이지 않는 재료들이 조합될 때 형성된다.
"리포플렉스(lipoplex)" 또는 "핵산 리포플렉스", 특히 "RNA 리포플렉스"라는 용어는 지질 및 핵산, 특히 RNA의 복합체를 가리킨다. 리포플렉스는 종종 중성의 "헬퍼" 지질을 종종 포함하는, 양이온성 리포좀이 핵산과 혼합될 때 자발적으로 형성된다.
만일 본 발명이 양전하, 음전하 또는 중성 전하 또는 양이온성 화합물, 음성 화합물 또는 중성 화합물을 지칭할 경우 이것은 일반적으로 상기 언급된 전하가 선택된 pH 예컨대 생리적 pH에서 존재함을 의미하는 것이다. 예를 들어, "양이온성 지질"이라는 용어는 선택된 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순(net) 양전하를 갖는 지질을 의미한다. "중성 지질"이라는 용어는 순 양전하 또는 순 음전하를 갖지 않는 지질을 의미하며 생리적 pH와 같은 선택된 pH에서 비-하전 또는 중성의 양쪽성 이온 형태로 존재할 수 있음을 의미한다. 본 발명에서 "생리적 pH"라 함은 약 7.5의 pH를 의미한다.
본 발명에 사용되도록 상정된 지질 담체와 같은 나노미립자상 담체는 RNA와 같은 핵산과, 예컨대 그 핵산이 봉입 또는 캡슐화되어 있는 핵산 또는 형성 베지클과 함께 복합체를 형성함으로써, 연계될 수 있는 물질 또는 비히클을 포함한다. 이것은 네이키드 핵산에 비해 그 핵산의 안정성을 증가시키는 결과를 낳는다. 특히, 혈액 내 핵산의 안정성이 증가될 수 있다.
양이온성 지질, 양이온성 폴리머 및 양전하를 갖는 기타 물질들은 음하전된 핵산과 함께 복합체를 형성할 수 있다. 이들 양이온성 분자들은 헥산을 복합화하는데 이용될 수 있음으로 해서, 소위 리포플렉스 또는 폴리플렉스를 각각 형성할 수 있고, 이들 복합체들은 핵산을 세포 내로 전달하는 것으로 나타났다.
본 발명에서 사용하기 위한 나노미립자상 핵산 조제물은 다양한 핵산 복합화 화합물로부터 다양한 프로토콜에 의해 수득가능하다. 지질, 폴리머, 올리고머 또는 양쪽성 물질은 전형적인 복합화제이다. 일 구체예에서, 복합화 화합물은 프로타민, 폴리에틸렌이민, 폴리-L-리신, 폴리-L-아르기닌 또는 히스톤으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1 물질을 포함한다.
본 발명에 따라, 프로타민은 양이온성 담체 물질로서 유용하다. "프로타민"이라는 용어는 아르기닌이 풍부하고 다양한 동물(예컨대 어류)의 정자 세포에서 체세포 히스톤 대신 DNA와 특히 연관된 것으로 밝혀진 비교적 저분자량의 다양한 강염기성 단백질을 가리킨다. 특히, "프로타민"이라는 용어는 강염기성이고, 수용성이며, 열에 의해 응집되지 않고 가수분해에 의해 아르기닌을 양산할 수 있는, 어류의 정자에서 발견되는 단백질을 의미한다. 정제된 형태의 이 물질은 헤파린의 응혈 효과를 무력화하기 위해 인슐린의 장기간-작용 제형에 사용된다.
본 발명에 따라, "프로타민"이라는 용어는 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 수득 또는 유래된 여하한 프로타민 아미노산 서열을 포괄하도록 의도되며 여기에는 그의 단편 및 상기 아미노산 서열이나 그의 단편의 멀티머 형태가 포괄된다. 뿐만 아니라, 이 용어는 특정 목적을 위해 특수하게 설계되고, 천연 또는 생물학적 공급원으로부터 분리될 수 없는 인공적인 (합성) 폴리펩타이드를 포괄한다.
본 발명에 따라 사용되는 프로타민은 설페이트화된 프로타민 또는 염산염 프로타민일 수 있다. 바람직한 일 구체예에서, 본 발명에 설명된 나노입자들의 제조에 사용되는 프로타민 공급원은 등장염 용액 내에 10 mg/ml (1 ml 당 5000 헤파린-무력화 단위)을 상회하는 양으로 프로타민을 함유하는 프로타민 5000이다.
리포좀은 인지질과 같은 베지클-형성 지질의 1 이상의 이중층을 종종 갖는 현미경적 지질 베지클로서 약물을 캡슐화할 수 있다. 본 발명에 따라 다양한 유형의 리포좀이 이용될 수 있고, 이의 비제한적인 예로는, 다중층 베지클(multilamellar vesicles: MLV), 소형 단일층 베지클 (small unilamellar vesicles: SUV), 대형 단일층 베지클(large unilamellar vesicles: LUV), 입체 안정화된 리포좀(sterically stabilized liposomes: SSL), 다엽성 베지클(multivesicular vesicles: MV), 및 대형 다엽성 베지클(large multivesicular vesicles: LMV) 뿐만 아니라 기술분야에 알려진 기타 이중층 형태를 들 수 있다. 리포좀의 크기와 층도(lamellarity)는 제조 방식에 따라 달라질 수 있고 사용될 베지클의 종류 선택은 바람직한 투여 방식에 따라 달라질 수 있다.
층상, 육각형 및 역 육각형 상, 큐빅 상, 미셀, 단일층으로 구성된 역 미셀을 포함하는 수성 매질 중에 지질이 존재할 수 있는, 다른 여러 형태의 초분자성 조직이 있다. 이러한 상들은 DNA 또는 RNA와의 조합에서도 얻을 수 있으며 RNA 및 DNA와의 상호 작용은 위상 상태에 실질적으로 영향을 줄 수 있다. 전술한 상들은 본 발명의 나노미립자상 핵산 제형 내에 존재할 수 있다.
핵산 및 핵산 리포좀으로부터의 핵산 리포플렉스의 형성을 위해, 상정된 핵산 리포플렉스를 제공할 수 있는 모든 적합한 리포좀 형성 방법들이 이용가능하다. 리포좀은 역증발법(reverse evaporation method: REV), 에탄올 주입법, 탈수-재수화법(dehydration-rehydration method: DRV), 초음파처리법 또는 기타 적절한 방법을 이용하여 형성될 수 있다.
리포좀이 형성된 후, 리포좀들은 실제로 균질한 크기 범위를 갖는 리포좀 집단을 얻도록 사이징될 수 있다.
이중층-형성 지질들은 일반적으로 2개의 탄화수소 사슬, 특히 아실 사슬 및 극성 또는 비극성인 헤드기를 갖는다. 이중층-형성 지질은 자연발생적인 지질 또는 합성 기원의 지질로 구성될 수 있고 여기에는 인지질 예컨대 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파타이드산, 포스파티딜이노시톨 및 스킹고마이신이 포함되며, 여기서 2개의 탄화수소 사슬은 일반적으로 약 14-22개의 탄소 원자 길이를 갖고, 다양한 불포화도를 갖는다. 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 기타 지질들로는 당지질 및 스테롤 예컨대 콜레스테롤 및 리포좀에도 사용가능한 그의 다양한 유사체를 들 수 있다.
양이온성 지질은 일반적으로 스테롤, 아실 또는 디아실 사슬과 같은 친지성 모이어티를 가지며, 전체적으로 순 양전하를 갖는다. 지질의 헤드기는 일반적으로 양전하를 지닌다. 양이온성 지질은 1 내지 10가의 양전하, 더욱 좋기로는 1 내지 3가의 양전하, 더욱 좋기로는 1가의 양전하를 갖는다. 양이온성 지질의 예로는 1,2-디-O-옥타데세닐l-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTMA); 디메틸디옥타데실암모늄 (DDAB); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판 (DOTAP); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판 (DODAP); 1,2-디아실옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 1,2-di알킬옥시-3-디메틸암모늄 프로판; 디옥타데실디메틸 암모늄 클로라이드 (DODAC), 1,2-디미리스토일옥시프로필-1,3-디메틸히드록시에틸 암모늄 (DMRIE), 및 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스퍼민 카르복스아미드)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나뮴 트리플루오로아세테이트 (DOSPA)를 들 수 있으며 이에 한정되지 않는다. DOTMA, DOTAP, DODAC, 및 DOSPA가 바람직하다. 가장 바람직한 것은 DOTMA이다.
이에 더해, 본 명세서에 설명된 나노입자들은 좋기로는 구조적 안정성 등을 고려할 때 중성 지질을 추가로 포함한다. 중성 지질은 핵산-지질 복합체의 전달 효율을 감안하여 적절히 선택가능하다. 중성 지질의 예로는 1,2-디-(9Z-옥타데세노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 디아실포스파티딜 콜린, 디아실포스파티딜 에탄올 아민, 세라마이드, 스핑고에미엘린, 세팔린, 스테롤 및 세레브로사이드를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 바람직한 것은 DOPE 및/또는 DOPC이다. DOPE가 가장 바람직하다. 양이온성 리포좀이 양이온성 지질과 중성 지질 양자 모두를 포함할 경우, 양이온성 지질 대 중성 지질의 몰 비율은 리포좀의 안정성 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라, 본 명세서에 설명된 나노입자들은 인지질을 포함할 수도 있다. 인지질은 글리세로인지질일 수 있다. 글리세로인지질의 비제한적인 예로는 3 가지 종류의 지질을 들 수 있다. 즉: (i) 예컨대, 포스파티딜콜린 (PC), 난황 포스파티딜콜린, 천연, 부분적으로 수소첨가되거나 완전히 수소첨가된 형태의 대두-유래 PC, 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 스핑고미엘린 (SM)을 포함하는 쯔비터이온성 인지질; (ii) 음하전된 인지질: 예컨대 포스파티딜세린 (PS), 포스파티딜이노시톨(PI), 포스파타이드산 (PA), 포스파티딜글리세롤 (PG) 디팔미토일 PG, 디미리스토일 포스파티딜글리세롤 (DMPG)을 포함; 메톡시-폴리에틸렌 글리콜-디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (mPEG-DSPE)의 경우처럼 컨쥬게이트가 음하전된 쯔비터이온 인지질을 제공하는 합성 유도체; 및 (iii) 포스포모노에스테르가 O-메틸화되어 양이온성 지질을 형성하는 것인 예컨대 포스파티딜콜린 또는 스핑고미엘린을 포함하는, 양이온성 인지질.
지질 담체에 대한 핵산의 결합(association)은 예컨대
담체가 물리적으로 핵산을 포획하도록 또는 공유결합, 이온결합 또는 수소결합에 의해 또는 비특이적 결합에 의한 흡착 수단에 의해, 담체의 간질(interstitial) 공간을 채우는 핵산에 의해 수행될 수 있다. 결합 방식이 무엇이든, 핵산은 그의 치료적 특성, 즉 항원-인코딩 특성을 견지해야 한다.
본 발명에 따르면, 용어 "질병"은 또한 암 질환을 지칭한다. 용어 "암 질환" 또는 "암" (의학용어: 악성신생물)은 세포 그룹이 조절되지 않는 성장 (정상 한계를 넘어서는 분열), 침입 (인접 조직에 대한 침입 및 파괴) 및 때때로 전이 (림프 또는 혈액을 통해 체내의 다른 위치로 감염)룰 나타내는 질병의 종류를 의미한다. 암의 상기 세가지 악성 종양 성질은 양성 종양과 차별화 되는데, 양성종양은 자가 제한적이고, 침입하거나 전이하지 않는다. 대부분의 암은 예를 들어 팽창한 종양 또는 비정상적 세포 성장으로 형성된 병변 (종양세포 또는 암세포로 불림)을 형성하지만, 일부는 백혈병처럼 형성하지 않는다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 신경교종 및 백혈병을 포함하나 반드시 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 그러한 암의 예로는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 악성 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 주위 암, 위암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성기 및 생식기관의 암종, Hodgkin 병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장세포암, 신장골수암, 중추신경계(CNS) 신생물, 신경외배엽암, 척추축 종양, 신경교종, 수막종 및 뇌하수체 선종을 포함한다. 본 발명에 따른 용어 "암"은 또한 암 전이를 포함한다.
용어 "감염성 질병"은 인체에서 인체로 또는 생물체에서 생물체로 감염될 수 있고, 미생물 제제(예를 들어, 일반적인 감기)에 의해 유발되는 질병을 의미한다. 감염성 질병의 예로는 에이즈 (HIV), A, B 또는 C형 간염, 헤르페스, 대상포진 (수두), 풍진 (풍진 바이러스), 황열, 뎅기열 등 플라비바이러스, 인플루엔자 바이러스, 출혈성 감염병 (마르부르크 또는 에볼라 바이러스), 및 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)와 같은 바이러스성 감염 질환, 레지오넬라병 (레지오넬라), 성병 (예를 들어, 클라미디아 또는 임질), 위궤양 (헬리코박터), 콜레라 (비브리오), 결핵, 디프테리아, 대장균, 포도상 구균, 살모넬라 또는 연쇄구균 (파상풍)에 의한 감염과 같은 박테리아성 감염 질환; 말라리아, 수면병, 리슈만편모충증과 같은 원충 병원균에 의한 감염; 톡소플라즈마증, 즉, 플라스모디움, 트리파노소마, 리슈마니아 및 톡소플라즈마; 또는 예를 들어 크립토코커스 네오포르만스, 히스토플라즈마 칼술라툼, 콕시디오이데스 이미티스, 블라스토미세스 더마티티디스 또는 칸디다 알비칸스에 의해 유발되는 곰팡이 감염을 포함한다.
"자가면역 질환"이라는 용어는 신체가 자체 조직의 일부 성분에 대하여 면역 원성 (즉, 면역계) 반응을 일으키는 질병을 의미한다. 다시 말해서, 상기 면역계가 체내 일부 조직 또는 시스템을 자기로 인식하는 기능을 상실하고, 마치 외부 유입인 것처럼 그것을 표적으로 하고 공격하는 것이다. 자가면역 질환은 주로 하나의 장기가 영향을 받는 (예를 들어, 용혈성 빈혈 및 항-면역성 갑상선염) 것들, 및 자가 면역 질환 과정이 많은 조직 (예를 들면, 전신성 홍반 루푸스)을 통해 확산되는 것들로 분류될 수 있다. 예를 들어, 다발성 경화증은 T 세포가 뇌와 척수의 신경 섬유를 둘러싸고 있는 외장을 공격하여 발생하는 것으로 여겨진다. 이로 인해 조정 상실, 약화 및 흐린 시력이 나타난다. 자가 면역 질환은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 하시모토 갑상선염, 그레이브스 병, 루푸스, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 용혈성 빈혈, 항 면역성 갑상선염, 전신성 홍반 루푸스, 소아 지방변증, 크론 병, 대장염, 당뇨병, 경피증, 건선 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, 면역 반응은 항원 또는 그의 단편, 예컨대 질병-관련 항원을 코딩하는 적절한 mRNA를 대상자에게 도입함으로써 자극될 수 있다.
용어 "항원"은 면역 반응이 생성되는 것에 대한 항원결정부를 포함하는 제제에 관한 것이다. 용어 "항원"은 특정 단백질, 펩타이드, 다당류, 핵산, 특히 RNA 및 DNA 및 뉴클레오타이드를 포함한다. 용어 "항원"은 또한 변형을 통해서만 (예를 들어, 중간에 분자 내에서 또는 신체 단백질로 완성됨으로써) 항원성 및 민감성을 나타내는 물질을 포함한다. 항원은 좋기로는 수지상 세포 또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포와 같은 면역계의 세포에 의해 제공될 수 있다. 또한, 항원 또는 그의 가공 생성물은 T 또는 B 세포 수용체 또는 항체와 같은 면역 글로불린 분자에 의해 인식 가능한 것이 좋다. 바람직한 구체적인 예에서, 항원은 종양-관련 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원과 같은 질병-관련 항원이다.
"질병-관련 항원"이라는 용어는 질병과 관련한 항원을 지칭하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 질병-관련 항원은 숙주의 면역계를 자극하여 세포 항원 특이적 면역 반응 및/또는 질환에 대한 체액성 항체 반응을 일으키는 항원결정부를 함유하는 분자이다. 따라서 질병-관련 항원은 치료 목적으로 사용될 수 있다. 질병-관련 항원은 좋기로는 미생물, 전형적으로는 미생물 항원에 의한 감염과 관련되거나, 암, 전형적으로는 종양과 관련된다.
"항원을 수반하는 질병"이라는 용어는 항원과 관련되어 있는, 예를 들어 항원의 존재 및/또는 발현을 특징으로 하는 것과 같은 질병을 의미한다. 항원과 관련된 질병은 전염성 질병, 자가 면역 질환, 또는 암 질환 또는 간단하게는 암일 수 있다. 상기 언급된 것과 같이, 항원은 종양-관련 항원, 바이러스 항원 또는 박테리아 항원과 같은 질병-관련 항원 일수 있다.
일 구체예에서, 질병-관련 항원은 종양-관련 항원이다. 이 구체예에서, 본 발명은 암 또는 암 전이를 치료하는데 유용할 수 있다. 좋기로는, 병든 장기 또는 조직은 질병-관련 항원을 나타내거나 및/또는 그들의 표면에서 질병 관련 항원과의 결합을 특징으로 하는 암세포와 같은 병든 세포를 특징으로 한다. MHC 클래스 Ⅰ 및 클래스 Ⅱ 펩타이드 또는 핵산, 특히 상기 항원 또는 절편을 코딩하는 mRNA와 같은 손상되지 않은 또는 실질적으로 손상되지 않은 종양 관련 항원 또는 그의 단편의 면역화는 MHC 클래스 Ⅰ 및/또는 클래스 Ⅱ 유형의 반응 유도를 가능하게 하고, 따라서 암세포 및/또는 CD4+ T 세포를 용해시킬 수 있는 CD8+ 세포 독성 T 림프구과 같은 T 세포를 자극한다. 이러한 면역화는 또한 종양 관련 항원에 대한 항체 생산의 결과로 체액성 면역반응 (B 세포 반응)을 유도할 수 있다. 더욱이, 수지상세포 (DC)와 같은 항원 제시 세포 (APC)는 생체 외에서 종양 항원을 코딩하고 있는 핵산으로 형질 감염시킴으로써 MHC 클래스 Ⅰ로 나타난 펩타이드로 로딩될 수 있고 환자에게 투여될 수 있다. 하나의 구체적인 예에서, 용어 "종양-관련 항원"은 세포질, 세포 표면 및 세포 핵으로부터 유래된 암세포의 구성 성분을 나타낸다. 특히, 좋기로는 다량으로 세포 내로 또는 종양 세포에서 표면 항원으로서 생성되는 그러한 항원을 의미한다. 종양 항원의 예는 HER2, EGFR, VEGF, CAMPATH1-항원, CD22, CA-125, HLA-DR, 호지킨-림프종 또는 뮤신-1이 있으나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 종양-관련 항원은 좋기로는 유형 및/또는 발현 수준과 관련하여 종양 또는 암뿐만 아니라 종양 또는 암세포에 특유한 항원을 포함한다. 하나의 구체적인 예에서, "종양-관련 항원"은 정상적인 조건하 즉, 건강한 대상자에서는, 장기 및/또는 조직에서 제한된 수로만 발현되거나 특정 발달 단계에서 특이적으로 발현하는 단백질에 관한 것이다. 예를 들어 종양 관련 항원은 정상 조건하에서 위 조직, 바람직하게는 위 점막에서, 예를 들어 고환 같은 생식기관에서, 예를 들어 태반 같은 영양 융 조직에서 또는 생식세포계열에서 특이적으로 발현될 수 있고, 하나 이상의 종양 또는 암 조직에서 발현되거나 비정상적으로 발현된다. 이러한 맥락에서, "제한된 수"는 좋기로는 3 이하, 더욱 좋기로는 2 또는 1 이하를 의미한다. 본 발명의 측면에서 종양-관련 항원은 예를 들어 분화 항원, 좋기로는 세포형 특이적 분화 항원, 즉 정상 상태하에서 특정 세포 형의 특정 분화 단계, 암/고환 항원으로 특이적으로 발현하는 단백질, 즉, 정상상태하 고환 및 때로는 태반에서 특이적으로 발현하는 단백질 및 생식성 특이 항원을 포함한다. 본 발명의 측면에서, 종양-관련 항원은 좋기로는 정상 조직에서 발현하지 않거나 거의 발현하지 않거나 또는 종양세포에서 돌연변이 된다. 좋기로는, 종양-관련 항원 또는 종양-관련 항원의 이상 발현은 암세포를 확인한다. 본 발명의 측면에서, 대상자 예를 들어, 암 질병을 앓고 있는 환자의 암세포에서 발현되는 종양-관련 항원은 좋기로는 상기 대상자의 자가 단백질이다. 바람직한 구체적인 예에서, 본 발명의 내용에 따른 종양-관련 항원은 정상 상태하에서 특히 비-필수적인 조직 또는 장기 즉, 면역계가 손상을 입은 경우 대상자를 사망에 이르지 않게 하는 조직 또는 장기로, 또는 면역계에 의해 전혀 또는 거의 접근할 수 없는 신체의 장기 또는 구조에서 발현된다. 좋기로는, 종양-관련 항원은 MHC 분자의 측면에서 발현된 암세포에 의해 발현된다.
종양 면역 요법, 특히 종양 예방접종에서 표적 구조로서 본 발명에서 고려되는 바와 같은 종양 관련 항원의 기준을 이상적으로 충족시키는 분화 항원의 예는 CLDN6 및 CLDN18.2와 같은 Claudin 계통의 세포 표면 단백질이 있다. 그러한 분화 항원은 다양한 기원의 종양에서 발현되며, 그들의 선택적 발현 (독성 관련 정상 조직에서 발현되지 않음) 및 원형질막으로의 위치부여에 의해 항체 매개 암 면역요법과 관련하여 표적 구조로서 특히 적합하다.
본 발명에서 유용할 수 있는 항원의 다른 예로는 p53, ART-4, BAGE, 베타-카테닌/m, Bcr-abL CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK4/m, CEA, CLAUDIN-12, c-MYC, CT, Cyp-B, DAM, ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gap100, HAGE, HER-2/neu, HPV-E7, HPV-E6, HAST-2, hTERT (또는 hTRT), LAGE, LDLR/FUT, MAGE-A, 좋기로는 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, 또는 MAGE-A12, MAGE-B, MAGE-C, MART-1/Melan-A, MC1R, Myosin/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NF1, NY-ESO-1, NY-BR-1, p190 minor BCR-abL, Pm1/RARa, PRAME, proteinase 3, PSA, PSM, RAGE, RU1 또는 RU2, SAGE, SART-1 또는 SART-3, SCGB3A2, SCP1, SCP2, SCP3, SSX, SURVIVIN, TEL/AML1, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, TPTE 및 WT, 좋기로는 WT-1이 있다.
용어 "바이러스 항원"은 항원 성질을 가지는 바이러스 성분 즉, 개체에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 바이러스 성분을 의미한다. 바이러스 항원은 바이러스성 리보뉴클레오단백질 또는 피막 단백질 일 수 있다.
용어 "박테리아 항원"은 항원성질을 가지는 박테리아 성분 즉, 개체에서 면역 반응을 일으킬 수 있는 박테리아 성분을 의미한다. 박테리아 항원은 박테리아의 세포벽 또는 세포질 막으로부터 유도될 수 있다.
"항원 프로세싱"이라 함은 항원의 상기 항원의 단편들인 프로세션 산물로 분해 (예컨대 단백질의 펩타이드로의 분해) 및 이들 단편들 하나 이상과 세포, 좋기로는 특이적 T 세포에 대한 항원 제시 세포에 의한 제시를 위한 MHC 분자와의 연계 (예컨대 결합을 통해)를 가리킨다.
본 명세서에서 사용된 용어 "면역 반응"은 박테리아 또는 바이러스, 세포 또는 물질과 같은 면역 원성 생물체와 같은 면역계의 반응에 관한 것이다. 용어 "면역 반응"은 타고난 면역 반응 및 적응 면역 반응을 포함한다. 좋기로는, 면역 반응은 면역 세포의 활성, 시토카인 생합성 및/또는 항체 생산의 유도와 관련된다. 면역 반응은 수지상 세포 및/또는 대식세포와 같은 항원 제시 세포의 활성화 단계, 상기 항원 제시 세포에 의한 항원 또는 그의 항원의 제시 단계 및 이러한 제시에 기인한 세포독성 T 세포의 활성화 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
"치료하다" 또는 "치료"라는 용어는 개체의 건강 상태의 개선 및/또는 수명 연장(증진)에 관한 여하한 처치에 관한 것이다. 상기 치료는 개체의 질병을 제거하거나, 개체의 질병 발병을 정지 또는 둔화시키거나, 개체에 있어서 질병의 발병을 억제 또는 둔화시키거나, 개체에 있어서 증상의 빈도 또는 위중도를 감소시키거나 및/또는 현재 질병에 걸려 있거나 걸린 적이 있는 개체에 있어서 재발을 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
특히, 용어 "질병의 치료"는 치료, 지속기간의 단축, 개선, 질병 또는 그의 증상의 진행 또는 악화를 늦추거나 방지하는 것을 포함한다.
용어 "면역 요법"은 좋기로는 특이적 면역 반응 및/또는 면역 이펙터 기능(들)과 연관된 치료에 관한 것이다.
용어 "면역화" 또는 "백신 접종"은 치료적 또는 예방적인 이유로 대상자를 치료하는 과정을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "대상자" 또는 "개체"는 바람직하게는 포유류에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 측면에서 포유류는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 양, 소, 염소, 돼지, 말 등과 같은 가축 동물, 작은 쥐, 큰 쥐, 토끼, 기니피그 등과 같은 실험용 동물뿐만 아니라 동물원의 동물과 같은 포획 동물이 있다. 바람직한 구체적인 예에서, 대상자는 사람이다.
"항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)"라는 용어는 그 세포 표면상 (또는 세포 표면에서) 적어도 하나의 항원 또는 항원 단편을 디스플레잉, 획득 및/또는 제시할 수 있는 다향한 세포들에 관한 것이다. 항원-제시 세포는 프로페셔널 항원 제시 세포와 비-프로페셔널 항항원 제시 세포로 구분가능하다.
"프로페셔널 항원 제시 세포"라는 용어는 나이브 T 세포와의 상호반응에 요구되는 주요 조직적합 복합체 클래스 II (MHC 클래스 II)를 구성적으로 발현하는 항원 제시 세포에 관한 것이다. 만일 T 세포가 항원 제시 세포 막 상에서 MHC 클래스 II 분자 복합체와 상호반응하면, 그 항원 제시 세포는 T 세포의 활성화를 유도하는 공동-자극 분자를 생산한다. 프로페셔널 항원 제시 세포는 수지상 세포 및 대식세포를 포함한다
"비-프로페셔널 항원 제시 세포"라는 용어는 MHC 클래스 II 분자를 구성적으로 발현하지는 않지만, 인터페론-감마와 같은 특정 시토카인에 의한 자극시에는 발현하는 항원 제시 세포에 관한 것이다. 예를 들어, 비-프로페셔널 항원 제시 세포에는 섬유아세포, 흉선 상피세포, 갑상선 상피세포, 교질세포, 췌장 베타세포 또는 혈관내피세포들이 포함된다.
"주요 조직적합 복합체(major histocompatibility complex)"라는 용어 및 이의 약어 "MHC"에는 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자가 포함되고, 모든 척추동물에서 발생하는 유전자들의 복합체와 관련이 있다. MHC 단백질 또는 분자들은 MHC 단백질 또는 세포가 펩타이드와 결합하여 T 세포 수용체에 의한 인식을 위해 이들을 제시하는, 면역반응에 있어 림프구와 항원 제시세포 또는 병에걸린 세포들 간의 시그널링에 있어 중요하다. MHC에 의해 인코딩된 단백질들은 세포 표면 상에서 발현되고 자기 항원(세포 자신으로부터의 펩타이드 단편) 및 비자기 항원(예컨대 침습 미생물의 단편) 양자 모두를 T 세포에 대해 디스플레이한다.
본 발명에 있어서 "키메라 항원 수용체(CAR)"라는 용어는 "키메라 T 세포 수용체" 및 "인공 T 세포 수용체"와 동의어이다.
이 용어들은 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포 상에 모노클로날 항체의 특이성과 같은 임의적 특이성을 부여하는, 조작된 수용체에 관한다. 이러한 방식으로,다수의 암-특이 T 세포들이 입양세포(adoptive cell) 전달을 위해 생성될 수 있다. 따라서, CAR은 예컨대 T 세포 자신의 T 세포 수용체 대신 또는 그에 더해 T 세포 상에 제시될 수 있다. 이러한 T 세포들은 표적 세포의 인식을 위해 항원의 프로세싱 및 제시를 반드시 요구하지는 않으며 오히려 좋기로는 표적 세포 상에 제시되는 항원 특이성을 인식할 수 있다. 좋기로는, 상기 CAR은 세포 표면 상에서 발현된다. 본 발명의 목적 상 CAR을 포함하는 T 세포는 본 발명에서 사용된 바와 같은 "T 세포"라는 용어에 의해 포괄된다.
본 발명에 따라, 용어 "CAR" (또는 "키메라 항원 수용체")는 암 세포와 같은 표적 세포 상의 표적 구조(예컨대 항원)을 인식하고, 즉 결합하고 (예컨대 표적 세포 표면 상에서 발현된 항원에 대한 항원 결합 도메인의 결합에 의해) 세포 표면 상에서 상기 CAR을 발현하는 T 세포와 같은 면역 이펙터 세포에 특이성을 부여할 수 있는, 단일 분자 또는 분자들의 복합체를 포함하는 인공 수용체에 관한 것이다. 좋기로는, CAR에 의한 표적 구조의 인식은 상기 CAR을 발현하는 면역 이펙터 세퍼의 활성화를 결과시킨다. CAR은 전술한 바와 같은 1 이상의 도메인을 포함하는 상기 단백질 유닛을 포함할 수 있다. "CAR"이라는 용어는 T 세포 수용체들은 포함하지 않는다.
일 구체예에서, 모노클로날 항체로부터 유래된 단쇄 가변부 단편(single-chain variable fragment: scFv)은 CD3-제타 트랜스막 및 엔도도메인에 융합된다. 이러한 분자들은 표적 세포 상에서 scFv에 의한 그의 항원 표적 인식에 응답하여 제타 시그널의 통과 및 표적 항원을 발현하는 표적 세포의 살해를 결과시킨다. 역시 사용가능한 항원 인식 도메인은 특히 T 세포 수용체 (TCR) 알파 및 베타 단쇄를 포함한다. 실상 높은 친화도로 주어진 표적에 결합하는 것이면 거의 모두 항원 인식 영역으로 사용될 수 있다.
항원 인식에 이어, 수용체들은 응집하고 시그널이 세포로 전달된다. 이와 관련하여, "T 세포 시그널링 도메인"은, 항원 결합 후 T 세포에 활성화 시그널을 전달하는 도메인, 좋기로는 엔도도메인이다.가장 흔히 사용되는 엔도도메인 성분은 CD3-제타이다.
키메라 항원 수용체를 발현하는 CAR-조작된 T 세포들을 이용한 입양세포 전달 치료법은, CAR-변형된 T 세포를 조작하면 어떠한 종양 항원이든 표적화할 수 있기 때문에 유망한 항암 치료법이다. 예를 들어, 환자의 T 세포를 유전자 조작(유전자 변형)하여 그 환자의 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 지향된 CAR를 발현시킨 다음 환자에게 다시 주입할 수 있다.
본 발명에 따라, CAR은 T 세포 수용체의 기능을 대체할 수 있고, 특히 T 세포와 같은 세포에 대해 세포용해 활성과 같은 반응성을 부여할 수도 있다. 그러나, 항원 펩타이드-MHC 복합체에 대한 T 세포 수용체의 결합과 대조적으로, CAR은 특히 세포 표면 상에서 발현될 경우 항원에 결합할 수 있다.
본 발명에 따라, CARs은 일반적으로 3개의 도메인을 포함할 수 있다.
제1 도메인은 항원을 인식하여 결합하는 결합 도메인이다.
제2 도메인은 공동-자극(co-stimulation) 도메인이다. 공동-자극 도메인은 CAR이 표적화 모이어티에 결합하면 세포독성 림프구의 증식 및 생존을 향상시킨다. 공동-자극 도메인의 정체성은 CAR에 의한 표적화되니 모이어티의 결합시 세포성 증식 및 생존을 증강시키는 능력이라는 측면에서만 제한된다. 적절한 공동-자극 도메인에는 활성화된 T 세포 상에서 발현된 CD28-수퍼패밀리 공동-자극 분자, CD28, CD137 (4-1BB), 종양괴사인자(TNF) 수용체 패밀리 멤버, CD134 (OX40), 수용체의 TNFR-수포패밀리 멤버, 및 CD278 (ICOS)이 포함된다. 통상의 기술자라면 본 발명에 악영향을 미침이 없이 전술한 공동-자극 도메인들의 서열 변이체들이 사용될 수 있고, 이들 변이체들이 모델로 삼은 도메인과 동일 또는 유사한 활성을 상기 변이체들이 갖는다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변이체들은 이들이 유래된 도메인의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 일부 구체예에서, CAR 구조물(constructs)은 2개의 공동-자극 도메인을 갖는다. 특정 조합들은 4개의 전술한 도메인들의 가능한 모든 변이체들을 포함하는 반면, 특정 구체예들은 CD28+CD137 (4-1BB) 및 CD28+CD134 (OX40)를 포함한다.
제3 도메인은 활성화 시그널링 도메인 (또는 T 세포 시그널링 도메인)이다. 활성화 시그널링 도메인은 항원에 대한 CAR의 결합후 세포독성 림프구를 활성화시키는 역할을 한다. 활성화 시그널링 도메인의 정체성은 이것이, CAR에 의한 항원 결합 후 선택된 세포독성 림프구의 활성화를 유도하는 능력을 가진다는 점에 의해서만 제한된다. 적절한 활성화 시그널링 도메인에는 T 세포 CD3[제타] 사슬 및 Fc 수용체 [감마]가 포함된다. 통상의 기술자는 이들 전술한 활성화 시그널링 도메인의 서열 변이체들이 본 발명에 악영향을 미침이 없이 사용될 수 있고, 상기 변이체들이 이들이 모델로 삼은 도메인과 동일 또는 유사한 활성을 갖는다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변이체는 이들이 유래된 도메인의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 서열 동일성을 갖는다.
CARs은 3개의 도메인을 융합 단백질의 형태로 함께 포함할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 일반적으로 결합 도메인, 1 이상의 공동-자극 도메인 및 활성화 시그널링 도메인을 포함한다. 그러나, CARs은 이러한 배열로 한정되지 않고 다른 배열도 허용가능하며, 결합 도메인, 활성화 시그널링 도메인 및 1 이상의 공동-자극 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 항원과 자유롭게 결합하여야 하므로, 융합 단백질 내 결합 도메인의 위치는 일반적으로 세포 외부상의 영역 디스플레이가 달성될 수 있도록 하여야 할 것이다. 같은 방식으로, 공동-자극 도메인 및 활성화 시그널링 도메인은 세포독성 림프구의 활성 및 증식을 유도하는 역할을 하므로, 융합 단백질은 일반적으로 이들 2 도메인을 세포 내부에서 디스플레이한다. CARs는 융합 단백질의 세포 표면으로의 적절한 이출을 확실히 하기 위한 시그널 펩타이드, 융합 단백질이 일체형 막 단백질로서 유지될 수 있도록 하기 위한 트랜스막 도메인, 및 결합 도메인에 유연성을 부여하여 항원에 대한 강력한 결합을 허용하는 힌지 도메인 (또는 스페이서 영역)과 같은 부가적인 요소들을 포함할 수 있다.
본 발명의 CAR 시스템과 관련하여 사용되는 세포들은 좋기로는 T 세포, 특히 세포독성 림프구, 좋기로는 세포독성 T 세포, 내추럴 킬러 (NK) 세포 및 림포카인-활성화 킬러 (LAK) 세포로부터 선택되는 세포인 것이 바람직하다. 이들 세포독성 림프구 각각은 활성화되면, 표적 세포의 파괴를 촉발한다. 예컨대, 세포독성 T 세포들은 다음 수단 중 어느 하나 또는 양자 모두에 의해 표적의 파괴를 촉발한다. 첫 번째로, T 세포는 활성화되면 퍼포린, 그랜자임 및 그래뉼리신과 같은 세포독소를 방출한다. 퍼포린과 그래뉼리신ㄴ 표적 세포에 구멍(pores)을 내고, 그랜자임은 세포 내로 들어가서 세포의 아폽토시스(프로그램된 세포 사멸)를 유도하는, 세포질 내 카스파제 캐스케이드를 촉발한다. 두 번째로, 아폽토시스는 T 세포와 표적 세포들 간의 Fas-Fas 리간드 상호반응을 통해 유도될 수 있다. 세포독성 림프구는 이종 세포 또는 대립유전자 세포도 사용가능하지만, 동종 세포인 것이 좋다.
비-바이러스-기반 DNA 형질감염, 트랜스포존-기반 시스템 및 바이러스-기반 시스템을 비롯하여, CAR 구조물을 T 세포 내로 도입하는데 다양한 방법이 이용될 수 있다. 비-바이러스-기반 DNA 형질감염은 삽입 돌연변이 위험성이 낮다. 트랜스포존-기반 시스템은 통합 요소를 함유하지 않는 플라스미드보다 효과적으로 트랜스유전자를 통합시킬 수 있다. 바이러스-기반 시스템은 γ-레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터의 사용을 포함한다. γ-레트로바이러스는 비교적 생산하기 쉽고 효과적이고도 영구족으로 T 세포를 형질도입할 수 있으며 일차 인간 T 세포에 있어 통합 관접에서 안전한 것으로 이미 입증된 바 있다. 렌티바이러스 벡터 역시도 T 세포를 효과적이고도 영구적으로 형질도입시키지만 제조 단가가 더 비싸다. 이들은 또한 레트로바이러스 기반 시스템보다 잠재적으로 더 안전하다.
본 명세서에 설명된 RNA (예컨대 전사 주형으로서 본 발명에 설명된 핵산 분자를 사용하여 수득된 RNA)는 또한 체세포를 줄기-유사세포, 즉 줄기세포 특징을 갖는 세포로 시험관내 또는 생체내에서 재프로그램 또는 탈-분화시키는데 유용하다. 이것은 세포내에서 재프로그래밍 또는 탈-분화 프로세스를 개시하기 위해 시험관내 또는 생체내에서 재프로그래밍 인자들을 일시적으로 발현하는 것과 연관될 수 있다. 따라서 일 구체예에서, 본 발명에 설명된 RNA와 같은 핵산에 의해 인코딩된 펩타이드 또는 단백질은 체세포를 줄기세포 특징을 갖는 세포들로 재프로그래밍해주는 인자이다. 줄기-유사 세포들은 배아 또는 태아 생성 없이 본 발명에 따라 제공될 수 있다. 줄기세포 특징, 특히 전능성을 갖는 세포로의 체세포의 탈-분화는 체세포의 탈-분화를 유도하는 RNA 인코딩 인자들을 체세포로 도입하고(재프로그램된 전사 인자(rTF: reprogramming transcription factors라고도 칭함) 세포의 탈-분화를 허용하는 체세포들을 배양하으로써 수행될 수 있다. 탈-분화된 후, 세포는 뉴런, 조혈세포, 근육세포, 상피세포 및 기타 세포유형과 같은 동일 또는 상이한 체세포 종류로 재-분화되도록 유도될 수 있다. 따라서, 이러한 줄기-유사 세포들은 "세포 요법"에 의한 퇴행성 질환의 치료에 있어 의학적 용도를 가지며 심장 질환, 신경질환, 내분비 질환, 혈관 질환, 망막 질환, 피부 질환, 근육-골격 질환 및 기타 질환의 치료를 위한 신규한 치료 전략에 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 (i) 체세포를 포함하는 세포 집단을 제공하는 단계, (ii) 줄기세포 특징을 갖는 세포로 체세포의 재프로그래밍을 허용하는 1 이상의 인자들을 발현할 수 있는 본 발명의 RNA를 체세포 내로 도입하는 단계, 및 (iii) 줄기세포 특징을 갖는 세포를 발달시키는 단계를 포함하는, 줄기세포 특징을 갖는 세포를 제공하기 위한 방법에 관한 것이기도 하다. 일 구체예에서, 이 방법은 줄기세포 특징을 갖는 세포로의 체세포의 재프로그래밍을 증강시키는 miRNA를 체세포 내로 도입하는 것을 더 포함한다.
일 구체예에서, 1 이상의 인자들은 OCT4 및 SOX2를 포함한다. 이 1 이상의 인자들은 KLF4 및/또는 c-MYC 및/또는 NANOG 및/또는 LIN28을 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 1 이상의 인자들은 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC를 포함하고 LIN28 및 임의로 NANOG를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 1 이상의 인자들은 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28을 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 적어도 1종의 히스톤 데아세틸라제 저해제의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하되, 여기서 적어도 1종의 히스톤 데아세틸라제 저해제는 좋기로는 발프로산, 소듐 부티레이트, 트리코스타틴 A 및/또는 스크립타이드를 포함하는 것이 바람직하다.
일 구체예에서, 단계 (iii)은 배아 줄기세포 배양 조건 하에 체세포를 배양하는 것을 포함한다.
일 구체예에서, 줄기세포 특징에는 배아 줄기세포 형태학이 포함된다.
일 구체예에서, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 정상적인 핵형(karyotypes)을 가지며, 텔로머라제 활성을 발현하고, 배아 줄기세포에 특징적인 세포표면 마커들을 발현하거나 및/또는 배아 줄기세포에 특징적인 유전자들을 발현한다.
일 구체예에서, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 전능성 상태를 나타낸다.
일 구체예에서, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 세 가지 모든 일차 생식층의 진행된 유도체들로 분화될 발달 잠재능을 갖는다.
일 구체예에서, 체세포는 폐 섬유아세포, 포피 섬유아세포 또는 피부 섬유아세포와 같은 섬유아세포이다. 좋기로는 체세포는 인간 세포이다.
일 구체예에서, RNA는 전기천공 또는 리포펙션에 의해 체세포 내로 도입된다. 일 구체예에서, RNA는 체세포 내로 반복적으로 도입된다.
일 구체예에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 특정 인자들을 발현할 수 있는 RNA의 도입에 의해 상기 인자들이 장기간, 좋기로는 적어도 10 일, 좋기로는 적어도 11 일 및 더욱 좋기로는 적어도 12 일 동안 발현된다. 이러한 장기간의 발현을 달성하기 위해, RNA는 좋기로는 주기적으로(즉 반복적으로) 세포 내로 2회 이상, 좋기로는 전기천공에 의해 도입된다. 바람직하게는, RNA는 세포 내로 적어도 2회, 더욱 좋기로는 적어도 3 회, 더욱 좋기로는 적어도 4 회 더더욱 좋기로는 적어도 5 회, 좋기로는 최대 6 회, 더욱 좋기로는 최대 7 회, 더더욱 좋기로는 최대 8, 9 또는 10 회, 좋기로는 적어도 10 일, 좋기로는 적어도 11 일 및 더욱 좋기로는 적어도 12일 동안 도입되어 1 이상의 인자들이 장기간 발현될 수 있도록 한다. 좋기로는, RNA의 반복적 도입들 간의 경과 기간은 24 시간 내지 120 시간, 좋기로는 48 시간 내지 96 시간이다. 일 구체예에서, RNA의 반복 도입들 간의 경과 기간은 72 시간 이하, 좋기로는 48 시간 이하 또는 36 시간 이하이다. 일 구체예에서, 다음 회차의 전기천공에 앞서, 세포들을 이전 회차의 전기천공으로부터 회수한다. 어떠한 경우든, 재프로그램 프로세스를 뒷받침하는 기간 및 양으로 세포내에서 인자들이 발현되도록 조건이 선택되어야 한다.
"줄기세포"는 자가 재생할 수 있고, 미분화 상태로 유지될 수 있으며 분화될 수도 있는 능력이 있는 세포이다. 줄기세포는 그것이 자연적으로 거주하는 동물의 적어도 일생에 걸쳐 무제한적으로 분열할 수 있다. 줄기세포는 말단에서 분화되지 않는다; 이것은 분화 경로의 말기 단계에서가 아니다. 줄기세포가 분열할 경우, 각각의 딸 세포는 줄기세포로 남아있거나 또는 말단 분화로 진행되는 경로로 갈아탈 수 있다.
분화전능성(Totipotent) 줄기세포는 분화전능성 분화 특성을 갖고 완전한 생명체로 발달할 수 있는 세포이다. 이 특성은 정자에 의해 난모세포가 수정된 후 8-세포 단계까지 세포가 지니는 성질이다. 이 세포들이 분리되어 자궁 내로 이식되면, 이들은 완전한 생명체로 발달할 수 있다.
다분화능(Pluripotent) 줄기세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽층으로부터 유래하는 다양한 세포 및 조직으로 발달가능한 세포들이다. 수정 4-5일 후에 생성되는, 배아세포 내부에 위치하는 내부세포괴로부터 유래하는 다분화능 줄기세포들은 "배아 줄기세포"라 칭해지며 다양한 다른 조직 세포로 분화될 수 있지만 살아있는 새로운 생명체는 형성하지 못한다.
다능성(Multipotent) 줄기세포는 보통 기원이되는 장기 및 조직에 특이적인 세포 종류로만 분화하는 줄기세포이다. 다능성 줄기세포들은 태아, 신생아 및 성년기 동안 여러가지 조직 및 장기의 성장과 발달에 관여할 뿐 아니라 성인 조직 항상성 유지 및 조직 손상시 재생을 유도하는 기능에도 관여한다. 조직-특이적인 다능성 세포들은 집합적으로 "성체 줄기세포"라 칭해진다.
"배아 줄기세포: 또는 "ESC"는 배아로부터 분리되거나 배아 내에 존재하는 줄기세포이다. 이것은 생명체 내에 존재하는 각각의 그리고 모든 세포로 분화되는 능력을 갖는 다분화능 세포 또는 두 종류 이상의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력이 있는 다능성 세포일 수 있다.
본 발명에서 "배아(embryo)"는 그것이 발달하는 동물의 초기 단계를 가리킨다. 이 단계들은 착상(transplantation) 및 장배형성(gastrulation)에 의해 특징지어지는데 여기서 이들 세 가지 배엽층들은 각각의 장기 및 장기 시스템으로의 배엽층의 분화에 의해 정의 및 수립된다. 세 가지 배엽층들은 내배엽, 외배엽 및 중배엽이다.
"배반포(blastocyst)"는 수정된 난자가 분할되고, 양수가 충전된 캐비티를 둘러싼 세포의 구형층이 형성되거나 또는 형성된, 발달 초기 단계의 배아이다. 세포의 이러한 구형 층은 영양외배엽(trophectoderm)이다. 영양외배엽 내부에는 내부세포괴(inner cell mass: ICM)라 칭해지는 세포 응집체가 있다. 영양외배엽은 태반의 전구체이고 ICM은 배야의 전구체이다.
체세포 줄기세포라고도 칭해지는 성체 줄기세포는 성인에게서 발견되는 줄기세포이다. 성체 줄기세포는 분화된 조직에서 발견되며, 스스로 재생할 수 있고 제한적이기는 하지만, 그의 기원이 되는 조직의 특수항 세포 유형을 생성하도록 분화될 수 있다. 이의 예로는 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포 및 신경 줄기세포를 들 수 있다
"분화된 세포"는 보다 특수한 형태 또는 기능을 갖도록 점진적인 발달적 변화를 겪은 성숙한 세포이다. 세포 분화는 세포가 명확히 특수화된 세포 종류로 성숙함에 따라 겪은 프로세스이다. 분화된 세포들은 뚜렷한 특징을 가지며, 특이한 기능을 수행하고, 그들의 덜 분화된 대응세포에 비해 분열 가능성이 적다.
"미분화(undifferentiated)" 세포, 예컨대 미성숙, 배아 또는 원시 세포는 일반적으로 비특이적인 외관을 가지며 여러가지의 비-특이적 활동을 수행할 수 있고, 분화된 세포에 의해 일반적으로 수행되는 기능을 수행하지 못할 수 있다.
"체세포(Somatic cell)"는 모든 또는 여하한 분화된 세포를 가리키며 줄기세포, 생식세포 또는 배우자(gametes)는 포함하지 않는다. 좋기로는 본 발명에서 "체세포"라 함은 말단 분화된(terminally differentiated) 세포를 가리킨다.
본 발명에서 세포와 관련하여 "헌신된(committed)"이라는 용어는 특정 기능에 영구적으로 헌신하는 세포를 가리킨다. 헌신된 세포는 "말단 분화된 세포"라 칭하기도 한다.
본 발명에서 "분화"라 함은 세포가 특정 형태 또는 기능을 갖도록 적응하는 것을 의미한다. 세포에서, 분화는 보다 헌신된 세포로 이끈다.
본 발명에서 "탈분화(de-differentiation)"라 함은 형태 또는 기능의 특이성이 상실된 것을 말한다. 세포에서, 탈분화는 덜 헌신된 세포로 이끈다.
본 발명에서 "재프로그래밍(reprogramming)"은 세포의 유전자 프로그램의 복귀(resetting)을 가리킨다. 재프로그램된 세포는 좋기로는 다분화능을 나타낸다.
"탈분화된" 및 "재프로그램된"이라는 용어 또는 이와 유사한 용어들은 줄기세포 특징을 갖는 체세포-유래된 세포들을 가리키는 것으로서 본 발명에서 호환적으로 사용된다. 그러나, 이들 용어들이 메카니즘적 또는 기능적 고려에 의해 본 발명에 개시된 발명 대상을 한정하는 것으로 의도되는 것은 아니다.
"줄기세포 특징의 발달을 유도하는 RNA" 또는 "체세포를 줄기세포 특징을 갖는 세포로 재프로그래밍하는 것을 허용하는 1 이상의 인자들을 발현할 수 있는 RNA"라는 용어는 체세포 내로 도입될 경우 그 세포가 탈분화하도록 유도시키는 RNA를 가리킨다.
본 발명에서, "생식세포(germ cell)"라 함은 정모세포 또는 난모세포와 같은 생식세포 또는 생식세포로 발달하게 되는 세포를 가리킨다.
본 발명에서, "다분화능"이라 함은 태반의 세포 또는 자궁의 기타 지지세포들을 제외한 모든 세포가 될 수 있는 세포를 가리킨다.
"줄기세포 특징을 갖는 세포", "줄기세포 성질을 갖는 세포" 또는 "줄기 유사 세포"라는 표현은, 비록 분화된 비줄기 체세포로부터 유래된 것이지만, 줄기세포, 특히 배아 줄기세포에 있어 전형적인 1 이상의 성질들을 나타내는 세포들을 가리키는데 사용된다. 이러한 특징들에는 조밀한 콜로니, 높은 핵 대 세포질 비율 및 뚜렷한 뉴클레올리(prominent nucleoli), 정상적인 핵형, 텔로머라제 활성의 발현, 배아 줄기세포에 특징적인 세포 표면 마커의 발현, 및/또는 배아 줄기세포에 특징적인 유전자의 발현이 포함된다. 배아 줄기세포에 특징적인 세포 표면 마커는 예컨대 단계-특이적 배아 항원-3 (SSEA-3), SSEA-4, 종양-관련 항원-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, 및 TRA-2-49/6E로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 들 수 있다. 배아 줄기세포에 특징적인 유전자는 예컨대 내인성 OCT4, 내인성 NANOG, 성장 및 분화 인자 3 (GDF3), 감소된 발현 1 (REX1), 섬유아세포 성장인자 4 (FGF4), 배아 세포-특이 유전자 1 (ESG1), 발달성 다분화능-관련 2 (DPPA2), DPPA4, 및 텔로머라제 역전사효소 (TERT)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 줄기세포에 있어 전형적인 1 이상의 특징에는 다분화능이 포함된다.
본 발명의 일 구체예에서, 줄기세포 특징은 배아 줄기세포 형태학을 포하하며, 여기서 상기 배아 줄기세포 형태학은 좋기로는 조밀한 콜로니, 높은 핵 대 세포질 비율 및 뚜렷한 뉴클레올리로 이루어진 군으로부터 선택되는 형태학적 기준을 포함하는 것이 바람직하다. 특정 구체에에서, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 정상적인 핵형, 텔로머라제 활성의 발현, 배아 줄기세포에 특징적인 세포 표면 마커의 발현, 및/또는 배아 줄기세포에 특징적인 유전자의 발현이 포함된다. 배아 줄기세포에 특징적인 세포 표면 마커는 단계-특이적 배아 항원-3 (SSEA-3), SSEA-4, 종양-관련 항원-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, 및 TRA-2-49/6E로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 들 수 있고, 배아 줄기세포에 특징적인 유전자는 내인성 OCT4, 내인성 NANOG, 성장 및 분화 인자 3 (GDF3), 감소된 발현 1 (REX1), 섬유아세포 성장인자 4 (FGF4), 배아 세포-특이 유전자 1 (ESG1), 발달성 다분화능-관련 2 (DPPA2), DPPA4, 및 텔로머라제 역전사효소 (TERT)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
좋기로는, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 탈분화된 및/또는 재프로그램된 체세포이다. 좋기로는, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 다분화능 상태와 같은 배아 줄기세포의 기본적인 특징을 나타낸다. 좋기로는, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 세 가지 모든 원시배엽층의 진행된 유도체들로 분화되는 발달적 잠재능을 갖는다. 일 구체예에서, 일차 배엽층은 내배엽이고 진행된 유도체는 창자-유사한 상피조직이다. 또 다른 구체에에서, 일차 배엽층은 중배엽이고 진행된 유도체는 횡문근 및/또는 연골이다. 또 다른 구체예에서, 일차 배엽층은 외배엽이고 진행된 유도체는 신경 조직 및/또는 표피 조직이다. 바람직한 일 구체예에서, 줄기세포 특징을 갖는 세포들은 신경 세포 및/또는 심장 세포로 분화될 발달 잠재능을 갖는다.
일 구체예에서, 체세포는 중간엽 표현형을 갖는 배아 줄기세포 유래된 체세포이다. 바람직한 일 구체예에서, 체세포는 섬유아세포 예컨대 태아 섬유아세포 또는 출생후 섬유아세포 또는 각질세포, 좋기로는 모낭 유래된 각질세포이다. 또 다른 구체예에서, 섬유아세포는 폐 섬유아세포, 포피 섬유아세포 또는 피부 섬유아세포이다. 특정 구체예에서, 섬유아세포는 American Type Culture Collection (ATCC)에 Catalog No. CCL-186로 기탁된 섬유아세포, American Type Culture Collection (ATCC)에 Catalog No. CRL-2097로 기탁된 섬유아세포, 또는 American Type Culture Collection (ATCC)에 Catalog No. CRL-2522로 기탁된 섬유아세포, 또는 System Biosciences에 의해 catalog no. PC501A-HFF로 배포된 섬유아세포이다. 일 구체예에서, 섬유아세포는 성체 인간 피부 섬유아세포이다. 좋기로는, 체세포는 인간 세포이다. 본 발명에서, 체세포는 유전자 변형될 수 있다.
본 발명에서 RNA에 의한 발현과 연계되어 사용될 경우 "인자(factor)"라는 용어는 단백질 및 펩타이드 그리고 이의 유도체 및 변이체를 포함한다. 예컨대, 용어 "인자"는 OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 및 c-MYC를 포함한다.
인자들은 임의의 동물 종: 예컨대 포유동물 및 설치류의 것일 수 있다. 포유동물의 비제한적인 예로는 인간 및 비인간 영장류를 들 수 있다. 영장류의 비제한적인 예로는 인간, 침팬지, 개코원숭이, 시노몰구스 원숭이 및 기타 신세계 및 구세계 원숭이를 들 수 있다. 설치류로는 마우스, 래트, 기니픽, 햄스터 및 게르빌루스 쥐(gerbil)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따라, 체세포를 줄기세포 특징을 갖는 세포들로 재프로그래밍할 수 있는 1 이상의 인자들은 (i) OCT4 및 SOX2, (ii) OCT4, SOX2, 및 NANOG와 LIN28 중 일방 또는 양방, (iii) OCT4, SOX2 및 KLF4와 c-MYC 중 일방 또는 양방으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인자들의 어셈블리를 포함한다. 일 구체예에서, RNA에 의해 발현될 수 있는 상기 1 이상의 인자들에는 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28 또는 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC가 포함된다. 좋기로는, RNA는 전기천공 또는 마이크로인젝션에 의해 상기 체세포 내로 도입된다. 좋기로는, 본 발명은 예컨대 배아 줄기세포 배양 조건, 좋기로는 미분화 상태로 다분화능 줄기세포를 유지하는 적절한 조건 하에서 체세포를 배양시킴으로써, 줄기세포 특징을 갖는 세포들의 발달을 허용하는 단계를 더 포함한다.
OCT4는 진핵 POU 전사 인자의 전사 인자이며 배아 줄기세포의 다분화능의 지시자이다. 이것은 모계 발현되는 Octomer 결합 단백질이다. 이것은 난모세포, 미분화세포의 내부세포괴 및 원시 생식세포(primordial germ cell)에도 존재하는 것으로 관찰되었다. 유전자 POU5F1은 OCT4 단백질을 인코딩한다. 이 유전자명과 동의어에는 OCT3, OCT4, OTF3 및 MGC22487이 포함된다. 배아 줄기세포가 미분화된 채로 유지되기 위해서는 OCT4가 특별한 농도로 존재하는 것이 필요하다. 좋기로는, "OCT4 단백질" 또는 간단히 "OCT4"는 인간 OCT4에 관한 것이다.
Sox2는 단일 HMG DNA-결합 도메인을 갖는 전사 인자들을 인코딩하는 Sox (SRY-관련 HMG 박스) 유전자 패밀리의 멤버이다. SOX2는 그의 분화능을 억제함으로써 신경 선구세포(progenitor cell)를 조절하는 것으로 밝혀졌다. 이 인자의 억제는 심실구역(ventricular zone)으로부터의 배엽분리를 야기하며, 이어서 세포 주기로부터 이탈된다. 이들 세포들은 또한 조기 뉴런 분화 마커 및 그들의 선구세포 상실을 통해 그들의 선구세포 특징을 잃기 시작한다. 좋기로는, "SOX2 단백질" 또는 단순히 "SOX2"는 인간 SOX2에 관한 것이다.
NANOG는 NK-2형 호메오도메인 유전자로서, 짐작컨대 배아 줄기세포 재생 및 분화에 필수적인 유전자 발현을 제어함으로써 줄기세포 다분화능을 유지하는데 있어 핵심 역할을 하는 것으로 제안되어 왔다. NANOG는 그의 C 말단에 삽입된(embedded), 비정상적으로 강력한 두 개의 활성화 도메인을 갖는 전사 활성화제로서 거동한다. NANOG 발현 감소는 배아 줄기세포의 분화를 유도한다. 좋기로는, "NANOG 단백질" 또는 단순히 "NANOG"는 인간 NANOG에 관한다.
LIN28은 RNA-결합 모티프들, 즉" 저온충격 도메인 및 레트로바이러스형 CCHC 아연 핑거의 비정상적인 페어링을 갖는 보존된 세포질 단백질이다. 포유동물에 있어서, 이것은 미분화 세포에서 풍부하고도 그 종류가 다양하다. 다분화능 포유동물 세포에서, LIN28은 수크로스 구배의 폴리좀 분획 및 폴리(A)-결합 단백질과의 RNase-민감성 복합체에서 관찰되는데, 이는 이것이 mRNA 번역과 연관되어 있음을 시사한다. 좋기로는, "LIN28 단백질" 또는 단순히 "LIN28"은 인간 LIN28에 관한 것이다.
Krueppel-유사 인자(KLF4)는 예컨대 결장, 위장 및 피부와 같은 상이한 조직들의 유사분열후(postmitotic) 상피세포에서 강하게 발현되는 아연-핑거 전사 인자이다. KLF4는 이들 세포의 말단 분화에 필수적이며 세포 주기 조절에 관여한다. 좋기로는, "KLF4 단백질" 또는 단순히 "KLF4"는 인간 KLF4에 관한다.
MYC (cMYC) is a 광범위한 인간 암에서 과발현되는 원발암유전자(protooncogene)이다. 이것이 특이적으로 돌연변이되거나 과발현되면, 세포 증식 및 기능이 발암유전자처럼 증가한다. MYC 유전자는 인핸서 박스 서열 (E-boxes) 상의 결합 및 히스톤 아세틸트랜스퍼라제 (HATs)의 동원(recruiting)을 통해 모든 유전자의 15%의 발현을 제어하는 전사 인자를 인코딩한다. MYC는 N-MYC 및 L-MYC 유전자 역시도 포함하는, 전사 인자들의 MYC 패밀리에 속한다. MYC-패밀리 전사 인자들은 bHLH/LZ (베이직 헬릭스-루프-헬릭스 류신 지퍼: basic Helix-Loop-Helix Leucine Zipper) 도메인을 함유한다. 좋기로는, "cMYC 단백질" 또는 단순히 "cMYC"는 인간 cMYC에 관한다.
OCT4, SOX2, NANOG, LIN28, KLF4 또는 c-MYC와 같은 특이적 인자들과 관련한 기재는 이들 인자들의 모든 변이체에 관한 것으로도 이해되어야 한다. 특히, 세포에 의해 자연적으로 발현되는 이들 인자들의 모든 스플라이스 변이체, 후번역적으로 변형된 변이체, 입체배열, 이소폼 및 동족 종들 역시도 포괄되는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "miRNA" (마이크로RNA)는 진핵세포에서 발견되는 21-23-뉴클레오타이드-길이의 비코딩 RNA에 관한 것으로, ESC 자기-재생/분화 및 세포 주기 진행과 관련된 것들을 포함하여, 과잉 세포 기능을 조절하는 표적 mRNAs의 분해 유도 및/또는 번역 예방에 의해, 과잉 세포기능을 조절시킨다. miRNAs는 표적 메신저 RNA 전사체(mRNAs) 상의 상보적 서열들에 결합하여, 대체로 번역 억제 또는 표적 분해 및 유전자 슬라이싱을 초래하는 전사후 조절자이다. 이것은 올바른 조합 내의 miRNA는
줄기세포 특징을 가는 세포로 체세포를 시험관내에서 직접 세포성 재프로그래밍 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, miRNA 클로스터 302-367는 체세포 세포 재프로그래밍을 향상시킨다.
좋기로는, 줄기세포 특징을 갖는 세포들의 발달을 허용하는 단계가 체세포를 배아 줄기세포 배양 조건, 좋기로는 미분화 상태로 다분화능 줄기 세포를 유지하는데 적합한 조건 하에서 체세포를 배양하는 것을 포함하는 것이 바람직하다.
좋기로는, 줄기세포 특징을 갖는 세포들의 발달을 위해, 세포들을
Preferably, to allow the development of cells having 줄기세포 특징을 갖는 세포들의 발달을 허용하기 위해, 세포들을 1 이상의 DNA 메틸트랜스퍼라제 저해제 및/또는 1 이상의 히스톤 데아세틸라제 저해제 존재 하에 배양하는 것이 바람직하다. 바람직한 화합물은 5'-아자시티딘 (5'-azaC), 수베로일아닐리드 히드록삼산(SAHA), 덱사메타손, 트리코스타틴 A (TSA), 소듐 부티레이트 (NaBu), 스크립타이드 및 발프로산(VPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 좋기로는, 발프로산 존재하에, 좋기로는 0.5 내지 10 mM의 농도, 더욱 좋기로는 1 내지 5 mM의 농도, 가장 좋기로는 약 2 mM의 농도의 발프로산(VPA)의 존재하에 세포들을 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 종류를 불문한 모든 체세포의 분화에 영향을 미치는데 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 세포들에는 본 발명의 방법에 의해 재프로그램되거나 탈분화될 수 있는 세포들, 특히 완전히 또는 부분적으로 분화된 세포, 더욱 좋기로는 말단 분화된 세포일 수 있는 세포들이 포함된다. 좋기로는 체세포는 배아가 되기 전의 세포, 배아 세포, 태아 세포 및 출생후 다세포 생명체로부터 유래된 2배체 세포이다. 사용가능한 세포의 예로는 섬유아세포, 예컨대 태아 및 신생아 섬유아세포 또는 성체 섬유아세포, 각질세포, 특히 일차 각질세포, 더욱 좋기로는 모발로부터 유래된 각질세포, 지방세포, 상피세포, 표피세포, 연골세포, 난구세포, 신경세포, 교질 세포, 별아교세포, 심장세포, 식도세포, 근육세포, 멜라닌세포, 조혈세포, 골세포, 대식세포, 단핵구, 및 단핵 세포를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 세포들은 임의의 동물 종의 세포일 수 있으며: 예컨대, 포유동물 및 설치류의 세포일 수 있다. 본 발명에 의해 탈분화 및 재분화될 수 있는 포유동물 세포의 예로는 인간 및 비인간 영장류 세포를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명을 실시할 수 있는 영장류 세포들에는 인간, 침팬지, 개코원숭이 시노몰구서 원숭이 및 기타 구세계 및 신세계 원숭이를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명을 실시할 수 있는 설치류 세포의 비제한적인 예로는 마우스, 래트, 기니픽, 햄스터 및 게르빌루스 쥐(gerbil)를 들 수 있다.
본 발명에 따라 제조되는 탈분화된 세포들은 다분화능 줄기세포와 동일한 요구사항을 다수 나타낼 것으로 예상되며 배아 줄기세포에 사용되는 조건, 예컨대 ES 세포 배지 또는 배아세포의 성장을 뒷받침해주는 임의의 배지에서 증식 및 유지될 것으로 기대된다. 배아 줄기세포는 배양시 광조사된(irradiated) 마우스 배아 섬유아세포 또는 인간 섬유아세포 (예컨대 인간 포피 섬유아세포, 인간 피부 유아세포, 인간 자궁내막 섬유아세포, 인간 난관 섬유아세포)와 같은 불활성화된 배아 섬유아세포 상에서 유지될 경우 그들의 다분화능을 시험관내 유지한다. 일 구체예에서, 인간 배양보조세포(feeder cells)는 직접 분화에 의해 재프로그램된 세포와 동일 배양체로부터 유래된 자가(autologous) 배양보조세포일 수 있다.
나아가, 인간 배아 줄기세포는 마우스 배아 섬유아세포에 의해 조건화된 배지에서 Matrigel 상에서 성공적으로 증식될 수 있다. 인간 줄기세포는 장기간 동안 배양체에서 성장가능하며 특수한 배야야 조건 하에서 미분화상태로 유지될 수 있다.
특정 구체예에서, 세포 배양 조건은 세포의 분화를 억제하거나 또는 달리 탈분화를 증강시킬 수 있는, 예컨대 세포의 비-ES 세포, 영양외배엽 세포 또는 기타 세포 종류로의 분화를 방지할 수 있는 인자들과 세포를 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 탈분화된 세포들은 세포의 표현형의 변화를 모니터링하고 이드르이 유전자 및 단백질 발현을 특징짓는 것을 포함하는 방법에 의해 평가될 수 있다. 유전자 발현은 RT-PCR에 의해 측정가능하며 번역 산물은 면역세포화학 및 웨스턴 블로팅에 의해 결정가능하다. 특히, 전사체학(transcriptomics)를 비롯한 공지기술을 이용함으로써, 탈분화된 세포들을 특징화하여 유전자 발현 패턴을 결정할 수 있고 재프로그램된 세포가 배아 줄기세포와 같은 미분화된, 다분화능 대조군 세포의 경우에 예상되는 발현 패턴과 유사한 유전자 발현 패턴을 나타낼지를 가늠할 수 있다.
탈분화된 세포들의 다음의 유전자들의 발현을 이러한 관점에서 평가할 수 있다: OCT4, NANOG, 성장 및 분화 인자 3 (GDF3), 감소된 발현 1 (REX1), 섬유아세포 성장 인자 4 (FGF4), 배아의 세포-특이적 유전자 1 (ESG1), 발달 다분화능-관련 2 (DPPA2), DPPA4, 텔로머라제 역전사표소 (TERT), 배아 항원-3 (SSEA-3), SSEA-4, 종양-관련 항원-1-60 (TRA-1-60), TRA-1-81, 및 TRA-2-49/6E.
재프로그램된 세포들과 비교될 수 있는 미분화 또는 배아 줄기세포들은 분화되니 체세포와 동종의 것으로부터 유래된 것일 수 있다. 별법으로, 재프로그램된 세포와 비교될 수 있는 미분화 또는 배아 줄기세포는 분화된 체세포와 이종의 것으로부터 유래할 수 있다.
일부 구체예에서, 미분화 세포에서 특이적으로 발현된 특정 유전자가 재프로그램된 세포에서도 발현된다면, 재프로그램된 세포와 미분화 세포, 예컨대 배아 줄기 세포 간에 유전자 발현 패턴의 유사성이 존재하는 것이다. 예컨대, 일반적으로 분화된 체세포에서는 검출불가능한 예컨대 텔로머라제와 같은 특정 유전자를 이용하여 재프로그래밍 정도를 모니터링할 수 있다. 마찬가지로, 특정 유전자의 경우, 발현 부재를 이용하여 재프로그래밍 정도를 평가할 수 있다.
텔로머라제 활성의 유도에 의해 표시되는 자기-재생 능력은 탈분화된 세포에서 모니터링가능한 줄기세포의 또 다른 특징이다.
핵형 분석은 유사분열 세포들로부터의 염색체 스프레드, 스펙트럼 핵형분석, 텔로미어 길이 분석, 총 게놈 혼성화, 또는 기타 공지기술을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명을 이용하여, 적절한 인자들을 인코딩하는 RNA를 예컨대 전기천공에 의해 1 이상의 체세포 내로 통합시킨다. 통합 후, 세포들을 좋기로는 탈분화된 세포들의 유지를 지지하는 조건(즉 줄기세포 배양 조건)을 이용하여 배양한다. 이어서 탈분화된 세포들을 증식시키고 세포 치료에 필요한 여러 종류의 체세포들로 재분화시킨다. 본 발명에 따라 수득된 탈분화된 세포들은 시험관내 또는 생체내에서 1 이상의 소망되는 체세포 종류로 분화되도록 유도될 수 있다.
좋기로는, 본 발명에 따라 수득된 탈분화된 세포들은 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 3가지 배아 생식층의 임의의 층으로부터의 세포로 될 수 있다. 예를 들어, 탈분화된 세포들은 골격근, 골격, 피부 진피, 연결조직, 비뇨생식기, 심장, 혈액(림프 세포), 및 비장(중배엽); 위장, 결장, 간, 췌장, 방광; 요도막, 기관의 표피부, 폐, 인두, 갑상선, 부갑강선, 내장(내배엽); 또는 중추신경계, 망막 및 수정체, 두개 및 감각기, 신경절 및 신경, 색소 세포, 두부 연결조직, 표피, 모발, 유선(외배엽)으로 분화될 수 있다. 본 발명에 따라 수득된 탈분화된 세포들은 공지 기술을 이용하여 시험관내 또는 생체내에서 재분화될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 방법으로부터 결과된 재프로그램된 세포들을 이용하여 분화된 자손을 생산한다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은: (i) 본 발명의 방법을 이용하여 재프로그램된 세포들을 수득하고; 및 (ii) 재프로그램된 세포들의 분화를 유도하여 분화된 세포들을 생성하는 것을 포함하는, 분화된 세포의 생산 방법을 제공한다. 단계 (ii)는 생체내 또는 시험관내에서 수행될 수 있다. 또한, 분화는 재프로그램된 세포들이 도입된 바 있는 체내, 장기 또는 조직에 인 시투(in 냐셔 존재하거나 또는 부가될 수 있는 적절한 분화 인자들의 존재를 통해서도 유도될 수 있다. 분화된 세포들은 세포, 조직 및/또는 장기 이식분야에서 유리하게 사용되는 세포, 조직 및/또는 장기를 유도하는데 이용될 수 있다. 원한다면, 예컨대 재프로그래밍 전에 체세포 내로 유전자 변형을 도입할 수 있다. 본 발명의 분화된 세포들은 좋기로는 배아 줄기세포, 또는 배아 생식세포의 다분화능을 갖지 않으며, 기본적으로 조직-특이적으로 부분적 또는 완전히 분화된 세포들이다.
본 발명의 방법의 한 가지 장점은 본 발명에 의해 수득된 재프로그램된 세포들이 세포주의 사전 선별 또는 정제 또는 수립 없이 분화될 수 있다는 것이다. 따라서, 특정 구체예에서, 재프로그램된 세포들을 포함하는 세포들의 이종 집단을 목적하는 세포 종류로 분화시킨다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법으로부터 수득된 세포 혼합물을 1 이상의 분화 인자들에 노출시켜 시험관내 배양한다.
본 발명의 방법에 의해 수득되는 재프로그램된 세포들을 분화시키는 방법은 재프로그램된 세포의 투과화(permeabilization) 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 설명된 재프로그램 기술에 의해 생성된 세포, 또는 별법으로 재프로그램된 세포를 포함하는 세포들의 이종 혼합물을 1 이상의 분화 인자 또는 세포 추출물 또는 기타 분화 인자들을 포함하는 다른 조제물에 노출시키기에 앞서 투과화시킬 수 있다.
예를 들어, 분화된 세포들은 적어도 1종의 분화 인자의 존재 하에 재프로그램된 미분화 세포들을 배양하고 배양체로부터 분화된 세포를 선택함으로써 수득할 수 있다. 분화된 세포들의 선택은 표현형, 예컨대 분화된 세포 상에 존재하는 특정 세포 마커의 발현, 또는 기능성 분석 (예컨대 특정의 분화된 세포 종류의 1 이상의 기능을 수행하는 능력)에 의 기반할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명에 따라 재프로그램된 세포들은 그들의 DNA 서열(들)의 부가, 결실 또는 변형을 통해 유전적으로 변형된다.
본 발명에서 제조된 재프로그램되거나 탈분화된 세포들 또는 재프로그램되거나 탈분화된 세포들로부터 유래된 세포들은 연구조사 및 치료법에 유용하다. 재프로그램된 다분화능 세포들은 피부, 연골, 골격븐, 심장근, 신장, 간, 혈액 및 혈액 형성, 혈관 전구체 및 혈관 내피, 췌장 베타, 뉴런, 교질, 망막, 뉴런, 내장, 폐 및 간 세포를 비롯한 체내의 임의 세포로 분화될 수 있다.
재프로그램된 세포들은 재생/회복 요법에 유용하며 이를 필요로 하는 환자에게 이식될 수도 있다. 일 구체예에서, 세포들은 환자에 대해 자가 세포이다.
본 발명에 따라 제공된 재프로그램된 세포들은 심장, 신경, 내분비, 혈관, 망막, 피부, 근육-골격 질환 및 기타 질환의 치료시 치료적 전략에 이용될 수 있다.
비제한적인 예로서, 본 발명의 재프로그램된 세포들은 그의 천연 세포가 노화 또는 암 방사능치료법 또는 화학요법과 같은 절제요법(ablation therapy)로 인해 고갈된 동물에 있어 세포를 보충하는데 이용될 수 있다. 또 다른 비제한적인 예로서, 본 발명의 재프로그램된 세포들은 장기 재생 및 조직 복구에 유용하다. 본 발명의 일 구체예에서, 재프로그램된 세포들은 심근경색과 같은 허혈성 이벤트에 의해 손상된 근육 및 영양실조형 근육을 비롯한 손상된 근육 조직에 활기를 다시 불어넣는데 이용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 명세서에 개시된 재프로그램된 세포들은 인간을 비롯한 동물에 있어 트라우마 손상 또는 외과수술 후 상처를 완화시키는데 이용될 수 있다. 이 구체예에서, 본 발명의 재프로그램된 세포들은 예컨대 정맥투여와 같이 전신 투여되며 손상된 세포에 의해 분비된 순환 시토카인에 의해 동원된 갓 손상된 조직 부위로 이동한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 재프로그램된 세포들은 치료 부위 또는 복구 또는 재생을 필요로 하는 부위로 국소 투여될 수도 있다.
본 발명의 일 구체예에서, RNA와 같은 핵산은 환자로부터 세포를 제거하고, 상기 세포를 유전자 변형시킨 다음 환자 체내에 상기 변형된 세포를 재도입시키는 것과 같은 생체외 방법에 의해 환자에게 투여된다. 형질감염(transfection) 및 형질도입(transduction) 방법이 통상의 기술자에게 알려져 있다.
"형질감염"이라는 용어는 핵산, 특히 RNA의 세포 내로의 도입에 관한 것이다. 본 발명의 목적상, "형질감염"이라는 용어는 세포로의 핵산의 도입 또는 그러한 세포에 의한 핵산 흡수(uptake) 역시도 포함하며 여기서 상기 세포는 예컨대 환자와 같은 대상자 체내에 존재하는 것일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 본 발령에 설명된 핵산의 형질감염을 위한 세포는 시험관내 또는 생체내에서 제시될 수 있으며, 예컨대 상기 세포는 환자의 조직 및/또는 장기의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명에 따라, 형질감염은 일시적 또는 안정적일 수 있다. 형질감염의 특정 적용에 있어, 형질감염된 유전 물질이 일시적으로 발현되기만 한다면 충분하다. 형질감염 프로세스에 도입된 핵산은 대체로 핵 게놈 내로 통합되지 않으므로, 외래 핵산은 유사분열을 통해 희석되거나 분해될 것이다. 핵산의 에피좀 증폭을 허용하는 세포들은 희석률을 크게 감소시킨다. 형질감염된 핵산이 세포 및 그의 딸세포의 게놈 내에 실제로 잔류할 것이 요망된다면, 안정한 형질감염이 일어나야 한다. RNA는 그의 코딩된 단백질을 일시적으로 발현하도록 세포 내로 형질감염될 수 있다.
본 발명에 따라, 세포 내로 도입, 즉 핵산을 전달 또는 형질감염시키는데 유용한 모든 기술이 이용될 수 있다. 좋기로는, 표준 기술에 의해 세포 내로 RNA를 형질감염시킨다. 이러한 기술에는 전기천공, 리포펙션 및 마이크로주입이 포함된다. 본 발명의 특히 바람직한 일 구체예에서는 RNA를 전기천공에 의해 세포 내로 도입한다. 전기천공 또는 전기투과화는 외부에서 인가된 전기장에 의해 생성된 세포질막의 전기전도도 및 투과도의 유의적인 증가와 관련되어 있다. 이것은 대체로 어떤 물질을 세포 내로 도입하는 방식으로서 분자생물학에서 사용된다. 본 발명에 따라, 단백질 또는 펩타이드를 인코딩하는 핵산의 도입에 의해 상기 단백질 또는 펩타이드의 발현이 결과된다.
본 발명에 따라, 핵산은 특정 세포에 지향될 수 있다. 이러한 구체예에서, 핵산을 세포(예컨대 레트로바이러스 또는 리포좀)에 투여하는데 사용되는 담체는 결합된 표적 분자를 가질 수 있다. 예를 들어, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체와 같은 분자, 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드는 핵산 담체 내로 통합되거나 결합될 수 있다. 리포좀에 의한 핵산 투여가 요망될 경우, 표적화 및/또는 흡착을 가능케 하기 위해 세포내섭취(endocytosis)와 연계된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 리포좀 제형 내로 통합될 수 있다. 이러한 단백질에는 특정 세포 종류에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 내면화된 단백질에 대한 항체, 세포내 사이트를 표적화하는 단백질 등이 포함된다.
"리포터"는 분자, 일반적으로 리포터 유전자에 의해 인코딩되고 리포터 분석에서 측정되는 분자, 전형적으로 펩타이드 또는 단백질에 관한 것이다. 통상적인 계(system)는 대체로 효소 리포터를 이용하며 상기 리포터의 활성을 측정한다.
"다클로닝 사이트(multiple cloning site)"라 함은 제한효소 사이트를 함유하는 핵산 영역을 가리키며, 이러한 사이트들은 어느 것이든 예컨대 벡터의 절단 및 핵산 삽입에 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 뉴클레오타이드들 또는 아미노산들과 같은 2개의 요소들이 어떠한 간섭도 없이 서로 직접 인접해 있는 경우 이들은 연속적이다. 예를 들어, x 연속 뉴클레오타이드들 N의 서열은 서열 (N)x라 칭한다.
"제한효소 엔도뉴클리아제" 또는 "제한효소"는 특이적인 염기 서열들 내 DNA 분자의 양쪽 가닥 내의 포스포디에스테르 결합을 절단하는 효소 부류를 가리킨다. 이들은 이중가닥 DNA 분자 상의 인식 서열들이라 칭해지는 특이적인 결합 사이트들을 인식한다. DNA 내 상기 포스포디에스테르 결합이 상기 효소들에 의해 절단되는 사이트들을 절단 사이트라 칭한다. IIS형 효소의 경우, 절단 사이트는 DNA 결합 사이트로부터 소정 거리에 위치한다. 본 발명에서, "제한효소 엔도뉴클리아제"라는 용어에는, 예컨대, 효소 SapI, EciI, BpiI, AarI, AloI, BaeI, BbvCI, PpiI 및 PsrI, BsrD1, BtsI, EarI, BmrI, BsaI, BsmBI, FauI, BbsI, BciVI, BfuAI, BspMI, BseRI, EciI, BtgZI, BpuEI, BsgI, MmeI, CspCI, BaeI, BsaMI, Mva1269I, PctI, Bse3DI, BseMI, Bst6I, Eam1104I, Ksp632I, BfiI, Bso31I, BspTNI, Eco31I, Esp3I, BfuI, Acc36I, AarI, Eco57I, Eco57MI, GsuI, AloI, Hin4I, PpiI, 및 PsrI이 포함된다.
RNA의 "안정성"이라는 용어는 RNA의 "반감기"에 관계된다. "반감기"는 분자의 활성, 양, 갯수의 절반이 제거되는데 요구되는 기간에 관한다. 본 발명의 맥락에서, RNA의 반감기는 상기 RNA의 안정성의 지표가 된다.
본 명세서, 특히 치료와 관련하여 설명된 RNA와 같은 핵산은 상기 핵산 및 임의 성분으로서 1 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함하는 의약 조성물 또는 키트의 형태로서 존재할 수 있다.
의약 조성물은 좋기로는 멸균되며 유효량의 핵산을 함유한다.
의약 조성물은 단위 투여제형으로 대개 제공되며 공지 방식으로 제조될 수 있다. 의약 조성물은 예컨대 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다.
의약 조성물은 염, 완충물질, 보존제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있으며, 이들 모두는 약학적으로 허용가능한 것이 좋다. "약학적으로 허용가능한"이라 함은 그 의약 조성물의 활성 성분의 작용에 간섭하지 않는, 물질의 비독성을 가리킨다.
약학적으로 허용가능하지 않은 염들을 이용하여 약학적으로 허용가능한 염을 만들 수 있으며 이들 역시 본 발명에 속한다. 이러한 종류의 약학적으로 허용가능한 염에는 다음의 산으로부터 제조되는 것이 포함되나 이에 한정되지 않는다: 염산, 히드로브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 약학적으로 허용가능한 염은 또한 알칼리금속 염이나 알칼리토금속염, 예컨대 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염으로서 제조될 수도 있다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 완충물질에는 아세트산염, 시트르산염, 붕산염 및 인산염이 포함된다.
의약 조성물에 사용되기에 적합한 보존제로는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 들 수 있다.
"담체"라는 용어는 활성성분의 적용을 용이화, 증강 또는 가능하게 하기 위해, 활성성분과 조합되는, 천연 또는 비천연(합성) 유기 또는 무기 성분을 가리킨다. 본 발명에 따라, "담체"는 또한 환자에게 투여하는데 적합한 1 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함하기도 한다.
비경구 투여를 위한 가능한 담체 물질은 예컨대 멸균수, 글루코스 용액, Ringer, Ringer 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌 글리콜, 수소첨가된 나프탈렌 미치 특히, 생물적합성 락타이드 폴리머, 락타이드/글리콜라이드 코폴리머 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 코폴리머이다.
본 발명에서 "부형제"라는 용어는 의약 조성물 내에 존재할 수 있으나, 예컨대 담체, 바인더, 윤활제, 농후제, 표면활성제, 보존제, 유화제, 완충제, 풍미제 또는 착색제와 같이, 활성성분은 아닌 모든 물질을 가리키는 것으로 의도된다.
본 발명에서 의약 조성물은 주사 또는 주입을 비롯한 비경구 투여와 같은 여하한 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 좋기로는 예컨대 정맥내, 동맥내, 피하(subcutaneously), 림프절내, 피내(intradermally), 또는 근육내를 비롯한 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 대체로 활성 화합물의 멸균된 수성 또는 비수성 제제를 포함하며, 이것은 수용자의 혈액과 등장성인 것이 좋다. 적합한 담체 및 용매는 Ringer 용액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 이에 더해, 대개 멸균된 고정 오일(fixed oils)이 용액 또는 현탁액 매질로서 이용된다.
본 발명에 설명된 물질 및 조성물은 좋기로는 유효량으로 투여된다. "유효량"이라 함은 그 단독으로 또는 추가 투여량(doses)과 함께 소망되는 반응 또는 소망되는 효과를 낼 수 있는 양이다. 특정 질환 또는 특정 상태를 치료하는 경우, 소망되는 반응은 좋기로는 그 질환의 경과를 억제하는 것에 관한다. 이것은 질병의 진행을 둔화시키는 것, 특히, 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 상태의 치료시 소망되는 반응은 또한 상기 질병이나 상기 상태의 개시를 둔화시키거나 개시를 방지하는 것일 수도 있다.
본 발명에 설명된 물질 또는 조성물의 유효량은 치료하고자 하는 상태, 질병의 위중도, 환자의 개별적인 변수, 예컨대 연령, 생리적 상태, 크기 및 체중, 치료 기간, 부수되는 치료법의 종류(있을 경우), 특정 투여 경로 및 유사 인자들에 따라 달라진다. 따라서, 본 발명에 설명된 물질의 투여량은 이러한 다양한 변수에 따라 달라진다. 만일 환자의 반응이 초기 투여량으로 불충분할 경우, 더 많은 투여량(또는 보다 국소적인, 다른 투여 경로에 의해 달성되는 효과적으로 더 높은 투여량)이 사용될 수 있다.
이하에 도면과 실시예를 참고로 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하나, 이들은 어디까지나 설명 목적을 위해 제공되는 것일 뿐 본 발명의 보호 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다. 발명의 설명과 실시예에 기초하여, 당업자라면 추가 구체예들을 얼마든지 실시가능하며 이러한 추가 구체예 역시도 모두 본 발명의 범위에 포함된다.
도 1: 생체내 선발 프로세스의 개요도
출발 라이브러리를 준비하기 위해, 악티노마이신 D, 전사 저해제의 존재 하에 인간의 미성숙 수지상 세포를 5 시간 성장시켜 안정한 RNA를 미리 선발하였다. 나머지 세포의 mRNA를 추출하고 Poly(A)Purist Kit (Ambion)를 이용하여 정제한 다음 뉴클리아제 P1 (Roche)을 이용하여 단편화시켰다. 이를 위해, 10 ㎍ RNA를 24 μL의 총 반응 부피로, 8μL 50 mM NaAc 완충액(pH 5.5) 중 0.3 U NP-1 과 함께 45분간 인큐베이션하였다. RNeasy 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 정제한 후 단편들을 cDNA내로 역전사 시키도록 준비시켰다. RevertAid Premium 1st strand cDNA synthesis Kit (Fermentas) 프로토콜에 따라 그리고 소정의 프라이머 서열과 NotI-제한효소 사이트를 갖는 헥사머-프라이머를 이용하여 제1 및 제2 가닥 합성을 실시하였다. 5'-돌출부(overhangs)을 채우고 및 cDNA의 3'-돌출부를 제거하기 위해 이어서 cDNA를 15℃에서 5분간 12.5 U T4 DNA 폴리머라제와 함께 인큐베이tus시켰다. 5 μL 0.5 mM EDTA, pH 8.0을 첨가하여 반응을 종결시키고 NucleoBond 컬럼 (Macherey-Nagel)을 이용하여 cDNA를 정제하였다. cDNA-라이브러리를 NotI (NEB)로 절단하여 평활 말단(blunt end)과 점착성 말단(sticky end)를 갖는 단편들을 만들었다. 150 bp보다 작은 모든 단편들을 제거하기 위해 겔 준비를 통해 단편들을 부가적으로 크기 선별하였다. 라이브러리의 클로닝을 위해 패널 A에 도시된 벡터들을 EcoRV 및 NotI으로 절단하여 평활 말단과 점착성 말단을 각각 남겼다. 다음 단계에서 T4 DNA 리가제 (Fermentas)를 이용하여 라이브러리를 벡터에 접합시켰다. PhusionTM Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes)을 이용하여 표 4에 주어진 바와 같이 접합(ligation)혼합물을 PCR을 위한 주형으로서 직접 사용하였다. 정제 후, 표 5에 나타난 바와 같은 T7-전사를 위한 주형으로서 PCR 산물을 이용하였다. 37℃에서 인큐베이션하였다. 매 30분 마다 반응 혼합물에 0.75 μL 100 mM GTP를 첨가하였다. TURBO DNase (2U/μL, Ambion)를 첨가함으로써 2.5 시간 훙반응을 중단시킥고 37℃에서 다시 15분간 인큐베이션하였다. RNeasy 컬럼 (Qiagen)을 경유하여 반응물을 최종적으로 클린업하였다. 이어서, 전술한 바와 같이 RNAfmf hiDCs 내로 전기천공하여 선발 과정을 개시하는데 RNA-라이브러리를 이용하였다 (Kuhn et al, 2010). 선발을 위한 배양 후, RNeasy 컬럼 (Qiagen)을 이용하여 제조업자 지침에 따라 RNA를 추출 및 정제하였다. 이어서 제조업자 지침에 따라 Superscript II 역전사효소(Invitrogen)를 이용하여 dT18-프라이머를 이용하여 RNA를 cDNA 합성을 위한 주형으로서 사용하였다. 이어서 cDNA를 전술한 바와 같이 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 마지막으로, T7-전사 (상기 내용 참조)를 위한 주형으로서 PCR 산물을 이용하여 다음 선발 라운드 (패널 B)를 개시할 수 있다. DNA/cDNA 및 RNA 샘플의 품질 제어는 각각 아가로스 겔과 AGILENT 2100 bioanalyzer를 이용하여 실시하였다.
도 2: luc2CPmut-벡터 내의 샘플 모양 개략도
(A) 주어진 벡터 내로 단일 요소 또는 2개의 (상류 및 하류) 요소들을 3'-UTRs로서 클로닝하였다. 대조군 샘플들인 NEG (3' UTR의 삽입이 없는 음성 대조군), hBg 및 2hBg도 도시되어 있다. 선발 라운드를 위한 RNA의 제조. (B) hiDCs에서의 전기천공을 위해 T7-프로모터 및 폴리(A)-테일을 포함하는 연장된 프라이머들을 이용하는 PCR의 주형으로서 벡터를 이용하였다.
도 3: RNAs 인코딩 luc2CPmut의 안정성에 미치는 선발된 서열들의 효과
3' UTRs로서 선발된 서열들을 함유하는 RNA들의 경시적인 시페라제 활성, 반감기 및 총 단백질을 나타내는 결과를, 전기천공 후 인간 미성숙 수지상 세포 (NEG는 도 2에 정의되어 있음) 내로 도입된 본 발명의 최적-표준(gold-standard)인 2hBg와 비교 도시한 도면. 상단 패널은 표시된 바와 같은 3' UTRs를 갖는 3가지 예시적인 RNA의 경시적 결과를 도시한 것이다. 좌하단 패널에는, 2hBg를 갖는 RNA에 대하여 나타낸 바와 같은 각각의 3' UTR을 갖는 RNA의 반감기가 도시되어 있다. 마찬가지로, 2hBg를 갖는 RNA과 비교한 상대적인 총 단백질 발현을 우하단 패널에 나타내었다.
도 4: 리포터 유전자로서 luc2mut 및 새로 선택된 3'-UTRs를 이용한 대표적인 루시페라제 활성.
인간 미성숙 수지상 세포 내로 3' UTRs을 갖는 RNAfmf 전기천공한 후, 루시페라제 활성을 72시간에 걸쳐 측정하였다.
도 5: 섬유아세포 내로 IVT-RNAs를 전기천공한 대표적인 결과.
좌측 패널: luc2CPmut 기반 벡터. 우측 패널: luc2mut 기반 벡터
도 6: T 세포 내로 IVT-RNAs를 전기천공한 대표적인 결과.
가장 왼쪽의 패널은 FI 3' UTR을 갖는 RNA의 상대적인 총 단백질 발현을 CD4+ 및 CD8+ T 세포 내 2hBG를 갖는 RNA와 비교하여 도시한 것이다. 마찬가지로 FI 3' UTR을 갖는 RNA의 번역 효율과 mRNA 반감기를 CD4+ 및 CD8+ T 세포 내 2hBG를 갖는 RNA와 비교하여 각각 중간 패널 및 가장 오른쪽 패널에 나타내었다.
도 7: 뉴클레오타이드들이 변형된 RNAs를 테스트하기 위한 RNA 설계 및 인테그리티
A: 루시페라제 분석에 사용된 RNA들을 설명된 바와 같이 구축하였다. 5' cap으로서 β-S-ARCA(D2)를 사용하였다. 5'UTR로서 Kozak 서열을 포함하여, 인간 알파 글로빈 5'UTR이 사용되었다. 개똥벌레의 루시페라제 유전자 후에, 비교하고자 하는 2개의 3'UTRs을 클로닝하였다. 폴리A-테일로서, A30L70 서열이 사용되었다.
B: 형질감염에 앞서, RNAs를 2100 Bioanalyzer (Agilent)에서 이들의 인테그리티에 대해 검토하였다. 모든 RNAs는 충분히 높고도 필적할만한 인테그리티를 가졌으며 따라서 실험에 이용할 수 있었다.
도 8: FI 3' UTR의 생체내 RNA 안정성 및 기능에 미치는 효과
FI 3'UTR 또는 the 2hBg 3'UTR를 함유하는 gp70 mRNA 및 루시페라제를 F12와 함께 조제하여 BALB/c 마우스에 i.v. 투여하였다. 루시페라제 mRNA 투여 후, 6h 및 24h 후에 발현을 모니터링하였다; gp70 mRNA을 제0일과 제6일에 투여하고 CD8 및 gp70 tet+ 염색을 통해 제10일에 면역 활성화에 대해 분석하였다.
A) FI 3'UTR 또는 2hBg 3'UTR를 함유하는 m1Y 변형된 mRNA 및 비변형 mRNA를 주입한지 6 시간 및 24 시간 후의 루시페라제 활성 수준을 나타낸다. 변형되지 않은 mRNA와 FI 3'UTR를 함유하는 m1Y 변형된 루시페라제 mRNA 양자 모두 2hBg 3'UTR을 함유하는 대응하는 mRNA와 필적할만한 발현 수준을 나타내었다.
B) FI 3'UTR 또는 2hBg 3'UTR를 함유하는 gp70 mRNA에 반응하는 gp70-특이적 CD8 T 세포들의 백분율을 나타낸다. 두 개의 3'UTRs는 2회 면역화 후 항원-특이적 면역성을 동등하게 잘 유도하며, FI 3'UTR을 함유하는 gp70 mRNA이 투여된 바 있는 마우스들의 비장에서 항원-특이적 CD8 T 세포가 유의적으로 증가하였다.
통계: 일원 ANOVA 및 Tukey's 사후 검사, *p<0.05.
도 9: 자가-복제하는 RNA의 안정성에 미치는 UTRs 안정화 효과
비-세포독성 Semliki Forest 바이러스 유래 자가-복제(레플리콘) RNA의 3' 보존 서열 요소의 바로 상류에 탈안정화된 루시페라제(Luc2CP)를 클로닝하였다. 대응하는 선형화된 플라스미드로부터 레플리콘 RNA를 시험관내 전사에 의해 제조하여 이를 세포 내로 전기천공시켰다. 발광 기질을 첨가하여 루시페라제 발현을 96 시간 내지 120 시간 동안 측정하였다. (A) BHK21 세포를 이용한 대표적인 실험에서의 루시페라제 발현의 시간 경과. (B) 인간 포피 섬유아세포 (HFF)를 이용한 대표적인 실험에서의 루시페라제 발현의 시간 경과. 분비된 I형 인터페론의 세포독성을 감소시키기 위해, 각 샘플에 백시니아 바이러스 B18R mRNA를 공동형질감염시켰다(cotransfected). 단백질 키나제 R 활성화를 저해하고 전체적인 번역 수준을 증가시키기 위해, 백시니아 바이러스 E3 mRNA를 각 샘플에서 공동형질감염시켰다.
도 10: FI 요소의 상동성 스트레치.
밑줄친 서열 스트레치들은 서로 염기쌍을 이룰 것으로 예상되었다. 이 "8nt 돌연변이"를 위해, 제2 요소와의 상호반응을 방해하도록, 제1 요소를 aaagggcu로 돌연변이시켰다.
도 11: 2hBgUTR을 이용한 PCR-주형 기반 IVT 내의 인공물.
A: PCR을 통한 IVT 주형 생성을 나타낸 개략도. 5' 프라이머는 T7 프로모터의 상류에 어닐링하고, 3' 프라이머는 120nt polyA 테일을 함유하며 플라스미드-인코딩된 polyA 및 3'UTR의 일부에 어닐링한다. 2hBgUTR의 경우, 제1 반복물에 대한 어닐링에 의해 미스프라이밍이 일어날 수 있다. B: 2hBgUTR를 함유하는 플라스미드로부터의 PCR 산물. 붉은색 화살표는 부산물을 나타내며, 1hBg 단절(truncation)을 나타낸다. C: 이러한 PCR 산물로부터 전사된 RNA는 따라서 단축된 부산물(화살표)도 제시한다. D: 3'UTR로서 FI 요소를 함유하는 플라스미드로부터의 PCR 산물. 부산물은 보이지 않는다. E: 결과적인 mRNA는 부가적인 사이드-피크 없이 높은 인테그리티를 갖는 것으로 예측된 것이다.
도 12: 단절된 UTR 요소의 개략도 및 대응하는 mRNA 구조물의 반감기.
도 A의 상부 패널은 단절된 변이체들에 의해 커버되는 F-요소의 전장 서열 SEQ ID NO: 86의 핵산 위치를 참조로 단절된 UTR 요소들을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 A의 하부 패널은 F-요소의 전장 서열 SEQ ID NO: 86을 포함하는 mRNA를 참조로 단절된 UTR을 포함하는 mRNA의 상대적 반감기를 나타낸 도면이다. 루시페라제 리포터를 인코딩하는 mRNA를 hiDCs 내로 전기천공시키고 루시페라제 측정에 의해 이들의 발현을 경시적으로 추적하여 상대적인 RNA 반감기를 구하였다.
도 B의 상부 패널은 단절된 변이체들에 의해 커버되는 I-요소의 전장 서열 SEQ ID NO: 115의 핵산 위치를 참조로 단절된 UTR 요소들을 도식적으로 나타낸 도면이다.
도 B의 하부 패널은 F-요소의 전장 서열 SEQ ID NO: 115를 포함하는 mRNA를 참조로 단절된 UTR을 포함하는 mRNA의 상대적 반감기를 나타낸 도면이다. 루시페라제 리포터를 인코딩하는 mRNA를 hiDCs 내로 전기천공시키고 루시페라제 측정에 의해 이들의 발현을 경시적으로 추적하여 상대적인 RNA 반감기를 구하였다.
도 13: 랜덤 UTR에 대한 F, I 또는 FI 요소들을 포함하는 mRNA 구조물로부터의 상대적 반감기 및 단백질 발현.
도 13은 랜덤 UTR에 대한 F, I 또는 FI 요소들을 포함하는 mRNA 구조물로부터의 상대적 반감기 및 단백질 발현을 나타낸다. 이들 각 F 및 I의 전장 뿐 아니라 FI 조합에 대하여도, 랜덤 3'　UTR (257nt 길이)와 비교되었다. 모든 요소들을루시페라제-인코딩 구조물 내로 클로닝하고, mRNA로 시험관내 전사시킨 다음 hiDCs 내로 전기천공시키고, 루시페라제 발현을 경시적으로 측정하여, 상대적 반감기 및 총 단백질 발현을 계산하였다.
도 14: 세포의 재프로그래밍을 위한 UTR 요소들.
도 14A는 일차 인간 포피 섬유아세포의 재프로그래밍을 위한 타임라인을 나타낸다. 40,000 개의 세포들을 12-웰-플레이트에 플레이팅하고, 재프로그래밍 TF OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG 및 LIN28 (OSKMNL) (1:1:1:1:1:1)을 인코딩하는 0.33 ㎍ 비변형 시험관내 전사된 (IVT)-RNA과 0.08 ㎍의 각 B18R, E3 및 K3 (EKB)로 구성된 mRNA 혼합물 및 0.17㎍의 miRNAs 302a-d 및 367 (1:1:1:1:1:1)로 구성된 mRNA 혼합물 0.17㎍을 이용하여, 3일 (3x) 또는 4일 (4x) 연속하여 리포펙션시켰다. 이에 따른 RNA-구조물들은 인간 β-글로빈 3'UTR (2hBg), F-I-요소 (FI) 또는 I-F-요소 (IF)의 탠덤(tandem) 반복체로 이루어진 이들의 3'UTR에서만 차이가 났다. 제9일부터 콜로니 형성을 관찰하고 콜로니 분석을 제11일에 실시하였다.
도 14B는 수립된 콜로니들의 알칼라인 포스파타제(AP) 염색을 나타내고 도 14C는 AP 포지티브 콜로니들의 계수된 수를 나타내는 대응하는 막대 차트를 나타낸다.
도 14D는 FI-UTR을 함유하는 RNA를 이용한 결과적인 iPS-세포 콜로니의 형태학을 나타낸다. 뚜렷한 콜로니들 내에 조밀하게 밀집된 작은 세포들과 잘 정의된 경계를 갖는 hES 세포와 비숫한 모양이었다.
도 14E는 D에서 제조된 바와 같은 콜로니들의 AP에 대해 양성 염색된 4배 및 10배 확대도이다.
도 14F는 D에서 제조된 바와 같은 콜로니들의 hES 세포 표면 마커 TRA-1-60의 살아있는 염색 상태를 나타낸 도면이다.
도 14G는 콜로니의 펠렛화, 총 RNA 분리 및 qRT-PCR에 의한 정량화에 의해 평가된 hES-마커 OCT4 (내인성), NANOG (내인성), LIN28 (내인성), TERT 및 REX1의 mRNA-발현을 도시한 도면이다.
실시예 1: mRNAs를 안정화하는 서열 요소들의 동정
mRNAs를 안정화시키는 신규한 서열 요소들을 동정하기 위해, 본 발명자들은 시험관내 전사된 RNA에 대한 선발 환경으로서 hiDCs를 이용한 생체내 선발 프로세스를 개발하였다. hiDCs로부터 유래된 자연발생적인 mRNA 서열들을 이용하여 출발 RNA-라이브러리를 구축하였다. RNA 분리에 앞서, 세포들을 전사 저해제 악티노마이신 D (ActD)의 존재 하에 5 시간 성장시켜 안정한 RNAs를 미리 선발하였다. 이어서 나머지 mRNA를 추출하고 200-800 뉴클레오타이드들의 단편으로 감소시키고, 역전사시킨 다음, 선발 프로세스의 기초로서 선택된 hAg 5'UTR 서열 및 리포터 유전자를 산생하는 벡터 내에 3'-UTR로서 클로닝시켰다. 후속적인 라이브러리 mRNA 전사에 사용되는 DNA 주형을 PCR을 통해 증폭시키고, 이 동안 T7 프로모터를 5'-프라이머를 통해 A60 폴리A-테일을 3' 프라이머를 통해 도입하였다. 이어서 전사된 mRNA를 생체내 선발 프로세스에 도입하였으며, 이 프로세스는 상기 라이브러리를 수회 라운드에 걸쳐 시험관내 전사시키고, 대응하는 RNA를 hiDC로 전기천공한 다음, 소정 시간 경과 후 안정한 서열들을 추출 및 증폭시키는 것으로 이루어진다. 선발된 서열들의 증폭은 cDNA 합성 후 특이적 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 수행하였다. 이어서, 결과적인 PCR 산물들을 새로운 mRNA 라이브러리에 대한 주형으로서 사용하였다. 이것을 6 라운드만큼 수행하고, 잔류 RNAdml 추출은 라운드 1에서 24시간 후, 라운드 2 및 3에서 48시간 후, 라운드 4 및 5에서 72 시간 후, 및 마지막으로 라운드 6에서 96 시간 및 1주일 및 2주일 후에 실시하였다 (전기천공 후, 세포들을 3개 부분으로 나눈 다음 주어진 시점에서 개별적으로 수확함).
라운드 1 내지 5 경과 후 선발 프로세스를 모니터링하자 대응하는 RNA 풀의 평균 반감기가 유의적으로 증가한 것으로 입증되었는데, 이는 안정화 3'-UTR-요소들의 농축을 가리키는 것이다 (표 1). 그럼에도 불구하고, 안정성 증가는 라운드가 거듭됨에 따라 덜 뚜렷해졌다. 그러므로, 선발 프로세스를 최종 제6 라운드 후에 중단하였고, 여기서 RNA를 96 시간, 1주일 및 2주일 후에 세포로부터 추출하였다. 선발된 서열들을 특징화하기 위해, 350개를 상회하는 클론들을 시퀀싱하고, 라운드 5로부터 108, 라운드 6/96 시간으로부터 88, 라운드 6/1주일로부터 110 및 라운드 6/2주일로부터 96개를 클로닝하였다. 모든 서열들을 상호 비교하였을 뿐 아니라 이들의 게놈 기원을 동정하기 위해 BLASTed 처리하였다. 여기서, 서열들이 내인성 5'- 또는 3'-UTRs로부터 또는 코딩 영역으로부터 유래하였는지 특히 주목하였다. 마지막으로, hiDCs에서의 이들의 발현 수준을 NextBio (Illumina)로부터 다운로드하였다. 총체적으로, (i) 복수 서열들이 발견되었고, (ii) 내인성 RNA의 3'-UTRs 또는 내인성 비-코딩 RNA로부터 기원하며, 및 (iii) hiDCs에서 명백히 발현되었던 (표 2) 7개 그룹을 동정할 수 있었다. 이들은 다음 유전자들로부터 유래한다: IgG의 Fc 단편, 수용체, 트랜스포터, 알파 (B, FCGRT, NM_001136019), 림프구 특이적인 단백질 1 (D, LSP1, NM_002339), 케모카인 리간드 22 (E, CCL22, NM_002990), 스플릿의 아미노-말단 인핸서(F, AES, NM_198969), 포스포리파제 D 패밀리 멤버 3 (G, PLD3, NM_001031696), 미토콘드리아 인코딩된 12S RNA (I, MT_RNR1, NC_012920), 주요 조직적합 복합체 클래스 II DR 베타 4 (J, HLA-DRB4, NM_021983). 간단명료를 기하기 위해, 대문자 괄호 안의 영어 대문자 B 내지 I는 이하에서 이들 요소들의 약어로서 사용된다. 모든 경우에 있어서 하나의 서열에 대한 클론들은 정확히 그들의 5'- 및 3'- 말단에서 차이가 난다는 것이 중요한데, 이는 이들이 상이한 출발 클론으로부터 유래하고, 프로세스 동안 단순히 인위적으로 농축된 것이 아님을 입증하는 것이다 (스크리닝에서 동정된 모든 서열들의 완전한 리스팅에 대한 부록 참조).
실시예 2: 동정된 개별적인 서열 요소들의 특징화
동정된 서열 요소들의 특징화를 위해, 각 그룹의 대표적인 후보를 선택하였다 (자세한 서열은 부록에 표시함). 이어서 이 서열을 루시페라제 리포터 유전자가 들어있는 벡터에서 3'-UTR로서 클로닝하였다. 여기서 상기 루시페라제 리포터 유전자의 발현 수준은 세포 내로 전달 후 일정 시간 후에 분석할 수 있다. 단백질에서 관찰된 발현 패턴으로부터 RNA의 상대적인 안정성 및 번역 효율을 정확히 추론할 수 있다는 것이 이미 입증된 바 있다 (Kuhn 2010 Gene Ther.). 이 실험에 사용된 특이적인 리포터, luc2CPmut는, 루시페라제의 탈안정화된 형태이다(Promega). 이로 인해 RNA 안정성에 작은 변화라도 생기면 이를 검출할 수 있다. 이어서 이들 벡터들로부터 나온 시험관내 전사된 RNA를 2hBg 3'-UTR를 함유하는 본 발명의 최적 표준-mRNA(gold-standard-mRNA)와, RNA 안정성 및 번역 효율 측면에서 비교하였다. 대조군 샘플로서 3'-UTR이 없는 (즉 삽입물의 클로닝에 사용된 서열들만 함유하는) 시험관내 전사된 RNA 및 단일 베타-글로빈 요소 (1hB)만을 갖는 것을 이용하였다.
UTR 함유 벡터로부터 출발하여, 전사하고자 하는 영역을 60 뉴클레오타이드들의 폴리(A)-테일을 갖는 3' 프라이머 및 T7 프로모터를 함유하는 5' 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. AGENCOURT AMPURE XP (Beckman Coulter)를 이용하여 PCR 단편들을 클린업하였다. 각 PCR 반응물에 비드의 0.6 볼륨을 부가하여 혼합하였다. RT PCR에서 15분 인큐베이션 후, 비드에 결합된 PCR 산물을 자석 스탠드를 통해 과량의 프라이머, 뉴클레오타이드, 염 및 효소로부터 분리하였다. 비드를 80% 에탄올로 30초간 2회 세척하여 오염물을 추가로 제거하였다. 원하는 PCR 산물들을 마지막으로 30 μL로 2회 용리시키고 대응하는 RNA의 시험관내 전사를 n이한 주형으로서 사용하였다. 시험관내 전사를 위해, T7 RNA 폴리머라제 (Fermentas), 대응하는 반응 완충액 및 6 mM NTPs를 이용하였다. RNA의 효과적인 캡핑을 위해 GTP 농도를 1.5 mM로 감소시키고 6 mM의 β-S-ARCA(D2)를 반응물에 첨가하고 37℃에서 2.5 시간 동안 인큐베이션하였다. RNA를 카르복실화된 마그네틱 비드(Invitrogen)을 통해 정제하고 RNA 농도 및 품질을 분광광도계로 평가하고 2100 Bionanalyzer (Agilent)를 이용하여 분석하였다.
스크리닝 접근에서의 이들 동정 결과와 일치하게, 이들 모든 새로운 서열들은 RNA 안정성과 관련하여 2hBg과 비교시 매우 유사한 특징을 나타내었고 그룹 I (mtRNR1)이 가장 우수한 것으로 나타났다 (도 3; 표 3). 중요한 것은, 각각의 개별적인 요소가 3'-UTR이 없는 RNAdp 비해, 그리고 심지어 베타-글로빈 요소를 한 카피만을 갖는 RNA에 비해서도 RNA 안정성에 기여하였다는 점이다. 번역 효율은 경시적으로 발현된 총 단백질과 RNA 안정성 간의 직접적인 상관관계에 의해 관찰되는 바와 같이, 유의적으로 영향받지는 않았다.
실시예 3: 개별 서열 요소들의 조합
추가 실험에서, 각 그룹의 단일 서열들을 쌍을 이루는 방식으로 상호 조합시켰다 (도 2). 이의 근거는 2개의 3'-UTRs이 RNA의 안정성과 번역 효율에 부가적인 효과를 미쳤다는 이전의 본 발명자들의 관찰 결과에 기인한 것이다 (Holtkamp et al. 2006). RNA의 안정성 및 번역 효율을, 측정된 루시페라제 값을 R에서 스플라인을 이용하여 외삽함으로써 게산하고 이로부터 가장 가파른 기울기를 안정성으로서 시그널의 반감기 및 번역 효율로서 정의하였다. 보간된(interpolated) 스플라인의 적분을 총 단백질 발현으로서 해석한다. 총 64종의 조합을 클로닝하였으며, 즉, 새롭게 동정된 7종의 서열들과 인간 베타-글로빈 3'-UTR의 가능한 모든 조합을 클로닝하였다 (표 6). 전술한 바와 같이, RNA를 이들 주형 DNA로부터 준비한 다음, hiDCs에 전기천공하였다. 대조군으로서, 개별 요소들을 함유하는 RNA 역시도 포함시켰다. 7가지 새로운 요소들의 대다수에 있어서 다른 요소와의 적어도 한 가지 조합은 오직 단일 요소의 경우보다 RNA에 더 높은 안정성을 부여하는 것으로 관찰되었다(표 7 내지 표 13). 흥미롭게도, 대부분의 경우 I 요소(mtRNR1)를 갖는 조합 에서는 RNA 반감기가 증가되었다. 여기서, RNA의 안정성은 일반적으로 2hBg 3'-UTR을 갖는 RNA보다도 더 높았다. (표 7 내지 표 13). 거의 모든 조합들이 RNA의 번역 효율에 긍정적인 영향을 미쳤다. 종합적으로, RNA 안정성 및 번역 효율에 미치는 조합 효과는 총 단백질 발현을 최대 1.74배 증가시켰다. 따라서, 본 발명자들은 RNA에 증가된 안정성 및/또는 번역 효율을 부여하면서도 이와 동시에 상기 2hBg의 경우 설명된 1 요소의 동일한 2 카피가 갖는 문제점은 피할 수 있는 단일 요소(233 미만의 뉴클레오타이드 길이를 가짐) 및 2개의 상이한 요소들의 조합을 동정해낼 수 있었다.
루시페라제의 탈안정화된 형태를 이용하여 얻어진 결과를 입증하기 위해, 표준 루시페라제(Promega) 및 다음에 선택된 3'-UTRs: mtRNR1 (I), mtRNR1-AES (IF), AES-mtRNR1 (FI), mtRNR1-hBg (IhBg) 및 hBg-mtRNR1 (IhBg)를 산생하는 RNA에 대해 전술한 실험을 반복실시하였다. 도 4 및 표 14에 나타난 바와 같이, 상기 관찰된 것과 동등한 결과가 얻어졌으며, 이는 새로운 요소들이 개별적으로나 조합적으로, 2hBg 요소와 마찬가지로 mRNA 안정성 및/또는 번역 효율을 증가시킨다는 것을 증명하는 것이다.
실시예 4: 다른 세포 종류에서 선택된 서열 요소들을 산생하는 mRNA의 분석
hiDC-특이성이 있는지를 알아보기 위해 여러가지 상이한 세포 종류 및 세포주에 대해서도 새롭게 선발된 3'-UTRs mtRNR1 및 AES를 검사하였다. 이들 서열들을 인간 섬유아세포 (HFF), 쥐의 근아세포(C2C12) (도 5) 및 T 세포 (도 6)에서 테스트하여 이들이 이들 세포에서 안정화하는지를 평가하였다.
HFF 및 C2C12 세포들을 수확하고 전기천공을 위해 준비하였다. 다음으로 2.0 μg IVT-RNA를 지시된 3' UTRs를 함유하는 RNA를 인코딩하는 1.0 ㎍ GFP와 함께 전기천공하였다. 전기천공 후 세포들을 나누었다. 웰 당 5000개 세포들을 96-웰 플레이트에 총 7개 시점(2, 4, 8, 24, 48 및 72h)에서 3회씩 분배하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 웰 당 2E+05 세포들을 6-웰 플레이트 내로 플레이팅하고 24 시간 후 FACS를 위해 수확하였다(GFP-시그널). 이에 의해 형질감염 효율을 모니터링할 수 있었다. 이들은 72 내지 90% 로 차이가 났고 반감기 계산에 산입될 수 있다. T 세포 뿐만 아니라 HFF 및 C2C12를 이용하여 얻어진 결과들은 앞서 hiDC를 이용하여 얻어진 결과를 확인해주었다. I와 F의 조합은 특히 2hBg에 비해 반감기 측면에서 2배 내지 3배 더 우수하였다. 뿐만 아니라, FI는 C2C12 세포에서 3배 더 우수한 번역 효율과 본 발명의 최적-표준에 비해 경시적으로 2배나 더 우수한 단백질 생산능을 나타냈다. 이러한 결과는, I 및 F가 hiDC-특이적이지 않고, 다른 세포들에서도 mRNA 안정성 및 번역 효율을 증강시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
실시예 5: FI 3'UTR은 변형된 mRNA로부터 발현을 증가시킨다
단백질 치환요법을 비롯한 몇몇 응용예에서, 변형된 뉴클레오타이드들을 갖는 mRNAs는 감소된 그의 면역원성으로 인해 변형되지 않은 것들보다 더 선호된다 (Kariko et al., 2008). 그러나, 염기 변형은 대응하는 RNA 결합 단백질과의 상호반응에 직접 영향을미치거나 또는 RNA의 부차적인 구조 형성을 변경시킴으로써, mRNA의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 선택된 3' UTRs은 변형된 mRNA 관점에서 다르게 거동할 수 있다. 그러므로, 본 발명자들은 F 및 I의 조합을 2hBgUTR과, hiDCs, HFFs, CD8+ 및 CD4+ T-세포에서, 그리고 쥐의 MEFs, C2C12 및 bmDCs에서, m1Y 변형된 mRNA 관점에서 비교하였다. 리포터로서, 루시페라제를 이용하였다 (구조물의 설계는 도 7A를 참조할 것). 변형된 mRNAs를 만들기 위해, IVT 반응에서 U를 m1Y로 완전히 대체시켰다. 모든 실험에서, 비변형 RNA를 대조군으로서 포함시켰다. 수득된 mRNA의 인테그리티는 UTP의 m1YTP 교체에 의해 영향받지 않았다(도 7B). 표 15에 설명된 세팅을 이용하여 세포들을 전기천공하고 루시페라제 수준을 3, 6, 12, 24, 48, 72 및 96h에서 측정하였다.
비변형 루시페라제 mRNA의 전기천공으로 이전에 관찰되었던 효과들을 재생할 수 있었다: 모든 세포 종류에서 FI 요소는 RNA 안정성을 전달하는데 있어 2hBg 대조군보다 우수하거나 동등하였다 (표 16A). 쥐의 DCs 및 인간 T- 세포에서 mRNA 반감기는 2개의 3'UTR 사이에서 필적하였던 반면, FI 요소는 HFF 세포에서 mRNA 반감기를 최대 1.69배 증가시켰다. 총 단백질 양은 모든 세포에서 증가하였고, HEF 세포에서 가장 극명하게 증가하였다 (2.45배).
변형된 mRNA의 경우, FI 요소는 hiDCs에서 2hBg에 비해 mRNA 반감기 역시도 증가시켰고 총 단백질 양은 2 배 이상 증가되었다(표 16B). 다른 세포 종류에서의 결과 역시도 비변형 mRNA에서 얻어진 것과 유사하였다: FI 요소는 HFF, MEF 및 C2C12 세포가 연루된 모든 실험에서 2hBg 보다 우수하였고 T-세포 및 쥐의 DCs에서는 필적하였다 (표 16B). 그러므로, U 변형은 mRNA를 안정화하는 FI 요소의 능력을 변경시키는 것이 아니다.
Example 실시예 6: FI 3'UTR은 형질감염 방법과 무관하게 mRNA로부터의 발현으르 증가시킨다
이제까지, 모든 실험은 형질감염법으로서 전기천공법을 이용하여 수행되었다. 전기천공시 전달된 mRNA는 세포질에 직접 도달하는데, 엔도좀 흡수 경로 환경 하에서, 세포질은 리포펙션을 경유하여 형질감염된다. FI 요소가 이러한 조건 하에서도 기능하는지 알아보기 위해, 형질감염 시약으로서 RNAiMAX를 이용하는 이전 실험에서 사용된 바와 같이 루시페라제 mRNA를 함유하는 2hBg 및 동일한 FI를 이용하여 세포들을 리포펙션시켰다. 리포펙션 후에도, FI 요소는 루시페라제 발현을 증가시켰으나, 그 증가는 RNA가 전기천공을 통해 전달된 실험 사례보다 덜 두드러졌다 (표 16C). 따라서, 형질감염 방법이 FI 요소의 안정화 효과에 영향을 미치는 것은 아니다.
실시예 7: FI 3'UTR 및 2hBgUTR 함유 mRNA는 생체내에서 필적할만한 단백질 발현 및 면역 활성화를 이끌어낸다.
FI 3'UTR를 함유하는 mRNA로부터의 생체내 단백질 발현을 평가하기 위해, 앞선 실험에서 사용된 바와 같은 동일한 FI 및 2hBg 함유 루시페라제 mRNAs를 F12와 함RP 조성하고 BALB/c 마우스에게 투여하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 루시페라제 발현은 두 가지 3'UTRs 모두의 경우 필적할만하였다. 항원 특이적인 면역 반응 역시도 필적할만한 정도로 유도되었고 FI 3'UTR 함유 mRNA의 효과가 비장에서 살짝 더 강하였다.
실시예 8: IF UTR은 자가-복제 RNA의 시험관내 안정성을 증가시킨다.
알파바이러스 게놈으로부터 유래된 시험관내 전사된 자가-복제 RNA(레플리콘 RNA)는 강력한 백신 벡터이다. 레플리콘 RNA는 레플리콘 RNA의 세포질 복제 (복제 효소)에 필요한 효소 복합체의 처음 2/3를 암호화한다. 이 레플리카제는 서브게놈 RNA의 레플리카제-의존 합성을 위한 서브게놈 프로모터로서 작용하는 내면의 RNA 구조를 인식한다. 백신접종을 위한 트랜스유전자 또는 항원은 전체 레플리콘보다 훨씬 짧은 이 서브게놈 RNA 상에 인코딩된다. 전반적으로, 게놈 (전장 레플리콘 RNA)과 서브게놈 RNA는 양자 모두 세포 mRNA를 리셈블한다. 양자 모두 UTRs에 의해 플랭킹되고 두 가지 모두 캡핑되어 폴리아데닐화된다. 캡핑 및 폴리아데닐화를 담당하는 효소들은 레플리카제 효소 복합체 내에 함유되어 있다. UTR 내의 보존된 서열 요소 (CSE) - 5'CSE의 경우 레플리카제의 ORF와 중첩됨 - 는 레플리카제의 결합에 필요하며 마이너스 가닥 합성 (3'CSE) 또는 플러스 가닥 합성(5'CSE)에 있어서 프로모터로서 작용한다.
비-복제성 시험관내 전사된 mRNA에 대해 동정 및 검정된 신규한 안정화 UTRs이 보다 큰 안정성을 제공하는지, 그리고 그에 의해 레플리콘 RNA의 보다 높은 트랜스유전자 발현을 결과시키는지 평가하기 위해, 본 발명자들은 각각의 서열들을 레플리콘 RNA 주형 벡터 내로 클로닝시켰다. 3'CSE는 폴리-A 테일에 바로 인접하여 위치할 필요가 있기 때문에 본 발명자들은 신규한 UTRs를 탈안정화된 루시페라제(Luc2CP)를 인코딩하는 레플리콘의 3'CSE의 바로 상류에 삽입하였다. 레플리콘 RNA를 IVT mRNA와 유사한 선형화된 주형 플라스미드의 시험관내 전사에 의해 합성하였다. 레플리콘 RNA를 전기천공에 의해 세포(BHK21 및 HFF) 내로 도입하고 루시페라제 발현을 평가하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 삽입된 모든 UTRs는 사용된 두 가지 세포주 모뒝 있어서 Luc2CP의 번역을 증가시켰다. 흥미롭게도 "IF" UTR 조합이 발군의 번역 증가 효과를 결과시켰다.
실시예 9: 최대 90% 상동성의 뉴클레오타이드 교환은 FI 요소의 안정화 특성에 아무 영향을 미치지 않는다
신규한 안정화 UTR 서열들의 동정에 적용된 선발 공정으로 인해, 특정 크기 범위의 서열들이 수득되었다. 연장된 5' 및 3' 말단을 갖는 동일 서열들을 동정하여 요구되는 최소 길이에 대한 첫 번째 시사점이 제공되었다. 그러나, 각 요소가 그의 안정화 효과를 발휘하는데 요구되는 최소 영역은 이보다 더 짧을 수도 있다. 이에 더해, 서열이 약간 변형되어도 여전히 기능을 발휘할 수 있는데, 즉, 임의의 개별적인 뉴클레오타이드의 실체(identity)는 FI 요소의 특성을 안정화하는데 있어 가장 중요한 것이 아닐 수 있다. 뉴클레오타이드 교환에 대해 요소들이 어느 정도로 견고한지 알아보기 위해, 본래의 FI 요소에 대해 97.5%, 95.0%, 92.5% 및 90.0% 상동성을 갖는 3' UTR 서열들을 hiDCs에서 총 단백질 발현 및 mRNA에 대해 테스트하였다. 교환된 뉴클레오타이드들을 전체 서열 길이(서열 208-211, 랜덤 변형)에 대해 무작위적으로 선택하였다. 3'UTR로서 이들 변형된 요소들을 갖는 루시페라제 mRNAs를 시험관내 전사하고 hiDCs에 전기천공하여 이들의 발현 후 경시적으로 3, 6, 24, 48, 및 72 시간 후에 루시페라제를 측정하였다. 변형된 FI 요소를 갖는 루시페라제 mRNAs는 동일한 전체 단백질량을 생산하였고 대략 동일한 반감기를 가졌다(표 17).
전술한 바와 같이 랜덤 치환도를 증가시키는데 더해, FI 요소의 2차 구조를 파괴할 가능성이 있는 뉴클레오타이드 치환을 합리적으로 도입함으로써 변형된 FI 요소들의 또 다른 세트를 생성하였다. 다수의 천연 3 'UTR 서열에 있어서 mRNA의 안정성에 영향을 미치는 조절 단백질을 위한 결합 부위를 2차 구조가 제공하기 때문에 2차 구조가 중요하다는 것이 알려져 있다(Addess et al., 1997; Putland et al., 2002; Crucs et al., 2000; Adams et al., 2003). 서로 완벽하게 상보적인 두 개의 8nt 시퀀스가 FI 요소에 존재하는데, 하나는 F에 있고 다른 하나는 I 요소에 존재한다(도 10). 이 두 영역의 염기쌍은 대개 m폴드(mfold) 예측 후에 볼 수 있다. mFold (Zuker, 2003)는 입력 서열들의 2차 구조 예측을 가능하게 하는 컴퓨터 프로그램이다. 이 특이적인 2차 구조 요소의 중요성을 검토하기 위해, 염기쌍을 파괴하는 방식으로 서열을 변화시켰다 (서열 212, 8nt 돌연변이) 이 다소 긴 상보 서열들 외에도, 대부분의 출력 폴드에 존재하는 구조 요소들에 대해 FI 3'UTR에 대한 m폴드 예측을 스크리닝하였는데 따라서 이것은 생체내 형성 확률이 높다. 이들 폴드들의 염기쌍 형성에 관여하는 뉴클레오타이드들을 그의 염기쌍 파트너로 뒤바꿈으로써 본래 FI 서열들에 대해 97.5%, 95.0%, 92.5% 및 90.0% 상동성으로 변화시키고 이에 의해 당해 서열의 2차 구조를 유지시켰다 (서열 217-220, 변형을 유지하는 구조). 이에 더해, 동일 서열들을 이중 가닥 부분의 오직 한 가닥에서만 교환시킴으로써, 2차 구조를 고의적으로 파괴하였다. 이 경우, 본래 서열에 대한 실체는 각각 98.75%, 97.50%, 96.25%, 및 95.00%였다 (서열들 213-216, 변형을 탈안정화시키는 구조).
전술한 변형된 3' UTR 요소들을 갖는 루시페라제 RNAs를 시험관내 전사하고, hiDCs에 전기천공하여 이들을 발현시키고 3, 6, 24, 48 및 72 시간 후 루시페라제 측정하였다. 변형 전략을 사용하지 않으면 mRNA 반감기에 유의한 영향을 미칠 수 있다. 따라서 FI 요소의 안정화 특성은 적어도 최대 10.0 %의 뉴클레오타이드가 변화된 그의 뉴클레오티드 서열 또는 2차 구조의 변화에 대해 견고해 보인다. 또한, FI 서열의 변형에서 총 단백질의 감소는 관찰되지 않았다 (표 18 A 및 B).
실시예 10: 2hBg 대신 FI 요소를 이용하면 RNA-인코딩 영역의 PCR-기반 증폭에서 미스프라이밍이 회피된다
전술한 바와 같이, FI 요소는 mRNA 안정성 및 번역 효율과 관련하여 2hBg 3'UTR과 동등하거나 더 우수하다. FI 요소의 또 다른 장점은 그의 비-반복적 서열 때문인데, 반면에 hBg 3'UTR의 2개 카피는 몇몇 경우 문제를 일으킬 수 있다.
이것은 RNA 전사에 대한 DNA 주형이 PCR에 의해 증폭되는 경우 가장 극명하다. 이 경우, 전장 폴리A-테일은 3'UTR의 바로 3 '말단에서 결합하는 3'프라이머 올리고로 첨가된다 (도 11 A). 2hBgUTR의 경우, 단절된 부산물이 PCR 중에 출현하며 이것은 시퀀싱 후 UTR에서 1hBg 반복만을 갖는 mRNA로 구성되는 것으로 밝혀졌다(도 11 B). 전사 후, 단절(truncation)은 mRNA에서도 보인다 (도 11C). 이 현상은 2hBgUTR 요소를 함유하는 구조물과의 대부분의 PCR 반응에서 일어나며 프라이머 어닐링 온도, 완충액 조성, 프라이머 서열 또는 대체 폴리머라제를 비롯한 최적화 노력을 통해서도 완전히 피할 수 없다. 3' UTR과 폴리A-테일 사이에 독특한 링커 서열을 삽입한 후에도, 이 문제는 여전히 남아있다. 중요하게, 사이드 피크의 강도는 PCR 반응 수율과 상관관계가 있는데, 이는 PCR 사이클이 거듭될수록 증가하는 짧은 단절된 PCR 단편의 미스프라이밍(mispriming)이 문제의 가능한 원인이 될 수 있음을 시사한다. 따라서, 2hBg 3'-UTR을 갖는 RNA를 코딩하는 DNA 주형에 대해 만족할만한 조건이 이제까지 확인되지 못하였다.
이와 대조적으로, FI 요소를 갖는 DNA 주형의 PCR은 단절된 부산물을 전혀 생산하지 않았고(도 11 D), 결과적인 mRNA 역시도 Bioanalyzer 프로파일에서 부가적인 피크를 전혀 나타내지 않았다(도 11 E). 따라서, FI 요소는 PCR 주형의 온전성 및 대응하는 RNA 품질과 관련하여 2hBgUTR에 비해 3'UTR로서 상당한 개선을 나타내는 것이다
실시예 11: F 및 I 요소들의 서브단편들의 RNA-안정화 속성
새로운 안정화 UTR 요소를 확인하기 위해 적용된 선발 절차로 인해, 특정 크기 범위의 서열들이 얻어졌다. 연장된 5 '및 3' 말단을 갖는 동일한 서열의 동정에 의해 필요한 최소 길이에 대한 최초의 시사점(indication)이 제공되었다. 그러나 각 요소가 안정화 효과를 발휘하는 데 필요한 최소 영역은 더 짧을 수도 있다. 이를 위해, F 및 I 요소 모두에 대해, 5 '및/또는 3' 말단에서 단축된 원래의 요소의 상이한 단편을 포함하는 단축된 UTR을 각각 함유하는 5 개의 루시페라제 리포터 구조물이 설계되었다 (각각 도 12의 상부 패널 A 및 B). 이들 리포터 구조물들을 시험관내 전사하고, hiDCs 내로 전기천공하여 경시적으로 발현시키고 전기천공 3, 6, 24, 48 및 72 시간 후에 루시페라제 측정하였다. 각각의 전체 길이가 1로 설정된 RNA를 갖는 상대 RNA 반감기에 대해 결과 발현 곡선을 분석하였다 (각각 도 12의 하부 패널 A 및 B 참조).
F- 요소의 경우 시험된 모든 서브서열에서 mRNA 반감기가 유의하게 감소하지 않았는데 이는 안정화 역할을 하는 F-요소를 따라 다양한 서브서열들이 풍부하고도 비-협력적으로 관여하였음을 가리킨다. I-요소의 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있었지만 중심 영역 (nt37-107)만이 3'UTR로 사용되었을 때 약간의 성능 저하가 관찰되었다.
이러한 결과를 참조하기 위해, 전체 길이의 개별 F 및 I 요소뿐만 아니라 FI 조합을 출발 라이브러리(257nt 길이)로부터 무작위로 선택된 3 'UTR과 비교하였다. 이것은 출발 DNA 풀을 클로닝하고 단일 랜덤 클론을 선발함으로써 수득하였다. 전술한 바와 같이 각 UTR 서열들을 가는 루시페라제-인코딩 RNAs를 hiDC 내로 전기천공하고 루시페라제 발현을 경시적으로 측정하여 상대적인 반감기 및 총 단백질 발현을 계산하였다. F, I, 및 FI 요소에 비해, 무작위적으로 선발된 3' UTR을 갖는 RNA는 약간 덜 안정하였다 (도 13, 상부 패널). 선발된 UTRs의 효과는 총 단백질 발현에 대해서 보다 더 뚜렷하였다(도 13, 하부 패널). 이것은 전술한 바와 같은 F 및 I 요소의 단편의 영향이 단지 3 'UTR 서열의 존재에 기인한 것이 아니라 선발된 서열에 특이적이라는 것을 명확하게 나타내는 것이다. 이것은 선발 과정에서 풀(pool)의 RNA 안정성이 증가된 것으로 관찰된 것과 일치한다 (상기 내용 참조).
실시예 12: 줄기세포 재프로그래밍을 위한 안정화 UTR 요소들의 사용
40,000개의 세포들을 12-웰 플레이트에 플레이팅하고 재프로그래밍 TF OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG 및 LIN28 (OSKMNL)(1:1:1:1:1:1)를 인코딩하는 0.33 ㎍의 비변형 전사된 (IVT)-RNA 및 0.08 ㎍의 각 B18R, E3 및 K3(EKB) 및 miRNAs 302a-d 및 367로 구성된 miRNA 혼합물 0.17 ㎍ (1:1:1:1:1:1)으로 구성된 mRNA 혼합물로 3 일 (3x) 또는 4 일 (4x) 연속하여 리포펙션시켰다. 이에 의해 RNA-구조물들은 인간 β-글로빈 3'UTR (2hBg), F-I-요소 (FI) 또는 I-F-요소 (IF)의 탠덤 반복체로 구성된 그들의 ' UTR에 있어서만 차이가 났다. 세포들을 인간 배아 줄기(hES) 세포 배지에서 배양하고 제조업자 지침에 따라 RNAiMAX를 이용하여 리포펙션시켰다. 제9일부터, 콜로니 형성이 관찰되었고 제11일에 콜로니를 분석하였다 (타임라인 개관은 도 14A 참조). 수립된 콜로니들을 제11일에 AP Staining Kit을 이용하여 알칼리성 포스파타제(AP)로 염색하였다. 대표적인 염색의 개관은 도 14B를 참조할 수 있다. FI-요소의 통합에 의해 AP 양성 콜로니(진한색)가 더 높은 양으로 얻어졌다는 것이 명확해졌다. AP로 염색된 콜로니들을 계수하고 개관으로부터의 결과를 확인하였다: 이전에 사용되었더 2hBg-UTR에 비해, FI-UTR로 대체하자 세포가 3회 리포펙션된 경우 콜로니가 3-4배 더 많이 얻어졌다. IF-UTR에 의한 대체에 의해 2배 초과되었다. 4 가지 형질감염의 경우 이러한 효과들은 덜 두드러졌다. 이 경우에는 IF-UTRP의 경우 관찰된 개선이 관찰되지 않았다. 한 편에서는 프로세스가 4 가지 형질감염에 의해 포화된 것으로 보이는 반면, 다른 편에서는 콜로니의 과다한 성장으로 어느 정도 편향되어있다 (도 14C 참조). FI-UTR을 함유한 RNA를 사용하여 생성된 iPS- 세포 콜로니의 콜로니 형태학은 hES 세포-특유의 콜로니 및 잘 정의된 경계에서 단단히 채워진 작은 세포들과 유사했다 (도 14D). 이들 콜로니들은 AP에 대해 양성 염색가능하고(도 14E) 및 hES 세포 표면 마커 TRA-1-60에 대해 양성 염색가능하다 (도 14F). TRA-1-60 라이브 염색을 제조업자 지침에 따라 Stain-Alive TRA-1-60 항체 (Stegment)를 이용하여 수행하였다. 콜로니의 대표적인 사진을 찍었다. 콜로니들의 다분화능을 추가로 평가하기 위해, 세포들을 펠렛화하고, 총 RNA를 분리하고 hES-마커들 OCT4 (내인성), NANOG (내인성), LIN28 (내인성), TERT 및 REX1의 mRNA- 발현을 qRT-PCR에 의해 정량하였다. mRNA 발현을 HPRT의 그것에 대해 정규화하고 이를 입력 세포의 전사 수준과 비교하여 폴드 유도로서 나타내었다. 3회 리포펙션 후 콜로니들을 분석한 결과를 도 14G에 나타내었다. 분석된 모든 마커들은 입력 세포에 비해 고도로 발현되었는데 이는 재프로그램된 세포들의 다분화능을 가리키는 것이다. FI-함유 합성 mRNA의 우수성은 2hBg- 및 IF- 함유 mRNA로 재프로그램한 경우에 비해 더 높은 내인성 마커 발현에 의해 확인되었다.
이러한 결과들은 2hBg-UTR을 FI-UTR로 대체하면 보다 신속하고 효율적인 RNA-기반 재프로그램 기술이 제공된다는 것을 보여주는 것이다. 이것은 아마도 FI로 대체한 결과 재프로그래밍 전사 인자들의 보다 장기간의 그리고 보다 높은 발현에 기초하는 것일 것이다. FI 요소의 오리엔테이션은 따라서 그로 인해 IF 구조에서 이점이 관찰되지 않았으므로 없어서는 안될 것으로 보인다. FI-함유 mRNA에 의한 세포의 성공적인 재프로그래밍은 hES-세포 유사 형태, AP-활성 및 hES-세포 표면의 발현 및 결과적인 iPS- 세포 콜로니의 내인성 마커에 의해 확인되었다.
표 스캐닝
[표 1]
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[표 3]
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[표 10]
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[표 11]
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[표 13]
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[표 14]
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[표 15]
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[표 16]
전기천공시 비변형 및 변형된 mRNA 및 리포펙션시 비변형 RNA를 함유하는 2hBgUTR에 대한 FI-요소의 반감기 및 총 단백질.
3'UTR로서 FI 또는 2hBg 중 어느 하나를 함유하는 개똥벌레 루시페라제 유전자를 코딩하는 플라스미드들을 클래스IIS 제한효소에 의해 폴리(dA:dT)의 하류에서 선형화시킴으로써 폴리(dA:dT)를 지나 부가적인 뉴클레오타이드들을 갖지 않는 주형을 생성하였다. 선형화된 플라스미드 DNA는 카르복실화된 자석 비드(Invitrogen)을 이용하여 정제하고, 분광광도계로 정량하여 시험관내 전사시켰다. 시험관내 전사를 위해 RNA 저해제 및 파이로포스파타제가 보강된 홈-메이드 T7 RNA 폴리머라제를 125mM Hepes pH 8.35, 34mM MgOAc2, 10mM DTT 및 2mM Spermidin 완충액에서 7.5mM NTPs와 함께 사용하였다. RNA의 효율적인 캡핑을 위해 반응물에 6 mM의 β-S-ARCA(D2)를 첨가하고 초기 GTP 농도를 1.5 mM로 저하시키고 2.5 시간 동안 37℃에서 페드-뱃치 프로세스로 7.5 mM로 조정하였다. RNA를 카르복실화 자석 비드(Invitrogen)을 통해 정제하고 RNA 농도 및 품질을 분광광도계로 평가하고 2100 Bioanalyzer (Agilent)를 이용하여 분석하였다.
A)는 몇몇 인간 및 쥐의 세포주에서 FI 요소를 함유하는 비변형 mRNAs의 반감기가 2hBg 3'UTR을 함유하는 것들보다 더 높거나 필적함을 나타낸다. 표 15에 기재된 양으로 인간 섬유아세포 (HFFs), CD8+ 및 CD4+ T-세포, 쥐의 배아 섬유아세포 (MEF), 근세포종 세포(C2C12) 및 쥐의 DCs를 X-VIVO15 배지 (Lonza)에서 해당량의 RNA (표 15)와 혼합하여 전기천공하였다. 표시된 수의 세포들을 100㎕의 적절한 성장 배지에서 첨가제와 함께 96-웰 디쉬에 플레이팅하였다. 접종 후 2, 6, 24, 48, 72 및 96 시간 경과 후 형광 판독기(TECAN)에 Luciferin (Promega)을 첨가함으로써 개똥벌레 루시페라제 활성을 구하였다.
B) 상이한 인간 및 쥐의 세포주에서 FI 요소를 함유하는 m1Y 변형된 mRNAs의 반감기가 2hBg 3'UTR을 함유하는 것들보다 더 높거나 필적함을 나타낸다. 표 15에 기재된 양으로 인간의 미성숙 수지상 세포 (iDC), 섬유아세포 (HFFs), CD8+ 및 CD4+ T-세포, 쥐의 배아 섬유아세포 (MEF), 근세포종 세포 (C2C12) 및 쥐의 DCs를 X-VIVO15 배지 (Lonza)에서 m1Y 변형된 RNA(표 15)와 혼합하여 전기천공하였다. 표시된 수의 세포들을 100㎕의 적절한 성장 배지에서 첨가제와 함께 96-웰 디쉬에 플레이팅하였다. 접종 후 2, 6, 24, 48, 72 및 96 시간 경과 후 형광 판독기(TECAN)에 Luciferin (Promega)을 첨가함으로써 개똥벌레 루시페라제 활성을 구하였다.
C)는 RNA를 리포펙션에 의해 형질감염시킨 경우에도 상이한 세포주에서 FI 요소를 함유하는 비변형 mRNAs의 반감기가 2hBg 3'UTR을 함유하는 것들보다 더 높거나 필적함을 나타낸다. 50ng RNA를 15-30분 동안 0.2㎕ RNAiMAX와 함께 인큐베이션하고 96 웰에서 1E04 HFF, MEF 또는 C2C12 세포에 주었다. 형광 판독기(TECAN)에 Luciferin (Promega)을 첨가함으로써 3, 6, 12, 24, 48, 72 및 96 시간에서 루시페라제 수준을 측정하였다.
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[표 17]
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[표 18]
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본 발명에서 설명된 서열들은 다음과 같다:
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SEQUENCE LISTING <110> BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH et al. <120> 3' UTR SEQUENCES FOR STABILIZATION OF RNA <130> 674-146 PCT <150> PCT/EP2015/073180 <151> 2015-10-07 <160> 221 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 208 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 cauccugcug cugcugcugc ugcugcugcg ggucuuccug gaaucugacc auucguuguc 60 ugcuaugccc guccucacca agacugacug ccugcugcuu ugcuacugcc cgggcccaug 120 agacugacuu cccacugcuc ugccugccuc uccccacugc acuggcacag ccccgccuug 180 ccgcugcuga uccauugccg gugugacc 208 <210> 2 <211> 202 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 gcugcugcug cugcugcugc ugcgggucuu ccuggaaucu gaccauucgu ugucugcuau 60 gcccguccuc accaagacug acugccugcu gcuuugcuac ugcccgggcc caugagacug 120 acuucccacu gcucugccug ccucucccca cugcacuggc acagccccgc cuugccgcug 180 cugauccauu gccgguguga cc 202 <210> 3 <211> 210 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uuccugcugc ugcugcugcu gcugcugcug cgggucuucc uagaaucuga ccauucguug 60 ucugcuaugc ccguccucac caagacugac ugccugcugc uuugcuacug cccgggccca 120 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ugcugcuuug cuacugcccg ggcccaugag acugacuucc cucugcucug ccugccucuc 180 cccacugcac uggcacagcc ccgccuugcc gcugcugauc cauugccugu gugacca 237 <210> 23 <211> 214 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 ugaccaucuu ccauccugcu gcugcugcug cugcgggucu uccuggaauc ugaccauucg 60 uugucugcua ugcccguccu uaccaagacu gacugccugc ugcuuugcua cugcccgggc 120 ccaugagacu gacuucccac ugcucugccu gccucucccc acugcacugg cacagccccg 180 ccuugucgcu gcugauccau ugccggugug acac 214 <210> 24 <211> 128 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 gacugacugc cugcugcuuu gcuacugccc gggcccauga gacugacuuc ccacugcucu 60 gccugccucu ccccacugca cuggcacagc cccgccuugc cgcugcugau ccauugccgg 120 ugugaccc 128 <210> 25 <211> 230 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 cucccugagu cugaccaucu uccauccugc ugcugcugcu gcugcugcug cgggucuucc 60 uggaaucuga ccauucguug ucugcuaugc ccguccucac caagacugac ugccugcugc 120 uuugcuacug cccgggccca ugagacugac uucccacugc ucugccugcc ucuccccacu 180 gcacuggcac agccccgccu ugccgcugcu gauccauugc cggugugacc 230 <210> 26 <211> 211 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 uuccauccug cugcugcugc ugcugcugcu gcgggucuuc cuggaaucug accauucguu 60 gucugcuaug cccguccuca ccaagacuga cugccugcug cuuugcuacu gcccgggccc 120 augagacuga cuucccacug cucugccugc cucuccccac ugcacuggca cagccccgcc 180 uugccgcugc ugauccauug ccggugugac c 211 <210> 27 <211> 143 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 ugcccguccu caccaagacu gacugccugc ugcuuugcua cugcccgggc ccaugagacu 60 gacuucccac ugcucugccu gccucucccc acugcacugg cacagccccg ccuugccgcu 120 gcugauccau ugccggugug acc 143 <210> 28 <211> 143 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 ugcccguccu caccaagacu gacugccugc ugcuuugcua cugcccgggc ccaugagacu 60 gacuucccac ugcucugccu gccucucccc acugcacugg cacagccccg ccuugccgcu 120 gcugauccau ugccggugug acc 143 <210> 29 <211> 181 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 gcgggucuuc cuggaaucug aacauucguu gucugcuaug cccguccuca ccaagacuga 60 cugccugcug cuuugcuacu gcccgggccc augagacuga cuucccacug cucugccugc 120 cucuccccac ugcacuggca cagccccgcc uugccgcugc ugauccauug ccggugugac 180 c 181 <210> 30 <211> 154 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 guugucugcu augcccgucc ucaccaagac ugacugccug cugcuuugcu acugcccggg 60 cccaugagac ugacuuccca cugcucugcc ugccucuccc cacugcacug gcacagcccc 120 gccuugccgc ugcugaucca uugccggugu gacc 154 <210> 31 <211> 130 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 caagacugac ugccugcugc uuugcuacug cccgggccca ugagacugac uucccacugc 60 ucugccugcc ucuccccacu gcacuggcac agccccgccu ugccgcugcu gauccauugc 120 cggugugacc 130 <210> 32 <211> 138 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 ccucaccaag acugacugcc ugcugcuuug cuacugcccg gacccaugag acugacuucc 60 cacugcucug ccugccucuc cccacugcac uggcacagcc ccgccuugcc gcugcugauc 120 cauugccggu gugacugc 138 <210> 33 <211> 214 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 cuuccauccu gcugcugcug cugcugcugc ugcgggucuu ccuggaaucu gaccauucgu 60 ugucugcuau gcccguccuc accaagacug acugccugcu gcuuugcuac ugcccgggcc 120 caugagacug acuucccacu gcucugccug ccucucccca cugcacuggc acagccccgc 180 cuugccgcug cugauccauu gccgguguga cccc 214 <210> 34 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augagacuga cuucccacug cucugccugc 480 cucuccccac ugcacuggca cagccccgcc uugccgcugc ugauccauug ccggugugac 540 c 541 <210> 37 <211> 125 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 cugacugccu gcugcuuugc uacugcccgg gcccaugaga cugacuuccc acugcucugc 60 cugccucucc ccacugcacu ggcacagccc cgccuugccg cugcugaucc auugccggug 120 ugacc 125 <210> 38 <211> 131 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 ccaagacuga cugccugcug cuuugcuacu gcccgggccc augagacuga cuucccacug 60 cucugccugc cucuccccac ugcacuggca cagccccgcc uugccgcugc ugauccauug 120 acggugugac c 131 <210> 39 <211> 245 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 uaacuaccau ggccaguccu cccugagucu gaccaucuuc cauccugcug cugcugcugc 60 ugcugcgggu cuuccuggaa ucugaccauu cguugucugc uaugcccguc cucaccaaga 120 cugacugccu gcugcuuugc uacugcccgg gcccaugaga cugacuuccc acugcucugc 180 cugccucucc ccacugcacu ggcacagccc cgccuugccg cuguugaucc auugccggug 240 ugacc 245 <210> 40 <211> 131 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 ccaagacuga cugccugcug cuuugcuacu gcccgggccc augagacuga cuucccacug 60 cucugccugc cucuccccac ugcacuggca cagccccgcc uugccgcugu ugauccauug 120 ucggugugac c 131 <210> 41 <211> 131 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 ccaagacuga cugccugcug cuuugcuacu gcccgggccc augagacuga cuucccacug 60 cucugccugc cucuccccac ugcacuggca cagccccgcc uugccgcugc ugauccauug 120 ccggugugac c 131 <210> 42 <211> 149 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 cugcuaugcc uguccucacc aagacugacu gccugcugcu uugcuacugc ccgggcccau 60 gagacugacu ucccacugcu cugccugccu cuccccaaug cacuggcaca gccccgccuu 120 gccgcugcug auccauugcc ggugugacc 149 <210> 43 <211> 149 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 cugcuaugcc cguccucacc aagacugacu gccugcugcu uugcuacugc ccgggcccau 60 gagacugacu ucccacugcu cugccugccu cuccccacug cacuggcaca gccccgccuu 120 gccgcugcug auccauugcc ggugugacc 149 <210> 44 <211> 147 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 gcuaugcccg uccucaccaa gacugacugc cugcugcuuu gcuacugccc gggcccauga 60 gacugacuuc ccacugcucu gccugccucu ccccacugca cuggcacagc cccgccuugc 120 cgcugcugau ccauugccgg ugugacc 147 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gccgcugcug auccauugcc ggugugacc 169 <210> 49 <211> 131 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 ccaagacuga cugccugcug cuuugcuacu gcccgggccc augagacuga cuucccacug 60 cucugccugc cucuccccac ugcacuggca uagccccgcc uugccgcugc ugauccauug 120 ccggugugac c 131 <210> 50 <211> 175 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 cuuccuggaa ucugaccauu cguugucugc uaugcccguc cucaccaaga cugacugccu 60 gcugcuuugc uacugcccgg gcccaugaga cugacuuccc acugcucugc cugccucucc 120 ccacugcacu ggcauagccc cgccuugccg cugcugaucc auuuccggug ugacc 175 <210> 51 <211> 140 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 cagacacccg ccccccggcc cuggcuaaga auuugcuucc uguugccagc augaccuacc 60 cucgccucuu ugaugccauc cgcugccacc uccuuuugcu ccuggacccu uuagccucuc 120 ugcccuucca cucucugacc 140 <210> 52 <211> 149 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 uuccagccag acacccgccc cccggcccug gcuaagaagu ugcuuccugu ugccagcaug 60 accuacccuc gccucuuuga ugccauccgc ugccaccucc uuuugcuccu ggacccuuua 120 gccucucugc ccuuccacuc ucugacccc 149 <210> 53 <211> 212 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 cucgcuuccu gggucugcag guccagccgg cuggcacccu ccauguaccc aggggagauu 60 ccagccagac acccgccccc cggcccuggc uaagaaguug cuuccuguug ccagcaugac 120 cuacccucgc cucuuugaug ccauccgcug ccaccuccuu uugcuccugg acccuuuagc 180 cucucugccc uuccacucuc ugaccaccgc cc 212 <210> 54 <211> 144 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 uccagccaga cacccgcccc ccggcccugg cuaagaaguu gcuuccuguu gccagcauga 60 ccuacccucg ccucuuugau gccauccgcu gccaccuccu uuugcuccug gacccuuuag 120 cuucucugcc cuuccacucu cugg 144 <210> 55 <211> 207 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 cgcuuccugg gucugcaggu ccagccggcu ggcacccucc acguacccag gggagauucc 60 agccagacac ccgccccccg gcccuggcua agaaguugcu uccuguugcc agcaugaccu 120 acccucgccu cuuugaugcc auccgcugcc accuccuuuu gcuccuggac ccuuuagccu 180 cucugcccuu ccacucucug accaccg 207 <210> 56 <211> 158 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 cauguaccca ggggagauuc cagccagaca cccgcccccc ggcccuggcu aagaaguugc 60 uuccuguugc cagcaugacc uacccucgcc ucuuugaugc cauccgcugc caccuccuuu 120 ugcuccugga cccuuuagcc ucucugcccu uccacucg 158 <210> 57 <211> 197 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 cucgcuuccu gggucugcag guccagccgg cuggcacccu ccauguaccc aggggagauu 60 ccagccagac acccgccccc cggcccuggc uaagaaguug cuuccuguug ccagcaugac 120 cuacccucgc cucuuugaug ccauccgcug ccaccuccuu uugcuccugg acccuuuagc 180 cucucugccc ccccgau 197 <210> 58 <211> 236 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 58 cccagcuccc uaggcguccc aucucgcuuc cugggucugc agguccagcc ggcuggcacc 60 cuccauguac ccaggggaga uuccagccag acacccgccc cccggcccug gcuaagaagu 120 ugcuuccugu ugccagcaug accuacccuc gccucuuuga ugccauccgc ugccaccucc 180 uuuugcuccu ggacccuuua gccucucugc ccuuccacuc uuugaccccc aucuua 236 <210> 59 <211> 273 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 59 ggccaccggg caugggaagu augagaaggu gcuuguggaa gggggcccgg cucccuaggc 60 gucccaucuc gcuuccuggg ucugcagguc cagccggcug gcacccucca uguacccagg 120 gagauuccag ccagacaccc gccccccggc ccuggcuaag aaguugcuuc cuguugccag 180 caugaccuac ccucgccucu uugaugccau ccgcugccac cuccuuuugc uccuggaccc 240 uuuagccucu cugcccuucc acucucugac ccc 273 <210> 60 <211> 171 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 60 uguacccagg ggagauucca gccagacacc cgccccccgg cccuggcuaa gaaguugcuu 60 ccuguugcca gcaugaccua cccucgccuc uuugaugcca uccgcugcca ccuccuuuug 120 cuccuggacc cuuuagccuc ucugcccuuc cacucucuga ccaccacccc c 171 <210> 61 <211> 134 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 61 ccggcccugg cuaagaaguu gcuuccuguu gccagcauga ccuacccucg ccucuuugau 60 gccauccgcu gccaccuccu uuugcuccug gacccuuuag ccucucugcc cuuccacucu 120 cugaccacag cccc 134 <210> 62 <211> 140 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 62 ccccggcccu ggcuaagaag uugcuuccug uugccagcau gaccuacccu cgccucuuug 60 augccauccg cugccaccuc cuuuugcucc uggacccuuu agccucucug cccuuccacu 120 cucugaccac cgcccccgcc 140 <210> 63 <211> 188 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 63 ccggcuggca cccuccaugu acccagggga gauuccagcc agacacccgc cccccggccc 60 uggcuaagaa guugcuuccu guugccagca ugaccuaccc ucgccucuuu gaugccaucc 120 gcugccaccu ccuuuugcuc cuggacccuu uagccucucu gcccuuccac ucucugacca 180 ccgccccc 188 <210> 64 <211> 190 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 64 gccggcuggc acccuccaug uacccagggg agauuccagc cagacacccg ccccccggcc 60 cuggcuaaga aguugcuucc uguugccagc augaccuacc cuagccucuu ugaugccauc 120 cgcugccacc uccuuuuugc uccuggaccc uuuagccucu cugcccuucc acucucugac 180 caccgccccc 190 <210> 65 <211> 154 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 65 uccagccaga cacccgcccc ccggcccugg cuaagaaguu gcuuccuguu gccagcauga 60 ccuacccucg ccucuuugau gccauccgcu gccaccuccu uuugcuccug gacccuuuag 120 ccucucugcc cuuccacucu cugaccacca cccc 154 <210> 66 <211> 146 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 66 gccagacacc cgccccccgg cccuggcuaa gaaguugcuu ccuguugcca gcaugaccua 60 cccucgccuc uuugaugcca uccgcugcca ccuccuuuug cuccuggacc cuuuagccuc 120 ucugcccuuc cacucucuga cccccc 146 <210> 67 <211> 150 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 67 uccagccaga cacccgcccc ccggcccugg cuaagaaguu gcuuccuguu gccagcauga 60 ccuacccucg ccucuuugau gccauccgcu gccaccuccu uuugcuccug gacccuuuag 120 ccucucugcc cuuccacucu cugacccccc 150 <210> 68 <211> 233 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 68 cggcucccua ggcgucccau cucgcuuccu gggucugcag guccagccgg cuggcacccu 60 ccauguaccc aggggagauu ccagccagac acccgccccc cggcccuggc uaagaaguug 120 cuuccuguug ccagcaugac cuacccucgc cucuuugaug ccauccgcug ccaccuccuu 180 uugcuccugg acccuuuagc cucucugccc uuccacucuc ugaccacugc ccc 233 <210> 69 <211> 197 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 69 ugcaggucca gccggcuggc acccuccaug uacccagggg agauuccagc cagacaccca 60 ccccccggcc cuggcuaaga aguugcuccu guugccagca ugaccuaccc ucgccucuuu 120 gaugccaucc gcugccaccu ccuuuugcuc cuggacccuu uagccucucu gcccuuccac 180 ucucugacca cuacccc 197 <210> 70 <211> 155 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 70 uuccagccag acacccgccc cccggcccug gcuaagaagu ugcuuccugu ugccagcaug 60 accuacccuc gccucuuuga ugccauccgc ugccaccucc uuuugcuccu ggacccuuua 120 gccucucugc ccuuccacuc ucugaccacu gcccc 155 <210> 71 <211> 134 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 71 cccgcccccc ggcccuggcu aagaaguugc uuccuguugc cagcaugacc uacccucgcc 60 ucuuugaugc cauccgcugc caccuccuuu ugcuccugga cccuuuagcc ucucugcccu 120 uccacucucu gacc 134 <210> 72 <211> 147 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 72 cagccagaca cccgcccccc ggcccuggcu aagaaguugc uuccuguugc cagcaugacc 60 uacccucgcc ucuuugaugc cauccgcugc caccuccuuu ugcuccugga cccuuuagcc 120 ucucugcccu uccacucucu gaacacc 147 <210> 73 <211> 192 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 73 gagccuacuc ugaugaccgu ggccuuggcu ccuccaggaa ggcucaggag cccuaccucc 60 cugccauuau agcugcuccc cgccagaagc cugugccaac ucucugcauu cccugaucuc 120 cuguggcugu cacccuuggu caccuccgug cugucacugc caucuccccc cugaccccuc 180 gaacccaucc ua 192 <210> 74 <211> 191 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 74 gagccuacuc ugaugaccgu ggccuuggcu ccuccaggaa ggcucaggcg cccuaccucc 60 cugccauuau agcugcuccc cgccagaagc cugugccaac ucucugcauu cccugaucuc 120 caucccugug gcugucaccc uuggucaccu ccgugcuguc acugccaucu ccccccugac 180 cccucuaacc c 191 <210> 75 <211> 162 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 75 gccuacucug augaccgugg ccuuggcucc uccaggaagg cucaggagcc cuaccucccu 60 gccauuauag cugcuccccg ccagaagccu gugccaacuc ucugcauucc cugaucucca 120 ucccuguggc ugucacccuu gguccacugc caucuccccc cc 162 <210> 76 <211> 183 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 76 gagccuacuc ugaugaccgu ggccuuggcu ccuccaggaa ggcucaggag cccuaccucc 60 cugccauuau agcugcuccc cgccagaagc cugugccaac ucucugcauu cccugaucuc 120 caucccugug gcugucaccc uuggucaccu ccgugcuguu acugccaucu ccccccugac 180 ccc 183 <210> 77 <211> 240 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 77 gaagagccua cucugaugac cguggccuug gcuccuccag gaaggcucag gagcccuacc 60 ucccugccau uauagcugcu ccccgccaga agccugugcc aacucucugc auucccugau 120 cuccaucccu guggcuguca uccuugguca ccuccgugcu gucacugcca ucuccccccu 180 gaccccucua acccauccuc ugccucccuc ccugcaguca gaggguccug uucccaacca 240 <210> 78 <211> 166 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 78 uguggccuug gcuccuccag gaaggcuaag gagcccuacc ucccugccau uauagcugcu 60 ccccgccaga agccugugcc aacucucugc auucccugau cuccaucccu guggcuguca 120 cccuugguca ccuccgugcu gucacugcca ucuccccccu gacccc 166 <210> 79 <211> 155 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 79 gccuuggcuc cuccaggaag gcucaggagc ccuaccuccc ugccauuaua gcugcucccc 60 gccagaagcc ugugccaacu cucugcauuc ccugaucucc aucccugugg cugucacccu 120 uggucaccuc cgugcuguca cugccaucuc ccccc 155 <210> 80 <211> 310 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 80 agagccuacu cugaugaccg uggccuuggc uccuccagga aggcucagga gcccuaccuc 60 ccugccauua uagcugcucc ccgccagaag ccugugccaa cucucugcau ucccugaucu 120 ccaucccugu ggcugucacc cuuggucacc uccgugcugu cacugccauc uccccccuga 180 ccccucuaac ccauccucug ccucccuccc ugcagucaga ggguccuguu cccaucagcg 240 auuccccugc uuaaacccuu ccaugacucc ccacugcccu aagcugaggu cagucuccca 300 agccugacau 310 <210> 81 <211> 204 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 81 uauagcugcu ccccgccaga agccugugcc aacucucugc auucccugau cuccaucccu 60 guggcuguca cccuugguca ccuccgugcu gucacugcca ucuccccccu gaccccucua 120 acccauccuc ugccucccuc ccugcaguca gaggguccug uucccaucag cgauuccccu 180 gcuuaaaccc uuccaugaca gccc 204 <210> 82 <211> 169 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 82 ucugcauucc cugaucucca ucccuguggc ugucacccuu ggucaccucc gugcugucac 60 ugccaucucc ccccugaccc cucuaaccca uccucugccu cccucccugc agucagaggg 120 uccuguuccc aucagcgauu ccccugcuua agcccuucca ugacucccc 169 <210> 83 <211> 217 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 83 cucccugcca uuauagcugc uccccgccag aagccugugc caacucucug cauucccuga 60 ucuccauccc uguggcuguc acccuugguc accuccgugc ugucacugcc aucucccccc 120 ugaccccucu aacccauccu cugccucccu cccugcaguc agaggguccu guucccauca 180 gcgauucccc ugcuuaaacc cuuccaugac uccccaa 217 <210> 84 <211> 272 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 84 gccuacucug augaccgugg ccuugggucc uccaggaagg cucaggagcc cuaccucccu 60 gccauuauag cugcuccccg ccagaagucu gugccaacuc ucugcauucc cugaucucca 120 ucccuguggc ugucacccuu ggucaccucc gugcugucac ugccaucucc ccccugaccc 180 cucuaaccca uccucugccu cccucccugc agucagaggg uccuguuccc aucagcgauu 240 ccccugcuua aacccuucca ugacuccccu cu 272 <210> 85 <211> 131 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 85 cuaccucccu gccauuauag cugcuccccg ccagaagccu gugccaacuc ucugcauucc 60 cugaucucca ucccuguggc ugucacccuu ggucaccucc gugcugucac ugccaucucc 120 ccccugaccc c 131 <210> 86 <211> 136 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 86 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucuc 60 ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucc 136 <210> 87 <211> 203 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 87 ccggcccuuc ccccguuuug aacaugugua accgacaguc ugccugggcc acagcccucu 60 cacccuggua cugcaugcac gcaaugcuag cugccccuuu cccguccugg gcaccccgag 120 ucucccccga ccccgggucc cagguaugcu cccaccucca ccugccccac ucaccaccuc 180 ugcuaguucc agacaccccc gcg 203 <210> 88 <211> 197 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 88 ccuucccccg uuuugaacau guguaaccga cagucugccu gggccacagc ccucucaccc 60 ugguacugca ugcacgcaau gcuagcugcc ccuuucccgc ccugggcacc ccgagucucc 120 cccgaccccg ggucccaggu augcucccac cuccaccugc cccacucacc accucugcua 180 guuccagaca ccuccac 197 <210> 89 <211> 273 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 89 ucugccuggg ccacagcccu cucacccugg uacugcaugc acgcaaugcu agcugccccu 60 uucccguccu gggcaccccg agucuccccc gaccccgggu cccagguaug cucccaccuc 120 caccugcccc acucaccacc ucugcuaguu ccagacaccu ccacgcccac cugguccucu 180 cccaucgccc acaaaagggg gggcacgagg gacgagcuua gcugagcugg gaggagcagg 240 gugagggugg gcgacccagg auucccccac ccc 273 <210> 90 <211> 199 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 90 ugacaccuca gcugacagcg ugggcaacgc cugccgccug cucugaggcc cgauccagug 60 ggcaggccaa ggccugcugg gcccccgcgg acccaggugc ucugggucac ggucccuguc 120 cccgcacccc cgcuucuguc ugccccauug uggcuccuca ggcucucucc ccugcucucc 180 caccucuacc uccacccca 199 <210> 91 <211> 193 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 91 cucagcugac agcgugggca acgccugccg ccugcucuga ggcccgaucc agugggcagg 60 ccaaggccug cugggccccc gcggacccag gugcucuggg ucacgguccc uguccccgca 120 cccccgcuuc ugucugcccc auuguggcuc cucaggcucu cuccccugcu cucccaccuc 180 uaccuccacu ccc 193 <210> 92 <211> 158 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 92 ucugaggccc gauccagugg gcaggccaag gccugcuggg cccccgcgga cccaggugcu 60 cugggucacg gucccugucc ccgcaccccc gcuucugucu gccccauugu ggcuccucag 120 gcucucuccc cugcucuccc accucuaccu ccaccccc 158 <210> 93 <211> 153 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 93 ggcccgaucc agugggcagg ccaaggccug cugggccccc gcggacccag gugcucuggg 60 ucacgguccc uguccccgca cccccgcuuc ugucugcccc auuguggcuc cucaggcucu 120 cuccccugcu cucccaccuc uaccuccacc ccc 153 <210> 94 <211> 128 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 94 gccugcuggg cccccgcgga cccaggugcu cugggucacg gucccugucc ccgcaccccc 60 gcuucugucu gccccauugu ggcuccucag gcucucuccc cugcucuccc accucuaccu 120 ccgccccc 128 <210> 95 <211> 116 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 95 cgcggaccca ggugcucugg gucacggucc cuguccccgc acccccgcuu cugucugccc 60 cauuguggcu ccuuaggcuc ucuccccugc ucucccaccu uuaccuccac cccuac 116 <210> 96 <211> 190 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 96 cugacagcgu gggcaacgcc ugccgccugc ucugaggccc gauccagugg gcaggccaag 60 gccugcuggg cccccgcgga cccaggugcu cugggucacg gucccugucc ccgcaccccc 120 gcuucugucu gccccauugu ggcuccucag gcucucuccc cugcucuccc accucuaccu 180 ccacccccac 190 <210> 97 <211> 191 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 97 cugacagcgu gggcaacgcc ugccgccugc ucugaggccc gauccagugg gcaggccaag 60 gccugcuggg cccccgcgga cccaggugcu cugggucacg gucccugucc ccgcaccccc 120 gcuucugucu gccccauugu ggcuccucag gcucucuccc cugcucuccc accucuaccu 180 ccacccccaa c 191 <210> 98 <211> 191 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 98 cugacagcgu gggcaacgcc ugccgccugc ucugaggccc gauccagugg gcaggccaag 60 gccugcuggg cccccgcgga cccaggugcu cugggucacg gucccugucc ccgcaccccc 120 gcuucugucu gccccauugu ggcuccucag gcucucuccc cugcucuccc accucuaccu 180 ccacccccaa c 191 <210> 99 <211> 184 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 99 cgugggcaac gccugccgcc ugcucugagg cccgauccag ugggcaggcc aaggccugcu 60 gggcccccgc ggacccaggu gcucuggguc acggucccug uccccgcacc cccgcuucug 120 ucugccccau uguggcuccu caggcucucu ccccugcucu cccaccucua ccuccaccca 180 cacc 184 <210> 100 <211> 238 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 100 uccugaggga cugggacucc ccuuacagcc augaccuuga 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gcagcaaugc agcucaaaac 120 gcuuagccua gccacacccc cacgggaaac agcagugauu aaccuuuagc aauaaacgaa 180 aguuuaacua agcuauacua accccagggu uggucaauuu cgugccagcu acc 233 <210> 107 <211> 190 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 107 guuccaguga guucacccuc uaaaucacca cgaucaaaag ggacaagcau caagcacgca 60 gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc agugauuaac 120 cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg ucaauuucgu 180 gccagccacc 190 <210> 108 <211> 154 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 108 aaagggacaa gcaucaagca cgcagcaaug cagcucaaaa cgcuuagccu agccacaccc 60 ccacgggaaa cagcagugau uaaccuuuag caauaaacga aaguuuaacu aagcuauacu 120 aaccccaggg uuggucaauu ucgugccagc cacc 154 <210> 109 <211> 158 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 109 ucaaaaggga caagcaucaa gcacgcaaca augcagcuca aaaacgcuua gccuagccac 60 acccccacgg gaaacagcag ugauuaaccu uuagcaauaa acgaaaguuu aacuaagcua 120 cacuaacccc aggguugguc aauuucgugc cagccacc 158 <210> 110 <211> 210 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 110 uacacaugca 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gcuuugcagg augaaacacu uccccgcuug gcucucauuc uuccacaaga 60 gagaccuuuc uccggaccug guugcuacug guucagcaac ucugcagaaa auguccuccc 120 cuguggcugc cucagcucau gccuuuggcc ugaaguccca gcauugaugg cagccccuca 180 ucuuccaagu uuugugcucc ccuuuaccua acgcuuccug ccucccaugc aucuguacuc 240 cuucugugcc acu 253 <210> 123 <211> 253 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 123 uucugcccca gcuuugcagg augaaacacu uccccgcuug gcucucauuc uuccacaaga 60 gagaccuuuc uccggaccug guugcuacug guucagcaac ucugcagaaa auguccuccc 120 cuguggcugc cucagcucau gccuuuggcc ugaaguccca gcauugaugg cagccccuca 180 ucuuccaagu uuugugcucc ccuuuaccua acgcuuccug ccucccaugc aucuguacuc 240 cuucugugcc acu 253 <210> 124 <211> 250 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 124 ccccagcuuu gcaggaugaa acacuucccc gcuuggcucu cauucuucca caagagagac 60 cuuucuccgg accugguugc uacugguuca gcaacucugc agaaaauguc cuccccugug 120 gcugccucag cucaugccuu uggccugaag ucccagcauu gauggcagcc ccucaucuuc 180 caaguuuugu gcuccccuuu accuaacgcu uccugccucc caugcaucug uacuccuccu 240 gugccacaaa 250 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guacucca 228 <210> 128 <211> 280 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 128 gugaagauga ccacauucaa ggaagaaccu ucugccccag cuuugcagga ugaaacacuu 60 ccccgcuugg cucuccuucu uccacaagag agaccuuucu ccggaccugg uugcuacugg 120 uucagcagcu cugcagaaaa uguccucccu uguggcugcc ucagcucgua ccuuuggccu 180 gaagucccag cauuaauggc agccccucau cuuccaaguu uugugcuccc cuuuaccuaa 240 ugcuuccugc cucccaugca ucuguacucc ugcugugcca 280 <210> 129 <211> 207 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 129 uccacaagag agaccuuucu ccggaccugg cugcuacugg uucagcagcu cugcagaaaa 60 uguccucccu uguggcugcc ucagcucgua ccuuuggccu gaagucccag cauuaauggc 120 agccccucau cuuccaaguu uugugcuccc cuuuaccuaa ugcuuccugc cucccaugca 180 ucuguacucc ugcugugcca caaacac 207 <210> 130 <211> 207 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 130 uccacaagag agaccuuucu ccggaccugg cugcuacugg uucagcagcu cugcagaaaa 60 uguccucccu uguggcugcc ucagcucgua ccuuuggccu gaagucccag cauuaauggc 120 agccccucau cuuccaaguu uugugcuccc cuuuaccuaa ugcuuccugc cucccaugca 180 ucuguacucc ugcugugcca caaacac 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ggacccuuua 120 gccucucugc ccuuccacuc ucugaccccu uccagccaga cacccgcccc ccggcccugg 180 cuaagaaguu gcuuccuguu gccagcauga ccuacccucg ccucuuugau gccauccgcu 240 gccaccuccu uuugcuccug gacccuuuag ccucucugcc cuuccacucu cugacccc 298 <210> 154 <211> 304 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 154 uuccagccag acacccgccc cccggcccug gcuaagaagu ugcuuccugu ugccagcaug 60 accuacccuc gccucuuuga ugccauccgc ugccaccucc uuuugcuccu ggacccuuua 120 gccucucugc ccuuccacuc ucugaccccg ccuuggcucc uccaggaagg cucaggagcc 180 cuaccucccu gccauuauag cugcuccccg ccagaagccu gugccaacuc ucugcauucc 240 cugaucucca ucccuguggc ugucacccuu ggucaccucc gugcugucac ugccaucucc 300 cccc 304 <210> 155 <211> 285 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 155 uuccagccag acacccgccc cccggcccug gcuaagaagu ugcuuccugu ugccagcaug 60 accuacccuc gccucuuuga ugccauccgc ugccaccucc uuuugcuccu ggacccuuua 120 gccucucugc ccuuccacuc ucugaccccc ugguacugca 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uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug ggggauauua ugaagggccu 240 ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc auugcugcgu c 291 <210> 158 <211> 291 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 158 uuccagccag acacccgccc cccggcccug gcuaagaagu ugcuuccugu ugccagcaug 60 accuacccuc gccucuuuga ugccauccgc ugccaccucc uuuugcuccu ggacccuuua 120 gccucucugc ccuuccacuc ucugaccccc aagcacgcag caaugcagcu caaaacgcuu 180 agccuagcca cacccccacg ggaaacagca gugauuaacc uuuagcaaua aacgaaaguu 240 uaacuaagcu auacuaaccc caggguuggu caauuucgug ccagccacac c 291 <210> 159 <211> 382 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 159 uuccagccag acacccgccc cccggcccug gcuaagaagu ugcuuccugu ugccagcaug 60 accuacccuc gccucuuuga ugccauccgc ugccaccucc uuuugcuccu ggacccuuua 120 gccucucugc ccuuccacuc ucugaccccc uuugcaggau gaaacacuuc cccgcuuggc 180 ucucauucuu ccacaagaga gaccuuucuc cggaccuggu ugcuacuggu ucagcaacuc 240 ugcagaaaau guccuccccu guggcugccu cagcucaugc cuuuggccug aagucccagc 300 auugauggca gccccucauc uuccaaguuu ugugcucccc uuuaccuaac gcuuccugcc 360 ucccaugcau cuguacuccu cc 382 <210> 160 <211> 298 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 160 gccuuggcuc cuccaggaag gcucaggagc ccuaccuccc ugccauuaua gcugcucccc 60 gccagaagcc ugugccaacu cucugcauuc ccugaucucc aucccugugg cugucacccu 120 uggucaccuc cgugcuguca cugccaucuc cccccugccc guccucacca agacugacug 180 ccugcugcuu ugcuacugcc cgggcccaug agacugacuu cccacugcuc ugccugccuc 240 uccccacugc acuggcacag ccccgccuug ccgcugcuga uccauugccg gugugacc 298 <210> 161 <211> 304 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 161 gccuuggcuc cuccaggaag gcucaggagc ccuaccuccc ugccauuaua gcugcucccc 60 gccagaagcc ugugccaacu cucugcauuc ccugaucucc aucccugugg cugucacccu 120 uggucaccuc cgugcuguca cugccaucuc cccccuucca gccagacacc cgccccccgg 180 cccuggcuaa gaaguugcuu ccuguugcca gcaugaccua cccucgccuc uuugaugcca 240 uccgcugcca ccuccuuuug cuccuggacc cuuuagccuc ucugcccuuc cacucucuga 300 cccc 304 <210> 162 <211> 310 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 162 gccuuggcuc cuccaggaag gcucaggagc ccuaccuccc ugccauuaua gcugcucccc 60 gccagaagcc ugugccaacu cucugcauuc ccugaucucc aucccugugg cugucacccu 120 uggucaccuc cgugcuguca cugccaucuc cccccgccuu ggcuccucca ggaaggcuca 180 ggagcccuac cucccugcca uuauagcugc uccccgccag aagccugugc caacucucug 240 cauucccuga ucuccauccc uguggcuguc acccuugguc accuccgugc ugucacugcc 300 aucucccccc 310 <210> 163 <211> 291 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 163 gccuuggcuc cuccaggaag gcucaggagc ccuaccuccc ugccauuaua gcugcucccc 60 gccagaagcc ugugccaacu cucugcauuc ccugaucucc aucccugugg cugucacccu 120 uggucaccuc cgugcuguca cugccaucuc ccccccuggu acugcaugca cgcaaugcua 180 gcugccccuu ucccguccug gguaccccga gucucccccg accucggguc ccagguaugc 240 ucccaccucc 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aaaaacauuu auuuucauug cugcguc 297 <210> 166 <211> 297 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 166 gccuuggcuc cuccaggaag gcucaggagc ccuaccuccc ugccauuaua gcugcucccc 60 gccagaagcc ugugccaacu cucugcauuc ccugaucucc aucccugugg cugucacccu 120 uggucaccuc cgugcuguca cugccaucuc ccccccaagc acgcagcaau gcagcucaaa 180 acgcuuagcc uagccacacc cccacgggaa acagcaguga uuaaccuuua gcaauaaacg 240 aaaguuuaac uaagcuauac uaaccccagg guuggucaau uucgugccag ccacacc 297 <210> 167 <211> 388 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 167 gccuuggcuc cuccaggaag gcucaggagc ccuaccuccc ugccauuaua gcugcucccc 60 gccagaagcc ugugccaacu cucugcauuc ccugaucucc aucccugugg cugucacccu 120 uggucaccuc cgugcuguca cugccaucuc ccccccuuug caggaugaaa cacuuccccg 180 cuuggcucuc auucuuccac aagagagacc uuucuccgga ccugguugcu acugguucag 240 caacucugca gaaaaugucc uccccugugg cugccucagc ucaugccuuu ggccugaagu 300 cccagcauug auggcagccc cucaucuucc 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cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc 420 ucc 423 <210> 184 <211> 285 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 184 gagagcucgc uuucuugcug uccaauuucu auuaaagguu ccuuuguucc cuaaguccaa 60 cuacuaaacu gggggauauu augaagggcc uugagcaucu ggauucugcc uaauaaaaaa 120 cauuuauuuu cauugcugcg ucugcccguc cucaccaaga cugacugccu gcugcuuugc 180 uacugcccgg gcccaugaga cugacuuccc acugcucugc cugccucucc ccacugcacu 240 ggcacagccc cgccuugccg cugcugaucc auugccggug ugacc 285 <210> 185 <211> 291 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 185 gagagcucgc uuucuugcug uccaauuucu auuaaagguu ccuuuguucc cuaaguccaa 60 cuacuaaacu gggggauauu augaagggcc uugagcaucu ggauucugcc uaauaaaaaa 120 cauuuauuuu cauugcugcg ucuuccagcc agacacccgc cccccggccc uggcuaagaa 180 guugcuuccu guugccagca ugaccuaccc ucgccucuuu gaugccaucc gcugccaccu 240 ccuuuugcuc cuggacccuu uagccucucu gcccuuccac ucucugaccc c 291 <210> 186 <211> 297 <212> RNA <213> 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cuaaguccaa 60 cuacuaaacu gggggauauu augaagggcc uugagcaucu ggauucugcc uaauaaaaaa 120 cauuuauuuu cauugcugcg uccaagcacg cagcaaugca gcucaaaacg cuuagccuag 180 ccacaccccc acgggaaaca gcagugauua accuuuagca auaaacgaaa guuuaacuaa 240 gcuauacuaa ccccaggguu ggucaauuuc gugccagcca cacc 284 <210> 191 <211> 375 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 191 gagagcucgc uuucuugcug uccaauuucu auuaaagguu ccuuuguucc cuaaguccaa 60 cuacuaaacu gggggauauu augaagggcc uugagcaucu ggauucugcc uaauaaaaaa 120 cauuuauuuu cauugcugcg uccuuugcag gaugaaacac uuccccgcuu ggcucucauu 180 cuuccacaag agagaccuuu cuccggaccu gguugcuacu gguucagcaa cucugcagaa 240 aauguccucc ccuguggcug ccucagcuca ugccuuuggc cugaaguccc agcauugaug 300 gcagccccuc aucuuccaag uuuugugcuc cccuuuaccu aacgcuuccu gccucccaug 360 caucuguacu ccucc 375 <210> 192 <211> 285 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 192 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca ccugcccguc cucaccaaga cugacugccu gcugcuuugc 180 uacugcccgg gcccaugaga cugacuuccc acugcucugc cugccucucc ccacugcacu 240 ggcacagccc cgccuugccg cugcugaucc auugccggug ugacc 285 <210> 193 <211> 291 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 193 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca ccuuccagcc agacacccgc cccccggccc uggcuaagaa 180 guugcuuccu guugccagca ugaccuaccc ucgccucuuu gaugccaucc gcugccaccu 240 ccuuuugcuc cuggacccuu uagccucucu gcccuuccac ucucugaccc c 291 <210> 194 <211> 297 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 194 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca ccgccuuggc uccuccagga aggcucagga gcccuaccuc 180 ccugccauua uagcugcucc ccgccagaag ccugugccaa cucucugcau ucccugaucu 240 ccaucccugu ggcugucacc cuuggucacc uccgugcugu cacugccauc ucccccc 297 <210> 195 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 195 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca cccugguacu gcaugcacgc aaugcuagcu gccccuuucc 180 cguccugggu accccgaguc ucccccgacc ucggguccca gguaugcucc caccuccacc 240 ugccccacuc accaccucug cuaguuccag acaccucc 278 <210> 196 <211> 332 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 196 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca cccugacagc gugggcaacg ccugccgccu gcucugaggc 180 ccgauccagu gggcaggcca aggccugcug ggcccccgcg gacccaggug cucuggguca 240 cggucccugu ccccgcaccc ccgcuucugu cugccccauu guggcuccuc aggcucucuc 300 cccugcucuc ccaccucuac cuccaccccc ac 332 <210> 197 <211> 284 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 197 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca ccgagagcuc gcuuucuugc uguccaauuu cuauuaaagg 180 uuccuuuguu cccuaagucc aacuacuaaa cugggggaua uuaugaaggg ccuugagcau 240 cuggauucug ccuaauaaaa aacauuuauu uucauugcug cguc 284 <210> 198 <211> 284 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 198 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca cccaagcacg cagcaaugca gcucaaaacg cuuagccuag 180 ccacaccccc acgggaaaca gcagugauua accuuuagca auaaacgaaa guuuaacuaa 240 gcuauacuaa ccccaggguu ggucaauuuc gugccagcca cacc 284 <210> 199 <211> 375 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 199 caagcacgca gcaaugcagc ucaaaacgcu uagccuagcc acacccccac gggaaacagc 60 agugauuaac cuuuagcaau aaacgaaagu uuaacuaagc uauacuaacc ccaggguugg 120 ucaauuucgu gccagccaca cccuuugcag gaugaaacac uuccccgcuu ggcucucauu 180 cuuccacaag agagaccuuu cuccggaccu gguugcuacu gguucagcaa cucugcagaa 240 aauguccucc ccuguggcug ccucagcuca ugccuuuggc cugaaguccc agcauugaug 300 gcagccccuc aucuuccaag uuuugugcuc cccuuuaccu aacgcuuccu gccucccaug 360 caucuguacu ccucc 375 <210> 200 <211> 376 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 200 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc uccugcccgu 240 ccucaccaag acugacugcc ugcugcuuug cuacugcccg ggcccaugag acugacuucc 300 cacugcucug ccugccucuc cccacugcac uggcacagcc ccgccuugcc gcugcugauc 360 cauugccggu gugacc 376 <210> 201 <211> 382 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 201 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc uccuuccagc 240 cagacacccg ccccccggcc cuggcuaaga aguugcuucc uguugccagc augaccuacc 300 cucgccucuu ugaugccauc cgcugccacc uccuuuugcu ccuggacccu uuagccucuc 360 ugcccuucca cucucugacc cc 382 <210> 202 <211> 388 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 202 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc uccgccuugg 240 cuccuccagg aaggcucagg agcccuaccu cccugccauu auagcugcuc cccgccagaa 300 gccugugcca acucucugca uucccugauc uccaucccug uggcugucac ccuuggucac 360 cuccgugcug ucacugccau cucccccc 388 <210> 203 <211> 369 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 203 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc ucccugguac 240 ugcaugcacg caaugcuagc ugccccuuuc ccguccuggg uaccccgagu cucccccgac 300 cucggguccc agguaugcuc ccaccuccac cugccccacu caccaccucu gcuaguucca 360 gacaccucc 369 <210> 204 <211> 423 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 204 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc ucccugacag 240 cgugggcaac gccugccgcc ugcucugagg cccgauccag ugggcaggcc aaggccugcu 300 gggcccccgc ggacccaggu gcucuggguc acggucccug uccccgcacc cccgcuucug 360 ucugccccau uguggcuccu caggcucucu ccccugcucu cccaccucua ccuccacccc 420 cac 423 <210> 205 <211> 375 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 205 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc uccgagagcu 240 cgcuuucuug cuguccaauu ucuauuaaag guuccuuugu ucccuaaguc caacuacuaa 300 acugggggau auuaugaagg gccuugagca ucuggauucu gccuaauaaa aaacauuuau 360 uuucauugcu gcguc 375 <210> 206 <211> 375 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 206 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc ucccaagcac 240 gcagcaaugc agcucaaaac gcuuagccua gccacacccc cacgggaaac agcagugauu 300 aaccuuuagc aauaaacgaa aguuuaacua agcuauacua accccagggu uggucaauuu 360 cgugccagcc acacc 375 <210> 207 <211> 466 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 207 cuuugcagga ugaaacacuu ccccgcuugg cucucauucu uccacaagag agaccuuucu 60 ccggaccugg uugcuacugg uucagcaacu cugcagaaaa uguccucccc uguggcugcc 120 ucagcucaug ccuuuggccu gaagucccag cauugauggc agccccucau cuuccaaguu 180 uugugcuccc cuuuaccuaa cgcuuccugc cucccaugca ucuguacucc ucccuuugca 240 ggaugaaaca cuuccccgcu uggcucucau ucuuccacaa gagagaccuu ucuccggacc 300 ugguugcuac ugguucagca acucugcaga aaauguccuc cccuguggcu gccucagcuc 360 augccuuugg ccugaagucc cagcauugau ggcagccccu caucuuccaa guuuugugcu 420 ccccuuuacc uaacgcuucc ugccucccau gcaucuguac uccucc 466 <210> 208 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 208 cugguacugc auggacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucac 60 ccccgaccuc gggucccagg uaucguccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc auagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaauc gaauguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 209 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 209 cucguacugc auggacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucac 60 caccgaccuc gggucccagg uaucguccca ccuccacgug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc auagccacac 180 ccccacggga aacaguagug auuaaccuuu agcaauaauc gaaugucuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguugaucaa uuacgugcca gccacacc 278 <210> 210 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 210 cucguacugc auggacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uccuggguac cccgagucac 60 caccgaccuc gggucccagg uaucguccca ccuccacgug ccccacucac caccuuugcu 120 aguuccagac accucccaug cacgcagcaa ugcagaucaa aacgcuuagc auagccacac 180 ccccacggga aacaguagug auuaaccuuu agcaauaauc gaaugucuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguugaucaa uuacgugcca gccacacc 278 <210> 211 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 211 gucguacugc auggacgcaa ugcuagcagc accuuucccg uccuggguac cccgagucac 60 caccgaccuc gggucccagg uaucguccca ccuccacgug ccccacccac caccuuugcu 120 aguuccagag accucccaug cacgcagcaa ugcagaucaa aacgcuuagc auagccacac 180 cgccacggga aacaguagug aucaaccuuu agcuauaauc gaaugucuaa cuaagcuauu 240 cuaaccacag gguugaucaa uuacgugcca gccagacc 278 <210> 212 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 212 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccaaagggc uccuggguac cccgagucuc 60 ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 213 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 213 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg ugguccguac cccgagucuc 60 ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 214 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 214 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uggaccguac ggcgagucuc 60 ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 215 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 215 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuugccg uggaccguac gggcugucuc 60 ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 216 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 216 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuugggc uggaccguac gggcugucuc 60 ccccgaccuc gggucccagg uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 217 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 217 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg ugguccguac cccgagucuc 60 ccccgaccuc gggucggacc uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 218 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 218 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuucccg uggaccguac ggcgagucuc 60 ccccgaccuc gccucggucc uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggga aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 219 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 219 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuugccg uggaccguac gggcugucuc 60 ccccgaccag cccucggucc uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccacggca aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 220 <211> 278 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Combination of 3'-UTR sequence elements <400> 220 cugguacugc augcacgcaa ugcuagcugc cccuuugggc uggaccguac gggcugucuc 60 ccccgaccag cccucggucc uaugcuccca ccuccaccug ccccacucac caccucugcu 120 aguuccagac accucccaag cacgcagcaa ugcagcucaa aacgcuuagc cuagccacac 180 ccccagccca aacagcagug auuaaccuuu agcaauaaac gaaaguuuaa cuaagcuaua 240 cuaaccccag gguuggucaa uuucgugcca gccacacc 278 <210> 221 <211> 142 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-UTR sequence element <400> 221 gagagcucgc uuucuugcug uccaauuucu auuaaagguu ccuuuguucc cuaaguccaa 60 cuacuaaacu gggggauauu augaagggcc uugagcaucu ggauucugcc uaauaaaaaa 120 cauuuauuuu cauugcugcg uc 142

Claims (48)

  1. 5'→ 3'의 전사 방향으로 다음을 포함하는 핵산 분자:
    (a) 프로모터;
    (b) 전사가능한 핵산 서열 또는 전사가능한 핵산 서열을 도입하기 위한 핵산 서열; 및
    (c) 상기 프로모터 (a)의 조절 하에 전사될 경우, 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 3'-미번역 영역을 전사체 내에 코딩하는 핵산 서열:
    (c-1) FCGRT의 3'-미번역 영역의 핵산 서열 FCGRT, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-2) LSP1의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-3) CCL22의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-5) PLD3의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-7) HLA-DRB4의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    및
    (c-8) 상기 (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) 및 (c-7) 하의 2개 이상의 핵산 서열들, 단편 및/또는 변이체들의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 핵산 서열 (b) 및 (c)는 프로모터 (a)의 조절 하에 전사되어 공통 전사체(common transcript)가 될 수 있고, 상기 공통 전사체에서는 핵산 서열 (c)로부터 전사된 핵산 서열이 활성화되어, 전사가능한 핵산 서열 (b)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는 것인 핵산 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NOs: 86 내지 89, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로부터 선택된 핵산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NO: 86의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NOs: 105 내지 121로부터 선택된 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 SEQ ID NO: 115의, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산 서열 (c-8)은 (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) 및 (c-7)의 동일 또는 상이한 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 2종 이상의 조합을 포함하는 것인 핵산 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산 서열 (c-8)은 (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체 및, (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체의 조합을 포함하는 것인 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체는 (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체의 5'에 위치하는 것인 핵산 분자.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체, 및 (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체의 조합은 SEQ ID NO: 174의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 것인 핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 프로모터 (a)의 조절 하에 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (d)를 추가로 포함하는 것인 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리아데닐 서열은 적어도 20 A 뉴클레오타이드들, 좋기로는 적어도 40, 적어도 80, 적어도 100 또는 적어도 120 A 뉴클레오타이드들, 좋기로는 연속적인 A 뉴클레오타이드들을 포함하는 것인 핵산 분자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열은, 2 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열, 좋기로는 임의(arbitrary) 서열로서, 이 때 상기 2 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열의 첫번째 뉴클레오타이드와 마지막 뉴클레오타이드는 A 뉴클레오타이드 이외의 뉴클레오타이드인 것인 핵산 분자.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 핵산 서열 (d)는 프로모터 (a) 조절 하에 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하고, 상기 핵산 서열 (d) 대신 핵산 서열 (d)'을 포함하는 핵산 분자에 비해 대장균 내에서 상기 핵산 분자의 전파(propagation)시 더 높은 안정성을 나타내며, 상기 핵산 서열 (d)'은 프로모터 (a)의 조절 하에 전사될 경우, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열과 동일한 길이의 폴리아데닐 서열을 코딩하는 것인, 핵산 분자.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열은 적어도 80 뉴클레오타이드들, 좋기로는 적어도 90 또는 100 뉴클레오타이드들을 포함하는 것인 핵산 분자.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열은 상기 폴리아데닐 서열의 위치 21 내지 위치 80, 좋기로는 위치 21 내지 위치 60, 더욱 좋기로는 위치 31 내지 위치 50의 영역 내에 위치하는 것인 핵산 분자.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열 앞에는 상기 폴리아데닐 서열 내 적어도 20 A 잔기들이 선행하고 그 뒤에는 상기 폴리아데닐 서열 내 적어도 20 A 잔기들이 후행하는 것인 핵산 분자.
  18. 제11항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열의 길이는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 8, 좋기로는 적어도 10, 더욱 좋기로는 적어도 15 뉴클레오타이드들인 것인 핵산 분자.
  19. 제11항 내지 제18항 중 어느 하나의 항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열의 길이는 50 이하, 좋기로는 30 이하, 더욱 좋기로는 20 이하의 뉴클레오타이드들인 것인 핵산 분자.
  20. 제11항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 상기 서열은 연속 A 잔기들을 3개 이하, 좋기로는 2개 이하로 포함하며, 바람직하게는 포함하지 않는 것인 핵산 분자.
  21. 제11항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산 서열 (b), (c) 및 (d)는 프로모터 (a)의 조절 하에 전사되어 공통 전사체를 생성할 수 있는 것인 핵산 분자.
  22. 제21항에 있어서, 핵산 서열 (c) 및 임의로 (d)로부터 전사된 핵산 서열들은 전사가능한 핵산 서열 (b)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키도록 활성적인 것인 핵산 분자.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 상기 핵산 서열은 전사체 내 3' 말단에 위치하는 것인 핵산 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 폐쇄형 원형 분자 또는 선형 분자인 것인 핵산 분자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 하나의 항에 있어서, 전사가능한 핵산 서열은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며 전사가능한 핵산 서열을 도입하기 위한 핵산 서열은 복수개의 클로닝 사이트인 것인 핵산 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, (i) 리포터 유전자; (ii) 선별가능한 마커; 및 (iii) 복제 원점으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 멤버를 추가로 포함하는 것인 핵산 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 하나의 항에 있어서, 특히 선형화된 후, RNA, 특히 mRNA의 시험관내 전사에 적합한 것인 핵산 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 주형으로서 사용하여 전사, 좋기로는 시험관내(in vitro) 전사에 의해 수득가능한 RNA.
  29. 5'→ 3' 방향으로 다음을 포함하는 RNA:
    (a) 5'-미번역 영역;
    (b) 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산; 및
    (c) 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 3'-미번역 영역:
    (c-1) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 FCGRT, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-2) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 LSP1, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-3) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 CCL22, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-4) AES의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-5) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 PLD3, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (c-7) HLA-DRB4의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    및
    (c-8) (c-1), (c-2), (c-3), (c-4), (c-5), (c-6) 및 (c-7)에 기재된 2 이상의 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 조합.
  30. 제29항에 있어서, A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열 (d)를 추가로 포함하는 것인 RNA.
  31. 제30항에 있어서, 상기 핵산 서열 (d)는 상기 RNA의 3' 말단에 위치하는 것인 RNA.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 핵산 서열 (c) 및 임의로 (d)는 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적인 것인 RNA.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 추가로 (e) 5' Cap을 포함하는 것인 RNA.
  34. (i) 제1항 내지 제27항 중 어느 하나의 항에 기재된 핵산 분자를 제공하는 단계, 및
    (ii) 주형으로서 상기 핵산 분자를 이용하여 RNA를 전사하는 단계
    를 포함하는, RNA의 수득 방법.
  35. (i) 제34항의 방법에 따라 펩타이드 또는 단백질를 인코딩하는 RNA를 수득하는 단계, 및
    (ii) RNA를 번역하는 단계
    를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 수득 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 핵산 분자의 전사에 앞서, 핵산 분자의 절단을 더 포함하는 것인 방법.
  37. (i) 전사될 경우, 3'-미번역 영역을 코딩하는 핵산 서열 (b)를 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 전사가능한 핵산 서열 (a)의 3' 말단에 커플링하는 단계, 및
    (ii) 수득된 핵산을 전사하는 단계
    를 포함하는 RNA의 수득 방법에 관한 것으로서,
    여기서 상기 3'-미번역 영역은 다음으로부터 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열, 즉:
    (b-1) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 FCGRT, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (b-2) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 LSP1, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (b-3) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 CCL22, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (b-4) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 AES, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (b-5) 3'-미번역 영역의 핵산 서열 PLD3, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (b-6) MT-RNR1의 비-코딩 RNA의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    (b-7) HLA-DRB4의 3'-미번역 영역의 핵산 서열, 그의 단편 또는 상기 핵산 서열 또는 단편의 변이체,
    및
    (b-8) (b-1), (b-2), (b-3), (b-4), (b-5), (b-6) 및 (b-7)에 기재된 2 이상의 핵산 서열들, 단편들 및/또는 변이체들의 조합
    을 포함하는 것인, RNA의 수득 방법.
  38. 제37항에 있어서, 핵산 서열 (a) 및 (b)는 전사되어 공통 전사체를 형성할 수 있고, 여기서 핵산 서열 (b)로부터 전사된 핵산 서열은 전사가능한 핵산 서열 (a)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적인 것인 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 방법은 전사될 경우 A 뉴클레오타이드들 이외의 뉴클레오타이드들을 함유하는 1 이상의 연속 뉴클레오타이드들의 서열을 폴리아데닐 서열 내에 임의로 포함하는 폴리아데닐 서열인 핵산 서열을 코딩하는 핵산 서열 (c)를, 핵산 서열 (b)의 3' 말단에 커플링하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 핵산 서열 (a), (b), 및 (c)가 전사되어, 공통 전사체를 생성하되, 여기서 상기 핵산 서열 (b) 및 임의로, (c)로부터 전사된 핵산 서열은 전사가능한 핵산 서열 (a)로부터 전사된 핵산 서열의 번역 효율 및/또는 안정성을 증가시키는데 활성적인 것인 방법.
  41. (i) 제37항 내지 제40항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 RNA를 수득하는 단계, 및
    (ii) RNA를 번역하는 단계
    를 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 수득 방법.
  42. 제34항 내지 제41항 중 어느 하나의 항에 있어서, 전사는 시험관내에서 수행되는 것인 방법.
  43. 제34항, 제36항 내지 제40항 및 제42항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법에 의해 수득가능한 RNA.
  44. 제28항 내지 제33항 및 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 RNA를 번역하는 것을 포함하는, 펩타이드 또는 단백질의 수득 방법.
  45. 숙주 세포를 형질감염(transfecting)시키기 위한, 제28항 내지 제33항 및 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 RNA의 용도.
  46. 제45항에 있어서, 숙주 세포는 항원-제시 세포, 특히 수지상 세포, 단핵구 또는 대식세포인 것인 용도.
  47. 제28항 내지 제33항 및 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 RNA의 백신점종을 위한 용도.
  48. 제28항 내지 제33항 및 제43항 중 어느 하나의 항에 기재된 RNA의, 체세포를 줄기세포 특징을 갖는 세포로 재프로그래밍시키는데 있어서의 용도.
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