TW202227478A - 對細胞靶向遞送的藥劑及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於對細胞靶向遞送酬載(payload)之藥劑及方法。該等藥劑和方法可有效用於遞送治療性或診斷性藥劑至目標細胞。在一具體實例中，本發明係涉及投予編碼一胜肽或多肽(標簽化合物)之RNA，而該胜肽或多肽係包括一與目標細胞結合的結合基團(主要靶向基團)及另一與包括酬載(效應子探針)之藥物結合的結合基團。在表現RNA後，主要靶向基團可與目標抗原，例如癌細胞上的癌抗原結合，及然後包括在效應子探針內的第二靶向基團可以第二目標為目標，藉此精確地遞送「酬載」至目標細胞，例如癌細胞。

Description

對細胞靶向遞送的藥劑及方法
本發明係關於對細胞靶向遞送酬載(payload)之藥劑及方法。該等藥劑和方法可有效用於遞送治療性或診斷性藥劑至目標細胞。在一具體實例中，本發明係涉及投予編碼一胜肽或多肽(標簽化合物)之RNA，而該胜肽或多肽係包括一與目標細胞結合的結合基團(主要靶向基團(primary targeting moiety))及另一與包括酬載(效應子探針)之藥劑結合的結合基團。在表現RNA後，主要靶向基團係與目標抗原，例如癌細胞上的癌抗原結合，及然後包括在效應子探針內的第二靶向基團可以第二目標為靶向，藉此精確地遞送「酬載」至目標細胞，例如癌細胞。
在許多醫學治療和診斷領域中，係希望選擇性遞送藥劑，例如治療劑(藥物)或診斷劑(例如造影劑)至一對象，例如一病患體內的特定位置，或局限區域。
器官或組織之主動靶向可藉由直接或間接的將所欲活性基團(例如，細胞毒性化合物)與一在感興趣目標位置與細胞表面結合之靶向結構接合，來進行。用於靶定此等藥劑的靶向基團典型地為對細胞表面目標，例如膜蛋白具有親和力之構築體，且係包括抗體或抗體片段。
本發明係關於一種方法，其中係使用RNA所編碼的標簽化合物(docketing compound)來標定目標細胞，例如藉由與主要目標(例如，細胞表面抗原)結合。該標簽化合物係包括一實際上被另一化合物靶定的第二目標，亦即配置有靶向該第二目標基團的效應子探針。效應子探針係包括一效應子基團，例如治療性及/或診斷性化合物，或用於治療及/診斷化合物之標靶基團，例如效應子細胞。因此，根據本發明，係投予編碼一標簽化合物的RNA。在RNA表現後，此標簽化合物可能，例如藉由與主要目標結合而與目標細胞結合。加入效應子探針，其係經由其第二靶向基團與標簽化合物上的第二目標結合。常見的第二目標/第二靶向基團對之實例為抗體/抗原系統。文中所描述的觀點容許使用針對廣泛範圍目標細胞的單一效應子化合物，亦即藉由使用單一效應子化合物與靶向不同主要目標和包括一相同第二目標之不同標簽化合物組合。文中所述的觀點為更有的利的，因為使用單一標籤化合物之主要靶定可與靶定相同第二目標和包括不同效應子基團的不同效應子探針組合來進行。因此，文中所述的觀點容許依序將不同效應子基團靶向被標簽化合物標定的目標細胞。
在一方面，本發明係關於對目標細胞靶向遞送酬載之方法，其係包括： (i)     以編碼包括一第一結合基團的胜肽或多肽之RNA轉染一或多個細胞； (ii)   讓該一或多個細胞表現該胜肽或多肽，使得其與目標細胞相連結並將第一結合基團展示在目標細胞的表面；及 (iii) 加入包括或連接第二結合基團的酬載； 其中該第一結合基團和第二節基團係彼此相互結合。
在一具體實例中，係藉由將一或多個細胞與包括RNA的粒子接觸，將該RNA轉染該一或多個細胞。
在一具體實例中，該等粒子係包括以該一或多個細胞為目標的靶向分子。
在一具體實例中，該一或多個細胞係包括或由目標細胞所組成。
在一具體實例中，該一或多個細胞係表現包括第一結合基團之胜肽或多肽，使得其仍與該一或多個細胞結合。
在一具體實例中，該一或多個細胞與目標細胞不同。
在一具體實例中，該一或多個細胞係表現包括一第一結合基團之胜肽或多肽，使其被該一或多個細胞所分泌。
在一具體實例中，該一或多個細胞係表現包括一第一結合基團之胜肽或多肽，使其釋放於血液中。
在一具體實例中，該包括一第一結合基團之胜肽或多肽係包括與目標細胞上的目標結合之第三結合基團。
在一具體實例中，該目標為一細胞表面抗原。
在一具體實例中，該第一結合基團和該第三結合基團係相互連接。在一具體實例中，該第一結合基團和第三結合基團係共價相互連接。
在一具體實例中，該第一結合基團為一抗體或抗體衍生物。在一具體實例中，該第二結合基團為一胜肽標籤。
在一具體實例中，該第一結合基團為一胜肽標籤。在一具體實例中，該第二結合基團為一抗體或抗體衍生物。
在一具體實例中，該第三結合基團為一抗體或抗體衍生物。
在一具體實例中，該抗體衍生物為一抗體片段。
在一具體實例中，該胜肽或多肽為一雙專一性抗體。在一具體實例中，該雙專一性抗體為雙專一性單鏈抗體。
在一具體實例中，該第二結合基團和酬載係共價或非共價相互連接。在一具體實例中，該酬載係包括一醫藥活性劑。在一具體實例中，該酬載係包括一診斷化合物。在一具體實例中，該酬載係包括一治療化合物。在一具體實例中，該酬載係包括一載體。在一具體實例中，該載體為顆粒載體。在一具體實例中，該顆粒載體係包括脂質基底的粒子、聚合物基底的粒子或其混合物。在一具體實例中，該載體係併入一診斷化合物。在一具體實例中，該載體係併入一治療化合物。在一具體實例中，該酬載係包括一第四結合基團。在一具體實例中，該第四結合基團係與細胞表面抗原結合。在一具體實例中，與該第四結合基團結合的該細胞表面抗原係存在免疫細胞上。
在一具體實例中，該目標細胞係存在於一對象中。
在一具體實例中，文中所述的方法係於活體內進行。
在一具體實例中，文中所述的方法係包括投予一對象： (i)     編碼一包括第一結合基團之胜肽或多肽的RNA，或包括該RNA的粒子；及 (ii)   包括或連接一第二結合基團的酬載或編碼該酬載的RNA。
在一具體實例中，文中所述的方法係用於診斷及/或治療一疾病，其中該目標細胞係表現或可能表現與該疾病有關的抗原。
在一具體實例中，該目標細胞為罹病細胞。
在一具體實例中，該標靶為腫瘤抗原。在一具體實例中，該目標細胞為腫瘤或癌細胞。
在一具體實例中，該目標細胞為免疫效應子細胞。在一具體實例中，該目標細胞為T細胞。在一具體實例中，該目標為一該免疫效應子細胞之特徵性抗原。
在一具體實例中，文中所述的方法係用於將編碼一抗原受體之核酸遞送至該免疫效應子細胞。
在一方面，本發明係關於在一對象中對目標細胞靶向遞送一酬載之方法，其係包括投予該對象： (i)     編碼一包括第一結合基團之胜肽或多肽的RNA；及 (ii)   包括或連接一第二結合基團或其編碼RNA的酬載； 其中該第一結合基團和該第二結合基團係彼此相互連接且其中該包括第一結合基團的胜肽或多肽進一步係包括與目標細胞上的目標結合之第三結合基團。
在一具體實例中，該RNA，當投予時，係存在於粒子中。
在一具體實例中，在RNA投予後，包括第一結合基團和第三結合基團的該胜肽或多肽係被該對象的一或多個細胞所表現。在一具體實例中，該一或多個細胞係分泌該包括第一結合基團和第三結合基團的胜肽或多肽。在一具體實例中，該一或多個細胞係表現該包括第一結合基團和第三結合基團的胜肽或多肽，使得其釋放於血液中。
在一方面，本發明係關於對一目標細胞靶向遞送酬載之套組，係包括： (i)     編碼一包括第一結合基團之胜肽或多肽的RNA；及 (ii)   包括或連接一第二結合基團的酬載或編碼該酬載的RNA； 其中該第一結合基團和該第二結合基團係彼此相互結合。
在一具體實例中，該包括第一結合基團的胜肽或多肽係包括與目標細胞上的目標結合之第三結合基團。
在一具體實例中，該目標為一細胞表面抗原。
在一具體實例中，該第一結合基團和該第三結合基團係彼此相互連接。在一具體實例中，該第一結合基團和該第三結合基團係共價彼此相互連接。
在一具體實例中，該第一結合基團為一抗體或抗體衍生物。在一具體實例中，該第二結合基團為一胜肽標籤。
在一具體實例中，該第一結合基團為一胜肽標籤。在一具體實例中，該第二結合基團為一抗體或抗體衍生物。
在一具體實例中，該第三結合基團為一抗體或抗體衍生物。
在一具體實例中，該抗體衍生物為 一抗體片段。
在一具體實例中，該胜肽或多肽為雙專一性抗體。在一具體實例中，該雙專一性抗體為雙專一性單鏈抗體。
在一具體實例中，該第二結合基團和該酬載係共價或非共價相互連接。在一具體實例中，該酬載係包括一醫藥活性劑。在一具體實例中，該酬載係包括一診斷化合物。在一具體實例中，該酬載係包括一治療化合物。在一具體實例中，該酬載係包括一載體。 在一具體實例中，該載體為一顆粒載體。在一具體實例中，該顆粒載體係包括脂質基底的粒子、聚合物基底的粒子或其混合物。在一具體實例中，該載體係併入一診斷化合物。在一具體實例中，該載體係併入一治療化合物。在一具體實例中，該酬載係包括一第四結合基團。在一具體實例中，該第四結合基團係與細胞表面抗原結合。在一具體實例中，與該第四結合基團結合的細胞表面抗原係存在免疫細胞上。
在一具體實例中，該RNA係存在粒子中。
在一方面，本發明係關於用於文中所述方法中之文中所述的藥劑或組成物。
序列之說明
下表係提供文中作為參照的特定序列之列表。
序列說明
SEQ ID NO: 說明 SEQUENCE
5’-UTR (hAg-Kozak)
1 5’-UTR AACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACC
3’-UTR (2hBg)
2 3’-UTR CUCGAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCGAGAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAUUUAUUUUCAUUGCUGCGUCGAGACCUGGUCCAGAGUCGCUAGC
3’-UTR (FI 元件 )
3 3’-UTR CUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACC
A30L70
4 A30L70 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
ALFA和CLDN6雙專一性結構之序列 分泌訊號 aCLDN6(IMAB027)VH-CH1- GS 連接子 - aALFA-VHH- gs- His- 標籤 : MDWTWRVFCLLAVAPGAHS EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC ggggsgggs EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggs HHHHHH** 分泌訊號 aALFA-VHH -GS 連接子 - aCLDN6(IMAB027)VH-CH1- gs - His- 標籤 : MDWTWRVFCLLAVAPGAHS EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggggsgggs EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC ggs HHHHHH** 分泌訊號 aCLDN6(IMAB027)-VH-CH1-CH2-CH3- GS 連接子 - aALFA-VHH - gs- His- 標籤 : MDWTWRVFCLLAVAPGAHS EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ggggsgggs EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggs HHHHHH** 分泌訊號 aALFA-VHH -GS 連接子 - aCLDN6(IMAB027)-VH-CH1-CH2-CH3 -gs- His- 標籤 : MDWTWRVFCLLAVAPGAHS EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggggsgggs EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ggs HHHHHH** 前導訊號 -VL- CL(IMAB027)MHFQVQIFSFLLISASVIMSRG QIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYLHWFQQKPGTSPKLWVYSTSNLPSGVPARFGGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSIYPPWTFGGGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC*ALFA和CD3雙專一性結構之序列 分泌訊號- aALFA-VHH - GS 連接子 - aCD3-VHH (F04)- gs- His- 標籤 : MDWTWRVFCLLAVAPGAHS EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggggsgggs EVQLVESGGGPVQAGGSLRLSCAASGRTYRGYSMAWFRQSPGKEREFVAAIVWSDGNTYYEDFVKGRFTISRDSAKNTLYLQMTNLKPEDTALYYCAAKIRPYIFKIAGQYDYWGQGTQVTVSS ggs HHHHHH** 分泌訊號- aCD3-VHH (F04) -GS 連接子 - aALFA-VHH - gs- His- 標籤 : MDWTWRVFCLLAVAPGAHS EVQLVESGGGPVQAGGSLRLSCAASGRTYRGYSMAWFRQSPGKEREFVAAIVWSDGNTYYEDFVKGRFTISRDSAKNTLYLQMTNLKPEDTALYYCAAKIRPYIFKIAGQYDYWGQGTQVTVSS ggggsgggs EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggs HHHHHH** 分泌訊號- aALFA-VHH - GS 連接子 - VL(TR66)-GS 連接子 - VH(TR66)- gs- His- 標籤 : MDWTWRVFCLLAVAPGAHS EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggggsgggs QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKggggsggggsggggsggggsggggs QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSS ggs HHHHHH** 分泌訊號- VL(TR66) -GS 連接子 - VH(TR66)- GS 連接子 - aALFA-VHH - gs- His- 標籤 : MHFQVQIFSFLLISASVIMSRG QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK ggggsggggsggggsggggsggggs QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSS ggggsgggs EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAMGWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS ggs HHHHHH**
雖然本文係詳描述於下，但請了解，本文不限於文中所述的特定方法、方案和試劑，因為這些可做變化。亦請了解，文中所用的方法僅作為描述特定具體實例之目的，且不希望限制本文之範圍，其範圍僅受限於隨附的申請專利範圍。除非另有定義，否則文中所用的所有技術和科學術語係具有熟習本項技術之一般技術者正常理解的相同意義。
較佳地，文中所用的術語係如"A multilingual glossary of biotechnological terms：(IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)中所描述之定義。
除非另有指出，否則本文之施行係應用習知的化學、生化、細胞生物學、免疫學和重組DNA技術法，其係說明於本領域的參考文獻中(參照，例如，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989)。
在下文中將描述本文之元件。這些元件係以特定的具體實例列出，然而，應了解，其可以任何方式及以任何數目組合而創造出另外的具體實例。以不同方式描述的實例和具體實例不應理解為本文僅限於明確描述的具體實例。本說明書應了解係揭示和涵蓋組合明確描述的具體實例與任何數目的所揭示元件之具體實例。再者，除非內文中另有指出，否則所有所述元件之任何排列和組合應視為由本說明書所揭示。
術語「大約」係指大致或接近，且在一具體實例文中所描述的數值或範圍之情況下較佳地係指該所述或聲稱的數值或範圍的± 20%、± 10%、± 5%或± 3%。
除非文中另有指出或明確與內容相矛盾，否則用於描述本發明內容(特別是在申請專利範圍的內容)之術語「一（a、an）」和「此」及類似的參照應理解為涵蓋單數和複數二者。文中描述的數值範圍僅希望作為個別指出落在該範圍內的各個別數值的速記方法。除非文中另有指出，否則各個別數值係併入本說明書中如同其個別描述於文中。除非文中另有指出或另外明確與內容相矛盾，否則所有文中所述的方法可以任何適合的順序進行。文中所提供的任何和所有實例或示例語言(例如，「如」)之用法僅希望更佳闡明本發明且並非加諸限制於其他聲稱的本發明範圍。在本說明書中不應有任何語言被理解為係指施行本文所必須之任何非申請專利範圍的元件。
除非明白的指出，否則術語「包括」係用於本文之內容中指出，除了由「包括」所導入列出的成員之外，另外的成員可視需要存在。然而請考量作為本文之特定具體實例，術語「包括」係涵蓋無另外成員存在的可能性，亦即就此具體實例之目的，「包括」應理解為具有「由...組成」或「基本上由...組成之意義。
整個本說明書之內文引用了數個文獻。文中所引述的各文獻(包括所有的專利、專利申請案、科學刊物、製造商規範、說明書等)，無論上文或下文，係以全文引用的方式併入。不應理解為文中承認本發明無權早於此揭示文。 定義
在下文中，將提供適用於本文所有方面的定義。除非另有指出，否則下列術語係具有下列意義。任何未定義的術語係具有其技術所認可的意義。
術語例如「下降」、「減少」、「抑制」或「妨害」如文中所用係關於在程度上整體下降或造成整體下降低之能力，較佳地至少5%，至少10%，至少20%，至少50%，至少75%減少或甚至更高。這些術語包括完全或基本上完全抑制，亦即降至零或基本上達到零。
術語例如「增加」、「增強」或「超過」較佳地係關於增加或增強至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少80%，至少100%，至少200%，至少500%，或甚至更高。
根據本文，術語「胜肽」係包括寡肽和多肽且係指包括約2個或更多個，約3個或更多個，約4個或更多個，約6個或更多個，約8個或更多個，大約10個或更多個，約13個或更多個，約16個或更多約20個或更多個，及至高達大約50個，約100個或大約150個連續胺基酸，經由胜肽鍵相互連接的物質。術語「蛋白」或「多肽」係指大的胜肽，特言之，具有至少約150個胺基酸之胜肽，但術語「胜肽」、「蛋白」和「多肽」在文中通常係以同義來使用。
「片段」，就胺基酸序列(胜肽或蛋白)而言，係關於胺基酸序列的一部份，亦即代表在N端及/或C端短縮的胺基酸序列之序列。C端短縮的片段(N端片段)可，例如藉由缺少開放閱讀框之3’端的截斷開放閱讀框轉譯來獲得。N端短縮的片段(C端片段)可，例如藉由缺少開放閱讀框之5’端的截斷開放閱讀框轉譯來獲得，只要該截斷的開放閱讀框包括作為起始轉譯的開始密碼子。胺基酸序列的片段係包括，例如來自胺基酸序列至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80%，至少90%的胺基酸殘基。胺基酸序列的片段較佳地係包括至少6個，特言之至少8個，至少12個，至少15個，至少20個，至少30個，至少50個，或至少100個來自胺基酸序列的連續胺基酸殘基。
「變體」在文中係指一胺基酸序列憑藉至少一個胺基酸修飾而與親代胺基酸序列不同。親代胺基酸序列可為天然生成的或野生型(WT)胺基酸序列，或可為野生型胺基酸序列之經修飾版本。較佳的，相較於親代胺基酸序列，變體胺基酸序列具有至少一個胺基酸修飾，例如相較於親代，1至約20個胺基酸修飾，及較佳地1至約10個或1至約5個胺基酸修飾。
「野生型」或「WT」或「天然」在文中係指在自然界中發現的胺基酸序列，包括等位基因變異。野生型胺基酸序列、胜肽或蛋白係具有並非故意修飾的胺基酸序列。
就本文之目的，胺基酸序列 (胜肽、蛋白或多肽)的「變體」係包括胺基酸插入變體、胺基酸加成變體、胺基酸刪除變體及/或胺基酸取代變體。術語「變體」係包括所有的突變體、剪接變體和物種同源物，尤其是該等天然生成者。術語「變體」係包括，尤其是，胺基酸序列的片段。
胺基酸插入變體係包括於特定的胺基酸序列中插入單一或二個或更多個胺基酸。在具有插入的胺基酸序列變體之情況下，係將一或多個胺基酸殘基插入胺基酸序列的特定位置，雖然在適當篩選所產生的產物中隨機插入亦為可能的。胺基酸加成變體係包括一或多個胺基酸之胺基-及/或羧基-端融合，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多個胺基酸。胺基酸刪除變體其特徵為從序列移除一或多個胺基酸，例如移除1、2、3、5、10、20、30、50或更多個胺基酸。刪除可在蛋白的任何位置。在蛋白的N端及/或C端包括刪除的胺基酸刪除變體亦稱為N端及/或C端截短變體。胺基酸取代變體其特徵為至少一個序列中的殘基係經移除並在其位置插入另外的殘基。較佳的係給予該等修飾其在胺基酸序列中的位置在同源蛋白或胜肽間並非保守性及/或以其他具有類似性質的胺基酸取代。較佳地，胜肽和蛋白變體中胺基酸改變為保守性胺基酸改變，亦即類似的帶電或未帶電胺基酸之取代。保守性胺基酸改變係涉及在其側鏈上相關之胺基酸家族的取代。天然生成的胺基酸一般係分成四個家族：酸性(天門冬胺酸、麩胺酸)，鹼性(離胺酸、精胺酸、組胺酸)，非極性(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)及未帶電極性(甘胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸)胺基酸。本丙胺酸、色胺酸和酪胺酸有時一起被歸類為芳香系胺基酸。在一具體實例中，保守性胺基酸取代係包括下列基團內的取代： 甘胺酸，丙胺酸； 纈胺酸，異白胺酸，白胺酸； 天門冬安胺酸，麩胺酸； 天門冬醯胺酸，麩醯胺酸； 絲胺酸，蘇胺酸； 離胺酸，精胺酸；及 苯丙胺酸，酪胺酸。
較佳地類似性程度，較佳地一特定胺基酸序列和該特定胺基酸序列之變體的胺基酸序列之間的同一性應為至少約60%、70%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%。就一胺基酸區之相似性和同一性程度較佳地為參照胺基酸序列全長的至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約40%，至少約50%，至少約60%，至少約70%，至少約80%，至少約90%或約100%。例如，若該參照胺基酸序列係由200個胺基酸所組成，則較佳地類似性或同一性程度較佳地為至少約20個，至少約40個，至少約60個，至少約80個，至少約100個，至少約120個，至少約140個，至少約160個，至少約180個，或約200個胺基酸，在某些具體實例中連續胺基酸。在某些具體實例中，類似性或同一性程度為全長的參照胺基酸序列。測定序列類似性，較佳地序列同一性之比對可以技術中已知的工具來進行，較佳地使用最佳序列比對，例如使用標準設定，較佳地EMBOSS::needle，Matrix：Blosum62，Gap Open 10.0，Gap Extend 0.5。
「序列類似性」係指相同或代表保守性胺基酸取代的胺基酸百分比。二條胺基酸序列間的「序列同一性」係指序列間相同的胺基酸百分比。二條核酸序列間的「序列同一性」係指序列間相同的核苷酸百分比。
術語「%同一的」（% identical）、「%同一性」（% identity）或類似術語希望係指，尤其是，在欲比較的二序列間最佳比對中相同的核苷酸或胺基酸百分比。該百分比為純統計的，且二序列間的差異可能但非必要隨機分配於全長的所比較序列。二序列的比較通常係藉由在最佳比對後，就有關片段或「比較窗」將該序列做比較來進行，以便於鑑別對應序列的局部區域。就比較的最佳比對可以手動進行或在Smith和Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482之局部同源性比對的幫助下，在Needleman和Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443之局部同源性比對的幫助下以及在Pearson和Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444之類似性搜尋比對之幫助下，或使用該比對的電腦程式幫助下(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)進行。在某些具體實例中，二條序列的同一性百分比係使用國家生物技術資訊中心(NCBI)網站上可取得的BLASTN或BLASTP演算法來測定(例如於blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch &BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq)。在某些具體實例中，用於NCBI網站上的BLASTN演算法之演算參數係包括：(i)期望閥值設定為10；(ii) 字組大小設定為28；(iii)查詢範圍內的最大匹配設定為0；(iv)匹配/錯配得分設定為1，-2；(v)缺位成本設定為直線；及(vi)使用低複雜度區域之過濾。在某些具體實例中，用於NCBI網站上的BLASTN演算法之演算參數係包括：(i)期望閥值設定為10；(ii) 字組大小設定為3；(iii) 查詢範圍內的最大匹配設定為0；(iv)矩陣設定為BLOSUM62；(v)缺位成本設定為存在：11延伸：1；及(vi)條件組成得分矩陣調整。
藉由測定其中與欲比較序列相符之相同位置的數目，將此數目除以所比較的位置數目(例如，參照序列中的位置數目)並將此結果乘以100，得到同一性百分比。
在某些具體實例中，類似性或同一性的程度為參照序列全長之至少約50%，至少約60%，至少約70%，至少約80%，至少約90%或約100%的區域。例如，若參照核酸係由200個核苷酸所組成，則同一性程度為至少約100個，至少約120個，至少約140個，至少約160個，至少約180個或約200個胺基酸來表示，在某些具體實例中為連續核苷酸。在某些具體實例中，類似性或同一性的程度為全長的參照序列。
根據本文同源胺基酸序列係具有至少40%，特言之至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90% 及較佳地至少95%，至少98或至少99%的胺基酸殘基同一性。
熟習技術者可容易地，例如，藉由重組DNA操縱來製備文中所描述的胺基酸序列變體。製備具有取代、添加、插入或刪除的胜肽或蛋白之DNA序列操縱係詳細描述於，例如Sambrook et al. (1989)。再者，文中所描述的胜肽和胺基酸變體可在已知胜肽合成技術，例如藉由固相合成和類似方法之幫助下容易地製備。
在一具體實例中，胺基酸序列(胜肽或蛋白)之片段或變體較佳地為「功能性片段」或「功能性變體」。術語胺基酸序列之「功能性片段」或「功能性變體」係關於任何一或更多種與從其衍生的胺基酸序列具有相同或類似的功能性質之片段或變體，亦即其為功能上的同等物。就結合劑例如抗體之序列而言，一特別的功能為從該胺基酸序列衍生片段或變體所展現的一或多種結合活性。術語「功能性片段」或「功能性變體」，如文中所用，尤其是指一變體分子或序列，其相較於親代分子的胺基酸序列係包括一或多個胺基酸已改變的胺基酸序列且仍能滿足一或多項親代分子或序列的功能，例如與目標分子結合。在一具體實例中，親代分子或序列之胺基酸序列中的修飾並不會顯著影響或改變此分子或序列的特性。在不同的具體實例中，功能性片段或功能性變體之功能可能下降但仍明顯存在，例如功能性變體的結合可能為親代分子或序列的至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，或至少90%。然而，在其他的具體實例中，相較於親代分子或序列，功能性片段或功能性變體之結合可能增強。
「衍生自」一指定胺基酸序列(胜肽、蛋白或多肽)之胺基酸序列(胜肽、蛋白或多肽)係指第一胺基酸序列的來源。較佳地，該衍生自特定胺基酸序列胺的基酸序列係具有與該特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的胺基酸序列。衍生自特定胺基酸序列胺的基酸序列可能為該特定序列或其片段的變體。例如，熟習本項技術之一般技術者應了解，適用於文中的序列可經改變，使其在序列上與衍生該等序列之天然生成或原生序列不同，而同時保留所欲的該天然序列活性。
如文中所用，「指示性材料」或「操作說明」係包括出版物、紀錄、圖表或任何可用於傳達本發明之組成物和方法效用之媒介呈現。本發明套組之指示性材料可，例如，固定於含有本發明組成物之容器上或與含有組成物的容器一起裝運。另一種選擇，指示性材料可與含有本發明的容器分開裝運，使得指示性材料和組成物由接受者配合使用。
「分離的」係指改變或從天然的狀態移出。例如，天然存在一動物中的核酸或胜肽天並非「分離的」，但部分或完全與其天然狀態的共存物質分開之相同的核酸或胜肽則為「分離的」。分離的核酸或蛋白可以實質上純的形式存在，或可存在於非天然環境，例如，舉例而言，宿主細胞中。
術語「重組的」在本發明內容中係指「經由基因工程製造」。較佳地，一「重組物」，例如重組核酸在本發明內文中為非天然生成的。
術語「天然生成的」如文中所用係指一物體可在自然界發現之事實。例如，存在一生物體(包括病毒)中以及可從天然來源分離，且並未以人為方式於實驗室刻意修飾的胜肽或核酸是為天然生成的。
「生理pH」如文中所用係指約7.5之pH。
術語「基因修飾」或簡稱「修飾」係包括以核酸轉染細胞。術語「轉染」係關於將核酸，特言之DNA，導入細胞。就本發明之目的，術語「轉染」亦包括將核酸導入細胞或藉由此細胞吸收核酸，其中該細胞可存在於對象中，例如，病患中。因此，根據本發明，用於轉染文中所述之核酸的細胞可存在活體外或活體內，例如此細胞可形成病患的部分器官、組織及/或生物體。根據本發明，轉染可為過渡的或穩定的。就某些轉染的應用，若轉染的基因物質僅是過渡性表現便已足夠。RNA可轉染至細胞中用以過渡性表現其編碼的蛋白。因為在轉染過程中導入的核酸通常不會整合至胞核基因體，因此外來的核酸將會經由有絲分裂稀釋或降解。容許核酸的游離體增幅之細胞大大降低稀釋率。若轉染的核酸實際上仍在細胞的基因體中及其子代細胞為所希望的，則必須進行穩定轉染。此穩定轉染可藉由使用病毒為基礎的系統或轉座子為基礎的系統來進行轉染。一般而言，編碼一標簽化合物的核酸係過渡性轉染至細胞。RNA可轉染至細胞用以過渡性表現其編碼的蛋白。 主要目標
「主要目標」如本發明中所用，係關於例如在治療、診斷及/或造影方法中偵測、調節、結合或者對付的目標。
主要目標可選自人類或動物體內任何適合的目標，並可為細胞、病原、寄生蟲或可存在細胞、病原或寄生蟲上。
根據特定的具體實例，該主要目標為結構，例如存在目標細胞表面上的蛋白，例如細胞表面抗原或細胞表面受體。主要目標在疾病，例如感染或癌症期間可能為上調的。在罹病的組織中，上述標記可能與健康組織不同並提供早期偵測、特定診斷和治療，尤其是標靶治療之獨特可能性。
在某些具體實例中主要目標或簡稱「目標」為腫瘤抗原。在本發明內文中，術語「腫瘤抗原」或「腫瘤相關抗原」係關於在正常情況下專一表現於有限數目之組織及/或器官上或特定發育階段的蛋白，例如，腫瘤抗原在正常情況下可專一表現在胃組織，較佳地胃黏膜，在生殖器官，例如睪丸，在滋養層組織，例如胎盤，或在生殖系細胞，以及表現或異常表現於一或多種腫瘤或癌症組織。在此情況下，「有限數目」較佳地係指不超過3種，更佳地不超過2種。在本發明內文中腫瘤抗原係包括，例如，分生抗原，較佳地細胞類型專一性分生抗原，亦即在正常情況下專一表現在特定分生階段的特定細胞類型之蛋白，癌症/睪丸抗原，亦即在正常情況下專一表現在睪丸及有時候胎盤之蛋白，以及生殖系專一性抗原。在本發明內文中，腫瘤抗原較佳地係與癌細胞的細胞表面結合，且較佳地不會或僅極少表現在正常組織。較佳地，腫瘤抗原或異常表現的腫瘤抗原辨識癌細胞。在本發明內文中，由對象，例如患有癌症疾病之病患中的癌細胞所表現腫瘤抗原，較佳為該對象的自體蛋白。在較佳的具體實例中，腫瘤抗原在本發明內文中在正常情況下係表現在非必須之組織或器官，亦即該等組織或器官當被免疫系統損傷時不會導致該對象死亡，或在不會或僅極少讓免疫系統進入之身體器官或結構。較佳地，腫瘤抗原之胺基酸序列在表現於正常組織中的腫瘤抗原和表現在癌症組織的腫瘤抗原間為相同的。
腫瘤抗原之實例包括p53、ART-4、BAGE、β-catenin/m、Bcr-abL CAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、claudin家族的細胞表面蛋白，例如CLAUDIN-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT (or hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A、preferably MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、or MAGE-A12、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、-2、-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、p190 minor BCR-abL、Pm1/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、SURVIVIN、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE和WT。特佳的腫瘤抗原包括CLAUDIN-18.2 (CLDN18.2)和CLAUDIN-6 (CLDN6)。
根據本發明，可藉由遞送編碼對目標細胞具專一性之標簽化合物的RNA，及/或提供帶有與標靶，例如目標細胞上的抗原結合之基團的標簽化合物，將酬載專一遞送至標靶，例如目標細胞。
將編碼標簽化合物的RNA特定遞送至目標細胞可藉由使用包括該RNA及與一標靶，例如目標細胞上的抗原結合的靶向分子之粒子來施行。 標簽化合物(Docketing compound)
根據本發明，RNA所編碼的「標簽化合物」係用來在主要目標，例如目標細胞或目標細胞上的抗原以及「標簽化合物」之間形成連接，例如非共價連接。此標簽化合物可與效應子探針形成連接，例如非共價或共價連接。RNA所編碼的標簽化合物在文中亦稱為「RiboDocker」。
在一具體實例中，標簽化合物係包括「主要靶向基團」，亦稱為「與標靶結合的結合基團」，特言之「與目標細胞上的目標結合之結合基團」，其能與主要感興趣標靶結合。「主要靶向基團」如本發明中所用係關於與主要目標結合的標簽化合物之部分。此等靶向基團典型地為對細胞表面標靶(例如，膜受體)，或結構蛋白(例如澱粉樣斑塊)具有親和力之基團。這些基團可為任何與主要目標結合的胜肽或蛋白(例如抗體或抗體片段)。用於文中適合的主要靶向基團之特定具體實例包括細胞表面抗原結合胜肽和抗體。主要靶向基團之其他實例為與受體結合的胜肽或蛋白。
主要靶向基團較佳地係以高專一性及/或高親和力結合且與主要目標的結合較佳地在體內為穩定的。
為了能專一靶向上述的主要目標，標簽化合物之主要靶向基團可包括包含(但不限於)抗體、抗體片段，例如Fab2、Fab、scFV、VHH區和其他蛋白或胜肽之化合物。
根據本發明一特定的具體實例，該主要目標為一受體且適合的主要靶向基團係包括，但不限於此等受體的配體或仍會與受體結合的其一部分，例如，在受體結合蛋白配體之情況下為受體結合胜肽。
天然蛋白之其他主要靶向基團的實例包括干擾素，例如α、β和γ干擾素、介白素，以及蛋白生長因子，例如轉化生長因子(TGF)或血小板衍生生長因子(PDGF)。
根據本發明另一特定的具體實例，主要目標和主要靶向基團係經選擇使其產生專一或增加靶向組織或疾病，例如癌症、發炎、感染、心血管疾病，例如血栓、動脈硬化病灶、缺氧位置，例如中風，腫瘤、心血管病症、腦病症、細胞凋亡、血管新生、器官及報導子基因/酵素。此項可藉由選擇具組織、細胞或疾病專一性表現的主要目標來達成。例如，腫瘤抗原可能過度表現在各種腫瘤細胞類型，但不會表現或低量表現在正常細胞上。
此標簽化合物進一步係包括作為「第二目標」之基團，亦即，提供結合夥伴包括酬載之效應子探針的標簽化合物部分。包括在與效應子探針(第二目標)結合的標簽化合物內的結合基團和包括在與標簽化合物結合之效應子探針內的結合基團(「第二靶向基團」)係彼此相互結合。
根據一具體實例，該標簽化合物係包括雙專一性抗體。在一具體實例中，該標簽化合物係包括與主要目標結合的結合區和與效應子探針上的第二靶向基團結合的結合區。在一具體實例中，該標簽化合物係包括與主要目標結合的抗體片段和與效應子探針上的第二靶向基團結合的抗體片段。在一具體實例中，至少一結合區係包括一抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一具體實例中，至少一結合區係包括單域抗體，例如VHH。在一具體實例中，結合區係包括一抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)以及另一結合區係包括單域抗體，例如VHH。在一具體實例中，與主要目標結合的結合區係包括抗體的重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)。在一具體實例中，與效應子探針上的第二靶向基團結合的結合區係包括單域抗體，例如VHH。
在一具體實例中，該標簽化合物係包括與主要目標結合的抗體之Fab片段。在一具體實例中，該衍生自重鏈的Fab鏈係於C端經由GS連接子和與效應子探針上的第二靶向基團結合的VHH相連接。在一具體實例中，與效應子探針上的第二靶向基團結合的VHH係在C端經由GS連接子與衍生自重鏈的Fab鏈相連接。
在一具體實例中，該標簽化合物係包括一與主要目標結合的全長抗體。在一具體實例中，該全長抗體的重鏈係在C端經由GS連接子和與效應子探針上的第二靶向基團結合的VHH相連接。在一具體實例中，與效應子探針上的第二靶向基團結合的VHH係在C端經由GS連接子與全長抗體的重鏈相連接。
在一具體實例中，該標簽化合物係包括一融合蛋白，該融合蛋白係包括與主要目標結合的結合區和與效應子探針上的第二靶向基團結合的結合區。
術語「融合蛋白」如文中所用係指包括二或更多個次單位的多肽或蛋白。較佳的，此融合蛋白為二或更多次單位間的轉譯融合物。此轉譯融合物可藉由對一閱讀框中的次單位以另一次單位的核苷酸序列基因工程化編碼核苷酸來產生。次單位間可穿插連接子。
在一具體實例中，該標簽化合物係包括單胜肽鏈。在一具體實例中，該單胜肽鏈係包括與主要目標結合的抗體片段和與效應子探針上的第二靶向基團結合的抗體片段。在一具體實例中，抗體片段為VHH、scFv或其混合物。在不同具體實例中，該標簽化合物係包括下列結構之一(從N至C端)： VHH(效應子探針上的α第二靶向基團)-視需要連接子-VHH(α主要目標) VHH(α主要目標)-視需要連接子-VHH(效應子探針上的α第二靶向基團) VHH(效應子探針上的α第二靶向基團)-視需要連接子-scFv (α主要目標) scFv(α主要目標)-視需要連接子-VHH(效應子探針上的α第二靶向基團) VHH(α主要目標)-視需要連接子-scFv(效應子探針上的α第二靶向基團) scFv(效應子探針上的α第二靶向基團)-視需要連接子-VHH(α主要目標) scFv(效應子探針上的α第二靶向基團)-視需要連接子-scFv(α主要目標) scFv(α主要目標)-視需要連接子-scFv (效應子探針上的α第二靶向基團)。
在一具體實例中，該標簽化合物係包括訊號胜肽，例如N端訊號胜肽，其能從表現此RNA的細胞分泌該標簽化合物。 效應子探針
效應子探針係包括一第二靶向基團。該第二靶向基團係關於供包括在標簽化合物內可用的第二目標形成結合夥伴之效應子探針部分。效應子探針進一步係包括在文中稱為「效應子基團」或「酬載」之基團，其能引起、提供或帶來所欲的診斷、造影及/或治療效用。該第二靶向基團和效應子基團可共價或非共價連接。例如，若第二靶向基團為抗原受體而效應子基團為細胞，則該抗原受體可表現在該細胞的表面且可能非共價與該細胞相連接。
在一具體實例中，其中該第二靶向基團係包括胜肽或蛋白(例如，抗體片段或胜肽標籤)而該效應子基團係包括胜肽或蛋白，效應子探針可包括單一胜肽鏈。在一具體實例中，該效應子探針係包括包含第二靶向基團和效應子基團之融合蛋白。在此具體實例中，效應子探針可直接投予或以編碼該效應子探針之RNA投予(類似投予編碼標簽化合物之RNA)。
在一具體實例中，其中該第二靶向基團係包括胜肽或蛋白(例如，抗體片段或胜肽標籤)而該效應子基團係包括非胜肽或蛋白之化合物，該第二靶向基團可，例如經連接子，與該效應子基團化學上連接。
在一具體實例中，該包括在標簽化合物內的第二目標和包括在效應子探針內的第二靶向基團在生理狀況下係彼此相互結合。
在一具體實例中，包括在標簽化合物內的第二目標係包括一胜肽或蛋白，例如，胜肽標籤，而該包括在效應子探針內的第二靶向基團係包括結合劑，例如，與該胜肽或蛋白結合的抗體片段。
在一具體實例中，包括在效應子探針內的第二靶向基團係包括一胜肽或蛋白，例如，胜肽標籤，而包括在標簽化合物內的第二目標係包括結合劑，例如，一與該胜肽或蛋白結合的抗體片段。
在一具體實例中，用於文中之第二目標/第二靶向基團系統係包括表位標籤/結合劑系統。
在一具體實例中，該表位標籤/結合劑系統係包括包含SRLEEELRRRLTE序列的的表位標籤，而該結合劑係包括一包含CDR1序列GVTISALNAMAMG、CDR2序列AVSERGNAM和CDR3序列LEDRVDSFHDY之駱駝化VHH區。在一具體實例中，該表位標籤/結合劑系統係包括一包含SRLEEELRRRLTE序列之表位標籤，而該結合劑係包括一駱駝化VHH區，該駱駝化VHH區係包括EVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCTASGVTISALNAMAM GWYRQAPGERRVMVAAVSERGNAMYRESVQGRFTVTRDFTNKMVSLQMDNLKPEDTAVYYCHVLEDRVDSFHDYWGQGTQVTVSS胺基酸序列，與該胺基酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%同一性之胺基酸序列，該胺基酸序列的片段，或與該胺基酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%同一性之胺基酸序列。
如文中所用，「表位標籤」係指抗體或具有類抗體功能的蛋白分子可與其結合的一段胺基酸。
在一具體實例中，在標簽化合物與效應子探針結合後，形成共價連結。在此具體實例中，文中所用的第二目標/第二靶向基團係包括標籤/捕捉子系統，形成共價鍵，例如，SpyTag/SpyCatcher形成一異胜肽鍵。
該SpyTag/SpyCatcher系統為用於重組蛋白之可逆接合的技術。胜肽SpyTag與蛋白SpyCatcher自發性反應，在彼此之間形成分子內異胜肽鍵。使用成對的標籤/捕捉子(Tag/Catcher)，可在二個重組蛋白之間進行生物接合。
在一具體實例中，包括在效應子探針內的效應子基團係包括一治療或診斷基團。在一具體實例中，包括在效應子探針內的效應子基團係包括一治療或診斷基團之標靶，例如，效應子細胞，例如免疫細胞。
效應子基團可，例如，為可偵測標記。「可偵測標記」如文中所用係關於允許探針偵測之效應子探針的部分，例如當存在於細胞、組織或生物體中時。本發明內文中所設想的可偵測標記類型為顯影劑。在本發明內文中設想了不同類型的可偵測標記，並描述於下文。
因此，根據本發明特定的具體實例，本發明之藥劑和方法係用於造影，尤其是醫療造影。為了鑑別主要目標，係使用包括一或多個可偵測標記之造影探針作為效應子探針。特定的造影探針之可偵測標記之實例為用於習用造影系統之顯影提供基團，例如MRI-可成像結構、自旋標記、光學標記、超音波回應結構、X-光-回應基團、放射性核種、(生物)發光和FRET-型染劑。本發明內文中所設想的示例可偵測標記係包括，但不限於，螢光分子，例如自體螢光分子、與試劑接觸後發光的分子等、放射性標記；生物素，例如，經由生物素與抗生物素(avidin)結合來偵測；螢光標籤，用於MRI的造影結構，包括順磁性金屬，造影劑諸如此類。用於造影之放射性核種可為，例如，由下列組成之群中選出的同位素： 3H、 11C、 13N、 15O、 18F、 19F、 51Cr、 52Fe、 52Mn、 55Co、 60Cu、 61Cu、 62Zn、 62Cu、 63Zn、 64Cu、 66Ga、 67Ga、 68Ga、 70As、 71As、 72As、 74As、 75Se、 75Br、 76Br、 77Br、 80Br、 82Br、 82Rb、 86Y、 88Y、 89Sr、 89Zr、 97Ru、 99Tc、 110In、 111In、 113In、 114In、 117Sn、 120I、 122Xe、 123I、 124I、 125I、 166Ho、 167Tm、 169Yb、 193Pt、 195Pt、 201Tl和 203Pb。例如可用於治療之其他的元素和同位素亦可適用於特定應用中的造影。
MRI-可成像基團可為順磁性離子或超順磁性粒子。順磁性離子可為由下列組成之群中選出的元素：Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。
TX-光-回應基團包括，但不限於碘、鋇和硫酸鋇。
再者，本發明內文中所設想的可偵測標記亦包括可藉由結合抗體而被偵測出的胜肽或多肽，例如，藉由結合可偵測標定抗體。在一具體實例中，可偵測標記為小的有機PET和SPECT標記，例如 18F、 11C或 123I。
效應子基團亦可為治療劑，例如醫藥活性劑。醫藥活性劑之實例已為熟習技術者所知並提供於文中。治療性探針亦可視需要包括一可偵測標記。
因此，根據另外的具體實例，本發明之藥劑和方法係用於靶向治療。此項可藉由使用包括第二靶向基團和一或多個醫藥活性劑(例如，藥物或用於放射性治療的放射性同位素)之效應子探針來進行。
效應子基團亦可包括一囊泡、脂質體、聚合物膠囊或任何其他填充或承載診斷或治療基團的載劑。
術語「醫藥活性劑」係關於任何藥劑，例如化合物或細胞，當投予一個體時為治療上有效的。術語「醫藥活性劑」進一步係關於在一包括投予該藥劑之治療干預中，改變，較佳地治癒、減輕或部分遏止特定疾病的臨床表現及其併發症之任何藥劑。
在一具體實例中，醫藥活性劑係包括醫藥活性RNA或醫藥活性胜肽或蛋白。
「醫藥活性RNA」為編碼一醫藥活性胜肽或蛋白的RNA或其本身具有醫藥活性，例如，具有一或多項如該等醫藥活性蛋白所述的醫藥活性。例如，此RNA可為一或多股的RNA干擾(RNAi)。此等藥劑包括短干擾RNA(siRNA)或短的髮夾RNA(shRNA)，或siRNA的前驅物或類微-RNA，靶向目標轉錄，例如，轉錄對象之內生性疾病相關的轉錄。
「醫藥活性胜肽或蛋白」，當以一治療上有效量投予對象時，對於該對象的症狀或疾病狀態係具有正面或有利的效應。較佳地，醫藥活性胜肽或蛋白係具有治癒或緩解性質且可投予用於改善、緩解、減輕、反轉、延遲疾病或病症的一或多個徵候發生或減低其嚴重性。醫藥活性胜肽或蛋白可具有預防性質並可用於延緩疾病發生或減低此等疾病或病理症狀之嚴重度。術語「醫藥活性胜肽或蛋白」包括完整的蛋白或多肽，且亦可指其醫藥活性片段。其亦可包括胜肽或蛋白之醫藥活性類似物。術語「醫藥活性胜肽或蛋白」係包括為抗原之胜肽或蛋白，亦即將胜肽或蛋白投予對象在該對象中引發可能為治療性或部分或完全保護性的免疫反應。
醫藥活性蛋白之實例包括，但不限於，細胞激素和免疫系統蛋白，例如免疫活性化合物(例如，介白素、集落刺激因子(CSF)、顆粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)、顆粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅血球生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素、整合素、地址素、選擇素、歸巢受體、T細胞受體、免疫球蛋白、可溶性主要組織相容性複合物抗原、免疫活性抗原例如細菌、寄生蟲或病毒抗原、過敏原、自體抗原、抗體)，荷爾蒙(胰島素、甲狀腺素、兒茶酚胺(catecholamine)、促性腺激素(gonadotrophine)、促激素(trophic hormone)、泌乳素(prolactin)、催產素(oxytocin)、多巴胺(dopamine)、牛生長素(bovine somatotropin)、瘦體素(leptin)及諸如此類)，生長激素(例如，人類生長激素)，生長因子(例如，表皮生長因子、神經生長因子、類胰島素生長因子及諸如此類)，生長因子受體，酵素(組織胞漿素原活化劑、鏈激酶、類固醇生物合成或降解類固醇生成酵素、激酶、磷酸二酯酶、甲基酶、去甲基酶、去氫酶、纖維酶、蛋白酶、脂解酶、磷脂酶、芳香酶、細胞色素、腺苷酸或鳥苷酸環化酶、神經胺酸酶及諸如此類)，受體(類固醇激素受體、胜肽受體)，結合蛋白(生長激素或生長因子結合蛋白及諸如此類)，轉錄和轉譯因子，腫瘤生長抑制蛋白(例如抑制血管新生之蛋白)，結構蛋白(例如膠原蛋白、絲蛋白、纖維蛋白原、彈性蛋白、微管蛋白、肌動蛋白和肌凝蛋白)，血液蛋白(凝血酶、血清白蛋白、第VII因子、第VIII因子、胰島素、第IX因子、第X因子、組織胞漿素原活化劑、C蛋白、溫韋伯氏因子(von Wilebrand factor)、抗凝血酶III、葡萄糖腦苷脂酶、紅血球生成素顆粒細胞集落刺激因子(GCSF)或修飾的第VIII因子、抗凝血劑及諸如此類。
在一具體實例中，該醫藥活性蛋白為涉及調節淋巴樣恆定狀態之細胞激素，較佳地涉及和較佳地誘發或增進T細胞之發育、促發、擴增、分化及/或存活。在一具體實例中，該細胞激素為介白素。在一具體實例中，根據本發明之醫藥活性蛋白為由下列組成之群中選出的介白素：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IL-21。
在一具體實例中，效應子探針係包括一效應子基團，其為可用於放射性治療及/或化療的化合物。在一具體實例中，效應子探針係包括化療化合物之效應子基團。
化療為一種使用一或多種抗癌藥物(化療劑)之癌症治療，通常為標準化療療程之部分。術語化療意味非專一性使用細胞內毒藥來抑制有絲分裂。內涵意義排除了阻斷胞外訊號(訊號傳導)之更具選擇性藥劑。以專一性分子或基因標靶發展之療法，其係抑制來自經典內分泌荷爾蒙之生長-促進訊號(主要為乳癌之雌激素和前列腺癌之雄性激素)，目前稱為賀爾蒙療法。相反的，其他抑制生長訊號如該等與受體酪胺酸激酶有關的生長訊號則稱為標靶療法。
藉由干擾細胞分裂(有絲分裂)的習用化療劑具細胞毒性，但癌細胞在對於這藥劑的感受性變化萬千。更大程度上，化療可能被認為是傷害或施壓細胞的一種方式，若啟動細胞凋亡，其然後可能導致細胞死亡。
化療劑包括烷化劑、抗代謝物、抗-微管劑、拓樸異構酶抑制劑和細胞毒性抗生素。
烷化劑具有烷化許多分子之能力，包括蛋白、RNA和DNA。烷化劑的子類型有氮芥、亞硝脲、四𠯤、氮丙啶、順鉑(cisplatin)及衍生物，和非經典的烷化劑。氮芥包括甲基二(氯乙基)胺(mechlorethamine)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、美法崙(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、異環磷醯胺(ifosfamide)和白消安(busulfan)。亞硝脲包括N-亞硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)和司莫司汀(semustine) (MeCCNU)、福莫司汀(fotemustine)和鏈佐菌素(streptozotocin)。四𠯤包括達卡巴仁(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺(temozolomide)。氮丙啶包括噻替派(thiotepa)、絲裂黴素(mytomycin)和地吖醌(diaziquone)(AZQ)。順鉑及衍生物包括順鉑、卡鉑(carboplatin)和 奧沙利鉑(oxaliplatin)。其係藉由與生物上重要的分子之胺基、羧基、巰基和磷酸基團形成共價鍵來妨害細胞功能。非經典的烷化劑包括甲基苄肼(procarbazine)和六甲蜜胺(hexamethylmelamine)。在一特佳的具體實例中，該烷化劑為環磷醯胺。
抗-代謝物為一群阻礙DNA和RNA合成之分子。其許多具有類似DNA和RNA建構組元之構造。抗-代謝物類似核鹼基或核苷，但具有改變的化學基團。這些藥物係藉由阻斷DNA合成所需的酵素或是併入DNA或RNA中，發揮其效用。抗-代謝物的子類型有抗-葉酸、氟嘧啶、去氧核苷類似物及硫嘌呤。抗-葉酸包括胺甲蝶呤(methotrexate)和培美曲塞(pemetrexed)。氟嘧啶包括氟尿嘧啶(fluorouracil和卡培他濱(capecitabine.。去氧核苷類似物包括阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他濱(gemcitabine)、地西他濱(decitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、氟達拉濱(fludarabine)、奈拉濱(nelarabine)、克拉屈濱(cladribine)、克羅拉濱(clofarabine)和噴司他丁(pentostatin)。硫嘌呤包括硫鳥嘌呤(thioguanine)和巰嘌呤(mercaptopurine)。
抗-微管劑係藉由防阻微管功能來阻斷細胞分裂。長春花屬生物鹼防阻微管形成，而紫杉烷(taxane)係防阻微管分解。長春花屬生物鹼包括長春瑞濱(vinorelbine)、長春地辛(vindesine)和長春氟寧(vinflunine)。紫杉烷(Taxane)包括歐洲紫杉醇(docetaxel)(Taxotere)和太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Taxol)。
拓樸異構酶抑制劑為影響二種酵素：拓樸異構酶I和拓樸異構酶II活性的藥物並包括伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan)、喜樹鹼(camptothecin)、依託泊苷(etoposide)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、替尼泊苷(teniposide)、新生黴素(novobiocin)、美巴龍(merbarone)和阿柔比星(aclarubicin)。
細胞毒性抗生素為具有各種作用機制之多變化的藥物群族。其在化療適應症上共同的主題為其係打斷細胞分裂。最重要的子類為蔥環類藥(anthracycline)(例如，多柔比星(doxorubicin)、道諾黴素（Daunorubicin）、表柔比星(Epirubicin)、 表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、吡柔比星(pirarubicin)和阿柔比星(aclarubicin))及博來黴素(bleomycin)；其他著名的實例包括絲裂黴素C(mitomycin C)、米托蒽醌(mitoxantrone)和放線菌素(actinomycin)。
在一具體實例中，效應子探針係包括一效應子基團，其為一效應子細胞。在此具體實例中，該效應子細胞可在其表面表現一胜肽或蛋白，例如，包括第二靶向基團之抗原受體。在一具體實例中，效應子基團係包括一效應子細胞之標靶。在此具體實例中，該效應子細胞可在其表面表現一胜肽或蛋白，例如，一抗原受體，其係靶向效應子探針上的效應子基團。
有關本發明所用的細胞及可導入其中的編碼抗原受體之核酸(DNA或RNA)，特言之，免疫效應子細胞例如具有細胞溶解潛力的細胞，特言之，淋巴樣細胞，及較佳地為T細胞，特言之細胞毒性淋巴細胞，較佳地係選自細胞毒性T細胞、天然殺手(NK)細胞、和淋巴激素活化殺手(LAK)細胞。在活化後，各細胞毒性淋巴細胞觸發目標細胞的破壞。例如，細胞毒性T細胞藉由任一或二種下列方法來觸發目標細胞破壞。第一，在活化後T細胞釋放細胞毒素，例如穿孔素( perforin)、顆粒酶(granzyme)和顆粒溶解素(granulysin)。穿孔素和顆粒溶解素在目標細胞上製造孔洞，而顆粒酶則進入細胞並在細胞質觸發凋亡蛋白酶(caspase)級聯，引發細胞凋亡(程序性細胞死亡)。第二，細胞凋亡可經由T細胞和目標細胞間的Fas-Fas配體相互作用引發。關於本發明中所用的細胞，雖然可使用異源性細胞或同種異體的細胞，但較佳地為自體細胞。
術語「效應子功能」在本發明內文中係包括任何由免疫系統之組成份所媒介的功能，其例如產生殺死罹病細胞，例如腫瘤細胞，或抑制腫瘤生長及/或抑制腫瘤發育，包括抑制腫瘤傳播和轉移。較佳地，效應子功能在本發明內文中為T細胞媒介的效應子功能。此等功能包括，在幫手T細胞(CD4 +T細胞)的情況下，釋放細胞激素及/或活化CD8 +淋巴細胞(CTL)及/或B細胞，而在CTL的情況下為消除細胞，亦即特徵為表現抗原的細胞，例如經由細胞凋亡或穿孔素媒介的細胞溶解，產生細胞激素例如IFN-γ和TNF-α，及專一性溶解細胞殺死表現抗原的目標細胞。
術語「免疫效應子細胞」或「免疫反應細胞」在本發明內文中係關於在免疫反應期間發揮效應子功能之細胞。「免疫效應子細胞」在一具體實例中能結合一抗原，例如由標簽化合物所呈現作為第二目標或由效應子探針所呈現作為效應子基團的抗原。例如，免疫效應子細胞係包括T細胞(細胞毒性T細胞、幫手T細胞、腫瘤浸潤T細胞)、B細胞、天然殺手細胞、嗜中性細胞、巨噬細胞和樹突細胞。較佳地，在本發明內文中「免疫效應子細胞」為T細胞，較佳地CD4 +及/或CD8 +T細胞，最佳地CD8 +T細胞。根據本發明，術語「免疫效應子細胞」亦包括可經適當刺激成熟變成免疫細胞的細胞(例如T細胞，特言之，輔助T細胞或溶解細胞的T細胞)。免疫效應子細胞包括CD34 +造血幹細胞、未成熟和成熟T細胞及未成熟和成熟B細胞。當暴露於一抗原時，T細胞前驅物分化成為溶解細胞的T細胞，係類似免疫系統之殖株選擇(clonal selection)。
在一具體實例中，免疫效應子細胞為CAR-表現的免疫效應子細胞。
根據本發明所用的免疫效應子細胞可表現內生性抗原受體，例如T細胞受體或B細胞受體，或可能缺乏表現內生性抗原受體。
「淋巴樣細胞」為視需要在適合修飾後，例如轉移抗原受體例如TCR或CAR後，能產生免疫反應，例如細胞免疫反應之細胞，或此等細胞的前驅細胞並包括淋巴細胞，較佳地T淋巴細胞、淋巴母細胞和漿細胞。淋巴細胞可為如文中所述的免疫效應子細胞。較佳的淋巴細胞為可經修飾用以在細胞表現上表現抗原受體之T細胞。在一具體實例中，該淋巴細胞缺乏內生性表現T細胞受體。
術語「T細胞」和「T淋巴細胞」在文中可交換使用並包括輔助T細胞(CD4 +T細胞)和包括溶解細胞T細胞之細胞毒性T細胞(CTL、CD8 +T細胞)。
T細胞係屬於稱為淋巴細胞的白血球細胞群族，並在細胞媒介的免疫力上扮演中樞性角色。其，例如B細胞和天然殺手細胞藉由在其細胞表面呈現稱為T細胞受體(TCR)的特別受體，而有別於其他淋巴細胞類型。胸腺為負責成熟化T細胞的主要器官。已發現有數種不同的T細胞子類，其各自具有不同的功能。
輔助T細胞係在免疫過程中協助其他白細胞，除了其他功能之外，包括使B細胞成熟成為漿細胞及活化細胞毒性T細胞和巨噬細胞。因為在其表面上表現CD4糖蛋白，這些細胞亦稱為CD4 +T細胞。幫手T細胞當藉由表現在抗原呈獻細胞(APC)表面上的第II類MHC分子呈獻胜肽抗原時，變為活化。一但活化後，其快速分裂並分泌稱為細胞激素的小蛋白，調節或協助活化免疫反應。
細胞毒性T細胞破壞病毒感染的細胞和腫瘤感染的細胞，且亦牽涉移植排斥。因為在其細胞表面表現CD8糖蛋白，這些細胞亦稱為CD8 +T細胞。這些細胞藉由與幾乎存在每個身體細胞表面上的抗原相關第Ｉ類MHC結合來辨識其目標。
「調節T細胞」或「Treg」為調節免疫系統、維持自體抗原耐受性和防止自體免疫疾病的T細胞子群族。Treg具免疫抑制性且一般係抑制或下調效應子T細胞的誘發和增生。Treg表現生物標記CD4、FoxP3和CD25。
如文中所用，術語「初始T細胞」係指成熟T細胞，不像活化的或記憶T細胞，在周邊內其不會遭逢其同源抗原。初始T細胞通常其特徵為表面表現L-選擇素(CD62L)，無活化標記CD25、CD44或CD69存在，且無記憶CD45RO同型存在。
如文中所用，術語「記憶T細胞」係指T細胞亞群組的子類，其先前已遭逢並對其同源抗原起反應。在第二次遭逢此抗原時，記憶T細胞可複製，以升高比第一次免疫系統回應此抗原時更快和更強的免疫反應。記憶T細胞可為CD4 +或CD8 +且通常表現CD45RO。
根據本發明，術語「T細胞」亦包括經適當刺激可成熟為T細胞的細胞。
大多數的T細胞具有以數種蛋白複合物存在的T細胞受體(TCR)。實際的T細胞受體係由二條從獨立的T細胞受體α和β(TCRα和TCRβ)基因所產生並稱為α-和β-TCR鏈之個別胜肽鏈所組成。γδ T細胞代表在其表面上具有獨特T細胞受體(TCR)之小的T細胞子類。然而，在γδ T細胞中，TCR係由γ-鏈和δ-鏈所構成。此群組的T細胞(總T細胞的2%)比αβ T細胞較不常見。
所有的T細胞係源自於骨髓中的造血幹細胞。衍生自造血幹細胞的造血前驅細胞聚居於胸腺並藉由細胞分裂擴增，產生大群族的未成熟胸腺細胞。最早的胸腺細胞不會表現CD4也不會表現CD8，且因此被歸類為雙陰性(CD4 -CD8 -)細胞。當其經由發育演進，變成雙陽性胸腺細胞(CD4 +CD8 +)，且最後成熟為單陽性(CD4 +CD8 -或CD4 -CD8 +)胸腺細胞，然後從胸腺釋放至周邊組織。
T細胞一般可使用標準程序於試管內或活體外製備。例如，T細胞可使用市售細胞分離系統從哺乳動物之骨髓，周邊血液或部分的骨髓或周邊血分離出。另一種選擇，T細胞可衍生自相關或不相關的人類、非人類動物、細胞株或培養物。包括T細胞的樣本可，例如，為周邊血液單核細胞(PBMC)。
如文中所用, 術語「NK細胞」或「天然殺手細胞」係指周邊血液淋巴細胞的子類，係定義為表現CD56或CD16且缺乏T細胞受體。如文中所提供的，NK細胞亦可從幹細胞或前驅細胞分化。
文中所述的細胞，例如免疫效應子細胞可經基因修飾於活體外/試管內或活體內在欲治療的對象中用以表現一抗原受體，例如嵌合抗原受體(CAR)結合抗原。在一具體實例中，用以表現抗原受體的修飾係發生在活體外/試管內。隨後，經修飾的細胞可投予病患。
以表現嵌合抗原受體之CAR-工程化T細胞的過繼性細胞轉移療法為一有前景的抗-癌治療，因為CAR修飾的T細胞可經工程化實際上靶向任何腫瘤細胞。例如，病患的T細胞可經基因工程化(基因修飾)用以表現專一針對病患腫瘤細胞抗原之CAR，然後輸注回病患中。
根據本發明，術語「CAR」(或「嵌合抗原受體」)與術語「嵌合T細胞受體」和「人工T細胞」為同義詞且係關於包括單一分子或分子複合物之人工受體，其係辨識，亦即與標靶結構(例如，抗原)結合(例如，藉由抗原結合區與抗原結合)並可賦予免疫效應子細胞專一性，例如在細胞表面上表現該CAR的T細胞。此等細胞並非必須要處理或呈獻該目標細胞所辨識之抗原，而是較佳地可以專一性辨識任何抗原。較佳地，藉由CAR辨識標靶結構造成表現該CAR之免疫效應子細胞活化。CAR可包括一或多個蛋白單元，而該蛋白單元係包括一或多個如文中所述的區域。術語「CAR」不包括T細胞受體。
CAR係包括目標專一性結合元件，另稱為抗原結合單位或抗原結合區，其一般而言為CAR胞外區的部分。特言之，本發明之CAR係以標簽化合物或效應子探針上的抗原為目標。
在本發明一具體實例中，抗原結合區係包括對該抗原具專一性之免疫球蛋白重鏈的可變區(VH)和對該抗原具專一性之免疫球蛋白輕鏈的可變區(VL)。在一具體實例中，該免疫球蛋白為抗體。在一具體實例中，該重鏈可變區(VH)和對應的輕鏈可變區(VL)係經由胜肽連接子相連接。較佳地，CAR中的抗原結合基團部分為scFv。
CAR係經設計用以包括與CAR的胞外區融合之跨膜區。在一具體實例中，該跨膜區並非天然與CAR的其中一個區結合。在一具體實例中，該跨膜區係天然與CAR的其中一個區結合。在一具體實例中，該跨膜區係經胺基酸取代修飾而避免此等區與相同或不同表面膜蛋白的跨膜區結合，用以降低與受體複合物之其他成員的交互作用。該跨膜區可衍生自天然或合成的來源。當來源為天然時，該區可衍生自任何膜結合或跨膜蛋白。在本發明中特定用途的跨膜區可衍生自(亦即包括至少該跨膜區的)T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。另一種選擇，該跨膜區可為合成的，在此情況下其應包括主要為疏水性殘基，例如白胺酸和纈胺酸。較佳地在各合成的跨膜區末端可找到苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。
在某些情況下，本發明之CAR係包括絞鏈區，其係形成跨膜區和胞外區之間的鍵連。
CAR之細胞質區或另外胞外訊號係負責活化至少一項其中已置入CAR的免疫細胞之正常效應子功能。術語「效應子功能」係指細胞的特化功能。T細胞的效應子功能，例如，可為細胞溶解活性或幫手活性，包括分泌細胞激素。因此術語「胞內訊號傳遞區」係指轉導效應子功能訊號及引導細胞進行特化功能之蛋白部分。在通常整個胞內訊號傳遞區可應用的同時，在許多的情況下並不需要使用整條鏈。就達到使用胞內訊號傳遞區之截斷部分的程度，可使用此截斷的部分取代整條鏈，只要其轉導效應子功能訊號即可。術語胞內訊號傳遞區因此係包括任何足以轉導效應子功能訊號之胞內訊號傳遞區的截斷部分。
已知單獨經由TCR產生的訊號不足用於完全活化T細胞並且亦須要一第二或共刺激訊號。因此，T細胞活化可以說是由二條不同的細胞質訊號傳遞序列所媒介：該等經由TCR開始抗原依賴的主要活化(主要細胞質訊號傳遞序列)和該等以抗原依賴的方式作用，用以提供第二或共刺激訊號(第二細胞質訊號傳遞序列)。
在一具體實例中，CAR係包括衍生自CD3-ζ之主要細胞質訊號傳遞序列。再者，CAR的細胞質區可包括與共刺激訊號傳遞區組合的CD3-ζ訊號傳遞區。
共刺激區的身分（identity）僅限於其中在靶向基團與CAR結合後具有增進細胞增生和存活之能力者。適合的共刺激區包括CD28、CD137 (4-1BB)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的成員、CD134 (OX40)、受體之TNFR-超家族的成員和CD278(ICOS)、表現在活化T細胞上的CD28-超家族共刺激分子。熟習技術者應了解，在對本發明無不利影響下，可使用這些提及的共刺激區之序列變體，其中該等變體係具有與其仿效的區域相同或類似活性。此等變體與衍生彼等的區域之胺基酸序列應具有至少約80%序列同一性。在本發明之某些具體實例中，CAR結構係包括二個共刺激區。當特定的組合係包括四個提及區之所有可能的變體的同時，特定實例係包括CD28+CD137 (4-1BB)和CD28+CD134 (OX40)。
CAR的細胞質訊號傳遞部分之細胞質訊號傳遞序列可隨機或以指定順序彼此相互連接。視需要，短的寡肽或多肽連接子，較佳地長度介於2至10個胺基酸可形成該鍵連。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供特別適合的連接子。
在一具體實例中，CAR係包括引導新生蛋白進入內質網的訊號胜肽。在一具體實例中，該訊號胜肽係在抗原結合區之前。在一具體實例中，該訊號胜肽係衍生自一免疫球蛋白，例如IgG。
CAR可包括上述區，共同形成一融合蛋白。此等融合蛋白一般而言將包括抗原結合區、一或多個共刺激區，以及訊號傳遞序列，以N端至C端的方向相連接。然而，本發明之CAR並不限於此排列且其他排列為可接受的並包括一結合區、一訊號傳遞區和一或多個共刺激區。應了解，因為結合區必須自由與抗原結合，因此融合蛋白中結合區的放置一般而言應達到將此區展現在細胞外部。以相同的方式，因為共刺激和訊號傳遞區係用來引發細胞毒性淋巴細胞的活性和增生，因此融合蛋白一般而言應將這二個區展現在細胞外部。
在一具體實例中，CAR分子係包括： i)            目標抗原(例如，表位標籤)結合區； ii)          跨膜區；及 iii)        包括4-1BB共刺激區和CD3-ζ訊號傳遞區之胞內區。
在一具體實例中，抗原結合區係包括scFv。在一具體實例中，跨膜區係包括由下列組成之群中選出的蛋白之跨膜區：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD154、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、CD160、CD19、IL2R beta、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDlld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDlla、LFA-1、ITGAM、CDllb、ITGAX、CDllc、ITGBl、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAMl (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGLl、CDIOO (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Lyl08)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C，或其功能性變體。在一具體實例中，跨膜區係包括CD8α 跨膜區。在一具體實例中，抗原結合區係藉由絞鏈區與跨膜區相連接。在一具體實例中，該絞鏈區為CD8α絞鏈區。
在一具體實例中，本發明之CAR分子係包括： i)            目標抗原結合區； ii)          CD8α絞鏈區； iii)        CD8α跨膜區；及 iv)        包括4-1BB共刺激區和CD3-ζ訊號傳遞區之胞內區。
各種方法可用於將抗原受體，例如CAR結構導入細胞，例如T細胞，產生細胞基因修飾，用以表現該抗原受體。此等方法包括非病毒為基礎的DNA轉染，例如，mRNA轉染、轉座子為基礎的系統，以及病毒為基礎的系統。非病毒為基礎的DNA轉染具有低風險的插入誘變。轉座子為基礎的系統比不含有整合元件的質體可更有效地整合轉殖基因。病毒為基礎的系統包括使用γ-反轉錄病毒和慢病毒載體。γ-反轉錄病毒相當容易製造，有效並持久地轉導T細胞，且在初級人類T細胞中從整合的觀點已初步驗證為安全的。慢病毒載體亦有效及持久地轉導T細胞但製造上更昂貴。其潛在上亦比反轉錄病毒為基礎的系統更安全。
在一具體實例中，T細胞或T細胞前驅細胞係於活體外或活體內以編碼抗原受體的核酸轉染。在一具體實例中，可使用活體外和活體內轉染之組合。在一具體實例中，該T細胞或T細胞前驅細胞係來自所欲治療的對象。在本發明所有方面之一具體實例中，該T細胞或T細胞前驅細胞係來自與所欲治療對象不同的對象。
CAR T細胞可使用靶向T細胞的奈米粒於活體內製造，且因此幾乎為即刻。例如，聚(β-胺基酯)-為基礎的奈米粒可與抗-CD3e F(ab)片段偶合用於與T細胞上的CD3結合。在與T細胞結合後，這些奈米粒被內吞。其內含物，例如編碼抗-腫瘤抗原CAR的質體DNA，由於包括含有微管相關序列(MTAS)之胜肽及核定位訊號(NLS)，可導向T細胞核。包括居於CAR基因表現匣側邊之轉座子和編碼過度活躍的轉座酶之個別質體，可容許將CAR載體有效整合至染色體中。在奈米粒注入後能在活體內製造CAR T細胞之系統係描述於Smith et al. (2017) Nat. Nanotechnol. 12：813-820。
再者，CD19-CAR T細胞可使用專一性靶向人類CD8 +細胞之慢病毒載體CD8-LV於活體內直接產生(Pfeiffer A. et al., EMBO Mol. Med. Nov；10(11), 2018, 9158)。
另外的可能性係使用CRISPR/Cas9法，蓄意地於特定基因座放置CAR編碼序列。例如，可剔除現有的T細胞受體(TCR)，同時敲入CAR並將其於內生性啟動子之動力調節控制下置入，其另外可能緩和TCR表現；參照，例如，Eyquem et al. (2017) Nature 543：113-117。
在一具體實例中，經基因修飾用於表現抗原受體之細胞，係以編碼該抗原受體之核酸穩定或過渡性轉染。因此，編碼該抗原受體的核酸係整合或不會整合至該細胞的基因體中。
在一具體實例中，經基因修飾用於表現抗原受體之細胞對於表現內生性T細胞受體及/或內生性HLA為失活的。
在一具體實例中，文中所述的細胞可為所欲治療對象之自體、同種異體或同基因。在一具體實例中，本文預想從病患移出細胞及隨後將細胞再遞送回病患。在一具體實例中，本發明並未設想從病患移出細胞。就後者之情況，所有的細胞之基因修飾步驟係在活體內進行。
術語「自體」係用來描述任何衍生自相同對象的事物。例如，「自體移植」係指移植衍生自相同對象之組織或器官。此等程序為有利的，因為其克服另外可能造成排斥之免疫學障礙。
術語「同種異體」係用來描述任何衍生自相同物種不同個體之事物。當一或多個基因座的基因不相同時，二或更多個個體彼此可被認是同種異體。
術語「同基因」係用來描述任何衍生自具有相同基因型之個體或組織之事物，亦即雙胞胎或近交系動物或其組織。
術語「異源性」係用來描述某些由多種不同元件組成的事物。舉例而言，將個體的骨髓轉移到另一不同的個體即構成異源移植。異源基因為衍生自該對象以外來源的基因。 結合基團和藥劑
本文係描述結合基團或藥劑，例如抗體或抗體衍生物。再者，本文係描述雙專一性或多專一性結合劑，例如包括第一和第二結合區之雙專一性抗體，其中該第一結合區能與主要目標結合而第二結合區能與效應子探針上的第二靶向基團結合。
術語「表位」係指為結合劑所辨識之一分子或抗原之部分或片段。例如，表位可為抗體或任何其他結合蛋白所辨識。一表位可包括該抗原之連續或不連續的部分且長度係介於約5至約100個，較佳地介於約5至約50個，更佳地介於約8至約30個，最佳地介於約8至約25個胺基酸，例如，表位較佳地長度可為9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個胺基酸。在一具體實例中，表位長度係介於約10至約25個胺基酸。術語「表位」係包括結構表位。
術語「免疫球蛋白」係指一種結構上相關的醣蛋白，其係由二對多肽鏈，一對輕(L)低分子量鏈和一對重(H)鏈所組成的，全部四條係藉由雙硫鍵相互連接。免疫球蛋白的結構已完全定性。參見，例如Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))。簡言之，各重鏈典型地係包括重鏈可變區(文中縮寫為V H或VH)和重鏈恆定區(文中縮寫為C H或CH)。重鏈恆定區典型地係包括三個區CH1、CH2和CH3。絞鏈區為介於重鏈CH1和CH2區之間的區域且具高度彈性。絞鏈區中的雙硫鍵為IgG分子中二條重鏈間相互作用的部分。各輕鏈典型地係包括輕鏈可變區(文中縮寫為V L或VL)及輕鏈恆定區(文中縮寫為C L或CL)。輕鏈恆定區典型地係包括CL區。VH和VL區可進一步細分為高變區(或可為序列中高變的高變區及/或結構定義環之形式)，亦稱為互補決定區(CDR)，其間穿插更保守的稱為框架區(FR)的區域。各VH和VL典型地係包括三個CDR和四個FR，從胺基酸到羧基端以下列順序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4 (亦參見Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901‑917 (1987))。除非內容另有陳述或內容為矛盾的，否則在本發明恆定區中所指的胺基酸位置係根據EU-編號(Edelman et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1969 May；63(1)：78-85；Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. 1991 NIH Publication No. 91-3242)。一般而言，文中所述的CDR係以Kabat定義。
術語「胺基酸對應位置」如文中所用係指人類IgG1重鏈中胺基酸位置編號。在其他免疫球蛋白中的對應胺基酸位置可藉由以人類IgG1比對找出。因此，「對應」另外序列之胺基酸或片段的一序列中的胺基酸或片段，係使用標準序列比對程式，例如ALIGN、ClustalW或類似程式，典型地係以內建設定，與另一胺基酸比對，且與人類IgG1重鏈具有至少50%，至少80%，至少90%或至少95%同一性之胺基酸或片段。如何比對序列或序列中的片段已為本項技術所熟知，且據此測定出序列中根據本發明胺基酸之對應位置。
術語「抗體」(Ab)在本發明內文中，係指具有結合，較佳地專一性結合抗原之能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其衍生物。在一具體實例中，結合係在典型的生理狀況下，以較長時間的半衰期，例如至少約30分鐘，至少約45分鐘，至少約1小時，至少約2小時，至少約4小時，至少約8小時，至少約12小時，約24小時或更久，約48小時或更久，約3、4、5、6、7天或更多天等，或任何其他相關功能上定義時期(例如足以引發、提升、增進及/或調節與抗體和抗原結合有關的生理反應之時間)發生。免疫球蛋白分子的重鏈和輕鏈之可變區含有與一抗原作用之結合區。術語「抗原結合區」、「結合區」或「抗原結合區域」如文中所用，係指與抗原作用之區或區域且典型地係包括VH區和VL區二者。術語抗體當用於文中時不僅包括單專一性抗體，亦包括包含多個，例如2個或更多個，例如3個或更多個，不同抗原結合區之多專一性抗體。抗體(Ab)的恆定區可媒介免疫球蛋白與宿主組織或因子結合，包括各種免疫系統的細胞(例如效應子細胞)和補體系統之成份，例如C1q，補體活化之經典路徑中的第一組份。如上所示，術語抗體如文中所用，除非另有陳述或內容明確矛盾，否則係包括抗原結合片段，亦即保留與抗原專一結合之能力的抗體片段，及抗體衍生物，亦即衍生自抗體的結構體。已顯示，抗體的抗原結合功能可由全長抗體之片段來展現。涵蓋在「抗體」內的抗原結合片段的實例包括(i)Fab’或Fab片段、由VL、VH、CL和CH1區組成的單價片段，或描述於WO2007059782 (Genmab)之單價抗體；(ii)F(ab') 2片段，包括二個Fab片段在絞鏈區藉由雙硫橋連接二的價片段；(iii)基本上由VH和CH1區組成的Fd 片段；(iv)基本上由抗體單臂之VL和VH區組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward et al ., Nature 341, 544‑546 (1989))，其基本上由VH區組成的且亦稱為區域抗體(Holt et al；Trends Biotechnol. 2003 Nov； 21(11)：484-90)；(vi)駱駝化或奈米抗體分子(Revets et al；Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan； 5(1)：111-24)和(vii)分離的互補決定區(CDR)。再者，雖然Fv片段的二個區VL和VH，係由個別的基因所編碼，但其可使用重組法，藉由能使其變成單一蛋白鏈之合成的連接子相連結，在其中VL和VH區對形成單價分子(已知為單鏈抗體或單鏈Fv(scFv)，參見，例如Bird et al ., Science 242, 423‑426 (1988)和Huston et al ., PNAS USA 85, 5879‑5883 (1988))。除非內容另有註明或明確指出，否則此單鏈抗體係涵蓋在術語抗體中。雖然此等片段一般係包括在抗體的意義中，但其整體上及各自獨立地為本發明之獨特特徵，具有不同生物性質和利用性。在本發明內文中這些和其他可使用的抗體片段，以及此等片段之雙專一性模式係進一步論述於文中。亦應了解，術語抗體，除非另有指出，否則亦包括以任何已知技術，例如酵素裂解、胜肽合成和重組技術所提供之多株抗體、單株抗體(mAb)、類抗體多肽，例如嵌合抗體和人源化抗體，以及保留專一性結合抗原能力的抗體片段(抗原結合片段)。
詞語「單鏈Fv」或「scFv」係指其中習知雙鏈抗體之重鏈和輕鏈(VH和VL)的可變區已連接形成一條鏈之抗體。視需要，於兩鏈間插入連接子(通常為胜肽)使其能適當摺疊並創造出活性結合位。
單域抗體，亦稱為奈米抗體(nanobody)，為由單一單體可變抗體區所組成的抗體片段。在一具體實例中，單域抗體為重鏈抗體之可變區(V H)。這些係稱為VHH片段。如同完整抗體，單域抗體能選擇性與一特定抗原結合。第一個單域抗體係從駱駝中發現的重鏈抗體經工程化。軟骨魚亦具有重鏈抗體(IgNAR，「免疫球蛋白新抗原受體」)，可從其得到稱為VNAR片段的單域抗體。另一種方法係將來自人類或小鼠之正常免疫球蛋白G IgG)的二聚體可變區分裂成單體。雖然大部分單域抗體的研究目前係以重鏈可變區為基礎，但衍生自輕鏈的奈米抗體已顯示專一與標靶表位結合。
抗體可具有任何同型。如文中所用，術語「同型」係指由重鏈恆定區基因所編碼的免疫球蛋白種類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM)。當文中提及一特定的同型，例如IgG1時，此術語不限於特定的同型序列，例如特定的IgG1序列，而是用來指出該抗體在序列上比其他同型與該同型更接近，例如IgG1。因此，例如本發明之IgG1抗體可為天然生成IgG1抗體之序列變體，包括恆定區中的變異。
在各種具體實例中，抗體為IgG1抗體，更特言之IgG1 kappa或IgG1 lambda同型(亦即 IgG1，κ、λ)、IgG2a抗體(例如IgG2a、κ、λ)、IgG2b抗體(例如IgG2b，κ、λ)、IgG3抗體(例如IgG3，κ、λ)或IgG4抗體(例如IgG4，κ、λ)。
術語「單株抗體」如文中所用係指單一分子組成物之抗體分子的製備物。單株抗體組成物係對一特定表位展現單一結合專一性和親和力。因此，術語「人類單株抗體」係指展現單一結合專一性，具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變和恆定區的抗體。人類單株抗體可藉由包括一B細胞之雜交瘤來產生，而該B細胞係從具有包括人類重鏈轉殖基因和輕鏈轉殖基因之基因體與永生化細胞融合之基因轉殖或染色體轉殖的非人類動物，例如基因轉殖小鼠得來。
術語「嵌合抗體」如文中所用，係指其中可變區係衍生自非人類物種(例如衍生自囓齒動物)且恆定區係衍生自不同的物種，例如人類之抗體。治療應用的嵌合單株抗體係經開發用以降低抗體免疫原性。術語「可變區」或「可變區域」如嵌合抗體內容中所用，係指包括免疫球蛋白重鏈和輕鏈二者之CDR和框架區的區域。嵌合抗體可藉由使用如Sambrook et al ., 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ch. 15中所述的標準DNA技術來產生。嵌合抗體可為基因上或酵素性工程化重組抗體。其係在熟習技術者所知的產生嵌合抗體範圍內，且因此，產生根據本發明之嵌合抗體可藉由文中所述之外的其他方法來進行。
術語「人源化抗體」如文中所用，係指基因上工工程化非人類抗體，其係含有人類恆定區和經修飾用於含有高程度與人類可變區序列同源性之非人類可變區。此項可藉由將六個共同形成抗原結合位之非人類抗體互補決定區(CDR)嫁接至同源人類受體框架區(FR)來達成(參見WO92/22653和EP0629240)。為了完全重建親代抗體之結合親和力和專一性，可能需要將來自親代抗體(亦即非人類抗體)的框架殘基以人類框架區(回復突變)取代。結構同源性模擬可幫助鑑別框架區中對抗體結合性質具重要性的胺基酸殘基。因此，人源化抗體可包括非人類CDR序列，視需要係包括一或多個胺基酸回復突變成非人類胺基酸序列之主要人類框架區，以及全人類恆定區。視需要，可應用另外的胺基酸修飾(不一定為回復突變)，得到具有較佳特性，例如親和力和生化性質之人源化抗體。
術語「人類抗體」如文中所用，係指具有衍生自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區和恆定區的抗體。人類抗體可包括非人類生殖系免疫球蛋白序列所編碼的胺基酸殘基(例如，藉由活體外逢機或定點誘變或藉由活體內體細胞突變所導入的突變)。然而，術語「人類抗體」如文中所用，不希望包括其中衍生自另外哺乳動物物種，例如小鼠或大鼠之生殖系的CDR序列已嫁接至人類框架序列的抗體。人類單株抗體可藉由各種技術來製造，包括習用的單株抗體法，例如Kohler和Milstein , Nature256：495 (1975)之標準體細胞雜交技術。雖然體細胞雜交法為較佳的，但基本上，可應用其他製造單株抗體的技術，例如病毒或B-淋巴細胞之致癌轉化或使用人類抗體基因庫的噬菌體展現技術。適用於製備分泌人類單株抗體之雜交瘤的動物系統為鼠類系統。小鼠中雜交瘤產生為一完全建立之方法。用於分離融合用之免疫脾細胞的免疫法和技術已為本項技術所知。融合夥伴(例如，鼠類骨髓瘤細胞)和融合程序亦為已知的。人類單株抗體可因此，例如使用帶有部分人類免疫系統而非小鼠或大鼠系統之基因轉殖或染色體轉殖小鼠或大鼠來產生。因此，在一具體實例中，人類抗體係從帶有人類生殖系免疫球蛋白序列取代動物的免疫球蛋白序列之基因轉殖動物，例如小鼠或大鼠所獲得。在此等具體實例中，抗體係源自於導入動物中的人類生殖系免疫球蛋白序列，但最終的抗體序列為該人類生殖系免疫球蛋白序列進一步被體細胞超突變修飾及由內生性動物抗體機制之親和力成熟的結果，參見，例如Mendez et al. 1997 Nat Genet. 15(2)：146-56。
當用於文中，除非內容為矛盾的，否則術語「Fab-臂」、「結合臂」或「臂」係包括重鏈-輕鏈對且在文中可與「半-分子」交換使用。
術語「全長」當用於抗體的內容中時，係指非片段的抗體，但含有在正常自然界中發現的同型之特定同型的所有區域，例如IgG1抗體之VH、CH1、CH2、CH3、絞鏈、VL和CL區。
當用於文中時，除非內容為矛盾的，否則術語「Fc區」係指由免疫球蛋白重鏈的二條Fc序列所組成的抗體區，其中該Fc序列係包括至少一絞鏈區，CH2區和CH3區。
如文中所用，術語「結合」或「能結合」在抗體與預定的抗原或表位結合的內容中，當使用生物膜干涉技術(Bio-Layer Interferometry)(BLI)，或例如，當使用表面電漿共振(SPR)技術以BIAcore 3000儀器使用抗原作為配體及抗體作為分析物測定時，典型地為以相當約10 ‑7M或更低，例如約10 ‑8M或更低，例如約10 ‑9M或更低，約10 ‑10M或更低，或約10 ‑11M或甚至更低之K D的親和力結合。抗體與預定抗原或表位結合的對應K D親和力，比其對於與預定抗原或密切相關抗原以外的非專一性抗原(例如，BSA、酪蛋白)結合的親和力至少低10倍，例如至少低100倍，例如至少低1,000倍，例如至少低10,000倍，例如至少低100,000倍。親和力較低之量係依照抗體的K D，使得當抗體的K D為非常低時(亦即，此抗體為高專一性)，則對抗原的親和力之程度係低於非專一性抗原之親和力可能至少10,000倍。
術語「k d」(sec ‑1)， 如文中所用，係指特定抗體-抗原相互作用之解離速率常數。該數值亦稱為k off值。
術語「K D」(M)，如文中所用，係指特定抗體-抗原相互作用之解離平衡常數。
本發明亦設想包括文中所描述抗體之VL區、VH區或一或多個CDR的功能性變體之抗體。用於本文中一抗體之VL、VH或CDR的功能性變體仍能讓抗體保留至少一實質比例(至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或更高)的「參照」或「親代」抗體之親和力及/或專一性/選擇性，且在某些情況下，此一抗體可能與大於親代抗體的親和力、選擇性及/或專一性有關。
此等功能性變體典型地係保留顯著的親代抗體之序列同一性。
示例性的變體包括該等主要藉由保守性取代而與親代抗體的VH及/或VL及/或CDR區不同的變體；例如變體中至高10個，例如9、8、7、6、5、4、3、2或1個取代為保守性胺基酸殘基置換。
文中所述的抗體序列之功能性變體，例如VL區，或VH區，或與文中所述的抗體序列具有特定程度的同源性或同一性之抗體序列，例如VL區，或VH區，較佳地在非CDR序列包括修飾或變異，而CDR序列較佳地仍保持不變。.
除非內容為矛盾的，否則術語「專一性」如文中所用希望係具有下列意義。若與相同的抗原和相同的表位結合，則二個抗體具有「相同的專一性」。
術語「競爭」可指第一抗體和第二抗體之間競爭與相同抗原結合。另外，「競爭」亦可指抗體和內生性配體之間競爭與對應的內生性配體之受體結合。若一抗體防止了內生性配體與其受體結合，則此一抗體被認為是阻斷配體與其受體之內生性相互作用且因此係與內生性配體相互競爭。如何檢測抗體與目標抗原結合之競爭已為熟習本項技術者所熟知。此一方法的實例為所謂的交叉競爭分析，其可，例如以ELISA或以流式細胞術來進行。另一種選擇，競爭可使用生物膜干涉技術來測定。
競爭與目標抗原結合的抗體可結合抗原上不同的表位，其中該等表位為彼此足夠靠近使得第一抗體與一表位結合而防阻了第二抗體與另外的表位結合。在其他的情況中，然而，二個不同的抗體可能與抗原上的相同表位結合且在一競爭結合分析中可能競爭結合。此等與相同表位結合的抗體在文中係視為具有相同專一性。因此，在一具體實例中，與相同表位結合的抗體係視為與目標分子上的相同胺基酸結合。與目標抗原上的相同表位結合之抗體可藉由熟習本項技術者已知的標準丙胺酸掃描實驗或抗體-抗原結晶化實驗來測定。較佳地，與不同表位結合的抗體或結合區不會相互競爭和其個別的表位結合。
如上所述，各種抗體模式已描述於本項技術中。本發明之結合劑基本上可包括任何同型的抗體。同型的選擇典型地將由所欲的Fc-媒介效應子功能來引導，例如ADCC引發，或要求缺乏Fc-媒介的效應子功能之抗體(「惰性」抗體)。示例的同型有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可使用人類輕鏈恆定區、κ或λ。本發明之抗體的效應子功能可藉由同型互換來改變，例如，各種治療用途之IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗體。在一具體實例中，本發明抗體之二條重鏈為IgG1同型，例如IgG1，κ的二條重鏈。視需要，重鏈可如文中他處所述在絞鏈及/或CH3區經修飾。
較佳地，各抗原結合區或區域係包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，且其中該可變區各自係包括三個CDR序列，分別為CDR1、CDR2和CDR3，及四個框架序列，分別為FR1、FR2、FR3和FR4。再者，抗體係包括二個重鏈恆定區(CH)，和二個輕鏈恆定區(CL)。
在一具體實例中，結合劑係包括全長抗體，例如全長IgG1抗體。
在其他的具體實例中，結合劑係包括抗體片段，例如Fab’或Fab片段、由VL、VH、CL和CH1區組成的單價片段、如WO2007059782中所述的單價抗體(Genmab)、F(ab') 2片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、駱駝化或奈米抗體，或分離的互補決定區(CDR)。
術語「結合劑」在本發明內文中係指任何能與所欲的抗原結合之藥劑。在本發明特定的具體實例中，結合劑為或包括抗體、抗體片段或任何其他結合蛋白或其任何組合。
術語「結合基團」在本發明內文中係指能與所欲的抗原結合之任何基團、基群或區域。在本發明特定的具體實例中，結合基團為或包括一抗體、抗體片段或任何其他結合蛋白或其任何組合。
天然生成的抗體一般為單專一性，亦即其係與單一抗原結合。本發明係描述結合劑，例如，與例如主要目標和第二靶向基團上的不同表位結合之標簽化合物。此等結合劑為至少雙專一性或多專一性，例如三專一性、四專一性等等。因此，結合劑可包括二或更多個文中所述的抗體或其片段。特言之，文中所述的結合劑可為由二個不同抗體、抗體和不同抗體片段，以及二個不同抗體片段組成的人工蛋白(該二個不同抗體的片段形成二個結合區)。
根據本發明，雙專一性結合劑，特言之，雙專一性蛋白，例如雙專一性抗體為具有二個不同結合專一性之分子因此可與二個表位結合。特言之，術語「雙專一性抗體」如文中所用係指包括二個抗原結合位之抗體，第一個結合位對第一表位具有親和力而第二結合位對不同於第一表位的第二表位具有結合親和力。
術語「雙專一性」在本發明內文中，係指具有二個與不同表位結合的不同抗原結合區。
「多專一性結合劑」為具有二個以上不同結合專一性的分子。
許多雙專一性抗體的模式和用途已為本項技術所知，且請參閱Kontermann; Drug Discov Today, 2015 Jul; 20(7)：838-47及；MAbs, 2012 Mar-Apr；4(2): 182-97。
根據本發明之雙專一性結合劑不限於特定的雙專一性模式或其製造方法。
可用於本發明之雙專一性抗體分子的實例包括(i)具有二臂包括不同抗原結合區之單一抗體；(ii)對二個不同表位具有專一性的單鏈抗體，例如，經由二個scFvs以串聯與額外的胜肽連接子連接；(iii)雙可變區抗體(DVD-Ig)，其中各輕鏈和重鏈含有二個可變區經由短胜肽鍵連串聯(Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig™) Molecule, In: Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010))；(iv)化學連接的雙專一性(Fab’)2片段；(v)串聯抗體(Tandab)，其為二個單鏈雙抗體融合產生四價雙專一性抗體，對各目標抗原具有二個結合位；(vi)彈性抗體(flexibody)，其為scFvs與雙抗體組合，產生一多價分子；(vii)所謂的「dock and lock」分子，以蛋白激酶A中的二聚化和對接區為基礎，當用於Fab時，可產生由二個相同Fab片段與不同Fab片段相連結所組成的三價雙專一性結合蛋白；(viii)所謂的蠍子分子(Scorpion molecule)，其係包括，例如，二個scFvs與人類Fab-臂二端融合；及(ix)雙抗體。
術語「雙專一性抗體」係包括雙抗體(diabody)。雙抗體為二價、雙專一性抗體，其中VH和VL區係表現在單一多肽鏈上，但使用極短的連接子使其無法在相同鏈上的二個區之間配對，藉此迫使該區與其他鏈的互補區配對而製造出二個抗原結合位(參見，例如Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448；Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2：1121-1123)。雙專一性抗體亦包括雙專一性單鏈抗體。術語「雙專一性單鏈抗體」係指包括二個結合區的單一多肽鏈。特言之，術語「雙專一性單鏈抗體」或「單鏈雙專一性抗體」或相關術語依照本發明較佳地係指在一全免疫球蛋白中缺乏恆定區及/或Fc部分存在的單一多肽鏈中由連接至少二個抗體可變區所產生的抗體結構，例如，雙專一性單鏈抗體可為具有總計二個抗體可變區之結構，例如二個VH區，其各自能專一與個別的表位結合，並經由短段多肽間隔子彼此相連接，使得二個抗體可變區與插入的間隔子係以單一連續的多肽鏈存在。雙專一性單鏈抗體的另外實例可為具有三個抗體可變區之單一多肽鏈。本處，二個抗體可變區，例如VH和VL，可組成scFv，其中二個抗體可變區係經由合成的多肽連接子彼此相連接，後者通常係經基因工程化使得免疫原性最小化而同時保持對蛋白水解最大阻抗。此scFv能專一與特定的表位結合，及與另外的抗體可變區相連接，例如VH區，該VH區能與不同於被scFv結合的表位結合。又雙專一性單鏈抗體的另外實例可為具有四個抗體可變區之單一多肽鏈。本處，前二個抗體可變區，例如VH區和VL區，可形成能與表位結合的scFv，而第二VH區和VL區可形成能與另外表外結合的第二scFv。在單一連續多肽鏈內，專一性之個別抗體可變區可有利地被合成的多肽連接子隔開，而個別的scFvs可有利地被上述的短多肽間隔子隔開。根據一具體實例，雙專一性抗體的第一結合區係包括抗體可變區，較佳地VHH區。根據本發明一具體實例，雙專一性抗體的第一結合區係包括二個抗體可變區，較佳地scFv，亦即VH-VL或VL-VH。根據本發明一具體實例，雙專一性抗體之第二結合區係包括一抗體可變區，較佳地VHH區。根據本發明一具體實例，雙專一性抗體之第二結合區係包括二個抗體可變區，較佳地scFv，亦即VH-VL或VL-VH。在其最小的形式中，根據本發明之雙專一性抗體中抗體可變區的總數因此僅為二個。例如，此一抗體可能包括二個VH或二個VHH區。根據一具體實例，雙專一性抗體的第一結合區和第二結合區各自係包括一個抗體可變區，較佳地VHH區。根據一具體實例，雙專一性抗體的第一結合區和第二結合區各自係包括二個抗體可變區，較佳地scFv，亦即VH-VL或VL-VH。在此具體實例中，該結合劑較佳地係包括(i)第一抗體之重鏈可變區(VH)，(ii)第一抗體之輕鏈可變區(VL)，(iii) 第二抗體之重鏈可變區(VH)及(iv)第二抗體之輕鏈可變區(VL)。
在一具體實例中，根據本發明雙專一性抗體係包括二個各自係針對不同表位的Fab區。在一具體實例中，本發明之分子為抗原結合片段(Fab)2複合物。該Fab2複合物係由包含Fv區，亦即對表位具專一性的VH和VL區之Fab片段，及另一包括對另外表位具專一性的Fv區之Fab片段所組成。各Fab片段可由二條單鏈，VL-CL模組和VH-CH模組所組成。另外，各個別的Fab片段可以單鏈排列，較佳地，VL-CL-CH-VH，且個別的可變區和恆定區可經胜肽連接子相連接。
在一具體實例中，根據本發明結合劑係包括各種類型的二價和三價單鏈可變片段(scFv)，模擬二個抗體之可變區的融合蛋白。二價單鏈可變片段(二-scFv，雙-scFv)可藉由連接二個scFv加以工程化。此項可藉由以二個VH和二個VL區製造一單胜肽鏈，產生串聯的scFv來進行。本發明亦包括：包含二個以上scFv結合區之多專一性分子。
另一個可能性為以對二個可變區而言為太短的連接子胜肽製造scFvs，使其無法摺疊一起(大約5個胺基酸)，而迫使scFv二聚化。此類型係稱為雙抗體。又較短的連接子(1或2個胺基酸)導致三聚物形成，所謂的三抗體。亦有產生四抗體。其對於其標靶比雙抗體展現更高的親和力。
特佳的雙專一性抗體之實例為雙抗體(Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772)，其為小的雙價和雙專一性抗體片段。雙抗體係在藉由胜肽連接子相連接的相同多肽鏈(VH-VL)上包括一重鏈可變區(VH)和一輕鏈可變區(VL)，而該連接子太短而無法在相同鏈上的二個區之間配對。此舉迫使與另鏈的互補區配對並促進帶有二個功能性抗原結合位的二聚體分子組合。
在一具體實例中，根據本發明雙專一性或多專一性分子係包括免疫球蛋白的可變區(VH，VL)和恆定區(C)。在一具體實例中雙專一性分子為一微型抗體(minibody)，較佳地，包括二條單一VH-VL-C鏈經由各鏈的恆定區(C)相互連接之微型抗體。根據此方面，對應的可變重鏈區(VH)，對應的可變輕鏈區(VL)和恆定區(C)從N端至C端係以下列順序排列：VH(表位1)-VL(表位1)-(C)和VH(表位2)-VL(表位2)-C，其中C較佳地為CH3區，表位1係指第一表位而表位2係指第二表位。恆定區配對使得微型抗體形成。
根據另外方面，本發明之雙專一性結合劑為雙專一性單鏈抗體結構的模式，由此該結構係包括或由至少二個結合區所組成。在一具體實例中，各結合區係包括來自抗體重鏈的可變區(「VH區」)，其中第一結合區的VH係專一與表位1結合，而第二結合區的VH區係專一與表位2結合。二個結合區視需要係藉由短的多肽間隔子相連接。各結合區可另外包括來自抗體輕鏈的可變區(「VL區」)，各第一和第二結合區內的VH區和VL區係經由長度足夠而能使第一結合區的VH區和VL區和第二結合區的VH區和VL區彼此相互配對之多肽連鏈相互連接。
在一具體實例中，文中所述的結合劑係包括一包含第一結合區的抗體，例如，全長抗體。在一具體實例中，文中所述的結合劑係包括包含第二結合區的抗體片段，例如scFv或VHH，其係與包含第一結合區的抗體共價連接。在一具體實例中，該結合劑係包括與抗體的輕鏈或重鏈之N端或C端共價連接之抗體片段，例如scFv或VHH。 核酸
術語「多核苷酸」或「核酸」，如文中所用希望係包括DNA和RNA，例如基因體DNA、cDNA、mRNA、重組製造的和化學合成的分子。核酸可為單股或雙股。RNA係包括活體外轉錄的RNA(IVT RNA)或合成的RNA。根據本發明，多核苷酸較佳地為分離的。
核酸可能包括在一載體中。術語「載體」如文中所用係包括任何熟習技術者已知的任何載體，包括質體載體，黏粒載體，噬菌體載體例如λ噬菌體，病毒載體例如反轉錄病毒、腺病毒或桿狀病毒載體，或人工染色體載體例如細菌人工染色體(BAC)、酵母菌人工染色體(YAC)或P1人工染色體(PAC)。該等載體係包括表現以及選殖載體。表現載體係包括黏粒以及病毒載體且通常係含有所欲的編碼序列和用於在一特定的宿主生物(例如，細菌宿主、植物、昆蟲或哺乳動物)或活體外表現系統中表現操作上連接此編碼序列的適當DNA序列。選殖載體通常係用來工程化和增幅特定的所欲DNA片段且可能缺乏表現該所欲DNA片段所需之功能序列。
在本發明所有方面之一具體實例中，文中所述編碼標簽化合物之RNA係表現於所治療的對象之細胞中，用以提供該標簽化合物。若一標簽化合物係包括一條以上的多肽鏈，則不同的多肽鏈可由相同或不同的RNA分子來編碼。
文中所述的核酸可為重組的及/或分離的分子。
在本文中，術語「RNA」係關於包括核糖核苷酸殘基之核酸分子。在較佳的具體實例中，RNA係含有所有或大多數核糖核苷酸殘基。如文中所用，「核糖核苷酸」係指在β-D-呋喃核糖基基團的2’-位置具有羥基基團的核苷酸。術語「核糖核苷酸」係關於在β-D-呋喃核糖基基團的2’-位置具有羥基基團的核苷酸。RNA係包括，不限於雙股RNA，單股RNA，分離的RNA，例如部分或完全純化的RNA，基本上純的RNA，合成的RNA和重組產生的RNA，以及藉由添加、刪除、取代及/或改變一或多個核甘酸而與天然生成的RNA不同之修飾的RNA。此等改變可指於內部RNA核苷酸或於RNA的末端添加非核苷酸物質。文中亦涵蓋RNA分子中的核苷酸可為非標準核苷酸，例如化學合成的核苷酸或去氧核苷酸。就本文，這些經改變的RNA可視為天然生成RNA的類似物。
在本文之特定的具體實例中，該RNA為信使-RNA(mRNA)，其係關於編碼一胜肽或蛋白之RNA轉錄。如本項技術中所建立的，mRNA一般係含有5'未轉譯區(5'-UTR)，蛋白編碼區，3'未轉譯區(3'-UTR)。在某些具體實例中，mRNA可藉由活體外轉錄或化學合成來產生。在一具體實例中，該mRNA係藉由活體外轉錄使用DNA模板所產生，其中DNA係指含有去氧核糖核苷酸的核酸。
在一具體實例中，RNA為活體外轉錄的RNA(IVT-RNA)並可藉由活體外一適當的DNA模板之轉錄來獲得。用於控制轉錄的啟動子可為任何用於任何RNA聚合酶之啟動子。用於活體外轉錄的DNA模板可藉由選殖核酸，尤其是cDNA，並將其導入適合活體外轉錄的載體來獲得。cDNA可藉由反轉錄RNA來獲得。
在本文特定的具體實例中，該RNA為「複製子RNA」或簡稱「複製子」，尤其是「自我複製RNA」或「自我增幅RNA」。在一特佳的具體實例中，該複製子或自我複製RNA係衍生自或包括衍生自ssRNA病毒之元件，尤其是正股ssRNA病毒，例如α病毒。α病毒係於受感染細胞的細胞質中複製(就α病毒的生命週期請參見José et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837–856)。典型地許多α病毒的總基因體長度範圍係介於11,000至12,000個核苷酸之間，而基因體RNA典型的係具有5’端帽和3’ poly(A)尾部。α病毒的基因體係編碼非結構蛋白(涉及病毒RNA之轉錄、修飾和複製及蛋白修飾)和結構蛋白(形成病毒粒)。在基因體中典型地有二個開放閱讀框(ORF)。四個非結構蛋白(nsP1–nsP4)典型地係由第一ORF開頭靠近基因體5′端共同編碼，而α病毒結構蛋白係由在第一ORF下游發現並延伸靠近基因體3’端的第二ORF所共同編碼。典型的，第一ORF係大於第二ORF，比率大約為2：1。在受α病毒感染的細胞中，僅編碼非結構蛋白的核酸序列從基因體RNA轉譯，而編碼結構蛋白的基因訊息可從次基因體轉錄來轉譯，其為類似真核生物信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111–124)。在感染後，亦即病毒生命週期的早期，(+)股基因體RNA如信使RNA直接行動，進行編碼非結構性多蛋白之開放閱讀框的轉譯(nsP1234)。α病毒衍生的載體已提出用於遞送外來基因訊息至目標細胞或目標生物體。以簡單方法，將編碼α病毒結構蛋白之開放閱讀框以編碼一感興趣蛋白之開放閱讀框替代。以α病毒為基礎的複製轉移系統係依靠在二個分開的核酸分子上的α病毒核苷酸序列元件：核酸分子係編碼病毒的複製酶(典型地為多蛋白nsP1234)，而另一核酸分子能藉由該複製酶轉移複製(因此稱為複製轉移系統)。在特定的宿主T細胞中複製轉移需要這二種核酸分子存在。能藉由複製酶轉移複製的核酸分子必須包括特定的α病毒序列元件才能識別及藉由α病毒複製酶合成RNA。
在一具體實例中，文中所述的RNA可具有修飾的核苷。在某些具體實例中，RNA係包括修飾的核苷取代至少一個(例如每一個)尿苷。
術語「尿嘧啶」，如文中所用，係描述可能發生在RNA核酸中的其中一個核鹼基。尿嘧啶的結構為：
Figure 02_image001
。
術語「尿苷」，如文中所用，係描述可能發生在RNA中的其中一個核甘酸。尿苷的結構為：
Figure 02_image003
。
UTP(尿苷5’-三磷酸)具有下列結構：
Figure 02_image005
。
假-UTP(假尿苷5’-三磷酸)具有下列結構：
Figure 02_image007
。
「假尿苷」為一修飾的核苷酸之實例，其為尿苷的異構物，其中尿嘧啶係經由碳-碳鍵取代氮-碳糖苷鍵與戊糖環連結。
另外的示例性修飾核苷為N1-甲基-假尿苷(m1Ψ)，其係具有下列結構：
Figure 02_image009
。
N1-甲基-假-UTP具有下列結構：
Figure 02_image011
。
另外的示例性修飾核苷為5-甲基-尿苷(m5U)，其係具有下列結構：
Figure 02_image013
。
在某些具體實例中，文中所述之RNA中的一或多個尿苷係經修飾的核苷酸置換。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸為修飾的尿苷。
在某些具體實例中，RNA係包括修飾的核苷酸替代至少一尿苷。在某些具體實例中，RNA係包括修飾的核苷酸替代各尿苷。
在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係包括假尿苷(ψ)。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係包括N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係包括5-甲基-尿苷(m5U)。在某些具體實例中，RNA可包括一種以上的修飾核苷酸，且該修飾的核苷酸係獨立地選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係包括假尿苷(ψ)和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係包括假尿苷(ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係包括N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在某些具體實例中，該修飾的核苷酸係包括假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在某些具體實例中，替代一或多個，例如，全部RNA中的尿苷之修飾的核苷酸可為一或多個3-甲基-尿苷(m 3U)、5-甲氧基-尿苷(mo 5U)、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-尿苷(s 2U)、4-硫基-尿苷(s 4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho 5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo 5U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo 5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm 5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羥基甲基-尿苷(chm 5U)、5-羧基羥基甲基-尿苷甲基酯(mchm 5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm 5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫基-尿苷(mcm 5s 2U)、5-胺基甲基-2-硫基-尿苷(nm 5s 2U)、5-甲基胺基甲基-尿苷(mnm 5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硫基-尿苷(mnm 5s 2U)、5-甲基胺基甲基-2-硒基-尿苷(mnm 5se 2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm 5U)、5-羧基甲基胺基甲基-尿苷(cmnm 5U)、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基-尿苷(cmnm 5s 2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-尿苷(τm 5U)、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫基-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸基甲基-4-硫基-假尿苷)、5-甲基-2-硫基-尿苷(m 5s 2U)、1-甲基-4-硫基-假尿苷(m 1s 4ψ)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m 3ψ)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脫氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-脫氮-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m 5D)、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧基丙基)尿苷(acp 3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧基丙基)假尿苷(acp 3ψ)、5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm 5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫基-尿苷(inm 5s 2U)、α-硫基-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m 5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫基-2′-O-甲基-尿苷(s 2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm 5Um)、5-胺甲醯基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm 5Um)、5-羧基甲基胺基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm 5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m 3Um)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm 5Um)、1-硫基-尿苷、去氧胸腺苷、2′-F-阿拉伯糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基胺基)尿苷，或任何本項技術中已知的其他修飾尿苷。
在一具體實例中，RNA係包括其他修飾的核苷酸或包括另外的修飾核苷酸，例如，修飾的胞苷。例如，在一具體實例中，在RNA中係以5-甲基胞苷部分或完全取代，較佳地完全取代胞苷。在一具體實例中，RNA係包括5-甲基胞苷和一或多個選自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一具體實例中，RNA係包括5-甲基胞苷和N1-甲基-假尿苷(m1ψ)。在某些具體實例中，RNA係包括5-甲基胞苷替代胞苷及N1-甲基-假尿苷(m1ψ)替代尿苷。
在某些具體實例中，根據本文之RNA係包括一5’端帽。在一具體實例中，本文之RNA不具有未加帽的5'-三磷酸。在一具體實例中，RNA可經5'-端帽類似物修飾。術語「5'-端帽」係指在mRNA分子5'-端所發現的結構且一般係由鳥嘌呤核苷酸經由5'-對5'-三磷酸鍵連與mRNA相連接所組成。在一具體實例中，此鳥苷係在7-位置經甲基化。帶有5'-端帽或5'-端帽類似物的RNA可藉由活體外轉錄來提供，其中5'-端帽係共轉錄表現於RNA股，或可使用加帽酵素轉錄後連接RNA。
在某些具體實例中，用於RNA的建構單元端帽為m 2 7,3’-OGppp(m 1 2’-O)ApG(有時候亦稱為m 2 7,3`OG(5’)ppp(5’)m 2’-OApG)，其係具有下列結構：
Figure 02_image015
。
下列為包括RNA和m 2 7,3`OG(5’)ppp(5’)m 2’-OApG之示例的Cap1 RNA：
Figure 02_image017
。
下列為另一示例性的Cap1 RNA(無端帽類似物)：
Figure 02_image019
.
在某些具體實例中，該RNA係經「Cap0」結構修飾，使用，在一具體實例中，具有下列結構之端帽類似物抗-反向端帽(ARCA Cap (m 2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G))：
Figure 02_image021
。
下列為一包括RNA和m 2 7,3`OG(5’)ppp(5’)G之示例性的Cap0 RNA：
Figure 02_image023
。
在某些具體實例中，「Cap0」結構係使用具有下列結構之端帽類似物β-S-ARCA (m 2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)所產生：
Figure 02_image025
。
下列為包括β-S-ARCA (m 2 7,2`OG(5’)ppSp(5’)G)和RNA之示例的Cap0 RNA：
Figure 02_image027
。
β-S-ARCA的「D1」非對映異構物或「β-S-ARCA(D1)」，相較於β-S-ARCA的D2非對映異構物(β-S-ARCA(D2))，為HPLC管柱上首先溶析的β-S-ARCA非對映異構物且因此具有較短的滯留時間(參照WO 2011/015347，以引用的方式併入本文)。
特佳的端帽為β-S-ARCA(D1)(m 2 7,2'-OGppSpG)或m 2 7,3’-OGppp(m 1 2’-O)ApG。
在某些具體實例中，根據本文之RNA係包括 5'-UTR及/或3'-UTR。術語「非轉譯區」或「UTR」係關於DNA分子中的區域，其係經轉錄但未轉譯成一胺基酸序列，或係關於RNA分子，例如mRNA分子中的對應的區域。非轉譯區(UTR)可為當前的開放閱讀框之5’端(上游)(5’-UTR)及/或開放閱讀框之3’端(下游)(3’-UTR)。5’-UTR若存在，係位於5'端，蛋白編碼區之開始密碼子的上游。5’-UTR為5’端帽(若存在的話)的下游，例如直接與5’端帽相鄰。3’-UTR，若存在，係位於3'端，蛋白編碼區之終止密碼子的下游，但術語「3’-UTR」較佳地不包括poly(A)序列。因此，3’-UTR為poly(A)序列(若存在的話)之上游，例如直接與poly(A)序列相鄰。
在某些具體實例中，RNA係包括5’-UTR，而該5’-UTR係包括SEQ ID NO：1核苷酸序列，或與SEQ ID NO：1核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%同一性的核苷酸序列。
在某些具體實例中，RNA係包括3’-UTR，而該3’-UTR係包括SEQ ID NO：2或3核苷酸序列，或與SEQ ID NO：2或3核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%或80%同一性的核苷酸序列。
特佳的5’-UTR係包括SEQ ID NO：之1核苷酸序列。特佳的3’-UTR係包括SEQ ID NO：2或3之核苷酸序列。
在某些具體實例中，根據本文RNA係包括3'-poly(A)序列。
如文中所用，術語「poly(A)序列」或「poly(A)尾」係指不間斷或間斷的腺苷酸殘基序列，其典型地係位於RNA分子的3'端。Poly(A)序列已為熟習本項技術者所知並可接在文中所述的RNA中3’-UTR之後。不間斷的poly(A)序列其特徵為連續的腺苷酸殘基。自然界中，不間斷的poly(A)序列為典型的。文中所揭示的RNA可具有在轉錄後藉由模板依賴的RNA聚合酶連附至游離的RNA 3'端之poly(A)序列，或由DNA編碼及由模板依賴的RNA聚合酶轉錄的poly(A)序列。
已驗證，大約120個A核苷酸的poly(A)序列在轉染的真核細胞中對於RNA的量，以及對於從一存在poly(A)序列上游(5’)之開放閱讀框轉譯的蛋白量，具有有利的影響( Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017)。
poly(A)序列可為任何長度。在某些具體實例中，poly(A)序列係包括，基本上由或由至少20個，較佳地至少30個，較佳地至少40個，較佳地至少80個，較佳地至少100個及至高500個，至高400個，至高300個，至高200個，或至高150個A核苷酸，及尤其是約120個A核苷酸所組成。在此語境中「基本上由…組成」係指poly(A)序列中大多數的核苷酸，典型地至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%或至少99%之poly(A)序列中的核苷酸數目為A核苷酸，但允許其餘的核苷酸為A核苷酸以外的核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鳥苷酸)，C核苷酸(胞苷酸)。在此語境中「由…組成」係指poly(A)序列中所有的核苷酸，亦即poly(A)序列中的核苷酸數目100%為A核苷酸。術語「A核苷酸」或「A」係指腺苷酸。
在某些具體實例中，poly(A)序列係在RNA轉錄期間連接，亦即活體外轉錄的RNA之製備期間，以在編碼股的互補股中包括重複的dT核苷酸(去氧胸苷酸)之DNA模板為基礎。編碼poly(A)序列之DNA序列(編碼股)係稱為poly(A)卡匣。
在某些具體實例中，存在DNA編碼股的poly(A)卡匣基本上係由dA核苷酸所組成的，但其中插入四種核苷酸(dA、dC、dG、dT)之隨機序列。此等隨機序列長度可為5至50個，10至30個，或10至20個核苷酸。此一卡匣係揭示於WO 2016/005004 A1中，其係以引用的方式併入。任何揭示於WO 2016/005004 A1的poly(A)卡匣皆可用於本發明中。基本上由dA核苷酸所組成的，但其中插入具有相同分布的四種核苷酸(dA、dC、dG、dT)之隨機序列並具有長度例如5至50個核苷酸的poly(A)卡匣顯示，在DNA量上，在大腸桿菌( E.coli)中質體DNA的常量增殖，且在RNA量上，仍與有關支持RNA安定性和轉譯效能的有利性質相關。因此，在某些具體實例中，包含在文中所述的RNA分子中之 poly(A)序列基本上係由A核苷酸所組成，但其中插入一個四種核苷酸(A、C、G、U)之隨機序列。此隨機序列的長度可為5至50個，10至30個，或10至20個核苷酸。
在某些具體實例中，在其3'-端poly(A)序列的側邊並無任何A核苷酸以外的核苷酸，亦即，poly(A)序列在其3'端不會遮蔽或跟隨A以外的核苷酸。
在某些具體實例中，poly(A)序列可包括至少20個，至少30個，至少40個，至少80個，或至少100個及至高500個，至高400個，至高300個，至高200個或至高150個核苷酸。在某些具體實例中，poly(A)序列基本上可由至少20個，至少30個，至少40個，至少80個或至少100個及至高500個，至高400個，至高300個，至高200個或至高150個核苷酸所組成。在某些具體實例中，poly(A)序列可由至少20個，至少30個，至少40個，至少80個或至少100 個及至高500個，至高400個，至高300，至高200個或至高150個核苷酸所組成。在某些具體實例中，poly(A)序列係包括至少100個核苷酸。在某些具體實例中，poly(A)序列係包括大約150個核苷酸。在某些具體實例中，poly(A)序列係包括大約120個核苷酸。
在某些具體實例中，RNA係包括包含SEQ ID NO：4核苷酸序列，或與SEQ ID NO：4核苷酸序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%,或80%同一性之核苷酸序列的poly(A)序列。
特佳的poly(A)序列係包括SEQ ID NO：4之核苷酸序列。
根據本文，標簽化合物較佳地係以單股、5'‑加帽mRNA來投予，其在進入投予該RNA之對象的細胞後，轉譯成個別蛋白。 較佳地，該RNA係含有就有關穩定性和轉譯效能之RNA最大效用進行最適化的結構元件(5'‑端帽，5'‑UTR，3'‑UTR，poly(A)序列)。
在一具體實例中，係利用β-S-ARCA(D1)作為在RNA之5'-端的特定加帽結構。在一具體實例中，係利用m 2 7,3’-OGppp(m 1 2’-O)ApG作為在RNA之5'-端的特定加帽結構。在一具體實例中，5'-UTR序列係衍生自人類α-血球蛋白mRNA且視需要具有最適化的「Kozak序列」用以增加轉譯效能。在一具體實例中，將二個衍生自「分裂的胺基端增強子」(AES) mRNA(稱為F)和粒線體編碼的12S核糖體RNA(稱為I)的序列元件之組合置於編碼序列和poly(A)序列間，用以確保較高的最大蛋白量及延長mRNA的持久性。這些係藉由活體外選擇賦予RNA安定性及擴大總蛋白表現之序列方法來鑑別(參見WO 2017/060314，以引用的方式併入文中)。在一具體實例中，將二個衍生自人類β-血球蛋白mRNA之重複的3'-UTR放置於編碼序列和poly(A)之間，用以確保較高的最大蛋白量及延長mRNA的持久性。在一具體實例中，使用量測長度110個核苷酸的poly(A)序列，其係由一段30個腺苷酸殘基，接著10個核苷酸的連接子序列及另外70個腺苷酸殘基所組成。此poly(A)序列係經設計用來增強RNA安定性和轉譯效能。
在本發明所有方面之一具體實例中，編碼標簽化合物的RNA係表現在所治療對象的細胞中，用以提供該標簽化合物。在本發明所有方面之一具體實例中，該RNA係過渡性表現在該對象的細胞中。在本發明所有方面之一具體實例中，該RNA係於活體外轉錄RNA。在本發明所有方面之一具體實例中，表現的該標簽化合物係進入胞外空間，亦即分泌標簽化合物。
在本文內容中，術語「轉錄」係關於一種過程，其中DNA序列中的基因碼係轉錄成RNA。隨後，該RNA可轉譯成胜肽或蛋白。
根據本發明，術語「轉錄」係包括「活體外轉錄」，其中術語「活體外轉錄」係關於一種過程，其中RNA，尤其是mRNA係於無細胞系統的活體外合成，較佳地，使用適當的細胞萃取，較佳地，選殖載體可應用於產生轉錄。這些選殖載體一般被指稱為轉錄載體且根據本發明係涵蓋在術語「載體」中。根據本發明，用於本發明的RNA較佳地為活體外轉錄的RNA(IVT-RNA)且可藉由活體外適當的DNA模板之轉錄來獲得。用於控制轉錄的啟動子可為用於任何RNA聚合酶之任何啟動子。特定的RNA聚合酶之實例為T7、T3和SP6 RNA聚合酶。較佳地，根據本發明活體外轉錄係由T7或SP6啟動子控制。用於活體外轉錄的DNA模板可藉由選殖核酸，尤其是cDNA，並將其導入供活體外轉錄的適當載體來獲得。該cDNA可藉由RNA的反轉錄來獲得。
就有關RNA，術語「表現」或「轉譯」係關於細胞核糖體中的過程，藉由該過程RNA的一股引導胺基酸序列之組裝，製造胜肽或蛋白。
在一具體實例中，投予文中所述的RNA後，例如，調配為RNA脂質粒子，至少一部分的RNA係遞送至細胞供表現。在一具體實例中，至少一部分的RNA係遞送至目標細胞的細胞溶質(cytosol)。在一具體實例中，該RNA係藉由目標細胞轉譯，產生其編碼的胜肽或蛋白。
「編碼」係指在多核苷酸中特定核苷酸序列之固有性質，例如基因，cDNA或mRNA，在生物過程作為合成其他聚合物和大分子的模板，其係具有定義核苷酸(亦即，rRNA、tRNA和mRNA)或定義胺基酸序列且該生物性質係從其所產生。因此，若對應基因之mRNA的轉錄和轉譯在細胞或其他生物系統中製造蛋白，則該基因係編碼該蛋白。編碼股，其核苷酸序列係與mRNA序列相同且通常係以序列列表提供，以及非編碼股，用作為基因或cDNA轉錄之模板，二者可稱為編碼該蛋白或該基因或cDNA之其他產物。
在一具體實例中，根據本發明所投予的編碼標簽化合物之RNA為非免疫原性的（non-immunogenic）。
術語「非免疫原性RNA」如文中所用係指在投予例如，哺乳動物後不會引發免疫系統反應之RNA，或引發比相同的RNA可能引發的反應更弱的反應，其差異僅在於該RNA未進行過賦予該非免疫原性RNA非免疫原性之修飾和處理，亦即比標準RNA(stdRNA)所引發的的反應更弱的反應。在一較佳地具體實例中，非免疫原性RNA，文中亦稱為修飾RNA(modRNA)，係藉由併入修飾的核苷酸抑制RNA-媒介的先天免疫受體活化成為該RNA並移出雙股的RNA (dsRNA)來賦予非免疫原性。
就藉由併入修飾的核苷酸賦予該非免疫原性RNA非免疫原性，可使用任何的修飾的核苷酸，只要其降低或抑制RNA的免疫原性。特佳的為抑制RNA-媒介的先天免疫受體活化之修飾核苷酸。在一具體實例中，該修飾的核苷酸係包括以包含修飾的核鹼基之核苷酸置換一或多個尿苷。在一具體實例中，該修飾的核鹼基為修飾的尿嘧啶。在一具體實例中，該包括修飾的核鹼基之核苷酸係由下列組成之群中選出：3-甲基-尿苷(m 3U)、5-甲氧基-尿苷(mo 5U)、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫基-尿苷(s 2U)、4-硫基-尿苷(s 4U)、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho 5U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo 5U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo 5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm 5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羥基甲基-尿苷(chm 5U)、5-羧基羥基甲基-尿苷甲基酯(mchm 5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm 5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫基-尿苷(mcm 5s 2U)、5-胺基甲基-2-硫基-尿苷(nm 5s 2U)、5-甲基胺基甲基-尿苷(mnm 5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基胺基甲基-2-硫基-尿苷(mnm 5s 2U)、5-甲基胺基甲基-2-硒基-尿苷(mnm 5se 2U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm 5U)、5-羧基甲基胺基甲基-尿苷(cmnm 5U)、5-羧基甲基胺基甲基-2-硫基-尿苷(cmnm 5s 2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-尿苷(τm 5U)、1-牛磺酸基甲基-假尿苷、5-牛磺酸基甲基-2-硫基-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸基甲基-4-硫基-假尿苷)、5-甲基-2-硫基-尿苷(m 5s 2U)、1-甲基-4-硫基-假尿苷(m 1s 4ψ)、4-硫基-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m 3ψ)、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脫氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-脫氮-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m 5D)、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫基-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷(acp 3U)、1-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基)假尿苷(acp 3ψ)、5-(異戊烯基胺甲基)尿苷(inm 5U)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2-硫基-尿苷(inm 5s 2U)、α-硫基-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m 5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫基-2′-O-甲基-尿苷(s 2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm 5Um)、5-胺甲醯基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm 5Um)、5-羧甲基胺甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm 5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m 3Um)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm 5Um)、1-硫基-尿苷、去氧胸苷、2′-F-阿拉伯糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿拉伯糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基) 尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基胺基)尿苷。在一特佳的具體實例中，該包括修飾的核鹼基之核苷酸為假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，尤其是N1-甲基-假尿苷。
在一具體實例中，以包括修飾的核鹼基之核苷酸置換一或多個尿苷係包括置換至少1%，至少2%，至少3%，至少4%，至少5%，至少10%，至少25%，至少50%，至少75%，至少90%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%或100%的尿苷。
在使用T7 RNA聚合酶藉由活體外轉錄(IVT)合成mRNA期間，由於酵素的非習知活性，產生大量異常產物，包括雙股RNA(dsRNA)。dsRNA引發發炎性細胞激素並活化效應子酵素，導致蛋白合成抑制。可從RNA移除dsRNA，例如IVT RNA，舉例而言，藉由離子-對逆向HPLC，使用無孔或有孔的C-18聚苯乙烯-二乙烯苯(PS-DVB)基質。另一種選擇，酵素為基礎的方法，係使用專一水解dsRNA而非ssRNA之大腸桿菌RNaseIII，藉此從IVT RNA製備物消除dsRNA污染物。再者，藉由使用纖維素物質可從ssRNA分離dsRNA。在一具體實例中，係將RNA製備物與纖維物質接觸並於允許dsRNA與纖維素物質結合且不允許ssRNA與纖維素結合的條件下，讓纖維物質與ssRNA分離。
如文中所用術語「移出」或「移除」係指第一物質之群族特性，例如非免疫原性RNA，與接近的第二物質群族，例如dsRNA分離，其中第一物質群族並不一定無第二物質，且第二物質群族並不一定無第一物質。然而，特徵為移除第二群族物質的第一物質之群族，相較於第一和第二物質之非分離基質混合物，係具有可測量較低的第二物質含量。
在一具體實例中，從非免疫原性RNA移除dsRNA係包括移除dsRNA使得非免疫原性RNA組成物中低於10%，低於5%，低於4%，低於3%，低於2%，低於1%，低於0.5%，低於0.3%或低於0.1%的RNA為dsRNA。在一具體實例中，非免疫原性RNA為無或基本上無dsRNA。在某些具體實例中，非免疫原性RNA組成物係包括一純化的單股核苷酸修飾RNA製備物。例如，在某些具體實例中，純化的單股核苷酸修飾RNA製備物實質上為無雙股RNA(dsRNA)。在某些具體實例中，相對於所有其他核酸分子(DNA，dsRNA等)，該純化的製備物為至少90%，至少91%，至少92%，至少93 %，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，至少99.5%,或至少99.9%單股核苷酸修飾RNA。
在一具體實例中，非免疫原性RNA比具有相同序列的標準RNA在細胞中更有效率轉錄。在一具體實例中，相對於未修飾的對應物，轉譯提升2倍。在一具體實例中，轉譯提升3倍。在一具體實例中，轉譯提升4倍。在一具體實例中，轉譯提升5倍。在一具體實例中，轉譯提升6倍。在一具體實例中，轉譯提升至7倍。在一具體實例中，轉譯提升8倍。在一具體實例中，轉譯提升9倍。在一具體實例中，轉譯提升10倍。在一具體實例中，轉譯提升至15倍。在一具體實例中，轉譯提升20倍。在一具體實例中，轉譯提升50倍。在一具體實例中，轉譯提升100倍。在一具體實例中，轉譯提升200倍。在一具體實例中，轉譯提升500倍。在一具體實例中，轉譯提升1000倍。在一具體實例中，轉譯提升2000倍。在一具體實例中，倍數為10至1000倍。在一具體實例中，倍數為10至100倍。在一具體實例中，倍數為10至200倍。在一具體實例中，倍數為10至300倍。在一具體實例中，倍數為10至500倍。在一具體實例中，倍數為20至1000倍。在一具體實例中，倍數為30至1000倍。在一具體實例中，倍數為50至1000倍。在一具體實例中，倍數為100至1000倍。在一具體實例中，倍數為200至1000倍。在一具體實例中，轉譯提升至任何其他顯著量或量之範圍。
在一具體實例中，非免疫原性RNA比帶有相同序列之標準RNA具有顯著較低的先天非免疫原性。在一具體實例中，非免疫原性RNA係具有比其未修飾的對應物低2倍的先天免疫反應。在一具體實例中，先天免疫反應係下降3倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降4倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降5倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降6倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降7倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降8倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降9倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降10倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降15倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降20倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降50倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降100倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降200倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降500倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降1000倍。在一具體實例中，先天免疫原性係下降2000倍。
術語「具有顯著較低的先天免疫原性」係指可偵測的先天免疫原性下降。在一具體實例中，此術語係指可在無觸發可偵測的先天免疫反應下投予有效量的非免疫原性RNA之下降。在一具體實例中，此術語係指可在無引起足以降低可偵測的非免疫原性RNA所編碼之蛋白產生的先天免疫反應下，重複投予非免疫原性RNA之下降。在一具體實例中，此下降為得以在無引起足以消除可偵測的非免疫原性RNA所編碼之蛋白產生的先天免疫反應下，可重複投予該非免疫原性RNA。
「免疫原性」為外來物質，例如RNA，挑起人類或其他動物體內之免疫反應的能力。先天致免疫系統為相當非特定及立即的免疫系統組成份。其為二種脊椎動物免疫系統之主要組成份之一，連同後天免疫系統。
如文中所用「內生性」係指任何來自或由生物體、細胞、組織或系統內部所產生的物質。
如文中所用，術語「外生性」係指任何從生物體、細胞、組織或系統外部所導入或所產生的物質。
術語「表現」，如文中所用係如特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯所定義。
如文中所用，術語「連接」或「融合（fused、fusion）」可交換使用。這些術語係指二或更多個元件、組份或區域連結一起。 密碼子最佳化/增加G/C含量
在某些具體實例中，文中所述的標簽化合物之胺基酸序列係由一密碼子最適化及/或其G/C含量相較於野生型編碼序列為增加的編碼序列所編碼。此項亦包括其中編碼序列的一或多個序列區係經密碼子最適化及/或相較於野生型編碼序列的對應序列區增加G/C含量之具體實例。在一具體實例中，密碼子最佳化及/或增加G/C含量較佳地不會改變編碼胺基酸序列之序列。
術語「密碼子最佳化」係指改變核酸分子之編碼區中的密碼子，用以反映典型的宿主生物體之密碼子用途，較佳的無改變此核酸分子所編碼的胺基酸序列。在本發明內文中，編碼區較佳地係經密碼子最適化供在一使用文中所述的RNA分子治療之對象中最適表現。密碼子最適化係以轉譯效能亦能由出現在細胞之tRNA中的不同頻率來測定之發現為基礎。因此，RNA之序列可經修飾，使得可取得的頻繁出現tRNA密碼子得以插入而取代「罕見密碼子」。
在本發明的某些具體實例中，文中所述RNA的編碼區之鳥苷/胞嘧啶(G/C)含量相較於野生型RNA的對應編碼序列之G/C含量為增加的，其中由該RNA所編碼的胺基酸序列較佳地，相較於野生型RNA所編碼的胺基酸序列，為未經修飾的。此RNA序列的修飾係基於任何欲轉譯的RNA區之序列對於mRNA之有效轉譯為重要之事實。具有增加的G(鳥苷)/C(胞嘧啶)含量之序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量之序列更為穩定。就數個密碼子編碼一和相同胺基酸之事實(所謂的基因碼簡併)而言，可測定對於安定性最有利的密碼子(所謂的替代性密碼子利用)。依照該RNA所編碼的胺基酸，相較於其野生型序列，RNA序列之修飾有各種可能性。特言之，含有A及/或U核苷酸的密碼子可藉由以其他編碼相同胺基酸，但不含有A及/或U或含有較低量的A及/或U之核苷酸的密碼子取代這些密碼子，加以修飾。
在各種具體實例中，相較於野生型RNA之編碼區的G/C含量，文中所述RNA之編碼區的G/C含量增加至少10%，至少20%，至少30%，至少40%，至少50%，至少55%或甚至更高。 含有核酸的粒子
文中所述的核酸，例如編碼標簽化合物的RNA，可調配成粒子來給藥。
在本文的內容中，術語「粒子」係關於由分子或分子複合物所形成的結構實體。在一具體實例中，術語「粒子」係關於微米-或奈米-大小的結構，例如分散在媒劑中的微米或奈米大小之緊密結構。在一具體實例中，粒子為含有核酸的粒子，例如包括DNA、RNA或其混合物之粒子。
正電分子之間的靜電交互作用，例如聚合物和脂質及帶正電核酸係涉及粒子形成。其產生複合和自發性形成核酸粒子。在一具體實例中，核酸粒子為奈米粒子。
如本文中所用，「奈米粒子」係指具有適合非經腸投予之平均直徑的粒子。
「核酸粒子」可用於將核酸遞送至感興趣的目標位置(例如，細胞、器官諸如此類)。核酸粒子可由至少一陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質，至少一陽離子聚合物，例如魚精蛋白(protamine)，或其混合物和核酸所形成。核酸粒子包括脂質奈米粒子(LNP)-為基底和脂質複合物(lipoplex)(LPX)-為基底的調配物。
不希望受限於任何理論，咸信陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質及/或陽離子聚合物與核酸共同組合形成聚集物，且此聚集形成膠狀穩定粒子。
在一具體實例中，文中所述的粒子進一步係包括至少一陽離子或陽離子可離子化脂質以外的脂質或類脂質物質，至少一陽離子聚合物以外的聚合物或其混合物。
在某些具體實例中，核酸粒子係包括一種以上的核酸分子，其中該核酸分子的分子參數可相類似或彼此不同，如有關莫耳質量或基本結構元件，例如分子建構、加帽、編碼區或其他特性。
文中所述的核酸粒子可具有，在一具體實例中，範圍從約30 nm至約1000 nm，從約50 nm至約800 nm，從約70 nm至約600 nm，從約90 nm至約400 nm或從約100 nm至約300 nm之平均直徑。
文中所述的核酸粒子可具有低於約0.5，低於約0.4，低於約0.3或約0.2或更低的多分散性指數。舉例而言，核酸粒子可具有範圍約0.1至約0.3或約0.2至約0.3之多分散性指數(polydispersity index)。
有關RNA脂質粒子，N/P比係給予脂質中氮基團與RNA中磷酸基團數目的比率。其係與電荷比相關，因為氮原子(依pH而定)通常帶正電而磷酸基團係帶負電。N/P比，其中存有電荷平衡，係依pH而定。脂質調配物常常在N/P比大於4至高達12時形成，因為帶正電的奈米粒子被認為較有利於轉染。在該情況下，RNA被認為與奈米粒子完全結合。
文中所述的核酸粒子可使用廣泛範圍的方法來製備，其可能涉及從至少一陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質及/或至少一陽離子聚合物得到膠體並將該膠體與核酸混合，得到核酸粒子。
術語「膠體」如文中所用係關於其中分散的粒子不會沉澱下來之均質混合物的類型。混合物中不可溶粒子為微觀的，其中粒子大小介於1至1000奈米之間。此混合物可稱為膠體或膠狀懸浮液。有時候術語「膠體」僅係指混合物中的粒子而並非整個懸浮液。
就製備包括至少一陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質及/或至少一陽離子聚合物之膠體在文中可應用習用於製備脂質體囊泡並經適當調整。最常用於製備脂質體囊泡的方法係具有下列基本階段：(i)將脂質溶解於有機溶劑，(ii)將生成的溶液乾燥，及(iii)將乾燥的脂質水合(使用各種水性媒劑)。
在薄膜水合法中，首先將脂質溶於適合的有機溶劑，及於燒瓶底部乾燥至產生薄膜。將得到的脂質薄膜使用適當的水性媒劑水合，產生脂質體分散液。再者，可包括另外的縮減尺寸步驟。
逆相蒸發為另一種用於製備脂質體囊泡之薄膜水合法，其係涉及在水相和含有脂質之有機相間形成油包水乳化液。短暫的超音波處理此混合物為系統均質化所必須。於減壓下移除有機相，產生乳狀凝膠，將其隨後轉變成脂質體懸浮液。
術語「乙醇注射技術」係指其中經由針將包括脂質的乙醇溶液快速注射至一水溶液中的方法。此動作係將脂質分散至整個溶液並加速脂質結構形成，例如脂質囊泡形成，例如脂質體形成。一般而言，文中所述的RNA脂質複合物粒子係藉由將RNA加到膠體脂質體分散液中所獲得。使用乙醇注射技術，例如膠體脂質體分散液，在一具體實例中，係如下所形成：將包括脂質，例如陽離子脂質和另外的脂質的乙醇溶液注射至攪拌下的水溶液中。在一具體實例中，文中所述的RNA脂質複合物粒子在不需要擠壓下即可獲得。
術語「擠壓」係指製造具有固定、橫斷剖面之粒子。特言之，其係指縮減粒子大小，由此迫使粒子通過具有定義孔洞的過濾器。
具有無有機溶劑特性的其他方法，亦可根據本文用於製備膠體。
LNP典型地係包括四種組份：可離子化陽離子脂質、中性脂質。例如磷脂質，類固醇例如膽固醇，及接合脂質的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)-脂質。各組份係負責酬載保護，及能有效於細胞內遞送。LNP可藉由將溶於乙醇的脂質於水性緩衝液中快速與核酸混合來製備。
術語「平均直徑」係指藉由動態雷射光散射(DLS)所測量，使用所謂的累積演算法分析數據之粒子的流體力學直徑，其係提供所謂的長度直徑之Z 平均，及無因次之多分散性指數(PI)作為結果(Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321)。本處粒子的「平均直徑」、「直徑」或「大小」係與Z 平均值作為同義詞使用。
「多分散性指數」較佳地係以動力光散射測量為基準，藉由如「平均直徑」之定義中所提及的所謂累積分析所計算。在特定的先決條件下，其可作為整體奈米粒子之大小分布的量度單位。
含有不同類型核酸的粒子先前已描述適合用於遞送顆粒形式的核酸(例如Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60)。就非病毒核酸遞送媒劑，奈米粒子包膠的核酸物理性保護核酸免於降解及，依照特定的化學，可幫助細胞攝入和內小體脫離（endosomal escape）。
本文係描述包括至少一陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質，及/或至少一與核酸結合形成核酸粒子的陽離子聚合物之粒子及包括此等粒子的組成物。核酸粒子可包括藉由與粒子之非共價交互作用，以不同形式複合的核酸。文中所述的粒子並非病毒粒子，特言之感染性病毒粒子，亦即其不能病毒性感染細胞。
適合的陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質和陽離子聚合物為形成核酸粒子之物質且係包括在術語「粒子形成組份」或「粒子形成試劑」內。術語「粒子形成組份」或「粒子形成試劑」係關於與核酸相結合形成核酸粒子之任何組份。此等組份係包括可為核酸粒子之部分的任何組份。 陽離子聚合物
有鑑於其高度的化學彈性，聚合物為常用於奈米粒子為基底的遞送之物質。典型地，陽離子聚合物係用於以靜電將帶負電的核酸凝結至奈米粒子中。這些帶負電的基團通常係由胺所組成，其在介於5.5至7.5之pH範圍改變其質子化狀態，被認為導致離子不平衡，造成內小體破裂。聚合物，例如聚-L-離胺酸、聚醯胺胺、魚精蛋白和聚乙基亞基，以及天然生成的聚合物例如幾丁聚醣全皆適用於核酸遞送及適合作為文中的聚合物。此外，一些研究者已合成特別針對核酸遞送的聚合物。特言之，聚(β-胺基酯)，由於其合成容易及生物可降解性，已獲得廣泛地用於核酸遞送。此等合成的聚合物亦適合作為文中之陽離子聚合物。
「聚合物」，如文中所用，就其一般的意義，亦即，包括一或多個藉由共價鍵相連接的重複單元(單體)之分子結構。該等重複單元可全部相同，或在某些情況下，聚合物內可存有一種以上的重複單元。在某些情況下，聚合物為生物衍生的，亦及生物聚合物，例如蛋白。在某些情況下，聚合物中亦可存有另外的基團，例如靶向基團，例如該等文中所述的靶向基團。
若聚合物內存有一種以上的重複單元，則該聚合物可被視為「共聚物」。應了解，文中所用的聚合物可以任何方式排列。例如，重複單元可以隨機的順序排列，以交替的順序或為「嵌段」共聚物，亦即包括一或多個各自係包括一第一重複單元(例如，第一嵌段)的區，及一或多個各自係包括一第二重複單元(例如，第二嵌段)的區等。嵌段共聚物可具有二個(雙嵌段共聚物)，三個(三嵌段共聚物)或更多數目的不同嵌段。
在特定的具體實例中，聚合物為生物相容的。生物相容的聚合物為典型地在適度濃度時不會造成顯著細胞死亡之聚合物。在特定的具體實例中，生物相容的聚合物為生物可降解的，亦即該聚合物在生理環境下，例如在體內，能化學性及/或生物性降解。
在特定的具體實例中，聚合物可為魚精蛋白(protamine)或聚伸烷基亞胺，尤其是魚精蛋白。
術語「魚精蛋白」係指任何各種分子量相當低之強鹼性蛋白，其係富含精胺酸且發現係與DNA特別相關，在各種動物(如魚類)之精細胞中替代身體組織蛋白。特言之，術語「魚精蛋白」係指在魚的精子中發現的蛋白，其為強鹼性，可溶於水，不會熱凝結，且在水解後主要產生精胺酸。其純化的形式係用於長效性胰島素調配物及中和肝素的抗凝血劑效應。
根據本文，術語「魚精蛋白」如文中所用係指包括由天然或生物來源所得來或衍生的任何魚精蛋白胺基酸序列，包括其片段及該胺基酸序列的多聚體形式或其片段以及人工和針對特定目的所特別設計及無法從天然或生物來源分離的(合成的)多肽。
在一具體實例中，聚伸烷基亞胺係包括聚乙基亞胺及/或聚丙基亞胺，較佳地聚乙基亞胺。較佳的聚伸烷基亞胺為聚乙基亞胺(PEI)。PEI的平均分子量較佳地為0.75∙10 2至10 7Da，較佳地1000至10 5Da，更佳的10000至40000 Da，更佳的15000至30000 Da，甚佳的20000至25000 Da。
較佳的根據本文為直鏈聚伸烷基亞胺，例如直鏈聚乙基亞胺(polyethyleneimine，PEI)。
預計用於文中的陽離子聚合物(包括聚陽離子聚合物)係包括能以靜電結合核酸的任何陽離子聚合物。在一具體實例中，預計用於文中的陽離子聚合物包括可藉由與核酸形成複合物結合核酸或形成其中包封（enclosed）或包膠（encapsulated）核酸的囊泡之任何陽離子聚合物。
文中所述的粒子亦可包括陽離子聚合物以外的聚合物，亦即非陽離子聚合物及/或陰離子聚合物。整體而言，陰離子和中性聚合物在文中稱為非陽離子聚合物。 脂質和類脂質物質
術語「脂質」和「類脂質物質」在文中係廣泛地定義為包括一或多個疏水性官能基或基團和視需要以及一或多個親水性官能基或基團之分子。包括疏水性基團和親水性基團的分子亦常稱為兩親分子。脂質通常難溶於水。在水性的環境中，兩親分子的性質能讓分子自我組合成有組織的結構和不同相。其中一相係由二層脂質所組成，因為其在水性環境中係以囊泡，多層/單層脂質體，或膜存在。疏水性可由包括非極性基團來賦予，其係包括，但不限於，長鏈飽和及不飽和脂系烴基基團且此等基團係被一或多個芳香、環脂系或雜環基團取代。親水性基團可包括極性及/或帶電基團並包括碳水化合物、磷酸基、羧基、硫酸基、胺基、巰基、硝基、羥基及其他類似基團。
如文中所用，術語「兩親分子」係指具有極性部分和非極性部分。通常，兩親化合物具有與長的疏水性尾部連附的極性頭部。在某些具體實例中，極性部分可溶於水，而非極性部分不溶於水。另外，極性部分可具有形式正電荷，或形式負電荷。另一種選擇，極性部分可具有形式正電荷和負電荷，且可為兩性離子或內鹽。就本文之目的，兩親化合物可為，但不限於，一或許多個天然或非天然脂質和類脂質化合物。
術語「類脂質物質」、「類脂質化合物」或「類脂質分子」係關於結構上及/或功能上與脂質有關的物質，但狹義上不視為脂質。例如，此術語係包括能形成兩親層之化合物，因為其在水性環境中係以囊泡，多層/單層脂質體，或膜存在並包括界面活性劑，或具有親水性和疏水性基團的合成化合物。一般而言，此術語係指包括具有不同結構組織之親水性和疏水性基團的分子，其可與脂質相類似或不相似。除非文中另有指出或內容明確矛盾，否則如文中所用，術語「脂質」應理解係涵蓋脂質和類脂質物質二者。
可包括在兩親層之特定的兩親化合物實例係包括，但不限於磷脂質、胺基脂質和神經鞘脂質(sphingolipid)。
在特定的具體實例中，該兩親化合物為脂質。術語「脂質」係指一群特徵為不溶於水但可溶於許多有機溶劑的有機化合物。一般而言，脂質可分成八類：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、神經鞘脂質、醣脂質、聚乙醯酮(Polyketide)(衍生自酮醯次單位之縮合)、固醇脂質和異戊烯醇脂質(衍生自異戊二烯次單位之縮合)。雖然術語「脂質」有時候係用作為脂肪的同義詞，脂肪為脂質之子群族稱為三酸甘油酯。脂質亦包括分子，例如脂肪酸分子及其衍生物(包括三-、二-、單酸甘油酯和磷脂質)，以及含有固醇的代謝物，例如膽固醇。
脂肪酸或脂肪酸殘基為烴基鏈所構成，末端帶有羧酸基團的多樣化分子群族；此排列賦予分子極性、親水性末端和不溶於水的非極性、疏水性末端。碳鏈，典型地係介於4至24個碳長，可為飽和或不飽和，且可與含有氧、鹵素、氮和硫之功能基團連接。若脂肪酸含有雙鍵，則有順式或反式幾何異構物之可能性，其顯著地影響分子的組態。順式雙鍵造成脂肪酸鏈彎曲，一種與鏈中更多雙鍵化合之效應。在脂肪酸範疇中其他主要脂質種類為脂防酯類和脂肪醯胺類。
甘油脂係由單-、雙-和三-取代的甘油所組成，最為人所知的為甘油脂肪酸三酯，稱為三酸甘油酯。詞語「三酸甘油酯(triacylglycerol)」有時候係與「三醯甘油酯(triglyceride)」同義使用。在這些化合物中，甘油的三個羥基各自典型地以不同的脂肪酸酯化。另外的甘油脂之子類係以甘油葡糖苷代表，其特徵為存有一或多個糖殘基經由糖苷鍵連與甘油相連接。
甘油磷脂為兩親分子(含有疏水性和親水性區)，係含有一甘油核心以酯鍵連連接二個脂肪酸衍生的「尾部」和以一磷酸酯鍵連連接一「頭部」基團。甘油磷脂的實例，通常係指磷脂(雖然神經鞘磷脂亦分類為磷脂)，為磷脂醯膽鹼(亦稱為PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂醯乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂醯絲胺酸(PS或GPSer)。
神經鞘脂為化合物之複合物家族，享有共同結構特性，神經鞘胺醇基(sphingoid base)骨架。哺乳動物中主要的神經鞘胺醇基通常係稱為神經鞘胺醇(sphingosine)。神經醯胺(Ceramide)(N-醯基-神經鞘胺醇基)為具有一醯胺-連接脂肪酸之主要神經鞘胺醇基衍生物的子類。脂肪酸典型地為飽和或單元不飽和，具有16至26碳原子鏈長。哺乳動物的主要神經鞘磷脂質(phosphosphingolipid)為神經鞘磷脂(sphingomyelin)(神經醯胺磷酸膽鹼)，而昆蟲主要係含有神經醯胺磷酸乙醇胺，及真菌具有植物神基醯胺磷酸肌醇和含甘露糖的頭基。醣神經鞘脂質(glycosphingolipid)為多樣的分子家族，由一或多個糖殘基經由一糖苷鍵與神經鞘胺醇基連接所組成。這些之實例有簡單和複合的醣神經鞘脂質，例如腦苷脂(cerebroside)和神經節苷脂(ganglioside)。
固醇脂質，例如膽固醇及其衍生物，或生育醇及其衍生物，為膜脂質，以及甘油磷脂和神經鞘磷脂之重要組份。
醣脂質係描述其中脂肪酸直接與糖骨架相連接，形成與雙層膜相容結構之化合物。在醣脂質中，係以單醣取代存在甘油脂和甘油磷脂中的甘油骨架。最熟悉的醣脂質為革蘭氏陰性菌中脂多醣之脂質A組份的醯化葡萄糖胺前驅物。典型的脂質A分子為雙醣的葡萄糖胺，其係以多如七條脂肪醯基鏈衍生。大腸桿菌生長所需的最小脂多醣為Kdo2-Lipid A，一種以2個3-去氧-D-甘露-辛酮醣酸(Kdo)殘基經糖基化之六醯基化葡萄糖胺。
聚乙醯酮係藉由乙醯基和丙醯基次單位以經典的酵素以及與脂肪酸合成共享機制特性之疊代和多模組酵素聚合化所合成。其係包括來自動物、植物、細菌、真菌和海洋來源的大量二級代謝物和天然產物，並具有良好的結構多樣性。許多的聚乙醯酮為環狀分子，其骨架通常進一步經糖基化、甲基化、羥基化、氧化或其他處理加以修飾。
根據本文，脂質和類脂質物質可為陽離子、陰離子或中性。中性脂質或類脂質物質係在選擇的pH中以不帶電或中性二性離子形式存在。 陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質
文中所描述的核酸粒子可包括至少一種陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質作為粒子形成劑。預計用於文中之陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質係包括能以靜電結合核酸之任何陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質。在一具體實例中，預計用於文中之陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質可藉由，例如藉由與核酸形成複合物或形成其中包封或包膠核酸之囊泡，而與核酸結合。
如文中所用，「陽離子脂質」或「陽離子類脂質物質」係指具有淨正電荷之脂質或類脂質物質。陽離子脂質或類脂質物質係藉由靜電交互作用與帶負電的核酸結合。一般而言，陽離子脂質具有親脂基團，例如固醇、醯基鏈、二醯基或更多醯基鏈，及脂質的頭基典型地係帶有正電。
在特定的具體實例中，陽離子脂質或類脂質物質僅在特定的pH，在特定的酸性pH具有淨正電荷，而其在不同的，較佳地較高的pH，例如生理pH，較佳地無淨正電荷，較佳地無電荷，亦即其為中性。相較於在生理pH仍為陽離子的粒子，此可離子化行為被認為是經由內小體逃離和降低毒性的幫助，增進效力。
就本文之目的，除非狀況有相矛盾，否則此「陽離子可離子化」脂質或類脂質物質係包括在術語「陽離子脂質或類脂質物質」中。
在一具體實例中，陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質係包括包含至少一帶正電或能被質子化的氮原子(N)之頭基。
陽離子脂質之實例包括，但不限於1,2-二油醯基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)；N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙基胺(DODMA)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙烷(DOTMA)、3-(N—(N′,N′-二甲基胺基乙烷)-胺甲醯基)膽固醇(DC-Chol)、二甲基雙十八烷基銨(DDAB)；1,2-二油醯基-3-二甲基銨-丙烷(DODAP)；1,2-二醯氧基-3-二甲基銨丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基銨丙烷；雙十八醯基二甲基氯化銨(DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(DSDMA)、2,3-二(十四烷基)丙基-(2-羥基乙基)-二甲基銨(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-乙基磷酸膽鹼(DMEPC)、l,2-二肉豆蔻醯基-3-三甲基銨丙基(DMTAP)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羥基乙基溴化銨(DORIE),和2,3-二油醯基氧基-N-[2(精胺醯胺)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙銨(DOSPA)、1,2-二亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亞麻油基氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLenDMA)、雙十八醯基醯胺基甘胺醯基精胺(DOGS)、3-二甲基胺基-2-(膽-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(順,順-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(膽-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧雜戊氧基)-3-二甲基-1-(順,順-9′,12′-十八碳二烯氧基)丙烷 (CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)、1,2-N,N′-二油烯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亞麻油醯基氧基-N,N-二甲基丙基胺(DLinDAP)、1,2-N,N′-二亞麻油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亞麻油醯基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-DMA)、2,2-二亞麻油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧戊環(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亞麻油基-4-(2-二甲基胺基乙基)-[1,3]-二氧戊環(DLin-KC2-DMA)、三十七基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基胺基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、N-(2-羥基乙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四基氧基)-1-溴化丙銨(DMRIE)、(±)-N-(3-胺基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(順-9-十四碳烯基氧基)-1-溴化丙銨(GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-胺基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十二基氧基)-1-溴化丙銨(GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-胺基丙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四基氧基)-1-溴化丙銨(GAP-DMRIE)、N-(2-胺基乙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四基氧基)-1-溴化丙銨(βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苯甲基)-N,N-二甲基-2,3-雙(油醯基氧基)丙-1-銨(DOBAQ)、2-({8-[(3β)- 膽-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八基-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(Octyl-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻醯基-3-二甲基銨-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕櫚醯基l-3-二甲基銨-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-胺基丙基)胺基]-4-[di(3-胺基-丙基)胺基]丁基甲醯胺基)乙基]-3,4-二[油烯基氧基]-苯甲醯胺(MVL5)、1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽鹼(DOEPC)、2,3-雙(十二基氧基)-N-(2-羥基乙基)-N,N-二甲基丙基-1-溴化銨(DLRIE)、N-(2-胺基乙基)-N,N-二甲基-2,3-雙(十四基氧基)丙基-1-溴化銨(DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8'-((((2(二甲基胺基)乙基)硫基)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(ATX)、N,N-二甲基-2,3-雙(十二基氧基)丙-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-雙(十四基氧基)丙-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基胺基丁醯基)氧基)十七酸(L319)、N-十二基-3-((2-十二基胺甲醯基-乙基)-{2-[(2-十二基胺甲醯基-乙基)-2-{(2-十二基胺甲醯基-乙基)-[2-(2-十二基胺甲醯基-乙基胺基)-乙基]-胺基}-乙基胺基)丙醯胺(lipidoid 98N 12-5)、1-[2-[雙(2-羥基十二基)胺基]乙基-[2-[4-[2-[雙(2 羥基十二基)胺基]乙基]哌𠯤-1-基]乙基]胺基]十二-2-醇(lipidoid C12-200)。
在某些具體實例中，陽離子脂質可包括存在粒子中總脂質之約10 mol %至約100 mol %，約20 mol %至約100 mol %，約30 mol %至約100 mol %，約40 mol %至約100 mol %或約50 mol %至約100 mol %。 另外的脂質或類脂質物質
文中所述的粒子亦可包括陽離子或陽離子可離子化脂質或類脂質物質以外的脂質或類脂質物質，亦即非陽離子脂質或類脂質物質(包括非陽離子可離子化脂質或類脂質物質)。整體而言，陰性和中性脂質或類脂質物質在文中係稱為非陽離子脂質或類脂質物質。除了可離子化/陽離子脂質或類脂質物質，藉由加入其他疏水性基團，例如膽固醇和脂質，將核酸粒子調配物最適化，可增進粒子穩定性和核酸遞送效能。
可併入可能會或不會影響整個核酸粒子電荷之另外的脂質或類脂質物質。在特定的具體實例中，另外的脂質或類脂質物質為非陽離子脂質或類脂質物質。非陽離子脂質可包括，例如，一或多種陰離子脂質及/或中性脂質。如文中所用，「陰離子脂質」在一選擇的pH下帶負電之任何脂質。如文中所用，「中性脂質」係指在一選擇的pH下以不帶電或中性離子形式存在之任何脂質種類。在較佳的具體實例中，另外的脂質係包括一或多種下列的中性脂質組份：(1)磷脂質，(2)膽固醇或其衍生物；或(3)磷脂質和膽固醇或其衍生物的混合物。膽固醇衍生物的實例包括，但不限於膽固醇、膽甾烷酮、膽甾烯酮、糞甾烷醇、膽硬脂基-2'-羥基乙基醚、膽硬脂基-4'-羥基丁基醚、生育醇和其衍生物，以及其混合物。
可使用的特定磷脂質包括，但不限於磷脂醯膽鹼、、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯絲胺酸或神經鞘磷脂。此等磷脂質包括，尤其是磷脂醯膽鹼，例如二醯基磷脂醯膽鹼，例如二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、二十五醯基磷脂醯膽鹼、二月桂醯基磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二花生醯基磷脂醯膽鹼 (DAPC)、二山俞醯基磷脂醯膽鹼 (DBPC)、十三醯基磷脂醯膽鹼(DTPC)、二肉鹼醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、棕櫚醯基油醯基-磷脂醯膽鹼 (POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼 (18：0 Diether PC)、1-油醯基-2-胆固醇基半琥珀醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(OChemsPC)、1-十六基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(C16 Lyso PC)和磷脂醯乙醇胺，尤其是二醯基磷脂醯乙醇胺，例如二油醯基磷脂醯乙醇胺 (DOPE)、二硬脂醯基-磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯基-磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基-磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二月桂醯基-磷脂醯乙醇胺(DLPE)、二植烷醯基-磷脂醯乙醇胺 (DPyPE)，及另外帶有不同疏水鏈之磷脂醯乙醇胺。
在特定較佳的具體實例中，該另外的脂質為DSPC或DSPC和膽固醇。
在特定較佳的具體實例中，該核酸粒子係包括陽離子脂質和另外的脂質二者。
在一具體實例中，文中所述的粒子係包括接合脂質的聚合物，例如peg化脂質。術語「peg化脂質」係指包括脂質部分和聚乙二醇部分之分子。peg化脂質已為本項技術所知。
不希望受限於理論，至少一陽離子脂質的量，相較於至少一另外脂質的量，可能影響重要的核酸粒子特性，例如核酸的電荷、粒子大小、安定性、組織選擇性和生物活性。因此，在某些具體實例中，至少一陽離子脂質與至少一另外的脂質之莫耳比係從約10：0至約1：9，約4：1至約1：2，或約3：1至約1：1。
在某些具體實例中，非陽離子脂質的量，尤其是中性脂質(例如，一或多種的磷脂質及/或膽固醇)可包括存在粒子中的總脂質之約10 mol %至約90 mol %，從約0 mol %至約80 mol %，從約0 mol %至約70 mol %，從約0 mol %至約60 mol %，或從約0 mol %至約50 mol %。 脂質複合物粒子 ( lipoplex particle )
在本文特定的具體實例中，文中所述的RNA可以RNA脂質複合物粒子存在。
在本文內容中，術語「RNA脂質複合物粒子」係關於含有脂質，尤其是粒子陽離子脂質和RNA之粒子。帶正電的脂質體和帶負電的RNA之靜電交互作用造成複合並自發形成RNA脂質複合物粒子。帶正電的脂質體一般可使用陽離子脂質，例如DOTMA，及另外的脂質，例如DOPE來合成。在一具體實例中，RNA脂質複合物粒子為奈米粒子。
在特定的具體實例中，該RNA脂質複合物粒子係包括陽離子脂質和另外的脂質二者。在一示例的具體實例中，該陽離子脂質為DOTMA而該另外的脂質為DOPE。
在某些具體實例中，至少一陽離子脂質與至少一另外的脂質之莫耳比係從約10：0至約1：9，約4：1至約1：2,或約3：1至約1：1。在特定的具體實例中，莫耳比可為約3：1，約2.75：1，約2.5：1，約2.25：1，約2：1，約1.75：1，約1.5：1，約1.25：1，或約1：1。在一示例的具體實例中，至少一陽離子脂質與至少一另外的脂質之莫耳比為約2：1。
文中所述的RNA脂質複合物粒子，在一具體實例中具有範圍從約200 nm至約1000 nm，從約200 nm至約800 nm，從約250至約700 nm，從約400至約600 nm，從約300 nm至約500 nm,或從約350 nm至約400 nm之平均直徑。在特定的具體實例中，該RNA脂質複合物粒子係具有約200 nm，約225 nm，約250 nm，約275 nm，約300 nm，約325 nm，約350 nm，約375 nm，約400 nm，約425 nm，約450 nm，約475 nm，約500 nm，約525 nm，約550 nm，約575 nm，約600 nm，約625 nm，約650 nm，約700 nm，約725 nm，約750 nm，約775 nm，約800 nm，約825 nm，約850 nm，約875 nm，約900 nm，約925 nm，約950 nm，約975 nm，或約1000 nm之平均直徑。。在一具體實例中，該RNA脂質複合物粒子係具有範圍從約250 nm至約700 nm之平均直徑。在另外的具體實例中，該RNA脂質複合物粒子係具有範圍從約300 nm至約500 nm之平均直徑。在一示例的具體實例中，該RNA脂質複合物粒子係具有約400 nm之平均直徑。
RNA脂質複合物粒子和包括文中所述的RNA脂質複合物粒子之組成物，投予後，尤其是靜脈內投予後可用於遞送RNA至目標組織。RNA脂質複合物粒子可使用藉由將脂質溶液注射至水中或適合的水相中所獲得的脂質體來製備。在一具體實例中，該水相係具有酸性pH。在一具體實例中，該水相係包括乙酸，例如，約5 mM之量。脂質體可藉由將脂質體與RNA混合，用於製備RNA脂質複合物粒子。在一具體實例中，脂質體和RNA脂質複合物粒子係包括至少一陽離子脂質和至少一另外的脂質。在一具體實例中，該至少一陽離子脂質係包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙基(DOTMA)及/或1,2-二油醯基-3-三甲基銨-丙烷(DOTAP)。在一具體實例中，該至少一另外的脂質係包括1,2-二-(9Z-十八烯醯基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、膽固醇(Chol)及/或1,2-二油醯基-sn-甘油基-3-磷酸膽鹼(DOPC)。在一具體實例中，該至少一陽離子脂質係包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙基(DOTMA)而該至少一另外的脂質係包括1,2-二-(9Z-十八烯醯基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一具體實例中，該脂質體和RNA脂質複合物粒子係包括1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基銨丙基(DOTMA)和1,2-二-(9Z-十八烯醯基)-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。 脂質奈米粒子(LNP)
在一具體實例中，核酸，例如文中所述的RNA係以脂質奈米粒子(LNP)的形式投予。LNP可包括能形成黏附一或多個核酸分子之粒子，或將一或多個核酸分子包膠在其中之粒子的任何脂質。
在一具體實例中，LNP係包括一或多個陽離子脂質，及一或多個安定化脂質。安定化脂質係包括中性脂質和peg化脂質。
在一具體實例中，LNP係包括陽離子脂質、中性脂質、固醇和接合脂質的聚合物；且RNA係包膠於脂質奈米粒子內或與脂質奈米粒子結合。
在一具體實例中，LNP係包括從40至55莫耳百分比，從40至50莫耳百分比，從41至49 mol 百分比，從41至48莫耳百分比，從42至48 mol 百分比，從43至48莫耳百分比，從44至48莫耳百分比，從45至48百分比，從46至48莫耳百分比，從47至48莫耳百分比，或從47.2至47.8莫耳百分比的陽離子脂質。在一具體實例中，LNP係包括約47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0莫耳百分比的陽離子脂質。
在一具體實例中，中性脂質係以範圍從5至15莫耳百分比，從7至13莫耳百分比，或從9至11莫耳百分比之濃度存在。在一具體實例中，中性脂質係以約9.5、10或10.5莫耳百分比之濃度存在。
在一具體實例中，類固醇係以範圍從30至50莫耳百分比，從35至45莫耳百分比或從38至43莫耳百分比之濃度存在。在一具體實例中，類固醇係以約40、41、42、43、44、45或46莫耳百分比之濃度存在。
在一具體實例中，LNP係包括從1至10莫耳百分比，從1至5莫耳百分比，或從1至2.5莫耳百分比之接合脂質的聚合物。
在一具體實例中，LNP係包括從40至50莫耳百分比的陽離子脂質；從5至15莫耳百分比的中性脂質；從35至45莫耳百分比的類固醇；從1至10莫耳百分比的接合脂質之聚合物；和包膠於脂質奈米粒子內或與脂質奈米粒子結合之RNA。
在一具體實例中，莫耳百分比係以存在脂質奈米粒子中的總脂質莫耳為基準所測定。
在一具體實例中，中性脂質係由下列組成之群中選出：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一具體實例中，中性脂質係由下列組成之群中選出：DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一具體實例中，該中性脂質為DSPC。
在一具體實例中，該類固醇為膽固醇。
在一具體實例中，接合脂質的聚合物為peg化脂質。在一具體實例中，該peg化脂質係具有下列結構：
Figure 02_image029
或其醫藥上可接受鹽、互變異構物或立體異構物，其中： R 12和R 13各自獨立地為含有10至30個碳原子之直鏈或支鏈、飽和或不飽和烷基鏈，其中該烷基鏈視需要係插入一或多個酯鍵；而w具有範圍從30至60之平均值。在一具體實例中，R 12和R 13各自獨立地為含有12至16個碳原子之直鏈、飽和烷基鏈。在一具體實例中，w具有範圍從40至55之平均值。在一具體實例中，平均的w為約45。在一具體實例中，R 12和R 13各自獨立地為含有約14個碳原子之直鏈、飽和烷基鏈，而w具有約45之平均值。
在某些具體實例中，LNP的陽離子脂質組份係具有式(III)之結構：
Figure 02_image031
(III) 或其醫藥上可接受鹽、互變異構物、前驅物或立體異構物，其中： L 1或L 2其中之一為–O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O) x-、-S-S-、‑C(=O)S-、SC(=O)-、-NR aC(=O)-、-C(=O)NR a-、NR aC(=O)NR a‑、-OC(=O)NR a-或-NR aC(=O)O-，而另一個L 1或L 2為–O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O) x-、-S‑S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NR aC(=O)-、-C(=O)NR a-、NR aC(=O)NR a‑、-OC(=O)NR a-或-NR aC(=O)O-或直接鍵結； G 1和G 2各自獨立地為未經取代C 1-C 12伸烷基或C 1-C 12伸烯基； G 3為C 1-C 24伸烷基、C 1-C 24伸烯基、C 3-C 8伸環烷基、C 3-C 8伸環烯基； R a為H或C 1-C 12烷基； R 1和R 2各自獨立地為C 6-C 24烷基或C 6-C 24烯基； R 3為H、OR 5、CN、‑C(=O)OR 4、‑OC(=O)R 4或–NR 5C(=O)R 4； R 4為C 1-C 12烷基； R 5為H或C 1-C 6烷基；及 X為0、1或2。
在某些前述的式(III)之具體實例中，該脂質係具有下列結構(IIIA)或(IIIB)其中之一：
Figure 02_image033
或
Figure 02_image035
(IIIA)                               (IIIB) 其中： A為3至8-員環烷基或伸環烷基環； R 6各自獨立地為H、OH或C 1-C 24烷基； N為範圍從1至15之整數。
在某些前述的式(III)之具體實例中，該脂質係具有結構(IIIA)，而在其他的具體實例中，該脂質係具有結構(IIIB)。
在其他的式(III)之具體實例中，該脂質係具有下列結構(IIIC)或(IIID)其中之一：
Figure 02_image037
或
Figure 02_image039
(IIIC)                              (IIID) 其中y和z各自獨立地為範圍從1至12之整數。
在任何前述的式(III)之具體實例中，L 1或L 2其中之一為‑O(C=O)‑。例如，在某些具體實例中，L 1和L 2各自為‑O(C=O)‑。在某些不同的任何前述具體實例中，L 1和L 2各自獨立地為‑(C=O)O‑或‑O(C=O)-。例如，在某些具體實例中L 1和L 2各自為‑(C=O)O‑。
在某些不同的式(III)之具體實例中，該脂質係具有下列結構(IIIE)或(IIIF)其中之一：
Figure 02_image041
或
Figure 02_image043
。 (IIIE)                                (IIIF)
在某些前述的式(III)之具體實例中，該脂質係具有下列結構(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)其中之一：
Figure 02_image045
；
Figure 02_image047
； (IIIG)                                        (IIIH)
Figure 02_image049
或
Figure 02_image051
。 (IIII)                                        (IIIJ)
在某些前述的式(III)之具體實例中，n為範圍從2至12之整數，例如2至8或2至4。例如，在某些具體實例中，n為3、4、5或6。在某些具體實例中，n為3。在某些具體實例中，n為4。在某些具體實例中，n為5。在某些具體實例中，n為6。
在某些其他前述的式(III)之具體實例中，y和z各自獨立地為範圍從2至10之整數。例如，在某些具體實例中，y和z各自獨立地為範圍從4至9，或4至6之整數。
在某些前述的式(III)之具體實例中，R 6為H。在其他前述的具體實例中，R 6為C 1-C 24烷基。在其他具體實例中，R 6為OH。
在某些式(III)之具體實例中，G 3為未經取代。在其他的具體實例中，G3係經取代。在各種不同的具體實例中，G 3為直鏈C 1-C 24伸烷基或直鏈C 1-C 24伸烯基。
在某些其他前述的式(III)之具體實例中，R 1或R 2，或二者，為C 6-C 24烯基。例如，在某些具體實例中，R 1和R 2各自獨立地具有下列結構：
Figure 02_image053
， 其中： R 7a和R 7b各自獨立地為H或C 1-C 12烷基；及 a為2至12之整數， 其中R 7a、R 7b和a各自係經選擇，使得R 1和R 2各自獨立的係包括6至20個碳原子。例如，在某些具體實例中a為範圍從5至9，或8至12之整數。
在某些前述的式(III)之具體實例中，至少一次發生的R 7a為H。例如，在某些具體實例中，R 7a在每次發生時為H。在其他不同的前述具體實例中，至少一次發生的R 7b為C 1-C 8烷基。例如，在某些具體實例中，C 1-C 8烷基為甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正己基或正辛基。
在不同的式(III)之具體實例中，R 1或R 2或二者，具有下列結構其中之一：
Figure 02_image055
；
Figure 02_image057
；
Figure 02_image059
；
Figure 02_image061
；
Figure 02_image063
；
Figure 02_image065
；
Figure 02_image067
；
Figure 02_image069
；
Figure 02_image071
；
Figure 02_image073
。
在某些前述的式(III)之具體實例中，R 3為OH、CN、‑C(=O)OR 4、‑OC(=O)R 4或–NHC(=O)R 4。在某些具體實例中，R 4為甲基或乙基。
在各種不同的具體實例中，該式(III)之陽離子脂質係具有下表中所列其中一項的結構。
代表性的(III)式化合物
編號 結構
III-1
Figure 02_image075
III-2
Figure 02_image077
III-3
Figure 02_image079
III-4
Figure 02_image081
III-5
Figure 02_image083
III-6
Figure 02_image085
III-7
Figure 02_image087
III-8
Figure 02_image089
III-9
Figure 02_image091
III-10
Figure 02_image093
III-11
Figure 02_image095
III-12
Figure 02_image097
III-13
Figure 02_image099
III-14
Figure 02_image101
III-15
Figure 02_image103
III-16
Figure 02_image105
III-17
Figure 02_image107
III-18
Figure 02_image109
III-19
Figure 02_image111
III-20
Figure 02_image113
III-21
Figure 02_image115
III-22
Figure 02_image117
III-23
Figure 02_image119
III-24
Figure 02_image121
III-25
Figure 02_image123
III-26
Figure 02_image125
III-27
Figure 02_image127
III-28
Figure 02_image129
III-29
Figure 02_image131
III-30
Figure 02_image133
III-31
Figure 02_image135
III-32
Figure 02_image137
III-33
Figure 02_image139
III-34
Figure 02_image141
III-35
Figure 02_image143
III-36
Figure 02_image145
在某些具體實例中，該LNP係包括一式(III)之脂質、RNA、一中性脂質、一類固醇和一peg化脂質。在某些具體實例中，式(III)之脂質為化合物III-3。在某些具體實例中，中性脂質為DSPC。在某些具體實例中，該類固醇為膽固醇。在某些具體實例中，該peg化脂質為ALC-0159。 ALC-0159 ：
Figure 02_image147
在某些具體實例中，陽離子脂質係以從約40至約50莫耳百分比之量存在LNP中。在一具體實例中，中性脂質係以從約5至約15莫耳百分比之量存在LNP中。在一具體實例中，類固醇係以從約35至約45莫耳百分比之量存在LNP中。在一具體實例中，peg化脂質係以從約1至約10莫耳百分比之量存在LNP中。
在某些具體實例中，LNP係包括從約40至約50莫耳百分比之量的化合物III-3，從約5至約15莫耳百分比之量的DSPC，從約35至約45莫耳百分比之量的膽固醇，及從約1至約10莫耳百分比之量的ALC-0159。
在某些具體實例中，LNP係包括 約47.5莫耳百分比之量的化合物III-3，約10莫耳百分比之量的DSPC，約40.7莫耳百分比之量的膽固醇，及約1.8莫耳百分比之量的ALC-0159。
N/P值較佳地為至少約4。在某些具體實例中，N/P值的範圍係從4至20，4至12，4至10，4至8，或5至7。在一具體實例中，N/P值為約6。 醫藥組成物
文中所述的藥劑，例如編碼標簽化合物或效應子探針之RNA可以醫藥組成物或醫藥品來給藥且可以任何適合的醫藥組成物形式來投予。
在本發明所有方面之一具體實例中，文中所述的組份，例如編碼標簽化合物或效應子探針之RNA可以醫藥組成物來給藥，而該醫藥組成物可包括一醫藥上可接受載劑及可視需要包括一或多種佐劑、安定劑等。在一具體實例中，該醫藥組成物係用於治療性或預防性治療，例如，用於治療或防止疾病。
術語「醫藥組成物」係關於包括治療上有效的藥劑，較佳地與醫藥上可接受載劑、稀釋劑及/或賦形劑一起之調配物。該醫藥組成物可藉由將該醫藥組成物投予對象，有效用於治療、防止或降低疾病或病症的嚴重度。醫藥組成物在本項技術中亦稱為醫藥調配物。
根據本文之醫藥組成物一般係以「醫藥上有效量」及「醫藥上可接受的製備物」來施用。
術語「醫藥上可接受」係指不會與醫藥組成物的活性成份之作用交互作用之無毒物質。
術語「醫藥上有效量」或「治療上有效量」係指單獨或進一步與另外的劑量及/或藥劑共同達到所欲反應或所用效應之量。在治療一特定疾病的情況下，所欲的反應較佳地係關於抑制病程。此項包括延緩疾病的進程及，特言之，擾亂或反轉疾病的進程。在治療疾病中所欲的反應亦可為延遲或防止該疾病或該症狀發作。文中所述的組成物之有效量將依照所治療的症狀、疾病的嚴重度、病患的個體參數，包括年齡、生理狀況、體型和體重、治療持續時間、伴隨治療之類型(若有的話)、特定的給藥路徑及類似因素而定。因此，文中所述的組成物之給藥劑量可依照各種此等參數而定。在病患對於起始劑量反應不足的情況下，可使用較高的劑量(或藉由不同更局部的路徑給藥，達到有效較高劑量)。
本文之醫藥組成物可含有鹽類、緩衝劑、防腐劑，及視需要其他的治療劑。在一具體實例中，本文之醫藥組成物係包括一或多種醫藥上可接受載劑、稀釋劑及/或賦形劑。
適合用於本文之醫藥組成物的防腐劑包括，不限於，苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、氯丁醇(chlorobutanol)、對羥基苯甲酸酯(paraben)和硫柳汞(thimerosal)。
術語「賦形劑」如文中所用係指可存在本文之醫藥組成物，但並非活性成份之物質。賦形劑之實例，包括(不限於)載劑、結著劑、稀釋劑、潤滑劑、增稠劑、界面活性劑、防腐劑、安定劑、乳化劑、緩衝劑、調味劑或色素。
術語「稀釋劑」係關於稀釋及/或降黏劑。再者，術語「稀釋劑」係包括任何一或多種液體或固體懸浮液及/或混合媒劑。適合的稀釋劑之實例包括乙醇、甘油和水。
術語「載劑」係指可為天然、合成、有機之組份，其中係與活性成份組成以便於促進、提升或能夠投予該醫藥組成物。載劑如文中所用可為一或多種適合投予一對象之相容的固體或液體填充劑、稀釋劑或包膠物質。適合的載劑包括，不限於無菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、無菌氯化鈉溶液、等張食鹽水、聚二醇類、氫化萘及，尤其是，生物相容的交酯聚合物、交酯/乙醇酸交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物。在一具體實例中，本文之醫藥組成物係包括等張食鹽水。
治療用途的醫藥上可接受載劑、賦形劑或稀釋劑已為醫藥技術所熟知，並描述於，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)。
醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑可就有關所希望的給藥路徑和標準的醫藥施行來選擇。
在一具體實例中，文中所述之醫藥組成物可以靜脈內、動脈內、皮下、皮內、肌肉內給藥。在特定的具體實例中，該醫藥組成物係經調配供局部給藥或全身給藥。全身給藥可包括係涉及經由胃腸道吸收之經腸給藥，或非經腸給藥。如文中所用，「非經腸給藥」係指以任何經由胃腸道以外的方式投予，例如藉由靜脈內注射。在一較佳的具體實例中，該醫藥組成物係經調配供肌肉內給藥。在另外的具體實例中，該醫藥組成物係經調配供全身給藥，例如，靜脈內給藥。
術語「共投予」如文中所用係指藉此將不同的化合物或組成物，例如編碼一標簽化合物和效應子探針之RNA投予相同的病患。不同的化合物或組成物可同時，於基本上相同的時間或先後給藥。 治療
文中所述的藥劑、組成物和方法可用於治療患有疾病，例如，特徵為存有表現一抗原(其可作為主要目標)之罹病細胞之疾病的對象。特佳的疾病為癌症疾病。例如，若抗原係衍生自病毒，則此等藥劑、組成物和方法可有效用於治療由該病毒所造成的病毒疾病。若該抗原為一腫瘤抗原，則該等藥劑、組成物和方法可有效用於治療其中癌細胞係表現該腫瘤抗原之癌症疾病。
文中所述的藥劑、組成物和方法可用於治療性或預防性治療各種疾病。在一具體實例中，文中所述的藥劑、組成物和方法可有效用於預防性及/或治療性治療涉及抗原之疾病。
術語「疾病」係指影響個體之身體的異常狀況。疾病通常係解釋為與特定徵候和徵狀有關的醫學症狀。疾病可由源自於外部來源之因子所引起，例如感染性疾病，或其可能由內部功能失調所造成，例如自體免疫疾病。在人類中，「疾病」通常係廣義地用來指對患病的個體造成疼痛、功能失調、痛苦、社會問題或死亡之症狀，或接觸該個體之類似問題。從廣義上來說，其有時候係包括受傷、失能、病症、症候、感染、分離症候、偏差行為和非典型結構和功能之變異，而在其他的內容及就其他目的，這些可視為可區別的項目。疾病通常不僅在身體上影響個體，亦可能情緒上影響個體，當染上和患有許多疾病可能改變個體的生命觀點及其個性。
在本內文中，術語「治療（treatment、treating）」或「治療性干預」係關於就打擊症狀，例如疾病或病症為目的管理和照護一對象。此術語希望係包括全方位治療對象患有的特定症狀，例如投予治療上有效的化合物用以減輕此等症狀和併發症，延緩疾病、病症或症狀的進程，減輕或緩解徵候和併發症，及/或治癒或消除疾病、病症或症狀，以及防止症狀，其中防止應理解為就打擊該疾病、症狀或病症為目的管理和照護個體並包括投予活性化合物用以防止症候或併發症的發生。
術語「治療性治療」係關於改善健康狀態及/或延長(增加)個體壽命之任何治療。該治療可消除個體中的疾病，遏止或延緩個體中疾病的發展，抑制或延緩個體中疾病發展，降低個體中症候的頻率和嚴重度，及/或於目前具有或先前具有一疾病之個體中降低復發。
術語「預防性治療」或「防止性治療」係關於希望防止一疾病於個體中發生之任何治療。術語「預防性治療」或「防止性治療」在文中可交換使用。
術語「個體」和「對象」在文中可交換使用。其係指可罹患一疾病或病症或易受一疾病或病症(例如癌症)影響，但可能會或不會具有該疾病或病症之人類或另外的哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、貓、牛、豬、綿羊或靈長類)。除非另有說明，否則術語「個體」和「對象」並非指特定年齡，且因此係包括成人、老年者、孩童和新生兒。在本文之具體實例中，「個體」和「對象」為「病患」。
術語「病患」係指治療的個體或對象，特言之罹病的個體或對象。
在本文之一具體實例中，目標為遞送醫藥活性劑(包括化合物和細胞)至表現抗原之罹病的細胞，例如表現腫瘤抗原的癌細胞，並治療疾病，例如涉及表現一抗原，例如腫瘤抗原之細胞的癌症疾病 。
術語「涉及抗原的疾病」，「涉及表現一抗原之細胞的疾病」或類似術語係指牽涉一抗原之任何疾病，例如特徵為呈現抗原之疾病。涉及抗原的疾病可為染感性疾病或單純癌症。如上所提，抗原可為疾病相關抗原，例如腫瘤抗原，病毒抗原或細菌抗原。在一具體實例中，涉及抗原的疾病為涉及表現一抗原，較佳地於細胞表面之細胞的疾病。
術語「感染性疾病」係指可在個體間傳送或生物體間傳送的疾病，且其係由微生物所造成(例如一般感冒)。感染性疾病已為本項技術所知並包括，例如，疾病係分別由病毒、細菌或寄生蟲所造成之病毒疾病、細菌疾病或寄生蟲疾病。就此，該感染性疾病可為，例如，肝炎、性傳染病(例如，披衣菌或淋病)、肺結核、HIV/後天免疫不全症候群(AIDS)、白喉、B型肝炎、C型肝炎、霍亂、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)、禽流感和流感。
術語「癌症疾病」或「癌症」係指或描述一個體中的生理狀況，其典型地特徵為不受調控的細胞生長。癌症的實例包括，但不限於，惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤和白血病。更特言之，此等癌症的實例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰臟癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼球內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、臀部癌、胃癌、大腸癌、乳癌、前列腺癌、子宮癌、性生殖器官癌症、何杰金氏症(Hodgkin's Disease)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、膀胱癌、腎癌、腎細胞癌、腎盂癌、中樞神經系統(CNS)的腫瘤、神經外胚癌、脊髓腫瘤、膠質瘤、腦膜瘤和腦下垂體腺瘤。術語「癌症」根據本文亦包括癌症轉移。
術語「實體腫瘤」或「實體癌症」如文中所用係指癌團的顯現，如本項技術所熟知的，例如 Harrison's Principles of Internal Medicine，第14版。較佳地，此術語係指血液以外的身體組織之癌症或惡性腫瘤，較佳地血液、骨髓和淋巴系統以外。例如，但不限於，實體腫瘤係包括前列腺癌、肺癌、大腸直腸組織癌、膀胱癌、口咽/喉部組織癌症、腎癌、乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌、子宮頸癌、位癌、胰臟癌、腦癌和中樞神經系統癌症。
文中參照的文件引用和研究並非意欲承認任何前述者為相關先前技術。所有有關這些文件內容的陳述係以申請者可取得的資訊為基礎且不構成任何承認這些文件的內容的正確性。
呈現下列說明係使熟習本項技術之一般技術者能製作和使用該等不同的具體實例。僅提供特定的裝置、技術和施用之說明作為實例。文中所述之實例的各種修飾對於熟習本項技術之一般技術者為顯而易見的，且在不悖離各種具體實例的精神和範圍下，文中所定義的通則可適用於其他實例和應用。因此，該等各種實例不希望受限於文中所述的實例，而應符合與專利申請項一致的範圍。 實例 材料和方法 細胞和細胞培養
將人類CLDN6 (CHO-K1-CLDN6)、CHO-K1-MOCK、FlpIn-CHO-GFP和人類CD3表現細胞(FlpIn-CHO-huCD3)置於添加10% (v/v)胎牛血清(FBS)和600 µg/mL潮黴素B(Hygromycin B)(用於FlpIn-CHO-huCD3和–GFP)及1 mg/mL遺傳黴素(Geneticin)(用於CHO-K1-CLDN6)之杜氏修飾營養素混合物F-12 (DMEM/F-12)培養基中生長。將細胞維持在37°C，5% CO 2-溼化大氣及每48-72 h繼代培養。讓HEK297T-17細胞生長於添加10% FBS之杜氏修飾營養素混合物(DMEM)培養基並維持在37°C，5% CO 2-溼化大氣及每48-72 h繼代培養。就大規模生產雙專一性蛋白，係使用來自Invitrogen公司之Freestyle™ CHO-S細胞株。將細胞置於蓋上通氣孔蓋之聚碳酸酯、拋棄式、無菌的Erlenmeyer燒瓶中培養(125 mL)使用15-25%的標稱容量以120-135 rpm (Minitron震盪培養箱，Infors-HT)於標準的溼化條件下(37°C和8% CO 2)培養。當密度達到約1-1.5 x 10 6個活細胞/mL時，將細胞繼代培養，就CHO細胞(CDCHO培養基，Invitrogen)，典型地為每48-72 h於添加1 X HT 添加物和4 mM麩醯胺酸之無蛋白化學定義培養基。
就分析轉譯效能，係將RNA電穿孔至HEK-293-T-17細胞中並將包括RiboDocker蛋白的細胞培養上清液以SDS PAGE和西方墨點分析。 雙專一性蛋白之建構和親和純化
藉由基因合成(TWIST Bioscience)產生人類密碼子最適化的Fab、scFv, IgG或VHH序列。將抗-CLDN6 (IMAB027) IgG (VH-CH1-3)、Fab片段(VH-CH1)、抗-CD3 scFv (TR66)或抗-CD3 VHH (F04)結構使用(G4S1)1胜肽連接子編碼序列與抗-ALFA VHH(NanoTag)融合，並裝配上分泌訊號序列和6xHis-標籤序列(參見表1和2及圖1和2上的序列)。就重組表現雙專一性結構，係將CHO-S細胞以MaxCyte流式電穿孔條件使用製造商的方案電穿孔。從CHO-S生產細胞株收取培養上清液並將重組蛋白經由Capturem His-tagged Purification Maxiprep套組(TaKaRa)純化。以SDS-PAGE和考瑪斯亮藍染色檢測質性以及使用過氧化酶接合的單株抗體抗-6xHis-標籤抗體進行西方墨點分析。 HEK293_T17 細胞之電穿孔
將HEK-293_T17細胞以X-Vivo培養基(Biozym)調整至8 x 10 6/mL之密度。將250 µL的細胞轉置於0.4 cm比色管(VWR)並以25 µL經10 mM HEPES/0.1 mM EDTA稀釋的RNA電穿孔(0.1 mg/mL或0.01 mg/mL之最終RNA濃度)，或僅HEPES/EDTA緩衝液作為空白對照組。使用ECM830裝置(BTX Harvard Aparatus)的電穿孔條件為250福特(Volt)，2脈衝，5 ms。隨後將細胞添加750 µL Expi293 TM培養基(Gibco)至總計1 mL含有2x10 6個細胞。將這些植入12-孔細胞培養盤(Cellstar)的孔槽。48小時後收取細胞培養上清液，離心(300 x g, 10 min)並儲存於2–8°C直到以流式細胞儀分析(FACS)。 合成 ALFA-Dye 胜肽
化學合成ALFA胜肽並與Cy5或Alexa-Fluor-680 (AF680)染劑接合。經由無銅點擊化學使用不同策略連接Cy5：在第一結構中(Cy5-DBCO-疊氮化物-ALFA-NH2)將Cy5-DBCO(二苯并伸環辛基)與在N端含一疊氮基團之C端醯胺化的ALFA胜肽接合。就其他結構(Cy5-疊氮化物-FCO-ALFA-OH，Cy5-疊氮化物-FCO-ALFA-NH2)係使用Cy5-疊氮化物與含有FCO(氟環辛炔基)之Alfa胜肽進行點擊反應。AF680接合的胜肽係從Pepscan和JPT訂購。在這些情況下，螢光團係經由短的PEG3間隔子(Pepscan)或使用導入的N端半胱胺酸殘基連接，其係讓馬來醯亞胺為基礎的巰基基團接合得以進行。不同ALFA胜肽螢光團接合物係如圖3中所示。 FACS 分析
將細胞植入96孔微量滴定盤(圓底)至2×10 5的最終密度並在標示的ALFA雙專一性抗體的存在下於4°C培養1 h。之後，以FACS-緩衝液(1x PBS+5 mL 0.5 M EDTA+10 mL FBS)清洗細胞並以ALFA-Cy5或ALFA-AF680胜肽於冰上培養30 min。另一次的FACS緩衝液沖洗步驟後，以FACS Celesta (BD Biosciences)分析細胞。使用激發雷射線633 nm來偵測Cy5和AF680訊號。 實例 1 ： 雙專一性結構 之 活體外功能分析
藉由如上述之基因合成產生如圖1和2所示之雙專一性結構序列。化學合成ALFA胜肽並與如上述之Cy5或Alexa-Fluor-680接合。
圖4至6係顯示標靶(CLDN6或CD3)過度表現細胞及目標陰性細胞(FlpIn-CHO-MOCK)之FACS分析。在圖4中細胞係於純化、重組的抗-CLDN6-抗-ALFA抗體和螢光標定的ALFA胜肽之存在下分析。使用下列的量/濃度： 1.      100 nM aALFA X aCLDN6 VH(IMAB027)-CH1-H6包括VL-CL(IMAB027) (ALFA X aCLDN6 VH(IMAB027)-CH1-H6：VL-CL(IMAB027)之間的比率 = 1：1.5) 2.      100 nM aCLDN6 VH(IMAB027)-CH1 X aALFA-H6包括VL-CL(IMAB027) (aCLDN6 VH(IMAB027)-CH1 X aALFA-H6 ：VL-CL(IMAB027之間的比率= 1：1.5) 3.      100 nM aALFA X aCLDN6 VH(IMAB027)CH1-CH2-CH3-H6包括VL-CL(IMAB027)(aALFA X aCLDN6 VH(IMAB027)CH1-CH2-CH3-H6：VL-CL(IMAB027)之間的比率= 1：2.5) 4.      100 nM aCLDN6 VH(IMAB027)CH1-CH2-CH3 X aALFA-H6包括VL-CL(IMAB027)(aCLDN6 VH(IMAB027)CH1-CH2-CH3 X aALFA-H6 ：VL-CL(IMAB027)之間的比率= 1：2.5) 1.-4.      + VL-CL(IMAB027) a)        1 µg/mL Cy5-DBCO-疊氮化物-ALFA-NH2 b)       1 µg/mL Cy5-疊氮化物-FCO-ALFA-OH c)        1 µg/mL Cy5-疊氮化物-FCO-ALFA-NH2 d)       或1 µg/mL ALFA-AF680
在圖5中細胞係在純化重組的抗-CD3-抗-ALFA抗體和所示量之(1、0.2、0.04、0.008、0.0016和0.00032 µg/mL)之Cy5-DBCO-Azioe-ALFA-NH2螢光標定的ALFA胜肽的存在下分析。使用下列結構和量/濃度： 1.        240 nM aALFA X aCD3 VL-VH(TR66)-H6 2.        156 nM aCD3 VL-VH(TR66) X aALFA-H6 3.        294 nMaCD3 VHH (F04) X aALFA-H6 4.        416 nMaALFA X aCD3 VHH (F04)-H6
圖4 & 5中FACS測量就復合的(aALFA-ALFA胜肽連接的)結構在其個別細胞表面標靶的存在下顯示特異性螢光密度增加。
在圖6中，係分析經純化、重組的雙專一性抗體處理的細胞與以表現相同結構之RNA轉染的HEK293T-17細胞上清液培養的細胞之比較。本處，就純化、重組的蛋白和RNA電穿孔後細胞上清液中的蛋白，此實驗顯示類似的結果。 實例 2 ： 用於癌症之模組 化、雙專一性抗體
在本實例中，如圖7所示，將腫瘤專一性配體，與抗-ALFA VHH序列融合的抗-CLDN6 scFv，和抗-T細胞專一性配體，與ALFA-標籤融合的抗-CD3 VHH，以二種包膠於液體奈米粒的個別編碼RNA之形式投予病患。液體奈米粒係由肝細胞吸收，然後表現二種雙專一性融合蛋白並將其釋放血液中。抗-CLDN6 x 抗-ALFA靶向配體係堆積在腫瘤位置而抗-CD3-ALFA-標籤係堆積在T細胞位置。經由抗-ALFA VHH 對ALFA-標籤的高專一性，二種細胞群族(腫瘤細胞和T-細胞)彼此相互連結。此舉觸發了CD3-媒介的T細胞活化，導致腫瘤細胞溶離。所述的過程理論上普遍適用於不同的腫瘤抗原和免疫細胞抗原。 實例 3 ： 通用 CART 法
在本實驗中，如圖8中所示，產生CAR-T細胞，其中係將以一標籤為目標的結合基團作為辨識區，與嵌合抗原受體之絞鏈、跨膜和胞內訊號區融合。為了降低成本及能快速供應病患，同種異體的CART細胞為就此目的之首選，其可經由已建立的方法來產生，如αβ T-細胞去除之基因工程。將通用的CART細胞投予病患。就第二組份，係將腫瘤專一性靶向配體，例如抗-CLDN6 scFv，與標籤序列融合並以包膠於脂體奈米粒的RNA投予病患。脂體奈米粒係由肝細胞吸收，然後表現該雙專一性融合蛋白並將其釋放於血液中。靶向配體係堆積在腫瘤位置，在該處最後通用CAR-T細胞可結合及媒介殺死腫瘤細胞，所述的過程理論上普遍適用於不同的腫瘤抗原且基本上應能提升功效以及能經由提供編碼不同靶向配體之RNA的混合物同時靶定數種抗原。本方法之另外的主要優點為在缺乏靶向配體下，CAR-T細胞的安全持久性。若腫瘤細胞消除了，此舉能在無耗竭CAR-T細胞下暫停治療，及在腫瘤復發的情況下平行地提供使用相同或另外靶向配體持續治療之選項。 實例 4 ： 用於靶向 ALFA 胜肽 呈現奈米粒子之 RiboDocker RiboDocker 生產和品質控制
以25 µg 編碼CD3-VHH(F04) X ALFA-VHH之RNA(25 µL 10 mM Hepes, 0.1 mM EDTA)，藉由電穿孔2x 10 6個HEK293T-17細胞產生對抗CD3和ALFA-胜肽之RiboDocker(以250 µL X-Vivo15培養基)。以無RNA的緩衝液電穿孔細胞，作為陰性對照(空白)。48小時後，收取細胞上清液並過濾。分析式SDS-PAGE和西方墨點確認成功產生RiboDocker並於CD3-表現細胞株上進行流式細胞分析驗證其功能性。 奈米粒子 -RiboDocker 實驗
就奈米粒-RiboDocker 實驗，係將15 µL含有RiboDocker的上清液以塗覆15 µL ALFA-胜肽的脂質複合物(PLX)於室溫培養5 min。PLX具有15或7.5之N/P比率並且承載編碼報導子基因螢光素酶和Thy1.1的多核酸。使用無ALFA-胜肽的奈米粒子作為陰性對照。
將5x 10 5個CD3表現JurkaT細胞(100 µL)以6 µL的RiboDocker-PLX混合物於96孔深孔盤在37°C培養 5 min。使用空白上清液作為陰性對照及1.25 µg/mL純化aCD3-VHH(F04) X aALFA-VHH蛋白做為陽性對照。每孔加入400 µL生長培養基(RPMI + 10% FBS)。就隔夜培養係將100 µL的混合物植入96孔白色平底盤供螢光素酶分析及將250 µL植入96孔圓底盤供FACS分析(Thy1.1偵測)。於37°C, 5% CO 2進行隔夜培養。 分析
為了評估成功生產RiboDocker，其ALFA-塗覆PLX之aALFA-VHH-媒介的結合，隨後的粒子之內化和報導子基因表現，係經由流式細胞分析之發光和Thy1.1表現，測量螢光素酶活性。
就螢光素酶分析，係將50 µL Bright-Glo-分析基質加到96孔白色平底盤的每個孔槽(100 µL細胞懸浮液)並於室溫黑暗中培養3 min。以Tecan判讀儀測量發光。
將Thy1.1陽性細胞以a-Thy1.1-AF647(選植株OX-7)染色進行流式細胞術。將死的細胞(eFlour450 +)從分析中排除。藉由將Thy1.1 +細胞的中位數螢光密度(MFI)乘以Thy1.1 +細胞之分率比較FACS-數據。
圖9係顯示RiboDocker促進特定塗覆ALFA的奈米粒攝入至目標細胞並從其運送的核酸加以表現。
無
圖 1 ：抗 -ALFA 和抗 -CLDN6 雙專一性結構之序列
此圖係顯示與四個抗-ALFA和抗-CLDN6雙專一性結構有關的五種序列。圖1A從上而下係顯示a)抗-Claudin-6抗體的可變重鏈片段於C端經由GS連接子與帶有C端His-標籤之抗-ALFA-VHH相連接，b)抗-ALFA-VHH於C端經由GS連接子與帶有一C端His-標籤之抗-Claudin-6抗體的可變重鏈片段相連接，及c)全長的抗-Claudin-6抗體重鏈於C端經由GS連接子與帶有C端His-標籤之抗-ALFA-VHH相連接。圖1B係顯示d)抗-ALFA-VHH於C端經由GS連接子與帶有C端His-標籤之全長的抗-Claudin-6抗體重鏈相連接，及e)抗-Claudin-6抗體之輕鏈可變片段。所有的序列係包括N端分泌或前導訊號。個別的序列元件係強調標示於圖中。
圖 2 ：抗 -ALFA 和抗 -CD3 雙專一性結構之序列
此圖係顯示與四個抗-ALFA和抗-CD3雙專一性結構相關的四種序列。圖2從上而下係表示a) 一抗-ALFA-VHH於C端經由一GS連接子與帶有一C端His-標籤之抗-CD3-VHH(F04)相連接，b)一抗-CD3-VHH(F04)於C端經由一GS連接子與帶有一C端His-標籤之抗-ALFA-VHH相連接，c)一抗-ALFA-VHH於C端經由GS連接子與帶有一C端His-標籤之抗-CD3抗體(TR66)的單鏈可變片段(scFv)相連接，及d)抗-CD3抗體(TR66)的單鏈可變片段(scFv)於C端經由一GS連接子與帶有一C端His-標籤之抗-ALFA-VHH相連接。所有的序列係包括一N端分泌訊號。個別的序列元件係強調標示於圖中。
圖 3 ：合成的 ALFA-染劑胜肽之概觀
合成的ALFA-染劑胜肽之概觀：以螢光團Cy5或Alexa Fluor 680 (AF680)檢測接合合成的ALFA-胜肽之不同的接合反應(i)無銅點擊化學，(ii)半胱胺酸馬來醯亞胺接合，及(iii)經由小的PEG3間隔子接合。經由點擊化學建立三個不同結構之Cy5接合的ALFA-胜肽 (i)：Cy5-DBCO-疊氮化物-ALFA-NH2，Cy5-疊氮化物-FCO-ALFA-OH，Cy5-疊氮化物-FCO-ALFA-NH2。
圖 4 ：雙專一性抗 -CLDN6 和抗 -ALFA 結構之結合分析
圖4A係顯示靶向ALFA-標籤和CLDN6之雙專一性結構的流程概要。在圖4B中將CLDN6過度表現細胞和目標陰性細胞以Cy5-ALFA或ALFA-AF680胜肽在無(無RiboDocker)或有ALFA-雙專一性靶向CLDN6結構的存在下培養(以IMAB027 Fab或IgG結構為基準)，並藉由FACS分析。
圖 5 ：雙專一性抗 -CD3 和抗 -ALFA 結構之結合分析
雙專一性抗-CD3和抗-ALFA結構之結合分析。將CD3過度表現細胞和目標陰性細胞以DBCO-ALFA-NH2胜肽在無(無RiboDocker)或有ALFA-雙專一性靶向CD3結構的存在下培養(以TR66 scFv或VHH抗CD3為基準)，並藉由FACS分析。
圖 6 ：雙專一性抗 -CD3( 以 RNA 投予 ) 和抗 -ALFA 結構之結合分析
藉由HEK-293T-17細胞之電穿孔產生RiboDocker抗CD3和ALFA-胜肽。使用不同濃度(2.5 µg, 25 µg)的編碼aALFA-VHH X aCD3-VHH(F04)或aCD3-VHH(F04) X aALFA-VHH之RNA進行HEK293T-17細胞之電穿孔。在一定義時間點之後，收取上清液並用於FACS之結合分析。因此，將目標過度表現細胞和目標陰性細胞以100 µL上清液培養，接著Cy5-DBCO-ALFA-NH2胜肽培養。將做為陰性對照的Cy5-DBCO-ALFA-NH2胜肽與細胞在無RiboDocker但具有抗-ALFA VHH下培養。使用二種不同濃度(100 nM和500 nM)的aALFA-VHH X aCD3-VHH(F04)或aCD3-VHH(F04) X aALFA-VHH純化蛋白做為陽性對照。
圖 7 ：用於癌症治療之模組、雙專一性抗體
此圖係含有使用模組化、雙專一性抗體之癌症治療法的流程說明。文中，係以編碼DNA形式提供帶有對於標籤具專一性之第一結合基團及針對腫瘤相關抗原之第二結合基團的第一結構。將此RNA調配成脂質奈米粒子投予一病患。此RNA在活體內轉譯成雙專一性蛋白並釋放於血液中。將一包括標籤和第三結合基團的第二結構投予該病患(例如，以編碼RNA的形式並調配成脂質奈米粒)，釋放至血液並與該第一結構結合。依照該第三結合基團的專一性，此複合物將招募新的效應子，例如吸引腫瘤的免疫細胞。
圖 8 ：模組化 CAR-T 細胞法
此圖係含有以ALFA-tag/NbALFA實例上成對的模組化相互作用為基礎之通用CAR-T法的流程說明。文中產生一通用和現成可生產的CART細胞(1)其在其表面係帶有一標籤-結合基團(例如NbALFA VHH)。將一第二結合基團，所謂的靶向配體(TL)，由ALFA-標籤與腫瘤抗原專一性配體所組成(例如scFv，VHH或Fab片段)，以脂質奈米粒調配RNA投予該病患(2)。此RNA在活體內係轉譯成雙專一性蛋白，釋放至血液中。以其與特定腫瘤抗原之專一結合為基礎，在靶向配體堆積在腫瘤上後，其將被NbALFA-CAR T細胞結合，而活化成為導致腫瘤細胞溶離之結果(3)。藉由使用不同的靶向配體，連續或平行地使用該病患的相同CART細胞產物，可對付不同的腫瘤抗原。
圖 9 ：用於靶向 ALFA 胜肽呈現奈米粒之 RiboDocker
藉由HEK293T-17細胞之電穿孔產生RiboDocker抗CD3和ALFA-胜肽。使用25 µg編碼aCD3-VHH(F04) X aALFA-VHH之RNA進行HEK293T-17細胞之電穿孔。48 h後，收取帶有RiboDocker1之5 µL上清液並以15 µL包膠受體基因(用於螢光酶和Thy1.1)之ALFA-胜肽呈現奈米粒(PLX = 帶有不同N/P比率的脂質複合物(polyplex))培養。使用無ALFA-胜肽做為陰性對照奈米粒。培養後，以6 µL的RiboDocker-奈米粒混合物培養5x 10 5個CD3表現細胞。使用1.25 µg/mL的aCD3-VHH(F04) X aALFA-VHH純化蛋白作為陽性對照。加入400 µL生長培養基及將100 µL的混合物植入平底盤供螢光酶分析並使用250 µL進行FACS分析用以偵測Thy1.1訊號。 N/P 比率：帶正電聚合物胺(N=氮)基團與帶負電核酸磷酸(P)基團之比率。
無
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Claims (74)

  1. 一種對目標細胞靶向遞送酬載(payload)之方法，係包括： (i)     以編碼包括一第一結合基團的胜肽或多肽之RNA轉染一或多個細胞； (ii)   讓該一或多個細胞表現該胜肽或多肽，使得其與目標細胞相連結並將第一結合基團展示在目標細胞的表面；及 (iii) 加入包括或連接一第二結合基團的酬載； 其中該第一結合基團和第二節基團係彼此相互結合。
  2. 如請求項1之方法，其中係藉由將該一或多個細胞與包括RNA的粒子接觸，將該RNA轉染該一或多個細胞。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該等粒子係包括以該一或多個細胞為目標的靶向分子。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該一或多個細胞係包括或由目標細胞所組成。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，該一或多個細胞係表現包括一第一結合基團之胜肽或多肽，使得其仍與該一或多個細胞結合。
  6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該一或多個細胞與目標細胞不同。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該一或多個細胞係表現包括一第一結合基團之胜肽或多肽，使其被該一或多個細胞所分泌。
  8. 如請求項1至3、6和7中任一項之方法，其中該一或多個細胞係表現包括一第一結合基團之胜肽或多肽，使其釋放於血液中。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該包括一第一結合基團之胜肽或多肽係包括與目標細胞上的目標結合之第三結合基團。
  10. 如請求項9之方法，其中該標的為一細胞表面抗原。
  11. 如請求項9或10之方法，其中該第一結合基團和該第三結合基團係彼此相互連接。
  12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該第一結合基團和該第三結合基團係彼此共價相互連接。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該第一結合基團為一抗體或抗體衍生物。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中該第二結合基團為一胜肽標籤。
  15. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該第一結合基團為一胜肽標籤。
  16. 如請求項1至12和15中任一項之方法，其中該第二結合基團為一抗體或抗體衍生物。
  17. 如請求項9至16中任一項之方法，其中該第三結合基團為一抗體或抗體衍生物。
  18. 如請求項13、14、16和17中任一項之方法，其中該抗體衍生物為一抗體片段。
  19. 如請求項1至14、17和18中任一項之方法，其中該胜肽或多肽為雙專一性抗體。
  20. 如請求項19之方法，其中該雙專一性抗體為雙專一性單鏈抗體。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該第二結合基團和該酬載係共價或非共價相互連接。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該酬載係包括一醫藥活性劑。
  23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該酬載係包括一診斷化合物。
  24. 如請求項1至23中任一項之方法，其中該酬載係包括一治療化合物。
  25. 如請求1至24項中任一項之方法，其中該酬載係包括一載劑。
  26. 如請求項25之方法，其中該載體為顆粒載體。
  27. 如請求項26之方法，其中該顆粒載體係包括脂質基底的粒子、聚合物基底的粒子或其混合物。
  28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中該載體係併入一診斷化合物。
  29. 如請求項25至28中任一項之方法，其中該載體係併入一治療化合物。
  30. 如請求項1至29中任一項之方法，其中該酬載係包括一第四結合基團。
  31. 如請求項30之方法，其中該第四結合基團係與細胞表面抗原結合。
  32. 如請求項31之方法，其中與該第四結合基團結合的細胞表面抗原係存在免疫細胞上。
  33. 如請求項1至32中任一項之方法，其中該目標細胞細存在一對象中。
  34. 如請求項1至33中任一項之方法，其係於活體內進行。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，係包括投予一對象： (i)     編碼一包括第一結合基團之胜肽或多肽的RNA或包括該RNA的粒子；及 (ii)   包括或連接一第二結合基團的酬載或編碼該酬載的RNA。
  36. 如請求項1至35中任一項之方法，其係用於診斷及/或治療疾病，其中該目標細胞係表現或可表現與該疾病有關的抗原。
  37. 如請求項1至36中任一項之方法，其中該目標細胞為罹病的細胞。
  38. 如請求項9至37中任一項之方法，其中該標靶為腫瘤抗原。
  39. 如請求項1至38中任一項之方法，其中該目標細胞為腫瘤或癌細胞。
  40. 如請求項1至39中任一項之方法，其中該目標細胞為免疫效應子細胞。
  41. 如請求項1至35和40中任一項之方法，其中該目標細胞為T細胞。
  42. 如請求項40或41之方法，其中該目標為一該免疫效應子細胞之特徵性抗原。
  43. 如請求項1至35和40至42中任一項之方法，其係用於將編碼一抗原受體之核酸遞送至免疫效應子細胞。
  44. 一種用於一對象中向目標細胞靶向遞送酬載之方法，其係包括投與該對象： (i)     編碼一包括第一結合基團的胜肽或多肽之RNA；及 (ii)   包括或連接一第二結合基團的酬載或編碼該酬載的RNA； 其中該第一結合基團和該第二結合基團係彼此相互連接且其中包括第一結合基團的該胜肽或多肽進一步係包括與目標細胞上的抗原結合之第三結合基團。
  45. 如請求項44之方法，其中該RNA，當投予時，係存在粒子中。
  46. 如請求項44或45之方法，其中在投予該RNA後，包括第一結合基團和第三結合基團的該胜肽或多肽係被該對象的一或多個細胞所表現。
  47. 如請求項46之方法，其中該一或多個細胞係分泌包括第一結合基團和第三結合基團的該胜肽或多肽。
  48. 如請求項46或47之方法，其中該一或多個細胞係表現該包括第一結合基團和第三結合基團的胜肽或多肽，使得其釋放至血液中。
  49. 一種向目標細胞靶向遞送酬載之套組，係包括： (i)     編碼一包括第一結合基團的胜肽或多肽之RNA；及 (ii)   包括或連接一第二結合基團的酬載或編碼該酬載的RNA； 其中該第一結合基團和該第二結合基團係彼此相互結合。
  50. 如請求項49之套組，其中該包括第一結合基團的胜肽或多肽係包括一與目標細胞上的目標結合之第三結合基團。
  51. 如請求項50之套組，其中該目標為一細胞表面抗原。
  52. 如請求項50或51之套組，其中該第一結合基團和該第三結合基團係彼此相互連接。
  53. 如請求項50至52中任一項之套組，其中該第一結合基團和該第三結合基團係彼此共價相互連接。
  54. 如請求項49至53中任一項之套組，其中該第一結合基團為一抗體或抗體衍生物。
  55. 如請求項49至54中任一項之套組，其中該第二結合基團為一胜肽標籤。
  56. 如請求項49至53中任一項之套組，其中該第一結合基團為一胜肽標籤。
  57. 如請求項49至53和56中任一項之套組，其中該第二結合基團為一抗體或抗體衍生物。
  58. 如請求項50至57中任一項之套組，其中該第三結合基團為一抗體或抗體衍生物。
  59. 如請求項54、55、57和58中任一項之套組，其中該抗體衍生物為一抗體片段。
  60. 如請求項49至55、58和59中任一項之套組，其中該胜肽或多肽為雙專一性抗體。
  61. 如請求項60之套組，其中該雙專一性抗體為雙專一性單鏈抗體。
  62. 如請求項49至61中任一項之套組，其中該第二結合基團和該酬載係共價或非共價相互連接。
  63. 如請求項49至62中任一項之套組，其中該酬載係包括 一醫藥活性劑。
  64. 如請求項49至63中任一項之套組，其中該酬載係包括一診斷化合物。
  65. 如請求項49至64中任一項之套組，其中該酬載係包括一治療化合物。
  66. 如請求項49至65中任一項之套組，其中該酬載係包括一載劑。
  67. 如請求項66之套組，其中該載體為一顆粒載體。
  68. 如請求項67之套組，其中該顆粒載體係包括脂質基底的粒子，聚合物基底的粒子或其混合物。
  69. 如請求項66至68中任一項之套組，其中該載體係併入一診斷化合物。
  70. 如請求項66至69中任一項之套組，其中該載體係併入一治療化合物。
  71. 如請求項49至70中任一項之套組，其中該酬載係包括一第四結合基團。
  72. 如請求項71之套組，其中該第四結合基團係與細胞表面抗原結合。
  73. 如請求項72之套組，其中與該第四結合基團結合的細胞表面抗原係存在免疫細胞上。
  74. 如請求項49至73中任一項之套組，其中該RNA係存在粒子中。
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