CN117615752A - 包含缓冲物质的rna组合物及其制备、储存和使用方法 - Google Patents

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S·潘茨纳
U·K·布拉施克
J-J·克里杰
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本公开一般涉及包含缓冲物质的RNA组合物、制备和储存这类组合物的方法以及这类组合物在治疗中的用途的领域。

Description

包含缓冲物质的RNA组合物及其制备、储存和使用方法
技术领域
本公开一般涉及包含缓冲物质的RNA组合物、制备和储存这类组合物的方法以及这类组合物在治疗中的用途的领域。
背景技术
重组核酸(如DNA或RNA)在将外源遗传信息递送至靶细胞中的用途是众所周知的。使用RNA的优点包括瞬时表达和非转化特征。RNA不需要进入细胞核才能被表达，而且不会整合到宿主基因组中，从而消除了各种风险如肿瘤发生。
重组核酸可以裸露形式向有此需要的受试者给药；然而，通常使用药物组合物给药重组核酸。例如，可以使用不同的递送媒介物将RNA递送至受试者，主要基于阳离子聚合物或脂质，它们与RNA一起形成纳米颗粒。纳米颗粒的目的是保护RNA免受降解，使RNA能够递送至靶位点，并促进细胞摄取和靶细胞的处理。RNA递送的效率部分依赖于纳米颗粒的分子组成，并受许多参数的影响，包括粒径、制剂以及分子部分的电荷或接枝(graft)，如聚乙二醇(PEG)或其他配体。这类纳米颗粒制剂的命运由不同的关键因素控制(例如，纳米颗粒的尺寸和尺寸分布等)。例如，这些因素自2018年在FDA"Liposome Drug ProductsGuidance"中被称作应当分析和详述的特定属性。目前纳米颗粒制剂临床应用的局限性可能在于缺少均质、纯净和良好表征的纳米颗粒制剂。
与其他RNA纳米颗粒产品相比，包含可电离脂质的纳米颗粒在靶向和效力方面可以显示出优势。然而，要获得常规药物使用所需的足够保质期是具有挑战性的。据说，为了稳定，包含可电离脂质的LNP需要在更低的温度下冷冻，如-80℃，这对冷链构成了重大挑战，或者它们只能储存在冷藏温度以上，例如5℃，在此温度只能获得有限的稳定性。
已知在溶液或纳米颗粒中的RNA经历缓慢的片段化。此外，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的存在下，RNA倾向于采用非常稳定的折叠形式，这很难进行翻译。这两种机制，即片段化和这种稳定RNA折叠(也称为“光迁移物质(LMS)”)的形成，都是温度依赖性的，并导致完整和可获得的RNA的损失，从而限制了液体产品的稳定性；然而，它们在冷冻状态下基本不存在。
因此，本领域仍然需要(i)包含可电离脂质和RNA的组合物，其是稳定的并且可以在符合制药实践中常规技术的温度范围内储存，特别是在约-25℃的温度下储存，或者甚至在+2至+20℃之间的温度下以液体形式储存；(ii)即用型的组合物；(iii)优选可以重复冷冻和解冻的组合物；以及(iv)制备和储存这类组合物的方法。本公开解决了这些和其他需求。
本发明人惊讶地发现本文所述的组合物和方法满足上述要求。特别地，已经证明，通过使用特定缓冲物质，特别是三乙醇胺(TEA)及其质子化形式，可以制备稳定并可以液体形式储存的组合物。
发明内容
在第一方面，本公开提供了一种组合物，其包含(i)RNA；(ii)阳离子可电离脂质；和(iii)水相，其中所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)，它的N-氧化物，或其质子化形式，其中：R1、R2和R3中的每一个独立地选自H、C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3；或者R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代；R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-6亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-6亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基；并且R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3。
如本申请中所证实的，在RNA组合物中使用基于上述特定缓冲物质、特别是TEA及其质子化形式的缓冲系统代替PBS，抑制了非常稳定折叠形式(在本文中也称为“光迁移物种(light migrating species,LMS)”)的RNA的形成。此外，本申请证实了令人惊讶地是，通过使用这种缓冲系统，可以获得一种RNA组合物，其在以液体形式储存约3个月后具有提高的RNA完整性。因此，所要求保护的组合物提供了提高的稳定性，可以在符合制药实践中的常规技术的温度范围内储存，并提供了即用型(ready-to-use)组合物。
在第二方面，本公开提供了一种组合物，其包含(i)RNA；和(ii)水相，其中所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)、它的N-氧化物，或其质子化形式，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自H、C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3；或者R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代；R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-6亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-6亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基；并且R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3。
在第一和第二方面的一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。例如，R1、R2和R3中的每一个可以独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
在第一和第二方面的一些实施方案中，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-4亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-3亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-2亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-2烷基。例如，R4各自可以独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。在一些实施方案中，R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
在第一和第二方面的一些实施方案中，其中R1、R2和R3中的任何一个(或每一个)是C1-6亚烷基-R4并且R4是OH，优选亚烷基具有2-6个碳原子，如2-4个，例如，2、3或4个碳原子。因此，在这些实施方案中，R1、R2和R3中的任何一个(或每一个)优选是C2-6亚烷基-OH，更优选C2-4亚烷基-OH，更优选C2-3亚烷基-OH，如C2亚烷基-OH。
在第一和第二方面的一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个独立地选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
在第一和第二方面的一些实施方案中，R1、R2和R3都相同。例如，R1、R2和R3可以都是甲基、乙基或2-羟乙基。
在第一和第二方面的一些实施方案中，R1和R2相同，并且R3与R1和R2不同。例如，R1和R2中的每一个可以是2-羟乙基或甲基；和/或R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
在第一和第二方面的一些实施方案中，R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代。在一些实施方案中，R3选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R3选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。在一些实施方案中，N-杂环是单环，其含有至少一个氮环原子和任选存在的选自O和S的另一个环杂原子。例如，N-杂环可以是单环，其含有(i)一个氮环原子；(ii)两个氮环原子；(iii)一个氮环原子和一个氧环原子；(iv)一个氮环原子和一个硫环原子；或者(v)三个氮环原子。在一些实施方案中，N-杂环是单环5-或6-元N-杂环，如单环6-元N-杂环。N-杂环的优选实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、1,3,5-六氢三嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。优选地，N-杂环选自哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。在一些实施方案中，N-杂环仅含有一个氮环原子；在这些实施方案中，优选这个氮环原子被R3取代，R3不是H。在一些实施方案中，N-杂环含有一个以上的氮环原子；在这些实施方案中，优选一个氮环原子被R3取代，R3不是H，并且其他氮环原子中的至少一个，优选其他氮环原子中的每一个，被R5取代。在一些实施方案中，R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。在一些实施方案中，N-杂环是哌啶基，并且环N原子被R3取代，R3不是H。在一些实施方案中，N-杂环是哌嗪基，两个环N原子中的一个被R3取代，R3不是H，并且另一个环N原子任选被R5取代，优选地，另一个环N原子被R5取代。在一些实施方案中，N-杂环是哌嗪基，并且两个环N原子都被取代，其中两个环N原子中的一个被R3取代，R3不是H，并且另一个环N原子被R5取代，其中优选地，R5选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。在上述一些实施方案中，当R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环时，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。在上述一些实施方案中，当R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环时，R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。在上述一些实施方案中，当R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，R3和R5中的任何一个(或每一个)是C1-6亚烷基-R4并且R4是OH时，优选亚烷基具有2-6个碳原子，如2-4个，例如，2、3或4个碳原子。因此，在这些实施方案中，R3和R5中的任何一个(或每一个)优选是C2-6亚烷基-OH，更优选C2-4亚烷基-OH，更优选C2-3亚烷基-OH，如C2亚烷基-OH。在上述一些实施方案中，当R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环时，R3和R5相同。在上述一些实施方案中，当R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环时，R3和R5均为甲基、乙基、2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基，优选地，R3和R5均为2-羟乙基。在上述一些实施方案中，当R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环时，R3和R5互不相同。
在第一和第二方面的一些实施方案中，R1是H。在一些实施方案中，R2和R3中的每一个独立地选自C1--6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。例如，R2和R3中的每一个可以独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。在一些实施方案中，R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
在一些实施方案中，当R1是H时，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。例如，R4可以各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
在第一和第二方面的一些实施方案中，当R1是H时，R2和R3中的任何一个(或每一个)是C1-6亚烷基-R4并且R4是OH，优选亚烷基具有2-6个碳原子，如2-4个，例如，2、3或4个碳原子。因此，在这些实施方案中，R2和R3中的任何一个(或每一个)优选是C2-6亚烷基-OH，更优选C2-4亚烷基-OH，更优选C2-3亚烷基-OH，如C2亚烷基-OH。
在一些实施方案中，当R1是H时，R2和R3中的每一个独立地选自2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基，优选地，R2和R3均为2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的叔胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3均不是H)或其质子化形式或者是如本文定义的叔胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3均不是H)或其质子化形式。因此，在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，如上所述。在一些实施方案中，所述叔胺是单胺。在一些实施方案中，所述叔胺选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)、三乙醇胺(TEA)、乙基二乙醇胺、2-(二乙基氨基)乙-1-醇、三乙胺和2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇。在一些实施方案中，所述叔胺包含三乙醇胺(TEA)或者是三乙醇胺(TEA)。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的环胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式或者是如本文定义的环胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式。因此，在一些实施方案中，R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，其任选被一个或两个R5取代，如上所述。在一些实施方案中，所述环胺选自被一个或多个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分取代的N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪和吗啉。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的仲胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3中的一个是H)或其质子化形式或者是如本文定义的仲胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3中的一个是H)或其质子化形式。因此，在一些实施方案中，R1是H并且R2和R3中的每一个独立地选自C1--6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，如上所述。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质包含N-氧化物或是N-氧化物。在一些实施方案中，所述N-氧化物是三甲胺N-氧化物。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4部分。在这些实施方案的那些情况下，当R4是OH时，优选亚烷基具有2-6个碳原子，如2-4个，例如，2、3或4个碳原子。因此，在这些实施方案中，其中缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4部分并且R4是OH，至少一个C1-6亚烷基-R4部分优选是C2-6亚烷基-OH，更优选C2-4亚烷基-OH，更优选C2-3亚烷基-OH，如C2亚烷基-OH或2-羟乙基。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式和N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含三乙醇胺(TEA)或其质子化形式或者是三乙醇胺(TEA)或其质子化形式。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物中缓冲物质的浓度在约10mM至约200mM之间，如约20mM至约180mM之间、约30mM至约170mM之间、约40mM至约160mM之间、约50mM至约50mM之间、约60mM至约140mM之间、约70mM至约130mM之间、约80mM至约120mM之间、约90mM至约110mM之间。在一些实施方案中，组合物中缓冲物质的浓度在约15mM至约100mM之间，优选在约20mM至约80mM之间，更优选在约40mM至约60mM之间，如约50mM。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲系统进一步包含阴离子。在一些实施方案中，这种阴离子可以作为进一步的缓冲物质。在一些实施方案中，所述阴离子选自无机和/或有机酸(特别地，当组合物的期望pH比缓冲物质式N(R1)(R2)(R3)、它的N-氧化物，或其质子化形式的pKa低至少2.5个pH单位时)。在一些实施方案中，所述阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根以及二羧酸或三羧酸的阴离子，如柠檬酸、琥珀酸、丙二酸、戊二酸或己二酸的阴离子。在一些实施方案中，当缓冲系统包含阴离子时，组合物中阴离子的浓度至少等于组合物中缓冲物质的浓度。例如，组合物中阴离子的浓度可以高于组合物中缓冲物质的浓度。因此，在第一和第二方面的那些实施方案中，当组合物中缓冲物质的浓度是在约10mM至约200mM范围内的x时，组合物中阴离子的浓度至少等于x，例如，高于x。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物的pH在约4.0至约8.0之间。例如，组合物的pH可以在约4.5至约8.0之间，如约5.0至约8.0之间、约5.5至约8.0之间、约6.0至约8.0之间、约6.5至约8.0之间、约6.8至约7.9之间、约7.0至约7.8之间或者约7.5。
在第一和第二方面的一些实施方案中，水是组合物中的主要组分和/或组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约1.0％(v/v)，如小于约0.5％(v/v)。例如，组合物中含有的水的量可以是至少50％(w/w)，如至少至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)或至少95％(w/w)。特别地，如果组合物包含冷冻保护剂，则组合物中含有的水的量可以是至少50％(w/w)，如至少至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)或至少90％(w/w)。如果组合物基本上不含冷冻保护剂，则组合物中含有的水的量可以是至少95％(w/w)。另外地或可选择地地，组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)，如小于约0.9％(v/v)、小于约0.8％(v/v)、小于约0.7％(v/v)、小于约0.6％(v/v)、小于约0.5％(v/v)、小于约0.4％(v/v)、小于约0.3％(v/v)、小于约0.2％(v/v)、小于约0.1％(v/v)、小于约0.05％(v/v)或小于约0.01％(v/v)。在这方面，在正常条件下为液体的冷冻保护剂将不视为除水之外的溶剂，而是视为冷冻保护剂。换句话说，组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)，如小于约0.5％(v/v)的上述任选限制不适用于在正常条件下为液体的冷冻保护剂。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物的重量摩尔渗透压浓度至多为约1000x 10-3渗透压摩尔/kg，如约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约750x 10-3渗透压摩尔/kg之间。在一些实施方案中，组合物的重量摩尔渗透压浓度至多为约500x 10-3渗透压摩尔/kg，如至多约490x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约480x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约470x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约460x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约450x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约440x10-3渗透压摩尔/kg、至多约430x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约420x10-3渗透压摩尔/kg、至多约410x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约400x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约390x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约380x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约370x10-3渗透压摩尔/kg、至多约360x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约350x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约340x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约330x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约320x10-3渗透压摩尔/kg、至多约310x 10-3渗透压摩尔/kg或至多约300x 10-3渗透压摩尔/kg。如果组合物不包含冷冻保护剂，则组合物的重量摩尔渗透压浓度可以低于300x 10-3渗透压摩尔/kg，如至多约250x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约200x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约150x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约100x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约50x10-3渗透压摩尔/kg、至多约40x 10-3渗透压摩尔/kg或至多约30x 10-3渗透压摩尔/kg。如果组合物包含冷冻保护剂，则优选组合物的重量摩尔渗透压浓度的主要部分由冷冻保护剂提供。例如，冷冻保护剂可以提供组合物的重量摩尔渗透压浓度的至少50％，如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l，如约10mg/l至约400mg/l、约10mg/l至约300mg/l、约10mg/l至约200mg/l、约10mg/l至约150mg/l或约10mg/l至约100mg/l，优选约10mg/l至约140mg/l，更优选约20mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。在一些实施方案中，组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l，如约10mg/l至约140mg/l、约20mg/l至约130mg/l、约25mg/l至约125mg/l、约30mg/l至约120mg/l、约35mg/l至约115mg/l、约40mg/l至约110mg/l、约45mg/l至约105mg/l或约50mg/l至约100mg/l。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物包含冷冻保护剂，优选浓度为至少约1％w/v，其中冷冻保护剂优选包含一种或多种选自碳水化合物和醇(如糖醇或低级醇)的化合物，更优选冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、山梨醇及其组合(如来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合组成的组或者来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合组成的组)，更优选冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。在一些实施方案中，组合物中冷冻保护剂的浓度至少为1％w/v，如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v、至少8％w/v或至少9％w/v。在一些实施方案中，组合物中冷冻保护剂的浓度高达25％w/v，如高达20％w/v、高达19％w/v、高达18％w/v、高达17％w/v、高达16％w/v、高达15％w/v、高达14％w/v、高达13％w/v、高达12％w/v或高达11％w/v。在一些实施方案中，组合物中冷冻保护剂的浓度为1％w/v至20％w/v，如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在一些实施方案中，组合物包含冷冻保护剂(如蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇，特别是蔗糖和/或甘油)，所述冷冻保护剂浓度为5％w/v至15％w/v，如6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v或9％w/v至11％w/v，或者浓度为约10％w/v。
在第一和第二方面的一些实施方案中，其中组合物包含冷冻保护剂，冷冻保护剂的存在浓度导致组合物的重量摩尔渗透压浓度在约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约1000x10-3渗透压摩尔/kg(如约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约500x 10-3渗透压摩尔/kg、约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约480x 10-3渗透压摩尔/kg、约60x 10-3渗透压摩尔/kg至约460x 10-3渗透压摩尔/kg、约70x 10-3渗透压摩尔/kg至约440x 10-3渗透压摩尔/kg、约80x 10-3渗透压摩尔/kg至约420x 10-3渗透压摩尔/kg、约90x 10-3渗透压摩尔/kg至约400x 10-3渗透压摩尔/kg、约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约380x 10-3渗透压摩尔/kg、约120x 10-3渗透压摩尔/kg至约360x 10-3渗透压摩尔/kg、约140x 10-3渗透压摩尔/kg至约340x 10-3渗透压摩尔/kg、约160x 10-3渗透压摩尔/kg至约310x 10-3渗透压摩尔/kg、约180x 10-3渗透压摩尔/kg至约300x 10-3渗透压摩尔/kg或约200x10-3渗透压摩尔/kg至约300x 10-3渗透压摩尔/kg)的范围内，基于组合物的总重量。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物基本上不含冷冻保护剂。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的叔胺(即N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3均不是H)或其质子化形式，组合物的pH在约4.0至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l。在这个实施方案中，优选组合物的pH在约4.5至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约20mg/l至约130mg/l，如约30mg/l至约120mg/l。在特别优选的实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的叔胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物包含冷冻保护剂。在可选的特别优选的实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的叔胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物基本上不含冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述叔胺是单胺。在一些实施方案中，所述叔胺选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)、三乙醇胺(TEA)、乙基二乙醇胺、2-(二乙基氨基)乙-1-醇、三乙胺和2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇。在一些实施方案中，所述叔胺包含三乙醇胺(TEA)或是三乙醇胺(TEA)。
在第一和第二方面的一些实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的环胺(即N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，其任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式，组合物的pH在约4.0至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l。在这个实施方案中，优选所述组合物的pH在约4.5至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约20mg/l至约130mg/l，如约30mg/l至约120mg/l。在特别优选的实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的环胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物包含冷冻保护剂。在可选的特别优选的实施方案中，缓冲物质包含如本文定义的环胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物基本上不含冷冻保护剂。在一些实施方案中，环胺选自被一个或多个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分取代的N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪和吗啉。
在第一方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
在第一方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(X)的结构
或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中L10、L20、G1、G2、G3、R35、R36和R37如本文所定义。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质选自以下：结构X-1至X-36(本文所示)；结构A至G(本文所示)；或者N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(DODMA)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)，三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和4-((二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-N,N-二甲基-4-氧代丁基-1-胺(DPL-14)。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质是具有结构X-3的脂质。
在第一方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(XI)的结构：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、G1、G2和m如本文所定义。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质选自结构(XIV-1)、(XIV-2)和(XIV-3)(本文所示)。
在第一方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质占存在于组合物中的总脂质的约20摩尔％至约80摩尔％，优选约25摩尔％至约65摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％。
在第一方面的一些实施方案中，组合物进一步包含一种或多种其他脂质。在一些实施方案中，一种或多种其他脂质选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合。在一些实施方案中，组合物包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质；或者聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸和脂质样物质的缀合物)、中性脂质(例如，磷脂，如DSPC)和类固醇(例如，胆固醇)。
在第一方面的一些实施方案中，其中组合物进一步包含聚合物缀合脂质作为一种或多种其他脂质之一，聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质选自DSPE-PEG、DOPE-PEG、DPPE-PEG和DMPE-PEG。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中R12、R13和w如本文所定义。
在第一方面的一些实施方案中，其中组合物进一步包含聚合物缀合脂质作为一种或多种其他脂质之一，聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物。在一些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物是选自由聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
在第一方面的一些实施方案中，其中组合物进一步包含聚合物缀合脂质作为一种或多种其他脂质之一，聚合物缀合脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5摩尔％至约5摩尔％，优选约1摩尔％至约5摩尔％，更优选约1摩尔％至约4.5摩尔％。
在第一方面的一些实施方案中，其中组合物进一步包含中性脂质作为一种或多种其他脂质之一，中性脂质是磷脂。在一些实施方案中，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。在一些实施方案中，磷脂选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十三碳酰磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，DTPC)、双十四酰磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，DLPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。
在第一方面的一些实施方案中，其中组合物进一步包含中性脂质作为一种或多种其他脂质之一，中性脂质占存在于组合物中的总脂质的约5摩尔％至约40摩尔％，优选约5摩尔％至约20摩尔％，更优选约5摩尔％至约15摩尔％。
在第一方面的一些实施方案中，其中组合物进一步包含类固醇作为一种或多种其他脂质之一，类固醇是固醇如胆固醇。
在第一方面的一些实施方案中，其中组合物进一步包含类固醇作为一种或多种其他脂质之一，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约10摩尔％至约65摩尔％，优选约20摩尔％至约60摩尔％，更优选约30摩尔％至50摩尔％。
在第一方面的一些实施方案中，组合物包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇，其中阳离子可电离脂质占存在于组合物中的总脂质的约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％；聚合物缀合脂质占存在于组合物中的总脂质的约1摩尔％至约4.5摩尔％；中性脂质(例如，磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约5摩尔％至约15摩尔％；并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约30摩尔％至约50摩尔％。
在第一和第二方面的一些实施方案中，至少一部分RNA和，如果存在，一种或多种脂质存在于颗粒中，如脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体和/或脂质复合物(LPX)。在第一和第二方面的一些实施方案中，RNA包封在颗粒内或与颗粒缔合。在一些实施方案中，颗粒包含组合物中所含RNA的至少约75％。在一些实施方案中，颗粒包含组合物中所含RNA的至少约76％，如至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％。在一些实施方案中，颗粒的大小为约30nm至约500nm。
在第一和第二方面的一些实施方案中，RNA是mRNA或抑制性RNA。
在第一和第二方面的一些实施方案中，RNA(如mRNA)(i)包含代替尿苷的修饰的核苷；(ii)具有密码子优化的编码序列；和/或(iii)具有与野生型编码序列相比G/C含量增加的编码序列。在一些实施方案中，修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在第一和第二方面的一些实施方案中，RNA(如mRNA)包含以下中的至少一个或多个：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。在一些实施方案中，RNA(如mRNA)包含以下所有：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。在一些实施方案中，poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。在一些实施方案中，5’帽是cap1或cap2结构。
在第一和第二方面的一些实施方案中，RNA(如mRNA)编码一种或多种多肽。在一些实施方案中，一种或多种多肽是药学活性多肽和/或包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
在第一和第二方面的一些实施方案中，药学活性多肽和/或抗原或表位源自或是病原体的蛋白、所述蛋白的免疫原性变体、或者所述蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在一些实施方案中，病原体是引起传染病的病原体。
在第一和第二方面的一些实施方案中，药学活性多肽和/或抗原或表位源自或是SARS-CoV-2刺突(S)蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在一些实施方案中，RNA(如mRNA)包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在一些实施方案中，SARS-CoV2 S蛋白变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。在一些实施方案中，SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7的氨基酸17-1273的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少80％相同性。在一些实施方案中，所述片段包含SARS-CoV-2S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，(i)SARS-CoV-2S蛋白或(ii)SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性变体的片段与SEQID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少80％相同性。
在第一方面的一些实施方案中，RNA是抑制性RNA(如siRNA)，并且选择性地与靶mRNA杂交和/或对靶mRNA具有特异性。在一些实施方案中，靶mRNA包含编码药学活性肽或多肽的ORF，特别是表达(特别是表达增加，例如，与健康受试者中的表达相比)与疾病相关的药学活性肽或多肽。在一些实施方案中，靶mRNA包含编码药学活性肽或多肽的ORF，所述药学活性肽或多肽的表达(特别是表达增加，例如，与健康受试者中的表达相比)与癌症相关。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物为液体形式，优选在约2℃至约10℃的温度下。
在第一和第二方面的一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)后，组合物的RNA完整性足以产生期望的效果，例如，诱导免疫应答。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，组合物储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)后的RNA完整性，与储存前的RNA完整性相比，至少为50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，组合物储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)后的RNA完整性，与储存前的RNA完整性相比，至少为90％。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，组合物储存至少4周(例如，至少3个月)后的RNA完整性，与储存前的RNA完整性相比，至少为50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，组合物储存至少4周(例如，至少3个月)后的RNA完整性，与储存前的RNA完整性相比，至少为90％。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)至少为50％，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，组合物储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月或至少3个月)后的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％。在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)至少为50％，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，组合物储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％。
另外地或可选择地，在第一和第二方面的一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)后，液体组合物的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))足以产生期望的效果，例如，诱导免疫应答。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，液体组合物储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))基本上等于初始组合物(即储存之前)的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一些实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，液体组合物储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)基本上等于储存之前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一实施方案中，优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，液体组合物储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且优选地，在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，液体组合物储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物为冷冻形式(例如，在-20℃)。
在第一和第二方面的一些实施方案中，当组合物是冷冻形式时，优选组合物(a)包含冷冻保护剂；(b)pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5；或者(c)包含冷冻保护剂并且pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。在一些实施方案中，冷冻保护剂(i)选自本文公开的冷冻保护剂；和/或(ii)以本文公开的浓度存在。例如，冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇和1,3-丙二醇，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖；和/或可以以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘油，任选地，其以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后的RNA完整性与组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或基本上100％。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后的RNA完整性与组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为90％、至少95％、至少97％、至少98％或基本上100％。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后的RNA颗粒(特别是LNP)的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于组合物冷冻前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
在第一和第二方面的一些实施方案中，组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)至少为50％，冷冻组合物解冻后组合物的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选基本上100％。
另外地或可选择地，在第一和第二方面的一些实施方案中，冷冻组合物解冻后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))基本上等于组合物冷冻前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后的RNA颗粒的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且冷冻组合物解冻后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)基本上等于冷冻前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且冷冻组合物解冻后的RNA颗粒的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
在第一和第二方面的一些实施方案中，在一次冷冻/解冻循环后，优选在两次冷冻/解冻循环后，更优选在三次冷冻/解冻循环后，更优选在四次冷冻/解冻循环后，更优选在五次冷冻/解冻循环或更多个后，组合物的RNA颗粒的尺寸和RNA完整性基本上与初始组合物(即，组合物第一次冷冻之前)的RNA颗粒的尺寸和RNA完整性基本上相同(即，基本上相等)。
在第三方面，本公开提供一种制备包含分散在最终水相中的LNP的组合物的方法，其中LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；最终水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含最终缓冲物质，所述最终缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)，它的N-氧化物，或其质子化形式，其中R1、R2和R3如第一方面所定义；其中所述方法包括：
(I)制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；以及
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得组合物，
其中步骤(I)包括：
(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(b)制备包含阳离子可电离脂质和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(c)将根据(a)制备的RNA溶液与根据(b)制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在(第一)中间水相中的LNP的(第一)中间制剂，所述(第一)中间水相包含第一缓冲系统；以及
(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤根据(c)制备的第一中间制剂，
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
如本申请中所证实的，在包含LNP的组合物中使用基于上述特定缓冲物质、特别是TEA及其质子化形式的特定缓冲系统代替PBS，抑制了非常稳定折叠形式(在本文中也称为“光迁移物种(LMS)”)的RNA的形成。此外，本申请证实了令人惊讶地是，通过使用这种缓冲系统，可以获得一种LNP RNA组合物，其在以液体形式储存约3个月后具有提高的RNA完整性。因此，通过所要求保护的方法制备的组合物提供了提高的稳定性，可以在符合制药实践中的常规技术的温度范围内储存，并提供了即用型制品。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲物质是叔胺(即，R1、R2和R3均不是H)或其质子化形式。因此，在一些实施方案中，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，如上所述。在一些实施方案中，所述叔胺是单胺。在一些实施方案中，所述叔胺选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)、三乙醇胺(TEA)、乙基二乙醇胺、2-(二乙基氨基)乙-1-醇、三乙胺和2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇。在一些实施方案中，所述叔胺包含三乙醇或是胺(TEA)。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲物质是环胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，其任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式。因此，在一些实施方案中，R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，其任选被一个或两个R5取代，如上所述。在一些实施方案中，所述环胺选自被一个或多个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分取代的N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪和吗啉。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲物质是仲胺(即，R1、R2、R3中的一个是H)或其质子化形式。因此，在一些实施方案中，R1是H并且R2和R3中的每一个独立地选自C1--6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，如上所述。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4部分。在这些实施方案的那些情况下，当R4是OH时，优选亚烷基具有2-6个碳原子，如2-4个，例如，2、3或4个碳原子。因此，在这些实施方案中，其中最终缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4部分并且R4是OH，至少一个C1-6亚烷基-R4部分优选是C2-6亚烷基-OH，更优选C2-4亚烷基-OH，更优选C2-3亚烷基-OH，如C2亚烷基-OH或2-羟乙基。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。在一些实施方案中，最终缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式和N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式。在一些实施方案中，最终缓冲物质包含三乙醇胺(TEA)或其质子化形式或是三乙醇胺(TEA)或其质子化形式。
在第三方面的一些实施方案中，特别是如果期望制备冷冻形式的组合物，则第三方面的方法包括(II)将制剂冷冻至约-10℃或更低。因此，在这些实施方案中，进行第三方面的方法得到冷冻形式的组合物。
在第三方面的一些实施方案中，特别是当组合物是冷冻形式时，优选组合物(a)包含冷冻保护剂；(b)pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，并且最优选约5.5；或者(c)包含冷冻保护剂并且pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，并且最优选约5.5。在一些实施方案中，冷冻保护剂(i)选自本文公开的冷冻保护剂；和/或(ii)以本文公开的浓度存在。例如，冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇和1,3-丙二醇，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖；和/或可以以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘油，任选地，其以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
在一些可选的实施方案中，特别是如果期望制备液体形式的组合物，则第三方面的方法不包括步骤(II)。因此，在这些实施方案中，进行第三方面的方法得到液体形式的组合物。
在第三方面的一些实施方案中，步骤(I)进一步包括在步骤(c)之后选自稀释和过滤的一个或多个步骤，如切向流过滤和渗滤。例如，稀释步骤可以包括将稀释溶液添加至中间制剂中。这样的稀释溶液可以包含一种或多种额外的化合物以及任选存在的最终缓冲系统，其中所述一种或多种额外的化合物可以包含冷冻保护剂。所述一个或多个过滤步骤(包括步骤(d)、(f')、(g')和(h'))可以用于从中间体制剂中去除不需要的化合物(例如，乙醇和/或一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸)和/或用于增加中间制剂的RNA浓度和/或改变中间制剂的pH和/或缓冲系统。为此，可以使用含水缓冲溶液，其不含不需要的化合物(使得所述不需要的化合物从中间制剂中被洗出并进入含水缓冲溶液中)和/或其与含水缓冲溶液相比是高渗的(使得水从中间制剂流至含水缓冲溶液)和/或其具有与中间制剂的pH和/或缓冲系统不同的pH和/或缓冲系统。
在第三方面的一些实施方案中，步骤(I)包括：
(a')提供含水RNA溶液；
(b')提供包含第一缓冲系统的第一含水缓冲溶液；
(c')将根据(a')提供的含水RNA溶液与根据(b')提供的第一含水缓冲溶液混合，从而制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(d')制备包含阳离子可电离脂质和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(e')将根据(c')制备的RNA溶液与根据(d')制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在第一水相中的LNP的第一中间制剂，所述第一水相包含第一缓冲系统；
(f')任选使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液过滤根据(e')制备的第一中间制剂，从而制备另一中间制剂，其包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中所述另一含水缓冲溶液可以与所述第一含水缓冲溶液相同或不同；
(g')任选重复步骤(f')一次或两次或更多次，其中在步骤(f')的一次循环之后获得的另一中间制剂用作下一次循环的第一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中在每次循环中，所述另一含水缓冲溶液可以与所述第一含水缓冲溶液相同或不同；
(h')使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液，如果不存在步骤(f')，则过滤在步骤(e')中获得的第一中间制剂，或者如果存在步骤(f')而不存在步骤(g')，则过滤在步骤(f')中获得的另一中间制剂，或者如果存在步骤(f')和(g')，则过滤在步骤(g')之后获得的另一中间制剂；以及
(i')任选用稀释溶液稀释在步骤(h')中获得的制剂；
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
在第三方面的一些实施方案中，组合物中最终缓冲物质的浓度，特别是最终缓冲物质及其质子化形式的总浓度在约10mM至约200mM之间，如约20mM至约180mM之间、约30mM至约170mM之间、约40mM至约160mM之间、约50mM至约50mM之间、约60mM至约140mM之间、约70mM至约130mM之间、约80mM至约120mM之间、约90mM至约110mM之间。在一些实施方案中，组合物中最终缓冲物质的浓度，特别是最终缓冲物质及其质子化形式的总浓度在约15mM至约100mM之间，优选在约20mM至约80mM之间，更优选在约40mM至约60mM之间，如约50mM。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲系统进一步包含阴离子，其优选选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根以及二羧酸或三羧酸的阴离子，如柠檬酸、琥珀酸、丙二酸、戊二酸或己二酸的阴离子。在一些实施方案中，当最终缓冲系统包含阴离子时，组合物中阴离子的浓度至少等于组合物中最终缓冲物质的浓度。例如，组合物中阴离子的浓度可以高于组合物中最终缓冲物质的浓度。因此，在第三方面的那些实施方案中，当组合物中最终缓冲物质的浓度是在约10mM至约200mM范围内的x时，组合物中阴离子的浓度至少等于x，例如，高于x。
在第三方面的一些实施方案中，其中步骤(I)中获得的制剂和/或组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包含选自碳水化合物和醇(如糖醇或低级醇)的一种或多种化合物。例如，冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、山梨醇及其组合(如来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合组成的组或者来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合组成的组)。在一些实施方案中，步骤(I)中获得的制剂和/或组合物包含蔗糖和/或甘油作为冷冻保护剂。
在第三方面的一些实施方案中，其中步骤(I)中获得的制剂和/或组合物包含冷冻保护剂，制剂和/或组合物中冷冻保护剂的浓度至少为1％w/v，如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v、至少8％w/v或至少9％w/v。在一些实施方案中，制剂和/或组合物中冷冻保护剂的浓度高达25％w/v，如高达20％w/v、高达19％w/v、高达18％w/v、高达17％w/v、高达16％w/v、高达15％w/v、高达14％w/v、高达13％w/v、高达12％w/v或高达11％w/v。在一些实施方案中，制剂和/或组合物中冷冻保护剂的浓度为1％w/v至20％w/v，如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在一些实施方案中，制剂和/或组合物包含冷冻保护剂(如蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇或其组合，特别是蔗糖和/或甘油)，浓度为5％w/v至15％w/v，如6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v或9％w/v至11％w/v，或者浓度为约10％w/v。例如，第三方面的方法可以包括使用稀释溶液的稀释步骤，其中所述稀释溶液包含足量的冷冻保护剂，以便在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物中实现冷冻保护剂的上述浓度。
在第三方面的一些实施方案中，其中步骤(I)中获得的制剂和/或组合物包含冷冻保护剂，冷冻保护剂的存在浓度导致组合物的重量摩尔渗透压浓度在约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约1000x 10-3渗透压摩尔/kg(如约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约500x 10-3渗透压摩尔/kg、约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约480x 10-3渗透压摩尔/kg、约60x 10-3渗透压摩尔/kg至约460x 10-3渗透压摩尔/kg、约70x 10-3渗透压摩尔/kg至约440x 10-3渗透压摩尔/kg、约80x 10-3渗透压摩尔/kg至约420x 10-3渗透压摩尔/kg、约90x 10-3渗透压摩尔/kg至约400x10-3渗透压摩尔/kg、约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约380x 10-3渗透压摩尔/kg、约120x 10-3渗透压摩尔/kg至约360x 10-3渗透压摩尔/kg、约140x 10-3渗透压摩尔/kg至约340x 10-3渗透压摩尔/kg、约160x 10-3渗透压摩尔/kg至约310x 10-3渗透压摩尔/kg、约180x 10-3渗透压摩尔/kg至约300x 10-3渗透压摩尔/kg或约200x 10-3渗透压摩尔/kg至约300x 10-3渗透压摩尔/kg)的范围内，基于制剂/组合物的总重量。例如，第三方面的方法可以包括使用稀释溶液的稀释步骤，其中所述稀释溶液包含足量的冷冻保护剂，以便在步骤(I)中获得的制剂和/或组合物中实现上述重量摩尔渗透压浓度值。
在第三方面的一些实施方案中，步骤(I)中获得的制剂和/或组合物基本上不含冷冻保护剂。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲系统的pH(和组合物的pH)在约4.0至约8.0之间。例如，最终缓冲系统的pH(和组合物的pH)可以在约4.5至约8.0之间，如约5.0至约8.0之间、约5.5至约8.0之间、约6.0至约8.0之间、约6.5至约8.0之间、约6.8至约7.9之间、约7.0至约7.8之间或者约7.5。
在第三方面的一些实施方案中，第一缓冲系统的pH(和步骤(a)中获得的RNA溶液的pH)低于6.0，优选至多约5.5，如至多约5.0、至多约4.9、至多约4.8、至多约4.7、至多约4.6或至多约4.5。例如，第一缓冲系统的pH(和步骤(a)中获得的RNA溶液的pH)可以在约3.5至约5.9之间，如约4.0至约5.5之间或者约4.5至约5.0之间。为此，步骤(a)中获得的RNA溶液可以进一步包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸(例如，柠檬酸根阴离子和/或EDTA的阴离子)。在一些实施方案中，优选在去除一种或多种不需要的物质(例如，乙醇和/或一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸)的条件下进行步骤(d)，从而得到包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中最终水相基本不含这类一种或多种不需要的物质。例如，这样的条件可以包括使用包含最终缓冲系统(即，最终缓冲物质)的最终缓冲溶液对包含分散在步骤(c)中获得的中间水相中的LNP的中间制剂进行至少一个过滤步骤，如切向流过滤或渗滤，其中最终缓冲溶液不含一种或多种不需要的物质。或者，这样的条件可以包括(i)使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液，对包含分散在步骤(c)中获得的中间水相中的LNP的中间制剂(即，第一中间制剂)进行至少一个过滤步骤，如切向流过滤或渗滤，从而制备包含分散在包含另一缓冲系统的另一水相中的LNP的另一中间制剂，其中所述另一含水缓冲溶液的另一缓冲系统可以与步骤(a)中使用的缓冲系统相同或不同；(ii)任选重复步骤(i)一次或两次或更多次，其中将在步骤(i)的一次循环之后获得的包含分散在另一水相中的LNP的另一中间制剂用作下一次循环的第一中间制剂，其中在每次循环中，另一含水缓冲溶液的另一缓冲系统可以与步骤(a)中使用的第一缓冲系统相同或不同；以及(iii)使用最终含水缓冲溶液，对在步骤(i)中获得的中间制剂(如果不存在步骤(ii))或在步骤(ii)中获得的中间制剂(如果存在步骤(ii))进行至少一个过滤步骤，如切向流过滤或渗滤，其中所述中间和最终含水缓冲溶液中的至少一种(优选所有中间和最终含水缓冲溶液)不含一种或多种不需要的物质。
类似地，在第三方面的一些实施方案中，其中步骤(I)包括步骤(a')至(e')和(h')(以及任选存在的步骤(f')、(g')、和(i')中的一个或多个步骤)，第一含水缓冲溶液的pH(和步骤(c')中获得的RNA溶液的pH)低于6.0，优选至多约5.5，如至多约5.0、至多约4.9、至多约4.8、至多约4.7、至多约4.6或至多约4.5。例如，第一含水缓冲溶液的pH(和步骤(c')中获得的RNA溶液的pH)可以在约3.5至约5.9之间，如约4.0至约5.5之间或者约4.5至约5.0之间。为此，在(b')中提供的第一含水缓冲溶液(和第一水相)可以进一步包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸(例如，柠檬酸根阴离子和/或EDTA的阴离子)。在这些实施方案中，优选步骤(f')至(h')中的至少一个是在从第一中间制剂和/或从另一中间制剂中去除一种或多种不需要的物质(例如，乙醇和/或一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸)的条件下进行的，从而得到包含分散在另一水相中或最终水相中的LNP的另一中间制剂，其中所述另一水相和/或最终水相基本不含一种或多种不需要的物质。例如，这样的条件可以包括使用另一含水缓冲溶液和/或最终缓冲溶液，其中另一含水缓冲溶液和最终缓冲溶液中的至少一种(优选所有另一含水缓冲溶液和最终缓冲剂溶液)不含一种或多种不需要的物质。在一些实施方案中，过滤步骤可以是切向流过滤或渗滤，优选切向流过滤。
在第三方面的一些实施方案中，步骤(a)中使用的第一缓冲系统包含步骤(d)中使用的最终缓冲物质，优选步骤(a)中使用的第一缓冲系统的缓冲系统和pH与在步骤(d)中使用最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同。例如，在第三方面的这个实施方案中仅使用一种含水缓冲溶液。
类似地，在第三方面的一些实施方案中，其中步骤(I)包括步骤(a')至(e')和(h')(以及任选存在的步骤(f')、(g')、和(i')中的一个或多个步骤)，步骤(b')、(f')和(g')中使用的每个第一缓冲系统和每个另一缓冲系统包含步骤(h')中使用的最终缓冲物质，优选步骤(b')、(f')和(g')中使用的每个第一含水缓冲溶液和每个另一含水缓冲溶液的缓冲系统和pH与最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同。例如，第三方面的这个实施方案步骤(b')，(f')，如果存在，(g')，如果存在，和h'中使用的含水缓冲溶液是相同的。
在第三方面的一些实施方案中，制剂和/或组合物包含水作为主要组分和/或组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约1.0％(v/v)，如小于约0.5％(v/v)。例如，制剂和/或组合物中含有的水的量可以是至少50％(w/w)，如至少至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)或至少95％(w/w)。特别地，如果制剂和/或组合物包含冷冻保护剂，则制剂和/或组合物中含有的水的量可以是至少50％(w/w)，如至少至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)或至少90％(w/w)。如果制剂和/或组合物基本上不含冷冻保护剂，则制剂和/或组合物中含有的水的量可以是至少95％(w/w)。另外地或可选择地，组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)，如小于约0.9％(v/v)、小于约0.8％(v/v)、小于约0.7％(v/v)、小于约0.6％(v/v)、小于约0.5％(v/v)、小于约0.4％(v/v)、小于约0.3％(v/v)、小于约0.2％(v/v)、小于约0.1％(v/v)、小于约0.05％(v/v)或小于约0.01％(v/v)。在这方面，在正常条件下为液体的冷冻保护剂将不视为除水之外的溶剂，而是视为冷冻保护剂。换句话说，组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)，如小于约0.5％(v/v)的上述任选限制不适用于在正常条件下为液体的冷冻保护剂。
在第三方面的一些实施方案中，组合物的重量摩尔渗透压浓度至多为约1000x10-3渗透压摩尔/kg，如约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约750x 10-3渗透压摩尔/kg之间。在一些实施方案中，组合物的重量摩尔渗透压浓度至多约为500x 10-3渗透压摩尔/kg，如至多约490x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约480x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约470x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约460x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约450x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约440x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约430x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约420x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约410x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约400x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约390x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约380x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约370x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约360x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约350x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约340x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约330x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约320x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约310x 10-3渗透压摩尔/kg或至多约300x 10-3渗透压摩尔/kg。如果组合物不包含冷冻保护剂，则组合物的重量摩尔渗透压浓度可以低于300x 10-3渗透压摩尔/kg，如至多约250x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约200x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约150x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约100x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约50x 10-3渗透压摩尔/kg、至多约40x 10-3渗透压摩尔/kg或至多约30x 10-3渗透压摩尔/kg。如果组合物包含冷冻保护剂，则优选组合物的重量摩尔渗透压浓度的主要部分由冷冻保护剂提供。例如，冷冻保护剂可以提供组合物的重量摩尔渗透压浓度的至少50％，如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在第三方面的一些实施方案中，组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l，如约10mg/l至约400mg/l、约10mg/l至约300mg/l、约10mg/l至约200mg/l、约10mg/l至约150mg/l或约10mg/l至约100mg/l，优选约10mg/l至约140mg/l，更优选约20mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。在一些实施方案中，组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l。例如，组合物中RNA的浓度可以为约10mg/l至约140mg/l，如约20mg/l至约130mg/l、约25mg/l至约125mg/l、约30mg/l至约120mg/l、约35mg/l至约115mg/l、约40mg/l至约110mg/l、约45mg/l至约105mg/l或约50mg/l至约100mg/l。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲物质包含如本文所定义的叔胺(即，R1、R2和R3均不是H)或其质子化形式，组合物的pH在约4.0至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l。在这个实施方案中，优选组合物的pH在约4.5至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约20mg/l至约130mg/l，如约30mg/l至约120mg/l。在特别优选的实施方案中，最终缓冲物质包含如本文所定义的叔胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物包含冷冻保护剂。在可选的特别优选的实施方案中，最终缓冲物质包含如本文所定义的叔胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物基本上不含冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述叔胺是单胺。在一些实施方案中，所述叔胺选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)、三乙醇胺(TEA)、乙基二乙醇胺、2-(二乙基氨基)乙-1-醇、三乙胺和2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇。在一些实施方案中，所述叔胺包含三乙醇胺(TEA)或是三乙醇胺(TEA)。
在第三方面的一些实施方案中，最终缓冲物质包含如本文所定义的环胺(即N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式，组合物的pH在约4.0至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l。在这个实施方案中，优选组合物的pH在约4.5至约8.0之间，并且组合物中RNA的浓度为约20mg/l至约130mg/l，如约30mg/l至约120mg/l。在特别优选的实施方案中，最终缓冲物质包含如本文所定义的环胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物包含冷冻保护剂。在可选的特别优选的实施方案中，最终缓冲物质包含如本文所定义的环胺或其质子化形式；组合物的pH在约5.0至约8.0之间；组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；并且组合物基本上不含冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述环胺选自被一个或多个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分取代的N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪和吗啉。
在第三方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
在第三方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(X)的结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中L10、L20、G1、G2、G3、R35、R36和R37如本文所定义。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质选自以下：结构X-1至X-36(本文所示)；和/或结构A至F(本文所示)；和/或N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(DODMA)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)，三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和4-((二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-N,N-二甲基-4-氧代丁基-1-胺(DPL-14)。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质是具有结构X-3的脂质。
在第三方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(XI)的结构：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、G1、G2和m如本文所定义。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质选自结构(XIV-1)、(XIV-2)和(XIV-3)(本文所示)。
在第三方面的一些实施方案中，阳离子可电离脂质占存在于组合物中的总脂质的约20摩尔％至约80摩尔％，优选约25摩尔％至约65摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％。
在第三方面的一个实施方案中，步骤(b)或(d')中制备的乙醇溶液进一步包含一种或多种其他脂质，并且LNP进一步包含一种或多种其他脂质。优选地，一种或多种其他脂质选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合。在第三方面的一些实施方案中，一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质；或聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)、中性脂质(例如，磷脂，如DSPC)和类固醇(例如，胆固醇)，从而LNP包含如本文所述的阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质；或聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)、中性脂质(例如，磷脂，如DSPC)和类固醇(例如，胆固醇)。
在第三方面的一些实施方案中，其中一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质，所述聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质。例如，聚乙二醇化脂质选自DSPE-PEG、DOPE-PEG、DPPE-PEG和DMPE-PEG。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质可以具有以下结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中R12、R13和w如本文所定义。
在第三方面的一些实施方案中，其中一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质，聚合物缀合脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物。例如，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物可以是选自聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
在第三方面的一些实施方案中，其中一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质，聚合物缀合脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5摩尔％至约5摩尔％，优选约1摩尔％至约5摩尔％，更优选约1摩尔％至约4.5摩尔％。
在第三方面的一些实施方案中，其中一种或多种其他脂质包含中性脂质，中性脂质是磷脂。这样的磷脂优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂的具体实例包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三碳酰磷脂酰胆碱(DTPC)、双十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。
在第三方面的一些实施方案中，其中一种或多种其他脂质包含中性脂质(如磷脂)，中性脂质占存在于组合物中的总脂质的约5摩尔％至约40摩尔％，优选约5摩尔％至约20摩尔％，更优选约5摩尔％至约15摩尔％。
在第三方面的一些实施方案中，其中一种或多种其他脂质包含类固醇，类固醇是固醇如胆固醇。
在第三方面的一些实施方案中，其中一种或多种其他脂质包含类固醇，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约10摩尔％至约65摩尔％，优选约20摩尔％至约60摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％。
在第三方面的一些实施方案中，乙醇溶液包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇，基于乙醇溶液中脂质的总摩尔量，摩尔比为20％至60％的阳离子可电离脂质、0.5％至15％的聚合物缀合脂质、5％至25％的中性脂质和25％至55％的类固醇。例如，基于乙醇溶液中脂质的总摩尔量，摩尔比可以是40％至55％的阳离子可电离脂质、1.0％至10％的聚合物缀合脂质、5％至15％的中性脂质和30％至50％的类固醇，如45％至55％的阳离子可电离脂质、1.0％至5％的聚合物缀合脂质、8％至12％的中性脂质和35％至45％的类固醇。
在第三方面的一些实施方案中，LNP包含组合物中所包含RNA的至少约75％。例如，LNP可以包含组合物中所包含RNA的至少约76％，如至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％。
在第三方面的一些实施方案中，RNA是mRNA。
在第三方面的一些实施方案中，RNA(如mRNA)包封在LNP内或与LNP缔合。
在第三方面的一些实施方案中，RNA(如mRNA)(i)包含代替尿苷的修饰的核苷；(ii)具有密码子优化的编码序列；和/或(iii)具有与野生型编码序列相比G/C含量增加的编码序列。在一些实施方案中，修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在第三方面的一些实施方案中，RNA(如mRNA)包含以下一个或多个：(a)5’帽，如cap1或cap2结构；(b)5’UTR；(c)3’UTR；和(d)poly-A序列。在一些实施方案中，poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。
在第三方面的一些实施方案中，RNA(如mRNA)编码一种或多种多肽。在一些实施方案中，一种或多种多肽是药学活性多肽和/或包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
在第三方面的一些实施方案中，药学活性多肽和/或抗原或表位源自或是病原体的蛋白、所述蛋白的免疫原性变体、或者所述蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在一些实施方案中，病原体是引起传染病的病原体。
在第三方面的一些实施方案中，药学活性多肽和/或抗原或表位源自或是SARS-CoV-2刺突(S)蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在一些实施方案中，RNA(如mRNA)包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在第三方面的一些实施方案中，SARS-CoV2S蛋白变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。在一些实施方案中，SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ IDNO:7的氨基酸17-1273的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少80％相同性。在一些实施方案中，所述片段包含SARS-CoV-2S蛋白的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，(i)SARS-CoV-2S蛋白或(ii)SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性变体的片段与SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少80％相同性。
在第四方面，本公开提供一种制备含水RNA组合物的方法，其中所述方法包括(I)制备包含RNA和水相的制剂，其中水相包含缓冲物质，缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)、它的N-氧化物，或其质子化形式，其中R1、R2和R3如第一方面所定义；以及(II)任选地将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，从而获得组合物。
在第四方面的一些实施方案中，所述方法包括步骤(II)(即，将所述制剂冷冻至约-10℃或更低。
在第四方面的一些实施方案中，特别是当所述方法包括步骤(II)时，优选组合物(a)包含冷冻保护剂；(b)pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5；或者(c)包含冷冻保护剂并且pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。在一些实施方案中，冷冻保护剂(i)选自本文公开的冷冻保护剂；和/或(ii)以本文公开的浓度存在。例如，冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖；和/或可以以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘油，任选地，其在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
在第四方面的一些实施方案中，所述缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含三乙醇胺(TEA)或其质子化形式或是三乙醇胺(TEA)或其质子化形式。
应当理解本文在第一、第二或第三方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第四方面的任何实施方案。
在第五方面，本公开提供一种储存组合物的方法，其包括根据第三方面的方法制备组合物，并将组合物储存在约-90℃至约-10℃的温度范围内，如约-90℃至约-40℃或约-40℃至约-25℃或约-25℃至约-10℃，或者约-20℃的温度。在第五方面的一些实施方案中，将冷冻组合物储存至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周。在第五方面的一些实施方案中，将冷冻组合物在-20℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月。在第五方面的一些实施方案中，可以将组合物储存在-70℃下。
在第五方面的一些实施方案中，优选组合物(a)包含冷冻保护剂；(b)pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，并且最优选约5.5；或者(c)包含冷冻保护剂并且pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，并且最优选约5.5。在一些实施方案中，冷冻保护剂(i)选自本文公开的冷冻保护剂；和/或(ii)以本文公开的浓度存在。例如，冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖；和/或可以以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘油，任选地，其以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
在第五方面的一些实施方案中，缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含三乙醇胺(TEA)或其质子化形式或者是三乙醇胺(TEA)或其质子化形式。
在第五方面的一些实施方案中，储存组合物的方法包括根据包括步骤(II)的第三方面的方法制备组合物(即，将所述制剂冷冻至约-10℃或更低)；以及将所述冷冻组合物在约-90℃至约-10℃的温度范围内储存一定时间(例如，至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月)；以及将冷冻组合物在约0℃至约20℃的温度范围内储存一定时间(例如，至少4周，如至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)。
应当理解本文在第一、第二或第三方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第五方面的任何实施方案。
在第六方面，本公开提供一种储存组合物的方法，其包括根据第三方面的方法制备液体组合物，并将所述液体组合物储存在约0℃至约20℃的温度范围内，如约1℃至约15℃、约2℃至约10℃或约2℃至约8℃，或者约5℃的温度。在第六方面的一些实施方案中，将所述液体组合物储存至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月，优选至少4周。在第六方面的一些实施方案中，将所述液体组合物在5℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月。
在第六方面的一些实施方案中，储存组合物的方法包括根据包括步骤(II)的第三方面的方法制备组合物(即，将所述制剂冷冻至约-10℃或更低)；以及将所述冷冻组合物在约0℃至约20℃的温度范围内储存一定时间(例如，至少4周)。
在第六方面的一些实施方案中，缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含三乙醇胺(TEA)或其质子化形式或者是三乙醇胺(TEA)或其质子化形式。
应当理解本文在第一、第二或第三方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第六方面的任何实施方案。
在第七方面，本公开提供通过第三、第四、第五或第六方面的方法可制备的组合物。在第七方面的一些实施方案中，组合物可以是冷冻形式，其优选地可以在约-90℃或更高的温度下储存，如约-90℃至约-10℃。例如，第七方面的冷冻组合物可以储存在约-90℃至约-40℃或约-40℃至约-25℃或约-25℃至约-10℃的温度范围内，或者约-20°的温度。在第七方面的一些实施方案中，可以将组合物储存至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周。例如，可以将冷冻组合物在-20℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月。
在第七方面的一些实施方案中，当组合物是冷冻形式时，优选组合物(a)包含冷冻保护剂；(b)pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，并且最优选约5.5；或者(c)包含冷冻保护剂并且pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，并且最优选约5.5。在一些实施方案中，冷冻保护剂(i)选自本文公开的冷冻保护剂；和/或(ii)以本文公开的浓度存在。例如，冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖；和/或可以以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，并且更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘油，任选地，其以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
在第七方面的一些实施方案中，缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含三乙醇胺(TEA)或其质子化形式或者是三乙醇胺(TEA)或其质子化形式。
在第七方面的一些实施方案中，当组合物为冷冻形式时，冷冻组合物解冻后的RNA完整性为至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或基本上100％，例如，已在-20℃下储存的冷冻组合物解冻后，与组合物冷冻前组合物的RNA完整性相比。
在一些实施方案中，组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)至少为50％，冷冻组合物解冻后组合物的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选基本上100％。
另外地或可选择地，在第七方面的一些实施方案中，当组合物为冷冻形式时，冷冻组合物解冻后RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))基本上等于所述组合物冷冻前RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后RNA颗粒的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且冷冻组合物解冻后RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)基本上等于冷冻前RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，冷冻组合物解冻后RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且冷冻组合物解冻后RNA颗粒的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
在一些实施方案中，在一次冷冻/解冻循环后，优选在两次冷冻/解冻循环后，更优选在三次冷冻/解冻循环后，更优选在四次冷冻/解冻循环后，更优选在五次冷冻/解冻循环或更多次后，组合物的RNA颗粒的尺寸和RNA完整性基本上与初始组合物(即，组合物第一次冷冻之前)的RNA颗粒的尺寸和RNA完整性基本上相同(即，基本上相等)。
在第七方面的一个可选实施方案中，组合物为液体形式。
在第七方面的一些实施方案中，当组合物为液体形式时，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，液体组合物的RNA完整性足以产生期望的效果，例如诱导免疫应答。例如，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，液体组合物的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比可以至少为50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。在一些实施方案中，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，液体组合物的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比可以至少为90％、至少95％、至少97％或至少98％。在一些实施方案中，组合物优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少4周后，RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。在一些实施方案中，组合物优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少4周后，RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为90％、至少95％、至少97％或至少98％。
在一些实施方案中，液体组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)至少为50％，液体组合物优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月或至少3个月)后的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％。在一些实施方案中，液体组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)至少为50％，液体组合物优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月或至少3个月)后的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％。
另外地或可选择地，在第七方面的一些实施方案中，当组合物为液体形式时，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，液体组合物的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))足以产生期望的效果，例如诱导免疫应答。例如，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，液体组合物的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))基本上等于初始组合物(即储存之前)的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一些实施方案中，液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一些实施方案中，液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)基本上等于储存之前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，RNA颗粒的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第七方面的任何实施方案。
在第八方面，本公开提供一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过第三、第四或第五方面的方法制备的冷冻组合物并解冻所述冷冻组合物，从而获得即用型药物组合物的步骤。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第八方面的任何实施方案。
在第九方面，本公开提供一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过第三、第四或第六方面的方法制备的液体组合物，从而获得即用型药物组合物的步骤。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第九方面的任何实施方案。
在第十方面，本公开提供通过第八或第九方面的方法可制备的即用型药物组合物。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第十方面的任何实施方案。
在第十一方面，本公开提供第一、第七和第十方面中任一方面的组合物，其用于治疗。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九或第十方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第十一方面的任何实施方案。
在第十二方面，本公开提供第一、第七和第十方面中任一方面的组合物，其用于诱导免疫应答。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十或第十一方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第十二方面的任何实施方案。
在第十三方面，本公开提供一种转染细胞的方法，其包括将第一、第二、第七或第十方面中任一方面的组合物添加至细胞；并且将组合物和细胞的混合物温育足够长的时间。在一些实施方案中，特别是在RNA (如mRNA)编码药学活性蛋白的那些实施方案中，将组合物和细胞的混合物温育足够长的时间以允许药学活性蛋白的表达。在一些实施方案中，特别是在RNA是针对靶mRNA的抑制性RNA(如siRNA)的那些实施方案中，将组合物和细胞的混合物温育足够长的时间以允许抑制靶mRNA的转录和/或翻译。在一些实施方案中，所述足够长的时间是至少1小时(如至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约5小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时)和/或高达约48小时(如高达约36或高达约24小时)。在第十三方面的一些实施方案中，所述方法在体内进行(即，所述细胞形成受试者的器官、组织和/或生物体的一部分)。在第十三方面的一些实施方案中，所述方法在体外进行(即，所述细胞不形成受试者的器官、组织和/或生物体的一部分，例如，细胞是离体细胞培养物)。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一或第十二方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第十三方面的任何实施方案。
在第十四方面，本公开提供第一、第二、第七或第十方面中任一方面的组合物在转染细胞中的用途。在第十四方面的一些实施方案中，所述用途是体内用途(即，所述细胞形成受试者的器官、组织和/或生物体的一部分)。在第十四方面的一些实施方案中，所述用途是体外用途(即，所述细胞不形成受试者的器官、组织和/或生物体的一部分，例如，所述细胞是离体细胞培养物)。
应当理解本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二或第十三方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第十四方面的任何实施方案。
在另一方面，本公开提供一种试剂盒，其包含第一、第二、第七、第十、第十一或第十二方面中任一方面的组合物或者如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，试剂盒用于治疗，如用于诱导免疫应答。在一些实施方案中，试剂盒用于诱导针对病原体的免疫应答，如用于治疗或预防传染病。
进一步的逐项列出的实施方案如下：
1.一种组合物，其包含(i)RNA；(ii)阳离子可电离脂质；和(iii)水相，其中所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)、它的N-氧化物或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3中的每一个独立地选自H、C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3；或者R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代；
R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-6亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-6亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基；并且
R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3。
2.项目1的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。
3.项目1或2的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。
4.项目1-3中任一项的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
5.项目1-4中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-4亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-3亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-2亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-2烷基。
6.项目1-5中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
7.项目1-6中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
8.项目1-7中任一项的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
9.项目1-8中任一项的组合物，其中R1、R2和R3都相同。
10.项目9的组合物，其中R1、R2和R3都是甲基、乙基或2-羟乙基。
11.项目1-8中任一项的组合物，其中R1和R2相同，并且R3与R1和R2不同。
12.项目11的组合物，其中R1和R2中的每一个是2-羟乙基、乙基或甲基。
13.项目11或12的组合物，其中R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
14.项目1的组合物，其中R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代。
15.项目14的组合物，其中R3选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R3选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
16.项目14或15的组合物，其中所述N-杂环是单环，其含有至少一个氮环原子和任选存在的选自O和S的另一个环杂原子。
17.项目14-16中任一项的组合物，其中所述N-杂环是单环，其含有(i)一个氮环原子；(ii)两个氮环原子；(iii)一个氮环原子和一个氧环原子；(iv)一个氮环原子和一个硫环原子；或者(v)三个氮环原子。
18.项目14-17中任一项的组合物，其中所述N-杂环是单环5-或6-元N-杂环，如单环6-元N-杂环。
19.项目14-18中任一项的组合物，其中所述N-杂环选自吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、1,3,5-六氢三嗪基、吗啉基和硫代吗啉基，优选选自哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。
20.项目14-19中任一项的组合物，其中，如果所述N-杂环仅含有一个氮环原子，则这个氮环原子被R3取代，R3不是H，或者，如果所述N-杂环含有一个以上的氮环原子，则一个氮环原子被R3取代，R3不是H，并且其他氮环原子中的至少一个，优选其他氮环原子中的每一个，被R5取代。
21.项目14-20中任一项的组合物，其中R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
22.项目14-21中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌啶基，并且环N原子被R3取代，R3不是H。
23.项目14-21中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌嗪基，两个环N原子中的一个被R3取代，R3不是H，并且另一个环N原子任选被R5取代，优选另一个N原子被R5取代。
24.项目23的组合物，其中两个环N原子都被取代，并且R5选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
25.项目14-24中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
26.项目14-25中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
27.项目14-26中任一项的组合物，其中R3和R5相同。
28.项目27的组合物，其中R3和R5均为甲基、乙基、2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基，优选地，R3和R5均为2-羟乙基。
29.项目14-26中任一项的组合物，其中R3和R5互不相同。
30.项目1的组合物，其中R1是H。
31.项目30的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。
32.项目30或31的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。
33.项目30-32中任一项的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
34.项目30-33中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
35.项目30-34中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
36.项目30-35中任一项的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基，优选地，R2和R3均为2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基。
36a.项目1-36中任一项的组合物，其中所述缓冲物质是N-氧化物。
37.项目1-36a中任一项的组合物，其中所述缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
38.项目1-37中任一项的组合物，其中所述缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分。
39.一种组合物，其包含(i)RNA；和(ii)水相，其中所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)、它的N-氧化物或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3中的每一个独立地选自H、C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3；或者R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，其任选被一个或两个R5取代；
R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-6亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-6亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基；并且
R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3。
40.项目39的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。
41.项目39或40的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。
42.项目39-41中任一项的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
43.项目39-42中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-4亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-3亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-2亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-2烷基。
44.项目39-43中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
45.项目39-44中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
46.项目39-45中任一项的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
47.项目39-46中任一项的组合物，其中R1、R2和R3都相同。
48.项目47的组合物，其中R1、R2和R3都是甲基、乙基或2-羟乙基。
49.项目39-46中任一项的组合物，其中R1和R2相同，并且R3与R1和R2不同。
50.项目49的组合物，其中R1和R2中的每一个是2-羟乙基、乙基或甲基。
51.项目49或50的组合物，其中R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
52.项目39的组合物，其中R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代。
53.项目52的组合物，其中R3选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R3选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
53a.项目52或53的组合物，其中所述N-杂环是单环，其含有至少一个氮环原子和任选存在的选自O和S的另一个环杂原子。
53b.项目52-53a中任一项的组合物，其中所述N-杂环是单环，其含有(i)一个氮环原子；(ii)两个氮环原子；(iii)一个氮环原子和一个氧环原子；(iv)一个氮环原子和一个硫环原子；或者(v)三个氮环原子。
53c.项目52-53b中任一项的组合物，其中所述N-杂环是单环5-或6-元N-杂环，如单环6-元N-杂环。
53d.项目52-53c中任一项的组合物，其中所述N-杂环选自吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、1,3,5-六氢三嗪基、吗啉基和硫代吗啉基，优选选自哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。
54.项目52-53d中任一项的组合物，其中，如果所述N-杂环仅含有一个氮环原子，则这个氮环原子被R3取代，R3不是H，或者，如果所述N-杂环含有一个以上的氮环原子，则一个氮环原子被R3取代，R3不是H，并且其他氮环原子中的至少一个，优选其他氮环原子中的每一个，被R5取代。
55.项目52-54中任一项的组合物，其中R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
56.项目52-55中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌啶基，并且环N原子被R3取代，其中R3不是H。
57.项目52-55中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌嗪基，两个环N原子中的一个被R3取代，R3不是H，并且另一个环N原子任选被R5取代，优选另一个N原子被R5取代。
58.项目57的组合物，其中两个环N原子都被取代，并且R5选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
59.项目52-58中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
60.项目52-59中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
61.项目52-60中任一项的组合物，其中R3和R5相同。
62.项目61的组合物，其中R3和R5均为甲基、乙基、2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基，优选地，R3和R5均为2-羟乙基。
63.项目52-60中任一项的组合物，其中R3和R5互不相同。
63a.项目39的组合物，其中R1是H。
63b.项目63a的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。
63c.项目63a或63b的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。
63d.项目63a-63c中任一项的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
63e.项目63a-63d中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，更优选R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
63f.项目63a-63e中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
63g.项目63a-63f中任一项的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基，优选地，R2和R3均为2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基。
63h.项目39-63g中任一项的组合物，其中所述缓冲物质是N-氧化物。
64.项目39-63h中任一项的组合物，其中所述缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
65.项目39-64中任一项的组合物，其中所述缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分。
66.项目1-65中任一项的组合物，其中所述缓冲系统进一步包含阴离子，所述阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根以及二羧酸或三羧酸的阴离子，如柠檬酸、琥珀酸、丙二酸、戊二酸或己二酸的阴离子。
67.项目1-66中任一项的组合物，其中所述组合物中缓冲物质的浓度在约10mM至约200mM之间，优选在约15mM至约100mM之间，更优选在约20mM至约80mM之间，更优选在约40mM至约60mM之间，如约50mM。
68.项目1-67中任一项的组合物，其中所述组合物的pH在约4.0至约8.0之间，优选在约4.5至约8.0之间，如约5.0至约8.0之间、约5.5至约8.0之间、约6.0至约8.0之间、约6.5至约8.0之间、约6.8至约7.9之间或者约7.0至约7.8之间。
69.项目1-68中任一项的组合物，其中水是所述组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约0.5％(v/v)。
70.项目1-69中任一项的组合物，其中所述组合物的重量摩尔渗透压浓度至多约为1000x 10-3渗透压摩尔/kg，优选约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约750x 10-3渗透压摩尔/kg之间，如约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约500x 10-3渗透压摩尔/kg之间，更优选约300x10-3渗透压摩尔/kg。
71.项目1-70中任一项的组合物，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l，如约10mg/l至约400mg/l、约10mg/l至约300mg/l、约10mg/l至约200mg/l、约10mg/l至约150mg/l或约10mg/l至约100mg/l，优选约10mg/l至约140mg/l，更优选约20mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
72.项目1-71中任一项的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂，优选浓度至少约为1％w/v，其中所述冷冻保护剂优选包含一种或多种选自碳水化合物和醇(如糖醇或低级醇)的化合物，更优选所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、山梨醇及其组合(如来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合组成的组或者来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合组成的组)，更优选所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。
72a.项目1-71中任一项的组合物，其中所述组合物基本上不含冷冻保护剂。
73.项目1-38和66-72中任一项的组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
74.项目1-38和66-73中任一项的组合物，其中所述阳离子可电离脂质具有式(X)的结构
或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L10和L20之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L10和L20中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接的键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-12亚烯基；
G3是C1-24亚烷基、C2-24亚烯基、C3-8亚环烷基或C3-8亚环烯基；
Ra是H或C1-12烷基；
R35和R36各自独立地是C6-24烷基或C6-24烯基；
R37是H、OR50、CN、-C(＝O)OR40、-OC(＝O)R40或–NR50C(＝O)R40；
R40是C1-12烷基；
R50是H或C1-6烷基；并且
x是0、1或2。
74a.项目1-38和66-74中任一项的组合物，其中：
(α)所述阳离子可电离脂质选自以下结构X-1至X-36：
/>
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(β)所述阳离子可电离脂质选自以下结构A-G：
或者
(γ)所述阳离子可电离脂质是具有结构X-3的脂质。
75.项目1-38和66-73中任一项的组合物，其中所述阳离子或阳离子可电离脂质具有式(XI)的结构：
其中
R1和R2中的每一个独立地是R5或-G1-L1-R6，其中R1和R2中至少一个是-G1-L1-R6；
R3和R4中的每一个独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、芳基和C3-10环烷基；
R5和R6中的每一个独立地是具有至少10个碳原子的非环状烃基；
G1和G2中的每一个独立地是未取代的C1-12亚烷基或C2-12亚烯基；
L1和L2中的每一个独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-和-NRaC(＝O)O-；
Ra是H或C1-12烷基；
m是0、1、2、3或4；并且
x是0、1或2。
75a.项目1-38、66-73和75中任一项的组合物，其中所述阳离子可电离脂质选自以下结构(XIV-1)、(XIV-2)和(XIV-3)：
76.项目1-38和66-75a中任一项的组合物，其中所述阳离子可电离脂质占存在于组合物中的总脂质的约20摩尔％至约80摩尔％，优选约25摩尔％至约65摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％。
77.项目1-76中任一项的组合物，其进一步包含一种或多种其他脂质，优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述组合物包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇。
78.项目77的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质优选(i)选自DSPE-PEG、DOPE-PEG、DPPE-PEG和DMPE-PEG；或者(ii)具有以下结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地是含有10-30个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且w的平均值的范围为30-60。
79.项目77的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物优选是选自聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
80.项目77-79中任一项的组合物，其中所述聚合物缀合脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5摩尔％至约5摩尔％，优选约1摩尔％至约5摩尔％，更优选约1摩尔％至约4.5摩尔％。
81.项目77-80中任一项的组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三碳酰磷脂酰胆碱(DTPC)、双十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。
82.项目77-81中任一项的组合物，其中所述中性脂质占存在于组合物中总脂质的约5摩尔％至约40摩尔％，优选约5摩尔％至约20摩尔％，更优选约5摩尔％至约15摩尔％。
83.项目77-82中任一项的组合物，其中所述类固醇包含固醇如胆固醇。
84.项目77-83中任一项的组合物，其中所述类固醇占存在于组合物中的总脂质的约10摩尔％至约65摩尔％，优选约20摩尔％至约60摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％。
85.项目77-84中任一项的组合物，其包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇，其中所述阳离子可电离脂质占存在于组合物中的总脂质的约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％；所述聚合物缀合脂质占存在于组合物中的总脂质的约1摩尔％至约4.5摩尔％；所述中性脂质(例如，磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约5摩尔％至约15摩尔％；并且所述类固醇占存在于组合物中的总脂质的约30摩尔％至约50摩尔％。
86.项目1-85中任一项的组合物，其中至少一部分RNA和，如果存在，一种或多种脂质存在于颗粒中，如脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体和/或脂质复合物(LPX)。
86a.项目86的组合物，所述颗粒包含组合物中所包含RNA的至少约75％，优选至少约80％。
86b.项目86或86a的组合物，其中所述RNA包封在颗粒内或与颗粒缔合。
87.项目86-86b中任一项的组合物，其中所述颗粒的大小为约30nm至约500nm。
88.项目1-87中任一项的组合物，其中所述RNA是mRNA或抑制性RNA。
89.项目1-88中任一项的组合物，其中所述RNA(i)包含代替尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷优选选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)；(ii)具有密码子优化的编码序列；和/或(iii)具有与野生型编码序列相比G/C含量增加的编码序列。
90.项目1-89中任一项的组合物，其中所述RNA包含以下至少一个，优选以下全部：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。
91.项目90的组合物，其中所述poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中所述poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。
92.项目90或91的组合物，其中所述5’帽是cap1或cap2结构。
93.项目1-92中任一项的组合物，其中所述RNA编码一种或多种多肽，其中优选所述一种或多种多肽是药学活性多肽和/或包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
94.项目93的组合物，其中所述药学活性多肽和/或抗原或表位源自病原体的蛋白、所述蛋白的免疫原性变体、或者所述蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段或者是病原体的蛋白、所述蛋白的免疫原性变体、或者所述蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
95.项目93或94的组合物，其中所述药学活性多肽和/或抗原或表位源自SARS-CoV-2刺突(S)蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段或者是SARS-CoV-2刺突(S)蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
95a.项目94或95的组合物，其中所述RNA包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
95b.项目95或95a的组合物，其中所述SARS-CoV2 S蛋白变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。
95c.项目95-95b中任一项的组合物，其中所述SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ IDNO:7的氨基酸17-1273的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少80％相同性。
95d.项目95-95c中任一项的组合物，其中所述片段包含SARS-CoV-2S蛋白的受体结合结构域(RBD)。
95e.项目95d的组合物，其中(i)SARS-CoV-2S蛋白或(ii)SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性变体的片段与SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少80％相同性。
96.项目1-95e中任一项的组合物，其中所述组合物为液体形式，优选在约2℃至约10℃的温度下。
97.项目1-96中任一项的组合物，其中优选在约2℃至约8℃的温度下，所述组合物储存至少一周后的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为50％。
98.项目87-97中任一项的组合物，其中所述组合物储存后的RNA颗粒(特别是LNP)的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于储存前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
99.项目1-95e中任一项的组合物，其中所述组合物为冷冻形式。
99a.项目99的组合物，其中所述组合物的pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。
99b.项目99或99a的组合物，其进一步包含冷冻保护剂。
99c.项目99b的组合物，其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖，例如所述冷冻保护剂是甘油。
99d.项目99b或99c的组合物，其中所述冷冻保护剂以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
100.项目99-99d中任一项的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为50％。
101.项目99或100的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA颗粒(特别是LNP)的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于所述组合物冷冻前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
102.一种制备包含分散在最终水相中的LNP的组合物的方法，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；所述最终水相包含最终缓冲系统，所述最终缓冲系统包含最终缓冲物质，所述最终缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)，它的N-氧化物或其质子化形式，其中R1、R2和R3如项目1-38中任一项所定义；
其中所述方法包括：
(I)制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；以及
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得所述组合物，
其中步骤(I)包括：
(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(b)制备包含阳离子可电离脂质和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(c)将根据(a)制备的RNA溶液与根据(b)制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在第一水相中的LNP的第一中间制剂，所述第一水相包含第一缓冲系统；以及
(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤根据(c)制备的第一中间制剂，从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
103.项目102的方法，其中步骤(I)进一步包括选自稀释和过滤的一个或多个步骤。
104.项目102或103的方法，其中步骤(I)包括：
(a')提供含水RNA溶液；
(b')提供包含第一缓冲系统的第一含水缓冲溶液；
(c')将根据(a')提供的含水RNA溶液与根据(b')提供的第一含水缓冲溶液混合，从而制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(d')制备包含阳离子可电离脂质和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(e')将根据(c')制备的RNA溶液与根据(d')制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在包含第一缓冲系统的第一水相中的LNP的第一中间制剂；
(f')任选使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液过滤根据(e')制备的第一中间制剂，从而制备另一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中所述另一含水缓冲溶液可以与所述第一含水缓冲溶液相同或不同；
(g')任选重复步骤(f')一次或两次或更多次，其中在步骤(f')的一次循环之后获得的另一中间制剂用作下一次循环的第一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中在每次循环中，所述另一含水缓冲溶液可以与所述第一含水缓冲溶液相同或不同；
(h')使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液，如果不存在步骤(f')，则过滤在步骤(e')中获得的第一中间制剂，或者如果存在步骤(f')而不存在步骤(g')，则过滤在步骤(f')中获得的另一中间制剂，或者如果存在步骤(f')和(g')，则过滤在步骤(g')之后获得的另一中间制剂；以及
(i')任选用稀释溶液稀释在步骤(h')中获得的制剂；
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
105.项目102-104中任一项的方法，其中过滤是切向流过滤或渗滤，优选切向流过滤。
106.项目102-105中任一项的方法，其包括(II)将所述制剂冷冻至约-10℃或更低。
106a.项目106的方法，其中所述组合物的pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。
107.项目106或106a的方法，所述方法进一步包括冷冻保护剂(优选步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂)。
107a.项目107的方法，其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖，例如所述冷冻保护剂是甘油。
107b.项目107或107a的方法，其中所述冷冻保护剂的浓度在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间。
108.项目102-107b中任一项的方法，其中所述最终缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
108a.项目102-108中任一项的方法，其中所述最终缓冲系统进一步包含阴离子，优选选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉代乙磺酸(MES)的阴离子、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)的阴离子、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)的阴离子以及二羧酸或三羧酸的阴离子，如柠檬酸、琥珀酸、丙二酸、戊二酸或己二酸的阴离子。
109.项目102-108a中任一项的方法，其中所述组合物中最终缓冲物质的浓度在约10mM至约200mM之间，优选在约15mM至约100mM之间，更优选在约20mM至约80mM之间，更优选在约40mM至约60mM之间，如约50mM。
110.项目102-109中任一项的方法，其中(i)步骤(a)中获得的RNA溶液的pH低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5；或者(ii)第一含水缓冲溶液的pH低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5。
111.项目102-110中任一项的方法，其中(i)步骤(a)中使用的第一缓冲系统包含步骤(d)中使用的最终缓冲物质，优选步骤(a)中使用的第一缓冲系统的缓冲系统和pH与在步骤(d)中使用的最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同；或者(ii)步骤(b')、(f')和(g')中使用的每个第一缓冲系统和每个另一缓冲系统包含步骤(h')中使用的最终缓冲物质，优选步骤(b')、(f')和(g')中使用的每个第一含水缓冲溶液和每个另一含水缓冲溶液的缓冲系统和pH与最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同。
112.项目102-111中任一项的方法，其中所述组合物的pH在约4.0至约8.0之间，优选在约4.5至约8.0之间，如约5.0至约8.0之间、约5.5至约8.0之间、约6.0至约8.0之间、约6.5至约8.0之间、约6.8至约7.9之间或者约7.0至约7之间。
113.项目102-112中任一项的方法，其中水是所述制剂和/或组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约0.5％(v/v)。
114.项目102-113中任一项的方法，其中所述组合物的重量摩尔渗透压浓度至多约为1000x 10-3渗透压摩尔/kg，优选约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约750x 10-3渗透压摩尔/kg之间，如约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约500x 10-3渗透压摩尔/kg之间，更优选约300x 10-3渗透压摩尔/kg。
115.项目102-114中任一项的方法，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l，如约10mg/l至约400mg/l、约10mg/l至约300mg/l、约10mg/l至约200mg/l、约10mg/l至约150mg/l或约10mg/l至约100mg/l，优选约10mg/l至约140mg/l，更优选约20mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
115a.项目102-115中任一项的方法，其中(i)步骤(I)进一步包括用稀释溶液稀释根据(d)制备的制剂，或者存在步骤(i')，其中所述稀释溶液包含冷冻保护剂；和/或(ii)步骤(I)中获得的制剂和所述组合物包含冷冻保护剂，优选浓度为至少约1％w/v，其中所述冷冻保护剂优选包含一种或多种选自碳水化合物和醇(如糖醇或低级醇)的化合物，更优选所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、山梨醇及其组合(如来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合组成的组或者来自由蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合组成的组)，更优选所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。
115b.项目102-106a和108-115中任一项的方法，其中步骤(I)中获得的制剂和所述组合物基本上不含冷冻保护剂。
116.项目102-115b中任一项的方法，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
116a.项目102-116中任一项的方法，其中所述阳离子可电离脂质如项目73-75a中任一项所定义。
117.项目102-116a中任一项的方法，其中步骤(b)或(d')中制备的乙醇溶液进一步包含一种或多种其他脂质，并且LNP进一步包含一种或多种其他脂质，其中所述一种或多种其他脂质优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇。
117a.项目117的方法，其中所述聚合物缀合脂质如项目78-80中任一项所定义。
117b.项目117或117a的方法，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三碳酰磷脂酰胆碱(DTPC)、双十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。
117c.项目117-117b中任一项的方法，其中所述类固醇包含固醇如胆固醇。
118.项目102-117c中任一项的方法，其中所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇以20％-60％阳离子可电离脂质、0.5％-15％聚合物缀合脂质、5％-25％中性脂质(例如，磷脂)和25％-55％类固醇的摩尔比存在于乙醇溶液中，优选摩尔比为45％-55％阳离子可电离脂质、1.0％-5％聚合物缀合脂质、8％-12％中性脂质和35％-45％类固醇。
118a.项目102-118中任一项的方法，其中所述LNP包含所述组合物中所包含的RNA的至少约75％，优选至少约80％。
119.项目102-118a中任一项的方法，其中所述RNA如项目88和89-95e中任一项所定义。
120.项目102-105和107-119中任一项的方法，其不包括步骤(II)。
121.一种制备含水RNA组合物的方法，其中所述方法包括：
(I)制备包含RNA和水相的制剂，其中所述水相包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)，它的N-氧化物，或其质子化形式，其中R1、R2和R3如项目1-38中任一项所定义；以及
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得所述组合物。
122.项目121的方法，其包括(II)将所述制剂冷冻至约-10℃或更低。
122a.项目122的方法，其中所述组合物的pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。
123.项目122或122a的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂。
123a.项目123的方法，其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、葡萄糖、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖，例如所述冷冻保护剂是甘油。
123b.项目123或123a的方法，其中所述冷冻保护剂以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
124.项目121的方法，其不包括步骤(II)。
125.项目121-124中任一项的方法，其中所述缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
126.一种储存组合物的方法，其包括根据项目102-119、121、122和125中任一项的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约-90℃至约-10℃的温度范围内，如约-90℃至约-40℃或约-25℃至约-10℃。
126a.项目126的方法，其中所述组合物的pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。
127.项目126或126a的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂。
127a.项目127的方法，其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖，例如所述冷冻保护剂是甘油。
127b.项目127或127a的方法，其中所述冷冻保护剂以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
128.项目126-127b中任一项的方法，其中将所述组合物储存至少1个月，如至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月。
129.一种储存组合物的方法，其包括根据项目102-128中任一项的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约0℃至约20℃的温度范围内，如约1℃至约15℃、约2℃至约10℃或约2℃至约8℃，或者约5℃的温度。
130.项目129的方法，其中将所述组合物储存至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月。
131.一种组合物，其可通过项目102-130中任一项的方法制备。
132.项目131的组合物，其为冷冻形式。
132a.项目132的组合物，其中所述组合物的pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。
133.项目132或132a的组合物，其进一步包含冷冻保护剂。
133a.项目133的组合物，其中所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖，例如所述冷冻保护剂是甘油。
133b.项目133或133a的组合物，其中所述冷冻保护剂在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间的浓度存在。
134.项目132-133b中任一项的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻之前的RNA完整性相比至少为50％。
135.项目132-134中任一项的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于所述组合物冷冻前RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
136.项目131的组合物，其为液体形式。
137.项目136的组合物，其中所述组合物储存至少1周后的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为50％。
138.项目136或137的组合物，其中所述组合物储存至少1周后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于储存前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
139.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过项目102-119、121-123b和125-128中任一项的方法制备的冷冻组合物并解冻所述冷冻组合物，从而获得所述即用型药物组合物的步骤。
140.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过项目102-105、107-121、124、125、129和130中任一项的方法制备的液体组合物，从而获得所述即用型药物组合物的步骤。
141.一种即用型药物组合物，其可通过项目139或140的方法制备。
142.项目1-101、131-138和141中任一项的组合物，其用于治疗。
143.项目1-101、131-138和141中任一项的组合物，其用于诱导受试者的免疫应答。
143a.一种转染细胞的方法，所述方法包括将项目1-101、131-138和141中任一项的组合物添加至细胞；并且将所述组合物和细胞的混合物温育足够长的时间。
143b.项目1-101、131-138和141中任一项的组合物在转染细胞中的用途。
143c.一种试剂盒，其包含项目1-101、131-138和141-143中任一项的组合物或者如本文所述的药物组合物。
143d.项目143c的试剂盒，其用于治疗，如用于诱导免疫应答。
143e.项目143c或143d的试剂盒，其用于诱导针对病原体的免疫应答，如用于治疗或预防传染病。
本文公开了本公开的其他方面。
附图说明
图1：RNA的降解与缓冲物质的类型相关。将RNALNP在各种缓冲系统(100mM,pH7.4)中在室温下温育12周。
图2：LMS的产生与阴离子部分的存在有关。将RNALNP在各种缓冲系统(100mM,pH7.4)中在室温下温育12周。
图3：RNA完整性与缓冲液化学。
图4：经过至少一次冷冻/解冻循环的LNP RNA组合物中不同冷冻保护剂的存在对LNP大小的影响。
序列描述
下表提供本文引用的某些序列的列表。
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具体实施方式
尽管下文更详细地进一步描述了本公开，但是应当理解本公开并不限于本文描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不是为了限制本公开的范围，本公开的范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中会更详细地描述本公开的要素。这些要素用具体实施方案列出，然而，应当理解它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的实例和优选实施方案不应当理解为将本公开仅限于明确描述的实施方案。本说明书应当理解为支持并涵盖组合明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选的要素的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都应当认为通过本申请的说明书公开。
优选地，本文使用的术语如"Amultilingual glossary of biotechnologicalterms:(IUPAC Recommendations)",H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,and H.Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)所述定义。
除非另有说明，否则本公开的实践会采用该领域的文献中解释的常规化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术(参见，例如，Organikum,Deutscher Verlag derWissenschaften,Berlin 1990；Streitwieser/Heathcook,"Organische Chemie",VCH,1990；Beyer/Walter,"Lehrbuch der Organischen Chemie",S.Hirzel VerlagStuttgart,1988；Carey/Sundberg,"Organische Chemie",VCH,1995；March,"AdvancedOrganic Chemistry",John Wiley&Sons,1985；Chemie Lexikon,Falbe/Regitz(Hrsg.),Georg Thieme Verlag Stuttgart,New York,1989；Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989。
在整个说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”及变化如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应当理解为意指包括所陈述的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。术语“基本上由…组成”表示排除具有任何实质意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含”涵盖术语“基本上由…组成”，而后者又涵盖术语“由…组成”。因此，在本申请中每次出现时，术语“包含”可以替换为术语“基本上由…组成”或“由…组成”。同样，在本申请中每次出现时，术语“基本上由…组成”可以替换为术语“由…组成”。
在描述本公开的上下文中(特别是在权利要求的上下文中)使用的术语“一个(a)”、“一个(an)”和“这个”以及相似指称应当理解为覆盖单数和复数，除非在本文中另有指明或与上下文明显矛盾。
除非在本文中另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。
除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有实例或者示例性语言(例如，“如”)的使用仅为了更好地说明本公开，并不对本公开的范围构成限制。本说明书中没有语言应当理解为说明对于本公开的实践必不可少的任何未要求保护的要素。
在本文中使用时，“和/或”视作两个指定特征或组分中每一个的具体公开，包含或不包含另一个。例如，“X和/或Y”视作(i)X、(ii)Y以及(iii)X和Y中每一个的具体公开，就像每个在本文中单独列出一样。
在本公开的上下文中，术语“约”表示准确性的区间，本领域普通技术人员会理解所述准确性的区间仍确保所讨论的特征的技术效果。该术语通常表示与所示数值偏差±10％，如±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％和例如±0.01％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±10％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±5％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±4％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±3％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±2％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±1％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.9％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.8％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.7％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.6％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.5％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.4％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.3％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.2％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.1％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.05％。在一些实施方案中，“约”表示与所示数值偏差±0.01％。如普通技术人员会理解的，对于给定技术效果的数值的这种具体偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果一般可以具有比人造或工程技术效果更大的这种偏差。
本文中值的范围的列举仅为了用作单独提到落在所述范围内的每个不同值的速记方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值均并入本说明书中，就像其在本文中单独陈述一样。
在这个说明书的整个正文中引用了几个文件。本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指导等)，无论上文或下文，均整体援引加入本文。本文中的任何内容都不应理解为承认本发明无权凭借在先的发明而早于这样的公开。
定义
在下文中，将提供适用于本公开的所有方面的定义。除非另有说明，否则以下术语具有以下含义。任何未定义的术语均具有其公认的含义。
如本文所用的术语如“减少”或“抑制”表示导致总体降低的能力，例如，在水平上，降低约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多或者约75％或更多。术语“抑制”或相似短语包括完全或基本上完全的抑制，即减少至0或基本上至0。
如本文所用的术语如“增强”或“增加”表示导致总体增加或增强的能力，例如，在水平上，增加或增强至少约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约75％或更多或者约100％或更多。在一些实施方案中，这些术语涉及增加或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％或至少约100％。
如本文所用的“生理pH”是指约7.5或约7.4的pH。在一些实施方案中，生理pH为7.3至7.5。在一些实施方案中，生理pH为7.35至7.45。在一些实施方案中，生理pH为7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。
如本文所用的“生理条件”是指活体、特别是人的条件(特别是pH和温度)。优选地，生理条件表示生理pH和/或约37℃的温度。
如本公开中所用，“％(w/v)”(或“％w/v”)是指重量体积百分比，它是一种浓度单位，以克(g)为单位测量溶质的量，表示为以毫升(ml)为单位的溶液总体积的百分比。
如本公开中所用，“重量％”或“％(w/w)”(或“％w/w”)是指重量百分比，它是一种浓度单位，以克(g)为单位测量物质的量，表示为以克(g)为单位的总组合物的总重量的百分比。
如本公开中所用，“摩尔(mol)％”定义为一种组分的摩尔数与所有组分的总摩尔数的比值，乘以100。
如本公开中所用，“总脂质的摩尔％”定义为一种脂质组分的摩尔数与所有脂质的总摩尔数的比值，乘以100。在这个上下文中，在一些实施方案中，术语“总脂质”包括脂质和脂质样物质。
术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类离子类别的量和它们各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度I在数学上通过下式表示：
其中c是特定离子类别的摩尔浓度，z是其电荷的绝对值。总和Σ取自溶液中所有不同种类的离子(i)。
根据本公开，在一些实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。
关于二价无机离子的存在，特别是二价无机阳离子，由于螯合剂的存在，它们的浓度或有效浓度(游离离子的存在)在一实施方案中足够低以防止RNA的降解。在一实施方案中，二价无机离子的浓度或有效浓度低于RNA核苷酸之间磷酸二酯键水解的催化水平。在一实施方案中，游离二价无机离子的浓度为20μM或更少。在一实施方案中，没有或基本上没有游离的二价无机离子。
“重量摩尔渗透压浓度(osmolality)”是指特定溶质的浓度，表示为每千克溶剂的溶质渗透压摩尔(osmole)数。
术语“冻干(lyophilizing)”或“冻干(lyophilization)”是指物质的冷冻干燥，通过将其冷冻然后降低周围压力(例如，低于15Pa，如低于10Pa，低于5Pa或1Pa或更低)以允许物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相。因此，术语“冻干”和“冷冻-干燥”在本文中可互换使用。
术语“喷雾干燥”是指通过混合(加热)气体与容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体来喷雾干燥物质，其中来自形成的液滴的溶剂蒸发，导致干燥粉末。
术语“重构”涉及将溶剂如水添加至干燥的产品以使其恢复为液体状态，例如其原始液体状态。
术语“冷冻”涉及液体的凝固，通常伴随着热量的释放。
如本文所用的术语“水相”涉及包含颗粒(特别是LNP)、脂质体和/或脂质复合物的组合物/制剂，是指流动相或液相，即包括溶解在其中的所有组分但(形式上)不包括颗粒的连续水相。因此，如果颗粒如LNP分散在水相中并且所述水相基本上不含化合物X，则所述水相是以以实际可行的方式不含X，例如，含水组合物中化合物X的浓度小于1重量％。然而，同时分散在水相中的颗粒可以包含大于1重量％的量的化合物X是可能的。
如本文所用的与碱(例如，具有式N(R1)(R2)(R3)或它的N-氧化物的缓冲物质)有关的表述“质子化形式”表示碱的共轭酸，其中所述共轭酸含有质子，所述质子可通过产生碱的去质子化而去除。例如，TEA的质子化形式具有式[HN(CH2CH2OH)3]+。如本文所用的“缓冲物质”是指碱与其质子化形式的混合物(例如，TEA和[HN(CH2CH2OH)3]+的混合物)。因此，组合物中所含的缓冲物质的量是所述组合物中碱和共轭酸的量之和。
在本公开的上下文中术语“重组”表示“通过遗传工程制备”。在一些实施方案中，本公开的上下文中的“重组物体”不是天然存在的。
如本文所用的术语“天然存在”是指物体可以在自然中发现这一事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中且可以分离自自然来源并且尚未被人在实验室中有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”表示“存在于自然界中”，包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离，但是将来可能从自然来源发现和/或分离的物体。
如本文所用，术语“室温”和“环境温度”在本文中可互换使用，是指至少约15℃，优选约15℃至约35℃，约15℃至约30℃，约15℃至约25℃或约17℃至约22℃的温度。这类温度包括15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃和22℃。
术语“烷基”是指饱和的直链或支化烃的单价基团。优选地，烷基包含1-12(如1-10)个碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子，缩写为C1-12烷基，(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，缩写为C1-10烷基)，更优选1-8个碳原子，如1-6或1-4个碳原子。示例性烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基(也称为2-丙基或1-甲基乙基)、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基(iso-pentyl)、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基-丙基、异戊基(iso-amyl)、正己基、异己基、仲己基、正庚基、异庚基、正辛基、2-乙基-己基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基等。“取代的烷基”表示一个或多个(例如1至与烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)亚烷基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。取代的烷基的实例包括氯甲基、二氯甲基、氟甲基和二氟甲基。
术语“亚烷基”是指饱和的直链或支化烃的二价基团。优选地，亚烷基包含1-12(如1-10)个碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选1-8个碳原子，如1-6或1-4个碳原子。示例性亚烷基包括亚甲基，亚乙基(即，1,1-亚乙基，1,2-亚乙基)，亚丙基(即，1,1-亚丙基，1,2-亚丙基(-CH(CH3)CH2-)，2,2-亚丙基(-C(CH3)2-)和1,3-亚丙基)，亚丁基异构体(例如，1,1-亚丁基，1,2-亚丁基，2,2-亚丁基，1,3-亚丁基，2,3-亚丁基(顺式或反式或者其混合物)，1,4-亚丁基，1,1-异亚丁基，1,2-异亚丁基和1,3-异亚丁基)，亚戊基异构体(例如，1,1-亚戊基，1,2-亚戊基，1,3-亚戊基，1,4-亚戊基，1,5-亚戊基，1,1-异亚戊基，1,1-仲亚戊基，1,1-新亚戊基)，亚己基异构体(例如，1,1-亚己基，1,2-亚己基，1,3-亚己基，1,4-亚己基，1,5-亚己基，1,6-亚己基和1,1-异亚己基)，亚庚基异构体(例如，1,1-亚庚基，1,2-亚庚基，1,3-亚庚基，1,4-亚庚基，1,5-亚庚基，1,6-亚庚基，1,7-亚庚基和1,1-异亚庚基)，亚辛基异构体(例如，1,1-亚辛基，1,2-亚辛基，1,3-亚辛基，1,4-亚辛基，1,5-亚辛基，1,6-亚辛基，1,7-亚辛基，1,8-亚辛基和1,1-异亚辛基)等。具有至少3个碳原子且每端具有自由价的直链亚烷基部分也可称为亚甲基的倍数(例如，1,4-亚丁基也可称为四亚甲基)。一般来说，亚烷基部分除了以“亚基(ylene)”结尾之外，也可以用“二基(diyl)”结尾(例如，1,2-亚丁基(1,2-butylene)也可称为丁烷-1,2-二基(butan-1,2-diyl))。“取代的亚烷基”表示一个或多个(例如1至与亚烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)亚烷基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支化烃的单价基团。一般来说，烯基中碳-碳双键的最大数目可以等于烯基中碳原子数除以2得到的整数，如果烯基中碳原子数是奇数，将除法结果向下取整到下一个整数。例如，对于具有9个碳原子的烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，烯基具有1-6个(如1-4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，烯基包含2-12(如2-10)个碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2-8个碳原子，如2-6个碳原子或2-4个碳原子。因此，在一优选实施方案中，烯基包含2-12个(缩写为C2-12烯基)(例如，2-10个)碳原子以及1、2、3、4、5或6个(例如，1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选其包含2-8个碳原子以及1、2、3或4个碳-碳双键，如2-6个碳原子以及1、2或3个碳-碳双键或者2-4个碳原子以及1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可以是顺式(Z)或反式(E)构型。示例性烯基包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(即烯丙基)、1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-庚烯基，2-庚烯基，3-庚烯基，4-庚烯基，5-庚烯基，6-庚烯基，1-辛烯基，2-辛烯基，3-辛烯基，4-辛烯基，5-辛烯基，6-辛烯基，7-辛烯基，1-壬烯基，2-壬烯基，3-壬烯基，4-壬烯基，5-壬烯基，6-壬烯基，7-壬烯基，8-壬烯基，1-癸烯基，2-癸烯基，3-癸烯基，4-癸烯基，5-癸烯基，6-癸烯基，7-癸烯基，8-癸烯基，9-癸烯基，1-十一碳烯基，2-十一碳烯基，3-十一碳烯基，4-十一碳烯基，5-十一碳烯基，6-十一碳烯基，7-十一碳烯基，8-十一碳烯基，9-十一碳烯基，10-十一碳烯基，1-十二碳烯基，2-十二碳烯基，3-十二碳烯基，4-十二碳烯基，5-十二碳烯基，6-十二碳烯基，7-十二碳烯基，8-十二碳烯基，9-十二碳烯基，10-十二碳烯基，11-十二碳烯基等。如果烯基连接至氮原子，双键不可以在氮原子的α位。“取代的烯基”表示一个或多个(例如1至与烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)烯基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“炔基”是指具有至少一个碳-碳三键的线性或支化的单价烃部分，其中总碳原子可以是6-30个，通常6-20个，经常6-18个。炔基可以任选具有一个或多个碳碳双键。一般来说，炔基中碳-碳三键的最大数目可以等于炔基中碳原子数除以2得到的整数，如果炔基中碳原子数是奇数，将除法结果向下取整到下一个整数。例如，对于具有9个碳原子的炔基，碳-碳三键的最大数目为4。优选地，炔基具有1-6个(例如1-4个)，即1、2、3、4、5或6个，更优选1或2个碳-碳三键。
术语“亚烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支化烃的二价基团。一般来说，亚烯基中碳-碳双键的最大数目可以等于亚烯基中碳原子数除以2得到的整数，如果亚烯基中碳原子数是奇数，将除法结果向下取整到下一个整数。例如，对于具有9个碳原子的亚烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚烯基具有1-6个(如1-4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，亚烯基包含2-12(如2-10)个碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2-8个碳原子，如2-6个碳原子或2-4个碳原子。因此，在一优选实施方案中，亚烯基包含2-12个(如2-10个碳)原子以及1、2、3、4、5或6个(如1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选其包含2-8个碳原子以及1、2、3或4个碳-碳双键，如2-6个碳原子以及1、2或3个碳-碳双键或者2-4个碳原子以及1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可以是顺式(Z)或反式(E)构型。示例性亚烯基包括乙烯-1,2-二基、亚乙烯基(vinylidene)(也称为亚乙烯基(ethenylidene))、1-丙烯-1,2-二基，1-丙烯-1,3-二基，1-丙烯-2,3-二基，亚烯丙基(allylidene)，1-丁烯-1,2-二基，1-丁烯-1,3-二基，1-丁烯-1,4-二基，1-丁烯-2,3-二基，1-丁烯-2,4-二基，1-丁烯-3,4-二基，2-丁烯-1,2-二基，2-丁烯-1,3-二基，2-丁烯-1,4-二基，2-丁烯-2,3-二基，2-丁烯-2,4-二基，2-丁烯-3,4-二基等。如果亚烯基连接至氮原子，双键不可以在氮原子的α位。“取代的亚烯基”表示一个或多个(如1至与亚烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)亚烯基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“环烷基”代表“烷基”和“烯基”的环状非芳香形式，优选具有3-14个碳原子，如3-12个或3-10个碳原子，即，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子(如3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选3-7个碳原子。示例性环烷基包括环丙基、环丙烯基、环丁基、环丁烯基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基、环庚烯基、环辛基、环辛烯基、环壬基、环壬烯基、环十二烷基、环十二烯基和金刚烷基。环烷基可以由一个环(单环)、两个环(双环)或两个以上的环(多环)组成。
术语“亚环烷基”表示“亚烷基”的环状非芳香形式并且是成对的、邻位的或分离的二价基团。在某些实施方案中，亚环烷基(i)是单环或多环(如双环或三环)的，和/或(ii)是3-至14-元(即，3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，如3-至12-元或3-至10-元)。在一实施方案中，亚环烷基是单环、双环或三环的3-至14-元(即，3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，如3-至12-元或3-至10-元)亚环烷基。一般来说，除了如上所述的亚环烷基部分使用“亚基(ylene)”结尾之外，还可以使用“二基(diyl)”结尾(例如，1,2-亚环丙基(1,2-cyclopropylene)也可以称为环丙烷-1,2-二基(cyclopropan-1,2-diyl))。示例性亚环烷基包括亚环己基，亚环庚基，亚环丙基，亚环丁基，亚环戊基，亚环辛基，二环[3.2.1]亚辛基，二环[3.2.2]亚壬基和亚金刚烷基(例如，三环[3.3.1.13,7]癸-2,2-二基)。“取代的亚环烷基”表示一个或多个(如1至与亚环烷基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)亚烷基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“亚环烯基”表示“亚烯基”的环状非芳香形式并且是成对的、邻位的或分离的二价基团。一般来说，亚环烯基中碳-碳双键的最大数目可以等于亚环烯基中碳原子数除以2得到的整数，如果亚环烯基中碳原子数是奇数，将除法结果向下取整到下一个整数。例如，对于具有9个碳原子的亚环烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚环烯基具有1-6个(如1-4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。在某些实施方案中，亚环烯基(i)是单环或多环(如双环或三环)的，和/或(ii)是3-至14-元(即，3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，例如3-至12-元或3-至10-元)。在一实施方案中，亚环烯基是单环、双环或三环的3-至14-元(即，3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，如3-至12-元或3-至10-元)亚环烯基。示例性亚环烯基包括亚环己烯基、亚环庚烯基、亚环丙烯基、亚环丁烯基、亚环戊烯基和亚环辛烯基。“取代的亚环烯基”表示一个或多个(如1至与亚环烯基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)亚环烯基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“芳基”是指芳香环烃的单价基团。优选地，芳基含有3-14个(例如，5、6、7、8、9或10个，如5、6或10个)碳原子，其可以排列成一个(例如，苯基)或两个或更多个缩合环(例如，萘基)。示例性芳基包括环丙烯鎓(cyclopropenylium)、环戊二烯基、苯基、茚基、萘基、薁基(azulenyl)、芴基、蒽基和菲基。优选地，“芳基”是指含有6个碳原子的单环或含有10个碳原子的芳香双环系统。优选的实例是苯基和萘基。芳基不涵盖富勒烯。
术语“杂环基”或“杂环”表示如上文定义的非芳香环烷基，其中环烷基中的1、2、3或4个碳原子被杂原子置换，优选选自氧、氮、硅、硒、磷和硫，更优选选自O、S和N。杂环基优选具有1或2个环，所述环含有3-10个，如3、4、5、6或7个环原子。优选地，在杂环基的每个环中，O原子的最大数目为1，S原子的最大数目为1，O和S原子的最大总数为2。示例性杂环基包括吗啉基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基(也称为哌啶基(piperidyl))、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基(diazinanyl)、1,3-六氢哒嗪基、1,3,5-六氢三嗪基(triazinanyl)、吗啉基、硫代吗啉基、二和四氢呋喃基、二和四氢噻吩基、二和四氢吡喃基、六亚甲基四胺基(urotropinyl)、内酯、内酰胺、环状酰亚胺和环状酐。“取代的杂环基”表示一个或多个(例如1至与杂环基结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)杂环基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“N-杂环”表示如上文定义的杂环，其中所述杂环含有至少一个N环原子，并且可以含有一个或多个其他环杂原子(优选选自氧、氮、硅、硒、磷和硫，更优选选自O、S和N)。示例性N-杂环包括吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、1,3,5-六氢三嗪基、吗啉基和硫代吗啉基，优选选自哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。“取代的N-杂环”表示一个或多个(例如1至与N-杂环结合的氢原子的最大数目，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，如1-5个、1-4个、或1-3个、或1或2个)N-杂环的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
在烃类的上下文中使用的术语“芳族”是指整个分子必须是芳族的。例如，如果单环芳基被氢化(部分或完全)，则出于本公开的目的，所得氢化环状结构归类为环烷基。同样，如果双环或多环芳基(例如萘基)被氢化，则所得氢化双环或多环结构(例如1,2-二氢萘基)出于本公开的目的归类为环烷基(即使是一个环仍是芳族的，例如在1,2-二氢萘基中)。在本申请中，杂芳基(即，如上文定义的芳基，其中芳基中的一个或多个碳原子被杂原子置换)和杂环基之间也有类似的区别。例如，吲哚啉基，即吲哚基的二氢变体，出于本公开的目的归类为杂环基，因为双环结构中只有一个环是芳族的，且其中一个环原子是杂原子。
通常一级取代基优选选自C1-3烷基、苯基、卤素、-CF3、-OH、-OCH3、-SCH3、-NH2-z(CH3)z、-C(＝O)OH和-C(＝O)OCH3，其中z是0、1或2，并且C1-3烷基是甲基、乙基、丙基或异丙基。特别优选的一级取代基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、卤素(如F、Cl或Br)和-CF3，如卤素(例如F、Cl或Br)和-CF3。
关于式N(R1)(R2)(R3)的表述“R1、R2和R3中的至多一个是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3”表示H、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3中的每一个只可以同时与N(R1)(R2)(R3)的N原子结合一次。例如，如果R1、R2和R3中的一个是H，则另外两个不可以是H(即，另外两个必须是H以外的基团)。同样，如果R1、R2和R3中的一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2，则另外两个不可以是CH(C1-5亚烷基-R4)2(即，另外两个必须是CH(C1-5亚烷基-R4)2以外的基团)。而且，如果R1、R2和R3中的一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，则另外两个不可以是C(C1-5亚烷基-R4)3(即，另外两个必须是C(C1-5亚烷基-R4)3以外的基团)。优选地，该表述表示R1、R2和R3中只有一个可以是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，另外两个不可以是H，也不可以是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3(例如，另外两个独立地是C1-6烷基，或者与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)。
如本文在冷冻组合物上下文中使用的表述“冷冻组合物解冻后”是指冷冻组合物必须在可以测量特征(如组合物中含有的颗粒(如LNP)的RNA完整性和/或尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI)之前解冻。
“一价”化合物涉及仅具有一个所关注的官能团的化合物。例如，一价阴离子涉及仅具有一个带负电荷的基团的化合物，优选在生理条件下。
“二价”或“二元(dibasic)”化合物涉及具有两个所关注的官能团的化合物。例如，有机二元酸具有两个酸基团。
“多价”或“多元(polybasic)”化合物涉及具有三个或更多个所关注的官能团的化合物。例如，有机多元酸具有三个或更多个酸基团。
如本文所用，表述“基本上不含X”表示混合物(如本文所述的组合物或制剂的水相)以实际可行的方式不含X。例如，如果混合物基本上不含X，则混合物中X的量可以小于1重量％(例如，小于0.5重量％，小于0.4重量％，小于0.3重量％，小于0.2重量％，小于0.1重量％，小于0.09重量％，小于0.08重量％，小于0.07重量％，小于0.06重量％，小于0.05重量％，小于0.04重量％，小于0.03重量％，小于0.02重量％，小于0.01重量％，小于0.005重量％，小于0.001重量％)，基于混合物的总重量。
如本文所用，表述“柠檬酸根阴离子”表示任何含有柠檬酸根阴离子并在溶解于含水介质时会释放出柠檬酸根阴离子的化合物。含有柠檬酸根阴离子并在溶解于含水介质时会释放出柠檬酸根阴离子的化合物的实例包括柠檬酸和柠檬酸的盐。
如本文所用，表述“EDTA阴离子”表示任何含有EDTA阴离子并在溶解于含水介质时会释放出EDTA阴离子的化合物。含有EDTA阴离子并在溶解于含水介质时会释放出阴离子的化合物的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)和EDTA的盐。
如本文所用，表述“有机二元酸阴离子”表示任何含有游离形式(即，质子化的)、酐形式或盐形式的两个酸基团的有机化合物。在这方面，术语“酸基团”是指羧酸或硫酸基团。优选地，表述“有机二元酸”不包括羧酸或硫酸基团与一个或多个有机醇的酯。有机二元酸的实例包括草酸、苹果酸和酒石酸。
如本文所用，表述“有机多元酸阴离子”表示任何含有游离形式(即，质子化的)、酐形式或盐形式的三个或更多个酸基团的有机化合物。在这方面，术语“酸基团”是指羧酸或硫酸基团。优选地，表述“有机多元酸”不包括羧酸或硫酸基团与一个或多个有机醇的酯。有机多元酸的一个实例包括柠檬酸。
表述“RNA完整性”是指样品中含有的全长(即非片段化)RNA占RNA总量(即非片段化加片段化RNA)的百分比。RNA的完整性可以通过色谱法分离RNA(例如，使用毛细管电泳)、确定主要RNA峰的峰面积(即，全长(即非片段化)RNA的峰面积)、确定总RNA的峰面积，并将主要RNA峰的峰面积除以总RNA的峰面积而确定。
术语“冷冻保护剂”涉及添加到制品(例如制剂或组合物)中以在冷冻阶段保护所述制品的活性成分的物质。
术语“冻干保护剂”涉及添加到制剂中以在干燥阶段保护活性成分的物质。
根据本公开，术语“肽”包括寡肽和多肽，并且是指包含经由肽键互相连接的约2个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个以及多达约50个、约100个或约150个连续氨基酸的物质。术语“多肽”是指较大的肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽。“肽”和“多肽”都是蛋白分子，尽管术语“肽”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。
当以治疗有效量提供给受试者时，“治疗性蛋白”对受试者的状况或疾病状态具有积极或有利的作用。在一些实施方案中，治疗性蛋白具有治愈或缓解特性，并且可以给药以改善、减轻、缓解、逆转、延迟疾病或病症的一种或多种症状的发生或者减轻疾病或病症的一种或多种症状的严重程度。治疗性蛋白可以具有预防特性，并且可以用来延迟疾病的发生或者减轻这类疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白”包括完整的蛋白或肽，并且还可以指其治疗活性片段。其还可以包括蛋白的治疗活性变体。治疗活性蛋白的实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原和免疫刺激剂如细胞因子。
根据本公开的各种实施方案，编码肽、多肽或蛋白的核酸如RNA(例如，mRNA)被摄取或引入，即转染或转导至细胞中，导致所述肽、多肽或蛋白的表达，所述细胞可以存在于体外或受试者中。细胞可以在细胞内(例如在细胞质中和/或在细胞核中)表达编码的肽、多肽或蛋白，可以分泌编码的肽、多肽或蛋白，和/或可以在表面上表达编码的肽、多肽或蛋白。
根据本公开，术语如“核酸表达”和“核酸编码”或相似术语在本文中可互换使用，并且关于特定肽、多肽或蛋白，其表示如果存在于适当环境中，优选在细胞内，核酸可以表达以产生所述肽、多肽或蛋白。
术语“部分(portion)”是指一部分。关于特定结构如氨基酸序列或蛋白，术语其“部分”可以指所述结构的连续或不连续部分。
术语“部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用，是指连续的元件。例如，结构如氨基酸序列或蛋白的一部分是指所述结构的连续元件。当在组合物的上下文中使用时，术语“部分(part)”表示组合物的一部分(portion)。例如，组合物的一部分(part)可以是所述组合物的0.1％-99.9％(如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何部分(portion)。
关于氨基酸序列(肽、多肽或蛋白)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即，代表在N-末端和/或C-末端缩短的氨基酸序列的序列。在C-末端缩短的片段(N-末端片段)，例如通过缺少开放阅读框3'-末端的截短的开放阅读框的翻译可获得。在N-末端缩短的片段(C-末端片段)，例如通过缺少开放阅读框5'-末端的截短的开放阅读框的翻译可获得，只要截短的开放阅读框包含用于启动翻译的起始密码子。氨基酸序列的片段包含例如来自氨基酸序列的氨基酸残基的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。氨基酸序列的片段包含例如氨基酸序列的多达8个、特别是多达10个、多达12个、多达15个、多达20个、多达30个或多达55个连续氨基酸的序列。
根据本公开，肽、多肽或蛋白的一部分(part)或片段优选具有衍生它的肽、多肽或蛋白的至少一种功能特性。这种功能特性包括药理学活性，与其他肽、多肽或蛋白的相互作用，酶促活性，与抗体的相互作用以及核酸的选择性结合。例如，肽、多肽或蛋白的药理学活性片段具有衍生该片段的肽、多肽或蛋白的至少一种药理学活性。肽、多肽或蛋白的一部分(part)或片段优选包含肽或蛋白的至少6个、特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肽或蛋白的一部分(part)或片段优选包含肽或蛋白的多达8个、特别是多达10个、多达12个、多达15个、多达20个、多达30个或多达55个连续氨基酸的序列。
如本文所用的关于氨基酸序列(肽、多肽或蛋白)的“变体”是指至少一个氨基酸(例如，不同的氨基酸，或相同氨基酸的修饰)不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸的修饰形式。在一些实施方案中，与亲本氨基酸序列相比，变体氨基酸序列具有至少一个氨基酸差异，例如，与亲本相比，具有1至约20个氨基酸差异，并且优选1至约10个或1至约5个氨基酸差异。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然”表示在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽、多肽或蛋白具有未经有意修饰的氨基酸序列。
为了本公开的目的，氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。特别地，术语“变体”包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入单个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入氨基酸序列中的特定位点，尽管适当筛选所得产物的随机插入也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸的氨基-和/或羧基-末端融合，如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。氨基酸缺失变体的特征在于从序列去除一个或多个氨基酸，如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白的任何位置。在蛋白的N-末端和/或C-末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称作N-末端和/或C-末端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于去除序列中的至少一个残基并在其位置插入另一残基。优先考虑在同源蛋白或肽之间不保守的氨基酸序列位置中的修饰和/或用具有相似特性的其他氨基酸置换氨基酸。在一些实施方案中，肽和蛋白变体中的氨基酸改变是保守的氨基酸改变，即，相似带电荷或不带电荷的氨基酸的取代。保守的氨基酸改变包括在它们的侧链中相关的一个氨基酸家族的取代。天然存在的氨基酸一般分为4个家族：酸性(天冬氨酸、谷氨酸)，碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，和不带电荷的极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)氨基酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时共同归类为芳香氨基酸。在一实施方案中，保守氨基酸取代包括以下组内的取代：
-甘氨酸，丙氨酸；
-缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；
-天冬氨酸，谷氨酸；
-天冬酰胺，谷氨酰胺；
-丝氨酸，苏氨酸
-赖氨酸，精氨酸；和
-苯丙氨酸，酪氨酸。
在一些实施方案中，给定氨基酸序列和所述给定氨基酸序列变体的氨基酸序列之间的相似性，优选相同性程度是至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选对参考氨基酸序列整个长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸给出相似性或相同性程度，在一些实施方案中是连续氨基酸。在一些实施方案中，对参考氨基酸序列的整个长度给出相似性或相同性程度。可以用本领域已知的工具进行确定序列相似性，优选序列相同性的比对，优选使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle，Matrix:Blosum62，Gap Open10.0，Gap Extend 0.5。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列相同性”表示所述序列之间相同的核苷酸的百分比。
特别地，术语“％相同”、“％相同性”或类似术语是指在待比较的序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比纯粹是统计上的，并且两个序列之间的差异可以但不必一定随机分布在待比较的序列的整个长度上。通常在对片段或“比较窗口”最佳比对之后，通过比较序列进行两个序列的比较，以便鉴定相应序列的局部区域。可以手动或者借助于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源性算法，借助于Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，借助于Pearsonand Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA88,2444的相似性搜索方法，或借助于使用所述算法的计算机程序(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics ComputerGroup,575Science Drive,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)进行比较的最佳比对。在一些实施方案中，使用BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的百分比相同性，可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LIN K_LOC＝align2seq)上获得。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTN算法的算法参数包括：(i)Expect Threshold设置为10；(ii)Word Size设置为28；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)Match/Mismatch Scores设置为1，-2；(v)Gap Costs设置为Linear；以及(vi)用于低复杂度区域的过滤器。在一些实施方案中，用于NCBI网站上的BLASTP算法的算法参数包括：(i)Expect Threshold设置为10；(ii)Word Size设置为3；(iii)查询范围中的最大匹配设置为0；(iv)Matrix设置为BLOSUM62；(v)Gap Costs设置为Existence:11Extension:1；以及(vi)条件成分评分矩阵调整。
通过确定待比较的序列对应的相同位置的数目，用这个数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将这个结果乘以100，获得百分比相同性。
在一些实施方案中，对参考序列整个长度的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则对至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个核苷酸给出相同性程度，在一些实施方案中是连续核苷酸。在一些实施方案中，对参考序列的整个长度给出相似性或相同性程度。
根据本公开，同源氨基酸序列表现出氨基酸残基的至少40％、特别是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％以及优选至少95％、至少98或至少99％相同性。
技术人员可以容易地制备本文描述的氨基酸序列变体，例如，通过重组DNA操作。例如，Sambrook等人(1989)详细描述了用于制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白的DNA序列的操作。此外，本文描述的肽和氨基酸变体可以借助已知的肽合成技术容易地制备，例如，通过固相合成和类似方法。
在一些实施方案中，氨基酸序列(肽、多肽或蛋白)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”涉及表现出一种或多种与其来源的氨基酸序列相同或相似的功能特性的任何片段或变体，即，功能等同。关于抗原或抗原序列，一种特定功能是片段或变体所来源的氨基酸序列表现出的一种或多种免疫原性活性。如本文所用，术语“功能片段”或“功能变体”特别是指这样的变体分子或序列，其包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或多个氨基酸的氨基酸序列，并且仍能够完成亲本分子或序列的一种或多种功能，例如，诱导免疫应答。在一实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变所述分子或序列的特征。在不同的实施方案中，功能片段或功能变体的功能可能降低但仍显著存在，例如，功能变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在其他实施方案中，与亲本分子或序列相比，可以增强功能片段或功能变体的免疫原性。
氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)“源自”指定氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)是指第一氨基酸序列的起源。在一些实施方案中，源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员会理解，可以改变适合用于本文的抗体，从而它们的序列不同于其来源的天然存在的序列或天然序列，同时保留天然序列的期望活性。
在一些实施方案中，“分离的”表示从自然状态或人工组合物如来自生产过程的组合物中改变或去除(例如，纯化)。例如，天然存在于活动物体内的核酸或肽不是“分离的”，但是从其自然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如，宿主细胞。在一些实施方案中，本公开中使用的RNA(如mRNA)是基本上纯化的形式。在一些实施方案中，基本上纯化形式的RNA(如mRNA)的溶液(优选水溶液)含有第一缓冲系统。
术语“遗传修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA，引入细胞。为了本公开的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞或这种细胞摄取核酸，其中所述细胞可以存在于受试者中，例如，患者。因此，根据本公开，用于转染本文所述核酸的细胞可以存在于体外或体内，例如所述细胞可以构成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本公开，转染可以是瞬时或稳定的。对于转染的一些应用，转染的遗传物质仅瞬时表达就足够了。可以将RNA转染入细胞以瞬时表达其编码的蛋白。因为转染过程中引入的核酸通常不整合入核基因组，所以外源核酸会通过有丝分裂稀释或降解。允许核酸游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须进行稳定转染。这种稳定的转染可以通过使用基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常，将编码抗原的核酸瞬时转染入细胞。可以将RNA转染入细胞以瞬时表达其编码的蛋白。
本公开包括肽、多肽或蛋白的类似物。根据本公开，肽、多肽或蛋白的类似物是衍生它的所述肽、多肽或蛋白的修饰形式，并且具有所述肽、多肽或蛋白的至少一种功能特性。例如，肽、多肽或蛋白的药理学活性类似物具有衍生该类似物的肽、多肽或蛋白的至少一种药理学活性。这类修饰包括任何化学修饰，并且包括与蛋白、多肽或肽相关的任何分子的单个或多个取代、缺失和/或添加，如碳水化合物、脂质和/或蛋白或肽。在一实施方案中，蛋白、多肽或肽的“类似物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或者结合抗体或另一细胞配体导致的那些修饰形式。术语“类似物”还延伸至所述蛋白、多肽和肽的所有功能性化学等价物。
如本文所用，“激活”或“刺激”是指已充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞(例如，免疫效应细胞如T细胞)的状态。激活还可以与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应功能相关。此外，术语“激活的免疫效应细胞”是指正在进行细胞分裂的免疫效应细胞。
术语“引发(priming)”是指这样的过程，其中免疫效应细胞如T细胞与其特异性抗原首次接触并导致分化为效应细胞如效应T细胞。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在一些实施方案中，该术语优选用于免疫应答的上下文，其中免疫效应细胞被抗原刺激，增殖，并且扩增识别所述抗原的特定免疫效应细胞。在一些实施方案中，扩增导致免疫效应细胞的分化。
根据本公开的“抗原”涵盖会引发免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制如细胞应答所针对的任何物质。这还包括其中将抗原加工为抗原肽并且免疫应答或免疫机制针对一种或多种抗原肽的情况，特别是如果在MHC分子的背景下呈递。特别地，“抗原”涉及与抗体或T-淋巴细胞(T-细胞)特异性反应的任何物质，优选肽或蛋白。根据本公开，术语“抗原”包括包含至少一个表位如T细胞表位的任何分子。优选地，本公开的上下文中的抗原是一种分子，任选在加工之后，诱导免疫反应，优选是抗原(包括表达抗原的细胞)特异性的。在一实施方案中，抗原是疾病相关抗原，如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，或者源自这种抗原的表位。
根据本公开，可以使用任何合适的抗原，其是免疫应答的候选物，其中免疫应答可以是体液或细胞免疫应答或两者兼而有之。在本公开的一些实施方案的情况下，抗原由细胞呈递，优选由抗原呈递细胞在MHC分子的背景下呈递，这导致针对抗原的免疫应答。抗原可以是对应于或源自天然存在的抗原的产物。这类天然存在的抗原可以包括或可以源自过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他传染物和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本公开，抗原可以对应于天然存在的产物，例如，病毒蛋白或其部分。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义用于指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是一种含有表位的分子，所述表位会刺激宿主的免疫系统以产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。疾病相关抗原包括病原体相关抗原，即与微生物感染相关的抗原，通常是微生物抗原(如细菌或病毒抗原)，或者与癌症相关的抗原，通常是肿瘤，如肿瘤抗原。
在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即肿瘤细胞的一部分，特别是那些主要出现在细胞内或作为肿瘤细胞表面抗原的抗原。在另一实施方案中，抗原是病原体相关抗原，即源自病原体的抗原，例如源自病毒、细菌、单细胞生物或寄生虫，例如病毒抗原如病毒核糖核蛋白或外壳蛋白。特别地，抗原应当由MHC分子呈递，这导致调节，特别是免疫系统细胞的激活，优选CD4+和CD8+淋巴细胞，特别是经由T-细胞受体活性的调节。
术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”是指癌细胞的成分，其可以源自细胞质、细胞表面或细胞核。特别地，它是指那些在细胞内产生或作为肿瘤细胞上的表面抗原的抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎儿硫糖蛋白、α2-H-铁蛋白和γ-胎蛋白，以及各种病毒肿瘤抗原。根据本公开的一些实施方案，肿瘤抗原包括在类型和/或表达水平方面是肿瘤或癌症以及肿瘤或癌细胞特有的任何抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌组分。细菌抗原可以源自细菌的细胞壁或细胞质膜。
术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即免疫系统识别的分子的一部分或片段，例如，抗体T细胞或B细胞识别的分子的一部分或片段，特别是在MHC分子的背景下呈递时。蛋白的表位可以包含所述蛋白的连续或不连续部分，并且例如长度可以为约5至约100，约5至约50，约8至约0，约10至约25个氨基酸，例如，表位可以优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，本公开的上下文中的表位是T细胞表位。
术语如“表位”、“抗原片段”、“免疫原性肽”和“抗原肽”在本文中可互换使用，并且例如可以涉及抗原的不完全呈递(representation)，例如，其能够引发针对抗原或者表达或包含和呈递抗原的细胞的免疫应答。在一些实施方案中，，该术语涉及抗原的免疫原性部分。优选地，它是T细胞受体识别(即，特异性结合)的抗原的一部分，特别是如果在MHC分子的背景下呈递。某些优选的免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。术语“表位”是指免疫系统识别的分子如抗原的一部分或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可以包括所述抗原的连续或不连续部分，并且可以长度为约5-约100，如约5-约50，更优选约8-约30，最优选约8-约25个氨基酸，例如，表位可以优选长度为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一些实施方案中，表位长度在约10至约25个氨基酸之间。术语“表位”包括T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指在MHC分子的背景下呈递时被T细胞识别的蛋白的一部分或片段。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导很重要，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们用于T细胞上的T细胞受体识别。MHC编码的蛋白在细胞表面上表达，并且向T细胞展示自身抗原(来自细胞自身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可能是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，特别是长约13至约18个氨基酸，而更长或更短的肽可能是有效的。
肽和蛋白抗原可以长度为2-100个氨基酸，包括例如，5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可以大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可以大于100个氨基酸。
肽或蛋白抗原可以是可以诱导或增加免疫系统发展对肽或蛋白的抗体和T细胞应答的能力的任何肽或蛋白。
在一些实施方案中，疫苗抗原，即将其接种到受试者中诱导免疫应答的抗原，被免疫效应细胞识别。在一些实施方案中，如果疫苗抗原被免疫效应细胞识别，其能够在适当的共刺激信号存在下诱导携带识别疫苗抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。在本公开的实施方案的上下文中，疫苗抗原优选被呈递或存在于细胞表面上，优选抗原呈递细胞。在一些实施方案中，抗原由患病细胞(如肿瘤细胞或感染细胞)呈递。在一些实施方案中，抗原受体是TCR，其与在MHC背景下呈递的抗原表位结合。在一些实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，TCR与细胞如抗原呈递细胞呈递的抗原的结合导致所述T细胞的刺激、引发和/或扩增。在一些实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，TCR与患病细胞上呈递的抗原的结合导致患病细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔蛋白(perforin)和颗粒酶。
在一些实施方案中，抗原受体是与抗原表位结合的抗体或B细胞受体。在一些实施方案中，抗体或B细胞受体与抗原的天然表位结合。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面结合”表示分子如抗原与细胞的质膜结合并位于细胞的质膜上，其中分子的至少一部分面向所述细胞的细胞外空间，并且从所述细胞的外部可及，例如，通过位于细胞外部的抗体。在这个上下文中，一部分可以是例如至少4个、至少8个、至少12个或至少20个氨基酸。结合可以是直接或间接的。例如，结合可以是通过一个或多个跨膜结构域，一个或多个脂质锚定物，或者通过与可以在细胞质膜的外叶上发现的任何蛋白、脂质、糖或其他结构相互作用。例如，与细胞表面结合的分子可以是具有细胞外部分的跨膜蛋白，或者可以是通过与作为跨膜蛋白的另一蛋白相互作用而与细胞表面结合的蛋白。
“细胞表面”或“细胞的表面”按照其在本领域中的正常含义使用，因此包括蛋白和其他分子的结合可及的细胞外部。如果抗原位于细胞表面并且对例如通过添加至细胞的抗原特异性抗体的结合可及，则抗原在所述细胞表面上表达。在一些实施方案中，细胞表面上表达的抗原是具有CAR可以识别的胞外部分的整合膜蛋白。
本公开的上下文中的术语“胞外部分”或“胞外域(exodomain)”是指分子如蛋白的一部分，其面向细胞的胞外空间并且优选从所述细胞外可及，例如通过结合位于细胞外的分子如抗体。在一些实施方案中，该术语是指一个或多个细胞外环或结构域或其片段。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)，其包含溶细胞性T细胞。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及识别T细胞所靶向的抗原的T细胞，特别是当在MHC分子的背景下呈递于抗原呈递细胞或患病细胞如癌细胞的表面时，并且优选发挥T细胞的效应功能。如果细胞杀死表达抗原的靶细胞，则认为T细胞是抗原特异性的。可以使用各种标准技术中的任一种，例如，在铬释放测定或增殖测定内评价T细胞特异性。或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成。在本公开的某些实施方案中，RNA(特别是mRNA)编码至少一个表位。
术语“靶标”应当表示物质如细胞或组织，其是免疫应答如细胞免疫应答的靶标。靶标包括呈递抗原或抗原表位(即源自抗原的肽片段)的细胞。在一实施方案中，靶细胞是表达抗原并优选用I类MHC呈递所述抗原的细胞。
“抗原加工”是指抗原降解为加工产物，加工产物是所述抗原的片段(例如，蛋白降解为肽)，并且这些片段中的一个或多个与MHC分子关联(例如，经由结合)用于通过细胞，优选抗原呈递细胞呈递给特定T-细胞。抗原呈递细胞可以区分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
“抗原反应性CTL”表示对抗原或源自所述抗原的肽有反应的CD8+T-细胞，其与I类MHC一起在抗原呈递细胞表面上呈递。
根据本公开，CTL反应性可以包括持续的钙通量、细胞分裂、产生细胞因子如IFN-g和TNF-α、上调激活标记如CD44和CD69以及特异性溶细胞杀伤表达肿瘤抗原的靶细胞。还可以使用准确指示CTL反应性的人工报告物确定CTL反应性。
术语“免疫应答”和“免疫反应”在本文中以其常规含义可互换使用，是指对抗原的综合身体应答，并且可以指细胞免疫应答、体液免疫应答或两者。根据本公开，关于物质如抗原、细胞或组织的术语“对…免疫应答”或“针对…免疫应答”涉及针对所述物质的免疫应答如细胞应答。免疫应答可以包括一种或多种选自以下的反应：发展针对一种或多种抗原的抗体，以及扩增抗原特异性T-淋巴细胞，如CD4+和CD8+T-淋巴细胞，例如CD8+T-淋巴细胞，其可以在体外的各种增殖或细胞因子产生测试中检测到。
在本公开的上下文中，术语“诱导免疫应答”和“引发免疫应答”以及类似术语是指免疫应答的诱导，如细胞免疫应答、体液免疫应答或两者的诱导。免疫应答可以是保护性/防护性/预防性和/或治疗性的。免疫应答可以针对任何免疫原或抗原或抗原肽，优选针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如，病毒(如流感病毒(A、B或C)、CMV或RSV)的抗原)。在这个上下文中“诱导”可以表示在诱导之前没有针对特定抗原或病原体的免疫应答，但是其也可以表示在诱导之前有一定水平的针对特定抗原或病原体的免疫应答，并且在诱导之后所述免疫应答增强。因此，在这个上下文中“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。在一些实施方案中，在个体中诱导免疫应答之后，所述个体受到保护免于发展疾病如传染病或癌性疾病，或者疾病状况通过诱导免疫应答改善。
术语“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“细胞介导的免疫”或类似术语表示包括针对细胞的细胞应答，其特征在于抗原的表达和/或用I类或II类MHC呈递抗原。细胞应答涉及称作T细胞或T淋巴细胞的细胞，其充当“辅助细胞”或“杀伤细胞”。辅助T细胞(也称作CD4+T细胞)通过调节免疫应答发挥中心作用，而杀伤细胞(也称作细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤细胞如患病细胞。
术语“体液免疫应答”是指活生物体中的一个过程，其中对物质和生物体应答产生抗体，它们最终中和和/或消除所述物质和生物体。抗体应答的特异性由T和/或B细胞通过结合单一特异性抗原的膜相关受体来介导。在结合适当抗原并接收各种其他激活信号之后，B淋巴细胞分裂，产生记忆B细胞以及分泌抗体的浆细胞克隆，每个克隆产生的抗体识别与其抗原受体识别的相同的抗原表位。记忆B淋巴细胞保持休眠状态，直至它们随后被其特异性抗原激活。这些淋巴细胞提供记忆的细胞基础，并且在再次暴露于特异性抗原时导致抗体应答升级。
如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其能够与抗原上的表位特异性结合。特别地，术语“抗体”是指包含通过二硫键互相连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和任何前述抗体的组合。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。可变区和恒定区在本文中还分别称作可变结构域和恒定结构域。VH和VL区可以进一步细分为高变性的区域，称作互补决定区(CDR)，其中散布着更保守的、称作框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含3个CDR和4个FR，从氨基-末端至羧基-末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH的CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL的CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)，其中CH可以进一步细分为恒定结构域CH1、铰链区以及恒定结构域CH2和CH3(从氨基-末端至羧基-末端按照以下顺序排列：CH1、CH2、CH3)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应子细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以各种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2以及单链抗体和人源化抗体。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白，如涉及抗原受体如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构结构域，即免疫球蛋白结构域。该术语涵盖膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也称作表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白一般称为抗体。免疫球蛋白一般包含几条链，通常是通过二硫键连接的两条相同的重链和两条相同的轻链。这些链主要包含免疫球蛋白结构域，如VL(可变轻链)结构域，CL(恒定轻链)结构域，VH(可变重链)结构域以及CH(恒定重链)结构域CH1、CH2、CH3和CH4。有五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即，α、d、ε、g和μ，其导致不同类别的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在它们的羧基-末端包含跨膜结构域和短胞质结构域。在哺乳动物中有两种类型的轻链，即，λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型内基本上是保守的，其中可变部分高度不同并负责抗原识别。
术语“疫苗接种”和“免疫接种”描述出于治疗或预防原因治疗个体的过程，并且涉及以下程序：向个体给药一种或多种免疫原或抗原或其衍生物，特别是以对其编码的RNA(尤其是mRNA)的形式，如本文所述，并且刺激针对所述一种或多种免疫原或抗原的免疫应答或者以呈递所述一种或多种免疫原或抗原为特征的细胞。
“以呈递抗原为特征的细胞”或“呈递抗原的细胞”或“在抗原呈递细胞表面上呈递抗原的MHC分子”或类似表述表示细胞如患病细胞，特别是肿瘤细胞或受感染的细胞，或者直接或在加工之后呈递抗原或抗原肽的抗原呈递细胞，在MHC分子的背景下，优选MHC I类和/或MHC II类分子，最优选MHC I类分子。
在本公开的上下文中，术语“转录”涉及一个过程，其中将DNA序列中的遗传密码转录为RNA(尤其是mRNA)。随后，可以将RNA(尤其是mRNA)翻译为肽、多肽或蛋白。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过这个过程mRNA链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白。
本文所述的药物制品，特别是试剂盒，可以包含说明材料或说明书。如本文所用，“说明材料”或“说明书”包括可以用来传达本公开的组合物和方法的可用性的出版物、记录、图标或任何其他表达介质。本公开的试剂盒的说明材料可以例如粘贴至含有本公开的组合物的容器，或者与含有组合物的容器一起运送。或者，说明材料可以与容器分开运送，目的是说明材料和组合物由接受者合作使用。
如本文所用的术语“任选”或“任选地”表示随后描述的事件、情况或条件可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件、情况或条件发生和不发生的情况。
本文所述特定化合物的前药是在向个体给药后在生理条件下发生化学转化以提供所述特定化合物的那些化合物。此外，前药可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转化为所述特定化合物。例如，当例如与合适的酶或化学试剂一起放置在透皮贴剂储库(transdermal patch reservoir)中时，前药可以缓慢地转化为特定化合物。示例性前药是在体内可水解的酯类(使用特定化合物中包含的醇或羧基)或酰胺(使用特定化合物中包含的氨基或羧基)。具体地，包含在特定化合物中并且具有至少一个氢原子的任何氨基均可以转化为前药形式。典型的N-前药形式包括氨基甲酸酯、曼尼希碱(Mannich base)、烯胺和烯胺酮。
在本说明书中，化合物的结构式可以代表所述化合物的某种异构体。然而，应当理解本公开包括所有异构体如几何异构体、基于不对称碳的光学异构体、立体异构体、互变异构体等结构上出现的异构体和异构体混合物，并不限于式的描述。此外，在本说明书中，化合物的结构式可以代表所述化合物的特定盐和/或溶剂化物。然而，应当理解本公开包括所有盐(例如，药学可接受的盐)和溶剂化物(例如，水合物)，并不限于特定盐和/或溶剂化物的描述。
“异构体”是具有相同分子式但结构不同(“结构异构体”)或官能团和/或原子的几何(空间)定位不同(“立体异构体”)的化合物。“对映异构体”是一对彼此不可重叠镜像的立体异构体。“外消旋混合物”或“外消旋物”含有一对等量的对映异构体，并用前缀(±)表示。“非对映异构体”是不可重叠且不是彼此镜像的立体异构体。“互变异构体”是相同化学物质的结构异构体，即使是纯的，但由于各个原子或原子群的迁移，也会自发地和可逆地相互转化；即互变异构体彼此处于动态化学平衡。互变异构体的一个实例是酮-烯醇-互变异构现象的异构体。“构象异构体(Conformer)”是立体异构体，仅通过形式单键的旋转即可相互转化，尤其包括那些导致不同3维形式的(杂)环的立体异构体，例如环己烷的椅式、半椅式、船式和扭船式。
如本文所用的术语“溶剂化物”是指溶解物质在溶剂(如有机溶剂(例如，脂肪醇(如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇)、丙酮、乙腈、醚等)，水或者两者或更多种这些液体的混合物)中的加成络合物，其中所述加成络合物以晶体或混合晶体的形式存在。加成络合物中所含溶剂的量可以是化学计量的或非化学计量的。“水合物”是其中溶剂是水的溶剂化物。
在同位素标记的化合物中，一个或多个原子被具有相同质子数但中子数不同的相应原子置换。例如，氢原子可以被氘或氚原子置换。可以用于本公开的示例性同位素包括氘、氚、11C、13C、14C、15N、18F、32P、32S、35S、36Cl和125I。
术语“平均直径”是指通过动态光散射(DLS)并使用所谓的累积量算法进行数据分析而测得的颗粒的平均流体动力学直径，其结果是提供具有一定长度尺寸的所谓的Z平均，以及无量纲的多分散性指数(PDI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp 4814-4820,ISO13321)。这里颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与Z平均的这个值同义使用。
在一些实施方案中，“多分散性指数”基于动态光散射测量，通过“平均直径”的定义中提到的所谓的累积量分析来计算。在某些先决条件下，可以将其作为纳米颗粒整体尺寸分布的度量。
颗粒绕旋转轴的“回转半径”(在本文中缩写为Rg)是一个点到旋转轴的径向距离，如果假设颗粒的整个质量集中在该点，则其绕给定轴的转动惯量会与其实际质量分布相同。在数学上，Rg是颗粒组分与其质量中心或给定轴的均方根距离。例如，对于包含n个质量元素的大分子，质量为mi(i＝1,2,3,…,n)，位于距质量中心固定距离si处，Rg是所有质量元素的si 2的质量平均值的平方根，并且可以计算如下：
回转半径可以通过实验来确定或计算，例如，通过使用光散射。特别地，对于小散射矢量结构函数S定义如下：
其中N是组分的数目(Guinier's定律)。
“D10值”，特别是关于颗粒的定量尺寸分布，是10％的颗粒具有小于这个值的直径时的直径。D10值是一种描述最小颗粒在颗粒群内(如在获得自场-流分级分离的颗粒峰内)的比例的方法。
“D50值”，特别是关于颗粒的定量尺寸分布，是50％的颗粒具有小于这个值的直径时的直径。D50值是一种描述颗粒群的平均粒径的方法(如在获得自场-流分级分离的颗粒峰内)。
“D90值”，特别是关于颗粒的定量尺寸分布，是90％的颗粒具有小于这个值的直径时的直径。“D95”、“D99”和“D100”值具有相应的含义。D90、D95、D99和D100值是描述较大颗粒在颗粒群内(如在获得自场-流分级分离的颗粒峰内)的比例的方法。
颗粒的“流体动力学半径”(有时称为“Stokes半径”或“Stokes-Einstein半径”)是以与所述颗粒相同的速度扩散的假设硬球体的半径。流体动力学半径与颗粒的移动性相关，不仅考虑尺寸，而且还考虑溶剂效应。例如，具有较强水合作用的较小带电颗粒可能比具有较弱水合作用的较大带电颗粒具有更大的流体动力学半径。这是因为较小的颗粒在穿过溶液时拖曳更多的水分子。因为颗粒在溶剂中的实际尺寸不可直接测量，流体动力学半径可以由Stokes-Einstein方程定义：
其中kB是Boltzmann常数；T是温度；η是溶剂的粘度；D是扩散系数。扩散系数可以通过实验确定，例如，通过使用动态光散射(DLS)。因此，一种确定颗粒或颗粒群的流体动力学半径(如本文公开的制剂或组合物中包含的颗粒如LNP的流体动力学半径，或者对这样的制剂或组合物进行场-流分级分离获得的颗粒峰的流体动力学半径)的方法是测量所述颗粒或颗粒群的DLS信号(如本文公开的制剂或组合物中包含的颗粒如LNP的DLS信号，或者对这样的制剂或组合物进行场-流分级分离获得的颗粒峰的DLS信号)。
如本文所用的术语“聚集体”涉及颗粒簇，其中颗粒相同或非常相似并以非共价方式互相粘附(例如，经由离子相互作用、H桥相互作用、偶极相互作用和/或范德华相互作用)。
如本文所用的表述“光散射”是指物理过程，其中由于光通过的介质中的局部不均匀性而迫使光偏离直线轨迹至一条或多条路径。
术语“UV”表示紫外光，并且指定波长从10nm至400nm的电磁波谱带，即比可见光短但比X-射线长。
如本文所用的表述“多角度光散射”或“MALS”涉及用于测量由样品散射成多角度的光的技术。“多角度”在这方面表示在测量时可以在不同的离散角度检测散射光，例如，通过在包括所选特定角度的范围内移动的单个检测器或固定在特定角度位置的检测器阵列。在一优选实施方案中，MALS中使用的光源是激光源(MALLS：多角度激光散射)。基于包含颗粒的组合物的MALS信号并通过使用适当形式(例如，Zimm图、Berry图或Debye图)，可以确定回转半径(Rg)，并因此确定所述颗粒的尺寸。优选地，Zimm图是使用以下等式的图形表示：
其中c是颗粒在溶剂中的质量浓度(g/mL)；A2是第二维里系数(mol·mL/g2)；P(θ)是与散射光强度对角度的依赖性相关的形状因数；Rθ是过量Rayleigh比例(cm-1)；K*是光学常数，等于4π2ηo(dn/dc)2λ0 -4NA -1，其中ηo是溶剂在入射辐射(真空)波长处的折射率，λ0是入射辐射(真空)波长(nm)，NA是阿伏伽德罗数(mol-1)，dn/dc是微分折射率增量(mL/g)(参见，例如，Buchholz et al.(Electrophoresis 22(2001),4118-4128)；B.H.Zimm(J.Chem.Phys.13(1945),141；P.Debye(J.Appl.Phys.15(1944):338；和W.Burchard(Anal.Chem.75(2003),4279-4291)。优选地，Berry图由以下项或其倒数计算：
其中c、Rθ和K*如上文定义。优选地，Debye图由以下项或其倒数计算：
其中c、Rθ和K*如上文定义。
如本文所用的表述“动态光散射”或“DLS”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布谱(profile)的技术，特别是关于颗粒的流体动力学半径。单色光源，通常是激光，通过偏振器射入样品。然后散射光穿过第二个偏振器，在那里它被检测到，并且将生成的图像投影到屏幕上。溶液中的颗粒被光击中并在所有方向上衍射光。来自颗粒的衍射光可以相长干扰(亮区)或相消干扰(暗区)。这个过程以很短的时间间隔重复，并且通过比较每个点随时间的强度的自相关器来分析产生的散斑图案集。
如本文所用的表述“静态光散射”或“SLS”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布谱的技术，特别是关于颗粒的回转半径和/或颗粒的摩尔质量。在含有颗粒的溶液中发射高强度单色光，通常是激光。一个或多个检测器用于在一个或多个角度测量散射强度。需要角度依赖性来获得所有半径大分子的摩尔质量和尺寸的准确测量。因此，在相对于入射光方向的几个角度同时测量，称作多角度光散射(MALS)或多角度激光散射(MALLS)，一般视为静态光散射的标准实施方式。
核酸
术语“核酸”包括脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、它们的组合和它们的修饰形式。该术语包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。核酸可以作为单链或双链以及线性或共价环状闭合分子存在。核酸可以是分离的。根据本公开，术语“分离的核酸”表示所述核酸(i)是体外扩增的，例如通过用于DNA的聚合酶链反应(PCR)或用于RNA的体外转录(使用例如RNA聚合酶)，(ii)是通过克隆重组产生的，(iii)是纯化的，例如通过切割和通过凝胶电泳分离，或者(iv)是合成的，例如，通过化学合成。
术语“核苷”(在本文中缩写为“N”)涉及可以认为是没有磷酸基团的核苷酸的化合物。虽然核苷是与糖(例如，核糖或脱氧核糖)连接的核碱基，但是核苷酸包含核苷以及一个或多个磷酸基团。核苷的实例包括胞苷、尿苷、假尿苷、腺苷和鸟苷。
通常构成天然存在的核酸的五种标准核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鸟苷。五种核苷通常分别缩写为它们的单字母代码U、A、T、C和G。但是，胸苷更常写作“dT”(“d”代表“脱氧”)，因为它含有2'-脱氧呋喃核糖部分而不是尿苷中发现的呋喃核糖环。这是因为胸苷存在于脱氧核糖核酸(DNA)而不是核糖核酸(RNA)中。相反地，尿苷存在于RNA而不是DNA中。其余三种核苷可以在RNA和DNA中找到。在RNA中，它们会表示为A、C和G，而在DNA中，它们会表示为dA、dC和dG。
修饰的嘌呤(A或G)或嘧啶(C、T或U)碱基部分优选被一个或多个烷基修饰，更优选一个或多个C1-4烷基，甚至更优选一个或多个甲基。修饰的嘌呤或嘧啶碱基部分的具体实例包括N7-烷基-鸟嘌呤、N6-烷基-腺嘌呤、5-烷基-胞嘧啶、5-烷基-尿嘧啶和N(1)-烷基-尿嘧啶，如N7-C1-4烷基-鸟嘌呤、N6-C1-4烷基-腺嘌呤、5-C1-4烷基-胞嘧啶、5-C1-4烷基-尿嘧啶和N(1)-C1-4烷基-尿嘧啶，优选N7-甲基-鸟嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶和N(1)-甲基-尿嘧啶。
在本文中，术语“DNA”涉及包括脱氧核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，DNA包含全部或大部分脱氧核糖核苷酸残基。如本文所用，“脱氧核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位置缺少羟基的核苷酸。DNA包括但不限于双链DNA、单链DNA、分离的DNA如部分纯化的DNA、基本上纯的DNA、合成的DNA、重组产生的DNA，以及通过添加、缺失、替代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的DNA的修饰的DNA。这类改变可以指将非核苷酸物质添加至内部DNA核苷酸或DNA的末端。本文还考虑DNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或核糖核苷酸。对于本公开，认为这些改变的DNA是天然存在的DNA的类似物。如果基于分子中核苷酸残基的总数，分子中脱氧核糖核苷酸残基的含量超过50％(如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子包含“大部分脱氧核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(不管核苷酸残基是否是标准的(即，天然存在的)核苷酸残基或其类似物)。
DNA可以是重组DNA，并且可以通过核酸特别是cDNA的克隆来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
RNA
根据本公开，术语“RNA”表示包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位置具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、替代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。这类改变可以指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或RNA的末端。本文中还考虑RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开，这些改变/修饰的核苷酸可以称作天然存在的核苷酸的类似物，并且含有这类改变/修饰的核苷酸的相应RNA(即，改变/修饰的RNA)可以称作天然存在的RNA的类似物。如果基于分子中核苷酸残基的总数，分子中核糖核苷酸残基的含量超过50％(如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子包含“大部分核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(不管核苷酸残基是否是标准的(即，天然存在的)核苷酸残基或其类似物)。
“RNA”包括mRNA、tRNA、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、自扩增RNA(saRNA)、单链RNA(ssRNA)、dsRNA、抑制性RNA(如反义ssRNA、小干扰RNA(siRNA)或microRNA (miRNA))、激活RNA(如小激活RNA)和免疫刺激性RNA(isRNA)。在一些实施方案中，“RNA”是指mRNA。
在一优选实施方案中，RNA包含编码肽、多肽或蛋白的开放阅读框(ORF)。
如本文所用的术语“体外翻译”或“IVT”表示以无细胞方式进行转录(即，RNA的产生)。即，IVT不使用活的/培养的细胞，而是使用从细胞提取的转录机制(例如，细胞裂解物或其分离的组分，包括RNA聚合酶(优选T7、T3或SP6聚合酶))。
mRNA
在本公开的所有方面的一些实施方案中，RNA是mRNA。
根据本公开，术语“mRNA”表示“信使-RNA”，并且包括可以通过使用DNA模板产生的“转录物”。一般来说，mRNA编码肽、多肽或蛋白。通常，mRNA包含5'-UTR、肽/蛋白编码区和3'-UTR。在本公开的上下文中，mRNA优选通过体外转录(IVT)从DNA模板产生。如上所示，体外转录方法是技术人员已知的，并且各种体外转录试剂盒是可商购的。
mRNA是单链的，但是可以含有自我互补序列，其允许mRNA的部分(part)折叠并与自身配对以形成双螺旋。
根据本公开，“dsRNA”表示双链RNA，并且是具有两条部分或完全互补链的RNA。
在本公开的优选实施方案中，mRNA涉及编码肽、多肽或蛋白的RNA转录物。
在一些实施方案中，优选编码肽、多肽或蛋白的RNA具有至少45个核苷酸的长度(如至少60个、至少90个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1,000个、至少1,500个、至少2,000个、至少2,500个、至少3,000个、至少3,500个、至少4,000个、至少4,500个、至少5,000个、至少6,000个、至少7,000个、至少8,000个、至少9,000个核苷酸)，优选多达15,000个，如多达14,000个，多达13,000个，多达12,000个核苷酸，多达11,000个核苷酸或多达10,000个核苷酸。
如本领域中建立的，RNA(如mRNA)一般含有5'非翻译区(5'-UTR)、肽/多肽/蛋白编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，RNA(如mRNA)是通过体外转录或化学合成产生的。在一实施方案中，使用DNA模板通过体外转录产生RNA(如mRNA)。体外转录方法是技术人员已知的；参见，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor1989。此外，各种体外转录试剂盒是可商购的，例如，来自Thermo FisherScientific(如TranscriptAidTM T7试剂盒、T7试剂盒、/>NewEngland BioLabs Inc.(如HiScribeTM T7试剂盒、HiScribeTM T7 ARCA mRNA试剂盒)、Promega(如RiboMAXTM、/>系统)、Jena Bioscience(如SP6或T7转录试剂盒)和Epicentre(如AmpliScribeTM)。为了提供修饰的RNA(如mRNA)，相应修饰的核苷酸，如修饰的天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和/或修饰的非天然存在的核苷酸，可以在合成(优选体外转录)期间掺入，或者修饰可以在转录之后实现和/或添加至mRNA。
在一些实施方案中，RNA(如mRNA)是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过适当DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选地，体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入适当的载体用于体外转录来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
在本公开的一些实施方案中，RNA(如mRNA)是“复制子RNA”(如“复制子mRNA”)或简单的“复制子”，特别是“自复制RNA”(例如“自复制mRNA”)或者“自扩增RNA”(或“自扩增mRNA”)。在一特别优选的实施方案中，复制子或自复制RNA (如自复制mRNA)源自或包含源自ssRNA病毒的元件，特别是正链ssRNA病毒如甲病毒。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在受感染细胞的细胞质中复制(甲病毒生命周期的综述参见Joséet al.,FutureMicrobiol.,2009,vol.4,pp.837–856)。许多甲病毒的总基因组长度通常范围在11,000和12,000个核苷酸之间，并且基因组RNA通常具有5’-帽和3’poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(ORF)。4种非结构蛋白(nsP1–nsP4)通常由基因组5′末端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由第二ORF一起编码，所述第二ORF位于第一ORF下游并延伸至基因组的3’末端附近。通常，第一ORF比第二ORF大，比例大约为2:1。在被甲病毒感染的细胞中，只有编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，这是一种类似于真核信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould et al.,2010,Antiviral Res.,vol.87 pp.111–124)。感染之后，即在病毒生命周期的早期阶段，(+)链基因组RNA直接充当信使RNA，用于翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已建议将甲病毒衍生的载体用于将外来遗传信息递送至靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框被编码所关注的蛋白的开放阅读框置换。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个单独的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，而另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此命名为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。
在本公开的一些实施方案中，本文所述的RNA(如mRNA)(例如，包含在本公开的组合物中和/或用于本公开的方法中)含有一种或多种修饰，例如，以提高其稳定性和/或提高翻译效率和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，为了增加RNA(如mRNA)的表达，可以在编码区，即编码所表达的肽或蛋白的序列内对其进行修饰，优选不改变所表达的肽或蛋白的序列。这类修饰例如在WO 2007/036366和PCT/EP2019/056502中有所描述，并且包括以下：5'-帽结构；天然存在的poly(A)尾的延长或截短；5'-和/或3'-非翻译区(UTR)的改变，如引入与所述RNA的编码区无关的UTR；用合成核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸；以及密码子优化(例如，改变，优选增加RNA的GC含量)。在根据本公开的修饰的mRNA的上下文中，术语“修饰”优选涉及在所述RNA(如mRNA)中不天然存在的mRNA的任何修饰。
在一些实施方案中，本文所述的RNA(如mRNA)包括5’-帽结构。在一实施方案中，mRNA没有无加帽的5'-三磷酸。在一实施方案，本文所述的RNA(如mRNA)可以包含常规5'-帽和/或5'-帽类似物。术语“常规5'-帽”是指在mRNA分子的5'-末端发现的帽结构，一般由鸟苷5'-三磷酸(Gppp)组成，所述鸟苷5'-三磷酸(Gppp)经由其三磷酸部分连接至mRNA的下一个核苷酸的5'-末端(即，鸟苷通过5'至5'三磷酸键连接至mRNA的其余部分)。鸟苷可以在位置N7甲基化(导致帽结构m7Gppp)。术语“5'-帽类似物”是指5'-帽，其基于常规5'-帽，但是已在m7鸟苷结构的2'-或3'-位置进行修饰以避免5'-帽结构类似物在反方向上整合(这类5'-帽类似物也称作抗反向帽类似物(ARCA))。特别优选的5'-帽类似物是在磷酸桥中的桥接和非桥接氧处具有一个或多个替代的那些，如在β-磷酸处硫代磷酸酯修饰的5'-帽类似物(如m2 7,2'OG(5')ppSp(5')G(称作beta-S-ARCA或β-S-ARCA))，如PCT/EP2019/056502所述。提供如本文所述的具有5’-帽结构的RNA(如mRNA)可以通过在相应的5’-帽化合物存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5’-帽结构共转录地掺入产生的RNA(如mRNA)链中，或者可以例如通过体外转录产生RNA(如mRNA)，并且可以使用加帽酶，例如痘苗病毒的加帽酶，将5’-帽结构转录后连接至mRNA。
在一些实施方案中，RNA(如mRNA)包含5'-帽结构，其选自m2 7,2'OG(5’)ppSp(5')G(特别是其D1非对映体)、m2 7,3'OG(5')ppp(5')G和m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG。在一些实施方案中，编码包含抗原或表位的肽、多肽或蛋白的RNA包含m2 7,2'OG(5’)ppSp(5')G(特别是其D1非对映体)作为5'-帽结构。
在一些实施方案中，RNA(如mRNA)包含cap0、cap1或cap2，优选cap1或cap2。根据本公开，术语“cap0”表示结构“m7GpppN”，其中N是在2'位置带有OH部分的任何核苷。根据本公开，术语“cap1”表示结构“m7GpppNm”，其中Nm是在2'位置带有OCH3部分的任何核苷。根据本公开，术语“cap2”表示结构“m7GpppNmNm”，其中Nm各自独立地是在2'位置带有OCH3部分的任何核苷。
5'-帽类似物beta-S-ARCA(β-S-ARCA)具有以下结构：
“β-S-ARCA的D1非对映体”或“β-S-ARCA(D1)”是β-S-ARCA的非对映体，与β-S-ARCA的D2非对映体(β-S-ARCA(D2))相比其在HPLC柱上首先洗脱，因此表现出较短的保留时间。HPLC优选是分析HPLC。在一实施方案中，Supelcosil LC-18-T RP柱，优选规格：5μm、4.6x250mm用于分离，由此可以应用1.3ml/min的流速。在一实施方案中，使用乙酸铵中的甲醇梯度，例如，在15min内，0.05M乙酸铵，pH＝5.9中的甲醇的0-25％线性梯度。UV-检测(VWD)可以在260nm下进行，荧光检测(FLD)可以在280nm激发和337nm检测下进行。
cap1的构建块5'-帽类似物m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG(也称作m2 7,3'OG(5')ppp(5')m2 '-OApG)具有以下结构：
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包含β-S-ARCA和mRNA的示例性cap0 mRNA具有以下结构：
包含m2 7,3'OG(5')ppp(5')G和mRNA的示例性cap0 mRNA具有以下结构：
包含m2 7,3'-OGppp(m1 2'-O)ApG和mRNA的示例性cap1 mRNA具有以下结构：
如本文所用，术语“poly(A)尾”或“poly-A序列”是指腺苷酸残基的不间断或间断的序列，其通常位于RNA(如mRNA)分子的3'-末端。Poly-A尾或poly-A序列是本领域技术人员已知的，并且可以在本文所述RNA(如mRNA)中的3’-UTR之后。不间断的poly-A尾的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly-A尾是典型的。本文公开的RNA(如mRNA)可以具有在转录之后通过不依赖于模板的RNA聚合酶连接至RNA的游离3'-末端的poly-A尾，或者由DNA编码并由模板依赖性RNA聚合酶转录的poly-A尾。
已证实约120个A核苷酸的poly-A尾对转染的真核细胞中的mRNA水平以及从存在于poly-A尾上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白水平具有有益影响(Holtkamp et al.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)。
poly-A尾可以具有任何长度。在一些实施方案中，poly-A尾包含、基本上由或由以下组成：至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个以及多达500个、多达400个、多达300个、多达200个或多达150个A核苷酸，特别是约120个A核苷酸。在这种情况下，“基本上由…组成”表示poly-A尾中的大多数核苷酸，通常poly-A尾中核苷酸数量的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但是允许其余的核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在这种情况下，“由…组成”表示poly-A尾中的所有核苷酸，即poly-A尾中100％数量的核苷酸是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如，在制备体外转录的RNA期间，连接poly-A尾。编码poly-A尾的DNA序列(编码链)称作poly(A)盒。
在一些实施方案中，DNA编码链中存在的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但是被四种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。在WO 2016/005324 A1中公开了这样的盒，其援引加入本文。WO 2016/005324 A1中公开的任何poly(A)盒都可以用于本公开。涵盖这样的poly(A)盒，其基本上由dA核苷酸组成，但是被具有均等分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)且具有例如5-50个核苷酸长度的随机序列中断，在DNA水平上在大肠杆菌(E.coli)中表现出质粒DNA的恒定增殖，并且在RNA水平上仍与支持RNA稳定性和翻译效率方面的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA(特别是mRNA)分子中包含的poly-A尾基本上由A核苷酸组成，但是被四种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5-50、10-30或10-20个核苷酸。
在一些实施方案中，在poly-A尾的3'-末端侧翼没有除A核苷酸以外的核苷酸，即poly-A尾在其3'-末端未被A以外的核苷酸掩盖(mask)或跟随。
在一些实施方案中，poly-A尾可以包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个以及多达500个、多达400个、多达300个、多达200个或多达150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾可以基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个以及多达500个、多达400个、多达300个、多达200个或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾可以由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个或至少100个以及多达500个、多达400个、多达300个、多达200个或多达150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含约120个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含或由SEQ IDNO:14的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，poly-A序列具有与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开中使用的RNA(如mRNA)包含5'-UTR和/或3'-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中的区域，其转录但不翻译为氨基酸序列，或者涉及RNA分子如mRNA分子中的相应区域。非翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框的5'(上游)(5'-UTR)和/或开放阅读框的3'(下游)(3'-UTR)。如果存在，5'-UTR位于5'-末端，蛋白编码区的起始密码子的上游。5'-UTR位于5'-帽(如果存在)的下游，例如，直接与5'-帽相邻。如果存在，3'-UTR位于3'-末端，蛋白编码区的终止密码子的下游，但是术语“3'-UTR”优选不包括poly-A序列。因此，3'-UTR位于poly-A序列(如果存在)的上游，例如，直接与poly-A序列相邻。将3'-UTR掺入RNA(优选mRNA)分子的3'-非翻译区可以导致翻译效率的提高。可以通过掺入两个或更多个这样的3'-UTR(它们优选以头对尾方向排列；参见，例如，Holtkamp etal.,Blood 108,4009-4017(2006))来实现协同效应。3'-UTR对于其引入的RNA(优选mRNA)可以是自体的或异源的。在一特定实施方案中，3'-UTR源自珠蛋白基因或mRNA，如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白或β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白的基因或mRNA。例如，可以通过用一个或多个，优选两个拷贝的3'-UTR置换现有3'-UTR或者插入一个或多个，优选两个拷贝的3'-UTR来修饰RNA(优选mRNA)，所述3'-UTR源自珠蛋白基因，如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白或β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白。
在一些实施方案中，本公开中使用的RNA(如mRNA)包含5’-UTR，所述5’-UTR包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开中使用的RNA(如mRNA)包含3’-UTR，所述3’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
本文所述的RNA(如mRNA)可以具有修饰的核糖核苷酸以增加其稳定性和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，在一些实施方案中，本文所述的RNA(如mRNA)中的尿苷被修饰的核苷置换(部分或完全，优选完全)。在一些实施方案中，修饰的核苷是修饰的尿苷。
在一些实施方案中，置换尿苷的修饰的尿苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-尿苷(m5U)和它们的组合。
在一些实施方案中，置换(部分或完全，优选完全)RNA(如mRNA)中的尿苷的修饰的核苷可以是以下任何一种或多种：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖(ara)-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷或本领域已知的任何其他修饰的尿苷。
被假尿苷修饰(部分或完全，优选完全置换尿苷)的RNA(优选mRNA)在本文中称作“Ψ-修饰的”，而术语“m1Ψ-修饰的”表示RNA (优选mRNA)含有N(1)-甲基假尿苷(部分或完全，优选完全置换尿苷)。此外，术语“m5U-修饰的”表示RNA(优选mRNA)含有5-甲基尿苷(部分或完全，优选完全置换尿苷)。这类Ψ-或m1Ψ-或m5U-修饰的RNA与它们的未修饰形式相比通常表现出降低的免疫原性，因此在避免或最小化免疫应答诱导的应用中是优选的。在一些实施方案中，RNA(优选mRNA)含有完全置换尿苷的N(1)-甲基假尿苷。
可以将本公开所述的RNA(优选mRNA)的密码子进一步优化，例如，以增加RNA的GC含量和/或置换在细胞(或受试者)中稀有的密码子，其中由是所述细胞(或受试者)中的同义频繁密码子的密码子表达所关注的肽或蛋白。在一些实施方案中，由本公开所述的RNA编码的氨基酸序列由编码序列编码，所述编码序列经过密码子优化和/或与野生型编码序列相比其G/C含量增加。这还包括实施方案，其中与野生型编码序列的相应序列区域相比，编码序列的一个或多个序列区域是密码子优化和/或G/C含量增加的。在一实施方案中，密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
术语“密码子优化”是指改变核酸分子编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用，而优选不改变核酸分子编码的氨基酸序列。在本公开的上下文中，编码区优选是密码子优化的，以用于使用本文所述的RNA(优选mRNA)在待治疗的受试者中的最佳表达。密码子优化是基于以下发现：翻译效率还由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，可以修饰RNA (优选mRNA)的序列，从而插入可获得频繁出现的tRNA的密码子来代替“稀有密码子”。
在一些实施方案中，与野生型RNA的相应编码区的G/C含量相比，本文所述的RNA(优选mRNA)的编码区的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量增加，其中与野生型RNA编码的氨基酸序列相比，RNA(优选mRNA)编码的氨基酸序列优选是未修饰的。RNA序列的这种修饰是基于以下事实：待翻译的任何RNA区域的序列对于该mRNA(优选mRNA)的高效翻译都是重要的。具有增加的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有增加的A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。关于几个密码子编码同一个氨基酸(所谓的遗传密码的简并性)的事实，可以确定对于稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。根据RNA(优选mRNA)编码的氨基酸，与其野生型序列相比，对于RNA序列的修饰有各种可能性。特别地，含有A和/或U核苷酸的密码子可以通过用其他密码子替代这些密码子来修饰，所述其他密码子编码相同氨基酸但不含A和/或U或者含有较低量的A和/或U核苷酸。
在各种实施方案中，与野生型RNA编码区的G/C含量相比，本文所述的RNA(特别是mRNA)编码区的G/C含量增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。
上述修饰的组合，即掺入5'-帽结构，掺入poly-A序列，暴露poly-A序列，改变5'-和/或3'-UTR(如掺入一个或多个3'-UTR)，用合成核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，5-甲基胞苷用于胞苷和/或假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)用于尿苷)以及密码子优化对RNA(优选mRNA)的稳定性和翻译效率的提高具有协同效应。因此，在一些实施方案中，本公开所述的RNA(优选mRNA)，特别是本公开的编码诱导免疫应答的抗原或表位的RNA(优选mRNA)，含有上述修饰中的至少两种、至少三种、至少四种或全部五种的组合，即，(i)掺入5'-帽结构，(ii)掺入poly-A序列，暴露poly-A序列；(iii)改变5'-和/或3'-UTR(如掺入一个或多个3'-UTR)；(iv)用合成核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，5-甲基胞苷用于胞苷和/或假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)用于尿苷)，以及(v)密码子优化。在一些实施方案中，本公开所述的RNA(优选mRNA)包含cap1或cap2，优选cap1结构。在一些实施方案中，poly-A序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A序列包含或由SEQ ID NO:14的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
本公开的一些方面涉及将本文公开的RNA(优选mRNA)靶向递送至某些细胞或组织。在一些实施方案中，本公开涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。如果给药的RNA(优选mRNA)是编码诱导免疫应答的抗原或表位的RNA(优选mRNA)，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。在一些实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。“淋巴系统”是循环系统的一部分，并且是免疫系统的重要部分，包含携带淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。主要或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成主要淋巴器官。包括淋巴结和脾在内的次要或外周淋巴器官维持成熟的幼稚淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
基于脂质的RNA(如mRNA)递送系统对肝脏具有固有的偏好。肝脏积累是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体以及脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。在一些实施方案中，靶器官是肝脏，靶组织是肝组织。特别地，如果期望在器官或组织中存在mRNA或者编码的肽或蛋白和/或如果期望表达大量编码的肽或蛋白和/或如果期望或需要全身存在编码的肽或蛋白、特别是大量的编码的肽或蛋白，则优选递送至这样的靶组织。
在一些实施方案中，给药本文所述的RNA(特别是mRNA)组合物后，将至少一部分RNA递送至靶细胞或靶器官。在一些实施方案中，将至少一部分RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一些实施方案中，RNA是编码肽或蛋白的RNA(优选mRNA)，并且RNA被靶细胞翻译以产生所述肽或蛋白。在一些实施方案中，靶细胞是肝脏中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是内皮细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是血细胞。在一些实施方案中，靶细胞是淋巴结中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肺中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是皮肤中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞如脾中的专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是NK细胞。在一些实施方案中，靶细胞是单核细胞。因此，本文所述的RNALNP组合物可以用于将RNA(优选mRNA)递送至这样的靶细胞。因此，本公开还涉及一种将RNA(优选mRNA)递送至受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括将本文所述的RNA组合物给药至受试者。在一些实施方案中，将RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一些实施方案中，RNA是编码肽或蛋白的RNA(优选mRNA)，并且RNA被靶细胞翻译以产生所述肽或蛋白。
抑制性RNA
在本公开的所有方面的一些实施方案中，RNA是抑制性RNA。
如本文所用的术语“抑制性RNA”表示选择性地与靶mRNA杂交和/或对靶mRNA具有特异性，从而抑制(例如，减少)其转录和/或翻译的RNA。抑制性RNA包括具有相对于靶mRNA的反义方向序列的RNA分子。合适的抑制性寡核苷酸的长度通常从5个至几百个核苷酸不等，更典型的是长度约20-70个核苷酸或更短，甚至更典型的是长度约10-30个核苷酸。抑制性RNA的实例包括反义RNA、核糖核酸酶、iRNA、siRNA和miRNA。在本公开的所有方面的一些实施方案中，抑制性RNA是siRNA。
如本文所用的术语“反义RNA”是指在生理条件下与包含特定基因的DNA或所述基因的mRNA杂交，从而抑制所述基因的转录和/或所述mRNA的翻译的RNA。反义RNA或其一部分可以与天然存在的mRNA形成双链体，从而阻止mRNA的积累或翻译。另一种可能性是使用核糖核酸酶灭活核酸。反义RNA可以与N-末端或5'上游位点如翻译起始位点、转录起始位点或启动子位点杂交。在一些实施方案中，反义RNA可以与3'-非翻译区或mRNA剪接位点杂交。
反义RNA的大小可以为15个核苷酸至15,000个不等，优选20-12,000个，特别是100-10,000个、150-8,000个、200-7,000个、250-6,000个、300-5,000个核苷酸，如15-2,000个、20-1,000个、25-800个、30-600个、35-500个、40-400个、45-300个、50-250个、55-200个、60-150或65-100个核苷酸。在一实施方案中，反义RNA的长度为至少2,700个核苷酸(如至少2,800个、至少2,900个、至少3,000个、至少3,100个、至少3,200个、至少3,300个、至少3,400个、至少3,500个、至少3,600个、至少3,700个、至少3,800个、至少3,900个、至少4,000个、至少4,100个、至少4,200个、至少4,300个、至少4,400个、至少4,500个、至少4,600个、至少4,700个、至少4,800个、至少4,900个、至少5,000个核苷酸)。
反义RNA的稳定性可以根据需要进行修饰。例如，反义RNA可以通过一种或多种具有稳定作用的修饰来稳定。这类修饰包括修饰的磷酸二酯键(如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或氨基磷酸酯键代替天然存在的磷酸二酯键)和2'-取代(例如，2'-氟、2'-O-烷基(如2'-O-甲基、2'-O-丙基或2'-O-戊基)和2'-O-烯丙基)。例如，在反义RNA的一些实施方案中，硫代磷酸酯键部分取代磷酸二酯键。可选择地或另外地，在反义RNA的一些实施方案中，核糖部分在2'-位置被O-烷基(如2'-O-甲基)部分取代。
反义RNA可以靶向任何靶mRNA序列(“靶序列”)中大约19-25个连续核苷酸的任何片段。一般来说，可以从对应于靶mRNA的给定cDNA序列选择靶mRNA上的靶序列，优选从起始密码子下游(即，在3'-方向)50-100nt开始。然而，靶序列可以位于5'-或3'-非翻译区，或者位于起始密码子附近的区域。
可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得反义RNA。例如，可以使用本领域已知的方法化学合成或重组产生反义RNA。优选地，反义RNA是利用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒转录而来的。
适合用于表达反义RNA的质粒的选择、将表达反义RNA的核酸序列插入质粒的方法以及体外转录所述反义RNA的IVT方法均在本领域的技术内。
如本文所用的“小干扰RNA”或“siRNA”表示能够与靶mRNA的一部分特异性结合的RNA分子，优选长度大于10个核苷酸，更优选长度大于15个核苷酸，最优选长度为18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。这种结合诱导一个过程，其中靶mRNA的所述部分被切割或降解，从而抑制所述靶mRNA的基因表达。19-25个核苷酸的范围是最优选的siRNA大小。虽然原则上，siRNA的正义和反义链可以包含两个互补的单链RNA分子，但是根据本公开，siRNA包含单个分子，其中两个互补部分是碱基配对的，并且通过单链“发夹”区域共价连接。也就是说，正义区域和反义区域可以经由接头分子共价连接。接头分子可以是多核苷酸或非核苷酸接头，但优选是多核苷酸接头。不希望受任何理论的束缚，据信siRNA分子的发夹区域在细胞内被“Dicer”蛋白(或其等同物)切割，形成两个单独碱基配对的RNA分子的siRNA。
siRNA还可以包含3'-突出。如本文所用，“3'-突出”是指从RNA链的3'-末端延伸出来的至少一个未配对的核苷酸。因此，在一些实施方案中，siRNA包含至少一个长度为1至约6个核苷酸(包括核糖核苷酸或脱氧核苷酸)的3'-突出，优选长度为1至约5个核苷酸，更优选长度为1至约4个核苷酸，特别优选长度为约2至约4个核苷酸。在siRNA分子的两条链(即，siRNA分子在细胞内被“Dicer”蛋白切割后)都包含3'-突出的实施方案中，每条链的突出的长度可以相同或不同。在一些优选的实施方案中，3'-突出存在于siRNA的两条链上，并且长度为2个核苷酸。例如，siRNA的每条链可以包含双脱氧胸苷酸("TT")或双尿苷酸("uu")的3'-突出。
为了增强siRNA的稳定性，还可以稳定3'-突出，防止降解。在一些实施方案中，通过包括嘌呤核苷酸如腺苷或鸟苷核苷酸来稳定突出。或者，用修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如，用2'-脱氧胸苷取代3'-突出中的尿苷核苷酸，是可以容忍的，并且不影响RNAi降解的效率。特别地，2'-脱氧胸苷中不存在2'-羟基会显著增强3'-突出在组织培养介质(medium)中的核酸酶抗性。
如本文所用，“靶mRNA”是指作为下调靶标的RNA分子。在一些实施方案中，靶mRNA包含编码如本文所述的药学活性肽或多肽的ORF。在一些实施方案中，药学活性肽或多肽是其表达(特别是表达增加，例如，与健康受试者中的表达相比)与疾病相关的肽或多肽。在一些实施方案中，靶mRNA包含编码药学活性肽或多肽的ORF，其表达(特别是表达增加，例如，与健康受试者中的表达相比)与癌症相关。
根据本公开，siRNA可以靶向任何靶mRNA序列(“靶序列”)中大约19-25个连续核苷酸的任何片段。例如，2002年10月11日修订的Tuschl T.et al.,"The siRNA User Guide"中给出了选择siRNA靶序列的技术，其全部公开内容援引加入本文。"The siRNA UserGuide"可在由Dr.Thomas Tuschl,Laboratory of RNAMolecular Biology,RockefellerUniversity,New York,USA维护的万维网上获得，通过访问Rockefeller University的网站并以“siRNA”为关键词搜索即可找到。关于靶序列的选择和/或siRNA的设计可以在Protocol Online(www.protocol-online.com)的网页上使用关键词“siRNA”找到进一步的指导。因此，在一些实施方案中，本公开中使用的siRNA的正义链包含与靶mRNA中任何约19至约25个核苷酸的连续序列基本上相同的核苷酸序列。
一般来说，可以从对应于靶mRNA的给定cDNA序列选择靶mRNA上的靶序列，优选从起始密码子下游(即，在3'-方向)50-100nt开始。然而，靶序列可以位于5'-或3'-非翻译区，或者位于起始密码子附近的区域。
可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得siRNA。例如，可以使用本领域已知的方法化学合成或重组产生siRNA，如Tuschl等人的美国申请第2002/0086356号中描述的果蝇体外系统，其全部公开内容援引加入本文。siRNA可以由pol III表达载体表达，无需改变靶向位点，因为据信只有当第一个转录的核苷酸是嘌呤时，从pol III启动子表达RNA才会有效。
优选地，siRNA是利用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒转录而来的。用于从质粒转录本公开中使用的siRNA的合适启动子包括例如U6或H1 RNApol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。其他合适启动子的选择在本领域的技术内。
适合用于转录siRNA的质粒的选择、将表达siRNA的核酸序列插入质粒的方法以及体外转录所述siRNA的IVT方法均在本领域的技术内。
如本文所用的术语“miRNA”(microRNA)涉及非编码RNA，其长度为21-25(如21-23，优选22)个核苷酸，诱导靶mRNA的降解和/或阻止其翻译。miRNA通常存在于植物、动物和一些病毒中，其中它们分别在植物和动物中由真核核DNA编码以及由病毒DNA编码(在基因组是基于DNA的病毒中)。miRNA是转录后调节因子，与靶信使RNA转录物(mRNA)上的互补序列结合，通常导致翻译阻抑或者靶标降解和基因沉默。
可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得miRNA。例如，可以使用本领域已知的方法化学合成或重组产生miRNA(例如，通过使用可商购的试剂盒如Applied BiologicalMaterials Inc.销售的miRNA cDNA合成试剂盒)。优选地，miRNA是利用任何合适的启动子从重组的环状或线性DNA质粒转录而来的。
药学活性肽或多肽
“编码”是指多核苷酸如基因、cDNA或RNA(优选mRNA)中特定核苷酸序列的固有特性，以便用作生物过程中合成其他聚合物或大分子的模板，所述聚合物或大分子具有确定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列以及由此所致的生物学特性。因此，如果对应于基因的RNA(优选mRNA)的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该基因编码蛋白。其核苷酸序列与RNA序列相同且通常在序列表中提供的编码链以及用作基因或cDNA转录模板的非编码链均可以称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
在一些实施方案中，本公开所述的RNA(优选mRNA)包含编码一种或多种多肽例如肽或蛋白、优选药学活性肽或蛋白的核酸序列(例如，ORF)。
在一些实施方案中，本公开所述的RNA(优选mRNA)包含编码肽或蛋白、优选药学活性肽或蛋白的核酸序列(例如，ORF)，并且能够表达所述肽或蛋白，特别是如果被转移至细胞或受试者中。因此，在一些实施方案中，本公开所述的RNA(优选mRNA)含有编码肽或蛋白的编码区(ORF)，优选编码药学活性肽或蛋白。在这方面，“开放阅读框”或“ORF”是一段连续的密码子，以起始密码子开始并以终止密码子结束。这种编码药学活性肽或蛋白的RNA(优选mRNA)在本文中也称作“药学活性RNA”(或“药学活性mRNA”)。在一些实施方案中，本公开所述的RNA(优选mRNA)包含编码一种以上肽或多肽的核酸序列，例如，两种、三种、四种或更多种肽或多肽。
根据本公开，术语“药学活性肽或蛋白”表示可以用于治疗个体的肽或蛋白，其中所述肽或蛋白的表达会有益于例如改善疾病或病症的症状。优选地，药学活性肽或蛋白具有治疗或缓解特性，并且可以将其给药以改善、减轻、缓解、逆转、延迟疾病或病症的一种或多种症状的发生或者减轻疾病或病症的一种或多种症状的严重程度。在一些实施方案中，当以治疗有效量给药至个体时，药学活性肽或蛋白对个体的疾病状况或疾病状态具有积极或有利的影响。药学活性肽或蛋白可以具有预防特性，并且可以用来延迟疾病或病症的发生或者减轻这种疾病或病症的严重程度。术语“药学活性肽或蛋白”包括完整的蛋白或多肽，并且还可以指其药学活性片段。它还可以包括肽或蛋白的药学活性类似物。
药学活性肽和蛋白的具体实例包括但不限于免疫刺激剂，例如，细胞因子、激素、粘附分子、免疫球蛋白、免疫活性化合物、生长因子、蛋白酶抑制剂、酶、受体、凋亡调节剂、转录因子、肿瘤抑制蛋白、结构蛋白、重编程因子、基因组工程化蛋白和血液蛋白。在一些实施方案中，药学活性肽和多肽包括置换蛋白。
“免疫刺激剂”是通过诱导任何免疫系统组分，特别是免疫效应细胞的激活或增加其活性来刺激免疫系统的任何物质。免疫刺激剂可以是促炎的(例如，当治疗感染或癌症时)，或抗炎的(例如，当治疗自身免疫性疾病时)。
在一些实施方案中，免疫刺激剂是细胞因子或其变体。细胞因子的实例包括干扰素，如干扰素-α(IFN-α)或干扰素-γ(IFN-γ)，白介素，如IL2、IL7、IL12、IL15和IL23，集落刺激因子，如M-CSF和GM-CSF，以及肿瘤坏死因子。根据另一方面，免疫刺激剂包括佐剂型免疫刺激剂如APC Toll样受体激动剂或共刺激/细胞粘附膜蛋白。Toll样受体激动剂的实例包括共刺激/粘附蛋白如CD80、CD86和ICAM-1。
术语“细胞因子”涉及具有约5-60kDa(如约5-20kDa)的分子量并参与细胞信号传导(例如，旁分泌、内分泌和/或自分泌信号传导)的蛋白。特别地，当释放时，细胞因子对其释放位置周围的细胞行为产生影响。细胞因子的实例包括淋巴因子、白介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。根据本公开，细胞因子不包括激素或生长因子。细胞因子与激素的不同之处在于(i)它们通常在比激素更多变的浓度下起作用，并且(ii)一般由广泛的细胞产生(几乎所有有核细胞都可以产生细胞因子)。干扰素通常特征在于抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素是通过与受调节细胞表面上的干扰素受体结合来改变和调节细胞内的基因转录的蛋白，从而防止细胞内的病毒复制。干扰素可以分为两种类型。IFN-γ是唯一的II型干扰素；其他都是I型干扰素。细胞因子的具体实例包括促红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、骨形态发生蛋白(BMP)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ(INFγ)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素11(IL-11)、白介素12(IL-12)和白介素21(IL-21)。
根据本公开，细胞因子可以是天然存在的细胞因子或者其功能片段或变体。细胞因子可以是人细胞因子，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。一种特别优选的细胞因子是干扰素-α。
可以通过在将RNA优先递送至肝脏或肝脏组织的制剂中向受试者给药编码免疫刺激剂的RNA来向受试者提供免疫刺激剂。优选将RNA递送至这样的靶器官或组织，特别地，如果期望表达大量的免疫刺激剂和/或如果期望或需要全身存在免疫刺激剂，特别是大量的。RNA递送系统对肝脏有天生的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米颗粒，特别是脂质纳米颗粒。
用于靶向肝脏的合适免疫刺激剂的实例是参与T细胞增殖和/或维持的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL2或IL7，其片段和变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白，如PK延长(extended)的细胞因子。
在另一实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA可以在将RNA优先递送至淋巴系统(特别是次要淋巴器官，更特别是脾)的制剂中给药。优选将免疫刺激剂递送至这样的靶组织，特别地，如果期望在这种器官或组织中存在免疫刺激剂(例如，为了诱导免疫应答，特别是在T-细胞引发期间或为了激活常驻免疫细胞需要免疫刺激剂如细胞因子的情况下)，但是不期望免疫刺激剂全身存在，特别是大量存在(例如，因为免疫刺激剂具有全身毒性)。
合适的免疫刺激剂的实例是参与T细胞引发的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL12、IL15、IFN-α或IFN-β，其片段和变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白，如PK延长的细胞因子。
干扰素(IFN)是宿主细胞响应几种病原体如病毒、细菌、寄生虫还有肿瘤细胞的存在而产生和释放的一组信号传导蛋白。在典型情况下，病毒感染的细胞会释放干扰素，引起附近的细胞增强它们的抗病毒防御。
基于它们通过其传导信号的受体的类型，干扰素通常分为三类：I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。
所有I型干扰素均与称作IFN-α/β受体(IFNAR)的特异性细胞表面受体复合物结合，所述IFN-α/β受体(IFNAR)由IFNAR1和IFNAR2链组成。
人中存在的I型干扰素是IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω。一般来说，当身体识别已入侵的病毒时产生I型干扰素。它们由成纤维细胞和单核细胞产生。一旦释放，I型干扰素与靶细胞上的特异性受体结合，这导致蛋白表达，从而防止病毒产生和复制其RNA和DNA。
IFNα蛋白主要由浆细胞样树突细胞(pDC)产生。它们主要参与针对病毒感染的先天免疫。负责它们合成的基因有13个亚型，分别称作IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。这些基因被发现一起在染色体9上的簇中。
IFNβ蛋白由成纤维细胞大量产生。它们具有抗病毒活性，主要参与先天免疫应答。已描述了两种类型的IFNβ，IFNβ1和IFNβ3。IFNβ1的天然和重组形式具有抗病毒、抗细菌和抗癌特性。
II型干扰素(人中的IFNγ)也称作免疫干扰素，并且被IL12激活。此外，II型干扰素由细胞毒性T细胞和T辅助细胞释放。
III型干扰素通过由IL10R2(也称作CRF2-4)和IFNLR1(也称作CRF2-12)组成的受体复合物传导信号。虽然比I型和II型IFN的发现时间更近，但是最近的信息证实III型IFN在某些类型的病毒或真菌感染中的重要性。
一般来说，I型和II型干扰素负责调节和激活免疫应答。
根据本公开，I型干扰素优选IFNα或IFNβ，更优选IFNα。
根据本公开，干扰素可以是天然存在的干扰素或者其功能片段或变体。干扰素可以是人干扰素，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。
白介素(IL)是一组细胞因子(分泌的蛋白和信号分子)，基于区分的结构特征可以将其分为四大组。但是，它们的氨基酸序列相似性很弱(通常15–25％相同性)。人基因组编码超过50种白介素和相关蛋白。
根据本公开，白介素可以是天然存在的白介素或者其功能片段或变体。白介素可以是人白介素，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。
本文所述的免疫刺激剂多肽可以制备为融合或嵌合多肽，其包括免疫刺激剂部分和异源多肽(即，不是免疫刺激剂的多肽)。可以将免疫刺激剂融合至延长PK的基团，其增加循环半衰期。下文描述了延长PK的基团的非限制性实例。应当理解增加免疫刺激剂如细胞因子或其变体的循环半衰期的其他PK基团也适用于本公开。在某些实施方案中，延长PK的基团是血清白蛋白(例如，小鼠血清白蛋白、人血清白蛋白)。
如本文所用，术语“PK”是“药物动力学”的首字母缩写，并且涵盖化合物的特性，包括例如受试者的吸收、分布、代谢和消除。如本文所用，“延长PK的基团”是指与生物活性分子融合或一起给药时增加生物活性分子的循环半衰期的蛋白、肽或部分。延长PK的基团的实例包括血清白蛋白(例如，HSA)，免疫球蛋白Fc或Fc片段及其变体，转铁蛋白及其变体以及人血清白蛋白(HSA)结合剂(如美国公开号2005/0287153和2007/0003549中公开的)。Kontermann,Expert Opin Biol Ther,2016Jul；16(7):903-15中公开了其他示例性延长PK的基团，其整体援引加入本文。如本文所用，“PK延长”的免疫刺激剂是指与延长PK的基团组合的免疫刺激剂部分。在一些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂是融合蛋白，其中免疫刺激剂部分连接或融合至延长PK的基团。
在某些实施方案中，相对于单独的免疫刺激剂(即，未融合至延长PK的基团的免疫刺激剂)，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期增加。在某些实施方案中，相对于单独的免疫刺激剂的血清半衰期，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期长至少20％、至少40％、至少60％、至少80％、至少100％、至少120％、至少150％、至少180％、至少200％、至少400％、至少600％、至少800％或至少1000％。在某些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期是单独的免疫刺激剂的血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍。在某些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期是至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。
如本文所用，“半衰期”是指化合物如肽或多肽的血清或血浆浓度在体内例如由于自然机制的降解和/或清除或螯合而减少50％所花费的时间。适合用于本文的PK延长的免疫刺激剂在体内是稳定的，并且其半衰期通过例如融合至抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白(例如，HAS或MSA)而增加。半衰期可以通过本身已知的任何方式确定，如通过药物动力学分析。合适的技术对于本领域技术人员是清楚的，并且例如一般可以包括以下步骤：向受试者合适地给药合适剂量的氨基酸序列或化合物；定期从所述受试者采集血液样品或其他样品；确定所述血液样品中氨基酸序列或化合物的水平或浓度；以及从由此获得的数据(的图)计算直至氨基酸序列或化合物的水平或浓度与剂量给药时的初始水平相比降低50％为止的时间。例如，标准手册如Kenneth,A.et al.,Chemical Stability ofPharmaceuticals:AHandbook for Pharmacists和Peters et al.,PharmacokineticAnalysis:A Practical Approach(1996)中提供了进一步的细节。还参考Gibaldi,M.etal.,Pharmacokinetics,2nd Rev.Edition,Marcel Dekker(1982)。
在某些实施方案中，延长PK的基团包括血清白蛋白或其片段，或者血清白蛋白或其片段的变体(为了本公开的目的，所有这些均包括在术语“白蛋白”中)。可以将本文所述的多肽融合至白蛋白(或者其片段或变体)以形成白蛋白融合蛋白。美国公开号20070048282中描述了这样的白蛋白融合蛋白。
如本文所用，“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一个分子的白蛋白(或者其片段或变体)与至少一个分子的蛋白(如治疗性蛋白，特别是免疫刺激剂)融合而形成的蛋白。可以通过翻译核酸产生白蛋白融合蛋白，其中所述核酸编码治疗性蛋白的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸符合读框地连接。一旦是白蛋白融合蛋白的一部分，治疗性蛋白和白蛋白可以各自称作白蛋白融合蛋白的“部分(portion)”、“区域”或“部分(moiety)”(例如，“治疗性蛋白部分”或“白蛋白部分”)。在高度优选的实施方案中，白蛋白融合蛋白包含至少一个分子的治疗性蛋白(包括但不限于治疗性蛋白的成熟形式)和至少一个分子的白蛋白(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在一些实施方案中，白蛋白融合蛋白由宿主细胞如给药的RNA的靶器官的细胞加工，例如肝细胞，并且分泌至循环中。用于RNA表达的宿主细胞的分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可以包括但不限于信号肽切割；二硫键的形成；适当折叠；碳水化合物的添加和加工(例如，N-和O-连接的糖基化)；特异性蛋白水解切割；和/或组装为多聚体蛋白。白蛋白融合蛋白优选由RNA以非加工形式编码，其特别在N-末端具有信号肽，并且在细胞分泌之后优选以加工形式存在，其中特别已切割掉信号肽。在最优选的实施方案中，“白蛋白融合蛋白的加工形式”是指已经历N-末端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，在本文中也称作“成熟的白蛋白融合蛋白”。
在优选的实施方案中，与不融合至白蛋白时的相同治疗性蛋白的血浆稳定性相比，包含治疗性蛋白的白蛋白融合蛋白具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常是指从体内给药治疗性蛋白并进入血流到治疗性蛋白降解并从血流清除进入最终从身体清除治疗性蛋白的器官(如肾或肝)的时间。根据治疗性蛋白在血流中的半衰期计算血浆稳定性。治疗性蛋白在血流中的半衰期可以通过本领域已知的常见测定容易地确定。
如本文所用，“白蛋白”统指具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如，生物活性)的白蛋白或氨基酸序列，或者白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或者其片段或变体，特别是人白蛋白的成熟形式，或者来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或者这些分子的变体。白蛋白可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于母鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以来自与治疗性蛋白部分不同的动物。
在某些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)，或者其片段或变体，如US5,876,969、WO 2011/124718、WO 2013/075066和WO 2011/0514789中公开的那些。术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，涵盖人血清白蛋白(以及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(以及其片段和变体)。
如本文所用，足以延长治疗性蛋白的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段是指长度或结构足以稳定或延长蛋白的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段，从而与非融合状态下的血浆稳定性相比，白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白部分的血浆稳定性延长或扩展。
白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含白蛋白序列的全长，或者可以包括其一个或多个能够稳定或延长治疗活性或血浆稳定性的片段。这类片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可以包括来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可以包括白蛋白的特定结构域的一部分或全部。例如，可以使用跨越前两个免疫球蛋白样结构域的HSA的一个或多个片段。在一优选实施方案中，HSA片段是HSA的成熟形式。
一般来说，白蛋白片段或变体长度为至少100个氨基酸，优选长度为至少150个氨基酸。
根据本公开，白蛋白可以是天然存在的白蛋白或者其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白，并且可以源自任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。
在一些实施方案中，白蛋白融合蛋白包含白蛋白作为N-末端部分，以及治疗性蛋白作为C-末端部分。或者，还可以使用包含白蛋白作为C-末端部分，以及治疗性蛋白作为N-末端部分的白蛋白融合蛋白。在其他实施方案中，白蛋白融合蛋白具有融合至白蛋白的N-末端和C-末端的治疗性蛋白。在一优选实施方案中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是相同的治疗性蛋白。在另一优选实施方案中，融合在N-和C-末端的治疗性蛋白是不同的治疗性蛋白。在一些实施方案中，不同的治疗性蛋白都是细胞因子。
在一些实施方案中，治疗性蛋白通过肽接头连接至白蛋白。融合部分之间的肽接头可以在部分之间提供更大的物理间隔，因此使治疗性蛋白的可及性最大化，例如，用于与其同源受体结合。肽接头可以由氨基酸组成，从而它是柔性的或更刚性的。接头序列可以通过蛋白酶或化学切割。
如本文所用，术语“Fc区”是指天然免疫球蛋白由其两条重链各自的Fc结构域(或Fc部分)形成的部分。如本文所用，术语“Fc结构域”是指单个免疫球蛋白(Ig)重链的一部分或片段，其中所述Fc结构域不含Fv结构域。在某些实施方案中，Fc结构域开始于木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区，并且终止于抗体的C-末端。因此，完整的Fc结构域至少包含铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc结构域包含以下至少一个：铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或者其变体、部分或片段。在某些实施方案中，Fc结构域包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某些实施方案中，Fc结构域包含融合至CH3结构域(或其部分)的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域包含融合至CH3结构域(或其部分)的CH2结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域由CH3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。本文中的Fc结构域一般是指包含免疫球蛋白重链的Fc结构域的全部或部分的多肽。这包括但不限于包含完整CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽以及仅包含例如铰链、CH2和CH3结构域的这类肽的片段。Fc结构域可以源自任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域涵盖天然Fc和Fc变体分子。如本文所示，本领域普通技术人员会理解可以修饰任何Fc结构域，从而其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域不同。在某些实施方案中，Fc结构域具有降低的效应功能(例如，FcγR结合)。
本文所述的多肽的Fc结构域可以源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域可以包含源自IgG1分子的CH2和/或CH3结构域以及源自IgG3分子的铰链区。在另一实例中，Fc结构域可以包含嵌合铰链区，所述嵌合铰链区部分源自IgG1分子，并且部分源自IgG3分子。在另一实例中，Fc结构域可以包含嵌合铰链，所述嵌合铰链部分源自IgG1分子，并且部分源自IgG4分子。
在某些实施方案中，延长PK的基团包括Fc结构域或其片段，或者Fc结构域或其片段的变体(为了本公开的目的，所有这些均包括在术语“Fc结构域”中)。Fc结构域不含与抗原结合的可变区。适合用于本公开的Fc结构域可以获得自许多不同来源。在某些实施方案中，Fc结构域源自人免疫球蛋白。在某些实施方案中，Fc结构域来自人IgG1恒定区。但是，应当理解，Fc结构域可以源自另一哺乳动物物种的免疫球蛋白，包括例如，啮齿动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如黑猩猩、猕猴)物种。
此外，Fc结构域(或者其片段或变体)可以源自任何免疫球蛋白类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
各种Fc结构域基因序列(例如，小鼠和人恒定区基因序列)以可公开获取的保藏物的形式可获得。可以选择缺少特定效应功能和/或具有特定修饰以减少免疫原性的包含Fc结构域的恒定区结构域。已公开了许多抗体和抗体编码基因的序列，并且可以利用本领域公知的技术从这些序列衍生合适的Fc结构域序列(例如铰链、CH2和/或CH3序列，或者其片段或变体)。
在某些实施方案中，延长PK的基团是血清白蛋白结合蛋白如US2005/0287153、US2007/0003549、US2007/0178082、US2007/0269422、US2010/0113339、WO2009/083804和WO2009/133208中描述的那些，它们整体援引加入本文。在某些实施方案中，延长PK的基团是转铁蛋白，如US 7,176,278和US 8,158,579中公开的，它们整体援引加入本文。在某些实施方案中，延长PK的基团是血清免疫球蛋白结合蛋白如US2007/0178082、US2014/0220017和US2017/0145062中公开的那些，它们整体援引加入本文。在某些实施方案中，延长PK的基团是与血清白蛋白结合的基于纤连蛋白(Fn)的支架结构域蛋白，如US2012/0094909中公开的那些，其整体援引加入本文。US2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于Fn3的延长PK的基团的非限制性实例是Fn3(HSA)，即与人血清白蛋白结合的Fn3蛋白。
在某些实施方案中，适合根据本公开使用的PK延长的免疫刺激剂可以采用一个或多个肽接头。如本文所用，术语“肽接头”是指在多肽链的线性氨基酸序列中连接两个或更多个结构域(例如，延长PK的部分和免疫刺激剂部分)的肽或多肽序列。例如，肽接头可以用于将免疫刺激剂部分连接至HSA结构域。
适合将延长PK的基团融合至例如免疫刺激剂的接头是本领域公知的。示例性接头包括甘氨酸-丝氨酸-多肽接头、甘氨酸-脯氨酸-多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸-多肽接头，即，由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。
在一些实施方案中，药学活性肽或蛋白包含置换蛋白。在这些实施方案中，本公开提供一种治疗患有需要蛋白置换的病症(例如，蛋白缺乏症)的受试者的方法，其包括向所述受试者给药如本文所述的编码置换蛋白的RNA。术语“蛋白置换”是指将蛋白(包括其功能变体)引入缺乏这种蛋白的受试者。该术语还指将蛋白引入以其他方式需要或受益于提供蛋白的受试者，例如，患有蛋白不足的受试者。术语“以蛋白缺乏为特征的病症”是指因蛋白缺乏或不足而导致出现病理状况的任何病症。这个术语涵盖蛋白折叠障碍，即构象障碍，其导致无生物活性的蛋白产物。蛋白不足可以涉及传染病、免疫抑制、器官衰竭、腺体问题、放射性疾病、营养缺乏、中毒或者其他环境或外部损伤。
术语“激素”涉及一类由腺体产生的信号传导分子，其中信号传导通常包括以下步骤：(i)在特定组织中合成激素；(ii)储存和分泌；(iii)将激素转运至其靶标；(iv)通过受体结合激素；(v)信号的中继和放大；以及(vi)激素的分解。激素与细胞因子的不同之处在于(1)激素通常以较少变化的浓度发挥作用，以及(2)一般由特定种类的细胞产生。在一些实施方案中，“激素”是肽或蛋白激素，如胰岛素、加压素、催乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲状腺激素、生长激素(如人生长激素或牛促生长素)、催产素、心房利钠肽(ANP)、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦蛋白。
术语“粘附分子”涉及位于细胞表面并参与细胞与其他细胞或与胞外基质(ECM)结合的蛋白。粘附分子通常是跨膜受体，可以分为钙不依赖性(例如，整合素、免疫球蛋白超家族、淋巴细胞归巢受体)和钙依赖性(钙粘着蛋白和选择素)。粘附分子的具体实例是整合素、淋巴细胞归巢受体、选择素(例如，P-选择素)和地址素。
整合素也参与信号转导。特别地，当配体结合时，整合素调节细胞信号传导途径，例如，跨膜蛋白激酶如受体酪氨酸激酶(RTK)的途径。这种调节可以导致细胞生长、分裂、存活或分化或者细胞凋亡。整合素的具体实例包括：α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、αLβ2、αMβ2、αIIbβ3、αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6、αVβ8和α6β4。
术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白超家族”是指参与细胞的识别、结合和/或粘附过程的分子。属于这个超家族的分子具有共同特征，它们含有称作免疫球蛋白结构域或折叠的区域。免疫球蛋白超家族的成员包括抗体(例如，IgG)、T细胞受体(TCR)、主要组织相容性复合物(MHC)分子、共受体(例如，CD4、CD8、CD19)、抗原受体辅助分子(例如，CD-3γ、CD3-δ、CD-3ε、CD79a、CD79b)、共刺激或抑制分子(例如，CD28、CD80、CD86)等。
术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物，优选通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟，诱导和/或抑制细胞因子生物合成，和/或通过刺激B细胞产生抗体来改变体液免疫。免疫活性化合物具有有效的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可以下调免疫应答的其他方面，例如将免疫应答从TH2免疫应答转移，这可用于治疗广泛的TH2介导的疾病。免疫活性化合物可以用作疫苗佐剂。免疫活性化合物的具体实例包括白介素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体和抗原，特别是肿瘤相关抗原、病原体相关抗原(如细菌、寄生虫或病毒抗原)、过敏原和自身抗原。优选的免疫活性化合物是疫苗抗原，即接种到受试者中诱导免疫应答的抗原。
在一些实施方案中，本公开所述的RNA(特别是mRNA)包含编码肽或多肽的核酸序列，所述肽或多肽包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。“包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽”在本文中也称作“疫苗抗原”、“肽和蛋白抗原”或简称“抗原”。
在一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(特别是mRNA)是单链的、5'加帽的mRNA，在进入给药RNA的受试者细胞，例如抗原呈递细胞(APC)时，被翻译为相应的蛋白。优选地，RNA(i)含有为RNA在稳定性和翻译效率方面发挥最大效力优化的结构元件(5'帽、5'UTR、3'UTR、poly(A)序列)；(ii)为优化RNA的效力而修饰(例如，增加翻译效率，减少免疫原性和/或减少细胞毒性)(例如，通过用合成核苷(例如，选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷的修饰的核苷)置换(部分或完全，优选完全)天然存在的核苷(特别是胞苷)；和/或密码子优化)，或者(iii)(i)和(ii)两种情况都有。
在一些实施方案中，β-S-ARCA(D1)用作RNA的5'-末端的特定加帽结构。在一些实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，poly(A)序列的长度为110个核苷酸，由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基组成。设计这个poly(A)序列以增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率。在一些实施方案中，poly(A)序列包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:14的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷代替尿苷。在一些实施方案中，置换(部分或完全，优选完全)尿苷的修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷。在一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA具有以下编码序列：(a)经过密码子优化，(b)与野生型编码序列相比其G/C含量增加，或者(c)(a)和(b)两种情况都有。
在一些实施方案中，在受试者的细胞中表达编码疫苗抗原的RNA以提供疫苗抗原。在一些实施方案中，疫苗抗原的表达在细胞表面。在一些实施方案中，疫苗抗原是在MHC的背景下呈递的。在一些实施方案中，将编码疫苗抗原的RNA在受试者的细胞中瞬时表达。在一些实施方案中，将编码疫苗抗原的RNA全身给药。在一些实施方案中，在全身给药编码疫苗抗原的RNA之后，在脾中发生编码疫苗抗原的RNA的表达。在一些实施方案中，在全身给药编码疫苗抗原的RNA之后，在抗原呈递细胞中，优选在专职抗原呈递细胞中发生编码疫苗抗原的RNA的表达。在一些实施方案中，抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和B细胞。在一些实施方案中，在全身给药编码疫苗抗原的RNA之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有编码疫苗抗原的RNA的表达发生。在一些实施方案中，在全身给药编码疫苗抗原的RNA之后，脾中编码疫苗抗原的RNA的表达是肺中表达量的至少5倍。
疫苗抗原包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。因此，疫苗抗原包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的抗原序列。这种抗原序列可以对应于靶抗原或疾病相关抗原，例如，感染性物质(例如，病毒或细菌抗原)或肿瘤抗原的蛋白，或者可以对应于其免疫原性变体，或者靶抗原或疾病相关抗原的免疫原性片段或其免疫原性变体。因此，抗原序列可以包含靶抗原或疾病相关抗原或其免疫原性变体的至少一个表位。
适合根据本公开使用的抗原序列，例如表位，通常可以源自靶抗原，即针对其引发免疫应答的抗原。例如，疫苗抗原内含有的抗原序列可以是靶抗原或者靶抗原的片段或变体。
抗原序列或其加工产物，例如，其片段，可以与免疫效应细胞携带的抗原受体如TCR或CAR结合。在一些实施方案中，抗原序列选自免疫效应细胞靶向的靶细胞表达的抗原或其片段，或者抗原序列或片段的变体。
可以根据本公开通过给药编码疫苗抗原的RNA向受试者提供的疫苗抗原，优选在提供疫苗抗原的受试者中导致诱导免疫应答，例如，免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。所述免疫应答，例如，刺激、引发和/或扩增的免疫效应细胞，优选针对靶抗原，特别是患病细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可以包含疾病相关抗原，或者其片段或变体。在一些实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上等同于疾病相关抗原。
在本公开的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”表示导致诱导免疫应答的物质，例如，导致免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增，所述免疫应答，例如，刺激、引发和/或扩增的免疫效应细胞，靶向抗原，即疾病相关抗原，特别是由患病细胞、组织和/或器官呈递时。因此，疫苗抗原可以对应于或可以包含疾病相关抗原，可以对应于或可以包含疾病相关抗原的片段，或者可以对应于或可以包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果疫苗抗原包含疾病相关抗原片段或与疾病相关抗原片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可以包含免疫效应细胞的抗原受体靶向的疾病相关抗原表位或与疾病相关抗原表位同源的序列。因此，根据本公开，疫苗抗原可以包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开的“抗原的免疫原性片段”优选涉及抗原的片段，其能够诱导针对抗原或表达抗原的细胞的免疫应答，例如，刺激、引发和/或扩增携带与抗原或表达抗原的细胞结合的抗原受体的免疫效应细胞。优选疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)提供相关表位用于免疫效应细胞上存在的抗原受体结合。在一些实施方案中，在细胞如抗原呈递细胞(任选在MHC的背景下)的表面上表达疫苗抗原或其片段(类似于疾病相关抗原)，以便提供相关表位用于免疫效应细胞结合。疫苗抗原可以是重组抗原。
在本发明的所有方面的一些实施方案中，在受试者的细胞中表达编码疫苗抗原的RNA，以提供抗原或其加工产物用于免疫效应细胞表达的抗原受体结合，所述结合导致免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。根据本公开的“抗原”涵盖会引发免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制如细胞应答和/或体液应答所针对的任何物质。这还包括其中将抗原加工为抗原肽并且免疫应答或免疫机制针对一种或多种抗原肽的情况，特别是如果在MHC分子的背景中呈递。特别地，“抗原”涉及与抗体或T-淋巴细胞(T-细胞)特异性反应的任何物质，如肽或多肽。术语“抗原”可以包含分子，所述分子包含至少一个表位，如T细胞表位。在一些实施方案中，抗原是任选在加工后，诱导免疫反应的分子，所述免疫反应可以是抗原(包括表达抗原的细胞)特异性的。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原，如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，或者源自这种抗原的表位。
在一些实施方案中，抗原在免疫系统的细胞表面上被呈递或存在于免疫系统的细胞表面上，如抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞。抗原或其加工产物如T细胞表位，在一些实施方案中由抗原受体结合。因此，抗原或其加工产物可以与免疫效应细胞如T-淋巴细胞(T细胞)特异性地反应。
术语“自体抗原”或“自身抗原”是指源自受试者体内的抗原(即，自体抗原也可以称作“自体的抗原”)，并且针对身体的这个正常部分产生异常的强烈的免疫应答。这种针对自身抗原的强烈免疫应答可能是“自身免疫性疾病”的原因。
在一些实施方案中，在患病细胞(如肿瘤细胞或感染细胞)的表面上表达抗原。在一些实施方案中，抗原受体是与抗原的胞外域或胞外域中的表位结合的CAR。在一些实施方案中，CAR与活细胞表面上存在的抗原的天然表位结合。在一些实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，CAR与细胞如抗原呈递细胞上存在的抗原的结合导致所述T细胞的刺激、引发和/或扩增。在一些实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，CAR与患病细胞上存在的抗原的结合导致患病细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔蛋白和颗粒酶。
根据一些实施方案，将增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列直接或通过接头与抗原肽或多肽(抗原序列)融合。因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA包含至少一个编码抗原肽或多肽的编码区以及增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可以以RNA编码的形式给药的用于疫苗接种的抗原包含天然存在的抗原或片段如其表位。
这类增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选位于抗原肽或多肽的C-末端(并且任选地在打破免疫耐受的氨基酸序列的C-末端)，但不限于此。如本文定义的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选改善抗原加工和呈递。在一些实施方案中，如本文定义的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包括但不限于源自人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列，特别是包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或其功能变体的序列。
在一些实施方案中，可以将分泌序列，例如包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的序列，与抗原肽或多肽的N-末端融合。
在一些实施方案中，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列，与SEQ ID NO:36的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:36的氨基酸序列的功能片段，或与SEQID NO:36的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA包含至少一个编码抗原肽或多肽的编码区以及增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选与抗原肽或多肽融合，更优选与如本文所述的抗原肽或多肽的C-末端融合。
此外，可以将分泌序列，例如包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的序列，与抗原肽或多肽的N-末端融合。
源自破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风类毒素的氨基酸序列可以用于克服自身耐受机制，以便在启动期间通过提供T-细胞帮助有效地建立对自体抗原的免疫应答。
已知破伤风类毒素重链包括可以与MHC II类等位基因杂乱结合并在几乎所有破伤风疫苗接种的个体中诱导CD4+记忆T细胞的表位。此外，已知与单独应用肿瘤相关抗原相比，破伤风类毒素(TT)辅助表位与肿瘤相关抗原的组合通过在引发过程中提供CD4+介导的T-细胞帮助从而提高免疫刺激。为了降低破伤风序列刺激CD8+T细胞的风险，其可能与预期诱导的肿瘤抗原特异性T-细胞应答竞争，使用的不是破伤风类毒素的整个片段C，因为已知它含有CD8+T-细胞表位。可选地选择含有杂乱结合辅助表位的两个肽序列，以确保与尽可能多的MHC II类等位基因结合。基于离体研究的数据，选择了众所周知的表位p2(QYIKANSKFIGITEL；TT830-844；SEQ ID NO:40)和p16(MTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQG；TT578-609；SEQ ID NO:41)。在临床试验中，p2表位已用于肽疫苗接种以增强抗黑素瘤活性。
非临床数据表明编码肿瘤抗原加上杂乱结合的破伤风类毒素序列的RNA疫苗导致增强的针对肿瘤抗原的CD8+T-细胞应答和改善的耐受性突破。来自用包括与肿瘤抗原特异性序列符合读框地融合的那些序列的疫苗接种的患者的免疫监测数据显示，所选择的破伤风类毒素能够在几乎所有患者中诱导破伤风特异性T-细胞应答。
根据一些实施方案，将打破免疫耐受的氨基酸序列直接或通过接头(例如，具有根据SEQ ID NO:38的氨基酸序列的接头)与抗原肽或多肽融合。
打破免疫耐受的这类氨基酸序列优选位于抗原肽或多肽的C-末端(任选地在增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列的N-末端，其中打破免疫耐受的氨基酸序列以及增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列可以直接或通过接头融合，例如，具有根据SEQ ID NO:39的氨基酸序列的接头)，但不限于此。如本文定义的打破免疫耐受的氨基酸序列优选改善T细胞应答。在一些实施方案中，如本文定义的打破免疫耐受的氨基酸序列包括但不限于源自破伤风类毒素衍生的辅助序列p2和p16(P2P16)的序列，特别是包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或其功能变体的序列。
在一些实施方案中，打破免疫耐受的氨基酸序列包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:37的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:37的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，打破免疫耐受的氨基酸序列包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。
在下文中，描述了疫苗RNA的实施方案，其中在描述其元件时使用的某些术语具有以下含义:
帽：选自m2 7,2′OG(5’)ppSp(5′)G(特别是其D1非对映体)、m2 7,3′OG(5′)ppp(5′)G和m2 7,3′-OGppp(m1 2′-O)ApG的5′-帽结构。
hAg-Kozak：人α-珠蛋白mRNA的5′-UTR序列，其具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。
sec/MITD：源自编码人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列的融合蛋白标签，已被证明改善抗原加工和呈递。Sec对应于编码分泌信号肽的78bp片段，其指导新生多肽链易位至内质网。MITD对应于MHC I类分子的跨膜和细胞质结构域，也称为MHC I类运输结构域。
抗原:编码相应疫苗抗原/表位的序列。
甘氨酸-丝氨酸接头(GS)：编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短肽接头的序列，通常用于融合蛋白。
P2P16:编码破伤风类毒素衍生的辅助表位以打破免疫耐受的序列。
FI元件：3′-UTR是源自“分裂的氨基末端增强子”(AES)mRNA(称作F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称作I)的两个序列元件的组合。通过对赋予RNA稳定性和增加总蛋白表达的序列的离体选择过程鉴定了这些。
A30L70：长度为110个核苷酸的poly(A)-尾，由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基组成，设计为增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率。
在一些实施方案中，本文所述的疫苗RNA具有以下结构之一：
帽-hAg-Kozak-sec-GS(1)-抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD-FI-A30L70
β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS(1)-抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD-FI-A30L70
在一些实施方案中，本文所述的疫苗抗原具有结构：
sec-GS(1)-抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD
在一些实施方案中，hAg-Kozak包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列。在一些实施方案中，sec包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2P16包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，MITD包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，GS(1)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，GS(2)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，GS(3)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，FI包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列。在一些实施方案中，A30L70包含SEQ ID NO:14的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码疫苗抗原/表位的序列包含置换(部分或完全，优选完全)尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷。
在一些实施方案中，编码疫苗抗原/表位的序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，与野生型编码序列相比，编码疫苗抗原/表位的序列的G/C含量增加。
术语“专职(professional)抗原呈递细胞”涉及组成性表达与幼稚T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合物II类(MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞膜上的MHC II类分子复合物相互作用，则抗原呈递细胞产生共刺激分子，诱导T细胞的激活。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职(non-professional)抗原呈递细胞”涉及不组成性表达MHC II类分子，但是在受到某些细胞因子如干扰素-γ刺激时表达MHC II类分子的抗原呈递细胞。示例性非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰β细胞或血管内皮细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指吞噬细胞的一种亚型，其属于抗原呈递细胞的类别。在一些实施方案中，树突细胞源自造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟的细胞的特征在于高吞噬活性和低T细胞激活潜力。未成熟的树突细胞不断采样周围环境中的病原体如病毒和细菌。一旦它们与可呈递的抗原接触，它们会激活为成熟的树突细胞并开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将它们的蛋白降解为小片，并且在成熟时利用MHC分子将那些片段呈递在它们的细胞表面。同时，它们上调在T细胞激活中充当共受体的细胞表面受体如CD80、CD86和CD40，大大增强它们激活T细胞的能力。它们还上调趋化性受体CCR7，其诱导树突细胞通过血流到达脾或通过淋巴系统到达淋巴结。这里它们充当抗原呈递细胞，并且通过呈递抗原以及非抗原特异性共刺激信号来激活辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可以主动诱导T细胞或B细胞相关的免疫应答。在一些实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“巨噬细胞”是指通过单核细胞的分化产生的吞噬细胞的亚组。被炎症、免疫细胞因子或微生物产物激活的巨噬细胞非特异性地吞噬并通过水解和氧化攻击杀死巨噬细胞内的外来病原体，导致病原体的降解。来自降解蛋白的肽展示在巨噬细胞表面上，在这里它们可以被T细胞识别，并且它们可以直接与B细胞表面上的抗体相互作用，导致T和B细胞激活并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞的类别。在一些实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
术语“过敏原”是指一种源自受试者体外的抗原(即，过敏原也可以称作“异源抗原”)，并且产生异常的强烈的免疫应答，其中受试者的免疫系统击退感知到的对受试者无害的威胁。“过敏”是由这种对过敏原的强烈免疫反应引起的疾病。过敏原通常是能够通过免疫球蛋白E(IgE)应答在特应性个体中刺激I型超敏反应的抗原。过敏原的具体实例包括源自花生蛋白(例如，Ara h 2.02)、卵清蛋白、草花粉蛋白(例如，Phl p 5)和尘螨蛋白(例如，Der p 2)的过敏原。
术语“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的分子。通常，生长因子充当细胞之间的信号传导分子。术语“生长因子”包括与其靶细胞表面上的特异性受体结合的特定细胞因子和激素。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)如VEGFA、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子、肝配蛋白、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、神经调节蛋白、神经营养蛋白(例如，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF))、胎盘生长因子(PGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肾胺酶(RNLS)(抗凋亡存活因子)、T-细胞生长因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子(转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β))以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。在一实施方案中，“生长因子”是肽或蛋白生长因子。
术语“蛋白酶抑制剂”是指抑制蛋白酶功能的分子，特别是肽或蛋白。蛋白酶抑制剂可以根据被抑制的蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶抑制剂)或它们的作用机制(例如，自杀抑制剂，如丝氨酸蛋白酶抑制剂)进行分类。蛋白酶抑制剂的具体实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶和苯丁抑制素(bestatin)。
术语“酶”是指加速化学反应的大分子生物催化剂。像任何催化剂一样，酶不会在其催化的反应中被消耗，并且不改变所述反应的平衡。与许多其他催化剂不同，酶的特异性要高得多。在一实施方案中，酶对于受试者的体内平衡是必不可少的，例如，酶的任何功能障碍(特别地，可能由任何突变、缺失或产生减少引起的活性降低)都会导致疾病。酶的实例包括单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶和乳糖酶。
术语“受体”是指从细胞外接收信号(特别是称作配体的化学信号)的蛋白分子。信号(例如，配体)与受体的结合引起细胞的某种应答，例如，激酶的细胞内激活。受体包括跨膜受体(如离子通道连接(离子型)受体、G蛋白连接(代谢型)受体和酶联受体)和细胞内受体(如细胞质受体和核受体)。受体的具体实例包括类固醇激素受体、生长因子受体和肽受体(即，配体是肽的受体)，如P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)。术语“生长因子受体”是指与生长因子结合的受体。
术语“细胞凋亡调节因子”是指调节细胞凋亡，即激活或抑制细胞凋亡的分子，特别是肽或蛋白。细胞凋亡调节因子可以分为两大类：调节线粒体功能的调节因子和调节胱天蛋白酶的调节因子。第一类包括蛋白(例如，BCL-2、BCL-xL)，其通过防止线粒体膜电位丧失和/或促凋亡蛋白如细胞色素C释放至胞质溶胶中来保护线粒体完整性。促凋亡蛋白(例如，BAX、BAK、BIM)也属于第一类，其促进细胞色素C的释放。第二类包括阻断胱天蛋白酶激活的蛋白，如细胞凋亡蛋白抑制剂(例如，XIAP)或FLIP。
术语“转录因子”涉及调节遗传信息从DNA到信使RNA的转录速率的蛋白，特别是通过与特定DNA序列结合来调节。转录因子可以调节整个生命过程中的细胞分裂、细胞生长和细胞死亡；胚胎发育期间的细胞迁移和组织；和/或响应来自细胞外的信号，如激素。转录因子含有至少一个与特定DNA序列结合的DNA-结合结构域，通常与受转录因子调节的基因相邻。转录因子的具体实例包括MECP2、FOXP2、FOXP3、STAT蛋白家族和HOX蛋白家族。
术语“肿瘤抑制蛋白”涉及保护细胞免于在癌症道路上的迈出一步的分子，特别是肽或蛋白。肿瘤抑制蛋白(通常由相应的肿瘤抑制基因编码)表现出对细胞周期调节的减弱或抑制作用和/或促进细胞凋亡。它们的功能可能是以下一种或多种：抑制对细胞周期持续至关重要的基因；将细胞周期与DNA损伤耦合(只要细胞中存在受损的DNA，就不应当发生细胞分裂)；如果不可以修复受损的DNA，则启动细胞凋亡；转移抑制(例如，防止肿瘤细胞分散，阻断接触抑制的丧失以及抑制转移)；以及DNA修复。肿瘤抑制蛋白的具体实例包括p53、磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)、SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)、vonHippel–Lindau肿瘤抑制蛋白(pVHL)、结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)、CD95、肿瘤发生抑制蛋白5(ST5)、肿瘤发生抑制蛋白5(ST5)、肿瘤发生抑制蛋白14(ST14)和Yippee样3(YPEL3)。
术语“结构蛋白”是指赋予流体生物组分刚度和刚性的蛋白。结构蛋白大多是纤维状的(如胶原蛋白和弹性蛋白)，但是也可以是球状的(如肌动蛋白和微管蛋白)。通常，球状蛋白作为单体是可溶的，但是聚合形成长纤维，例如，其可以构成细胞骨架。其他结构蛋白是能够产生机械力的运动蛋白(如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白)，以及表面活性蛋白。结构蛋白的具体实例包括胶原蛋白、表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白。
术语“重编程因子”或“重编程转录因子”涉及分子，特别是肽或蛋白，当在体细胞中任选与其他物质如其他重编程因子一起表达时，其导致所述体细胞重编程或去分化为具有干细胞特征，特别是多能性的细胞。重编程因子的具体实例包括OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28和NANOG。
术语“基因组工程蛋白”涉及能够在受试者基因组中插入、缺失或置换DNA的蛋白。基因组工程蛋白的具体实例包括巨核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复-CRISPR-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)。
术语“血液蛋白”涉及存在于受试者的血浆，特别是健康受试者的血浆中的肽或蛋白。血液蛋白具有多种功能，如转运(例如，白蛋白、转铁蛋白)、酶促活性(例如，凝血酶或血浆铜蓝蛋白)、凝血(例如，纤维蛋白原)、防御病原体(例如，补体组分和免疫球蛋白)、蛋白酶抑制剂(例如，α1-抗胰蛋白酶)等。血液蛋白的具体实例包括凝血酶、血清白蛋白、因子VII、因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白C、von Willebrand因子、抗凝血酶III、葡糖脑苷脂酶、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、修饰的因子VIII和抗凝剂。
因此，在一些实施方案中，药学活性肽或蛋白是(i)细胞因子，优选选自促红细胞生成素(EPO)、白介素4(IL-2)和白介素10(IL-11)，更优选EPO；(ii)粘附分子，特别是整合素；(iii)免疫球蛋白，特别是抗体；(iv)免疫活性化合物，特别是抗原，例如病毒或细菌抗原，如SARS-CoV-2的抗原；(v)激素，特别是加压素、胰岛素或生长激素；(vi)生长因子，特别是VEGFA；(vii)蛋白酶抑制剂，特别是α1-抗胰蛋白酶；(viii)酶，优选选自单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶和乳糖酶；(ix)受体，特别是生长因子受体；(x)细胞凋亡调节因子，特别是BAX；(xi)转录因子，特别是FOXP3；(xii)肿瘤抑制蛋白，特别是p53；(xiii)结构蛋白，特别是表面活性蛋白B；(xiv)重编程因子，例如，选自OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28和NANOG；(xv)基因组工程蛋白，特别是成簇规律间隔短回文重复-CRISPR-相关蛋白9(CRISPR-Cas9)；以及(xvi)血液蛋白，特别是纤维蛋白原。
在一些实施方案中，药学活性肽或蛋白包含一种或多种抗原或者一种或多种表位，即，向受试者给药所述肽或蛋白在受试者中引发针对所述一种或多种抗原或者一种或多种表位的免疫应答，这可能是治疗性的或者部分或完全保护性的。
在某些实施方案中，RNA(优选mRNA)编码至少一个表位，例如，至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。
在某些实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原，并且抗原序列(例如，表位)源自肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，其一般已知在各种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新抗原”，其是个体肿瘤特异性的，并且以前尚未被免疫系统识别。新抗原或新表位可能由癌细胞基因组中的一个或多个癌症特异性突变导致氨基酸改变所致。如果所述肿瘤抗原是新抗原，则疫苗抗原优选包含所述新抗原的一个表位或片段，所述新抗原包含一个或多个氨基酸改变。
肿瘤抗原的实例包括但不限于p53，ART-4，BAGE，β-联蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，密蛋白家族的细胞表面蛋白，如CLAUDIΝ-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap 100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A1 1或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1，MUM-2，MUM-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，pl90最小BCR-abL，Pml/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，SURVIVIN，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT以及WT-1。
癌症突变因个体而异。因此，编码新的表位(新表位)的癌症突变代表在开发疫苗组合物和免疫疗法中有吸引力的靶标。肿瘤免疫疗法的效力依赖于选择能够在宿主内诱导有效免疫应答的癌症特异性抗原和表位。RNA可以用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。驻留在脾中的树突细胞(DC)代表对免疫原性表位或抗原如肿瘤表位的RNA表达特别感兴趣的抗原呈递细胞。已显示使用多个表位会促进肿瘤疫苗组合物的治疗效力。肿瘤突变组(mutanome)的快速测序可以为个体化疫苗提供多个表位，所述疫苗可以由本文所述的RNA(特别是mRNA)编码，例如，作为单一多肽，其中表位任选被接头隔开。在本公开的某些实施方案中，RNA(特别是mRNA)编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。示例性实施方案包括编码至少五个表位(称作“五表位”)的RNA(特别是mRNA)和编码至少十个表位(称作“十表位”)的RNA(特别是mRNA)。
在某些实施方案中，表位源自病原体相关抗原。在一些实施方案中，药学活性多肽和/或抗原或表位源自或是病原体的蛋白、所述蛋白的免疫原性变体、或者该蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
在一些实施方案中，所述病原体选自病毒、细菌、真菌、寄生虫或其他微生物。
示例性病毒包括但不限于严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)，如SARS-CoV2，人免疫缺陷病毒(HIV)，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)(例如，CMV5)，人疱疹病毒(HHV)(例如，HHV6、7或8)，单纯疱疹病毒(HSV)，牛疱疹病毒(BHV)(例如，BHV4)，马疱疹病毒(EHV)(例如，EHV2)，人T-细胞白血病病毒(HTLV)5，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，麻疹病毒，乳多空病毒(JC和BK)，肝炎病毒(例如，HBV或HCV)，黏液瘤病毒，腺病毒，鼻病毒，肠道病毒，细小病毒，多瘤病毒，流感病毒，乳头瘤病毒(如人乳头瘤病毒(HPV))，痘病毒如痘苗病毒，和传染性软疣病毒(MCV)，狂犬病病毒，轮状病毒，诺如病毒，风疹病毒以及腮腺炎病毒。由病毒感染引起的示例性疾病包括但不限于SARS、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、麻疹、水痘、巨细胞病毒感染、生殖器疱疹、肝炎(如乙型肝炎或丙型肝炎)、流感(流感，如人流感、猪流感、犬流感、马流感和禽流感)、HPV感染、带状疱疹、狂犬病、普通感冒、胃肠炎、风疹和腮腺炎。
示例性细菌包括但不限于弯曲杆菌(Campylobacter)(如空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni))、肠杆菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)(例如，F.coli O157:H7)、A组链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、李斯特菌、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、包柔螺旋体(Borrelia)和立克次体(Rickettsia)、衣原体科(Chlamydiaceae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、百日咳杆菌(Bordetellapertussis)、破伤风梭菌、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、链球菌(Streptococcus)(如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)或化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes))以及梅毒螺旋体(Treponema pallidum)。由细菌感染引起的示例性疾病包括但不限于炭疽、霍乱、白喉、食源性疾病、麻风病、脑膜炎、消化性溃疡病、肺炎、脓毒、败血性休克、破伤风、结核病、伤寒、尿路感染、莱姆病(Lyme disease)、落基山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)、衣原体病、淋病、百日咳、破伤风、脑膜炎、猩红热和梅毒。
示例性寄生虫包括但不限于疟原虫(Plasmodium)、锥虫(Trypanosoma)、利什曼原虫(Leishmania)、毛滴虫(Trichomonas)、双核阿米巴属(Dientamoeba)、贾第鞭毛虫(Giardia)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、纳氏虫属(Naegleria)、等孢子球虫属(Isospora)、弓形虫(Toxoplasma)、肉孢子虫(Sarcocystis)、西伯鼻孢子虫(Rhinosporidium seeberi)和小袋纤毛虫(Balantidium)。由寄生虫感染引起的示例性疾病包括但不限于疟疾、锥虫病、恰加斯病(Chagas disease)、利什曼病(leishmaniasis)、滴虫病(trichomoniasis)、双核阿米巴病(dientamoebiasis)、贾第虫病(giardiasis)、阿米巴痢疾(amebic dysentery)、球虫病(coccidiosis)、弓形虫病(toxoplasmosis)、肉孢子虫病(sarcocystosis)、鼻孢子虫病(rhinosporidiosis)和小袋纤毛虫病(balantidiasis)。
在一些实施方案中，病原体是传染性病原体，特别是引起传染病的病原体，如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生虫病。在一些实施方案中，病原体是病毒、细菌或寄生虫。因此，在这些实施方案中，本文所述的RNA(特别是mRNA)和/或组合物可以用于预防和/或治疗由所述病原体引起的传染病。
在某些实施方案中，表位源自病毒抗原。
在一些实施方案中，抗原或表位源自冠状病毒蛋白、其免疫原性变体、或者所述冠状病毒蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。因此，在一些实施方案中，本公开中使用的mRNA编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含冠状病毒蛋白、其免疫原性变体、或者所述冠状病毒蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
在一些实施方案中，抗原或表位源自冠状病毒S蛋白、其免疫原性变体、或者所述冠状病毒S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。因此，在一些实施方案中，本公开所述的RNA(特别是mRNA)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含冠状病毒S蛋白、其免疫原性变体、或者所述冠状病毒S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在一些实施方案中，冠状病毒是MERS-CoV。在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV。在一些实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2。
冠状病毒是有包膜的、正义的、单链RNA((+)ssRNA)病毒。它们具有已知RNA病毒中最大的基因组(26–32kb)，并且在系统发生上分为4个属(α、β、γ和δ)，而β冠状病毒进一步细分为4个谱系(A、B、C和D)。冠状病毒感染广泛的鸟类和哺乳动物物种，包括人。一些人冠状病毒一般引起轻度呼吸道疾病，尽管在婴儿、老年人和免疫受损的人中严重程度可能更高。分别属于β冠状病毒谱系C和B的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)具有高致病性。在过去15年内，这两种病毒都从动物宿主进入了人类群体，并且导致高病死率的爆发。严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)(MN908947.3)属于β冠状病毒谱系B。它与SARS-CoV具有至少70％序列相似性。
一般来说，冠状病毒具有4种结构蛋白，即包膜(E)、膜(M)、核壳(N)和刺突(S)。E和M蛋白在病毒装配中具有重要功能，而N蛋白对于病毒RNA合成是必需的。关键的糖蛋白S负责病毒结合和进入靶细胞。S蛋白合成为单链无活性前体，在生成细胞中被弗林蛋白酶样宿主蛋白酶切割成两个非共价结合的亚基S1和S2。S1亚基含有受体结合结构域(RBD)，其识别宿主细胞受体。S2亚基含有融合肽、两个七肽重复和跨膜结构域，需要所有这些以通过经历大的构象重排来介导病毒和宿主膜的融合。S1和S2亚基三聚化形成大的预融合刺突。
SARS-CoV-2的S前体蛋白可以被蛋白水解切割为S1(685aa)和S2(588aa)亚基。S1亚基包含受体结合结构域(RBD)，其介导病毒通过宿主血管紧张素转化酶2(ACE2)受体进入敏感细胞。
在一些实施方案中，抗原或表位源自SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。因此，在一些实施方案中，本公开所述的RNA(优选mRNA)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。因此，在一些实施方案中，编码的氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白的表位或其免疫原性变体，用于在受试者中诱导针对冠状病毒S蛋白，特别是SARS-CoV-2S蛋白的免疫应答。在一些实施方案中，RNA(优选mRNA)包含编码在SEQ ID NO:1的位置986和987处具有脯氨酸残基取代的全长SARS-CoV2 S蛋白的ORF。在一些实施方案中，SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7具有至少80％相同性(如至少85％相同性、至少90％相同性、至少91％相同性、至少92％相同性、至少93％相同性、至少94％相同性、至少95％相同性、至少96％相同性、至少97％相同性、至少98％相同性或至少99％相同性)。
在一些实施方案中，给药RNA(特别是mRNA)以(在通过适当的靶细胞表达之后)提供抗原，用于诱导免疫应答，例如，抗体和/或免疫效应细胞，其靶向靶抗原(冠状病毒S蛋白，特别是SARS-CoV-2S蛋白)或其加工产物。在一些实施方案中，根据本公开诱导的免疫应答是B细胞介导的免疫应答，即抗体介导的免疫应答。另外地或可选择地，在一些实施方案中，根据本公开诱导的免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是抗冠状病毒，特别是抗SARS-CoV-2免疫应答。
在一些实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性片段包含SARS-CoV-2S蛋白的S1亚基，或者SARS-CoV-2S蛋白的S1亚基的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，本公开所述的RNA(例如，mRNA)包含编码多肽的开放阅读框，所述多肽包含SARS-CoV-2S蛋白的受体结合部分，所述RNA适合所述多肽的细胞内表达。在一些实施方案中，这种编码的多肽不包含完整的S蛋白。在一些实施方案中，编码的多肽包含受体结合结构域(RBD)，例如，如SEQID NO:5所示。在一些实施方案中，编码的多肽包含根据SEQ ID NO:29或31的肽。
SARS-CoV-2冠状病毒全长刺突(S)蛋白由1273个氨基酸组成，具有如SEQ ID NO:1所示的以下氨基酸序列。为了本公开的目的，SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列被认为是野生型SARS-CoV-2S蛋白氨基酸序列。本文给出的SARS-CoV-2S蛋白的位置编号相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列和SARS-CoV-2S蛋白变体中的相应位置。
在具体的实施方案中，以使原型预融合构象稳定的方式修饰根据SEQ ID NO:1的全长刺突(S)蛋白。可以通过在全长刺突蛋白中的氨基酸残基986和987处引入两个连续的脯氨酸取代来获得预融合构象的稳定。具体地，以这样的方式获得刺突(S)蛋白稳定的蛋白变体，将位置986处的氨基酸残基交换为脯氨酸，并且将位置987处的氨基酸残基也交换为脯氨酸。在一些实施方案中，其中原型预融合构象稳定的SARS-CoV-2S蛋白变体包含SEQ IDNO:7中示出的氨基酸序列。
本领域技术人员知道各种刺突变体，和/或记录它们的资源。
在一些实施方案中，本文所述的RNA(特别是mRNA)(例如，包含在本公开的组合物中和/或用于本公开的方法)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白、其变体或其片段，基本上由SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白、其变体或其片段组成，或者由SARS-CoV-2的刺突(S)蛋白、其变体或其片段组成。
SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列、其变体或其片段在本文中也称作“RBD”或“RBD结构域”。
在一些实施方案中，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列能够形成多聚体复合物，特别是三聚体复合物。为此，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列可以包含允许形成多聚体复合物的结构域，特别是包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的三聚体复合物。在一些实施方案中，允许形成多聚体复合物的结构域包含三聚结构域，例如，本文描述的三聚结构域。
在一些实施方案中，将三聚结构域直接或通过接头(例如，甘氨酸/丝氨酸接头)融合至SARS-CoV-2S蛋白、其变体或其片段，即抗原肽或蛋白。因此，在一些实施方案中，将三聚结构域融合至上述编码的氨基酸序列包含的源自SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列(可以任选地将其融合至上述信号肽)。
这类三聚结构域优选位于抗原肽或蛋白的C-末端，但不限于此。如本文定义的三聚结构域优选允许RNA编码的抗原肽或蛋白的三聚化。如本文定义的三聚结构域的实例包括但不限于折叠子(foldon)，T4次要纤维蛋白的天然三聚结构域。T4次要纤维蛋白(fibritin)的C-末端结构域(折叠子)对于次要纤维蛋白三聚体结构的形成必不可少，并且可以用作人工三聚结构域。在一些实施方案中，如本文定义的三聚结构域包括但不限于包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的序列或其功能变体。
在一些实施方案中，如本文定义的三聚结构域包括但不限于包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列的序列或其功能变体。在一实施方案中，如本文定义的三聚结构域包括但不限于包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的序列或其功能变体。
在一些实施方案中，三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码三聚结构域的RNA(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列，与SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，编码三聚结构域的RNA(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸7-87的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可以通过添加T4-次要纤维蛋白衍生的“foldon”三聚结构域来修饰由编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA表达的RBD抗原(例如，如本文所述)，例如，以增加其免疫原性。
在一些实施方案中，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列由与野生型编码序列相比密码子优化和/或G/C含量增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
在一些实施方案中，
(i)编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸979-1584的核苷酸序列，与SEQID NO:2、8或9的核苷酸979-1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸979-1584的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸979-1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，
(i)编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2055的核苷酸序列，与SEQID NO:2、8或9的核苷酸49-2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2055的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ IDNO:1的氨基酸17-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，
(i)编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-3819的核苷酸序列，与SEQID NO:2、8或9的核苷酸49-3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-3819的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17-1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，
(i)编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2049的核苷酸序列，与SEQID NO:2、8或9的核苷酸49-2049的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2049的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2049的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ IDNO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49-2049的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，编码的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸17-683的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，编码的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-683的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，编码的氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-685的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列包含分泌信号肽。
在一些实施方案中，分泌信号肽融合，优选在N-末端，至SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体，或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
在一些实施方案中，
(i)编码分泌信号肽的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列，与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1-48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)分泌信号肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:1的氨基酸1-16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列，与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:6的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:5的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列，与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:4的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，与SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:3的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54-716的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸54-716的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:30的核苷酸54-716的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:30的核苷酸54-716的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54-716的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-221的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-725的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸54-725的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:32的核苷酸54-725的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:32的核苷酸54-725的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列，与SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:5的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:18的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54-824的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸54-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:30的核苷酸54-824的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:30的核苷酸54-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54-824的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-257的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-260的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-833的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸54-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:32的核苷酸54-833的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:32的核苷酸54-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-833的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-260的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111-824的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸111-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:30的核苷酸111-824的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:30的核苷酸111-824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111-824的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-257的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120-833的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸120-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:32的核苷酸120-833的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:32的核苷酸120-833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120-833的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-260的氨基酸序列。
根据某些实施方案，将跨膜结构域直接或通过接头(例如，甘氨酸/丝氨酸接头)融合至SARS-CoV-2S蛋白、其变体或其片段，即，抗原肽或蛋白。因此，在一些实施方案中，将跨膜结构域融合至上述疫苗抗原包含的源自SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列(可以任选将其融合至上述信号肽和/或三聚结构域)。这类跨膜结构域优选位于抗原肽或蛋白的C-末端，但不限于此。优选地，这类跨膜结构域位于三聚结构域(如果存在)的C-末端，但不限于此。在一实施方案中，三聚结构域存在于SARS-CoV-2S蛋白、其变体或其片段(即，抗原肽或蛋白)和跨膜结构域之间。如本文定义的跨膜结构域优选允许RNA编码的抗原肽或蛋白锚定在细胞膜中。
在一些实施方案中，如本文定义的跨膜结构域序列包括但不限于SARS-CoV-2S蛋白的跨膜结构域序列，特别是包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列的序列或其功能变体。
在一些实施方案中，跨膜结构域序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，跨膜结构域序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码跨膜结构域序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列，与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，编码跨膜结构域序列的RNA(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619-3762的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54-986的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸54-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:30的核苷酸54-986的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:30的核苷酸54-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54-986的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1-311的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-995的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸54-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:32的核苷酸54-995的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:32的核苷酸54-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-995的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-314的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111-986的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸111-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:30的核苷酸111-986的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:30的核苷酸111-986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111-986的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸20-311的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120-995的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸120-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:32的核苷酸120-995的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:32的核苷酸120-995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120-995的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸23-314的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:30的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，与SEQID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:29的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:32的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，与SEQID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:31的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:28的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA
(i)包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列，与SEQ ID NO:27的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:27的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:27的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，与SEQID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:28的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
在一些实施方案中，上述疫苗抗原包含SARS-CoV-2冠状病毒刺突(S)蛋白的连续序列，所述连续序列由或基本上由上述疫苗抗原包含的源自SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列组成。在一实施方案中，上述疫苗抗原包含不超过220个氨基酸、215个氨基酸、210个氨基酸或205个氨基酸的SARS-CoV-2冠状病毒刺突(S)蛋白的连续序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，在本文中描述为BNT162b1(RBP020.3)、BNT162b2(RBP020.1或RBP020.2)。在一实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，在本文中描述为RBP020.2。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列，与SEQ ID NO:21的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:19或20的核苷酸序列，与SEQ ID NO:19或20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:19或20的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列，与SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:7的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54-725的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1-224的氨基酸序列。
在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:42的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且
(i)包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，与SEQ ID NO:43的核苷酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的核苷酸序列，和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列。在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且
(i)包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列，与SEQ ID NO:44的核苷酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的核苷酸序列，和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列。在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO:42的氨基酸序列。
在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:45的氨基酸序列的免疫原性片段，或与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且
(i)包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列，与SEQ ID NO:46的核苷酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的核苷酸序列，和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列。在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:46的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO:45的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且
(i)包含SEQ ID NO:47的核苷酸序列，与SEQ ID NO:47的核苷酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的核苷酸序列，和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％或97％相同性的氨基酸序列。在一实施方案中，编码疫苗抗原的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:47的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQID NO:45的氨基酸序列。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述RNA含有上述RNA修饰中的一种或多种，即掺入5'-帽结构，掺入poly-A序列、暴露poly-A序列，改变5'-和/或3'-UTR(如掺入一个或多个3'-UTR)，用合成核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，5-甲基胞苷用于胞苷和/或假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)用于尿苷)以及密码子优化。在一实施方案中，RNA含有上述修饰的组合，优选至少两种、至少三种、至少四种或全部五种上述修饰的组合，即，(i)掺入5'-帽结构，(ii)掺入poly-A序列，暴露poly-A序列；(iii)改变5'-和/或3'-UTR(如掺入一个或多个3'-UTR)；(iv)用合成核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，5-甲基胞苷用于胞苷和/或假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)用于尿苷)，以及(v)密码子优化。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，RNA是修饰的RNA，特别是稳定的mRNA。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷代替至少一个尿苷。在一些实施方案中，RNA包含修饰的核苷代替尿苷，如代替每个尿苷。在一些实施方案中，修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。在一些实施方案中，所述RNA包含5’帽，优选cap1或cap2结构，更优选cap1结构。在一些实施方案中，所述RNA包含5’-UTR，所述5’-UTR包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNA包含3’-UTR，所述3’-UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述RNA包含poly-A序列。在一些实施方案中，所述poly-A序列包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，所述poly-A序列包含或由SEQ ID NO:14的核苷酸序列组成。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括RBD中的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的Q321L、V341I、A348T、N354D、S359N、V367F、K378R、R408I、Q409E、A435S、N439K、K458R、I472V、G476S、S477N、V483A、Y508H、H519P等)，和/或刺突蛋白中的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的D614G等)。本领域技术人员知道各种刺突变体，和/或记录它们的资源(例如，由COVID-19病毒基因组分析渠道维护并在https://cov.lanl.gov/components/sequence/COV/int_sites_tbls.comp找到的刺突中的突变位点表)(最后访问时间2020年8月24日)，并且，阅读本公开会理解本文所述的RNA组合物和/或方法可以表征它们的能力是在疫苗接种的受试者中诱导血清，所述血清表现出关于任何或所有这样的变体和/或其组合的中和活性。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中501位的突变，并且任选可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括“关切变体202012/01”(VOC-2012/01；也称作谱系B.1.1.7)。该变体此前已被英国公共卫生部在2020年12月命名为第一个正在研究的变体(VUI–202012/01)，但是后来重新归类为关切变体(VOC-202012/01)。VOC-202012/01是SARS-CoV-2的变体，其在英国COVID-19大流行期间于2020年10月从上个月采集的样品中首次检测到，并且在12月中旬迅速开始传播。其与英国COVID-19感染率的显著增加有关；据认为这种增加至少部分是由于刺突糖蛋白的受体结合结构域内的N501Y变化，这是与人细胞中的ACE2结合所需要的。VOC-202012/01变体由23个突变定义：13个非同义突变，4个缺失和6个同义突变(即，有17个改变蛋白的突变和6个不改变蛋白的突变)。VOC 202012/01中的刺突蛋白变化包括缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。VOC-202012/01中最重要的变化之一看来是N501Y，在氨基酸位点501处从天冬酰胺(N)到酪氨酸(Y)的变化。这个突变单独或与N末端结构域(NTD)中位置69/70处的缺失组合可以增强病毒的传播能力。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括变体“501.V2”。从2020年10月开始在样品中首次观察到这种变体，并且从那时起在南非通过全基因组测序(WGS)已确认超过300例具有501.V2变体，其中在2020年12月，其是病毒的主要形式。初步结果表明，这种变体可能具有更高的传播能力。501.V2变体由多个刺突蛋白变化定义，包括：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，并且最近收集的病毒具有额外的变化：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述SARS-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中的H69/V70缺失。所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I等)。在特定实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体包括以下突变：与SEQ ID NO:1相比的缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括“簇5(Cluster5)”，也被丹麦国家血清研究所(SSI)称作ΔFVI-刺突。它是在丹麦北日德兰半岛发现的，并且据信已通过水貂养殖场从水貂传播至人。在簇5中，已确认病毒的刺突蛋白中的几个不同突变。特异性突变包括69–70δHV(蛋白中第69和第70位置处的组氨酸和缬氨酸残基的缺失)、Y453F(在位置453处从酪氨酸变为苯丙氨酸)、I692V(在位置692处从异亮氨酸变为缬氨酸)、M1229I(在位置1229处从甲硫氨酸变为异亮氨酸)和任选存在的S1147L(在位置1147处从丝氨酸变为亮氨酸)。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：缺失69-70、Y453F、I692V、M1229I和任选存在的S1147L。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述SARS-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置614处的突变，如与SEQID NO:1相比在刺突蛋白中的D614G突变。与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置614处包括突变的所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的Y144缺失、N501Y、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和D614G，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述SARS-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置501和614处的突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突变体包括刺突蛋白中的N501Y突变和D614G突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和D614G，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述SARS-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置484处的突变，如与SEQID NO:1相比在刺突蛋白中的E484K突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括变体谱系B.1.1.248，称作巴西变体。SARS-CoV-2的这种变体已命名为P.1谱系，具有17个独特的氨基酸变化，其中10个在其刺突蛋白中，包括N501Y和E484K。B.1.1.248源自B.1.1.28。E484K存在于B.1.1.28和B.1.1.248中。B.1.1.248具有许多S-蛋白多态性[L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I、V1176F]，并且在某些关键RBD位置(K417、E484、N501)与南非描述的变体相似。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述SARS-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置501和484处的突变，如与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中的N501Y突变和E484K突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述SARS-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置501、484和614处的突变，如与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中的N501Y突变、E484K突变和D614G突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和D614G，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中的L242/A243/L244缺失。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和缺失242-244，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I和K417N。与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置417处的突变，如与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中的K417N和K417T突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和K417N,，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I和缺失242-244。与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突变体，所述SARS-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中位置417和484和/或501处的突变，如与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中的K417N或K417T突变以及E484K和/或N501Y突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和K417N,，以及任选存在的与SEQ ID NO:1相比的突变：L18F、R246I和缺失242-244。与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突变体还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括变体谱系B.1.1.529，称作Omicron变体。这种变体具有大量突变,包括A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE(在氨基酸214后插入EPE)、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突变体，所述SARs-CoV-2刺突变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE(在氨基酸214后插入EPE)、G339D、S371L、S373P、S375F、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。在一些实施方案中，例如，如本文所述RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个或至少37个：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A、N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del、N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del、L141del、Y144F、Y145D、G142del。在一些实施方案中，例如，如本文所述RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或全部：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A。所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del，和/或可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突变体可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个或全部：L141del、Y144F、Y145D、G142del。在一些实施方案中，例如，如本文所述RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。在一些实施方案中，例如，如本文所述RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。在一些实施方案中，例如，如本文所述RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一些实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。在一些实施方案中，例如，如本文所述RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
与SEQ ID NO:1相比，本文所述的SARs-CoV-2刺突变体可以包括或不包括D614G突变。
SARs-CoV-2刺突变体可以具有“药物组合物的用途”一节中公开的一个或多个突变。
在本公开的一些实施方案中，抗原(如肿瘤抗原或疫苗抗原)优选作为单链、5'加帽的RNA(优选mRNA)给药，其在进入给药所述RNA的受试者细胞时翻译为相应的蛋白。优选地，RNA含有在稳定性和翻译效率方面为RNA的最大效力优化的结构元件(5'帽、5'UTR、3'UTR、poly(A)序列)。
在一些实施方案中，β-S-ARCA(D1)用作RNA的5'-末端的特异性加帽结构。在一实施方案中，m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG用作RNA的5'-末端的特异性加帽结构。在一些实施方案中，5'-UTR序列源自人α-珠蛋白mRNA，并且任选具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。在一些实施方案中，将源自“分裂的氨基末端增强子”(AES)mRNA(称作F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称作I)的两个序列元件的组合(FI元件)置于编码序列和poly(A)序列之间，以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。在一些实施方案中，将源自人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3'-UTR置于编码序列和poly(A)序列之间，以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。在一些实施方案中，使用长度为110个核苷酸的poly(A)序列，其由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基组成。设计这个poly(A)序列以增强RNA稳定性和翻译效率。
在下文中，描述了三种不同RNA平台的实施方案，每种RNA平台编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
一般来说，本文所述的疫苗RNA可以包含从5'至3'的以下结构之一：
帽-5'-UTR-疫苗抗原-编码序列-3'-UTR-Poly(A)
或
β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-疫苗抗原-编码序列-FI-A30L70。
一般来说，本文所述的疫苗抗原可以包含从N-末端至C-末端的以下结构之一：
信号序列-RBD-三聚结构域
或
信号序列-RBD-三聚结构域-跨膜结构域。
RBD和三聚结构域可以通过接头分开，特别是GS接头，如具有氨基酸序列GSPGSGSGS(SEQ ID NO:33)的接头。三聚结构域和跨膜结构域可以通过接头分开，特别是GS接头，如具有氨基酸序列GSGSGS(SEQ ID NO:34)的接头。
信号序列可以是如本文所述的信号序列。RBD可以是如本文所述的RBD结构域。三聚结构域可以是如本文所述的三聚结构域。跨膜结构域可以是如本文所述的跨膜结构域。
在一实施方案中，
信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16或1-19的氨基酸序列或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，或者与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，
RBD包含SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列，或者与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，
三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列或者SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或者与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列；并且
跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列，或者与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，
信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16或1-19的氨基酸序列或者SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，
RBD包含SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列，
三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；并且
跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列。
上述RNA或编码上述疫苗抗原的RNA可以是含有非修饰的尿苷的mRNA(uRNA)、核苷修饰的mRNA(modRNA)或自我扩增RNA(saRNA)。在一些实施方案中，上述RNA或编码上述疫苗抗原的RNA是核苷修饰的mRNA(modRNA)。
非修饰的尿苷信使RNA(uRNA)
非修饰的信使RNA(uRNA)的活性原理是在进入细胞时翻译的单链mRNA。除了编码冠状病毒疫苗抗原的序列(即开放阅读框)，每个uRNA优选含有在稳定性和翻译效率方面为RNA的最大效力进行优化的常见结构元件(5′-帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)-尾)。优选的5’帽结构是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2'-OGppSpG)。优选的5′-UTR和3′-UTR分别包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列和SEQ ID NO:13的核苷酸序列。优选的poly(A)-尾包含SEQ ID NO:14的序列。
这个平台的不同实施方案如下所示：
RBL063.1(SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
RBL063.2(SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162a1；RBL063.3(SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:5)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
在这方面，“hAg-Kozak”是指人α-珠蛋白mRNA的5'-UTR序列，具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率；“S1S2蛋白”/“S1S2 RBD”是指编码SARS-CoV-2的相应抗原的序列；“FI元件”是指3’-UTR是源自“分裂的氨基末端增强子”(AES)mRNA(称作F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称作I)的两个序列元件的组合。这些是通过对赋予RNA稳定性和增加总蛋白表达的序列进行离体选择而鉴定的；“A30L70”是指长度为110个核苷酸的poly(A)-尾，由一段30个腺苷残基，随后10个核苷酸接头序列和另外70个腺苷残基组成，设计为增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率；“GS”是指甘氨酸-丝氨酸接头，即编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列，通常用于融合蛋白。
核苷修饰的信使RNA(modRNA)
核苷修饰的信使RNA(modRNA)药物物质的活性原理也是在进入细胞时翻译的单链mRNA。除了编码冠状病毒疫苗抗原的序列(即开放阅读框)，每个modRNA含有如uRNA的为RNA的最大效力优化的常见结构元件(5′-帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)-尾)。与uRNA相比，modRNA含有1-甲基-假尿苷代替尿苷。优选的5’帽结构是m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。优选的5′-UTR和3′-UTR分别包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列和SEQ ID NO:13的核苷酸序列。优选的poly(A)-尾包含SEQ ID NO:14的序列。将额外的纯化步骤应用于modRNA以减少体外转录反应期间产生的dsRNA污染物。
这个平台的不同实施方案如下所示：
BNT162b2；RBP020.1(SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:7)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162b2；RBP020.2(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:7)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162b1；RBP020.3(SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:5)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，与次要纤维蛋白融合的S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
BNT162b3c(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-GS-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)，与融合至S1S2蛋白的跨膜结构域(TM)的次要纤维蛋白融合)；在抗原序列N-末端的固有S1S2蛋白分泌信号肽(aa 1-19)
BNT162b3d(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG-hAg-Kozak-RBD-GS-次要纤维蛋白-GS-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)，与融合至S1S2蛋白的跨膜结构域(TM)的次要纤维蛋白融合)；在抗原序列N-末端的免疫球蛋白分泌信号肽(aa 1-22)
自我扩增RNA(saRNA)
自我扩增mRNA(saRNA)药物物质的活性原理是单链RNA，其在进入细胞时自我扩增，此后翻译冠状病毒疫苗抗原。与优选编码单一蛋白的uRNA和modRNA相反，saRNA的编码区包含两个开放阅读框(ORF)。5’-ORF编码RNA依赖性RNA聚合酶如委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)RNA依赖性RNA聚合酶(复制酶)。复制酶ORF在3’之后是亚基因组启动子和编码抗原的第二ORF。此外，saRNAUTR含有自我扩增所需的5’和3’保守序列元件(CSE)。saRNA含有如uRNA的为RNA的最大效力优化的常见结构元件(5′-帽、5′-UTR、3′-UTR、poly(A)-尾)。saRNA优选含有尿苷。优选的5’帽结构是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2'-OGppSpG)。
saRNA的细胞质递送启动甲病毒样的生命周期。但是，saRNA不编码基因组包装或细胞进入所需的甲病毒结构蛋白，因此复制能力强的病毒颗粒的产生是几乎不可能的。复制不涉及产生DNA的任何中间步骤。因此saRNA的使用/摄入不会在靶细胞内造成基因组整合或其他永久性遗传修饰的风险。此外，saRNA本身通过dsRNA中间体的识别有效激活先天免疫应答来防止其持续复制。
这个平台的不同实施方案如下所示：
RBS004.1(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:7)
结构 β-S-ARCA(D1)-复制酶-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原 SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
RBS004.2(SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:7)
结构 β-S-ARCA(D1)-复制酶-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原 SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(S1S2全长蛋白，序列变体)
BNT162c1；RBS004.3(SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:5)
结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-RBD-GS-次要纤维蛋白-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
RBS004.4(SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28)
结构β-S-ARCA(D1)-复制酶-RBD-GS-次要纤维蛋白-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2的病毒刺突蛋白(S蛋白)(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))
此外，可以将分泌信号肽(sec)优选以sec翻译为N末端标签的方式与抗原编码区融合。在一些实施方案中，sec对应于S蛋白的分泌信号肽。通常用于融合蛋白的编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列可以用作GS/接头。
在一些实施方案中，编码抗原(如肿瘤抗原或疫苗抗原)的RNA(优选mRNA)在被治疗以提供抗原的受试者的细胞中表达。在一些实施方案中，RNA在受试者的细胞中瞬时表达。在一些实施方案中，RNA是体外转录的。在一些实施方案中，抗原的表达在细胞表面。在一些实施方案中，抗原在MHC的背景下表达和呈递。在一些实施方案中，抗原的表达是进入细胞外空间，即分泌抗原。
抗原分子或其加工产物，例如，其片段，可以与免疫效应细胞携带的抗原受体如BCR或TCR结合，或者与抗体结合。
根据本公开通过给药编码肽和蛋白抗原的RNA(如mRNA)提供给受试者的肽和蛋白抗原，其中所述抗原是疫苗抗原，优选在提供所述肽或蛋白抗原的受试者中导致诱导免疫应答，例如，体液和/或细胞免疫应答。所述免疫应答优选针对靶抗原。因此，疫苗抗原可以包含靶抗原、其变体或其片段。在一实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上等同于靶抗原。在本公开的上下文中，术语“抗原的片段”或“抗原的变体”表示导致诱导免疫应答的物质，所述免疫应答靶向所述抗原，即靶抗原。因此，疫苗抗原可以对应于或可以包含靶抗原，可以对应于或可以包含靶抗原的片段，或者可以对应于或可以包含与靶抗原或其片段同源的抗原。因此，根据本公开，疫苗抗原可以包含靶抗原的免疫原性片段或与靶抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开的“抗原的免疫原性片段”优选涉及能够诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原片段。疫苗抗原可以是重组抗原。
术语“在免疫学上等同”表示在免疫学上等同的分子，如在免疫学上等同的氨基酸序列表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学效应，例如，在免疫学效应的类型方面。在本公开的上下文中，关于用于免疫的抗原或抗原变体的免疫学效应或特性，优选使用术语“在免疫学上等同”。例如，如果氨基酸序列在暴露于受试者的免疫系统时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列在免疫学上等同于参考氨基酸序列。因此，在一些实施方案中，在免疫学上等同于抗原的分子在T细胞的刺激、引发和/或扩增方面表现出与T细胞靶向的抗原相同或基本上相同的特性和/或发挥相同或基本上相同的效应。
在一实施方案中，本公开中使用的RNA(优选mRNA)是非免疫原性的。可以根据本公开给药编码免疫刺激剂的RNA以提供辅助作用。编码免疫刺激剂的RNA可以是标准RNA或非免疫原性RNA。
如本文所用的术语“非免疫原性RNA”(如“非免疫原性mRNA”)是指这样的RNA，其在给药至例如哺乳动物时不会诱导免疫系统的应答，或者诱导的应答比不同之处仅在于尚未进行赋予非免疫原性RNA非免疫原性的修饰和处理的相同RNA诱导的弱，即，比标准RNA(stdRNA)诱导的弱。在某些实施方案中，非免疫原性RNA，在本文中也称为修饰的RNA(modRNA)，通过在RNA中掺入抑制RNA介导的先天免疫受体激活的修饰的核苷和/或限制双链RNA(dsRNA)的量，例如，通过限制双链RNA(dsRNA)的形成，例如，在体外转录期间，和/或通过去除双链RNA(dsRNA)，例如，在体外转录后，赋予非免疫原性。在某些实施方案中，通过在RNA中掺入抑制RNA介导的先天免疫受体激活的修饰的核苷和/或通过去除双链RNA(dsRNA)，例如，在体外转录后，赋予非免疫原性RNA非免疫原性。
为了通过掺入修饰的核苷赋予非免疫原性RNA(尤其是mRNA)非免疫原性，可以使用任何修饰的核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性。特别优选抑制RNA介导的先天免疫受体激活的修饰的核苷。在一些实施方案中，修饰的核苷包括用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷。在一实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。在一些实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、尿苷5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷5-氧乙酸甲基酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿苷(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲基酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒基-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2′-O-甲基-尿苷(Um)、5,2′-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2′-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2′-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2′-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2′-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2′-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2′-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2′-F-阿糖-尿苷、2′-F-尿苷、2′-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷以及5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。在一特别优选的实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，特别是N1-甲基-假尿苷。
在一些实施方案中，用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷包括置换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。
在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(IVT)合成mRNA(优选mRNA)期间，由于酶的非常规活性，产生大量异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白合成抑制。在通过体外转录(IVT)合成mRNA期间，可以限制dsRNA的形成，例如，通过限制合成期间三磷酸尿苷(UTP)的量。任选地，在合成mRNA期间可以添加UTP一次或几次。而且，可以使用无孔或多孔的C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)基质通过离子对反相HPLC从RNA如IVT RNA去除dsRNA。或者，可以使用基于酶的方法，使用特异性水解dsRNA但不水解ssRNA的大肠杆菌RNaseIII，从而从IVT RNA制品消除dsRNA污染物。此外，可以通过使用纤维素材料将dsRNA与ssRNA分开。在一实施方案中，在允许dsRNA与纤维素材料结合且不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件下，使RNA制品与纤维素材料接触，并且将ssRNA与纤维素材料分离。用于提供ssRNA的合适方法公开于例如WO 2017/1822524中。
当术语在本文中使用时，“去除(remove)”或“去除(removal)”是指将第一物质群体(如非免疫原性RNA)从临近第二物质群体(如dsRNA)分离的特征，其中第一物质群体不必完全没有第二物质，并且第二物质群体不必完全没有第一物质。然而，与第一和第二物质的未分离的混合物相比，以去除第二物质群体为特征的第一物质群体具有可测量的较低含量的第二物质。
在一些实施方案中，从非免疫原性RNA去除dsRNA(尤其是dsmRNA)包括去除dsRNA，从而非免疫原性RNA组合物中少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.3％或少于0.1％的RNA是dsRNA。在一实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)组合物包含单链核苷修饰的RNA的纯化制品。例如，在一些实施方案中，单链核苷修饰的RNA(尤其是mRNA)的纯化制品基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，纯化的制品是至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％单链核苷修饰的RNA。
各种方法可以用于确定dsRNA的量。例如，可以使样品与dsRNA特异性抗体接触，与RNA结合的抗体量可以作为样品中dsRNA量的度量。含有已知量的dsRNA的样品可以用作参考。
例如，可以将RNA点在膜上，例如，尼龙印迹膜。可以将膜封闭，例如，在含有5％(w/v)脱脂奶粉的TBS-T缓冲液(20mM TRIS pH 7.4,137mM NaCl,0.1％(v/v)TWEEN-20)中。对于dsRNA的检测，可以将膜与dsRNA特异性抗体温育，例如，dsRNA-特异性小鼠mAb(English&Scientific Consulting,Szirák,Hungary)。洗涤之后，例如，用TBS-T，可以将膜与二抗温育，例如，HRP缀合的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch,Cat#715-035-150)，并且可以检测二抗提供的信号。
在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)在细胞中比具有相同序列的标准RNA更有效地翻译。在一些实施方案中，相对于其未修饰的对应物，翻译增强2倍。在一些实施方案中，翻译增强3倍。在一些实施方案中，翻译增强4倍。在一些实施方案中，翻译增强5倍。在一些实施方案中，翻译增强6倍。在一些实施方案中，翻译增强7倍。在一些实施方案中，翻译增强8倍。在一些实施方案中，翻译增强9倍。在一些实施方案中，翻译增强10倍。在一些实施方案中，翻译增强15倍。在一些实施方案中，翻译增强20倍。在一些实施方案中，翻译增强50倍。在一些实施方案中，翻译增强100倍。在一些实施方案中，翻译增强200倍。在一实施方案中，翻译增强500倍。在一些实施方案中，翻译增强1000倍。在一些实施方案中，翻译增强2000倍。在一些实施方案中，系数是10-1000倍。在一些实施方案中，系数是10-100倍。在一些实施方案中，系数是10-200倍。在一些实施方案中，系数是10-300倍。在一些实施方案中，系数是10-500倍。在一些实施方案中，系数是20-1000倍。在一些实施方案中，系数是30-1000倍。在一些实施方案中，系数是50-1000倍。在一些实施方案中，系数是100-1000倍。在一些实施方案中，系数是200-1000倍。在一些实施方案中，翻译增强任何其他显著量或量的范围。
在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)表现出比具有相同序列的标准RNA显著更低的先天免疫原性。在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)表现出比其未修饰的对应物少2倍的先天免疫应答。在一些实施方案中，先天免疫原性降低3倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低4倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低5倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低6倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低7倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低8倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低9倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低10倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低15倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低20倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低50倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低100倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低200倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低500倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低1000倍。在一些实施方案中，先天免疫原性降低2000倍。
术语“表现出显著更低的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的减少。在一些实施方案中，该术语是指减少，使得可以给药有效量的非免疫原性RNA(尤其是mRNA)而不触发可检测的先天免疫应答。在一些实施方案中，该术语是指减少，使得可以重复给药非免疫原性RNA(尤其是mRNA)而不引发足以可检测地减少非免疫原性RNA编码的蛋白产生的先天免疫应答。在一些实施方案中，减少使得可以重复给药非免疫原性RNA(尤其是mRNA)而不引发足以消除非免疫原性RNA编码的蛋白的可检测产生的先天免疫应答。
“免疫原性”是外来物质如RNA在人或其他动物体内引起免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统的组成部分，其是相对非特异性和即时的。它和适应性免疫系统一起是脊椎动物免疫系统的两个主要组成部分之一。
如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统或者在其内部产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或者在其外部产生的任何物质。
如本文所用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指两个或更多个元件或组件或结构域连接在一起。
颗粒
本文所述的核酸如RNA，特别是mRNA，可以存在于颗粒中，所述颗粒包含(i)核酸，以及(ii)至少一种阳离子或阳离子可电离的化合物如聚合物或脂质，络合核酸。
先前已描述了不同类型的含有RNA的颗粒适合递送颗粒形式的RNA(参见，例如，Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒RNA递送媒介物，RNA的纳米颗粒封装在物理上保护RNA免于降解，并且根据特定的化学，可以辅助细胞摄取和内体逃逸。
带正电荷的分子如聚合物和脂质与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。
在制备过程中，将RNA的水溶液引入含有阳离子可电离脂质的乙醇脂质混合物中，例如，pH为5时，导致带负电荷的RNA药物物质和带正电荷的阳离子可电离脂质之间的静电相互作用。这种静电相互作用导致颗粒形成，同时有效封装RNA药物物质。在RNA封装后，将所得的RNA-LNP周围的介质调节至例如pH 8，导致LNP上的表面电荷中和。当所有其他变量保持不变时，与带电荷的颗粒相比，电荷中性颗粒表现出更长的体内循环寿命，并且更好地递送至肝细胞，而带电荷的颗粒会被网状内皮系统迅速清除。当核内体摄取时，核内体的低pH使LNP融合并允许将RNA释放到靶细胞的细胞质中。
在本公开的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体，特别是形成颗粒的化合物。在一些实施方案中，颗粒含有由一种或多种类型的两亲物质(例如，两亲脂质、两亲聚合物和/或两亲蛋白/多肽)制成的包膜(例如，一个或多个层或薄层)。在这个上下文中，表述“两亲物质”表示所述物质具有亲水性和亲脂性特性。包膜还可以包含不必是两亲性的额外物质(例如，其他脂质和/或其他聚合物)。因此，颗粒可以是单层或多层结构，其中构成一个或多个层或薄层的物质包含一种或多种类型的两亲物质(特别是选自两亲脂质、两亲聚合物和/或两亲蛋白/多肽)，任选与不必是两亲性的额外物质(例如，其他脂质和/或其他聚合物)组合。在一些实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米大小的结构，如微米或纳米大小的致密结构。在这方面，术语“微米大小”表示颗粒的所有三个外部尺寸都在微米级别，即在1和5μm之间。根据本公开，术语“颗粒”包括脂质复合物颗粒(lipoplex particle，LPX)、脂质纳米颗粒(LNP)、多聚复合物颗粒、脂质多聚复合物颗粒、病毒样颗粒(VLP)和它们的混合物(例如，两种或更多种颗粒类型的混合物，如LPX和VLP的混合物或者LNP和VLP的混合物)。
“核酸颗粒”可以用于将核酸(如RNA，特别是mRNA)递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可以由至少一种阳离子或阳离子可电离脂质或脂质样物质、至少一种阳离子聚合物如鱼精蛋白或其混合物以及核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米颗粒(LNP)和基于脂质复合物(LPX)的制剂。
不受任何理论的束缚，据信阳离子或阳离子可电离脂质或脂质样物质和/或阳离子聚合物与核酸组合在一起形成聚集体，并且这种聚集导致胶体稳定的颗粒。在一些实施方案中，颗粒包含两亲脂质，特别是阳离子或阳离子可电离的两亲脂质，以及如本文所述的RNA(尤其是mRNA)。在一些实施方案中，颗粒包含或由本文公开的阳离子/阳离子可电离脂质(特别是本文公开的式(X)的阳离子可电离脂质；具有本文公开的结构A至G之一的阳离子可电离脂质；或本文公开的式(XI)的阳离子可电离脂质)和辅助脂质组成，如聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇(PEG)脂质；或者聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)；中性脂质(如磷脂)；类固醇(如胆固醇)；以及它们的组合。在一些实施方案中，在本文所述的RNA颗粒中，RNA(特别是mRNA)与阳离子可电离脂质(特别是本文公开的式(X)的阳离子可电离脂质；具有本文公开的结构A至G之一的阳离子可电离脂质；或本文公开的式(XI)的阳离子可电离脂质)结合，在LNP的情况下，占据LNP的中心核心。在一些实施方案中，聚合物缀合脂质(例如，PEG脂质；或者聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)与磷脂一起形成颗粒(如LNP)的表面。在一些实施方案中，表面包含双层。在一些实施方案中，带电荷和不带电荷形式的胆固醇和阳离子可电离脂质(特别是本文公开的式(X)的阳离子可电离脂质；具有本文公开的结构A至G之一的阳离子可电离脂质；或本文公开的式(XI)的阳离子可电离脂质)可以分布在整个颗粒如LNP中。
一般来说，脂质复合物(LPX)可通过混合两种水相获得，即包含RNA的相和包含脂质分散体的相。在一些实施方案中，脂质相包含脂质体。
在一些实施方案中，脂质体是自我封闭的单层或多层囊泡颗粒，其中片层包含脂质双层，封装的内腔包含水相。使用脂质体形成纳米颗粒的先决条件是混合物中所需的脂质能够在应用的水性环境中形成层状(双层)相。
在一些实施方案中，脂质体包含单层或多层磷脂双层，包裹水性核心(在本文中也称作水性内腔)。它们可以由具有极性头部(亲水)基团和非极性尾部(疏水)基团的材料制备而成。在一些实施方案中，配制设计用于递送核酸的脂质体中采用的阳离子脂质具有两亲性，由带正电荷的(阳离子)胺头基通过甘油连接至碳链或胆固醇衍生物组成。
在一些实施方案中，脂质复合物是基于多层脂质体的制剂，是由阳离子脂质体与RNA的静电相互作用形成的。在一些实施方案中，形成的脂质复合物具有独特的分子内部排列，这是由脂质体结构转化为紧密的RNA–脂质复合物所引起的。在一些实施方案中，这些制剂的特征在于对RNA的包裹性差，对RNA的包裹不完全。
在一些实施方案中，LPX颗粒包含两亲脂质，特别是阳离子或阳离子可电离的两亲脂质，以及如本文所述的RNA(尤其是mRNA)。在一些实施方案中，带正电荷的脂质体(由一种或多种两亲脂质，特别是阳离子或阳离子可电离的两亲脂质制成)和带负电荷的RNA(尤其是RNA)之间的静电相互作用导致RNA脂质复合物颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体一般可以使用阳离子或阳离子可电离的两亲脂质合成，如式(I)的阳离子可电离脂质，DOTMA和/或DODMA，以及其他脂质，如DOPE或DSPC。在一些实施方案中，RNA(尤其是mRNA)脂质复合体颗粒是纳米颗粒。
一般来说，脂质纳米颗粒(LNP)可通过将水相中的RNA与包含有机溶剂如乙醇的相中的脂质直接混合而获得。在这种情况下，脂质或脂质混合物可以用于颗粒形成，它们在水中不会形成层状(双层)相。
在一些实施方案中，本文所述的颗粒除了阳离子可电离脂质之外进一步包含至少一种脂质或脂质样物质。
在一些实施方案中，核酸颗粒(尤其是RNA颗粒，如RNA-LNP(例如，mRNA颗粒，如mRNA-LNP))包含一种以上类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可以彼此相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构元件，如分子结构、加帽、编码区或其他特征。
在一些实施方案中，本文所述的RNA(例如，mRNA)可以与如本文所述的颗粒非共价结合。在一些实施方案中，RNA(尤其是mRNA)可以粘附至颗粒的外表面(表面RNA(尤其是表面mRNA))和/或可以包含在颗粒中(包裹的RNA(尤其是包裹的mRNA))。
如本公开所用，“纳米颗粒”是指包含如本文所述的核酸(尤其是RNA如mRNA)和至少一种阳离子脂质的颗粒，其中所述颗粒的所有三个外部尺寸都在纳米级别，即，至少约1nm和低于约1000nm(优选地，在10至990nm之间，如在15至900nm之间，在20至800nm之间，在30至700nm之间，在40至600nm之间或在50至500nm之间)。优选地，最长轴和最短轴没有显著差异。优选地，颗粒的大小是它的直径。
本文所述的核酸颗粒(尤其是RNA颗粒，如mRNA颗粒)可以呈现出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或小于约0.05的多分散性指数(PDI)。举例来说，核酸颗粒可以呈现出在约0.01至约0.4或约0.1至约0.3范围内的多分散性指数。
在本公开的上下文中，术语“脂质复合物(lipoplex)颗粒”涉及含有两亲脂质，特别是阳离子两亲脂质和如本文所述的核酸(尤其是RNA如mRNA)的颗粒。带正电荷的脂质体(由一种或多种两亲脂质，特别是阳离子两亲脂质制成)和带负电荷的核酸(尤其是RNA如mRNA)之间的静电相互作用导致核酸脂质复合物颗粒的络合和自发形成。带正电荷的脂质体一般可以使用阳离子两亲脂质如DOTMA和其他脂质如DOPE合成。在一实施方案中，核酸(尤其是RNA如mRNA)脂质复合物颗粒是纳米颗粒。
术语“脂质纳米颗粒”涉及纳米大小的含有脂质的颗粒。
在本公开的上下文中，术语“多聚复合物(polyplex)颗粒”涉及含有两亲聚合物，特别是阳离子两亲聚合物和如本文所述的核酸(尤其是RNA如mRNA)的颗粒。带正电荷的阳离子两亲聚合物和带负电荷的核酸(尤其是RNA如mRNA)之间的静电相互作用导致核酸多聚复合物颗粒的络合和自发形成。适合用于制备多聚复合物颗粒的带正电荷的两亲聚合物包括鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚-L-赖氨酸、聚-L-精氨酸和组蛋白。在一实施方案中，核酸(尤其是RNA如mRNA)多聚复合物颗粒是纳米颗粒。
术语“脂质多聚复合物(lipopolyplex)颗粒”涉及含有如本文所述的两亲脂质(特别是阳离子两亲脂质)、如本文所述的两亲聚合物(特别是阳离子两亲聚合物)和如本文所述的核酸(尤其是RNA如mRNA)的颗粒。在一实施方案中，核酸(尤其是RNA如mRNA)脂质多聚复合物颗粒是纳米颗粒。
术语“病毒样颗粒”(在本文中缩写为VLP)是指与病毒非常相似的分子，但不含有所述病毒的任何遗传物质并因此是非感染性的。优选地，VLP含有如本文所述的核酸(优选RNA)，所述核酸(优选RNA)与衍生VLP的病毒是异源的。VLP可以通过病毒结构蛋白的单独表达合成，所述病毒结构蛋白然后可以自组装成病毒样结构。在一实施方案中，来自不同病毒的结构衣壳蛋白的组合可以用于产生重组VLP。VLP可以制备自多种病毒家族的组分，包括乙型肝炎病毒(HBV)(小HBV衍生的表面抗原(HBsAg))、细小病毒科(例如，腺相关病毒)、乳头瘤病毒科(例如，HPV)、逆转录病毒科(例如，HIV)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)和噬菌体(例如Qβ、AP205)。
术语“含有核酸的颗粒”涉及如本文所述的与核酸(尤其是RNA如mRNA)结合的颗粒。在这方面，核酸(尤其是RNA如mRNA)可以粘附至颗粒的外表面(表面核酸(尤其是表面RNA如表面mRNA))和/或可以包含在颗粒中(包裹的核酸(尤其是包裹的RNA)如包裹的mRNA)。
在一实施方案中，本公开的方法和用途中利用的颗粒的大小(优选直径，即，半径的两倍，例如回转半径(Rg)值的两倍或流体动力学半径的两倍)在约10至约2000nm的范围内，如至少约15nm(优选至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm或至少约100nm)和/或至多1900nm(优选至多约1900nm、至多约1800nm、至多约1700nm、至多约1600nm、至多约1500nm、至多约1400nm、至多约1300nm、至多约1200nm、至多约1100nm、至多约1000nm、至多约950nm、至多约900nm、至多约850nm、至多约800nm、至多约750nm、至多约700nm、至多约650nm、至多约600nm、至多约550nm或至多约500nm)，优选在约20至约1500nm的范围内，如约30至约1200nm、约40至约1100nm、约50至约1000、约60至约900nm、约70至800nm、约80至700nm、约90至600nm、或者约50至500nm或约100至500nm，如在10至1000nm、15至500nm、20至450nm、25至400nm、30至350nm、40至300nm、50至250nm、60至200nm或70至150nm的范围内。
在一些实施方案中，本文所述的颗粒(例如，LNP和LPX)的平均直径在一些实施方案中为约50nm至约1000nm、约50nm至约800nm、约50nm至约700nm、约50nm至约600nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约100nm至约1000nm、约100nm至约800nm、约100nm至约700nm、约100nm至约600nm、约100nm至约500nm、约100nm至约450nm、约100nm至约400nm、约100nm至约350nm、约100nm至约300nm、约100nm至约250nm、约100nm至约200nm、约150nm至约1000nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约150nm至约500nm、约150nm至约450nm、约150nm至约400nm、约150nm至约350nm、约150nm至约300nm、约150nm至约250nm、约150nm至约200nm、约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约200nm至约700nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、约200nm至约450nm、约200nm至约400nm、约200nm至约350nm、约200nm至约300nm或约200nm至约250nm。
关于RNA脂质颗粒(尤其是RNALNP如mRNALNP)，N/P比例给出脂质中的氮基团与RNA中的磷酸基团数量的比例。它与电荷比例有关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电荷，而磷酸基团带负电荷。当存在电荷平衡时，N/P比例取决于pH。脂质制剂通常以大于4最多12的N/P比例形成，因为认为带正电荷的纳米颗粒有利于转染。在这种情况下，认为RNA与纳米颗粒完全结合。
本文所述的核酸颗粒(尤其是RNA颗粒如mRNA颗粒)可以使用广泛的方法制备，所述方法可以包括从至少一种阳离子或阳离子可电离脂质和/或至少一种阳离子聚合物获得胶体，并且将胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。
如本文所用的术语“胶体”涉及一种类型的均匀混合物，其中分散的颗粒不会沉淀。混合物中的不溶性颗粒是微观的，粒径在1至1000纳米之间。混合物可以称为胶体或胶体悬浮液。有时术语“胶体”仅指混合物中的颗粒而不是整个悬浮液。
为了制备包含至少一种阳离子或阳离子可电离脂质和/或至少一种阳离子聚合物的胶体，常规用于制备脂质体囊泡并适当调整的方法可适用于本文。制备脂质体囊泡的最常用方法共有以下基本阶段：(i)将脂质溶于有机溶剂中，(ii)干燥所得的溶液，以及(iii)将干燥的脂质水合(使用各种含水介质)。
在膜水合方法中，首先将脂质溶于合适的有机溶剂中，然后干燥以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的含水介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可以包括额外的缩小步骤。
反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的可选方法，其包括在水相和含有脂质的有机相之间形成油包水乳液。为了系统均质化，需要对这种混合物进行简短的超声处理。在减压下去除有机相产生乳状凝胶，其随后变为脂质体悬浮液。
术语“乙醇注射技术”是指一个过程，其中通过针头将包含脂质的乙醇溶液快速注射至水溶液中。这个行为将脂质分散在整个溶液中，并且促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成如脂质体形成。一般来说，本文所述的核酸(尤其是RNA如mRNA)脂质复合物颗粒可通过将核酸(尤其是RNA如mRNA)添加至胶体脂质体分散体来获得。使用乙醇注射技术，在一实施方案中，如下所述形成这种胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质，如阳离子可电离脂质(如本文公开的式(X)的阳离子可电离脂质；具有本文公开的结构A至G之一的阳离子可电离脂质；DOTMA和/或DODMA)和其他脂质(如聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇(PEG)脂质；或者聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)；中性脂质(如磷脂)；类固醇(如胆固醇)；以及组合)的乙醇溶液注射至水溶液中。在一些实施方案中，本文所述的核酸(尤其是RNA如mRNA)脂质复合物颗粒无需挤出步骤即可获得。
术语“挤出(extruding)”或“挤出(extrusion)”是指产生具有固定横截面轮廓的颗粒。特别地，其是指颗粒的缩小，由此迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。
具有不含有机溶剂特征的其他方法也可以根据本公开用于制备胶体。
LNP通常包含四种组分：可电离的阳离子脂质，中性脂质如磷脂，类固醇如胆固醇和聚合物缀合脂质。每种组分负责有效载荷保护，并且实现高效的细胞内递送。LNP可以通过将溶于乙醇的脂质与含水缓冲液中的核酸快速混合来制备。虽然本文所述的RNA颗粒可以包含聚合物缀合脂质如PEG脂质，或肌氨酸化脂质，但本文还提供RNA颗粒，其不包含(i)PEG脂质，或不包含(ii)肌氨酸化脂质，或者不包含(i)和(ii)的任何组合。在一些实施方案中，RNA颗粒不包含任何聚合物缀合脂质(换句话说，这些RNA颗粒基本上不含聚合物缀合脂质)。
先前已描述了不同类型的含有核酸的颗粒适合递送颗粒形式的核酸(参见，例如，Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒核酸递送媒介物，核酸的纳米颗粒包裹在物理上保护核酸免于降解，并且根据特定的化学，可以辅助细胞摄取和内体逃逸。
在一优选实施方案中，本文所述的包含RNA和至少一种阳离子可电离脂质的LNP进一步包含一种或多种其他脂质。
在一些实施方案中，通过以下步骤制备本文所述的包含RNA和至少一种阳离子可电离脂质的LNP：(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；(b)制备乙醇溶液，其包含所述阳离子可电离脂质以及，如果存在，一种或多种其他脂质；(c)将在(a)中制备的RNA溶液与在(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在包含第一缓冲系统的第一水相中的LNP的第一中间制剂；以及(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤在(c)中制备的第一中间制剂，从而制备包含分散在包含最终缓冲系统的最终水相中的LNP的制剂。在步骤(c)之后，可以进行选自稀释和过滤的一个或多个步骤，如切向流过滤或渗滤。在一些实施方案中，第一缓冲系统不同于最终缓冲系统。在可选的实施方案中，第一缓冲系统和最终缓冲系统相同。
在一些实施方案中，本文所述的包含RNA和至少一种阳离子可电离脂质的LNP是通过以下步骤制备的：(a’)在水相中制备阳离子可电离脂质与(如果存在的话)一种或多种其他脂质的脂质体或胶体制剂；(b’)制备含有水和缓冲系统的RNA溶液；以及(c’)将根据(a’)制备的脂质体或胶体制剂与根据(b’)制备的mRNA溶液混合。在步骤(c’)之后，可以进行选自稀释和过滤的一个或多个步骤，如切向流过滤。
本公开描述了组合物，其包含RNA(尤其是mRNA)和至少一种与所述RNA结合形成核酸颗粒的阳离子可电离脂质。RNA颗粒可以包含通过非共价相互作用以不同形式与颗粒复合的RNA。本文所述的颗粒不是病毒颗粒，特别不是感染性病毒颗粒，即它们不能病毒式地感染细胞。
合适的阳离子可电离脂质是那些形成核酸颗粒的脂质，并且涵盖在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”定义下。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸结合形成核酸颗粒的任何组分。这类组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。
在一些实施方案中，RNA颗粒(尤其是mRNA颗粒)包含一种以上类型的核酸分子，其中RNA分子的分子参数可以彼此相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构元件如分子结构、加帽、编码区或其他特征。
在微粒制剂中，有可能将每种RNA种类分别配制为单独的微粒制剂。在这种情况下，每种单独的微粒制剂会包含一种RNA种类。单个微粒制剂可以作为单独的实体存在，例如在单独的容器中。这类制剂可通过分别提供每种RNA种类(通常每种以含有RNA的溶液形式)连同颗粒形成剂，从而允许形成颗粒来获得。各自的颗粒会只含有在形成颗粒时提供的特定RNA种类(单独的微粒制剂)。在一些实施方案中，组合物如药物组合物包含一种以上单独的颗粒制剂。各自的药物组合物称作混合微粒制剂。根据本公开的混合微粒制剂可通过分别形成单独的微粒制剂，然后混合单独的微粒制剂的步骤获得。通过混合的步骤，可获得包含含有RNA颗粒的混合群体的制剂。单独的微粒群体可以一起在一个容器中，包含单独的微粒制剂的混合群体。或者，有可能将药物组合物的所有RNA种类一起配制为组合的微粒制剂。这类制剂可通过提供所有RNA种类的组合制剂(通常是组合溶液)连同颗粒形成剂，从而允许形成颗粒来获得。与混合微粒制剂相反，组合微粒制剂通常包含颗粒，所述颗粒包含一种以上的RNA种类。在组合微粒组合物中，不同的RNA种类通常一起存在于单个颗粒中。
脂质
术语“脂质”和“脂质样物质”在本文中广泛定义为包含一个或多个疏水部分或基团以及任选还包含一个或多个亲水部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也常表示为两亲物。脂质通常不溶或难溶于水，但是可溶于许多有机溶剂。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装为有组织的结构和不同的相。其中一个相由脂质双层组成，因为它们存在于水性环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中。可以通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂肪烃基团以及被一个或多个芳基、脂环基团或杂环基团取代的这类基团。亲水基团可以包含极性和/或带电荷的基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似基团。
如本文所用，术语“疏水”是指在水溶液中基本上不互溶或不溶的任何分子、部分或基团。术语疏水基团包括具有至少6个碳原子的碳氢化合物。碳氢化合物的一价基团在本文中称作烃基。疏水基团可以具有官能团(例如，醚、酯、卤化物等)以及碳和氢以外的原子，只要该基团满足在水溶液中基本上不互溶或不溶的条件。
术语“碳氢化合物”包括非环状的，例如，线性(直链)或支化的烃基，如本文定义的烷基、烯基或炔基。应当理解烷基、烯基或炔基中的一个或多个氢原子可以被其他原子取代，例如，卤素、氧或硫。除非另有说明，碳氢化合物基团还可以包括环状(烷基、烯基或炔基)基团或芳基，条件是碳氢化合物的整体极性保持相对非极性。
如本文所用，术语“两亲性”是指同时具有极性部分和非极性部分的分子。通常，两亲性化合物具有连接至疏水性长尾的极性头基。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。此外，极性部分可以具有形式正电荷或形式负电荷。或者，极性部分可以具有形式正电荷和负电荷，并且是两性离子或内盐。为了本公开的目的，两亲性化合物可以是但不限于一种或多种天然或非天然脂质和脂质样化合物。
术语“脂质样物质”、“脂质样化合物”或“脂质样分子”涉及在结构和/或功能上与脂质相关但在严格意义上可能不视为脂质的物质。例如，该术语包括在水性环境中存在于囊泡、多层/单层脂质体或膜中时能够形成两亲性层的化合物，并且包括表面活性剂或者同时具有亲水和疏水部分的合成化合物。一般来说，该术语是指分子，其包含具有不同结构组织的亲水和疏水部分，其可以与脂质结构组织相似或不相似。能够自发整合至细胞膜中的脂质样化合物的实例包括功能性脂质构建体如合成的功能-间隔子-脂质构建体(FSL)、合成的功能-间隔子-固醇构建体(FSS)以及人工两亲分子。包含两条长烷基链和一个极性头基的脂质一般为圆柱形。两条烷基链占据的面积与极性头基占据的面积相似。这类脂质作为单体溶解度低，倾向于聚集成不溶于水的平面双层。仅包含一条线性烷基链和一个亲水头基的传统表面活性剂单体一般呈锥形。亲水头基倾向于比线性烷基链占据更多的分子空间。在一些实施方案中，表面活性剂倾向于聚集成水溶性的球形或椭圆形胶束。虽然脂质也具有与表面活性剂相同的一般结构-极性亲水头基和非极性疏水尾-但脂质与表面活性剂的不同之处在于单体的形状、溶液中形成的聚集体的类型以及聚集所需的浓度范围。如本文所用，术语“脂质”解释为涵盖脂质和脂质样物质，除非本文另有说明或明显与上下文矛盾。
可以包括在两亲性层中的两亲性化合物的具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘酯。
在某些实施方案中，两亲性化合物是脂质。术语“脂质”是指一组有机化合物，其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。一般来说，脂质可以分为八类：脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(衍生自酮酰基亚基的缩合)、固醇脂质和异戊烯醇脂质(衍生自异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称作甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖分子如脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、单甘油酯和磷脂)，以及类固醇，即含有固醇的代谢物如胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的实例包括但不限于胆固烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪固醇、胆固醇基-2'-羟乙基醚、胆固醇基-4'-羟基丁基醚、生育酚及其衍生物，以及它们的混合物。
脂肪酸或脂肪酸残基是由以羧酸基团终止的烃链组成的一组多样化分子；这种排列赋予分子极性、亲水性末端，以及不溶于水的非极性、疏水性末端。碳链的长度通常为4-24个碳原子之间，可以是饱和或不饱和的，并且可以连接至包含氧、卤素、氮和硫的官能团。如果脂肪酸含有双键，则可能存在顺式或反式几何异构现象，这会显著影响分子的构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，这是与链中更多双键复合(compounded)的效应。脂肪酸类别中的其他主要脂质类别是脂肪酯和脂肪酰胺。
甘油脂由单取代、双取代和三取代的甘油组成，最著名的是甘油的脂肪酸三酯，称作甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常被不同脂肪酸各自酯化。甘油脂的其他亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在一个或多个通过糖苷键连接至甘油的糖残基。
甘油磷脂是两亲性分子(同时含有疏水区和亲水区)，其含有甘油核心，所述甘油核心通过酯键连接至两个脂肪酸衍生的“尾部”，并且通过磷酸酯键连接至一个“头部”基团。甘油磷脂通常称作磷脂(尽管鞘磷脂也归类为磷脂)，其实例是磷脂酰胆碱(也称作PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。
鞘脂是一个复杂的化合物家族，其享有一个共同结构特征，鞘氨醇碱基骨架。哺乳动物中的主要鞘氨醇碱基通常称作鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱基)是鞘氨醇碱基衍生物的主要亚类，其具有酰胺连接的脂肪酸。脂肪酸通常是饱和或单不饱和的，具有16-26个碳原子的链长度。哺乳动物的主要磷酸鞘酯是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要含有神经酰胺磷酸乙醇胺，真菌则具有植物神经酰胺磷酸肌醇和含有甘露糖的头基。鞘糖脂是一个多样化的分子家族，其由一个或多个糖残基通过糖苷键连接至鞘氨醇碱基组成。这些的实例是简单和复杂的鞘糖脂如脑苷脂和神经节苷脂。
固醇脂质，如胆固醇及其衍生物，或者生育酚及其衍生物，与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。
糖脂描述了其中脂肪酸直接连接至糖骨架，形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖取代甘油脂和甘油磷脂中存在的甘油骨架。最熟知的糖脂是革兰氏阴性细菌中脂多糖的脂质A组分的酰化氨基葡萄糖前体。典型的脂质A分子是氨基葡萄糖的二糖，其衍生有多达七条脂肪-酰基链。在大肠杆菌生长中所需的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，这是一种六酰化的氨基葡萄糖二糖，其被两个3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸(Kdo)残基糖基化。
聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合成酶具有相同机制特征的迭代和多模块酶聚合乙酰基和丙酰基亚基合成的。它们包含大量来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的次级代谢物和天然产物，并且具有很大的结构多样性。许多聚酮是环状分子，其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰。
阳离子可电离脂质
本文所述的RNA组合物和本文所述的核酸颗粒(尤其是RNALNP)包含至少一种阳离子可电离脂质作为颗粒形成剂。本文中预期使用的阳离子可电离脂质包括任何能够静电结合核酸的阳离子可电离脂质或脂质样物质。在一实施方案中，本文中预期使用的阳离子可电离的脂质可以与核酸结合，例如通过与核酸形成复合物或者形成其中包封或包裹核酸的囊泡。
如本文所用，“阳离子脂质”或“阳离子脂质样物质”是指具有净正电荷的脂质或脂质样物质。阳离子脂质或脂质样物质通过静电相互作用结合带负电荷的核酸。一般来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，如固醇、酰基链、二酰基或更多个酰基链，并且脂质的头基通常携带正电荷。
在某些实施方案中，阳离子脂质或脂质样物质仅在某些pH下，特别是在酸性pH下具有净正电荷，而在不同的、优选更高的pH如生理pH下，其优选没有净正电荷，优选没有电荷，即，其是中性的。与在生理pH下保持阳离子的颗粒相比，认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。
如本文所用，“阳离子可电离脂质”是指具有净正电荷或中性的脂质或脂质样物质，即非永久阳离子的脂质。因此，取决于溶解阳离子可电离脂质的组合物的pH，阳离子可电离脂质是带正电荷的或中性的。为了本公开的目的，除非与环境矛盾，否则术语“阳离子脂质”包含这类“阳离子可电离”脂质。
在一实施方案中，阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括优选在生理条件下至少一个带正电荷或能够质子化的氮原子(N)。
阳离子脂质的实例包括但不限于N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(DODMA)、1,2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、3-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基氮鎓(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、l,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴铵(DORIE)、和2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺羧酰胺)乙基]-N,N-二甲基-l-丙三氟乙酸铵(DOSPA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基(dilinolenyloxy)-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、双十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁基-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5′-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3′-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9′,12′-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N′-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N′-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、三十七烷基(heptatriaconta)-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙铵(DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯基氧基)-1-溴化丙铵(GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-溴化丙铵(GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙铵(GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙铵(βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰氧基)丙烷-1-铵(DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆固醇-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烯-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、2,3-双(十二烷氧基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-溴铵(DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)丙烷-1-溴铵(DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8'-((((2(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮杂二基)-二辛酸酯(ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)丙-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)-氧基)十七烷二酸酯(L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基-氨基)丙酰胺(lipidoid 98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoid C12-200)。优选DODMA、DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在具体的实施方案中，阳离子或阳离子可电离脂质是DODMA。
DOTMA是具有季胺头基的阳离子脂质。DOTMA的结构可以表示如下：
DODMA是具有叔胺头基的可电离阳离子脂质。DODMA的结构可以表示如下：
在某些实施方案中，组合物包含阳离子可电离脂质。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括优选在生理条件下至少一个带正电荷或能够质子化的氮原子(N)。
阳离子可电离脂质的实例公开于例如WO 2016/176330和WO 2018/078053中。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(X)的结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L10和L20之一是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L10和L20中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-12亚烯基；
G3是C1-24亚烷基、C2-24亚烯基、C3-8环亚烷基或C3-8环亚烯基；
Ra是H或C1-12烷基；
R35和R36各自独立地是C6-24烷基或C6-24烯基；
R37是H、OR50、CN、-C(＝O)OR40、-OC(＝O)R40或–NR50C(＝O)R40；
R40是C1-12烷基；
R50是H或C1-6烷基；并且
x是0、1或2。
在式(X)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(XA)或(XB)之一：
其中：
A是3-8元环烷基或环亚烷基基团；
在每次出现时，R60独立地是H、OH或C1-C24烷基；
n1是1-15的整数。
在式(X)的一些前述实施方案中，脂质具有结构(XA)，而在其他实施方案中，脂质具有结构(XB)。
在式(X)的其他实施方案中，脂质具有以下结构(XC)或(XD)之一：
其中y和z各自独立地是1-12的整数。
在式(X)的任何前述实施方案中，L10和L20之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L10和L2各自是-O(C＝O)-。在前述任一项的一些不同实施方案中，L10和L20各自独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L10和L20各自是-(C＝O)O-。
在式(X)的一些不同实施方案中，脂质具有以下结构(XE)或(XF)之一：
在式(X)的一些前述实施方案中，脂质具有以下结构(XG)、(XH)、(XJ)或(XK)之一：
在式(X)的一些前述实施方案中，n1是2-12的整数，例如2-8或2-4。例如，在一些实施方案中，n1是3、4、5或6。在一些实施方案中，n1是3。在一些实施方案中，n1是4。在一些实施方案中，n1是5。在一些实施方案中，n1是6。
在式(X)的一些其他前述实施方案中，y和z各自独立地是2-10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4-9或4-6的整数。
在式(X)的一些前述实施方案中，R60是H。在其他前述实施方案中，R60是C1-C24烷基。在其他实施方案中，R60是OH。
在式(X)的一些实施方案中，G3是未取代的。在其他实施方案中，G3是取代的。在各种不同实施方案中，G3是线性C1-C24亚烷基或线性C2-C24亚烯基。
在式(X)的一些其他前述实施方案中，R35或R36或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R35和R36各自独立地具有以下结构：
其中：
在每次出现时，R7a和R7b独立地是H或C1-C12烷基；并且
a是2-12的整数，
其中各自选择R7a、R7b和a，从而R35和R36各自独立地包含6-20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5-9或8-12的整数。
在式(X)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，在每次出现时R7a是H。在前述其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(X)的不同实施方案中，R35或R36或两者具有以下结构之一：
在式(X)的一些前述实施方案中，R37是OH、CN、-C(＝O)OR40、-OC(＝O)R40或-NHC(＝O)R40。在一些实施方案中，R40是甲基或乙基。
在各种不同实施方案中，式(X)的阳离子脂质具有以下所示结构之一。
/>
/>
在各种不同实施方案中，阳离子可电离脂质具有下表所示的结构之一。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(XI)的结构：
其中
R1和R2中的每一个独立地是R5或-G1-L1-R6，其中R1和R2中至少一个是-G1-L1-R6；
R3和R4中的每一个独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、芳基和C3-10环烷基；
R5和R6中的每一个独立地是具有至少10个碳原子的非环状烃基；
G1和G2中的每一个独立地是未取代的C1-12亚烷基或C2-12亚烯基；
L1和L2中的每一个独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-和-NRaC(＝O)O-；
Ra是H或C1-12烷基；
m是0、1、2、3或4；并且
x是0、1或2。
在式(XI)的一些前述实施方案中，G1独立地是未取代的C1-C12亚烷基或未取代的C2-12亚烯基，例如，未取代的、直链C1-12亚烷基或未取代的、直链C2-12亚烯基。在一些实施方案中，G1各自独立地是未取代的C6-12亚烷基或未取代的C6-12亚烯基，例如，未取代的、直链C6-12亚烷基或未取代的、直链C6-12亚烯基。在一些实施方案中，G1各自独立地是未取代的C8-12亚烷基或未取代的C8-12亚烯基，例如，未取代的、直链C8-12亚烷基或未取代的、直链C8-12亚烯基。在一些实施方案中，G1各自独立地是未取代的C6-10亚烷基或未取代的C6-10亚烯基，例如，未取代的、直链C6-10亚烷基或未取代的、直链C6-10亚烯基。在一些实施方案中，G1各自独立地是具有8、9或10个碳原子的未取代的亚烷基，例如具有8、9或10个碳原子的未取代的、直链亚烷基。在一些实施方案中，其中R1和R2都独立地是-G1-L1-R6，R1的G1可以不同于R2的G1。在一些这样的实施方案中，例如，R1的G1是未取代的、直链C1-12亚烷基，R2的G1是未取代的、直链C2-12亚烯基；或者R1的G1是未取代的、直链C1-12亚烷基基团，R2的G1是不同的未取代的、直链C1-12亚烷基基团。在一些实施方案中，其中R1和R2都独立地是-G1-L1-R6，R1的G1可以与R2的G1相同。在一些这样的实施方案中，例如，G1各自是相同的未取代的、直链C8-12亚烷基，如未取代的、直链C8-10亚烷基，或者G1各自是相同的未取代的、直链C6-12亚烯基。
在式(XI)的一些前述实施方案中，L1各自独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-和-C(＝O)NRa-。在一些实施方案中，L1的Ra是H或C1-12烷基。在一些实施方案中，L1的Ra是H或C1-6烷基，例如，H或C1-3烷基。在一些实施方案中，L1的Ra是H、甲基或乙基。在一些实施方案中，L1各自独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-和-SC(＝O)-。在一些实施方案中，L1各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。在一些实施方案中，其中R1和R2都独立地是-G1-L1-R6，R1的G1可以不同于R2的L1。在一些这样的实施方案中，例如，R1的L1是选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-和-C(＝O)NRa-的一个部分(例如，R1的L1是-O(C＝O)-)，R2的L1是选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-和-C(＝O)NRa-的不同部分(例如，R2的L1是-(C＝O)O-)。在一些实施方案中，其中R1和R2都独立地是-G1-L1-R6，R1的L1可以与R2的L1相同。在一些这样的实施方案中，例如，L1各自是选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-和-C(＝O)NRa-的相同部分，例如，L1各自是-O(C＝O)-或L1各自是-(C＝O)O-。
在式(XI)的一些前述实施方案中，R6各自独立地是具有至少10个碳原子的非环状烃基，例如，具有至少10个碳原子的直链烃基。在一些实施方案中，R6各自独立地具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在一些实施方案中，R6各自独立地是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烃基，例如，具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烃基。在一些实施方案中，R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。在一些实施方案中，R6各自独立地具有至多30个碳原子(如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子)，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。在一些实施方案中，R6各自独立地是具有至少10个碳原子的非环状烃基，例如，具有至少10个碳原子的直链烃基，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。在一些实施方案中，R6各自独立地是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烃基，例如，具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烃基，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。在一些实施方案中，R6的烃基是烷基或烯基，例如，C10-30烷基或烯基。因此，在一些实施方案中，R6各自独立地是具有至少10个碳原子的非环状烷基或具有至少10个碳原子的非环状烯基，例如具有至少10个碳原子的直链烷基或具有至少10个碳原子的直链烯基。在一些实施方案中，R6各自独立地是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烷基或具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烯基，例如，具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烷基或具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烯基。在一些实施方案中，R6各自独立地是具有11-19个碳原子(如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的非环状烷基，例如，具有11-19个碳原子(如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的直链烷基。在一些实施方案中，R6各自独立地是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烷基或具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烯基，例如，具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烷基或具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烯基，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。在一些实施方案中，R6各自独立地是具有11-19个碳原子(如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的非环状烷基，例如，具有11-19个碳原子(如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的直链烷基，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。表述“内部碳原子”是指R6与L1连接的R6的碳原子，其与R6的至少2个其他碳原子直接成键。例如，对于下面的C11烷基，位于位置2、3、4、5和7中任一个的每个碳原子都符合根据本公开的“内部碳原子”，而位于位置1、6、8、9、10和11的碳原子则不符合。
因此，通过R6的内部碳连接至L1的C11烷基的R6包括以下基团：
其中代表R6与L1结合的键。此外，对于直链烷基，例如，直链C11烷基，除了直链烷基的第一个和最后一个碳原子(即，除了位于直链C11烷基的位置1和11的碳原子)之外的每个碳原子都符合“内部碳原子”。因此，在一些实施方案中，具有p个碳原子并通过R6的内部碳原子连接至L1的直链烷基的R6表示R6通过位于位置2至(p-1)中任一个的R6的碳原子连接至L1(从而排除位于位置1和p的末端C原子)。在一些实施方案中，其中R6是具有p’个碳原子的直链烷基(其中p’是偶数)，并且通过R6的内部碳原子连接至L1，R6通过位于R6的位置(p’/2-1)、(p’/2)和(p’/2+1)中任一个的碳连接至L1(例如，如果p’为10，则R6通过位于R6的位置4、5和6中任一个的碳原子连接至L1)。在一些实施方案中，其中R6是具有p”个碳原子的直链烷基(其中p”是奇数)，并且通过R6的内部碳原子连接至L1，R6通过位于R6的位置(p”-1)/2和(p”+1)/2中任一个的碳原子连接至L1(例如，如果p”为11，则R6通过位于R6的位置5和6中任一个的碳连接至L1)。一般来说，应当理解，如果R1和R2都是-G1-L1-R6，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1，则R1的R6通过R1的R6的内部碳原子连接至R1的L1(而不是R2的L1)，而R2的R6通过R2的R6的内部碳原子连接至R2的L1(而不是R1的L1)。在一些实施方案中，R6各自独立地选自：
和其中/>代表R6与L1结合的键。在一些实施方案中，其中R1和R2都独立地是-G1-L1-R6，R1的R6不同于R2的R6。在一些这样的实施方案中，例如，R1的R6可以是具有至少10个碳原子的非环状，优选直链烃基(例如，R1的R6是)，并且R2的R6可以是不同的具有至少10个碳原子的非环状，优选直链烃基(例如，R2的R6是/>)。在一些实施方案中，其中R1和R2都独立地是-G1-L1-R6，R1的R6与R2的R6相同。在一些这样的实施方案中，例如，R6各自是相同的具有至少10个碳原子的非环状，优选直链烃基(例如，R6各自是/>)。
在式(XI)的一些前述实施方案中，R5是具有至少10个碳原子的非环状烃基，例如，具有至少10个碳原子的直链烃基。在一些实施方案中，R5是具有至少12个碳原子，如至少14个、至少16个或至少18个碳原子的非环状烃基，例如，具有至少12个、至少14个、至少16个或至少18个碳原子的直链烃基。在一些实施方案中，R5具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在一些实施方案中，R5是非环状烃基，例如，直链烃基，其中每个烃基具有10-30碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个、10-20个碳原子，或12-30个、12-28个、12-26个、12-24个、12-22个、12-20个碳原子，或14-30个、14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)。在一些实施方案中，R5的烃基是烷基或烯基，例如，C10-30烷基或烯基。因此，在一些实施方案中，R5是具有至少10个碳原子(如至少12个、至少14个、至少16个或至少18个碳原子)的非环状烷基或具有至少10个碳原子(如至少12个、至少14个、至少16个或至少18个碳原子)的非环状烯基，例如，具有至少10个碳原子(如至少12个、至少14个、至少16个或至少18个碳原子)的直链烷基或具有至少10个碳原子(如至少12个、至少14个、至少16个或至少18个碳原子)的直链烯基。在一些实施方案中，R5是非环状烷基或非环状烯基，例如，直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有10-30碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个、10-20个碳原子，或12-30个、12-28个、12-26个、12-24个、12-22个、12-20个碳原子，或14-30个、14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)。在一些实施方案中，烯基具有至少2个碳-碳双键，例如，2个或3个碳-碳双键，如2个碳-碳双键。在一些实施方案中，烯基具有至少1个顺式构型的碳-碳双键，例如，1个、2个或3个，如2个顺式构型的碳-碳双键。因此，在一些实施方案中，R5是非环状烷基或非环状烯基，例如，直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有10-30碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个、10-20个碳原子，或12-30个、12-28个、12-26个、12-24个、12-22个、12-20个碳原子，或14-30个、14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有至少2个碳-碳双键，例如，2个或3个碳-碳双键。在一些实施方案中，R5是非环状烷基或非环状烯基，例如，直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有10-30碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个、10-20个碳原子，或12-30个、12-28个、12-26个、12-24个、12-22个、12-20个碳原子，或14-30个、14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有至少1个碳-碳双键为顺式构型，如1个、2个或3个碳-碳双键。在一些实施方案中，R5具有以下结构：其中/>代表R5与化合物的剩余部分结合的键。
在式(XI)的一些前述实施方案中，L2选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-和-NRaC(＝O)O-。在一些实施方案中，L2选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-和-C(＝O)NRa-。在一些实施方案中，L2的Ra是H或C1-12烷基。在一些实施方案中，L2的Ra是H或C1-6烷基，例如，H或C1-3烷基。在一些实施方案中，L2的Ra是H、甲基或乙基。在一些实施方案中，L2选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-和-SC(＝O)-。在一些实施方案中，L2是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。
在式(XI)的一些前述实施方案中，G2是未取代的C1-12亚烷基或未取代的C2-12亚烯基，例如，未取代的、直链C1-12亚烷基或未取代的、直链C2-12亚烯基。在一些实施方案中，G2是未取代的C2-10亚烷基或未取代的C2-10亚烯基，例如，未取代的、直链C2-10亚烷基或未取代的、直链C2-10亚烯基。在一些实施方案中，G2是未取代的C2-6亚烷基或未取代的C2-6亚烯基，例如，未取代的、直链C2-6亚烷基或未取代的、直链C2-6亚烯基。在一些实施方案中，G2是未取代的C2-4亚烷基或未取代的C2-4亚烯基，例如，未取代的、直链C2-4亚烷基或未取代的、直链C2-4亚烯基。在一些实施方案中，G2是乙烯或三亚甲基。
在式(XI)的一些前述实施方案中，R3和R4中的每一个独立地是C1-6烷基或C2-6烯基。在一些实施方案中，R3和R4中的每一个独立地是C1-4烷基或C2-4烯基。在一些实施方案中，R3和R4中的每一个独立地是C1-3烷基。在一些实施方案中，R3和R4中的每一个独立地是甲基或乙基。在一些实施方案中，R3和R4中的每一个都是甲基。
在式(XI)的一些前述实施方案中，m是0、1、2或3。在一些实施方案中，m是0或2。在一些实施方案中，m是0。在一些实施方案中，m是2。
在式(XI)的一些前述实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(XIIa)或(XIIb)的结构：
其中
R3和R4中的每一个独立地是C1-C6烷基或C2-6烯基；
R5是具有至少14个碳原子(如至少16个碳原子)的直链烃基，其中所述烃基优选具有至少2个碳-碳双键；
R6各自独立地是具有至少10个碳原子的直链烃基(例如，直链烷基)和/或R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1，优选R6各自独立地是具有至少10个碳原子的直链烃基(例如，直链烷基)并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1；
G1各自独立地是未取代的、直链C4-12亚烷基或C4-12亚烯基，例如，未取代的、直链C6-12亚烷基或C6-12亚烯基，如未取代的直链C8-12亚烷基或未取代的、直链C8-12亚烯基；
G2是未取代的C2-C10亚烷基或C2-10亚烯基，优选未取代的C2-C6亚烷基或C2-6亚烯基；
L1和L2中的每一个独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；并且
m是0、1、2或3，优选0或2。
在式(XIIa)的一些前述实施方案中，R5具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在式(XIIa)的一些实施方案中，R5是具有14-30个碳原子(如14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或者16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)的直链烃基。在式(XIIa)的一些实施方案中，R5是具有14-30个碳原子(如14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或者16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)的直链烷基或烯基。在式(XIIa)的一些实施方案中，烯基具有至少2个碳-碳双键，例如，2个或3个碳-碳双键，如2个碳-碳双键。在一些实施方案中，烯基具有至少1个顺式构型的碳-碳双键，例如，1个、2个或3个，如2个顺式构型的碳-碳双键。因此，在式(XIIa)的一些实施方案中，R5是直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有14-30个碳原子(如14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或者16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有至少2个碳-碳双键，例如，2个或3个碳-碳双键。在式(XIIa)的一些实施方案中，R5是直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有14-30个碳原子(如14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或者16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有至少1个碳-碳双键为顺式构型，如1个、2个或3个碳-碳双键。在式(XIIa)的一些实施方案中，R5是直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有14-30个碳原子(如14-28个、14-26个、14-24个、14-22个、14-20个碳原子，或者16-30个、16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有2个或3个碳-碳双键，其中至少1个碳-碳双键为顺式构型，如1个、2个或3个碳-碳双键。在式(XIIa)的一些实施方案中，R5具有以下结构：
其中/>代表R5与化合物的剩余部分结合的键。
在式(XIIa)的一些实施方案中，R6具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在式(XIIa)的一些实施方案中，R6是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烃基(例如，非环状烷基)，例如，具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)。在式(XIIa)的一些实施方案中，R6是具有至少10个碳原子的直链烃基(例如，直链烷基)，并且R6通过R6的内部碳原子连接至L1。在式(XIIa)的一些实施方案中，R6是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的非环状烃基(例如，非环状烷基)，例如，具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且R6通过R6的内部碳原子连接至L1。在式(XIIa)的一些实施方案中，G1独立地是未取代的、直链C4-12亚烷基或C4-12亚烯基，例如，未取代的、直链C6-12亚烷基或C6-12亚烯基。在式(XIIa)的一些实施方案中，R5是直链烃基，例如，直链烯基，具有至少14个碳原子(如14-30个碳原子)以及2个或3个碳-碳双键；R6是具有至少10个碳原子(例如，具有10-30个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且R6通过R6的内部碳原子连接至L1；G1独立地是未取代的、直链C4-12亚烷基或C4-12亚烯基，例如，未取代的、直链C6-12亚烷基或C6-12亚烯基。
在式(XIIb)的一些前述实施方案中，R6各自独立地具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在式(XIIb)的一些实施方案中，R6各自独立地是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子，或者11-19个碳原子，如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)。在式(XIIb)的一些实施方案中，R6各自独立地是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子，或者11-19个碳原子，如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。在式(XIIb)的一些实施方案中，R6各自独立地选自：
/>
和其中/>代表R6与L1结合的键。在式(XIIb)的一些实施方案中，G1各自独立地是未取代的、直链C6-12亚烷基或C6-12亚烯基。在式(XIIb)的一些实施方案中，G1各自独立地是未取代的、直链C8-12亚烷基或C8-12亚烯基。在式(XIIb)的一些实施方案中，R6各自独立地是具有至少10个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子，或者11-19个碳原子，如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且通过R6的内部碳原子连接至L1；G1各自独立地是未取代的、直链C8-12亚烷基或C8-12亚烯基。
在式(XI)的一些前述实施方案中，阳离子可电离脂质具有式(XIIIa)或(XIIIb)的结构：
其中
R3和R4中的每一个独立地是C1-4烷基或C2-4烯基，更优选C1-3烷基，如甲基或乙基；
R5是具有至少16个碳原子的直链烷基或烯基，其中所述烯基优选具有至少2个碳-碳双键；
R6各自独立地是具有至少10个碳原子的直链烃基，其中R6通过R6的内部碳原子连接至L1；
G1各自独立地是未取代的、直链C6-12亚烷基或未取代的、直链C6-12亚烯基，例如，未取代的、直链C8-12亚烷基或未取代的、直链C8-12亚烯基，如未取代的、直链C8-10亚烷基或未取代的、直链C8-10亚烯基，如未取代的、直链C8亚烷基；
G2是未取代的C2-6亚烷基或C2-6亚烯基，优选未取代的C2-4亚烷基或C2-4亚烯基，如乙烯或三亚甲基；
L1和L2中的每一个独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；并且
m是0、1、2或3，优选0或2。
在式(XIIIa)的一些前述实施方案中，R5具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R5是具有16-30个碳原子(如16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)的直链烷基或烯基。在式(XIIIa)的一些实施方案中，烯基具有至少2个碳-碳双键，例如，2个或3个碳-碳双键，如2个碳-碳双键。在一些实施方案中，烯基具有至少1个顺式构型的碳-碳双键，例如，1个、2个或3个，如2个顺式构型的碳-碳双键。因此，在式(XIIIa)的一些实施方案中，R5是直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有16-30个碳原子(如16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有至少2个碳-碳双键，例如，2个或3个碳-碳双键。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R5是直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有16-30个碳原子(如16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有至少1个碳-碳双键为顺式构型，如1个、2个或3个碳-碳双键。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R5是直链烷基或直链烯基，其中每个烷基和烯基独立地具有16-30个碳原子(如16-28个、16-26个、16-24个、16-22个、16-20个碳原子，或者18-30个、18-28个、18-26个、18-24个、18-22个或18-20个碳原子)，并且烯基具有2个或3个碳-碳双键，其中至少1个碳-碳双键为顺式构型，如1个、2个或3个碳-碳双键。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R5具有以下结构：其中/>代表R5与化合物的剩余部分结合的键。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R6具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R6是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且R6通过R6的内部碳原子连接至L1。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R6是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子)的直链烷基，并且R6通过R6的内部碳原子连接至L1。在式(XIIIa)的一些实施方案中，G1独立地是未取代的、直链C4-12亚烷基或C4-12亚烯基，例如，未取代的、直链C6-12亚烷基或C6-12亚烯基。在式(XIIIa)的一些实施方案中，R5是直链烃基，例如，直链烯基，具有至少16个碳原子(如16-30个碳原子)以及2个或3个碳-碳双键；R6是具有至少10个碳原子(例如，具有10-30个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且R6通过R6的内部碳原子连接至L1；G1独立地是未取代的、直链C4-12亚烷基或C4-12亚烯基，例如，未取代的、直链C6-12亚烷基或C6-12亚烯基。
在式(XIIIb)的一些前述实施方案中，R6各自独立地具有至多30个碳原子，如至多28个、至多26个、至多24个、至多22个或至多20个碳原子。在式(XIIIb)的一些实施方案中，R6各自独立地是具有10-30个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子，或者11-19个碳原子，如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1。在式(XIIIb)的一些实施方案中，R6各自通过R6的内部碳原子连接至L1并独立地选自：
和/>其中/>代表R6与L1结合的键。在式(XIIIb)的一些实施方案中，G1各自独立地是未取代的、直链C8-12亚烷基或C8-12亚烯基，例如，未取代的、直链C8-10亚烷基或C8-10亚烯基。在式(XIIIb)的一些实施方案中，R6各自独立地是具有至少10个碳原子(如10-28个、10-26个、10-24个、10-22个或10-20个碳原子，或者11-19个碳原子，如11个、13个、15个、17个或17个碳原子)的直链烃基(例如，直链烷基)，并且通过R6的内部碳原子连接至L1；G1各自独立地是未取代的、直链C8-12亚烷基或C8-12亚烯基，例如，未取代的、直链C8-10亚烷基或C8-10亚烯基。
在式(XI)的一些前述实施方案中，阳离子可电离脂质具有以下式(XIV-1)、(XIV-2)和(XIV-3)之一：
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质是(6Z,16Z)-12-((Z)-癸-4-烯-1-基)二十二碳-6,16-二烯-11-基5-(二甲氨基)戊酸酯(3D-P-DMA)。3D-P-DMA的结构可以表示如下：
在各种不同的实施方案中，阳离子可电离脂质选自N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(DODMA)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和4-((二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-N,N-二甲基-4-氧代丁-1-胺(DPL-14)。
阳离子可电离脂质的其他实例包括但不限于3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷、1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、双十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁基-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9’,12’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2-({8-[(3β)-胆固醇-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烯-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)，二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8'-((((2(二甲基氨基)乙基)硫代)羰基)氮杂二基)二辛酸酯(ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)丙-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(lipidoid 98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoid C12-200)。
在某些实施方案中，阳离子可电离脂质具有结构X-3。
在一些实施方案中，本文使用的阳离子脂质是或包含DPL14。如本文所用，“DPL14”是包含以下通式的脂质：
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应当理解对本文公开的阳离子可电离脂质的任何引用还包括其盐(特别是药学上可接受的盐)、互变异构体、立体异构体、溶剂合物(例如，水合物)和同位素标记的形式。
在一些实施方案中，阳离子可电离脂质可以占组合物/颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约100摩尔％、约20摩尔％至约100摩尔％、约30摩尔％至约100摩尔％、约40摩尔％至约100摩尔％或约50摩尔％至约100摩尔％。
在一些实施方案中，其中本文所述的组合物/颗粒(特别是RNA组合物/颗粒)包含阳离子可电离脂质以及一种或多种其他脂质，所述阳离子可电离脂质占组合物/颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约80摩尔％、约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、约30摩尔％至约50摩尔％、约35摩尔％至约45摩尔％或约40摩尔％。在一些实施方案中，阳离子可电离脂质占组合物/颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约80摩尔％、约20摩尔％至约80摩尔％、约25摩尔％至约65摩尔％或约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％。
在一实施方案中，本文所述的颗粒(特别是RNALNP)包含40-55摩尔％、40-50摩尔％、41-49摩尔％、41-48摩尔％、42-48摩尔％、43-48摩尔％、44-48摩尔％、45-48摩尔％、46-48摩尔％、47-48摩尔％或47.2-47.8摩尔％的阳离子可电离脂质。在一实施方案中，颗粒(特别是RNALNP)包含约47.0、47.1、47.2、47.3、47.4、47.5、47.6、47.7、47.8、47.9或48.0摩尔％的阳离子可电离脂质。
在一些实施方案中，其中至少一部分本文所述的阳离子可电离脂质与至少一部分RNA结合形成颗粒(例如，LNP)，所述阳离子可电离脂质可以占组合物中存在的总脂质的约10摩尔％至约95摩尔％、约20摩尔％至约95摩尔％、约20摩尔％至约90摩尔％、约30摩尔％至约90摩尔％、约40摩尔％至约90摩尔％或约40摩尔％至约80摩尔％，如约20摩尔％至约80摩尔％、约25摩尔％至约70摩尔％、约30摩尔％至约60摩尔％或约30摩尔％至约50摩尔％，如所述颗粒中存在的总脂质的约40摩尔％至约60摩尔％。
在一些实施方案中，N/P值至少约为4。在一些实施方案中，N/P值范围为4-20、4-12、4-10、4-8或5-7。在一些实施方案中，N/P值约为6。
其他脂质
本文所述的RNA组合物还可以包含除阳离子可电离脂质以外的脂质或脂质样物质，即，非阳离子脂质或脂质样物质(包括非阳离子可电离脂质或脂质样物质)。阴离子和中性脂质或脂质样物质在本文中统称为非阳离子脂质或脂质样物质。除了阳离子可电离脂质之外，通过添加其他疏水部分如胆固醇和脂质来优化核酸颗粒的制剂，可以增强组合物和/或颗粒稳定性和核酸(如RNA)递送的效力。
可以掺入一种或多种其他脂质，其可能影响或不影响核酸颗粒的总电荷。在某些实施方案中，一种或多种其他脂质是非阳离子脂质或脂质样物质。非阳离子脂质可以包含例如一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。如本文所用，“阴离子脂质”是指在所选pH下带负电荷的任何脂质。如本文所用，“中性脂质”是指在所选pH下以不带电荷或中性的两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。
在某些实施方案中，本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)包含阳离子可电离脂质以及一种或多种其他脂质。
不希望受理论束缚，与一种或多种其他脂质的量相比，阳离子可电离脂质的量可能影响核酸颗粒的重要特征，如核酸的电荷、粒径、稳定性、组织选择性和生物活性。因此，在一些实施方案中，阳离子可电离脂质与一种或多种其他脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2或约3:1至约1:1。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)中的一种或多种其他脂质包含以下一种或多种：中性脂质、类固醇、聚合物缀合脂质及其组合。
中性脂质
在一些实施方案中，一种或多种其他脂质包含中性脂质，优选磷脂。在一些实施方案中，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。可以使用的具体磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这类磷脂特别包括二酰磷脂酰胆碱，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三碳酰磷脂酰胆碱(DTPC)、双十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)、二植酰基-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)、1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPG)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1′-rac-甘油)(DPPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、N-棕榈酰基-D-赤型-鞘氨醇磷酰胆碱(SM)，以及具有不同疏水链的其他磷脂酰乙醇胺脂质。在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DOPC、DMPC、DPPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。
因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)包含阳离子可电离脂质和DSPC。
在一些实施方案中，中性脂质以5-15摩尔％、7-13摩尔％或9-11摩尔％的浓度存在于本文所述的RNA组合物(特别是mRNA组合物)中。在一些实施方案中，中性脂质以本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)中存在的总脂质的约9.5、10或10.5摩尔％的浓度存在。
类固醇
在一实施方案中，类固醇是胆固醇。因此，在一些实施方案中，RNA组合物(尤其是mRNA组合物)包含阳离子可电离脂质和胆固醇。
在一实施方案中，类固醇以30-50摩尔％、35-45摩尔％或38-43摩尔％的浓度存在于RNA组合物(特别是mRNA组合物)中。在一些实施方案中，类固醇以本文所述的组合物(尤其是mRNA组合物)中存在的总脂质的约40、41、42、43、44、45或46摩尔％的浓度存在。
在某些优选的实施方案中，本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)包含DSPC和胆固醇，优选以上述浓度。
在一些实施方案中，中性脂质(特别是一种或多种磷脂)和类固醇(特别是胆固醇)的组合浓度可占本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)中存在的总脂质的约0摩尔％至约90摩尔％、约0摩尔％至约80摩尔％、约0摩尔％至约70摩尔％、约0摩尔％至约60摩尔％、或约0摩尔％至约50摩尔％，如约20摩尔％至约80摩尔％、约25摩尔％至约75摩尔％、约30摩尔％至约70摩尔％、约35摩尔％至约65摩尔％或约40摩尔％至约60摩尔％。
在一些实施方案中，其中至少一部分的(i)RNA，(ii)式(I)的阳离子可电离脂质，和(iii)其他脂质形成颗粒(例如，LNP)，其他脂质(例如，一种或多种磷脂和/或胆固醇)可以占颗粒中存在的总脂质的约0摩尔％至约60摩尔％、约2摩尔％至约55摩尔％、约5摩尔％至约50摩尔％、约5摩尔％至约45摩尔％、约10摩尔％至约45摩尔％、约15摩尔％至约40摩尔％或约20摩尔％至约40摩尔％。
在一些实施方案中，磷脂可以占颗粒中存在的总脂质的约5摩尔％至约40摩尔％，优选约5摩尔％至约20摩尔％，更优选约5摩尔％至约15摩尔％。
在一些实施方案中，类固醇(特别是胆固醇)占颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约65摩尔％，优选约20摩尔％至约60摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％。
聚合物缀合脂质
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物可以包含至少一种聚合物缀合脂质。聚合物缀合脂质通常是包含脂质部分和与其缀合的聚合物部分的分子。
在一些实施方案中，聚合物缀合脂质是PEG缀合脂质，在本文中也称作聚乙二醇化脂质或PEG-脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指同时包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的。
在一些实施方案中，聚合物缀合脂质是聚肌氨酸缀合脂质，在本文中也称作肌氨酸化脂质或pSar-脂质。术语“肌氨酸化脂质”是指同时包含脂质部分和聚肌氨酸部分的分子。
如本文所用，“聚合物”具有其通常的含义，即，包含通过共价键连接的一个或多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可以全部相同，或者在某些情况下，聚合物内可以存在一种以上类型的重复单元。在某些情况下，聚合物是生物衍生的，即，生物聚合物如蛋白。在某些情况下，聚合物中还可以存在其他部分，例如靶向部分。如果聚合物内存在一种以上类型的重复单元，则将该聚合物称为“共聚物”。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，重复单元可以以随机顺序、交替顺序排列，或者作为“嵌段”共聚物，即，包含一个或多个区域，每个区域包含第一重复单元(例如，第一嵌段)，以及一个或多个区域，每个包含第二重复单元(例如，第二嵌段)，等等。嵌段共聚物可以具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数量的不同嵌段。
在一些实施方案中，设计聚合物缀合脂质，通过形成屏蔽疏水脂质层的保护性亲水层来空间稳定脂质颗粒。在一些实施方案中，当这类脂质颗粒在体内给药时，聚合物缀合脂质可以减少其与血清蛋白的结合和/或由此引起的网状内皮系统的摄取。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物不包括聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物不包括肌氨酸化脂质。在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物不包括聚乙二醇化脂质或肌氨酸化脂质。在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物不包括任何聚合物缀合脂质。
聚乙二醇(PEG)缀合脂质
在一些实施方案中，聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指同时包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的。在一实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构(XV)：
或者其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中R12和R13各自独立地是含有10-30个碳原子的直链或支化的、烷基或烯基链，其中所述烷基或烯基链任选被一个或多个酯键中断；并且w的平均值为30-60。
在式(XV)的一些实施方案中，R12和R13中的每一个独立地是含有10-18个碳原子，优选12-16个碳原子的直链烷基链。
在式(XV)的一些实施方案中，R12和R13相同。在一些实施方案中，R12和R13中的每一个是含有12个碳原子的直链烷基链。在一些实施方案中，R12和R13中的每一个是含有14个碳原子的直链烷基链。在一些实施方案中，R12和R13中的每一个是含有16个碳原子的直链烷基链。
在式(XV)的一些实施方案中，R12和R13不同。在一些实施方案中，R12和R13中的一个是含有12个碳原子的直链烷基链，R12和R13中的另一个是含有14个碳原子的直链烷基链。
在式(XV)的一些实施方案中，z的平均值为40-50，如平均值为45。
在式(XV)的一些实施方案中，z在一定范围内，使得式(XV)的聚乙二醇化脂质的PEG部分的平均分子量为约400至约6000g/摩尔，如约1000至约5000g/摩尔、约1500至约4000g/摩尔或约2000至约3000g/摩尔。
各种PEG缀合脂质是本领域已知的，包括但不限于聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)，聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)，PEG琥珀酸二酰甘油(PEG-S-DAG)如4-O-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)，聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)，或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯如w-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(w甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯等。
PEG缀合脂质的其他实例包括DSPE-PEG(1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[羧基(聚乙二醇)甲氧基])，如DSPE-PEG(2000)钠盐，DOPE-PEG(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[(聚乙二醇)甲氧基])，如DOPE-PEG(2000)铵盐，DPPE-PEG(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[(聚乙二醇)甲氧基)，如DPPE-PEG(2000)铵盐，和DMPE-PEG(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[(聚乙二醇)甲氧基])，如DMPE-PEG(2000)钠盐。
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质是2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺/2-[2-(ω-甲氧基(聚乙二醇2000)乙氧基]-N,N-双十四烷基乙酰胺，例如，具有以下结构：
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质是DMG-PEG 2000，例如，具有以下结构：
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构：
其中n的平均值为30-60，如约50。
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质是PEG2000-C-DMA，其优选是指3-N-[(ω-甲氧基聚(乙二醇)2000)氨甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧基-丙胺(MPEG-(2kDa)-C-DMA)或甲氧基-聚乙二醇-2,3-双(十四烷氧基)丙基氨基甲酸酯(2000)。可以选择PEG2000-C-DMA以便向肝脏提供最佳的RNA递送。已发现通过调节PEG脂质锚的烷基链长度，可以以可预测的方式控制包封的核酸的药理学。在小瓶中，即在给药之前，颗粒保留完整的PEG2000-C-DMA。在血室中，即在给药之后，随着时间的推移，PEG2000-C-DMA从RNA颗粒解离，显示更容易被细胞摄取的融合颗粒，最终导致RNA有效载荷的释放。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物可以包含如WO 2017/075531和WO2018/081480所述的一种或多种PEG缀合脂质或聚乙二醇化脂质，为了本文所述的目的，每篇的全部内容援引加入本文。
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质占本文所述RNA组合物中存在的总脂质的约1摩尔％至约10摩尔％，优选约1摩尔％至约5摩尔％，更优选约1摩尔％至约2.5摩尔％。
在一些实施方案中，其中至少一部分的(i)RNA，(ii)式(I)的阳离子可电离脂质，和(iii)聚乙二醇化脂质形成颗粒(例如，LNP)，聚乙二醇化脂质可以占颗粒中存在的总脂质的约1摩尔％至约10摩尔％，优选约1摩尔％至约5摩尔％，更优选约1摩尔％至约2.5摩尔％。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物包含如本文公开的阳离子可电离脂质、聚乙二醇化脂质、磷脂和胆固醇，其中所述阳离子可电离脂质占组合物中存在的总脂质的40-50摩尔％，聚乙二醇化脂质占组合物中存在的总脂质的1-5摩尔％，磷脂占组合物中存在的总脂质的5-15摩尔％，胆固醇占组合物中存在的总脂质的30-50摩尔％。在一些实施方案中，磷脂是DOPE。在一些实施方案中，磷脂是DSPC。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质是DMG-PEG 2000。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物中含有的缓冲物质包含或者是如本文定义的叔胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3均不是H)或其质子化形式。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物中含有的缓冲物质包含或者是如本文定义的环胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含或者是TEA或其质子化形式。
聚肌氨酸(pSar)缀合脂质
在一些实施方案中，聚合物缀合脂质是聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，即包含聚肌氨酸(聚(N-甲基甘氨酸))的脂质或脂质样物质。因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物包含如本文公开的阳离子可电离脂质和pSar缀合脂质。在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物可以进一步包含中性脂质(例如，磷脂)、胆固醇或其衍生物，或者中性脂质(例如，磷脂)和胆固醇或其衍生物的组合。在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物包含如本文所述的阳离子可电离脂质、pSar缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)以及胆固醇或其衍生物。在一些实施方案中，磷脂是DSPC。在一些实施方案中，磷脂是DOPE。在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物包含如本文所述的阳离子可电离脂质、pSar缀合脂质、DSPC以及胆固醇或其衍生物。
聚肌氨酸可以包含乙酰化(中性末端基团)或其他官能化末端基团。在RNA-脂质颗粒的情况下，在一实施方案中，聚肌氨酸与颗粒中包含的非阳离子脂质或脂质样物质缀合，优选共价结合。
在某些实施方案中，聚肌氨酸的末端基团可以用一个或多个赋予某些特性的分子部分官能化，如正电荷或负电荷，或者将颗粒导向特定细胞类型、细胞集合或组织的靶向剂。
各种合适的靶向剂是本领域已知的。靶向剂的非限制性实例包括肽、蛋白、酶、核酸、脂肪酸、激素、抗体、碳水化合物、单糖、寡糖或多糖、肽聚糖、糖肽等。例如，可以采用与靶细胞表面上的抗原结合的多种不同物质中的任何一种。针对靶细胞表面抗原的抗体一般对靶标表现出必要的特异性。除了抗体之外，还可以采用合适的免疫反应性片段，如Fab、Fab′、F(ab′)2或scFv片段或单结构域抗体(例如骆驼VHH片段)。本领域已有许多适合用于形成靶向机制的抗体片段。类似地，靶细胞表面上任何受体的配体都可以适当地用作靶向剂。这些包括任何天然或合成的小分子或生物分子，其特异性地结合至期望的靶细胞表面发现的细胞表面受体、蛋白或糖蛋白。
在某些实施方案中，聚肌氨酸包含2至200个、2至190个、2至180个、2至170个、2至160个、2至150个、2至140个、2至130个、2至120个、2至110个、2至100个、2至90个、2至80个、2至70个、5至200个、5至190个、5至180个、5至170个、5至160个、5至150个、5至140个、5至130个、5至120个、5至110个、5至100个、5至90个、5至80个、5至70个、10至200个、10至190个、10至180个、10至170个、10至160个、10至150个、10至140个、10至130个、10至120个、10至110个、10至100个、10至90个、10至80个或10至70个肌氨酸单元。
在某些实施方案中，聚肌氨酸包含以下通式(XVI)：
其中x是指肌氨酸单元的数目。聚肌氨酸通过键之一可以连接至颗粒形成组分或疏水性组分。聚肌氨酸通过另一个键可以连接至H、亲水基团、可电离基团，或连接至接头以连接功能部分如靶向部分。
聚肌氨酸可以缀合、特别是共价结合或连接至任何颗粒形成组分，如脂质或脂质样物质。聚肌氨酸-脂质缀合物是一种分子，其中聚肌氨酸缀合至如本文所述的脂质，如阳离子脂质或阳离子可电离脂质或其他脂质。或者，聚肌氨酸与不同于阳离子可电离脂质或者一种或多种其他脂质的脂质或脂质样物质缀合。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物包含以下通式(XVIa)：
其中R11和R12之一包含疏水基团，而另一个是H、亲水基团、可电离基团或任选包含靶向部分的官能团。在一实施方案中，疏水基团包含直链或支化的烷基或芳基，优选包含10-50个、10-40个或12-20个碳原子。在一实施方案中，包含疏水基团的R11或R12包含连接至一个或多个直链或支化的烷基的部分，如杂原子，特别是N。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物包含以下通式(XVIb)：
其中R是H、亲水基团、可电离基团或任选包含靶向部分的官能团。
通式(XVIa)和(XVIb)中的符号“x”是指肌氨酸单元的数目并且可以是如本文定义的数目。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物是选自聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
通常，聚肌氨酸部分具有2至200个、5至200个、5至190个、5至180个、5至170个、5至160个、5至150个、5至140个、5至130个、5至120个、5至110个、5至100个、5至90个、5至80个、10至200个、10至190个、10至180个、10至170个、10至160个、10至150个、10至140个、10至130个、10至120个、10至110个、10至100个、10至90个或10至80个肌氨酸单元。
在一些实施方案中，pSar缀合脂质具有以下式(VII-1)的结构：
其中n是23。式(VII-1)的pSar缀合脂质在本文中也称作“C14pSar23”。
因此，在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)包含阳离子可电离脂质和聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，例如，如上文所定义的聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物。
在某些情况下，聚肌氨酸-脂质缀合物可以占本文所述组合物(尤其是RNA组合物)中存在的总脂质的约0.2摩尔％至约50摩尔％、约0.25摩尔％至约30摩尔％、约0.5摩尔％至约25摩尔％、约0.75摩尔％至约25摩尔％、约1摩尔％至约25摩尔％、约1摩尔％至约20摩尔％、约1摩尔％至约15摩尔％、约1摩尔％至约10摩尔％、约1摩尔％至约5摩尔％、约1.5摩尔％至约25摩尔％、约1.5摩尔％至约20摩尔％、约1.5摩尔％至约15摩尔％、约1.5摩尔％至约10摩尔％、约1.5摩尔％至约5摩尔％、约2摩尔％至约25摩尔％、约2摩尔％至约20摩尔％、约2摩尔％至约15摩尔％、约2摩尔％至约10摩尔％或约2摩尔％至约5摩尔％。
在一些实施方案中，其中至少一部分的(i)RNA，(ii)式(I)的阳离子可电离脂质，和(iii)pSar缀合脂质形成颗粒(例如，LNP)，pSar缀合脂质可以占颗粒中存在的总脂质的约0.5摩尔％至约5摩尔％，优选约1摩尔％至约5摩尔％，更优选约1摩尔％至约4.5摩尔％。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物包含如本文所述的阳离子可电离脂质、pSar缀合脂质、磷脂和胆固醇，其中所述阳离子可电离脂质占组合物中存在的总脂质的40-50摩尔％，pSar缀合脂质占组合物中存在的总脂质的1-4.5摩尔％，磷脂占组合物中存在的总脂质的5-15摩尔％，胆固醇占组合物中存在的总脂质的30-50摩尔％。在一些实施方案中，磷脂是DOPE。在一些实施方案中，磷脂是DSPC。在一些实施方案中，pSar缀合脂质是C14pSar23。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物中含有的缓冲物质包含或者是如本文定义的叔胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3均不是H)或其质子化形式。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物中含有的缓冲物质包含或者是如本文定义的环胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含或者是TEA或其质子化形式。
RNA组合物的实施方案
在一些实施方案中，一种或多种其他脂质包含以下组分之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合脂质的混合物；或者(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。在一些实施方案中，一种或多种其他脂质包含以下组分之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或者(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。
因此，在优选的实施方案中，本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)包含阳离子可电离脂质以及以下脂质或脂质混合物之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合脂质的混合物；或者(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。在具体的实施方案中，阳离子可电离脂质以40-50摩尔％的浓度存在；中性脂质以5-15摩尔％的浓度存在；类固醇以35-45摩尔％的浓度存在；并且聚合物缀合脂质以1-10摩尔％的浓度存在，其中RNA包封在LNP内或与LNP结合。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物(尤其是mRNA组合物)中含有的缓冲物质包含或是如本文定义的叔胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3均不是H)或其质子化形式。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物(尤其是mRNA组合物)中含有的缓冲物质包含或是如本文定义的环胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含或是TEA或其质子化形式。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(尤其是mRNA组合物)包含阳离子可电离脂质以及以下脂质或脂质混合物之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或者(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。在一些具体的实施方案中，阳离子可电离脂质以40-50摩尔％的浓度存在；磷脂以5-15摩尔％的浓度存在；类固醇以35-45摩尔％的浓度存在；并且聚乙二醇化脂质以1-10摩尔％的浓度存在，其中RNA包封在LNP内或与LNP结合。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物(尤其是mRNA组合物)中含有的缓冲物质包含或是如本文定义的叔胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2、R3均不是H)或其质子化形式。在一些实施方案中，本文所述RNA组合物(尤其是mRNA组合物)中含有的缓冲物质包含或是如本文定义的环胺(即，N(R1)(R2)(R3)，其中R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代)或其质子化形式。在一些实施方案中，缓冲物质包含或是TEA或其质子化形式。
N/P值优选是至少约4。在一些实施方案中，N/P值范围为4-20、4-12、4-10、4-8或5-7。在一实施方案中，N/P值是约6。
本文所述的LNP的平均直径在一实施方案中可以是约30nm至约200nm或约60nm-约120nm。
一般来说，本文所述的包含RNA的LNP(或“RNALNP”)是可以用于将RNA递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的“RNA-脂质颗粒”。RNA-脂质颗粒通常由阳离子可电离脂质(如具有结构I-3的脂质)以及一种或多种其他脂质形成，所述其他脂质如磷脂(例如，DSPC)、类固醇(例如，胆固醇或其类似物)和聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)。
在不受任何理论束缚的情况下，认为阳离子可电离脂质以及一种或多种其他脂质与RNA组合在一起形成胶体稳定的颗粒，其中核酸与脂质基质结合。
在一些实施方案中，RNA-脂质颗粒包含一种以上类型的RNA分子，其中RNA分子的分子参数可以彼此相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构元件如分子结构、加帽、编码区或其他特征。
在一些实施方案中，除了RNA之外，RNA-脂质LNP(如mRNA-脂质LNP)包含：(i)阳离子可电离脂质，其可以占颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约80摩尔％、约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、约30摩尔％至约50摩尔％、约35摩尔％至约45摩尔％、或约40摩尔％，(ii)中性脂质和/或类固醇(例如，一种或多种磷脂和/或胆固醇)，其可占颗粒中存在的总脂质的约0摩尔％至约90摩尔％、约20摩尔％至约80摩尔％、约25摩尔％至约75摩尔％、约30摩尔％至约70摩尔％、约35摩尔％至约65摩尔％、或约40摩尔％至约60摩尔％，以及(iii)聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质，其可以占颗粒中存在的总脂质的1摩尔％至10摩尔％、1摩尔％至5摩尔％、或1摩尔％至2.5摩尔％；或者聚肌氨酸-脂质缀合物，其可以占颗粒中存在的总脂质的约0.2摩尔％至约50摩尔％、约0.25摩尔％至约30摩尔％、约0.5摩尔％至约25摩尔％、约0.75摩尔％至约25摩尔％、约1摩尔％至约25摩尔％、约1摩尔％至约20摩尔％、约1摩尔％至约15摩尔％、约1摩尔％至约10摩尔％、约1摩尔％至约5摩尔％、约1.5摩尔％至约25摩尔％、约1.5摩尔％至约20摩尔％、约1.5摩尔％至约15摩尔％、约1.5摩尔％至约10摩尔％、约1.5摩尔％至约5摩尔％、约2摩尔％至约25摩尔％、约2摩尔％至约20摩尔％、约2摩尔％至约15摩尔％、约2摩尔％至约10摩尔％、或约2摩尔％至约5摩尔％)。
在某些优选的实施方案中，中性脂质包含磷脂，占颗粒中存在的总脂质的约5摩尔％至约50摩尔％、约5摩尔％至约45摩尔％、约5摩尔％至约40摩尔％、约5摩尔％至约35摩尔％、约5摩尔％至约30摩尔％、约5摩尔％至约25摩尔％、或约5摩尔％至约20摩尔％。
在某些优选的实施方案中，类固醇包含胆固醇或其衍生物，占颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约80摩尔％、约10摩尔％至约70摩尔％、约15摩尔％至约65摩尔％、约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、或约30摩尔％至约50摩尔％。
在某些优选的实施方案中，中性脂质和类固醇包含以下混合物：(i)磷脂如DSPC，占颗粒中存在的总脂质的约5摩尔％至约50摩尔％、约5摩尔％至约45摩尔％、约5摩尔％至约40摩尔％、约5摩尔％至约35摩尔％、约5摩尔％至约30摩尔％、约5摩尔％至约25摩尔％、或约5摩尔％至约20摩尔％；以及(ii)胆固醇或其衍生物如胆固醇，占颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约80摩尔％、约10摩尔％至约70摩尔％、约15摩尔％至约65摩尔％、约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、或约30摩尔％至约50摩尔％。作为一个非限制性实例，包含磷脂和胆固醇的混合物的mRNA LNP可以包含DSPC，其占颗粒中存在的总脂质的约5摩尔％至约50摩尔％、约5摩尔％至约45摩尔％、约5摩尔％至约40摩尔％、约5摩尔％至约35摩尔％、约5摩尔％至约30摩尔％、约5摩尔％至约25摩尔％、或约5摩尔％至约20摩尔％，和包含胆固醇，其占颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约80摩尔％、约10摩尔％至约70摩尔％、约15摩尔％至约65摩尔％、约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、或约30摩尔％至约50摩尔％。
在一些实施方案中，除了RNA之外，RNA-脂质颗粒包含：(i)阳离子可电离脂质(如具有结构I-3的脂质)，其可以占颗粒中存在的总脂质的10摩尔％至约80摩尔％、约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、约30摩尔％至约50摩尔％、约35摩尔％至约45摩尔％、或约40摩尔％，(ii)DSPC，其可以占颗粒中存在的总脂质的约5摩尔％至约50摩尔％、约5摩尔％至约45摩尔％、约5摩尔％至约40摩尔％、约5摩尔％至约35摩尔％、约5摩尔％至约30摩尔％、约5摩尔％至约25摩尔％、或约5摩尔％至约20摩尔％；(iii)胆固醇，其可以占颗粒中存在的总脂质的约10摩尔％至约80摩尔％、约10摩尔％至约70摩尔％、约15摩尔％至约65摩尔％、约20摩尔％至约60摩尔％、约25摩尔％至约55摩尔％、或约30摩尔％至约50摩尔％，以及(iv)聚乙二醇化脂质，其可以占颗粒中存在的总脂质的1摩尔％至10摩尔％、1摩尔％至5摩尔％或1摩尔％至2.5摩尔％；或者(iv’)聚肌氨酸-脂质缀合物，其可以占颗粒中存在的总脂质的约0.2摩尔％至约50摩尔％、约0.25摩尔％至约30摩尔％、约0.5摩尔％至约25摩尔％、约0.75摩尔％至约25摩尔％、约1摩尔％至约25摩尔％、约1摩尔％至约20摩尔％、约1摩尔％至约15摩尔％、约1摩尔％至约10摩尔％、约1摩尔％至约5摩尔％、约1.5摩尔％至约25摩尔％、约1.5摩尔％至约20摩尔％、约1.5摩尔％至约15摩尔％、约1.5摩尔％至约10摩尔％、约1.5摩尔％至约5摩尔％、约2摩尔％至约25摩尔％、约2摩尔％至约20摩尔％、约2摩尔％至约15摩尔％、约2摩尔％至约10摩尔％或约2摩尔％至约5摩尔％。
本文所述的RNALNP的平均直径的范围在一实施方案中是约30nm至约1000nm、约30nm至约800nm、约30nm至约700nm、约30nm至约600nm、约30nm至约500nm、约30nm至约450nm、约30nm至约400nm、约30nm至约350nm、约30nm至约300nm、约30nm至约250nm、约30nm至约200nm、约30nm至约190nm、约30nm至约180nm、约30nm至约170nm、约30nm至约160nm、约30nm至约150nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约50nm至约190nm、约50nm至约180nm、约50nm至约170nm、约50nm至约160nm、或约50nm至约150nm。
在某些实施方案中，本文所述的RNALNP的平均直径的范围是约40nm至约800nm、约50nm至约700nm、约60nm至约600nm、约70nm至约500nm、约80nm至约400nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、或约200nm至约400nm。
本文所述的例如通过本文所述方法制备的RNALNP，表现出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或约0.05或更小的多分散性指数。例如，RNALNP可以表现出在约0.05至约0.2范围内的多分散性指数，如约0.05至约0.1。
在本公开的某些实施方案中，本文所述的RNALNP中的RNA的浓度为约2mg/l至约5g/l、约2mg/l至约2g/l、约5mg/l至约2g/l、约10mg/l至约1g/l、约50mg/l至约0.5g/l或约100mg/l至约0.5g/l。在特定的实施方案中，所述RNA浓度为约5mg/l至约150mg/l、约0.005mg/mL至约0.09mg/mL、约0.005mg/mL至约0.08mg/mL、约0.005mg/mL至约0.07mg/mL、约0.005mg/mL至约0.06mg/mL或约0.005mg/mL至约0.05mg/mL。
包含RNA颗粒的组合物
本文所述的组合物可以包含RNA LNP，优选多个RNALNP。术语“多个RNALNP”或“多个RNA-脂质颗粒”是指一定数量的颗粒的群体。在某些实施方案中，该术语是指超过10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022或1023或更多颗粒的群体。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含尺寸为至少10μm的颗粒，其量小于4000/ml，优选至多3500/ml，如至多3400/ml、至多3300/ml、至多3200/ml、至多3100/ml或至多3000/ml。
本领域技术人员会清楚的是，多个颗粒可以包括前述范围的任何分数或其中的任何范围。
在一些实施方案中，本文所述的组合物是液体或固体，其中固体是指冷冻形式。
本发明人令人惊讶地发现，在包含LNP的组合物中使用基于上述特定缓冲物质、特别是TEA及其质子化形式的特定缓冲系统代替PBS，抑制了非常稳定折叠形式(在本文中也称为“光迁移物质(LMS)”)的RNA的形成。
此外，本申请证实了令人惊讶地是，通过使用这种缓冲系统，可以获得一种RNA组合物，其在以液体形式储存约3个月后具有提高的RNA完整性。因此，通过所要求保护的方法制备组合物提供了改进的稳定性，可以在符合制药实践中的常规技术的温度范围内储存，并提供了即用型制品。
如本文所用，关于颗粒(如LNP)的尺寸(Z平均)的表述“等于”或“基本上等于”是指在处理步骤之后(例如，在冷冻/解冻循环之后)包含在组合物中的颗粒的Z平均值对应于加工步骤之前(例如，冷冻/解冻循环之前)的颗粒的Z平均值±30％(优选±25％，更优选±24％，如±20％、±15％、±10％、±5％或±1％)。例如，如果包含在尚未经历冷冻/解冻循环的组合物中的颗粒(如LNP)的尺寸(Z平均)值为90nm，并且包含在经历冷冻/融化循环的组合物中的颗粒(如LNP)的尺寸(Z平均)值为115nm，则在冷冻/解冻循环之后、即在解冻冷冻组合物之后的颗粒的尺寸(Z平均)认为(基本上)等于在冷冻/解冻循环之前、即在冷冻组合物之前的颗粒的尺寸(Z平均)。如本文所用，关于颗粒(如LNP)的尺寸分布或PDI的表述“等于”或“基本上等于”应相应解释。例如，如果包含在尚未经历冷冻/解冻循环的组合物中的颗粒(如LNP)的PDI值为0.30，并且包含在经历冷冻/融化循环的组合物中的颗粒(如LNP)的PDI值为0.38，则在冷冻/解冻循环之后、即在解冻冷冻组合物之后的颗粒的PDI认为(基本上)等于在冷冻/解冻循环之前、即在冷冻组合物之前的颗粒的PDI。
本文所述的组合物还可以包含冷冻保护剂(特别是如果组合物为冷冻形式或者需要经历至少一个冷冻步骤或至少一个冷冻/解冻循环)和/或表面活性剂作为稳定剂，以避免产品质量的显著损失，特别是在储存和/或冷冻期间RNA活性的显著损失，例如以减少或防止聚集、颗粒坍塌、RNA降解和/或其他类型的损害。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是碳水化合物。如本文所用，术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是单糖。如本文所用，术语“单糖”是指不可以水解为更简单的碳水化合物单元的单个碳水化合物单元(例如，单糖(simple sugar))。示例性单糖冷冻保护剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是二糖。如本文所用，术语“二糖”是指由2个单糖单元形成的化合物或化学部分，单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4键或1-6键键合在一起。二糖可以水解为两个单糖。示例性二糖冷冻保护剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。
术语“三糖”表示连接在一起形成一个分子的三个糖。三糖的实例包括棉子糖和松三糖。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是寡糖。如本文所用，术语“寡糖”是指由3至约15个，优选3至约10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4个键或1-6个键键合在一起，形成线性、支化或环状结构。示例性寡糖冷冻保护剂包括环糊精、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可以被氧化或还原。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是环状寡糖。如本文所用，术语“环状寡糖”是指由3至约15个，优选6、7、8、9或10个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4个键或1-6个键键合在一起，形成环状结构。示例性环状寡糖冷冻保护剂包括作为离散化合物的环状寡糖，如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。
其他示例性环状寡糖冷冻保护剂包括这样的化合物，其包括较大分子结构中的环糊精部分，如包含环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可以被氧化或还原，例如，氧化为二羰基形式。如本文所用，术语“环糊精部分”是指环糊精(例如，α、β或γ环糊精)基团，其掺入到较大分子结构如聚合物中或是其一部分。环糊精部分可以直接或通过任选存在的接头键合至一个或多个其他部分。环糊精部分可以被氧化或还原，例如，氧化为二羰基形式。
碳水化合物冷冻保护剂，例如，环状寡糖冷冻保护剂，可以是衍生的碳水化合物。例如，在一实施方案中，冷冻保护剂是衍生的环状寡糖，例如，衍生的环糊精，例如，2-羟丙基-β-环糊精，例如，部分醚化的环糊精(例如，部分醚化的β环糊精)。
示例性冷冻保护剂是多糖。如本文所用，术语“多糖”是指由至少16个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键，例如通过1-4个键或1-6个键键合在一起，形成线性、支化或环状结构，并且包括含有多糖作为其骨架结构一部分的聚合物。在骨架中，多糖可以是线性或环状的。示例性多糖冷冻保护剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糖糊精等。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是糖醇。如本文所用，术语“糖醇”是指含有至少两个碳原子和附着至每个碳原子的一个羟基的有机化合物。通常，糖醇来源于糖(例如，通过糖的氢化)，并且是水溶性固体。如本文所用，术语“糖”是指甜味的可溶性碳水化合物。糖醇的实例包括乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇(iditol)、肌醇、庚七醇、异麦芽糖酮醇(isomalt)、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇和聚糖醇(polyglycitol)。在一实施方案中，糖醇具有式HOCH2(CHOH)nCH2OH，其中n为0-22(例如，0、1、2、3或4)，或其环状变体(通常可以通过糖醇脱水得到环状醚而衍生；例如异山梨醇是山梨醇的环状脱水变体)。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是低级醇，如具有最多6个碳原子(优选至少2个，最多5、4或3个碳原子)的醇(特别是脂肪醇)。在优选的实施方案中，低级醇与水完全互溶。在一些实施方案中，冷冻保护剂选自乙醇、丙醇、1,2-丙二醇和1,3-丙二醇。
在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘油和/或山梨醇。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)可以包括蔗糖作为冷冻保护剂。不希望受理论束缚，蔗糖的作用是促进组合物的冷冻保护，从而防止核酸(尤其是RNA)颗粒聚集并保持组合物的化学和物理稳定性。某些实施方案在本公开中考虑蔗糖的替代冷冻保护剂。替代稳定剂包括但不限于葡萄糖、甘油和山梨醇，优选葡萄糖和甘油。
优选的冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合。在一些实施方案中，冷冻保护剂选自蔗糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇和葡萄糖，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖。在一优选的实施方案中，冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。在一更优选的实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。在一些其他优选的实施方案中，冷冻保护剂是甘油。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)包含冷冻保护剂，其浓度为至少1％w/v，如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v、至少8％w/v或至少9％w/v。在一些实施方案中，组合物中冷冻保护剂的浓度为最高25％w/v，如最高20％w/v、最高19％w/v、最高18％w/v、最高17％w/v、最高16％w/v、最高15％w/v、最高14％w/v、最高13％w/v、最高12％w/v或最高11％w/v。在一些实施方案中，组合物中冷冻保护剂的浓度为1％w/v至20％w/v，如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNA LNP组合物)包含冷冻保护剂(如蔗糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖或其组合，特别是蔗糖和/或甘油)，(总)浓度为5％w/v至15％w/v，如6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v或9％w/v至11％w/v，或者浓度为约10％w/v。
在一些实施方案中，特别是组合物为冷冻形式的那些，优选冷冻保护剂的浓度在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间。
优选地，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)包含冷冻保护剂，其浓度导致组合物的重量摩尔渗透压浓度基于组合物总重量为约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约1渗透压摩尔/kg(如约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约900x 10-3渗透压摩尔/kg、约120x10-3渗透压摩尔/kg至约800x 10-3渗透压摩尔/kg、约140x 10-3渗透压摩尔/kg至约700x 10-3渗透压摩尔/kg、约160x 10-3渗透压摩尔/kg至约600x 10-3渗透压摩尔/kg、约180x 10-3渗透压摩尔/kg至约500x 10-3渗透压摩尔/kg或约200x 10-3渗透压摩尔/kg至约400x 10-3渗透压摩尔/kg)，例如，约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约400x 10-3渗透压摩尔/kg(如约50x 10-3渗透压摩尔/kg至约390x 10-3渗透压摩尔/kg、约60x 10-3渗透压摩尔/kg至约380x 10-3渗透压摩尔/kg、约70x 10-3渗透压摩尔/kg至约370x10-3渗透压摩尔/kg、约80x 10-3渗透压摩尔/kg至约360x 10-3渗透压摩尔/kg、约90x 10-3渗透压摩尔/kg至约350x 10-3渗透压摩尔/kg、约100x10-3渗透压摩尔/kg至约340x 10-3渗透压摩尔/kg、约120x 10-3渗透压摩尔/kg至约330x10-3渗透压摩尔/kg、约140x 10-3渗透压摩尔/kg至约320x 10-3渗透压摩尔/kg、约160x 10-3渗透压摩尔/kg至约310x 10-3渗透压摩尔/kg、约180x 10-3渗透压摩尔/kg至约300x 10-3渗透压摩尔/kg或约200x 10-3渗透压摩尔/kg至约300x 10-3渗透压摩尔/kg)。
在一些实施方案中，特别是组合物为冷冻形式的那些，优选组合物的pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。
在一些实施方案中，特别是组合物为冷冻形式的那些，优选组合物(a)包含冷冻保护剂；(b)pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5；或者(c)包含冷冻保护剂且pH在4.0至8.0之间，优选在5.0至7.0之间，更优选在5.5至6.5之间，最优选约5.5。在一些实施方案中，冷冻保护剂(i)选自本文公开的冷冻保护剂；和/或(ii)以本文公开的浓度存在。例如，冷冻保护剂可以选自蔗糖、甘油、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖及其组合，如选自蔗糖、甘油和葡萄糖；和/或浓度可以在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间。在一些实施方案中，冷冻保护剂是甘油，任选地，其浓度在约100mM至约600mM之间，优选在约200mM至约600mM之间，更优选在约300mM至约500mM之间。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)包含蔗糖作为冷冻保护剂(例如，浓度在约100mM至约600mM之间，优选约200mM至约600mM之间，更优选约300mM至约500mM之间)以及叔胺或环胺(如本文定义的式N(R1)(R2)(R3))作为缓冲物质，优选以本文指定的量/浓度。在一些实施方案中，叔胺包含或是TEA或其质子化形式。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)包含甘油作为冷冻保护剂(例如，浓度在约100mM至约600mM之间，优选约200mM至约600mM之间，更优选约300mM至约500mM之间)以及叔胺或环胺(如本文定义的式N(R1)(R2)(R3))作为缓冲物质，优选以本文指定的量/浓度。在一些实施方案中，叔胺包含或是TEA或其质子化形式。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)包含1,2-丙二醇作为冷冻保护剂(例如，浓度在约100mM至约600mM之间，优选约200mM至约600mM之间，更优选约300mM至约500mM之间)以及叔胺或环胺(如本文定义的式N(R1)(R2)(R3))作为缓冲物质，优选以本文指定的量/浓度。在一些实施方案中，叔胺包含或是TEA或其质子化形式。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)包含1,3-丙二醇作为冷冻保护剂(例如，浓度在约100mM至约600mM之间，优选约200mM至约600mM之间，更优选约300mM至约500mM之间)以及叔胺或环胺(如本文定义的式N(R1)(R2)(R3))作为缓冲物质，优选以本文指定的量/浓度。在一些实施方案中，叔胺包含或是TEA或其质子化形式。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)包含葡萄糖作为冷冻保护剂(例如，浓度在约100mM至约600mM之间，优选约200mM至约600mM之间，更优选约300mM至约500mM之间)以及叔胺或环胺(如本文定义的式N(R1)(R2)(R3))作为缓冲物质，优选以本文指定的量/浓度。在一些实施方案中，叔胺包含或是TEA或其质子化形式。
在一些可选的实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNALNP组合物)基本上不含冷冻保护剂，例如它们不含任何冷冻保护剂，并且包含叔胺或环胺(如本文定义的式N(R1)(R2)(R3))作为缓冲物质，优选以本文指定的量/浓度。在一些实施方案中，叔胺包含或是TEA或其质子化形式。
本公开的某些实施方案考虑了在本文所述的RNA组合物(如RNA LNP组合物)中使用螯合剂。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键，从而产生稳定的水溶性络合物的化合物。不希望受理论束缚，螯合剂降低游离二价离子的浓度，其在本公开中其可能诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA的盐、去铁草酰胺B、去铁胺、二硫卡宾钠(dithiocarb sodium)、青霉胺、喷替酸钙、喷替酸(pentetic acid)的钠盐、二巯基丁二酸(succimer)、曲恩汀、次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid)、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)和双(氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N',N'-四乙酸。在某些实施方案中，螯合剂是EDTA或EDTA的盐。在一示例性实施方案中，螯合剂是EDTA二钠二水合物。在一些实施方案中，EDTA的浓度为约0.05mM至约5mM、约0.1mM至约2.5mM或约0.25mM至约1mM。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物(如RNA LNP组合物)的水相不包含螯合剂。例如，优选的是，如果本文所述的RNA组合物(如RNA LNP组合物)包含螯合剂，则所述螯合剂仅存在于LNP中，如果有的话。
药物组合物
本文所述的RNA组合物可用作或用于制备用于治疗或预防性治疗的药物组合物或药物。
本文所述的RNA组合物可以以任何合适的药物组合物的形式给药。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效物质的组合物，优选与药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂一起组合。通过向受试者给药药物组合物，所述药物组合物可用于治疗、预防疾病或病症或者降低疾病或病症的严重程度。在本公开的上下文中，药物组合物包含如本文所述的RNA。
本公开的药物组合物可以包含一种或多种佐剂，或者可以与一种或多种佐剂一起给药。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含一组异质化合物如油乳剂(例如，弗氏佐剂)、矿物质化合物(如明矾)、细菌产物(如百日咳杆菌毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFa、INF-γ、GM-CSF、LT-a。进一步已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油如ISA51。用于本公开的其他合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys，以及亲脂性组分，例如皂苷、海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(TDB)、单磷酰脂质-A(MPL)、单分枝酰基甘油(MMG)或吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)。
本公开的药物组合物可以是冷冻形式或“即用形式”(即，以一种形式，特别是液体形式，其可以立即向受试者给药，例如无需任何处理，如解冻、重建或稀释)。因此，在给药可储存形式的药物组合物之前，必须将这种可储存形式加工或转变为即用型或可给药形式。例如，冷冻的药物组合物必须解冻。即用型注射剂可以装在容器中，如小瓶、安瓿或注射器，其中所述容器可以含有一个或多个剂量。
在一些实施方案中，药物组合物为冷冻形式，并且可以在约-90℃或更高的温度下储存，如约-90℃至约-10℃。例如，本文所述的冷冻药物组合物(如通过第三、第四、第五或第八方面的方法制备的冷冻组合物，或者第一、第二、第七、第七、第十、第十一或第十二方面的冷冻组合物)可以在约-90℃至约-10℃的温度范围内储存，如约-905℃至约-40℃或约-40℃至约-25℃，或约-25℃至约-10℃，或约-20℃的温度。
在冷冻形式的药物组合物的一些实施方案中，可以将药物组合物储存至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周。例如，可以将冷冻药物组合物在-20℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月。
在冷冻形式的药物组合物的一些实施方案中，冷冻药物组合物解冻后的RNA完整性为至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或基本上100％，例如，解冻已在-20℃下储存(例如，至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周)的冷冻组合物后。在冷冻形式的药物组合物的一些实施方案中，冷冻药物组合物解冻后的RNA完整性为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或基本上100％，例如，解冻已在-20℃下储存(例如，至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周)的冷冻组合物后。
在一些实施方案中，药物组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)为至少50％，冷冻组合物解冻后组合物的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％，更优选基本上100％。
在冷冻形式的药物组合物的一些实施方案中，冷冻药物组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI基本上等于冷冻前LNP的尺寸(Z平均)和/或者尺寸分布和/或PDI。例如，如果由本文所述的冷冻药物组合物制备即用型药物组合物，优选包含在即用型药物组合物中的LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI基本上等于冷冻前包含在冷冻药物组合物中(如包含在第二方面的方法的步骤(I)制备的制剂中)的LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
在一些实施方案中，在一次冷冻/解冻循环后，优选在两次冷冻/解冻循环后，更优选在三次冷冻/解冻循环后，更优选在四次冷冻/解冻循环后，更优选在五次冷冻/解冻循环或更多次后，药物组合物的RNA颗粒的尺寸和RNA完整性基本上与初始药物组合物(即，药物组合物第一次冷冻之前)的RNA颗粒的尺寸和RNA完整性基本上相同(即，基本上相等)。
在一些实施方案中，药物组合物为液体形式，并且可以在约0℃至约20℃的温度范围内储存。例如，本文所述的液体药物组合物(如通过第二、第四或第七方面的方法制备的液体组合物，或者第五、第八、第九或第十方面的液体组合物)可以在约1℃至约15℃的温度范围内储存，如约2℃至约10℃，或约2℃至约8℃，或约5℃的温度。
在液体形式的药物组合物的一些实施方案中，可以将药物组合物储存至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月，优选至少4周。例如，可以将液体药物组合物在5℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，更优选至少6个月。
在液体形式的药物组合物的一些实施方案中，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，液体组合物的RNA完整性足以产生期望的效果，例如诱导免疫应答。例如，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，与初始组合物的RNA完整性(即，组合物储存前的RNA完整性)相比，液体组合物的RNA完整性可以为至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。在一些实施方案中，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，与初始组合物的RNA完整性(即，组合物储存前的RNA完整性)相比，液体组合物的RNA完整性为至少90％。在一些实施方案中，优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少4周(例如，至少3个月)后，与储存前的RNA完整性相比，组合物的RNA完整性为至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％。在一些实施方案中，优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少4周(例如，至少3个月)后，与储存前的RNA完整性相比，组合物的RNA完整性为至少90％。
在一些实施方案中，药物组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)为至少50％，药物组合物优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月或至少3个月)后的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％，优选至少95％，更优选至少97％，更优选至少98％。在一些实施方案中，药物组合物的初始RNA完整性(即，在其制备后但储存前)为至少50％，药物组合物优选在0℃或更高的温度下，如约2℃至约8℃，储存至少1周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月或至少3个月)后的RNA完整性为初始RNA完整性的至少90％。
在液体形式的药物组合物的一些实施方案中，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，药物组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))足以产生期望的效果，例如诱导免疫应答。例如，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周(如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月或至少6个月)时，药物组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))基本上等于初始药物组合物(即在储存之前)的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一些实施方案中，药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，LNP的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一些实施方案中，药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)基本上等于储存之前的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一些实施方案中，药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少1周(如至少4周或至少3个月)后，LNP的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
根据本公开的药物组合物一般以“药学有效量”和在“药学可接受的制剂”中应用。
术语“药学可接受的”是指物质的无毒性，其不与药物组合物的活性组分的作用相互作用。
术语“药学有效量”是指单独或与进一步的剂量一起实现期望反应或期望效果的量。在治疗特定疾病的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病过程。这包括减缓疾病的发展，特别是中断或逆转疾病的发展。治疗疾病中的期望反应还可以是延迟疾病或疾病状况的发生或者防止其发生。本文所述的颗粒或药物组合物的有效量取决于待治疗的疾病状况，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、体形和体重，治疗的持续时间，伴随疗法的类型(如果存在)，给药的具体途径以及类似因素。因此，本文所述的颗粒或药物组合物的给药剂量可以取决于各种这样的参数。在患者对初始剂量的反应不足的情况下，可以使用更高的剂量(或者通过不同的、更局部化的给药途径达到的有效的更高剂量)。
在特定的实施方案中，本公开的药物组合物(例如，免疫原性组合物，即可以用于诱导免疫应答的药物组合物)在容器(例如，小瓶)中配制为单剂量。在一些实施方案中，将免疫原性组合物配制为小瓶中的多剂量制剂。在一些实施方案中，多剂量制剂包括至少2个剂量/小瓶。在一些实施方案中，多剂量制剂包括总计2-20个剂量/小瓶，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个剂量/小瓶。在一些实施方案中，小瓶中的每个剂量体积相等。在一些实施方案中，第一剂量是与后续剂量不同的体积。
“稳定的”多剂量制剂优选表现出没有不可接受的微生物生长水平，并且基本上没有或没有活性生物分子组分的分解或降解。如本文所用，“稳定的”免疫原性组合物包括在给药至受试者时仍能够引发期望的免疫应答的制剂。
本公开的药物组合物可以含有缓冲剂(特别是衍生自RNA组合物，用其制备药物组合物)、防腐剂和任选存在的其他治疗剂。在一实施方案中，本公开的药物组合物、特别是即用型药物组合物，包含一种或多种药学可接受的载剂、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
如本文所用的术语“赋形剂”是指可以存在于本公开的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载剂、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、增香剂或着色剂。
“药学可接受的盐”包括例如酸加成盐，其可以例如通过使用药学可接受的酸形成，如盐酸、乙酸、乳酸、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)或苯甲酸。此外，合适的药学可接受的盐可以包括碱金属盐(例如，钠盐或钾盐)；碱土金属盐(例如，钙盐或镁盐)；铵盐(NH4+)；以及与合适的有机配体(例如，季铵和胺阳离子)形成的盐。药学可接受的盐的说明性实例可以在现有技术中找到；参见，例如，S.M.Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.,66,pp.1-19(1977))。不是药学可接受的盐可以用于制备药学可接受的盐，并且包括在本公开中。
术语“稀释剂”涉及使得可以稀释和/或变稀释的物质。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇和水。
术语“载剂”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，其中组合了活性组分以促进、增强或使药物组合物的给药成为可能。如本文所用的载剂可以是一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适合向受试者给药。合适的载剂包括但不限于无菌水、林格氏液、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧-丙烯共聚物。
用于治疗用途的药学可接受的载剂、赋形剂或稀释剂在药学领域众所周知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaroedit.1985)中进行了描述。
药物载剂、赋形剂或稀释剂可以根据预期的给药途径和标准药物实践进行选择。
药物组合物的给药途径
在一实施方案中，本文所述的组合物，如本文所述的药物组合物或即用型药物组合物，可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、经皮肤、经鼻内、肌肉内或肿瘤内给药。在某些实施方案中，将(药物)组合物配制为用于局部给药或全身给药。全身给药可以包括肠道给药，其包括通过胃肠道吸收，或者肠胃外给药。如本文所用，术语“肠胃外给药”是指以通过胃肠道以外的任何方式给药，如通过静脉内注射。在一优选的实施方案中，(药物)组合物、特别是即用型药物组合物配制为用于全身给药。在另一优选的实施方案中，全身给药是通过静脉内给药。在另一优选的实施方案中，将(药物)组合物、特别是即用型药物组合物配制为用于肌肉内给药。
药物组合物的用途
本文所述的RNA组合物可以用于各种疾病的治疗性或预防性治疗，特别是在向受试者提供肽或蛋白导致治疗或预防效果的疾病中。例如，提供源自病毒的抗原或表位可以用于治疗或预防由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可以用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。提供功能性蛋白或酶可以用于治疗以功能失调的蛋白为特征的遗传性疾病，例如溶酶体贮积病(例如粘多糖贮积病)或因子缺乏症。提供细胞因子或细胞因子融合物可以用于调节肿瘤微环境。
术语“疾病”(在本文中也称作“病症”)是指影响个体身体的异常状况。疾病通常解释为与特定症状或体征相关的医学状况。疾病可能是由源自外部来源的因素引起的，如传染病，或者其可能是由内部功能失调引起的，如自身免疫性疾病。在人中，“疾病”通常更广泛地用于指引起患病个体的疼痛、功能障碍、窘迫、社会问题或死亡或者与个体接触的人的相似问题的任何状况。在这个更广泛的意义上，其有时包括损伤、残疾、病症、综合征、感染、孤立症状、偏差行为以及结构和功能的非典型变化，但是在其他上下文中和为了其他目的，这些可以认为是可区分的类别。疾病通常不仅在身体上，而且还在情感上影响个体，因为感染和患有许多疾病可以改变一个人的人生观和一个人的性格。
术语“传染病”是指可以从个体传播至个体或从生物体传播至生物体的任何疾病，并且是由微生物因子引起的。传染病是本领域已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生虫性疾病，所述疾病分别是由病毒、细菌和寄生虫引起的。在这方面，传染病可以是例如性传播疾病(例如，衣原体病、淋病或梅毒)、SARS、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、麻疹、水痘、巨细胞病毒感染、生殖器疱疹、肝炎(如乙型肝炎或丙型肝炎)、流感(流感，如人流感、猪流感、犬流感、马流感和禽流感)、HPV感染、带状疱疹、狂犬病、普通感冒、胃肠炎、风疹、腮腺炎、炭疽、霍乱、白喉、食源性疾病、麻风病、脑膜炎、消化性溃疡病、肺炎、脓毒、败血性休克、破伤风、结核病、伤寒、尿路感染、莱姆病、落基山斑疹热、衣原体病、百日咳、破伤风、脑膜炎、猩红热、疟疾、锥虫病、恰加斯病、利什曼病、滴虫病、双核阿米巴病、贾第虫病、阿米巴痢疾、球虫病、弓形虫病、肉孢子虫病、鼻孢子虫病和小袋纤毛虫病。
在一些实施方案中，本文所述的RNA组合物可以用于传染病的治疗性或预防性治疗。
在本文中，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗性干预”涉及为了对抗疾病状况如疾病或病症的目的而对受试者的管理和护理。该术语旨在包括对受试者所患的给定疾病状况的全范围治疗，如给药治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延迟疾病、病症或疾病状况的发展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、病症或疾病状况以及预防疾病状况，其中预防应理解为为了对抗疾病、疾病状况或病症的目的而对个体的管理和护理，并且包括给药活性化合物以预防症状或并发症的发生。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状态和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体的疾病，阻止或减缓个体的疾病发展，抑制或减缓个体的疾病发展，降低个体症状的频率或严重程度，和/或减少当前患有或以前患有疾病的个体中的复发。
术语“预防性治疗”或“预防治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。它们是指人或另一哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)，或任何其他非哺乳动物动物，包括鸟类(鸡)、鱼类或任何其他动物物种，这些动物可能困扰于或易患疾病或病症(例如，癌症、传染病)，但可能患有或可能不患有疾病或病症，或者可能需要预防性干预如疫苗接种，或者可能需要蛋白替代疗法等干预措施。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“受试者”并不表示特定年龄，因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开的实施方案中，“个体”或“受试者”是“患者”。
术语“患者”表示治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。
在本公开的一些实施方案中，目的是通过疫苗接种来提供对传染病的保护。
在本公开的一些实施方案中，目的是向受试者、特别是有此需要的受试者提供分泌的治疗蛋白，例如抗体、双特异性抗体、细胞因子、细胞因子融合蛋白、酶。
在本公开的一些实施方案中，目的是向受试者、特别是有此需要的受试者提供蛋白替代疗法，如产生红细胞生成素、因子VII、血管性血友病因子、β-半乳糖苷酶、α-N-乙酰基葡糖苷酶。
在本公开的一些实施方案中，目的是调节/重新编程血液中的免疫细胞。
在本公开的一些实施方案中(特别是与抑制性RNA有关的那些实施方案)，目的是减少或抑制肽或多肽的表达(如靶mRNA的转录和/或翻译)。在一些实施方案中，靶mRNA包含编码药学活性肽或多肽的ORF，特别是其表达(特别是表达增加，例如，与健康受试者中的表达相比)与疾病相关的药学活性肽或多肽。在一些实施方案中，靶mRNA包含编码药学活性肽或多肽的ORF，其表达(特别是表达增加，例如，与健康受试者中的表达相比)与癌症相关。
在一些实施方案中，本文所述的含有编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA组合物(在下文中简称为“SARS-CoV-2S RNA组合物”)在向受试者给药后诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，在受试者中靶向一组不同的S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是天然存在的S蛋白变体。在一些实施方案中，该组不同的S蛋白变体包含至少5种、至少10种、至少15种或甚至更多种S蛋白变体。在一些实施方案中，这样的S蛋白变体包含在RBD结构域中具有氨基酸修饰的变体和/或在RBD结构域外具有氨基酸修饰的变体。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置321(Q)的氨基酸是S。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置321(Q)的氨基酸是L。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置341(V)的氨基酸是I。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置348(A)的氨基酸是T。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置354(N)的氨基酸是D。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置359(S)的氨基酸是N。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置367(V)的氨基酸是F。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置378(K)的氨基酸是S。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置378(K)的氨基酸是R。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置408(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置409(Q)的氨基酸是E。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置435(A)的氨基酸是S。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置439(N)的氨基酸是K。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置458(K)的氨基酸是R。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置472(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置476(G)的氨基酸是S。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置477(S)的氨基酸是N。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置483(V)的氨基酸是A。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置508(Y)的氨基酸是H。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置519(H)的氨基酸是P。在一实施方案中，这样的S蛋白变体包含SARS-CoV-2S蛋白或其天然存在的变体，其中对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。
在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、570(A)、614(D)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、484(E)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、242(L)、243(A)和244(L)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向VOC-202012/01。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向501.V2。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选存在的：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。所述S蛋白变体还可以在对应于SEQ ID NO:1中位置614的位置处包含D->G突变。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)和70(V)的位置处包含缺失的天然存在的S蛋白变体。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)和70(V)的位置处包含缺失的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处的突变：144(Y)、501(N)、570(A)、614(D)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、484(E)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)和1229(M)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向VOC-202012/01。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向“簇5”。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：缺失69-70、Y453F、I692V、M1229I和任选存在的S1147L。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、501(N)、570(A)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、484(E)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)和1229(M)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置484(E)的氨基酸是K。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向VOC-202012/01。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y、D614G和A701V，以及任选存在的：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)和614(D)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y，并且对应于SEQ IDNO:1中位置614(D)的氨基酸是G。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)和614(D)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、570(A)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、484(E)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)和1229(M)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向VOC-202012/01。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y、D614G和A701V，以及任选存在的：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、501(N)、570(A)、614(D)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)、1229(M)、20(T)、26(P)、138(D)、190(R)、417(K)、655(H)、1027(T)和1176(V)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置20(T)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置26(P)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置138(D)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置190(R)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是T。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置655(H)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1027(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1176(V)的氨基酸是F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向501.V2。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选存在的：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。所述S蛋白变体还可以在对应于SEQ ID NO:1中位置614的位置处包含D->G突变。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向“B.1.1.28”。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向“B.1.1.248”。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)和484(E)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y，并且对应于SEQ IDNO:1中位置484(E)的氨基酸是K。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)和484(E)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、570(A)、614(D)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)、1229(M)、20(T)、26(P)、138(D)、190(R)、417(K)、655(H)、1027(T)和1176(V)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置20(T)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置26(P)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置138(D)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置190(R)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是T。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置655(H)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1027(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQID NO:1中位置1176(V)的氨基酸是F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向501.V2。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选存在的：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。所述S蛋白变体还可以在对应于SEQ ID NO:1中位置614的位置处包含D->G突变。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向“B.1.1.248。”
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)、484(E)和614(D)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y，对应于SEQ IDNO:1中位置484(E)的氨基酸是K，并且对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)、484(E)和614(D)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、570(A)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)、1229(M)、20(T)、26(P)、138(D)、190(R)、417(K)、655(H)、1027(T)和1176(V)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置20(T)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置26(P)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置138(D)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置190(R)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置417(K)的氨基酸是T。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置655(H)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1027(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1176(V)的氨基酸是F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和D614G，以及任选存在的：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)、243(A)和244(L)的位置处包含缺失的天然存在的S蛋白变体。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)、243(A)和244(L)的位置处包含缺失的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、501(N)、570(A)、614(D)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、484(E)、701(A)、18(L)、246(R)、417(K)、453(Y)、692(I)、1147(S)、1229(M)、20(T)、26(P)、138(D)、190(R)、417(K)、655(H)、1027(T)和1176(V)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置20(T)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置26(P)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置138(D)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置190(R)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是T。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置655(H)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1027(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1176(V)的氨基酸是F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向501.V2。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和缺失242-244，以及任选存在的：L18F、R246I和K417N。所述S蛋白变体还可以在对应于SEQ ID NO:1中位置614的位置处包含D->G突变。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置417(K)的氨基酸是T。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、501(N)、570(A)、614(D)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、484(E)、701(A)、18(L)、246(R)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)、1229(M)、20(T)、26(P)、138(D)、190(R)、655(H)、1027(T)和1176(V)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置20(T)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置26(P)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置138(D)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置190(R)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置655(H)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1027(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1176(V)的氨基酸是F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向501.V2。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和K417N，以及任选存在的：L18F、R246I和缺失242-244。所述S蛋白变体还可以在对应于SEQ ID NO:1中位置614的位置处包含D->G突变。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向“B.1.1.248。”
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是在对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)和484(E)和/或501(N)的位置处包含突变的天然存在的S蛋白变体。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是N，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K和/或对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)的氨基酸是T，对应于SEQ ID NO:1中位置484(E)的氨基酸是K和/或对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。
在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1中位置417(K)和484(E)和/或501(N)的位置处包含突变的S蛋白变体可以包含一个或多个其他突变。这样的一个或多个其他突变可以选自在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处的突变：69(H)、70(V)、144(Y)、570(A)、614(D)、681(P)、716(T)、982(S)、1118(D)、80(D)、215(D)、701(A)、18(L)、246(R)、242(L)、243(A)、244(L)、453(Y)、692(I)、1147(S)、1229(M)、20(T)、26(P)、138(D)、190(R)、655(H)、1027(T)和1176(V)。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置69(H)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置70(V)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置144(Y)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置570(A)的氨基酸是D。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置614(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置681(P)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置716(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置982(S)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1118(D)的氨基酸是H。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置80(D)的氨基酸是A。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置215(D)的氨基酸是G。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置701(A)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置18(L)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置246(R)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置242(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置243(A)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置244(L)的氨基酸缺失。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置453(Y)的氨基酸是F。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置692(I)的氨基酸是V。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1147(S)的氨基酸是L。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1229(M)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置20(T)的氨基酸是N。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置26(P)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置138(D)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置190(R)的氨基酸是S。在一实施方案中，对应于SEQ IDNO:1中位置655(H)的氨基酸是Y。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1027(T)的氨基酸是I。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置1176(V)的氨基酸是F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向501.V2。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和K417N，以及任选存在的：L18F、R246I和缺失242-244。所述S蛋白变体还可以在对应于SEQ ID NO:1中位置614的位置处包含D->G突变。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向“B.1.1.248。”
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处包含以下突变的S蛋白变体：L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向Omicron(B.1.1.529)变体。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ IDNO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个或至少37个：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A、N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del、N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del、L141del、Y144F、Y145D、G142del。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ IDNO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或全部：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A。所述S蛋白变体可以包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del，和/或可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del。在一些实施方案中，所述S蛋白变体可以包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个或全部：L141del、Y144F、Y145D、G142del。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ IDNO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个或至少33个：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ IDNO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导抗体应答，特别是中和抗体应答，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ IDNO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导免疫应答(细胞和/或抗体应答，特别是中和抗体应答)，其靶向Omicron(B.1.1.529)变体。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导免疫应答(细胞和/或抗体应答，特别是中和抗体应答)，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个或至少37个：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A、N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del、N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del、L141del、Y144F、Y145D、G142del。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导免疫应答(细胞和/或抗体应答，特别是中和抗体应答)，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或全部：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A。所述S蛋白变体可以包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del，和/或可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del。在一些实施方案中，所述S蛋白变体可以包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个或全部：L141del、Y144F、Y145D、G142del。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导免疫应答(细胞和/或抗体应答，特别是中和抗体应答)，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个或至少33个：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导免疫应答(细胞和/或抗体应答，特别是中和抗体应答)，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一些实施方案中，向受试者给药后，本文所述的SARS-CoV-2S RNA组合物在受试者中诱导免疫应答(细胞和/或抗体应答，特别是中和抗体应答)，其靶向S蛋白变体，所述S蛋白变体包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
如本文所用的术语“对应于位置…的氨基酸”是指对应于SARS-CoV-2S蛋白中氨基酸位置编号的氨基酸位置编号，特别是SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列。短语“与SEQ IDNO:1相比”等同于“在对应于SEQ ID NO:1中以下位置的位置处”。其他冠状病毒S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体中的相应氨基酸位置可以通过与SARS-CoV-2S蛋白进行比对来找到，特别是与SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列进行比对。如何比对序列或序列中的片段，从而确定根据本发明的氨基酸序列在序列中的相应位置在本领域中是公知的。可以使用标准序列比对程序如ALIGN、ClustalW或相似程序，通常用默认设置。
在一些实施方案中，抗体应答靶向的一组不同的S蛋白变体包含至少5个、至少10个、至少15个或甚至更多个选自以下的S蛋白变体：上文描述的Q321S、V341I、A348T、N354D、S359N、V367F、K378S、R408I、Q409E、A435S、K458R、I472V、G476S、V483A、Y508H、H519P和D614G变体。在一些实施方案中，抗体应答靶向的一组不同的S蛋白变体包含选自以下的所有S蛋白变体：上文描述的Q321S、V341I、A348T、N354D、S359N、V367F、K378S、R408I、Q409E、A435S、K458R、I472V、G476S、V483A、Y508H、H519P和D614G变体。
在一些实施方案中，抗体应答靶向的一组不同的S蛋白变体包含至少5个、至少10个、至少15个或甚至更多个选自以下的S蛋白变体：上文描述的Q321L、V341I、A348T、N354D、S359N、V367F、K378R、R408I、Q409E、A435S、N439K、K458R、I472V、G476S、S477N、V483A、Y508H、H519P和D614G变体。在一些实施方案中，抗体应答靶向的一组不同的S蛋白变体包含选自以下的所有S蛋白变体：上文描述的Q321L、V341I、A348T、N354D、S359N、V367F、K378R、R408I、Q409E、A435S、N439K、K458R、I472V、G476S、S477N、V483A、Y508H、H519P和D614G变体。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含本文对S蛋白变体如SARS-CoV-2S蛋白变体，特别是天然存在的S蛋白变体所述的一个或多个突变。在一实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段在对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的位置处包含突变。在一实施方案中，对应于SEQ ID NO:1中位置501(N)的氨基酸是Y。在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含选自VOC-202012/01、501.V2、簇5和B.1.1.248的SARS-CoV-2变体的SARS-CoV-2S蛋白的一个或多个突变，如所有突变。在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含在SEQ ID NO:1的位置80具有丙氨酸取代，在位置215具有甘氨酸取代，在位置484具有赖氨酸取代，在位置501具有酪氨酸取代，在位置701具有缬氨酸取代，在位置18具有苯丙氨酸取代，在位置246具有异亮氨酸取代，在位置417具有天冬酰胺取代，在位置614具有甘氨酸取代，在位置242-244缺失以及在位置986和987具有脯氨酸取代的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个、至少34个、至少35个、至少36个或至少37个：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A、N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del、N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del、L141del、Y144F、Y145D、G142del。在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或全部：T547K、H655Y、D614G、N679K、P681H、N969K、S373P、S371L、N440K、G339D、G446S、N856K、N764K、K417N、D796Y、Q954H、T95I、A67V、L981F、S477N、G496S、T478K、Q498R、Q493R、E484A。所述SARs-CoV-2S蛋白、变体或片段可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N501Y、S375F、Y505H、V143del、H69del、V70del，和/或可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或全部：N211del、L212I、ins214EPE、G142D、Y144del、Y145del。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2蛋白、变体或片段可以包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少1个、至少2个、至少3个或全部：L141del、Y144F、Y145D、G142del。在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变中的至少10个、至少15个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少28个、至少29个、至少30个、至少31个、至少32个、至少33个：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K和L981F。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段与SEQ ID NO:1相比，包含K986P和V987P。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F、K986P和V987P。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含与SEQ ID NO:1相比的以下突变：A67V、Δ69-70、T95I、G142D、Δ143-145、Δ211、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F、K986P和V987P。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQID NO:42的氨基酸序列或与SEQ ID NO:42的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或者SEQID NO:45的氨基酸序列或与SEQ ID NO:45的氨基酸序列具有至少99.5％、99％、98.5％、98％、98.5％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一些实施方案中，例如，如本文所述的RNA编码的包含所述突变的SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者所述SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列。
本领域技术人员会知道免疫疗法和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位免疫受试者来产生对疾病的免疫保护性反应，其与待治疗的疾病在免疫学上相关。因此，本文所述的药物组合物可用于诱导或增强免疫应答。因此本文所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述向个体给药抗原的过程，目的是例如出于治疗或预防原因诱导免疫应答。
本文参考的文件和研究的引用并不意味着承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
提供所述描述(包括以下实施例)是为了使本领域普通技术人员能够制备和使用各种实施方案。特定设备、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文描述的实例的各种修改对于本领域普通技术人员是显而易见的，并且在不背离各种实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可以应用于其他实例和应用。因此，各种实施方案不是为了限制本文描述和示出的实例，而是与符合权利要求的范围一致。
实施例
方法
RNA LNP的制备
本文以脂质X-3作为阳离子可电离脂质的实例来描述制备方案。同样的方案也适用于其他阳离子可电离脂质。因此，也可以如所述制备和稳定具有阳离子可电离脂质和RNA之间的比(N/P比)，例如更高或更低的N/P比的其他制剂，包括负电荷过量的那些制剂，此外，可以使用其他脂质比(磷脂、胆固醇、聚合物缀合脂质)以及其他类型的聚合物缀合脂质(例如，聚肌氨酸脂质)。方案也适用于不含任何聚合物缀合脂质的产品。
通过水相-乙醇混合方案制备RNA LNP。简单地说，将在含水缓冲条件下(例如，50mM柠檬酸盐，pH 4.0)的RNA(如编码包含SARS-CoV-2 S蛋白的氨基酸序列的BNT162b2)与乙醇脂质混合物混合，所述乙醇脂质混合物包含脂质X-3、DSPC、胆固醇和2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺，摩尔比为47.5:10:40.7:1.8，分别为3份RNA和1份脂质混合物的体积比。混合是通过使用T型混合元件的基于标准泵的设置来实现的。将脂质纳米颗粒原胶体用2份缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液50mM，pH 4.0)进一步稀释。总流量在400至2000mL/min之间，例如720ml/min。相对于柠檬酸盐缓冲液(50mM pH 4.0)的TFF(切向流过滤)用于减少乙醇含量和浓缩LNP产物。使用透析盒进行缓冲液交换。在20mM靶缓冲液pH7.4下透析4小时。透析后确定LNP悬浮液的RNA浓度。通过添加10mM靶缓冲液pH7.4，将储备悬浮液调整至相等浓度。然后通过添加适当体积的1M缓冲液pH7.4和40％蔗糖，将每个单独悬浮液的4个等分试样配制在10mM、20mM、50mM或100mM该缓冲液以及10％蔗糖中。将每份1mL的样品密封储存在20-25℃下。
LNP尺寸和多分散性
通过动态光散射(DLS)评估RNALNP制剂/组合物(或其样品)中LNP的平均粒径和尺寸分布。所述方法采用粒度分析仪，其使用173°的反向散射来确定粒径。结果报告为颗粒的Z平均尺寸或流体动力学直径以及多分散性指数。多分散性值用于描述围绕测量的Z平均尺寸拟合的对数正态分布的宽度，并使用颗粒尺寸测定软件中的专有数学计算生成。尺寸和多分散性的结果分别以nm和多分散性指数值报告。将样品在缓冲液或水中稀释至适当浓度。对于本文描述的实验，使用Wyatt DynaPro酶标仪与透明的平底96孔板，含有20μL稀释于100μL水中的样品。使用DYNAMICS 7计算以nm计的流体动力学直径和多分散性指数。
RNA完整性
RNA完整性通过毛细管电泳确定。将用TritonTM X-100/乙醇处理的RNALNP施加至包含在毛细管中的凝胶基质上。RNA及其衍生物、降解物和杂质根据其大小进行分离。凝胶基质含有荧光染料，其与RNA组分特异性结合，从而允许通过CCD检测仪检测的蓝色LED诱导荧光进行检测。激发波长为470nm。通过将RNA主峰的峰面积与总检测峰面积进行比较来确定RNA的完整性，报告为百分比。晚迁移物质(late migrating species,LMS)由比主峰晚检测到的所有信号表示，也表示为主峰面积的百分比。
实施例1
如上所述制备RNA LNP并将其透析至表2所列的缓冲液之一中。
表2.为LNP中延长的RNA和胶体稳定性测试的缓冲物质
缓冲液具有表2中列出的浓度，并且所有样品进一步包含300mM蔗糖。随着时间的推移对RNA完整性进行分析，并且报告为％完整RNA、％作为晚迁移物质(LMS)出现的RNA和％片段化的RNA(从左到右)。所有样品中RNA的起始完整性均为75％。
表3.在19种缓冲液中于室温下储存后的RNA完整性、LMS和降解。
表4.在19种缓冲液中于室温下储存后的LNP尺寸。
当根据表1中示出的缓冲离子的结构元素观察时，表3和4中示出的数据可以得出以下结论：
1.RNA的片段化与胺的类型有关，降解减少的顺序为叔胺或季胺<仲胺<伯胺。
2.与二胺相比，单胺的RNA片段化程度较低。
3.晚迁移物质的产生与缓冲化合物中阴离子部分的存在有关。
4.叔单胺保护RNA免于片段化和LMS形成。
图1-3进一步支持该结论。
胺的类型和RNA降解之间的相关性在图1中更清楚地示出，表明在造成RNA低降解的缓冲液中叔单胺明显富集。在另一方面，伯胺和一些仲胺导致RNA的大量或完全降解(相关性0.86)。
类似地，LMS的形成与缓冲物质中阴离子位点的数量表现出明显的相关性，如图2所示。阴离子部分如磷酸盐、磺酸或羧基促进LMS的形成(相关性0.78)。
图3示出每种缓冲液在其最佳浓度下的RNA降解。性能最佳的缓冲液始终是浓度在20至100mM之间的叔单胺。
实施例2
将含水mRNA溶液和乙醇脂质溶液混合制备脂质纳米颗粒。此后，进行了纯化步骤(使用0.2μm滤器)和复合步骤。具体来说，mRNA在40mM柠檬酸盐缓冲液pH 4.0中提供，最终浓度为0.4mg/mL。在35℃下将脂质溶解于无水EtOH中，最终浓度为30.1mg/mL，并且通过0.2μm PES滤器过滤。为了形成脂质纳米颗粒，使用混合器在RT下将一体积的脂质溶液与三体积的mRNA溶液混合。在这个混合步骤后不久，用两体积的柠檬酸盐缓冲液pH 4.0进行在线(online)稀释步骤，以降低EtOH浓度。然后使用切向流过滤针对柠檬酸盐缓冲液pH 4.0对中间产物进行渗滤(2体积交换)，以进一步降低EtOH浓度。渗滤后，将产物分成6个相等的等分试样，将每个等分试样对如表5所列的不同缓冲液进行透析。
表5：用于每个等分试样的透析的缓冲液
透析后，收集每个等分试样，使用注射器滤器进行0.2μm过滤，并且分析mRNA含量。mRNA定量后，将每个样品分成32个相等的等分试样，并且在每个等分试样中上层(top)加入不同浓度的八种待检测的不同冷冻保护剂之一，如表6所列。
表6：冻融实验中用于每个等分试样上层的冷冻保护剂及其浓度。
靶mRNA浓度为0.1mg/mL。然后将所有等分试样装入96-孔深孔板中，用作冻融实验的起始材料。
这些实验的结果如图4A-D所示。
从图4A-D可以看出，包含蔗糖或甘油作为冷冻保护剂的组合物表现最好，即，即使在5次冷冻/解冻循环后，它们也表现出良好的胶体稳定性。

Claims (143)

1.一种组合物，其包含(i)RNA；(ii)阳离子可电离脂质；和(iii)水相，
其中所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)，它的N-氧化物，或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3中的每一个独立地选自H、C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3；或者R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代；
R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-6亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-6亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；R6各自独立地选自H和C1-3烷基；并且
R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3。
2.权利要求1的组合物，其中
R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1--6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。
3.权利要求1或2的组合物，其中
R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。
4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中
R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，
优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中
R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-4亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，
优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-3亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，
更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-2亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-2烷基。
6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中
R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，
优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，
更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
8.权利要求1-7中任一项的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其中R1、R2和R3都相同。
10.权利要求9的组合物，其中R1、R2和R3都是甲基、乙基或2-羟乙基。
11.权利要求1-8中任一项的组合物，其中R1和R2相同，并且R3与R1和R2不同。
12.权利要求11的组合物，其中R1和R2中的每一个是2-羟乙基、乙基或甲基。
13.权利要求11或12的组合物，其中R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
14.权利要求1的组合物，其中R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代。
15.权利要求14的组合物，其中R3选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R3选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R3选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R3选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，
更优选地，R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
16.权利要求14或15的组合物，其中所述N-杂环是单环，其含有至少一个氮环原子和任选存在的选自O和S的另一个环杂原子。
17.权利要求14-16中任一项的组合物，其中所述N-杂环是单环，其含有(i)一个氮环原子；(ii)两个氮环原子；(iii)一个氮环原子和一个氧环原子；(iv)一个氮环原子和一个硫环原子；或者(v)三个氮环原子。
18.权利要求14-17中任一项的组合物，其中所述N-杂环是单环5-或6-元N-杂环，如单环6-元N-杂环。
19.权利要求14-18中任一项的组合物，其中所述N-杂环选自吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、噁唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、1,3,5-六氢三嗪基、吗啉基和硫代吗啉基，
优选地，所述N-杂环选自哌啶基、哌嗪基、1,2-六氢哒嗪基、1,3-六氢哒嗪基、吗啉基和硫代吗啉基。
20.权利要求14-19中任一项的组合物，其中，如果所述N-杂环仅含有一个氮环原子，则这个氮环原子被R3取代，R3不是H，或者，
如果所述N-杂环含有一个以上的氮环原子，则一个氮环原子被R3取代，R3不是H，并且其他氮环原子中的至少一个，优选其他氮环原子中的每一个，被R5取代。
21.权利要求14-20中任一项的组合物，其中R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
22.权利要求14-21中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌啶基，并且环N原子被R3取代，R3不是H。
23.权利要求14-21中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌嗪基，两个环N原子中的一个被R3取代，R3不是H，并且另一个环N原子任选被R5取代，优选地，另一个环N原子被R5取代。
24.权利要求23的组合物，其中两个环N原子都被取代，并且R5选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
25.权利要求14-24中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，
优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，
更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
26.权利要求14-25中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
27.权利要求14-26中任一项的组合物，其中R3和R5相同。
28.权利要求27的组合物，其中R3和R5均为甲基、乙基、2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基，优选地，R3和R5均为2-羟乙基。
29.权利要求14-26中任一项的组合物，其中R3和R5互不相同。
30.权利要求1的组合物，其中R1是H。
31.权利要求30的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。
32.权利要求30或31的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地。R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。
33.权利要求30-32中任一项的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，
优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，
更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，
更优选地，R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
34.权利要求30-33中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，
优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，
更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
35.权利要求30-34中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
36.权利要求30-35中任一项的组合物，其中R2和R3中的每一个独立地选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基，优选地，R2和R3均为2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基。
37.权利要求1-36中任一项的组合物，其中所述缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
38.权利要求1-37中任一项的组合物，其中所述缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分。
39.一种组合物，其包含(i)RNA；和(ii)水相，其中所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)，它的N-氧化物，或其质子化形式，其中：
R1、R2和R3中的每一个独立地选自H、C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是H、CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3；或者R1、R2和R3中的两个与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代；
R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-6亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-6亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基；并且
R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3。
40.权利要求39的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4、CH(C1-5亚烷基-R4)2和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-5亚烷基-R4)2或C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4、CH(C1-3亚烷基-R4)2和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-3亚烷基-R4)2或C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4、CH(C1-2亚烷基-R4)2和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是CH(C1-2亚烷基-R4)2或C(C1-2亚烷基-R4)3。
41.权利要求39或40的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，其中R1、R2和R3中的至多一个是C(C1-2亚烷基-R4)3。
42.权利要求39-41中任一项的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-6烷基和C1-6亚烷基-R4，
优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-4烷基和C1-4亚烷基-R4，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-3烷基和C1-3亚烷基-R4，
更优选地，R1、R2和R3中的每一个独立地选自C1-2烷基和C1-2亚烷基-R4。
43.权利要求39-42中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-4亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，
优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-3亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-3烷基，
更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(R6)z-(C1-2亚烷基-OH)2-z，其中z各自独立地选自0和1；并且R6各自独立地选自H和C1-2烷基。
44.权利要求39-43中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，
优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，
更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
45.权利要求39-44中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
46.权利要求39-45中任一项的组合物，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
47.权利要求39-46中任一项的组合物，其中R1、R2和R3都相同。
48.权利要求47的组合物，其中R1、R2和R3都是甲基、乙基或2-羟乙基。
49.权利要求39-46中任一项的组合物，其中R1和R2相同，并且R3与R1和R2不同。
50.权利要求49的组合物，其中R1和R2中的每一个是2-羟乙基、乙基或甲基。
51.权利要求49或50的组合物，其中R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基、2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基和1,5-二羟基-3-(2-羟乙基)戊烷-3-基。
52.权利要求39的组合物，其中R1和R2与氮原子连接在一起形成5-或6-元N-杂环，所述5-或6-元N-杂环任选被一个或两个R5取代。
53.权利要求52的组合物，其中R3选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R3选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R3选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R3选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，
更优选地，R3选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
54.权利要求52-53中任一项的组合物，其中，如果所述N-杂环仅含有一个氮环原子，则这个氮环原子被R3取代，R3不是H，或者，
如果所述N-杂环含有一个以上的氮环原子，则一个氮环原子被R3取代，R3不是H，并且其他氮环原子中的至少一个，优选其他氮环原子中的每一个，被R5取代。
55.权利要求52-54中任一项的组合物，其中R5各自独立地选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
56.权利要求52-55中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌啶基，并且环N原子被R3取代，其中R3不是H。
57.权利要求52-55中任一项的组合物，其中所述N-杂环是哌嗪基，两个环N原子中的一个被R3取代，R3不是H，并且另一个环N原子任选被R5取代，优选地，另一个环N原子被R5取代。
58.权利要求57的组合物，其中两个环N原子都被取代，并且R5选自C1-6烷基、C1-6亚烷基-R4和C(C1-5亚烷基-R4)3，
优选地，R5选自C1-4烷基、C1-4亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-3烷基、C1-3亚烷基-R4和C(C1-3亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自C1-2烷基、C1-2亚烷基-R4和C(C1-2亚烷基-R4)3，
更优选地，R5选自甲基、乙基、2-羟乙基、2-(2-羟基乙氧基)乙基和2-[双(2-羟乙基)氨基]乙基。
59.权利要求52-58中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-4亚烷基-OH)和-N(C1-4亚烷基-OH)2，
优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-3亚烷基-OH)和-N(C1-3亚烷基-OH)2，
更优选地，R4各自独立地选自-OH、-O-(C1-2亚烷基-OH)和-N(C1-2亚烷基-OH)2。
60.权利要求52-59中任一项的组合物，其中R4各自独立地选自-OH、2-羟基乙氧基和双(2-羟乙基)氨基。
61.权利要求52-60中任一项的组合物，其中R3和R5相同。
62.权利要求61的组合物，其中R3和R5均为甲基、乙基、2-羟乙基或2-(2-羟基乙氧基)乙基，优选地，R3和R5均为2-羟乙基。
63.权利要求52-60中任一项的组合物，其中R3和R5互不相同。
64.权利要求39-63中任一项的组合物，其中所述缓冲物质选自双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷或BTM)及其质子化形式、三乙醇胺(TEA)及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
65.权利要求39-64中任一项的组合物，其中所述缓冲物质包含至少一个C1-6亚烷基-R4(如2-羟乙基)部分。
66.权利要求1-65中任一项的组合物，其中所述缓冲系统进一步包含阴离子，所述阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根以及二羧酸或三羧酸的阴离子，如柠檬酸、琥珀酸、丙二酸、戊二酸或己二酸的阴离子。
67.权利要求1-66中任一项的组合物，其中所述组合物中缓冲物质的浓度在约10mM至约200mM之间，优选在约15mM至约100mM之间，更优选在约20mM至约80mM之间，更优选在约40mM至约60mM之间，如约50mM。
68.权利要求1-67中任一项的组合物，其中所述组合物的pH在约4.0至约8.0之间，优选在约4.5至约8.0之间，如约5.0至约8.0之间、约5.5至约8.0之间、约6.0至约8.0之间、约6.5至约8.0之间、约6.8至约7.9之间或者约7.0至约7.8之间。
69.权利要求1-68中任一项的组合物，其中水是所述组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约0.5％(v/v)。
70.权利要求1-69中任一项的组合物，其中所述组合物的重量摩尔渗透压浓度至多约为1000x 10-3渗透压摩尔/kg，优选约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约750x 10-3渗透压摩尔/kg之间，如约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约500x 10-3渗透压摩尔/kg之间，更优选约300x10-3渗透压摩尔/kg。
71.权利要求1-70中任一项的组合物，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l，如约10mg/l至约400mg/l、约10mg/l至约300mg/l、约10mg/l至约200mg/l、约10mg/l至约150mg/l或约10mg/l至约100mg/l，优选约10mg/l至约140mg/l，更优选约20mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
72.权利要求1-71中任一项的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂。
73.权利要求1-38和66-72中任一项的组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
74.权利要求1-38和66-73中任一项的组合物，其中所述阳离子可电离脂质具有式(X)的结构
或者其药学可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L10和L20之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、
SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L10和L20中的另一个是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-12亚烯基；
G3是C1-24亚烷基、C2-24亚烯基、C3-8环亚烷基或C3-8环亚烯基；
Ra是H或C1-12烷基；
R35和R36各自独立地是C6-24烷基或C6-24烯基；
R37是H、OR50、CN、-C(＝O)OR40、-OC(＝O)R40或–NR50C(＝O)R40；
R40是C1-12烷基；
R50是H或C1-6烷基；并且
x是0、1或2。
75.权利要求1-38和66-73中任一项的组合物，其中所述阳离子或阳离子可电离脂质具有式(XI)的结构：
其中
R1和R2中的每一个独立地是R5或-G1-L1-R6，其中R1和R2中至少一个是-G1-L1-R6；
R3和R4中的每一个独立地选自C1-6烷基、C2-6烯基、芳基和C3-10环烷基；
R5和R6中的每一个独立地是具有至少10个碳原子的非环状烃基；
G1和G2中的每一个独立地是未取代的C1-12亚烷基或C2-12亚烯基；
L1和L2中的每一个独立地选自-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-和-NRaC(＝O)O-；
Ra是H或C1-12烷基；
m是0、1、2、3或4；并且
x是0、1或2。
76.权利要求1-38和66-75中任一项的组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含存在于所述组合物中的总脂质的约20摩尔％至约80摩尔％，优选约25摩尔％至约65摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％。
77.权利要求1-76中任一项的组合物，其进一步包含一种或多种其他脂质，优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述组合物包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇。
78.权利要求77的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质优选(i)选自DSPE-PEG、DOPE-PEG、DPPE-PEG和DMPE-PEG；或者(ii)具有以下结构：
或者其药学可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地是含有10-30个碳原子的直链或支化的、饱和或不饱和的烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且w具有在30-60之间的平均值。
79.权利要求77的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物优选是选自由聚肌氨酸-二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸-二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸-磷脂缀合物、聚肌氨酸-神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
80.权利要求77-79中任一项的组合物，其中所述聚合物缀合脂质占存在于所述组合物中的总脂质的约0.5摩尔％至约5摩尔％，优选约1摩尔％至约5摩尔％，更优选约1摩尔％至约4.5摩尔％。
81.权利要求77-80中任一项的组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三碳酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基-磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。
82.权利要求77-81中任一项的组合物，其中所述中性脂质占存在于所述组合物中的总脂质的约5摩尔％至约40摩尔％，优选约5摩尔％至约20摩尔％，更优选约5摩尔％至约15摩尔％。
83.权利要求77-82中任一项的组合物，其中所述类固醇包含固醇，如胆固醇。
84.权利要求77-83中任一项的组合物，其中所述类固醇占存在于所述组合物中的总脂质的约10摩尔％至约65摩尔％，优选约20摩尔％至约60摩尔％，更优选约30摩尔％至约50摩尔％。
85.权利要求77-84中任一项的组合物，其包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇，其中所述阳离子可电离脂质占存在于所述组合物中的总脂质的约30摩尔％至约50摩尔％，如约40摩尔％至约50摩尔％；所述聚合物缀合脂质占存在于所述组合物中的总脂质的约1摩尔％至约4.5摩尔％；所述中性脂质(例如，磷脂)占存在于所述组合物中的总脂质的约5摩尔％至约15摩尔％；所述类固醇占存在于所述组合物中的总脂质的约30摩尔％至约50摩尔％。
86.权利要求1-85中任一项的组合物，其中至少一部分RNA和，如果存在，一种或多种脂质存在于颗粒中，如脂质纳米颗粒(LNP)、脂质体和/或脂质复合物(LPX)。
87.权利要求86的组合物，其中所述颗粒的大小为约30nm至约500nm。
88.权利要求1-87中任一项的组合物，其中所述RNA是mRNA或抑制性RNA。
89.权利要求1-88中任一项的组合物，其中所述RNA(i)包含代替尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷优选选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)；(ii)具有密码子优化的编码序列；和/或(iii)具有与野生型编码序列相比G/C含量增加的编码序列。
90.权利要求1-89中任一项的组合物，其中所述RNA包含以下中的至少一个，优选以下全部：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。
91.权利要求90的组合物，其中所述poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中所述poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。
92.权利要求90或91的组合物，其中所述5’帽是cap1或cap2结构。
93.权利要求1-92中任一项的组合物，其中所述RNA编码一种或多种多肽，其中所述一种或多种多肽优选是药学活性多肽和/或包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
94.权利要求93的组合物，其中所述药学活性多肽和/或抗原或表位源自或是病原体的蛋白、所述蛋白的免疫原性变体或者所述蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
95.权利要求93或94的组合物，其中所述药学活性多肽和/或抗原或表位源自或是SARS-CoV-2刺突(S)蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
96.权利要求1-95中任一项的组合物，其中所述组合物为液体形式，优选在约2℃至约10℃的温度下。
97.权利要求1-96中任一项的组合物，其中优选在约2℃至约8℃的温度下，所述组合物储存至少一周后的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为50％。
98.权利要求87-97中任一项的组合物，其中所述组合物储存后的RNA颗粒(特别是LNP)的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))基本上等于储存前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
99.权利要求1-95中任一项的组合物，其中所述组合物为冷冻形式。
100.权利要求99的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为50％。
101.权利要求99或100的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA颗粒(特别是LNP)的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于所述组合物冷冻前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
102.一种制备包含分散在最终水相中的LNP的组合物的方法，其中
所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；
所述最终水相包含最终缓冲系统，所述最终缓冲系统包含最终缓冲物质，所述最终缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)，它的N-氧化物，或其质子化形式，其中R1、R2和R3如权利要求1-38中任一项所定义；
其中所述方法包括：
(I)制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；以及
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得所述组合物，
其中步骤(I)包括：
(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(b)制备包含阳离子可电离脂质和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(c)将根据(a)制备的RNA溶液与根据(b)制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在第一水相中的LNP的第一中间制剂，所述第一水相包含第一缓冲系统；以及
(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤根据(c)制备的第一中间制剂，
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
103.权利要求102的方法，其中步骤(I)进一步包括选自稀释和过滤的一个或多个步骤。
104.权利要求102或103的方法，其中步骤(I)包括：
(a')提供含水RNA溶液；
(b')提供包含第一缓冲系统的第一含水缓冲溶液；
(c')将根据(a')提供的含水RNA溶液与根据(b')提供的第一含水缓冲溶液混合，从而制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(d')制备包含阳离子可电离脂质和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(e')将根据(c')制备的RNA溶液与根据(d')制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在第一水相中的LNP的第一中间制剂，所述第一水相包含第一缓冲系统；
(f')任选使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液过滤根据(e')制备的第一中间制剂，从而制备另一中间制剂，其包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中所述另一含水缓冲溶液可以与所述第一含水缓冲溶液相同或不同；
(g')任选重复步骤(f')一次或两次或更多次，其中在步骤(f')的一次循环之后获得的另一中间制剂用作下一次循环的第一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中在每次循环中，所述另一含水缓冲溶液可以与所述第一含水缓冲溶液相同或不同；
(h')使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液，
如果不存在步骤(f')，则过滤在步骤(e')中获得的第一中间制剂，或者
如果存在步骤(f')而不存在步骤(g')，则过滤在步骤(f')中获得的另一中间制剂，或者
如果存在步骤(f')和(g')，则过滤在步骤(g')之后获得的另一中间制剂；
以及
(i')任选用稀释溶液稀释在步骤(h')中获得的制剂；
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
105.权利要求102-104中任一项的方法，其中过滤是切向流过滤或渗滤，优选切向流过滤。
106.权利要求102-105中任一项的方法，其包括(II)将所述制剂冷冻至约-10℃或更低。
107.权利要求106的方法，其中在步骤(I)中获得的制剂和所述组合物包含冷冻保护剂。
108.权利要求102-107中任一项的方法，其中所述最终缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
109.权利要求102-108中任一项的方法，其中所述组合物中最终缓冲物质的浓度在约10mM至约200mM之间，优选在约15mM至约100mM之间，更优选在约20mM至约80mM之间，更优选在约40mM至约60mM之间，如约50mM。
110.权利要求102-109中任一项的方法，其中(i)在步骤(a)中获得的RNA溶液的pH低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5；或者(ii)第一含水缓冲溶液的pH低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5。
111.权利要求102-110中任一项的方法，其中
(i)在步骤(a)中使用的第一缓冲系统包含步骤(d)中使用的最终缓冲物质，优选地，在步骤(a)中使用的第一缓冲系统的缓冲系统和pH与在步骤(d)中使用的最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同；或者
(ii)在步骤(b')、(f')和(g')中使用的每个第一缓冲系统和每个另一缓冲系统包含步骤(h')中使用的最终缓冲物质，优选地，在步骤(b')、(f')和(g')中使用的每个第一含水缓冲溶液和每个另一含水缓冲溶液的缓冲系统和pH与最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同。
112.权利要求102-111中任一项的方法，其中所述组合物的pH在约4.0至约8.0之间，优选在约4.5至约8.0之间，如约5.0至约8.0之间、约5.5至约8.0之间、约6.0至约8.0之间、约6.5至约8.0之间、约6.8至约7.9之间或者约7.0至约7.8之间。
113.权利要求102-112中任一项的方法，其中水是所述制剂和/或组合物中的主要组分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约0.5％(v/v)。
114.权利要求102-113中任一项的方法，其中所述组合物的重量摩尔渗透压浓度至多约为1000x 10-3渗透压摩尔/kg，优选约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约750x 10-3渗透压摩尔/kg之间，如约100x 10-3渗透压摩尔/kg至约500x 10-3渗透压摩尔/kg之间，更优选约300x 10-3渗透压摩尔/kg。
115.权利要求102-114中任一项的方法，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约500mg/l，如约10mg/l至约400mg/l、约10mg/l至约300mg/l、约10mg/l至约200mg/l、约10mg/l至约150mg/l或约10mg/l至约100mg/l，优选约10mg/l至约140mg/l，更优选约20mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
116.权利要求102-115中任一项的方法，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
117.权利要求102-116中任一项的方法，其中在步骤(b)或(d')中制备的乙醇溶液进一步包含一种或多种其他脂质，并且所述LNP进一步包含一种或多种其他脂质，其中所述一种或多种其他脂质优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质、中性脂质(例如，磷脂)和类固醇。
118.权利要求102-117中任一项的方法，其中所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇以20％至60％阳离子可电离脂质、0.5％至15％聚合物缀合脂质、5％至25％中性脂质(例如，磷脂)和25％至55％类固醇的摩尔比存在于乙醇溶液中，优选摩尔比为45％至55％阳离子可电离脂质、1.0％至5％聚合物缀合脂质、8％至12％中性脂质和35％至45％类固醇。
119.权利要求102-118中任一项的方法，其中所述RNA如权利要求88和89-95中任一项所定义。
120.权利要求102-105和107-119中任一项的方法，其不包括步骤(II)。
121.一种制备含水RNA组合物的方法，其中所述方法包括：
(I)制备包含RNA和水相的制剂，其中所述水相包含缓冲物质，所述缓冲物质具有式N(R1)(R2)(R3)、它的N-氧化物，或其质子化形式，其中R1、R2和R3如权利要求1-38中任一项所定义；以及
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得所述组合物。
122.权利要求121的方法，其包括(II)将所述制剂冷冻至约-10℃或更低。
123.权利要求122的方法，其中所述组合物包含冷冻保护剂。
124.权利要求121的方法，其不包括步骤(II)。
125.权利要求121-124中任一项的方法，其中所述缓冲物质选自BTM及其质子化形式、TEA及其质子化形式、乙基二乙醇胺及其质子化形式、2-(二乙基氨基)乙-1-醇及其质子化形式、三乙胺及其质子化形式、2-[2-(二乙基氨基)乙氧基]乙-1-醇及其质子化形式、二乙醇胺及其质子化形式、N,N'-双(2-羟乙基)哌嗪及其质子化形式、N,N,N',N'-四(2-羟乙基)乙二胺及其质子化形式和三甲胺N-氧化物及其质子化形式。
126.一种储存组合物的方法，其包括根据权利要求102-119、121、122和125中任一项的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约-90℃至约-10℃的温度范围内，如约-90℃至约-40℃或约-25℃至约-10℃。
127.权利要求126的方法，其中所述组合物包含冷冻保护剂。
128.权利要求127的方法，其中将所述组合物储存至少1个月，如至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月。
129.一种储存组合物的方法，其包括根据权利要求102-128中任一项的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约0℃至约20℃的温度范围内，如约1℃至约15℃、约2℃至约10℃或约2℃至约8℃，或者约5℃的温度。
130.权利要求129的方法，其中将所述组合物储存至少1周，如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少24个月。
131.一种组合物，其通过权利要求102-130中任一项的方法制备。
132.权利要求131的组合物，其为冷冻形式。
133.权利要求132的组合物，其进一步包含冷冻保护剂。
134.权利要求132或133的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为50％。
135.权利要求132-134中任一项的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于所述组合物冷冻前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
136.权利要求131的组合物，其为液体形式。
137.权利要求136的组合物，其中所述组合物储存至少1周后的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为50％。
138.权利要求136或137的组合物，其中所述组合物储存至少1周后的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)基本上等于储存前的RNA颗粒的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
139.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过权利要求102-119、121、122、123和125-128中任一项的方法制备的冷冻组合物并解冻所述冷冻组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
140.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过权利要求102-105、107-121、124、125、129和130中任一项的方法制备的液体组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
141.一种即用型药物组合物，其可通过权利要求139或140的方法制备。
142.权利要求1-101、131-138和141中任一项的组合物，其用于治疗。
143.权利要求1-101、131-138和141中任一项的组合物，其用于在受试者中诱导免疫应答。
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