CN116829134A - 包含rna的lnp组合物及其制备、储存和使用方法 - Google Patents

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R·达尔瓦里
S·卢特拉
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Abstract

本发明一般涉及包含RNA的脂质纳米颗粒(LNP)组合物的领域、制备和储存这种组合物的方法以及这种组合物在治疗中的用途。

Description

包含RNA的LNP组合物及其制备、储存和使用方法
技术领域
本发明一般涉及包含RNA的脂质纳米颗粒(LNP)组合物的领域、制备和储存这种组合物的方法以及这种组合物在治疗中的用途。
背景技术
重组核酸(如DNA或RNA)将外源遗传信息递送到靶细胞中的用途是众所周知的。使用RNA的优点包括瞬时表达和非转化特性。RNA不需要进入细胞核才能表达，而且不能整合到宿主基因组中，从而消除了致癌等多种风险。
重组核酸可以裸核酸形式向有需要的受试者给药；然而，通常使用组合物给药重组核酸。例如，RNA可以通过含有RNA和纳米颗粒形成载体的所谓纳米颗粒制剂递送，例如阳离子脂质(例如永久带电的阳离子脂质)、阳离子脂质和一种或多种其他脂质的混合物或阳离子聚合物。此类纳米颗粒制剂的命运由不同的关键因素控制(例如，纳米颗粒的尺寸和尺寸分布等)。例如，这些因素从2018年开始在FDA的“脂质体药物产品指南(Liposome DrugProducts Guidance)”中称为应分析和规定的特定属性。目前纳米颗粒制剂临床应用的局限性可能在于缺乏均匀、纯净和良好表征的纳米颗粒制剂。
与其他RNA纳米颗粒产品相比，包含可电离脂质的LNP在靶向和功效方面可以显示出优势。然而，要获得常规药物使用所需的足够保质期是一项挑战。据说，为了稳定，包含可电离脂质的LNP需要在更低的温度下冷冻，如-80℃，这对冷链构成了重大挑战，或者它们只能储存在冷冻温度以上，如5℃，在此温度只能获得有限的稳定性。
已知在溶液或LNP中的RNA经历缓慢的片段化。此外，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的存在下，RNA倾向于采用非常稳定的折叠形式，这很难进行翻译。这两种机制，即片段化和这种稳定RNA折叠的形成，都是温度依赖性的，并导致完整和可获得的RNA的损失，从而限制了液体产品的稳定性；然而，它们在冷冻状态下基本不存在。
因此，本领域仍然需要(i)包含LNP的组合物，所述LNP包含可电离的脂质和RNA，并且所述组合物是稳定的并且可以在符合制药实践中的常规技术的温度范围内储存，特别是在约-25℃的温度下，或者甚至在+2至+20℃之间的温度下以液体形式储存；(ii)可即时使用的组合物；(iii)优选可重复冷冻和解冻的组合物；和(iv)制备和储存这种组合物的方法。本发明解决了这些和其他需求。
本发明人惊奇地发现本文所述的组合物和方法满足上述要求。特别地，已经证明，通过使用低浓度(例如，至多约25mM)的特定缓冲物质、特别是三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)及其质子化形式，并且排除无机磷酸盐阴离子以及柠檬酸盐阴离子和EDTA的阴离子，可以制备稳定的并且可以在约-25℃甚至以液体形式储存的组合物。
发明内容
第一方面，本发明提供了一种组合物，其包含分散在水相中的脂质纳米颗粒(LNP)，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含选自Tris及其质子化形式、双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-methane)及其质子化形式和三乙醇胺(TEA)及其质子化形式的缓冲物质，并且所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸(MES)的阴离子、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)的阴离子和2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)的阴离子；所述组合物中缓冲物质的浓度为至多约25mM；并且所述水相基本不含无机磷酸盐阴离子、基本不含柠檬酸盐阴离子和基本不含乙二胺四乙酸(EDTA)的阴离子。
如本申请中所证实的，在包含LNP的组合物中使用基于上述特定缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的缓冲系统代替PBS，抑制了非常稳定折叠形式的RNA的形成。此外，本申请证实了令人惊讶地是，通过简单地降低包含LNP和缓冲系统的组合物中缓冲物质的浓度，其中LNP包含阳离子可电离脂质和RNA，与含有浓度为50mM的相同缓冲物质的组合物相比，在冷冻-解冻循环后，可以获得具有改进的RNA完整性的RNA LNP组合物。因此，所要求保护的组合物提供了改进的稳定性，可以在符合制药实践中的常规技术的温度范围内储存，并提供了即用型(ready-to-use)组合物。
在第一方面的优选实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，即Tris及其质子化形式的混合物。
在一个实施方案中，所述单价阴离子选自氯离子(chloride)、乙酸根(acetate)、乙醇酸根(glycolate)、乳酸根(lactate)、吗啉乙磺酸根和3-(N-吗啉代)丙磺酸根(morpholinoethanesulfonate)，或选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸根(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonate)，优选选自氯离子、乙酸根、乳酸根和吗啉乙磺酸根，更优选选自氯离子、乙酸根和吗啉乙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根和乳酸根，如氯离子或乙酸根。
在一个实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，并且所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和3-(N-吗啉代)丙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸根，优选选自氯离子、乙酸根、乳酸根和吗啉乙磺酸根，更优选选自氯离子、乙酸根和吗啉乙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根和乳酸根，如氯离子或乙酸根。
在第一方面的一个实施方案中，在所述组合物中缓冲物质的浓度、特别是Tris及其质子化形式的总浓度，为至多约20mM，例如至多约19mM、至多约18mM、至多约17mM、至多约16mM、至多约15mM、至多14mM、至多约13mM、至多12mM、最约11mM或至多约10mM。在一个实施方案中，在所述组合物中缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的下限是至少约1mM，优选至少约2mM，例如至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM或至少约9mM。例如，在所述组合物中缓冲物质的浓度、特别是Tris及其质子化形式的总浓度，可以在约1mM至约20mM之间，例如在约2mM至约15mM之间、在约5mM至约14mM之间、约7mM至约13mM之间、在约8mM至约12mM之间、在约9mM至约11mM之间，例如约10mM。
在第一方面的一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或者有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子。在第一亚组中，应用这些标准中的至少一个标准。例如，在这个第一亚组的一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子。在这个第一亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含碳酸盐阴离子。在这个第一亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含有机二元酸阴离子。在这个第一亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含有机多元酸阴离子。
在第一方面的第二亚组中，应用上述标准中的至少两个标准。例如，在这个第二亚组的一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子且基本不含碳酸盐阴离子。在这个第二亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子且基本不含有机二元酸阴离子。在这个第二亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子且基本不含有机多元酸阴离子。在这个第二亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含碳酸盐阴离子且基本不含有机二元酸阴离子。在这个第二亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含碳酸盐阴离子且基本不含有机多元酸阴离子。在这个第二亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含有机二元酸阴离子且基本不含有机多元酸阴离子。
在第一方面的第三亚组中，应用上述标准中的至少三个标准。例如，在这个第三亚组的一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子。在这个第三亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。在这个第三亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。在这个第三亚组的另一个实施方案中，所述水相基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。
在第一方面的第四亚组中，应用上述标准中的至少四个标准。即，在这个第四亚组中，所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中)，所述组合物包含冷冻保护剂。在第一方面的替代实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中)，所述组合物基本不含冷冻保护剂。因此，这些实施方案的具体实施例如下：
(1)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(2)所述水相基本不含碳酸盐阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(3)所述水相基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(4)所述水相基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(5)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有碳酸盐阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(6)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(7)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(8)所述水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(9)所述水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(10)所述水相基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(11)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(12)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(13)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(14)所述水相基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(15)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物包含冷冻保护剂；
(16)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(17)所述水相基本不含碳酸盐阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(18)所述水相基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(19)所述水相基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(20)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含碳酸盐阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(21)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(22)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(23)所述水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(24)所述水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(25)所述水相基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(26)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(27)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(28)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(29)所述水相基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(30)所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且所述组合物基本不含冷冻保护剂。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)中的任一个中)，其中所述组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包含选自碳水化合物和糖醇的一种或多种化合物。例如，所述冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合。在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物包含蔗糖和/或甘油作为冷冻保护剂。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中所述组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂在组合物中的浓度为至少1％w/v，例如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v、至少8％w/v或至少9％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在组合物中的浓度为高达25％w/v，例如高达20％w/v、高达19％w/v、高达18％w/v和高达17％w/v、高达16％w/v、高达15％w/v、高达14％w/v、高达13％w/v、高达12％w/v或高达11％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在组合物中的浓度为1％w/v至20％w/v、例如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物包含浓度为5％w/v至15％w/v，例如6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v或9％w/v至11％w/v、或约10％w/v浓度的冷冻保护剂(特别是蔗糖和/或甘油)。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中所述组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的存在浓度导致所述组合物的摩尔渗透压浓度基于所述组合物的总重量为约50×10-3osmol/kg至约400×10-3osmol/kg(如约50×10-3osmol/kg至约390×10-3osmol/kg、约60×10-3osmol/kg至约380×10-3osmol/kg、约70×10-3osmol/kg至约370×10-3osmol/kg、约80×10-3osmol/kg至约360×10-3osmol/kg、约90×10-3osmol/kg至约350×10-3osmol/kg、约100×10-3osmol/kg至约340×10-3osmol/kg、约120×10- 3osmol/kg至约330×10-3osmol/kg、约140×10-3osmol/kg至约320×10-3osmol/kg、约160×10-3osmol/kg至约310×10-3osmol/kg、约180×10-3osmol/kg至约300×10-3osmol/kg或约200×10-3osmol/kg至约300×10-3osmol/kg)。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个具体实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，特别是在第一方面的那些实施方案中，其中所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根和乳酸根，并且所述组合物中单价阴离子的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)至多等于组合物中缓冲物质的浓度。例如，所述组合物中单价阴离子的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)可以小于组合物中缓冲物质的浓度。因此，在第一方面的那些实施方案中，其中所述缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式在组合物中的浓度至多为约20mM时，单价阴离子(特别是所有单价阴离子的总浓度)在组合物中的浓度至多等于约20mM，例如小于20mM。通常，所述组合物中单价阴离子如氯离子和/或乙酸根的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)可以小于约15mM，例如小于约14mM、小于约13mM、小于约12mM、少于约11mM、小于约10mM、小于约9mM、小于约8mM、小于约7mM、小于约6mM或小于约5mM。在一个实施方案中，所述组合物中的氯离子浓度如上所定义(例如，小于约15mM等)，并且所述组合物不含乙酸根。在另一个实施方案中，所述组合物中的乙酸根浓度如上所定义(例如，小于约15mM等)，并且所述组合物不含氯离子。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，特别是在第一方面的那些实施方案中，其中所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，所述水相和/或组合物中的钠浓度小于20mM，例如小于约15mM，例如小于约14mM、小于约13mM、小于约12mM、少于约11mM、小于约10mM、小于约9mM、小于约8mM、小于比约7mM、小于约6mM或小于约5mM。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，特别是在第一方面的那些实施方案中，其中所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，所述单价阴离子选自MES、MOPS和HEPES的阴离子，并且所述组合物中单价阴离子的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)至少等于所述组合物中缓冲物质的浓度。例如，所述组合物中单价阴离子的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)可以高于所述组合物中缓冲物质的浓度。因此，在第一方面的那些实施方案中，其中所述组合物中缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的浓度至多为约20mM，所述组合物中单价阴离子的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)至少等于约20mM，例如高于20mM。通常，所述组合物中的单价阴离子的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)可以高于约20mM，例如高于约21mM、高于约22mM、高于约23mM、高于约24mM、高于约25mM、高于约26mM、高于约27mM、高于约28mM、高于约29mM或高于约30mM，且优选至多50mM，例如至多45mM、至多40mM或至多35mM。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间。例如，所述组合物的pH可以在约6.9至约7.9之间，例如在约7.0至约7.9之间、约7.1至约7.8之间、约7.2至约7.7之间、约7.3和至7.6之间、约7.4至约7.6之间或约7.5。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物包含水作为主要组分和/或组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约1.0％(v/v)。例如，所述组合物中所含的水的量可以是至少50％(w/w)，例如至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)或至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。特别地，如果所述组合物包含冷冻保护剂，则组合物中所含水的量可以是至少50％(w/w)，例如至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)或至少90％(w/w)。如果所述组合物基本不含冷冻保护剂，则组合物中所含水的量可以为至少95％(w/w)。另外或替代地，所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)，例如小于约0.9％(v/v)、小于约0.8％(v/v)、小于约0.7％(v/v)、小于约0.6％(v/v)、小于约0.5％(v/v)、小于约0.4％(v/v)、小于约0.3％(v/v)、小于约0.2％(v/v)、小于约0.1％(v/v)、小于约0.05％(v/v)或小于约0.01％(v/v)。在这方面，在正常条件下为液体的冷冻保护剂将不视为除水之外的溶剂，而是视为冷冻保护剂。换言之，所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)的上述任选限制不适用于在正常条件下为液体的冷冻保护剂。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物的摩尔渗透压浓度为至多约400×10-3osmol/kg，如至多约390×10-3osmol/kg、至多约380×10-3osmol/kg、至多约370×10-3osmol/kg、至多约360×10-3osmol/kg、至多约350×10- 3osmol/kg、至多约340×10-3osmol/kg、至多约330×10-3osmol/kg、至多约320×10-3osmol/kg、至多约310×10-3osmol/kg，或至多约300×10-3osmol/kg。如果所述组合物不包含冷冻保护剂，则所述组合物的摩尔渗透压浓度可低于300×10-3osmol/kg，如至多约250×10- 3osmol/kg、至多约200×10-3osmol/kg、至多约150×10-3osmol/kg、至多约100×10-3osmol/kg、至多约50×10-3osmol/kg、至多约40×10-3osmol/kg或至多约30×10-3osmol/kg。如果所述组合物包含冷冻保护剂，则优选所述组合物的摩尔渗透压浓度的主要部分由冷冻保护剂提供。例如，所述冷冻保护剂可以提供组合物摩尔渗透压浓度的至少50％，例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l。例如，所述组合物中RNA的浓度可以是约10mg/l至约140mg/l，例如约20mg/l至约130mg/l、约25mg/l至约125mg/l、约30mg/l至约120mg/l、约35mg/l至约115mg/l、约40mg/l至约110mg/l、约45mg/l至约105mg/l或约50mg/l至约100mg/l。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式，所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间，并且所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l。在这个实施方案中，优选所述组合物的pH在约6.9至约7.9之间，并且所述组合物中RNA的浓度为约25mg/l至约125mg/l，例如约30mg/l至约120mg/l。在所要求保护的组合物的特别优选的实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式；所述组合物的pH在约6.9至约7.9之间；所述组合物中所述RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸和基本不含有机多元酸；并且所述组合物包含冷冻保护剂。在所要求保护的组合物的另一个特别优选的实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式；所述组合物的pH在约6.9至约7.9之间；所述组合物中RNA的浓度为约30mg/l至约120mg/l；所述水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸和基本不含有机多元酸；并且所述组合物基本不含冷冻保护剂。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。例如，所述阳离子可电离脂质可以具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中L1、L2、G1、G2、G3、R1、R2和R3如本文所定义。优选地，阳离子可电离脂质选自以下：结构I-1至I-36(本文所示)；和/或结构A至F(本文所示)；和/或N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(DODMA)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)，庚三烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)，和4-((二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-N,N-二甲基-4-氧代丁基-1-胺(DPL-14)。在一个特别优选的实施方案中，所述阳离子可电离脂质是具有结构I-3的脂质。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，LNP进一步包含一种或多种其他脂质。优选地，所述一种或多种其他脂质选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合。在第一方面的优选实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，LNP包含本文所述的阳离子可电离脂质，聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸和脂质样物质的缀合物)、中性脂质(例如DSPC)和类固醇(例如，胆固醇)。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中LNP进一步包含聚合物缀合脂质作为一种或多种其他脂质之一，所述聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质。例如，所述聚乙二醇化脂质可以具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中R12、R13和w如本文所定义。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中LNP进一步包含聚合物缀合脂质作为一种或多种其他脂质之一，聚合物缀合脂质是聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物。例如，所述聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物可以是选自聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物和聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中LNP进一步包含中性脂质作为一种或多种其他脂质之一，所述中性脂质是磷脂。这种磷脂优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂的具体的实例包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine)、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十三碳酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，DTPC)、双十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。在一个特别优选的实施方案中，所述中性脂质是DSPC。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中LNP进一步包含类固醇作为一种或多种其他脂质之一，所述类固醇是固醇，例如胆固醇。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上述实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述水相不包含螯合剂。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，LNP包含所述组合物中包含的RNA的至少约75％。例如，LNP可包含所述组合物中包含的RNA的至少约76％，例如至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)包封在LNP内或与LNP缔合。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)包含取代尿苷的修饰的核苷。例如，所述修饰的核苷可选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)包含以下一个或多个：(a)5’帽，例如cap1或cap2结构；(b)5’UTR；(c)3’UTR；和(d)poly-A序列，例如包含至少100个核苷酸的poly-A序列，其中所述poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。
在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)编码一种或多种多肽。例如，所述一种或多种多肽可包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在优选的实施方案中，所述RNA(如mRNA)包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在第一方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA包含编码全长SARS-CoV2 S蛋白变体的ORF，所述变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。例如，SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ IDNO:7可具有至少80％的相同性。
在第一方面的一个优选实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，如上述实施方案(1)至(30)的任一个)，所述组合物是冷冻形式。优选地，所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性为至少50％，如至少52％、至少54％、至少55％、至少56％，至少58％，或至少60％，例如在解冻已在-20℃下储存的冷冻组合物后。另外或替代地，所述冷冻组合物解冻后的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))等于所述组合物冷冻前的LNP尺寸(Z平均)(或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)等于冷冻前LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述冷冻组合物解冻后LNP的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
在第一方面的另一个优选实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物是液体形式。优选地，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的RNA完整性足以产生预期效果，例如诱导免疫应答。例如，当在0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的RNA完整性可以是至少50％，例如至少52％、至少54％、至少55％、至少56％、至少58％或至少60％。另外或替代地，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))足以产生预期效果，例如诱导免疫应答。例如，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)))等于初始组合物(即在储存之前)的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)等于储存前LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
在第二方面，本发明提供了一种制备包含分散在最终水相中的LNP的组合物的方法，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；所述最终水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含最终缓冲物质和最终单价阴离子，所述最终缓冲物质选自Tris及其质子化形式、Bis-Tris甲烷及其质子化形式和TEA及其质子化形式，并且所述最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、MES的阴离子、MOPS的阴离子和HEPES的阴离子；所述组合物中最终缓冲物质的浓度为至多约25mM；并且所述最终水相基本不含无机磷酸盐阴离子、基本不含柠檬酸盐阴离子和基本不含EDTA的阴离子；其中所述方法包括：
(I)制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；和
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得所述组合物，
其中步骤(I)包括：
(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(b)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(c)将根据(a)制备的RNA溶液与根据(b)制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在包含第一缓冲系统的中间水相中的LNP的中间制剂；和
(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤根据(c)制备的第一中间制剂，
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
如本申请中所证实的，在包含LNP的组合物中使用基于上述特定缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的特定缓冲系统代替PBS，抑制了非常稳定折叠形式的RNA的形成。此外，本申请证实了令人惊讶地是，通过简单地降低包含LNP和缓冲系统的组合物中缓冲物质的浓度，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA，与含有浓度为50mM的相同缓冲物质的组合物相比，在冷冻-解冻循环后，可以获得具有改进的RNA完整性的RNA LNP组合物。因此，通过所要求保护的方法制备的组合物提供了改进的稳定性，可以在符合制药实践中常规技术的温度范围内储存，并且提供了一种即用型制剂。
在第二方面的一个特别优选的实施方案中，最终缓冲物质是Tris及其质子化形式，即Tris及其质子化形式的混合物。
在第二方面的一个实施方案中，最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和3-(N-吗啉代)丙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸根，优选选自氯离子、乙酸根、乳酸根和吗啉乙磺酸根，更优选选自氯离子、乙酸根和吗啉乙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根和乳酸根，如氯离子或乙酸根。
在第二方面的一个实施方案中，最终缓冲物质是Tris及其质子化形式，并且最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和3-(N-吗啉代)丙磺酸根，或选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸根和2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸根，优选选自氯离子、乙酸根、乳酸根和吗啉乙磺酸根，更优选选自氯离子、乙酸根、乳酸根和吗啉乙磺酸根，更优选选自氯离子、乙酸根和吗啉乙磺酸根，如氯离子或乙酸根。
在一个实施方案中，特别是如果希望制备冷冻形式的组合物，则第二方面的方法包括(II)将制剂冷冻至约-10℃或更低。因此，在这个实施方案中进行第二方面的方法得到冷冻形式的组合物。
在另一个实施方案中，特别是如果希望制备液体形式的组合物，则第二方面的方法不包括步骤(II)。因此，在这个实施方案中进行第二方面的方法得到液体形式的组合物。
在第二方面的一个实施方案中，步骤(I)进一步包括在步骤(c)之后选自稀释和过滤的一个或多个步骤，例如切向流过滤和渗滤。例如，稀释步骤可以包括将稀释溶液添加到中间制剂中。这样的稀释溶液可以包含一种或多种另外的化合物和任选的最终缓冲系统，其中所述一种或多种另外的化合物可以包含冷冻保护剂。所述一个或多个过滤步骤(包括步骤(d)、(f’)、(g’)和(h’))可用于从中间体制剂中去除不需要的化合物(例如乙醇和/或一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸)和/或用于增加中间制剂的RNA浓度和/或改变中间制剂的pH和/或缓冲系统。为此可以使用含水缓冲溶液，其不含不需要的化合物(由此所述不需要的化合物从中间制剂中洗出并进入含水缓冲溶液中)和/或其与中间制剂相比是高渗的(使得水从中间制剂流到含水缓冲溶液)和/或者其具有除了中间制剂的pH和/或缓冲系统的pH和/或缓冲系统。
在第二方面的优选实施方案中，步骤(I)包括：
(a’)提供RNA水溶液；
(b’)提供包含第一缓冲系统的第一含水缓冲溶液；
(c’)将根据(a’)提供的RNA水溶液与根据(b’)提供的第一含水缓冲溶液混合，从而制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(d’)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(e’)将根据(c’)制备的RNA溶液与根据(d’)制备的乙醇溶液混合，从而制备第一中间制剂，其包含分散在第一水相中的LNP，所述第一水相包含第一缓冲系统；
(f’)任选使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液过滤根据(e’)制备的第一中间制剂，从而制备另一中间制剂，其包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；
(g’)任选重复步骤(f’)一次或两次或更多次，其中在步骤(f’)的一次循环之后获得的另一中间制剂用作下一循环的第一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中在每个循环中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；
(h’)使用包含最终缓冲系统且pH值至少为6.0的最终含水缓冲溶液，
如果不存在步骤(f’)，则过滤在步骤(e’)中获得的第一中间制剂，或者
如果存在步骤(f’)而不存在步骤(g’)，则过滤在步骤(f’)中获得的另一中间制剂，或者
如果存在步骤(f’)和(g’)，则过滤在步骤(g’)之后获得的另一中间制剂；
以及
(i’)任选使用稀释溶液稀释在步骤(h’)中获得的制剂；
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
在第二方面的一个实施方案中，所述组合物中最终缓冲物质的浓度、特别是Tris及其质子化形式的总浓度，为至多约20mM，例如至多约19mM、至多约18mM、至多约17mM、至多约16mM、至多约15mM、至多14mM、至多约13mM、至多12mM、最约11mM或至多约10mM。在一个实施方案中，在所述组合物中最终缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的下限是至少约1mM，优选至少约2mM，例如至少约3mM、至少约4mM、至少约5mM、至少约6mM、至少约7mM、至少约8mM或至少约9mM。例如，在所述组合物中最终缓冲物质的浓度、特别是Tris及其质子化形式的总浓度，可以在约1mM至约20mM之间，例如在约2mM至约15mM之间、在约5mM至约14mM之间、约7mM至约13mM之间、在约8mM至约12mM之间、在约9mM至约11mM之间，例如约10mM。
在第二方面的一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或者有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子。在第二方面的第一亚组中，应用这些标准中的至少一个标准。例如，在第二方面的这个第一亚组的一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子。在第二方面的这个第一亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子。在第二方面的这个第一亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含有机二元酸阴离子。在第二方面的这个第一亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含有机多元酸阴离子。
在第二方面的第二亚组中，应用上述标准中的至少两个标准。例如，在第二方面的这个第二亚组的一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子且基本不含碳酸盐阴离子。在第二方面的这个第二亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子且基本不含有机二元酸阴离子。在第二方面的这个第二亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子且基本不含有机多元酸阴离子。在第二方面的这个第二亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子且基本不含有机二元酸阴离子。在第二方面的这个第二亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子且基本不含有机多元酸阴离子。在第二方面的这个第二亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含有机二元酸阴离子且基本不含有机多元酸阴离子。
在第二方面的第三亚组中，应用上述标准中的至少三个标准。例如，在第二方面的这个第三亚组的一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子。在第二方面的这个第三亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。在第二方面的这个第三亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。在第二方面的这个第三亚组的另一个实施方案中，所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。
在第二方面的第四亚组中，应用上述标准中的至少四个标准。即，在第二方面的这个第四亚组中，所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中)，在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂。在第二方面的另一个实施方案中(特别是在上述第二方面第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中)，在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂。因此，这些实施方案的具体实施例如下：
(1)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子，并且步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(2)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(3)所述最终水相基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(4)所述最终水相基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(5)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含碳酸盐阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(6)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(7)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(8)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(9)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(10)所述最终水相基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(11)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(12)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(13)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(14)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不包含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(15)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂；
(16)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(17)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(18)所述最终水相基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(19)所述最终水相基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(20)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含碳酸盐阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(21)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(22)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(23)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(24)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(25)所述最终水相基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(26)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机二元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(27)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(28)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(29)所述最终水相基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂；
(30)所述最终水相基本不含无机硫酸盐阴离子、基本不含碳酸盐阴离子、基本不含有机二元酸阴离子和基本不含有机多元酸阴离子，并且在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物基本不含冷冻保护剂。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂包括选自碳水化合物和糖醇的一种或多种化合物。例如，所述冷冻保护剂可以选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合。在第二方面的优选实施方案中(特别是在上述第二方面第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含蔗糖和/或甘油作为冷冻保护剂。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中在步骤(I)中获得的制剂和/或所述组合物包含冷冻保护剂，所述制剂和/或组合物中所述冷冻保护剂的浓度为至少1％w/v，例如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v、至少8％w/v或至少9％w/v。在一个实施方案中，所述制剂和/或组合物中所述冷冻保护剂的浓度为高达25％w/v，例如高达20％w/v、高达19％w/v、高达18％w/v和高达17％w/v、高达16％w/v、高达15％w/v、高达14％w/v、高达13％w/v、高达12％w/v或高达11％w/v。在一个实施方案中，所述制剂和/或组合物中所述冷冻保护剂的浓度为1％w/v至20％w/v、例如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述制剂和/或组合物包含浓度为5％w/v至15％w/v，例如6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v或9％w/v至11％w/v、或约10％w/v浓度的冷冻保护剂(特别是蔗糖和/或甘油)。例如，第二方面的方法可以包括使用稀释溶液的稀释步骤，其中所述稀释溶液包括足量的冷冻保护剂，以便在步骤(I)中获得的制剂和/或组合物中实现冷冻保护剂的上述浓度。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中在步骤(I)中获得的制剂和/或组合物包含冷冻保护剂，所述冷冻保护剂的存在浓度导致所述组合物的摩尔渗透压浓度基于所述制剂/组合物的总重量为约50×10-3osmol/kg至约400×10- 3osmol/kg(如约50×10-3osmol/kg至约390×10-3osmol/kg、约60×10-3osmol/kg至约380×10-3osmol/kg、约70×10-3osmol/kg至约370×10-3osmol/kg、约80×10-3osmol/kg至约360×10-3osmol/kg、约90×10-3osmol/kg至约350×10-3osmol/kg、约100×10-3osmol/kg至约340×10-3osmol/kg、约120×10-3osmol/kg至约330×10-3osmol/kg、约140×10-3osmol/kg至约320×10-3osmol/kg、约160×10-3osmol/kg至约310×10-3osmol/kg、约180×10-3osmol/kg至约300×10-3osmol/kg或约200×10-3osmol/kg至约300×10-3osmol/kg)。例如，第二方面的方法可以包括使用稀释溶液的稀释步骤，其中所述稀释溶液包括足量的冷冻保护剂，以便在步骤(I)中获得的制剂和/或组合物中实现冷冻保护剂的上述摩尔渗透压浓度值。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个具体实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，特别是在第二方面的那些实施方案中，其中所述最终缓冲物质是Tris及其质子化形式，最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根和乳酸根，并且所述组合物中最终单价阴离子的浓度(特别是所有最终单价阴离子的总浓度)至多等于组合物中最终缓冲物质的浓度。例如，所述组合物中最终单价阴离子的浓度(特别是所有最终单价阴离子的总浓度)可以小于组合物中最终缓冲物质的浓度。因此，在第二方面的那些实施方案中，其中所述最终缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式在组合物中的浓度至多为约20mM时，最终单价阴离子(特别是所有单价阴离子的总浓度)在组合物中的浓度至多等于约20mM，例如小于20mM。通常，所述组合物中单价阴离子如氯离子和/或乙酸根的浓度(特别是所有单价阴离子的总浓度)可以小于约15mM，例如小于约14mM、小于约13mM、小于约12mM、少于约11mM、小于约10mM、小于约9mM、小于约8mM、小于约7mM、小于约6mM或小于约5mM。在一个实施方案中，所述组合物中的氯离子浓度如上所定义(例如，小于约15mM等)，并且所述组合物不含乙酸根。在另一个实施方案中，所述组合物中的乙酸根浓度如上所定义(例如，小于约15mM等)，并且所述组合物不含氯离子。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，特别是在第二方面的那些实施方案中，其中所述最终缓冲物质是Tris及其质子化形式，所述水相和/或组合物中的钠浓度小于20mM，例如小于约15mM，例如小于约14mM、小于约13mM、小于约12mM、少于约11mM、小于约10mM、小于约9mM、小于约8mM、小于比约7mM、小于约6mM或小于约5mM。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个具体实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，特别是在第二方面的那些实施方案中，其中所述最终缓冲物质是Tris及其质子化形式，所述最终单价阴离子选自MES、MOPS和HEPES的阴离子，并且所述组合物中最终单价阴离子的浓度(特别是所有最终单价阴离子的总浓度)至少等于组合物中最终缓冲物质的浓度。例如，所述组合物中最终单价阴离子的浓度(特别是所有最终单价阴离子的总浓度)可以高于组合物中最终缓冲物质的浓度。因此，在第二方面的那些实施方案中，其中所述最终缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式在组合物中的浓度至多为约20mM时，最终单价阴离子(特别是所有单价阴离子的总浓度)在组合物中的浓度至少等于约20mM，例如高于20mM。通常，所述组合物中的最终单价阴离子的浓度(特别是所有最终单价阴离子的总浓度)可以高于约20mM，例如高于约21mM、高于约22mM、高于约23mM、高于约24mM、高于约25mM、高于约26mM、高于约27mM、高于约28mM、高于约29mM或高于约30mM，且优选至多50mM，例如至多45mM、至多40mM或至多35mM。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，最终缓冲系统的pH(和所述组合物的pH)在约6.5和约8.0之间。例如，所述组合物的pH可以在约6.9至约7.9之间，例如在约7.0至约7.9之间、约7.1至约7.8之间、约7.2至约7.7之间、约7.3和至7.6之间、约7.4至约7.6之间或约7.5。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，第一缓冲系统的pH(和在步骤(a)中获得的RNA溶液的pH)低于6.0，优选至多约5.5，例如至多约5.0，至多约4.9，至多约4.8、至多约4.7、至多约4.6或至多约4.5。例如，第一缓冲系统的pH(和在步骤(a)中获得的RNA溶液的pH)可以在约3.5至约5.9之间，例如在约4.0至约5.5之间，或在约4.5至约5.0之间。为此，在步骤(a)中获得的RNA溶液可以进一步包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸(例如柠檬酸盐阴离子和/或EDTA的阴离子)。在这个实施方案中，优选在除去所述一种或多种有机二元和/或有机多元酸的条件下进行步骤(d)，从而得到包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中最终水相基本不含一种或多种所述有机二元酸和/或有机多元酸。例如，这样的条件可包括使用包含最终缓冲系统(即，最终缓冲物质和最终单价阴离子)的最终缓冲溶液对包含分散在步骤(c)中获得的中间水相中的LNP的中间制剂进行至少一个过滤步骤，例如切向流过滤或渗滤，其中所述最终缓冲溶液不包含所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸(并且优选不包含乙醇)。或者，这样的条件可以包括(i)使用包含另外的缓冲系统的另外的含水缓冲溶液对包含分散在步骤(c)中获得的中间水相中的LNP的中间制剂(即，第一中间制剂)进行至少一个过滤步骤，例如切向流过滤或渗滤，从而制备包含分散在包含所述另外的缓冲系统的另外的水相中的LNP的另外的中间制剂，其中所述另外的含水缓冲溶液的另外的缓冲系统可以与步骤(a)中使用的缓冲系统相同或不同；(ii)任选重复步骤(i)一次或两次或更多次，其中将在一个循环的步骤(ⅰ)之后获得的包含分散在另一水相中的LNP的另一中间体制剂用作下一循环的第一中间制剂，其中在每个循环中，所述另外的含水缓冲溶液的另外的缓冲系统可以与步骤(a)中使用的第一缓冲系统相同或不同；和(iii)使用最终的含水缓冲溶液，对在步骤(i)中获得的中间制剂(如果不存在步骤(ii))或在步骤(ii)中获得的中间制剂(如果存在步骤(ii))进行至少一个过滤步骤，例如切向流过滤或渗滤，其中所述中间和最终的含水缓冲溶液中的至少一种(优选所有的中间和最终含水缓冲溶液)不含所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸(并且优选不含乙醇)。
类似地，在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中步骤(I)包括步骤(a’)至(e’)和(h’)(以及任选的步骤(f’)、(g’)、和(i’)中的一个或多个步骤)，第一含水缓冲溶液的pH(和在步骤(c’)中获得的RNA溶液的pH)低于6.0，优选至多约5.5，例如至多约5.0，至多约4.9，至多约4.8，至多约4.7，至多约4.6或至多约4.5。例如，第一含水缓冲溶液的pH(和在步骤(c’)中获得的RNA溶液的pH)可以在约3.5至约5.9之间，例如在约4.0至约5.5之间或在约4.5和约5.0之间。为此，在(b’)中提供的第一含水缓冲溶液(和第一水相)可以进一步包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸(例如柠檬酸盐阴离子和/或EDTA的阴离子)。在这个实施方案中，优选步骤(f’)至(h’)中的至少一个步骤是在从第一中间制剂和/或从另一中间制剂中除去一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸的条件下进行的，从而得到包含分散在另一水相中或最终水相中的LNP的另一中间制剂，所述另一水相和/或最终水相基本不含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸。例如，这样的条件可以包括使用另一含水缓冲溶液和/或最终缓冲溶液，其中所述另一含水缓冲溶液或最终缓冲溶液中的至少一种(优选所有另外的含水缓冲溶液和所述最终缓冲剂溶液)不包含所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸(并且优选不包含乙醇)。在一个实施方案中，所述过滤步骤可以是切向流过滤或渗滤，优选切向流过滤。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，在步骤(a)中使用的第一缓冲系统包含在步骤(d)中使用的最终缓冲物质和最终单价阴离子，优选在步骤(a)中使用的缓冲系统和第一缓冲系统的pH与在步骤(d)中使用的缓冲系统和最终含水缓冲溶液的pH相同。例如，在第二方面的这个实施方案中仅使用一种含水缓冲溶液。
类似地，在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中步骤(I)包括步骤(a’)至(e’)和(h’)(以及任选的步骤(f’)、(g’)、和(i’)中的一个或多个步骤)，步骤(b’)、(f’)和(g’)中使用的第一缓冲系统和每个另外的缓冲系统均包含步骤(h’)中使用的最终缓冲物质和最终单价阴离子，优选步骤(b’)、(f’)和(g’)中使用缓冲系统和每个第一含水缓冲溶液和每个另外含水缓冲溶液的pH与最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同。例如，在第二方面的这个实施方案的步骤(b’)、(f’)(如果存在)、(g’)(如存在)和(h’)中使用的含水缓冲溶液是相同的。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述制剂和/或组合物包含水作为主要组分和/或组合物中含有的除水以外的溶剂的总量小于约1.0％(v/v)。例如，所述制剂和/或组合物中所含的水的量可以是至少50％(w/w)，例如至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)或至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)、至少90％(w/w)、或至少95％(w/w)。特别地，如果所述制剂和/或组合物包含冷冻保护剂，则制剂和/或组合物中所含水的量可以是至少50％(w/w)，例如至少55％(w/w)、至少60％(w/w)、至少65％(w/w)、至少70％(w/w)、至少75％(w/w)、至少80％(w/w)、至少85％(w/w)或至少90％(w/w)。如果所述制剂和/或组合物基本不含冷冻保护剂，则制剂和/或组合物中所含水的量可以为至少95％(w/w)。另外或替代地，所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)，例如小于约0.9％(v/v)、小于约0.8％(v/v)、小于约0.7％(v/v)、小于约0.6％(v/v)、小于约0.5％(v/v)、小于约0.4％(v/v)、小于约0.3％(v/v)、小于约0.2％(v/v)、小于约0.1％(v/v)、小于约0.05％(v/v)或小于约0.01％(v/v)。在这方面，在正常条件下为液体的冷冻保护剂将不视为除水之外的溶剂，而是视为冷冻保护剂。换言之，所述组合物中含有的除水以外的溶剂的总量可以小于约1.0％(v/v)的上述任选限制不适用于在正常条件下为液体的冷冻保护剂。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物的摩尔渗透压浓度为至多约400×10-3osmol/kg，如至多约390×10-3osmol/kg、至多约380×10-3osmol/kg、至多约370×10-3osmol/kg、至多约360×10-3osmol/kg、至多约350×10- 3osmol/kg、至多约340×10-3osmol/kg、至多约330×10-3osmol/kg、至多约320×10-3osmol/kg、至多约310×10-3osmol/kg，或至多约300×10-3osmol/kg。如果所述组合物不包含冷冻保护剂，则所述组合物的摩尔渗透压浓度可低于300×10-3osmol/kg，如至多约250×10- 3osmol/kg、至多约200×10-3osmol/kg、至多约150×10-3osmol/kg、至多约100×10-3osmol/kg、至多约50×10-3osmol/kg、至多约40×10-3osmol/kg或至多约30×10-3osmol/kg。如果所述组合物包含冷冻保护剂，则优选所述组合物的摩尔渗透压浓度的主要部分由冷冻保护剂提供。例如，所述冷冻保护剂可以提供组合物摩尔渗透压浓度的至少50％，例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l。例如，所述组合物中RNA的浓度可以是约10mg/l至约140mg/l，例如约20mg/l至约130mg/l、约25mg/l至约125mg/l、约30mg/l至约120mg/l、约35mg/l至约115mg/l、约40mg/l至约110mg/l、约45mg/l至约105mg/l或约50mg/l至约100mg/l。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述最终缓冲物质是Tris及其质子化形式，所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间，并且所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l。在这个实施方案中，优选所述组合物的pH在约6.9至约7.9之间，并且所述组合物中RNA的浓度为约25mg/l至约125mg/l，例如约30mg/l至约120mg/l。在第二方面的特别优选的实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式；所述组合物的pH在约6.9至约7.9之间；所述组合物中RNA的浓度为约25mg/l至约125mg/l，例如约30mg/l至约120mg/l；所述最终水相基本不含硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸和基本不含有机多元酸；并且所述组合物包含冷冻保护剂。在第二方面的另一个特别优选的实施方案中，所述缓冲物质是Tris及其质子化形式；所述组合物的pH在约6.9至约7.9之间；所述组合物中RNA的浓度为约25mg/l至约125mg/l，例如约30mg/l至约120mg/l；所述最终水相基本不含硫酸盐阴离子、基本不含有机二元酸和基本不含有机多元酸；并且所述组合物基本不含冷冻保护剂。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。例如，所述阳离子可电离脂质可以具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中L1、L2、G1、G2、G3、R1、R2和R3如本文所定义。优选地，阳离子可电离脂质选自以下：结构I-1至I-36(本文所示)；和/或结构A至F(本文所示)；和/或N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(DODMA)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)，庚三烯酸-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)，和4-((二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-N,N-二甲基-4-氧代丁基-1-胺(DPL-14)。在一个特别优选的实施方案中，所述阳离子可电离脂质是具有结构I-3的脂质。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，在步骤(b)或(d’)中制备的乙醇溶液进一步包含一种或多种另外的脂质，并且LNP进一步包含所述一种或多种另外的脂质。优选地，所述一种或多种其他脂质选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合。在第二方面的一个优选实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上述实施例(1)至(30)的任一个中)，所述一种或多种另外的脂质包含聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)、中性脂质(例如DSPC)和类固醇(例如胆固醇)，从而LNP包含本文所述的阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质(例如，聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物)、中性脂质(例如DSPC)和类固醇(例如，胆固醇)。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中所述一种或多种另外的脂质包含聚合物缀合脂质，所述聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质。例如，所述聚乙二醇化脂质可以具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中R12、R13和w如本文所定义。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上述实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中所述一种或多种另外的脂质包含聚合物缀合脂质，所述聚合物缀合脂质是聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物。例如，所述聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物可以是选自聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物和聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中所述一种或多种另外的脂质包含中性脂质，所述中性脂质是磷脂。这种磷脂优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂的具体的实例包括二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三碳酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、双十四酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OchemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DpyPE)。在一个特别优选的实施方案中，所述中性脂质是DSPC。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，其中所述一种或多种另外的脂质包括类固醇，所述类固醇是固醇如胆固醇。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述乙醇溶液包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇，基于所述乙醇溶液中脂质的总摩尔量，摩尔比为20％至60％的阳离子可电离脂质、0.5％至15％的聚合物缀合脂质、5％至25％的中性脂质和25％至55％的类固醇。例如，基于所述乙醇溶液中脂质的总摩尔量，所述摩尔比可以是40％至55％的阳离子可电离脂质、1.0％至10％的聚合物缀合脂质、5％至15％的中性脂质和30％至50％的类固醇，例如45％至55％的阳离子可电离脂质、1.0％至5％的聚合物缀合脂质、8％至12％的中性脂质以及35％至45％的类固醇。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第一方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上述实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述最终水相不包含螯合剂。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，LNP包含所述组合物中包含的RNA的至少约75％。例如，LNP可包含所述组合物中包含的RNA的至少约76％，例如至少约77％、至少约78％、至少约79％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％或至少约95％。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)包封在LNP内或与LNP缔合。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)包含取代尿苷的修饰的核苷。例如，所述修饰的核苷可选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)包含以下一个或多个：(a)5’帽，例如cap1或cap2结构；(b)5’UTR；(c)3’UTR；和(d)poly-A序列，例如包含至少100个核苷酸的poly-A序列，其中所述poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。
在第二方面的一个优选实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA(例如mRNA)编码一种或多种多肽。例如，所述一种或多种多肽可包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。在优选的实施方案中，所述RNA(如mRNA)包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在第二方面的一个实施方案中(特别是在上述第二方面的第一、第二、第三或第四亚组的一个实施方案中，例如在上面列出的实施方案(1)至(30)的任一个中)，所述RNA包含编码全长SARS-CoV2 S蛋白变体的ORF，所述变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。例如，SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ IDNO:7可具有至少80％的相同性。
在第三方面，本发明提供了一种储存组合物的方法，其包括根据第二方面的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约-90℃至约-10℃的温度范围内，例如约-90℃至约-40℃或约-40℃至约-25℃，或约-25℃至约-10℃，或温度约为-20℃。在第三方面的一个实施方案中，将所述冷冻组合物储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周。在第三方面的一个实施方案中，将冷冻组合物在-20℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，进一步优选至少6个月。在第三方面的一个实施方案中，所述组合物可以在-70℃下储存。
在第三方面的一个实施方案中，储存组合物的方法包括根据包括步骤(II)的第二方面的方法制备组合物(即，将所述制剂在约-10℃或以下冷冻)；将冷冻组合物在约-90℃至约-10℃的温度范围内储存一定时间(例如，至少一周)；以及将冷冻组合物在约0℃至约20℃的温度范围内储存一定时间(例如，至少一周)。
应当理解，本文在第一或第二方面的上下文中描述的任何实施方案(特别地，第一方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第一方面的实施方案(1)至(30)的任一个或第二方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第二方面的实施方案(1)至(30)的任一个)也可以应用于第三方面的任何实施方案。
在第四方面，本发明提供了一种储存组合物的方法，其包括根据第二方面的方法制备液体组合物，并将所述液体组合物储存在约0℃至约20℃，例如约1℃至15℃、约2℃至10℃、或约2℃至8℃的温度下，或在约5℃的温度范围内。在第四方面的一个实施方案中，将液体组合物储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月或至少6个月，优选至少4周。在第四方面的一个实施方案中，将液体组合物在5℃下储存至少4周，优选至少1个月、更优选至少2个月、更优选至少3个月、进一步优选至少6个月。
在第四方面的一个实施方案中，储存组合物的方法包括根据包括步骤(II)的第二方面的方法制备组合物(即，将所述制剂在约-10℃或以下)冷冻；以及将冷冻组合物在约0℃至约20℃的温度范围内储存一定时间(例如至少一周)。
应当理解，本文在第一、第二或第三方面的上下文中描述的任何实施方案(特别地，第一方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第一方面的实施方案(1)至(30)的任一个或第二方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第二方面的实施方案(1)至(30)的任一个)也可以应用于第四方面的任何实施方案。
在第五方面，本发明提供了通过第二、第三或第四方面的方法可制备的组合物。在第五方面的一个实施方案中，所述组合物可以是冷冻形式，其优选地可以在约-90℃或更高的温度下储存，例如约-90℃至约-10℃。例如，第五方面的冷冻组合物可以在约-90℃至约-40℃或约-40℃至约-25℃、或约-25℃至约-10℃或约-20℃的温度范围内储存。在第五方面的一个实施方案中，所述组合物可以储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周。例如，冷冻组合物可以在-20℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，进一步优选至少6个月。
在第五方面的一个实施方案中，其中所述组合物为冷冻形式，在冷冻组合物解冻后(例如，在已在-20℃下储存的冷冻组合物解冻后)的RNA完整性为至少50％，如至少52％、至少54％、至少55％、至少56％、至少58％或至少60％。
另外或替代地，在第五方面的一个实施方案中，当所述组合物为冷冻形式时，所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))等于所述组合物冷冻前LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)等于冷冻前LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述冷冻组合物解冻后LNP的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
在第五方面的另一个实施方案中，所述组合物为液体形式。
在第五方面的一个实施方案中，所述组合物为液体形式，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的RNA完整性足以产生预期效果，例如诱导免疫应答。例如，当在0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的RNA完整性可以是至少50％，例如至少52％、至少54％、至少55％、至少56％、至少58％或至少60％。
另外或替代地，在第五方面的一个实施方案中，所述组合物为液体形式，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))足以产生预期效果，例如诱导免疫应答。例如，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))等于初始组合物(即在储存之前)的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)等于储存前LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述液体组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
应当理解，本文在第一、第二、第三或第四方面的上下文中描述的任何实施方案(特别地，第一方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第一方面的实施方案(1)至(30)的任一个或第二方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第二方面的实施方案(1)至(30)的任一个)也可以应用于第五方面的任何实施方案。
在第六方面，本发明提供了一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过第二或第三方面的方法制备的冷冻组合物并解冻所述冷冻组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
应当理解，本文在第一、第二、第三、第四或第五方面的上下文中描述的任何实施方案(特别地，第一方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第一方面的实施方案(1)至(30)的任一个或第二方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第二方面的实施方案(1)至(30)的任一个)也可以应用于第六方面的任何实施方案。
在第七方面，本发明提供了一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过第二或第四方面的方法制备的液体组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
应当理解，本文在第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的上下文中描述的任何实施方案(特别地，第一方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第一方面的实施方案(1)至(30)的任一个或第二方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第二方面的实施方案(1)至(30)的任一个)也可以应用于第七方面的任何实施方案。
在第八方面，本发明提供了通过第六或第七方面的方法可制备的即用型药物组合物。
应当理解，本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的上下文中描述的任何实施方案(特别地，第一方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第一方面的实施方案(1)至(30)的任一个或第二方面的上述第一、第二、第三或第四亚组的任何实施方案，例如上面列出的第二方面的实施方案(1)至(30)的任一个)也可以应用于第八方面的任何实施方案。
在第九方面，本发明提供了第一、第五和第八方面中任一方面的组合物的治疗用途。
应当理解，本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七或第八方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第九方面的任何实施方案。
在第十方面，本发明提供了第一、第五和第八方面中任一方面的组合物在诱导免疫应答中的用途。
应当理解，本文在第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八或第九方面的上下文中描述的任何实施方案也可以应用于第十方面的任何实施方案。
进一步的分项实施方案如下所述：
1.一种组合物，其包含分散在水相中的脂质纳米颗粒(LNP)，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质和单价阴离子，所述缓冲物质选自三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)及其质子化形式，双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-methane)及其质子化形式以及三乙醇胺(TEA)及其质子化形式，并且单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸(MES)的阴离子、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)的阴离子和2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)的阴离子；所述组合物中缓冲物质的浓度至多为约25mM；所述水相基本上不含无机磷酸盐阴离子，基本上不含柠檬酸盐阴离子，以及基本上不含乙二胺四乙酸(EDTA)的阴离子。
2.项目1所述的组合物，其中所述缓冲物质为Tris及其质子化形式。
3.项目1或2所述的组合物，其中所述组合物中缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的浓度为至多约20mM，优选至多约15mM，更优选至多约10mM，例如约10mM。
4.项目1至3中任一项所述的组合物，其中所述水相基本上不含无机硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子，特别是基本上不含无机硫酸盐阴离子、碳酸盐阴离子、有机二元酸阴离子和有机多元酸阴离子。
5.项目1至4中任一项所述的组合物，其中所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根和乳酸根，并且所述组合物中单价阴离子的浓度至多等于、优选小于所述组合物中缓冲物质的浓度，例如小于约9mM。
6.项目1至4中任一项所述的组合物，其中所述单价阴离子选自MES、MOPS和HEPES的阴离子，并且所述组合物中单价阴离子的浓度至少等于、优选高于所述组合物中缓冲物质的浓度。
7.项目1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间，优选在约6.9至约7.9之间，例如在约7.0至约7.8之间。
8.项目1至7中任一项所述的组合物，其中水是所述组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂总量小于约0.5％(v/v)。
9.项目1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物的摩尔渗透压浓度至多约为400×10-3osmol/kg。
10.项目1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l，优选约10mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
11.项目1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂，优选浓度为至少约1％w/v，其中所述冷冻保护剂优选包含选自碳水化合物和糖醇的一种或多种化合物，更优选所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合，更优选所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。
12.项目1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物基本上不含冷冻保护剂。
13.项目1至12中任一项所述的组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
14.项目1至13中任一项所述的组合物，其中所述阳离子可电离脂质具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8环亚烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x是0、1或2。
15.项目1至13中任一项所述的组合物，其中：
(α)所述阳离子可电离脂质选自本文所示结构I-1至I-36；或
(β)所述阳离子可电离脂质选自本文所示结构A至F；或
(γ)所述阳离子可电离脂质是具有本文所示结构I-3的脂质。
16.项目1至15中任一项所述的组合物，其中所述LNP进一步包含一种或多种其他脂质，优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述LNP包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇。
17.项目16所述的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质优选具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或未饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多个酯键中断；且w具有在30至60之间的平均值。
18.项目16所述的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，其中所述聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物优选是选自由聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物、聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
19.项目16至18中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰磷基脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OchemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DpyPE)。
20.项目16至19中任一项所述的组合物，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。
21.项目1至20中任一项所述的组合物，其中所述水相不包含螯合剂。
22.项目1至21中任一项所述的组合物，其中所述LNP包含所述组合物中包含的RNA的至少约75％，优选至少约80％。
23.项目1至22中任一项所述的组合物，其中所述RNA包封在所述LNP内或与所述LNP缔合。
24.项目1至23中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含替代尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷优选选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
25.项目1至24中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含以下中的至少一个、优选以下全部：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。
26.项目25所述的组合物，其中所述poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中所述poly-A序列优选为中断的A核苷酸序列。
27.项目25或26所述的组合物，其中所述5’帽是cap1或cap2结构。
28.项目1至27中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码一种或多种多肽，其中所述一种或多种多肽优选包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
29.项目28所述的组合物，其中所述RNA包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
30.项目28或29所述的组合物，其中所述RNA包含编码全长SARS-CoV2 S蛋白变体的ORF，所述变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。
31.项目29或30所述的组合物，其中所述SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的相同性。
32.项目1至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冷冻形式。
33.项目32所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为50％。
34.项目82或83所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于所述组合物冷冻前LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
35.项目1至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体形式。
36.一种制备包含分散在最终水相中的LNP的组合物的方法，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；最终水相包括最终缓冲系统，所述最终缓冲系统包含最终缓冲物质和最终单价阴离子，所述最终缓冲物质选自Tris及其质子化形式、Bis-Tris甲烷及其质子化形式、TEA及其质子化形式，并且所述最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、MES的阴离子、MOPS的阴离子和HEPES的阴离子；所述组合物中最终缓冲物质的浓度至多为约25mM；并且最终水相基本上不含无机磷酸盐阴离子，基本上不含柠檬酸盐阴离子，且基本上不含EDTA的阴离子；
其中所述方法包括：
(I)制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；和
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得所述组合物，
其中步骤(I)包括：
(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(b)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(c)将根据(a)制备的RNA溶液与根据(b)制备的乙醇溶液混合，从而制备第一中间制剂，其包含分散在第一水相中的LNP，所述第一水相包含第一缓冲系统；和
(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤根据(c)制备的第一中间制剂，从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
37.项目求36所述的方法，其中步骤(I)进一步包括选自稀释和过滤的一个或多个步骤。
38.项目36或37所述的方法，其中步骤(I)包括：
(a’)提供RNA水溶液；
(b’)提供包含第一缓冲系统的第一含水缓冲溶液；
(c’)将根据(a’)提供的RNA水溶液与根据(b’)提供的第一含水缓冲溶液混合，从而制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(d’)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(e’)将根据(c’)制备的RNA溶液与根据(d’)制备的乙醇溶液混合，从而制备第一中间制剂，其包含分散在第一水相中的LNP，所述第一水相包含第一缓冲系统；
(f’)任选使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液过滤根据(e’)制备的第一中间制剂，从而制备另一中间制剂，其包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；
(g’)任选重复步骤(f’)一次或两次或更多次，其中在步骤(f’)的一次循环之后获得另一中间制剂用作下一循环的第一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中在每个循环中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；
(h’)使用包含最终缓冲系统且pH值至少为6.0的最终含水缓冲溶液，
如果不存在步骤(f’)，则过滤在步骤(e’)中获得的第一中间制剂，或者
如果存在步骤(f’)而不存在步骤(g’)，则过滤在步骤(f’)中获得的另一中间制剂，或者
如果存在步骤(f’)和(g’)，则过滤在步骤(g’)之后获得的另一中间制剂；
以及
(i’)任选使用稀释溶液稀释在步骤(h’)中获得的制剂；
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
39.项目36至38中任一项所述的方法，其中过滤是切向流过滤或渗滤，优选切向流过滤。
40.项目36至39中任一项所述的方法，其包括(II)将所述制剂冷冻至约-10℃或更低。
41.项目36至40中任一项所述的方法，其中所述最终缓冲物质是Tris及其质子化形式。
42.项目36至41中任一项所述的方法，其中所述组合物中最终缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的浓度为至多约20mM，优选至多约15mM，更优选至多约10mM，例如约10mM。
43.项目36至42中任一项所述的方法，其中所述水相基本上不含无机硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子，特别是基本上不含无机硫酸盐阴离子、碳酸盐阴离子、有机二元酸阴离子和有机多元酸阴离子。
44.项目36至43中任一项所述的方法，其中
(i)在步骤(a)中制备的RNA溶液还包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子，以及步骤(d)是在去除所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子的条件下进行，产生包含分散在最终水相中的LNP的制剂，所述最终水相基本上不含在步骤(a)中制备的RNA溶液中存在的所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子；或者
(ii)第一含水缓冲溶液和第一水相包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子，并且步骤(f’)至(h’)中的至少一个步骤是在从第一中间制剂和/或从另一中间制剂中去除所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子的条件下进行。
45.项目36至44中任一项所述的方法，其中
(i)在步骤(a)中获得的RNA溶液的pH值低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5；或者
(ii)第一含水缓冲溶液的pH值低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5。
46.项目44或45所述的方法，其中所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子包含柠檬酸盐阴离子和/或EDTA的阴离子。
47.项目36至43中任一项所述的方法，其中
(i)在步骤(a)中使用的第一缓冲系统包含步骤(d)中使用的最终缓冲物质和最终单价阴离子，优选在步骤(a)中使用的第一缓冲系统的缓冲系统和pH与在步骤(d)中使用的最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同；或者
(ii)在步骤(b’)、(f’)和(g’)中使用的每个第一缓冲系统和每个另一缓冲系统包含在步骤(h’)中使用的最终缓冲物质和最终单价阴离子，优选在步骤(b’)、(f’)和(g’)中使用的每个第一含水缓冲溶液和每个另一含水缓冲溶液的缓冲系统和pH与最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同。
48.项目36至47中任一项所述的方法，其中所述最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根和乳酸根，并且所述组合物中最终单价阴离子的浓度至多等于、优选小于所述组合物中缓冲物质的浓度，例如小于约9mM。
49.项目36至48中任一项所述的方法，其中所述最终单价阴离子选自MES、MOPS和HEPES的阴离子，并且所述组合物中最终单价阴离子的浓度至少等于、优选高于所述组合物中最终缓冲物质的浓度。
50.项目36至49中任一项所述的方法，其中所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间，优选在约6.9至约7.9之间，例如在约7.0至约7.8之间。
51.项目36至50中任一项所述的方法，其中水是所述制剂和/或组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂总量小于约0.5％(v/v)。
52.项目36至51中任一项所述的方法，其中所述组合物的摩尔渗透压浓度至多约为400×10-3osmol/kg。
53.项目36至52中任一项所述的组合物，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l，优选约10mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
54.项目36至53中任一项所述的方法，其中(i)步骤(I)进一步包括使用稀释溶液稀释根据(d)制备的制剂，或者，存在步骤(i’)，其中稀释溶液包含冷冻保护剂；和/或
(ii)在步骤(I)中获得的制剂和所述组合物包含冷冻保护剂，优选浓度为至少约1％w/v，其中所述冷冻保护剂优选包含选自碳水化合物和糖醇的一种或多种保护剂，更优选所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇以及其组合，更优选所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。
55.项目36至53中任一项所述的方法，其中在步骤(I)中获得的制剂和所述组合物基本上不含冷冻保护剂。
56.项目36至55中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
57.项目36至56中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8环亚烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x是0、1或2。
58.项目36至56中任一项所述的方法，其中：
(α)所述阳离子可电离脂质选自本文所示结构I-1至I-36；或
(β)所述阳离子可电离脂质选自本文所示结构A至F；或
(γ)所述阳离子可电离脂质是具有本文所示结构I-3的脂质。
59.项目36至58中任一项所述的方法，其中在步骤(b)或(d’)中制备的乙醇溶液进一步包含一种或多种其他脂质，并且LNP进一步包含一种或多种其他脂质，其中所述一种或多种其他脂质优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇。
60.项目59所述的方法，其中所述聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质优选具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或未饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多个酯键中断；且w具有在30至60之间的平均值。
61.项目59所述的方法，其中所述聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，其中所述聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物优选是选自由聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物、聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
62.项目59至61中任一项所述的方法，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。
63.项目59至62中任一项所述的方法，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。
64.项目36至63中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇以20％至60％阳离子可电离脂质、0.5％至15％聚合物缀合脂质、5％至25％中性脂质和25％至55％类固醇的摩尔比存在于乙醇溶液中，优选摩尔比为45％至55％阳离子可电离脂质、1.0％至5％聚合物缀合脂质、8％至12％中性脂质和35％至45％类固醇。
65.项目36至64中任一项所述的方法，其中所述最终水相不包含螯合剂。
66.项目36至65中任一项所述的方法，其中所述LNP包含所述组合物中包含的RNA的至少约75％，优选至少约80％。
67.项目36至66中任一项所述的方法，其中所述RNA包封在所述LNP内或与所述LNP缔合。
68.项目36至67中任一项所述的方法，其中所述RNA包含替代尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷优选选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
69.项目36至68中任一项所述的方法，其中所述RNA包含以下中的至少一个、优选以下全部：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。
70.项目产品69所述的方法，其中所述poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中所述poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。
71.项目69或70所述的方法，其中所述5’帽是cap1或cap2结构。
72.项目36至71中任一项所述的方法，其中所述RNA编码一种或多种多肽，其中所述一种或多种多肽优选包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
73.项目72所述的方法，其中所述RNA包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
74.项目72或73所述的方法，其中所述RNA包含编码全长SARS-CoV2 S蛋白变体的ORF，所述变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。
75.项目73或74所述的方法，其中所述SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的相同性。
76.项目36至39和41至75中任一项所述的方法，其不包括步骤(II)。
77.一种储存组合物的方法，其包括根据项目36至75中任一项所述的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约-90℃至约-10℃的温度范围内，例如约-90℃至约-40℃或约-25℃至约-10℃。
78.项目77所述的方法，其中将所述组合物储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月。
79.一种储存组合物的方法，其包括根据项目36至78中任一项所述的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约0℃至约20℃的温度范围内，例如约1℃至约15℃，约2℃至约10℃，或约2℃至约8℃或约5℃的温度。
80.项目79所述的方法，其中将所述组合物储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月或至少6个月。
81.一种组合物，其可通过项目36至80中任一项所述的方法制备。
82.项目81所述的组合物，其是冷冻形式。
83.项目82所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的组合物的RNA完整性相比至少为50％。
84.项目82或83所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于所述组合物冷冻前LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
85.项目81所述的组合物，其是液体形式。
86.项目85所述的组合物，其中所述组合物储存至少1周后的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为50％。
87.项目85或86所述的组合物，其中所述组合物储存至少一周后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于储存前LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
88.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过项目36至75、77和78中任一项所述的方法制备的冷冻组合物，并解冻所述冷冻组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
89.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过项目36至39、41至76、79和80中任一项的方法制备的液体组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
90.一种即用型药物组合物，其可通过项目88或89所述方法制备。
91.项目1至35、81至87和90中任一项所述的组合物，用于治疗。
92.项目1至35、81至87和90中任一项所述的组合物，用于在受试者中诱导免疫应答。
本发明的其他方面在本文中揭示。
附图说明
图1是BNT162b1材料的体内测定示意图。
图2示出通过毛细管电泳测定的RNA完整性。使用添加到有机相中的20mM Tris通过水相-乙醇混合方案制备RNA LNP。在pH 4、pH 5.5或pH 6.8的Tris:乙酸根中产生LNP，并将所得初级LNP分开：对一部分进行PBS透析(A)；对另一部分进行针对pH 7.4的Tris:乙酸根的透析(B)。为了进行比较，有机相没有接受Tris，在pH 5.5的乙酸钠缓冲液中产生LNP，并且将材料针对pH 7.4的Tris:乙酸根进行透析。所有样品均在室温下储存50小时。
图3示出所选RNA LNP组合物的形态。用低温电子显微镜对玻璃化样品进行分析。对于d028样品，使用了2.5倍以上的放大倍数。
图4示出RNA LNP组合物的小鼠免疫原性。将1μg RNA LNP组合物D028(LNP A)、D029(LNP B)和D030(LNP C)肌内注射到小鼠中，使用参考组合物(ATM)和盐水作为对照。对S1蛋白的表达(左图)和S1 IgG的产生(右图)进行了28天的跟踪。所有RNA LNP组合物彼此之间以及相对于参考组合物具有相当的生物活性。
图5示出RNA LNP组合物D028(A)以及RNA LNP组合物D029(B)和D030(C)的稳定性。正方形：室温，菱形：5℃，三角形：-20℃，圆形-70℃。实线：颗粒尺寸、RNA完整性或RNA含量；虚线：PDI、LMS(表示稳定折叠的RNA)或RNA包封。
图6示出缓冲强度为10mM或50mM的胶体稳定性RNA LNP组合物。正方形：室温，菱形：5℃，三角形：-20℃。实线表示颗粒尺寸，虚线表示PDI。
图7示出RNA相对于Tris缓冲液强度的稳定性。结果表示在特定时间和条件后样品中存在的RNA形态百分比。RNA表示全长RNA；LMS表示高度稳定折叠形式的RNA；Frag表示样品的RNA片段。
序列描述
下表提供了本文引用的某些序列的列表。
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具体实施方式
尽管本发明在下文中进一步更详细地描述，但是应当理解，本发明不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些方法、方案或试剂可以变化。还应理解，此处使用的术语只是为了描述特定的实施方案，并不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。
在下文中，将更详细地描述本发明的元素。这些元素与特定实施方案一起列出，然而，应当理解，它们可以以任何方式和任何数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的实施例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本描述应理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的公开和/或优选元素相组合的实施方案。此外，除非上下文另有指示，否则本申请中所有描述的元素的任何排列和组合都应认为是由本申请的描述所公开的。例如，如果在一个优选实施方案中，所述组合物(或制剂)包含冷冻保护剂，并且在另一个优选的实施方案中，所述阳离子可离电离脂质具有结构I-3，则在进一步优选的实施方案中，所述组合物(或制剂)包含冷冻保护剂和具有结构I-3的阳离子可电离脂质。
优选地，本文中使用的术语定义如“A multilingual glossary ofbiotechnological terms:(IUPAC Recommendations)”,H.G.W.Leuenberger,B.Nagel,andH.Eds.,Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland,(1995)所述。
除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域的文献中解释的常规化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术(参见例如，Organikum,Deutscher Verlag derWissenschaften,Berlin 1990；Streitwieser/Heathcook,“Organische Chemie”,VCH,1990；Beyer/Walter,“Lehrbuch der Organischen Chemie”,S.Hirzel VerlagStuttgart,1988；Carey/Sundberg,“Organische Chemie”,VCH,1995；March,“AdvancedOrganic Chemistry”,John Wiley&Sons,1985；Chemie Lexikon,Falbe/Regitz(Hrsg.),Georg Thieme Verlag Stuttgart,New York,1989；Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor 1989。
在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则“包含”一词或其变体将理解为意味着包含所述成员、整数或步骤或成组的成员、整数或步骤，但不排除任何其他成员、整数、步骤或成组的成员、整数或步骤。术语“基本由…组成”是指除外任何重要意义的其他成员、整数或步骤。术语“包含”涵盖术语“基本上由…组成”，进而又涵盖“由…组成”。因此，在本申请中每次出现时，术语“包含”可替换为术语“基本上由…组成”或“由…组成”。同样，在本申请中每次出现时，术语“基本上由…组成”可替换为术语“由…组成”。
术语“一个(种)(a)”、“一个(种)(an)”和“所述(the)”以及在描述本发明的上下文中使用的类似用法(特别是在权利要求的上下文中)应解释为涵盖单数和复数，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。本文对值范围的叙述仅旨在用作单独提及在所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另有说明，否则每个单独的值均并入本说明书中，就像其在本文中单独陈述一样。本文描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有指示或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，而对以其他方式要求保护的本发明的范围不构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示对本发明的实践至关重要的任何未要求保护的元素。
如本文所用，“和/或”应视为两个特定特征或组件中每一个的具体公开，包括或不包括另一个。例如，“X和/或Y”应视为(i)X、(ii)Y和(iii)X和Y中每一个的具体公开，就像其在本文中单独列出一样。
在本发明的上下文中，术语“约”表示普通技术人员将理解的精确度区间，以仍然确保所讨论的特征的技术效果。所述术语通常表示与所指示的数值的偏差为±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％和例如±0.01％。如本领域普通技术人员将理解的，这种对于给定技术效果的数值的具体偏差将取决于所述技术效果的性质。例如，天然或生物技术效果通常可以比人为或工程技术效果具有更大的偏差。
本文对值范围的叙述仅旨在用作单独提及在所述范围内的每个单独值的简写方法。除非本文中另有说明，否则每个单独的值均并入本说明书中，就像其在本文中单独陈述一样。
本说明书全文引用了多个文件。本文引用的每一份文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商规范、说明书等)，无论是在上文还是下文引用的，均通过援引整体加入本文。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明无权凭借先前的发明提前公开。
定义
在下文中，将提供适用于本发明的所有方面的定义。除非另有说明，下列术语具有以下含义。任何未定义的术语都有其公认的含义。
如本文所用的诸如“减少”或“抑制”的术语是指导致整体降低的能力，例如约5％或更大、约10％或更大、约15％或更大、约20％或更大、约25％或更大、约30％或更大、约40％或更大、约50％或更大或约75％或更大的水平。术语“抑制”或类似的短语包括完全或基本上完全的抑制，即减少到零或基本上为零。
在一个实施方案中，诸如“增加”或“增强”的术语涉及增加或增强至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约80％或至少约100％。
如本文所用，“生理pH”是指约7.5的pH。
如本文所用，“生理条件”是指活体、特别是人的条件(特别是pH和温度)。优选地，生理条件是指生理pH和/或约37℃的温度。
如在本发明中使用的，“％(w/v)”(或“％w/v”)是指重量体积百分比，其是测量以克(g)为单位的溶质的量与以毫升(ml)为单位的溶液总体积的百分比表示的浓度单位。
如在本发明中所使用的，“％重量”或“％(w/w)”(或“％w/w”)是指重量百分比，其是测量以克(g)为单位的物质的量与以克(g)为单位的总组合物总重量的百分比表示的浓度单位。
关于二价无机离子、特别是二价无机阳离子的存在，其浓度或由于螯合剂的存在而产生的有效浓度(游离离子的存在)在一个实施方案中足够低以防止RNA降解。在一个实施方案中，二价无机离子的浓度或有效浓度低于水解RNA核苷酸之间的磷酸二酯键的催化水平。在一个实施方案中，游离二价无机离子的浓度为20μM或更低。在一个实施方案中，没有或基本上没有游离的二价无机离子。
“摩尔渗透压浓度”是指特定溶质的浓度，表示为每千克溶剂的溶质渗透压摩尔数。
术语“冷冻”涉及液体的凝固，通常伴随着热量的释放。
如本文所用，术语“水相”涉及包含颗粒、特别是LNP的组合物/制剂，是指流动相或液相，即包括溶解在其中的所有组分但(形式上)不包括颗粒的连续水相。因此，如果颗粒例如LNP分散在水相中并且所述水相基本上不含化合物X，则所述水相是以在实践和现实中是可行的方式不含X，例如，所述水相组合物中化合物X的浓度小于1％重量。然而，同时分散在水相中的颗粒可以包含大于1％重量的量的化合物X是可能的。
如本文所用，与碱(例如有机伯胺，如Tris)相关的表述“质子化形式”是指碱的共轭酸，其中所述共轭酸含有质子，所述质子可通过产生所述碱的去质子化而去除。例如，质子化形式的Tris的分子式为[H3N(CH2CH2OH)3]+。如本文所用，“缓冲物质”是指碱与其质子化形式的混合物(例如，Tris与[H3N(CH2CH2OH)3]+的混合物)。因此，组合物中所含的缓冲物质的量是所述组合物中碱和共轭酸的量之和。
在本发明上下文中的术语“重组”是指“通过基因工程产生”。在一个实施方案中，本发明上下文中的“重组物体”不是天然存在的。
如本文所用，术语“天然存在的”指的是物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界来源中分离出来并且未在实验室中经人为有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现的”是指“存在于自然界中”，包括已知的物体以及尚未被发现和/或分离自自然界但将来可能从自然资源中发现和/或分离出来的物体。
如本文所用，术语“室温”和“环境温度”在本文中可互换使用，是指至少约15℃、优选约15℃至35℃、约15℃至约30℃、15℃至25℃或17℃至22℃的温度。这些温度包括15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃和22℃。
术语“烷基”是指饱和直链或支链烃的单自由基。优选地，烷基包含1至12个(例如1至10个)碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子，缩写为C1-12烷基，(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，缩写为C1-10烷基)，更优选1至8个碳原子，例如1至6个或1至4个碳原子。示例的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基(也称为2-丙基或1-甲基乙基)、丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基(iso-pentyl)、仲戊基、新戊基、1,2-二甲基丙基、异戊基(iso-amyl)、正己基、异己基、仲己基、正庚基、异庚基、正辛基、2-乙基己基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基等。“取代的烷基”指一个或多个(例如1至与烷基结合最大数目的氢原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，例如1至5个、1至4个、或1至3个、或1或2个)亚烷基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。取代的烷基的实例包括氯甲基、二氯甲基、氟甲基和二氟甲基。
术语“亚烷基”是指饱和直链或支链烃的双自由基。优选地，亚烷基包含1至12个(例如1至10个)碳原子，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选1至8个碳原子，例如1至6个或1至4个碳原子。示例的亚烷基包括亚甲基、乙烯(即，1,1-乙烯，1,2-乙烯)，丙烯(即，1,1-丙烯，1,2-丙烯(-CH(CH3)CH2-)，2,2-丙烯(-C(CH3)2-)和1,3-丙烯)，丁烯异构体(例如，1,1-丁烯，1,2-丁烯，2,2-丁烯，1,3-丁烯，2,3-丁烯(顺式或反式或其混合物)，1,4-丁烯，1,1-异丁烯，1,2-异丁烯和1,3-异丁烯)，戊烯异构体(例如，1,1-戊烯，1,2-戊烯，1,3-戊烯，1,4-戊烯，1,5-戊烯，1,1-异戊烯，1,1-仲戊基，1,1-新戊基)，己烯异构体(例如，1,1-己烯，1,2-己烯，1,3-己烯，1,4-己烯，1,5-己烯，1,6-己烯和1,1-异己烯)，庚烯异构体(例如，1,1-庚烯，1,2-庚烯，1,3-庚烯，1,4-庚烯，1,5-庚烯，1,6-庚烯，1,7-庚烯和1,1-异庚烯)，辛烯异构体(例如，1,1-辛烯，1,2-辛烯，1,3-辛烯，1,4-辛烯，1,5-辛烯，1,6-辛烯，1,7-辛烯，1,8-辛烯和1,1-异辛烯)等。具有至少3个碳原子且每端具有自由价的直链亚烷基部分也可称为亚甲基的倍数(例如，1,4-丁烯也可称为四亚甲基)。一般情况下，亚烷基部分除了以“ylene”结尾之外，也可以用“diyl”结尾(例如，1,2-丁烯(1,2-butylene)也可称为丁烯-1,2-二基(butan-1,2-diyl))。“取代的亚烷基”指一个或多个(例如1至与亚烷基结合最大数目的氢原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，例如1至5个、1至4个、或1至3个、或1或2个)亚烷基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃的单自由基。通常，烯基中碳-碳双键的最大数目可以等于烯基中碳原子数除以2得到的整数，如果烯基中碳原子数是奇数，将除法结果向下取整到下一个整数。例如，对于具有9个碳原子的烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2至8个碳原子，例如2至6个碳原子或2至4个碳原子。因此，在一个优选的实施方案中，烯基包含2至12个(缩写为C2-12烯基)(例如，2至10个)碳原子和1、2、3、4、5或6个(例如，1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选其包含2至8个碳原子和1、2、3或4个碳-碳双键，例如2至6个碳原子和1、2或3个碳-碳双键或2至4个碳原子和1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可以是顺式(Z)或反式(E)构型。示例的烯基包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(即烯丙基)、1-丁烯基，2-丁烯基，3-丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-戊烯基，4-戊烯基，1-己烯基，2-己烯基，3-己烯基，4-己烯基，5-己烯基，1-庚烯基，2-庚烯基，3-庚烯基，4-庚烯基，5-庚烯基，6-庚烯基，1-辛烯基，2-辛烯基，3-辛烯基，4-辛烯基，5-辛烯基，6-辛烯基，7-辛烯基，1-壬烯基，2-壬烯基，3-壬烯基，4-壬烯基，5-壬烯基，6-壬烯基，7-壬烯基，8-壬烯基，1-癸烯基，2-癸烯基，3-癸烯基，4-癸烯基，5-癸烯基，6-癸烯基，7-癸烯基，8-癸烯基，9-癸烯基，1-十一碳烯基，2-十一碳烯基，3-十一碳烯基，4-十一碳烯基，5-十一碳烯基，6-十一碳烯基，7-十一碳烯基，8-十一碳烯基，9-十一碳烯基，10-十一碳烯基，1-十二碳烯基，2-十二碳烯基，3-十二碳烯基，4-十二碳烯基，5-十二碳烯基，6-十二碳烯基，7-十二碳烯基，8-十二碳烯基，9-十二碳烯基，10-十二碳烯基，11-十二碳烯基等。如果烯基连接到氮原子上，双键不能在氮原子的α位。“取代的烯基”指一个或多个(例如1至与烯基结合最大数目的氢原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，例如1至5个、1至4个、或1至3个、或1或2个)烯基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“亚烯基”是指具有至少一个碳-碳双键的不饱和直链或支链烃的双自由基。通常，亚烯基中碳-碳双键的最大数目可以等于亚烯基中碳原子数除以2得到的整数，如果亚烯基中碳原子数是奇数，将除法结果向下取整到下一个整数。例如，对于具有9个碳原子的亚烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。优选地，亚烯基包含2至12个(例如2至10个)碳原子，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子)，更优选2至8个碳原子，例如2至6个碳原子或2至4个碳原子。因此，在一个优选的实施方案中，亚烯基包含2至12个(例如，2至10个碳)原子和1、2、3、4、5或6个(例如，1、2、3、4或5个)碳-碳双键，更优选其包含2至8个碳原子和1、2、3或4个碳-碳双键，例如2至6个碳原子和1、2或3个碳-碳双键或2至4个碳原子和1或2个碳-碳双键。碳-碳双键可以是顺式(Z)或反式(E)构型。示例的亚烯基包括乙烯-1,2-二基、亚乙烯基(vinylidene)(也称为亚乙烯基(ethenylidene))、1-丙烯-1,2-二基，1-丙烯-1,3-二基，1-丙烯-2,3-二基，亚烯丙基(allylidene)，1-丁烯-1,2-二基，1-丁烯-1,3-二基，1-丁烯-1,4-二基，1-丁烯-2,3-二基，1-丁烯-2,4-二基，1-丁烯-3,4-二基，2-丁烯-1,2-二基，2-丁烯-1,3-二基，2-丁烯-1,4-二基，2-丁烯-2,3-二基，2-丁烯-2,4-二基，2-丁烯-3,4-二基等。如果亚烯基连接到氮原子上，双键不能在氮原子的α位。“取代的亚烯基”指一个或多个(例如1至与亚烯基结合最大数目的氢原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，例如1至5个、1至4个、或1至3个、或1或2个)亚烯基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“亚环烷基”表示“亚烷基”的环状非芳族形式并且是成对的、邻位的或分离的双自由基。在某些实施方案中，亚环烷基是(i)单环或多环(例如双环或三环)的，和/或是(ii)3至14元(即3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，例如3至12元或3至10元)。在一个实施方案中，亚环烷基是单环、双环或三环的3至14元(即，3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，例如3至12元或3至10元)亚环烷基。通常，除了如上所述的亚环烷基部分使用“ylene”结尾之外，还可以使用“diyl”结尾(例如，1,2-环丙烯(1,2-cyclopropylene)也可以称为环丙烷-1,2-二基(cyclopropan-1,2-diyl))。示例的亚环烷基包括亚环己基，亚环庚基，亚环丙基，亚环丁基，亚环戊基，亚环辛基，二环[3.2.1]亚辛基，二环[3.2.2]亚壬基和亚金刚烷基(例如，三环[3.3.1.13,7]癸-2,2-二基)。“取代的亚环烷基”指一个或多个(例如1至与亚环烷基结合最大数目的氢原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，例如1至5个、1至4个、或1至3个、或1或2个)亚烷基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
术语“亚环烯基”表示“亚烯基”的环状非芳族形式并且是成对的、邻位的或分离的双自由基。通常，亚环烯基中碳-碳双键的最大数目可以等于亚环烯基中碳原子数除以2得到的整数，如果亚环烯基中碳原子数是奇数，将除法结果向下取整到下一个整数。例如，对于具有9个碳原子的亚环烯基，碳-碳双键的最大数目为4。优选地，亚环烯基具有1至6个(例如1至4个)，即1、2、3、4、5或6个碳-碳双键。在某些实施方案中，亚环烯基是(i)单环或多环(例如双环或三环)的，和/或是(ii)3至14元(即3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，例如3至12元或3至10元)。在一个实施方案中，亚环烯基是单环、双环或三环的3至14元(即，3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-、10-、11-、12-、13-或14-元，例如3至12元或3至10元)亚环烯基。示例的亚环烯基包括亚环己烯基、亚环庚烯基、亚环丙烯基、亚环丁烯基、亚环戊烯基和亚环辛烯基。“取代的亚环烯基”指一个或多个(例如1至与亚环烯基结合最大数目的氢原子，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或高达10个，例如1至5个、1至4个、或1至3个、或1或2个)亚环烯基的氢原子被除氢以外的取代基置换(当多于一个氢原子被置换时，取代基可以相同或不同)。优选地，除氢之外的取代基是一级取代基，如本文所述。
在上下文中使用的术语烃类的“芳族”是指整个分子必须是芳族的。例如，如果单环芳基被氢化(部分或完全)，则出于本发明的目的，所得氢化环状结构归类为环烷基。同样，如果双环或多环芳基(例如萘基)被氢化，则所得氢化双环或多环结构(例如1,2-二氢萘基)出于本发明的目的归类为环烷基(即使是一个环仍是芳族，例如在1,2-二氢萘基中)。
通常一级取代基优选选自C1-3烷基、苯基、卤素、-CF3、-OH、-OCH3、-SCH3、-NH2-z(CH3)z、-C(＝O)OH和-C(＝O)OCH3，其中z是0、1或2，且C1-3烷基是甲基、乙基、丙基或异丙基。特别优选的一级取代基选自甲基、乙基、丙基、异丙基、卤素(例如F、Cl或Br)和-CF3，例如卤素(例如F、Cl或Br)和-CF3。
如本文在冷冻组合物上下文中使用的表述“所述冷冻组合物解冻后”是指所述冷冻组合物必须在可以测量特征(例如包含在组合物中的LNP的RNA完整性和/或尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI)之前解冻。
“一价”化合物涉及仅具有一个相关的官能团的化合物。例如，一价阴离子涉及仅具有一个带负电荷的基团的化合物，优选在生理条件下。
“二价”或“二元”化合物涉及具有两个相关的官能团的化合物。例如，有机二元酸有两个酸基团。
“多价”或“多元”化合物涉及具有三个或更多个相关的官能团的化合物。例如，有机多元酸具有三个或更多个酸基团。
表述“RNA完整性”是指样品中包含的全长(即非片段化)RNA占RNA总量(即非片段化加片段化RNA)的百分比。RNA的完整性可以通过色谱法分离RNA(例如，使用毛细管电泳)、确定主要RNA峰的峰面积(即，全长(即非片段化)RNA的峰面积)、确定总RNA的峰面积，并将主要RNA峰的峰面积除以总RNA的峰面积而确定。
术语“冷冻保护剂”涉及添加到制备物(例如制剂或组合物)中以在冷冻阶段保护所述制备物的活性成分的物质。
根据本发明，术语“肽”包括寡肽和多肽并且是指包含通过肽键彼此连接的约2或多个、约3或多个、约4或多个、约6或多个、约8或多个、约10或多个、约13或多个、约16或多个、约20或多个及至多约50个、约100个或约150个连续氨基酸。术语“蛋白”是指较大的肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽，但术语“肽”和“蛋白”在本文中通常作为同义词使用。
当以治疗有效量提供给受试者时，“治疗性蛋白”对受试者的病症或疾病状态具有积极或有益的作用。在一个实施方案中，治疗性蛋白具有治愈或缓解的性质并且可以给药以对疾病或病症的一种或多种症状起到改善、缓解、减轻、逆转、延迟发作或降低严重性的作用。治疗性蛋白可具有预防性质，可用于延迟疾病的发作或减轻此类疾病或病理状况的严重程度。术语“治疗性蛋白”包括完整的蛋白或肽，并且还可以指其具有治疗活性的片段。它还可以包括治疗活性的蛋白变体。治疗活性蛋白的实例包括但不限于用于疫苗接种的抗原和免疫刺激剂例如细胞因子。
根据本发明，优选的是编码肽或蛋白的核酸例如RNA(例如，mRNA)一旦被细胞吸收或引入，即转染或转导到可以存在于体外或受试者体内的细胞中，导致所述肽或蛋白的表达。所述细胞可以在细胞内(例如在细胞质和/或细胞核中)表达编码的肽或蛋白，可以分泌编码的肽或蛋白，或者可以在表面表达编码的肽或蛋白。
根据本发明，诸如“核酸表达”和“核酸编码”或类似术语在本文中可互换使用，并且关于特定的肽或多肽意味着核酸如果存在于合适的环境中，优选在细胞内，其可以表达以产生所述肽或多肽。
术语“部分(portion)”是指一部分。关于特定结构例如氨基酸序列或蛋白，术语其“部分(portion)”可指所述结构的连续或不连续部分。
术语“部分(part)”和“片段”在本文中可互换使用并且指的是连续的元素。例如，诸如氨基酸序列或蛋白的结构的一部分(part)是指所述结构的连续元素。当在组合物的上下文中使用时，术语“部分(part)”是指组合物的一部分(portion)。例如，组合物的一部分(part)可以是所述组合物的0.1％至99.9％(例如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何部分(portion)。
关于氨基酸序列(肽或蛋白)的“片段”，涉及氨基酸序列的一部分(part)，即代表在N末端和/或C末端缩短的氨基酸序列的序列。例如通过缺少开放阅读框3’端的截短的开放阅读框的翻译而获得，可获得C末端缩短的片段(N末端片段)。例如通过缺少开放阅读框5’端的截短的开放阅读框的翻译而获得，只要所述截短的开放阅读框包含用于启动翻译的起始密码子即可，可获得在N末端缩短的片段(C末端片段)。氨基酸序列的片段包含例如来自氨基酸序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段优选包含来自氨基酸序列的至少6个、特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。
根据本发明，肽或蛋白的一部分(part)或片段优选具有其所来源的肽或蛋白的至少一种功能性质。此类功能性质包括药理学活性、与其他肽或蛋白相互作用、酶促活性、与抗体相互作用以及核酸的选择性结合。例如，肽或蛋白的药理学活性片段具有所述片段所来源的肽或蛋白的至少一种药理学活性。肽或蛋白的一部分(part)或片段优选包含所述肽或蛋白的至少6个、特别是至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个或至少50个连续氨基酸的序列。肽或蛋白的一部分(part)或片段优选包含所述肽或蛋白的多达8个、特别是多达10个、多达12个、多达15个、多达20个、多达30个或多达55个连续氨基酸的序列。
本文中的“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本氨基酸序列的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的修饰形式。优选地，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比，1至约20个氨基酸修饰，优选1至约10个或1至约5个氨基酸修饰。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然”是指在自然界中发现的氨基酸序列，包括等位基因变异。野生型氨基酸序列、肽或蛋白具有未经有意修饰的氨基酸序列。
出于本发明的目的，氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)的“变体”包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸取代变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象变体、同种型变体、等位基因变体、物种变体和物种同系物，特别是那些天然存在的变体。术语“变体”尤其包括氨基酸序列的片段。术语“变体”尤其包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中插入一个或两个或更多个氨基酸。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，将一个或多个氨基酸残基插入到氨基酸序列中的特定位点，尽管所得产物的适当筛选的随机插入也是可能的。氨基酸添加变体包含一个或多个氨基酸的氨基和/或羧基末端融合，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或多个氨基酸，例如去除1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以在蛋白的任何位置。包含蛋白N末端和/或C末端缺失的氨基酸缺失变体也称为N末端和/或C末端截短变体。氨基酸取代变体的特征在于序列中的至少一个残基移除并且另一个残基插入其位置。优选所述修饰位于在同源蛋白或肽之间非保守的氨基酸序列中的位置和/或将氨基酸用具有相似性质的其他氨基酸置换。优选地，肽和蛋白变体中的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即类似带电或不带电氨基酸的取代。保守的氨基酸变化涉及其侧链中相关的一个氨基酸家族中的取代。天然存在的氨基酸通常分为四类：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时统称为芳香族氨基酸。在一个实施方案中，保守氨基酸取代包括以下组的取代：
-甘氨酸，丙氨酸；
-缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；
-天冬氨酸，谷氨酸；
-天冬酰胺，谷氨酰胺；
-丝氨酸，苏氨酸；
-赖氨酸，精氨酸；和
-苯丙氨酸，酪氨酸。
优选地，给定氨基酸序列和是所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性、优选相同性程度为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选对于是参考氨基酸序列全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出相似性或相同性程度。例如，在一些实施方案中，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选对于至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个连续氨基酸给出相似性或相同性程度。在一些实施方案中，相似性或相同性的程度是对于参考氨基酸序列的全长给出的。用于确定序列相似性、优选序列相同性的比对可以使用本领域已知的工具进行，优选使用最佳序列比对，例如使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle,Matrix:Blosum62,Gap Open 10.0,GapExtend 0.5。
“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸取代的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列相同性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列相同性”表示序列之间相同的核苷酸的百分比。
术语“％相同”和“％相同性”或类似术语尤其旨在指代在待比较序列之间的最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计学上的，两个序列之间的差异可以但不一定随机分布在待比较序列的整个长度上。两个序列的比较通常通过在最佳比对后相对于某节段或“比较窗口”比较序列来进行，以鉴定相应序列的局部区域。用于比较的最佳比对可以手动进行或借助于Smith and Waterman,1981,Ads App.Math.2,482的局部同源算法、借助于Neddleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源算法、借助于Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444相似性搜索算法、或借助于使用所述算法的计算机程序(GAP,BESTFIT,FASTA,BLAST P,BLAST Nand TFASTAinWisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis.)。在一些实施方案中，使用BLASTN或BLASTP算法确定两个序列的百分比相同性，可得自美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站(例如，blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LIN K_LOC＝align2seq)。在一些实施方案中，NCBI网站上用于BLASTN算法的算法参数包括：(i)Expect Threshold设置为10；(ii)Word Size设置为28；(iii)查询范围中Max matches设置为0；(iv)Match/Mismatch Scores设置为1,-2；(v)Gap Costs设置为Linear；以及(vi)使用的低复杂度区域过滤器。在一些实施方案中，NCBI网站上用于BLASTP算法的算法参数包括：(i)ExpectThreshold设置为10；(ii)Word Size设置为3；(iii)查询范围中Max matches设置为0；(iv)Matrix设置为BLOSUM62；(v)Gap Costs设置为Existence:11Extension:1；以及(vi)conditional compositional score matrix adjustment。
通过确定待比较序列对应的相同位置的数量，将所述数量除以比较的位置数量(例如，参考序列中的位置数量)并将所述结果乘以100来获得相同性百分比。
在一些实施方案中，对于是参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出相似性或相同性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则给出至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个核苷酸的相同性程度，在一些实施方案中是连续的核苷酸。在一些实施方案中，相似性或相同性的程度是对于参考序列的全长给出的。
根据本发明，同源氨基酸序列呈现至少40％，特别是至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，优选至少95％，至少98％或至少99％的氨基酸残基相同性。
本文所述的氨基酸序列变体可由技术人员容易地制备，例如通过重组DNA操作进行。例如Sambrook et al.(1989)详细描述了制备具有取代、添加、插入或缺失的肽或蛋白的DNA序列的操作。此外，本文所述的肽和氨基酸变体可以借助已知的肽合成技术容易地制备，例如通过固相合成法和类似方法。
在一个实施方案中，氨基酸序列(肽或蛋白)的片段或变体优选是“功能片段”或“功能变体”。术语氨基酸序列的“功能片段”或“功能变体”涉及任何片段或变体，其表现出一种或多种与其来源的氨基酸序列相同或相似的功能性质，即是功能等同的。关于抗原或抗原序列，一种特定功能是由所述片段或变体所来源的氨基酸序列展示的一种或多种免疫原性活性。如本文所用，术语“功能片段”或“功能变体”特别指包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变了一个或多个氨基酸的氨基酸序列的变体分子或序列，并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或多种功能，例如，诱导免疫应答。在一个实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不会显著影响或改变所述分子或序列的特征。在不同的实施方案中，所述功能片段或功能变体的功能可能降低但仍显著存在，例如，功能变体的免疫原性可以是亲本分子或序列的免疫原性的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在其他实施方案中，与亲本分子或序列相比，所述功能片段或功能变体的免疫原性可能会增强。
氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)“源自”指定氨基酸序列(肽、蛋白或多肽)是指第一个氨基酸序列的起源。优选地，源自特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与所述特定序列或其片段相同、基本相同或同源的氨基酸序列。源自特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是所述特定序列或其片段的变体。例如，本领域的普通技术人员将理解适用于本文的抗原可以改变，使得其序列不同于其所源自的天然存在的或天然的序列，同时保留期望的天然序列的活性。
“分离的”是指改变或脱离其天然状态。例如，天然存在于活动物体内的核酸或肽不是“分离的”，但与其天然状态的共存物质部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如存在于宿主细胞中。在一个优选的实施方案中，用于本发明的RNA(例如mRNA)是基本上纯化的形式。在一个实施方案中，基本上纯化形式的RNA(例如mRNA)的溶液(优选水溶液)含有第一缓冲系统。
术语“遗传修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。术语“转染”涉及将核酸，特别是RNA引入细胞。出于本发明的目的，术语“转染”还包括将核酸引入细胞或核酸被此类细胞摄取，其中所述细胞可存在于受试者例如患者中。因此，根据本发明，用于本文所述核酸转染的细胞可存在于体外或体内，例如所述细胞可以构成患者的器官、组织和/或生物体的一部分。根据本发明，转染可以是瞬时的或稳定的。对于一些转染应用，转染的遗传物质仅瞬时表达就足够了。可以将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外源核酸会通过有丝分裂稀释或降解。允许核酸游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果希望转染的核酸实际保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须进行稳定转染。这种稳定的转染可以通过使用基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常，将编码抗原的核酸瞬时转染到细胞中。可以将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白。
根据本发明，肽或蛋白的类似物是其源自的所述肽或蛋白的修饰形式，并且具有所述肽或蛋白的至少一种功能性质。例如，肽或蛋白的药理学活性类似物具有所述类似物所来源的肽或蛋白的至少一种药理学活性。这样的修饰包括任何化学修饰并且包括与所述蛋白或肽相关的任何分子例如碳水化合物、脂质和/或蛋白或肽的单个或多个取代、缺失和/或添加。在一个实施方案中，蛋白或肽的“类似物”包括获得自糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解裂解或结合于抗体或另一细胞配体的那些修饰的形式。术语“类似物”还延伸至所述蛋白和肽的所有功能性化学等价物。
如本文所用，“激活”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的免疫效应细胞如T细胞的状态。激活也可能与信号传导通路的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“激活的免疫效应细胞”尤其指正在进行细胞分裂的免疫效应细胞。
术语“引发”是指这样的过程，其中免疫效应细胞如T细胞首先与其特异性抗原接触并导致分化成效应细胞如效应T细胞。
术语“克隆扩增”或“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在本发明的上下文中，所述术语优选用于免疫应答的语境中，其中免疫效应细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性免疫效应细胞扩增。优选地，克隆扩增导致免疫效应细胞的分化。
根据本发明的“抗原”涵盖将引起免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制如细胞应答所针对的任何物质。这也包括其中抗原被加工成抗原肽并且免疫应答或免疫机制针对一种或多种抗原肽的情况，特别是如果在MHC分子的背景下提呈。特别地，“抗原”涉及与抗体或T-淋巴细胞(T-细胞)特异性反应的任何物质，优选肽或蛋白。根据本发明，术语“抗原”包括包含至少一个表位例如T细胞表位的任何分子。优选地，本发明上下文中的抗原是任选在加工后诱导免疫反应的分子，其优选对抗原(包括表达抗原的细胞)具有特异性。在一个实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原或源自此类抗原的表位。
根据本发明，可以使用任何合适的抗原，其是免疫应答的候选者，其中免疫应答可以是体液免疫应答也可以是细胞免疫应答。在本发明的一些实施方案的情况下，所述抗原优选由细胞提呈，优选在MHC分子的情况下由抗原提呈细胞提呈，这导致针对抗原的免疫应答。抗原优选是对应于或源自天然存在的抗原的产物。此类天然存在的抗原可包括或可源自过敏原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染因子和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本发明，抗原可对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白或其部分。
术语“疾病相关抗原”以其最广义使用，指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是一种含有表位的分子，刺激宿主的免疫系统产生针对疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答。疾病相关抗原包括病原体相关抗原，即与微生物感染相关的抗原，通常是微生物抗原(例如细菌或病毒抗原)，或与癌症、通常是肿瘤相关的抗原，例如肿瘤抗原。
在优选的实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即肿瘤细胞的一部分，特别是那些主要出现在细胞内或作为肿瘤细胞表面抗原的抗原。在另一个实施方案中，抗原是病原体相关抗原，即源自病原体的抗原，例如源自病毒、细菌、单细胞生物或寄生虫的抗原，例如病毒抗原如病毒核糖核蛋白或衣壳蛋白。特别地，抗原应由MHC分子提呈，导致免疫系统细胞的调节,特别是免疫系统的细胞的激活，优选CD4+和CD8+淋巴细胞，特别是通过T细胞受体活性的调节。
术语“肿瘤抗原”是指癌细胞的组成成分，其可来源于细胞质、细胞表面或细胞核。具体而言，它是指细胞内产生的或作为肿瘤细胞表面抗原产生的那些抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎硫糖蛋白、α2-H-铁蛋白和γ-胎蛋白，以及各种病毒肿瘤抗原。根据本发明，肿瘤抗原优选包含肿瘤或癌症以及在类型和/或表达水平方面是肿瘤或癌症的特征性的任何抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原性质的任何病毒组分，即能够在个体中引起免疫应答的性质。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原性质的任何细菌组分，即能够在个体中引起免疫应答的性质。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或细胞质膜。
术语“表位”是指分子如抗原中的抗原决定簇，即被免疫系统识别的分子的一部分或片段，例如被抗体T细胞或B细胞识别，特别是在MHC分子的背景下提呈时。蛋白的表位优选包含所述蛋白的连续或不连续部分(portion)并且优选长度为约5个至约100个、优选约5个至约50个、更优选约8个至约0个、最优选约10个至约25个氨基酸，例如，表位长度可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。特别优选的是，本发明上下文中的表位是T细胞表位。
诸如“表位”、“抗原片段”、“免疫原性肽”和“抗原肽”等术语在本文中可互换使用，并且优选涉及抗原的不完整表示，其优选能够引发针对所述抗原或表达或包含并优选提呈所述抗原的细胞的免疫应答。优选地，所述术语涉及抗原的免疫原性部分(portion)。优选地，其是被T细胞受体识别(即特异性结合)的抗原的一部分(portion)，特别是如果在MHC分子的背景下提呈。某些优选的免疫原性部分(portion)与MHC I类或II类分子结合。术语“表位”是指免疫系统识别的分子例如抗原的一部分(part)或片段。例如，表位可以被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可以包括所述抗原的连续或不连续部分(portion)并且长度可以为约5至约100、例如约5至约50、更优选约8至约30、最优选约8至约25个氨基酸，例如所述表位的长度可优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。在一个实施方案中，表位的长度在约10至约25个氨基酸之间。术语“表位”包括T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的背景下提呈时被T细胞识别的蛋白的一部分(part)或片段。术语“主要组织相容性复合物”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原提呈细胞或患病细胞之间的信号传导很重要，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并将其提呈以供T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白在细胞表面表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为约8至约10个氨基酸，但更长或更短的肽也可以有效。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为约10至约25个氨基酸，特别是约13至约18个氨基酸，而更长和更短的肽也可以是有效的。
肽和蛋白抗原的长度可以是2至100个氨基酸，包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸，或50个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽可多于50个氨基酸。在一些实施方案中，所述肽可多于100个氨基酸。
所述肽或蛋白抗原可以是可以诱导或增加免疫系统产生针对所述肽或蛋白的抗体和T细胞应答的能力的任何肽或蛋白。
在一个实施方案中，疫苗抗原，即将其接种到受试者中诱导免疫应答的抗原，被免疫效应细胞识别。优选地，所述疫苗抗原如果被免疫效应细胞识别，则能够在适当的共刺激信号存在下诱导携带识别疫苗抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、引发和/或扩增。在本发明的实施方案的上下文中，所述疫苗抗原优选被提呈或存在于细胞表面，优选抗原提呈细胞。在一个实施方案中，抗原由患病细胞(例如肿瘤细胞或感染细胞)提呈。在一个实施方案中，抗原受体是TCR，其与在MHC背景下提呈的抗原的表位结合。在一个实施方案中，当由T细胞表达和/或提呈在T细胞上时，TCR与由细胞如抗原提呈细胞提呈的抗原的结合导致所述T细胞的刺激、引发和/或扩增。在一个实施方案中，当由T细胞表达和/或提呈在T细胞上时，TCR与患病细胞上提呈的抗原的结合导致所述患病细胞的细胞溶解和/或细胞凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶。
在一个实施方案中，抗原受体是结合抗原表位的抗体或B细胞受体。在一个实施方案中，抗体或B细胞受体结合抗原的天然表位。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面结合”是指诸如抗原的分子与细胞质膜结合及位于细胞质膜上，其中至少一部分分子面向所述细胞外空间，并且可以从所述细胞的外部接近，例如通过位于细胞外部的抗体。在这种情况下，所述一部分(part)优选为至少4个、优选至少8个、优选至少12个、更优选至少20个氨基酸。所述结合可以是直接的或间接的。例如，结合可以是通过一个或多个跨膜结构域、一个或多个脂锚定蛋白或通过与可以在细胞质膜的外叶上发现的任何其他蛋白、脂质、糖类或其他结构的相互作用的结合。例如，与细胞表面结合的分子可以是具有细胞外部分(portion)的跨膜蛋白，或者可以是通过与作为跨膜蛋白的另一蛋白相互作用而与细胞表面结合的蛋白。
“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的通常含义使用，因此包括易于与蛋白和其他分子结合的细胞外部。如果抗原位于所述细胞的表面并且易于被例如添加到细胞的抗原特异性抗体结合，则所述抗原在所述细胞表面上表达。
在本发明的上下文中，术语“胞外部分(portion)”或“胞外结构域”指的是诸如蛋白的分子的一部分，其面向细胞的胞外空间并且优选地可从所述细胞的外部接近，例如通过结合位于细胞外的分子例如抗体。优选地，所述术语是指一个或多个细胞外环或结构域或其片段。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和细胞毒性T细胞(CTL、CD8+T细胞)，后者包含溶细胞性T细胞。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及识别T细胞所靶向的抗原的T细胞，特别是当在MHC分子的情况下提呈于抗原提呈细胞或患病细胞如癌细胞的表面时，并优选发挥T细胞的效应子功能。如果T细胞杀死表达抗原的靶细胞，则认为T细胞对抗原具有特异性。可以使用任何多种标准技术来评估T细胞特异性，例如在铬释放测定或增殖测定中评估。或者，可以测量淋巴因子(如干扰素-γ)的合成。在本发明的某些实施方案中，所述RNA(特别是mRNA)编码至少一个表位。
术语“靶标”应指作为免疫应答如细胞免疫应答的靶标的物质如细胞或组织。靶标包括提呈抗原或抗原表位(即源自抗原的肽片段)的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是表达抗原并且优选I类MHC提呈所述抗原的细胞。
“抗原加工”是指抗原降解为作为所述抗原片段的加工产物(例如，蛋白降解为肽)以及一个或多个这些片段与MHC分子联合(例如通过结合)由细胞、优选抗原提呈细胞提呈给特异性的T细胞。
“抗原应答性CTL”是指应答抗原或源自所述抗原的肽的CD8+T细胞，其与I类MHC提呈在抗原提呈细胞的表面上。
根据本发明，CTL应答性可包括持续的钙离子流、细胞分裂、细胞因子如IFN-γ和TNF-α的产生、活化标记物如CD44和CD69的上调，以及表达肿瘤抗原的靶细胞的特异性细胞溶解性杀伤。CTL应答也可以使用精确指示CTL应答性的人工报道分子来确定。
术语“免疫应答”和“免疫反应”在本文中以其常规含义可互换使用，指针对抗原的综合机体应答，优选指细胞免疫应答、体液免疫应答或这二者。根据本发明，关于诸如抗原、细胞或组织等主体(agent)所用术语“免疫应答于”或“针对...免疫应答”涉及针对所述主体(agent)的免疫应答，例如细胞应答。免疫应答可以包含一种或多种选自以下的反应：针对一种或多种抗原抗体的产生及抗原特异性T-淋巴细胞的扩增，优选CD4+和CD8+T淋巴细胞，更优选CD8+T淋巴细胞，这可以在体外各种增殖或细胞因子产生的测试中检测。
在本发明的上下文中，术语“诱导免疫应答”和“引发免疫应答”和类似术语是指免疫应答的诱导，优选细胞免疫应答、体液免疫应答或二者的诱导。免疫应答可以是保护性/防护性(preventive)/预防性(prophylactic)和/或治疗性的。免疫应答可以针对任何免疫原或抗原或抗原肽，优选针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如病毒抗原(例如流感病毒(A、B或C)，CMV或RSV))。本文中的“诱导”可以意味着在诱导前没有针对特定抗原或病原体的免疫应答，但也可以意味着在诱导前对特定抗原或病原体有一定程度的免疫应答，并且在诱导后所述免疫应答增强。因此，本文中的“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。优选地，在个体中诱导免疫应答后，所述个体被保护免于发生疾病如感染性疾病或癌性疾病或者通过诱导免疫应答改善疾病状况。
术语“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“细胞介导的免疫”或类似术语意在包括针对细胞的细胞应答，其特征在于抗原的表达和/或I类或Ⅱ类MHC的抗原提呈。细胞应答涉及称为T细胞或T淋巴细胞的细胞，它们充当“辅助细胞”或“杀伤细胞”。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答发挥核心作用，而杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或CTL)会杀死如病变细胞等细胞。
术语“体液免疫应答”是指在活生物体中应答主体和生物体产生抗体的过程，所述抗体最终中和和/或消除这些物质和生物体。抗体应答的特异性由T细胞和/或B细胞通过结合单一特异性抗原的膜相关受体介导。在结合适当的抗原并接收到各种其他激活信号后，B淋巴细胞分裂，产生记忆B细胞以及分泌抗体的浆细胞克隆，每种细胞均产生识别与其抗原受体所识别的相同抗原表位的抗体。记忆B淋巴细胞保持休眠状态，直到其随后被其特异性抗原激活。当重新暴露于特异性抗原时，这些淋巴细胞提供记忆的细胞基础并导致抗体应答的升级。
如本文所用，术语“抗体”是指能够特异性结合抗原上的表位的免疫球蛋白分子。特别地，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体和任何前述抗体的组合。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。可变区和恒定区在本文中也分别称为可变结构域和恒定结构域。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其中散布着称为框架区(FR)的更保守区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。VH的CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL的CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)，其中CH可进一步细分为恒定结构域CH1、铰链区和恒定结构域CH2和CH3(以如下顺序从氨基末端排列至羧基末端：CH1，CH2，CH3)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。抗体可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白，优选涉及抗原受体例如抗体或B细胞受体(BCR)。免疫球蛋白的特征在于具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构域，即免疫球蛋白结构域。所述术语包括膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，它们通常是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白通常称为抗体。免疫球蛋白一般包含几条链，通常是两条相同的重链和两条相同的轻链，它们通过二硫键连接。这些链主要由免疫球蛋白结构域组成，例如VL(可变轻链)结构域、CL(恒定轻链)结构域、VH(可变重链)结构域和CH(恒定重链)结构域CH1、CH2、CH3和CH4。哺乳动物免疫球蛋白重链有五种类型，即α、δ、ε、γ和μ，它们代表不同类别的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在其羧基末端包含跨膜结构域和短胞质结构域。在哺乳动物中有两种类型的轻链，即lambda和kappa。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型中基本上是保守的，其中可变部分高度多样化并负责抗原识别。
术语“疫苗接种”和“免疫接种”描述了出于治疗或预防原因对个体进行治疗的过程，涉及将一种或多种免疫原或抗原或其衍生物、特别是如本文所述以编码其的RNA(尤其是mRNA)的形式给药个体并刺激针对所述一种或多种免疫原或抗原或特征在于提呈所述一种或多种免疫原或抗原的细胞的免疫应答。
“特征在于抗原提呈的细胞”或“提呈抗原的细胞”或“在抗原提呈细胞表面提呈抗原的MHC分子”或类似表述是指诸如患病细胞的细胞，特别是肿瘤细胞或受感染的细胞，或在MHC分子的情况下直接或在加工后提呈抗原或抗原肽的抗原提呈细胞，优选I类MHC和/或II类MHC分子，最优选I类MHC分子。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及一种过程，其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA(尤其是mRNA)。随后，RNA(尤其是mRNA)可被翻译成肽或蛋白。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及在细胞核糖体中的过程，通过所述过程mRNA链指导氨基酸序列的组装以产生肽或蛋白。
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件、情况或条件可能会或可能不会发生，并且所述描述包括其中所述事件、情况或条件发生和不发生的情况。
本文所述特定化合物的前药是在给药个体后在生理条件下发生化学转化以提供所述特定化合物的那些化合物。此外，前药可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转化为所述特定化合物。例如，当例如与合适的酶或化学试剂一起放置在透皮贴剂储库(transdermal patch reservoir)中时，前药可以缓慢地转化为特定化合物。示例的前药是可在体内水解的酯类(使用特定化合物中包含的醇或羧基)或酰胺(使用特定化合物中包含的氨基或羧基)。具体地，包含在特定化合物中并且具有至少一个氢原子的任何氨基均可以被转化成前药形式。典型的N-前药形式包括氨基甲酸酯、曼尼希碱(Mannich base)、烯胺和烯胺酮。
“异构体”是具有相同分子式但结构不同(“结构异构体”)或官能团和/或原子的几何(空间)定位不同(“立体异构体”)的化合物。“对映异构体”是一对彼此不可重叠镜像的立体异构体。外消旋混合物”或“外消旋物”含有一对等量的对映异构体，并用前缀(±)表示。“非对映异构体”是不可重叠且不是彼此镜像的立体异构体。“互变异构体”是相同化学物质的结构异构体，即使是纯的，但由于各个原子或原子群的迁移，也会自发地和可逆地相互转化；即互变异构体彼此处于动态化学平衡。互变异构体的一个实例是酮-烯醇-互变异构现象的异构体。“构象异构体(Conformers)”是立体异构体，仅通过形式单键的旋转即可相互转化，尤其包括那些导致不同3维形式的(杂)环的立体异构体，例如环己烷的椅式、半椅式、船式和扭船式。
术语“平均直径”是指通过动态光散射(DLS)测量的颗粒的平均流体动力学直径，使用所谓的累积量算法进行数据分析，其结果提供具有长度维度的所谓的Z平均，以及无量纲的多分散性指数(PDI)(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,pp 4814-4820,ISO 13321)。此处颗粒的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与这个Z平均同义使用。
“多分散性指数”优选基于动态光散射测量通过所谓的“平均直径”的定义中提到的累积量分析来计算。在某些先决条件下，它可以作为纳米粒子集合的尺寸分布的量度。
颗粒绕旋转轴的“回转半径”(此处缩写为Rg)是一个点距旋转轴的径向距离，如果假设颗粒的整个质量都集中在所述点，则其绕给定轴的转动惯量与其实际质量分布相同。在数学上，Rg是粒子分量与其质心或给定轴的均方根距离。例如，对于由n个质量元素组成的大分子，质量mi(i＝1、2、3、...、n)，距离质心的固定距离为si，Rg是所有质量元素的质量平均值si 2的平方根，可以如下计算：
回转半径可以通过实验确定或计算，例如通过使用光散射法确定。特别地，对于小散射矢量结构函数S定义如下：
其中N是组分的数目(Guinier’s定律)。
“D10值”，特别是关于颗粒的定量尺寸分布，是10％的颗粒具有小于所述值的直径时的直径。D10值是描述一群颗粒中最小颗粒的比例的一种方式(例如获得自场流分离的颗粒峰内)。
“D50值”，特别是关于颗粒的定量尺寸分布，是50％的颗粒具有小于所述值的直径时的直径。D50值是描述一群颗粒平均颗粒尺寸的一种方式(例如获得自场流分离颗粒峰内)。
“D90值”，特别是关于颗粒的定量尺寸分布，是90％的颗粒具有小于所述值的直径时的直径。“D95”、“D99”、“D100”的值具有相应的含义。D90、D95、D99和D100值用于描述较大颗粒在颗粒群中的比例(例如获得自场流分离的颗粒峰内)。
颗粒的“流体力学半径”(有时称为“斯托克斯(Stokes)半径”或“斯托克斯-爱因斯坦(Stokes-Einstein)半径”)是以与所述颗粒相同的速率扩散的假想硬球体的半径。流体力学半径与颗粒的移动性有关，不仅要考虑尺寸，还要考虑溶剂效应。例如，具有较强水合作用的较小带电颗粒可能比具有较弱水合作用的较大带电颗粒具有更大的流体力学半径。这是因为较小的颗粒在运动穿过溶液时会拖曳更多的水分子。由于溶剂中颗粒的实际尺寸无法直接测量，流体力学半径可由Stokes-Einstein方程定义：
其中kB是玻尔兹曼常数；T是温度；η是溶剂粘度；D是扩散系数。扩散系数可以通过实验来确定，例如通过使用动态光散射(DLS)。因此一种确定颗粒或颗粒群的流体力学半径(例如本文公开的制剂或组合物中所含的如LNP的颗粒的流体力学半径，或者通过使这种制剂或组合物经历场流分馏而获得的颗粒峰的流体力学半径)的程序是测量所述颗粒或颗粒群的DLS信号(例如本文公开的制剂或组合物中所含的如LNP的颗粒的DLS信号，或者通过使这样的制剂或组成经历场流分馏而获得的颗粒峰的DLS信号)。
本文中使用的术语“聚集体”涉及颗粒簇，其中各颗粒是相同或非常相似的，并且以非共价方式(例如，通过离子相互作用、H桥相互作用、偶极相互作用和/或范德华相互作用)彼此粘附。
本文使用的表述“光散射”是指由于光穿过的介质中的局部不均匀性，光被迫偏离直线轨迹至一条或多条路径的物理过程。
术语“UV”是指紫外，指波长为10nm至400nm的电磁光谱波段，即比可见光的波段短，但比X射线的波段长。
本文使用的表述“多角度光散射”或“MALS”涉及一种用于测量由样品散射成多角度的光的技术。在这方面，“多角度”是指散射光可以以不同的离散角度进行检测，例如，通过在包括选定的特定角度在内的范围内移动的单个探测器或固定在多个特定角度位置的探测器阵列测量。在一个优选实施方案中，在MALS中使用的光源是激光源(MALLS：多角度激光散射)。基于包含颗粒的组合物的MALS信号，并通过使用适当的形式(例如Zimm图、Berry图或Debye图)，可以确定回转半径(Rg)，从而确定所述颗粒的尺寸。优选地，Zimm图是使用以下方程的图形表示：
其中c是颗粒在溶剂中的质量浓度(g/mL)；A2是第二维里系数(mol·mL/g2)；P(θ)是与散射光强度对角度的依赖性有关的形状因子；Rθ是过量瑞利比(Rayleigh ratio)(cm-1)；K*是等于4π2ηo(dn/dc)2λ0 -4NA -1的光学常数，其中ηo是溶剂在入射辐射(真空)波长下的折射率，λ0是入射辐射(真空)波长(nm)，NA是阿伏伽德罗数(mol-1)，dn/dc是微分折射率增量(mL/g)(参见，例如Buchholz et al.(Electrophoresis 22(2001),4118-4128)；B.H.Zimm(J.Chem.Phys.13(1945),141；P.Debye(J.Appl.Phys.15(1944):338；andW.Burchard(Anal.Chem.75(2003),4279-4291)。优选地，Berry图由以下项计算：
其中c、Rθ和K*如以上定义。优选地，Debye图由以下项计算：
其中c、Rθ和K*如以上定义。
本文中使用的表述“动态光散射”或“DLS”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布图的技术，特别是针对颗粒的流体力学半径。单色光源、通常是激光通过偏振器射入样品。然后散射的光穿过第二个偏振器，在此被检测到，得到的图像投影到屏幕上。溶液中的颗粒被光击中，并将光衍射到各个方向。来自颗粒的衍射光可以相长干涉(亮区域)，也可以相消干涉(暗区域)。所述过程以短时间间隔重复，并且通过比较每个点随时间的光强度的自相关器来分析所得到的散斑图案集。
本文中使用的表述“静态光散射”或“SLS”是指确定颗粒的尺寸和尺寸分布曲线的技术，特别是针对颗粒的回转半径和/或颗粒的摩尔质量。在含有颗粒的溶液中发射高强度单色光、通常是激光。一个或多个检测器用于测量一个或多个角度的散射强度。需要角度依赖性来获得所有半径大分子的摩尔质量和尺寸的精确测量。因此，在相对于入射光方向的多个角度上同时测量，称为多角度光散射(MALS)或多角度激光散射(MALLS)，通常视为静态光散射的标准实施方式。
术语“核酸”包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、其组合及其修饰形式。所述术语包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生和化学合成的分子。核酸可以以单链或双链和线性或共价环状闭合分子的形式存在。核酸可以分离。根据本发明，术语“分离的核酸”是指核酸(i)是在体外扩增，例如对于DNA是通过聚合酶链反应(PCR)或者对于RNA是体外转录(使用例如RNA聚合酶)，(ii)是通过克隆重组产生，(iii)是例如通过裂解和凝胶电泳分离而纯化，或(iv)是例如通过化学合成而合成。
术语“核苷”(本文缩写为“N”)涉及可以认为是没有磷酸基团的核苷酸的化合物。虽然核苷是连接到糖(例如核糖或脱氧核糖)的核碱基，但核苷酸是由核苷和一个或多个磷酸基团组成。核苷的实例包括胞苷、尿苷、假尿苷、腺苷和鸟苷。
通常构成天然存在的核酸的五种标准核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鸟苷。这五个核苷通常分别缩写为它们的单字母代码U、A、T、C和G。然而，胸苷更常见地写成“dT”(“d”代表“脱氧”)，因为它含有2'-脱氧呋喃核糖部分，而不是尿苷中的呋喃核糖环。这是因为胸苷存在于脱氧核糖核酸(DNA)中，而不是核糖核酸(RNA)中。相反，尿苷存在于RNA而非DNA中。剩下的三种核苷可以存在于RNA和DNA中两者中。在RNA中，它们将表示为A、C和G，而在DNA中，它们表示为dA、dC和dG。
修饰的嘌呤(A或G)或嘧啶(C、T或U)碱基部分优选被一个或多个烷基、更优选一个或多个C1-4烷基、更优选一种或多个甲基修饰。修饰的嘌呤或嘧啶碱基部分的具体实例包括N7-烷基鸟嘌呤、N6-烷基腺嘌呤、5-烷基胞嘧啶、5-烷基尿嘧啶和N(1)-烷基尿嘧啶，例如N7-C1-4烷基鸟嘌呤，N6-C1-4烷基腺嘌呤、5-C1-4烷基胞嘧啶，5-C1-4烷基尿嘧啶，以及N(1)-C1-4烷基尿嘧啶，优选N7-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N(1)-甲基尿嘧啶。
本文中，术语“DNA”涉及包括脱氧核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选实施方案中，DNA包含全部或大部分脱氧核糖核苷酸残基。如本文所用，“脱氧核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位置缺乏羟基的核苷酸。DNA包括但不限于双链DNA、单链DNA、分离的DNA如部分纯化的DNA、基本上纯的DNA、合成的DNA、重组产生的DNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的DNA的修饰的DNA。这种改变可以指将非核苷酸物质添加到内部DNA核苷酸或添加到DNA末端。本文还预期DNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或核糖核苷酸。对于本发明，这些改变的DNA被认为是天然存在的DNA的类似物。如果分子中脱氧核糖核苷酸残基的含量基于分子中核苷酸残基总数超过50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子包含“大部分脱氧核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基总数是所有核苷酸残基之和(无论核苷酸残基是标准的(即天然存在的)核苷酸残基还是其类似物)。
DNA可以是重组DNA，并且可以通过克隆核酸、特别是cDNA来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
RNA
根据本发明，术语“RNA”是指包括核糖核苷酸残基的核酸分子。在优选的实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。如本文所用，“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2'-位置具有羟基的核苷酸。RNA包括但不限于双链RNA、单链RNA、分离的RNA如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的修饰的RNA。这种改变可以指将非核苷酸物质添加到内部RNA核苷酸或添加到RNA末端。本文还预期RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本发明，这些改变/修饰的核苷酸可以称为天然存在的核苷酸的类似物，并且含有这种改变的/修饰的核苷酸的相应RNA(即，改变的/修饰的RNA)可以称为天然存在的RNA的类似物。如果分子中核糖核苷酸残基的含量基于分子中核苷酸残基总数超过50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子包含“大部分核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基总数是所有核苷酸残基之和(无论核苷酸残基是标准的(即天然存在的)核苷酸残基还是其类似物)。
“RNA”包括mRNA、tRNA、核糖体RNA(rRNA)、小核RNA(snRNA)、自扩增RNA(saRNA)、单链RNA(ssRNA)、dsRNA、抑制性RNA(如反义ssRNA、小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA))、激活RNA(如小激活RNA)和免疫刺激性RNA(isRNA)。
在优选的实施方案中，RNA包括编码肽或蛋白的开放阅读框(ORF)。
本文使用的术语“体外转录”或“IVT”是指转录(即RNA的产生)以无细胞的方式进行。即，IVT不使用活的/培养的细胞，而是使用从细胞中提取的转录机制(例如，细胞裂解物或其分离的组分，包括RNA聚合酶(优选T7、T3或SP6聚合酶))。
根据本发明，术语“mRNA”意指“信使RNA”，并涉及可通过使用DNA模板产生并可编码肽或蛋白的“转录物”。通常，mRNA包含5'-UTR、肽/蛋白编码区和3'-UTR。在本发明的上下文中，mRNA优选通过体外转录(IVT)从DNA模板产生。如上所述，体外转录方法是本领域技术人员已知的，并且多种体外转录试剂盒可商购。
mRNA是单链的，但可以含有自身互补序列，使mRNA的部分(part)折叠并与自身配对形成双螺旋。
根据本发明，“dsRNA”是指双链RNA，是具有两条部分或完全互补链的RNA。
在本发明的优选实施方案中，mRNA涉及编码肽或蛋白的RNA转录物。
在一个实施方案中，优选编码肽或蛋白的RNA具有至少45个核苷酸的长度(如至少60个、至少90个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少600个、至少700个、至少800个、至少900个、至少1000个、至少1500个、至少2000个、至少2500个、至少3000个、至少3500个、至少4000个、至少4500个、至少5000个、至少6000个、至少7000个、至少8000个、至少9000个核苷酸)，优选多达15000个、如多达14000个、多达13000个、多达12000个核苷酸、多达11000个核苷酸或多达10000个核苷酸。
在一个实施方案中，RNA(例如mRNA)包含5'非翻译区(5'-UTR)、肽编码区和3'非翻译区(3'-UTR)。在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)通过体外转录或化学合成产生。在一个实施方案中，RNA(例如mRNA)通过使用DNA模板的体外转录产生。体外转录方法是本领域技术人员已知的；参见例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,J.Sambrook et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor1989。此外，多种体外转录试剂盒是可商购的，例如来自Thermo Fisher Scientific(如TranscriptAidTM T7试剂盒，T7试剂盒，/>)，New EnglandBioLabs Inc.(如HiScribeTM T7试剂盒，HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒)，Promega(如RiboMAXTM，/>systems)，Jena Bioscience(如SP6或T7转录试剂盒)，和Epicentre(如AmpliScribeTM)。为了提供修饰的RNA(如mRNA)，可以在合成过程(优选体外转录)中掺入相应的修饰的核苷酸，如修饰的天然存在的核苷酸、非天然存在的核酸和/或修饰的非天然存在的核苷酸，或者可以在转录后在mRNA中进行修饰和/或将修饰添加到mRNA中。
在一个实施方案中，RNA(例如mRNA)是体外转录的RNA(IVT-RNA)，并且可以通过合适的DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6 RNA聚合酶。优选地，体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸、特别是cDNA，并将其引入合适的载体中用于体外转录来获得。cDNA可以通过RNA的逆转录获得。
在本发明的一些实施方案中，RNA(如mRNA)是“复制子RNA”(如“复制子mRNA”)或简单的“复制子”，特别是“自复制RNA”(例如“自复制mRNA”)或者“自扩增RNA”(或“自扩增mRNA”)。在一个特别优选的实施方案中，复制子或自复制RNA(如自复制mRNA)衍生自或包含衍生自ssRNA病毒、特别是正链ssRNA病毒如甲病毒的元件。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在受感染细胞的细胞质中复制(甲病毒生命周期的综述参见Joséet al.,FutureMicrobiol.,2009,vol.4,pp.837–856)。许多甲病毒的总基因组长度通常在11,000至12,000个核苷酸之间，基因组RNA通常具有5’-帽和3’-poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常具有两个开放阅读框(ORF)。四种非结构蛋白(nsP1-nsP4)通常由基因组5’端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由位于第一个ORF下游并延伸到基因组3’端附近的第二ORF一起编码。通常，第一ORF比第二ORF大，比例大约为2:1。在被甲病毒感染的细胞中，只有编码非结构蛋白的核酸序列是从基因组RNA中翻译的，而编码结构蛋白的遗传信息可以从亚基因组转录物中翻译，亚基因组转录是一种类似于真核信使RNA的RNA分子(mRNA；Gould et al.,2010,Antiviral Res.,vol.87pp.111–124)。感染后，即在病毒生命周期的早期阶段，(+)链基因组RNA直接类似信使RNA起作用，翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已经建议将外来遗传信息递送到靶细胞或靶生物体中的甲病毒衍生载体。在简单的方法中，编码相关的蛋白的开放阅读框置换编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框。基于甲病毒的反式复制系统依赖于两个独立核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此被称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中同时存在这两种核酸分子。能够被反式复制酶复制的核酸分子必须包含一些甲病毒序列元件，以允许甲病毒复制酶识别和合成RNA。
在本发明的一个实施方案中，RNA(如mRNA)包含一种或多种修饰，例如，以提高其稳定性和/或提高翻译效率和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，为了增加RNA(如mRNA)的表达，可以在编码区即编码所表达的肽或蛋白的序列内对其进行修饰，优选不改变所表达的肽或蛋白的序列。例如，在WO 2007/036366和PCT/EP2019/056502中描述了这样的修饰，并且包括以下各项：5’-帽结构；天然存在的poly(A)尾区的延伸或截短；5’-和/或3’-非翻译区(UTR)的改变，例如引入与所述RNA的编码区无关的UTR；用合成核苷酸置换一种或多种天然存在的核苷酸；以及密码子优化(例如，改变，优选增加RNA的GC含量)。在根据本发明的修饰的mRNA的上下文中，术语“修饰”优选涉及不天然存在于所述RNA(例如mRNA)中的mRNA的任何修饰。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)包括5’-帽结构。在一个实施方案中，mRNA不具有无加帽的5’-三磷酸。在一个实施方案中，RNA(例如mRNA)可以包括常规的5’-帽和/或5’-帽类似物。术语“常规5’-帽”是指在mRNA分子5’-端发现的帽结构，通常由5’-三磷酸鸟苷(Gppp)组成，通过其三磷酸部分连接到mRNA下一个核苷酸的5’-端(即，鸟苷通过5’至5’三磷酸连接到所述mRNA的其余部分)。鸟苷可以在位置N7甲基化(产生帽结构m7Gppp)。术语“5’-帽类似物”是指基于常规5’-帽的5’-帽，但在m7鸟苷结构的2’-或3’-位置修饰，以避免5’-帽类似物以反向整合(这种5’-帽类似物也称为抗反向帽类似物(ARCA))。特别优选的5’-帽类似物是在磷酸桥中的桥接和非桥接氧具有一个或多个取代的那些，例如在β-磷酸的硫代磷酸酯修饰的5’-帽类似物(例如m2 7,2’OG(5’)ppSp(5’)G(称为beta-S-ARCA或β-S-ARCA))，如PCT/EP2019/056502中所述。提供如本文所述的具有5’-帽结构的RNA(如mRNA)可以通过DNA模板在相应的5’-帽化合物存在下的体外转录来实现，其中所述5’-帽结构共转录并入产生的RNA(例如mRNA)链中，或者RNA(例如mRNA)可以例如通过体外转录产生，并且5’-帽结构可以通过使用加帽酶例如痘苗病毒加帽酶在转录后连接到所述mRNA。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)包含5’-帽结构，其选自m2 7,2’OG(5’)ppSp(5’)G(特别是其D1非对映异构体)、m2 7,3’OG(5’)ppp(5’)G、和m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG。
在一些实施方案中，RNA(例如mRNA)包含cap0、cap1或cap2，优选cap1或cap2。根据本发明，术语“cap0”是指结构“m7GpppN”，其中N是在2’位置带有OH部分的任何核苷。根据本发明，术语“cap1”是指结构“m7GpppNm”，其中Nm是在2’位置带有OCH3部分的任何核苷。根据本发明，术语“cap2”是指结构“m7GpppNmNm”，其中每个Nm独立地是在2’位置具有OCH3部分的任何核苷。
beta-S-ARCA(β-S-ARCA)的D1非对映异构体具有以下结构：
“beta-S-ARCA的D1非对映异构体”或“beta-S-ARCA(D1)”是与beta-S-ARCA的D2非对映体(beta-S-ARCA(D2))相比首先在HPLC柱上洗脱的beta-S-ARCA的非对映异构体，因此表现出较短的保留时间。所述HPLC优选地是分析型HPLC。在一个实施方案中，SupelcosilLC-18-T RP柱用于分离，优选格式为5μm、4.6×250mm，由此可以应用1.3ml/min的流速。在一个实施方案中，使用在乙酸铵中的甲醇梯度，例如在15分钟内甲醇在0.05M乙酸铵中0-25％的线性梯度，pH＝5.9。UV检测(VWD)可以在260nm下进行，荧光检测(FLD)可以用280nm激发和337nm检测进行。
作为cap1的构建块的5’帽类似物m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG(也称作m2 7,3’OG(5’)ppp(5’)m2’-OApG)具有以下结构：
示例的包含β-S-ARCA和mRNA的cap0 mRNA具有以下结构：
示例的包含m2 7,3’OG(5’)ppp(5’)G和mRNA的cap0 mRNA具有以下结构：
示例的包含m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG和mRNA的cap1 mRNA具有以下结构：
如本文所用，术语“poly-A尾”或“poly-A序列”指通常位于RNA(如mRNA)分子的3'-端的腺苷酸残基的不间断或间断的序列。Poly-A尾或poly-A序列是本领域技术人员已知的，并且可以在本文所述RNA中3’-UTR之后。不间断的poly-A尾的特征是连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly-A尾是典型的。本文公开的RNA(例如mRNA)可以具有在转录后通过模板非依赖性RNA聚合酶连接到RNA的游离3’端的poly-A尾，或者由DNA编码并通过模板依赖性RNA聚酶转录的poly-A尾。
已经证明，约120A核苷酸的poly-A尾对转染的真核细胞中的mRNA水平以及对从poly-A尾上游(5’)存在的开放阅读框翻译的蛋白水平具有有益影响(Holtkamp et al.,2006,Blood,vol.108,pp.4009-4017)。
所述poly-A尾可以是任何长度。在一些实施方案中，poly-A尾包含、基本上由或由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个和多达500个、多达400个、多达300个、多达200个或多达150个A核苷酸组成，特别是约120个A核苷酸。在本文中，“基本上由…组成”是指poly-A尾中的大多数核苷酸、通常是poly-A尾的核苷酸的数量的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但允许剩余的核苷酸是除A核苷酸以外的核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在这种情况下，“由…组成”是指poly-A尾中的所有核苷酸、即poly-A尾中100％数量的核苷酸是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中，poly-A尾在RNA转录期间、例如在制备体外转录的RNA期间，基于在与编码链互补的链中包含重复dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板而连接。编码poly-A尾的DNA序列(编码链)称为poly(A)盒。
在一些实施方案中，存在于DNA编码链中的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被四个核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50个、10至30个或10至20个核苷酸。这样的盒在WO 2016/00524A1中公开，所述专利通过援引加入本文。WO 2016/00524A1中公开的任何poly(A)盒都可以用于本发明。基本上由dA核苷酸组成、但被四个核苷酸(dA、dC、dG、dT)相等分布且长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的poly(A)盒示出在DNA水平上质粒DNA在大肠杆菌中的持续繁殖，并且在RNA水平上还与关于涵盖支持RNA稳定性和翻译效率的有益性质相关。因此，在一些实施方案中，本文所述的mRNA分子中含有的poly-A尾基本由A核苷酸组成，但被四个核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这种随机序列的长度可以是5至50个、10至30个或10至20个核苷酸。
在一些实施方案中，除了A核苷酸之外，没有其他核苷酸在poly-A尾的3’端侧翼，即poly-A尾在其3’端没有被除A之外的核苷酸掩蔽或跟随。
在一个实施方案中，poly-A序列包含至少100个核苷酸。在一个实施方案中，poly-A序列包含或由SEQ ID NO:14的核苷酸序列组成。在一个实施方案中，poly-A序列与SEQ IDNO:14的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明中使用的RNA(例如mRNA)包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“未翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中被转录但未翻译成氨基酸序列的区域，或RNA分子(如mRNA分子)中的相应区域。未翻译区(UTR)可以存在于开放阅读框(5’-UTR)的5’(上游)和/或开放阅读框(3’-UTR)的3’(下游)。5’-UTR(如果存在)位于蛋白编码区起始密码子上游的5’-端。5’-UTR位于5’-帽(如果存在)的下游，例如直接与5’-帽相邻。3’-UTR(如果存在)位于蛋白编码区终止密码子下游的3’-端，但术语“3’-UTR”优选不包括poly-A序列。因此，3’-UTR位于poly-A序列(如果存在)的上游，例如直接与poly-A序列相邻。将3’-UTR掺入RNA(优选mRNA)分子的3’-非翻译区可以提高翻译效率。通过结合两个或多个这样的3’-UTR可以实现协同效应(其优选地以从头至尾的方向排列；见例如，Holtkamp et al.,Blood 108,4009-4017(2006))。3’-UTR对于其引入的RNA(优选mRNA)是自体或异源的。在一个特定的实施方案中，3’-UTR源自珠蛋白基因或mRNA，例如α2珠蛋白、α1珠蛋白或β珠蛋白、优选β珠蛋白、更优选人β珠蛋白的基因或mRNA。例如，所述RNA(优选mRNA)可以通过用或插入一个或多个、优选两个拷贝的3’-UTR(源自珠蛋白基因，如α2珠蛋白、α1珠蛋白、β珠蛋白，优选β珠蛋白，更优选人β珠蛋白)置换现有的3’-UTR而修饰。
在一些实施方案中，本发明中使用的RNA(如mRNA)包含5’UTR，所述5’UTR包含SEQID NO:12的核苷酸序列，或与SEQ ID No:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明中使用的RNA(如mRNA)包含3’UTR，所述3’UTR包含SEQID NO:13的核苷酸序列，或与SEQ ID No:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
所述RNA(如mRNA)可具有修饰的核糖核苷酸，以增加其稳定性和/或降低免疫原性和/或减少细胞毒性。例如，在一个实施方案中，本文所述的RNA(如mRNA)中的尿苷被修饰的核苷置换(部分或完全置换，优选完全置换)。在一些实施方案中，所述修饰的核苷是修饰的尿苷。
在一些实施方案中，置换尿苷的修饰的尿苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-尿苷(m5U)及其组合。
在一些实施方案中，置换(部分或全部、优选全部)RNA(如mRNA)中的尿苷的修饰核苷可以是以下任一种或多种：3-甲基尿苷(m3U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代尿苷(s2U)、4-硫代尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基尿苷、5-卤代尿苷(例如，5-碘代尿苷或者5-溴代尿苷)、尿苷-5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷-5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基尿苷(cm5U)、1-羧甲基假尿苷、5-羧基羟甲基尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代假尿苷)、5-甲基-2-硫代尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷(m5D)、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷、N1-甲基假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷(inm5s2U)、α-硫代尿苷、2’-O-甲基尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基尿苷(m5Um)、2’-O-甲基假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基尿苷(inm5Um)、1-硫代尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖尿苷(2′-F-ara-uridine)、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖尿苷(2′-OH-ara-uridine)、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷或者本领域已知的任何其他修饰的尿苷。
假尿苷(部分或完全、优选完全置换尿苷)修饰的RNA(优选mRNA)在本文中称为“Ψ修饰的”，而术语“m1Ψ修饰的”是指RNA(优选mRNA)含有N(1)-甲基假尿苷(部分或全部、优选完全置换尿苷)。此外，术语“m5U修饰”是指RNA(优选mRNA)含有5-甲基尿苷(部分或完全、优选完全置换尿苷)。与未修饰的形式相比，这种Ψ或m1Ψ或m5U修饰的RNA通常表现出降低的免疫原性，因此在避免或最小化免疫应答诱导的应用中是优选的。
本发明中使用的RNA(优选mRNA)的密码子可以进一步优化，例如以增加RNA的GC含量和/或置换在所述细胞(或受试者)中罕见的密码子，在所述细胞(或受试者)中，相关的肽或蛋白由在所述细胞(或受试者)中是同义频繁密码子的密码子表达。在一些实施方案中，由本发明中使用的RNA编码的氨基酸序列由密码子优化的和/或其G/C含量与野生型编码序列相比增加的编码序列编码。这还包括这样的实施方案，其中编码序列的一个或多个序列区域与野生型编码序列的相应序列区域相比是密码子优化的和/或G/C含量增加的。在一个实施方案中，密码子优化和/或G/C含量增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
术语“密码子优化”是指改变核酸分子编码区中的密码子以反映宿主生物的典型密码子使用，而优选不改变所述核酸分子编码的氨基酸序列。在本发明的上下文中，编码区优选是密码子优化的，以用于使用本文所述的RNA(优选mRNA)在待治疗的受试者中的最佳表达。密码子优化是基于发现翻译效率也由细胞中tRNA出现的不同频率决定。因此，可以对RNA序列(优选mRNA)进行修饰，从而插入可获得频繁出现的tRNA的密码子来代替“罕见密码子”。
在一些实施方案中，本文所述的RNA(优选mRNA)的编码区的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量与野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比增加，其中由所述RNA(优选mRNA)编码的氨基酸序列与由野生型RNA编码的氨基酸序列相比优选不被修饰。RNA序列的这种修饰是基于这样一个事实，即待翻译的任何RNA区域的序列对于所述RNA(优选mRNA)的有效翻译是重要的。G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量增加的序列比A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量增加的序列更稳定。关于一些密码子编码同一个氨基酸的事实(所谓的遗传密码的简并)，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子用途)。与野生型序列相比，根据由所述RNA(优选mRNA)编码的氨基酸，存在多种修饰RNA序列的可能性。特别地，含有A和/或U核苷酸的密码子可以通过用其他密码子取代这些密码子而修饰，所述其他密码子编码相同氨基酸但不含有A和/或U或含有较低含量的A和/或U核苷酸。
在各种实施方案中，与野生型RNA编码区的G/C含量相比，本文所述的mRNA编码区的G/C含量增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。
上述修饰的组合，即引入5’-帽结构、引入poly-A序列，poly-A序列的解掩蔽、改变5’-和/或3’-UTR(例如引入一个或多个3’-UTR)、用合成核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷置换胞苷和/或用假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)置换尿苷)，以及密码子优化，对RNA(优选mRNA)的稳定性和翻译效率的提高具有协同作用。因此，在一个优选的实施方案中，本发明中使用的RNA(优选mRNA)、特别是本发明的编码诱导免疫应答的抗原或表位的RNA(优选mRNA)，含有至少两种、至少三种、至少四种或全部五种上述修饰的组合，即(i)引入5’-帽结构，(ii)引入poly-A序列、poly-A序列的解掩蔽；(iii)改变5’-和/或3’-UTR(例如引入一个或多个3’-UTR)；(iv)用合成核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷置换胞苷和/或用假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)置换尿苷)；和(v)密码子优化。在一个实施方案中，RNA包含cap1或cap2，优选cap1结构。在一个实施方案中，poly-A序列包含至少100个核苷酸。在一个实施方案中，poly-A序列包含或由SEQ ID NO:14的核苷酸序列组成。在一个实施方案中，5’UTR包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一个实施方案中，3’UTR包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。
本发明的一些方面涉及将本文公开的RNA(优选mRNA)靶向递送到某些细胞或组织。在一个实施方案中，本发明涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。如果给药的RNA(优选mRNA)是编码诱导免疫应答的抗原或表位的RNA(优选mRNA)，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原提呈细胞，例如脾中的专职性抗原提呈细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突状细胞。“淋巴系统”是循环系统的一部分，也是免疫系统的重要组成部分，包括携带淋巴的淋巴管道网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管道网络和循环淋巴组成。初级或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞中产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成了初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官，包括淋巴结和脾，维持成熟的幼稚淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
基于脂质的RNA(如mRNA)递送系统对肝脏具有固有的偏好。肝脏堆积是由肝脏血管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。在一个实施方案中，靶器官是肝脏，靶组织是肝组织。特别地，如果希望在所述器官或组织中存在mRNA或编码的肽或蛋白和/或如果希望表达大量编码的肽或者蛋白和/或者如果希望或需要系统存在编码的肽和蛋白、特别是大量的编码的肽或者蛋白，则优选递送到这样的靶组织。
在一个实施方案中，在给药本文所述的RNA LNP组合物后，将至少一部分RNA递送至靶细胞或靶器官。在一个实施方案中，将至少一部分RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，所述RNA是编码肽或蛋白的RNA(优选mRNA)，并且所述RNA被靶细胞翻译以产生所述肽或蛋白。在一个实施方案中，靶细胞是肝脏中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肌细胞。在一个实施方案中，靶细胞是内皮细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是淋巴结中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是肺中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是血细胞。在一个实施方案中，靶细胞是皮肤中的细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一个实施方案中，靶细胞是抗原提呈细胞，例如脾中的专职性抗原提呈细胞。在一个实施方案中，靶细胞是脾中的树突状细胞。在一个实施方案中，靶细胞是T细胞。在一个实施方案中，靶细胞是B细胞。在一个实施方案中，靶细胞是NK细胞。在一个实施方案中，靶细胞是单核细胞。因此，本文所述的RNA LNP组合物可用于将RNA(优选mRNA)递送到这样的靶细胞。因此，本发明还涉及一种将RNA(优选mRNA)递送至受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括将本文所述的RNA LNP组合物给药受试者。在一个实施方案中，将RNA递送至靶细胞的胞质溶胶。在一个实施方案中，所述RNA是编码肽或蛋白的RNA(优选mRNA)，并且所述RNA被靶细胞翻译以产生所述肽或蛋白。
“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，如基因、cDNA或RNA(优选mRNA)，以用作生物学过程中合成其他聚合物和大分子的模板，其具有定义的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或定义的氨基酸序列以及由此产生的生物学性质。因此，如果对应于所述基因的RNA(优选mRNA)的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则所述基因编码所述蛋白。其核苷酸序列与RNA序列相同并且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cDNA的转录模板的非编码链都可以称为编码所述基因或cDNA的蛋白或其他产物。
在一个实施方案中，本发明中使用的RNA(优选mRNA)包含编码一种或多种多肽例如肽或蛋白、优选药物活性肽或蛋白的核酸序列(例如，ORF)。
在一个优选实施方案中，本发明中使用的RNA(优选mRNA)包含编码肽或蛋白、优选药物活性肽或蛋白的核酸序列(例如ORF)，并且能够表达所述肽或蛋白(特别是如果转移到细胞或受试者中)。因此，本发明中使用的RNA(优选mRNA)优选含有编码肽或蛋白、优选编码药物活性肽或蛋白的编码区(ORF)。在这方面，“开放阅读框”或“ORF”是以起始密码子开始并以终止密码子结束的一段连续的密码子序列。这种编码药物活性肽或蛋白的RNA(优选mRNA)在本文中也称为“药物活性RNA”(或“药物活性mRNA”)。
根据本发明，术语“药物活性肽或蛋白”是指可用于治疗个体的肽或蛋白，其中肽或蛋白的表达将有益于例如改善疾病或病症的症状。优选地，药物活性肽或蛋白具有治疗性质或缓和性质，并且可以用于改善、缓和、减轻、逆转、延迟发生或减轻疾病或障碍的一种或多种症状的严重性。优选地，当以治疗有效量给药个体时，药物活性肽或蛋白对个体的病况或疾病状态具有积极或有利的作用。药物活性肽或蛋白可具有预防性质，并可用于延缓疾病或障碍的发作或减轻这种疾病或障碍严重程度。术语“药物活性肽或蛋白”包括完整的蛋白或多肽，也可以指其药物活性片段。还可以包括肽或蛋白的药物活性类似物。
药物活性肽和蛋白的具体实例包括但不限于细胞因子、激素、粘附分子、免疫球蛋白、免疫活性化合物、生长因子、蛋白酶抑制剂、酶、受体、凋亡调节因子、转录因子、肿瘤抑制蛋白、结构蛋白、重编程因子、基因组工程蛋白，以及血液蛋白。
术语“细胞因子”涉及分子量约为5至20kDa并参与细胞信号传导(例如旁分泌、内分泌和/或自分泌信号传导)的蛋白。特别地，当释放时，细胞因子对其释放部位周围细胞的行为产生影响。细胞因子的实例包括淋巴因子、白细胞介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(TNF)。根据本发明，细胞因子不包括激素或生长因子。细胞因子与激素的不同之处在于：(i)其通常以比激素更可变的浓度发挥作用，以及(ii)通常由广泛的细胞产生(几乎所有有核细胞都能产生细胞因子)。干扰素通常特征在于抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素是通过与受调节细胞表面的干扰素受体结合来改变和调节细胞内基因转录的蛋白，从而阻止病毒在细胞内复制。干扰素可以分为两种类型。干扰素γ是唯一的II型干扰素；所有其他干扰素均是I型干扰素。细胞因子的具体实例包括红细胞生成素(EPO)、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、骨形态发生蛋白(BMP)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(IFNβ)、干扰素γ、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素10(IL-10)、白介素11(IL-11)、白介素12(IL-12)和白介素21(IL-21)。
在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白包括置换蛋白。在这个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有需要蛋白置换的障碍(例如，蛋白缺乏症)的受试者的方法，其包括向受试者给药本文所述的编码置换蛋白的RNA。术语“蛋白置换”是指将蛋白(包括其功能性变体)引入这种蛋白缺乏的受试者体内。所述术语还指将蛋白引入以其他方式需要或受益于提供蛋白的受试者，例如患有蛋白不足的受试者。术语“以蛋白缺乏为特征的障碍”是指因蛋白缺乏或数量不足而导致出现病理状况的任何病症。这个术语包括蛋白折叠障碍，即构象障碍，其导致生物无活性的蛋白产物。蛋白缺乏可涉及感染性疾病、免疫抑制、器官衰竭、腺体问题、辐射疾病、营养缺乏、中毒或其他环境或外部损伤。
术语“激素”涉及由腺体产生的一类信号分子，其中信号传导通常包括以下步骤：(i)在特定组织中合成激素；(ii)储存和分泌；(iii)将所述激素转运至其靶标；(iv)通过受体结合所述激素；(v)信号的中继和放大；以及(vi)激素的分解。激素与细胞因子的不同之处在于：(1)激素通常以较少变化的浓度发挥作用；(2)通常由特定种类的细胞产生。在一个实施方案中，“激素”是肽或蛋白激素，如胰岛素、血管加压素、催乳素、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲状腺激素、生长激素(如人生长激素或牛生长激素)、催产素、心房钠尿肽(ANP)、胰高血糖素、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和瘦素。
术语“粘附分子”涉及位于细胞表面并参与细胞与其他细胞或细胞外基质(ECM)结合的蛋白。粘附分子通常是跨膜受体，可分为钙非依赖性(如整合素、免疫球蛋白超家族、淋巴细胞归巢受体)和钙依赖性(钙粘蛋白和选择素)。粘附分子的具体实例是整合素、淋巴细胞归巢受体、选择素(例如P-选择素)和地址素(addressin)。
整合素也参与信号转导。特别地，在配体结合时，整合素调节细胞信号传导通路，例如跨膜蛋白激酶如受体酪氨酸激酶(RTK)的信号传导通路。这种调节可导致细胞生长、分裂、存活或分化或导致凋亡。整合素的具体实例包括：α1β1,α2β1,α3β1,α4β1,α5β1,α6β1,α7β1,αLβ2,αMβ2,αIIbβ3,αVβ1,αVβ3,αVβ5,αVβ6,αVβ8和α6β4。
术语“免疫球蛋白”或“免疫球蛋白超家族”是指参与细胞识别、结合和/或粘附过程的分子。属于这个超家族的分子具有共同的特征，即它们含有一个称为免疫球蛋白结构域或折叠的区域。免疫球蛋白超家族的成员包括抗体(例如IgG)、T细胞受体(TCR)、主要组织相容性复合体(MHC)分子、共受体(例如CD4、CD8、CD19)、抗原受体辅助分子(例如CD-3γ、CD3-δ、CD-3ε、CD79a、CD79b)、共刺激或抑制分子(例如CD28、CD80、CD86)等。
术语“免疫活性化合物”涉及改变免疫应答的任何化合物，优选通过诱导和/或抑制免疫细胞的成熟、诱导和/或者抑制细胞因子生物合成和/或通过刺激B细胞产生抗体来改变体液免疫而改变免疫应答。免疫活性化合物具有强大的免疫刺激活性，包括但不限于抗病毒和抗肿瘤活性，并且还可以下调免疫应答的其他方面，例如将免疫应答从TH2免疫应答转移，这可用于治疗广泛的TH2介导的疾病。免疫活性化合物可以用作疫苗佐剂。免疫活性化合物的具体实例包括白细胞介素、集落刺激因子(CSF)、粒细胞集落刺激因素(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素、整合素、地址素、选择素、归巢受体，及抗原，特别是肿瘤相关抗原，病原体相关抗原(如细菌、寄生虫或病毒抗原)、过敏原和自身抗原。优选的免疫活性化合物是疫苗抗原，即接种到受试者中诱导免疫应答的抗原。
术语“自体抗原”或“自身抗原”是指源自受试者体内的抗原(即，自身抗原也可称为“自体抗原)，并产生对这个机体正常部分的异常强烈免疫应答。这种针对自身抗原的强烈免疫应答可以是“自身免疫性疾病”的原因。
术语“过敏原”是指一种源自于受试者体外的抗原(即，过敏原也可称为“异种抗原”)，其产生异常强烈的免疫应答，其中受试者的免疫系统抵抗感知到的对受试者无害的威胁。“过敏”是由对过敏原的强烈免疫应答引起的疾病。过敏原通常是一种抗原，能够通过免疫球蛋白E(IgE)应答刺激特应性个体的I型超敏反应。过敏原的具体实例包括源自花生蛋白(例如Ara h 2.02)、卵清蛋白、草花粉蛋白(例如Phl p 5)和尘螨蛋白(例如Der p 2)的过敏原。
术语“生长因子”是指能够刺激细胞生长、增殖、愈合和/或细胞分化的分子。通常，生长因子作为细胞之间的信号传导分子。术语“生长因子”包括与其靶细胞表面的特定受体结合的特定细胞因子和激素。生长因子的实例包括骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)例如VEGFA、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子、ephrins、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、神经调节蛋白、神经营养素(例如，脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF))、胎盘生长因子(PGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、肾胺酶(renalase)(RNLS)(抗凋亡存活因子)、T细胞生长因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子(转化生长因子α(TGF-α)，和转化生长因子β(TNF-β))，及肿瘤坏死因子α(TNF-α)。在一个实施方案中，“生长因子”是肽或蛋白生长因子。
术语“蛋白酶抑制剂”是指抑制蛋白酶功能的分子，特别是肽或蛋白。蛋白酶抑制剂可以根据抑制的蛋白酶分类(例如天冬氨酸蛋白酶抑制剂)或根据其作用机制分类(例如自杀性抑制剂，如丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins))。蛋白酶抑制剂的具体实例包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如α1-抗胰蛋白酶、抑肽酶和苯丁抑制素(bestatin)。
术语“酶”是指加速化学反应的大分子生物催化剂。像任何催化剂一样，酶在其催化的反应中不被消耗，也不会改变所述反应的平衡。与许多其他催化剂不同，酶的特异性要高得多。在一个实施方案中，酶对于受试者的体内稳态是必需的，例如，酶的任何功能障碍(特别是可以由任何突变、缺失或产生减少引起的活性降低)都会导致疾病。酶的实例包括单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖胺酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶和乳糖酶。
术语“受体”是指从细胞外接收信号(特别是称为配体的化学信号)的蛋白分子。信号(例如配体)与受体的结合引起细胞的某种反应，例如激酶的细胞内激活。受体包括跨膜受体(如离子通道连接的(离子型)受体、G蛋白连接的(代谢型)受体和酶连接的受体)和细胞内受体(如细胞质受体和核受体)。受体的具体实例包括类固醇激素受体、生长因子受体和肽受体(即其配体为肽的受体)，例如P-选择素糖蛋白配体-1(PSGL-1)。术语“生长因子受体”是指与生长因子结合的受体。
术语“细胞凋亡调节因子”是指调节细胞凋亡的分子，特别是肽或蛋白，即激活或抑制细胞凋亡。细胞凋亡调节因子可分为两大类：调节线粒体功能的因子和调节半胱天冬酶的因子。第一类包括蛋白(例如，BCL-2、BCL-xL)，其通过防止线粒体膜电位的丧失和/或促凋亡蛋白如细胞色素C释放到胞质溶胶中来保持线粒体完整性。同样属于第一类的是促进细胞色素C释放的促凋亡蛋白(例如，BAX、BAK、BIM)。第二类包括阻断半胱天冬酶激活的蛋白，例如细胞凋亡蛋白抑制剂(例如，XIAP)或FLIP。
术语“转录因子”涉及调节遗传信息从DNA到信使RNA的转录速率的蛋白，特别是通过与特定的DNA序列结合进行调节。转录因子可以在生命中调节细胞分裂、细胞生长和细胞死亡；在胚胎发育过程中调节细胞迁移和组构；和/或应答来自细胞外部的信号如激素。转录因子含有至少一个与特定DNA序列结合的DNA结合结构域，通常与受转录因子调节的基因相邻。转录因子的具体实例包括MECP2、FOXP2、FOXP3、STAT蛋白家族和HOX蛋白家族。
术语“肿瘤抑制蛋白”涉及分子，尤其是肽或蛋白，其保护细胞免于走向通往癌症的道路。肿瘤抑制蛋白(通常由相应的肿瘤抑制基因编码)呈现出对调节细胞周期的减弱或抑制作用和/或促进细胞凋亡。其功能可以是以下一种或多种：抑制细胞周期持续所必需的基因；将细胞周期与DNA损伤相关联(只要损伤的DNA存在于细胞中，就不应该发生细胞分裂)；如果受损的DNA不能被修复，则引发细胞凋亡；转移抑制作用(例如，防止肿瘤细胞扩散、阻断失去接触抑制和抑制转移)；以及DNA修复。肿瘤抑制蛋白的具体实例包括p53、磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)、SWI/SNF(转换/蔗糖非发酵性)、von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子(pVHL)、结肠腺瘤样息肉蛋白(APC)、CD95、肿瘤发生抑制蛋白5(ST5)、肿瘤发生抑制蛋白5(ST5)、肿瘤发生抑制蛋白14(ST14)和Yippee样蛋白3(YPEL3)。
术语“结构蛋白”是指赋予流体生物组分硬度和刚性的蛋白。结构蛋白大多是纤维状的(如胶原蛋白和弹性蛋白)，但也可以是球状的(如肌动蛋白和微管蛋白)。通常，球状蛋白以单体形式可溶，但聚合形成长纤维，例如这些纤维可构成细胞骨架。其他结构蛋白是能够产生机械力的运动蛋白(如肌球蛋白、驱动蛋白和动力蛋白(dynein))和表面活性蛋白。结构蛋白的具体实例包括胶原蛋白、表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、弹性蛋白、微管蛋白、肌动蛋白和肌球蛋白。
术语“重编程因子”或“重编程转录因子”涉及分子，特别是肽或蛋白，当其在体细胞中任选与其他制剂如其他重编程因子一起表达时，导致所述体细胞重编程或去分化为具有干细胞特征、特别是多能性的细胞。重编程因子的具体实例包括OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28和NANOG。
术语“基因组工程蛋白”涉及能够在受试者基因组中插入、缺失或置换DNA的蛋白。基因组工程蛋白的具体实例包括巨核酸酶(meganucleases)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Cas9)。
术语“血液蛋白”涉及存在于受试者血浆、特别是健康受试者的血浆中肽或蛋白。血液蛋白具有多种功能，如转运(如白蛋白、转铁蛋白)、酶活性(如凝血酶或血浆铜蓝蛋白)、凝血(如纤维蛋白原)、防御病原体(如补体成分和免疫球蛋白)、蛋白酶抑制剂(如α1-抗胰蛋白酶)等。血液蛋白的具体实例包括凝血酶、血清白蛋白、因子VII，因子VIII、胰岛素、因子IX、因子X、组织纤溶酶原激活物、蛋白C、血管性血友病因子(von Willebrandfactor)、抗凝血酶III、葡糖脑苷酯酶、红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、修饰的因子VIII和抗凝血剂。
因此，在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白是(i)细胞因子，优选选自红细胞生成素(EPO)、白细胞介素4(IL-2)和白细胞介素10(IL-11)，更优选EPO；(ii)粘附分子，特别是整合素；(iii)免疫球蛋白，特别是抗体；(iv)免疫活性化合物，特别是抗原；(v)激素，特别是血管加压素、胰岛素或生长激素；(vi)生长因子，特别是VEGFA；(vii)蛋白酶抑制剂，特别是α1-抗胰蛋白酶；(viii)酶，优选选自单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羟化酶、假胆碱酯酶、胰酶和乳糖酶；(ix)受体，特别是生长因子受体；(x)细胞凋亡调节因子，特别是BAX；(xi)转录因子，特别是FOXP3；(xii)肿瘤抑制蛋白，特别是p53；(xiii)结构蛋白，特别是表面活性蛋白B；(xiv)重编程因子，例如选自OCT4、SOX2、c-MYC、KLF4、LIN28和NANOG；(xv)基因组工程蛋白，特别是成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Cas9)；和(xvi)血液蛋白，特别是纤维蛋白原。
在一个实施方案中，药物活性肽或蛋白包含一种或多种抗原或一个或多个表位，即为受试者给药所述肽或蛋白在受试者中引发针对所述一种或多种抗原或一个或多个表位的免疫应答，所述免疫应答可以是治疗性的或部分或完全保护性的。
在某些实施方案中，所述RNA(优选mRNA)编码至少一个表位。
在某些实施方案中，所述表位来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是一种“标准”抗原，通常已知在各种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是一种“新抗原”，其对个体的肿瘤是特异性的，并且先前没有被免疫系统识别。新抗原或新表位可以得自癌症细胞基因组中导致氨基酸变化的一个或多个癌症特异性突变。肿瘤抗原的实例包括但不限于：p53，ART-4，BAGE，-连环蛋白/m，Bcr-abL CAMEL，CAP-1，CASP-8，CDC27/m，CDK4/m，CEA，紧密连接蛋白(claudin)家族的细胞表面蛋白，如CLAUDΓΝ-6，CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12，c-MYC，CT，Cyp-B，DAM，ELF2M，ETV6-AML1，G250，GAGE，GnT-V，Gap 100，HAGE，HER-2/neu，HPV-E7，HPV-E6，HAST-2，hTERT(或hTRT)，LAGE，LDLR/FUT，MAGE-A，优选MAGE-A1，MAGE-A2，MAGE-A3，MAGE-A4，MAGE-A5，MAGE-A6，MAGE-A7，MAGE-A8，MAGE-A9，MAGE-A10，MAGE-A11，或MAGE-A12，MAGE-B，MAGE-C，MART-1/Melan-A，MC1R，肌球蛋白/m，MUC1，MUM-1，MUM-2，MUM-3，NA88-A，NF1，NY-ESO-1，NY-BR-1，p190次要BCR-abL(pl90minor BCR-abL)，Pml/RARa，PRAME，蛋白酶3，PSA，PSM，RAGE，RU1或RU2，SAGE，SART-1或SART-3，SCGB3A2，SCP1，SCP2，SCP3，SSX，SURVIVIN，TEL/AML1，TPI/m，TRP-1，TRP-2，TRP-2/INT2，TPTE，WT和WT-1。
癌症突变因个体而异。因此，编码新型表位(新表位)的癌症突变是疫苗组合物和免疫治疗的开发中的诱人目标。肿瘤免疫治疗的疗效取决于能够在宿主体内诱导有效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。RNA可用于向患者递送患者特异性肿瘤表位。驻留在脾脏中的树突状细胞(DC)代表对免疫原性表位或抗原如肿瘤表位的RNA表达特别相关的抗原提呈细胞。多个表位的使用已被证明能提高肿瘤疫苗组合物的治疗效果。对肿瘤突变组(mutanome)的快速测序可以为个体化疫苗提供多个表位，这些表位可以由本文所述的mRNA编码，例如作为单个多肽，其中所述表位任选由接头分离。在本发明的某些实施方案中，mRNA编码至少一个表位、至少两个表位，至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位，或至少十个表位。示例的实施方案包括编码至少五个表位的mRNA(称为“五表位(pentatope)”)和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的mRNA。
在某些实施方案中，所述表位源自病原体相关抗原，特别是源自病毒抗原。在一个实施方案中，所述表位源自SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。因此，在一个实施方案中，本发明中使用的RNA(优选mRNA)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。在一个实施方案中，所述RNA包含编码在SEQ IDNO:1的986和987位具有脯氨酸残基取代的全长SARS-CoV2 S蛋白变体的ORF。在一个实施方案中，SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的相同性(例如至少85％相同性、至少90％相同性、至少91％相同性、至少92％相同性、至少93％相同性、至少94％相同性、至少95％相同性、至少96％相同性、至少97％相同性、至少98％相同性或至少99％相同性)。
在一个实施方案中，SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性片段包含SARS-CoV-2S蛋白的S1亚基或SARS-CoV-2S蛋白的S1亚基的受体结合结构域(RBD)。在一些实施方案中，本发明中使用的RNA(例如，mRNA)包含编码多肽的开放阅读框，所述多肽包含SARS-CoV-2S蛋白的受体结合部分，所述RNA适合于所述多肽的细胞内表达。在一些实施方案中，这种编码的多肽不包含完整的S蛋白。在一些实施方案中，所述编码的多肽包含受体结合结构域(RBD)，例如如SEQ ID NO:5所示。在一些实施方案中，所述编码的多肽包含根据SEQ ID NO:29或31的肽。
在一个实施方案中，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列能够形成多聚复合物，特别是三聚体复合物。为此，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列可以包含允许形成多聚复合物的结构域，特别是形成包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列的三聚体复合物。在一个实施方案中，允许形成多聚复合物的结构域包括三聚化结构域，例如本文所述的三聚化结构域。
在一个实施方案中，本文定义的三聚化结构域包括但不限于包含SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列的序列或其功能变体。在一个实施方案中，本文定义的三聚化结构域包括但不限于包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的序列或其功能变体。
在一个实施方案中，三聚化结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列，与SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，三聚化结构域包含SEQID No:10的氨基酸3至29的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码三聚化结构域的RNA，(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸7至87的核苷酸序列，与SEQ ID NO:11的核苷酸7至87的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:11的核苷酸7到87的核苷酸序列的片段，或与SEQ ID NO:11的核苷酸7至87的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列；和/或(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列、与SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:10的氨基酸3到29的氨基酸序列的功能片段，或与SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码三聚化结构域的RNA，(i)包含SEQ ID NO:11的核苷酸7至87的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:10的氨基酸3至29的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，由编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段(例如，如本文所述)的RNA表达的RBD抗原可通过添加T4-次要纤维蛋白(fibritin)衍生的“foldon”三聚化结构域来修饰，例如以增加其免疫原性。
在一个实施方案中，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列由密码子优化的和/或其G/C含量比野生型编码序列增加的编码序列编码，其中密码子优化和/或G/C含量的增加优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
在一实施方案中，
(i)编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列，与SEQID NO:2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2、8和9的核苷酸979至1584的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸979至1584的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸327至528的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸327至528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1的氨基酸327至528的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸327至528的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，
(i)编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列，与SEQID NO:2、8或9的核苷酸49至2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2、8和9的核苷酸49至2055的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2、8或者9的核苷酸49至2055的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸17至685的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸17至685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1的氨基酸17至685的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸17至685的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一实施方案中，
(i)编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列，与SEQID NO:2、8或9的核苷酸49至3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2、8和9的核苷酸49至3819的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2、8或者9的核苷酸49至3819的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段包含SEQ ID NO:1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1或7的氨基酸17至1273的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的氨基酸序列包含分泌信号肽。
在一个实施方案中，分泌信号肽优选在N末端与SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段融合。
在一实施方案中，
(i)编码分泌信号肽的RNA包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列，与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸1至48的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)所述分泌信号肽包含SEQ ID NO:1的氨基酸1至16的氨基酸序列，与SEQ IDNO:1的氨基酸1至16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1的氨基酸1至16的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸1至16的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列，与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:6的核苷酸序列或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列，与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:4的核苷酸序列或与SEQ ID NO:4的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、与SEQ IDNO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54至716的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸54至716的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:30的核苷酸54至716的核苷酸序列或与SEQ ID NO:30的核苷酸54至716的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至221的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1至221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸1至221的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸1至221的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原异性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54至716的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至221的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54至725的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸54至725的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:32的核苷酸54至725的核苷酸序列或与SEQ ID NO:32的核苷酸54至725的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至224的氨基酸序列、与SEQ ID NO:31的氨基酸1至224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸1至224的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸1至224的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列，与SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列所述具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列或与SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，与SEQ IDNO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％，98％、97％，96％、95％，90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:17、21或26的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:18的氨基酸序列或与SEQ ID NO:18的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID No:18的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54至824的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸54至824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:30的核苷酸54至824的核苷酸序列或与SEQ ID NO:30的核苷酸54至824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％的相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54至824的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至257的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54至833的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸54至833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:32的核苷酸54至833的核苷酸序列或与SEQ ID NO:32的核苷酸54至833的核苷酸序列有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54至833的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至260的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111至824的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸111至824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:30的核苷酸111至824的核苷酸序列或与SEQ ID NO:30的核苷酸111至824的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，编码疫苗抗原的RNA，(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111至824的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至257的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120至833的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸120到833的核酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:32的核苷酸120至833的核苷酸序列与SEQ ID NO:32的核苷酸120至833的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120至833的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至260的氨基酸序列的氨基酸序列。
根据某些实施方案，跨膜结构域直接或通过接头(例如甘氨酸/丝氨酸接头)与SARS-CoV-2S蛋白、其变体或其片段(即抗原肽或蛋白)融合。因此，在一个实施方案中，跨膜结构域与源自上述疫苗抗原所包含的SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列融合(其可任选与如上所述的信号肽和/或三聚化结构域融合)。这种跨膜结构域优选位于抗原肽或蛋白的C末端，但不限于此。优选地，这样的跨膜结构域位于三聚化结构域的C末端，如果存在的话，但不限于此。在一个实施方案中，三聚化结构域存在于SARS-CoV-2S蛋白、其变体或其片段(即抗原肽或蛋白)与跨膜结构域之间。本文定义的跨膜结构域优选允许将由所述RNA编码的抗原肽或蛋白锚定到细胞膜中。
在一个实施方案中，本文定义的跨膜结构域序列包括但不限于SARS-CoV-2S蛋白的跨膜结构域序列，特别是包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列或其功能变体的序列。
在一个实施方案中，跨膜结构域序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列或SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一个实施方案中，跨膜结构域序列包括SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码跨膜结构域序列的RNA：(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619至3762的核苷酸序列，与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619至3762的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619至3762的核苷酸序列或与SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619至3762的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的功能片段。在一个实施方案中，编码跨膜结构域序列的RNA，(i)包含SEQ ID NO:2、8或9的核苷酸3619至3762的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207至1254的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54至986的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸54至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:30的核苷酸54至986的核苷酸序列与SEQ ID NO:30的核苷酸54至986的核苷酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％的相同性的核酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸顺序具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸54至986的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸1至311的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54至995的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸54至995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:32的核苷酸54至995的核苷酸序列或与SEQ ID NO:32的核苷酸54至995的核苷酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA,(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54至995的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至314的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111至986的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸111至986的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:30的核苷酸11至986的核苷酸序列或与SEQ IDNo:30的核苷酸111至986的核苷酸序列具有至少99％，98％、97％，96％、95％、90％、85％或80％的相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列，与SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列或与SEQ ID No:29的氨基酸20至311的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性片段或其免疫原性变体的RNA，(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸111至986的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸20至311的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列或与SEQ ID No:31的氨基酸23至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120至995的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸120至995的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:32的核苷酸120至995的核苷酸序列或与SEQ ID NO:32的核苷酸120至995的核苷酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％的相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列，与SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸120至995的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸23至314的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列，与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:30的核苷酸序列或与SEQ ID NO:30的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，与SEQID NO:29的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:29的氨基酸序列或与SEQ ID NO:29的氨基酸序列具有至少99％，98％、97％，96％、95％，90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码疫苗抗原的RNA，(i)包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列，与SEQ ID NO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO.32的核苷酸序列或与SEQ ID NO:32的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，与SEQID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与SEQ ID NO:31的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％，90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA,(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，疫苗抗原包含SEQID NO:28的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，
(i)包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列，与SEQ ID NO:27的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列，或SEQ ID NO:27的核苷酸序列或与SEQ ID NO:27的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列的片段；和/或
(ii)编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列，与SEQID NO:28的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，或SEQ ID NO:28的氨基酸序列或与SEQ ID NO:28的氨基酸序列具有至少99％，98％、97％，96％、95％，90％、85％或80％相同性的氨基酸序列的免疫原性片段。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA,(i)包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，上述疫苗抗原包含SARS-CoV-2冠状病毒刺突(S)蛋白的连续序列，其由或基本上由源自上述疫苗抗原所包含的SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性片段(抗原肽或蛋白)的上述氨基酸序列组成。在一个实施方案中，上述疫苗抗原包含不超过220个氨基酸、215个氨基酸、210个氨基酸或205个氨基酸的SARS-CoV-2冠状病毒刺突(S)蛋白的连续序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，本文描述为BNT162b1(RBP020.3)、BNT162b2(RBP020.1或RBP020.2)。在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，本文描述为RBP020.2。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQID NO:21的核苷酸序列，与SEQ ID NO:21的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、或80％相同性的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:21的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQID NO:19或20的核苷酸序列，与SEQ ID NO:19或20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7的氨基酸顺序具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:19或20的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID No:7的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQID NO:20的核苷酸序列，与SEQ ID NO:20的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA是核苷修饰的信使RNA(modRNA)，并且(i)包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一个实施方案中，编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA，(i)包含SEQ ID NO:32的核苷酸54至725的核苷酸序列；和/或(ii)编码包含SEQ ID NO:31的氨基酸1至224的氨基酸序列的氨基酸序列。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述RNA含有上述的一种或多种RNA修饰，即掺入5’-帽结构、掺入poly-A序列、poly-A序列的去掩蔽、改变5’-和/或3’-UTR(例如掺入一个或多个3’-UTR)，用合成的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷置换胞苷和/或假尿苷(Ψ)或用N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)置换尿苷)和密码子优化。在一个实施方案中，所述RNA含有上述修饰的组合，优选至少两种、至少三种、至少四种或所有五种上述修饰的组合，即，(i)掺入5’-帽结构；(ii)掺入poly-A序列，poly-A序列的去掩蔽；(iii)5’-和/或3’-UTR的改变(如掺入一个或多个3’-UTR)；(iv)用合成的核苷酸置换一个或多个天然存在的核苷酸(例如，用5-甲基胞苷置换胞苷和/或用假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)置换尿苷)及(v)密码子优化。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述RNA是修饰的RNA，特别是稳定的mRNA。在一个实施方案中，所述RNA包含取代至少一个尿苷的修饰的核苷。在一个实施方案中，所述RNA包含替代尿苷的修饰的核苷，例如取代每个尿苷。在一个实施方案中，经修饰的核苷独立地选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿嘧啶(m1ψ)和5-甲基尿苷(m5U)。在一个实施方案中，所述RNA包含5’帽，优选cap1或cap2结构，更优选cap1结构。在一个实施方案中，所述RNA包含5’UTR，其包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:12的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述RNA包含3’UTR，其包含SEQ ID NO:13的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:13的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述RNA包含poly-A序列。在一个实施方案中，poly-A序列包含至少100个核苷酸。在一个实施方案中，所述poly-A序列包含或由SEQ ID NO:14的核苷酸序列组成。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括RBD中的突变(与SEQ ID NO:1相比，例如但不限于Q321L、V341I、A348T、N354D、S359N、V367F、K378R、R408I、Q409E、A435S、N439K、K458R、I472V、G476S、S477N、V483A、Y508H、H519P等)和/或刺突蛋白中的突变(与SEQID NO:1相比，例如但不限于D614G等)。本领域的技术人员知道各种刺突蛋白变体和/或记录它们的资源(例如，由COVID-19Viral Genome Analysis Pipeline维护的并见于https://cov.lanl.gov/components/sequence/COV/int_sites_tbls.comp的刺突蛋白中突变位点表)(最后访问时间为2020年8月24日)，并且通过阅读本说明书，技术人员将会意识到本文所述的RNA组合物和/或方法可以根据其在接种疫苗的受试者中诱导血清的能力显示出针对任何或所有此类变体和/或其组合的中和活性。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中501位的突变，并且任选可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如，但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括“关切变异株202012/01(Variant of Concern 202012/01)”(VOC-2012/01；也称为谱系B.1.1.7)。所述变体此前被英国公共卫生部(Public Health England)于2020年12月命名为第一个正在调查的变体(Variant Under Investigation，VUI-202012/01)，但重新归类为关切变异株(VOC-202012/01)。VOC-202012/01是SARS-CoV-2的变异株，其于2020年10月在英国COVID-19大流行期间从上个月采集的样本中首次检测到，并于12月中旬迅速开始传播。其与英国COVID-19感染率显著增加有关；认为这种增加至少部分是由于刺突糖蛋白受体结合结构域内N501Y的变化所致，N501Y是与人类细胞中的ACE2结合所必需的。VOC-202012/01变体由23个突变定义：13个非同义突变、4个缺失和6个同义突变(即有17个突变改变蛋白，6个突变不改变蛋白)。VOC 202012/01中的刺突蛋白变化包括缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。VOC-202012/01中最重要的变化之一似乎是N501Y，即氨基酸位点501从天冬酰胺(N)到酪氨酸(Y)的变化。这种突变单独或与N末端结构域(NTD)69/70位的缺失相组合可以增强病毒的传播性。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括变体“501.V2”。这个变体于2020年10月首次在样品中观察到，此后，在南非通过全基因组测序(WGS)证实了300多例501.V2变体，到2020年12月，它是所述病毒的主要形式。初步结果表明，这个变体可以具有更高的传播能力。501.V2变体由多个刺突蛋白的变化定义，其包括：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，最近收集的病毒有另外的变化：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、R246I、K417N和缺失242-244。所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比包括在刺突蛋白中H69/V70缺失的SARS-CoV-2刺突蛋白变体。所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I等)。在特定实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体包括以下突变：与SEQ ID NO:1相比的缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括变体“簇5(Cluster 5)”，也被丹麦国家血清研究所(Danish State Serum Institute,SSI)称为ΔFVI刺突蛋白。它是在丹麦North Jutland,Denmark发现的，据信是通过水貂养殖场从水貂传播给人类的。在簇5中，病毒刺突蛋白中的几个不同突变已被证实。特异性突变包括69-70deltaHV(在蛋白中第69和70位的组氨酸和缬氨酸残基的缺失)、Y453F(在453位从酪氨酸改变为苯丙氨酸)、I692V(在692位的异亮氨酸改变为缬氨酸)、M1229I(在1229位的甲硫氨酸改变为异亮氨酸)和任选的S1147L(在1147位的丝氨酸改变为亮氨酸)。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括以下突变：与SEQ ID NO:1相比的缺失69-70、Y453F、I692V、M1229I和任选的S1147L。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中614位的突变，例如与SEQ ID NO:1相比在棘突蛋白中的D614G突变。与SEQ ID NO:1相比包括在刺突蛋白中614位突变的所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARs-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和D614G，以及任选与SEQ ID NO:1相比的以下突变：L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中501和614位的突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体包括刺突蛋白中的N501Y突变和D614G突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体包括一个或多个进一步的突变(例如但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比的以下突变：缺失69-70、缺失144、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A和D1118H。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体与SEQ ID NO:1相比包括以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和D614G，以及任选与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中484位的突变，例如与SEQ ID No:1相比在刺突蛋白中的E484K突变。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体可包括一个或多个进一步的突变(例如，但不限于与SEQ ID NO:1相比的H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，与SEQ ID NO:1相比包括以下突变：D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选与SEQ IDNO:1相比的突变L18F、R246I、K417N和缺失242-244。所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括称为巴西变体(Brazil(ian)variant)的变异谱系B.1.1.248。这个SARS-CoV-2变体命名为P.1谱系，有17个独特的氨基酸变化，其中10个在其刺突蛋白中，包括N501Y和E484K。B.1.1.248源自B.1.1.28。E484K同时存在于B.1.1.28和B.1.1.248中。B.1.1.248具有许多S蛋白多态性[L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I、V1176F]，并且在某些关键RBD位置(K417、E484、N501)与南非描述的变体相似。
因此，在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的特定实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARS-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARs-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中501和484位置的突变，如与SEQ IDNO:1相比刺突蛋白中的N501Y突变和E484K突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体与SEQ ID NO:1相比可包括一个或多个进一步的突变(与SEQ ID NO:1相比例如但不限于H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述变体包括具有以下突变的SARS-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变D80A、D215G、E484K、N501Y和A701V，以及任选的与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、R246I、K417N和缺失242-244。所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体与SEQ ID NO:1相比还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARS-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述刺突蛋白变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中第501、484和614位置的突变，例如与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中的N501Y突变、E484K突变和D614G突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体与SEQ ID NO:1相比可包括一个或多个进一步的突变(与SEQID NO:1相比例如但不限于H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、K417N、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARs-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和D614G，以及任选的与SEQ ID NO:1相比突变L18F、R246I、K417N和缺失242-244。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中具有L242/A243/L244缺失的SARs-CoV-2刺突蛋白变体。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体与SEQ ID NO:1相比可包括一个或多个进一步的突变(与SEQ ID NO:1相比例如但不限于H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、K417N、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述变体包括具有以下突变的SARs-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和缺失242-244，以及任选与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、R246I和K417N。所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体与SEQ ID NO:1相比还可以包括D614G突变。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-2刺突蛋白变体，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比在刺突蛋白中417位置的突变，例如与SEQ ID No:1相比在刺突蛋白中的K417N或K417T突变。在一些实施例中，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体与SEQ IDNO:1相比可包括一个或多个进一步的突变(与SEQ ID NO:1相比例如但不限于H69/V70缺失、Y144缺失、N501Y、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、E484K、A701V、L18F、R246I、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARS-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和K417N，以及任选的与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、R246I和缺失242-244。所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的突变D614G。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARS-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括SARS-CoV-22刺突蛋白变体，所述变体包括与SEQ ID NO:1相比包括在刺突蛋白中417和484和/或501位置的突变，如与SEQID NO:1相比在刺突蛋白中的K417N或K417T突变以及E484K和/或N501Y突变。在一些实施方案中，所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体与SEQ ID NO:1相比可包括一个或多个进一步的突变(与SEQ ID NO:1细胞例如但不限于H69/V70缺失、Y144缺失、A570D、D614G、P681H、T716I、S982A、D1118H、D80A、D215G、A701V、L18F、R246I、L242/A243/L244缺失、Y453F、I692V、S1147L、M1229I、T20N、P26S、D138Y、R190S、H655Y、T1027I、V1176F等)。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARS-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变D80A、D215G、E484K、N501Y、A701V和K417N，以及任选的与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、R246I和缺失242-244。所述SARs-CoV-2刺突蛋白变体还可以包括与SEQ ID NO:1相比的突变D614G。
在编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段的RNA的一个实施方案中，所述变体包括具有以下突变的SARS-CoV-2刺突蛋白变体：与SEQ ID NO:1相比的突变L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、H655Y、T1027I和V1176F。
与SEQ ID NO:1相比，本文所述的SARs-CoV-2刺突蛋白变体可以包括也可不包括D614G突变。
在本发明的一个实施方案中，抗原(如肿瘤抗原或疫苗抗原)优选作为单链5’端加帽的RNA(优选mRNA)给药，其在进入给药所述RNA的受试者细胞时翻译成相应的蛋白。优选地，所述RNA含有结构元件，所述结构元件针对RNA在稳定性和翻译效率方面的最大效力而优化(5’帽、5’UTR、3’UTR、poly-A序列)。
在一个实施方案中，β-S-ARCA(D1)用作RNA5’端的特异性加帽结构。在一个实施方案中，m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG用作RNA 5’端的特异性加帽结构。在一个实施方案中，5’-UTR序列源自人α-珠蛋白mRNA，并且任选具有优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。在一个实施方案中，源自“分裂的氨基末端增强子(amino terminal enhancer of split)”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件(FI元件)的组合置于编码序列和poly-A序列之间，以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。在一个实施方案中，将源自人β-珠蛋白mRNA的两个重复3’-UTR置于编码序列和poly(A)序列之间，以确保更高的最大蛋白水平和延长的mRNA持久性。在一个实施方案中，使用长度为110个核苷酸的poly-A序列，所述序列由30个腺苷残基的一段序列、随后是10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基组成。这个poly(A)序列设计用于增强RNA的稳定性和翻译效率。
在下文中，描述了三种不同RNA平台的实施方案，每种RNA平台编码SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
通常，本文所述的疫苗RNA可包含从5’至3’的以下结构之一：
帽-5’-UTR-疫苗抗原编码序列-3’-UTR-poly(A)
或
β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-疫苗抗原编码序列-FI-A30L70。
通常，本文所述的疫苗抗原从N末端到C末端可以包含以下结构之一：
信号序列-RBD-三聚结构域
或
信号序列-RBD-三聚结构域-跨膜结构域。
RBD和三聚结构域可以由接头分隔，特别是GS接头，例如具有氨基酸序列GSPGSGSGS(SEQ ID NO:33)的接头。三聚结构域和跨膜结构域可以由接头分隔，特别是GS接头，例如具有氨基酸序列GSGSGS(SEQ ID NO:34)的接头。
信号序列可以是如本文所述的信号序列。RBD可以是如本文所述的RBD结构域。三聚结构域可以是如本文所述的三聚结构域。跨膜结构域可以是如本文所述的跨膜结构。
在一实施方案中，
信号序列包含SEQ ID NO:1的氨基酸1-16或1-19的氨基酸序列或SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，或与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，RBD包含SEQ ID NO:1的氨基酸327-528的氨基酸序列，或与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列，
三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的氨基酸序列，或与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列；和
跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列，或与这个氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％相同性的氨基酸序列。
在一实施方案中，
信号序列包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-16或1-19的氨基酸序列或SEQ ID NO:31的氨基酸1-22的氨基酸序列，
RBD包含SEQ ID NO:1的氨基酸327至528的氨基酸序列，
三聚结构域包含SEQ ID NO:10的氨基酸3-29的氨基酸序列或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；和
跨膜结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸1207-1254的氨基酸序列。
上述RNA或编码上述疫苗抗原的RNA可以是非修饰的含尿苷的mRNA(uRNA)、核苷修饰的mRNA(modRNA)或自扩增RNA(saRNA)。在一个实施方案中，上述RNA或编码上述疫苗抗原的RNA是核苷修饰的mRNA(modRNA)。
非修饰的尿苷信使RNA(uRNA)
非修饰信使RNA(uRNA)的活性原理是单链mRNA在进入细胞时被翻译。除了编码冠状病毒疫苗抗原的序列(即开放阅读框)外，每个uRNA优选含有共同的结构元件，所述结构元件针对RNA在稳定性和翻译效率方面的最大功效而优化(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR和poly(A)尾)。优选的5’帽结构是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2’-OGppSpG)。优选的5’-UTR和3’-UTR分别包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列和SEQ ID NO:13的核苷酸序列。优选的poly(A)尾包含SEQID NO:14的序列。
这个平台的不同实施方案如下所示：
RBL063.1(SEQ ID NO:15；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(S1S2全长蛋白，序列变体)的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)
RBL063.2(SEQ ID NO:16；SEQ ID NO:7)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(S1S2全长蛋白，序列变体)的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)
BNT162a1；RBL063.3(SEQ ID NO:17；SEQ ID NO:5)
结构β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-RBD-GS-Fibritin-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))的病毒刺突蛋白(S蛋白)
在这方面，“hAg-Kozak”是指人α-珠蛋白mRNA的5’-UTR序列，具有优化的Kozak序列，以提高翻译效率；“S1S2蛋白”/“S1S2 RBD”是指编码SARS-CoV-2的相应抗原的序列；“FI元件”是指3’-UTR是来源于“分裂(split)的氨基末端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两个序列元件的组合。这些是通过对赋予RNA稳定性和增加总蛋白表达的序列进行离体选择而鉴定的；“A30L70”是指长度为110个核苷酸的poly(A)尾，由30个腺苷残基组成，随后是10个核苷酸的接头序列和另外设计的70个腺苷残基以增强树突状细胞中RNA的稳定性和翻译效率；“GS”是指甘氨酸-丝氨酸接头，即编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列，通常用于融合蛋白。
核苷修饰的信使RNA(modRNA)
核苷修饰信使RNA(modRNA)药物物质的活性原理也是在单链信使RNA在进入细胞时被翻译。除了编码冠状病毒疫苗抗原的序列(即开放阅读框)外，每个modRNA都含有通用的结构元件，这些结构元件是为RNA的最大功效而优化的，如uRNA(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR和poly(A)尾)。与uRNA相比，modRNA含有1-甲基-假尿苷而不是尿苷。优选的5’-帽结构是m27 ,3’-OGppp(m12’-O)ApG。优选的5’-UTR和3’-UTR分别包含SEQ ID NO:12的核苷酸序列和SEQID NO:13的核苷酸序列。优选的poly(A)尾包含SEQ ID NO:14的序列。对modRNA应用额外的纯化步骤，以减少体外转录反应期间产生的dsRNA污染物。
这个平台的不同实施方案如下所示：
BNT162b2；RBP020.1(SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:7)
结构m27,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(S1S2全长蛋白，序列变体)的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)
BNT162b2；RBP020.2(SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:7)
结构m27,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(S1S2全长蛋白，序列变体)的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)
BNT162b1；RBP020.3(SEQ ID NO:21；SEQ ID NO:5)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG)-hAg-Kozak-RBD-GS-Fibritin-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域与fibritin融合)的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)
BNT162b3c(SEQ ID NO:29；SEQ ID NO:30)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG-hAg-Kozak-RBD-GS-Fibritin-GS-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)与融合到S1S2蛋白跨膜结构域(TM)的Fibritin融合))的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)；抗原序列N末端的固有S1S2蛋白分泌信号肽(aa 1-19)
BNT162b3d(SEQ ID NO:31；SEQ ID NO:32)
结构m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG-hAg-Kozak-RBD-GS-Fibritin-GS-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD)与融合到S1S2蛋白跨膜结构域(TM)的Fibritin融合))的病毒刺突蛋白(S1S2蛋白)；抗原序列N末端的免疫球蛋白分泌信号肽(aa 1-22)
自扩增RNA(saRNA)
自扩增mRNA(saRNA)药物物质的活性原理是单链RNA在进入细胞时自我扩增，然后翻译冠状病毒疫苗抗原。与优选编码单个蛋白的uRNA和modRNA相反，saRNA的编码区包含两个开放阅读框(ORF)。5’-ORF编码RNA依赖性RNA聚合酶，如委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(VEEV)RNA依赖性RNA聚合酶(复制酶)。复制酶ORF在3’之后是亚基因组启动子和编码抗原的第二ORF。此外，saRNA UTR含有自扩增所需的5’和3’保守序列元件(CSE)。saRNA含有常见的结构元件，这些结构元件针对RNA最大功效优化，如uRNA(5’-帽、5’-UTR、3’-UTR和poly(A)尾)。saRNA优选含有尿苷。优选的5’帽结构是β-S-ARCA(D1)(m2 7,2’-OGppSpG)。
saRNA的细胞质递送启动了一个甲病毒样的生命周期。然而，saRNA不编码基因组包装或进入细胞所需的甲病毒结构蛋白，因此产生具有复制能力的病毒颗粒是非常不可能的。复制不涉及产生DNA的任何中间步骤。因此，saRNA的使用/摄取不会在靶细胞内造成基因组整合或其他永久性遗传修饰的风险。此外，saRNA本身通过dsRNA中间体的识别有效激活先天免疫应答，从而阻止其持续复制。
这个平台的不同实施方案如下所示：
RBS004.1(SEQ ID NO:24；SEQ ID NO:7)
结构beta-S-ARCA(D1)-replicase-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(S1S2全长蛋白，序列变体)的病毒刺突蛋白(S蛋白)
RBS004.2(SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:7)
结构beta-S-ARCA(D1)-replicase-S1S2-PP-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(S1S2全长蛋白，序列变体)的病毒刺突蛋白(S蛋白)
BNT162c1；RBS004.3(SEQ ID NO:26；SEQ ID NO:5)
结构beta-S-ARCA(D1)-replicase-RBD-GS-Fibritin-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))的病毒刺突蛋白(S蛋白)
RBS004.4(SEQ ID NO:27；SEQ ID NO:28)
结构beta-S-ARCA(D1)-replicase-RBD-GS-Fibritin-TM-FI-A30L70
编码的抗原SARS-CoV-2(部分序列，S1S2蛋白的受体结合结构域(RBD))的病毒刺突蛋白(S蛋白)
此外，分泌信号肽(sec)可以优选地以sec翻译为N末端标签的方式与抗原编码区融合。在一个实施方案中，sec对应于S蛋白的分泌信号肽。编码主要由氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列(如通常用于融合蛋白)可以用作GS/接头。
在一个实施方案中，编码抗原(例如肿瘤抗原或疫苗抗原)的RNA(优选mRNA)在被处理以提供抗原的受试者的细胞中表达。在一个实施方案中，RNA在受试者的细胞中瞬时表达。在一个实施方案中，RNA是在体外转录的。在一个实施方案中，抗原的表达在细胞表面。在一个实施方案中，抗原在MHC的背景下表达和呈递。在一个实施方案中，抗原的表达是进入细胞外空间，即分泌抗原。
抗原分子或其加工产物，例如其片段，可以与免疫效应细胞携带的抗原受体如BCR或TCR结合，或与抗体结合。
根据本发明，通过给药编码肽和蛋白抗原的RNA(如mRNA)而提供给受试者肽和蛋白抗原，其中所述抗原是疫苗抗原，优选在提供所述肽或蛋白抗原的受试者中诱导免疫应答，例如体液和/或细胞免疫应答。所述免疫应答优选针对靶抗原。因此，疫苗抗原可以包含靶抗原、其变体或其片段在一个实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上等同于靶抗原。在本发明的上下文中，术语“抗原片段”或“抗原变体”是指导致诱导免疫应答的制剂，所述免疫应答靶向所述抗原，即靶抗原。因此，疫苗抗原可以对应于或可以包含靶抗原，可以对应于或可以包含靶抗原的片段，或者可以对应于或者可以包含与靶抗原或其片段同源的抗原。因此，根据本发明，疫苗抗原可以包含靶抗原的免疫原性片段或与靶抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本发明的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及能够诱导针对靶抗原的免疫应答的抗原的片段。所述疫苗抗原可以是重组抗原。
术语“免疫等效”是指免疫等效分子，如免疫等效氨基酸序列，表现出相同或基本相同的免疫性质和/或发挥相同或基本上相同的免疫作用，例如就免疫作用的类型而言。在本发明的上下文中，关于用于免疫的抗原或抗原变体的免疫作用或性质，优选使用术语“免疫等效”。例如，如果所述氨基酸序列当暴露于受试者的免疫系统时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫应答，则所述氨基酸序列在免疫学上等同于参考氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明中使用的RNA(优选mRNA)是非免疫原性的。可以根据本发明给药编码免疫刺激剂的RNA以提供佐剂效果。编码免疫刺激剂的RNA可以是标准RNA或非免疫原性RNA。
如本文所用，术语“非免疫原性RNA”(如“非免疫原性mRNA”)是指在给药例如哺乳动物时不会诱导免疫系统的应答，或诱导比不同之处仅在于未经修饰和处理以使其成为非免疫原性的相同RNA诱导的应答较弱的应答，即比标准RNA(stdRNA)诱导的应答弱。在一个优选的实施方案中，非免疫原性RNA，在本文中也称为修饰的RNA(modRNA)，是通过将抑制RNA介导的先天免疫受体活化的修饰核苷掺入RNA中并去除双链RNA(dsRNA)而变得非免疫原性。
为了通过掺入修饰的核苷使非免疫原性RNA(尤其是mRNA)非免疫原性，可以使用任何修饰的核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性即可。特别优选的是抑制RNA介导的先天免疫受体活化的修饰核苷。在一个实施方案中，修饰的核苷包含一个或多个尿苷用包含修饰的核碱基的核苷置换。在一个实施方案中，修饰的核碱基是修饰的尿嘧啶。在一个实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷选自：3-甲基尿苷(m3U)、5-甲氧基尿苷(mo5U)、5-氮杂尿苷、6-氮杂尿苷、2-硫代-5-氮杂尿苷、2-硫代尿苷(s2U)、4-硫代尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基尿苷、5-卤代尿苷(例如，5-碘代尿苷或者5-溴代尿苷)、尿苷-5-氧乙酸(cmo5U)、尿苷-5-氧乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基尿苷(cm5U)、1-羧甲基假尿苷、5-羧基羟甲基尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基尿苷(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基尿苷(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基尿苷、1-丙炔基假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代假尿苷)、5-甲基-2-硫代尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基假尿苷、3-甲基假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基假尿苷、1-甲基-1-去氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-去氮杂假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基二氢尿苷(m5D)、2-硫代二氢尿苷、2-硫代二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代尿苷、4-甲氧基假尿苷、4-甲氧基-2-硫代假尿苷、N1-甲基假尿苷、3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代尿苷(inm5s2U)、α-硫代尿苷、2’-O-甲基尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基尿苷(m5Um)、2’-O-甲基假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2’-O-甲基尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基尿苷(inm5Um)、1-硫代尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。在一个特别优选的实施方案中，包含修饰的核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，特别是N1-甲基-假尿苷。
在一个实施方案中，用包含修饰的核碱基的核苷置换一个或多个尿苷包括置换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。
在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(IVT)合成RNA(优选mRNA)期间，由于所述酶的非常规活性，产生了大量的异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并激活效应子酶，从而抑制蛋白合成。dsRNA可以例如通过使用无孔或多孔C-18聚苯乙烯二乙烯基苯(PS-DVB)基质的离子对反相HPLC从诸如IVT RNA的RNA中去除。或者，可以使用使用特异性水解dsRNA但不水解ssRNA的大肠杆菌RNaseIII的基于酶的方法，从而从IVT RNA制剂中消除dsRNA污染物。此外，dsRNA可以通过使用纤维素材料与ssRNA分离。在一个实施方案中，将RNA制剂与纤维素材料接触，并且在允许dsRNA与纤维素材料结合而不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件下将ssRNA与纤维材料分离。用于提供ssRNA的合适方法公开于例如WO2017/1822524中。
正如本文所用的术语，“去除”或“消除”是指将第一物质群体(如非免疫原性RNA)与第二物质群体(例如dsRNA)临近性分离的特征，其中第一物质群体非必须没有第二物质，并且第二物质的群体非必须没有第一物质。然而，与第一和第二物质的未分离的混合物相比，以去除第二物质群体为特征的第一物质群体具有可测量的较低含量的第二物质。
在一个实施方案中，从非免疫原性RNA中去除dsRNA(尤其是mRNA)包括去除dsRNA，使得非免疫原RNA组合物中少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.3％或少于0.1％的RNA是dsRNA。在一个实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)组合物包含单链核苷修饰的RNA的纯化制剂。例如，在一些实施方案中，单链核苷修饰的RNA(尤其是mRNA)的纯化制剂基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，纯化的制剂相对于所有其他核酸分子(DNA、dsRNA等)其中至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少99.9％是单链核苷修饰的RNA。
在一个实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)在细胞中比具有相同序列的标准RNA更有效地翻译。在一个实施方案中，翻译相对于其未修饰的对应物增强2倍。在一个实施方案中，翻译增强3倍。在一个实施方案中，翻译增强4倍。在一个实施方案中，翻译增强5倍。在一个实施方案中，翻译增强6倍。在一个实施方案中，翻译增强7倍。在一个实施方案中，翻译增强8倍。在一个实施方案中，翻译增强9倍。在一个实施方案中，翻译增强10倍。在一个实施方案中，翻译增强15倍。在一个实施方案中，翻译增强20倍。在一个实施方案中，翻译增强50倍。在一个实施方案中，翻译增强100倍。在一个实施方案中，翻译增强200倍。在一个实施方案中，翻译增强500倍。在一个实施方案中，翻译增强1000倍。在一个实施方案中，翻译增强2000倍。在一个实施方案中，所述倍数是10-1000倍。在一个实施方案中，所述倍数是10-100倍。在一个实施方案中，所述倍数是10-200倍。在一个实施方案中，所述倍数是10-300倍。在一个实施方案中，所述倍数是10-500倍。在一个实施方案中，所述倍数是20-1000倍。在一个实施方案中，所述倍数是30-1000倍。在一个实施方案中，所述倍数是50-1000倍。在一个实施方案中，所述倍数是100-1000倍。在一个实施方案中，所述倍数是200-1000倍。在一个实施方案中，翻译增强任何其他显著量或量的范围。
在一个实施方案中，所述非免疫原性RNA(尤其是mRNA)表现出比具有相同序列的标准RNA显著更低的先天免疫原性。在一个实施方案中，所述非免疫原性RNA(尤其是mRNA)表现出比其未修饰的对应物少2倍的先天免疫应答。在一个实施方案中，先天免疫原性降低3倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低4倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低5倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低6倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低7倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低8倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低9倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低10倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低15倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低20倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低50倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低100倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低200倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低500倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低1000倍。在一个实施方案中，先天免疫原性降低2000倍。
术语“表现出明显较少的先天免疫原性”是指先天免疫原性的可检测的减少。在一个实施方案中，所述术语是指这样的减少，即由此可以在不触发可检测的先天免疫应答的情况下给药有效量的非免疫原性RNA(尤其是mRNA)。在一个实施方案中，所述术语指的是这样的减少，即由此可以重复给药非免疫原性RNA(尤其是mRNA)，而不会引发足以可检测地降低由非免疫原性RNA编码的蛋白的产生的先天免疫应答。在一个实施方案中，所述减少使得非免疫原性RNA(尤其是mRNA)可以重复给药，而不会引发足以消除由非免疫原性RNA编码的蛋白的可检测产生的先天免疫应答。
“免疫原性”是指RNA等外来物质在人体或其他动物体内引发免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统中相对非特异性和即时性的组成部分。它是脊椎动物免疫系统和适应性免疫系统的两个主要组成部分之一。
如本文所用，“内源性”是指来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生的任何物质。
如本文所用，术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外引入或在其外部产生的任何物质。
本文中使用的术语“表达”定义为特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指将两个或多个元件、组件或结构域结合在一起。
脂质纳米颗粒
先前已经描述了不同类型的含RNA颗粒适合于以颗粒形式递送RNA(参见例如，Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒RNA递送载体，RNA的纳米颗粒封装在物理上保护RNA免受降解，并且根据特定的化学性质，可以有助于细胞摄取和内体逃逸。
带正电荷的分子(如聚合物和脂质)与带负电荷的核酸之间的静电相互作用参与颗粒的形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。
在本发明的上下文中，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体，特别是形成颗粒的化合物。优选地，颗粒含有由一种或多种类型的两亲物质(例如，两亲脂质、两亲聚合物和/或两亲蛋白/多肽)制成的包膜(例如，一层或多层或薄片)。在这种情况下，“两亲物质”的表述意味着所述物质同时具有亲水性和亲脂性。所述包膜还可以包含不必是两亲性的其他物质(例如，其他脂质和/或其他聚合物)。因此所述颗粒可以是单层或多层结构，其中构成所述一层或多层或薄片的物质包括一种或多种类型的两亲物质(特别选自两亲性脂质、两亲性聚合物和/或两亲性蛋白/多肽)，其任选与不必是两亲性的其他物质(例如，其他脂质和/或其他聚合物)组合。在一个实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米规格的结构，例如微米或纳米规格的紧凑结构。在这方面，术语“微米规格是指颗粒的所有三个外部维度都在微米级，即在1到5μm之间。根据本发明，术语“颗粒”包括脂蛋白颗粒(LPX)、脂质纳米颗粒(LNP)、多聚复合物(polyplex)颗粒、脂质多聚复合物(lipopolyplex)颗粒、病毒样颗粒(VLP)，及其混合物(例如，两种或多种颗粒类型的混合物，例如LPX和VLP的混合物或LNP和VLP混合物)。
“核酸颗粒”可用于将核酸递送至相关的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。核酸颗粒可由至少一种阳离子或阳离子可电离脂质或脂质样物质、至少一种阳离子聚合物如鱼精蛋白或其混合物和核酸形成。核酸颗粒包括基于脂质纳米颗粒(LNP)和基于脂质复合物(LPX)的制剂。
在不受任何理论约束的情况下，认为阳离子或阳离子可电离脂质或脂质样物质和/或阳离子聚合物与核酸组合在一起形成聚集体，并且这种聚集体导致胶体稳定的颗粒。
在一个实施方案中，本文所述的颗粒除了阳离子可电离脂质之外进一步包含至少一种脂质或脂质样物质。
在一些实施方案中，核酸颗粒(特别是RNA颗粒，例如RNA-LNP(例如，mRNA颗粒，如mRNA-LNP))包含一种以上类型的核酸分子，其中核酸分子的分子参数可以彼此相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构元件，例如分子结构、加帽、编码区域或其他特征。
如在本发明中所用，“纳米颗粒”是指包含本文所述的核酸(特别是mRNA)和至少一种阳离子脂质的颗粒，其中颗粒的所有三个外部维度都是纳米级的，即至少约1nm且低于约1000nm(优选地，在10nm和990nm之间，例如在15nm和900nm之间，在20nm和800nm之间，30nm和700nm之间，40nm和600nm之间，或50nm和500nm之间)。优选地，最长轴和最短轴没有显著差异。优选地，颗粒的大小是指其直径。
本文所述的核酸颗粒(尤其是RNALNP)可呈现出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或小于约0.05的多分散性指数(PDI)。例如，核酸颗粒可以呈现出在约0.01至约0.4或约0.1至约0.3范围内的多分散性指数。
在本发明的上下文中，术语“脂质复合物(lipoplex)颗粒”涉及含有本文所述的两亲性脂质、特别是阳离子两亲性脂质和核酸(特别是RNA如mRNA)的颗粒。带正电的脂质体(由一种或多种两亲性脂质、特别是阳离子两亲性脂类制成)和带负电的核酸(特别是RNA，如mRNA)之间的静电相互作用导致核酸-脂质复合物颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子两亲性脂质如DOTMA和另外的脂质如DOPE合成。在一个实施方案中，核酸(特别是RNA如mRNA)脂质复合物颗粒是纳米颗粒。
术语“脂质纳米颗粒”涉及纳米规格的含脂质颗粒。
在本发明的上下文中，术语“多聚复合物(polyplex)颗粒”涉及含有本文所述的两亲性聚合物、特别是阳离子两亲性聚合物子和核酸(特别是RNA，例如mRNA)的颗粒。带正电的阳离子两亲性聚合物和带负电的核酸(尤其是RNA，如mRNA)之间的静电相互作用导致核酸多聚复合物颗粒的复合和自发形成。适用于制备多聚复合物颗粒的带正电荷的两亲性聚合物包括鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚L-赖氨酸、聚L-精氨酸和组蛋白。在一个实施方案中，核酸(特别是RNA如mRNA)多聚复合物颗粒是纳米颗粒。
术语“脂质多聚复合物(lipopolyplex)颗粒”涉及含有本文所述的两亲性脂质(特别是阳离子两亲性脂类)、本文所述两亲性聚合物(特别是阳离子两亲性聚合物)和本文所述核酸(特别是RNA如mRNA)的颗粒。在一个实施方案中，核酸(特别是RNA如mRNA)脂质多聚复合物颗粒是纳米颗粒。
术语“病毒样颗粒”(在本文缩写为VLP)是指与病毒非常相似的分子，但不含有所述病毒的任何遗传物质，因此不具有感染性。优选地，VLP含有如本文所述的核酸(优选RNA)，所述核酸(优选RNA)与VLP衍生自其中的病毒异源。VLP可以通过病毒结构蛋白的单独表达合成，然后可以自组装成病毒样结构。在一个实施方案中，来自不同病毒的结构衣壳蛋白的组合可用于产生重组VLP。VLP可以由多种病毒家族的组分产生，包括乙型肝炎病毒(HBV)(小的HBV衍生的表面抗原(HBsAg))、细小病毒科(例如，腺相关病毒)、乳头瘤病毒科(例如，HPV)、逆转录病毒科(例如，HIV)、黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)和噬菌体(例如，Qβ，AP205)。
术语“含核酸颗粒”涉及如本文所述的与核酸(特别是RNA如mRNA)结合的颗粒。在这方面，核酸(特别是RNA，例如mRNA)可以粘附到颗粒的外表面(表面核酸(特别是表面RNA，例如表面mRNA))和/或可以包含在颗粒中(包封的核酸(特别是包封的RNA，例如包封的mRNA))。
在一个实施方案中，在本发明的方法和用途中使用的颗粒具有在约10至约2000nm范围内的尺寸(优选直径，即半径的2倍，例如回转半径(Rg)值的两倍或流体动力学半径的2倍)，如至少约15nm(优选至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm、或至少约100nm)和/或至多1900nm(优选至多约1900nm、至多约1800nm、至多约1700nm、至多约1600nm、至多约1500nm、至多约1400nm、至多约1300nm、至多约1200nm、至多约1100nm、至多约1000nm、至多约950nm、至多约900nm、至多约850nm、至多约800nm、至多约750nm、至多约700nm、至多约650nm、至多约600nm、至多约550nm、或至多约500nm)，优选在约20至约1500nm范围，如约30至约1200nm、约40至约1100nm、约50至约1000nm、约60至约900nm、约70至800nm、约80至700nm、约90至600nm、或约50至500nm或约100至500nm，如在10至1000nm、15至500nm、20至450nm、25至400nm、30至350nm、40至300nm、50至250nm、60至200nm、或70至150nm范围。
关于RNA脂质颗粒(特别是RNALNP，例如mRNA LNP)，N/P比给出脂质中的氮基团与RNA中的磷酸基团的数量的比。它与电荷比有关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电，而磷酸基团带负电。在存在电荷平衡的情况中，N/P比取决于pH。脂质制剂通常以大于4至12的N/P比形成，因为认为带正电荷的纳米颗粒有利于转染。在这种情况下，认为RNA与纳米颗粒完全结合。
本文所述的核酸颗粒(特别是RNALNP，例如mRNALNP)可以使用广泛的方法制备，所述方法可以包括从至少一种阳离子或阳离子可电离脂质和/或至少一种阳离子聚合物中获得胶体，并将所述胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。
如本文所用，术语“胶体”涉及一种均匀混合物，其中分散的颗粒不会沉淀。所述混合物中的不溶性颗粒是微观的，颗粒尺寸在1至1000纳米之间。所述混合物可以称为胶体或胶体悬浮液。有时，术语“胶体”仅指混合物中的颗粒，而不是整个悬浮液。
为了制备包含至少一种阳离子或阳离子可电离脂质和/或至少一种阳离子聚合物的胶体，本文可应用常规用于制备脂质体囊泡的方法并适当改编。制备脂质体囊泡的最常用方法共有以下基本阶段：(i)脂质在有机溶剂中的溶解，(ii)所得溶液的干燥，以及(iii)干燥脂质的水合(使用各种水相介质)。
在膜水合法中，首先将脂质溶解在合适的有机溶剂中，然后干燥，在烧瓶底部形成薄膜。使用合适的水相介质将所获得的脂质膜进行水合以产生脂质体分散体。此外，所述方法可以包括额外的缩小尺寸的步骤。
反相蒸发是制备脂质体囊泡的膜水合的替代方法，其涉及在水相和含有脂质的有机相之间形成油包水乳液。为了进行系统均化需要对所述混合物进行短暂的超声处理。在减压下去除有机相产生乳白色凝胶，所述凝胶随后转变为脂质体悬浮液。
术语“乙醇注射技术”是指通过针头将包含脂质的乙醇溶液快速注入水溶液中的过程。这种作用使脂质分散在整个溶液中，并促进脂质结构的形成，例如脂质囊泡的形成，如脂质体的形成。通常，本文所述的核酸(特别是RNA如mRNA)脂质复合物颗粒可通过将核酸(尤其是RNA，如mRNA)加入胶体脂质体分散体中而获得。使用乙醇注射技术，在一个实施方案中，如下所述形成这种胶体脂质体分散体：在搅拌下将包含脂质(例如阳离子可电离脂质和另外的脂质)的乙醇溶液注入水溶液中。在一个实施方案中，本文所述的核酸(尤其是RNA，如mRNA)脂质复合物颗粒可在没有挤出步骤的情况下获得。
术语“挤出”是指产生具有固定横截面轮廓的颗粒。特别地，其指的是颗粒的尺寸缩小，从而迫使颗粒通过具有限定孔径的过滤器。
根据本发明，也可以使用具有无有机溶剂特性的其他方法来制备胶体。
LNP通常包含四种组分：可电离的阳离子脂质、中性脂质(如磷脂)、类固醇(如胆固醇)和聚合物缀合脂质。每种组分都负责有效载荷保护，并使得可以进行有效的细胞内递送。LNP可以通过将溶解在乙醇中的脂质与含水缓冲液中的核酸快速混合来制备。
先前已经描述了不同类型的含核酸颗粒适合于以颗粒形式递送核酸(参见例如，Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒核酸递送载体，核酸的纳米颗粒包封在物理上保护核酸免受降解，并且根据特定的化学性质，可以有助于细胞摄取和内体逃逸。
在一个优选实施方案中，如本文所述包含RNA和至少一种阳离子可电离脂质的LNP进一步包含一种或多种其他脂质。
在一个实施方案中，通过以下步骤制备如本文所述包含RNA和至少一种阳离子可电离脂质的LNP：(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；(b)制备乙醇溶液，其包含所述阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质；(c)将在(a)中制备的RNA溶液与在(b)中制备的乙醇溶液混合，从而制备包含分散在包含第一缓冲系统的第一水相中的LNP的第一中间制剂；和(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤在(c)中制备的第一中间制剂，从而制备包含分散在包含最终缓冲系统的最终水相中的LNP的制剂。在步骤(c)之后，可以进行选自稀释和过滤的一个或多个步骤，例如切向流过滤或渗滤。在一个实施方案中，第一缓冲系统不同于最终缓冲系统。在另一个实施方案中，第一缓冲系统和最终缓冲系统是相同的。
在另一个实施方案中，如本文所述的包含RNA和至少一种阳离子可电离脂质的LNP是通过以下步骤制备的：(a’)在水相中制备阳离子可电离脂质与(如果存在的话)一种或多种其他脂质的脂质体或胶体制剂；(b’)制备含有水和缓冲系统的RNA溶液；和(c’)将根据(a’)制备的脂质体或胶体制剂与根据(b’)制备的mRNA溶液混合。在步骤(c’)之后，可以进行选自稀释和过滤的一个或多个步骤，例如切向流过滤。
本发明描述了包含颗粒的组合物，所述颗粒包含RNA(尤其是包含RNA的LNP)和至少一种与所述RNA结合形成核酸颗粒的阳离子可电离脂质。所述RNA颗粒可包含通过与所述颗粒的非共价相互作用以不同形式复合的RNA。本文所述的颗粒不是病毒颗粒，特别不是感染性病毒颗粒，即其不能病毒性地感染细胞。
合适的阳离子可电离脂质是那些形成核酸颗粒的脂质，并且被涵盖在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”定义下。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸结合形成核酸颗粒的任何组分。这样的组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。
阳离子可电离脂质
本文所述的核酸颗粒(特别是RNALNP)包含至少一种阳离子可电离脂质作为颗粒形成剂。本文预期使用的阳离子可电离脂质包括任何能够静电结合核酸的阳离子可电离脂质或脂质样物质。在一个实施方案中，本文预期使用的阳离子可电离脂质可以与核酸结合，例如通过与核酸形成复合物或形成核酸被包封或包囊在之中的囊泡。
如本文所用，“阳离子脂质”或“阳离子脂质样物质”是指具有净正电荷的脂质或脂质样物质。阳离子脂质或脂质样物质通过静电相互作用结合带负电的核酸。通常，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如固醇、酰基链、二酰基链或多酰基链，并且所述脂质的头基通常携带正电荷。
在某些实施方案中，阳离子脂质或脂质样物质仅在特定pH、特别是酸性pH下具有净正电荷，而其在不同的、优选更高的pH例如生理pH下优选无净正电荷，优选无电荷，即为中性。与在生理pH下保持阳离子的颗粒相比，认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强功效。
如本文所用，“阳离子可电离脂质”是指具有净正电荷或中性(即非永久阳离子的脂质)的脂质或脂质样物质。因此，取决于溶解阳离子可电离脂质的组合物的pH，所述阳离子可电离脂质是带正电荷的或中性的。
在一个实施方案中，所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括优选在生理条件下至少一个带正电荷或能够质子化的氮原子(N)。
阳离子可电离脂质的实例公开于例如WO 2016/176330和WO 2018/078053中。在一些实施方案中，所述阳离子可电离脂质具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1和L2另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8环亚烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x是0、1或2。
在式(I)的一些前述实施方案中，所述脂质具有以下结构(IA)或(IB)：
其中：
A是3-8元环烷基或环亚烷基基团；
R6在每次出现独立地是H、OH或C1-C24烷基；
n是1至15之间的整数。
在式(I)的一些前述实施方案中，所述脂质具有结构(IA)，而在其他实施方案中，所述脂质具有结构(IB)。
在式(I)的其他实施方案中，所述脂质具有以下结构(IC)或(ID)之一：
其中y和z独立地是1至12之间的整数。
在式(I)的任何前述实施方案中，L1和L2之一是-O(C＝O)-。例如，在一些实施例中，每个L1和L2是-O(C＝O)-。在前述任何一些不同实施方案中，每个L1和L2独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，每个L1和L2是-(C＝O)O-。
在式(I)的一些不同实施方案中，所述脂质具有以下结构(IE)或(IF)之一：
在式(I)的一些前述实施方案中，所述脂质具有以下结构(IG)、(IH)、(IJ)或(IK)之一：
在式(I)的一些前述实施方案中，n是2至12的整数，例如2至8或2至4。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。
在式(I)的前述实施方案中的一些其他实施方案中，每个y和z独立地是2至10的整数。例如，在一些实施方案中，每个y和z独立地是从4至9或从4至6的整数。
在式(I)的一些前述实施方案中，R6是H。在前述实施方案的其他实施方案中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方案中，R6是OH。
在式(I)的一些实施方案中，G3是未取代的。在其他实施方案中，G3是取代的。在各种不同的实施方案中，G3是直链C1-C24亚烷基或直链C2-C24亚烯基。
在式(I)的一些其他前述实施方案中，R1或R2或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；和
a是2至12的整数，
其中每个R7a、R7b和a加以选择，由此每个R1和R2独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5至9的整数或8至12的整数。
在式(I)的前述实施方案中的一些实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案，R7a在每次出现时均是H。在前述的其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(I)的不同实施方案中，R1或R2或两者具有以下结构之一：
在式(I)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在各种不同的实施方案中，式(I)的阳离子脂质具有下述结构之一。
式(I)的代表性化合物。
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在各种不同的实施方案中，所述阳离子可电离脂质具有下表中列出的结构之一。
在各种不同的实施方案中，阳离子可电离脂质选自N,N-二甲基-2,3-二油氧基丙胺(DODMA)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)，三十七烷基-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)和4-((二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)氨基)氧基)-N,N-二甲基-4-氧代丁基-1-胺(DPL-14)。
阳离子可电离脂质的其他实例包括但不限于3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(DC-Chol)，1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷，1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)，1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)，1,2-二亚麻基氧基(dilinolenyloxy)-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)，双十八烷基氨基甘氨酰精胺(DOGS)，3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁基-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)，2-[5’-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9’,12’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)，N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺(DMOBA)，1,2-N,N’-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)，2,3-二亚油酰氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)，1,2-N,N’-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)，1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)，2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)，2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)，三十七烷基(heptatriaconta)-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)，2-({8-[(3β)-胆固醇-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烯-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)，1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DMDAP)，1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)，N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰氨基)乙基]-3,4-二[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)，二((Z)-壬-2-烯-1-基)-8,8'-((((2(二甲基氨基)乙基)硫基)羰基)氮杂二基)二辛酸酯(ATX)，N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)丙-1-胺(DLDMA)，N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙-1-胺(DMDMA)，二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)，N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙氨基)丙酰胺(lipidoid 98N12-5)，1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoid C12-200)。
在一个优选的实施方案中，所述阳离子可电离脂质具有结构I-3。
在一些实施方案中，所述阳离子可电离脂质可占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约100mol％、约20mol％至约100mol％、约30mol％至约100mol％、约40mol％至约100mol％、或约50mol％至约100mol％。
在一个实施方案中，其中本文所述颗粒(特别是RNALNP)包含阳离子可电离脂质和一种或多种其他脂质，所述阳离子可电离脂质占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％。
在一个实施方案中，本文所述的颗粒(特别是RNALNP)包含40mol％至55mol％、40mol％至50mol％、41mol％至49mol％、41mol％至48mol％、42mol％至48mol％、43mol％至48mol％、44mol％至48mol％、45mol％至48mol％、46mol％至48mol％、47mol％至48mol％或47.2mol％至47.8mol％的阳离子可电离脂质。在一个实施方案中，所述颗粒(特别是RNALNP)包含约47.0mol％、47.1mol％、47.2mol％、47.3mol％、47.4mol％、47.5mol％、47.6mol％、47.7mol％、47.8mol％、47.9mol％或48.0mol％的阳离子可电离脂质。
其他脂质
本文所述的颗粒(特别是RNA LNP)还可以包含不同于阳离子可电离脂质的脂质或脂质样物质，即非阳离子脂质或脂质样物质(包括非阳离子可电离脂质或脂质样物质)。阴离子和中性脂质或脂质样物质在本文中统称为非阳离子脂质或脂质样物质。除了阳离子可电离脂质之外，通过添加其他疏水性部分(例如胆固醇和脂质)来优化核酸颗粒制剂可以增强颗粒稳定性和核酸递送效力。
术语“脂质”和“脂质样物质”在本文中被广泛定义为包含一个或多个疏水性部分或基团以及任选还包含一个或者多个亲水性部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也经常被表示为两亲物。脂质通常不易溶于水。在水相环境中，两亲性使分子能够自组装成组织结构和不同的相。其中一个相由脂质双层组成，因为它们存在于水相环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中。疏水性可以通过包含非极性基团来赋予，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和的脂族烃基以及被一个或多个芳基、脂环基团或杂环基团取代的这类基团。亲水基团可以包含极性和/或带电荷的基团，并且包括碳水化合物、磷酸盐、羧酸、硫酸盐、氨基、巯基、硝基、羟基和其他类似的基团。
如本文所用，术语“两亲性”是指同时具有极性部分和非极性部分的分子。通常，两亲性化合物有一个连接在疏水性长尾上的极性头基。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。此外，极性部分可以具有形式正电荷，或具有形式负电荷。或者，极性部分可以具有形式正电荷和负电荷二者，并且是两性离子或内盐。为了本发明的目的，两亲性化合物可以是但不限于一种或多种天然或非天然脂质和脂质样化合物。
术语“脂质样物质”、“脂质样化合物”或“脂质样分子”涉及在结构和/或功能上与脂质相关的物质，但在严格意义上可能不视为脂质。例如，所述术语包括能够形成两亲性层的化合物，因为它们存在于水相环境中的囊泡、多层/单层脂质体或膜中，并且包括表面活性剂或同时具有亲水和疏水部分的合成化合物。一般来说，所述术语指的是这样的分子，其包含具有不同结构组织的亲水性和疏水性部分，其与脂质的结构组织可以相似或可以不相似。如本文所用，术语“脂质”应解释为涵盖脂质和脂质样物质，除非本文另有说明或与上下文明确矛盾。
可包括在两亲性层中的两亲性化合物的具体实例包括但不限于磷脂、氨基脂质和鞘脂。
在某些实施方案中，两亲性化合物是脂质。“脂质”一词是指一组有机化合物，其特征是不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。通常，脂质可分为八类：脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮化合物(衍生自酮酯酰基亚基的缩合)、固醇脂质和异戊烯醇脂质(衍生自异戊二烯亚基的缩聚)。尽管“脂质”一词有时被用作脂肪的同义词，但脂肪是一种称为甘油三酯的脂质亚组。脂质还涵盖这样的分子，如脂肪酸及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯和磷脂)，以及类固醇，即含固醇的代谢产物，如胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的实例包括但不限于胆固烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆固醇基-2’-羟乙基醚、胆固醇基-4’-羟丁基醚、生育酚及其衍生物，及其混合物。
脂肪酸或脂肪酸残基是由末端为羧酸基团的烃链组成的一组多样化分子；这种排列赋予分子一个极性、亲水性末端和一个不溶于水的非极性、疏水性末端。碳链的长度通常在4到24个碳原子之间，可以是饱和的或不饱和的，并且可以连接到包含氧、卤素、氮和硫的官能团。如果脂肪酸含有双键，则可能存在顺式或反式几何异构现象，这会显着影响分子的构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，这是与链中更多双键复合(compounded)的效应。脂肪酸类别中的其他主要脂质类别是脂肪酯和脂肪酰胺。
甘油脂由单取代、双取代和三取代甘油组成，最著名的是甘油的脂肪酸三酯，称为甘油三酯。“三酰基甘油”一词有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基均被酯化，通常被不同的脂肪酸酯化。甘油脂的其他亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在一个或多个通过糖苷键连接到甘油的糖残基。
甘油磷脂是两亲性分子(含有疏水区和亲水区二者)，其含有一个甘油核心，通过酯键连接到两个脂肪酸衍生的“尾部”，并通过磷酸酯键连接到一个“头部”基团。甘油磷脂通常称为磷脂(虽然鞘磷脂也归类为磷脂)，其实例是磷脂酰胆碱(也称为PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。
鞘脂类是一个复杂的化合物家族，它们具有共同的结构特征，即鞘氨醇碱基(sphingoid base)骨架。哺乳动物中的主要鞘氨醇碱基通常称为鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱基)是具有酰胺连接的脂肪酸的鞘氨醇碱基衍生物的主要亚类。脂肪酸通常是饱和或单不饱和的，链长为16至26个碳原子。哺乳动物的主要磷酸鞘脂是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要含有神经酰胺磷酸乙醇胺，而真菌则含有植物神经酰胺磷酸肌醇和含甘露糖的头基。鞘糖脂是一个多样化的分子家族，由一个或多个糖残基通过糖苷键连接到鞘氨醇碱基组成。这些的实例是简单和复杂的鞘糖脂，如脑苷脂和神经节苷脂。
固醇类脂质，如胆固醇及其衍生物，或生育酚及其衍生物，与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。
糖脂描述了其中脂肪酸直接连接到糖骨架的化合物，形成与膜双层相容的结构。在糖脂中，单糖取代甘油脂和甘油磷脂中存在的甘油骨架。最熟知的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖的脂质A组分的酰化氨基葡萄糖前体。典型的脂质A分子是氨基葡萄糖的二糖，其衍生有多达七个脂肪酰基链。在大肠杆菌中为生长所需的最基本的脂多糖是Kdo2-脂质A，这是一种六酰化的氨基葡萄糖二糖，其被两个3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸(Kdo)残基糖基化。
聚酮化合物是通过经典酶以及与脂肪酸合酶具有相同机制特征的迭代和多模块酶聚合乙酰基和丙酰基亚基而合成的。它们包含大量来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的次生代谢产物和天然产物，具有很大的结构多样性。许多聚酮化合物是环状分子，其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他方式而进一步修饰。
根据本发明，脂质和脂质样物质可以是阳离子的、阴离子的或中性的。中性脂质或脂质样物质在选定的pH值下以不带电荷或中性两性离子的形式存在。
阳离子或阳离子可电离脂质和脂质样物质可用于静电结合RNA。阳离子可电离脂质和脂质样物质是优选仅在酸性pH下带正电荷的物质。与在生理pH下保持阳离子的颗粒相比，认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强功效。所述颗粒还可以包含非阳离子脂质或脂质样物质。阴离子和中性脂质或脂质样物质在本文中统称为非阳离子脂质或脂质样物质。除了可电离的/阳离子的脂质或脂质样物质外，通过添加其他疏水部分例如胆固醇和脂质来优化RNA颗粒制剂可增强颗粒稳定性，并可显着提高RNA递送的效力。
可以掺入一种或多种另外的脂质，其可能会或可能不会影响核酸颗粒的总电荷。在某些实施方案中，所述一种或多种另外的脂质是非阳离子脂质或脂质样物质。所述非阳离子脂质可包含例如一种或多种阴离子脂质和/或中性脂质。如本文所用，“阴离子脂质”是指在选定pH下带负电荷的任何脂质。如本文所用，“中性脂质”是指在选定pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的多种脂质种类中的任一种。
在某些实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNALNP)包含阳离子可电离脂质和一种或多种另外的脂质。
不希望受理论束缚，与所述一种或多种另外的脂质的量相比，所述阳离子可电离脂质的量可影响核酸颗粒的重要特征，例如所述核酸的电荷、颗粒尺寸、稳定性、组织选择性和生物活性。因此，在一些实施方案中，所述阳离子可电离脂质与一种或多种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。
在一个实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNALNP)中包含的一种或多种另外的脂质包括以下一种或多种脂质：中性脂质，类固醇，聚合物缀合脂质及其组合。
在一个实施方案中，一种或多种另外的脂质包括中性脂质，其是磷脂。优选地，所述磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。可以使用的具体磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这种磷脂的具体实例包括二酰磷脂酰胆碱，如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三碳酰磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)，及磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)、1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPG)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DPPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、N-棕榈酰基-D-赤型-鞘氨醇磷酰胆碱(SM)，以及进一步具有不同疏水链的磷脂酰乙醇胺脂质。在一个实施方案中，所述中性脂质选自DSPC、DOPC、DMPC、DPPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一个实施方案中，所述中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一个实施方案中，所述中性脂质是DSPC。
因此，在一个实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNALNP)包含阳离子可电离脂质和DSPC。
在一个实施方案中，中性脂质以5mol％至15mol％、7mol％至13mol％或9mol％至11mol％的浓度存在于本文所述的颗粒(特别是RNALNP)中。在一个实施方案中，中性脂质在本文所述颗粒(尤其是RNALNP)中存在的总脂质的约9.5mol％、10mol％或10.5mol％的浓度存在。
在一个实施方案中，所述类固醇是胆固醇。因此，在一个实施方案中，所述核酸颗粒(尤其是RNA LNP)包含阳离子可电离脂质和胆固醇。
在一个实施方案中，所述类固醇以30mol％至50mol％、35mol％至45mol％或38mol％至43mol％的浓度存在于颗粒(特别是RNA LNP)中。在一个实施方案中，类固醇以本文所述颗粒(尤其是RNA LNP)中存在的总脂质的约40mol％、41mol％、42mol％、43mol％、44mol％、45mol％或46mol％的浓度存在。
在某些优选的实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNA LNP)包含DSPC和胆固醇，优选以上述浓度。
在一些实施方案中，中性脂质(特别是一种或多种磷脂)和类固醇(特别是胆固醇)的组合浓度可占本文所述核酸颗粒(特别是RNA LNP)中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约0mol％至约80mol％、约0mol％至约70mol％、约0mol％至约60mol％、或约0mol％至约50mol％，如约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％。
在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸和脂质样物质的缀合物。
术语“聚乙二醇化脂质”是指同时包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的。在一个实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中R12和R13各自独立地是含有10至30个碳原子的直链或支链烷基或烯基链，其中所述烷基或烯基链任选被一个或多个酯键中断；w的平均值为30至60。在一个实施方案中，R12和R13各自独立地是含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在一个实施方案中，w具有从40到55的平均值范围。在一个实施方案中，平均w为约45。在一个实施方案中，R12和R13各自独立地是含有约14个碳原子的直链饱和烷基链，并且w具有约45的平均值。
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质是2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺/2-[2-(ω-甲氧基(聚乙二醇2000)乙氧基]-N,N-双十四烷基乙酰胺，例如具有以下结构：
在一个实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNA LNP)包含阳离子可电离脂质和聚乙二醇化脂质，例如如上所定义的聚乙二醇化脂质。
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质以存在于所述颗粒(特别是RNALNP)中总脂质的1mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至2.5mol％的浓度存在于颗粒(特别是RNALNP)中。
在一个实施方案中，所述聚合物缀合的脂质是聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，即包含聚肌氨酸(聚(N-甲基甘氨酸))的脂质或脂质样物质。聚肌氨酸可包含乙酰化(中性端基)或其他功能化端基。在RNA脂质颗粒的情况下，在一个实施方案中，聚肌氨酸与包含在颗粒中的非阳离子脂质或脂质样物质缀合，优选共价结合。
在某些实施方案中，聚肌氨酸的末端基团可以用一个或多个赋予某些特性的分子部分功能化，例如正电荷或负电荷，或将颗粒导向特定细胞类型、细胞集合或组织的靶向剂。
本领域已知多种合适的靶向剂。靶向剂的非限制性实例包括肽、蛋白、酶、核酸、脂肪酸、激素、抗体、碳水化合物、单糖、寡糖或多糖、肽聚糖、糖肽等。例如，可以使用与靶细胞表面上的抗原结合的多种不同物质中的任何一种。针对靶细胞表面抗原的抗体通常对所述靶表现出必要的特异性。除了抗体之外，还可以使用合适的免疫反应性片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2或scFv片段或单结构域抗体(例如骆驼VHH片段)。本领域已有许多适合用于形成靶向机制的抗体片段。类似地，靶细胞表面上任何受体的配体都可以适当地用作靶向剂。这些包括任何天然或合成的小分子或生物分子，其特异性结合在预期的靶细胞表面发现的细胞表面受体、蛋白或糖蛋白。
在某些实施方案中，所述聚肌氨酸包含2至200、2至190、2至180、2至170、2至160、2至150、2至140、2至130、2至120、2至110、2至100、2至90、2至80、2至70、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、5至70、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、10至80、或10至70个肌氨酸单位。
在某些实施方案中，所述聚肌氨酸包含以下通式(II)：
其中x是肌氨酸单元的数目。所述聚肌氨酸通过所述键之一可以连接到颗粒形成组分或疏水性组分。所述聚肌氨酸通过另一个键可以连接到H、亲水基团、可电离基团，或连接到接头以连接功能部分如靶向部分。
所述聚肌氨酸可以缀合、特别是共价结合或连接至任何颗粒形成组分，例如脂质或脂质样物质。所述聚肌氨酸-脂质缀合物是一种分子，其中聚肌氨酸缀合至本文所述的脂质，例如阳离子脂质或阳离子可电离脂质或另外的脂质。或者，聚肌氨酸与不同于阳离子可电离脂质或所述一种或多种另外的脂质的脂质或脂质样物质缀合。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物包含以下通式(IIa)：
其中R1和R2之一包含疏水基团，而另一个是H、亲水基团、可电离基团或任选包含靶向部分的官能团。在一个实施方案中，所述疏水基团包含直链或支链烷基或芳基，优选包含10至50、10至40或12至20个碳原子。在一个实施方案中，包含疏水基团的R1或R2包含连接到一个或多个直链或支链烷基的部分，例如杂原子，特别是N。
在某些实施方案中，聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物包含以下通式(IIb)：
其中R是H、亲水基团、可电离基团或任选包含靶向部分的官能团。
通式(IIa)和(IIb)中的符号“x”是指肌氨酸单元的数目并且可以是如本文所定义的数目。
在某些实施方案中，聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物是选自聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物和聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
通常，所述聚肌氨酸组分具有2至200、5至200、5至190、5至180、5至170、5至160、5至150、5至140、5至130、5至120、5至110、5至100、5至90、5至80、10至200、10至190、10至180、10至170、10至160、10至150、10至140、10至130、10至120、10至110、10至100、10至90、或10至80个肌氨酸单元。
因此，在一个实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNA LNP)包含阳离子可电离脂质和聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸和脂质样物质的缀合物，例如如上所定义的聚肌氨酸-脂质缀合物或聚肌氨酸和脂质样物质的缀合物。
在某些情况中，所述聚肌氨酸脂质缀合物可占本文所述核酸颗粒(特别是RNALNP)中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％。
在一些实施方案中，所述一种或多种另外的脂质包含以下组分之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合的脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合的脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物；或(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的脂质包含以下组分之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。
因此，在优选的实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNALNP)包含阳离子可电离脂质和以下脂质或脂质混合物之一：(1)中性脂质；(2)类固醇；(3)聚合物缀合的脂质；(4)中性脂质和类固醇的混合物；(5)中性脂质和聚合物缀合的脂质的混合物；(6)类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物；或(7)中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。在一个具体实施方案中，阳离子可电离脂质以40mol％至50mol％的浓度存在；所述中性脂质以5mol％至15mol％的浓度存在；所述类固醇以35mol％至45mol％的浓度存在；并且所述聚合物缀合的脂质以1mol％至10mol％的浓度存在，其中所述RNA包封在LNP内或与LNP结合。
在更优选的实施方案中，本文所述的核酸颗粒(尤其是RNA LNP)包含阳离子可电离脂质和以下脂质或脂质混合物之一：(1)磷脂；(2)胆固醇；(3)聚乙二醇化脂质；(4)磷脂和胆固醇的混合物；(5)磷脂和聚乙二醇化脂质的混合物；(6)胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物；或(7)磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质的混合物，优选各自具有上述浓度。在一个具体实施方案中，所述阳离子可电离脂质以40mol％至50mol％的浓度存在；所述磷脂以5mol％至15mol％的浓度存在；所述胆固醇以35mol％至45mol％的浓度存在；并且所述聚乙二醇化脂质以1mol％至10mol％的浓度存在，其中所述RNA包封在LNP内或与LNP结合。
N/P值优选为至少约4。在一些实施方案中，N/P值的范围为4至20、4至12、4至10、4至8或5至7。在一个实施方案中，N/P值是约6。
本文所述的LNP在一个实施方案中可具有约30nm至约200nm或约60nm至约120nm范围内的平均直径。
通常，本文所述的包含RNA的LNP(或“RNA LNP”)是可用于将RNA递送到相关的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的“RNA脂质颗粒”。RNA脂质颗粒通常由阳离子可电离脂质(例如具有结构I-3的脂质)和一种或多种另外的脂质形成，所述另外的脂质例如磷脂(例如DSPC)、类固醇(例如胆固醇或其类似物)和聚合物缀合的脂质(例如聚乙二醇化脂质或聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸和脂质样物质的缀合物)。
在不受任何理论束缚的情况下，认为所述阳离子可电离脂质和一种或多种另外的脂质与RNA组合在一起形成胶体稳定的颗粒，其中所述核酸与脂质基质结合。
在一些实施方案中，RNA脂质颗粒包含一种以上类型的RNA分子，其中所述RNA分子的分子参数可以彼此相似或不同，例如关于摩尔质量或基本结构元件，例如分子结构、加帽、编码区或其他特征。
在一些实施方案中，除了RNA之外，RNA脂质LNP(例如mRNA脂质LNP)还包含：(i)阳离子可电离脂质，其可占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％，(ii)中性脂质和/或类固醇(例如一种或多种的磷脂和/或胆固醇)，其可占所述颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约20mol％至约80mol％、约25mol％至约75mol％、约30mol％至约70mol％、约35mol％至约65mol％、或约40mol％至约60mol％，和(iii)聚合物缀合脂质(例如聚乙二醇化脂质，其可占所述颗粒中存在的总脂质的1mol％至10mol％、1mol％至5mol％、或1mol％至2.5mol％；或聚肌氨酸脂质缀合物，其可占所述颗粒中存在的总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％、或约2mol％至约5mol％)。
在某些实施方案中，所述中性脂质包括磷脂，占所述颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％。
在某些实施方案中，所述类固醇包括胆固醇或其衍生物，占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。
在某些优选的实施方案中，所述中性脂质和类固醇包含以下的混合物：(i)磷脂如DSPC占所述颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；和(ii)胆固醇或其衍生物如胆固醇占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。作为一个非限制性实例，包含磷脂和胆固醇的混合物的mRNA LNP可包含DSPC，其占所述颗粒中存在的总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％，和包含胆固醇，其占所述颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％。
在一些实施方案中，除了RNA之外，RNA脂质颗粒还包含：(i)阳离子可电离脂质(例如具有结构I-3的脂质)，其可占所述颗粒中存在的总脂质的10mol％至约80mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、约30mol％至约50mol％、约35mol％至约45mol％、或约40mol％，(ii)DSPC，其可占所述颗粒中总脂质的约5mol％至约50mol％、约5mol％至约45mol％、约5mol％至约40mol％、约5mol％至约35mol％、约5mol％至约30mol％、约5mol％至约25mol％、或约5mol％至约20mol％；(iii)胆固醇，其可占所述颗粒中总脂质的约10mol％至约80mol％、约10mol％至约70mol％、约15mol％至约65mol％、约20mol％至约60mol％、约25mol％至约55mol％、或约30mol％至约50mol％，和(iv)聚乙二醇化脂质，其可占所述颗粒中总脂质的1mol％至10mol％、1mol％至5mol％或1mol％至2.5mol％，或(iv’)聚肌氨酸脂质缀合物，其可占所述颗粒中总脂质的约0.2mol％至约50mol％、约0.25mol％至约30mol％、约0.5mol％至约25mol％、约0.75mol％至约25mol％、约1mol％至约25mol％、约1mol％至约20mol％、约1mol％至约15mol％、约1mol％至约10mol％、约1mol％至约5mol％、约1.5mol％至约25mol％、约1.5mol％至约20mol％、约1.5mol％至约15mol％、约1.5mol％至约10mol％、约1.5mol％至约5mol％、约2mol％至约25mol％、约2mol％至约20mol％、约2mol％至约15mol％、约2mol％至约10mol％或约2mol％至约5mol％。
在一个实施方案中，本文描述的RNA LNP的平均直径范围是约30nm至约1000nm、约30nm至约800nm、约30nm至约700nm、约30nm至约600nm、约30nm至约500nm、约30nm至约450nm、约30nm至约400nm、约30nm至约350nm、约30nm至约300nm、约30nm至约250nm、约30nm至约200nm、约30nm至约190nm、约30nm至约180nm、约30nm至约170nm、约30nm至约160nm、约30nm至约150nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm、约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约50nm至约190nm、约50nm至约180nm、约50nm至约170nm、约50nm至约160nm、或约50nm至约150nm。
在某些实施方案中，本文描述的RNA LNP的平均直径范围是约40nm至约800nm、约50nm至约700nm、约60nm至约600nm、约70nm至约500nm、约80nm至约400nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、或约200nm至约400nm。
本文所述的例如通过本文所述方法制备的RNA LNP，表现出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或约0.05或更小的多分散性指数。例如，RNA LNP可以表现出在约0.05至约0.2范围内的多分散性指数，例如约0.05至约0.1。
在本发明的某些实施方案中，本文所述的RNA LNP中的RNA的浓度为约2mg/l至约5g/l、约2mg/l至约2g/l、约5mg/l至约2g/l、约10mg/l至约1g/l、约50mg/l至约0.5g/l或约100mg/l至约0.5g/l。在特定的实施方案中，所述RNA浓度为从约5mg/l至约150mg/l、约0.005mg/mL至约0.09mg/mL、约0.005mg/mL至约0.08mg/mL、约0.005mg/mL至约0.07mg/mL、约0.005mg/mL至约0.06mg/mL或约0.005mg/mL至约0.05mg/mL
包含RNA颗粒的组合物/制剂
本文所述的组合物/制剂包含RNA LNP，优选多个RNA LNP。术语“多个RNA LNP”或“多个RNA脂质颗粒”是指一定数量的颗粒的群体。在某些实施方案中，所述术语指的是超过10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1016、1017、1018、1019、1020、1021、1022或1023或更多颗粒的群体。
在一个实施方案中，本文所述的组合物/制剂包含尺寸为至少10μm的颗粒，其量小于4000/ml，优选至多3500/ml，例如至多3400/ml、至多3300/ml、至多3200/ml、至多3100/ml或至多3000/ml。
本领域技术人员将清楚的是，多个颗粒可以包括前述范围的任何部分或其中的任何范围。
在一些实施方案中，本文所述的组合物是液体或固体，其中固体是指冷冻形式。
本发明人出人意料地发现，在包含LNP的组合物中使用基于Tris、Bis-Tris甲烷或TEA、特别是Tris的缓冲液代替PBS抑制了非常稳定的折叠形式RNA的形成。
此外，本申请证实了，将包含(i)浓度为50mM的缓冲系统和(ii)包含阳离子可电离脂质和RNA的LNP的组合物进行冻融循环会导致RNA完整性的显著损失，而令人惊讶的是，通过简单地降低所述组合物中缓冲物质的浓度，可以在冻融循环后获得具有改进的RNA完整性的RNA LNP组合物。因此，权利要求的组合物提供了改进的稳定性，可以在符合制药实践中常规技术的温度范围内储存，并提供了即用型制剂。
此外，令人惊奇地发现，在RNA LNP组合物的水相中存在某些多价阴离子(特别是无机磷酸盐阴离子、柠檬酸盐阴离子和EDTA的阴离子，以及任选无机硫酸盐阴离子、碳酸盐阴离子、有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子)，可导致在所述组合物在冷冻然后解冻时颗粒尺寸增加(当对所述组合物进行至少一次冷冻-解冻循环时)，并且包含如本文公开的基于Tris、Bis-Tris-甲烷或TEA的缓冲液且其水相基本上不含此类二价和/或多价阴离子的RNA组合物可以冷冻和解冻而不增加颗粒尺寸。
因此，根据本发明，本文所述的组合物的水相基本上不含无机磷酸盐阴离子、基本上不含有柠檬酸盐阴离子和基本上不含EDTA的阴离子，并且优选基本上不包含硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或者有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子。在一个实施方案中，本文所述组合物的水相优选基本上不含无机磷酸盐阴离子、柠檬酸盐阴离子、EDTA的阴离子、无机硫酸盐阴离子、碳酸盐阴离子、有机二元酸阴离子和有机多元酸阴离子。
如本文所用，“基本上不含X”的表述是指混合物(如本文所述组合物或制剂的水相)不含X，以这种方式是实际可行的。例如如果混合物基本上不含X，则所述混合物中X的量以所述混合物总重量计可以小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。
因此，如果本文所述的RNA LNP组合物的水相基本上不含无机磷酸盐阴离子，则优选所述RNALNP组合物的水相中无机磷酸盐阴离子的量以所述水相总重量计小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。
如果本文所述的RNA LNP组合物的水相基本上不含柠檬酸盐阴离子，则优选所述RNALNP组合物的水相中柠檬酸盐阴离子的量以所述水相总重量计小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。
如果本文所述的RNA LNP组合物的水相基本上不含EDTA的阴离子，优选在RNA LNP组合物的水相中EDTA的阴离子的量以所述水相总重量计小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.00重量5％、小于0.001重量％)。
如果本文所述的RNA LNP组合物的水相基本上不含无机硫酸盐阴离子，则优选所述RNA LNP组合物的水相中无机硫酸盐阴离子的量以所述水相总重量计小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。
如果本文所述的RNA LNP组合物的水相基本上不含碳酸盐阴离子，则优选所述RNALNP组合物的水相中碳酸盐阴离子的量以所述水相总重量计小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。
如果本文所述的RNA LNP组合物的水相基本上不含有机二元酸阴离子，则优选所述RNA LNP组合物的水相中有机二元酸阴离子的量以所述水相总重量计小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。
如果本文所述的RNA LNP组合物的水相基本上不含有机多元酸阴离子，则优选所述RNA LNP组合物的水相中有机多元酸阴离子的量以所述水相总重量计小于1重量％(例如，小于0.5重量％、小于0.4重量％、小于0.3重量％、小于0.2重量％、小于0.1重量％、小于0.09重量％、小于0.08重量％、小于0.07重量％、小于0.06重量％、小于0.05重量％、小于0.04重量％、小于0.03重量％、小于0.02重量％、小于0.01重量％、小于0.005重量％、小于0.001重量％)。
如本文所用，“无机磷酸盐阴离子”是指含有无机磷酸盐阴离子的任何化合物，当其溶解在水性介质中时释放无机磷酸盐阴离子。含有无机磷酸盐阴离子并且当溶解在水性介质中时释放无机磷酸盐阴离子的化合物的实例包括磷酸和磷酸盐、磷酸的缀合物以及这种缀合物的盐，如二磷酸盐、三磷酸盐等。优选地，“无机磷酸盐阴离子”的表述不包括磷酸与一种或多种有机醇的酯。因此，优选地，“无机磷酸盐阴离子”的表述不包括核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。
如本文所用，“柠檬酸盐阴离子”是指含有柠檬酸盐阴离子的任何化合物，当其溶解在水性介质中时释放柠檬酸盐阴离子。含有柠檬酸盐阴离子并在水性介质中溶解时释放柠檬酸盐阴离子的化合物的实例包括柠檬酸和柠檬酸盐。
如本文所用，“EDTA的阴离子”是指含有EDTA的阴离子的任何化合物，当其溶解在水性介质中时释放EDTA的阴离子。含有EDTA的阴离子并在水性介质中溶解时释放阴离子的化合物的实例包括乙二胺四乙酸(EDTA)和EDTA的盐。
如本文所用，“无机硫酸盐阴离子”是指含有无机硫酸盐阴离子的任何化合物，当其溶解在水性介质中时释放无机硫酸盐阴离子。含有无机硫酸盐阴离子并且当溶解在水性介质中时释放无机硫酸盐阴离子的化合物的实例包括硫酸和硫酸盐。优选地，“无机硫酸盐阴离子”的表述不包括硫酸与一种或多种有机醇的酯。
如本文所用，“碳酸盐阴离子”是指含有碳酸盐阴离子(即HCO3-和CO3 2-)的任何化合物，当其溶解在水性介质中时释放碳酸盐阴离子。含有碳酸盐阴离子并且当溶解在水性介质中时释放碳酸盐阴离子的化合物的实例包括二氧化碳的水溶液和碳酸盐。优选地，“碳酸盐阴离子”的表述不包括与一种或多种有机醇的碳酸酯。
如本文所用，“有机二元酸阴离子”的表述是指含有两个游离形式(即质子化)、酸酐形式或盐形式的酸性基团的任何有机化合物。在这方面，术语“酸性基团”是指羧酸或硫酸基团。优选地，“有机二元酸”的表述不包括羧酸或硫酸基团与一种或多种有机醇的酯。有机二元酸的实例包括草酸、苹果酸和酒石酸。
如本文所用，“有机多元酸阴离子”是指含有三个或更多个游离形式(即质子化)、酸酐形式或盐形式的酸性基团的任何有机化合物。在这方面，术语“酸性基团”是指羧酸或硫酸基团。优选地，“有机多元酸”的表述不包括羧酸或硫酸基团与一种或多种有机醇的酯。有机多元酸的一个实例包括柠檬酸。
如本文所用，关于颗粒(例如LNP)的尺寸(Z平均)的表述“等于”，是指在处理步骤之后(例如，在冷冻/解冻循环之后)包含在组合物中的颗粒的Z平均的值对应于在处理步骤之前(例如，冷冻/解冻周期之前)的颗粒的Z平均的值±30％(优选地，±25％，更优选地±24％，例如±20％、±15％、±10％、±5％或±1％)。例如，如果包含在尚未经历冷冻/解冻循环的组合物中的颗粒(例如LNP)的尺寸(Z平均)值为90nm，并且包含在经历冷冻/融化循环的组合物内的颗粒(如LNP)尺寸(Z平均)值为115nm，则在冷冻/解冻周期之后、即在解冻所述冷冻组合物之后的颗粒的尺寸(Z平均)认为等于在冷冻/解冻循环之前、即在冷冻组合物之前的颗粒的尺寸(Z平均)。如本文所用，关于颗粒(如LNP)的尺寸分布或PDI的表述“等于”应相应解释。例如，如果包含在尚未经历冷冻/解冻循环的组合物中的颗粒(例如LNP)的PDI值为0.30，并且包含在经历冷冻/融化循环的组合物内的颗粒(如LNP)的PDI值为0.38，则在冷冻/解冻周期之后、即在解冻所述冷冻组合物之后的颗粒的PDI认为等于在冷冻/解冻循环之前、即在冷冻组合物之前的颗粒的PDI。
本文所述的组合物还可包含作为稳定剂的冷冻保护剂和/或表面活性剂，以避免产品质量的显著损失，特别是在储存和/或冷冻期间RNA活性的显著损失，例如以减少或防止聚集、颗粒坍塌、RNA降解和/或其他类型的损害。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是碳水化合物。如本文所用，术语“碳水化合物”是指并包括单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是单糖。如本文所用，术语“单糖”是指不能水解为更简单的碳水化合物单元的单个碳水化合物单元(例如，单糖)。示例性的单糖冷冻保护剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是二糖。如本文所用，术语“二糖”是指通过糖苷键(例如通过1至4个键或1至6个键)结合在一起的2个单糖单元形成的化合物或化学部分。二糖可以水解成两个单糖。示例的二糖冷冻保护剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。
术语“三糖”是指三个糖连接在一起形成一个分子。三糖的实例包括棉子糖和松三糖(melezitose)。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是寡糖。如本文所用，术语“寡糖”是指由3至约15个、优选3至约10个单糖单元形成的化合物或化学部分，这些单糖单元通过糖苷键、例如通过1至4个键或1至6个键结合在一起，形成线性、支链或环状结构。示例性寡糖冷冻保护剂包括环糊精、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可以被氧化或还原。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是环状寡糖。如本文所用，术语“环状寡糖”是指由3至约15个、优选6、7、8、9或10个单糖单元形成的化合物或化学部分，这些单糖单元通过糖苷键、例如通过1至4个键或1至6个键结合在一起以形成环状结构。示例性环状寡糖冷冻保护剂包括环状寡糖，其是分立的化合物，例如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。
其他示例的环状寡糖冷冻保护剂包括这样的化合物，其包括较大分子结构中的环糊精部分，例如含有环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可以被氧化或还原，例如氧化成二羰基形式。如本文所用，术语“环糊精部分”是指环糊精(如α、β或γ环糊精)基团，其掺入到较大分子结构如聚合物中或其一部分。环糊精部分可以直接或通过任选的接头与一个或多个其他部分结合。环糊精部分可以被氧化或还原，例如氧化成二羰基形式。
碳水化合物冷冻保护剂，例如环状寡糖冷冻保护剂可以是衍生的碳水化合物。例如，在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是衍生的环状寡糖，例如衍生的环糊精，例如2-羟丙基-β-环糊精，例如部分醚化的环糊精(如部分醚化的β环糊精)。
一种示例的冷冻保护剂是多糖。如本文所用，术语“多糖”是指由至少16个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键(例如通过1至4个键或1至6个键)结合在一起以形成线性、支链或环状结构，并且包括将多糖作为其骨架结构的一部分的聚合物。在骨架中，所述多糖可以是线性的或环状的。示例的多糖冷冻保护剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糊精等。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是糖醇。如本文所用，术语“糖醇”是指含有至少两个碳原子和附着于每个碳原子的一个羟基的有机化合物。通常，糖醇来源于糖(例如，通过糖的氢化)，并且是水溶性固体。如本文所用，术语“糖”是指甜味的可溶性碳水化合物。糖醇的实例包括乙二醇、甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇、甘露醇、山梨醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇(iditol)、肌醇、庚七醇、异麦芽糖酮醇(isomalt)、麦芽糖醇、乳糖醇、麦芽三糖醇、麦芽四糖醇和聚糖醇(polyglycitol)。在一个实施方案中，糖醇具有式HOCH2(CHOH)nCH2OH，其中n为0至22(例如，0、1、2、3或4)，或其环状变体(通常可通过糖醇脱水得到环状醚而衍生；例如异山梨醇是山梨醇的环状脱水变体)。
在一个实施方案中，所述冷冻保护剂是甘油和/或山梨醇。
在一个实施方案中，RNA LNP组合物可以包括蔗糖作为冷冻保护剂。不希望受理论束缚，蔗糖的作用是促进组合物的冷冻保护，从而防止核酸(特别是RNA)颗粒聚集并保持所述组合物的化学和物理稳定性。某些实施方案在本发明中考虑了蔗糖的替代冷冻保护剂。替代稳定剂包括但不限于葡萄糖、甘油和山梨醇。
优选的冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合。在优选的实施方案中，所述冷冻保护剂包括蔗糖和/或甘油。在更优选的实施方案中，所述冷冻保护剂是蔗糖。
在一个实施方案中，本文所述的RNA LNP组合物包含冷冻保护剂，其浓度为至少1％w/v，例如至少2％w/v、至少3％w/v、至少4％w/v、至少5％w/v、至少6％w/v、至少7％w/v、至少8％w/v或至少9％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在组合物中的浓度为高达25％w/v，例如高达20％w/v、高达19％w/v、高达18％w/v和高达17％w/v、高达16％w/v、高达15％w/v、高达14％w/v、高达13％w/v、高达12％w/v或高达11％w/v。在一个实施方案中，所述冷冻保护剂在组合物中的浓度为1％w/v至20％w/v、例如2％w/v至19％w/v、3％w/v至18％w/v、4％w/v至17％w/v、5％w/v至16％w/v、5％w/v至15％w/v、6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、9％w/v至11％w/v或约10％w/v。在一个实施方案中，本文所述RNA LNP组合物包含冷冻保护剂(特别是蔗糖和/或甘油)，其(总)浓度为5％w/v至15％w/v，例如6％w/v至14％w/v、7％w/v至13％w/v、8％w/v至12％w/v、或9％w/v至11％w/v或浓度为约10％w/v。
优选地，本文所述的RNA LNP组合物包含冷冻保护剂，其浓度导致所述组合物的摩尔渗透浓度基于所述组合物总重量为约50×10-3osmol/kg至约1osmol/kg(如约100×10- 3osmol/kg至约900×10-3osmol/kg、约120×10-3osmol/kg至约800×10-3osmol/kg、约140×10-3osmol/kg至约700×10-3osmol/kg、约160×10-3osmol/kg至约600×10-3osmol/kg、约180×10-3osmol/kg至约500×10-3osmol/kg、或约200×10-3osmol/kg至约400×10-3osmol/kg)，例如约50×10-3osmol/kg至约400×10-3osmol/kg(如约50×10-3osmol/kg至约390×10- 3osmol/kg、约60×10-3osmol/kg至约380×10-3osmol/kg、约70×10-3osmol/kg至约370×10-3osmol/kg、约80×10-3osmol/kg至约360×10-3osmol/kg、约90×10-3osmol/kg至约350×10-3osmol/kg、约100×10-3osmol/kg至约340×10-3osmol/kg、约120×10-3osmol/kg至约330×10-3osmol/kg、约140×10-3osmol/kg至约320×10-3osmol/kg、约160×10-3osmol/kg至约310×10-3osmol/kg、约180×10-3osmol/kg至约300×10-3osmol/kg、或约200×10-3osmol/kg至约300×10-3osmol/kg)。
在一个优选实施方案中，RNA LNP组合物/制剂包含蔗糖作为冷冻保护剂和Tris作为缓冲物质，优选以本文规定的量/浓度使用。
在一个替代的优选实施方案中，RNA LNP组合物/制剂基本上不含冷冻保护剂，例如其不含任何冷冻保护剂。
本发明的某些实施方案考虑了螯合剂在本文所述的RNA LNP组合物/制剂中的用途。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键、从而产生稳定的水溶性复合物的化合物。在不希望被理论束缚的情况下，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，在本发明中可能另外诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的实例包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA盐、去铁胺B、去铁胺(deferoxamine)、二硫卡宾钠(dithiocarb sodium)、青霉胺、喷替酸钙、喷替酸(pentetic acid)的钠盐、二巯基丁二酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid)、反式二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和双(氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N’,N’-四乙酸。在某些实施方案中，螯合剂是EDTA或EDTA盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是EDTA二钠二水合物。在一些实施方案中，EDTA的浓度为约0.05mM至约5mM、约0.1mM至约2.5mM或约0.25mM至约1mM。
在优选的替代实施方案中，本文所述的RNA LNP组合物/制剂的水相不包含螯合剂。例如，优选的是，如果本文所述的RNA LNP组合物/制剂包含螯合剂，则所述螯合剂仅存在于LNP中。
药物组合物
本文所述的RNA LNP组合物可用作或用于制备用于治疗或预防性治疗的药物组合物或药物。
本文所述的RNA LNP可以以任何合适的药物组合物的形式给药。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效制剂的组合物，优选与药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起组合。所述药物组合物通过给药受试者的所述药物成分可用于治疗、预防或降低疾病或障碍的严重程度。在本发明的上下文中，所述药物组合物包含本文所述的RNA LNP。
本发明的药物组合物可以包含一种或多种佐剂，或者可以与一种或多种佐剂一起给药。术语“佐剂”是指延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包括一组非均相化合物，例如油乳剂(例如Freund’s佐剂)、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产物(例如百日咳杆菌(Bordetella pertussis)毒素)或免疫刺激复合物。佐剂的实例包括但不限于LPS、GP96、CpG寡核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白细胞介素、趋化因子。所述趋化因子可以是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFa、INF-γ、GM-CSF、LT-a。进一步已知的佐剂是氢氧化铝、Freund’s佐剂或油，例如ISA51。用于本发明的其他合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys，以及亲脂性组分，例如皂苷、海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(TDB)、单磷酰脂质-A(MPL)、单分枝酰基甘油(MMG)或吡喃葡萄糖基脂质佐剂(GLA)。
本发明的药物组合物可以是冷冻形式或“即用形式”(即，以一种形式，特别是液体形式，其可以立即给药受试者，例如无需任何处理，如解冻、重建或稀释)。因此，在给药可储存形式的药物组合物之前，必须将所述可储存形式加工或转变为即用型或可给药形式。例如冷冻的药物组合物必须解冻。即用型注射剂可以装在容器中，例如小瓶、安瓿或注射器，其中所述容器可以包含一个或多个剂量。
在一个实施方案中，所述药物组合物为冷冻形式，并且可以在约-90℃或更高的温度下储存，例如约-90℃至约-10℃。例如，本文所述的冷冻药物组合物(如通过第二、第三或第六方面的方法制备的冷冻组合物，或第五、第八、第九或第十方面的冷冻组合物)可在约-90℃至约-10℃的温度范围内储存，如约-905℃至约-40℃或约-40℃至约-25℃，或约-25℃至约-10℃，或约-20℃的温度。
在冷冻形式的药物组合物的一个实施方案中，所述药物组合物可以储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月，优选至少4周。例如，冷冻药物组合物可以在-20℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，进一步优选至少6个月。
在冷冻形式的药物组合物的一个实施方案中，所述冷冻药物组合物解冻后的RNA完整性为至少50％，例如至少52％、至少54％、至少55％、至少56％、至少58％或至少60％，例如解冻已在-20℃下储存的冷冻组合物后。
在冷冻形式的药物组合物的一个实施方案中，所述冷冻药物组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI等于冷冻前LNP的尺寸(Z平均)和/或者尺寸分布和/或PDI。例如如果由本文所述的冷冻药物组合物制备即用型药物组合物，优选包含在即用型药物组合物中的LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI等于冷冻前包含在冷冻药物组合物中(例如包含在根据第二方面的方法的步骤(I)制备的制剂中)的LNP尺寸(Z平均)和/或尺寸分布或PDI。
在一个实施方案中，所述药物组合物是液体形式，并且可以在约0℃至约20℃的温度范围内储存。例如，本文所述的液体药物组合物(例如通过第二、第四或第七方面的方法制备的液体组合物，或根据第五、第八、第九或第十方面的液体组合物)可以在约1℃至约15℃、例如约2℃至10℃，或约2℃至8℃或在约5℃的温度下储存。
在液体形式的药物组合物的一个实施方案中，所述药物组合物可以储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月或至少6个月，优选至少4周。例如，所述液体药物组合物可以在5℃下储存至少4周，优选至少1个月，更优选至少2个月，更优选至少3个月，进一步优选至少6个月。
在液体形式的药物组合物的一个实施方案中，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述液体组合物的RNA完整性足以产生预期效果，例如诱导免疫应答。例如，当在0℃或更高温度下储存至少一周时，与初始组合物的RNA整体性(即，所述组合物储存前的RNA完整度)相比，所述液体组合物的RNA完整性可以是至少50％，例如至少52％、至少54％、至少55％、至少56％、至少58％或至少60％。
在液体形式的药物组合物的一个实施方案中，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述药物组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI))足以产生预期效果，例如诱导免疫应答。例如，当在例如0℃或更高温度下储存至少一周时，所述药物组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于初始(即储存前)药物组合物的LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)。在一个实施方案中，所述药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间。在一个实施方案中，在所述药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的PDI小于0.3，优选小于0.2，更优选小于0.1。在一个实施方案中，所述药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)等于储存前LNP的尺寸(Z平均)(和/或尺寸分布和/或PDI)。在一个实施方案中，所述药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的尺寸(Z平均)在约50nm至约500nm之间，优选在约40nm至约200nm之间，更优选在约40nm至约120nm之间，并且所述药物组合物例如在0℃或更高温度下储存至少一周后，LNP的PDI小于0.3(优选小于0.2，更优选小于0.1)。
根据本发明的药物组合物通常以“药学有效量”和“药学可接受的制剂”应用。
术语“药学上可接受的”是指与所述药物组合物的活性组分的作用不相互作用的无毒性物质。
术语“药物有效量”是指单独或与进一步的剂量一起实现预期反应或预期效果的量。在治疗特定疾病的情况下，预期反应优选与抑制疾病进程有关。这包括减缓疾病的进展，特别是中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的预期反应也可以是延迟所述疾病或所述病症的发作或预防其发作。本文所述的颗粒或药物组合物的有效量将取决于待治疗的病况、疾病的严重程度、患者的个体参数，包括年龄、生理状况、体形和体重、治疗的持续时间、伴随治疗的类型(如果存在)、具体给药途径和类似因素。因此，本文所述的颗粒或药物组合物的给药剂量可以取决于各种这样的参数。在患者对初始剂量的反应不足的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的、更局部的给药途径获得的有效的更高剂量)。
在特定实施方案中，本发明的药物组合物(例如免疫原性组合物，即可用于诱导免疫应答的药物组合物)在容器(例如小瓶)中配制为单剂量。在一些实施方案中，将所述免疫原性组合物配制成小瓶中的多剂量制剂。在一些实施方案中，所述多剂量制剂包括每个小瓶至少2剂。在一些实施方案中，所述多剂量制剂包括每小瓶总计2-20剂，例如每小瓶2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12剂。在一些实施方案中，小瓶中的每个剂量在体积上是相等的。在一些实施方案中，第一剂量是与后续剂量不同的体积。
“稳定”的多剂量制剂优选表现出没有不可接受的微生物生长水平，并且基本上没有或根本没有活性生物分子组分的分解或降解。如本文所用，“稳定”的免疫原性组合物包括这样的制剂，其在给药受试者时保持能引发预期的免疫应答。
本发明的药物组合物可以含有缓冲剂(特别是衍生自RNA LNP组合物/制剂，用其制备所述药物组合物)、防腐剂和任选的其他治疗剂。在一个实施方案中，本发明的药物组合物、特别是即用型药物组合物，包括一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本发明的药物组合物的合适的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯类(paraben)和硫柳汞。
如本文所用，术语“赋形剂”是指可以存在于本发明的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的实例包括但不限于载体、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。
“药学上可接受的盐”包括例如酸加成盐，其可以例如通过使用药学上可接受的酸形成，例如盐酸、乙酸、乳酸、2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、3-(N-吗啉基)丙磺酸(MOPS)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)或苯甲酸。此外，合适的药学上可接受的盐可以包括碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)、铵盐(NH4+)以及与合适的有机配体(例如季铵和胺阳离子)形成的盐。药学上可接受的盐的示例实例可在现有技术中找到，例如参见S.M.Berge et al.,"Pharmaceutical Salts",J.Pharm.Sci.,66,pp.1-19(1977))。药学上不可接受的盐可用于制备药学上可接受的盐，并包括在本发明中。
术语“稀释剂”是指使得可以稀释和/或变稀释的制剂。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任何一种或多种。合适的稀释剂的实例包括乙醇和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，其中组合活性组分以促进、增强或使药物组合物的给药成为可能。本文所用的载体可以是一种或多种相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质，其适合向受试者给药。合适的载体包括但不限于无菌水、林格氏液(Ringer)、乳酸林格氏液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。
用于治疗用途的药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂在药学领域是众所周知的，并且例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.RGennaro edit.1985)中进行了描述。
药物载体、赋形剂或稀释剂可以根据预期给药途径和标准药物实践进行选择。
药物组合物的给药途径
在一个实施方案中，本文描述的组合物，例如本文描述的药物组合物或即用型药物组合物，可以静脉内、动脉内、皮下、皮内、经皮肤、经鼻内、肌肉内或肿瘤内给药。在某些实施方案中，所述(药物)组合物配制为用于局部给药或全身给药。全身给药可包括涉及通过胃肠道吸收的经肠给药或肠外给药。如本文所用，“肠外给药”是指除通过胃肠道以外的任何方式给药，例如通过静脉内注射。在一个优选的实施方案中，所述(药物)组合物、特别是即用型药物组合物配制为用于全身给药。在另一个优选实施方案中，全身给药是通过静脉内给药。在另一个优选的实施方案中，所述(药物)组合物、特别是即用型药物组合物配制为用于肌内给药。
药物组合物的用途
本文所述的RNA颗粒可用于各种疾病的治疗性或预防性处理，特别是在向受试者提供肽或蛋白导致治疗或预防效果的疾病中。例如，提供源自病毒的抗原或表位可用于治疗或预防由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗其中癌细胞表达所述肿瘤抗原的癌症疾病。提供功能性蛋白或酶可用于治疗以功能失调的蛋白为特征的遗传性疾病，例如溶酶体贮积病(例如粘多糖贮积病)或因子缺乏症。提供细胞因子或细胞因子融合物可用于调节肿瘤微环境。
术语“疾病”(本文也称为“病症”)是指影响个体身体状况的异常状况。疾病通常解释为与特定症状和体征相关的医疗状况。疾病可能是由最初来自外部来源的因素引起的，如感染性疾病，也可能是由内部功能失调引起的，例如自身免疫性疾病。在人类中，“疾病”通常被更广泛地用于指给患病个体带来疼痛、功能失调、痛苦、社会问题或死亡的任何情况，或为与所述个体接触的人带来类似问题的任何状况。在这个更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、残疾、障碍、综合征、感染、孤立症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在其他情况下并出于其他目的，这些可能视为可区分的类别。疾病通常不仅影响个体的身体，也影响个体的情感，因为感染和患有许多疾病会改变一个人对生活的看法和个性。
在本文中，术语“治疗”、“治疗的”或“治疗干预”是指为了对抗例如疾病或障碍等病况的目的而对受试者进行的管理和照护。所述术语旨在包括对受试者所患的给定病症的全谱治疗，例如给药治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病况的进展，减轻或缓解症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病况以及预防所述病况，其中预防应理解为为了对抗所述疾病、障碍或病况而对个体进行管理和照护，并且包括给药活性化合物以预防症状或并发症的发作。
术语“治疗性处理”涉及改善个体健康状况和/或延长(增加)个体寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体的疾病，阻止或减缓个体的疾病发展，抑制或减缓个体疾病的发生，降低个体症状的频率或严重程度，和/或减少当前患有或以前患有疾病的个体中疾病的复发。
术语“预防性治疗”或“预防性处理”是指旨在防止疾病在个体发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防性处理”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“受试者”在本文中可互换使用。他们是指人或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长目动物)，或任何其他非哺乳动物动物，包括鸟类(鸡)、鱼类或任何其他动物物种，这些动物可能困扰于或易患疾病或障碍(例如，癌症、感染性疾病)，但可能患有或可能不患有所述疾病或障碍，或者可能需要预防性干预如疫苗接种，或者可能需要蛋白替代疗法等干预措施。在许多实施方案中，所述个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“受试者”并不表示特定的年龄，因此包括成年个体、老年个体、儿童和新生儿。在本发明的实施方案中，所述“个体”或“受试者”是“患者”。
术语“患者”是指接受治疗的个体或受试者，特别是患病的个体或受试者。
在本发明的一个实施方案中，目的是通过接种疫苗来提供对抗感染性疾病的保护。
在本发明的一个实施方案中，目的是向受试者、特别是有需要的受试者提供分泌的治疗蛋白，例如抗体、双特异性抗体、细胞因子、细胞因子融合蛋白、酶。
在本发明的一个实施方案中，目的是向受试者、特别是有需要的受试者提供蛋白替代疗法，例如产生红细胞生成素、因子VII、血管性血友病因子、β-半乳糖苷酶、α-N-乙酰基葡糖苷酶。
在本发明的一个实施方案中，目的是调节/重新编程血液中的免疫细胞。
本领域技术人员将知道，免疫疗法和疫苗接种的原理之一基于这样一个事实，即通过用抗原或表位免疫受试者来产生对疾病的免疫保护反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文所述的药物组合物可用于诱导或增强免疫应答。因此，本文所述的药物组合物可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
术语“免疫”或“疫苗接种”描述了为诱导免疫应答而向个人给药抗原的过程，例如出于治疗或预防原因。
本文引用的文件和研究并不意味着承认上述任何内容都与现有技术有关。关于这些文件内容的所有声明均基于申请人可获得的信息，不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现所述描述(包括以下示例)是为了使本领域普通技术人员能够产生和使用各种实施方案。对特定设备、技术和应用的描述仅作为示例提供。对本领域普通技术人员来说，对本文描述的示例的各种修改将是显而易见的，并且在不脱离各种实施方案的精神和范围的情况下，本文定义的一般原理可以应用于其他实施例和应用。因此，各种实施方案不旨在局限于本文所述和所示的实施例，而是应符合与权利要求一致的范围。
实施例
方法
RNA LNP的生产
本文以脂质I-3作为阳离子可电离脂质的实施例来描述生产方案。同样的方案也适用于其他阳离子可电离脂质。因此，也可以生产具有阳离子可电离脂质和RNA之间的比(N/P比)例如更高或更低的N/P比的其他制剂，包括负电荷过量的那些制剂，并如所述的稳定。此外，可以使用其他脂质比(磷脂、胆固醇、聚合物缀合脂质)以及其他类型的聚合物缀合脂质(例如，聚肌氨酸脂质)。所述方案也适用于不含任何聚合物缀合脂质的产品。
通过水相-乙醇混合方案制备RNA LNP。简言之，将在含水缓冲条件下(如50mM柠檬酸盐，pH 4.0)的RNA(如编码包含SARS-CoV-2S蛋白的氨基酸序列的BNT162b2)与乙醇脂质混合物混合，所述乙醇脂质混合物包含脂质I-3、DSPC、胆固醇和2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺，摩尔比为47.5:10:40.7:1.8，分别为3份RNA和1份脂质混合物的体积比。所述混合是通过使用T型混合元件的基于标准泵的设置来实现的。将脂质纳米颗粒原胶体用2份缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液50mM，pH 4.0)进一步稀释。总流量在400至2000mL/min之间，例如720ml/min。将由此获得的初级LNP产物进一步相对于缓冲液(例如PBS缓冲液pH 7.4(对照)或Tris缓冲液10或50mM pH7.4或不同的缓冲液)进行切向流过滤，以进行缓冲液置换和去除乙醇。渗滤完成后，将制剂浓缩。随后，将缓冲液置换的RNA LNP制剂稀释，例如用补充蔗糖的PBS(对照)或用补充蔗糖的Tris缓冲液10或50mM pH 7.4稀释，使得LNP制剂中的最终RNA浓度为0.1至0.5mg/ml，蔗糖含量为10％w/v。将RNA LNP制剂的样品在5℃或室温下储存，或在不同温度(例如，-5℃、-20℃、-70℃和/或-80℃)下冷冻储存。
LNP尺寸和多分散性
通过动态光散射(DLS)评估RNA LNP制剂/组合物(或其样品)中LNP的平均颗粒尺寸和尺寸分布。所述方法使用了一种尺寸谱仪，所述粒度分析仪使用173°的反向散射来确定颗粒尺寸。结果报告为颗粒的Z平均尺寸和多分散性指数。多分散性值用于描述测量的Z平均尺寸周围拟合的对数正态分布的宽度，并使用尺寸测定软件中的专有数学计算生成。尺寸和多分散性的结果分别以nm和多分散指数值报告。
RNA完整性
RNA完整性通过毛细管电泳测定。将用TritonTM X-100/乙醇处理的RNA LNP施加到包含在毛细管中的凝胶基质上。所述RNA及其衍生物、降解物和杂质根据其大小进行分离。凝胶基质含有荧光染料，其与RNA组分特异性结合，从而允许通过CCD检测器检测的蓝色LED诱导荧光进行检测。激发波长为470nm。通过将RNA主峰的峰面积与总检测峰面积进行比较来确定RNA的完整性。
RNA含量和包封
RNA含量通过用洗涤剂TritonTMX-100破坏LNP来测定，随后使用分光荧光光度计基于RNA结合荧光染料的信号测量总RNA含量。通过比较不存在(游离RNA)和存在(总RNA)TritonTMX-100的LNP样品的/>信号来计算RNA包封。RNA含量和包封的结果分别以mg/mL和百分比报告。
脂质相同性和脂质含量
HPLC-CAD测定法使用分辨所有四种脂质(I-3、DSPC、胆固醇和2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺)的方法确定等分试样中脂质的相同性和浓度。通过将保留时间与参考标准品的保留时间进行比较来确定个体脂质的相同性。每种个体脂质的浓度是通过样品面积对参考标准产生的相应五点校准曲线的响应来确定的，使用带电气溶胶检测器(CAD)进行峰值检测。脂质相同性和脂质含量的结果分别以与参考标准相比的相对保留时间和mg/mL报告。
电子显微镜
将完全处理和冷冻(-80℃)的样品置于室温下。将5μl的每个样品施加于金网格(ULTRAuFoil 2/1，Quantifoil Micro Tools，Jena，Germany)上，并将过量的液体自动印迹在纸上。样品在冷冻箱(Carl Zeiss NTS GmbH，Oberkochen，Germany)中于-180℃的液态乙烷中进行速冻。去除过量的乙烷，并立即用Gatan 626冷冻转移支架(Gatan Pleasanton，USA)将样品转移到预冷的冷冻电子显微镜Philips CM120，Eindhoven，Netherlands)中，所述显微镜在120kV下操作并在低剂量条件下观察。使用2k CMO相机(F216 TVIPS，Gauting，德国)记录图像。为了降低噪声，每帧平均四个图像。
体外表达(IVE)
LNP样品的蛋白表达(例如刺突蛋白表达)是使用目前正在进行进一步评估以增加日间稳健性的表征测定法来测量的。首先，将LNP样品以所示的RNA水平(非饱和浓度)添加到HEK-293T细胞中。使用抗蛋白单克隆抗体(例如抗刺突蛋白受体结合域(RBD)兔单克隆抗体)测量蛋白表达。通过量化对结合的抗蛋白抗体(例如结合的抗RBD抗体)具有阳性信号的细胞的数量来测量表达。
小鼠免疫原性
将5组5只雌性BALB/c小鼠用1μg剂量水平的配制药物免疫一次(第0天)，或用单独缓冲液(对照组)，以20μL的剂量体积肌肉内注射(i.m.)免疫。每周采集一次血液，持续三周(第7、14和21天)，通过ELISA和基于假病毒的中和试验(pVNT)分析抗体免疫应答。在研究结束时(第28天)，采集血液，然后对动物实施安乐死，以采集脾脏，并通过ELISpot和细胞内细胞因子染色(ICS)对脾细胞中的T细胞应答进行进一步分析；参见图1。
实施例1
使用添加到有机相中的20mM Tris通过水相-乙醇混合方案制备RNA LNP。在pH 4、pH 5.5或pH 6.8的50mM Tris:乙酸根中产生LNP，并将所得初级LNP分开：对一部分进行PBS透析(A)；对另一部分进行针对50mM pH 7.4的Tris:乙酸根的透析(B)。为了进行比较，有机相没有接受Tris，在pH 5.5的50mM乙酸钠缓冲液中产生LNP，并且将材料针对pH 7.4的50mMTris:乙酸根进行透析。所有样品均在室温下储存50小时。如上所述使用毛细管电泳测量RNA完整性。结果如图2A和B所示。
含有阳离子可电离脂质、特别是脂质I-3和PBS的RNA LNP组合物采用高度稳定折叠形式的RNA(可检测到在约2190秒主峰拖尾)。如果LNP是在PBS以外的缓冲液(如Tris)中制备的，即在不存在PBS的情况下，并且在透析期间将所述缓冲液置换为PBS，则也是如此；参见图2A。在所有这些样品中，这种高度稳定折叠形式的RNA的量在18％和21％之间。
然而，在组合物中使用单价缓冲物质Tris(而不是多价PBS)(即当配制成即用型组合物时，在储存、运输和给药药物产品的制备中)抑制了高度稳定折叠形式RNA的形成；参见图2B。
因此，从这些结果可以得出结论，在透析期间添加Tris足以抑制高度稳定折叠形式的RNA的形成。相反，仅在LNP制备过程的上游部分添加Tris并不能防止在对初级LNP制剂针对PBS进行透析时形成高度稳定折叠形式的RNA。
实施例2
在确定Tris是抑制高度稳定折叠形式RNA形成的优选单价缓冲物质后，我们着手优化关于胶体稳定性方面的组成成分，特别是在冻融循环期间。
将包含(i)单价阴离子(乙酸根、乙醇酸根或乳酸根)、(ii)二价或部分二价阴离子(酒石酸盐、磷酸盐、碳酸盐)或(iii)两性离子(HEPES和MES)的化合物与作为缓冲物质的Tris组合，并在-20℃下随时间或冻融循环期间测定LNP的胶体稳定性。结果如表2所示。
表2：LNP在包含Tris和选择的阴离子的缓冲液中的胶体稳定性
将LNP(在50mM Tris:Hac pH 5.5中形成，TFF在50mM Tris:Hac中pH 7.4中形成)稀释10倍到左栏所列的基质中。将物质在上方所示的温度和时间下温育。LNP的颗粒尺寸以相对于原始尺寸表示。认为在90％和110％之间的值表示物质是稳定的。Suc＝以mM为单位的蔗糖浓度，T＝Tris，Hac＝乙酸，Lac＝乳酸，Gly＝乙醇酸，Pi＝无机磷酸盐，HEPES＝羟乙基哌嗪乙磺酸，MES＝吗啉乙磺酸，Tart＝酒石酸。
从表2中提供的数据可以明显看出，单价阴离子乙酸根、乳酸根和MES的存在促进了RNA LNP组合物的冷冻，而不会使胶体坍塌。值得注意的是，胶体稳定性在-20℃可延长长达3个冻融循环加上89天的随访期，或者在5℃也是同样如此。
然而，部分或完全二价离子碳酸根、磷酸根和酒石酸根的存在导致RNA LNP组合物在冷冻过程中缺乏胶体稳定性。
总之，可以得出结论，LNP在包含Tris作为阳离子和选自乙酸根、乳酸根或MES的单价阴离子的缓冲液中，在-20℃下是胶体稳定的，但在有机二元酸和/或有机多元酸存在下不稳定。胶体稳定性包括重复的冻融循环和延长的储存期或这两个因素的组合。
实施例3
制备以下三种RNA LNP组合物：
-D028
LNP在pH 4.0的50mM柠檬酸盐中形成，并如上所述进行处理。在TFF期间引入pH7.4的50mM Tris:乙酸根，并且在进一步包含300mM蔗糖的相同缓冲液中稀释制剂以得到0.5mg/mL或0.1mg/mL的RNA浓度。
-D029
对于D029，50mM Tris:乙酸根pH 6.9的单一缓冲液用于LNP的形成、TFF和稀释。如上所述添加300mM蔗糖。
-D030
LNP在pH 5.5的50mM Tris:乙酸根中形成，并使用相同的缓冲液如上所述进行处理。进行与D028相同的TFF和稀释。
所得RNA LNP组合物的特征总结于表3中。
表3-RNA LNP组合物D028、D029和D030的特征
从表3中可以明显看出，RNA LNP组合物在彼此之间是可比的。
使用冷冻电子显微镜进一步表征RNA LNP组合物。其结果如图3所示。从图3中可以看出，所有RNA LNP组合物都有一个共同的形态，描述为主要填充的30至110nm的球形囊泡。经常观察到外部双层。
当在小鼠中测试时，所有RNA LNP组合物在生物活性方面与参考物及彼此之间也是可比的。S1蛋白的表达量和S1特异性抗体的IgG浓度是可比的，如图4所示。当从第14天和第28天滴度的角度来看时以及鉴于S1表达，认为在第21天D028的S1特异性抗体的较低水平是异常值。
由于本发明的一个目的是开发具有改进的稳定性的RNA LNP组合物，分析了与稳定性有关的关键质量属性。将来自RNA LNP组合物D028、D029和D030的样品保存在-70℃和室温之间的温度下，并在IVE测定中对其理化性质和活性进行表征。其结果如图5所示。
图5A显示了RNA LNP组合物D028在所有温度水平下的胶体稳定性。这包括LNP结构的物理稳定性和物质的总RNA含量。正如预期的那样，RNA的完整性以温度依赖性的方式衰减，但在12周后仍在规范范围内。值得注意的是，即使在整个12周期间均暴露于室温下，这种RNA LNP组合物中也基本上不存在高度稳定折叠形式的RNA的形成。
RNA LNP组合物D029和D030具有相似的稳定性模式。任何储存条件都不会影响物质的胶体稳定性、物理完整性或含量。当暴露于+5℃超过12周时，RNA完整性保持在规范的限制范围内；参见图5B和5C。
总之，使用包含Tris和乙酸根的缓冲系统的RNA LNP组合物在形态、小鼠免疫原性以及释放时和稳定性期间的物理化学性质方面是可比的。
实施例4
这个实施例分析了(i)缓冲液浓度和(ii)Tris的抗衡阴离子作为缓冲物质对RNALNP组合物的胶体稳定性和RNA完整性的影响
为此，基于D028产生RNA LNP制剂，针对10mM和50mM的Tris:乙酸根以及10mM和50mM的Tris:HCl进行透析，并分析所得RNA LNP组合物的胶体稳定性和RNA稳定性。特别地，将RNA LNP组合物以液体或冷冻形式温育长达49天。在5℃下仅收集19天的数据，但在室温下与实施例2中的结果一致。结果如图6和图7所示。
从图6中可以看出，当储存在具有10mM强度的缓冲液中时，在-20℃储存的RNA LNP组合物的尺寸开始与液体样品轻微分离，而50mM缓冲液提供了完全的胶体稳定性。可以得出结论，当在具有单价阴离子如乙酸根或氯离子的Tris缓冲液中配制RNA时，所述RNA对RNALNP组合物基质的缓冲液离子强度敏感。
从图7中可以看出，与在50mM缓冲液中配制的组合物相比，缓冲液离子强度为10mM的RNA LNP组合物更稳定。这一发现与阴离子类型无关。对于冷冻物质也观察到不同的降解速率。
总之，当在具有单价阴离子如乙酸根或氯离子的Tris缓冲液中配制时，RNA稳定性对RNA LNP组合物的缓冲液强度敏感。

Claims (92)

1.一种组合物，其包含分散在水相中的脂质纳米颗粒(LNP)，其中
所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；
所述水相包含缓冲系统，所述缓冲系统包含缓冲物质和单价阴离子，
所述缓冲物质选自三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)及其质子化形式，双(2-羟乙基)氨基-三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris-甲烷)及其质子化形式、以及三乙醇胺(TEA)及其质子化形式，并且
所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、吗啉乙磺酸(MES)的阴离子、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)的阴离子和2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)的阴离子；
所述组合物中缓冲物质的浓度至多为约25mM；并且
所述水相基本上不含无机磷酸盐阴离子，基本上不含柠檬酸盐阴离子，以及基本上不含乙二胺四乙酸(EDTA)的阴离子。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述缓冲物质为Tris及其质子化形式。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述组合物中缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的浓度为至多约20mM，优选至多约15mM，更优选至多约10mM，例如约10mM。
4.权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述水相基本上不含无机硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子，特别是基本上不含无机硫酸盐阴离子、碳酸盐阴离子、有机二元酸阴离子和有机多元酸阴离子。
5.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根和乳酸根，并且所述组合物中单价阴离子的浓度至多等于、优选小于所述组合物中缓冲物质的浓度，例如小于约9mM。
6.权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中所述单价阴离子选自MES、MOPS和HEPES的阴离子，并且所述组合物中单价阴离子的浓度至少等于、优选高于所述组合物中缓冲物质的浓度。
7.权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间，优选在约6.9至约7.9之间，例如在约7.0至约7.8之间。
8.权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中水是所述组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂总量小于约0.5％(v/v)。
9.权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物的摩尔渗透压浓度至多约为400×10-3osmol/kg。
10.权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l，优选约10mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
11.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含冷冻保护剂，优选浓度为至少约1％w/v，其中所述冷冻保护剂优选包含选自碳水化合物和糖醇的一种或多种化合物，更优选所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇及其组合，更优选所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。
12.权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物基本上不含冷冻保护剂。
13.权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
14.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述阳离子可电离脂质具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8环亚烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x是0、1或2。
15.权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中：
(α)所述阳离子可电离脂质选自以下结构I-1至I-36：
(β)所述阳离子可电离脂质选自以下结构A至F：
或
(γ)所述阳离子可电离脂质是具有结构I-3的脂质。
16.权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述LNP进一步包含一种或多种其他脂质，优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述LNP包含阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇。
17.权利要求16所述的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质优选具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或未饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多个酯键中断；且w具有在30至60之间的平均值。
18.权利要求16所述的组合物，其中所述聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，其中所述聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物优选是选自由聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物、聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
19.权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰磷基脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。
20.权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。
21.权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中所述水相不包含螯合剂。
22.权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述LNP包含所述组合物中包含的RNA的至少约75％，优选至少约80％。
23.权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述RNA包封在所述LNP内或与所述LNP缔合。
24.权利要求1至23中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含替代尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷优选选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
25.权利要求1至24中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含以下中的至少一个、优选以下全部：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。
26.权利要求25所述的组合物，其中所述poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中所述poly-A序列优选为中断的A核苷酸序列。
27.权利要求25或26所述的组合物，其中所述5’帽是cap1或cap2结构。
28.权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述RNA编码一种或多种多肽，其中所述一种或多种多肽优选包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
29.权利要求28所述的组合物，其中所述RNA包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
30.权利要求28或29所述的组合物，其中所述RNA包含编码全长SARS-CoV2 S蛋白变体的ORF，所述变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。
31.权利要求29或30所述的组合物，其中所述SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的相同性。
32.权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是冷冻形式。
33.权利要求32所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的RNA完整性相比至少为50％。
34.权利要求32或33所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于所述组合物冷冻前LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
35.权利要求1至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物是液体形式。
36.一种制备包含分散在最终水相中的LNP的组合物的方法，其中
所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；
所述最终水相包括最终缓冲系统，所述最终缓冲系统包含最终缓冲物质和最终单价阴离子，
所述最终缓冲物质选自Tris及其质子化形式、Bis-Tris甲烷及其质子化形式、TEA及其质子化形式，并且
所述最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根、乳酸根、MES的阴离子、MOPS的阴离子和HEPES的阴离子；
所述组合物中最终缓冲物质的浓度至多为约25mM；并且
所述最终水相基本上不含无机磷酸盐阴离子，基本上不含柠檬酸盐阴离子，且基本上不含EDTA的阴离子；
其中所述方法包括：
(I)制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂，其中所述LNP包含阳离子可电离脂质和RNA；和
(II)任选将所述制剂冷冻至约-10℃或更低，
从而获得所述组合物，
其中步骤(I)包括：
(a)制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(b)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(c)将根据(a)制备的RNA溶液与根据(b)制备的乙醇溶液混合，从而制备第一中间制剂，其包含分散在第一水相中的LNP，所述第一水相包含第一缓冲系统；和
(d)使用包含最终缓冲系统的最终含水缓冲溶液过滤根据(c)制备的第一中间制剂，
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
37.权利要求36所述的方法，其中步骤(I)进一步包括选自稀释和过滤的一个或多个步骤。
38.权利要求36或37所述的方法，其中步骤(I)包括：
(a’)提供RNA水溶液；
(b’)提供包含第一缓冲系统的第一含水缓冲溶液；
(c’)将根据(a’)提供的RNA水溶液与根据(b’)提供的第一含水缓冲溶液混合，从而制备含有水和第一缓冲系统的RNA溶液；
(d’)制备包含阳离子可电离脂质，和，如果存在，一种或多种其他脂质的乙醇溶液；
(e’)将根据(c’)制备的RNA溶液与根据(d’)制备的乙醇溶液混合，从而制备第一中间制剂，其包含分散在第一水相中的LNP，所述第一水相包含第一缓冲系统；
(f’)任选使用包含另一缓冲系统的另一含水缓冲溶液过滤根据(e’)制备的第一中间制剂，从而制备另一中间制剂，其包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；
(g’)任选重复步骤(f’)一次或两次或更多次，其中在步骤(f’)的一次循环之后获得的另一中间制剂用作下一循环的第一中间制剂，所述另一中间制剂包含分散在另一水相中的LNP，所述另一水相包含另一缓冲系统，其中在每个循环中，所述另一含水缓冲溶液与所述第一含水缓冲溶液可以相同或不同；
(h’)使用包含最终缓冲系统且pH值至少为6.0的最终含水缓冲溶液，
如果不存在步骤(f’)，则过滤在步骤(e’)中获得的第一中间制剂，或者
如果存在步骤(f’)而不存在步骤(g’)，则过滤在步骤(f’)中获得的另一中间制剂，或者
如果存在步骤(f’)和(g’)，则过滤在步骤(g’)之后获得的另一中间制剂；
以及
(i’)任选使用稀释溶液稀释在步骤(h’)中获得的制剂；
从而制备包含分散在最终水相中的LNP的制剂。
39.权利要求36至38中任一项所述的方法，其中过滤是切向流过滤或渗滤，优选切向流过滤。
40.权利要求36至39中任一项所述的方法，其包括(II)将所述制剂冷冻至约-10℃或更低。
41.权利要求36至40中任一项所述的方法，其中所述最终缓冲物质是Tris及其质子化形式。
42.权利要求36至41中任一项所述的方法，其中所述组合物中最终缓冲物质、特别是Tris及其质子化形式的浓度为至多约20mM，优选至多约15mM，更优选至多约10mM，例如约10mM。
43.权利要求36至42中任一项所述的方法，其中所述水相基本上不含无机硫酸盐阴离子和/或碳酸盐阴离子和/或有机二元酸阴离子和/或有机多元酸阴离子，特别是基本上不含无机硫酸盐阴离子、碳酸盐阴离子、有机二元酸阴离子和有机多元酸阴离子。
44.权利要求36至43中任一项所述的方法，其中
(i)在步骤(a)中制备的RNA溶液还包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子，以及步骤(d)是在去除所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子的条件下进行，产生包含分散在最终水相中的LNP的制剂，所述最终水相基本上不含在步骤(a)中制备的RNA溶液中存在的所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子；或者
(ii)第一含水缓冲溶液和第一水相包含一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子，并且步骤(f’)至(h’)中的至少一个步骤是在从第一中间制剂和/或从另一中间制剂中去除所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子的条件下进行。
45.权利要求36至44中任一项所述的方法，其中
(i)在步骤(a)中获得的RNA溶液的pH值低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5；或者
(ii)第一含水缓冲溶液的pH值低于6.0，优选至多约5.0，更优选至多约4.5。
46.权利要求44或45所述的方法，其中所述一种或多种有机二元酸和/或有机多元酸阴离子包含柠檬酸盐阴离子和/或EDTA的阴离子。
47.权利要求36至43中任一项所述的方法，其中
(i)在步骤(a)中使用的第一缓冲系统包含步骤(d)中使用的最终缓冲物质和最终单价阴离子，优选在步骤(a)中使用的第一缓冲系统的缓冲系统和pH与在步骤(d)中使用的最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同；或者
(ii)在步骤(b’)、(f’)和(g’)中使用的每个第一缓冲系统和每个另一缓冲系统包含在步骤(h’)中使用的最终缓冲物质和最终单价阴离子，优选在步骤(b’)、(f’)和(g’)中使用的每个第一含水缓冲溶液和每个另一含水缓冲溶液的缓冲系统和pH与最终含水缓冲溶液的缓冲系统和pH相同。
48.权利要求36至47中任一项所述的方法，其中所述最终单价阴离子选自氯离子、乙酸根、乙醇酸根和乳酸根，并且所述组合物中最终单价阴离子的浓度至多等于、优选小于所述组合物中最终缓冲物质的浓度，例如小于约9mM。
49.权利要求36至48中任一项所述的方法，其中所述最终单价阴离子选自MES、MOPS和HEPES的阴离子，并且所述组合物中最终单价阴离子的浓度至少等于、优选高于所述组合物中最终缓冲物质的浓度。
50.权利要求36至49中任一项所述的方法，其中所述组合物的pH在约6.5至约8.0之间，优选在约6.9至约7.9之间，例如在约7.0至约7.8之间。
51.权利要求36至50中任一项所述的方法，其中水是所述制剂和/或组合物中的主要成分和/或所述组合物中含有的除水以外的溶剂总量小于约0.5％(v/v)。
52.权利要求36至51中任一项所述的方法，其中所述组合物的摩尔渗透压浓度至多约为400×10-3osmol/kg。
53.权利要求36至52中任一项所述的组合物，其中所述组合物中RNA的浓度为约5mg/l至约150mg/l，优选约10mg/l至约130mg/l，更优选约30mg/l至约120mg/l。
54.权利要求36至53中任一项所述的方法，其中(i)步骤(I)进一步包括使用稀释溶液稀释根据(d)制备的制剂，或者，存在步骤(i’)，其中稀释溶液包含冷冻保护剂；和/或
(ii)在步骤(I)中获得的制剂和所述组合物包含冷冻保护剂，优选浓度为至少约1％w/v，其中所述冷冻保护剂优选包含选自碳水化合物和糖醇的一种或多种保护剂，更优选所述冷冻保护剂选自蔗糖、葡萄糖、甘油、山梨醇以及其组合，更优选所述冷冻保护剂包含蔗糖和/或甘油。
55.权利要求36至53中任一项所述的方法，其中在步骤(I)中获得的制剂和所述组合物基本上不含冷冻保护剂。
56.权利要求36至55中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质包含头基，所述头基包括至少一个能够在生理条件下质子化的氮原子。
57.权利要求36至56中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质具有式(I)的结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2之一是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8环亚烷基、C3-C8环亚烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；和
x是0、1或2。
58.权利要求36至56中任一项所述的方法，其中：
(α)所述阳离子可电离脂质选自以下结构I-1至I-36：
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(β)所述阳离子可电离脂质选自以下结构A至F：
或
(γ)所述阳离子可电离脂质是具有结构I-3的脂质。
59.权利要求36至58中任一项所述的方法，其中在步骤(b)或(d’)中制备的乙醇溶液进一步包含一种或多种其他脂质，并且LNP进一步包含一种或多种其他脂质，其中所述一种或多种其他脂质优选选自聚合物缀合脂质、中性脂质、类固醇及其组合，更优选所述一种或多种其他脂质包含聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇。
60.权利要求59所述的方法，其中所述聚合物缀合脂质包含聚乙二醇化脂质，其中所述聚乙二醇化脂质优选具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链、饱和或未饱和的烷基链，其中烷基链任选地被一个或多个酯键中断；且w具有在30至60之间的平均值。
61.权利要求59所述的方法，其中所述聚合物缀合脂质包含聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物，其中所述聚肌氨酸脂质缀合物或聚肌氨酸与脂质样物质的缀合物优选是选自由聚肌氨酸二酰基甘油缀合物、聚肌氨酸二烷氧基丙基缀合物、聚肌氨酸磷脂缀合物、聚肌氨酸神经酰胺缀合物及其混合物组成的组的成员。
62.权利要求59至61中任一项所述的方法，其中所述中性脂质是磷脂，优选选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂，更优选选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、双十五酰基磷脂酰胆碱、二月桂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(DAPC)、双二十二碳酰基磷脂酰胆碱(DBPC)、双二十三酰基磷脂酰胆碱(DTPC)、双二十四酰磷脂酰胆碱(DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆甾烯基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(DLPE)和二植酰基磷脂酰乙醇胺(DPyPE)。
63.权利要求59至62中任一项所述的方法，其中所述类固醇包含固醇，例如胆固醇。
64.权利要求36至63中任一项所述的方法，其中所述阳离子可电离脂质、聚合物缀合脂质、中性脂质和类固醇以20％至60％阳离子可电离脂质、0.5％至15％聚合物缀合脂质、5％至25％中性脂质和25％至55％类固醇的摩尔比存在于乙醇溶液中，优选摩尔比为45％至55％阳离子可电离脂质、1.0％至5％聚合物缀合脂质、8％至12％中性脂质和35％至45％类固醇。
65.权利要求36至64中任一项所述的方法，其中所述最终水相不包含螯合剂。
66.权利要求36至65中任一项所述的方法，其中所述LNP包含所述组合物中包含的RNA的至少约75％，优选至少约80％。
67.权利要求36至66中任一项所述的方法，其中所述RNA包封在所述LNP内或与所述LNP缔合。
68.权利要求36至67中任一项所述的方法，其中所述RNA包含替代尿苷的修饰的核苷，其中所述修饰的核苷优选选自假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基-尿苷(m5U)。
69.权利要求36至68中任一项所述的方法，其中所述RNA包含以下中的至少一个、优选以下全部：5’帽；5’UTR；3’UTR；和poly-A序列。
70.权利要求69所述的方法，其中所述poly-A序列包含至少100个A核苷酸，其中所述poly-A序列优选是中断的A核苷酸序列。
71.权利要求69或70所述的方法，其中所述5’帽是cap1或cap2结构。
72.权利要求36至71中任一项所述的方法，其中所述RNA编码一种或多种多肽，其中所述一种或多种多肽优选包含用于在受试者中诱导针对抗原的免疫应答的表位。
73.权利要求72所述的方法，其中所述RNA包含编码氨基酸序列的开放阅读框(ORF)，所述氨基酸序列包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体、或者SARS-CoV-2S蛋白或其免疫原性变体的免疫原性片段。
74.权利要求72或73所述的方法，其中所述RNA包含编码全长SARS-CoV2 S蛋白变体的ORF，所述变体在SEQ ID NO:1的986和987位置具有脯氨酸残基取代。
75.权利要求73或74所述的方法，其中所述SARS-CoV2 S蛋白变体与SEQ ID NO:7具有至少80％的相同性。
76.权利要求36至39和41至75中任一项所述的方法，其不包括步骤(II)。
77.一种储存组合物的方法，其包括根据权利要求36至75中任一项所述的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约-90℃至约-10℃的温度范围内，例如约-90℃至约-40℃或约-25℃至约-10℃。
78.权利要求77所述的方法，其中将所述组合物储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少24个月或至少36个月。
79.一种储存组合物的方法，其包括根据权利要求36至78中任一项所述的方法制备组合物，并将所述组合物储存在约0℃至约20℃的温度范围内，例如约1℃至约15℃，约2℃至约10℃，或约2℃至约8℃或约5℃的温度。
80.权利要求79所述的方法，其中将所述组合物储存至少1周，例如至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月或至少6个月。
81.一种组合物，其可通过权利要求36至80中任一项所述的方法制备。
82.权利要求81所述的组合物，其是冷冻形式。
83.权利要求82所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后的RNA完整性与所述组合物冷冻前的组合物的RNA完整性相比至少为50％。
84.权利要求82或83所述的组合物，其中所述冷冻组合物解冻后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于所述组合物冷冻前LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
85.权利要求81所述的组合物，其是液体形式。
86.权利要求85所述的组合物，其中所述组合物储存至少1周后的RNA完整性与储存前的RNA完整性相比至少为50％。
87.权利要求85或86所述的组合物，其中所述组合物储存至少一周后LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或多分散性指数(PDI)等于储存前LNP的尺寸(Z平均)和/或尺寸分布和/或PDI。
88.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过权利要求36至75、77和78中任一项所述的方法制备的冷冻组合物，并解冻所述冷冻组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
89.一种制备即用型药物组合物的方法，所述方法包括提供通过权利要求36至39、41至76、79和80中任一项的方法制备的液体组合物的步骤，从而获得所述即用型药物组合物。
90.一种即用型药物组合物，其可通过权利要求88或89所述方法制备。
91.权利要求1至35、81至87和90中任一项所述的组合物，用于治疗。
92.权利要求1至35、81至87和90中任一项所述的组合物，用于在受试者中诱导免疫应答。
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