CN118176209A - 涉及用于抗原疫苗接种的非免疫原性rna和pd-1轴结合拮抗剂的治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及用于抗原疫苗接种和诱导有效的抗原特异性免疫效应细胞应答(例如T细胞应答)的方法和药剂。这些方法和药剂尤其可用于治疗以表达免疫效应细胞所针对的抗原的病变细胞为特征的疾病。在一些实施方案中，本公开内容涉及包括以下的方法：向对象施用(i)编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA，即编码疫苗抗原的非免疫原性RNA；和(ii)PD‑1轴结合拮抗剂，例如抗PD‑1抗体和/或抗PD‑L1抗体。

Description

涉及用于抗原疫苗接种的非免疫原性RNA和PD-1轴结合拮抗 剂的治疗
技术领域
本公开内容涉及用于抗原疫苗接种和诱导有效的抗原特异性免疫效应细胞应答(例如T细胞应答)的方法和药剂。特别地，这些方法和药剂特别可用于治疗以表达免疫效应细胞所针对的抗原的病变细胞为特征的疾病。在一些实施方案中，本公开内容涉及包括以下的方法：向对象施用(i)编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA，即编码疫苗抗原的非免疫原性RNA；和(ii)PD-1轴结合拮抗剂，例如抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体。向对象施用编码疫苗抗原的非免疫原性RNA可提供(在合适的靶细胞表达RNA之后)用于刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞的疫苗抗原，并且因此可在对象中诱导针对疫苗抗原(和疾病相关抗原)的免疫应答。在一些实施方案中，免疫效应细胞携带对抗原或其加工产物具有结合特异性的抗原受体，例如T细胞受体(T cellreceptor，TCR)或嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)。在一些实施方案中，免疫效应细胞经遗传修饰以表达抗原受体。这样的遗传修饰可离体或在体外实现并随后可将免疫效应细胞施用于需要治疗的对象，和/或这样的遗传修饰可在需要治疗的对象中在体内实现。免疫效应细胞可以来自需要治疗的对象，并且可以是在需要治疗的对象中为内源性的。免疫效应细胞的抗原受体可靶向与疾病相关的抗原。如本文所表明的，与标准RNA诱导的免疫效应细胞例如T细胞相比，通过施用非免疫原性RNA诱导的免疫效应细胞例如T细胞表达更高水平的PD-1。因此，通过施用非免疫原性RNA诱导的免疫效应细胞例如T细胞易受PD-1/PD-L1阻断的影响，导致增强的免疫效应细胞扩增和免疫应答。因此，向对象施用PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体)可在对象中强烈增强针对疫苗抗原(和疾病相关抗原)的免疫应答。
背景技术
免疫系统在癌症、自身免疫、变态反应以及病原体相关疾病中发挥着重要作用。T细胞是抗肿瘤免疫应答的重要介导物。CD4+T细胞能够许可树突细胞(dendritic cell，DC)引发抗肿瘤CD8+T细胞应答，并且可通过IFNγ介导的MHC上调和生长抑制而直接作用于肿瘤细胞。它们介导包括CD8+T细胞在内的不同免疫亚组流入肿瘤，其中CD8+T细胞可以直接裂解肿瘤细胞。
T细胞应答不仅针对病原体而且针对肿瘤被自然诱导。这样的肿瘤特异性T细胞应答可通过治疗性抗癌疫苗接种来诱导或进一步促进，前提是抗原以DC在能够使T细胞致敏和增殖的环境中成熟为强效的抗原呈递细胞的方式递送。
在基于mRNA的疫苗平台的情况下，mRNA可通过脂质体制剂(RNA-脂质复合物，RNA-LPX)递送至位于次级淋巴器官中的抗原呈递细胞中，而不需要任何另外的佐剂用于免疫刺激(Kreiter,S.et al.Nature 520,692–696(2015)；Kranz,L.M.et al.Nature 534,396–401(2016))。
在以前的研究中，优化了抗原编码RNA的胞内稳定性、翻译效率(Holtkamp,Silkeet al.,2006,Blood 108(13):4009–17；Kuhn,AN et al.,2010,Gene Therapy 17(8):961–71；Orlandini von Niessen,Alexandra G.et al.,2019,Molecular Therapy 27(4):824–36)并增强了MHC I类和II类呈递(Kreiter,S.et al.,2008,The Journal of Immunology180(1):309–18)。静脉内施用的脂质体配制的RNA(RNA-LPX)旨在将编码的抗原的翻译和MHC呈递特异性地靶向至淋巴器官内的常驻树突状细胞(Kranz,Lena Mareen et al.,2016,Nature 534(7607):396–401)。由DC内化的RNA-LPX模拟感染性非自身并作为天然TLR7/8配体发挥作用，触发强烈的I型IFN主导的伴有促炎细胞因子的先天应答。
RNA-LPX疫苗平台由未经双链RNA纯化的经非核苷修饰的RNA(标准RNA，stdRNA)组成，可同时提供靶标身份，即抗原和佐剂。
为了降低疫苗RNA的免疫原性，可对核苷进行修饰并可消除剩余的双链RNA。合成了N1-甲基-假尿苷(N1-methyl-pseudourine)修饰的和纤维素纯化的疫苗RNA(经修饰的RNA，modRNA)(Andries,Oliwia et al.,2015,Journal of Controlled Release:OfficialJournal of the Controlled Release Society 217:337–44；Markus etal.,2019,Molecular Therapy-Nucleic Acids 15(April)；Pardi,Norbert et al.,2015,Journal of Controlled Release:Official Journal of the Controlled ReleaseSociety 217:345–51)。与stdRNA相比，modRNA限制了免疫活化和全身性IFNα释放。
在此描述了与用stdRNA诱导的细胞相比，modRNA诱导的免疫效应细胞(例如T细胞)表达更高水平的PD-1。表明了modRNA疫苗接种与PD-1轴结合拮抗剂治疗的组合产生了有效的抗原特异性免疫应答和有效的疫苗接种例如抗肿瘤活性。
发明内容
本发明一般性地包括对对象进行免疫治疗性治疗，包括(i)向对象施用编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA，即编码疫苗抗原的非免疫原性RNA；和(ii)例如通过施用PD-1轴结合拮抗剂或编码抗PD-1轴结合拮抗剂的RNA来向对象提供PD-1轴结合拮抗剂，例如抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体。本文中所述的免疫治疗包含疫苗治疗，并且还可包含基于细胞的免疫治疗例如基于TIL或T细胞的治疗，例如基于TCR或CAR转基因T细胞的治疗，其使用例如自体细胞。一般而言，使用本文中所述的治疗刺激的免疫效应细胞可靶向表达抗原的细胞，例如病变细胞，特别是表达肿瘤抗原的癌细胞。靶细胞可在细胞表面上表达抗原或可呈递抗原的加工产物。在一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原，并且疾病是癌症。这样的治疗提供了表达抗原的细胞的选择性根除，从而使对不表达该抗原的正常细胞的不良作用最小化。免疫效应细胞(任选地经遗传修饰以表达抗原受体)靶向抗原或其加工产物，并且因此靶向表达该抗原的靶细胞群或靶组织。这样的免疫效应细胞可施用于需要治疗的对象，或者在需要治疗的对象中可以是内源性的。在一些实施方案中，免疫效应细胞携带对靶抗原或其加工产物具有结合特异性的抗原受体，例如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，免疫效应细胞经遗传修饰以表达抗原受体。用于表达抗原受体的这样的遗传修饰可离体或在体外实现并随后可将免疫效应细胞施用于需要治疗的对象，或者这样的遗传修饰可在需要治疗的对象中在体内实现，或者可通过离体或体外和体内修饰的组合实现。施用编码疫苗抗原的非免疫原性RNA以提供(在合适的靶细胞表达多核苷酸之后)用于刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞的抗原，所述免疫效应细胞靶向靶抗原或其加工产物。在一些实施方案中，根据本公开内容的待诱导的免疫应答是针对表达免疫效应细胞所针对的抗原的靶细胞群或靶组织的免疫应答。在一些实施方案中，根据本公开内容的待诱导的免疫应答是T细胞介导的免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是抗肿瘤免疫应答，并且靶细胞群或靶组织是肿瘤细胞或肿瘤组织。
可通过施用PD-1轴结合拮抗剂来提供PD-1轴结合拮抗剂，例如抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体。或者，PD-1轴结合拮抗剂例如抗PD-1抗体和/或抗PD-L1抗体可以以编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA的形式施用。在一些实施方案中，所述RNA靶向肝以用于全身可用性。肝细胞可被有效地转染，并且能够产生大量的蛋白质。
本文中所述的方法和药剂还可针对免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA的施用或包含而提供。在一些实施方案中，本文中所述的方法和药剂不针对免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA的施用或包含而提供。在一些实施方案中，本文中所述的方法和药剂针对免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA的施用或包含而提供。
免疫刺激剂可与药代动力学修饰基团(下文称为“延长药代动力学(pharmacokinetic，PK)”免疫刺激剂)连接。在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA靶向肝以实现全身利用性。肝细胞可被有效地转染，并且能够产生大量的蛋白质。
编码疫苗抗原的RNA优选靶向次级淋巴器官。
在一个方面中，本文中提供了用于在对象中诱导免疫应答的方法，其包括：
(i)向对象施用编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；以及
(ii)向对象提供PD-1轴结合拮抗剂。
在一些实施方案中，对象患有与抗原的表达或升高表达相关的疾病、障碍或病症。
在一个方面中，本文中提供了用于治疗患有与抗原的表达或升高表达相关的疾病、障碍或病症的对象的方法，其包括：
(i)向对象施用编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；以及
(ii)向对象提供PD-1轴结合拮抗剂。
在一些实施方案中，免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
在一些实施方案中，免疫应答包含抗原特异性T细胞的产生。
在一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是癌症。
在一些实施方案中，方法包括向对象施用：
(i)编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；以及
(ii)PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
在一些实施方案中，方法包括向对象施用：
(i)编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；以及
(ii)PD-1轴结合拮抗剂。
在一些实施方案中，与标准RNA相比，非免疫原性RNA在施用时导致降低的树突细胞的活化、T细胞的活化和/或IFN-α的分泌。
在一些实施方案中，通过并入经修饰核苷和/或限制双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)的量，使非免疫原性RNA成为非免疫原性的。在一些实施方案中，通过并入经修饰核苷和/或除去dsRNA，使非免疫原性RNA成为非免疫原性的。
在一些实施方案中，经修饰核苷抑制RNA介导的先天免疫受体激活。
在一些实施方案中，经修饰核苷包含将一个或更多个尿苷替代为包含经修饰核碱基的核苷。
在一些实施方案中，经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。
在一些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
在一些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是1-甲基-假尿苷。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是mRNA。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是体外转录的RNA。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以用于靶向淋巴系统的制剂施用。
在一些实施方案中，淋巴系统包括次级淋巴器官，特别是脾。在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以用于靶向树突细胞的制剂施用。
在一些实施方案中，树突细胞是未成熟的树突细胞。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以包含脂质复合物(lipoplex，LPX)颗粒的制剂施用。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂包含PD-1结合拮抗剂。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂包含抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含纳武单抗(nivolumab)或派姆单抗(pembrolizumab)。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂包含PD-L1结合拮抗剂。
在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包含抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗、阿维单抗(avelumab)或度伐单抗。
在一些实施方案中，方法包括施用免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA。
在一些实施方案中，方法不包括施用免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA。
在一些实施方案中，免疫刺激剂是促炎或抗炎免疫刺激剂。
在一些实施方案中，免疫刺激剂包含细胞因子或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子包含I型干扰素或其变体。
在一些实施方案中，I型干扰素包含干扰素-α或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子包含白介素或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子支持T细胞致敏。
在一些实施方案中，细胞因子包含IL12、IL15或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子支持T细胞增殖和/或维持。
在一些实施方案中，细胞因子包含IL2、IL7或其变体。
在一些实施方案中，免疫刺激剂是延长药代动力学(PK)免疫刺激剂。在一些实施方案中，延长的PK免疫刺激剂包含融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含免疫刺激剂部分和选自血清白蛋白、免疫球蛋白片段、转铁蛋白、Fn3及其变体的部分。在一些实施方案中，血清白蛋白包括小鼠血清白蛋白或人血清白蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白片段包含免疫球蛋白Fc结构域。
在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA存在于用于靶向淋巴系统的制剂中。
在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA存在于用于靶向肝的制剂中。
在一些实施方案中，淋巴系统是次级淋巴器官，特别是脾。
在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA是非免疫原性的。在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA是mRNA。在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA是体外转录的RNA。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以及PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA以共同或单独的制剂施用。
在一些实施方案中，方法是用于在对象中治疗或预防癌症的方法。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA在对象的细胞中瞬时表达。
在一些实施方案中，对象是人。
在一个方面中，本文中提供了药物制剂，其包含：
(i)编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；和
(ii)PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
在一些实施方案中，药物制剂用于治疗与抗原的表达或升高表达相关的疾病、障碍或病症。
在一些实施方案中，免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
在一些实施方案中，免疫应答包含抗原特异性T细胞的产生。
在一些实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原。
在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是癌症。
在一些实施方案中，药物制剂包含：
(i)编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；和
(ii)PD-1轴结合拮抗剂。
在一些实施方案中，与标准RNA相比，非免疫原性RNA在施用时导致降低的树突细胞的活化、T细胞的活化和/或IFN-α的分泌。
在一些实施方案中，通过并入经修饰核苷和/或限制双链RNA(dsRNA)的量，使非免疫原性RNA成为非免疫原性的。在一些实施方案中，通过并入经修饰核苷和/或除去dsRNA，使非免疫原性RNA成为非免疫原性的。
在一些实施方案中，经修饰核苷抑制RNA介导的先天免疫受体激活。
在一些实施方案中，经修饰核苷包含将一个或更多个尿苷替代为包含经修饰核碱基的核苷。
在一些实施方案中，经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。
在一些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
在一些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是1-甲基-假尿苷。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是mRNA。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是体外转录的RNA。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA存在于用于靶向淋巴系统的制剂中。在一些实施方案中，淋巴系统包括次级淋巴器官，特别是脾。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA存在于用于靶向树突细胞的制剂中。
在一些实施方案中，树突细胞是未成熟的树突细胞。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA存在于包含脂质复合物(LPX)颗粒的制剂中。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂包含PD-1结合拮抗剂。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂包含抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含纳武单抗或派姆单抗。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂包含PD-L1结合拮抗剂。
在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包含抗PD-L1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗或度伐单抗(durvalumab)。
在一些实施方案中，药物制剂包含免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA。
在一些实施方案中，药物制剂不包含免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA。
在一些实施方案中，免疫刺激剂是促炎或抗炎免疫刺激剂。
在一些实施方案中，免疫刺激剂包含细胞因子或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子包含I型干扰素或其变体。
在一些实施方案中，I型干扰素包含干扰素-α或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子包含白介素或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子支持T细胞致敏。
在一些实施方案中，细胞因子包含IL12、IL15或其变体。
在一些实施方案中，细胞因子支持T细胞增殖和/或维持。
在一些实施方案中，细胞因子包含IL2、IL7或其变体。
在一些实施方案中，免疫刺激剂是延长药代动力学(PK)免疫刺激剂。在一些实施方案中，延长的PK免疫刺激剂包含融合蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包含免疫刺激剂部分和选自血清白蛋白、免疫球蛋白片段、转铁蛋白、Fn3及其变体的部分。在一些实施方案中，血清白蛋白包括小鼠血清白蛋白或人血清白蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白片段包含免疫球蛋白Fc结构域。
在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA存在于用于靶向淋巴系统的制剂中。
在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA存在于用于靶向肝的制剂中。
在一些实施方案中，淋巴系统是次级淋巴器官，特别是脾。
在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA是非免疫原性的。在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA是mRNA。在一些实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA是体外转录的RNA。
在一些实施方案中，编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以及PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA存在于共同或单独的制剂中。
在一些实施方案中，药物制剂是药盒。
在一些实施方案中，药物制剂包含在药物组合物中的编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以及PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
在一些实施方案中，药物制剂包含在单独容器中的编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以及PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
在一些实施方案中，药物制剂还包含使用该药物制剂的说明书。
在一些实施方案中，药物制剂是药物组合物。
在一个方面中，本文中提供的是用于药物用途的本文中所述的药物制剂。
在一些实施方案中，药物用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。
在一些实施方案中，疾病或病症是癌症。
在一个方面中，本文中提供的是用于本文中所述方法的本文中所述药物制剂。
在一些实施方案中，本文所述的RNA是单链RNA，其可在进入细胞(例如接受体细胞)后翻译成相应的蛋白质。除了编码氨基酸序列的野生型或经密码子优化序列(例如，药物活性肽或多肽例如抗原序列(包含表位的肽或多肽)之外，RNA还可包含一种或更多种结构元件，其针对RNA在稳定性和翻译效率方面的最大效力进行了优化(5’帽、5’UTR、3’UTR、poly(A)尾)。在一些实施方案中，RNA包含所有这些元件。在一些实施方案中，β-S-ARCA(D1)(m2 7,2’-OGppSpG)或m2 7,3’-OGppp(m1 2’-O)ApG可用作RNA药物物质5’末端处的特定加帽结构。作为5’-UTR序列，可使用人α-珠蛋白mRNA的5’-UTR序列，其任选地具有经优化的“Kozak序列”以提高翻译效率。作为3’-UTR序列，可使用两种序列元件的组合(FI元件)，所述两种序列元件的组合(FI元件)来源于“分裂的氨基端增强子”(amino terminal enhancer of split，AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)，其置于编码序列与poly(A)尾之间以确保较高的最大蛋白质水平和延长的mRNA持久性。这些是通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来确定的(参见WO 2017/060314，通过引用并入本文)。或者，3’-UTR可以是人β-珠蛋白mRNA的两个重复的3’-UTR。此外，可使用测量长度为110个核苷酸的poly(A)尾，其由以下的区段组成：30个腺苷残基，随后是(随机核苷酸的)10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基。这种poly(A)尾序列被设计成用于增强RNA稳定性和翻译效率。
包含表位的肽或多肽可包含除表位或抗原之外的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，这样的其他氨基酸序列包含增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列。替代地或另外地，这样的其他氨基酸序列包含破坏免疫耐受的氨基酸序列。
本文中所述的核酸(例如RNA)可与聚合物、蛋白质和/或脂质(优选脂质)复合，以产生用于施用的核酸颗粒。如果使用不同核酸的组合，核酸可以复合在一起或分别复合。
附图说明
图1：与用uRNA进行疫苗接种相比，用modRNA进行疫苗接种导致疫苗诱导的抗原特异性CD8+T细胞上PD-1的表达增强
将C57BL/6小鼠(每组和每个时间点n＝3)在第0天和第7天用20μg的由编码H-2Kb限制性表位OVA257-264(SIINFEKL)的modRNA或uRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种两次。对照小鼠接受氯化钠。在每次疫苗接种之后3、5和7天，(a)在脾中表达PD-1的OVA特异性CD8+T细胞的分数(平均值±SEM)和(b)在OVA特异性CD8+T细胞上PD-1的表达(MFI值的平均值±SEM)。(c)第二次疫苗接种之后5天，在血液中OVA特异性CD8+T细胞上PD-1的表达(MFI值的平均值±SEM)。当OVA特异性CD8+T细胞的分数低于1％时，未绘制数据(a、b)。垂直虚线表示治疗天数(a、b)。非配对t检验(c)。**：P≤0.01。modRNA，经核苷修饰的RNA。uRNA，含尿苷的RNA。OVA，鸡卵白蛋白。MFI，中值荧光强度。RNA，核糖核酸。PD-1，程序性死亡受体1。
图2：modRNA疫苗接种的效力通过与检查点阻断组合而增强，特别是在针对自身抗原进行疫苗接种时
(a)将C57BL/6小鼠(每组n＝5)用1或10μg由编码H-2Kb限制性表位OVA257-264(SIINFEKL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种五次(第0、7、14、21和28天)，并同时用200μg抗PD-L1抗体IP进行处理。对照小鼠接受modRNA和同种型或NaCl。从第二次疫苗接种开始，每次疫苗接种之后5天血液中总CD8+T细胞中OVA特异性CD8+T细胞的分数(平均值±SEM)。(b)将C57BL/6小鼠(每组n＝5)用20μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种五次(第0、7、14、21和28天)，并同时用250μg抗PD-1抗体IP进行处理。对照小鼠接受modRNA和同种型或NaCl。每次疫苗接种之后五天，血液中总CD8+T细胞中TRP2特异性CD8+T细胞的分数(平均值±SEM)。垂直虚线表示治疗天数(a、b)。通过混合效应分析和Tukey多重比较检验确定统计学显著性(b)。*：P≤0.05，**：P≤0.01。modRNA，经核苷修饰的RNA。RNA，核糖核酸。OVA，鸡卵白蛋白。TRP2，酪氨酸酶相关蛋白2。PD-1，程序性死亡受体1。PD-L1，程序性死亡受体配体1。
图3：与单独的modRNA疫苗接种相比，modRNA疫苗接种与检查点阻断的组合增强了治疗性抗肿瘤活性
将C57BL/6小鼠(每组n＝10)用B16-F10肿瘤细胞SC进行接种，并在肿瘤接种之后第9天开始直至第65天每周用10μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种。将小鼠同时用抗PD-L1抗体或同种型对照IP进行处理(首次处理：10mg/kg，连续处理：5mg/kg)。对照小鼠接受具有抗PD-L1抗体的对照RNA。(a)个体肿瘤生长。(b)存活。modRNA，经核苷修饰的RNA。RNA，核糖核酸。TRP2，酪氨酸酶相关蛋白2。PD-L1，程序性死亡受体配体1。
图4:与双重组合相比，将IL-2添加至modRNA疫苗接种与检查点阻断的组合增强了抗原特异性CD8+T细胞的诱导
将C57BL/6小鼠(每组n＝7)用20μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种三次(第0、7和14天)，并用10mg/kg抗PD-1抗体或同种型对照IP和3μg IL-2或白蛋白对照IV进行处理，其伴随第二次和第三次疫苗接种。对照小鼠接受氯化钠。(a)第三次疫苗接种之后五天，血液(左)和脾(右)中总CD8+T细胞中TRP2特异性CD8+T细胞的分数。(b)第三次疫苗接种之后5天，脾中TRP2特异性CD8+T细胞与调节性T细胞之比。(c)在用TRP2肽或无肽离体再刺激之后，总CD8+T细胞中分泌IFNγ的TRP2特异性CD8+T细胞的分数。当TRP2特异性CD8+T细胞的分数低于0.5％时，数据未绘制(c)。在用三重组合处理的组中除去了一个异常值(脾；a、b)。每个点代表一只小鼠，水平线：平均值(a、b)。通过单因素ANOVA和Tukey多重比较检验(a、b)或混合效应分析和Tukey多重比较检验(c)确定统计学显著性。ns：P＞0.05，***：P≤0.001，****：P≤0.0001。modRNA，经核苷修饰的RNA。RNA，核糖核酸。TRP2，酪氨酸酶相关蛋白2。Treg，调节性T细胞。PD-1，程序性死亡受体1。
图5：与双重组合相比，将IL-2添加至modRNA疫苗接种与检查点阻断的组合增强了治疗性抗肿瘤活性
将C57BL/6小鼠(每组n＝10)用B16-F10肿瘤细胞SC进行接种，并在肿瘤接种之后第8天开始直至第91天每周用10μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种。将小鼠同时用抗PD-L1抗体IP进行处理(首次处理：10mg/kg，连续处理：5mg/kg)，并在每次疫苗接种/抗PD-L1处理之后两天用1μg IL-2或白蛋白对照IV进行处理。(a)个体肿瘤生长。(b)存活。(c)小鼠响应于处理而经历白癜风的代表性图像。modRNA，经核苷修饰的RNA。RNA，核糖核酸。TRP2，酪氨酸酶相关蛋白2。IL-2，白介素2。PD-L1，程序性死亡受体配体1。
序列描述
下表提供了本文中引用的某些序列的列表。
具体实施方式
尽管下文更详细地描述了本公开内容，但是应理解，本公开内容不限于本文中所描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可变化。还应理解，本文中使用的术语仅出于描述一些具体实施方案的目的，而不旨在限制将仅受所附权利要求书限制的本公开内容的范围。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。
在下文中，将更详细地描述本公开内容的要素。这些要素与一些具体实施方案一起列出，然而，应理解，其可以以任何方式且以任意数量组合以产生另外的实施方案。多种描述的实例和优选的实施方案不应被理解为将本公开内容仅限于明确描述的一些实施方案。该描述应被理解为支持和涵盖将明确描述的实施方案与任何数量的所公开和/或优选的要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有说明，否则本申请中所有描述的要素的任何排列和组合都应被视为被本申请的说明书公开。
除非另有说明，本公开内容的实践将采用本领域文献中所解释的常规化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术。
在整个本说明书和随附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含/包括”以及变化形式将被理解为暗含包括所述的特征、要素、成员、整数或步骤或者特征、要素、成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他特征、要素、成员、整数或步骤或者特征、要素、成员、整数或步骤的组。术语“基本上由……组成”将权利要求书或公开内容的范围限制于特定的特征、要素、成员、整数或步骤，以及不实质上影响权利要求书或公开内容的基本特征和新特征的那些。术语“由……组成”将权利要求书或公开内容的范围限制为指定的特征、要素、成员、整数或步骤。术语“包含/包括”涵盖了术语“基本上由......组成”，而“基本上由......组成”又涵盖了术语“由......组成”。因此，在本申请中每次出现时，术语“包含/包括”可用术语“基本上由......组成”或“由......组成”代替。同样，在本申请中每次出现时，术语“基本上由......组成”可用术语“由......组成”代替。
除非在本文中另外指明或与上下文明显矛盾，否则在描述本公开内容的背景下(尤其是在权利要求的背景下)使用的没有数量词修饰的名词及类似的引用表示一个/种或更多个/种。
除非本文中另外指明或者与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法均可以以任何合适的顺序进行。
本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本公开内容，并且不对本公开内容的另外要求保护的范围构成限制。本说明书中的语言均不应被解释为指明对实践本公开内容必需的任何未要求保护的要素。
本文中使用的术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件、状况或情况可发生或可不发生，并且所述描述包括其中所述事件、状况或情况发生的实例以及其中所述事件、状况或情况不发生的实例。
本文中使用的“和/或”被认为是两个指定特征或组分中的每一者具有或不具有另一者的特定公开内容。例如“X和/或Y”被认为是(i)X、(ii)Y以及(iii)X和Y中每一种的特定公开内容，就如同各自单独地在本文中列出一样。
在本公开内容的背景下，术语“大约”表示普通技术人员将理解的准确度区间，以仍然确保所讨论的特征的技术效果。该术语通常表示与指示数值偏差±10％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％、±0.1％、±0.05％，并例如0.01％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±10％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±5％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值的偏差±4％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±3％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±2％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值的偏差±1％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.9％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.8％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.7％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.6％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.5％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.4％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.3％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.2％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.1％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.05％。在一些实施方案中，“大约”表示与指示的数值偏差±0.01％。如本领域普通技术人员将理解的，给定技术效果的数值的具体的这样的偏差将取决于技术效果的性质。例如，自然或生物技术效果可通常比人为或工程技术效果具有更大的这样的偏差。
本文中值的范围的记载仅旨在用作单独提及落在所述范围内的各个单独值的速记法。除非本文另外说明，否则每个单独值被并入说明书中，如同在本文中单独地记载一样。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文献。无论是上文还是下文，本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)都在此通过引用整体并入。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权由于在先发明而先于这样的公开内容。
定义
下面将提供适用于本公开内容所有方面的定义。除非另外指出，否则以下术语具有以下含义。任何未经定义的术语均具有其领域公认的含义。
本文中使用的术语例如“降低/减少”或“抑制”意指引起水平总体降低例如降低约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、或者约75％或更多的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全的抑制，即减少到零或基本上减少到零。
本文中使用的术语例如“增强”或“升高”意指引起水平的总体提高或增强例如至少约5％或更多、约10％或更多、约15％或更多、约20％或更多、约25％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约75％或更多、或者约100％或更多的能力。
本文所用的“生理pH”是指约7.4的pH。在一些实施方案中，生理pH为7.3至7.5。在一些实施方案中，生理pH为7.35至7.45。在一些实施方案中，生理pH为7.3、7.35、7.4、7.45或7.5。
本公开内容中使用的“％w/v”是指重量比体积百分比，其是测量以溶液总体积(以毫升(mL)计)的百分比表示的溶质的量(以克(g)计)的浓度单位。
本公开内容中使用的“重量％”是指重量百分比，其是测量以总组合物的总重量(以克(g)计)的百分比表示的物质量(以克(g)计)的浓度单位。
本公开内容中使用的“mol％”被定义为一种组分的摩尔数与所有组分的总摩尔数的比率乘以100。
本公开内容中使用的“总脂质的mol％”定义为一种脂质组分的摩尔数与所有脂质的总摩尔数的比率乘以100。在本文中，在一些实施方案中，术语“总脂质”包括脂质和脂质样物质。
术语“离子强度”是指特定溶液中不同种类的离子物质的数目与其各自电荷之间的数学关系。因此，离子强度I在数学上由下式表示：
其中c是特定离子物质的摩尔浓度，并且z是其电荷的绝对值。总和Σ取自溶液中所有不同种类的离子(i)。
根据本公开内容，在一些实施方案中，术语“离子强度”涉及单价离子的存在。关于二价离子，特别是二价阳离子的存在，在一些实施方案中，其浓度或有效浓度(游离离子的存在)由于螯合剂的存在而足够低以阻止核酸的降解。在一些实施方案中，二价离子的浓度或有效浓度低于用于水解核苷酸(例如RNA核苷酸)之间的磷酸二酯键的催化水平。在一些实施方案中，游离二价离子的浓度为20μM或更小。在一些实施方案中，不存在或基本上不存在游离二价离子。
“渗量”是指特定溶质的浓度，以每千克溶剂的溶质的渗透压摩尔数(osmole)表示。
术语“冻干”及其变形是指通过将物质冷冻并随后降低周围压力(例如，低于15Pa、例如低于10Pa、低于5Pa或1Pa或更低)以使该物质中的冷冻介质直接从固相升华至气相而进行的物质的冷冻干燥。因此，术语“冻干”和“冷冻干燥”在本文中可互换使用。
术语“喷雾干燥”是指通过将(加热的)气体与在容器(喷雾干燥器)内雾化(喷雾)的流体混合来使物质喷雾干燥，其中来自所形成的液滴的溶剂蒸发，导致干燥粉末。
术语“重构”涉及向干燥产品添加溶剂(例如水)以使其返回液体状态，例如其原始液体状态。
在本公开内容的背景下的术语“重组”意指“通过遗传工程制备的”。在一些实施方案中，在本公开内容的背景下的“重组物体”不是天然存在的。
本文中使用的术语“天然存在的”是指物体可在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可从自然界中的来源分离且没有在实验室中被人有意修饰的肽或核酸是天然存在的。术语“在自然界中发现”意指“存在于自然界中”并且包括已知的物体以及尚未从自然界发现和/或分离但可在将来从天然来源发现和/或分离的物体。
本文中使用的术语“室温”和“环境温度”在本文中可互换使用，并指至少约15℃，例如约15℃至约35℃，约15℃至约30℃，约15℃至约25℃，或约17℃至约22℃的温度。
术语“EDTA”是指乙二胺四乙酸二钠盐。所有浓度均相对于EDTA二钠盐给出。
术语“冷冻保护剂”涉及添加至制剂以在冷冻阶段期间保护活性成分的物质。
术语“冻干保护剂”涉及添加至制剂以在干燥阶段期间保护活性成分的物质。
根据本公开内容，术语“肽”是指包含通过肽键彼此连接的约两个或更多个、约3个或更多个、约4个或更多个、约6个或更多个、约8个或更多个、约10个或更多个、约13个或更多个、约16个或更多个、约20个或更多个，并且多至约50个、约100个、或约150个连续氨基酸的物质。术语“多肽”是指大肽，特别是具有至少约151个氨基酸的肽。“肽”和“多肽”二者都是蛋白质分子，但是术语“蛋白质”和“多肽”在本文中通常作为同义词使用。
术语“一部分(portion)”指级分(fraction)。对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构，术语其“一部分”可指所述结构的连续或不连续级分。
术语“部分”和“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续元件。例如，结构(例如氨基酸序列或蛋白质)的部分是指所述结构的连续元件。当在组合物的背景下使用时，术语“部分”意指组合物的一部分。例如，组合物的部分可以是所述组合物的0.1％至99.9％(例如0.1％、0.5％、1％、5％、10％、50％、90％或99％)的任何一部分。
关于氨基酸序列(肽或多肽)，“片段”涉及氨基酸序列的一部分，即代表在N端和/或C端缩短的氨基酸序列的序列。在C端缩短的片段(N端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的3’末端的截短的开放阅读框来获得。在N端缩短的片段(C端片段)可例如通过翻译缺少开放阅读框的5’末端的截短的开放阅读框来获得，只要截短的开放阅读框包含用于起始翻译的起始密码子即可。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％的氨基酸残基。氨基酸序列的片段包含来自氨基酸序列的例如至少6个、特别地至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个或至少100个连续氨基酸。氨基酸序列的片段包含例如氨基酸序列的例如多至8个、特别是多至10个、多至12个、多至15个、多至20个、多至30个或多至55个连续氨基酸的序列。
本文中使用的并参照氨基酸序列(肽或多肽)的“变体”意指由于与亲本氨基酸序列相差至少一个氨基酸(例如，不同的氨基酸，或相同氨基酸的修饰)的氨基酸序列。亲本氨基酸序列可以是天然存在的或野生型(wild type，WT)氨基酸序列，或者可以是野生型氨基酸序列的经修饰形式。在一些实施方案中，变体氨基酸序列与亲本氨基酸序列相比具有至少一个氨基酸差异，例如与亲本相比1至约20个氨基酸差异，例如1至约10个或1至约5个氨基酸差异。
本文中的“野生型”或“WT”或“天然的”意指在自然界中存在的氨基酸序列，包括等位基因变化。野生型氨基酸序列、肽或多肽具有未经有意修饰的氨基酸序列。
出于本公开内容的目的，氨基酸序列(肽或多肽)的“变体”可包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。术语“变体”包括所有突变体、剪接变体、翻译后修饰的变体、构象体(conformation)、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。术语“变体”特别地包括氨基酸序列的片段。
氨基酸插入变体包括在特定氨基酸序列中单个或两个或更多个氨基酸的插入。在具有插入的氨基酸序列变体的情况下，一个或更多个氨基酸残基被插入氨基酸序列中的特定位点中，尽管随机插入并合适筛选所得产物也是可以的。氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸的氨基和/或羧基端融合体。氨基酸缺失变体的特征在于从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如，去除1、2、3、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸。缺失可在蛋白质的任何位置中。在蛋白质的N端和/或C端末端包含缺失的氨基酸缺失变体也称为N端和/或C端截短变体。氨基酸替换变体的特征在于去除序列中的至少一个残基，并在其位置中插入另一个残基。优先考虑的是在同源肽或多肽之间非保守的氨基酸序列中的位置中的修饰和/或用具有相似特性的另一些氨基酸来替换氨基酸。在一些实施方案中，肽和多肽变体中的氨基酸变化是保守的氨基酸变化，即类似带电荷或不带电荷氨基酸的替换。保守的氨基酸变化涉及其侧链相关联的氨基酸的家族之一的替换。天然存在的氨基酸通常分为四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)；碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳香族氨基酸。在一些实施方案中，保守氨基酸替换包括以下组内的替换：
-甘氨酸、丙氨酸；
-缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；
-天冬氨酸、谷氨酸；
-天冬酰胺、谷氨酰胺；
-丝氨酸、苏氨酸；
-赖氨酸、精氨酸；以及
-苯丙氨酸、酪氨酸。
在一些实施方案中，给定氨基酸序列与作为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，例如同一性的程度将为至少约60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对为参考氨基酸序列的全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域给出。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则相似性或同一性的程度例如针对至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸(在一些实施方案中的连续氨基酸)给出。在一些实施方案中，相似性或同一性的程度针对参考氨基酸序列的全长给出。用于确定序列相似性，例如序列同一性的比对可使用本领域已知的工具，例如使用最佳序列比对，例如，使用Align，使用标准设置，优选EMBOSS::needle，矩阵:Blosum62，空位开放(Gap Open)10.0，空位延伸(Gap Extend)0.5来完成。
“序列相似性”表明相同的或表示保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表明序列之间相同氨基酸的百分比。两个核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的核苷酸的百分比。
术语“相同(％)”和“同一性(％)”或类似术语特别地旨在是指待比较的序列之间在最佳比对中相同的核苷酸或氨基酸的百分比。所述百分比是纯统计学的，并且两个序列之间的差异可以(但不一定)是随机分布在待比较的序列的全长上。两个序列的比较通常在关于区段或“比较窗口”进行最佳比对以鉴定相应序列的局部区域之后通过比较所述序列来进行。用于比较的最佳比对可人工进行，或者借助于Smith and Waterman,1981,AdsApp.Math.2,482的局部同源性算法，借助于Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48,443的局部同源性算法，借助于Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl Acad.Sci.USA 88,2444的相似性检索算法，或借助于使用所述算法的计算机程序(在Wisconsin GeneticsSoftware Package,Genetics Computer Group,575Science Drive,Madison,Wis中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)来进行。在一些实施方案中，使用可在美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)网站(例如，在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PAGE_TYPE＝BlastSearch&BLAST_SPEC＝blast2seq&LINK_LOC＝aligh2seq)上获得的BLASTN或BLASTP算法来确定两个序列的百分比同一性。在一些实施方案中，在NCBI网站上用于BLASTN算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为28；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)匹配/不匹配评分设置为1、-2；(v)空位成本(Gap Cost)设置为线性；以及(vi)正在使用的低复杂性区域的筛选程序(filter)。在一些实施方案中，在NCBI网站上用于BLASTP算法的算法参数包括：(i)预期阈值设置为10；(ii)字长设置为3；(iii)查询范围内的最大匹配设置为0；(iv)矩阵设置为BLOSUM62；(v)空位成本设置为存在11:延伸:1；以及(vi)条件组成评分矩阵调整。
百分比同一性通过确定待比较序列所对应的相同位置的数目，将该数目除以比较的位置数目(例如，参考序列中的位置数目)，并将该结果乘以100来获得。
在一些实施方案中，针对为参考序列全长的至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域给出相似性或同一性程度。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则针对至少约100、至少约120、至少约140、至少约160、至少约180或约200个核苷酸(在一些实施方案中的连续核苷酸)给出同一性程度。在一些实施方案中，针对参考序列的全长给出相似性或同一性程度。
根据本公开内容，同源氨基酸序列显示出氨基酸残基的至少40％，特别地至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％，以及例如至少95％、至少98％或至少99％同一性。
本文中所述的氨基酸序列变体可由技术人员例如通过重组DNA操作来容易地制备。用于制备具有替换、添加、插入或缺失的肽或多肽的DNA序列操作详细描述于例如Molecular Cloning:ALaboratory Manual,4th Edition,M.R.Green and J.Sambrookeds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 2012。此外，本文中所述的肽、多肽和氨基酸变体可在已知肽合成技术(例如通过固相合成和类似方法)的帮助下容易地制备。
在一些实施方案中，氨基酸序列(肽或多肽)的片段或变体是“功能性片段”或“功能性变体”。术语氨基酸序列的“功能性片段”或“功能性变体”涉及表现出与该片段或变体所来源的氨基酸序列的功能特性相同或相似的一个或更多个功能特性(即，其是功能等同的)的任何片段或变体。关于抗原或抗原序列，一个特定的功能是由该片段或变体所来源于的氨基酸序列所表现出的一种或更多种免疫原性活性。本文中使用的术语“功能性片段”或“功能性变体”特别是指包含与亲本分子或序列的氨基酸序列相比改变一个或更多个氨基酸并且仍然能够实现亲本分子或序列的一种或更多种功能(例如，诱导免疫应答)的氨基酸序列的变体分子或序列。在一些实施方案中，亲本分子或序列的氨基酸序列中的修饰不显著影响或改变该分子或序列的特性。在不同的实施方案中，功能性片段或功能性变体的功能可以降低但仍然显著存在，例如功能性片段或功能性变体的功能可以是亲本分子或序列的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％。然而，在另一些实施方案中，与亲本分子或序列相比，功能性片段或功能性变体的功能可以是增强的。
“来源于”指定氨基酸序列(肽或多肽)的氨基酸序列(肽或多肽)是指第一氨基酸序列的来源。在一些实施方案中，来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列具有与该特定序列或其片段相同、基本上相同或同源的氨基酸序列。来源于特定氨基酸序列的氨基酸序列可以是该特定序列或其片段的变体。例如，本领域普通技术人员将理解，适用于本文中的抗原可被改变，使得它们的序列与它们所来源的天然存在或天然的序列不同，同时保留天然序列的期望活性。
在一些实施方案中，“分离的”意指从天然状态或从人工组合物(例如来自生产过程的组合物)中取去(例如纯化)。例如，天然存在于活动物中的核酸、肽或多肽不是“分离的”，但是部分或完全从其天然状态的共存物质中分离的相同核酸、肽或多肽是“分离的”。分离的核酸、肽或多肽可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如宿主细胞中。
术语“遗传修饰”或简称“修饰”包括用核酸转染细胞。
术语“转染”涉及将核酸(特别是RNA)导入细胞中。出于本公开内容的目的，术语“转染”还包括将核酸导入细胞中或通过这样的细胞摄取核酸，其中所述细胞可以存在于对象(例如患者)中，或者细胞可以在体外(例如患者体外)。因此，根据本公开内容，用于转染本文中所述核酸的细胞可存在于体外或体内，例如所述细胞可形成患者的器官、组织和/或身体的一部分。根据本公开内容，转染可以是瞬时的或稳定的。对于转染的一些应用，如果仅瞬时表达所转染的遗传物质就已足够。可将RNA转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白质。由于在转染过程中引入的核酸通常不会整合到核基因组中，因此外源核酸将通过有丝分裂而被稀释或者降解。允许核酸进行游离扩增的细胞大大降低了稀释率。如果期望所转染的核酸实际上保留在细胞及其子细胞的基因组中，则必须发生稳定的转染。这样的稳定的转染可以通过使用例如基于病毒的系统或基于转座子的系统进行转染来实现。通常来说，编码抗原的核酸被瞬时转染入细胞中。通常来说，经遗传修饰以表达抗原受体的细胞用编码该受体的核酸稳定转染。RNA可被转染到细胞中以瞬时表达其编码的蛋白。
本公开内容包括肽或多肽的类似物。根据本公开内容，肽或多肽的类似物是其所来源于的所述肽或多肽的经修饰形式，并且具有所述肽或多肽的至少一种功能特性。例如，肽或多肽的药理活性类似物具有该类似物所来源于的肽或多肽的至少一种药理活性。这样的修饰包括任何化学修饰，并且包括与该肽或多肽缔合的任何分子(例如碳水化合物、脂质和/或肽或多肽)的单个或多个替换、缺失和/或添加。在一些实施方案中，肽或多肽的“类似物”包括由糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、棕榈酰化、豆蔻酰化、异戊二烯化、脂化、烷基化、衍生化、引入保护/封闭基团、蛋白水解切割或者与抗体或其他细胞配体结合得到的那些经修饰形式。术语“类似物”还延伸到所述肽和多肽的所有功能化学等同物。
本文中使用的术语“连接的”、“融合的”或“融合/融合体”可互换使用。这些术语是指两个或更多个要素或组分或结构域连接在一起。
本文中使用的“内源性”是指来自或产生于生物体、细胞、组织或系统内部的任何物质。
本文中使用的术语“外源性”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或产生的任何物质。
根据本发明的多个实施方案，编码肽或多肽的核酸(例如RNA)被细胞吸收或引入，即转染或转导至细胞中，该细胞可存在于体外或对象中，导致所述肽或多肽的表达。细胞可例如在胞内(例如在胞质和/或细胞核中)表达编码的肽或多肽、可分泌编码的肽或多肽、和/或者可在表面上表达编码的肽或多肽。
根据本公开内容，术语例如“表达……的核酸”和“编码……的核酸”或类似术语在本文中可互换使用，以及关于特定的肽或多肽，意指核酸如果存在于合适的环境中，例如细胞内，可被表达以产生所述肽或多肽。
本文中使用的术语“表达”包括特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
在本公开内容的背景下，术语“转录”涉及其中DNA序列中的遗传密码被转录成RNA(特别是mRNA)的过程。随后，RNA可翻译成肽或多肽。
关于RNA，术语“表达”或“翻译”涉及在细胞的核糖体中的这样的过程，通过该过程，mRNA的链指导组装氨基酸序列以产生肽或多肽。
本文中所述的药物制剂，特别是药盒，可包含指导材料或说明书。本文中使用的“指导材料”或“说明书”包括出版物、录音、图表或可用于传达本发明组合物和方法的有用性的任何其他表达媒介。例如，本发明试剂盒的指导材料可附接至包含本发明组合物的容器，或者与包含该组合物的容器一起运输。或者，指导材料可与容器分开运输，目的是指导材料和组合物由接受者协同使用。
本文中所述的特定化合物的前药是那些在施用于个体之后在生理条件下经历化学转化以提供特定化合物的化合物。另外，前药可以在离体环境中通过化学或生物化学方法转化成特定的化合物。例如，当例如将前药与合适的酶或化学试剂例如一起放入经皮贴剂储库中时，前药可以缓慢转化为特定的化合物。示例性的前药是在体内可水解的酯(使用特定化合物中包含的醇或羧基)或酰胺(使用特定化合物中包含的氨基或羧基)。具体而言，包含在特定化合物中并带有至少一个氢原子的任何氨基都可以转化为前药形式。典型的N-前药形式包括氨基甲酸酯、曼尼希碱、烯胺和烯胺酮。
在本说明书中，化合物的结构式可以表示所述化合物的某种异构体。然而，应该理解的是，本发明包括所有的异构体，例如几何异构体、基于不对称碳的旋光异构体、立体异构体、互变异构体等结构上存在的异构体和异构体混合物，并且不限于式的描述。
“异构体”是具有相同分子式但结构不同(“结构异构体”)或者官能团和/或原子的几何(空间)位置不同(“立体异构体”)的化合物。“对映体”是为彼此不可重叠镜像的立体异构体对。“外消旋混合物”或“外消旋体”包含等量的对映体对，并用前缀(±)表示。“非对映体”是不可重叠且彼此不是镜像的立体异构体。“互变异构体”是同一化学物质的结构异构体，其由于单个原子或原子团的迁移而自发和可逆地相互转化，即使当是纯的时也是如此；即互变异构体处于彼此的动态化学平衡中。互变异构体的实例是酮-烯醇-互变异构的异构体。“构象异构体”是仅通过围绕形式上的单键旋转即可相互转化的立体异构体，并且特别是包含那些导致(杂)环的不同3维形式，例如环己烷的椅型、半椅型、船型和扭船型的立体异构体。
术语“平均直径”是指粒子的平均流体动力学直径，如通过以下所测量的：动态光散射(dynamic light scattering，DLS)以及使用所谓的累积量算法(cumulantalgorithm)进行数据分析，其提供了具有长度维度的所谓的Z平均值和无量纲的多分散性指数(polydispersity index，PI)的结果(Koppel,D.,J.Chem.Phys.57,1972,第4814至4820页,ISO 13321)。这里，粒子的“平均直径”、“直径”或“尺寸”与Z平均值的该值同义。
在一些实施方案中，“多分散性指数”可以通过在“平均直径”的定义中提到的所谓的累积量分析基于动态光散射测量来计算。在一定的前提下，它可以作为纳米粒子系综的尺寸分布的量度。
粒子绕旋转轴的“回转半径”(本文缩写为Rg)是指某一点距旋转轴的径向距离，此处如果假设粒子的整个质量都是集中的，则绕给定轴的转动惯量与其实际质量分布相同。从数学上讲，Rg是粒子组分距其质心或给定轴的均方根距离。例如，对于由n个质量元素、质量mi(i＝1，2，3，…，n)构成的、位于距质心固定距离si处的大分子，Rg是所有质量元素上si 2的质量平均值的平方根，并可如下计算：
回转半径可以通过实验(例如通过使用光散射)确定或计算。特别地，对于小散射向量结构函数S定义如下：
其中N是组分的数量(Guinier定律)。
粒子的“流体动力学半径”(有时称为“斯托克斯半径(Stokes radius)”或“斯托克斯-爱因斯坦半径(Stokes-Einstein radius)”)是以与所述粒子相同的速率扩散的假设硬球的半径。流体动力学半径与粒子的移动性有关，不仅考虑尺寸，还考虑溶剂效应。例如，水合作用更强的更小带电粒子可比水合作用更弱的更大带电粒子具有更大的流体动力学半径。这是因为当更小的粒子在溶液中运动时，会带着更多的水分子。由于溶剂中粒子的实际尺寸无法直接测量，因此流体动力学半径可由斯托克斯-爱因斯坦方程定义：
其中kB是玻尔兹曼常数(Boltzmann constant)；T是温度；η是溶剂的黏度；并且D是扩散系数。扩散系数可以通过实验(例如通过使用动态光散射(DLS))确定。因此，用于确定粒子或粒子群的流体动力学半径(例如本文公开的样品或对照组合物中包含的粒子的流体动力学半径，或从使这样的样品或对照组合物经受场流分级获得的粒子峰的流体动力学半径)的一种程序是测量所述粒子或粒子群的DLS信号(例如本文公开的样品或对照组合物中包含的粒子的DLS信号，或从使这样的样品或对照组合物经受场流分级获得的粒子峰的DLS信号)。
本文使用的表达“光散射”是指由于光通过的介质中的局部不均匀性，光被迫偏离直线轨迹一个或更多个路径的物理过程。
术语“UV”意指紫外线，并指电磁波谱带，其波长为10nm至400nm，即比可见光短但比X射线长。
本文使用的表达“多角度光散射”或“MALS”涉及用于测量被样品散射到多个角度的光的技术。在这方面中,“多角度”意指如例如通过在包括选定的特定角度的范围内移动的单个检测器或固定在特定角度位置的检测器阵列测量的，可以以不同的离散角度检测散射光。在某些实施方案中，在MALS中使用的光源是激光源(MALLS：多角度激光散射)。基于包含粒子的组合物的MALS信号并通过使用合适的形式(例如，齐姆图(Zimm plot)、Berry图或Debye图)，有可能确定回转半径(Rg)并因此可确定所述粒子的尺寸。优选地，齐姆图是使用以下等式的图形表示：
其中c是溶剂中粒子的质量浓度(g/mL)；A2是第二维里系数(mol·mL/g2)；P(θ)是与散射光强度对角度的依赖相关的形状因子；Rθ是超瑞利比(Rayleigh ratio)(cm-1)；并且K*是等于4π2ηo(dn/dc)2λ0 -4NA -1的光学常数，其中ηo是溶剂在入射辐射(真空)波长下的折射率，λ0是入射辐射(真空)波长(nm)，NA是阿伏伽德罗常数(Avogadro’s number)(mol-1)，并且dn/dc是差示折射率增量(mL/g)(参见例如，Buchholz et al.(Electrophoresis 22(2001),4118-4128)；B.H.Zimm(J.Chem.Phys.13(1945),141；P.Debye(J.Appl.Phys.15(1944):338；和W.Burchard(Anal.Chem.75(2003),4279-4291)。优选地，Berry图按以下项计算：
其中c、Rθ和K*如上定义。优选地，Debye图按以下项计算：
其中c、Rθ和K*如上定义。
本文中使用的表达“动态光散射”或“DLS”是指确定粒子的尺寸和尺寸分布谱特别是关于粒子的流体动力学半径的技术。单色光源(通常是激光)通过起偏器射入样品中。然后散射光通过第二个起偏器，在那里被检测到并且产生的图像被投射到屏幕上。溶液中的粒子被光击中，并向各个方向衍射光。来自粒子的衍射光可以相长干涉(亮区)或相消干涉(暗区)。将该过程以短时间间隔重复，并且由自相关仪分析所得的散斑图组，所述自相关仪比较了随时间变化的每个点处的光强度。
本文中使用的表达“静态光散射”或“SLS”是指用于确定粒子尺寸和尺寸分布谱，特别是关于粒子的回转半径和/或粒子的摩尔质量的技术。在含有粒子的溶液中发射高强度单色光，通常是激光。将一个或更多个探测器用于测量一个或许多个角度处的散射强度。为了获得所有半径大分子的摩尔质量和尺寸二者的精确测量结果，需要角度依赖性。因此，在相对于入射光方向的多个角度下的同时测量结果(称为多角度光散射(multi-anglelight scattering，MALS)或多角度激光散射(multi-angle laser light scattering，MALLS))通常被视为静态光散射的标准实现。
核酸
术语“核酸”包含脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、其组合及其经修饰形式。该术语包含基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。在一些实施方案中，核酸是DNA。在一些实施方案中，核酸是RNA。在一些实施方案中，核酸是DNA和RNA的混合物。核酸可作为单链或双链且线性或共价环状闭合的分子存在。核酸可被分离。根据本公开内容，术语“分离的核酸”意指这样的核酸，其(i)对于DNA在体外扩增，例如通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增，或对于RNA在体外转录(使用例如RNA聚合酶)，(ii)通过克隆重组产生，(iii)被纯化，例如通过切割和通过凝胶电泳的分离进行纯化，或(iv)被合成，例如通过化学合成进行合成。
术语“核苷”(本文中缩写为“N”)涉及可以被认为是没有磷酸基团的核苷酸的化合物。尽管核苷是与糖(例如核糖或脱氧核糖)连接的核碱基，核苷酸由核苷和一个或更多个磷酸基团构成。核苷的实例包括胞苷、尿苷、假尿苷、腺苷和鸟苷。
通常构成天然存在的核酸的五种标准核苷是尿苷、腺苷、胸苷、胞苷和鸟苷。五种核苷通常缩写为其单字母代码，分别为U、A、T、C和G。然而，胸苷更通常被写为“dT”(“d”代表“脱氧”)，因为其含有2’-脱氧呋喃核糖部分而不是尿苷中存在的呋喃核糖环。这是因为胸苷存在于脱氧核糖核酸(DNA)而不是核糖核酸(RNA)中。相反，尿苷存在于RNA而非DNA中。其余的三种核苷可存在于RNA和DNA二者中。在RNA中，其将表示为A、C和G，而在DNA中，其将表示为dA、dC和dG。
经修饰嘌呤(A或G)或嘧啶(C、T或U)碱基部分在一些实施方案中被一个或更多个烷基，例如一个或更多个C1-4烷基，例如一个或更多个甲基修饰。经修饰嘌呤或嘧啶碱基部分的具体实例包括N7-烷基-鸟嘌呤、N6-烷基-腺嘌呤、5-烷基-胞嘧啶、5-烷基-尿嘧啶和N(1)-烷基-尿嘧啶，例如N7-C1-4烷基-鸟嘌呤、N6-C1-4烷基-腺嘌呤、5-C1-4烷基-胞嘧啶、5-C1-4烷基-尿嘧啶和N(1)-C1-4烷基-尿嘧啶，优选N7-甲基-鸟嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、5-甲基-尿嘧啶和N(1)-甲基-尿嘧啶。
本文中术语“DNA”涉及包含脱氧核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选实施方案中，DNA包含全部或大部分的脱氧核糖核苷酸残基。本文中使用的“脱氧核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’位缺乏羟基的核苷酸。DNA涵盖但不限于双链DNA、单链DNA、分离的DNA(例如部分纯化的DNA)、基本上纯的DNA、合成DNA、重组产生的DNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的DNA之经修饰DNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部DNA核苷酸或添加至DNA末端。本文中还考虑了DNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或核糖核苷酸。对于本公开内容，这些改变的DNA被认为是天然存在DNA的类似物。如果分子中脱氧核糖核苷酸残基的含量为基于分子中核苷酸残基的总数的超过50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子含有“大部分脱氧核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(无论核苷酸残基是否是标准的(即天然存在的)核苷酸残基还是其类似物)。
DNA可以是重组DNA，并且可以通过核酸(特别是cDNA)的克隆获得。cDNA可通过RNA的逆转录获得。
术语“RNA”涉及包含核糖核苷酸残基的核酸分子。在一些优选的实施方案中，RNA包含全部或大部分核糖核苷酸残基。本文中使用的“核糖核苷酸”是指在β-D-呋喃核糖基的2’位具有羟基的核苷酸。RNA涵盖但不限于双链RNA、单链RNA、经分离的RNA(例如部分纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA以及通过添加、缺失、替换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在的RNA之经修饰RNA。这样的改变可以是指将非核苷酸物质添加至内部RNA核苷酸或添加至RNA末端。本文中还考虑了RNA中的核苷酸可以是非标准核苷酸，例如化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。对于本公开内容，这些改变的/经修饰核苷酸可以被称为天然存在的核苷酸的类似物，并且包含这样的改变的/经修饰核苷酸的相应RNA(即，改变的/经修饰RNA)可以被称为天然存在的RNA的类似物。如果分子中核糖核苷酸残基的含量为基于分子中核苷酸残基的总数的超过50％(例如至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)，则分子包含“大部分的核糖核苷酸残基”。分子中核苷酸残基的总数是所有核苷酸残基的总和(无论核苷酸残基是否是标准的(即天然存在的)核苷酸残基或其类似物)。
“RNA”包含mRNA、tRNA、核糖体RNA(rRNA)、核内小RNA(snRNA)、自扩增RNA(saRNA)、单链RNA(ssRNA)、dsRNA、抑制性RNA(例如反义ssRNA、小干扰RNA(siRNA)或微RNA(miRNA))、激活RNA(例如小激活RNA)和免疫刺激性RNA(isRNA)。在一些实施方案中，“RNA”指mRNA。
本文中使用的术语“体外转录”或“IVT”意指以无细胞方式进行转录(即产生RNA)。即，IVT不使用活的/经培养的细胞，而是使用从细胞提取的转录机器(例如，细胞裂解物或其分离的组分，包括RNA聚合酶(优选T7、T3或SP6聚合酶))。
mRNA
根据本公开内容，术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且包括可通过使用DNA模板产生的“转录物”。通常来说，mRNA编码肽或多肽。
mRNA是单链的，但可能包含自身互补序列，该序列允许mRNA的部分进行折叠并与其自身配对以形成双螺旋。
根据本公开内容，“dsRNA”意指双链RNA，并且是具有两条部分或完全互补链的RNA。
在本公开内容的一些优选实施方案中，mRNA涉及编码肽或多肽的RNA转录物。
在一些实施方案中，优选地编码肽或多肽的mRNA的长度为至少45个核苷酸(例如至少60、至少90、至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少6,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000个核苷酸)，优选地多至15,000个，例如多至14,000个、多至13,000个、多至12,000个核苷酸、多至11,000个核苷酸或多至10,000个核苷酸。
如本领域所确定的，mRNA通常含有5’非翻译区(5’-UTR)、肽/多肽编码区和3’非翻译区(3’-UTR)。在一些实施方案中，mRNA通过体外转录或化学合成产生。在一些实施方案中，mRNA通过使用DNA模板的体外转录产生。体外转录方法是本领域技术人员已知的；参见例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,4th Edition,M.R.Green andJ.Sambrook eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor 2012。此外，多种体外转录试剂盒是可商购的，例如从Thermo Fisher Scientific(例如TranscriptAidTM T7试剂盒、T7试剂盒、)、New EnglandBioLabs Inc.(例如HiScribeTMT7试剂盒、HiScribeTMT7 ARCA mRNA试剂盒)、Promega(例如RiboMAXTM、系统)、Jena Bioscience(例如SP6或T7转录试剂盒)和Epicentre(例如AmpliScribeTM)。为了提供经修饰mRNA，可在合成(优选体外转录)期间并入相应经修饰核苷酸(例如经修饰天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和/或经修饰非天然存在的核苷酸)，或可在转录之后对mRNA进行修饰和/或添加修饰。
在一些实施方案中，mRNA是体外转录的mRNA(IVT-RNA)，并且可通过合适的DNA模板的体外转录获得。用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶。优选地，体外转录由T7或SP6启动子控制。用于体外转录的DNA模板可以通过克隆核酸(特别是cDNA)并将其导入用于体外转录的合适的载体中来获得。cDNA可通过RNA的逆转录获得。
在本公开内容的一些实施方案中，mRNA是“复制子mRNA”或简单地是“复制子”，特别是“自我复制mRNA”或“自我扩增mRNA”。在某些实施方案中，复制子或自我复制mRNA来源于或包含来源于ssRNA病毒(特别是阳性链ssRNA病毒例如甲病毒)的元件。甲病毒是正链RNA病毒的典型代表。甲病毒在受感染细胞的胞质中复制(对于甲病毒生命周期的综述，参见Joséet al.,Future Microbiol.,2009,第4卷,第837至856页)。许多甲病毒的总基因组长度通常为11,000至12,000个核苷酸，并且基因组RNA通常具有5’帽和3’poly(A)尾。甲病毒的基因组编码非结构蛋白(参与病毒RNA的转录、修饰和复制以及蛋白质修饰)和结构蛋白(形成病毒颗粒)。基因组中通常有两个开放阅读框(open reading frame，ORF)。四种非结构蛋白(nsP1至nsP4)通常由在基因组5’末端附近开始的第一ORF一起编码，而甲病毒结构蛋白由存在于第一ORF下游并延伸到基因组3’末端附近的第二ORF一起编码。通常来说，第一ORF大于第二ORF，比例为约2:1。在被甲病毒感染的细胞中，仅编码非结构蛋白的核酸序列从基因组RNA翻译，而编码结构蛋白的遗传信息可从亚基因组转录物翻译，所述亚基因组转录物是类似于真核信使RNA(mRNA)的RNA分子(Gould et al.,2010,Antiviral Res.,第87卷第111至124页)。在感染之后，即在病毒生命周期的早期，(+)链基因组RNA直接充当信使RNA用于翻译编码非结构多蛋白(nsP1234)的开放阅读框。已提出了将甲病毒来源的载体用于将外来遗传信息递送到靶细胞或靶生物体中。在简单的方法中，将编码甲病毒结构蛋白的开放阅读框替换为编码目的蛋白质的开放阅读框。基于甲病毒的反式复制系统依赖于以下两个分开的核酸分子上的甲病毒核苷酸序列元件：一个核酸分子编码病毒复制酶，并且另一个核酸分子能够被所述复制酶反式复制(因此称为反式复制系统)。反式复制需要在给定的宿主细胞中存在这两种核酸分子。能够被复制酶反式复制的核酸分子必须包含某些甲病毒序列元件以允许通过甲病毒复制酶进行识别和RNA合成。
在本公开内容的一些实施方案中，mRNA包含一个或更多个修饰，例如以提高其稳定性和/或提高翻译效率和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，为了提高mRNA的表达，可以在编码区(即编码表达的肽或多肽的序列)内进行修饰，优选地不改变表达的肽或多肽的序列。例如，这样的修饰在WO 2007/036366和PCT/EP2019/056502中描述，并且包括以下：5’-帽结构；天然存在的poly(A)尾的延伸或截短；5’-和/或3’-非翻译区的改变(UTR)，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR；用合成核苷酸替换一个或更多个天然存在的核苷酸；以及密码子优化(例如，以改变，优选提高RNA的GC含量)。
在一些实施方案中，mRNA包含5’-帽结构。在一些实施方案中，mRNA不具有未加帽的5’-三磷酸。在一些实施方案中，mRNA可包含常规5’-帽和/或5’-帽类似物。术语“常规5’-帽”是指在mRNA分子的5’-末端上存在的帽结构，并且通常由鸟苷5’-三磷酸(Gppp)组成，其通过其三磷酸部分连接到mRNA的下一个核苷酸的5’-末端(即鸟苷通过5’至5’三磷酸键连接到mRNA的其余部分)。鸟苷可在N7位甲基化(形成帽状结构m7Gppp)。术语“5’-帽类似物”包括这样的5’-帽，其基于常规的5’-帽，但其在m7鸟苷结构的2’或3’位被修饰以避免5’-帽类似物以相反方向整合(这样的5’-帽类似物也称为抗反向帽类似物(anti-reverse capanalog，ARCA))。特别优选的5’-帽类似物是在磷酸桥的桥接氧和非桥接氧处具有一个或更多个替换的那些，例如在β-磷酸盐处的硫代磷酸酯修饰的5’-帽类似物(例如m2 7，2′OG(5′)ppSp(5′)G(称为β-S-ARCA或β-S-ARCA))，如PCT/EP2019/056502中所述。提供如本文中所述的具有5’-帽结构的mRNA可以通过在相应的5’-帽化合物存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5’-帽结构被共转录地并入所产生的mRNA链中，或者mRNA可以例如通过体外转录来产生，并且5’-帽结构可以使用加帽酶(例如牛痘病毒的加帽酶)在转录之后与mRNA连接。
在一些实施方案中，mRNA包含选自m2 7，2′OG(5’)ppSp(5′)G(特别是其D1非对映体)、m2 7，3′OG(5′)ppp(5′)G和m2 7，3′-OGppp(m1 2′-O)ApG的5’-帽结构。在一些实施方案中，编码包含本文中所述表位的肽或多肽的非免疫原性RNA包含作为5’-帽结构的m2 7，2′OG(5’)ppSp(5′)G(特别是其D1非对映体)。
在一些实施方案中，mRNA包含帽0、帽1或帽2，优选帽1或帽2。根据本公开内容，术语“帽0”意指结构“m7GpppN”，其中N是在第2’位带有OH部分的任何核苷。根据本公开内容，术语“帽1”意指结构“m7GpppNm”，其中Nm是在第2’位带有OCH3部分的任何核苷。根据本公开内容，术语“帽2”意指结构“m7GpppNmNm”，其中每个Nm独立地是在第2’位带有OCH3部分的任何核苷。
5’-帽类似物β-S-ARCA(β-S-ARCA)具有以下结构：
“β-S-ARCA的D1非对映体”或“β-S-ARCA(D1)”是与β-S-ARCA的D2非对映体(β-S-ARCA(D2))相比，在HPLC柱上最先洗脱并因此保留时间更短的β-S-ARCA非对映体。HPLC优选为分析型HPLC。在一些实施方案中，使用Supelcosil LC-18-T RP柱(优选形式为：5μm，4.6×250mm)进行分离，从而可应用1.3ml/分钟的流量。在一些实施方案中，使用甲醇在乙酸铵中的梯度，例如甲醇在0.05M乙酸铵中的0至25％线性梯度，pH＝5.9，15分钟内。UV检测(VWD)可在260nm处进行，并且荧光检测(FLD)可在280nm激发和337nm检测下进行。
作为帽1构造单元的5’-帽类似物m2 7，3′-OGppp(m1 2′-O)ApG(也称为m2 7，3′OG(5′)ppp(5′)m2′-OApG)具有以下结构：
包含β-S-ARCA和mRNA的示例性帽0mRNA具有以下结构：
包含m2 7，3′OG(5′)ppp(5′)G和mRNA的示例性帽0mRNA具有以下结构：
包含m2 7，3′-OGppp(m1 2′-O)ApG和mRNA的示例性帽1mRNA具有以下结构：
本文中使用的术语“poly-A尾”或“poly-A序列”是指通常位于mRNA分子的3’末端的腺苷酸残基的不间断或间断的序列。Poly-A尾或poly-A序列是本领域技术人员已知的并且可在本文中所述的mRNA中的3’-UTR之后。不间断的poly-A尾的特征在于连续的腺苷酸残基。在自然界中，不间断的poly-A尾是典型的。本文公开的mRNA可以具有在转录后通过模板非依赖性RNA聚合酶连接到mRNA的游离3’末端的poly-A尾或由DNA编码并通过模板依赖性RNA聚合酶转录的poly-A尾。
已表明，约120个A核苷酸的poly-A尾对经转染真核细胞中的mRNA水平以及对从存在于poly-A尾的上游(5’)的开放阅读框翻译的蛋白质水平具有有益影响(Holtkamp etal.,2006,Blood,第108卷,第4009至4017页)。
poly-A尾可具有任何长度。在一些实施方案中，poly-A尾包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个A核苷酸，并且特别是约120个A核苷酸。在本背景下，“基本上由......组成”意指poly-A尾中的大多数核苷酸，通常按poly-A尾中核苷酸的数目计至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％是A核苷酸，但允许其余核苷酸是除A核苷酸之外的核苷酸，例如U核苷酸(尿苷酸)、G核苷酸(鸟苷酸)或C核苷酸(胞苷酸)。在本背景下，“由......组成”意指poly-A尾中的所有核苷酸，即按poly-A尾中核苷酸的数目计100％是A核苷酸。术语“A核苷酸”或“A”是指腺苷酸。
在一些实施方案中，基于在与编码链互补的链中包含重复的dT核苷酸(脱氧胸苷酸)的DNA模板，在RNA转录期间，例如在制备体外转录的RNA期间，连接poly-A尾。编码poly-A尾的DNA序列(编码链)被称为poly(A)盒。
在一些实施方案中，存在于DNA编码链中的poly(A)盒基本上由dA核苷酸组成，但被四种核苷酸(dA、dC、dG和dT)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。这样的盒公开于WO 2016/005324 A1中，其在此通过引用并入。WO2016/005324A1中公开的任何poly(A)盒均可用于本公开内容。涵盖以下：基本上由dA核苷酸组成但被具有均等分布的四种核苷酸(dA、dC、dG、dT)并且长度为例如5至50个核苷酸的随机序列中断的poly(A)盒显示，在DNA水平上质粒DNA在大肠杆菌(E.coli)中的恒定增殖，而在RNA水平上仍与对于支持RNA稳定性和翻译效率的有益特性相关。因此，在一些实施方案中，本文中所述的mRNA分子中包含的poly-A尾基本上由A核苷酸组成，但是被四种核苷酸(A、C、G、U)的随机序列中断。这样的随机序列的长度可以是5至50、10至30或10至20个核苷酸。
在一些实施方案中，除A核苷酸之外无核苷酸在其3’末端侧接poly-A尾，即，poly-A尾在其3’末端未被除A之外的核苷酸掩蔽或跟随。
在一些实施方案中，poly-A尾可包含至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾可基本上由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾可由至少20个、至少30个、至少40个、至少80个、或至少100个、并且多至500个、多至400个、多至300个、多至200个、或多至150个核苷酸组成。在一些实施方案中，poly-A尾包含SEQ ID NO:8中所示的poly-A尾。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少100个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含约150个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含约120个核苷酸。
在一些实施方案中，用于本公开内容的mRNA包含5’-UTR和/或3’-UTR。术语“非翻译区”或“UTR”涉及DNA分子中被转录但未被翻译成氨基酸序列的区域，或涉及RNA分子(例如mRNA分子)中的相应区域。非翻译区(UTR)可存在于开放阅读框的5’(上游)(5’-UTR)和/或开放阅读框的3’(下游)(3’-UTR)。5’-UTR(如果存在的话)位于5’末端，蛋白质编码区的起始密码子的上游。5’-UTR位于5’-帽(如果存在的话)的下游，例如直接与5’帽邻近。3’-UTR(如果存在的话)位于3’末端，蛋白质编码区的终止密码子的下游，但是术语“3’-UTR”一般不包含poly-A序列。因此，3’-UTR位于poly-A序列(如果存在的话)的上游，例如直接与poly-A序列邻近。另外，将3′-UTR并入到RNA(优选mRNA)分子的3′-非翻译区中可导致翻译效率的提高。可以通过并入两个或更多个这样的3’-UTR(其优选以头至尾方向排列；参见例如Holtkamp et al.,Blood108,4009-4017(2006))来实现协同作用。3’-UTR对于它们被引入的RNA(例如mRNA)可以是自体的或异源的。在某些实施方案中，3’-UTR来源于珠蛋白基因或mRNA，例如α2-珠蛋白、α1-球蛋白或β-珠蛋白(优选β-珠蛋白，例如人β-珠蛋白)的基因或mRNA。例如，可以通过将现有3’-UTR替换为一个或更多个，例如两个拷贝的来源于球蛋白基因(例如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白，例如β-球蛋白，例如人β-球蛋白)的3’-UTR，或者插入一个或更多个，例如两个拷贝的来源于球蛋白基因(例如α2-球蛋白、α1-球蛋白、β-球蛋白(例如β-球蛋白，例如人β-球蛋白)的3’-UTR，来对RNA(例如mRNA)进行修饰。
特别优选的5’-UTR包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。特别优选的3’-UTR包含SEQID NO:7的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA包含5’-UTR，5’-UTR包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA包含3’-UTR，3’-UTR包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列，或者与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
mRNA可具有经修饰核糖核苷酸，以提高其稳定性和/或降低免疫原性和/或降低细胞毒性。例如，在一些实施方案中，本文中所述mRNA中的尿苷被经修饰核苷(部分或完全，优选完全)替代。在一些实施方案中，经修饰核苷是经修饰尿苷。
在一些实施方案中，取代尿苷的经修饰尿苷选自假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)、5-甲基-尿苷(m5U)及其组合。
在一些实施方案中，(部分或完全，优选完全)替代mRNA中的尿苷的经修饰核苷可以是以下中的任一种或更多种：3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷、或本领域中已知的任何其他经修饰尿苷。
被假尿苷(部分或完全替代，优选完全替代尿苷)修饰的RNA(优选mRNA)在本文中称为“Ψ-修饰的”，而术语“m1Ψ-修饰的”意指RNA(优选mRNA)含有N(1)-甲基假尿苷(部分或完全替代，优选完全替代尿苷)。此外，术语“m5U-修饰的”意指RNA(优选mRNA)含有5-甲基尿苷(部分或完全替代，优选完全替代尿苷)。与其未经修饰形式相比，这样的Ψ-或m1Ψ-或m5U-修饰的RNA通常表现出降低的免疫原性，并因此，在要避免免疫应答诱导或使免疫应答诱导最小化的应用中是优选的。在一些实施方案中，RNA(优选mRNA)包含完全替代尿苷的N(1)-甲基假尿苷。
可以进一步优化本公开内容中使用的mRNA的密码子，例如以提高RNA的GC含量和/或用在其中待表达目的肽或多肽的细胞(或对象)中同义的频繁密码子来替代所述细胞(或对象)中罕见的密码子。在一些实施方案中，由本公开内容中使用的mRNA编码的氨基酸序列由这样的编码序列编码，其是密码子优化的和/或与野生型编码序列相比其G/C含量提高。这也包括其中编码序列的一个或更多个序列区域是密码子优化的和/或与野生型编码序列的相应序列区域相比G/C含量提高的实施方案。在一些实施方案中，密码子优化和/或G/C含量的提高优选不改变编码的氨基酸序列的序列。
术语“密码子优化的”是指改变核酸分子编码区中的密码子以反映宿主生物体的典型密码子使用，而优选不改变核酸分子编码的氨基酸序列。在本公开内容的背景下，可以使用本文中所述的mRNA对编码区进行密码子优化以实现在待治疗的对象中最佳表达。密码子优化基于这样的发现，即翻译效率也由tRNA在细胞中出现的不同频率决定。因此，可以对mRNA序列进行修饰，使得插入对于其可获得频繁出现的tRNA的密码子来代替“稀有密码子”。
在一些实施方案中，与野生型RNA的相应编码序列的G/C含量相比，本文中所述mRNA的编码区的鸟苷/胞嘧啶(G/C)含量提高，其中与野生型RNA编码的氨基酸序列相比该mRNA编码的氨基酸序列优选未被修饰。mRNA序列的这种修饰基于这样的事实，即任何待翻译的RNA区域的序列对于该mRNA的有效翻译都是重要的。G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量提高的序列比A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量提高的序列更稳定。关于数个密码子编码同一个氨基酸的事实(所谓的遗传密码的简并)，可以确定对稳定性最有利的密码子(所谓的替代密码子使用)。根据mRNA编码的氨基酸，与其野生型序列相比，mRNA序列有多种修饰可能性。特别是，含有A和/或U核苷酸的密码子可以通过用其他密码子(其编码相同氨基酸但不含A和/或U或者含有更低含量A和/或U核苷酸)替代这些密码子来修饰。
在多个实施方案中，与野生型RNA的编码区的G/C含量相比，本文中所述mRNA的编码区的G/C含量提高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％或甚至更多。
上述修饰的组合，即并入5’-帽结构、并入poly-A序列、使poly-A序列去掩蔽、改变5’-和/或3’-UTR(例如并入一个或更多个3’-UTR)、用合成核苷酸替代一个或更多个天然存在的核苷酸(例如用5-甲基胞苷替代胞苷和/或用假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)替代尿苷)、以及密码子优化，对RNA(优选mRNA)的稳定性具有协同影响并且翻译效率提高。因此，在一些实施方案中，用于本公开内容的mRNA包含至少两种、至少三种、至少四种或所有五种上述修饰的组合，即(i)并入5’-帽结构，(ii)并入poly-A序列，使poly-A序列去掩蔽；(iii)改变5’-UTR和/或3’-UTR(例如并入一个或更多个3’-UTR)；(iv)用合成核苷酸替代一个或更多个天然存在的核苷酸(例如用5-甲基胞苷替代胞苷和/或用假尿苷(Ψ)或N(1)-甲基假尿苷(m1Ψ)或5-甲基尿苷(m5U)替代尿苷)，和(v)密码子优化。
本公开内容的一些方面涉及将本文中公开的mRNA靶向递送至某些细胞或组织。在一些实施方案中，本公开内容涉及靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。如果施用的mRNA是编码用于诱导免疫应答的抗原或表位的mRNA，则特别优选的是靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别地是脾。在一些实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。“淋巴系统”是循环系统的一部分并且是免疫系统的重要部分，其包含运送淋巴的淋巴管网络。淋巴系统由淋巴器官、淋巴管的传导网络和循环淋巴组成。原发性或中央淋巴器官从未成熟的祖细胞产生淋巴细胞。胸腺和骨髓构成初级淋巴器官。次级或外周淋巴器官(包括淋巴结和脾)维持成熟的初始淋巴细胞并启动适应性免疫应答。
基于脂质的mRNA递送系统对肝具有固有的偏好。肝积聚是由肝血管系统或脂质代谢(脂质体和脂质或胆固醇缀合物)的不连续性质引起的。在一些实施方案中，靶器官是肝并且靶组织是肝组织。优选递送至这样的靶组织，特别是如果期望在该器官或组织中存在mRNA或编码的肽或多肽，和/或者如果期望表达大量编码的肽或多肽和/或者如果期望或需要全身性(特别是以显著的量)存在编码的肽或多肽的话。
在一些实施方案中，在施用本文中所述的mRNA颗粒之后，至少一部分mRNA被递送至靶细胞或靶器官。在一些实施方案中，至少一部分mRNA被递送至靶细胞的胞质溶胶。在一些实施方案中，mRNA是编码肽或多肽的mRNA，并且该mRNA被靶细胞翻译以产生肽或多肽。在一些实施方案中，靶细胞是肝中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肌细胞。在一些实施方案中，靶细胞是内皮细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是血细胞。在一些实施方案中，靶细胞是淋巴结中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是肺中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是血细胞。在一些实施方案中，靶细胞是皮肤中的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。在一些实施方案中，靶细胞是T细胞。在一些实施方案中，靶细胞是B细胞。在一些实施方案中，靶细胞是NK细胞。在一些实施方案中，靶细胞是单核细胞。因此，本文中所述的RNA颗粒可用于将mRNA递送至这样的靶细胞。
编码药物活性肽或多肽的核酸
编码”是指在多核苷酸(例如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列用作在生物过程中合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和由其产生的生物学特性。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常在序列表中提供)和用作基因或cDNA转录模板的非编码链二者均可称为编码蛋白质或者该基因或cDNA的其他产物。
在一些实施方案中，用于本公开内容的核酸(例如mRNA)包含编码肽或多肽(优选药物活性肽或多肽)的核酸序列。在一些实施方案中，用于本公开内容的核酸(例如mRNA)包含编码肽或多肽(优选药物活性肽或多肽)的核酸序列，并且能够表达所述肽或多肽，特别是如果转移到细胞或对象中的话。因此，在一些实施方案中，本公开内容中使用的核酸包含编码肽或多肽(例如编码药物活性肽或多肽)的编码区(开放阅读框(ORF))。在这方面中，“开放阅读框”或“ORF”是以起始密码子开始并以终止密码子结束的密码子的连续区段。编码药物活性肽或多肽的这样的核酸在本文中也称为“药物活性核酸”。特别地，编码药物活性肽或多肽的这样的mRNA在本文中也称为“药物活性mRNA”。在一些实施方案中，用于本公开内容中的核酸(例如mRNA)包含编码多于一种的肽或多肽(例如两种、三种、四种或更多种肽或多肽)的核酸序列。
根据本公开内容，术语“药物活性肽或多肽”意指可用于治疗个体的肽或多肽，在该个体中肽或多肽的表达将有益于例如改善疾病症状。优选地，药物活性肽或多肽具有治愈或姑息特性，并且可以被施用以改善、缓解、减轻、逆转疾病、延迟疾病的发作或者减轻疾病的一种或更多种症状的严重程度。在一些实施方案中，当以治疗有效量施用于个体时，药物活性肽或多肽对个体的病症或疾病状态具有积极或有利的作用。药物活性肽或多肽可具有预防特性，并且可用于延迟疾病发作或减轻这样的疾病的严重程度。术语“药物活性肽或多肽”包括完整的肽或多肽，并且也可以是指其药物活性片段。它还可以包括肽或多肽的药学活性变体和/或类似物。
根据本公开内容，术语“药物活性肽或多肽”包括疫苗抗原、PD-1轴结合拮抗剂、免疫刺激剂和抗原受体。
在一些实施方案中，编码药物活性肽或多肽的核酸(例如RNA)在经处理以提供药物活性肽或多肽的对象细胞中表达。在一些实施方案中，核酸在对象的细胞中瞬时表达。因此，在一些实施方案中，核酸不整合到细胞的基因组中。在一些实施方案中，核酸是RNA，优选体外转录的RNA。
在一些实施方案中，疫苗抗原在细胞表面表达。在一些实施方案中，疫苗抗原在MHC的背景下表达和呈递。在一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA在对象的细胞例如经处理以提供用于与免疫效应细胞结合的疫苗抗原的抗原呈递细胞中表达，所述结合导致免疫效应细胞的刺激、致敏和/或扩增。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂的表达进入胞外空间，即PD-1轴结合拮抗剂是分泌型的。
在一些实施方案中，免疫刺激剂的表达进入胞外空间，即免疫刺激剂是分泌型的。
在一些实施方案中，抗原受体在细胞表面表达。
编码疫苗抗原的非免疫原性RNA
本发明包括使用编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA。“包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽”在本文中也称为“疫苗抗原”、“肽和蛋白质抗原”或简称为“抗原”。
在一些实施方案中，编码疫苗抗原的非免疫原性RNA是单链、5’端加帽的mRNA，其在进入施用该RNA的对象的细胞(例如，抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)后翻译成相应的蛋白质。优选地，RNA包含针对该RNA在稳定性和翻译效率方面的最大效力而优化的结构元件(5’帽、5’UTR、3’UTR、poly(A)序列)。
在一些实施方案中，β-S-ARCA(D1)被用作RNA5’末端的特异性加帽结构。在一些实施方案中，5’-UTR包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:6的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，3’-UTR包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:7的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，poly(A)序列长度为110个核苷酸，并且由以下的区段组成：30个腺苷残基，其后是10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基。该poly(A)序列被设计成增强树突细胞中的RNA稳定性和翻译效率。在一些实施方案中，poly(A)序列包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列，或与SEQ ID NO:8的核苷酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，RNA作为脂质复合物颗粒施用，该脂质复合物颗粒优选包含DOTMA和DOPE，如本文中进一步所述的。在一些实施方案中，脂质复合物颗粒靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，特别是脾，更特别是脾中的树突细胞。在一些实施方案中，通过全身性施用，特别是通过静脉内施用来施用这样的颗粒。
在一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA在对象的细胞中表达以提供疫苗抗原。在一些实施方案中，疫苗抗原在细胞表面表达。在一些实施方案中，疫苗抗原在MHC的背景下呈递。在一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA在对象的细胞中瞬时表达。在一些实施方案中，全身性施用编码疫苗抗原的RNA。在一些实施方案中，在全身性施用编码疫苗抗原的RNA之后，编码疫苗抗原的RNA在脾中发生表达。在一些实施方案中，在全身性施用编码疫苗抗原的RNA之后，编码疫苗抗原的RNA在抗原呈递细胞中发生表达，优选在专职抗原呈递细胞中发生表达。在一些实施方案中，抗原呈递细胞选自树突细胞、巨噬细胞和B细胞。在一些实施方案中，在全身性施用编码疫苗抗原的RNA之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有编码疫苗抗原的RNA发生表达。在一些实施方案中，在全身性施用编码疫苗抗原的RNA之后，脾中编码疫苗抗原的RNA的表达量是肺中表达量的至少5倍。
疫苗抗原包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位。因此，疫苗抗原包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的抗原序列。这样的抗原序列可对应于靶抗原或疾病相关抗原，例如感染原(例如病毒抗原或细菌抗原)或肿瘤抗原蛋白质，或者可以对应于其免疫原性变体，或者靶抗原或疾病相关抗原的免疫原性片段或其免疫原性变体。因此，抗原序列可至少包含以下的表位：靶抗原或疾病相关抗原，或其免疫原性变体。
适合于根据本公开内容的应用的抗原序列(例如表位)通常可来源于靶抗原，即针对其而引发免疫应答的抗原。例如，疫苗抗原中包含的抗原序列可以是靶抗原或者靶抗原的片段或变体。
抗原序列或其加工产物(例如，其片段)可与免疫效应细胞携带的抗原受体(如TCR或CAR)结合。在一些实施方案中，抗原序列选自免疫效应细胞所靶向的靶细胞表达的抗原或其片段，或者该抗原序列或片段的变体。
根据本公开内容通过施用编码疫苗抗原的RNA向对象提供的疫苗抗原优选在被提供疫苗抗原的对象中导致诱导免疫应答，例如在刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞中。所述免疫应答，例如经刺激、致敏和/或扩增的免疫效应细胞，优选针对靶抗原，特别是由病变细胞、组织和/或器官表达的靶抗原，即疾病相关抗原。因此，疫苗抗原可包含疾病相关抗原或其片段或变体。在一些实施方案中，这样的片段或变体在免疫学上等同于疾病相关抗原。
在本发明的上下文中，术语“抗原片段”或“抗原变体”意指导致诱导免疫应答(例如在刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞中)的物质，该免疫应答(例如刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞)靶向抗原，即疾病相关抗原，特别是当其由病变细胞、组织和/或器官呈递时。因此，疫苗抗原可对应于或可包含疾病相关抗原，可对应于或可包含疾病相关抗原的片段，或者可对应于或可包含与疾病相关抗原或其片段同源的抗原。如果疫苗抗原包含疾病相关抗原的片段或与所述疾病相关抗原的片段同源的氨基酸序列，则所述片段或氨基酸序列可包含免疫效应细胞的抗原受体靶向的疾病相关抗原的表位或与所述疾病相关抗原的表位同源的序列。因此，根据本公开内容，疫苗抗原可包含疾病相关抗原的免疫原性片段或与疾病相关抗原的免疫原性片段同源的氨基酸序列。根据本公开内容的“抗原的免疫原性片段”优选地涉及抗原的片段，其能够诱导针对例如刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞的免疫应答，所述免疫效应细胞携带与抗原或表达抗原的细胞结合的抗原受体。优选的是疫苗抗原(类似于疾病相关抗原)提供与免疫效应细胞上存在的抗原受体结合的相关表位。在一些实施方案中，疫苗抗原或其片段(类似于疾病相关抗原)在细胞例如抗原呈递细胞(任选在MHC的情况下)的表面上表达，以提供用于与免疫效应细胞结合的相关表位。疫苗抗原可以是重组抗原。
在本发明所有方面的一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA在对象的细胞中表达，以提供用于与免疫效应细胞表达的抗原受体结合的抗原或其加工产物，所述结合导致刺激、致敏和/或扩增免疫效应细胞。
根据本公开内容的“抗原”涵盖将引发免疫应答的任何物质和/或免疫应答或免疫机制(例如细胞应答和/或体液应答)所针对的任何物质。这也包括这样的情况，其中抗原被加工成抗原肽，并且免疫应答或免疫机制针对一种或更多种抗原肽，特别是如果在MHC分子的背景下出现的话。具体而言，“抗原”涉及与抗体或T淋巴细胞(T细胞)特异性反应的任何物质，例如肽或多肽。术语“抗原”可包含含有至少一个表位(例如T细胞表位)的分子。在一些实施方案中，抗原是任选地在加工之后诱导免疫反应的分子，其可以对抗原(包括表达抗原的细胞)具有特异性。在一些实施方案中，抗原是疾病相关抗原，例如肿瘤抗原、病毒抗原或细菌抗原，或来源于这样的抗原的表位。
在一些实施方案中，抗原在免疫系统细胞的表面上呈递或存在于免疫系统细胞的表面上，所述免疫系统细胞例如抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞。在一些实施方案中，抗原或其加工产物例如T细胞表位与抗原受体结合。因此，抗原或其加工产物可与免疫效应细胞例如T淋巴细胞(T细胞)特异性反应。
术语“自身抗原”或“自体抗原”是指来源于对象体内(即，自身抗原也可以称为“自体抗原”)并且产生针对机体的该正常部分的异常剧烈免疫应答的抗原。这样的针对自身抗原的剧烈免疫反应可能是“自身免疫病”的原因。
根据本公开内容，可使用为免疫应答的候选物的任何合适的抗原，其中免疫应答可包括体液免疫应答或细胞免疫应答或二者。在本公开内容的一些实施方案的情况下，抗原由细胞呈递，例如由抗原呈递细胞呈递(在MHC分子的情况下)，其导致针对抗原的免疫应答。抗原可以是对应于或来源于天然存在的抗原的产物。这样的天然存在的抗原可包括或可来源于变应原、病毒、细菌、真菌、寄生虫和其他感染原和病原体，或者抗原也可以是肿瘤抗原。根据本公开内容，抗原可对应于天然存在的产物，例如病毒蛋白质或其一部分。
术语“疾病相关抗原”以其最广泛的含义使用，是指与疾病相关的任何抗原。疾病相关抗原是这样的分子：其包含将刺激宿主的免疫系统以产生针对该疾病的细胞抗原特异性免疫应答和/或体液抗体应答的表位。疾病相关抗原包括病原体相关抗原，即与微生物感染相关的抗原，通常是微生物抗原(例如细菌或病毒抗原)，或与癌症相关的抗原，通常是肿瘤，如肿瘤抗原。
在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原，即肿瘤细胞的一部分，特别是主要存在于细胞内或作为肿瘤细胞的表面抗原而主要存在的那些。在另一个实施方案中，抗原是病原体相关抗原，即来源于病原体的抗原，例如来自病毒、细菌、单细胞生物体或寄生虫的抗原，例如病毒抗原如病毒核糖核蛋白或包被蛋白。在一些实施方案中，抗原应由MHC分子呈递，其导致免疫系统的细胞(例如CD4+和CD8+淋巴细胞)的调节，特别是免疫系统的细胞(例如CD4+和CD8+淋巴细胞)的活化，特别是通过对T细胞受体的活性的调节所进行的。
术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”是指癌细胞的成分，其可来源于胞质、细胞表面或细胞核。特别地，它是指在胞内产生或在肿瘤细胞上作为表面抗原产生的那些抗原。例如，肿瘤抗原包括癌胚抗原、α1-胎蛋白、异铁蛋白和胎儿磺基糖蛋白、α2-H-铁蛋白和γ-胎蛋白，以及多种病毒肿瘤抗原。根据本公开内容的一些实施方案，肿瘤抗原包含肿瘤或癌症特征性的以及就类型和/或表达水平而言肿瘤或癌细胞特征性的任何抗原。
术语“病毒抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何病毒组分。病毒抗原可以是病毒核糖核蛋白或包膜蛋白。
术语“细菌抗原”是指具有抗原特性，即能够在个体中引起免疫应答的任何细菌组分。细菌抗原可来源于细菌的细胞壁或胞质膜。
术语“表位”是指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即分子的一部分或片段，其被免疫系统识别(例如被抗体、T细胞或B细胞识别)，特别是当在MHC分子的情况下呈递时。蛋白质的表位可包含所述蛋白质的连续或不连续的一部分，并且例如长度可以为约5至约100个、约5至约50个、约8至约30个或约10至约25个氨基酸，例如表位的长度可以优选为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个氨基酸。在一些实施方案中，本公开内容的背景下的表位是T细胞表位。
术语例如“表位”、“抗原片段”、“免疫原性肽”和“抗原肽”在本文中可互换使用，并且例如可涉及抗原的不完整表示，所述术语例如能够引发针对该抗原的免疫应答或细胞表达或包含并呈递该抗原。在一些实施方案中，该术语涉及抗原的免疫原性部分。在一些实施方案中，它是抗原的被T细胞受体识别(即特异性结合)的一部分，特别是如果在MHC分子的情况下呈递的话。某些优选的免疫原性部分与MHC I类或II类分子结合。术语“表位”是指分子(例如被免疫系统识别的抗原)的一部分或片段。例如，表位可被T细胞、B细胞或抗体识别。抗原的表位可包括抗原的连续或不连续部分，并且长度可以是约5至约100、例如约5至约50、约8至约30、或约8至约25个氨基酸，例如表位长度可以是9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个氨基酸。在一些实施方案中，表位的长度为约10至约25个氨基酸。术语“表位”包括T细胞表位。
术语“T细胞表位”是指当在MHC分子的情况下存在时被T细胞识别的蛋白质的部分或片段。术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且涉及存在于所有脊椎动物中的基因复合物。MHC蛋白或分子对于免疫反应中淋巴细胞与抗原呈递细胞或病变细胞之间的信号传导是重要的，其中MHC蛋白或分子结合肽表位并呈递它们以被T细胞上的T细胞受体识别。由MHC编码的蛋白质在细胞表面上表达，并向T细胞展示自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，侵入微生物的片段)二者。在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约8至约10个氨基酸，尽管更长或更短的肽可以是有效的。在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽通常长约10至约25个氨基酸，并且特别地长约13至约18个氨基酸，尽管更长和更短的肽可以是有效的。
肽和多肽抗原的长度可以是2至100个氨基酸，包括例如5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸、25个氨基酸、30个氨基酸、35个氨基酸、40个氨基酸、45个氨基酸或50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可以大于50个氨基酸。在一些实施方案中，肽可以大于100个氨基酸。
肽或多肽抗原可以是可诱导免疫系统产生针对该肽或多肽的抗体和T细胞应答的能力或将该能力提高的任何肽或多肽。
在一些实施方案中，疫苗抗原(即其接种到对象中诱导免疫应答的抗原)被免疫效应细胞识别。在一些实施方案中，疫苗抗原如果被免疫效应细胞识别，则该抗原能够在存在适当的共刺激信号的情况下诱导携带识别该疫苗抗原的抗原受体的免疫效应细胞的刺激、致敏和/或扩增。在本公开内容的实施方案的情况下，疫苗抗原可以例如呈递或存在于细胞(例如抗原呈递细胞)的表面上。
在一些实施方案中，抗原在病变细胞(例如肿瘤细胞或受感染细胞)中表达。
在一些实施方案中，抗原由病变细胞(例如肿瘤细胞或受感染细胞)呈递。在一些实施方案中，抗原受体是与在MHC的情况下呈递的抗原的表位结合的TCR。在一些实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，TCR与由细胞(例如抗原呈递细胞)呈递的抗原的结合导致所述T细胞的刺激、致敏和/或扩增。在一些实施方案中，当由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，TCR与存在于病变细胞上的抗原的结合导致病变细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶。
在一些实施方案中，抗原在病变细胞(例如肿瘤细胞或受感染细胞)的表面上表达。在一些实施方案中，抗原受体是与抗原的胞外结构域或抗原的胞外结构域中的表位结合的CAR。在一些实施方案中，CAR与活细胞表面上存在的抗原的天然表位结合。在一些实施方案中，当CAR由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，CAR与存在于细胞(例如抗原呈递细胞)上的抗原的结合导致刺激、致敏和/或扩增所述T细胞。在一些实施方案中，当CAR由T细胞表达和/或存在于T细胞上时，CAR与存在于病变细胞上的抗原的结合导致病变细胞的细胞溶解和/或凋亡，其中所述T细胞优选释放细胞毒性因子，例如穿孔素和颗粒酶。
根据一些实施方案，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列与抗原性肽或多肽(抗原序列)直接融合或通过接头融合。因此，在一些实施方案中，本文中所述的RNA包含编码抗原性肽或多肽的至少一个编码区和增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可以以编码抗原的RNA形式施用的用于疫苗接种的抗原包含天然存在的抗原或其片段(例如表位)。
这样的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选地位于抗原肽或多肽的C端(和任选地位于破坏免疫耐受的氨基酸序列的C端)，而不限于此。如本文中定义的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选地改善抗原加工和呈递。在一些实施方案中，如本文中定义的增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包括但不限于来源于人MHC I类复合物(HLA-B51，单倍型A2，B27/B51，Cw2/Cw3)的序列，特别是包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其功能变体的序列。
在一些实施方案中，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列、与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列、或者SEQ ID NO:2的氨基酸序列的功能片段或者与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列包括SEQ IDNO:2的氨基酸序列。
因此，在一些实施方案中，本文中所述的RNA包含至少一种编码抗原肽或多肽的编码区和增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列，所述增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列优选地与抗原肽或多肽融合，更优选地与如本文中所述的抗原肽或多肽的C端融合。
此外，分泌序列，例如，包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的序列，可与抗原肽或多肽的N端融合。
来源于破伤风梭菌(Clostridium tetani)的破伤风类毒素的氨基酸序列可用于克服自身耐受性机制，以便通过在致敏期间提供T细胞辅助来有效地开展对自身抗原的免疫应答。
已知破伤风类毒素重链包含可与MHC II类等位基因混杂结合并在几乎所有经破伤风疫苗接种的个体中诱导CD4+记忆T细胞的表位。另外，已知破伤风类毒素(TT)辅助表位与肿瘤相关抗原的组合与施加单独的肿瘤相关抗原相比通过在致敏期间提供CD4+介导的T细胞辅助来改善免疫刺激。为了降低可与预期的肿瘤抗原特异性T细胞应答的诱导竞争的破伤风序列刺激CD8+T细胞的风险，不使用破伤风类毒素的整个片段C，因为已知其包含CD8+T细胞表位。替代地选择包含混杂结合辅助表位的两种肽序列以确保与尽可能多的MHC II类等位基因结合。基于离体研究的数据，选择了公知的表位p2(QYIKANSKFIGITEL；TT830-844)和p16(MTNSVDDALINSTKIYSFPSVISKVNQGAQG；TT578-609)。p2表位已在临床试验中用于肽疫苗接种，以加强抗黑素瘤活性。
非临床数据显示，编码肿瘤抗原加混杂结合的破伤风类毒素序列二者的RNA疫苗导致针对肿瘤抗原的CD8+T细胞应答增强以及耐受破坏改善。来自用疫苗进行疫苗接种的患者的免疫监测数据(包括与肿瘤抗原特异性序列在框内融合的那些序列)显示，所选择的破伤风序列能够在几乎所有患者中诱导破伤风特异性T细胞应答。
根据一些实施方案，破坏免疫耐受的氨基酸序列直接或通过接头(例如，具有根据SEQ ID NO:4的氨基酸序列的接头)与抗原肽或多肽融合。
这样的破坏免疫耐受的氨基酸序列优选地位于抗原肽或多肽的C端(并且任选地在增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列的N端，其中破坏免疫耐受的氨基酸序列以及增强抗原加工和/或呈递的氨基酸序列可直接或通过接头(例如，具有根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列的接头)融合)，而不限于此。如本文中限定的破坏免疫耐受的氨基酸序列优选地改善T细胞应答。在一些实施方案中，如本文中限定的破坏免疫耐受的氨基酸序列包括而不限于来源于破伤风类毒素来源的辅助序列p2和p16(P2P16)的序列，特别是包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其功能变体的序列。
在一些实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列、与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列、或者SEQ ID NO:3的氨基酸序列的功能片段或者与SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％或80％同一性的氨基酸序列的功能片段。在一些实施方案中，破坏免疫耐受的氨基酸序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
在下文中，描述了疫苗RNA的一些实施方案，其中当描述其元件时使用的某些术语具有以下含义：
hAg-Kozak：人α-珠蛋白mRNA的5’-UTR序列，带有经优化的’Kozak序列’以提高翻译效率。
sec/MITD：来源于编码人MHC I类复合物(HLA-B51、单倍型A2、B27/B51、Cw2/Cw3)的序列的融合蛋白标签，其已显示改善抗原加工和呈递。sec对应于编码分泌信号肽的78bp片段，其引导新生多肽链易位到内质网中。MITD对应于MHC I类分子的跨膜和胞质结构域，也称为MHC I类运输结构域。
抗原：编码相应的疫苗抗原/表位的序列。
甘氨酸-丝氨酸接头(GS)：编码主要由如通常用于融合蛋白的氨基酸甘氨酸(G)和丝氨酸(S)组成的短接头肽的序列。
P2P16：编码破伤风类毒素来源辅助表位以破坏免疫耐受的序列。
FI元件：3’-UTR是来源于“分裂的氨基端增强子”(AES)mRNA(称为F)和线粒体编码的12S核糖体RNA(称为I)的两种序列元件的组合。这些通过对赋予RNA稳定性和增强总蛋白表达的序列进行离体选择过程来鉴定。
A30L70：测量长度为110个核苷酸的poly(A)尾，其由以下区段组成：30个腺苷残基，随后是10个核苷酸的接头序列和另外70个腺苷残基，所述poly(A)尾被设计成用于在树突细胞中增强RNA稳定性和翻译效率。
在一些实施方案中，本文中所述的疫苗RNA具有以下结构：
β-S-ARCA(D1)-hAg-Kozak-sec-GS(1)-抗原-GS(2)-P2P16-GS(3)-MITD-FI-A30L70
在一些实施方案中，本文中所述的疫苗抗原具有以下结构：
sec-GS(1)-抗原-GS(2)-P2P16-GS-GS(3)-MITD
在一些实施方案中，hAg-Kozak包含SEQ ID NO:6的核苷酸序列。在一些实施方案中，sec包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，P2P16包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，MITD包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，GS(1)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，GS(2)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，GS(3)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，FI包含SEQ ID NO:7的核苷酸序列。在一些实施方案中，A30L70包含SEQ ID NO:8的核苷酸序列。
术语“在细胞表面上表达”或“与细胞表面缔合”意指分子例如抗原与细胞的质膜缔合并位于质膜，其中该分子的至少一部分朝向所述细胞的胞外空间并可从所述细胞的外部接近，例如，通过位于细胞外的抗体。在本文中，一部分可以是例如至少4个、至少8个、至少12个或至少20个氨基酸。缔合可以是直接的或间接的。例如，可通过一个或更多个跨膜结构域、一个或更多个脂质锚或者通过与任何其他蛋白质、脂质、糖类或可在细胞的质膜的外小叶上发现的其他结构的相互作用进行缔合。例如，与细胞表面缔合的分子可以是具有胞外部分的跨膜蛋白质，或者可以是通过与作为跨膜蛋白质的另一种蛋白质相互作用而与细胞表面缔合的蛋白质。
“细胞表面”或“细胞的表面”根据其在本领域中的正常含义使用，并且因此包括可由蛋白质和其他分子结合的细胞外部。如果抗原位于所述细胞的表面，并且可被例如添加至细胞的抗原特异性抗体的结合所接近，则该抗原在细胞表面上表达。在一些实施方案中，在细胞表面上表达的抗原是具有可被CAR识别的胞外部分的完整膜蛋白。
在本公开内容的背景下，术语“胞外部分”或“胞外结构域”是指朝向细胞的胞外空间并且优选地可从所述细胞的外部接近(例如通过结合分子例如抗体(其位于细胞外部))的分子(例如，蛋白质)一部分。在一些实施方案中，该术语指一个或更多个胞外环或结构域或其片段。
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用，并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括溶细胞性T细胞的细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell，CTL)(CD8+T细胞)。术语“抗原特异性T细胞”或类似术语涉及这样的的T细胞，其识别T细胞所靶向的抗原(特别是当在MHC分子的背景下呈现在抗原呈递细胞或病变细胞例如癌细胞的表面上时)并且优选地发挥T细胞的效应子功能。如果T细胞杀伤表达抗原的靶细胞，则认为该细胞对抗原具有特异性。可使用多种标准技术中的任何一种(例如在铬释放测定或增殖测定中)来评价T细胞特异性。或者，可测量淋巴因子(例如干扰素-γ)的合成。
术语“靶标”应意指作为针对免疫应答(例如细胞免疫应答)的靶标的物质，例如细胞或组织。靶标包括呈递抗原或抗原表位(即来源于抗原的肽片段)的细胞。在一些实施方案中，靶细胞是表达抗原并向所述抗原呈递I类MHC的细胞。
“抗原加工”是指将抗原降解为作为所述抗原的片段的加工产物(例如，将多肽降解为肽)，并且这些片段中的一个或更多个与MHC分子缔合(例如，通过结合进行缔合)，以用于由细胞(例如抗原呈递细胞)呈递至特异性T细胞。抗原呈递细胞可分为专职抗原呈递细胞和非专职抗原呈递细胞。
术语“专职抗原呈递细胞”涉及组成型表达与初始T细胞相互作用所需的主要组织相容性复合体II类(Major Histocompatibility Complex class II，MHC II类)分子的抗原呈递细胞。如果T细胞与抗原呈递细胞的膜上的MHC II类分子复合体相互作用，则抗原呈递细胞产生共刺激分子，诱导T细胞的活化。专职抗原呈递细胞包括树突细胞和巨噬细胞。
术语“非专职抗原呈递细胞”涉及不组成型表达II类分子但在某些细胞因子(例如干扰素-γ)的刺激下表达的抗原呈递细胞。示例性的非专职抗原呈递细胞包括成纤维细胞、胸腺上皮细胞、甲状腺上皮细胞、神经胶质细胞、胰腺β细胞或血管内皮细胞。
术语“树突细胞”(DC)是指属于抗原呈递细胞类的吞噬细胞亚型。在一些实施方案中，树突细胞来源于造血骨髓祖细胞。这些祖细胞最初转化为未成熟的树突细胞。这些未成熟细胞的特征是高吞噬活性和低T细胞活化潜力。未成熟的树突细胞不断地从周围环境中取样，寻找病原体例如病毒和细菌。一旦它们接触到可呈递的抗原，就会被激活成成熟的树突细胞，并开始迁移至脾或淋巴结。未成熟的树突细胞吞噬病原体并将其蛋白质降解为小片段，并且成熟后使用MHC分子将这些片段呈现在其细胞表面。同时，它们上调在T细胞活化中发挥共受体的作用的细胞表面受体例如CD80、CD86和CD40，大大增强了它们活化T细胞的能力。它们还上调CCR7，其是诱导树突细胞通过血流到达脾或通过淋巴系统到达淋巴结的趋化受体。在这里，它们充当抗原呈递细胞，并通过向辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞呈递抗原以及非抗原特异性共刺激信号来活化辅助T细胞和杀伤T细胞以及B细胞。因此，树突细胞可主动诱导T细胞相关的免疫应答或B细胞相关的免疫应答。在一些实施方案中，树突细胞是脾树突细胞。
术语“巨噬细胞”是指由单核细胞分化产生的吞噬细胞亚群。由炎症、免疫细胞因子或微生物产物活化的巨噬细胞通过水解和氧化攻击来非特异性地吞噬和杀伤巨噬细胞内的外来病原体，导致病原体降解。来自经降解的蛋白质的肽展示在巨噬细胞表面，在那里它们可被T细胞识别，并且它们可直接与B细胞表面上的抗体相互作用，导致T和B细胞活化并进一步刺激免疫应答。巨噬细胞属于抗原呈递细胞类。在一些实施方案中，巨噬细胞是脾巨噬细胞。
“抗原响应性CTL”意指CD8+T细胞，所述CD8+T细胞响应于抗原或来源于所述抗原的肽，其用抗原呈递细胞表面上的I类MHC呈递。
根据本公开内容，CTL响应性可以包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)的产生、激活标志物(例如CD44和CD69)的上调以及对表达肿瘤抗原的靶细胞的特异性溶细胞性杀伤。CTL响应性也可以使用准确指示CTL响应性的人工报告子确定。
本文中使用的“活化”或“刺激”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞(例如免疫效应细胞例如T细胞)的状态。活化还可与信号传导途径的启动、诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“经活化的免疫效应细胞”尤其是指经历细胞分裂的免疫效应细胞。
术语“致敏”是指其中免疫效应细胞(例如T细胞)首次与其特异性抗原接触并导致分化为效应细胞(例如效应T细胞)的过程。
术语“扩增”是指其中特定实体倍增的过程。在一些实施方案中，该术语用于免疫应答的背景下，其中免疫效应细胞被抗原刺激、增殖，并且识别所述抗原的特异性免疫效应细胞被扩增。在一些实施方案中，扩增导致免疫效应细胞的分化。
术语“免疫应答”和“免疫反应”在本文中按其常规含义可互换使用，并且是指对抗原的整体身体应答，并且可以是指细胞免疫应答、体液免疫应答或其两者。根据本公开内容，关于物质(例如抗原、细胞或组织)的术语“对……的免疫应答”或“针对……的免疫应答”涉及针对所述物质的免疫应答，例如细胞应答。免疫应答可包括选自以下的一种或更多种反应：出现针对一种或更多种抗原的抗体，以及扩增抗原特异性T淋巴细胞，例如CD4+和CD8+T淋巴细胞，例如CD8+T淋巴细胞，其可在体外多种增殖或细胞因子产生测试中检测到。
在本公开内容的背景下，术语“诱导免疫应答”和“引起免疫应答”和类似术语是指免疫应答的诱导，例如细胞免疫应答、体液免疫应答或其两者的诱导。免疫应答可以是保护性/预先性/预防性和/或治疗性的。免疫应答可针对任何免疫原或抗原或抗原肽，例如针对肿瘤相关抗原或病原体相关抗原(例如，病毒(例如流感病毒(A、B或C)、CMV或RSV)的抗原)。在该背景下，“诱导”可意味着在诱导之前没有针对特定抗原或病原体的免疫应答，但是其也可意味着在诱导之前存在一定水平的针对特定抗原或病原体的免疫应答，并且在诱导之后，所述免疫应答增强。因此，在该背景下，“诱导免疫应答”也包括“增强免疫应答”。在一些实施方案中，在个体中诱导免疫应答之后，所述个体被保护免于发展疾病，例如感染性疾病或癌性疾病，或者通过诱导免疫应答来改善疾病状况。
术语“细胞免疫应答”、“细胞应答”、“细胞介导的免疫”或类似术语旨在包括针对以表达抗原和/或者用I类和/或II类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答。细胞应答涉及充当“辅助者”或“杀手”的被称为T细胞或T淋巴细胞的细胞。辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答发挥关键作用，而杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀伤细胞，例如病变细胞。
术语“体液免疫应答”是指活生物体中的过程，其中响应于物质或生物体而产生抗体，所述抗体最终将其中和和/或消除。抗体应答的特异性是由T细胞和/或B细胞通过单一特异性地结合抗原的膜缔合受体介导的。在结合适当的抗原以及接收到多种其他活化信号后，B淋巴细胞分裂，这产生了记忆B细胞以及分泌抗体的浆细胞克隆，每个克隆产生与其抗原受体所识别的相同的抗原表位的抗体。记忆B淋巴细胞保持休眠状态，直到其随后被其特异性抗原活化。当再次暴露于特异性抗原时，这些淋巴细胞提供了记忆的细胞基础，并导致抗体应答的逐步升级。
本文中使用的术语“抗体”是指能够与抗原上的表位特异性结合的免疫球蛋白分子。特别地，术语“抗体”是指包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体以及前述任何的组合。每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。可变区和恒定区在本文中也分别称为可变结构域和恒定结构域。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更为保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。VH的CDR称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，VL的CDR称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区包含重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)，其中CH可以进一步细分为恒定结构域CH1、铰链区以及恒定结构域CH2和CH3(从氨基端到羧基端按以下顺序排列：CH1、CH2、CH3)。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。抗体可以是来源于天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫活性部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体。
术语“免疫球蛋白”涉及免疫球蛋白超家族的蛋白质，例如涉及抗原受体，例如抗体或B细胞受体(B cell receptor，BCR)。免疫球蛋白以具有特征性免疫球蛋白(Ig)折叠的结构性结构域(即免疫球蛋白结构域)为特征。该术语涵盖膜结合免疫球蛋白以及可溶性免疫球蛋白。膜结合免疫球蛋白也称为表面免疫球蛋白或膜免疫球蛋白，其通常是BCR的一部分。可溶性免疫球蛋白通常称为抗体。免疫球蛋白通常包含数条链，通常是两条相同的重链和两条相同的轻链，其通过二硫键连接。这些链主要由免疫球蛋白结构域构成，例如VL(可变轻链)结构域、CL(恒定轻链)结构域、VH(可变重链)结构域和CH(恒定重链)结构域CH1、CH2、CH3和CH4。存在五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链，即α、δ、ε、γ和μ，它们构成了不同类别的抗体，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。与可溶性免疫球蛋白的重链相反，膜或表面免疫球蛋白的重链在其羧基端包含跨膜结构域和短的胞质结构域。在哺乳动物中，有两种类型的轻链，即λ和κ。免疫球蛋白链包含可变区和恒定区。恒定区在免疫球蛋白的不同同种型内是基本上保守的，其中可变部分是高度多样化的并且导致抗原识别。
术语“疫苗接种”和“免疫接种”描述了出于治疗性或预防性原因而治疗个体的过程，并且涉及以下操作：向个体施用一种或更多种如本文中所述的免疫原或抗原或者其衍生物(特别是以其编码RNA(特别是mRNA)的形式)，以及刺激针对所述一种或更多种免疫原或抗原或者以呈递所述一种或更多种免疫原或抗原为特征的细胞的免疫应答。
“以呈递抗原为特征的细胞”或“呈递抗原的细胞”或“在抗原呈递细胞表面上呈递抗原的MHC分子”或类似表述意指这样的细胞，例如病变细胞，特别是肿瘤细胞或感染的细胞，或者抗原呈递细胞，其直接地或在MHC分子(例如MHC I类和/或MHC II类分子)的情况下加工之后呈递抗原或抗原肽。在一些实施方案中，MHC分子是MHC I类分子。
在一些实施方案中，药物活性肽或多肽包含一种或更多种抗原或者一个或更多个表位，即向对象施用肽或多肽在对象中引发针对一种或更多种抗原或者一个或更多个表位的免疫应答，所述免疫应答可以是治疗性的或部分或完全保护性的。
在一些实施方案中，RNA编码至少一个表位。例如至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。
在一些实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原并且抗原序列(例如，表位)来源于肿瘤抗原。肿瘤抗原可以是“标准”抗原，其通常已知在多种癌症中表达。肿瘤抗原也可以是“新生抗原”，其对个体的肿瘤是特异性的，并且以前没有被免疫系统识别。新生抗原或新生表位可由癌细胞基因组中的一种或更多种癌症特异性突变引起，导致氨基酸变化。如果肿瘤抗原是新的抗原，则疫苗抗原优选包含含有一个或更多个氨基酸变化的所述新的抗原的片段或表位。
肿瘤抗原的一些实例包括但不限于p53、ART-4、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abLCAMEL、CAP-1、CASP-8、CDC27/m、CDK4/m、CEA、密蛋白家族的细胞表面蛋白，例如CLAUDΓΝ-6、CLAUDIN-18.2和CLAUDIN-12、c-MYC、CT、Cyp-B、DAM、ELF2M、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gap 100、HAGE、HER-2/neu、HPV-E7、HPV-E6、HAST-2、hTERT(或hTRT)、LAGE、LDLR/FUT、MAGE-A(优选MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11或MAGE-A12)、MAGE-B、MAGE-C、MART-1/Melan-A、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、NA88-A、NF1、NY-ESO-1、NY-BR-1、pl90小BCR-abL、Pml/RARa、PRAME、蛋白酶3、PSA、PSM、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、SCGB3A2、SCP1、SCP2、SCP3、SSX、存活蛋白、TEL/AML1、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、TPTE、WT和WT-1。
癌症突变因人而异。因此，编码新的表位(新生表位)的癌症突变代表了疫苗组合物和免疫治疗开发中有吸引力的靶标。肿瘤免疫治疗的效力依赖于能够在宿主体内诱导有效免疫应答的癌症特异性抗原和表位的选择。RNA可用于将患者特异性肿瘤表位递送至患者。驻留在脾中的树突细胞(DC)代表对免疫原性表位或抗原(例如肿瘤表位)的RNA表达具有特别益处的抗原呈递细胞。已表明使用多个表位以促进肿瘤疫苗组合物的治疗效力。肿瘤突变组的快速测序可为个体化疫苗提供多个表位，其可由本文中所述的RNA编码，例如作为单一多肽，在其中表位任选地被接头分开。在本公开内容的一些实施方案中，RNA编码至少一个表位、至少两个表位、至少三个表位、至少四个表位、至少五个表位、至少六个表位、至少七个表位、至少八个表位、至少九个表位或至少十个表位。一些示例性的实施方案包括编码至少五个表位(称为“五表位(pentatope)”)的RNA和编码至少十个表位(称为“十表位(decatope)”)的RNA。
在一些实施方案中，抗原或表位来源于病原体相关抗原，特别是来源于病毒抗原。在一些实施方案中，抗原或表位来源于SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或者SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性片段或其免疫原性变体。因此，在一些实施方案中，本公开内容中使用的mRNA编码包含SARS-CoV-2S蛋白、其免疫原性变体或者SARS-CoV-2S蛋白的免疫原性片段或其免疫原性变体的氨基酸序列。
术语“免疫学上等同的”意指例如关于免疫作用类型表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或者发挥相同或基本上相同的免疫学作用的免疫学上等同的分子，例如免疫学上等同的氨基酸序列。在本公开内容的背景下，术语“免疫学上等同的”优选地关于抗原或抗原变体用于免疫接种的免疫学作用或特性而使用。例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列在免疫学上等同。因此，在一些实施方案中，与抗原在免疫学上等同的分子在T细胞的刺激、致敏和/或扩增方面表现出与T细胞靶向的抗原相同或基本相同的特性和/或者发挥相同或基本相同的作用。
用于本公开内容的编码疫苗抗原的RNA是非免疫原性的。编码免疫刺激剂的RNA可根据本公开内容施用以提供佐剂作用。编码免疫刺激剂的RNA可以是标准RNA或非免疫原性RNA。
本文中使用的术语“非免疫原性RNA”(例如“非免疫原性mRNA”)是指在(例如向哺乳动物)施用时不诱导免疫系统的应答，或诱导比相同RNA诱导的应答更弱的应答的RNA，与所述相同RNA的不同之处仅在于，所述相同RNA未经受使非免疫原性RNA无免疫原性的修饰和处理，即比标准RNA(standard RNA，stdRNA)诱导的更弱。在某些实施方案中，通过以下使非免疫原性RNA(在本文中也称为经修饰的RNA(modified RNA，modRNA))无免疫原性：将抑制RNA介导的先天免疫受体的激活的经修饰核苷并入到RNA中和/或限制双链RNA(dsRNA)的量，例如，在体外转录期间例如通过限制双链RNA(dsRNA)的形成，和/或例如在体外转录之后去除双链RNA(dsRNA)。在某些实施方案中，通过将抑制RNA介导的先天免疫受体的激活的经修饰核苷并入到RNA中和/或例如在体外转录后通过去除双链RNA(dsRNA)，使非免疫原性RNA无免疫原性。
为了通过并入经修饰核苷使非免疫原性RNA(特别是mRNA)无免疫原性，可使用任何经修饰核苷，只要其降低或抑制RNA的免疫原性即可。特别优选的是抑制RNA介导的先天免疫受体的激活的经修饰核苷。在一些实施方案中，经修饰核苷包含用包含经修饰碱基的核苷对一个或更多个尿苷的替代。在一些实施方案中，经修饰核碱基是经修饰尿嘧啶。在一些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷)、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。在某些实施方案中，包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)，特别是N1-甲基-假尿苷。
在一些实施方案中，用包含经修饰核碱基的核苷替换一个或更多个尿苷包括替换至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的尿苷。
在使用T7 RNA聚合酶通过体外转录(IVT)合成mRNA期间，由于该酶的非常规活性，产生了大量异常产物，包括双链RNA(dsRNA)。dsRNA诱导炎性细胞因子并激活效应酶，导致蛋白质合成抑制。在通过体外转录(IVT)合成mRNA期间，可限制dsRNA的形成，例如，通过在合成期间限制尿苷三磷酸(uridine triphosphate，UTP)的量。任选地，UTP可在mRNA合成期间添加一次或更多次。此外，dsRNA可例如通过使用无孔或多孔C-18聚苯乙烯-二乙烯基苯(polystyrene-divinylbenzene，PS-DVB)基质的离子对反相HPLC从RNA(例如IVT RNA)中去除。或者，可以使用使用大肠杆菌RNA酶III的基于酶的方法，该酶特异性水解dsRNA，但不水解ssRNA，从而从IVT RNA制剂中消除dsRNA污染物。此外，可通过使用纤维素材料从ssRNA中分离dsRNA。在一些实施方案中，将RNA制剂与纤维素材料接触，并在允许dsRNA与纤维素材料结合而不允许ssRNA与纤维素材料结合的条件下将ssRNA与纤维素材料分离。例如，在WO2017/182524中公开了用于提供ssRNA的合适方法。
本文中使用的术语“去除”或“除去”是指第一物质群例如非免疫原性RNA与第二物质群例如dsRNA邻近性分离的特征，其中第一物质群不一定不含第二物质，并且第二物质群不一定不含第一物质。然而，与未分离的第一和第二物质混合物相比，以去除第二物质群为特征的第一物质群的第二物质的含量可测量地更低。
在一些实施方案中，双链RNA(dsRNA)的量是有限的，例如，dsRNA(尤其是mRNA)从非免疫原性RNA中被除去，使得非免疫原性组合物中的RNA中的dsRNA少于10％、少于5％、少于4％、少于3％、少于2％、少于1％、少于0.5％、少于0.3％、少于0.1％、少于0.05％、少于0.03％、少于0.01％、少于0.005％、少于0.004％、少于0.004％、少于0.003％、少于0.002％、少于0.001％或少于0.0005％。在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)不含或基本上不含dsRNA。在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)组合物包含单链核苷修饰的RNA的纯化制剂。在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)组合物包含单链核苷修饰的RNA(尤其是mRNA)并且基本上不含双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，相对于其他核酸分子(DNA、dsRNA等)，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)组合物包含至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％、至少99.99％、至少99.991％、至少99.992％、至少99.993％、至少99.994％、至少99.995％、至少99.996％、至少99.997％或至少99.998％的单链核苷修饰的RNA。
可使用多种方法来确定dsRNA的量。例如，样品可与dsRNA特异性抗体接触，并且与RNA结合的抗体的量可以作为样品中dsRNA量的量度。包含已知量的dsRNA的样品可用作参考。
例如，RNA可被点样到膜，例如尼龙印迹膜上。膜可被封闭，例如在包含5％(w/v)脱脂乳粉的TBS-T缓冲液(20mM TRIS pH 7.4，137mM NaCl，0.1％(v/v)吐温-20)中。为了检测dsRNA，可将膜与dsRNA特异性抗体例如dsRNA特异性小鼠mAb(English&ScientificConsulting,Szirák,Hungary)一起孵育。在洗涤例如用TBS-T洗涤之后，可将膜与二抗例如HRP缀合的驴抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch,目录号715-035-150)一起孵育，并可检测二抗提供的信号。
在一些实施方案中，非免疫原性RNA(特别是mRNA)比具有相同序列的标准RNA在细胞中的翻译更具有效率。在一些实施方案中，翻译相对于其未经修饰对应物增强的因数为2倍。在一些实施方案中，翻译增强了3倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了4倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了5倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了6倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了7倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了8倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了9倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了10倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了15倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了20倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了50倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了100倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了200倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了500倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了1000倍因数。在一些实施方案中，翻译增强了2000倍因数。在一些实施方案中，因数是10至1000倍。在一些实施方案中，因数是10至100倍。在一些实施方案中，因数是10至200倍。在一些实施方案中，因数是10至300倍。在一些实施方案中，因数是10至500倍。在一些实施方案中，因数是20至1000倍。在一些实施方案中，因数是30至1000倍。在一些实施方案中，因数是50至1000倍。在一些实施方案中，因数是100至1000倍。在一些实施方案中，因数是200至1000倍。在一些实施方案中，翻译增强了任何其他显著量或量的范围。
在一些实施方案中，非免疫原性RNA(尤其是mRNA)比具有相同序列的标准RNA表现出显著更低的先天免疫原性。在一些实施方案中，非免疫原性RNA(特别是mRNA)表现出比其未经修饰对应物低2倍的先天免疫应答。在一些实施方案中，先天免疫原性降低3倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低4倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低5倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低6倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低7倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低8倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低9倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低10倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低15倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低20倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低50倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低100倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低200倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低500倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低1000倍因数。在一些实施方案中，先天免疫原性降低2000倍因数。
术语“表现出明显更低的先天免疫原性”是指可检测到的先天免疫原性降低。在一些实施方案中，该术语是指降低使得可施用有效量的非免疫原性RNA(特别是mRNA)而不触发可检测的先天免疫应答。在一些实施方案中，该术语是指降低使得非免疫原性RNA(特别是mRNA)可重复施用而不引发足以可检测地降低由非免疫原性RNA编码的蛋白质的产生的先天免疫应答。在一些实施方案中，降低使得非免疫原性RNA(特别是mRNA)可重复施用而不引发足以消除由非免疫原性RNA编码的蛋白质的可检测产生的先天免疫应答。
“免疫原性”是指外来物质(例如RNA)在人或其他动物体内引发免疫应答的能力。先天免疫系统是免疫系统中相对非特异性和即时性的组成部分。其与适应性免疫系统一起，是脊椎动物免疫系统的两个主要组分之一。
PD-1轴结合拮抗剂
“免疫检查点”是指免疫系统的调节剂，并且特别是调节T细胞活性的幅度和质量的共刺激和抑制信号。在某些实施方案中，免疫检查点是抑制性信号。在某些实施方案中，抑制性信号是PD-1与PD-L1和/或PD-L2之间的相互作用。
“程序性死亡-1(Programmed Death-1，PD-1)”受体是指属于CD28家族的免疫抑制性受体。PD-1主要在体内先前活化的T细胞上表达，并且与两种配体(PD-L1和PD-L2)结合。本文中使用的术语“PD-1”包括人PD-1(human PD-1，hPD-1)，hPD-1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物。“程序性死亡配体1(ProgrammedDeath Ligand-1，PD-L1)”是用于PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)，在与PD-1结合之后下调T细胞活化和细胞因子分泌。本文中使用的术语“PD-L1”包括人PD-L1(human PD-L1，hPD-L1)，hPD-L1的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。本文中使用的术语“PD-L2”包括人PD-L2(human PD-L2，hPD-L2)，hPD-L2的变体、同种型和物种同源物，以及与hPD-L2具有至少一个共同表位的类似物。PD-1的配体(PD-L1和PD-L2)在抗原呈递细胞(例如树突细胞或巨噬细胞)以及其他免疫细胞的表面上表达。PD-1与PD-L1或PD-L2的结合导致T细胞活化的下调。表达PD-L1和/或PD-L2的癌细胞能够关闭(switch off)表达PD-1的T细胞，导致抗癌免疫应答的抑制。PD-1与其配体之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖降低以及癌细胞的免疫逃避。免疫抑制可通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用来逆转，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，这种作用是累加的。
许多免疫检查点受特定受体与配体对之间的相互作用(例如上述那些)调节。因此，免疫检查点蛋白介导免疫检查点信号传导。例如，检查点蛋白直接或间接调节T细胞活化、T细胞增殖和/或T细胞功能。癌细胞经常利用这些检查点途径来保护其免受免疫系统的攻击。因此，根据本公开内容调节的检查点蛋白的功能通常是调节T细胞活化、T细胞增殖和/或T细胞功能。免疫检查点蛋白因此调节和维持自身耐受性以及生理免疫应答的持续时间和强度。
本文中使用的术语“免疫检查点调节剂”或“检查点调节剂”是指调节一种或更多种检查点蛋白的功能的分子或化合物。免疫检查点调节剂通常能够调节自身耐受性和/或免疫应答的强度和/或持续时间。优选地，免疫检查点调节剂调节一种或更多种人检查点蛋白的功能，并且因此是“人检查点调节剂”。具体地，人检查点调节剂是免疫检查点抑制剂。
本文中使用的“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白或者完全或部分降低、抑制、干扰或负调节一种或更多种检查点蛋白的表达。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂与一种或更多种检查点蛋白结合。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂与调节检查点蛋白的一种或更多种分子结合。
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂阻止与免疫检查点相关的抑制性信号。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏与免疫检查点相关的抑制性信号传导的抗体或其片段。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的小分子抑制剂。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是破坏抑制性信号传导的基于肽的抑制剂。
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂是阻止检查点阻断剂蛋白之间相互作用的抗体、其片段或抗体模拟物。
在一些实施方案中，如本文中所述，抑制或阻断抑制性免疫检查点信号传导导致阻止或逆转免疫抑制以及建立或增强T细胞免疫。在一些实施方案中，如本文中所述，免疫检查点信号传导的抑制可降低或抑制免疫系统的功能障碍。在一些实施方案中，如本文中所述，免疫检查点信号传导的抑制使功能障碍的免疫细胞的功能障碍降低。在一些实施方案中，如本文中所述，免疫检查点信号传导的抑制使功能障碍T细胞的功能障碍降低。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂(免疫检查点阻断剂)是PD-1/PD-L1或PD-1/PD-L2信号传导途径的组成部分。
在某些实施方案中，抑制性免疫调节剂(免疫检查点阻断剂)是PD-1轴结合拮抗剂。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”是指这样的分子：其抑制PD-1轴结合配偶体(bindingpartner)与其一个或更多个结合配偶体相互作用，以除去由PD-1信号传导轴上的信号传导导致的T细胞功能障碍，结果是恢复或增强T细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。本文中使用的PD-1轴结合拮抗剂包含PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”是指这样的分子：其降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-L1或PD-L2)相互作用导致的信号转导。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其一个或更多个结合配偶体结合的分子。在一个特定方面中，PD-1结合拮抗剂抑制PD-1与PD-L1和/或PD-L2结合。例如，PD-1结合拮抗剂包含抗PD-1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用导致的信号转导的其他分子。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂降低由通过PD-1介导信号传导的T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号或者通过所述细胞表面蛋白来降低负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞的功能障碍降低(例如，增强对抗原识别的效应物应答)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。下文提供了PD-1结合拮抗剂的具体实例。
术语“PD-L1结合拮抗剂”是指这样的分子：其降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1或B7-1)相互作用导致的信号转导。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面中，PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1与PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂包含抗PD-L1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L1与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1或B7-1)相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L1结合拮抗剂降低由通过PD-L1介导信号传导的T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号或者通过所述细胞表面蛋白来降低负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞的功能障碍降低(例如，增强对抗原识别的效应物应答)。在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。下文提供了PD-L1结合拮抗剂的具体实例。
术语“PD-L2结合拮抗剂”是指这样的分子，其降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1)相互作用导致的信号转导。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其一个或更多个结合配偶体结合的分子。在一个特定方面中，PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2与PD-1结合。在一些实施方案中，PD-L2拮抗剂包括抗PD-L2抗体、其抗原结合片段、免疫黏附蛋白、融合蛋白、寡肽，以及降低、阻断、抑制、消除或干扰由PD-L2与其一个或更多个结合配偶体(例如PD-1)相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，PD-L2结合拮抗剂降低由通过PD-L2介导信号传导的T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负共刺激信号或者通过所述细胞表面蛋白来降低负共刺激信号，从而使功能障碍的T细胞的功能障碍降低(例如增强对抗原识别的效应物应答)。在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是免疫黏附蛋白。
在一些实施方案中，PD-1轴结合拮抗剂包含PD-1结合拮抗剂、PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“PD-1”的替代名称包括CD279和SLEB2。“PD-L1”的替代名称包括B7-H1、B7-4、CD274和B7-H。“PD-L2”的替代名称包括B7-DC、Btdc和CD273。在一些实施方案中，PD-1、PD-L1和PD-L2是人PD-1、PD-L1和PD-L2。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个特定方面中，PD-1配体结合配偶体是PD-L1和/或PD-L2。
在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面中，PD-L1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。
在一些实施方案中，PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2与其结合配偶体结合的分子。在一个特定方面中，PD-L2结合配偶体是PD-1。
拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白或寡肽。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。
示例性PD-1抑制剂包括但不限于抗PD-1抗体，例如BGB-A317(BeiGene；参见US 8,735,553、WO 2015/35606和US2015/0079109)，西米普利单抗(cemiplimab)(Regeneron；参见WO 2015/112800)和兰立珠单抗(lambrolizumab)(例如，在WO2008/156712中公开为hPD109A及其人源化衍生物h409A1、h409A16和h409A17)，AB137132(Abcam)，EH12.2H7和RMP1-14(#BE0146；Bioxcell Lifesciences Pvt.LTD.)，MIH4(Affymetrix eBioscience)，纳武单抗(OPDIVO，BMS-936558；Bristol Myers Squibb；参见WO 2006/121168)，派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475；Merck；参见WO 2008/156712)，皮地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011；CureTech；参见Hardy et al.,1994,Cancer Res.,54(22):5793-6和WO 2009/101611)，PDR001(Novartis；参见WO 2015/112900)，MEDI0680(AMP-514；AstraZeneca；参见WO 2012/145493)，TSR-042(参见WO 2014/179664)、REGN-2810(H4H7798N；参见US2015/0203579)，JS001(TAIZHOU JUNSHIPHARMA；参见Si-Yang Liu et al.,2007,J.Hematol.Oncol.70:136)，AMP-224(GSK-2661380；参见Li et al.,2016,Int J Mol Sci17(7):1151以及WO2010/027827和WO 2011/066342)、PF-06801591(Pfizer)，BGB-A317(BeiGene；参见WO2015/35606和US 2015/0079109)，BI 754091，SHR-1210(参见WO2015/085847)，以及如WO2006/121168中所述的抗体17D8、2D3、4H1、4A11、7D3和5F4，INCSHR1210(Jiangsu HengruiMedicine；也称为SHR-1210；参见WO 2015/085847)，TSR-042(Tesaro Biopharmaceutical；也称为ANB011；参见W02014/179664)，GLS-010(Wuxi/Harbin Gloria Pharmaceuticals；也称为WBP3055；参见Si-Yang et al.,2017,J.Hematol.Oncol.70:136)，STI-1110(SorrentoTherapeutics；参见WO 2014/194302)，AGEN2034(Agenus；参见WO 2017/040790)，MGA012(Macrogenics；参见WO 2017/19846)，IBI308(Innovent；参见WO 2017/024465、WO 2017/025016、WO 2017/132825和WO 2017/133540)，如在例如US 7,488,802、US 8,008,449、US8,168,757、WO 03/042402、WO 2010/089411(还公开了抗PD-L1抗体)、WO 2010/036959、WO2011/159877(还公开了针对TIM-3的抗体)、WO 2011/082400、WO 2011/161699、WO 2009/014708、WO 03/099196、WO 2009/114335、WO 2012/145493(还公开了针对PD-L1的抗体)、WO2015/035606、WO 2014/055648(还公开了抗KIR抗体)、US 2018/0185482(还公开了抗PD-L1和抗TIGIT抗体)、US 8,008,449、US 8,779,105、US 6,808,710、US 8,168,757、US2016/0272708和US 8,354,509中所述的抗PD-1抗体。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含纳武单抗(OPDIVO；BMS-936558)、派姆单抗(KEYTRUDA；MK-3475)、西米普利单抗(LIBTAYO，REGN2810)、皮地利珠单抗(CT-011)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)(PDR001)、MEDI0680(AMP-514)、多塔利单抗(dostarlimab)(TSR-042)、西利单抗(cetrelimab)(JNJ 63723283)、特瑞普利单抗(toripalimab)(JS001)、AMP-224(GSK-2661380)、PF-06801591、替雷利珠单抗(tislelizumab)(BGB-A317)、ABBV-181、BI754091或SHR-1210。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号：946414-94-4)。纳武单抗(Bristol-Myers Squibb/Ono)，也称为MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和其是WO2006/121168中描述的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链包含氨基酸序列：
(SEQ ID NO:11)，并且
(b)轻链包含氨基酸序列：
(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12的六个CDR序列(例如，来自SEQ ID NO:11的三个重链CDR和来自SEQ ID NO:12的三个轻链CDR)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:11的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:12的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区(VH)，以及(b)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链可变区(VL)：
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有氨基酸序列GITFSNSG(SEQ ID NO:15)的CDR-1，含有氨基酸序列IWYDGSKR(SEQ ID NO:16)的CDR-2，和含有氨基酸ATNDDY(SEQ ID NO:17)的CDR-3，以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有氨基酸序列QSVSSY(SEQ ID NO:18)的CDR-1，含有氨基酸序列DAS(SEQ ID NO:19)的CDR-2，和含有氨基酸序列QQSSNWPRT(SEQ ID NO:20)的CDR-3。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体是纳武单抗，其可以以240mg的剂量静脉内施用。纳武单抗可根据机构指南、公开的指南和相应的产品处方信息静脉内给予，并根据本方案给药。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是派姆单抗(CAS登记号：1374853-91-4)。派姆单抗(Merck)，也称为MK-3475、Merck 3475、兰立珠单抗、和SCH-900475，其是WO2009/114335中描述的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含重链和轻链序列，其中：
(a)重链包含氨基酸序列：
(SEQ ID NO:21)，并且
(b)轻链包含氨基酸序列：
(SEQ ID NO:22)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22的六个CDR序列(例如，来自SEQ ID NO:21的三个重链CDR和来自SEQ ID NO:22的三个轻链CDR)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含来自SEQ ID NO:21的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:22的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(VH)，以及(b)包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含：含有氨基酸序列GYTFTNYY(SEQ ID NO:25)的CDR-1，含有氨基酸序列INPSNGGT(SEQ ID NO:26)的CDR-2和含有氨基酸ARRDYRFDMGFDY(SEQ ID NO:27)的CDR-3，以及(b)轻链可变区(VL)，其包含：含有氨基酸序列NGVSTSGYSY(SEQ ID NO:28)的CDR-1，含有氨基酸序列LAS(SEQ ID NO:29)的CDR-2和含有氨基酸序列QHSRDLPLT(SEQ ID NO:30)的CDR-3。
在某个实施方案中，抗PD-1抗体是可以以200mg的剂量静脉内施用的派姆单抗。派姆单抗可根据机构指南、公开的指南和相应的产品处方信息静脉内给予，并根据本方案给药。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含西米普利单抗。
在某些实施方案中，抗PD-1抗体包含含有重链和轻链序列的抗体，其中：
(a)重链包含氨基酸序列：
并且
(b)轻链包含氨基酸序列：
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含抗体，该抗体包含来自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32的六个CDR序列(例如，来自SEQ ID NO:31的三个重链CDR和来自SEQ IDNO:32的三个轻链CDR)。在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含抗体，该抗体包含来自SEQ ID NO:31的重链可变结构域和来自SEQ ID NO:32的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，免疫检查点抑制剂包含抗体，该抗体包含：(a)重链可变区(VH)，其包含含有氨基酸序列FTFSNFG(SEQ ID NO:33)的CDR-1、含有氨基酸序列ISGGGRDT(SEQ ID NO:34)的CDR-2和含有氨基酸序列VKWGNIYFDY(SEQ ID NO:35)的CDR-3，以及(b)轻链可变区(VL)，其包含含有氨基酸序列LSINTF(SEQ ID NO:36)的CDR-1、含有氨基酸序列AAS(SEQ ID NO:37)的CDR-2和含有氨基酸序列QQSSNTPFT(SEQ ID NO:38)的CDR-3。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是MEDI-0680(AMP-514；AstraZeneca)。MEDI-0680是人源化IgG4抗PD-1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是PDR001(CAS登记号1859072-53-9；Novartis)。PDR001是人源化IgG4抗PD1抗体，其可阻断PD-L1和PD-L2与PD-1的结合。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是REGN2810(Regeneron)。REGN2810是人抗PD1抗体，也称为和西米普利单抗-rwlc。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是BGB-108(BeiGene)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是BGB-A317(BeiGene)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是JS-001(Shanghai Junshi)。JS-001是人源化抗PD1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是STI-A1110(Sorrento)。STI-A1110是人抗PD1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是INCSHR-1210(Incyte)。INCSHR-1210是人IgG4抗PD1抗体。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是PF-06801591(Pfizer)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是TSR-042(也称为ANB011；Tesaro/AnaptysBio)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是AM0001(ARMO Biosciences)。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是ENUM 244C8(Enumeral BiomedicalHoldings)。ENUM 244C8是抗PD1抗体，可抑制PD-1功能，但不阻断PD-L1与PD-1的结合。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体是ENUM 388D4(Enumeral BiomedicalHoldings)。ENUM 388D4是抗PD1抗体，可竞争性抑制PD-L1与PD-1的结合。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是免疫黏附素(例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PD-L1或PD-L2的胞外或PD-1结合部分的免疫黏附素)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224。AMP-224(CAS登记号1422184-00-6；GlaxoSmithKline/MedImmune)也称为B7-DCIg，是在WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。
在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是肽或小分子化合物。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AUNP-12(PierreFabre/Aurigene)。例如，参见
W02012/168944,W02015/036927,W02015/044900,W02015/033303,W02013/144704,W02013/132317,和W02011/161699。
在一些实施方案中，PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。本文中考虑并描述了多种抗PD-L1抗体。在本文中的任何实施方案中，分离的抗PD-L1抗体可与人PD-L1结合，例如如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示的人PD-L1或其变体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1和PD-1之间和/或PD-L1和B7-1之间的结合。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段的抗体片段。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体是人抗体。PCT专利申请WO 2010/077634 A1和美国专利No.8,217,149中描述了可用于本发明方法的抗PD-L1抗体的实例及用于制备其的方法，其通过引用并入本文。
示例性的PD-L1结合拮抗剂包含但不限于抗PD-L1抗体如MEDI4736(度伐单抗；AstraZeneca；参见WO 2011/066389)、MSB-0010718C(参见US2014/0341917)、YW243.55.S70(参见WO 2010/077634和US 8,217,149的SEQ ID NO:20)、MIH1(Affymetrix eBioscience；参见EP 3230319)、MDX-1105(Roche/Genentech；参见WO2013019906和US 8,217,149)STI-1014(Sorrento；参见W02013/181634)、CK-301(Checkpoint Therapeutics)、KN035(3DMed/Alphamab；参见Zhang et al.,2017,Cell Discov.3:17004)、阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267；参见US 9，724，413)、BMS-936559(Bristol Myers Squibb；参见US 7，943，743、WO 2013/173223)、阿维单抗(bavencio；参见US 2014/0341917)、LY3300054(Eli Lilly Co.)、CX-072(Proclaim-CX-072；也称为CytomX；参见WO2016/149201)、FAZ053、KN035(参见WO2017020801和WO2017020802)、MDX-1105(参见US2015/0320859)、在US 7，943，743中公开的抗PD-L1抗体(包括3G10、12A4(称为BMS-936559)、10A5、5F8、10H10、1B12、7H1、11E6、12B7和13G4)、如以下中描述的抗PD-L1抗体：WO 2010/077634，US 8，217，149，WO 2010/036959，WO 2010/077634，WO 2011/066342，US 8，217，149，US 7，943，743，WO 2010/089411，US 7，635，757，US 8，217，149，US 2009/0317368，WO2011/066389，WO2017/034916，WO2017/020291，WO2017/020858，W02017/020801，WO2016/111645，WO2016/197367，WO2016/061142，WO2016/149201，WO2016/000619，WO2016/160792，WO2016/022630，WO2016/007235，WO2015/179654，WO2015/173267，WO2015/181342，WO2015/109124，WO2018/222711，WO2015/112805，WO2015/061668，WO2014/159562，WO2014/165082，WO2014/100079.
在某些实施方案中，抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗(TECENTRIQ；RG7446；MPDL3280A；R05541267)、度伐单抗(MEDI4736)、BMS-936559、阿维单抗(bavencio)、洛达利单抗(lodapolimab)(LY3300054)、CX-072(Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035或MDX-1105。
PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体)可以以本领域已知的任何方式和任何途径施用。施用方式和途径将取决于所用PD-1轴结合拮抗剂的类型。
PD-1轴结合拮抗剂可以以本文中所述的任何合适的药物组合物的形式施用。
PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体)可以以编码PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体)的核酸(例如DNA或RNA)的形式施用。例如，抗体可在表达核酸中递送编码，如本文中所述。核酸分子可以以其本身递送，例如以质粒或mRNA分子的形式，或者与递送载剂复合，例如脂质体、脂质复合物或任何其他核酸颗粒(例如核酸脂质颗粒)。PD-1轴结合拮抗剂如抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体也可通过包含编码PD-1轴结合拮抗剂的表达盒的溶瘤病毒来施用。
免疫刺激剂
“免疫刺激剂”是通过诱导任何免疫系统组分，特别是免疫效应细胞的活化或提高其活性来刺激免疫系统的任何物质。免疫刺激剂可以是促炎的(例如，当治疗感染或癌症时)，或抗炎的(例如，当治疗自身免疫疾病时)。
根据一个方面，免疫刺激剂是细胞因子或其变体。细胞因子的一些实例包括干扰素，例如干扰素-α(interferon-alpha，IFN-α)或干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)；白介素，例如IL2、IL7、IL12、IL15和IL23；集落刺激因子，例如M-CSF和GM-CSF；以及肿瘤坏死因子。根据另一方面，免疫刺激剂包括佐剂型免疫刺激剂，例如APC Toll样受体激动剂或共刺激/细胞黏附膜蛋白。Toll样受体激动剂的一些实例包括共刺激/黏附蛋白，如CD80、CD86和ICAM-1。
术语“细胞因子”涉及分子量为约5至60kDa并参与细胞信号传导(例如，旁分泌、内分泌和/或自分泌信号传导)的蛋白质。特别地，当释放时，细胞因子对其释放位置周围的细胞行为产生影响。细胞因子的一些实例包括淋巴因子、白介素、趋化因子、干扰素和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)。根据本公开内容，细胞因子不包括激素或生长因子。细胞因子与激素的不同之处在于：(i)它们通常以比激素更加可变的浓度发挥作用，以及(ii)通常由广泛范围的细胞产生(几乎所有有核细胞均可以产生细胞因子)。干扰素通常特征在于抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。干扰素是通过与所调节细胞表面上的干扰素受体结合来改变和调节细胞内基因的转录从而阻止细胞内病毒复制的蛋白质。细胞因子的具体实例包括促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)、集落刺激因子(colony stimulatingfactor，CSF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、干扰素α(IFNα)、干扰素β(interferon beta，IFNβ)、干扰素γ(INFγ)、白介素2(interleukin2，IL-2)、白介素4(interleukin 4，IL-4)、白介素10(interleukin 10，IL-10)、白介素11(interleukin 11，IL-11)、白介素12(interleukin 12，IL-12)、白介素15(interleukin15，IL-15)和白介素21(interleukin 21，IL-21)，以及其变体和衍生物。
根据本公开内容，细胞因子可以是天然存在的细胞因子或其功能片段或变体。细胞因子可以是人细胞因子，并且可来源于任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物。一种特别优选的细胞因子是干扰素-α。
可通过向对象施用在用于将RNA优先递送至肝或肝组织的制剂中的编码免疫刺激剂的RNA来向对象提供免疫刺激剂。优选将RNA递送至这样的靶器官或组织，特别是如果期望表达大量的免疫刺激剂和/或如果期望或需要全身存在免疫刺激剂，特别是显著量的免疫刺激剂。
RNA递送系统对肝具有固有的偏好。这涉及基于脂质的颗粒、阳离子和中性纳米粒，特别是脂质纳米粒。
用于靶向肝的合适免疫刺激剂的实例是参与T细胞增殖和/或维持的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL2或IL7、其片段和变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白，例如延长PK的细胞因子。
在另一个实施方案中，编码免疫刺激剂的RNA可在制剂中施用，用于将RNA优先递送至淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。优选将免疫刺激剂递送至这样的靶组织，特别是，如果期望免疫刺激剂存在于该器官或组织中(例如，用于诱导免疫应答，特别是在T细胞致敏期间或用于活化常驻免疫细胞而需要免疫刺激剂例如细胞因子的情况下)，而不期望免疫刺激剂全身性存在，特别是以显著量全身性存在(例如，因为免疫刺激剂具有全身毒性)。
合适的免疫刺激剂的实例是参与T细胞致敏的细胞因子。合适的细胞因子的实例包括IL12、IL15、IFN-α或IFN-β、其片段及变体，以及这些细胞因子、片段和变体的融合蛋白，例如延长PK的细胞因子。
干扰素
干扰素(IFN)是由宿主细胞响应于多种病原体(例如病毒、细菌、寄生虫还有肿瘤细胞)的存在而产生和释放的一组信号传导蛋白。在一种典型情况下，病毒感染的细胞将释放干扰素，导致附近的细胞增强其抗病毒防御。
基于受体(通过其干扰素发出信号)的类型，干扰素通常分为三类：I型干扰素、II型干扰素和III型干扰素。
所有I型干扰素均与称为IFN-α/β受体(IFNAR)的特定细胞表面受体复合体结合，所述IFN-α/β受体(IFNAR)由IFNAR1和IFNAR2链组成。
人中存在的I型干扰素为IFNα、IFNβ、IFNε、IFNκ和IFNω。一般来说，I型干扰素是在身体识别入侵身体的病毒时产生的。它们由成纤维细胞和单核细胞产生。一旦释放，I型干扰素即与靶细胞上的特定受体结合，这导致表达将阻止病毒产生和复制其RNA和DNA的蛋白质。
IFNα蛋白主要由浆细胞样树突细胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)产生。它们主要参与针对病毒感染的先天免疫。负责其合成的基因以被称为以下的13种亚型出现：IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、IFNA21。这些基因在9号染色体上成簇一起被发现。
IFNβ蛋白由成纤维细胞大量产生。它们具有主要参与先天免疫应答的抗病毒活性。已经描述了两种类型的IFNβ，即IFNβ1和IFNβ3。IFNβ1的天然和重组形式具有抗病毒、抗菌和抗癌特性。
II型干扰素(人中的IFNγ)也称为免疫干扰素，并且由IL12活化。此外，II型干扰素由细胞毒性T细胞和T辅助细胞释放。
III型干扰素通过由IL10R2(也称为CRF2-4)和IFNLR1(也称为CRF2-12)组成的受体复合体发出信号。尽管比I型和II型干扰素发现得更晚，但最近的信息表明了III型IFN在一些类型的病毒或真菌感染中的重要性。
一般来说，I型和II型干扰素负责调节和活化免疫应答。
根据本公开内容，I型干扰素优选为IFNα或IFNβ，更优选为IFNα。
根据本公开内容，干扰素可以是天然存在的干扰素或其功能片段或变体。干扰素可以是人干扰素，并且可以来自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物。
白介素
白介素(IL)是一组细胞因子(分泌型蛋白和信号分子)，基于不同的结构特征可分为四大类。然而，它们的氨基酸序列相似性相当弱(通常15％至25％同一性)。人基因组编码多于50种白介素和相关蛋白质。
根据本公开内容，白介素可以是天然存在的白介素或其功能片段或变体。白介素可以是人白介素，并且可以来源于任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物。
PK延长基团
本文中所述的免疫刺激剂多肽可制备为融合多肽或嵌合多肽，其包含免疫刺激剂部分和异源多肽(即，不是免疫刺激剂的多肽)。免疫刺激剂可与PK延长基团融合，这提高了循环半衰期。下文描述了PK延长基团的一些非限制性实例。应理解，提高免疫刺激剂(例如细胞因子或其变体)的循环半衰期的其他PK基团也适用于本公开内容。在某些实施方案中，PK延长基团是血清白蛋白结构域(例如，小鼠血清白蛋白、人血清白蛋白)。
本文中使用的术语“PK”是“药代动力学”的首字母缩略词，并且涵盖化合物的包括以下的特性：例如由对象进行的吸收、分布、代谢和清除。本文中使用的“PK延长基团”是指当与生物活性分子融合或一起施用时提高生物活性分子的循环半衰期的蛋白质、肽或部分。PK延长基团的一些实例包括：血清白蛋白(例如，HSA)、免疫球蛋白Fc或Fc片段及其变体、转铁蛋白及其变体和人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)结合剂(如美国公开No.2005/0287153和2007/0003549中所公开的)。另一些示例性PK延长基团在Kontermann,Expert Opin Biol Ther,2016Jul；16(7):903-15中公开，其通过引用整体并入本文。本文中使用的“PK延长的”免疫刺激剂是指与PK延长基团组合的免疫刺激剂部分。在一些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂是其中免疫刺激剂部分与PK延长基团连接或融合的融合蛋白。
在某些实施方案中，相对于单独的免疫刺激剂(即，不与PK延长基团融合的免疫刺激剂)，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期提高。在某些实施方案中，相对于单独的免疫刺激剂的血清半衰期，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期长至少20％、40％、60％、80％、100％、120％、150％、180％、200％、400％、600％、800％或1000％。在某些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期是单独的免疫刺激剂的血清半衰期的至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、10倍、12倍、13倍、15倍、17倍、20倍、22倍、25倍、27倍、30倍、35倍、40倍或50倍长。在某些实施方案中，PK延长的免疫刺激剂的血清半衰期为至少10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时、110小时、120小时、130小时、135小时、140小时、150小时、160小时或200小时。
本文中使用的“半衰期”是指例如由于通过天然机制的降解和/或清除或螯合而使化合物(例如肽或多肽)的血清或血浆浓度在体内降低50％所花费的时间。适用于本文中的PK延长的免疫刺激剂在体内是稳定的，并且其半衰期通过例如与抵抗降解和/或清除或螯合的血清白蛋白(例如HSA或MSA)融合而提高。半衰期可以以本身已知的任何方式，例如通过药代动力学分析来确定。合适的技术对于本领域技术人员而言将是明显的，并且可例如通常包括以下步骤：合适地向对象施用合适剂量的氨基酸序列或化合物；定期收集来自所述对象的血液样品或其他样品；确定所述血液样品中氨基酸序列或化合物的水平或浓度；以及根据由此获得的数据(的图)计算直至氨基酸序列或化合物的水平或浓度与给药时的初始水平相比降低了50％为止的时间。另外的细节在例如标准手册例如Kenneth,A.etal.,Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists和在Peters et al.,Pharmacokinetic Analysis:A Practical Approach(1996)中提供。也参考Gibaldi,M.et al.,Pharmacokinetics,2nd Rev.Edition,Marcel Dekker(1982)。
在某些实施方案中，PK延长基团包括血清白蛋白或其片段或者血清白蛋白或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“白蛋白”包括)。本文中所述的多肽可以与白蛋白(或其片段或变体)融合以形成白蛋白融合蛋白。这样的白蛋白融合蛋白在美国公开No.20070048282中描述。
本文中使用的“白蛋白融合蛋白”是指通过将至少一个白蛋白分子(或其片段或变体)与至少一个蛋白质分子(例如治疗性蛋白质，特别是免疫刺激剂)融合而形成的蛋白质。白蛋白融合蛋白可通过翻译核酸来产生，其中编码治疗性蛋白质的多核苷酸与编码白蛋白的多核苷酸框内连接。治疗性蛋白质和白蛋白一旦是白蛋白融合蛋白的一部分则可各自被称为白蛋白融合蛋白的“部分(portion)”、“区域”或“部分(moiety)”(例如“治疗性蛋白质部分”或“白蛋白蛋白质部分”)。在一个高度优选的实施方案中，白蛋白融合蛋白包含至少一个治疗性蛋白质分子(包括但不限于治疗性蛋白质的成熟形式)和至少一个白蛋白分子(包括但不限于白蛋白的成熟形式)。在一个实施方案中，白蛋白融合蛋白由用于所施用RNA的宿主细胞(例如靶器官的细胞(例如肝细胞))加工并被分泌到循环中。在用于表达RNA的宿主细胞分泌途径中发生的新生白蛋白融合蛋白的加工可包括但不限于：信号肽切割；二硫键形成；适当折叠；糖类的添加和加工(例如如N-和O-连接糖基化)；特定的蛋白水解切割；和/或组装成多聚体蛋白质。白蛋白融合蛋白优选由RNA以特别地在其N端具有信号肽的非加工形式编码，并且在由细胞分泌之后优选以经加工的形式存在，其中特别地信号肽已被切割掉。在一个最优选的实施方案中，“白蛋白融合蛋白的经加工形式”是指已经经历了N端信号肽切割的白蛋白融合蛋白产物，在本文中也称为“成熟的白蛋白融合蛋白”。
在一些优选实施方案中，包含治疗性蛋白质的白蛋白融合蛋白与未与白蛋白融合的相同治疗性蛋白质的血浆稳定性相比具有更高的血浆稳定性。血浆稳定性通常是指当体内施用治疗性蛋白质并带入血流中与当治疗性蛋白质被降解并从血流中被清除至器官(例如肾或肝)(最终从身体清除治疗性蛋白质)之间的时间段。根据治疗性蛋白质在血流中的半衰期来计算血浆稳定性。治疗性蛋白质在血流中的半衰期可通过本领域已知的常规测定法容易地确定。
本文中使用的“白蛋白”统指白蛋白蛋白质或氨基酸序列，或具有白蛋白的一种或更多种功能活性(例如，生物活性)的白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”是指人白蛋白或其片段或变体，特别是人白蛋白的成熟形式，或者来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子的变体。白蛋白可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物，例如人、牛、羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于鸡和鲑鱼。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可与治疗性蛋白质部分来自不同的动物。
在某些实施方案中，白蛋白是人血清白蛋白(HSA)或其片段或变体，例如在US 5，876，969，WO 2011/124718，WO 2013/075066，和WO 2011/0514789中公开的那些。
术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本文中可互换使用。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”更广泛，并且涵盖人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。
本文中使用的足以延长治疗性蛋白质的治疗活性或血浆稳定性的白蛋白片段是指这样的白蛋白片段：长度或结构足以稳定或延长蛋白质的治疗活性或血浆稳定性，使得白蛋白融合蛋白的治疗性蛋白质部分的血浆稳定性与非融合状态下的血浆稳定性相比延长或延伸。
白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可包含白蛋白序列的全长，或者可包含其一个或更多个能够稳定或延长治疗活性或血浆稳定性的片段。这样的片段的长度可以是10个或更多个氨基酸，或者可包含来自白蛋白序列的约15、20、25、30、50或更多个连续氨基酸，或者可包含白蛋白的特定结构域的一部分或全部。例如，可使用跨越前两个免疫球蛋白样结构域的一个或更多个HSA片段。在一个优选实施方案中，HSA片段是HSA的成熟形式。
一般而言，白蛋白片段或变体将是至少100个氨基酸长，优选至少150个氨基酸长。
根据本公开内容，白蛋白可以是天然存在的白蛋白或其片段或变体。白蛋白可以是人白蛋白，并且可来源于任何脊椎动物，特别是任何哺乳动物。
优选地，白蛋白融合蛋白包含白蛋白作为N端部分并且包含治疗性蛋白质作为C端部分。或者，也可使用包含白蛋白作为C端部分并且包含治疗性蛋白质作为N端部分的白蛋白融合蛋白。在另一些实施方案中，白蛋白融合蛋白具有与白蛋白的N端和C端二者融合的治疗性蛋白质。在一个优选实施方案中，在N端和C端融合的治疗性蛋白质是相同的治疗性蛋白质。在另一个优选实施方案中，在N端和C端融合的治疗性蛋白质是不同的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，不同的治疗性蛋白质均是细胞因子。
在一些实施方案中，治疗性蛋白质通过肽接头与白蛋白连接。融合的部分之间的接头肽可在部分之间提供更大的物理分离，并因此使治疗性蛋白质部分的可及性最大化，例如，用于与其同源受体结合。接头肽可由氨基酸组成使得它是柔性的或更刚性的。接头序列可被蛋白酶或化学地切割。
本文中使用的术语“Fc区”是指天然免疫球蛋白的由其两条重链的各自的Fc结构域(或Fc部分)形成的部分。本文中使用的术语“Fc结构域”是指单个免疫球蛋白(Ig)重链的部分或片段，其中Fc结构域不包含Fv结构域。在某些实施方案中，Fc结构域在铰链区中在正好位于木瓜蛋白酶切割位点上游开始，并终止于抗体的C端。因此，完整的Fc结构域包含至少铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域。在某些实施方案中，Fc结构域包含以下至少之一：铰链(例如，上部、中间和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或者其变体、部分或片段。在某些实施方案中，Fc结构域包含完整的Fc结构域(即，铰链结构域、CH2结构域和CH3结构域)。在某些实施方案中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的铰链结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域包含与CH3结构域(或其部分)融合的CH2结构域(或其部分)。在某些实施方案中，Fc结构域由CH3结构域或其部分组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH3结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域由CH2结构域(或其部分)和CH3结构域组成。在某些实施方案中，Fc结构域由铰链结构域(或其部分)和CH2结构域(或其部分)组成。在某些实施方案中，Fc结构域缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。本文中的Fc结构域通常是指包含免疫球蛋白重链的Fc结构域的全部或部分的多肽。这包括但不限于包含完整的CH1、铰链、CH2和/或CH3结构域的多肽，以及这样的肽的仅包含例如铰链、CH2和CH3结构域的片段。Fc结构域可来源于任何物种和/或任何亚型的免疫球蛋白，包括但不限于：人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体。Fc结构域涵盖天然Fc和Fc变体分子。如本文中所述，本领域普通技术人员将理解，任何Fc结构域可被修饰，使得其氨基酸序列与天然存在的免疫球蛋白分子的天然Fc结构域不同。在某些实施方案中，Fc结构域具有降低的效应子功能(例如，FcγR结合)。
本文中所述的多肽的Fc结构域可来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的Fc结构域可包含来源于IgG1分子的CH2和/或CH3结构域和来源于IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，Fc结构域可包含部分地来源于IgG1分子且部分地来源于IgG3分子的嵌合铰链区。在另一个实例中，Fc结构域可包含部分地来源于IgG1分子且部分地来源于IgG4分子的嵌合铰链。
在某些实施方案中，PK延长基团包含Fc结构域或其片段或者Fc结构域或其片段的变体(出于本公开内容的目的，所有这些均由术语“Fc结构域”包括)。Fc结构域不包含与抗原结合的可变区。适用于本公开内容的Fc结构域可获自许多不同的来源。在某些实施方案中，Fc结构域来源于人免疫球蛋白。在某些实施方案中，Fc结构域来自人IgG1恒定区。然而，应理解，Fc结构域可来源于其他哺乳动物物种的免疫球蛋白，所述物种包括例如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠)或非人灵长类(例如，黑猩猩、猕猴)物种。
此外，Fc结构域(或其片段或变体)可来源于任何免疫球蛋白种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，并且可来源于任何免疫球蛋白同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
多种Fc结构域基因序列(例如，小鼠和人恒定区基因序列)均可以以公共可获得的保藏物的形式得到。可选择缺乏特定效应子功能和/或具有特定修饰以降低免疫原性的包含Fc结构域序列的恒定区结构域。许多抗体和抗体编码基因的序列已被公布，并且可使用本领域公认的技术从这些序列中得到合适的Fc结构域序列(例如，铰链、CH2和/或CH3序列或其片段或变体)。
在某些实施方案中，PK延长基团是血清白蛋白结合蛋白，例如在US2005/0287153，US2007/0003549，US2007/0178082，US2007/0269422，US2010/0113339，WO2009/083804，和WO2009/133208中描述的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，PK延长基团是转铁蛋白，如在US 7,176,278和US 8,158,579中公开的，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，PK延长基团是血清免疫球蛋白结合蛋白，例如在US2007/0178082、US2014/0220017和US2017/0145062中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，PK延长基团是与血清白蛋白结合的基于纤连蛋白(Fn)的支架结构域蛋白，例如US2012/0094909中公开的那些，其通过引用整体并入本文。在US2012/0094909中还公开了制备基于纤连蛋白的支架结构域蛋白的方法。基于Fn3的PK延长基团的一个非限制性实例是Fn3(HSA)，即与人血清白蛋白结合的Fn3蛋白。
在某些方面中，适合于根据本公开内容使用的PK延长的免疫刺激剂，可采用一种或更多种肽接头。本文中使用的术语“肽接头”是指在多肽链的线性氨基酸序列中将两个或更多个结构域(例如，PK延长的部分和免疫刺激剂部分)连接的肽或多肽序列。例如，肽接头可用于将免疫刺激剂部分与HSA结构域连接。
适合于将PK延长基团与例如免疫刺激剂融合的接头是本领域公知的。一些示例性的接头包括甘氨酸-丝氨酸-多肽接头、甘氨酸-脯氨酸-多肽接头和脯氨酸-丙氨酸多肽接头。在某些实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸-多肽接头，即由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。
免疫效应细胞
本文中使用的免疫效应细胞可向需要治疗的对象施用，或者可内源性存在于需要治疗的对象中。向对象施用编码疫苗抗原的RNA和PD-1轴结合拮抗剂允许刺激免疫效应细胞。本文中所述的方法和药剂尤其可用于治疗以表达免疫效应细胞所针对的抗原的病变细胞为特征的疾病。在一些实施方案中，免疫效应细胞携带对抗原或其加工产物具有结合特异性的抗原受体，例如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，免疫效应细胞存在于待治疗的对象中并表达抗原受体。在一些实施方案中，免疫效应细胞存在于待治疗的对象中，并在对象体内进行遗传修饰以表达抗原受体。在一些实施方案中，将来自待治疗对象或不同对象的免疫效应细胞施用于待治疗对象。施用的免疫效应细胞可在施用之前进行离体遗传修饰，或者在施用之后在对象体内进行遗传修饰以表达抗原受体。在一些实施方案中，抗原受体对免疫效应细胞是内源性的。
在一些实施方案中，免疫效应细胞包括对疫苗抗原有应答的任何细胞。这样的应答性包括活化、分化、增殖、存活和/或一种或更多种免疫效应物功能的指征。特别地，所述细胞包括具有裂解潜能的细胞，特别是淋巴细胞，并且优选T细胞，特别是细胞毒性淋巴细胞，优选选自细胞毒性T细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞和淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。一旦活化，这些细胞毒性淋巴细胞中的每一种都触发靶细胞的破坏。例如，细胞毒性T细胞通过以下方式中的任一种或两种触发靶细胞的破坏。首先，一旦活化，T细胞释放细胞毒素，例如穿孔素、颗粒酶(granzyme)和颗粒溶素(granulysin)。穿孔素和颗粒溶素在靶细胞中产生孔，而颗粒酶进入细胞并在细胞质中触发胱天蛋白酶级联，其诱导细胞的凋亡(程序性细胞死亡)。其次，凋亡可通过T细胞和靶细胞之间的Fas-Fas配体相互作用诱导。尽管可使用异源细胞或同种异体细胞，但结合本发明使用的细胞优选是自体细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞对治疗的对象是内源性的。
本发明上下文中的术语“效应子功能”包括由免疫系统组分介导的任何功能，这些功能导致例如杀伤病变细胞如肿瘤细胞，或抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤散播和转移。优选地，本发明上下文中的效应子功能是T细胞介导的效应子功能。在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下，这样的功能包括释放细胞因子和/或活化CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下包括例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞(即以表达抗原为特征的细胞)，产生细胞因子如IFN-γ和TNF-α，以及抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解杀伤。
在本发明上下文中，术语“免疫效应细胞”或“免疫反应性细胞”涉及在免疫反应期间发挥效应子功能的细胞。在一些实施方案中，“免疫效应细胞”能够结合抗原，例如在细胞上的MHC的情况下呈递或在细胞表面上表达的抗原并介导免疫应答的抗原。例如，免疫效应细胞包括T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞。优选地，在本发明的上下文中，“免疫效应细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+T细胞，最优选CD8+T细胞。根据本发明，术语“免疫效应细胞”还包括可在适当的刺激下成熟为免疫细胞(例如T细胞，特别是T辅助细胞或细胞裂解T细胞)的细胞。免疫效应细胞包括CD34+造血干细胞，未成熟和成熟T细胞以及未成熟和成熟B细胞。当暴露于抗原时，T细胞前体分化为细胞裂解T细胞，类似于免疫系统的克隆选择。
优选地，“免疫效应细胞”以一定程度的特异性识别抗原，特别是如果在MHC的情况下呈递或存在于病变细胞(例如癌细胞)的表面上时。优选地，所述识别使得识别抗原的细胞具有响应性或反应性。如果细胞是辅助T细胞(CD4+T细胞)，则这样的响应性或反应性可能涉及细胞因子的释放和/或CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞的活化。如果细胞是CTL，则这样的响应性或反应性可能涉及例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除细胞(即以表达抗原为特征的细胞)。根据本公开内容，CTL应答性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)产生、活化标志物(例如CD44和CD69)上调、以及抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤。CTL应答性也可使用精确指示CTL应答性的人工报告物来确定。这样的识别抗原并且是响应性或反应性的CTL在本文中也称为“抗原响应性CTL”。
在一些实施方案中，经遗传修饰的免疫效应细胞是表达CAR的免疫效应细胞。在一些实施方案中，经遗传修饰的免疫效应细胞是表达TCR的免疫效应细胞。
免疫效应细胞可表达内源性抗原受体例如T细胞受体或B细胞受体，或者可缺少内源性抗原受体表达。
“淋巴样细胞”是任选地在适当修饰之后，例如在转移抗原受体例如TCR或CAR之后，能够产生免疫应答(例如细胞免疫应答)的细胞，或者这样的细胞的前体细胞，并且包括淋巴细胞(优选T淋巴细胞)、成淋巴细胞和浆细胞。淋巴样细胞可以是如本文中所述的免疫效应细胞。优选的淋巴样细胞是可被修饰以在细胞表面上表达抗原受体的T细胞。在一些实施方案中，淋巴样细胞缺少T细胞受体的内源性表达。
抗原受体
本文中所述的免疫效应细胞表达抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)结合抗原或其加工产物，特别是当存在于靶细胞(例如抗原呈递细胞或病变细胞)上或由靶细胞(例如抗原呈递细胞或病变细胞)呈递时。细胞可以天然表达抗原受体或被修饰以表达抗原受体。在一些实施方案中，免疫效应细胞离体/体外或在被治疗的对象中体内被遗传修饰以表达抗原受体。在一些实施方案中，针对表达抗原受体的修饰是在离体/体外发生的。随后，可将经修饰细胞向患者施用。在一些实施方案中，针对表达抗原受体的修饰在体内发生。细胞可以是患者的内源性细胞或可已经施用于患者。
嵌合抗原受体
由于CAR修饰的T细胞可被改造以靶向几乎任何肿瘤抗原，因此用表达嵌合抗原受体的CAR改造T细胞进行过继性细胞转移治疗是有前景的抗癌治疗。例如，可将患者的T细胞遗传改造(遗传修饰)成表达特异性针对患者肿瘤细胞上的抗原的CAR，然后输注回患者中。
根据本发明，术语“CAR”(或“嵌合抗原受体”)与术语“嵌合T细胞受体”和“人工T细胞受体”同义，并且涉及包含单一分子或分子复合体的人工受体，其识别靶细胞(例如癌细胞)上的靶结构(例如抗原)(即与其结合)(例如通过抗原结合结构域与靶细胞表面上表达的抗原结合)并且可赋予免疫效应细胞例如在细胞表面上表达所述CAR的T细胞以特异性。这样的细胞不一定需要处理和呈递抗原来识别靶细胞，而是可优选地特异性识别靶细胞上存在的任何抗原。优选地，靶结构被CAR识别使得表达所述CAR的免疫效应细胞被活化。CAR可包含一个或更多个蛋白质单元，所述蛋白质单元包含如本文中所述的一个或更多个结构域。术语“CAR”不包括T细胞受体。
CAR包含靶标特异性结合元件或者称为抗原结合部分或抗原结合结构域，通常是CAR胞外结构域的一部分。抗原结合结构域识别充当靶细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。具体地，本发明的CAR靶向病变细胞(例如肿瘤细胞)上的抗原(例如肿瘤抗原)。
在一些实施方案中，CAR中的结合结构域与抗原特异性结合。在一些实施方案中，与CAR中的结合结构域结合的抗原在癌细胞中表达(肿瘤抗原)。在一些实施方案中，抗原在癌细胞表面上表达。在一些实施方案中，结合结构域与抗原的胞外结构域或胞外结构域中的表位结合。在一些实施方案中，结合结构域与存在于活细胞表面的抗原的天然表位结合。
在本发明的一些实施方案中，抗原结合结构域包含对抗原具有特异性的免疫球蛋白重链可变区(VH)和对抗原具有特异性的免疫球蛋白轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，免疫球蛋白是抗体。在一些实施方案中，所述重链可变区(VH)和相应的轻链可变区(VL)通过肽接头连接。优选地，CAR中的抗原结合部分是scFv。
CAR被设计为包含与CAR胞外结构域融合的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域不与CAR中的结构域之一天然缔合。在一些实施方案中，跨膜结构域与CAR中的结构域之一天然缔合。在一些实施方案中，通过氨基酸替换来修饰跨膜结构域以避免这样的结构域与具有相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合体的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可来源于天然或合成来源。在来源是天然的情况下，结构域可来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具有特定用途的跨膜区可来源于以下(即至少包含以下的跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成跨膜结构域的每个末端。
在一些实例中，本发明的CAR包含形成跨膜结构域和胞外结构域之间的连接的铰链结构域。
CAR的胞质结构域或另外的胞内信号传导结构域负责活化其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“胞内信号传导结构域”是指转导效应子功能信号并指导细胞进行特化功能的蛋白质的部分。虽然通常可使用整个胞内信号传导结构域，但是在许多情况下不需要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分来说，这样的截短部分可用于代替完整链，只要其转导效应子功能信号即可。术语胞内信号传导结构域因此意味着包括胞内信号传导结构域的足以转导效应子功能信号的任何截短部分。
已知通过单独TCR产生的信号不足以完全活化T细胞并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，T细胞活化可被认为由两种不同种类的胞质信号传导序列介导：通过TCR起始抗原依赖性初级活化的那些(初级胞质信号传导序列)和以抗原独立性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。
在一些实施方案中，CAR包含来源于CD3ζ的初级胞质信号传导序列。此外，CAR的胞质结构域可包含与共刺激信号传导区结合的CD3ζ信号传导结构域。
共刺激结构域的特性仅限于其具有在CAR与靶向部分结合之后增强细胞增殖和存活的能力。合适的共刺激结构域包括CD28、CD137(4-1BB)(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员)、CD134(OX40)(TNFR受体超家族成员)和CD278(ICOS)(在活化的T细胞上表达的CD28超家族共刺激分子)。技术人员将理解，可使用这些提及的共刺激结构域的序列变体而对本发明无不利影响，其中所述变体与其模拟的结构域具有相同或类似的活性。这样的变体与其来源于的结构域的氨基酸序列具有至少约80％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，CAR构建体包含两个共刺激结构域。虽然一些具体组合包括四种提及的结构域的所有可能变化方案，但是一些具体实例包括CD28+CD137(4-1BB)和CD28+CD134(OX40)。
CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以以随机或特定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽接头或多肽接头(优选长度为2至10个氨基酸)可形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
在一些实施方案中，CAR包含引导新生蛋白质进入内质网的信号肽。在一些实施方案中，信号肽在抗原结合结构域之前。在一些实施方案中，信号肽来源于例如IgG的免疫球蛋白。
根据本公开内容，CAR当存在于T细胞上时识别抗原(例如抗原呈递细胞或病变细胞(例如癌细胞)表面上的抗原)，使得该T细胞被刺激，和/或扩增或发挥如上所述的效应子功能。
免疫效应细胞的遗传修饰
为特异性靶向免疫效应细胞(例如CD8+T细胞)而功能化的颗粒可用于离体/体外或体内将编码抗原受体的核酸递送至免疫效应细胞(例如T细胞)以产生经遗传修饰以表达抗原受体的细胞。这样的遗传修饰包括基于非病毒的DNA转染、基于非病毒的RNA转染(例如mRNA转染)、基于转座子的系统和基于病毒的系统。基于非病毒的DNA转染具有低插入诱变风险。与不包含整合元件的质粒相比，基于转座子的系统可更有效地整合转基因。基于病毒的系统包括使用γ-逆转录病毒和慢病毒载体。γ-逆转录病毒相对容易产生，有效和持久地转导T细胞，并从整合的角度初步证明在原代人T细胞中是安全的。慢病毒载体也有效且永久地转导T细胞，但是制造更加昂贵。它们相比于基于逆转录病毒的系统还可能更加安全。
在本发明所有方面的一些实施方案中，用编码抗原受体的核酸离体或体内转染T细胞或T细胞祖细胞。在一些实施方案中，可使用离体和体内转染的组合。在本发明所有方面的一些实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自待治疗的对象。在本发明所有方面的一些实施方案中，T细胞或T细胞祖细胞来自与待治疗的对象不同的对象。
在本发明的一个方面中，CAR T细胞可在体内产生，并因此几乎瞬时地产生，其使用靶向T细胞的颗粒，例如纳米粒。例如，基于脂质的纳米粒和/或基于聚合物的纳米粒可与CD8特异性靶向部分进行偶联以与T细胞上的CD8结合。与T细胞结合之后，这些颗粒被内吞。它们的内容物，例如，编码抗原受体的核酸，例如编码抗肿瘤抗原CAR的质粒DNA，可定向到T细胞核，这是由于例如包含含有微管相关序列(microtubule-associated sequence，MTAS)和核定位信号(nuclear localization signal，NLS)的肽。包含位于编码抗原受体的核酸侧翼的转座子(例如CAR基因表达盒)和编码过度活跃转座酶的单独核酸(例如质粒)可允许编码抗原受体的核酸(例如，CAR载体)有效整合到染色体中。
另一种可能性是使用CRISPR/Cas9方法有意将抗原受体编码序列例如CAR编码序列置于特定基因座处。例如，现有的T细胞受体(TCR)可被敲除，同时敲入CAR并将其置于内源性启动子的动态调节控制下，否则其会弱化TCR的表达。
因此，除编码抗原受体的核酸之外，本文中所述的颗粒还可作为载物基因编辑工具如CRISPR/Cas9(或相关)或者转座子系统如sleeping beauty或piggy bag来递送。用于基因组整合/编辑的这样的工具(例如转座酶、基因编辑工具如CRISPR/Cas9)可作为蛋白质或编码核酸(DNA或RNA)递送。然而，mRNA的递送也是诱导抗原受体如CAR或T细胞受体(TCR)的瞬时表达的一种选择。
在本发明所有方面的一些实施方案中，经遗传修饰以表达抗原受体的细胞用编码抗原受体的核酸稳定或瞬时转染。因此，编码抗原受体的核酸被整合或未被整合到细胞的基因组中。
在本发明所有方面的一些实施方案中，使经遗传修饰以表达抗原受体的细胞失活以表达内源性T细胞受体和/或内源性HLA。
在本发明所有方面的一些实施方案中，本文中所述的细胞相对于待治疗的对象可以是自体的、同种异体的或同基因的。在一些实施方案中，本公开内容设想了从患者中除去细胞并随后将所述细胞重新递送至该患者。在一些实施方案中，本发明没有设想从患者中除去细胞。在后一种情况下，细胞遗传修饰的所有步骤都在体内进行。
术语“自体”用于描述来源于同一对象的任何事物。例如，“自体移植”是指来源于同一对象的组织或器官的移植。这样的操作是有利的，因为它们克服了免疫屏障，否则会导致排斥。
术语“同种异体的”用于描述来源于相同物种的不同个体的任何事物。当一个或更多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。
术语“同基因的”用于描述来源于具有相同基因型的个体或组织(即同卵双胞胎或相同近交品系的动物，或其组织)的任何事物。
术语“异源的”用于描述由多个不同要素组成的事物。作为一个实例，将一个个体的骨髓转移到不同个体中构成异源移植。异源基因是来源于除对象之外的来源的基因。
颗粒
本文中所述的核酸(例如RNA，特别是mRNA)可存在于包含以下的颗粒中：(i)核酸和(ii)至少一种阳离子化合物或阳离子可电离化合物(例如复合核酸的聚合物或脂质)。带正电荷的分子(例如聚合物和脂质)与带负电荷的核酸之间的静电相互作用涉及颗粒形成。这导致核酸颗粒的复合和自发形成。
先前已描述了适合于以颗粒形式递送RNA的不同类型的包含RNA的颗粒(参见，例如，Kaczmarek,J.C.et al.,2017,Genome Medicine 9,60)。对于非病毒RNA递送载体，纳米粒包封RNA在物理上保护RNA不被降解，并且根据具体的化学性质，可有助于细胞摄取和内体逃逸。
在本公开内容的背景下，术语“颗粒”涉及由分子或分子复合物形成的结构化实体，特别是形成化合物的颗粒。在一些实施方案中，颗粒包含由一种或更多种类型的两亲性物质(例如，两亲性脂质)制成的包膜(例如，一层或更多层或者薄层(lamella))。在本文中，表述“两亲性物质”意指该物质具有亲水性和亲脂性特性二者。包膜还可包含不一定是两亲性的另外的物质(例如，另外的脂质)。因此，颗粒可是单层或多层结构，其中构成一个或更多个层或薄层的物质包括任选地与不一定是两亲性的另外的物质(例如，另外的脂质)组合的一种或更多种类型的两亲性物质(特别是选自两亲性脂质的物质)。在一些实施方案中，术语“颗粒”涉及微米或纳米尺寸的结构，例如微米或纳米尺寸的致密结构。根据本公开内容，术语“颗粒”包括纳米粒。
“RNA颗粒”可用于将RNA递送至目的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。RNA颗粒可由包含至少一种阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质的脂质形成。不受任何理论的束缚，认为阳离子脂质或类脂质物质或者阳离子可电离脂质或类脂质物质与RNA组合在一起形成聚集体，并且该聚集体产生胶体稳定的颗粒。
本文中所述的RNA颗粒包含基于脂质纳米粒(LNP)和基于脂质复合物(Lipoplex，LPX)的制剂。
通常来说，脂质复合物(LPX)可通过混合两个水相获得，即包含RNA的相和包含脂质分散体的相。在一些实施方案中，脂质相包含脂质体。
在一些实施方案中，脂质体是自封闭的单层或多层囊状颗粒，其中片层包含脂质双层并且经包封的腔包含水相。使用脂质体以用于纳米粒形成的先决条件是混合物中的脂质根据需要能够在所应用的水环境中形成层状(双层)相。
在一些实施方案中，脂质体包含包封水芯(本文中也称为水腔)的单层或多层磷脂双层。它们可由具有极性头(亲水性)基团和非极性尾(疏水性)基团的材料制备。在一些实施方案中，用于配制被设计用于递送核酸的脂质体的阳离子脂质本质上是两亲性的，并且由通过甘油与烃链或胆固醇衍生物连接的带正电荷(阳离子)胺头基组成。
在一些实施方案中，脂质复合物是基于多层脂质体的制剂，其在阳离子脂质体与RNA的静电相互作用下形成。在一些实施方案中，形成的脂质复合物具有独特的分子内部排列，这是由于从脂质体结构转化为致密RNA脂质复合物而产生的。在一些实施方案中，这些制剂的特征在于它们对RNA的包封性差且不完全截留RNA。
在一些实施方案中，LPX颗粒包含两亲性脂质(特别是阳离子的或阳离子可电离的两亲性脂质)和如本文中所述的RNA(特别是mRNA)。在一些实施方案中，带正电荷脂质体(由一种或更多种两亲性脂质，特别是阳离子的或阳离子可电离的两亲性脂质制成)和带负电荷核酸(特别是mRNA)之间的静电相互作用导致核酸脂质复合物颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可使用阳离子的或阳离子可电离的两亲性脂质(例如DOTMA和/或DODMA)和另外的脂质(例如DOPE)合成。在一些实施方案中，RNA(特别是mRNA)脂质复合物颗粒是纳米粒。
一般性地，脂质纳米粒(LNP)可通过将水相中的RNA与包含有机溶剂(例如乙醇)的相中的脂质直接混合而获得。在这种情况下，脂质或脂质混合物可用于颗粒形成，其在水中不形成层状(双层)相。
在一些实施方案中，LNP包含以下或由以下组成：阳离子/可电离脂质和辅助脂质，例如磷脂、胆固醇和/或聚乙二醇(polyethylene，PEG)脂质。在一些实施方案中，在本文中所述的RNA LNP中，mRNA被占据LNP中心核心的可电离脂质结合。在一些实施方案中，PEG脂质与磷脂一起形成LNP的表面。在一些实施方案中，表面包含双层。在一些实施方案中，以带电荷和不带电荷形式的胆固醇和可电离脂质可分布在整个LNP中。
在一些实施方案中，RNA(例如，mRNA)可与如本文中所述的颗粒非共价缔合。在一些实施方案中，RNA(特别是mRNA)可黏附至颗粒的外表面(表面RNA(特别是表面mRNA))和/或可包含在颗粒中(经包封的RNA(特别是经包封的mRNA))。
在一些实施方案中，本文中所述的颗粒(例如，LNP和LPX)的尺寸(例如直径)为约10至约2000nm，例如至少约15nm(例如，至少约20nm、至少约25nm、至少约30nm、至少约35nm、至少约40nm、至少约45nm、至少约50nm、至少约55nm、至少约60nm、至少约65nm、至少约70nm、至少约75nm、至少约80nm、至少约85nm、至少约90nm、至少约95nm或至少约100nm)并且/或至多约1900nm(例如，至多约1900nm、至多约1800nm、至多约1700nm、至多约1600nm、至多约1500nm、至多约1400nm、至多约1300nm、至多约1200nm、至多约1100nm、至多约1000nm、至多约950nm、至多约900nm、至多约850nm、至多约800nm、至多约750nm、至多约700nm、至多约650nm、至多约600nm、至多约550nm或至多约500nm)，例如为约20至约1500nm，例如约30至约1200nm、约40至约1100nm、约50至约1000nm、约60至约900nm、约70至800nm、约80至700nm、约90至600nm、或约50至500nm、或约100至500nm，例如为10至1000nm、15至500nm、20至450nm、25至400nm、30至350nm、40至300nm、50至250nm、60至200nm、或70至150nm。
在一些实施方案中，本文中所述的颗粒(例如LNP和LPX)的平均直径在一些实施方案中为约50nm至约1000nm、约50nm至约800nm、约50nm至约700nm、约50nm至约600nm、约50nm至约500nm、约50nm至约450nm、约50nm至约400nm，约50nm至约350nm、约50nm至约300nm、约50nm至约250nm、约50nm至约200nm、约100nm至约1000nm、约100nm至约800nm、约100nm至约700nm、约100nm至约600nm、约100nm至约500nm、约100nm至约450nm、约100nm至约400nm、约100nm至约350nm、约100nm至约300nm、约100nm至约250nm、约100nm至约200nm、约150nm至约1000nm、约150nm至约800nm、约150nm至约700nm、约150nm至约600nm、约150nm至约500nm、约150nm至约450nm、约150nm至约400nm、约150nm至约350nm、约150nm至约300nm、约150nm至约250nm、约150nm至约200nm、约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约200nm至约700nm、约200nm至约600nm、约200nm至约500nm、约200nm至约450nm、约200nm至约400nm、约200nm至约350nm、约200nm至约300nm、或约200nm至约250nm。
在一些实施方案中，本文中所述的颗粒是纳米粒。术语“纳米粒”涉及包含如本文中所述的核酸(特别是mRNA)和至少一种阳离子脂质或阳离子可电离脂质的纳米尺寸颗粒，其中该颗粒的所有三个外部尺寸均在纳米级，即，至少约1nm且低于约1000纳米。优选地，颗粒的尺寸是其直径。
本文中所述的核酸颗粒(特别是mRNA颗粒)可表现出小于约0.5、小于约0.4、小于约0.3、小于约0.2、小于约0.1或小于约0.05的多分散指数(PDI)。通过示例的方式，核酸颗粒可表现出约0.01至约0.4或约0.1至约0.3的多分散指数。
N/P比给出了脂质中氮基团与核酸中磷酸基团数量的比率。它与电荷比相关，因为氮原子(取决于pH)通常带正电荷，而磷酸基团带负电荷。存在电荷平衡的N/P比取决于pH值。脂质制剂通常在大于四至十二的N/P比下形成，因为带正电荷的纳米粒被认为有利于转染。在这种情况下，认为RNA与纳米粒完全结合。
本文中所述的核酸颗粒(尤其是RNA颗粒，例如mRNA颗粒)可使用广泛多种方法制备，所述方法可包括从至少一种阳离子脂质或阳离子可电离脂质获得胶体，并将所述胶体与核酸混合以获得核酸颗粒。
本文中使用的术语“胶体”涉及一种类型的均匀混合物，其中分散的颗粒不沉降。混合物中的不溶性颗粒是微观的，粒径为1至1000纳米。该混合物可称为胶体或胶体混悬液。有时，术语“胶体”仅指混合物中的颗粒，而不是整个混悬液。
对于包含至少一种阳离子脂质或阳离子可电离脂质的胶体的制备，在本文中可应用的方法是通常用于制备脂质体囊泡并适当地进行调整的方法。用于制备脂质体囊泡的最常用的方法具有以下基本阶段：(i)在有机溶剂中脂质的溶解，(ii)所得溶液的干燥，和(iii)经干燥脂质的水合(使用多种水性介质)。
在膜水合法中，首先将脂质溶解在合适的有机溶剂中，然后完全干燥(dry down)以在烧瓶底部产生薄膜。使用适当的水性介质将获得的脂质膜水合以产生脂质体分散体。此外，可包括另外的缩减(downsizing)步骤。
反相蒸发是用于制备脂质体囊泡的膜水合的替代方法，其涉及在水相和含有脂质的有机相之间形成油包水乳液。体系均质化需要对该混合物进行简短的声处理。在减压下除去有机相产生乳状凝胶，其随后变成脂质体混悬液。
术语“乙醇注射技术”是指通过针将包含脂质的乙醇溶液快速注射到水溶液中的过程。该动作将脂质分散在整个溶液中，并促进脂质结构形成，例如脂质囊泡形成，例如脂质体形成。通常来说，本文中所述的RNA(特别是mRNA)脂质体颗粒可通过将RNA(特别是mRNA)添加至胶体脂质体分散体来获得。使用乙醇注射技术，在一些实施方案中，这样的胶体脂质体分散体如下形成：将包含脂质，例如阳离子脂质或阳离子可电离脂质(例如DOTMA和/或DODMA)和另外的脂质的乙醇溶液在搅拌下注射到水溶液中。在一些实施方案中，本文中所述的RNA(特别是mRNA)脂质复合物颗粒可在没有挤出步骤的情况下获得。
术语“挤出”及其变化形式是指产生具有固定的截面轮廓的颗粒。特别是，其是指使颗粒尺寸缩小，从而迫使颗粒通过具有限定孔的过滤器。
根据本公开内容，还可使用具有无有机溶剂特性的其他方法来制备胶体。
在一些实施方案中，LNP包含四种组分：可电离阳离子脂质、中性脂质(例如磷脂)、类固醇(例如胆固醇)和聚合物缀合的脂质。在一些实施方案中，LNP可通过在水性缓冲液中将溶于乙醇的脂质快速与RNA混合来制备。虽然本文中所述的RNA颗粒可包含聚合物缀合的脂质(例如PEG脂质)，但本文中提供的还是不包含聚合物缀合的脂质(例如PEG脂质)的RNA颗粒。
在一些实施方案中，包含RNA和本文中所述的至少一种阳离子脂质或阳离子可电离脂质的LNP通过以下来制备：(a)制备RNA溶液，其包含水，和缓冲体系；(b)制备包含阳离子脂质或阳离子可电离脂质和(如果存在的话)一种或更多种另外的脂质的乙醇溶液；以及(c)将在(a)下制备的RNA溶液与在(b)下制备的乙醇溶液混合，从而制备包含LNP的制剂。在步骤(c)之后，可进行选自稀释和过滤过滤(例如切向流过滤)的一个或更多个步骤。
在一些实施方案中，包含RNA和本文中所述的至少一种阳离子脂质或阳离子可电离脂质的LNP通过以下来制备：(a’)制备在水相中的阳离子脂质或阳离子可电离脂质和(如果存在的话)一种或更多种另外的脂质的脂质体或胶体制剂；和(b’)制备RNA溶液，其包含水，和缓冲体系；和(c’)将在(a’)下制备的脂质体或胶体制剂与在(b’)下制备的RNA溶液混合。在步骤(c’)之后，可进行选自稀释和过滤(例如切向流过滤)的一个或更多个步骤。
本公开内容描述了包含RNA(特别是mRNA)和至少一种阳离子脂质或阳离子可电离脂质的颗粒，该阳离子脂质或阳离子可电离脂质与RNA缔合以形成RNA颗粒和包含这样的颗粒的组合物。RNA颗粒可包含通过与颗粒的非共价相互作用以不同形式复合的RNA。本文中所述的颗粒不是病毒颗粒，特别是不是感染性病毒颗粒，即其不能病毒感染细胞。
合适的阳离子脂质或阳离子可电离脂质是形成核酸颗粒的那些，并且包括在术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”中。术语“颗粒形成组分”或“颗粒形成剂”涉及与核酸缔合以形成核酸颗粒的任何组分。这样的组分包括可以是核酸颗粒的一部分的任何组分。
在一些实施方案中，核酸颗粒(特别是mRNA颗粒)包含多于一种类型的RNA分子，其中RNA分子的分子参数如在摩尔质量或基本结构元件例如分子结构、加帽、编码区或其他特征方面可彼此类似或不同。
在颗粒制剂中，可将每种RNA独立配制为单独的颗粒制剂。在这种情况下，每种单独的颗粒制剂将包含一种RNA。单独的颗粒制剂可作为单独的实体存在，例如在单独容器中。这样的制剂可通过与颗粒形成剂一起独立提供每种RNA(通常各自以包含RNA的溶液的形式)从而允许颗粒形成来获得。各颗粒将仅包含颗粒形成时提供的特定RNA种类(单独的颗粒制剂)。在一些实施方案中，组合物例如药物组合物包含多于一种单独的颗粒制剂。各药物组合物称为混合的颗粒制剂。根据本发明的混合的颗粒制剂可通过独立形成单独的颗粒制剂，然后进行混合单独颗粒制剂的步骤来获得。通过混合步骤，可获得包含含有RNA颗粒的混合群体的制剂。单独的颗粒群体可一起在一个容器中，其包含单独的颗粒制剂的混合群体。或者，可将药物组合物的所有RNA种类一起配制为组合的颗粒制剂。这样的制剂可通过与颗粒形成剂一起提供所有RNA种类的组合的制剂(通常是组合的溶液)来获得，从而允许颗粒形成。与混合的颗粒制剂相反，组合的颗粒制剂将通常包含含有多于一种RNA的颗粒。在组合的颗粒组合物中，不同的RNA种类通常一起存在于单个颗粒中。
聚合物
鉴于聚合物的高度化学柔性，其是用于基于纳米粒的递送的常用物质。通常来说，阳离子聚合物用于将带负电荷的核酸静电凝聚成纳米粒。这些带正电荷的基团通常由胺组成，所述胺在5.5至7.5的pH范围内改变其质子化状态，被认为导致离子失衡从而导致内体破裂。聚合物例如聚-L-赖氨酸、聚酰胺-胺、鱼精蛋白和聚乙烯亚胺以及天然存在的聚合物例如壳聚糖均已应用于核酸递送并且适合作为本文中的阳离子聚合物。另外，一些调查人员已合成了专门用于核酸递送的聚合物。特别地，聚(β-氨基酯)由于其易于合成和生物可降解性而在核酸递送中获得了广泛的应用。这样的合成聚合物也适合作为本文中的阳离子聚合物。
本文中使用的“聚合物”具有其通常的含义，即包含通过共价键连接的一个或更多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可全部相同，或者在一些情况下，聚合物内可存在多于一种类型的重复单元。在一些情况下，聚合物是生物来源的，即生物聚合物(例如蛋白质)。在一些情况下，聚合物中也可存在另外的部分，例如靶向部分。
如果聚合物内存在多于一种类型的重复单元，则该聚合物被称为“共聚物”。应理解，本文中所使用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单元可以以任何方式排列。例如，重复单元可以以随机顺序、以交替顺序排列或者作为“嵌段”共聚物，即包含每个均包含第一重复单元的一个或更多个区域(例如，第一嵌段)，和每个均包含第二重复单元的一个或更多个区域(例如，第二嵌段)，等。嵌段共聚物可具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数目的不同嵌段。
在某些实施方案中，聚合物是生物相容性的。生物相容性聚合物是在中等浓度下通常不导致显著细胞死亡的聚合物。在某些实施方案中，生物相容性聚合物是生物可降解的，即该聚合物能够在生理环境内(例如体内)化学和/或生物地降解。
在某些实施方案中，聚合物可以是鱼精蛋白或聚亚烷基亚胺。
术语“鱼精蛋白”是指多种相对低分子量的强碱性蛋白质中的任一种，其富含精氨酸并且被发现特别是与DNA缔合以代替不同动物(例如鱼)的精细胞中的体细胞组蛋白。特别地，术语“鱼精蛋白”是指存在于鱼精液中的蛋白质，其是强碱性的，可溶于水，不被热凝结并且在水解之后主要产生精氨酸。以纯化的形式，其用于胰岛素的长效制剂并且用于中和肝素的抗凝作用。
根据本公开内容，本文中使用的术语“鱼精蛋白”意指包含获自或来源于天然或生物学来源的任何鱼精蛋白氨基酸序列包括其片段和所述氨基酸序列或其片段的多聚体形式以及(合成的)多肽，所述多肽是人工的并且是为特定目的而专门设计的，并且不能从天然或生物学来源中分离。
在一些实施方案中，聚亚烷基亚胺包括聚乙烯亚胺和/或聚丙烯亚胺，优选聚乙烯亚胺。优选的聚亚烷基亚胺是聚乙烯亚胺(polyethyleneimine，PEI)。PEI的平均分子量优选为0.75·102至107Da，优选1000至105Da，更优选10000至40000Da，更优选15000至30000Da，甚至更优选20000至25000Da。
根据本公开内容优选的是线性聚亚烷基亚胺，例如线性聚乙烯亚胺(PEI)。
考虑在本文中使用的阳离子聚合物(包括聚阳离子聚合物)包括能够静电结合核酸的任何阳离子聚合物。在一些实施方案中，考虑在本文中使用的阳离子聚合物包括可与核酸缔合(例如通过与核酸形成复合物或者形成其中围住(enclose)或包封核酸的囊泡)的任何阳离子聚合物。
本文中所述的颗粒还可包含除阳离子聚合物之外的聚合物，即非阳离子聚合物和/或阴离子聚合物。阴离子聚合物和中性聚合物在本文中统称为非阳离子聚合物。
脂质
术语“脂质”和“类脂质物质”在本文中被广泛定义为包含一个或更多个疏水部分或基团以及任选地还包含一个或更多个亲水部分或基团的分子。包含疏水部分和亲水部分的分子也经常被称为两亲体。脂质通常在水中是不溶的或难溶于水，但可溶于许多有机溶剂。在水性环境中，两亲性质允许分子自组装成有组织的结构和不同的相。那些相之一由脂质双层组成，因为它们存在于囊泡、多层/单层脂质体或水性环境中的膜中。可通过包含非极性基团来赋予疏水性，所述非极性基团包括但不限于长链饱和和不饱和脂族烃基团以及被一个或更多个芳族、脂环族或杂环基团取代的这样的基团。亲水基团可包含极性和/或带电荷基团，并且包括碳水化合物、磷酸根、羧基、硫酸根、氨基、巯基、硝基、羟基和其他相似基团。
本文中使用的术语“疏水的”是指在水溶液中基本上不混溶或不溶的任何分子、部分或基团。术语疏水基团包括具有至少6个碳原子的烃。疏水基团可具有官能团(例如，醚、酯、卤化物等)和除碳和氢之外的原子，只要该基团满足在水溶液中基本上不混溶或不溶的条件即可。
术语“烃”包括本文所定义的烷基、烯基或炔基。应当理解，烷基、烯基或炔基中的一个或更多个氢可以被其他原子，例如卤素、氧或硫取代。除非另有说明，否则烃基还可包括环状(烷基、烯基或炔基)基团或芳基，前提是烃的总极性保持相对非极性。
术语“烷基”是指饱和的线性或支化单价烃部分，其可具有六至三十个，通常六至二十个，通常六至十八个碳原子。示例性的非极性烷基包括但不限于己基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基等。
术语“烯基”是指具有至少一个碳碳双键的线性或支化单价烃部分，其中总碳原子数可以是六至三十，通常六至二十，通常六至十八。
术语“炔基”是指具有至少一个碳碳三键的线性或支化单价烃部分，其中总碳原子数可以是六至三十，通常六至二十，通常六至十八。炔基可任选地具有一个或更多个碳碳双键。
本文中使用的术语“两亲的”是指具有极性部分和非极性部分二者的分子。两亲化合物通常具有与长疏水尾连接的极性头。在一些实施方案中，极性部分可溶于水，而非极性部分不溶于水。另外，极性部分可具有形式正电荷或形式负电荷。或者，极性部分可具有形式正电荷和负电荷二者，并且可以是两性离子或内盐。出于本公开内容的目的，两亲化合物可以是但不限于一种或更多种天然或非天然的脂质和类脂质化合物。
术语“类脂质物质”、“类脂质化合物”或“类脂质分子”涉及与脂质在结构上和/或功能上相关但在严格意义上不能视为脂质的物质，特别是两亲性物质。例如，该术语包括当其存在于囊泡、多层/单层脂质体或水性环境中的膜时能够形成两亲层的化合物，并且包括表面活性剂或具有亲水和疏水部分二者的合成化合物。一般而言，该术语包括这样的分子，其包含具有可与或可不与脂质的结构组织类似的不同的结构组织的亲水和疏水部分。能够自发整合到细胞膜中的类脂质化合物的一些实例包括功能性脂质构建体，例如合成功能-间隔子-脂质构建体(synthetic function-spacer-lipid construct，FSL)、合成功能-间隔子-固醇构建体(synthetic function-spacer-sterol construct，FSS)以及人工两亲性分子。脂质通常为圆柱形。两条烷基链所占的面积与极性头基所占的面积类似。脂质作为单体的溶解度低，并易于聚集成不溶于水的平面双层。传统的表面活性剂单体通常是锥形的。亲水性头基倾向于比线性烷基链占据更多的分子空间。在一些实施方案中，表面活性剂倾向于聚集成水溶性的球形或椭圆形胶束。虽然脂质也具有与表面活性剂相同的一般结构——极性亲水头基和非极性疏水尾——但脂质在单体的形状、在溶液中形成的聚集体的类型以及在聚集所需的浓度范围方面与表面活性剂不同。除非本文中另外指出或明显与上下文相矛盾，否则本文中使用的术语“脂质”应被解释为包括脂质和类脂质物质二者。
通常来说，脂质可分为八种类别：脂肪酸、甘油脂质、甘油磷脂、鞘脂、糖脂、聚酮(来源于酮酯酰亚基的缩合)、固醇脂质和孕烯醇酮脂类(来源于异戊二烯亚基的缩合)。尽管有时将术语“脂质”用作脂肪的同义词，但脂肪是称为甘油三酯的脂质亚组。脂质还包括分子，例如脂肪酸类及其衍生物(包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和磷脂)，以及类固醇，即包含固醇的代谢物，例如胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的一些实例包括但不限于胆甾烷醇(cholestanol)、胆甾烷酮(cholestanone)、胆甾烯酮(cholestenone)、粪甾烷醇(coprostanol)、胆甾醇基-2’-羟乙基醚、胆甾醇基-4’-羟丁基醚、生育酚、及其衍生物，以及其混合物。
脂肪酸或脂肪酸残基是一类不同的分子，其由以羧酸基团终止的烃链构成；这种排列赋予该分子以极性的亲水端和不溶于水的非极性疏水端。通常长为4至24个碳的碳链可以是饱和的或不饱和的，并且可与包含氧、卤素、氮和硫的官能团连接。如果脂肪酸包含双键，则可能出现顺式或反式几何异构，这显著影响分子构型。顺式双键导致脂肪酸链弯曲，这是与链中的更多双键复合的作用。脂肪酸类别中的其他主要脂质种类是脂肪酯和脂肪酰胺。
甘油脂质由单取代甘油、双取代甘油和三取代甘油构成，最著名的是甘油脂肪酸三酯，称为甘油三酯。词语“三酰甘油”有时与“甘油三酯”同义使用。在这些化合物中，甘油的三个羟基通常各自被不同的脂肪酸酯化。另外的甘油脂质亚类以糖基甘油为代表，其特征在于存在通过糖苷键联与甘油连接的一个或更多个糖残基。
甘油磷脂是两亲分子(包含疏水区和亲水区二者)，其包含通过酯键联与两个脂肪酸来源的“尾”连接并且通过磷酸酯键联与一个“头”基连接的甘油核心。甘油磷脂(通常称为磷脂(尽管鞘磷脂也被归类为磷脂))的一些实例是磷脂酰胆碱(也称为PC、GPCho或卵磷脂)、磷脂酰乙醇胺(PE或GPEtn)和磷脂酰丝氨酸(PS或GPSer)。
鞘脂是享有共同的结构特征-鞘氨醇碱(sphingoid base)骨架的复杂的化合物家族。哺乳动物中主要的鞘氨醇碱通常被称为鞘氨醇。神经酰胺(N-酰基-鞘氨醇碱)是鞘氨醇碱衍生物的具有酰胺连接脂肪酸的一个主要亚类。脂肪酸通常是饱和的或单不饱和的，链长度为16至26个碳原子。哺乳动物的主要鞘磷酸脂(phosphosphingolipid)是鞘磷脂(神经酰胺磷酸胆碱)，而昆虫主要包含神经酰胺磷酸乙醇胺并且真菌具有植物神经酰胺磷酸肌醇和含甘露糖的头基。鞘糖脂是由通过糖苷键与鞘氨醇碱连接的一个或更多个糖残基构成的不同分子家族。这些中的一些实例是简单和复杂的鞘糖脂，例如脑苷脂和神经节苷脂。
固醇脂质(例如胆固醇及其衍生物或者生育酚及其衍生物)与甘油磷脂和鞘磷脂一起是膜脂质的重要组分。
糖脂描述的是其中脂肪酸与糖骨架直接连接从而形成与膜双层相容的结构的化合物。在糖脂中，单糖替代了存在于甘油脂质和甘油磷脂中的甘油骨架。最熟悉的糖脂是革兰氏阴性菌中脂多糖的脂质A组分的酰化葡糖胺前体。典型的脂质A分子是葡糖胺的二糖，其被多至七个脂肪酰基链衍生化。大肠杆菌中生长所需的最小脂多糖是Kdo2-脂质A，其为被两个3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖酸(Kdo)残基糖基化的葡糖胺六酰化二糖。
聚酮是通过经典酶以及与脂肪酸合酶共享机械特征的迭代和多模块酶通过乙酰基和丙酰基亚基的聚合而合成的。它们包含来自动物、植物、细菌、真菌和海洋来源的大量次级代谢产物和天然产物，并且具有大的结构多样性。许多聚酮是其骨架通常通过糖基化、甲基化、羟基化、氧化或其他过程进一步修饰的环状分子。
根据本公开内容，脂质和类脂质物质可以是阳离子的、阴离子的或中性的。中性脂质或类脂质物质在选定的pH下以不带电荷或中性两性离子的形式存在。
阳离子脂质/阳离子可电离脂质
本文中所述的核酸颗粒(例如RNA颗粒)包含至少一种阳离子脂质或阳离子可电离脂质作为颗粒形成剂。考虑在本文中使用的阳离子脂质或阳离子可电离脂质包括能够静电结合核酸的任何阳离子脂质或阳离子可电离脂质(包括类脂质物质)。在一些实施方案中，考虑在本文中使用的阳离子脂质或阳离子可电离脂质可例如通过与核酸形成复合物或者通过形成其中围住或包封核酸的囊泡来与核酸缔合。
本文中使用的“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质或类脂质物质。阳离子脂质通过静电相互作用与带负电荷的核酸结合。通常来说，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如固醇、酰基链、二酰基链或更多个酰基的链，并且脂质的头基通常带有正电荷。
在一些实施方案中，阳离子脂质仅在特定pH，特别是酸性pH下具有净正电荷，而在不同的优选更高的pH例如生理pH下，其优选地不具有净正电荷，优选地不具有电荷，即它是中性的。与在生理pH下保持阳离子的颗粒相比，认为这种可电离的行为通过帮助内体逃逸和降低毒性来增强效力。
本文中使用的“阳离子可电离脂质”是指具有净正电荷或是中性的，即不是永久阳离子的脂质或类脂质物质。因此，根据溶解阳离子可电离脂质的组合物的pH值，阳离子可电离脂质可以是带正电荷的或中性的。出于本公开内容的目的，除非与情况相矛盾，否则阳离子可电离脂质或包含在术语“阳离子脂质”中。
在一些实施方案中，阳离子脂质或阳离子可电离脂质包含头基，该头基(例如，在生理条件下)包含至少一个带正电荷或能够被质子化的氮原子(N)。
阳离子脂质或阳离子可电离脂质的一些实例包括但不限于：N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基丙胺(DODMA)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)、1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、3-(N-(N’,N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(DC-Chol)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1,2-二酰氧基-3-二甲基铵丙烷；1,2-二烷氧基-3-二甲基铵丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、2,3-二(十四烷氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基氮(DMRIE)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1,2-二油烯基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚麻基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLenDMA)、双十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)、3-二甲基氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5’-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9’,12’-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N’-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基丙胺(2,3-Dilinoleoyloxy-N,N-dimethylpropylamine，DLinDAP)、1,2-N,N’-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺(DMRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(顺式-9-十四烯基氧基)-1-溴化丙胺(GAP-DMORIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)-1-溴化丙胺(GAP-DLRIE)、(±)-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺(GAP-DMRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)-1-溴化丙胺(βAE-DMRIE)、N-(4-羧基苄基)-N,N-二甲基-2,3-双(油酰基氧基)丙烷-1-胺(DOBAQ)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(辛基-CLinDMA)、1,2-二肉豆蔻酰基-3-二甲基铵-丙烷(DMDAP)、1,2-二棕榈酰基-3-二甲基铵-丙烷(DPDAP)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基羧酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、2,3-双(十二烷氧基)-N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基丙烷-1-溴化铵(DLRIE)、N-(2-氨基乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-溴化铵(DMORIE)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)8,8’-((((2(二甲基氨基)乙基)硫基)羰基)氮烷二基)二辛酸酯(di((Z)-non-2-en-1-yl)8,8’-((((2(dimethylamino)ethyl)thio)carbonyl)azanediyl)dioctanoate，ATX)、N,N-二甲基-2,3-双(十二烷氧基)丙烷-1-胺(DLDMA)、N,N-二甲基-2,3-双(十四烷氧基)丙烷-1-胺(DMDMA)、二((Z)-壬-2-烯-1-基)-9-((4-(二甲基氨基丁酰基)氧基)十七烷二酸酯(L319)、N-十二烷基-3-((2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-{2-[(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-2-{(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基)-[2-(2-十二烷基氨基甲酰基-乙基氨基)-乙基]-氨基}-乙基氨基)丙酰胺(lipidoid 98N12-5)、1-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基-[2-[4-[2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基]哌嗪-1-基]乙基]氨基]十二烷-2-醇(lipidoid C12-200)。
在一些实施方案中，阳离子脂质或阳离子可电离脂质是DOTMA。在一些实施方案中，阳离子脂质或阳离子可电离脂质是DODMA。
DOTMA是具有季胺头基的阳离子脂质。DOTMA的结构可如下表示：
DODMA是具有叔胺头基的可电离的阳离子脂质。DODMA的结构可如下表示：
在一些实施方案中，阳离子脂质或阳离子可电离脂质可占颗粒中存在的总脂质的约10mol％至约95mol％、约20mol％至约95mol％、约20mol％至约90mol％、约30mol％至约90mol％、约40mol％至约90mol％、或约40mol％至约80mol％。
另外的脂质
本文中所述的颗粒还可包含除阳离子脂质或阳离子可电离脂质(在本文中也统称为阳离子脂质)之外的脂质(包括类脂质物质)，即，非阳离子脂质(包括非阳离子脂质或类脂质物质或者非阳离子可电离脂质或类脂质物质)。阴离子脂质或类脂质物质和中性脂质或类脂质物质在本文中统称为非阳离子脂质。除阳离子脂质或阳离子可电离脂质之外，通过添加其他疏水部分(例如胆固醇和脂质)对核酸颗粒制剂进行优化可增强颗粒稳定性和核酸递送的效力。
一种或更多种另外的脂质可影响或可不影响核酸颗粒的总电荷。在一些实施方案中，所述一种或更多种另外的脂质是非阳离子脂质或类脂质物质。非阳离子脂质可包含例如一种或更多种阴离子脂质和/或中性脂质。本文中使用的“阴离子脂质”是指在选定的pH值下带负电荷的任何脂质。本文中使用的“中性脂质”是指在选定pH下以不带电荷或中性两性离子形式存在的多种脂质物质中的任一种。
在一些实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mRNA的颗粒)包含阳离子脂质或阳离子可电离脂质和一种或更多种另外的脂质。
不希望受理论的束缚，与一种或更多种另外的脂质的量相比，阳离子脂质或阳离子可电离脂质的量可影响重要的核酸颗粒特性，例如核酸的电荷、颗粒尺寸、稳定性、组织选择性和生物活性。因此，在一些实施方案中，阳离子脂质或阳离子可电离脂质与一种或更多种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、约4:1至约1:1、约3:1至约1:1、或约3:1至约2:1。
在一些实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mRNA的颗粒)中包含的一种或更多种另外的脂质包括以下中的一种或更多种：中性脂质、类固醇及其组合。
在一些实施方案中，一种或更多种另外的脂质包括中性脂质，其是磷脂。在一些实施方案中，磷脂选自磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。可使用的特定磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰丝氨酸或鞘磷脂。这样的磷脂特别是包括二酰基磷脂酰胆碱(diacylphosphatidylcholine)，例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine，DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dimyristoylphosphatidylcholine，DMPC)、双十五烷酰基磷脂酰胆碱(dipentadecanoylphosphatidylcholine)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(dilauroylphosphatidylcholine)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二花生酰基磷脂酰胆碱(diarachidoylphosphatidylcholine，DAPC)、二山萮炔酰基磷脂酰胆碱(dibehenoylphosphatidylcholine，DBPC)、双二十三烷酰基磷脂酰胆碱(ditricosanoylphosphatidylcholine，DTPC)、二十四酰基磷脂酰胆碱(dilignoceroylphatidylcholine，DLPC)、棕榈酰油酰基-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine，POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰基-2-胆甾醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)和磷脂酰乙醇胺，特别是二酰基磷脂酰乙醇胺，例如二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine，DOPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(distearoyl-phosphatidylethanolamine，DSPE)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(dipalmitoyl-phosphatidylethanolamine，DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(dimyristoyl-phosphatidylethanolamine，DMPE)、二月桂酰基-磷脂酰乙醇胺(dilauroyl-phosphatidylethanolamine，DLPE)、二植烷酰基-磷脂酰乙醇胺(diphytanoyl-phosphatidylethanolamine，DPyPE)、1,2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPG)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)(DPPG)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、N-棕榈酰基-D-赤型-鞘氨醇磷酸胆碱(SM)以及具有不同疏水链的其他磷脂酰乙醇胺脂质。在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DOPC、DMPC、DPPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质是DOPE。
在一些实施方案中，另外的脂质包括以下之一：(1)磷脂，(2)胆固醇或其衍生物；或(3)磷脂和胆固醇或其衍生物的混合物。胆固醇衍生物的一些实例包括但不限于，胆甾烷醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾烷醇、胆甾醇基-2’-羟乙基醚、胆甾醇基-4’-羟丁基醚、生育酚及其衍生物，以及其混合物。
因此，在一些实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mRNA的颗粒)包含(1)阳离子的或阳离子可电离的脂质和磷脂，例如DOPE，或(2)阳离子的或阳离子可电离的脂质和磷脂，例如DOPE和胆固醇。
在一些实施方案中，本文中所述的核酸颗粒(特别是包含mRNA的颗粒)包含(1)DOTMA和DOPE，(2)DOTMA、DOPE和胆固醇，(3)DODMA和DOPE或(4)DODMA、DOPE和胆固醇。
DOPE是中性磷脂。DOPE的结构可如下表示：
胆固醇的结构可如下表示：
在一些实施方案中，本文中所述的颗粒不包括聚合物缀合的脂质，例如聚乙二醇化脂质。术语“聚乙二醇化脂质”是指包含脂质部分和聚乙二醇部分二者的分子。聚乙二醇化脂质是本领域已知的。
在一些实施方案中，另外的脂质(例如，一种或更多种磷脂和/或胆固醇)可占颗粒中存在的总脂质的约0mol％至约90mol％、约0mol％至约80mol％、约2mol％至约80mol％、约5mol％至约80mol％、约5mol％至约60mol％、约5mol％至约50mol％、约7.5mol％至约50mol％或约10mol％至约40mol％。在一些实施方案中，另外的脂质(例如，一种或更多种磷脂和/或胆固醇)占颗粒中存在的总脂质的约10mol％、约15mol％或约20mol％。
在一些实施方案中，另外的脂质包含以下的混合物：(i)磷脂，例如DOPE；和(ii)胆固醇或其衍生物。在一些实施方案中，磷脂例如DOPE与胆固醇或其衍生物的摩尔比为约9:0至约1:10、约2:1至约1:4、约1:1至约1:4、或约1:1至约1:3。
聚合物缀合的脂质
在一些实施方案中，颗粒可包含至少一种聚合物缀合的脂质。聚合物缀合的脂质通常是包含脂质部分和与其缀合的聚合物部分的分子。在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质是PEG缀合的脂质，在本文中也称为聚乙二醇化脂质或PEG-脂质。
在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质被设计成通过形成保护疏水性脂质层的保护性亲水层来在空间上稳定脂质颗粒。在一些实施方案中，当体内施用这样的脂质颗粒时，聚合物缀合的脂质可减少其与血清蛋白质的缔合和/或由此产生的网状内皮系统的摄取。
多种PEG缀合的脂质是本领域已知的，并且包括但不限于聚乙二醇化二酰基甘油(pegylated diacylglycerol，PEG-DAG)(例如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(pegylated phosphatidylethanoloamine，PEG-PE))、PEG二酰基甘油琥珀酸酯(PEG succinate diacylglycerol，PEG-S-DAG)(例如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸二乙酯(PEG-S-DMG))、聚乙二醇化神经酰胺(pegylated ceramide，PEG-cer)或者PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯(例如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯)等。
在一些实施方案中，颗粒可包含一种或更多种如WO 2017/075531和WO 2018/081480中所述的PEG缀合的脂质或聚乙二醇化脂质，其各自的全部内容通过引用并入本文中用于本文中所描述的目的。
脂质复合物颗粒
在本公开内容的一些实施方案中，本文中所述的RNA可存在于RNA脂质复合物颗粒中。
脂质复合物(LPX)是静电复合体，其通常通过将预形成的阳离子脂质脂质体与阴离子RNA混合而形成。形成的脂质复合物具有独特的分子内部排列，这是由于从脂质体结构转化为致密的RNA脂质复合物而产生的。这些制剂的特征通常在于其对核酸的较差包封和不完全截留。
在某些实施方案中，RNA脂质复合物颗粒包含阳离子脂质和另外的脂质二者。在一个示例性实施方案中，阳离子脂质是DOTMA并且另外的脂质是DOPE。
在一些实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约10:0至约1:9、约4:1至约1:2、或约3:1至约1:1。在一些具体实施方案中，摩尔比可以为约3:1、约2.75:1、约2.5:1、约2.25:1、约2:1、约1.75:1、约1.5:1、约1.25:1、或约1:1。在一个示例性实施方案中，至少一种阳离子脂质与至少一种另外的脂质的摩尔比为约2:1。
在一些实施方案中，本文中所述的RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm至约1000nm、约200nm至约800nm、约250至约700nm、约400至约600nm、约300nm至约500nm、或约350nm至约400nm。在一些具体实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约200nm、约225nm、约250nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约375nm、约400nm、约425nm、约450nm、约475nm、约500nm、约525nm、约550nm、约575nm、约600nm、约625nm、约650nm、约700nm、约725nm、约750nm、约775nm、约800nm、约825nm、约850nm、约875nm、约900nm、约925nm、约950nm、约975nm、或约1000nm。在一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约250nm至约700nm。在另一个实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约300nm至约500nm。在一个示例性实施方案中，RNA脂质复合物颗粒的平均直径为约400nm。
本文中所述的RNA脂质复合物颗粒和包含RNA脂质复合物颗粒的组合物可用于在肠胃外施用之后，特别是在静脉内施用之后，将RNA递送至靶组织。
脾靶向RNA脂质复合物颗粒在WO 2013/143683中所述，通过引用并入本文中。已经发现，具有净负电荷的RNA脂质复合物颗粒可用于优先靶向脾组织或脾细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中出现RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于在脾中表达RNA。在一个实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在肺和/或肝中没有或基本上没有出现RNA积累和/或RNA表达。在一些实施方案中，在施用RNA脂质复合物颗粒之后，在脾中的抗原呈递细胞(例如专职抗原呈递细胞)中出现RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开内容的RNA脂质复合物颗粒可用于将RNA(例如编码抗原或至少一种表位的RNA)靶向至淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。如果施用的RNA是编码疫苗抗原的RNA，则特别优选靶向淋巴系统，特别是次级淋巴器官，更特别是脾。在一些实施方案中，靶细胞是脾细胞。在一些实施方案中，靶细胞是抗原呈递细胞，例如脾中的专职抗原呈递细胞。在一些实施方案中，靶细胞是脾中的树突细胞。
本公开内容的RNA脂质复合物颗粒的电荷是至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷的总和。电荷比是至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷的电荷比通过以下等式来计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中的正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷总数)]。RNA浓度和至少一种阳离子脂质的量可使用本领域技术人员的常规方法来测定。
在一些实施方案中，在生理pH下，RNA脂质复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.6:2至约1:2，或约1.6:2至约1.1:2。在一个特定实施方案中，在生理pH下，RNA脂质复合物颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.6:2.0、约1.5:2.0、约1.4:2.0、约1.3:2.0、约1.2:2.0、约1.1:2.0或约1:2.0。
脂质纳米粒(LNP)
在一些实施方案中，本文中所述的RNA以脂质纳米粒(LNP)的形式存在。LNP可包含能够形成颗粒的任何脂质，其中一种或更多种核酸分子与所述颗粒连接，或者一种或更多种核酸分子被包封在所述颗粒中。
LNP通常包含四种组分：可电离的阳离子脂质、中性脂质(例如磷脂)、类固醇(例如胆固醇)和聚合物缀合的脂质(例如PEG-脂质)。LNP可通过将溶解在乙醇中的脂质与在水性缓冲液中的核酸混合来制备。
在一些实施方案中，在本文中所述的RNA LNP中，mRNA被占据LNP中央核心的可电离脂质结合。PEG脂质与磷脂一起形成LNP的表面。在一些实施方案中，表面包括双层。在一些实施方案中，以带电荷和不带电荷形式的胆固醇和可电离脂质可分布在整个LNP中。
在一些实施方案中，LNP包含一种或更多种阳离子脂质和一种或更多种稳定脂质。稳定脂质包括中性脂质和聚乙二醇化脂质。
在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合的脂质；和包封在脂质纳米粒内或与脂质纳米粒缔合的RNA。
在一些实施方案中，LNP占40至55mol百分比、40至50mol百分比、41至50mol百分比、42至50mol百分比、43至50mol百分比、44至50mol百分比、45至50mol百分比、46至50mol百分比或46至49mol百分比。
在一些实施方案中，中性脂质以浓度范围为5至15mol百分比、7至13mol百分比或9至11mol百分比存在。
在一些实施方案中，类固醇以浓度范围为30至50mol百分比、35至45mol百分比或38至43mol百分比存在。
在一些实施方案中，LNP占聚合物缀合的脂质的1至10mol百分比、1至5mol百分比或1至2.5mol百分比。
在一些实施方案中，LNP包含45至50mol百分比的阳离子脂质；5至15mol百分比的中性脂质；35至45mol百分比的类固醇；1至5mol百分比的聚合物缀合的脂质；和包封在脂质纳米粒内或与脂质纳米粒缔合的RNA。
在一些实施方案中，mol百分比基于脂质纳米粒中存在的脂质的总mol来确定。在一些实施方案中，mol百分比基于脂质纳米粒中存在的阳离子脂质、中性脂质、类固醇和聚合物缀合的脂质的总mol来确定。
在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、DOPG、DPPG、POPE、DPPE、DMPE、DSPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。
在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。
在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质是聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质具有以下结构或为其可药用盐、互变异构体或立体异构体：
其中：
R12和R13各自独立地是包含10至30个碳原子的直链或支链、饱和或不饱和烷基链，其中烷基链任选地被一个或更多个酯键中断；并且w的平均值范围为30至60。在一些实施方案中，R12和R13各自独立地是包含12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在一些实施方案中，w的平均值范围为40至55。在一些实施方案中，平均w为约45。在一些实施方案中，R12和R13各自独立地是包含约14个碳原子的直链饱和烷基链，并且w的平均值为约45。
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质是或包含2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺。
在一些实施方案中，LNP的阳离子脂质组分具有式(III)的结构或为其可药用盐、互变异构体、前药或立体异构体：
其中：
L1或L2中的一者是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一者是–O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键。
G1和G2各自独立地是未经取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4 or-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；并且
x是0、1或2。
在式(III)的一些前述实施方案中，所述脂质具有以下结构(IIIA)或(IIIB)之一：
其中：
A是3至8元环烷基或亚环烷基环；
R6在每次出现时独立地是H、OH或C1-C24烷基；
n是范围为1至15的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，所述脂质具有结构(IIIA)，并且在另一些实施方案中，所述脂质具有结构(IIIB)。
在式(III)的另一些实施方案中，所述脂质具有以下结构(IIIC)或(IIID)之一：
其中y和z各自独立地是1至12的整数。
在前述式(III)的任一个实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2中的每个是-O(C＝O)-。在任一前述的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-(C＝O)O-。
在式(III)的一些不同实施方案中，所述脂质具有以下结构(IIIE)或(IIIF)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，所述脂质具有以下结构(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，n是范围为2至12，例如2至8或2至4的整数。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。
在式(III)的一些其他前述实施方案中，y和z各自独立地是范围为2至10的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是范围为4至9或4至6的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R6是H。在另一些前述实施方案中，R6是C1-C24烷基。在另一些实施方案中，R6是OH。
在式(III)的一些实施方案中，G3是未经取代的。在另一些实施方案中，G3是经取代的。在多个不同的实施方案中，G3是线性C1-C24亚烷基或线性C1-C24亚烯基。
在式(III)的另一些前述实施方案中，R1或R2或其两者都是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；并且
a是2至12的整数，
其中R7a、R7b和a各自被选择使得R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是范围为5至9或8至12的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R7a至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a每次出现时都是H。在前述的另一些不同实施方案中，R7b至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或其两者具有下列结构之一：
在式(III)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、C(＝O)OR4、-OC(＝O)OR4或-NHC(＝O)OR4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在多个不同的实施方案中，式(III)的阳离子脂质具有下表中列出的结构之一。
式(III)的示例性化合物。
多种脂质(包括例如阳离子脂质、中性脂质和聚合物缀合的脂质)在本领域中是已知的，并且可在本文中用于形成脂质纳米粒，例如，靶向特定细胞类型(例如，肝细胞)的脂质纳米粒。在一些实施方案中，中性脂质可以是磷脂或其衍生物或包含磷脂或其衍生物(例如，1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPSC))和/或胆固醇。在一些实施方案中，聚合物缀合的脂质可以是PEG缀合的脂质(例如，2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺或其衍生物)。
在一些实施方案中，LNP包含式(III)的脂质、RNA、中性脂质、类固醇和聚乙二醇化脂质。在一些实施方案中，中性脂质是DSPC。在一些实施方案中，类固醇是胆固醇。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质是ALC-0159。
ALC-0159：
在一些实施方案中，阳离子脂质以约45至约50摩尔百分比的量存在于LNP中。在一些实施方案中，中性脂质以约5至约15摩尔百分比的量存在于LNP中。在一些实施方案中，类固醇以约35至约45摩尔百分比存在于LNP中。在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质以约1至约5摩尔百分比的量存在于LNP中。
在一些实施方案中，LNP所包含的阳离子脂质的量为约45至约50摩尔百分比、DSPC的量为约5至约15摩尔百分比、胆固醇的量为约35至约45摩尔百分比以及ALC-0159的量为约1至约5摩尔百分比。
N/P值优选地至少为约4。在一些实施方案中，N/P值的范围为4至20、4至12、4至10、4至8或5至7。在一些实施方案中，N/P值为约6。
化学治疗
在某些实施方案中，可结合本文所述的治疗对患者进行另外的治疗。这样的另外的治疗包括经典的癌症治疗，例如放射治疗、手术、热疗和/或化学治疗。
化学治疗是使用一种或更多种抗癌药物(化学治疗剂)的癌症治疗，通常作为标准化化学治疗方案的一部分。术语“化学治疗”已意味着非特异性使用胞内毒素来抑制有丝分裂。其含义不包括阻断胞外信号(信号转导)的更具选择性的药剂。开发具有特异性分子或遗传靶标的治疗，该治疗抑制来自经典内分泌激素(主要是用于乳腺癌的雌激素和用于前列腺癌的雄激素)的促生长信号，现在称为激素治疗。相比之下，对生长信号的其他抑制，如与受体酪氨酸激酶相关的抑制，被称为靶向治疗。
重要的是，药物的使用(无论是化学治疗、激素治疗还是靶向治疗)构成针对癌症的全身治疗，这在于它们被引入血流中，因此原则上能够处理体内任何解剖位置处的癌症。全身治疗通常与构成癌症局部治疗的其他方式((即效力限于应用它们的解剖区域的治疗)例如放射治疗、手术或热疗)联合使用。
传统化学治疗剂通过干扰细胞分裂(有丝分裂)而具有细胞毒性，但癌细胞对这些药剂的易感性存在较大差异。在很大程度上，化学治疗可被认为是损伤细胞或使细胞应激的方式，如果启动了凋亡，则可导致细胞死亡。
化学治疗剂包括烷化剂、抗代谢物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂和细胞毒性抗生素。
烷化剂具有使许多分子烷基化的能力，所述分子包括蛋白质、RNA和DNA。烷化剂的亚型是氮芥、亚硝脲、四嗪、氮丙啶、顺铂及其衍生物和非经典烷化剂。氮芥包括二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安(busulfan)。亚硝脲包括N-亚硝基-N-甲基脲(N-Nitroso-N-methylurea，MNU)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)和司莫司汀(semustine)(MeCCNU)、福莫司汀(fotemustine)和链脲菌素。四嗪包括达卡巴嗪(dacarbazine)、米托唑胺(mitozolomide)和替莫唑胺(temozolomide)。氮丙啶包括噻替派(thiotepa)、丝裂霉素和地吖醌(diaziquone)(AZQ)。顺铂及衍生物包括顺铂、卡铂(carboplatin)和奥沙利铂(oxaliplatin)。它们通过与生物重要分子中的氨基、羧基、巯基和磷酸基团形成共价键而损害细胞功能。非经典烷化剂包括丙卡巴肼(procarbazine)和六甲基三聚氰胺。在一个特别优选的实施方案中，烷化剂是环磷酰胺。
抗代谢物是一组阻碍DNA和RNA合成的分子。它们中的许多与DNA和RNA的构建块(building block)具有类似的结构。抗代谢物类似于核碱基或核苷，但具有经改变的化学基团。这些药物通过阻断DNA合成所需的酶或者并入到DNA或RNA中来发挥其作用。抗代谢物的亚型是抗叶酸、氟嘧啶、脱氧核苷类似物和硫嘌呤(thiopurine)。抗叶酸包括甲氨蝶呤和培美曲塞(pemetrexed)。氟嘧啶包括氟尿嘧啶和卡培他滨(capecitabine)。脱氧核苷类似物包括阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、地西他滨(decitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、氟达拉滨(fludarabine)、奈拉滨(nelarabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)和喷司他丁(pentostatin)。硫嘌呤包括硫鸟嘌呤和巯基嘌呤。
抗微管剂通过阻止微管功能来阻断细胞分裂。长春花生物碱类阻止微管形成，而紫杉烷阻止微管分解。长春花生物碱包括长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁。紫杉烷包括多西他赛(泰索帝(Taxotere))和紫杉醇(泰素(Taxol))。
拓扑异构酶抑制剂是影响拓扑异构酶I和拓扑异构酶II这两种酶活性的药物，并且包括伊立替康(irinotecan)、拓扑替康(topotecan)、喜树碱、依托泊苷(etoposide)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、替尼泊苷(teniposide)、新生霉素(novobiocin)、美巴龙(merbarone)和阿柔比星(aclarubicin)。
细胞毒性抗生素是不同组的具有多种作用机制的药物。它们在化学治疗适应证中具有的共同主题是它们中断细胞分裂。最重要的亚组是蒽环素(例如，多柔比星、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、吡柔比星(pirarubicin)和阿柔比星)和博莱霉素(bleomycin)；另一些突出的实例包括丝裂霉素C、米托蒽醌和放线菌素。
在一些实施方案中，在施用免疫效应细胞之前，可应用淋巴细胞清除治疗，例如，通过施用环磷酰胺和氟达拉滨。这样的治疗可提高细胞的持久性和临床应答的发生率和持续时间。
包含核酸的组合物
包含本文中所述的一种或更多种核酸(例如，以核酸颗粒的形式)的组合物可包含盐、缓冲液或如以下进一步描述的其他组分。
在一些实施方案中，用于本文中所述组合物的盐包含氯化钠。不希望受到理论的束缚，氯化钠用作用于在与脂质混合之前预处理RNA的离子渗量剂(ionic osmolalityagent)。在一些实施方案中，本文中所述的组合物可包含替代有机盐或无机盐。替代盐包括但不限于：氯化钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、乙酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、磷酸二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)钠盐。
一般而言，用于储存RNA颗粒，例如用于冷冻RNA颗粒的组合物包含低氯化钠浓度，或包含低离子强度。在一些实施方案中，氯化钠的浓度为0mM至约50mM、0mM至约40mM、或约10mM至约50mM。
根据本公开内容，本文中所述的RNA颗粒组合物具有适合于RNA颗粒的稳定性的pH，并且特别具有适合于RNA的稳定性的pH。不希望受到理论的束缚，在组合物的制造、储存和使用期间，缓冲体系的使用保持了本文中所述颗粒组合物的pH。在本公开内容的一些实施方案中，缓冲体系可包括溶剂(特别是水，例如去离子水，特别是注射用水)和缓冲物质。缓冲物质可选自2-[4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-基]乙烷磺酸(HEPES)、2-氨基-2-(羟基甲基)丙烷-1,3-二醇(Tris)、乙酸盐和组氨酸。一种优选的缓冲物质是HEPES。
本文中所述的组合物还可包含冷冻保护剂和/或表面活性剂作为稳定剂，以在储存、冷冻和/或冻干期间避免产物品质的实质性损失，并且特别是避免mRNA活性的实质性损失，例如以减少或防止聚集、颗粒塌陷、mRNA降解和/或其他类型的损伤。
在一个实施方案中，冷冻保护剂是碳水化合物。本文中使用的术语“碳水化合物”是指并且涵盖单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。
在一个实施方案中，冷冻保护剂是单糖。本文中使用的术语“单糖”是指不可水解成更简单的碳水化合物单元的单一碳水化合物单元(例如，简单的糖)。一些示例性的单糖冷冻保护剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。
在一个实施方案中，冷冻保护剂是二糖。本文中使用的术语“二糖”是指由2个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起。二糖可水解成两个单糖。一些示例性的二糖冷冻保护剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。
术语“三糖”意指连接在一起形成一个分子的三个糖。三糖的一些实例包括棉子糖和松三糖。
在一个实施方案中，冷冻保护剂是寡糖。本文中使用的术语“寡糖”是指由3至约15个(例如3至约10个)单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成线性、支化或环状结构。一些示例性的寡糖冷冻保护剂包括环糊精、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可被氧化或还原。
在一个实施方案中，冷冻保护剂是环状寡糖。本文中使用的术语“环状寡糖”是指由3至约15个(例如6、7、8、9或10个)单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成环状结构。一些示例性的环状寡糖冷冻保护剂包括为离散化合物的环状寡糖，例如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。
另一些示例性的环状寡糖冷冻保护剂包括在较大分子结构中包含环糊精部分的化合物，例如包含环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可被氧化或还原，例如氧化成二羰基形式。本文中使用的术语“环糊精部分”是指环糊精(例如，α、β或γ环糊精)基团，其被并入到较大分子结构(例如聚合物)中或是其一部分。环糊精部分可直接或通过任选的接头与一个或更多个其他部分结合。环糊精部分可被氧化或还原，例如氧化成二羰基形式。
碳水化合物冷冻保护剂，例如，环状寡糖冷冻保护剂，可以是衍生的碳水化合物。例如，在一个实施方案中，冷冻保护剂是衍生的环状寡糖，例如衍生的环糊精，例如，2-羟基丙基-β-环糊精，例如，部分醚化的环糊精(例如，部分醚化的β环糊精)。
示例性的冷冻保护剂是多糖。本文中使用的术语“多糖”是指由至少16个单糖单元形成的化合物或化学部分，所述单糖单元通过糖苷键联(例如通过1-4键联或1-6键联)键合在一起以形成线性、支化或环状结构，并且该术语包括包含多糖作为其主链结构一部分的聚合物。在主链中，多糖可以是线性的或环状的。一些示例性的多糖冷冻保护剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糖糊精等。
在一些实施方案中，RNA颗粒组合物可包含蔗糖。不希望受到理论的束缚，蔗糖的作用是促进组合物的冷冻保护，从而阻止RNA(特别是mRNA)颗粒聚集并保持组合物的化学和物理稳定性。在一些实施方案中，RNA颗粒组合物可包含针对蔗糖的替代冷冻保护剂。替代稳定剂包括但不限于海藻糖和葡萄糖。在一个具体的实施方案中，针对蔗糖的替代稳定剂是海藻糖或者蔗糖和海藻糖的混合物。
优选的冷冻保护剂选自蔗糖、海藻糖、葡萄糖、及其组合，例如蔗糖和海藻糖的组合。在一个优选的实施方案中，冷冻保护剂是蔗糖。
本公开内容的一些实施方案考虑了螯合剂在本文中所述的RNA组合物中的用途。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键从而产生稳定的水溶性复合物的化学化合物。不希望受到理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，其在本公开内容中可另外地诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的一些实例包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA盐、去铁敏B(desferrioxamine B)、去铁胺(deferoxamine)、二硫卡钠(dithiocarb sodium)、青霉胺、戊酸钙、戊酸钠盐、琥巯酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、氨三乙酸(nitrilotriacetic acid)、反式-二氨基环己烷四乙酸(trans-diaminocyclohexanetetraacetic acid，DCTA)、二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid，DTPA)和双(氨基乙基)乙二醇醚-N,N,N’,N’-四乙酸。在一些实施方案中，螯合剂是EDTA或EDTA的盐。在一个示例性实施方案中，螯合剂是EDTA二水合二钠。在一些实施方案中，EDTA的浓度为约0.05mM至约5mM、约0.1mM至约2.5mM或约0.25mM至约1mM。
在一个替代实施方案中，本文中所述的RNA颗粒组合物不包含螯合剂。
药物组合物
本文中所述的药剂可以以药物组合物或药物施用，并且可以以任何合适的药物组合物的形式施用。在一些实施方案中，药物组合物用于治疗性或预防性治疗，例如用于治疗或预防涉及抗原的疾病，如癌症或感染性疾病。
术语“药物组合物”涉及包含治疗有效剂，优选与可药用的载体、稀释剂和/或赋形剂一起的治疗有效剂的组合物。通过将所述药物组合物向对象施用，所述药物组合物可用于治疗、预防或减轻疾病的严重性。
本公开内容的药物组合物可包含一种或更多种佐剂或者可与一种或更多种佐剂一起施用。术语“佐剂”涉及延长、增强或加速免疫应答的化合物。佐剂包含化合物例如油乳剂(例如，弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿物质化合物(例如明矾)、细菌产品(例如百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)毒素)或免疫刺激复合物的非均质组。佐剂的一些实例包括但不限于：LPS、GP96、CpG寡脱氧核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核因子、淋巴因子、白介素、趋化因子。趋化因子可以是IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFa、INF-γ、GM-CSF、LT-a。另一些已知的佐剂是氢氧化铝、弗氏佐剂或油类，例如ISA51。用于本公开内容的另一些合适的佐剂包括脂肽，例如Pam3Cys以及亲脂组分例如皂苷、海藻糖-6,6-二山嵛酸酯(trehalose-6,6-dibehenate，TDB)、单磷酰脂质-A(monophosphoryl lipid-A，MPL)、单分枝酰基甘油(monomycoloyl glycerol，MMG)、或吡喃葡萄糖基脂质佐剂(glucopyranosyl lipid adjuvant，GLA)。
本公开内容的药物组合物可以以可存储形式(例如，以冷冻或冻干/冷冻干燥形式)或以“即用型”(即，以可立即向对象施用的形式，例如，不经任何处理例如稀释)。因此，在施用可储存形式的药物组合物之前，必须将该可储存形式加工或转化成即用型或可施用形式。例如，通过使用合适的溶剂(例如，去离子水，例如注射用水)或液体(例如水溶液)，例如，经冷冻的药物组合物必须解冻，或者经冷冻干燥的药物组合物必须重构。
根据本公开内容的药物组合物通常以“药学有效量”和以“可药用制剂”施加。
术语“可药用”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的物质的无毒性。
术语“药学有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的作用的量。在涉及治疗特定疾病的一些实施方案中，期望的反应可涉及对疾病进程的抑制。这包括减慢疾病的进展，并且在一些实施方案中，中断或逆转疾病的进展。疾病治疗中的期望反应还可以是对所述疾病或所述病症的发作的延迟或发作的预防。本文中所述药物组合物的有效量将取决于：待治疗病症，疾病的严重程度，患者的个体参数，包括年龄、生理状况、尺寸和体重，治疗的持续时间，伴随治疗(如果有的话)的类型，具体施用途径和类似因素。因此，本文中所述药物组合物的施用剂量可取决于多种这样的参数。在初始剂量下患者中的反应不充分的情况下，可使用更高剂量(或通过不同的更局部的施用途径来实现有效地更高剂量)。
本公开内容的药物组合物可包含缓冲剂、防腐剂和任选地其他治疗剂。在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物包含一种或更多种可药用的载体、稀释剂和/或赋形剂。
用于本公开内容的药物组合物中的合适的防腐剂包括但不限于：苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
本文中使用的术语“赋形剂”是指可存在于本公开内容的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的一些实例包括但不限于：载体、黏合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。
术语“稀释剂”涉及稀释剂(diluting agent)和/或稀化剂(thinning agent)。此外，术语“稀释剂”包括流体、液体或固体混悬剂和/或混合介质中的任一种或更多种。合适的稀释剂的一些实例包括乙醇、甘油和水。
术语“载体”是指可以是天然的、合成的、有机的、无机的组分，在其中将活性组分组合以促进、增强或实现药物组合物的施用。本文中使用的载体可以是适合于施用于对象的一种或更多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。合适的载体包括但不限于：无菌水、林格液(Ringer)、乳酸林格液、无菌氯化钠溶液、等张盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘并且特别是生物相容性丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物包含等张盐水。
用于治疗性用途的可药用的载体、赋形剂或稀释剂在药学领域中是公知的，并且描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.(A.R Gennaro编辑.1985)中。
可根据预期的施用途径和标准药物实践来选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
药物组合物的施用途径
在一些实施方案中，本文中所述的药物组合物可静脉内、动脉内、皮下、皮内、皮肤(dermally)、节内、肌内、瘤内或瘤周施用。在一些实施方案中，将药物组合物配制成用于局部施用或全身性施用。全身性施用可包括涉及通过胃肠道吸收的肠施用，或肠胃外施用。本文中使用的“肠胃外施用”是指以除通过胃肠道之外的任何方式施用，例如通过静脉内注射。在一些实施方案中，将药物组合物配制成用于全身性施用。在一些实施方案中，全身性施用通过静脉内施用。
在本发明所有方面的一些实施方案中，编码疫苗抗原的RNA、PD-1轴结合拮抗剂和任选的编码免疫刺激剂的RNA被全身性施用，例如静脉内施用。
本文中使用的术语“共施用”意指将不同化合物或组合物(例如，编码疫苗抗原的RNA和PD-1轴结合拮抗剂)施用于同一患者的过程。不同的化合物或组合物可同时、基本上同时或顺序施用。
组合物的用途
本文中所述的组合物可用于多种疾病的治疗性或预防性治疗，特别是其中向对象提供疫苗抗原导致治疗性或预防性作用的疾病，例如特征在于存在表达抗原的病变细胞的疾病，例如癌症疾病或感染性疾病。例如，提供来源于病毒的抗原或表位可用于治疗由所述病毒引起的病毒性疾病。提供肿瘤抗原或表位可用于治疗癌症疾病，在所述癌症疾病中癌细胞表达所述肿瘤抗原。
术语“疾病”(在本文中也称为“病症”)是指影响个体身体的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学病症。疾病可由最初来自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者疾病可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。在人中，“疾病”通常被更广泛地用于指引起以下的任何病症：痛苦、功能障碍、困扰、社会问题、或所折磨个体死亡、或与接触个体的那些类似的问题。从广义上讲，疾病有时包括伤害、残疾、病症、综合征、感染、孤立的症状、异常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些背景下和出于其他目的，这些可被视为可区分的类别。疾病通常不仅在身体上影响个体而且在情感上影响个体，因为感染多种疾病和在有多种疾病的情况下生活可改变人对生活的看法和人的性格。
术语“涉及抗原的疾病”是指牵涉抗原的任何疾病，例如以抗原的存在为特征的疾病。涉及抗原的疾病可以是感染性疾病或癌症疾病或仅是癌症。抗原可以是疾病相关抗原，例如肿瘤相关抗原、病毒抗原或细菌抗原。在一些实施方案中，涉及抗原的疾病是涉及表达抗原的细胞的疾病，并且优选在细胞表面呈递抗原，例如在MHC的情况下。
术语“感染性疾病”是指可在个体之间或生物体之间传播并且由微生物原(microbial agent)引起的任何疾病(例如，普通感冒)。感染性疾病是本领域中已知的，并且包括例如病毒性疾病、细菌性疾病或寄生物性疾病，这些疾病分别由病毒、细菌和寄生物引起。在这方面中，感染性疾病可以是，例如，肝炎、性传播疾病(例如衣原体或淋病)、结核病、HIV/获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、白喉、乙型肝炎、丙型肝炎、霍乱、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)、禽流感和流感。
术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于：上皮癌(carcinoma)、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin’s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(central nervous system，CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊椎轴肿瘤、胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。根据本公开内容的术语“癌症”还包括癌症转移。
在本发明背景中，术语“治疗”或“治疗性干预”涉及出于对抗病症例如疾病的目的的对对象的管理和护理。该术语旨在包括针对对象所遭受的给定病症的全谱治疗，例如施用治疗有效的化合物以减轻症状或并发症，延缓疾病、障碍或病症的进展，缓解或减轻症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症以及预防病症，其中预防应理解为出于对抗疾病、病症或障碍目的的对个体的管理和护理，并且包括施用活性化合物以预防症状或并发症的发作。
术语“治疗性治疗”涉及改善健康状况和/或延长(提高)个体寿命的任何治疗。所述治疗可消除个体中的疾病，阻止或减缓个体中疾病的发展，抑制或减缓个体中疾病的发展，降低个体中症状的频率或严重程度，和/或降低当前或以前患有疾病的个体中的复现性。
术语“预防性治疗”或“防止性治疗”涉及旨在防止疾病在个体中发生的任何治疗。术语“预防性治疗”或“防止性治疗”在本文中可互换使用。
术语“个体”和“对象”在本文中可互换使用。它们是指可受疾病(例如，癌症、感染性疾病)折磨或易于患有所述疾病(例如，癌症、感染性疾病)但是可患有或可未患有所述疾病或者可能需要预防性干预(例如疫苗接种)或者可能需要进行干预(例如通过蛋白质替代)的人或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类)或任何其他非哺乳动物，包括鸟类(鸡)、鱼或任何其他动物物种。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成年人、老年人、儿童和新生儿。在本公开内容的一些实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。
术语“患者”意指治疗的个体或对象，特别是患病的个体或对象。
在本公开内容的一些实施方案中，目的是通过提供疫苗诱导免疫应答。
本领域技术人员将知道免疫治疗和疫苗接种的原理之一是基于以下事实：通过用抗原或表位对对象进行免疫接种来产生针对疾病的免疫保护性反应，所述抗原或表位在免疫学上与待治疗的疾病相关。因此，本文中所述的药剂可应用于诱导或增强免疫应答。因此，本文中所述的药剂可用于涉及抗原或表位的疾病的预防性和/或治疗性治疗。
在本公开的一些实施方案中，目的是提供针对表达抗原的病变细胞例如表达肿瘤抗原的癌细胞的免疫应答，并治疗疾病例如涉及表达抗原(例如肿瘤抗原)的细胞的癌症疾病。
在本公开的一些实施方案中，目的是通过疫苗接种治疗癌症。
在本公开的一些实施方案中，目的是提供针对表达肿瘤抗原的癌细胞的免疫反应并治疗涉及表达肿瘤抗原的细胞的癌症疾病。
在本公开的一些实施方案中，目的是通过疫苗接种提供针对感染性疾病的预防。
本文中所引用的文件和研究的引证并不旨在承认任何前述内容是相关的现有技术。关于这些文件内容的所有陈述都是基于申请人可获得的信息，并不构成对这些文件内容正确性的任何承认。
呈现描述(包括以下实施例)以使本领域普通技术人员能够制造和使用多个实施方案。对特定装置、技术和应用的描述仅作为实例提供。对本文中所述实施例的多种修改对于本领域普通技术人员而言将是明显的，并且在不脱离多个实施方案的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可应用于另一些实施例和应用。因此，多个实施方案不旨在限于本文中描述和示出的实施例，而是与符合权利要求书的范围相一致。
实施例
实施例1：测试化合物
测试化合物是脂质体配制的RNA(RNA-脂质复合物[RNA-LPX])癌症疫苗，其被设计成静脉内施用，并将RNA编码的抗原特异性地靶向淋巴器官内的常驻树突细胞(DC)。这些DC翻译编码的抗原，并在MHC分子上呈现抗原衍生的表位，用于T细胞致敏。
另一种测试化合物是细胞因子mRNA，该细胞因子mRNA编码白介素-2(IL-2)，其与血清白蛋白融合以延长半衰期和生物利用度。
本申请中使用的RNA-LPX疫苗列于表2。简言之，它们由(i)未经dsRNA纯化的经非核苷修饰的含尿苷RNA(uridine-containing RNA，uRNA)组成，或由(ii)经m1ψ修饰的双链RNA纯化RNA(modRNA)组成。
疫苗RNA构建体的体外转录基于先前描述的pCMV-Script-载体(Stratagene)的衍生物(Holtkamp,S.et al.(2006)Blood 108,4009–4017)。这些质粒编码T7启动子、5’人血红蛋白亚单位α1(hAg)-UTR、3’UTR和poly(A)尾。
疫苗RNA构建体编码鸡卵白蛋白(ovalbumin，OVA)的H-2Kb限制性免疫显性表位OVA257-264(SIINFEKL)，随后是人β-珠蛋白的两个连续序列的3’UTR和120个核苷酸或100个核苷酸的poly(A)尾，其在70个核苷酸之后有接头。
另一种疫苗RNA构建体编码小鼠酪氨酸酶相关蛋白2(tyrosinase-relatedprotein 2，TRP2)的H2-Kb限制性表位Trp2180-188(SVYDFFVWL)，其与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP288-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合(Kianizad,K.et al.(2007)Cancer Res.67,6459–6467)，随后是3’UTR称为FI元件(其中F是分裂RNA的氨基末端增强子的136个核苷酸长的3’-UTR片段，并且I是线粒体编码的12SRNA的142个核苷酸长的片段，两者都在智人(Homosapiens)中鉴定；WO 2017/060314)和100个核苷酸的poly(A)尾，其在70个核苷酸之后有接头。
非编码RNA(对照RNA)包含人β-珠蛋白两个连续序列的3’UTR和100个核苷酸的poly(A)尾，其在70个核苷酸之后有接头，以及GS接头(GGSGGGGSGGGGSGGGGSGG)代替抗原序列。
基于Kreiter等人描述的人序列，疫苗RNA构建体配备有用于运输至内质网的分泌信号和来源于小鼠I类MHC的跨膜结构域(MITD)，用于改善MHC I类和II类表位的呈递(Kreiter,S.et al.(2008)J.Immunol.180,309–318)。疫苗RNA通过体外转录产生，如(Kreiter,S.et al.(2007)Cancer Immunol.Immunother.56,1577–1587)所述，并用β-S-ARCA帽0加帽(Kuhn,A.et al.(2010)Gene Ther.17,961–971)。对于经修饰RNA(modRNA)的合成，核苷尿苷被m1ψ替换(Pardi,N.et al.(2015)J.Control.Release 217,345–351)。对于纯化，将双链RNA耗尽(M.et al.(2019)Mol.Ther.-Nucleic Acids 15)。在H2O中洗脱RNA，并将其储存在-80℃下直到进一步使用。
疫苗RNA由DOTMA和DOPE构成的脂质体配制而成，以产生带负电荷的RNA-LPX(Kranz,L.M.et al.(2016)Nature 534,396–401)。RNA-LPX是在TRON gGmbH处在无菌和无核糖核酸酶的条件下制备的，即所有设备都经过高压灭菌并且所有表面在使用之前都用浸泡过的布清洗。将一小瓶RNA储液解冻，并连续用水、10mM HEPES/0.1mMEDTA、1.5M NaCl和L2脂质体稀释。每次添加后立即涡旋小瓶，并在添加所有组分后在环境温度下孵育10分钟。
表2：疫苗RNA制剂及其特性
m1ψ，N1-甲基-假尿苷。modRNA，经m1ψ修饰的RNA。u，尿苷。uRNA，含尿苷RNA。
RNA 核苷修饰 dsRNA纯化
uRNA 100％u 未经纯化
modRNA 100％m1ψ 经纯化
细胞因子编码RNA的体外转录基于pST1-T7-AGA-dEarl-hAg-MCS-FI-A30LA70质粒骨架和衍生的DNA构建体。这些质粒构建体包含5’UTR(智人hAg的5’UTR的衍生物)、3’FI元件和100个核苷酸的poly(A)尾，其在70个核苷酸之后有接头。细胞因子和血清白蛋白编码序列来源于小家鼠(mus musculus)，并且所得氨基酸序列没有引入任何变化。白蛋白被引入成熟IL-2序列(不编码IL-2的信号肽)的N-末端。仅在最末端的C端部分引入了终止密码子。细胞因子和白蛋白融合构建体中的不同蛋白质部分被编码甘氨酸和丝氨酸残基的30个核苷酸长的接头序列分开。
对照细胞因子RNA仅编码血清白蛋白。
如上所述通过体外转录产生细胞因子RNA。正常的核苷尿苷被1-甲基-假尿苷替换。细胞因子RNA配备有帽1结构，并且双链RNA分子如上所述被耗竭。在H2O中洗脱纯化的细胞因子mRNA，并将其储存在-80℃下直到进一步使用。
在无菌和无核糖核酸酶的条件下，即所有设备都经过高压灭菌并且所有表面在使用之前都用浸泡过的布清洗，在TRON gGmbH处用TransIT(Mirrus)配制细胞因子RNA。将一小瓶RNA储液解冻并根据制造商的说明连续配制，随即进行静脉注射。
所有描述的RNA构建体的体外转录和配制在BioNTech SE进行。
实施例2：方法
使用带有29G针的3/10cc胰岛素注射器IV施用编码血清白蛋白和IL-2的融合蛋白并且用TransIT配制的RNA-LPX和细胞因子RNA。通过吸入氧中的2.5％异氟烷将小鼠麻醉，随后进行静脉注射。IP施用抗PD-1(克隆RMP1-14，BioXCell)和抗PD-L1(克隆MPDL3280A[InvivoGen])抗体及其相应的同种型对照(分别为大鼠IgG2a[克隆2A3，BioXCell]和mIgG1[克隆MOPC-21，BioXCell])。
B16-F10是表达TRP2的鼠黑素瘤细胞系，并且购买于2010年(ATCCCRL-6475，批号58078645)。接收之后立即产生主细胞库和工作细胞库，其中第三和第四代用于肿瘤实验。每三个月对细胞进行支原体检测。接收之后未对细胞进行重新认证。
在右胁腹中接种3×105个B16-F10肿瘤细胞。每三到四天用卡尺非盲测量肿瘤尺寸，以使用公式(a2×b)/2(a，宽度；b，长度)计算肿瘤体积。当动物出现健康受损迹象或肿瘤长度超过15mm时，对其实施安乐死。
通过面静脉或从眶后神经丛采集血液。简言之，在没有预先麻醉的情况下通过面静脉采血。紧紧地抓住小鼠，并用刺血针(lancet)在精确而短的移动中穿刺面静脉。为了从眶后窦采血，在诱导室中用O2和异氟烷(2.5％)的混合物麻醉小鼠，并用玻璃微量血细胞比容管穿刺眶后丛。血液被收集到肝素管中用于流式细胞术。随后松开限制夹。
对于脾收集，将小鼠安乐死并用70％乙醇消毒，并从腹部切口开始进行解剖。收集脾并储存在冰上的PBS中，用于随后的单细胞制备。
根据标准操作制备单细胞悬液。使用注射器的柱塞将脾捣碎通过70μm细胞过滤器，以将脾细胞释放到试管中。用过量体积的PBS洗涤细胞，然后在环境温度下以300×g离心6分钟，并弃去上清液。在环境温度下用红细胞裂解缓冲液(154mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mM EDTA)裂解红细胞5分钟。用过量体积的PBS中止反应。在另一个洗涤步骤之后，将细胞重悬于DC培养基(RPMI培养基1640(1×)+GlutaMAX-I(Life Technologies)，10％ FBS，1％ NEAA，1％丙酮酸钠，0.5％青霉素/链霉素，50μM 2-巯基乙醇)中，再次通过70μm的细胞筛，计数，并在4℃下储存直到进一步使用。
对于流式细胞术分析，将从每只小鼠收集的50μL血液转移至96孔板，并用滴定量的抗体染色。
对于胞外染色，使用以下抗体：大鼠抗小鼠CD127(克隆A7R34，eBioscience)、大鼠抗小鼠CD25(克隆PC61，Biolegend)、大鼠抗小鼠CD4(克隆RM4-5，BD Bioscience)、大鼠抗小鼠CD8(克隆5H10，Invitrogen)、仓鼠抗小鼠KLRG1(克隆2F1，eBioscience)和仓鼠抗小鼠PD-1(克隆J43，BD Bioscience)。为了检测抗原特异性CD8+T细胞，将H2-Kb限制性MHC四聚体用于检测OVA257-264(SIINFEKL)特异性CD8+T细胞(MBL Ltd.)以及H-2Kb限制性MHC四聚体用于检测TRP-2180-188(SVYDFFVWL)特异性CD8+T细胞(MBL Ltd.)。胞外染色操作在2至8℃下进行30分钟。之后，添加BD裂解缓冲液，混合，并在室温下黑暗中孵育6至8分钟。离心之后(5分钟，460×g，环境温度)，用PBS洗涤细胞一次(5分钟，460×g，环境温度)，并重悬于流动缓冲液(补充有5mM EDTA和5％ FBS的PBS)中。样品储存在2至8℃下直到测量。
对于胞内染色，将细胞固定(Fix/Perm缓冲液，FoxP3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience))30分钟，并在2至8℃下透化(Perm缓冲液，FoxP3/转录因子染色缓冲液组[eBioscience])30分钟。将透化的细胞用Fc block进行胞内处理，并在2至8℃下用Perm缓冲液中的大鼠抗小鼠FoxP3(克隆FJK-16s，Invitrogen)染色30分钟。用PBS洗涤细胞两次(5分钟，460×g，4℃)，并重悬于流动缓冲液中。将样品储存在2至8℃下直到测量。
对于T细胞的胞内细胞因子染色，将4×106个脾细胞铺板在96孔板中并用MHC四聚体染色以检测TRP-2180-188(SVYDFFVWL)特异性CD8+T细胞。之后，用2μg/mL终浓度的TRP-2180-188(SVYDFFVWL)肽或细胞培养基(无肽)作为对照对细胞进行离体再刺激。在存在终浓度为10μg/mL的布雷菲德菌素A(Brefeldin A)(Sigma-Aldrich)、GolgiStop和GolgiPlug(均为BD Bioscience)的情况下，将细胞再刺激5小时。在流动缓冲液(补充有2％胎牛血清[fetal calf serum，FCS]、2mM EDTA[Sigma]和0.01％叠氮化钠[Morphisto]的Dulbecco磷酸缓冲盐水)中在存在Fc block的情况下，在2至8℃下用可固定的生存力染料(eBioscience)对细胞进行染色并用如上所述直接标记的抗体针对表面标记物进行胞外染色持续30分钟。将细胞用PBS(5分钟，460×g，4℃)洗涤一次，固定(固定/Perm缓冲液，FoxP3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience))30分钟，并在2至8℃下透化(Perm缓冲液，FoxP3/转录因子染色缓冲液组(eBioscience))30分钟。将透化的细胞用Fc block进行胞内处理，并在2至8℃下在Perm缓冲液中用大鼠抗小鼠INFγ(克隆XMG1.2，BD Bioscience)染色30分钟。用PBS洗涤细胞两次(5分钟，460×g，4℃)，并重悬在流动缓冲液中。将样品储存在2至8℃下直到测量。
在BD Canto II或BD LSRFortessa流式细胞仪上获取数据，并使用FlowJo软件版本10.3和GraphPad Prism 9进行分析。
实施例3:与用uRNA进行疫苗接种相比，用modRNA进行疫苗接种导致PD-1在疫苗诱导的抗原特异性CD8+T细胞上的表达增强
PD-1是T细胞上的抑制性表面受体，其在激活时上调。肿瘤中肿瘤特异性T细胞上该免疫检查点的持续表达已表明与T细胞耗竭有关，因为这些T细胞与肿瘤细胞上的配体PD-L1结合。用抗PD-1或抗PD-L1抗体的免疫检查点抑制(immune checkpoint inhibition，CPI)可阻止抑制性PD-1/PD-L1轴的建立，并重振或增强抗肿瘤免疫应答。数种PD-1/PD-L1特异性抗体已被批准用于治疗黑素瘤和其他实体瘤。
具有PD-1高表达的T细胞被认为具有高抗原亲和力。因此，特别是这些PD-1+T细胞应该从PD-1/PD-L1轴的抑制中受益。
首先确定了核苷修饰和dsRNA纯化对疫苗诱导的疫苗抗原特异性CD8+T细胞上PD-1表达水平的影响。
将C57BL/6小鼠(每组和每个时间点n＝3)在第0天和第7天用20μg由编码H-2Kb限制性表位OVA257-264(SIINFEKL)的modRNA或uRNA组成的RNA-LPX进行IV疫苗接种两次。对照小鼠接受NaCl。每次疫苗接种之后第3、5和7天分析脾中疫苗诱导的OVA特异性CD8+T细胞上PD-1的表达。第二次疫苗接种之后5天，在血液中分析疫苗诱导的OVA特异性CD8+T细胞上PD-1的表达。通过流式细胞术确定PD-1表达(参见实施例2)。
抗原特异性CD8+T细胞在脾中可测量，最早在疫苗接种之后5天总CD8+T细胞的比例大于1％(图1a)。用uRNA进行疫苗接种之后，与对照小鼠中总CD8+T细胞为约2％相比，平均68％的抗原特异性CD8+T细胞表达PD-1。相比之下，平均80％的抗原特异性CD8+T细胞在用modRNA进行疫苗接种之后表达PD-1。uRNA和modRNA诱导的PD-1+分数之间的差异保持到第7天。在第二次接种之后，PD-1+抗原特异性CD8+T细胞的分数在对uRNA的应答中下降(平均值为40％；第10天)，而对modRNA的应答进一步提高(平均值为88％；第10天)。在该时间点之后，PD-1+细胞的分数下降，这可能是因为PD-1+抗原特异性CD8+T细胞在疫苗接种之后第3天左右开始离开脾并进入循环。
在分析抗原特异性CD8+T细胞上PD-1的表达水平时，检测到了非常相似的差异(图1b)：与对照小鼠中总CD8+T细胞上PD-1的表达(平均MFI 125；第3天)相比，用uRNA进行疫苗接种导致抗原特异性CD8+T细胞上PD-1的表达提高(平均MFI 1,256)。在对用modRNA进行疫苗接种的应答中，抗原特异性CD8+T细胞上的PD-1表达明显增强(平均MFI 2,298)。在第7天，表达水平的差异是相似的。在第二次接种后，PD-1表达响应于uRNA而降低(平均MFI898；第10天)，但响应于modRNA而进一步略有提高(平均MFI 2,531；第十天)。
与这些观察结果一致的是，在第二次疫苗接种之后5天，血液中可检测到的抗原特异性T细胞在用modRNA进行的疫苗接种诱导时与uRNA相比表达更高水平的PD-1(平均MFI1,198vs 448；图1c)。
综上所述，用modRNA进行疫苗接种不仅提高了疫苗诱导的抗原特异性CD8+T细胞中PD-1+细胞的分数，还增强了该群体中PD-1表达水平。
实施例4：modRNA疫苗接种的效力通过与检查点阻断相结合而增强，特别是在针对自身抗原进行疫苗接种时
除肿瘤细胞之外，抗原呈递细胞在T细胞致敏期间也会暂时表达PD-L1。已经发现抗原特异性CD8+T细胞上的PD-1表达在致敏期间显著升高(参见实施例3)，试图研究这些T细胞是否将受益于用抗PD-1或抗PD-L1抗体的治疗。
将C57BL/6小鼠(每组n＝5)用1或10μg由编码H-2Kb限制性表位OVA257-264(SIINFEKL)的modRNA组成的RNA-LPX进行IV疫苗接种五次(第0、7、14、21和28天)，并同时用200μg抗PD-L1抗体IP进行处理。对照小鼠接受modRNA和同种型或NaCl。每次疫苗接种之后5天，从第二次接种开始(第12、19、26和33天)，通过流式细胞术分析血液中的抗原特异性CD8+T细胞(参见实施例2)。
用单独的1μg modRNA进行的疫苗接种诱导抗原特异性CD8+T细胞，其分数随着每次进一步疫苗接种而提高，直到在第四次疫苗接种之后达到平均为20％的平台期(第26天；图2a，左)。相比之下，modRNA疫苗接种与伴随的抗PD-L1抗体处理的组合增强了抗原特异性CD8+T细胞的诱导，在每个时间点抗原特异性CD8+T细胞的分数大约是单独的modRNA的两倍(约1.7至2.2倍)。
用单独的10μg modRNA进行疫苗接种在诱导抗原特异性CD8+T细胞方面比1μg更强效，在初始致敏阶段之后(两次疫苗接种之后，第12天)，相比于6％，平均分数为18％的总CD8+T细胞具有抗原特异性(图2a，右)。抗原特异性CD8+T细胞随着第三次疫苗接种进一步提高至平均分数为37％。虽然较高剂量的modRNA能够诱导比其本身低剂量高得多的分数的抗原特异性CD8+T细胞，但抗原特异性CD8+T细胞的分数进一步受益于modRNA与抗PD-L1抗体处理的组合，导致约1.5至2.3倍提高的分数。
与外来(病原体来源的、突变的)抗原相反，自身抗原通过中枢和外周耐受机制而免受不期望的T细胞攻击。由于它们也由肿瘤细胞表达，因此它们主要用作疫苗抗原。需要有效的治疗来克服这些耐受机制并扩增这样的针对肿瘤的自身反应性T细胞。
着手确定modRNA与CPI的组合是否能够增强T细胞针对自身抗原的应答。
将C57BL/6小鼠(每组n＝5)用20μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种5次(第0、7、14、21和28天)，并同时用250μg抗PD-1抗体IP进行治疗。对照小鼠接受modRNA和同种型或NaCl。除了第三次疫苗接种之后在每次疫苗接种之后5天(第5、12、26和33天)，通过流式细胞术分析血液中的抗原特异性CD8+T细胞(参见实施例2)。
从第一次疫苗接种开始，无论有或没有抗PD-1抗体，用modRNA进行疫苗接种均诱导了可检测到的自身抗原特异性CD8+T细胞分数高于对照水平，并且随着每次进一步疫苗接种而提高。值得注意的是，modRNA疫苗接种与抗PD-1抗体处理的组合能够证实针对外来抗原的疫苗接种所观察到的结果(参见图2a)：与抗PD-1抗体的组合增强了自身抗原特异性CD8+T细胞的分数，超过了由单独的modRNA诱导的分数，在五次疫苗接种之后达到了总CD8+T细胞中16％的自身抗原特异性CD8+T细胞的最大平均分数(第33天；图2b)。特别令人感兴趣的是，自身抗原特异性CD8+T细胞的分数是由单独的modRNA诱导的分数的大于4倍，表明modRNA疫苗接种与CPI的组合可特别适合于克服针对自身抗原的耐受性。
总之，modRNA疫苗接种诱导肿瘤抗原特异性CD8+T细胞的效力明显受益于与CPI的组合，并且当针对自身抗原进行疫苗接种时，两者的组合可特别令人感兴趣。
实施例5：与单独的modRNA疫苗接种相比，modRNA疫苗接种与检查点阻断的组合增强了治疗性抗肿瘤活性。
发现用CPI的治疗增强了由modRNA疫苗接种诱导的抗原特异性CD8+T细胞免疫，特别是针对自身抗原的免疫(参见实施例4)。这一发现促使研究这种组合对治疗性抗肿瘤活性的作用。
将C57BL/6小鼠(每组n＝10)用B16-F10肿瘤细胞SC进行接种，并在肿瘤接种之后第9天开始直至第65天每周用10μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种。将小鼠同时用抗PD-L1抗体或同种型对照IP进行处理(首次处理：10mg/kg，连续处理：5mg/kg)。对照小鼠接受具有抗PD-L1抗体的对照RNA。如实施例2中所述监测肿瘤生长。
用单独的modRNA进行疫苗接种的小鼠无法控制肿瘤生长(图3a)，并且中位生存期为28天(图3b)。然而，modRNA与抗PD-L1抗体的组合延迟了肿瘤过生长(outgrowth)，导致中位生存期为37天。值得注意的是，该组合导致一只小鼠的长期存活，该小鼠接受了持续治疗直至第100天，并直至第175天都存活。单独的抗PD-L1抗体表明了相似的肿瘤生长动力学，与单独的modRNA相似，以及单独的modRNA与modRNA和抗PD-L1抗体的组合之间的中位生存期(34天)。
总之，modRNA疫苗接种与CPI的组合增强了(自身)抗原特异性CD8+T细胞的诱导，这与增强的治疗性抗肿瘤活性相关。
实施例6：与双重组合相比，将IL-2添加至modRNA疫苗接种与检查点阻断的组合增强了抗原特异性CD8+T细胞的诱导和治疗性抗肿瘤活性
已经表明与单独的modRNA相比，modRNA疫苗接种与CPI的组合能够提供改善的抗肿瘤活性(参见实施例5)，接下来研究了添加关键的T细胞细胞因子IL-2是否可进一步促进抗原特异性CD8+T细胞免疫和治疗性抗肿瘤活性。
将C57BL/6小鼠(每组n＝7)用20μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种三次(第0、7和14天)，并用10mg/kg抗PD-1抗体或同种型对照IP以及3μg IL-2或白蛋白对照IV进行处理，同时进行第二次和第三次疫苗接种。对照小鼠接受NaCl。第三次疫苗接种之后5天(第19天)，通过流式细胞术分析血液和脾中的抗原特异性CD8+T细胞(参见实施例2)。
用modRNA与抗PD-1抗体的组合进行疫苗接种在三次疫苗接种之后在血液中的总CD8+T细胞中诱导了平均分数为6％的抗原特异性CD8+T细胞(第19天；图4a，左)。向该组合添加IL-2将抗原特异性CD8+T细胞的分数提高至平均45％。类似地，在脾中，由modRNA疫苗接种和抗PD-1抗体诱导的9％的抗原特异性CD8+T细胞的平均分数提高了约5倍，达到41％(图4a，右)。
与modRNA疫苗接种和抗PD-1相比，对三重组合的应答的强烈扩大导致抗原特异性CD8+T细胞与T调节性T细胞的比率从1.6大幅提高到6.4(图4b)。
令人感兴趣的是，与modRNA疫苗接种和抗PD-1的双重组合相比，IL-2的添加扩大了用同源肽离体再刺激时总CD8+T细胞中IFNγ分泌抗原特异性CD8+T细胞的分数(图4c)。
这些发现表明三重组合在产生功能性(自身)抗原特异性CD8+T细胞方面具有优势。
接下来，确定这些作用是否将转化为改善的治疗性抗肿瘤活性。
将C57BL/6小鼠(每组n＝10)用B16-F10肿瘤细胞SC进行接种，并在肿瘤接种之后第8天开始直至第91天每周用10μg由编码与人TRP2的MHC II类呈递表位TRP88-102(RKFFHRTCKCTGNFA)融合的TRP2180-188(SVYDFFVWL)的modRNA组成的RNA-LPX IV进行疫苗接种。将小鼠同时用抗PD-L1抗体IP进行处理(首次处理：10mg/kg，连续处理：5mg/kg)，并在每次疫苗接种/抗PD-L1处理之后两天用1μg IL-2或白蛋白对照IV进行处理。如实施例2)中所述监测肿瘤生长。
用modRNA进行疫苗接种与抗PD-L1抗体处理组合导致部分小鼠肿瘤生长延迟以及一次完全应答(图5a)。相比之下，向双重组合添加IL-2将完全应答的数量提高到3，并将总存活率从10％提高到30％(图5b)。
引人注目的是，包含IL-2的三重组合导致进展性白癜风，因为治疗诱导的自身反应性CD8+T细胞不仅杀伤表达TRP2的肿瘤细胞，还杀伤表达TRP2的健康黑色素细胞(图5c)。在没有IL-2的情况下，用modRNA疫苗接种与抗PD-L1治疗的双重组合没有观察到白癜风。
自体免疫的诱导令人印象深刻地表明了三重组合能够破坏T细胞针对自身抗原的耐受性，并使治疗诱导的抗原特异性CD8+T细胞的强度和细胞毒性效力可视化。

Claims (90)

1.用于在对象中诱导免疫应答的方法，其包括：
(i)向所述对象施用编码包含用于在所述对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；以及
(ii)向所述对象提供PD-1轴结合拮抗剂。
2.权利要求1所述的方法，其中所述对象患有与抗原的表达或升高表达相关的疾病、障碍或病症。
3.用于治疗患有与抗原的表达或升高表达相关的疾病、障碍或病症的对象的方法，其包括：
(i)向所述对象施用编码包含用于在所述对象中诱导针对所述抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；以及
(ii)向所述对象提供PD-1轴结合拮抗剂。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述免疫应答是T细胞介导的免疫应答。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述免疫应答包含抗原特异性T细胞的产生。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗原为肿瘤相关抗原。
7.权利要求2至6中任一项所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症为癌症。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用：
(i)所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；和
(ii)PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其包括向所述对象施用：
(i)所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；和
(ii)PD-1轴结合拮抗剂。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中与标准RNA相比，所述非免疫原性RNA在施用时导致降低的树突细胞活化、T细胞活化和/或IFN-α分泌。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中通过并入经修饰核苷和/或除去双链RNA(dsRNA)使所述非免疫原性RNA无免疫原性。
12.权利要求11所述的方法，其中所述经修饰核苷抑制RNA介导的先天免疫受体的激活。
13.权利要求11或12所述的方法，其中所述经修饰核苷包含将一个或更多个尿苷替代为包含经修饰核碱基的核苷。
14.权利要求13所述的方法，其中所述经修饰核碱基是经修饰的尿嘧啶。
15.权利要求13或14所述的方法，其中所述包含经修饰核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
16.权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
17.权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是1-甲基-假尿苷。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是mRNA。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是体外转录的RNA。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以用于靶向淋巴系统的制剂施用，所述淋巴系统例如次级淋巴器官，尤其是脾。
21.权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以用于靶向树突细胞的制剂施用。
22.权利要求21所述的方法，其中所述树突细胞是未成熟树突细胞。
23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以包含脂质复合物(LPX)颗粒的制剂施用。
24.权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂包含PD-1结合拮抗剂。
25.权利要求24所述的方法，其中所述PD-1结合拮抗剂包含抗PD-1抗体。
26.权利要求25所述的方法，其中所述抗PD-1抗体包含纳武单抗或派姆单抗。
27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述PD-1轴结合拮抗剂包含PD-L1结合拮抗剂。
28.权利要求27所述的方法，其中所述PD-L1结合拮抗剂包含抗PD-L1抗体。
29.权利要求28所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗、阿维单抗或度伐单抗。
30.权利要求1至29中任一项所述的方法，其不包括施用免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA。
31.权利要求30所述的方法，其中所述免疫刺激剂是促炎或抗炎免疫刺激剂。
32.权利要求30或31所述的方法，其中所述免疫刺激剂包含细胞因子或其变体。
33.权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子包含I型干扰素或其变体。
34.权利要求33所述的方法，其中所述I型干扰素包含干扰素-α或其变体。
35.权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子包含白介素或其变体。
36.权利要求32或35所述的方法，其中所述细胞因子支持T细胞致敏。
37.权利要求32、35和36中任一项所述的方法，其中所述细胞因子包含IL12、IL15或其变体。
38.权利要求32或35所述的方法，其中所述细胞因子支持T细胞增殖和/或维持。
39.权利要求32、35和38中任一项所述的方法，其中所述细胞因子包含IL2、IL7或其变体。
40.权利要求8至39中任一项所述的方法，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA和所述PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA以共同或单独的制剂施用。
41.权利要求1至40中任一项所述的方法，其为用于在对象中治疗或预防癌症的方法。
42.权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA在所述对象的细胞中瞬时表达。
43.权利要求1至42中任一项所述的方法，其中所述对象为人。
44.药物制剂，其包含：
(i)编码包含用于在对象中诱导针对抗原的免疫应答的表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；和
(ii)PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
45.权利要求44所述的药物制剂，其用于治疗与抗原的表达或升高表达相关的疾病、障碍或病症。
46.权利要求44或45所述的药物制剂，其中所述免疫应答为T细胞介导的免疫应答。
47.权利要求44至46中任一项所述的药物制剂，其中所述免疫应答包含抗原特异性T细胞的产生。
48.权利要求44至47中任一项所述的药物制剂，其中所述抗原为肿瘤相关抗原。
49.权利要求45至48中任一项所述的药物制剂，其中所述疾病、障碍或病症为癌症。
50.权利要求44至49中任一项所述的药物制剂，其包含：
(i)编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA；和
(ii)PD-1轴结合拮抗剂。
51.权利要求44至50中任一项所述的药物制剂，其中与标准RNA相比，所述非免疫原性RNA在施用时导致降低的树突细胞活化、T细胞活化和/或IFN-α分泌。
52.权利要求44至51中任一项所述的药物制剂，其中通过并入经修饰核苷和/或除去dsRNA使所述非免疫原性RNA无免疫原性。
53.权利要求52所述的药物制剂，其中所述经修饰核苷抑制RNA介导的先天免疫受体的激活。
54.权利要求52或53所述的药物制剂，其中所述经修饰核苷包含将一个或更多个尿苷替代为包含经修饰核碱基的核苷。
55.权利要求54所述的药物制剂，其中所述经修饰核碱基是经修饰的尿嘧啶。
56.权利要求54或55所述的药物制剂，其中所述包含经修饰核碱基的核苷选自3-甲基-尿苷(m3U)、5-甲氧基-尿苷(mo5U)、5-氮杂-尿苷、6-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代-尿苷(s2U)、4-硫代-尿苷(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿苷(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿苷、5-卤代-尿苷(例如，5-碘代-尿苷或5-溴代-尿苷)、尿苷5-羟乙酸(cmo5U)、尿苷5-羟乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧基甲基-尿苷(cm5U)、1-羧基甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿苷(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿苷甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿苷(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿苷(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿苷(mnm5U)、1-乙基-假尿苷、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿苷(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿苷(ncm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-尿苷(cmnm5U)、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代-尿苷(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷(τm5s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-2-硫代-尿苷(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿苷、5-甲基-二氢尿苷(m5D)、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿苷(inm5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿苷(inm5s2U)、α-硫代-尿苷、2’-O-甲基-尿苷(Um)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2’-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧基甲基氨基甲基-2’-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿苷、脱氧胸苷、2’-F-阿糖-尿苷、2’-F-尿苷、2’-OH-阿糖-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)尿苷。
57.权利要求54至56中任一项所述的药物制剂，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是假尿苷(ψ)、N1-甲基-假尿苷(m1ψ)或5-甲基-尿苷(m5U)。
58.权利要求54至57中任一项所述的药物制剂，其中所述包含经修饰核碱基的核苷是1-甲基-假尿苷。
59.权利要求44至58中任一项所述的药物制剂，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是mRNA。
60.权利要求44至59中任一项所述的药物制剂，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA是体外转录的RNA。
61.权利要求44至60中任一项所述的药物制剂，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA存在于用于靶向淋巴系统的制剂中，所述淋巴系统例如次级淋巴器官，尤其是脾。
62.权利要求44至61中任一项所述的药物制剂，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA存在于用于靶向树突细胞的制剂中。
63.权利要求62所述的药物制剂，其中所述树突细胞为未成熟树突细胞。
64.权利要求44至63中任一项所述的药物制剂，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA以包含脂质复合物(LPX)颗粒的制剂施用。
65.权利要求44至64中任一项所述的药物制剂，其中所述PD-1轴结合拮抗剂包含PD-1结合拮抗剂。
66.权利要求65所述的药物制剂，其中所述PD-1结合拮抗剂包含抗PD-1抗体。
67.权利要求66所述的药物制剂，其中所述抗PD-1抗体包含纳武单抗或派姆单抗。
68.权利要求44至67中任一项所述的药物制剂，其中所述PD-1轴结合拮抗剂包含PD-L1结合拮抗剂。
69.权利要求68所述的药物制剂，其中所述PD-L1结合拮抗剂包含抗PD-L1抗体。
70.权利要求69所述的药物制剂，其中所述抗PD-L1抗体包含阿特珠单抗、阿维单抗或度伐单抗。
71.权利要求44至70中任一项所述的药物制剂，其不包含免疫刺激剂或编码免疫刺激剂的RNA。
72.权利要求71所述的药物制剂，其中所述免疫刺激剂为促炎或抗炎免疫刺激剂。
73.权利要求71或72所述的药物制剂，其中所述免疫刺激剂包含细胞因子或其变体。
74.权利要求73所述的药物制剂，其中所述细胞因子包含I型干扰素或其变体。
75.权利要求74所述的药物制剂，其中所述I型干扰素包含干扰素-α或其变体。
76.权利要求73所述的药物制剂，其中所述细胞因子包含白介素或其变体。
77.权利要求73或76所述的药物制剂，其中所述细胞因子支持T细胞致敏。
78.权利要求73、76和77中任一项所述的药物制剂，其中所述细胞因子包含IL12、IL15或其变体。
79.权利要求73或76所述的药物制剂，其中所述细胞因子支持T细胞增殖和/或维持。
80.权利要求73、76和79中任一项所述的药物制剂，其中所述细胞因子包含IL2、IL7或其变体。
81.权利要求44至80中任一项所述的药物制剂，其中所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA和所述PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA存在于共同或单独的制剂中。
82.权利要求44至81中任一项所述的药物制剂，其为药盒。
83.权利要求44至82中任一项所述的药物制剂，其包含在药物组合物中的所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA和所述PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
84.权利要求44至83中任一项所述的药物制剂，其包含在单独容器中的所述编码包含表位的肽或多肽的非免疫原性RNA和所述PD-1轴结合拮抗剂或编码PD-1轴结合拮抗剂的RNA。
85.权利要求44至84中任一项所述的药物制剂，其还包含使用所述药物制剂的说明书。
86.权利要求44至81中任一项所述的药物制剂，其为药物组合物。
87.权利要求44至86中任一项所述的药物制剂，其用于药物用途。
88.权利要求87所述的药物制剂，其中所述药物用途包括疾病或病症的治疗性或预防性治疗。
89.权利要求88所述的药物制剂，其中所述疾病或病症为癌症。
90.权利要求44至89中任一项所述的药物制剂，其用于权利要求1至43中任一项所述的方法。
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Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
CA2383424C (en) 1999-08-23 2011-02-15 Gordon Freeman Novel b7-4 molecules and uses therefor
EP2360254A1 (en) 1999-08-23 2011-08-24 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Assays for screening anti-pd-1 antibodies and uses thereof
AU784634B2 (en) 1999-11-30 2006-05-18 Mayo Foundation For Medical Education And Research B7-H1, a novel immunoregulatory molecule
US20050287153A1 (en) 2002-06-28 2005-12-29 Genentech, Inc. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
US7176278B2 (en) 2001-08-30 2007-02-13 Biorexis Technology, Inc. Modified transferrin fusion proteins
JP4488740B2 (ja) 2001-11-13 2010-06-23 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート，インコーポレイテッド 免疫細胞活性化を調節する作用剤およびその使用方法
IL149820A0 (en) 2002-05-23 2002-11-10 Curetech Ltd Humanized immunomodulatory monoclonal antibodies for the treatment of neoplastic disease or immunodeficiency
US7696320B2 (en) 2004-08-24 2010-04-13 Domantis Limited Ligands that have binding specificity for VEGF and/or EGFR and methods of use therefor
ES2551682T3 (es) 2002-11-08 2015-11-23 Ablynx N.V. Anticuerpos de dominio simple dirigidos contra factor de necrosis tumoral-alfa y usos para los mismos
CN101899114A (zh) 2002-12-23 2010-12-01 惠氏公司 抗pd-1抗体及其用途
EP1729795B1 (en) 2004-02-09 2016-02-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CN117534755A (zh) 2005-05-09 2024-02-09 小野药品工业株式会社 程序性死亡-1(pd-1)的人单克隆抗体及使用抗pd-1抗体来治疗癌症的方法
KR101888321B1 (ko) 2005-07-01 2018-08-13 이. 알. 스퀴부 앤드 선즈, 엘.엘.씨. 예정 사멸 리간드 1 (피디-엘1)에 대한 인간 모노클로날 항체
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
KR101193722B1 (ko) 2006-07-24 2013-01-11 바이오렉시스 파마슈티칼 코포레이션 엑센딘 융합 단백질
WO2008028977A2 (en) 2006-09-08 2008-03-13 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
NZ600758A (en) 2007-06-18 2013-09-27 Merck Sharp & Dohme Antibodies to human programmed death receptor pd-1
US20090028857A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 Cell Genesys, Inc. Pd-1 antibodies in combination with a cytokine-secreting cell and methods of use thereof
BRPI0821924A2 (pt) 2007-12-27 2015-07-07 Novartis Ag Moléculas de ligação baseadas em fibronectina melhoradas e seu uso
CN104548091A (zh) 2008-02-11 2015-04-29 治疗科技公司 用于肿瘤治疗的单克隆抗体
US8168757B2 (en) 2008-03-12 2012-05-01 Merck Sharp & Dohme Corp. PD-1 binding proteins
KR101464572B1 (ko) 2008-03-20 2014-11-24 인스티튜트 퓌어 룬트퐁크테크닉 게엠베하 작은 스크린 크기들에 대해 비디오 이미지들을 적응시키는 방법
EP2274331B1 (en) 2008-05-02 2013-11-06 Novartis AG Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof
US7980189B2 (en) 2008-07-31 2011-07-19 Raytheon Company Methods and apparatus for a scuttle mechanism
JP2012510429A (ja) 2008-08-25 2012-05-10 アンプリミューン、インコーポレーテッド Ｐｄ−１アンタゴニストおよびその使用方法
US8552154B2 (en) 2008-09-26 2013-10-08 Emory University Anti-PD-L1 antibodies and uses therefor
CN102245640B (zh) 2008-12-09 2014-12-31 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pd-l1抗体及它们用于增强t细胞功能的用途
ES2629337T3 (es) 2009-02-09 2017-08-08 Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale Anticuerpos contra PD-1 y anticuerpos contra PD-L1 y usos de los mismos
US20130017199A1 (en) 2009-11-24 2013-01-17 AMPLIMMUNE ,Inc. a corporation Simultaneous inhibition of pd-l1/pd-l2
MX359551B (es) 2009-11-24 2018-10-02 Medimmune Ltd Agentes de union diana contra b7-h1.
US20130022629A1 (en) 2010-01-04 2013-01-24 Sharpe Arlene H Modulators of Immunoinhibitory Receptor PD-1, and Methods of Use Thereof
JP5969458B2 (ja) 2010-04-09 2016-08-17 アルブミディクス アクティーゼルスカブ アルブミン誘導体及び変異体
BR112012026216B1 (pt) 2010-04-13 2022-07-26 Bristol-Myers Squibb Company Proteínas com domínio "scaffold" baseado em fibronectina que se ligam à pcsk9, seu uso, bem como composição farmacêutica compreendendo as mesmas
CA2802344C (en) 2010-06-18 2023-06-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Bi-specific antibodies against tim-3 and pd-1 for immunotherapy in chronic immune conditions
US8907053B2 (en) 2010-06-25 2014-12-09 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunosuppression modulating compounds
EP2699264B1 (en) 2011-04-20 2018-03-14 Medlmmune, LLC Antibodies and other molecules that bind b7-h1 and pd-1
WO2012168944A1 (en) 2011-06-08 2012-12-13 Aurigene Discovery Technologies Limited Therapeutic compounds for immunomodulation
TW202114735A (zh) 2011-08-01 2021-04-16 美商建南德克公司 利用pd-1軸結合拮抗劑及mek抑制劑治療癌症之方法
JP2014529997A (ja) 2011-09-23 2014-11-17 ウニヴェルズィテート シュトゥットガルト 免疫グロブリン結合ドメインを使った血清中半減期延長
WO2013075066A2 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Proteins with improved half-life and other properties
PT2785375T (pt) 2011-11-28 2020-10-29 Merck Patent Gmbh Anticorpos anti-pd-l1 e usos destes
EP2822957A1 (en) 2012-03-07 2015-01-14 Aurigene Discovery Technologies Limited Peptidomimetic compounds as immunomodulators
WO2013143555A1 (en) 2012-03-26 2013-10-03 Biontech Ag Rna formulation for immunotherapy
US9422339B2 (en) 2012-03-29 2016-08-23 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunomodulating cyclic compounds
SG11201407190TA (en) 2012-05-15 2014-12-30 Bristol Myers Squibb Co Cancer immunotherapy by disrupting pd-1/pd-l1 signaling
BR112014029887A8 (pt) 2012-05-31 2021-09-14 Genentech Inc Método para tratar ou retardar a progressão do câncer, kits e uso de um antagonista de ligação do eixo pd-1, oxaliplatina, leucovorina e 5-fu
BR112014029883B1 (pt) 2012-05-31 2023-10-24 Sorrento Therapeutics Inc. Anticorpo recombinante anti-pd-l1 e uso de um anticorpo recombinante anti-pd-l1
SG11201502496WA (en) 2012-10-02 2015-04-29 Bristol Myers Squibb Co Combination of anti-kir antibodies and anti-pd-1 antibodies to treat cancer
AR093984A1 (es) 2012-12-21 2015-07-01 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos que se unen a ligando 1 de muerte programada (pd-l1) humano
WO2014165082A2 (en) 2013-03-13 2014-10-09 Medimmune, Llc Antibodies and methods of detection
EP2970473B1 (en) 2013-03-14 2017-08-16 Bristol-Myers Squibb Company Combination of dr5 agonist and anti-pd-1 antagonist and methods of use
JP6742903B2 (ja) 2013-05-02 2020-08-19 アナプティスバイオ インコーポレイティッド プログラム死−１（ｐｄ−１）に対する抗体
CA3175360C (en) 2013-05-31 2024-05-28 Sorrento Therapeutics, Inc. Antigen binding proteins that bind pd-1
CN104250302B (zh) 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
PT3041468T (pt) 2013-09-06 2018-09-28 Aurigene Discovery Tech Ltd Compostos peptidomiméticos cíclicos como imunomoduladores
WO2015036927A1 (en) 2013-09-10 2015-03-19 Aurigene Discovery Technologies Limited Immunomodulating peptidomimetic derivatives
SI3702373T1 (sl) 2013-09-13 2022-11-30 Beigene Switzerland Gmbh Protitelesa proti PD-1 in njihova uporaba kot terapevtiki in diagnostiki
WO2015044900A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Aurigene Discovery Technologies Limited Therapeutic immunomodulating compounds
EP3060581A4 (en) 2013-10-25 2017-06-07 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Anti-pd-l1 monoclonal antibodies and fragments thereof
EA035037B1 (ru) 2013-12-12 2020-04-21 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
DK3094351T3 (da) 2014-01-15 2022-02-21 Kadmon Corp Llc Immunmodulatoriske midler
TWI680138B (zh) 2014-01-23 2019-12-21 美商再生元醫藥公司 抗ｐｄ-ｌ１之人類抗體
TWI681969B (zh) 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
KR20220162844A (ko) 2014-05-13 2022-12-08 메디뮨 리미티드 비-소세포 폐암을 치료하기 위한 항-ｂ7-ｈ1 및 항-ｃｔｌａ-4 항체
US10302653B2 (en) 2014-05-22 2019-05-28 Mayo Foundation For Medical Education And Research Distinguishing antagonistic and agonistic anti B7-H1 antibodies
DK3149042T3 (da) 2014-05-29 2019-11-04 Spring Bioscience Corp PD-L1-antistoffer og anvendelser deraf
KR102003754B1 (ko) 2014-07-03 2019-07-25 베이진 엘티디 Pd-l1 항체와 이를 이용한 치료 및 진단
WO2016005004A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stabilization of poly(a) sequence encoding dna sequences
KR102360693B1 (ko) 2014-07-11 2022-02-08 벤타나 메디컬 시스템즈, 인코포레이티드 항-pd-l1 항체 및 이의 진단 용도
CN118388646A (zh) 2014-08-05 2024-07-26 中美冠科生物技术（太仓）有限公司 抗pd-l1抗体
PE20171067A1 (es) 2014-10-14 2017-07-24 Novartis Ag Moleculas de anticuerpo que se unen a pd-l1 y usos de las mismas
TWI595006B (zh) 2014-12-09 2017-08-11 禮納特神經系統科學公司 抗ｐｄ－１抗體類和使用彼等之方法
GB201500319D0 (en) 2015-01-09 2015-02-25 Agency Science Tech & Res Anti-PD-L1 antibodies
CN114702586A (zh) 2015-03-13 2022-07-05 西托姆克斯治疗公司 抗-pdl1抗体、可活化的抗-pdl1抗体、及其使用方法
EP3277320A4 (en) 2015-03-30 2018-08-01 Stcube, Inc. Antibodies specific to glycosylated pd-l1 and methods of use thereof
WO2016197367A1 (en) 2015-06-11 2016-12-15 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel anti-pd-l1 antibodies
SG10201906059VA (en) 2015-07-30 2019-08-27 Macrogenics Inc Pd-1-binding molecules and methods of use thereof
CN106397592A (zh) 2015-07-31 2017-02-15 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对程序性死亡配体(pd-l1)的单域抗体及其衍生蛋白
WO2017020291A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 Wuxi Biologics (Shanghai) Co. Ltd. Novel anti-pd-l1 antibodies
WO2017024465A1 (en) 2015-08-10 2017-02-16 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
AR105654A1 (es) 2015-08-24 2017-10-25 Lilly Co Eli Anticuerpos pd-l1 (ligando 1 de muerte celular programada)
EP4029522A1 (en) * 2015-08-28 2022-07-20 BioNTech SE Method for reducing immunogenicity of rna
PE20181322A1 (es) 2015-09-01 2018-08-14 Agenus Inc Anticuerpo anti-pd1 y sus metodos de uso
WO2017059902A1 (en) 2015-10-07 2017-04-13 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh 3' utr sequences for stabilization of rna
CN113636947A (zh) 2015-10-28 2021-11-12 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
WO2018081480A1 (en) 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
WO2017132827A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Pd-1 antibodies
CN111491361B (zh) 2016-02-02 2023-10-24 华为技术有限公司 确定发射功率的方法、用户设备和基站
MX2018012880A (es) 2016-04-22 2019-03-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Metodos para proporcionar arn de hebra sencilla.
CN109071656B (zh) 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂
BR112019014314A2 (pt) * 2017-01-11 2020-02-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Composição, e, método de indução de uma resposta imune adaptativa contra vírus zika.
KR20200010500A (ko) 2017-05-30 2020-01-30 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 항-lag-3 항체, pd-1 경로 억제제, 및 면역요법제의 조합을 포함하는 조성물
AU2019219200A1 (en) * 2018-02-12 2020-08-06 BioNTech SE Treatment using cytokine encoding RNA

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