JP2023549266A - Ｒｎａを含むｌｎｐ組成物ならびにそれを調製、貯蔵および使用する方法 - Google Patents

Ｒｎａを含むｌｎｐ組成物ならびにそれを調製、貯蔵および使用する方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、一般にＲＮＡを含む脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)組成物、そのような組成物を調製および貯蔵する方法ならびに治療におけるそのような組成物の使用の分野に関する。

Description

技術分野
本発明は、一般にＲＮＡを含む脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)組成物、そのような組成物を調製および貯蔵する方法ならびに治療におけるそのような組成物の使用の分野に関する。
背景
標的細胞に外来遺伝情報を送達するための組み換え核酸(例えばＤＮＡまたはＲＮＡ)の使用は周知である。ＲＮＡを使用する利点は、一過性発現および非形質転換特徴を含む。ＲＮＡは、発現されるのに核に入る必要がなく、さらに宿主ゲノムに統合され得ず、それ故に発癌などの多様なリスクを排除する。
組み換え核酸は、裸の形態でそれを必要とする対象に投与し得る；しかしながら、通常組み換え核酸は組成物を使用して投与される。例えば、ＲＮＡは、ＲＮＡおよびナノ粒子形成媒体、例えば、カチオン性脂質(例えば永久帯電カチオン性脂質)、カチオン性脂質と１以上の付加的脂質の混合物またはカチオン性ポリマーを含む、いわゆるナノ粒子製剤により送達され得る。このようなナノ粒子製剤の運命は、多様な鍵となる因子(例えば、ナノ粒子のサイズおよびサイズ分布など)により制御される。これらの因子は、例えば、２０１８年からＦＤＡ「リポソーム医薬品ガイダンス」で分析および特定すべき特別な属性として称されている。現在のナノ粒子製剤の臨床応用への制限は、均質、純粋かつ十分に特徴づけられたナノ粒子製剤がないことによるものであり得る。
イオン化可能脂質を含むＬＮＰは、他のＲＮＡナノ粒子産物と比較して、ターゲティングおよび有効性の点で利点を示し得る。しかしながら、通常の医薬用途で必要な十分なシェルフライフを得ることは困難である。安定化のために、イオン化可能脂質を含むＬＮＰは、コールドチェーンに相当な負荷を課す－８０℃などのはるかに低い温度で凍結される必要があるかまたは限定的な安定性しか得られない凍結温度より上の温度、例えば５℃でしか貯蔵できない。
溶液またはＬＮＰ中のＲＮＡは、ゆっくりした断片化を受けることが知られている。さらに、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)存在下、ＲＮＡは、翻訳にほとんど利用できない極めて安定な折り畳み形態を採用する傾向にある。両機構、すなわち、断片化およびこの安定なＲＮＡ折り畳みの形成は温度依存的であり、インタクトかつ利用可能なＲＮＡ喪失をもたらし、それにより、液体製品の安定性を限定する；しかしながら、それらは凍結状態では本質的に存在しない。
故に、(ｉ)イオン化可能脂質およびＲＮＡを含むＬＮＰを含み、安定であり、薬務における通常のテクノロジーに準拠した温度範囲、特に約－２５℃の温度または液体形態で＋２～＋２０℃の温度で貯蔵できる組成物；(ii)使用準備済(ready to use)である組成物；(iii)好ましくは、繰り返し凍結および解凍できる組成物；および(iv)そのような組成物を調製および貯蔵する方法が当分野でなお必要とされる。本発明はこれらおよびその他必要性に取り組む。
本発明者らは、驚くべきことにここに記載する組成物および方法が、上記要求を満たすことを発見した。特に、特定の緩衝物質、特にトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Ｔｒｉｓ)およびそのプロトン化形態を低濃度(例えば、最大約２５mM)で使用し、無機リン酸アニオンならびにクエン酸アニオンおよびＥＤＴＡのアニオンを除外することにより、安定かつ約－２５℃でまたは液体形態で貯蔵できる組成物を調製することが可能であることが示された。
概要
第一の態様において、本発明は、水相に分散された脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)を含む組成物であって、ここで、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；水相がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態、ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－Ｔｒｉｓ－メタン)およびそのプロトン化形態およびトリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態からなる群から選択される緩衝物質を含む緩衝系ならびに塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸(ＭＥＳ)のアニオン、３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)のアニオンおよび２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)のアニオンからなる群から選択される１価アニオンを含み；組成物における緩衝物質の濃度は最大約２５mMであり；そして水相は無機リン酸アニオンを実質的に含まず、クエン酸アニオンを実質的に含まずかつエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のアニオンを実質的に含まない、組成物を提供する。
本出願において示されるとおり、ＬＮＰを含む組成物においてＰＢＳの代わりに、上に特定した特定の緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態に基づく緩衝系を使用することにより、ＲＮＡの極めて安定な折り畳み形態の形成が阻害する。さらに、本出願は、驚くべきことに、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含むものである、ＬＮＰおよび緩衝系を含む組成物における緩衝物質の濃度を単に下げることにより、同じ緩衝物質を５０mMの濃度で含む組成物と比較して、凍結－解凍－サイクル後のＲＮＡ完全性が改善したＲＮＡ ＬＮＰ組成物を得ることが可能である。故に、ここに請求する組成物は、安定性を改善し、薬務における通常のテクノロジーに準拠した温度範囲で貯蔵できる、使用準備済組成物を提供する。
第一の態様の好ましい実施態様において、緩衝物質は、Ｔｒｉｓおよびそのプロトン化形態、すなわち、Ｔｒｉｓとそのプロトン化形態の混合物である。
ある実施態様において、１価アニオンは、塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸からなる群または塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸からなる群、好ましくは塩化物、酢酸、乳酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群、より好ましくは塩化物、酢酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群または塩化物、酢酸および乳酸からなる群から選択され、例えば、塩化物または酢酸である。
ある実施態様において、緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり、１価アニオンは、塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸からなる群または塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸からなる群、好ましくは塩化物、酢酸、乳酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群、より好ましくは塩化物、酢酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群または塩化物、酢酸および乳酸からなる群から選択され、例えば、塩化物または酢酸である。
第一の態様のある実施態様において、組成物中の緩衝物質の濃度、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の総濃度は、最大約２０mM、例えば最大約１９mM、最大約１８mM、最大約１７mM、最大約１６mM、最大約１５mM、最大約１４mM、最大約１３mM、最大約１２mM、最大約１１mMまたは最大約１０mMである。ある実施態様において、組成物中の緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の下限は、少なくとも約１mM、好ましくは少なくとも約２mM、例えば少なくとも約３mM、少なくとも約４mM、少なくとも約５mM、少なくとも約６mM、少なくとも約７mM、少なくとも約８mMまたは少なくとも約９mMである。例えば、組成物中の緩衝物質の濃度、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の総濃度は、約１mM～約２０mM、例えば約２mM～約１５mM、約５mM～約１４mM、約７mM～約１３mM、約８mM～約１２mM、約９mM～約１１mM、例えば約１０mMであり得る。
第一の態様のある実施態様において、水相は無機硫酸アニオンおよび／または炭酸アニオンおよび／または二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第一のサブグループにおいて、これらの基準の少なくとも１個が適用される。例えば、この第一のサブグループのある実施態様において、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まない。この第一のサブグループのさらなる実施態様において、水相は炭酸アニオンを実質的に含まない。この第一のサブグループのさらなる実施態様において、水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第一のサブグループのさらなる実施態様において、水相は多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第一の態様の第二のサブグループにおいて、上記の少なくとも２個が適用される。例えば、この第二のサブグループのある実施態様において、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ炭酸アニオンを実質的に含まない。この第二のサブグループのさらなる実施態様において、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第二のサブグループのさらなる実施態様において、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第二のサブグループのさらなる実施態様において、水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第二のサブグループのさらなる実施態様において、水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第二のサブグループのさらなる実施態様において、水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第一の態様の第三のサブグループにおいて、上記の少なくとも３個が適用される。例えば、この第三のサブグループのある実施態様において、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第三のサブグループのさらなる実施態様において、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第三のサブグループのさらなる実施態様において、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。この第三のサブグループのさらなる実施態様において、水相は炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第一の態様の第四のサブグループにおいて、上記の少なくとも４個が適用される。すなわち、この第四のサブグループにおいて、水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第一の態様のある実施態様において(特に第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物は、凍結保護剤を含む。第一の態様の別の実施態様において(特に第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物は凍結保護剤を実質的に含まない。故に、これら実施態様の具体例は次のとおりである：
(１)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(２)水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(３)水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(４)水相は多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(５)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ炭酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(６)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(７)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(８)水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(９)水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(１０)水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(１１)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(１２)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(１３)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(１４)水相は炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(１５)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を含む；
(１６)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(１７)水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(１８)水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(１９)水相は多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２０)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ炭酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２１)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２２)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２３)水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２４)水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２５)水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２６)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２７)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２８)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２９)水相は炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(３０)水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ組成物は凍結保護剤を実質的に含まない。
組成物が凍結保護剤を含む第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、該凍結保護剤は炭水化物および糖アルコールからなる群から選択される１以上の化合物を含む。例えば、凍結保護剤はスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。第一の態様の好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物は、スクロースおよび／またはグリセロールを凍結保護剤として含む。
組成物が凍結保護剤を含む第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物中の凍結保護剤の濃度は、少なくとも１％ｗ／ｖ、例えば少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖまたは少なくとも９％ｗ／ｖである。ある実施態様において、組成物中の凍結保護剤の濃度は、最大２５％ｗ／ｖ、例えば最大２０％ｗ／ｖ、最大１９％ｗ／ｖ、最大１８％ｗ／ｖ、最大１７％ｗ／ｖ、最大１６％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大１４％ｗ／ｖ、最大１３％ｗ／ｖ、最大１２％ｗ／ｖまたは最大１１％ｗ／ｖである。ある実施態様において、組成物中の凍結保護剤の濃度は、１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖ～１９％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖである。第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物は、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、例えば６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖまたは９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖの濃度または約１０％ｗ／ｖの濃度で凍結保護剤(特に、スクロースおよび／またはグリセロール)を含む。
組成物が凍結保護剤を含む第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、凍結保護剤は、組成物の総重量に基づき、組成物に約５０×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg(例えば、約５０×１０－３osmol／kg～約３９０×１０－３osmol／kg、約６０×１０－３osmol／kg～約３８０×１０－３osmol／kg、約７０×１０－３osmol／kg～約３７０×１０－３osmol／kg、約８０×１０－３osmol／kg～約３６０×１０－３osmol／kg、約９０×１０－３osmol／kg～約３５０×１０－３osmol／kg、約１００×１０－３osmol／kg～約３４０×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約３３０×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約３２０×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約３１０×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kg)の範囲のオスモル濃度をもたらす濃度で存在する。
緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、特に第一の態様の実施態様において、１価アニオンは塩化物、酢酸、グリコール酸および乳酸からなる群から選択され、組成物中の１価アニオン(特に全１価アニオンの総濃度)の濃度は、最大組成物における緩衝物質の濃度に等しい。例えば、組成物中の１価アニオン(特に全１価アニオンの総濃度)の濃度は、組成物における緩衝物質の濃度より低くてよい。故に、組成物中の緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mMである第一の態様の実施態様において、組成物中の１価アニオン(特に全１価アニオンの総濃度)の濃度は最大約２０mMまで、例えば、２０mM未満である。一般に、組成物中の塩化物および／または酢酸(特に全１価アニオンの総濃度)などの１価アニオンの濃度は、約１５mM未満、例えば約１４mM未満、約１３mM未満、約１２mM未満、約１１mM未満、約１０mM未満、約９mM未満、約８mM未満、約７mM未満、約６mM未満または約５mM未満であり得る。ある実施態様において、組成物中の塩化物濃度は上に定義するとおりであり(例えば、約１５mM未満など)、組成物は酢酸を含まない。別の実施態様において、組成物中の酢酸濃度は上に定義するとおりであり(例えば、約１５mM未満など)、組成物は塩化物を含まない。
緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、特に第一の態様の実施態様において、水相および／または組成物中のナトリウム濃度は、２０mM未満、例えば約１５mM未満、例えば、約１４mM未満、約１３mM未満、約１２mM未満、約１１mM未満、約１０mM未満、約９mM未満、約８mM未満、約７mM未満、約６mM未満または約５mM未満である。
緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、特に第一の態様の実施態様において、１価アニオンは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され、組成物中の１価アニオン(特に全１価アニオンの総濃度)の濃度は組成物における緩衝物質の濃度に少なくとも等しい。例えば、組成物中の１価アニオン(特に全１価アニオンの総濃度)の濃度は組成物における緩衝物質の濃度より高くてよい。故に、組成物中の緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mMである第一の態様の実施態様において、組成物中の１価アニオン(特に全１価アニオンの総濃度)の濃度は少なくとも約２０mMに等しく、例えば、２０mMより高い。一般に、組成物中の１価アニオン(特に全１価アニオンの総濃度)の濃度は約２０mM超、例えば約２１mM超、約２２mM超、約２３mM超、約２４mM超、約２５mM超、約２６mM超、約２７mM超、約２８mM超、約２９mM超または約３０mM超および好ましくは最大５０mM、例えば最大４５mM、最大４０mMまたは最大３５mMであり得る。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物のｐＨは約６.５～約８.０である。例えば、組成物のｐＨは、約６.９～約７.９、例えば約７.０～約７.９、約７.１～約７.８、約７.２～約７.７、約７.３～約７.６、約７.４～約７.６または約７.５であり得る。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物は主成分として水を含むおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％未満(ｖ／ｖ)である。例えば、組成物に含まれる水の量は、少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)、少なくとも９０％(ｗ／ｗ)または少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。特に、組成物が凍結保護剤を含むならば、組成物に含まれる水の量は、少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)または少なくとも９０％(ｗ／ｗ)であり得る。組成物が凍結保護剤を実質的に含まないならば、組成物に含まれる水の量は少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は、約１.０％未満(ｖ／ｖ)、例えば約０.９％未満(ｖ／ｖ)、約０.８％未満(ｖ／ｖ)、約０.７％未満(ｖ／ｖ)、約０.６％未満(ｖ／ｖ)、約０.５％未満(ｖ／ｖ)、約０.４％未満(ｖ／ｖ)、約０.３％未満(ｖ／ｖ)、約０.２％未満(ｖ／ｖ)、約０.１％未満(ｖ／ｖ)、約０.０５％未満(ｖ／ｖ)または約０.０１％未満(ｖ／ｖ)であり得る。これに関して、通常の条件下で液体である凍結保護剤は水以外の溶媒ではなく、凍結保護剤として考慮される。換言すると、換言すると組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約１.０％未満(ｖ／ｖ)であり得るとの上記任意の限定は、通常の条件下で液体である凍結保護剤に適用されない。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物のオスモル濃度は、最大約４００×１０－３osmol／kg、例えば最大約３９０×１０－３osmol／kg、最大約３８０×１０－３osmol／kg、最大約３７０×１０－３osmol／kg、最大約３６０×１０－３osmol／kg、最大約３５０×１０－３osmol／kg、最大約３４０×１０－３osmol／kg、最大約３３０×１０－３osmol／kg、最大約３２０×１０－３osmol／kg、最大約３１０×１０－３osmol／kgまたは最大約３００×１０－３osmol／kgである。組成物が凍結保護剤を含まないならば、組成物のオスモル濃度は３００×１０－３osmol／kg未満、例えば最大約２５０×１０－３osmol／kg、最大約２００×１０－３osmol／kg、最大約１５０×１０－３osmol／kg、最大約１００×１０－３osmol／kg、最大約５０×１０－３osmol／kg、最大約４０×１０－３osmol／kgまたは最大約３０×１０－３osmol／kgであり得る。組成物が凍結保護剤を含むならば、組成物のオスモル濃度の主要部分が凍結保護剤により提供されるのが好ましい。例えば、凍結保護剤は、組成物のオスモル濃度の少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％を提供し得る。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物中のＲＮＡの濃度は約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌである。例えば、組成物中のＲＮＡの濃度は、約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、例えば約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌ、約３５mg／ｌ～約１１５mg／ｌ、約４０mg／ｌ～約１１０mg／ｌ、約４５mg／ｌ～約１０５mg／ｌまたは約５０mg／ｌ～約１００mg／ｌであり得る。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり、組成物のｐＨは約６.５～約８.０であり、組成物中のＲＮＡの濃度は約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌである。この実施態様において、組成物のｐＨが約６.９～約７.９であり、組成物中のＲＮＡの濃度が約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであるのが好ましい。ここに請求する組成物の特に好ましい実施態様において、緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり；組成物のｐＨは約６.９～約７.９であり；組成物中のＲＮＡの濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸を実質的に含まず、多塩基性有機酸を実質的に含まず；そして組成物は凍結保護剤を含む。ここに請求する組成物の別の特に好ましい実施態様において、緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり；組成物のｐＨは約６.９～約７.９であり；組成物中のＲＮＡの濃度は約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸を実質的に含まず、多塩基性有機酸を実質的に含まず；そして組成物は凍結保護剤を実質的に含まない。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、カチオン的にイオン化可能な脂質は、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む。例えば、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(Ｉ)：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体の構造を有し得て、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はここに定義するとおりである。好ましくは、カチオン的にイオン化可能な脂質は次のものから選択される：構造Ｉ－１～Ｉ－３６(ここに示す)；および／または構造Ａ～Ｆ(ここに示す)；および／またはＮ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)および４－((ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イル)アミノ)オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－４－オキソブタン－１－アミン(ＤＰＬ－１４)。特に好ましい実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は構造Ｉ－３を有する脂質である。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＬＮＰはさらに１以上の付加的脂質を含む。好ましくは、１以上の付加的脂質は、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。第一の態様の好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＬＮＰは、ここに記載するカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質またはポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)、中性脂質(例えば、ＤＳＰＣ)およびステロイド(例えば、コレステロール)を含む。
ＬＮＰがポリマーコンジュゲート脂質を１以上の付加的脂質の一つとしてさらに含む第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。例えば、ペグ化脂質は次の構造：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体の構造を有し得て、ここで、Ｒ１２、Ｒ１３およびｗはここに定義するとおりである。
ＬＮＰがポリマーコンジュゲート脂質を１以上の付加的脂質の一つとしてさらに含む第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ポリマーコンジュゲート脂質はポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートである。例えば、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートは、ポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーであり得る。
ＬＮＰが１以上の付加的脂質の一つとして中性脂質をさらに含む第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、中性脂質はリン脂質である。このようなリン脂質は好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。リン脂質の特定の例は、ジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルファチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)を含む。特に好ましい実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。
ＬＮＰが１以上の付加的脂質としてステロイドをさらに含む第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ステロイドはコレステロールなどのステロールである。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、水相はキレート剤を含まない。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＬＮＰは、組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％を含む。例えば、ＬＮＰは、組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７６％、例えば少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％を含み得る。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)はＬＮＰに封入されているかまたは結合している。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。例えば、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択され得る。
第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、次の(ａ)キャップ１またはキャップ２構造などの５’キャップ；(ｂ)５’ ＵＴＲ；(ｃ)３’ ＵＴＲ；および(ｄ)少なくとも１００ヌクレオチドを含むポリ－Ａ配列などのポリ－Ａ配列であって、好ましくはＡヌクレオチドの中断された配列であるポリ－Ａ配列の１以上を含む。
第一の態様の好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は１以上のポリペプチドをコードする。例えば、１以上のポリペプチドは、対象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含み得る。好ましい実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。第一の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするＯＲＦを含む。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７と少なくとも８０％同一性を有し得る。
第一の態様の好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物は凍結形態である。好ましくは、凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性は、例えば、－２０℃で貯蔵された凍結組成物を解凍後、少なくとも５０％、例えば少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％または少なくとも６０％である。これに加えてまたはこれとは別に、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))は、組成物が凍結される前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのＰＤＩは、０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、凍結前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＬＮＰのＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
第一の態様の別の好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物は液体形態である。好ましくは、例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、液体組成物のＲＮＡ完全性は、所望の効果を生ずる、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、例えば、液体組成物のＲＮＡ完全性は、少なくとも５０％、例えば少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％または少なくとも６０％であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、液体組成物のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))、例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したときは、所望の効果を生ずる、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、例えば、液体組成物のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))は、最初、すなわち、貯蔵前の組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのＰＤＩは、０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、貯蔵前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
第二の態様において、本発明は、最終水相に分散されたＬＮＰを含む組成物を調製する方法であって、ここで、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；最終水相は最終緩衝物質および最終１価アニオンを含む緩衝系を含み、最終緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態、ビス－Ｔｒｉｓ－メタンおよびそのプロトン化形態およびＴＥＡおよびそのプロトン化形態からなる群から選択され、最終１価アニオンは塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、ＭＥＳのアニオン、ＭＯＰＳのアニオンおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され；組成物中の最終緩衝物質の濃度は最大約２５mMであり；そして最終水相は無機リン酸アニオンを実質的に含まず、クエン酸アニオンを実質的に含まずかつＥＤＴＡのアニオンを実質的に含まず；
(Ｉ)ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含む、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製し；そして
(II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
それにより、組成物を得ることを含み、
ここで、工程(Ｉ)は：
(ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；
(ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質、および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を調製し；
(ｃ)(ａ)の下に調製したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に調製したエタノール性溶液を混合し、それにより、第一緩衝系を含む中間水層に分散されたＬＮＰを含む中間製剤を調製し；そして
(ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液溶液を使用して(ｃ)の下に調製した第一中間製剤を濾過し、
それにより、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製することを含む、方法を提供する。
本出願において示されるとおり、ＬＮＰを含む組成物に、ＰＢＳの代わりに上記の特定の緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態に基づく特定の緩衝系を使用することは、ＲＮＡの極めて安定な折り畳み形態の形成を阻害する。さらに、本出願は、驚くべきことに、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含むものである、ＬＮＰおよび緩衝系を含む組成物における緩衝物質の濃度を単に下げることにより、５０mM濃度で同じ緩衝物質を含む組成物と比較して、凍結／解凍サイクル後のＲＮＡ完全性が改善されたＬＮＰ ＲＮＡ組成物を得ることが可能であることを示す。故に、本願方法により調製された組成物は、安定性の改善を提供し、薬務における通常のテクノロジーに準拠した温度範囲で貯蔵でき、使用準備済製剤を提供する。
第二の態様の特に好ましい実施態様において、最終緩衝物質は、Ｔｒｉｓおよびそのプロトン化形態、すなわち、Ｔｒｉｓとそのプロトン化形態の混合物である。
第二の態様のある実施態様において、最終１価アニオンは、塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸からなる群または塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸からなる群、好ましくは塩化物、酢酸、乳酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群、より好ましくは塩化物、酢酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群または塩化物、酢酸および乳酸からなる群から選択され、例えば、塩化物または酢酸である。
第二の態様のある実施態様において、最終緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり、最終１価アニオンは、塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸からなる群または塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸および２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸からなる群、好ましくは塩化物、酢酸、乳酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群、より好ましくは塩化物、酢酸、乳酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群、より好ましくは塩化物、酢酸およびモルホリノエタンスルホン酸からなる群、例えば、塩化物または酢酸から選択される。
ある実施態様において、特に凍結形態の組成物の調製が所望であるならば、第二の態様の方法は、(II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む。故に、この実施態様において、第二の態様の方法の実施により、凍結形態の組成物がもたらされる。
別の実施態様において、特に液体形態の組成物の調製が所望であるならば、第二の態様の方法は工程(II)を含まない。故に、この実施態様において、第二の態様の方法の実施により、液体形態の組成物がもたらされる。
第二の態様のある実施態様において、工程(Ｉ)は、工程(ｃ)後、タンジェンシャルフロー濾過および透析濾過などの希釈および濾過から選択される１以上の工程をさらに含む。例えば、希釈工程は、中間製剤への希釈溶液の添加を含み得る。このような希釈溶液は、１以上の付加的化合物および所望により最終緩衝系を含んでよく、ここで、１以上の付加的化合物は凍結保護剤を含み得る。１以上の濾過工程(工程(ｄ)、(ｆ’)、(ｇ’)および(ｈ’)を含む)を、中間製剤からの望まない化合物(例えば、エタノールおよび／または１以上の二および／または多塩基性有機酸)の除去および／または中間製剤のＲＮＡ濃度の増加および／または中間製剤のｐＨおよび／または緩衝系の変更に使用し得る。この目的で、望まない化合物を含まない(望まない化合物が中間製剤から水性緩衝液溶液に洗い出されるように)および／または水性緩衝液溶液と比較して高張である(水が中間製剤から水性緩衝液溶液に流れるように)および／または中間製剤以外のｐＨおよび／または緩衝系であるｐＨおよび／または緩衝系を有する水性緩衝液溶液が使用できる。
第二の態様の好ましい実施態様において、工程(Ｉ)は：
(ａ’)水性ＲＮＡ溶液を調製し；
(ｂ’)第一緩衝系を含む第一水性緩衝液溶液を調製し；
(ｃ’)(ａ’)の下に調製した水性ＲＮＡ溶液と(ｂ’)の下に調製した第一水性緩衝液溶液を混合し、それにより水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；
(ｄ’)カチオン的にイオン化可能な脂質、および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を調製し；
(ｅ’)(ｃ’)の下に調製したＲＮＡ溶液と(ｄ’)の下に調製したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散させたＬＮＰを含む第一中間製剤を調製し；
(ｆ’)所望により(ｅ’)の下に調製した第一中間製剤を、さらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液溶液を使用して濾過し、それによりさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を調製し、ここで、さらなる水性緩衝液溶液は第一水性緩衝液溶液と同一でも異なってもよく；
(ｇ’)所望により工程(ｆ’)を１回または２回以上繰り返し、ここで、１サイクルの工程(ｆ’)後得たさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を、次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液溶液は第一水性緩衝液溶液と同一でも異なってもよく；
(ｈ’)濾過工程(ｆ’)がないならば工程(ｅ’)で得た第一中間製剤または工程(ｆ’)が存在し、工程(ｇ’)が存在しないならば工程(ｆ’)で得たさらなる中間製剤または工程(ｆ’)および(ｇ’)が存在するならば、工程(ｇ’)後得たさらなる中間製剤を、最終緩衝系を含み、少なくとも６.０のｐＨを有する最終水性緩衝液溶液を使用して濾過し；そして
(ｉ’)所望により工程(ｈ’)で得た製剤を希釈溶液で希釈し；
それにより、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製することを含む。
第二の態様のある実施態様において、組成物中の最終緩衝物質の濃度、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の総濃度は、最大約２０mM、例えば最大約１９mM、最大約１８mM、最大約１７mM、最大約１６mM、最大約１５mM、最大約１４mM、最大約１３mM、最大約１２mM、最大約１１mMまたは最大約１０mMである。ある実施態様において、組成物中の最終緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の下限は、少なくとも約１mM、好ましくは少なくとも約２mM、例えば少なくとも約３mM、少なくとも約４mM、少なくとも約５mM、少なくとも約６mM、少なくとも約７mM、少なくとも約８mMまたは少なくとも約９mMである。例えば、組成物中の最終緩衝物質の濃度、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の総濃度は、約１mM～約２０mM、例えば約２mM～約１５mM、約５mM～約１４mM、約７mM～約１３mM、約８mM～約１２mM、約９mM～約１１mM、例えば約１０mMであり得る。
第二の態様のある実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンおよび／または炭酸アニオンおよび／または二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様の第一のサブグループにおいて、これらの基準の少なくとも１個が適用される。例えば、第二の態様のこの第一のサブグループのある実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第一のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第一のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第一のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第二の態様の第二のサブグループにおいて、上記の少なくとも２個が適用される。例えば、第二の態様のこの第二のサブグループのある実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ炭酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第二のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第二のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第二のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第二のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第二のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第二の態様の第三のサブグループにおいて、上記の少なくとも３個が適用される。例えば、第二の態様の第三のサブグループのある実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第三のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第三のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。第二の態様のこの第三のサブグループのさらなる実施態様において、最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第二の態様の第四のサブグループにおいて、上記の少なくとも４個が適用される。すなわち、第二の態様のこの第四のサブグループにおいて、最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
第二の態様のある実施態様において(特に第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む。第二の態様の別の実施態様において(特に第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない。故に、これら実施態様の具体例は次のとおりである：
(１)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(２)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(３)最終水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まず、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物およびは凍結保護剤を含む；
(４)最終水相は多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(５)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ炭酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(６)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(７)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(８)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(９)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(１０)最終水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(１１)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(１２)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(１３)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(１４)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(１５)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を含む；
(１６)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(１７)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(１８)最終水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(１９)最終水相は多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２０)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ炭酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２１)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２２)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２３)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２４)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２５)最終水相は二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２６)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２７)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２８)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(２９)最終水相は炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない；
(３０)最終水相は無機硫酸アニオンを実質的に含まず、炭酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まずかつ工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物は凍結保護剤を実質的に含まない。
工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物が凍結保護剤を含む、第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、該凍結保護剤は炭水化物および糖アルコールからなる群から選択される１以上の化合物を含む。例えば、凍結保護剤はスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。第二の態様の好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物はスクロースおよび／またはグリセロールを凍結保護剤として含む。
工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物が凍結保護剤を含む、第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、製剤および／または組成物中の凍結保護剤の濃度は、少なくとも１％ｗ／ｖ、例えば少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖまたは少なくとも９％ｗ／ｖである。ある実施態様において、製剤および／または組成物中の凍結保護剤の濃度は、最大２５％ｗ／ｖ、例えば最大２０％ｗ／ｖ、最大１９％ｗ／ｖ、最大１８％ｗ／ｖ、最大１７％ｗ／ｖ、最大１６％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大１４％ｗ／ｖ、最大１３％ｗ／ｖ、最大１２％ｗ／ｖまたは最大１１％ｗ／ｖである。ある実施態様において、製剤および／または組成物中の凍結保護剤の濃度は、１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖ～１９％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖである。第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、製剤および／または組成物は、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、例えば６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖまたは９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖの濃度または約１０％ｗ／ｖの濃度で凍結保護剤(特に、スクロースおよび／またはグリセロール)を含む。例えば、第二の態様の方法は、希釈溶液を使用する希釈工程をさらに含んでよく、ここで、希釈溶液は、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物中の凍結保護剤の上記濃度を達成するために十分量の凍結保護剤を含む。
工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物が凍結保護剤を含む、第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、凍結保護剤は、製剤／組成物の総重量に基づき、約５０×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg(例えば、約５０×１０－３osmol／kg～約３９０×１０－３osmol／kg、約６０×１０－３osmol／kg～約３８０×１０－３osmol／kg、約７０×１０－３osmol／kg～約３７０×１０－３osmol／kg、約８０×１０－３osmol／kg～約３６０×１０－３osmol／kg、約９０×１０－３osmol／kg～約３５０×１０－３osmol／kg、約１００×１０－３osmol／kg～約３４０×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約３３０×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約３２０×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約３１０×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kg)の範囲の組成物のオスモル濃度をもたらす濃度で存在する。例えば、第二の態様の方法は、希釈溶液を使用する希釈工程を含んでよく、ここで、希釈溶液は、工程(Ｉ)で得た製剤および／または組成物の上記オスモル濃度値を達成するのに十分量の凍結保護剤を含む。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、特に最終緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である第二の態様の実施態様において、最終１価アニオンは塩化物、酢酸、グリコール酸および乳酸からなる群から選択され、組成物中の最終１価アニオンの濃度(特に全最終１価アニオンの総濃度)は、最大で組成物中の最終緩衝物質の濃度に等しい。例えば、組成物中の最終１価アニオンの濃度(特に全最終１価アニオンの総濃度)組成物中の最終緩衝物質の濃度未満であり得る。故に、組成物中の最終緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mMである第二の態様の実施態様において、組成物中の最終１価アニオンの濃度(特に全最終１価アニオンの総濃度)は最大約２０mMまで、例えば、２０mM未満。一般に、組成物中の塩化物および／または酢酸(特に全１価アニオンの総濃度)などの１価アニオンの濃度は、約１５mM未満、例えば約１４mM未満、約１３mM未満、約１２mM未満、約１１mM未満、約１０mM未満、約９mM未満、約８mM未満、約７mM未満、約６mM未満または約５mM未満であり得る。ある実施態様において、組成物中の塩化物濃度は上に定義するとおりであり(例えば、約１５mM未満など)、組成物は酢酸を含まない。別の実施態様において、組成物中の酢酸濃度は上に定義するとおりであり(例えば、約１５mM未満など)、組成物は塩化物を含まない。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、特に最終緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である第二の態様の実施態様において、水相および／または組成物中のナトリウム濃度は、２０mM未満、例えば約１５mM未満、例えば、約１４mM未満、約１３mM未満、約１２mM未満、約１１mM未満、約１０mM未満、約９mM未満、約８mM未満、約７mM未満、約６mM未満または約５mM未満である。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、特に最終緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である第二の態様の実施態様において、最終１価アニオンは、ＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され、組成物中の最終１価アニオンの濃度(特に全最終１価アニオンの総濃度)は、少なくとも組成物中の最終緩衝物質の濃度に等しい。例えば、組成物中の最終１価アニオンの濃度(特に全最終１価アニオンの総濃度)は、組成物中の最終緩衝物質の濃度より高くてよい。故に、組成物中の最終緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mMである第二の態様の実施態様において、組成物中の最終１価アニオンの濃度(特に全最終１価アニオンの総濃度)は少なくとも約２０mMに等しく、例えば、２０mMより高い。一般に、組成物中の最終１価アニオンの濃度(特に全最終１価アニオンの総濃度)は約２０mM超、例えば約２１mM超、約２２mM超、約２３mM超、約２４mM超、約２５mM超、約２６mM超、約２７mM超、約２８mM超、約２９mM超または約３０mM超および好ましくは最大５０mM、例えば最大４５mM、最大４０mMまたは最大３５mMであり得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、最終緩衝系のｐＨ(および組成物のｐＨ)は約６.５～約８.０である。例えば、組成物のｐＨは、約６.９～約７.９、例えば約７.０～約７.９、約７.１～約７.８、約７.２～約７.７、約７.３～約７.６、約７.４～約７.６または約７.５であり得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、第一緩衝系(および工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は、６.０未満、好ましくは最大約５.５、例えば最大約５.０、最大約４.９、最大約４.８、最大約４.７、最大約４.６または最大約４.５のｐＨを有する。例えば、第一緩衝系のｐＨ(および工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は、約３.５～約５.９、例えば約４.０～約５.５または約４.５～約５.０であり得る。この目的で、工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液は、さらに１以上の二および／または多塩基性有機酸(例えば、クエン酸アニオンおよび／またはＥＤＴＡのアニオン)を含み得る。この実施態様において、１以上の二および／または多塩基性有機酸を除去し、最終水相が１以上の二および／または多塩基性有機酸を実質的に含まないものである、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤をもたらす条件下に工程(ｄ)を実施するのが好ましい。例えば、このような条件は、工程(ｃ)で得た中間水相に分散されたＬＮＰを含む中間製剤を、最終緩衝系(すなわち、最終緩衝物質および最終１価アニオン)を含む最終緩衝液溶液を使用する、タンジェンシャルフロー濾過または透析濾過などの少なくとも１個の工程の濾過に付すことを含み得て、ここで、最終緩衝液溶液は、１以上の二および／または多塩基性有機酸を含まない(および好ましくはエタノールを含まない)。あるいは、このような条件は、(ｉ)工程(ｃ)で得た中間水相に分散されたＬＮＰ(すなわち、第一中間製剤)を含む中間製剤を、さらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液溶液を使用するタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過などの少なくとも１個の工程の濾過に付し、それにより、さらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を調製し、ここで、さらなる水性緩衝液溶液のさらなる緩衝系は工程(ａ)で使用する緩衝系と同一でも異なってもよく；(ii)所望により工程(ｉ)を１回または２回以上繰り返し、ここで、１サイクルの工程(ｉ)後に得たさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を、次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液溶液のさらなる緩衝系は工程(ａ)で使用する第一緩衝系と同一でも異なってもよく；そして(iii)中間工程(Ｉ)で得た製剤(工程(ii)が存在しないならば)または工程(ii)で得た中間製剤(工程(ii)が存在するならば)を、最終水性緩衝液溶液を使用する、タンジェンシャルフロー濾過または透析濾過などの少なくとも１個の工程の濾過に付し、ここで、中間および最終水性緩衝液溶液の少なくとも１個(好ましくは全中間および最終水性緩衝液溶液)は１以上の二および／または多塩基性有機酸を含まない(および好ましくはエタノールを含まない)ことを含む。
同様に、工程(Ｉ)が工程(ａ’)～(ｅ’)および(ｈ’)(および所望により工程(ｆ’)、(ｇ’)および(ｉ’)の１以上)を含む、第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、第一水性緩衝液溶液(および工程(ｃ’)の下に得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は、６.０未満、好ましくは最大約５.５、例えば最大約５.０、最大約４.９、最大約４.８、最大約４.７、最大約４.６または最大約４.５のｐＨを有する。例えば、第一水性緩衝液溶液のｐＨ(および工程(ｃ’)の下に得たＲＮＡ溶液のｐＨ)は、約３.５～約５.９、例えば約４.０～約５.５または約４.５～約５.０であり得る。この目的で、(ｂ’)の下に提供された第一水性緩衝液溶液(および第一水相)は、さらに１以上の二および／または多塩基性有機酸(例えば、クエン酸アニオンおよび／またはＥＤＴＡのアニオン)を含み得る。この実施態様において、第一中間製剤および／またはさらなる中間製剤から１以上の二および／または多塩基性有機酸を除去し、さらなるおよび／または最終水相が１以上の二および／または多塩基性有機酸を実質的に含まないものである、さらなる水相または最終水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤をもたらす、条件下で工程(ｆ’)～(ｈ’)の少なくとも１個を実施するのが好ましい
。例えば、このような条件は、さらなる水性緩衝液溶液および／または最終緩衝液溶液の使用を含み得て、ここで、さらなる水性緩衝液溶液の少なくとも１個および最終緩衝液溶液(好ましくはさらなる水性緩衝液溶液および最終緩衝液溶液全て)は、１以上の二および／または多塩基性有機酸を含まない(および好ましくはエタノールを含まない)。ある実施態様において、濾過工程は、タンジェンシャルフロー濾過または透析濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過であり得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、工程(ａ)で使用する第一緩衝系は工程(ｄ)で使用した最終緩衝物質および最終１価アニオンを含み、好ましくは工程(ａ)で使用する第一緩衝系の緩衝系およびｐＨは、工程(ｄ)で使用する最終水性緩衝液溶液の緩衝系およびｐＨと同一である。例えば、第二の態様のこの実施態様において、水性緩衝液溶液を１個しか使用しない。
同様に、工程(Ｉ)が工程(ａ’)～(ｅ’)および(ｈ’)(および所望により工程(ｆ’)、(ｇ’)および(ｉ’)の１以上)を含む、第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、第一緩衝系および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全さらなる緩衝系の各々は、工程(ｈ’)で使用する最終緩衝物質および最終１価アニオンを含み、好ましくは第一水性緩衝液溶液および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる水性緩衝液溶液の各々の緩衝系およびｐＨは、最終水性緩衝液溶液の緩衝系およびｐＨと同一である。例えば、第二の態様のこの実施態様の工程(ｂ’)、存在するならば、(ｆ’)、存在するならば、(ｇ’)および(ｈ’)で使用する水性緩衝液溶液は同一である。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、製剤および／または組成物は水を主成分として含み、／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は約１.０％未満(ｖ／ｖ)である。例えば、製剤および／または組成物に含まれる水の量は、少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)、少なくとも９０％(ｗ／ｗ)または少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。特に、製剤および／または組成物が凍結保護剤を含むならば、製剤および／または組成物に含まれる水の量は、少なくとも５０％(ｗ／ｗ)、例えば少なくとも少なくとも５５％(ｗ／ｗ)、少なくとも６０％(ｗ／ｗ)、少なくとも６５％(ｗ／ｗ)、少なくとも７０％(ｗ／ｗ)、少なくとも７５％(ｗ／ｗ)、少なくとも８０％(ｗ／ｗ)、少なくとも８５％(ｗ／ｗ)または少なくとも９０％(ｗ／ｗ)であり得る。製剤および／または組成物が凍結保護剤を実質的に含まないならば、製剤および／または組成物に含まれる水の量は少なくとも９５％(ｗ／ｗ)であり得る。これに加えてまたはこれとは別に、組成物に含まれる水以外の溶媒の総量は、約１.０％未満(ｖ／ｖ)、例えば約０.９％未満(ｖ／ｖ)、約０.８％未満(ｖ／ｖ)、約０.７％未満(ｖ／ｖ)、約０.６％未満(ｖ／ｖ)、約０.５％未満(ｖ／ｖ)、約０.４％未満(ｖ／ｖ)、約０.３％未満(ｖ／ｖ)、約０.２％未満(ｖ／ｖ)、約０.１％未満(ｖ／ｖ)、約０.０５％未満(ｖ／ｖ)または約０.０１％未満(ｖ／ｖ)であり得る。これに関して、通常の条件下で液体である凍結保護剤は水以外の溶媒ではなく、凍結保護剤として考慮される。換言すると、換言すると組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約１.０％未満(ｖ／ｖ)であり得るとの上記任意の限定は、通常の条件下で液体である凍結保護剤に適用されない。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物のオスモル濃度は、最大約４００×１０－３osmol／kg、例えば最大約３９０×１０－３osmol／kg、最大約３８０×１０－３osmol／kg、最大約３７０×１０－３osmol／kg、最大約３６０×１０－３osmol／kg、最大約３５０×１０－３osmol／kg、最大約３４０×１０－３osmol／kg、最大約３３０×１０－３osmol／kg、最大約３２０×１０－３osmol／kg、最大約３１０×１０－３osmol／kgまたは最大約３００×１０－３osmol／kgである。組成物が凍結保護剤を含まないならば、組成物のオスモル濃度は、３００×１０－３osmol／kg未満、例えば最大約２５０×１０－３osmol／kg、最大約２００×１０－３osmol／kg、最大約１５０×１０－３osmol／kg、最大約１００×１０－３osmol／kg、最大約５０×１０－３osmol／kg、最大約４０×１０－３osmol／kgまたは最大約３０×１０－３osmol／kgであり得る。組成物が凍結保護剤を含むならば、組成物のオスモル濃度の主要部分が凍結保護剤により提供されるのが好ましい。例えば、凍結保護剤は、組成物のオスモル濃度の少なくとも５０％、例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％を提供し得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、組成物中のＲＮＡの濃度は約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌである。例えば、組成物中のＲＮＡの濃度は、約１０mg／ｌ～約１４０mg／ｌ、例えば約２０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌ、約３５mg／ｌ～約１１５mg／ｌ、約４０mg／ｌ～約１１０mg／ｌ、約４５mg／ｌ～約１０５mg／ｌまたは約５０mg／ｌ～約１００mg／ｌであり得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、最終緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり、組成物のｐＨは約６.５～約８.０であり、組成物中のＲＮＡの濃度は約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌである。この実施態様において、組成物のｐＨが約６.９～約７.９であり、組成物中のＲＮＡの濃度が約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであるのが好ましい。第二の態様の特に好ましい実施態様において、緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり；組成物のｐＨは約６.９～約７.９であり；組成物中のＲＮＡの濃度が約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；最終水相は硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸を実質的に含まず、多塩基性有機酸を実質的に含まず；そして組成物は凍結保護剤を含む。第二の態様の別の特に好ましい実施態様において、緩衝物質はＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態であり；組成物のｐＨは約６.９～約７.９であり；組成物中のＲＮＡの濃度が約２５mg／ｌ～約１２５mg／ｌ、例えば約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌであり；最終水相は硫酸アニオンを実質的に含まず、二塩基性有機酸を実質的に含まず、多塩基性有機酸を実質的に含まず；そして組成物は凍結保護剤を実質的に含まない。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、カチオン的にイオン化可能な脂質は、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む。例えば、カチオン的にイオン化可能な脂質は式(Ｉ)：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体の構造を有し得て、ここで、Ｌ１、Ｌ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はここに定義するとおりである。好ましくは、カチオン的にイオン化可能な脂質は次のものから選択される：構造Ｉ－１～Ｉ－３６(ここに示す)；および／または構造Ａ～Ｆ(ここに示す)；および／またはＮ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)および４－((ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イル)アミノ)オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－４－オキソブタン－１－アミン(ＤＰＬ－１４)。特に好ましい実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は構造Ｉ－３を有する脂質である。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、工程(ｂ)または(ｄ’)で調製したエタノール性溶液は、１以上の付加的脂質をさらに含み、ＬＮＰは、１以上の付加的脂質をさらに含む。好ましくは、１以上の付加的脂質は、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。第二の態様の好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、１以上の付加的脂質は、ＬＮＰがここに記載するカチオン的にイオン化可能な脂質ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質またはポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)、中性脂質(例えば、ＤＳＰＣ)およびステロイド(例えば、コレステロール)を含むように、ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質またはポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)、中性脂質(例えば、ＤＳＰＣ)およびステロイド(例えば、コレステロール)を含むテロール)を含む。
１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質を含む第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。例えば、ペグ化脂質は次の構造：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体の構造を有し得て、ここで、Ｒ１２、Ｒ１３およびｗはここに定義するとおりである。
１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質を含む第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ポリマーコンジュゲート脂質はポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートである。例えば、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートは、ポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーであり得る。
１以上の付加的脂質が中性脂質を含む、第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、中性脂質はリン脂質である。このようなリン脂質は、好ましくは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。リン脂質の特定の例はジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルファチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)を含む。特に好ましい実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。
１以上の付加的脂質がステロイドを含む第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ステロイドはコレステロールなどのステロールである。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、エタノール性溶液は、エタノール性溶液中の脂質の総モル量に基づき、カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドを２０％～６０％のカチオン的にイオン化可能な脂質、０.５％～１５％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～２５％の中性脂質および２５％～５５％のステロイドのモル比で含む。例えば、モル比は、エタノール性溶液中の脂質の総モル量に基づき、４０％～５５％のカチオン的にイオン化可能な脂質、１.０％～１０％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～１５％の中性脂質および３０％～５０％のステロイドであり得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、最終水相はキレート剤を含まない。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＬＮＰは、組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％を含む。例えば、ＬＮＰは、組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７６％、例えば少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％または少なくとも約９５％を含み得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)はＬＮＰに封入されているかまたは結合している。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。例えば、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択され得る。
第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、次の(ａ)キャップ１またはキャップ２構造などの５’キャップ；(ｂ)５’ ＵＴＲ；(ｃ)３’ ＵＴＲ；および(ｄ)少なくとも１００ヌクレオチドを含むポリ－Ａ配列などのポリ－Ａ配列であって、好ましくはＡヌクレオチドの中断された配列であるポリ－Ａ配列の１以上を含む。
第二の態様のある好ましい実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は１以上のポリペプチドをコードする。例えば、１以上のポリペプチドは、対象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含み得る。好ましい実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。第二の態様のある実施態様において(特に上に挙げた実施態様(１)～(３０)の何れかにおけるような第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループのある実施態様において)、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするＯＲＦを含む。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７と少なくとも８０％同一性を有し得る。
第三の態様において、本発明は、第二の態様の方法により組成物を調製し、組成物を、約－９０℃～約－１０℃、例えば約－９０℃～約－４０℃または約－４０℃～約－２５℃または約－２５℃～約－１０℃の範囲の温度または約－２０℃の温度で貯蔵することを含む、組成物を貯蔵する方法を提供する。第三の態様のある実施態様において、凍結組成物の貯蔵は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間である。第三の態様のある実施態様において、凍結組成物の貯蔵は、－２０℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月である。第三の態様のある実施態様において、組成物は－７０℃で貯蔵できる。
第三の態様のある実施態様において、組成物を貯蔵する方法は、工程(II)(すなわち、製剤の約－１０℃以下までの凍結)を含む第二の態様の方法により組成物を調製し；組成物を、ある期間(例えば、少なくとも１週間)約－９０℃～約－１０℃の範囲の温度で貯蔵；そして凍結組成物を、ある期間(例えば、少なくとも１週間)約０℃～約２０℃の範囲の温度で貯蔵することを含む。
第一または第二の態様でここに記載する何れかの実施態様(特に、上に挙げた第一の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れかまたは上に挙げた第二の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れか)を、第三の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
第四の態様において、本発明は、第二の態様の方法により液体組成物を調製し、液体組成物を約０℃～約２０℃、例えば約１℃～約１５℃、約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃の範囲の温度または約５℃の温度で貯蔵することを含む、組成物を貯蔵する方法を提供する。第四の態様のある実施態様において、液体組成物の貯蔵は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月または少なくとも６カ月、好ましくは少なくとも４週間である。第四の態様のある実施態様において、液体組成物の貯蔵は、５℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月である。
第四の態様のある実施態様において、組成物を貯蔵する方法は、工程(II)(すなわち、製剤の約－１０℃以下までの凍結)を含む第二の態様の方法により組成物を調製し；そして凍結組成物を、ある期間(例えば、少なくとも１週間)約０℃～約２０℃のは二の温度で貯蔵することを含む。
第一、第二または第三の態様においてここに記載する何れかの実施態様(特に、上に挙げた第一の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れかまたは上に挙げた第二の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れか)を、第四の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
第五の態様において、本発明は、第二、第三または第四の態様の方法により調製可能な組成物を提供する。第五の態様のある実施態様において、組成物は、好ましくは、約－９０℃以上、例えば約－９０℃～約－１０℃の温度で貯蔵できる、凍結形態であり得る。例えば、第五の態様の凍結組成物は、約－９０℃～約－４０℃または約－４０℃～約－２５℃または約－２５℃～約－１０℃の範囲の温度または約－２０°の温度で貯蔵され得る。第五の態様のある実施態様において、組成物は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間貯蔵できる。例えば、凍結組成物は、－２０℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月貯蔵され得る。
組成物が凍結形態である、第五の態様のある実施態様において、凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性は、例えば、－２０℃で貯蔵された凍結組成物を解凍後、少なくとも５０％、例えば少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％または少なくとも６０％である。
これに加えてまたはこれとは別に、組成物が凍結形態である、第五の態様のある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))は、組成物が凍結される前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのＰＤＩは、０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、凍結前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、凍結組成物解凍後のＬＮＰのＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
第五の態様の別の実施態様において、組成物は液体形態である。
組成物が液体形態である、第五の態様のある実施態様において、例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、液体組成物のＲＮＡ完全性は、所望の効果を生ずる、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、例えば、液体組成物のＲＮＡ完全性は、少なくとも５０％、例えば少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％または少なくとも６０％であり得る。
これに加えてまたはこれとは別に、組成物が液体形態である、第五の態様のある実施態様において、液体組成物のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))、例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したときは、所望の効果を生ずる、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、例えば、液体組成物のサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))は、最初、すなわち、貯蔵前の組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのＰＤＩは、０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、貯蔵前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の液体組成物のＬＮＰのＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
第一、第二、第三または第四の態様でここに記載する何れかの実施態様(特に、上に挙げた第一の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れかまたは上に挙げた第二の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れか)を、第五の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
第六の態様において、本発明は、第二または第三の態様の方法により調製した凍結組成物を準備し、凍結組成物を解凍し、それにより使用準備済医薬組成物を得るを工程を含む、使用準備済医薬組成物を調製する方法を提供する。
第一、第二、第三、第四または第五の態様でここに記載する何れかの実施態様(特に、上に挙げた第一の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れかまたは上に挙げた第二の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れか)を、第六の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
第七の態様において、本発明は、第二または第四の態様の方法で調製された液体組成物を準備し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を調製する方法を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五または第六の態様でここに記載する何れかの実施態様(特に、上に挙げた第一の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れかまたは上に挙げた第二の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れか)を、第七の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
第八の態様において、本発明は、第六または第七の態様の方法により調製可能な使用準備済医薬組成物を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六または第七の態様でここに記載する何れかの実施態様(特に、上に挙げた第一の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第一の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れかまたは上に挙げた第二の態様の実施態様(１)～(３０)の何れかなどの第二の態様の上記第一、第二、第三または第四のサブグループの何れか)を、第八の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
第九の態様において、本発明は、治療に使用するための、第一、第五および第八の態様の何れかの組成物を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七または第八の態様でここに記載する何れかの実施態様を、第九の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
第十の態様において、本発明は、免疫応答の誘導に使用するための、第一、第五および第八の態様の何れかの組成物を提供する。
第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八または第九の態様でここに記載する何れかの実施態様を、第十の態様の何れかにも適用し得ることは理解される。
さらなる項目別実施態様は次のとおりである：
１. 水相に分散された脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)を含む組成物であって、ここで、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；水相が緩衝物質および１価アニオンを含む緩衝系を含み、緩衝物質がトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Ｔｒｉｓ)およびそのプロトン化形態、ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－Ｔｒｉｓ－メタン)およびそのプロトン化形態およびトリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態ならびに塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸(ＭＥＳ)のアニオン、３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)のアニオンおよび２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)のアニオンからなる群から選択される１価アニオンからなる群から選択され；組成物における緩衝物質の濃度は最大約２５mMであり；そして水相は無機リン酸アニオンを実質的に含まず、クエン酸アニオンを実質的に含まずかつエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のアニオンを実質的に含まない、組成物。
２. 緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である、項１の組成物。
３. 組成物中の緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mM、好ましくは最大約１５mM、より好ましくは最大約１０mM、例えば約１０mMである、項１または２の組成物。
４. 水相が無機硫酸アニオンおよび／または炭酸アニオンおよび／または二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない、特に無機硫酸アニオン、炭酸アニオン、二塩基性有機酸アニオンおよび多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない、項１～３の何れかの組成物。
５. １価アニオンが塩化物、酢酸、グリコール酸および乳酸からなる群から選択され、組成物中の１価アニオンの濃度が最大で組成物における緩衝物質の濃度に等しい、好ましくは組成物における緩衝物質の濃度未満、例えば約９mM未満である、項１～４の何れかの組成物。
６. １価アニオンがＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され、組成物中の１価アニオンの濃度が少なくとも組成物における緩衝物質の濃度に等しい、好ましくは組成物における緩衝物質の濃度より高い、項１～４の何れかの組成物。
７. 組成物のｐＨが約６.５～約８.０、好ましくは約６.９～約７.９、例えば約７.０～約７.８である、項１～６の何れかの組成物。
８. 水が組成物の主成分であるおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％未満(ｖ／ｖ)である、項１～７の何れかの組成物。
９. 組成物のオスモル濃度が最大約４００×１０－３osmol／kgである、項１～８の何れかの組成物。
１０. 組成物中のＲＮＡの濃度が約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、項１～９の何れかの組成物。
１１. 組成物、好ましくは少なくとも約１％ｗ／ｖの濃度で、凍結保護剤を含み、ここで、凍結保護剤が好ましくは炭水化物および糖アルコールからなる群から選択される１以上の化合物を含み、より好ましくは凍結保護剤がスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは凍結保護剤がスクロースおよび／またはグリセロールを含む、項１～１０の何れかの組成物。
１２. 組成物が凍結保護剤を実質的に含まない、項１～１０の何れかの組成物。
１３. カチオン的にイオン化可能な脂質が、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、項１～１２の何れかの組成物。
１４. カチオン的にイオン化可能な脂質が式(Ｉ)：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
Ｌ１またはＬ２の一方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１およびＧ２が各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３がＣ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
ＲａがＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２が各々独立してＣ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３がＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４であり；
Ｒ４がＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５がＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；そして
ｘが０、１または２である、
項１～１３の何れかの組成物。
１５.
(α)カチオン的にイオン化可能な脂質がここに示す構造Ｉ－１～Ｉ－３６から選択される；または
(β)カチオン的にイオン化可能な脂質がここに示す構造Ａ～Ｆから選択される；または
(γ)カチオン的にイオン化可能な脂質がここに示す構造Ｉ－３を有する脂質である、
項１～１３の何れかの組成物。
１６. ＬＮＰが、好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の付加的脂質を含み、より好ましくはＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドを含む、項１～１５の何れかの組成物。
１７. ポリマーコンジュゲート脂質がペグ化脂質を含み、ここで、ペグ化脂質が好ましくは次の構造：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直線上または分岐した、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖が場合により１以上のエステル結合で中断されており；そしてｗが３０～６０の範囲の平均値を有する、項１６の組成物。
１８. ポリマーコンジュゲート脂質がポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含み、ここで、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートが好ましくはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、項１６の組成物。
１９. 中性脂質が、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセレオイルファチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択されるリン脂質である、項１６～１８の何れかの組成物。
２０. ステロイドがコレステロールなどのステロールを含む、項１６～１９の何れかの組成物。
２１. 水相がキレート剤を含まない、項１～２０の何れかの組成物。
２２. ＬＮＰが組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％を含む、項１～２１の何れかの組成物。
２３. ＲＮＡがＬＮＰに封入されているかまたは結合している、項１～２２の何れかの組成物。
２４. ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、ここで、修飾ヌクレオシドが好ましくはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される、項１～２３の何れかの組成物。
２５. ＲＮＡが５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリ－Ａ配列少なくとも１個、好ましくは全てを含む、項１～２４の何れかの組成物。
２６. ポリ－Ａ配列が少なくとも１００ Ａヌクレオチドを含み、好ましくはポリ－Ａ配列がＡヌクレオチドの中断された配列である、項２５の組成物。
２７. ５’キャップがキャップ１またはキャップ２構造である、項２５または２６の組成物。
２８. ＲＮＡが１以上のポリペプチドをコードし、ここで、１以上のポリペプチドが好ましくは象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含む、項１～２７の何れかの組成物。
２９. ＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む、項２８の組成物。
３０. ＲＮＡが配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするＯＲＦを含む、項２８または２９の組成物。
３１. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが配列番号７と少なくとも８０％同一性を有する、項２９または３０の組成物。
３２. 組成物が凍結形態である、項１～３１の何れかの組成物。
３３. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物が凍結される前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、項３２の組成物。
３４. 凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ)が組成物が凍結される前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと等しい、項３２または３３の組成物。
３５. 組成物が液体形態である、項１～３１の何れかの組成物。
３６. 最終水相に分散されたＬＮＰを含む組成物を調製する方法であって、ここで、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；最終水相が最終緩衝物質および最終１価アニオンを含む最終緩衝系を含み、最終緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態、ビス－Ｔｒｉｓ－メタンおよびそのプロトン化形態およびＴＥＡおよびそのプロトン化形態からなる群から選択され、最終１価アニオンが塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、ＭＥＳのアニオン、ＭＯＰＳのアニオンおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され；組成物中の最終緩衝物質の濃度が最大約２５mMであり；そして最終水相が無機リン酸アニオンを実質的に含まず、クエン酸アニオンを実質的に含まずかつＥＤＴＡのアニオンを実質的に含まず；
(Ｉ)ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含む、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製し；そして
(II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
それにより、組成物を得ることを含み、
ここで、工程(Ｉ)が：
(ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；
(ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質、および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を調製し；
(ｃ)(ａ)の下に調製したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に調製したエタノール性溶液を混合し、それにより、第一緩衝系を含む中間水層に分散されたＬＮＰを含む第一中間製剤を調製し；そして
(ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液溶液を使用して(ｃ)の下に調製した第一中間製剤を濾過し、
それにより、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製することを含む、方法。
３７. 工程(Ｉ)が希釈および濾過から選択される１以上の工程をさらに含む、項３６の方法。
３８. 工程(Ｉ)が
(ａ’)水性ＲＮＡ溶液を調製し；
(ｂ’)第一緩衝系を含む第一水性緩衝液溶液を調製し；
(ｃ’)(ａ’)の下に調製した水性ＲＮＡ溶液と(ｂ’)の下に調製した第一水性緩衝液溶液を混合し、それにより水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；
(ｄ’)カチオン的にイオン化可能な脂質、および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を調製し；
(ｅ’)(ｃ’)の下に調製したＲＮＡ溶液と(ｄ’)の下に調製したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散させたＬＮＰを含む第一中間製剤を調製し；
(ｆ’)所望により(ｅ’)の下に調製した第一中間製剤を、さらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液溶液を使用して濾過し、それによりさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を調製し、ここで、さらなる水性緩衝液溶液が第一水性緩衝液溶液と同一でも異なってもよく；
(ｇ’)所望により工程(ｆ’)を１回または２回以上繰り返し、ここで、１サイクルの工程(ｆ’)後得たさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を、次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液溶液が第一水性緩衝液溶液と同一でも異なってもよく；
(ｈ’)濾過工程(ｆ’)がないならば工程(ｅ’)で得た第一中間製剤または工程(ｆ’)が存在し、工程(ｇ’)が存在しないならば工程(ｆ’)で得たさらなる中間製剤または工程(ｆ’)および(ｇ’)が存在するならば、工程(ｇ’)後得たさらなる中間製剤を、最終緩衝系を含み、少なくとも６.０のｐＨを有する最終水性緩衝液溶液を使用して濾過し；そして
(ｉ’)所望により工程(ｈ’)で得た製剤を希釈溶液で希釈し；
それにより、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製することを含む、項３６または３７の方法。
３９. 濾過がタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過である、項３６～３８の何れかの方法。
４０. (II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む、項３６～３９、の何れかの方法。
４１. 最終緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である、項３６～４０の何れかの方法。
４２. 組成物中の最終緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mM、好ましくは最大約１５mM、より好ましくは最大約１０mM、例えば約１０mMである、項３６～４１の何れかの方法。
４３. 最終水相が無機硫酸アニオンおよび／または炭酸アニオンおよび／または二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まず、特に無機硫酸アニオン、炭酸アニオン、二塩基性有機酸アニオンおよび多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない、項３６～４２の何れかの方法。
４４. (ｉ)工程(ａ)で調製したＲＮＡ溶液が１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンをさらに含み、工程(ｄ)が、最終水相が工程(ａ)で調製したＲＮＡ溶液に存在する１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まないものである、最終水層に分散されたＬＮＰを含む製剤をもたらす１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを除去する条件下で実施される；または(ii)第一水性緩衝液溶液および第一水相が１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを含み、工程(ｆ’)～(ｈ’)の少なくとも１個が第一中間製剤および／またはさらなる中間製剤から１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを除去する条件下で実施される、項３６～４３の何れかの方法。
４５. (ｉ)工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する；または(ii)第一水性緩衝液溶液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する、項３６～４４の何れかの方法。
４６. １以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンがクエン酸アニオンおよび／またはＥＤＴＡのアニオンを含む、項４４または４５の方法。
４７. (ｉ)工程(ａ)で使用する第一緩衝系が工程(ｄ)で使用した最終緩衝物質および最終１価アニオンを含み、好ましくは工程(ａ)で使用する第一緩衝系の緩衝系およびｐＨが工程(ｄ)で使用する最終水性緩衝液溶液の緩衝系およびｐＨと同一である；または(ii)第一緩衝系および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全さらなる緩衝系の各々が工程(ｈ’)で使用する最終緩衝物質および最終１価アニオンを含み、好ましくは第一水性緩衝液溶液および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる水性緩衝液溶液の各々の緩衝系およびｐＨが最終水性緩衝液溶液の緩衝系およびｐＨと同一である、項３６～４３の何れかの方法。
４８. 最終１価アニオンが塩化物、酢酸、グリコール酸および乳酸からなる群から選択され、組成物中の最終１価アニオンの濃度が、最大組成物中の最終緩衝物質の濃度と等しい、好ましくは組成物中の最終緩衝物質の濃度未満、例えば約９mM未満である、項３６～４７の何れかの方法。
４９. 最終１価アニオンがＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され、組成物中の最終１価アニオンの濃度が少なくとも組成物中の最終緩衝物質の濃度に等しい、好ましくは組成物中の最終緩衝物質の濃度より高い、項３６～４８の何れかの方法。
５０. 組成物のｐＨが約６.５～約８.０、好ましくは約６.９～約７.９、例えば約７.０～約７.８である、項３６～４９の何れかの方法。
５１. 水が製剤および／または組成物の主成分であるおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％未満(ｖ／ｖ)である、項３６～５０の何れかの方法。
５２. 組成物のオスモル濃度が最大約４００×１０－３osmol／kgである、項３６～５１の何れかの方法。
５３. 組成物中のＲＮＡの濃度が約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、項３６～５２の何れかの方法。
５４. (ｉ)工程(Ｉ)がさらに(ｄ)の下に調製した製剤を希釈溶液で希釈することを含むかまたは工程(ｉ’)が存在し、ここで、希釈溶液が凍結保護剤を含む；および／または(ii)工程(Ｉ)で得た製剤および組成物が、好ましくは少なくとも約１％ｗ／ｖの濃度で凍結保護剤を含み、ここで、凍結保護剤が好ましくは炭水化物および糖アルコールから選択される１以上を含み、より好ましくは凍結保護剤がスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは凍結保護剤がスクロースおよび／またはグリセロールを含む、項３６～５３の何れかの方法。
５５. 工程(Ｉ)で得た製剤および組成物が凍結保護剤を実質的に含まない、項３６～５３の何れかの方法。
５６. カチオン的にイオン化可能な脂質が、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、項３６～５５の何れかの方法。
５７. カチオン的にイオン化可能な脂質が式(Ｉ)：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
Ｌ１またはＬ２の一方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１およびＧ２が各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３がＣ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
ＲａがＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２が各々独立してＣ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３がＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４であり；
Ｒ４がＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５がＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；そして
ｘが０、１または２である、
項３６～５６の何れかの方法。
５８.
(α)カチオン的にイオン化可能な脂質がここに示す構造Ｉ－１～Ｉ－３６から選択される；または
(β)カチオン的にイオン化可能な脂質がここに示す構造Ａ～Ｆから選択される；または
(γ)カチオン的にイオン化可能な脂質がここに示す構造Ｉ－３を有する脂質である、
項３６～５６の何れかの方法。
５９. 工程(ｂ)または(ｄ’)で調製したエタノール性溶液が１以上の付加的脂質をさらに含み、ＬＮＰが１以上の付加的脂質をさらに含み、ここで、１以上の付加的脂質が好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドを含む、項３６～５８の何れかの方法。
６０. ポリマーコンジュゲート脂質がペグ化脂質を含み、ここで、ペグ化脂質が好ましくは次の構造：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、１０～３０個の炭素原子を含む直線上または分岐した、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖が場合により１以上のエステル結合で中断されており；そしてｗが３０～６０の範囲の平均値を有する、項５９の方法。
６１. ポリマーコンジュゲート脂質がポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含み、ここで、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートが好ましくはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、項５９の方法。
６２. 中性脂質が、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセレオイルファチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択されるリン脂質である、項５９～６１の何れかの方法。
６３. ステロイドがコレステロールなどのステロールを含む、項５９～６２の何れかの方法。
６４. カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドがエタノール性溶液に２０％～６０％のカチオン的にイオン化可能な脂質、０.５％～１５％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～２５％の中性脂質および２５％～５５％のステロイドのモル比、好ましくは４５％～５５％のカチオン的にイオン化可能な脂質、１.０％～５％のポリマーコンジュゲート脂質、８％～１２％の中性脂質および３５％～４５％のステロイドのモル比で存在する、項３６～６３の何れかの方法。
６５. 最終水相がキレート剤を含まない、項３６～６４の何れかの方法。
６６. ＬＮＰが組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％を含む、項３６～６５の何れかの方法。
６７. ＲＮＡがＬＮＰに封入されているかまたは結合している、項３６～６６の何れかの方法。
６８. ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、ここで、修飾ヌクレオシドが好ましくはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される、項３６～６７の何れかの方法。
６９. ＲＮＡが５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリ－Ａ配列少なくとも１個、好ましくは全てを含む、項３６～６８の何れかの方法。
７０. ポリ－Ａ配列が少なくとも１００ Ａヌクレオチドを含み、好ましくはポリ－Ａ配列がＡヌクレオチドの中断された配列である、項６９の方法。
７１. ５’キャップがキャップ１またはキャップ２構造である、項６９または７０の方法。
７２. ＲＮＡが１以上のポリペプチドをコードし、ここで、１以上のポリペプチドが好ましくは象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含む、項３６～７１の何れかの方法。
７３. ＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む、項７２の方法。
７４. ＲＮＡが配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするＯＲＦを含む、項７２または７３の方法。
７５. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが配列番号７と少なくとも８０％同一性を有する、項７３または７４の方法。
７６. 工程(II)を含まない、項３６～３９および４１～７５の何れかの方法。
７７. 項３６～７５の何れかの方法により組成物を調製し、組成物を約－９０℃～約－１０℃、例えば約－９０℃～約－４０℃または約－２５℃～約－１０℃の範囲お温度で貯蔵することを含む、組成物を貯蔵する方法。
７８. 組成物の貯蔵が少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月である、項７７の方法。
７９. 項３６～７８の何れかの方法で組成物を調製し、組成物を約０℃～約２０℃、例えば約１℃～約１５℃、約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃の範囲の温度または約５℃の温度で貯蔵することを含む、組成物を貯蔵する方法。
８０. 組成物の貯蔵が少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月または少なくとも６カ月である、項７９の方法。
８１. 項３６～８０の何れかの方法により調製可能な組成物。
８２. 凍結形態である、項８１の組成物。
８３. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物が凍結される前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、項８２の組成物。
８４. 凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ)が組成物が凍結される前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと等しい、項８２または８３の組成物。
８５. 液体形態である、項８１の組成物。
８６. 少なくとも１週間組成物を貯蔵後のＲＮＡ完全性が貯蔵前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、項８５の組成物。
８７. 組成物を少なくとも１週間貯蔵後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ)が貯蔵前のＬＮＰのと等しい、項８５または８６の組成物。
８８. 項３６～７５、７７および７８の何れかの方法により凍結組成物を準備し、凍結組成物を解凍し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を調製する方法。
８９. 項３６～３９、４１～７６、７９および８０の何れかの方法により液体組成物を準備し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を調製する方法。
９０. 項８８または８９の方法により調製可能な使用準備済医薬組成物。
９１. 治療に使用するための項１～３５、８１～８７および９０の何れかの組成物。
９２. 対象における免疫応答の誘導に使用するための項１～３５、８１～８７および９０の何れかの組成物。
本発明のさらなる態様をここに開示する。
ＢＮＴ１６２ｂ１物質のインビボアッセイの概要である。
キャピラリー電気泳動により決定したＲＮＡ完全性を示す。ＲＮＡ ＬＮＰを、有機相に添加した２０mM Ｔｒｉｓを使用する水性－エタノール混合プロトコールにより調製した。ＬＮＰをＴｒｉｓ：酢酸ｐＨ４、ｐＨ５.５またはｐＨ６.８で産生し、得られた一次ＬＮＰを分けた：一方をＰＢＳ(Ａ)に対する透析に付した；他方をＴｒｉｓ：酢酸ｐＨ７.４(Ｂ)に対する透析に付した。比較のために、有機相はＴｒｉｓを受領せず、ＬＮＰをＮａ－酢酸緩衝液ｐＨ５.５で産生し、物質をＴｒｉｓ：酢酸ｐＨ７.４に対して透析した。全サンプルを、５０時間、室温で貯蔵した。
選択したＲＮＡ ＬＮＰ組成物の形態学を示す。ガラス化サンプルを低温電子顕微鏡法で分析した。Ｄ０２８サンプルについて、２.５倍高倍率を使用した。
ＬＮＰ組成物のマウス免疫原性を示す。１μgのＲＮＡ ＬＮＰ組成物Ｄ０２８(ＬＮＰ Ａ)、Ｄ０２９(ＬＮＰ Ｂ)およびＤ０３０(ＬＮＰ Ｃ)をマウスにｉ.ｍ.注射し、参照組成物(ＡＴＭ)および食塩水を対照として使用した。Ｓ１タンパク質の発現(左パネル)およびＳ１ ＩｇＧの産生(右パネル)を２８日追跡した。全ＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、互いにおよび参照組成物に対して同等の生物活性を有する。
ＲＮＡ ＬＮＰ組成物Ｄ０２８(Ａ)およびＲＮＡ ＬＮＰ組成物Ｄ０２９(Ｂ)およびＤ０３０(Ｃ)の安定性を示す。四角：室温、菱形：５℃、三角：－２０℃、丸－７０℃。実線：粒子径、ＲＮＡ完全性またはＲＮＡ含量；点線：ＰＤＩ、ＬＭＳ(安定な折り畳みを意味するＲＮＡ)またはＲＮＡ封入。
１０mMまたは５０mMの緩衝液強度を有するコロイド安定性ＲＮＡ ＬＮＰ組成物を示す。四角：室温、菱形：５℃、三角：－２０℃。実線は粒子径を示し、点線はＰＤＩを示す。
Ｔｒｉｓ緩衝液の強度に対するＲＮＡの安定性を示す。結果は、ある時間かつ条件後のサンプルに存在するＲＮＡモダリティの％を示す。ＲＮＡは完全長ＲＮＡを意味する；ＬＭＳはＲＮＡの高度に安定な折り畳み形態を表す；そしてＦｒａｇはサンプルのＲＮＡフラグメントを表す。
配列の記載
次表は、ここで言及するある配列の一覧を提供する。
発明の詳細な記載
本発明を下にさらに詳述するが、この開示は、ここに記載される特定の方法、プロトコールおよび試薬に、それらが変化し得るため、限定されないことは理解されるべきである。またここで使用する用語は特定の実施態様を記載する目的のみであり、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。他に定義されない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
以下に、本発明の要素をさらに詳細に記載する。これらの要素を特定の実施態様実施態様と共に列記しているが、しかしながら、それらをあらゆる方法でかつあらゆる数で組み合わせて、さらなる実施態様を作り得ることは理解されるべきである。種々に記載される例および好ましい実施態様は本発明を明記される実施態様にのみ限定すると解釈してはならない。この記載は、明記される実施態様とあらゆる数の開示されるおよび／または好ましい要素を組み合わせる実施態様を支持しかつ包含すると理解されるべきである。さらに、本出願における記載される全要素のあらゆる並べ替えおよび組み合わせは、文脈から他のことが示されない限り、本出願の記載により開示されると解釈されるべきである。例えば、好ましい実施態様において組成物(または製剤)が凍結保護剤を含みかつ他の好ましい実施態様においてカチオン的にイオン化可能な脂質が構造Ｉ－３を有するならば、さらなる好ましい実施態様において、組成物(または製剤)は凍結保護剤および構造Ｉ－３を有するカチオン的にイオン化可能な脂質を含む。
好ましくは、ここで使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)に記載のとおり定義される。
本発明の実施は、特に断らない限り、本分野の文献で説明される慣用の化学、生化学、細胞生物学、免疫学および組み換えＤＮＡの技術を用いる(例えば、Organikum, Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin 1990; Streitwieser/Heathcook, "Organische Chemie", VCH, 1990; Beyer/Walter, "Lehrbuch der Organischen Chemie", S. Hirzel Verlag Stuttgart, 1988; Carey/Sundberg, "Organische Chemie", VCH, 1995; March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 1985; Roempp Chemie Lexikon, Falbe/Regitz (Hrsg.), Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York, 1989; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照)。
本明細書および続く特許請求の範囲をとおして、文脈から他の解釈が必要ではない限り、用語「含む」および「含み」および「含んで」などのその変形は、記載するメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の包含を含意するが、他のメンバー、整数もしくは工程またはメンバー、整数もしくは工程の群の除外ではないと理解される。用語「から本質的になる」は、あらゆる本質的な意義の他のメンバー、整数または工程の除外を意味する。用語「含む」は用語「から本質的になる」を含み、これは今度は用語「からなる」を含む。故に、本出願にける各場合、用語「含む」は用語「から本質的になる」または「からなる」に置き換え得る。同様に、本出願にける各場合、用語「から本質的になる」は用語「からなる」に置き換え得る。
本発明の記載(特に特許請求の範囲において)で使用される単数表現は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、単数および複数両方を包含すると解釈される。ここでの値の範囲の記載は、単に該範囲に入る各個々の値を個々に言及する省略方法として役立つことが意図される。ここで特に断らない限り、各個々の値は、ここに個々に記載されるかのように本明細書に包含される。ここに記載する全方法は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、任意の適当な順番で実施され得る。ここに提供される任意かつ全ての例または例示的用語(例えば、「など」)は、単に本発明を良好に説明することが意図され、他の点で請求される本発明の範囲に限定を課さない。本発明における用語は、本発明の実施のために必須のあらゆる請求されていない要素を示すとして解釈されてはならない。
ここで使用するとき、「および／または」は、２個の特定される性質または成分の各々の、他方を伴うまたは伴わない具体的開示として解釈される。例えば、「Ｘおよび／またはＹ」は、(ｉ)Ｘ、(ii)Ｙおよび(iii)ＸおよびＹの各々の具体的開示を、ここに各々が個々に示されるように開示すると解釈される。
本発明において、用語「約」は当業者が問題の性質の技術的影響をなお確認できると理解される精度の区間を意味する。本用語は、典型的に記載される数値からの±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０.９％、±０.８％、±０.７％、±０.６％、±０.５％、±０.４％、±０.３％、±０.２％、±０.１％、±０.０５％および例えば±０.０１％の逸脱を示す。当業者により認識されるとおり、ある技術的影響についての数値の特定のこのような逸脱は、技術的影響の性質に依存する。例えば、天然または生物学的技術的影響は、一般に人為的または工学的技術的影響よりも逸脱を大くし得る。
ここでの値の範囲の記載は、単に該範囲に入る各個々の値を個々に言及する省略方法として役立つことが意図される。ここで特に断らない限り、各個々の値は、ここに個々に記載されるかのように本明細書に包含される。
いくつかの文献が、本明細書をとおして引用されている。ここに引用する文献(全ての特許、特許出願、科学論文、製造業者の明細、指示などを含む)の各々を、上記であれ下記であれ、引用によりそれら全体として本明細書に包含させる。本発明が先行発明によりこのような開示に先行する権利がないことを認めるとして解釈されるべきものはここにはない。
定義
以下において、本発明の全態様に適用される定義を提供する。次の用語は、特に断らない限り次の意味を有する。あらゆる定義されていない用語は、それらの認識されている意味を有する。
ここで使用される「減少」または「阻害」などの用語は、レベルの、例えば、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、約２０％以上、約２５％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上または約７５％以上の全体的現象を引き起こす能力を意味する。用語「阻害」または類似の用語は、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわち０または本質的に０への減少を含む。
「増加」または「増強」などの用語は、ある実施態様において少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約８０％または少なくとも約１００％の増加または増強に関する。
ここで使用する「生理学的ｐＨ」は、約７.５のｐＨをいう。
ここで使用される「生理学的条件」は、生存対象、特にヒトにおける条件(特にｐＨおよび温度)をいう。好ましくは、生理学的条件は、生理学的ｐＨおよび／または約３７℃の温度を意味する。
本明細書で使用する「％(ｗ／ｖ)」または「(％ｗ／ｖ)」は、ミリリットル(ml)での溶液の総体積のパーセントとして表されるグラム(ｇ)での溶質の量を測定する濃度単位である重量／体積パーセントをいう。
本明細書で使用する「重量％」または「％(ｗ／ｗ)」または「(％ｗ／ｗ)」は、グラム(ｇ)での総組成物の総重量のパーセントとして表されるグラム(ｇ)での物質の量を測定する濃度単位である重量パーセントをいう。
無機２価イオン、特に２価無機カチオンの存在に関して、キレート剤の存在によるその濃度または有効濃度(遊離イオンの存在)は、ある実施態様においてＲＮＡの分解を阻止するために十分に低い。ある実施態様において、２価無機イオンの濃度または有効濃度は、ＲＮＡヌクレオチド間のホスホジエステル結合の加水分解についての触媒レベル未満である。ある実施態様において、遊離２価無機イオンの濃度は２０μM以下である。ある実施態様において、遊離２価無機イオンはないまたは本質的にない。
「オスモル濃度」は、溶質のオスモル数／溶媒キログラムとして表された特定の溶質の濃度をいう。
用語「凍結」は、通常、熱を除くことによる、液体の固化をいう。
粒子、特にＬＮＰを含む組成物／製剤に関連してここで使用する用語「水相」は、(形式上)粒子を除く以外、そこに溶解される全要素を含む、移動または液体相、すなわち、連続水相を意味する。故に、ＬＮＰなどの粒子が水相に分散され、水相が化合物Ｘを実質的に含まないならば、水相は実際的におよび現実的に実行可能なようにＸを含まず、例えば、水性組成物中の化合物Ｘの濃度は１重量％未満である。しかしながら、同時に、水相に分散される粒子は、１重量％を超える量で化合物Ｘを含み得ることも可能である。
塩基(例えば、Ｔｒｉｓなどの有機一級アミン)と関連してここで使用する表現「プロトン化形態」は、コンジュゲート酸が、塩基をもたらす脱プロトン化により除去され得るプロトンを含む、塩基のコンジュゲート酸を意味する。例えば、プロトン化形態のＴｒｉｓは式[Ｈ３Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ)３]＋を有する。ここで使用する「緩衝物質」は、塩基とそのプロトン化形態の混合物(例えば、Ｔｒｉｓと[Ｈ３Ｎ(ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ)３]＋の混合物)をいう。結果として、組成物に含まれる緩衝物質の量は、組成物中の塩基およびコンジュゲート酸両方の合計の量である。
用語「組み換え」は、本発明において「遺伝子工学を介して製造した」ことを意味する。ある実施態様において、「組み換え物」は、本発明において天然に存在しない。
ここで使用する用語「天然に存在する」は、物体が天然で見られ得るとの事実をいう。例えば、生物(ウイルスを含む)に存在し、天然源から単離でき、研究室で人により意図的に修飾されていないペプチドまたは核酸は天然に存在する。用語「天然にみられる」は、「天然に存在する」を意味し、既知物体ならびにまだ発見されていないおよび／または天然から単離されていないが、将来天然源から発見および／または単離され得る物体を含む。
ここで使用する用語「室温」および「環境温度」はここで相互交換可能に使用され、少なくとも約１５℃、好ましくは約１５℃～約３５℃、約１５℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃または約１７℃～約２２℃の温度をいう。このような温度は１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃および２２℃を含む。
用語「アルキル」は、飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のモノラジカルをいう。好ましくは、アルキル基はＣ１－１２アルキルと略す１～１２(例えば１～１０)個の炭素原子、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子(例えばＣ１－１０アルキルと略す１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは１～８個の炭素原子、例えば１～６個または１～４個の炭素原子を含む。アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソ－プロピル(２－プロピルまたは１－メチルエチルとも称される)、ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソ－ペンチル、ｓｅｃ－ペンチル、ネオ－ペンチル、１,２－ジメチル－プロピル、イソ－アミル、ｎ－ヘキシル、イソ－ヘキシル、ｓｅｃ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、イソ－ヘプチル、ｎ－オクチル、２－エチル－ヘキシル、ｎ－ノニル、ｎ－デシル、ｎ－ウンデシル、ｎ－ドデシルなどを含む。「置換アルキル」は、アルキレン基の水素原子の１以上(例えば１～アルキル基に結合する水素原子の最大数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または最大１０個、例えば１～５個、１～４個または１～３個または１個または２個)が水素以外の置換基で置換されていることを意味する(１を超える水素原子が置換されるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベルの置換基である。置換アルキルの例は、クロロメチル、ジクロロメチル、フルオロメチルおよびジフルオロメチルを含む。
用語「アルキレン」は、飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のジラジカルをいう。好ましくは、アルキレンは１～１２(例えば１～１０)個の炭素原子、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子(例えば１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは１～８個の炭素原子、例えば１～６個または１～４個の炭素原子を含む。アルキレン基の例は、メチレン、エチレン(すなわち、１,１－エチレン、１,２－エチレン)、プロピレン(すなわち、１,１－プロピレン、１,２－プロピレン(－ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２－)、２,２－プロピレン(－Ｃ(ＣＨ３)２－)および１,３－プロピレン)、ブチレン異性体(例えば、１,１－ブチレン、１,２－ブチレン、２,２－ブチレン、１,３－ブチレン、２,３－ブチレン(ｃｉｓまたはｔｒａｎｓまたはこれらの混合物)、１,４－ブチレン、１,１－イソ－ブチレン、１,２－イソ－ブチレンおよび１,３－イソ－ブチレン)、ペンチレン異性体(例えば、１,１－ペンチレン、１,２－ペンチレン、１,３－ペンチレン、１,４－ペンチレン、１,５－ペンチレン、１,１－イソ－ペンチレン、１,１－ｓｅｃ－ペンチル、１,１－ネオ－ペンチル)、ヘキシレン異性体(例えば、１,１－ヘキシレン、１,２－ヘキシレン、１,３－ヘキシレン、１,４－ヘキシレン、１,５－ヘキシレン、１,６－ヘキシレンおよび１,１－イソヘキシレン)、ヘプチレン異性体(例えば、１,１－ヘプチレン、１,２－ヘプチレン、１,３－ヘプチレン、１,４－ヘプチレン、１,５－ヘプチレン、１,６－ヘプチレン、１,７－ヘプチレンおよび１,１－イソヘプチレン)、オクチレン異性体(例えば、１,１－オクチレン、１,２－オクチレン、１,３－オクチレン、１,４－オクチレン、１,５－オクチレン、１,６－オクチレン、１,７－オクチレン、１,８－オクチレンおよび１,１－イソオクチレン)などを含む。少なくとも３個の炭素原子を有し、各端に遊離原子価を有する直鎖アルキレン部分も複数のメチレンとして考えられる(例えば、１,４－ブチレンはテトラメチレンとも称され得る)。一般に、上記のようにアルキレン部分の最後に「イレン」を使用する代わりに、最後に「ジイル」を使ってもよい(例えば、１,２－ブチレンはブタン－１,２－ジイルとも称され得る)。「置換アルキレン」は、アルキレン基の水素原子の１以上(例えば１～アルキレン基に結合する水素原子の最大数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または最大１０個、例えば１～５個、１～４個または１～３個または１個または２個)が水素以外の置換基で置換されていることを意味する(１を超える水素原子が置換されるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベルの置換基である。
用語「アルケニル」は、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する不飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のモノラジカルをいう。一般に、アルケニル基における炭素－炭素二重結合の最大数はアルケニル基の炭素原子を２で除し、アルケニル基の炭素原子が奇数であるならば、除算の結果を次の下の整数に丸めた、整数と等しい。例えば、９個の炭素原子を有するアルケニル基について、炭素－炭素二重結合の最大数は４個である。好ましくは、アルケニル基は１～６(例えば１～４)個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素－炭素二重結合を有する。好ましくは、アルケニル基は２～１２(例えば２～１０)個の炭素原子、すなわち、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子(例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは２～８個の炭素原子、例えば２～６個の炭素原子または２～４個の炭素原子を有する。故に、好ましい実施態様において、アルケニル基は、Ｃ２－１２アルケニルと略す２～１２個、(例えば、２～１０)個の炭素原子および１個、２個、３個、４個、５個または６個(例えば、１個、２個、３個、４個または５個)の炭素－炭素二重結合を含み、より好ましくは２～８個の炭素原子および１個、２個、３個または４個の炭素－炭素二重結合、例えば２～６個の炭素原子および１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合または２～４個の炭素原子および１個または２個の炭素－炭素二重結合を含む。炭素－炭素二重結合はｃｉｓ(Ｚ)またはｔｒａｎｓ(Ｅ)配置であり得る。アルケニル基の例は、ビニル、１－プロペニル、２－プロペニル(すなわち、アリル)、１－ブテニル、２－ブテニル、３－ブテニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－ペンテニル、４－ペンテニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、４－ヘキセニル、５－ヘキセニル、１－ヘプテニル、２－ヘプテニル、３－ヘプテニル、４－ヘプテニル、５－ヘプテニル、６－ヘプテニル、１－オクテニル、２－オクテニル、３－オクテニル、４－オクテニル、５－オクテニル、６－オクテニル、７－オクテニル、１－ノネニル、２－ノネニル、３－ノネニル、４－ノネニル、５－ノネニル、６－ノネニル、７－ノネニル、８－ノネニル、１－デセニル、２－デセニル、３－デセニル、４－デセニル、５－デセニル、６－デセニル、７－デセニル、８－デセニル、９－デセニル、１－ウンデセニル、２－ウンデセニル、３－ウンデセニル、４－ウンデセニル、５－ウンデセニル、６－ウンデセニル、７－ウンデセニル、８－ウンデセニル、９－ウンデセニル、１０－ウンデセニル、１－ドデセニル、２－ドデセニル、３－ドデセニル、４－ドデセニル、５－ドデセニル、６－ドデセニル、７－ドデセニル、８－ドデセニル、９－ドデセニル、１０－ドデセニル、１１－ドデセニルなどを含む。アルケニル基が窒素原子に結合しているならば、二重結合は窒素原子に対してアルファではあり得ない。「置換アルケニル」は、アルケニル基の水素原子の１以上(例えば１～アルケニル基に結合する水素原子の最大数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９または最大１０個、例えば１～５個、１～４個または１～３個または１個または２個)が水素以外の置換基で置換されていることを意味する(１を超える水素原子が置換されるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベルの置換基である。
用語「アルケニレン」は、少なくとも１個の炭素－炭素二重結合を有する不飽和直鎖または分岐鎖炭化水素のジラジカルをいう。一般に、アルケニレン基における炭素－炭素二重結合の最大数は、アルケニレン基の炭素原子を２で除し、アルケニレン基の炭素原子が奇数であるならば、除算の結果を次の下の整数に丸めた、整数と等しい。例えば、９個の炭素原子を有するアルケニレン基について、炭素－炭素二重結合の最大数は４個である。好ましくは、アルケニレン基は１～６(例えば１～４)個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個の炭素－炭素二重結合を有する。好ましくは、アルケニレン基は２～１２(例えば２～１０)個の炭素原子、すなわち、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個または１２個の炭素原子(例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の炭素原子)、より好ましくは２～８個の炭素原子、例えば２～６個の炭素原子または２～４個の炭素原子を含む。故に、好ましい実施態様において、アルケニレン基は２～１２個(例えば２～１０個の炭素)の原子および１個、２個、３個、４個、５個または６個(例えば１個、２個、３個、４個または５個)の炭素－炭素二重結合を含み、より好ましくは２～８個の炭素原子および１個、２個、３個または４個の炭素－炭素二重結合、例えば２～６個の炭素原子および１個、２個または３個の炭素－炭素二重結合または２～４個の炭素原子および１個または２個の炭素－炭素二重結合を含む。炭素－炭素二重結合はｃｉｓ(Ｚ)またはｔｒａｎｓ(Ｅ)配置であり得る。アルケニレン基の例は、エテン－１,２－ジイル、ビニリデン(エテニリデンとも称される)、１－プロペン－１,２－ジイル、１－プロペン－１,３－ジイル、１－プロペン－２,３－ジイル、アリリデン、１－ブテン－１,２－ジイル、１－ブテン－１,３－ジイル、１－ブテン－１,４－ジイル、１－ブテン－２,３－ジイル、１－ブテン－２,４－ジイル、１－ブテン－３,４－ジイル、２－ブテン－１,２－ジイル、２－ブテン－１,３－ジイル、２－ブテン－１,４－ジイル、２－ブテン－２,３－ジイル、２－ブテン－２,４－ジイル、２－ブテン－３,４－ジイルなどを含む。アルケニレン基が窒素原子に結合しているならば、二重結合は窒素原子に対してアルファではあり得ない。「置換アルケニレン」は、アルケニレン基の水素原子の１以上(例えば１～アルケニレン基に結合する水素原子の最大数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または最大１０個、例えば１～５個、１～４個または１～３個または１個または２個)が水素以外の置換基で置換されていることを意味する(１を超える水素原子が置換されるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベルの置換基である。
用語「シクロアルキレン」は「アルキレン」の環状非芳香族バージョンであり、ジェミナル、隣接または孤立ジラジカルである。ある実施態様において、シクロアルキレンは(ｉ)単環式または多環式(例えば二または三環式)および／または(ii)３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)である。ある実施態様において、シクロアルキレンは単、二または三環式３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)シクロアルキレンである。一般に、上記のようにシクロアルキレン部分の最後に「イレン」を使用する代わりに、最後に「ジイル」を使ってもよい(例えば、１,２－シクロプロピレンはシクロプロパン－１,２－ジイルとも称され得る)。シクロアルキレン基の例は、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロオクチレン、ビシクロ[３.２.１]オクチレン、ビシクロ[３.２.２]ノニレンおよびアダマンタニレン(例えば、トリシクロ[３.３.１.１３,７]デカン－２,２－ジイル)を含む。「置換シクロアルキレン」は、アルキレン基の水素原子の１以上(例えば１～シクロアルキレン基に結合する水素原子の最大数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または最大１０個、例えば１～５個、１～４個または１～３個または１個または２個)が水素以外の置換基で置換されていることを意味する(１を超える水素原子が置換されるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベルの置換基である。
用語「シクロアルケニレン」は「アルケニレン」の環状非芳香族バージョンを表し、ジェミナル、隣接または孤立ジラジカルである。一般に、シクロアルケニレン基における炭素－炭素二重結合の最大数はシクロアルケニレン基の炭素原子を２で除し、シクロアルケニレン基の炭素原子が奇数であるならば、除算の結果を次の下の整数に丸めた、整数と等しい。例えば、９個の炭素原子を有するシクロアルケニレン基について、炭素－炭素二重結合の最大数は４個である。好ましくは、シクロアルケニレン基は１～６(例えば１～４)個、すなわち、１個、２個、３個、４個、５個または６個の素－炭素二重結合を有する。ある実施態様において、シクロアルケニレンは(ｉ)単環式または多環式(例えば二または三環式)および／または(ii)３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)である。ある実施態様において、シクロアルケニレンは単、二または三環式３～１４員(すなわち、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、１１員、１２員、１３員または１４員、例えば３～１２員または３～１０員)シクロアルケニレンである。シクロアルケニレン基の例は、シクロヘキセニレン、シクロヘプテニレン、シクロプロペニレン、シクロブテニレン、シクロペンテニレンおよびシクロオクテニレンを含む。「置換シクロアルケニレン」は、シクロアルケニレン基の水素原子の１以上(例えば１～シクロアルケニレン基に結合する水素原子の最大数、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または最大１０個、例えば１～５個、１～４個または１～３個または１個または２個)が水素以外の置換基で置換されていることを意味する(１を超える水素原子が置換されるとき、置換基は同一でも異なってもよい)。好ましくは、水素以外の置換基は、ここに特定する第一レベルの置換基である。
炭化水素に関連して使用される用語「芳香族」は、分子全体が芳香族でなければならないことを意味する。例えば、単環式アリールが水素化されるならば(部分的にまたは完全に)、得られた水素化環状構造は、本発明の目的でシクロアルキルとして分類される。同様に、二または多環式アリール(例えばナフチル)が水素化されるならば、得られた水素化二または多環式構造(例えば１,２－ジヒドロナフチル)は、本発明の目的でシクロアルキルとして分類される(１,２－ジヒドロナフチルにおけるなどの環の１個がなお芳香族であっても)。
典型的第一レベルの置換基は、好ましくはＣ１－３アルキル、フェニル、ハロゲン、－ＣＦ３、－ＯＨ、－ＯＣＨ３、－ＳＣＨ３、－ＮＨ２－ｚ(ＣＨ３)ｚ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＨおよび－Ｃ(＝Ｏ)ＯＣＨ３からなる群から選択され、ここで、ｚは０、１または２であり、Ｃ１－３アルキルはメチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルである。特に好ましい第一レベルの置換基はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ハロゲン(例えばＦ、ＣｌまたはＢｒ)および－ＣＦ３、例えばハロゲン(例えば、Ｆ、ＣｌまたはＢｒ)および－ＣＦ３からなる群から選択される。
凍結組成物に関連してここで使用する表現「凍結組成物解凍後」は、凍結組成物が、特徴(例えば、ＲＮＡ完全性および／または組成物に含まれるＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)が測定され得る前に解凍されなければならないことを意味する。
「１価」化合物は、目的の官能基を１個のみ有する化合物に関する。例えば、１価アニオンは、好ましくは生理学的条件下、負荷電基を１個のみ有する化合物に関する。
「２価」または「二塩基」化合物は、目的の官能基を２個有する化合物に関する。例えば、二塩基性有機酸は、２個の酸基を有する。
「多価」または「多塩基」化合物は、目的の官能基を３個以上有する化合物に関する。例えば、多塩基性有機酸は、３個以上の酸基を有する。
表現「ＲＮＡ完全性」は、サンプルに含まれるＲＮＡの総量(すなわち、非フラグメント化＋フラグメント化ＲＮＡ)に対する完全長(すなわち、非フラグメント化)ＲＮＡのパーセンテージを意味する。ＲＮＡ完全性は、クロマトグラフ的にＲＮＡを分離し(例えば、キャピラリー電気泳動を使用)、主ＲＮＡピークのピーク面積(すなわち、完全長(すなわち、非フラグメント化)ＲＮＡのピーク面積)を決定し、総ＲＮＡのピーク面積を決定し、主ＲＮＡピークのピーク面積を総ＲＮＡのピーク面積で除することにより決定され得る。
用語「凍結保護剤」は、凍結段階中製剤の活性成分を保護するために製剤(例えば、製剤または組成物)に転嫁される物質に関する。
本発明により、用語「ペプチド」はオリゴおよびポリペプチドを含み、互いにペプチド結合を介して結合する約２以上、約３以上、約４以上、約６以上、約８以上、約１０以上、約１３以上、約１６以上、約２０以上および最大約５０、約１００または約１５０の連続アミノ酸を含む、物質をいう。用語「タンパク質」は大型ペプチド、特に少なくとも約１５１アミノ酸を有するペプチドをいうが、用語「ペプチド」および「タンパク質」はここでは通常同義語として使用される。
「治療タンパク質」は、治療有効量で対象に提供したとき、対象の状態または疾患状態に正のまたは有利な効果を有する。ある実施態様において、治療タンパク質は治癒的または軽減的性質を有し、疾患または障害の以上の症状の改善、緩和、軽減、逆転、発症遅延または重症度低減のために投与され得る。治療タンパク質は予防的性質を有し得て、疾患発症遅延またはこのような疾患または病態の重症度低減のために投与され得る。用語「治療タンパク質」はタンパク質またはペプチド全体を含み、その治療活性フラグメントもいい得る。タンパク質の治療活性バリアントも含み得る。治療活性タンパク質の例は、ワクチン接種用抗原およびサイトカインなどの免疫刺激剤を含むが、これらに限定されない。
本発明によると、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)などの核酸が、細胞に取り込まれまたは導入されたら、すなわちトランスフェクトまたは形質導入されたら、その細胞はインビトロで存在するかまたは対象で該ペプチドまたはタンパク質の発現をもたらし得ることが好ましい。細胞は細胞内でコードしたペプチドまたはタンパク質を発現し得るか(例えば細胞質内および／または核内)、コードしたペプチドまたはタンパク質を分泌し得るかまたは表面に発現し得る。
本発明によると、「発現する核酸」および「コードする核酸」などの用語または類似の用語はここで相互交換可能に使用され、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞に存在するならば、該ペプチドまたはポリペプチドを産生するよう発現され得ることを意味する。
用語「部分」は、フラクションをいう。アミノ酸配列またはタンパク質などの特定の構造に関して、その「部分」なる用語は、該構造の連続的または非連続的フラクションを意味し得る。
用語「一部」および「フラグメント」はここで相互交換可能に使用され、連続的要素をいう。例えば、アミノ酸配列またはタンパク質などの構造の一部は、該構造の連続的要素をいう。組成物の文脈で使用するとき、用語「一部」は、組成物の部分を意味する。例えば、組成物の一部は、該組成物の０.１％～９９.９％(例えば０.１％、０.５％、１％、５％、１０％、５０％、９０％または９９％)のあらゆる部分であり得る。
アミノ酸配列(ペプチドまたはタンパク質)を参照する「フラグメント」は、アミノ酸配列の一部、すなわちＮ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列をいう。Ｃ末端で短縮されたフラグメント(Ｎ末端フラグメント)は、例えば、オープンリーディングフレームの３’末端を欠く切断オープンリーディングフレームの翻訳により、得られ得る。Ｎ末端で短縮されたフラグメント(Ｃ末端フラグメント)は、例えば、オープンリーディングフレームの５’末端を欠く切断オープンリーディングフレームの翻訳により切断オープンリーディングフレームが翻訳を開始させるための開始コドンを含む限り、得られ得る。アミノ酸配列のフラグメントは、アミノ酸配列からのアミノ酸残基の、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。アミノ酸配列のフラグメントは、好ましくはアミノ酸配列からの少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０または少なくとも１００連続アミノ酸を含む。
本発明によると、ペプチドまたはタンパク質の一部またはフラグメントは、好ましくはそれがもたらされたペプチドまたはタンパク質の１個の機能的性質の少なくとも１個を有する。このような機能的性質は、薬理学的活性、他のペプチドまたはタンパク質との相互作用、酵素活性、抗体との相互作用および核酸の選択的結合を含む。例えば、ペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性フラグメントは、フラグメントがもたらされたペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性の少なくとも１個を含む。ペプチドまたはタンパク質の一部またはフラグメントは、好ましくはペプチドまたはタンパク質の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０または少なくとも５０連続アミノ酸の配列を含む。ペプチドまたはタンパク質の一部またはフラグメントは、好ましくはペプチドまたはタンパク質の最大８、特に最大１０、最大１２、最大１５、最大２０、最大３０または最大５５連続アミノ酸の配列を含む。
ここでの「バリアント」は、少なくとも１個のアミノ酸修飾により親アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を意味する。親アミノ酸配列は天然に存在するかまたは野生型(ＷＴ)アミノ酸配列であり得るかまたは野生型アミノ酸配列の修飾バージョンであり得る。好ましくは、バリアントアミノ酸配列は、親アミノ酸配列と比較して少なくとも１個のアミノ酸修飾、例えば、親と比較して１～約２０アミノ酸修飾および好ましくは１～約１０または１～約５アミノ酸修飾を有する。
ここでの「野生型」または「ＷＴ」または「天然」は、アレル変異を含む、天然にみられるアミノ酸配列を意味する。野生型アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列を有する。
本発明の目的で、アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)の「バリアントは、アミノ酸挿入バリアント、アミノ酸付加バリアント、アミノ酸欠失バリアントおよび／またはアミノ酸置換バリアントを含む。用語「バリアント」は、全変異体、スプライスバリアント、翻訳後修飾バリアント、立体構造、アイソフォーム、アレルバリアント、種バリアントおよび種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。用語「バリアント」は、特に、アミノ酸配列のフラグメントを含む。
アミノ酸挿入バリアントは、特定のアミノ酸配列に単一または２以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列バリアントの場合、１以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、得られた産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。アミノ酸付加バリアントは、１以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸のアミノおよび／またはカルボキシ末端融合を含む。アミノ酸欠失バリアントは、配列からの１以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０以上アミノ酸の除去により特徴づけられる。欠失はタンパク質のどの位置でのよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失バリアントは、Ｎ末端および／またはＣ末端短縮化バリアントとも称される。アミノ酸置換バリアントは、除去される配列における少なくとも１個の残基およびその場所に挿入される他の残基により特徴づけられる。相同タンパク質またはペプチドで保存されていないアミノ酸配列における位置の修飾および／またはアミノ酸の類似の性質を有する他のものへの置換が優先する。好ましくは、ペプチドおよびタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、類似の電荷または非電荷アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、側鎖が関連するアミノ酸ファミリーの一つの置換を含む。天然に存在するアミノ酸は一般に４ファミリーに分けられる：酸性(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性(リシン、アルギニン、ヒスチジン)、非極性(アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)および非電荷極性(グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン)アミノ酸。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンはまとめて芳香族アミノ酸として分類されることがある。ある実施態様において、保存的アミノ酸置換は、次の群内での置換を含む：
－ グリシン、アラニン；
－ バリン、イソロイシン、ロイシン；
－ アスパラギン酸、グルタミン酸；
－ アスパラギン、グルタミン；
－ セリン、スレオニン；
－ リシン、アルギニン；および
－ フェニルアラニン、チロシン。
好ましくはあるアミノ酸配列と該あるアミノ酸配列のバリアントであるアミノ酸配列の間の類似度、好ましくは同一性は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。類似度または同一性は、好ましくは参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％であるアミノ酸領域について示される。例えば、参照アミノ酸配列が２００アミノ酸からなるとき、類似度または同一性は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００アミノ酸、ある実施態様において、連続アミノ酸について示される。ある実施態様において、類似度または同一性は参照アミノ酸配列の全長について示される。配列類似性、好ましくは配列同一性決定のためのアラインメントは、当分野で知られるツールで、好ましくは最良配列アラインメントを使用して、例えば、Alignを使用して、標準設定、好ましくはEMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5を使用して、実施され得る。
「配列類似性」は、同一であるまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸のパーセンテージを示す。２個のアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これら配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。２個の核酸配列間の「配列同一性」は、これら配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを示す。
用語「％同一」および「％同一性」または類似の用語は、特に、比較する配列間で最適アラインメントで同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセンテージをいうことが意図される。該パーセンテージは純粋に統計であり、２配列間の差異は、比較する配列の全長にわたり、必ずしもではないが、無作為に分布している可能性がある。２配列の比較は、通常、最適アラインメント後の、対応する配列の局所領域を同定するための、配列のセグメントまたは「比較域」の比較により実施される。比較のための最適アラインメントは手動でまたはSmith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同性アルゴリズムの助けを借りて、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 88, 2444の類似性サーチアルゴリズムの助けを借りてまたは該アルゴリズムを使用するコンピュータープログラムの助けを借りて実施し得る(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)。ある実施態様において、２配列のパーセント同一性は、United States National Center for Biotechnology Information (NCBI)ウェブサイト(例えばblast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq&LINK_LOC=align2seq)で入手可能なＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して、決定する。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＮアルゴリズムで使用されるアルゴリズムパラメータは：(ｉ)１０に設定したしきい値；(ii)２８に設定した用語サイズ；(iii)０に設定したクエリー範囲における最大マッチ；(iv)１、－２に設定したマッチ／ミスマッチスコア；(ｖ)線形に設定したギャップコスト；および(vi)使用される低複雑性領域のフィルターを含む。ある実施態様において、ＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴＰアルゴリズムで使用されるアルゴリズムパラメータは：(ｉ)１０に設定したしきい値；(ii)３に設定した用語サイズ；(iii)０に設定したクエリー範囲における最大マッチ；(iv)ＢＬＯＳＵＭ６２に設定したマトリクス；(ｖ)存在に設定したギャップコスト：１１伸長：１；および(vi)条件的組成スコアマトリクス調整を含む。
パーセンテージ同一性は、比較する配列が対応する同一位置数の決定、この数の比較位置数での徐算(例えば、参照配列における位置数)およこの結果の１００での乗算を含む。
ある実施態様において、類似度または同一性は、参照配列の全長の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または約１００％である領域について示される。例えば、参照核酸配列が２００ヌクレオチドからなるならば、同一性の程度は、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０または約２００ヌクレオチド、ある実施態様において、連続ヌクレオチドについて示される。ある実施態様において、類似度または同一性は参照配列の全長について示される。
相同アミノ酸配列は、本発明により、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％および好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８または少なくとも９９％同一性を示す。
ここに記載するアミノ酸配列バリアントは、例えば、組み換えＤＮＡ操縦により、当業者により容易に調製され得る。置換、付加、挿入または欠失を有するペプチドまたはタンパク質を調製するためのＤＮＡ配列の操縦は、例えば、Sambrook et al. (1989)に詳述される。さらに、ここに記載するペプチドおよびアミノ酸バリアントは、例えば、固相合成および類似の方法などの、既知ペプチド合成技術の助けを借りて、容易に調製し得る。
ある実施態様において、アミノ酸配列(ペプチドまたはタンパク質)のフラグメントまたはバリアントは、好ましくは「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」である。アミノ酸配列の「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」なる用語は、それが由来するアミノ酸配列と同一または類似の１以上の機能的性質を示すあらゆるフラグメントまたはバリアントに関し、すなわち、機能的に等価である。抗原または抗原性配列に関して、ある特定の機能は、フラグメントまたはバリアントが由来するアミノ酸配列により示される１以上の免疫原性活性である。ここで使用する用語「機能的フラグメント」または「機能的バリアント」は、特に親分子または配列のアミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸が変更され、なお、親分子または配列の機能の１以上、例えば、免疫応答の誘発を満たすことができる、バリアント分子または配列をいう。ある実施態様において、親分子または配列のアミノ酸配列の修飾は、分子または配列の特徴に顕著に影響しないまたは変更しない。異なる実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの機能は減少してよいが、なお、顕著に存在する、例えば、機能的バリアントの免疫原性は、親分子または配列の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％であり得る。しかしながら、他の実施態様において、機能的フラグメントまたは機能的バリアントの免疫原性は親分子または配列と比較して増強され得る。
指定するアミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)「由来の」アミノ酸配列(ペプチド、タンパク質またはポリペプチド)は、最初のアミノ酸配列の起源をいう。好ましくは、特定のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列は、特定の配列またはそのフラグメントと同一、本質的に同一または相同であるアミノ酸配列を有する。特定のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列は、特定の配列またはそのフラグメントのバリアントであり得る。例えば、ここで使用するのに適する抗原は、由来した天然に存在するまたは天然配列と配列が異なるが、天然配列の望ましい活性を保持するように変更され得ることを当業者は理解する。
「単離」は、天然状態から変更または除去されることを意味する。例えば、生存動物に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、天然状態の併存物質から部分的にまたは完全に単離される同じ核酸またはペプチドは「単離」されている。単離核酸またはタンパク質は、実質的に純粋な形態で存在できまたは、例えば、宿主細胞など非天然環境で存在できる。好ましい実施態様において、本発明で使用する(例えば、ｍＲＮＡ)は実質的に純粋な形態である。ある実施態様において、実質的に純粋な形態のＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)の溶液(好ましくは水溶液)は第一緩衝系を含む。
用語「遺伝子修飾」または単に「修飾」は、細胞を核酸でトランスフェクションすることを含む。用語「トランスフェクション」は、核酸、特にＲＮＡの細胞の導入に関する。本発明の目的で、用語「トランスフェクション」はまた細胞への核酸の導入またはそのような細胞による核酸の取り込みも含み、ここで、細胞は対象、例えば、患者に存在し得る。故に、本発明により、ここに記載する核酸のトランスフェクションのための細胞はインビトロまたはインビボに存在でき、例えば細胞は患者の臓器、組織および／または有機体の一部を形成できる。本発明によると、トランスフェクションは一過性でも安定でもよい。トランスフェクションの一部適用について、トランスフェクトした遺伝物質が一過性にのみ発現するので十分であり得る。ＲＮＡを、そのコードタンパク質を一過性に発現させるために細胞にトランスフェクトし得る。トランスフェクション過程で導入される核酸が通常核ゲノムに統合されないため、外来核酸は有糸分裂を介して希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅が可能な細胞は、希釈率が大きく減少する。トランスフェクトした核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残存することが望ましいならば、安定なトランスフェクションを行わなければならない。このような安定なトランスフェクションは、トランスフェクションのためのウイルスベースの系またはトランスポゾンベースの系を使用して達成できる。一般に、抗原をコードする核酸は、細胞に一過性にトランスフェクトされる。ＲＮＡを、そのコードタンパク質を一過性に発現させるために細胞にトランスフェクトし得る。
本発明によると、ペプチドまたはタンパク質のアナログは、それが由来し、該ペプチドまたはタンパク質の１個の機能的性質の少なくとも１個を有する該ペプチドまたはタンパク質の修飾携帯である。例えば、ペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性アナログは、アナログが由来するペプチドまたはタンパク質の薬理学的活性の少なくとも１個を有する。このような修飾は、何らかの化学修飾を含み、炭水化物、脂質および／またはタンパク質またはペプチドなどのタンパク質またはペプチドと関連する何れかの分子の単一または複数置換、欠失および／または付加を含む。ある実施態様において、タンパク質またはペプチドの「アナログ」は、グルコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護／遮断基の導入、タンパク質分解切断または抗体もしくは他の細胞リガンドへの結合に由来する修飾形態である。用語「アナログ」は、該タンパク質およびペプチドの全ての機能的化学等価物にまで拡大される。
ここで使用する「活性化」または「刺激」は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されているＴ細胞などの免疫エフェクター細胞の状態をいう。活性化はまたシグナル伝達経路開始、サイトカイン産生誘導および検出可能なエフェクター機能とも関連し得る。用語「活性化免疫エフェクター細胞」は、とりわけ、細胞分裂を受けている免疫エフェクター細胞をいう。
用語「プライミング」は、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞が特異的抗原と最初に接触し、エフェクターＴ細胞などのエフェクター細胞への分化が引き起こされる過程をいう。
用語「クローン性拡大」または「拡大」は、特定のものが増加する過程をいう。本発明において、本用語は、好ましくは免疫エフェクター細胞が抗原により刺激され、増殖し、該抗原により認識される特異的免疫エフェクター細胞が増幅される、免疫学的応答の状況で使用される。好ましくは、クローン性拡大は、免疫エフェクター細胞の分化に至る。
本発明による「抗原」は、免疫応答を引き起こすあらゆる物質および／または細胞応答などの免疫応答または免疫機構が向かうあらゆる物質をいう。これはまた、特にＭＨＣ分子の状況で提示されるとき、抗原が抗原ペプチドに処理され、免疫応答または免疫機構が１以上の抗原ペプチドに向かう状況も含む。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球(Ｔ細胞)と特異的に反応するあらゆる物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質に関する。本発明により、用語「抗原」は、Ｔ細胞エピトープなどの少なくとも１個のエピトープを含むあらゆる分子を含む。好ましくは、本発明における抗原は、所望により、処理後、好ましくは抗原(抗原発現細胞を含む)特異的である免疫反応を誘導する分子である。ある実施態様において、抗原は、腫瘍抗原、ウイルス抗原もしくは細菌抗原などの疾患関連抗原またはそのような抗原由来のエピトープである。
本発明によると、免疫応答のための候補であるあらゆる適当な抗原を使用してよく、ここで、免疫応答は液性および細胞免疫応答両方であり得る。本発明のある実施態様において、抗原は、好ましくは、ＭＨＣ分子の状況で、細胞により、好ましくは抗原提示細胞により提示され、これは、抗原に対する免疫応答をもたらす。抗原は、好ましくは天然に存在する抗原に対するまたはそれに由来する産物である。このような天然に存在する抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫およびその他感染因子ならびに病原体を含むかまたはそれに由来してよくまたは抗原は腫瘍抗原であってよい。本発明により、抗原は天然に存在する産物、例えば、ウイルスタンパク質またはその一部に対応し得る。
用語「疾患関連抗原」は、その最も広い意味で使用して、疾患と関連するあらゆる抗原をいう。疾患関連抗原は、疾患に対する細胞性抗原特異的免疫応答および／または液性抗体応答を行うために宿主の免疫系を刺激するエピトープを含む分子である。疾患関連抗原は、病原体関連抗原、すなわち、微生物による感染に関連する抗原、典型的に微生物抗原(例えば細菌またはウイルス抗原)または腫瘍抗原などの癌、典型的に腫瘍と関連する抗原を含む。
好ましい実施態様において、抗原は腫瘍抗原、すなわち、腫瘍細胞の一部、特に主に腫瘍細胞の細胞内にまたは表面抗原として現れるものである。他の実施態様において、抗原は病原体関連抗原、すなわち、病原体、例えば、ウイルス、細菌、単細胞生物または寄生虫由来の抗原、例えばウイルスリボヌクレオタンパク質またはコートタンパク質などのウイルス抗原である。特に、抗原は、特に、Ｔ細胞受容体活性調節を介して、特に、免疫系細胞、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の活性化を調節するＭＨＣ分子により提示されるべきである。
用語「腫瘍抗原」は、細胞質、細胞表面または細胞核由来であり得る癌細胞の構成要素をいう。特に、腫瘍細胞の細胞内または表面抗原として産生される抗原をいう。例えば、腫瘍抗原は、癌胎児性抗原、α１－フェトプロテイン、イソフェリチンおよび胎児性スルホ糖タンパク質、α２－Ｈ－フェロプロテインおよびγ－フェトプロテインならびに種々のウイルス腫瘍抗原を含む。本発明により、腫瘍抗原は、好ましくは腫瘍または癌にならびにタイプおよび／または発現レベルについて腫瘍または癌細胞で特徴的であるあらゆる抗原を含む。
用語「ウイルス抗原」は抗原性性質を有する、すなわち、個体で免疫応答を誘導できる、あらゆるウイルス要素をいう。ウイルス抗原はウイルスリボヌクレオタンパク質またはエンベロープタンパク質であり得る。
用語「細菌抗原」は、抗原性性質を有する、すなわち、個体で免疫応答を誘導できる、あらゆる細菌要素をいう。細菌抗原は細菌の細胞壁または細胞質膜に由来し得る。
用語「エピトープ」は、抗原における分子の抗原性決定基、すなわち、例えば、特に、ＭＨＣ分子の状況で提示されるとき、抗体Ｔ細胞またはＢ細胞により認識される、免疫系により認識される分子の一部またはフラグメントをいう。タンパク質のエピトープは、好ましくは該タンパク質の連続的または非連続的部分を含み、好ましくは約５～約１００、好ましくは約５～約５０、より好ましくは約８～約０、最も好ましくは約１０～約２５アミノ酸長である、例えば、エピトープは好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であり得る。本発明においてエピトープがＴ細胞エピトープであるのが特に好ましい。
「エピトープ」、「抗原のフラグメント」、「免疫原性ペプチド」および「抗原ペプチド」などの用語はここで相互交換可能に使用され、好ましくは抗原または抗原を発現するもしくは含むおよび好ましくは提示する細胞に対して免疫応答を誘発できる、好ましくは抗原の不完全な表現に関する。好ましくは、本用語は、抗原の免疫原性部分に関する。好ましくは、特にＭＨＣ分子の状況で提示されるならば、Ｔ細胞受容体により認識される(すなわち、特異的に結合される)抗原の部分である。ある好ましい免疫原性部分は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスII分子に結合する。用語「エピトープ」は、免疫系により認識される抗原などの分子の一部またはフラグメントをいう。例えば、エピトープはＴ細胞、Ｂ細胞または抗体により認識され得る。抗原のエピトープは抗原の連続的または非連続的部分を含み得て、約５～約１００、例えば約５～約５０、より好ましくは約８～約３０、最も好ましくは約８～約２５アミノ酸長であってよく、例えば、エピトープは好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５アミノ酸長であってよい。ある実施態様において、エピトープは約１０～約２５アミノ酸長である。用語「エピトープ」はＴ細胞エピトープを含む。
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子の状況で提示されるとき、Ｔ細胞により認識されるタンパク質の一部またはフラグメントをいう。用語「主要組織適合性複合体」および略語「ＭＨＣ」はＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスII分子を含み、全脊椎動物に存在する遺伝子複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または罹患細胞の間のシグナル伝達に重要であり、ここで、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドエピトープに結合し、Ｔ細胞のＴ細胞受容体に認識されるようにエピトープを提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は細胞表面に発現され、自己抗原(細胞自体からのペプチドフラグメント)および非自己抗原(例えば、侵襲微生物のフラグメント)をＴ細胞に提示する。クラスＩ ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的に約８～約１０アミノ酸長であるが、それより長いまたは短いペプチドが有効であり得る。クラスII ＭＨＣ／ペプチド複合体の場合、結合ペプチドは典型的に約１０～約２５アミノ酸長であり、特に約１３～約１８アミノ酸長であるが、それより長いまたは短いペプチドが有効であり得る。
ペプチドおよびタンパク質抗原は、例えば、５アミノ酸、１０アミノ酸、１５アミノ酸、２０アミノ酸、２５アミノ酸、３０アミノ酸、３５アミノ酸、４０アミノ酸、４５アミノ酸または５０アミノ酸長を含む、２～１００アミノ酸であり得る。ある実施態様において、ペプチドは５０を超えるアミノ酸であり得る。ある実施態様において、ペプチドは１００を超えるアミノ酸であり得る。
ペプチドまたはタンパク質抗原は、免疫系がペプチドまたはタンパク質に対する抗体を産生する能力およびＴ細胞応答を誘導または増加できるあらゆるペプチドまたはタンパク質であり得る。
ある実施態様において、ワクチン抗原、すなわち、対象への接種が免疫応答を誘導する抗原は免疫エフェクター細胞により認識される。好ましくは、ワクチン抗原は、免疫エフェクター細胞により認識されるならば、適切な共刺激シグナルの下、ワクチン抗原を認識する抗原受容体を運搬する免疫エフェクター細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大を誘導できる。本発明の実施態様において、ワクチン抗原は、好ましくは細胞、好ましくは抗原提示細胞の表面に提示されるかまたは存在する。ある実施態様において、抗原は罹患細胞(例えば腫瘍細胞または感染細胞)により提示される。ある実施態様において、抗原受容体は、ＭＨＣの状況で提示される抗原のエピトープに結合するＴＣＲである。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、抗原提示細胞などの細胞により提示される抗原に呈してＴ細胞により発現および／またはＴ細胞により提示されたとき、該Ｔ細胞の刺激、プライミングおよび／または拡大をもたらす。ある実施態様において、ＴＣＲの結合は、罹患細胞に提示される抗原に対してＴ細胞により発現および／またはＴ細胞により提示されたとき、罹患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスをもたらし、ここで、該Ｔ細胞は、好ましくは細胞毒性因子、例えば、パーフォリンおよびグランザイムを放出する。
ある実施態様において、抗原受容体は、抗原のエピトープに結合する抗体またはＢ細胞受容体である。ある実施態様において、抗体またはＢ細胞受容体は、抗原の天然エピトープに結合する。
用語「細胞表面に発現」または「細胞表面と結合」は、抗原などの分子が細胞の原形質膜と結合し、そこに位置し、ここで、分子の少なくとも一部は、該細胞の細胞外空間に面し、例えば、細胞の外側に位置する抗体により、該細胞の外側から接近可能である。この状況で、一部は、好ましくは少なくとも４、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸である。結合は直接的でも間接的でもよい。例えば、結合は１以上の膜貫通ドメイン、１以上の脂質アンカーによるまたは何らかの他のタンパク質、脂質、サッカライドまたは細胞の原形質膜の外葉に見られ得るその他の構造との相互作用によるものであり得る。例えば、細胞表面と結合する分子は、細胞外部分を有する膜貫通タンパク質であってよくまたは膜貫通タンパク質である他のタンパク質との相互作用により細胞表面に結合するタンパク質であってよい。
「細胞表面」または「細胞の表面」は、当分野でのその通常の意味に従い使用され、故に、タンパク質およびその他分子による結合のために接近可能な細胞の外側を含む。抗原は、該細胞の表面に位置するならば、細胞表面に発現され、例えば、細胞に加えられた抗原特異的抗体による結合のために接近可能である。
本発明において用語「細胞外部分」または「エキソドメイン」は、細胞の細胞外空間に面し、好ましくは、例えば、細胞の外側に位置する抗体などの結合分子により該細胞の外側から接近可能である、タンパク質などの分子の一部をいう。好ましくは、本用語は、１以上の細胞外ループまたはドメインまたはそのフラグメントをいう。
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」はここで相互交換可能に使用され、Ｔヘルパー細胞(ＣＤ４＋ Ｔ細胞)および細胞溶解Ｔ細胞を含む細胞毒性Ｔ細胞(ＣＴＬ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞)を含む。用語「抗原特異的Ｔ細胞」または類似の用語は、特にＭＨＣ分子の状況において、抗原提示細胞または癌細胞などの罹患細胞の表面に提示されたとき、Ｔ細胞が向かう抗原を認識し、好ましくはＴ細胞のエフェクター機能を発揮する、Ｔ細胞に関する。Ｔ細胞は、細胞が抗原を発現する標的細胞を殺すならば、抗原に特異的であると考えられる。Ｔ細胞特異性は、例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイ内の多様な標準的技術の何れかを使用して、評価し得る。あるいは、リンホカイン(例えばインターフェロン－γ)の合成が測定され得る。本発明のある実施態様において、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は少なくとも１個のエピトープをコードする。
用語「標的」は、細胞免疫応答などの免疫応答に対する標的である、細胞または組織などの因子を意味する。標的は、抗原または抗原エピトープ、すなわち、抗原由来のペプチドフラグメントを提示する細胞を含む。ある実施態様において、標的細胞は、抗原を発現する、好ましくはクラスＩ ＭＨＣと共に該抗原を提示する、細胞である。
「抗原プロセシング」は、該抗原のフラグメントであり(例えば、タンパク質のペプチドへの分解)、特異的Ｔ細胞のために細胞、好ましくは抗原提示細胞による提示のために、これらのフラグメントの１以上(例えば、結合により)とＭＨＣ分子を会合させる、抗原のプロセシング産物への分解をいう。
「抗原応答性ＣＴＬ」は、抗原提示細胞表面にクラスＩ ＭＨＣと共に提示される、該抗原由来の抗原またはペプチドに応答性であるＣＤ８＋ Ｔ細胞を意味する。
本発明によると、ＣＴＬ応答性は、持続するカルシウム流、細胞分裂、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－αなどのサイトカイン産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカー上方制御ならびに腫瘍抗原発現標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含み得る。ＣＴＬ応答性は、正確にＣＴＬ応答性を示す人工レポーターを使用して決定もし得る。
用語「免疫応答」および「免疫反応」は、ここでは慣用の意味で相互交換可能に使用され、抗原に対する統合された身体的応答をいい、好ましくは細胞免疫応答、液性免疫応答または両者をいう。本発明によると、抗原、細胞または組織などの因子に関して「免疫応答」または「対する免疫応答」なる用語は、該因子に対して向かう細胞応答などの免疫応答に関する。免疫応答は、インビトロで種々の増殖またはサイトカイン産生試験で検出され得る、１以上の抗原に対する抗体の産生および抗原特異的Ｔリンパ球、好ましくはＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔリンパ球、より好ましくはＣＤ８＋ Ｔリンパ球の拡大からなる群から選択される１以上の反応を含み得る。
本発明における用語「免疫応答の誘導」および「免疫応答の惹起」および類似の用語は、免疫応答の誘導、好ましくは細胞免疫応答、液性免疫応答または両者の誘導をいう。免疫応答は防止的／阻止的／予防的および／または治療的であり得る。免疫応答は、何らかの免疫原または抗原または抗原ペプチドに対する、好ましくは腫瘍関連抗原または病原体関連抗原に対するものであり得る(例えば、ウイルス(例えばインフルエンザウイルス(Ａ、ＢまたはＣ)、ＣＭＶまたはＲＳＶ)の抗原)。この状況で「誘導」は、誘導前には特定の抗原または病原体に対する免疫応答がなかったことを意味し得て、また、誘導前には特定の抗原または病原体に対する一定レベルの免疫応答があり、該免疫応答後増強されることも意味し得る。故に、この状況で「免疫応答の誘導」は「免疫応答の増強」も含む。好ましくは、個体での免疫応答の誘導後、該個体は、免疫応答の誘導により、感染性疾患または癌性疾患などの疾患の発症から保護されるかまたは疾患状態が軽減される。
用語「細胞免疫応答」、「細胞応答」、「細胞介在免疫」または類似の用語は、抗原を発現するおよび／またはクラスＩまたはクラスII ＭＨＣと共に抗原を提示することにより特徴づけられる、細胞に対する細胞応答を含むことを意味する。細胞応答は、「ヘルパー」または「キラー」として作用するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関する。ヘルパーＴ細胞(ＣＤ４＋ Ｔ細胞とも称される)は、免疫応答制御により中心的役割を果たし、キラー細胞(細胞毒性Ｔ細胞、細胞溶解Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される)は、罹患細胞などの細胞を殺す。
用語「液性免疫応答」は、抗体が、最終的に中和および／または排除される因子および生物に対する応答により産生される、生存生物における過程をいう。抗体応答の特異性は、単一特異性の抗原に結合する膜関連受容体を介してＴおよび／またはＢ細胞により媒介される。適切な抗原への結合および種々の他の活性化シグナル受容後、Ｂリンパ球は分裂し、記憶Ｂ細胞ならびに抗体分泌形質細胞クローンを産生し、各々、その抗原受容体により認識されたのと同一の抗原性エピトープを認識する抗体を産生する。記憶Ｂリンパ球は、その後特異的抗原により活性化されるまで休止状態である。これらのリンパ球は、記憶の細胞基盤および特異的抗原に再暴露されたとき抗体応答の結果的な増大を提供する。
ここで使用する用語「抗体」は、抗原のエピトープに特異的に結合できる免疫グロブリン分子をいう。特に、用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２個の重(Ｈ)鎖および２個の軽(Ｌ)鎖を含む糖タンパク質をいう。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および前記の何らかの組み合わせを含む。各重鎖は重鎖可変領域(ＶＨ)および重鎖定常領域(ＣＨ)からなる。各軽鎖は軽鎖可変領域(ＶＬ)および軽鎖定常領域(ＣＬ)からなる。可変領域および定常領域はここではそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインとも称する。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域(ＦＲ)と称される領域で分断される、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される、超可変性の領域にさらに細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端方向で次の順番に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨのＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称され、ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称される。重鎖および軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は重鎖定常領域(ＣＨ)および軽鎖定常領域(ＣＬ)を含み、ここで、ＣＨはさらに定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域および定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３に細分化され得る(アミノ末端からカルボキシ末端方向で次の順番に配置される：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３)。抗体の定常領域は免疫グロブリンの免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む宿主組織または因子への結合を媒介し得る。抗体は天然源または組み換え源由来のインタクトな免疫グロブリンであってよく、かつインタクトな免疫グロブリン免疫活性部分であってよい。抗体は、典型的に免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ(ａｂ)２ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む多様な形態で存在し得る。
用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗体またはＢ細胞受容体(ＢＣＲ)などの抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的免疫グロブリン(Ｉｇ)折り畳みを有する構造ドメイン、すなわち、免疫グロブリンドメインにより特徴づけられる。本用語は、膜結合免疫グロブリンおよび可溶性免疫グロブリンを含む。膜結合免疫グロブリンはまた一般にＢＣＲの一部である表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンもいう。可溶性免疫グロブリンは、一般に抗体をいう。免疫グロブリンは、一般にジスルフィド結合により連結される、数個の鎖、典型的に２個の同一重鎖および２個の同一軽鎖を含む。これらの鎖は、主にＶＬ(可変軽鎖)ドメイン、ＣＬ(定常軽鎖)ドメイン、ＶＨ(可変重鎖)ドメインおよびＣＨ(定常重鎖)ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４などの免疫グロブリンドメインからなる。５タイプの哺乳動物免疫グロブリン重鎖、すなわち、α、δ、ε、γおよびμがあり、異なるクラスの抗体、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭを担う。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは逆に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は膜貫通ドメインおよびカルボキシ末端に短細胞質ドメインを含む。哺乳動物において、２タイプの軽鎖、すなわち、ラムダおよびカッパがある。免疫グロブリン鎖は可変領域および定常領域を含む。定常領域は本質的に免疫グロブリンの種々のアイソタイプで保存され、ここで、可変部分は高度に可変であり、抗原認識を担う。
用語「ワクチン接種」および「免疫化」は、治療的または予防的理由で個体を処置する過程であり、ここに記載するとおり、１以上の免疫原または抗原またはその誘導体を、特にそれをコードするＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)の形態で、個体に投与し、該１以上の免疫原または抗原または該１以上の免疫原または抗原の提示により特徴づけられる細胞に対する免疫応答を刺激することに関する。
「抗原の提示により特徴づけられる細胞」または「抗原を提示する細胞」または「抗原提示細胞表面に抗原を提示するＭＨＣ分子」または類似の表現は、ＭＨＣ分子、好ましくはＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスII分子、最も好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の状況で、直接的にまたはその後のプロセシングで抗原または抗原ペプチドを提示する罹患細胞、特に腫瘍細胞または感染細胞または抗原提示細胞などの細胞を意味する。
本発明において、用語「転写」は、ＤＮＡ配列の遺伝コードがＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)に転写される過程に関する。続いて、ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)はペプチドまたはタンパク質に翻訳され得る。
ＲＮＡに関連して、用語「発現」または「翻訳」は、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の集合を指示し、ペプチドまたはタンパク質を形成する、細胞のリボソームによる過程に関する。
ここで使用する用語「任意の」または「所望により」は、続いて記載される事象、状況または状態が起こっても起こらなくてもよいことを意味し、本記載は、該事象、状況または状態が起こる場合および起こらない場合を含む。
ここに記載する特定の化合物のプロドラッグは、個体に投与されたら、生理学的条件下で化学変換を受けて、特定の化合物を提供する化合物である。さらに、プロドラッグは、エクスビボ環境で化学的または生化学的方法により特定の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、例えば、適当な酵素または化学試薬と経皮パッチリザーバーに入れたとき、特定の化合物にゆっくり変換し得る。プロドラッグの例は、インビボで加水分解可能なエステル(特定の化合物に含まれるアルコールまたはカルボキシ基を使用)またはアミド(特定の化合物に含まれるアミノまたはカルボキシ基を使用)である。具体的に、特定の化合物に含まれ、少なくとも１個の水素原子を担持するあらゆるアミノ基を、プロドラッグ形態に変換できる。典型的Ｎ－プロドラッグ形態は、カルバメート、マンニッヒ塩基、エナミンおよびエナミノンを含む。
「異性体」は、同じ分子式を有するが、構造が異なる(「構造異性体」)または官能基および／または原子の幾何的(空間)位置が異なる(「立体異性体」)化合物である。「エナンチオマー」は、互いに重なり合わない鏡像の立体異性体の対である。「ラセミ混合物」または「ラセミ体」は、等量でエナンチオマーの対を含み、接頭辞(±)により示される。「ジアステレオマー」は、互いに重ね合わせられず、鏡像ではない立体異性体の対である。「互変異性体」は、純粋であっても、個々の原子または原子の基の移動により、互いに自発的にかつ可逆的に相互変換する同じ化学物質の構造異性体である；すなわち、互変異性体は、互いに動的化学平衡である。互変異性体の例は、ケト－エノール－互変異性の異性体である。「配座異性体」は、形式上単結合に対して回転によってのみ相互変換され得る立体異性体であり － 特に － シクロヘキサンのいす型、半いす型、ふね型およびねじれふね型形態などの(ヘテロ)環状環の種々の３次元的形態をもたらすものである。
用語「平均直径」は、動的光散乱法(ＤＬＳ)により測定し、長さの寸法であるいわゆるＺ平均および無次元である多分散性指数(ＰＤＩ)を結果としてもたらすいわゆるキュムラントアルゴリズムを使用して、データ解析した粒子の平均流体力学直径をいう(Koppel, D., J. Chem. Phys. 57, 1972, pp 4814-4820, ISO 13321)。ここで、粒子に関する「平均直径」、「直径」または「サイズ」は、Ｚ平均のこの値と同義的に使用される。
「多分散性指数」は、好ましくは、「平均直径」の定義で記載したとおり、いわゆるキュムラント解析により動的光散乱法測定値に基づき計算される。ある必須条件下、ナノ粒子のアンサンブルのサイズ分布の測定として解釈し得る。
回転軸に対する粒子の「回転半径」(ここではＲｇと省略)は、粒子の全質量が集中すると仮定されたら、ある軸に対する慣性モーメントは質量の実際の分布と同じとなる、回転軸の点からの半径方向距離である。数学的に、Ｒｇは、その質量中心またはある軸からの粒子の成分の２乗平均平方根距離である。例えば、質量中心から固定距離ｓｉに位置する、ｎ個の質量要素からなる、質量ｍｉ(ｉ＝１、２、３、・・・、ｎ)の巨大分子について、Ｒｇは、全質量要素に対するｓｉ ２の質量平均の平方根であり、次のとおり計算できる：
回転半径は実験的に、例えば、光散乱法を使用して、決定または計算できる。特に、小散乱ベクター
について、構造関数Ｓは次のとおり定義される：
〔式中、Ｎは成分数(ギニエの法則)である。〕。
「Ｄ１０値」は、特に粒子の定量的サイズ分布に関して、粒子の１０％がこの値より小さい直径を有する、直径である。Ｄ１０値は、粒子集団内(例えば流動場分離法で得られる粒子ピーク内)の最小粒子の比率を記載することが意図される。
「Ｄ５０値」は、特に粒子の定量的サイズ分布に関して、粒子の５０％がこの値より小さい直径を有する、直径である。Ｄ５０値は、粒子集団内(例えば流動場分離法で得られる粒子ピーク内)の平均粒子径を記載することが意図される。
「Ｄ９０値」は、特に粒子の定量的サイズ分布に関して、粒子の９０％がこの値より小さい直径を有する、直径である。「Ｄ９５」、「Ｄ９９」および「Ｄ１００」値は対応する意味を有する。Ｄ９０、Ｄ９５、Ｄ９９およびＤ１００値は、粒子集団内(例えば流動場分離法で得られる粒子ピーク内)の大型粒子の比率を記載することが意図される。
粒子の「流体力学半径」(「ストークス半径」または「ストークス－アインシュタイン半径」と称されることもある)は、該粒子と同じ速度で拡散する仮想の硬球の半径である。流体力学半径は、サイズだけでなく、溶媒効果も考慮に入れて、粒子の移動性と関連する。例えば、電荷が小さく、水和が強い粒子は、電荷が大きく、水和が弱い粒子より大きな流体力学半径を有し得る。これは、小さい粒子が、溶液を移動するにつれて、大きな数の水分子を引き込むからである。溶媒中の粒子の実際の寸法は直接測定できないが、流体力学半径はストークス－アインシュタイン式により定義され得る：
〔式中、ｋＢはボルツマン定数であり；Ｔは温度であり；ηはであり；そしてＤは拡散係数である。〕。拡散係数は実験的に、例えば、動的光散乱法(ＤＬＳ)を使用して、決定できる。故に、粒子または粒子の集団(例えば、ここに開示する製剤または組成物に含まれるＬＮＰなどの粒子の流体力学半径またはそのような製剤または組成物を流動場分離法に付すことにより得られた粒子の流体力学半径)を得る一つの方法は、該粒子または粒子の集団のＤＬＳシグナル(例えば、ここに開示する製剤または組成物に含まれるＬＮＰなどの粒子のＤＬＳシグナルまたはそのような製剤または組成物を流動場分離法に付すことにより得られた粒子ピークのＤＬＳシグナル)の測定である。
ここで使用する用語「凝集」は、粒子の塊に関し、ここで、粒子は同一であるかまたは極めて類似し、互いに非共有結合的方法(例えば、イオン性相互作用、Ｈ橋相互作用、双極子相互作用および／またはファン・デル・ワールス相互作用)で結合する。
ここで使用する表現「光散乱法」は、光が通過する媒体中の局所的な不均一性により、光が１以上の経路で直線軌道から逸脱することを余儀なくされる物理的プロセスをいう。
用語「ＵＶ」は紫外を意味し、波長１０nm～４００nm、すなわち、可視光より短いが、Ｘ線より長い電磁スペクトルの帯をいう。
ここで使用する表現「マルチアングル光散乱法」または「ＭＡＬＳ」は、サンプルによる複数角への光散乱を測定する技術に関する。「マルチアングル」は、この点に関し、散乱光が、例えば、選択した特定角度を含む一定範囲を移動する単一検出器または特定の角位置に固定した一連の検出器により測定される、異なる別個の角度で検出できることを意味する。ある好ましい実施態様において、ＭＡＬＳで使用する光源は、レーザー源(ＭＡＬＬＳ：マルチアングルレーザー光散乱法)である。粒子を含む組成物のＭＡＬＳシグナルに基づき、かつ適切な定式化(例えば、ＺｉmMプロット、ＢｅｒｒｙプロットまたはＤｅｂｙｅプロット)を使用して、該粒子の回転半径(Ｒｇ)、故に、サイズを決定できる。好ましくは、ＺｉmMプロットは、次の式を使用したグラフ表示である：
〔式中、ｃは溶媒中の粒子の質量濃度であり(ｇ／mL)；Ａ２は第二ビリアル係数であり(mol・mL／ｇ２)；Ｐ(θ)は散乱光強度の角度依存性に関する形状因子であり；Ｒθは過剰レイリー比であり(cm－１)；そしてＫ＊は４π２ηｏ(ｄｎ／ｄｃ)２λ０ －４ＮＡ －１に等しい光学定数であり、ここで、ηｏは入射放射(真空)波長での溶媒の屈折率であり、λ０は入射放射(真空)波長(nm)であり、ＮＡはアボガドロ数(mol－１)であり、そしてｄｎ／ｄｃは示差屈折率増分(mL／ｇ)である。〕(例えば、Buchholz et al. (Electrophoresis 22 (2001), 4118-4128); B.H. Zimm (J. Chem. Phys. 13 (1945), 141; P. Debye (J. Appl. Phys. 15 (1944): 338;およびW. Burchard (Anal. Chem. 75 (2003), 4279-4291参照)。好ましくは、Ｂｅｒｒｙプロットは次の項を計算する：
〔式中、ｃ、ＲθおよびＫ＊は上に定義するとおりである。〕。好ましくは、Ｄｅｂｙｅプロットは次の項を計算する：
〔式中、ｃ、ＲθおよびＫ＊は上に定義するとおりである。〕。
ここで使用する表現「動的光散乱法」または「ＤＬＳ」は、特に、粒子の流体力学半径に関して、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定する技術をいう。単色光源、通常レーザーが偏光板を通してかつサンプルに照射される。次いで、散乱光は、第二の偏光板をとおり、そこで検出され、得られた画像がスクリーンに投影される。溶液中の粒子は、光に当たり、全方向に光を回析させる。粒子からの回析光は建設的(光領域)または破壊的(暗領域)に干渉される。この過程を短い間隔で繰り返し、得られたスペックルパターンのセットを、各スポットの光強度を経時的に比較するオートコリレーターにより解析する。
ここで使用する表現「静的光散乱法」または「ＳＬＳ」は、特に、粒子の回転半径および／または粒子のモル質量に関して、粒子のサイズおよびサイズ分布プロファイルを決定する技術をいう。高強度単色光、通常レーザーを、粒子を含む溶液に放つ。１個または多くの検出器を使用して、１個または多くの角度で散乱強度を測定する。角度依存が全巨大分子の半径のモル質量およびサイズ両方の正確な測定に必要である。故に、マルチアングル光散乱法(ＭＡＬＳ)またはマルチアングルレーザー光散乱法(ＭＡＬＬＳ)として知られる、入射光の方向に対する数角度での同時測定が、一般に静的光散乱法の標準的実施として考えられる。
用語「核酸」はデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)、リボ核酸(ＲＮＡ)、それらの組み合わせおよびその修飾形態を含む。本用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組み換えにより産生されたおよび化学的に合成された分子を含む。核酸は一本鎖または二本鎖および直鎖状または共有結合で閉環した分子として存在し得る。核酸は単離され得る。用語「単離核酸」は、本発明により、核酸(ｉ)が、例えばＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)でまたはＲＮＡでインビトロ転写(例えば、ＲＮＡポリメラーゼを使用して)、インビトロで増幅された、(ii)クローニングにより組み換えにより産生された、(iii)例えば、切断およびゲル電気泳動による分離により精製されたまたは(iv)例えば、化学合成により合成されたことを意味する。
用語「ヌクレオシド」(ここでは「Ｎ」と略す)は、リン酸基を欠くヌクレオチドと考えられ得る化合物に関する。ヌクレオシドは糖(例えば、リボースまたはデオキシリボース)に結合した核酸塩基であるが、ヌクレオチドはヌクレオシドおよび１以上のリン酸基からなる。ヌクレオシドの例は、シチジン、ウリジン、シュードウリジン、アデノシンおよびグアノシンを含む。
通常天然に存在する核酸を構成する５個の標準的ヌクレオシドはウリジン、アデノシン、チミジン、シチジンおよびグアノシンである。５個のヌクレオシドは、一般に、それぞれその一文字コードＵ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧに略される。しかしながら、チミジンは、ウリジンに見られるリボフラノース環ではなく、２’－デオキシリボフラノース部分を含むため、「ｄＴ」(「ｄ」は「デオキシ」を表す)として記載されるのがより一般的である。これは、チミジンがデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)に見られ、リボ核酸(ＲＮＡ)に見られないからである。逆に、ウリジンはＲＮＡに見られ、ＤＮＡに見られない。残りの３個のヌクレオシドはＲＮＡおよびＤＮＡ両方に見られ得る。ＲＮＡにおいて、Ａ、ＣおよびＧとして表され、一方ＤＮＡにおいて、ｄＡ、ｄＣおよびｄＧとして表される。
修飾プリン(ＡまたはＧ)またはピリミジン(Ｃ、ＴまたはＵ)塩基部分は、好ましくは１以上のアルキル基、より好ましくは１以上のＣ１－４アルキル基、さらにより好ましくは１以上のメチル基により修飾される。修飾プリンまたはピリミジン塩基部分の特定の例は、Ｎ７－アルキル－グアニン、Ｎ６－アルキル－アデニン、５－アルキル－シトシン、５－アルキル－ウラシルおよびＮ(１)－アルキル－ウラシル、例えばＮ７－Ｃ１－４アルキル－グアニン、Ｎ６－Ｃ１－４アルキル－アデニン、５－Ｃ１－４アルキル－シトシン、５－Ｃ１－４アルキル－ウラシルおよびＮ(１)－Ｃ１－４アルキル－ウラシル、好ましくはＮ７－メチル－グアニン、Ｎ６－メチル－アデニン、５－メチル－シトシン、５－メチル－ウラシルおよびＮ(１)－メチル－ウラシルを含む。
ここで、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチド残基を含む核酸分子に関する。好ましい実施態様において、ＤＮＡは全てまたは大部分がデオキシリボヌクレオチド残基を含む。ここで使用する「デオキシリボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を欠くヌクレオチドをいう。ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、単離ＤＮＡ、例えば部分的に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組み換えにより産生されたＤＮＡならびに天然に存在するＤＮＡと１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更により異なる修飾ＤＮＡを含むが、これらに限定されない。このような変更は、内部ＤＮＡヌクレオチドまたはＤＮＡ末端への非ヌクレオチド物質の付加をいい得る。ここでは、ＤＮＡにおけるヌクレオチドが、化学的に合成されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドなどの非標準的ヌクレオチドであり得ることも意図される。本発明について、これらの変更されたＤＮＡは、天然に存在するＤＮＡのアナログと考えられる。分子は、分子のデオキシリボヌクレオチド残基含量が、分子のヌクレオチド残基総数に基づき、５０％を超える(例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％)ならば、「大部分がデオキシリボヌクレオチド残基」である。分子のヌクレオチド残基の総数は、全ヌクレオチド残基(ヌクレオチド残基が標準的(すなわち、天然に存在する)ヌクレオチド残基であるかそのアナログであるかにかかわらず)の合計である。
ＤＮＡは組み換えＤＮＡであってよく、核酸、特にｃＤＮＡのクローニングにより得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得られ得る。
ＲＮＡ
本発明によると、用語「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチド残基を含む核酸分子を意味する。好ましい実施態様において、ＲＮＡは、全てまたは大部分がリボヌクレオチド残基を含む。ここで使用する「リボヌクレオチド」は、β－Ｄ－リボフラノシル基の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドをいう。ＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離ＲＮＡ、例えば部分的に精製されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えにより産生されたＲＮＡならびに天然に存在するＲＮＡと１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更により異なる修飾ＲＮＡを含むが、これらに限定されない。このような変更は、内部ＲＮＡヌクレオチドまたはＲＮＡ末端への非ヌクレオチド物質の付加をいい得る。ここではＲＮＡにおけるヌクレオチドが、化学的に合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準的ヌクレオチドであり得ることも意図される。本発明について、これらの変更／修飾ヌクレオチドを、天然に存在するヌクレオチドのアナログと称してよく、このような変更／修飾ヌクレオチドを含む対応するＲＮＡ(すなわち、変更／修飾ＲＮＡ)を、天然に存在するＲＮＡのアナログと称してよい。分子は、分子におけるリボヌクレオチド残基が、分子のヌクレオチド残基総数に基づき、５０％を超える(例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％)ならば、「大部分がリボヌクレオチド残基」である。分子のヌクレオチド残基の総数は、全ヌクレオチド残基(ヌクレオチド残基が標準的(すなわち、天然に存在する)ヌクレオチド残基であるかまたはそのアナログであるかにかかわらず)の合計である。
「ＲＮＡ」は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ(ｒＲＮＡ)、小核ＲＮＡ(ｓｎＲＮＡ)、自己増幅ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)、一本鎖ＲＮＡ(ｓｓＲＮＡ)、ｄｓＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ(例えばアンチセンスｓｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)またはミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ))、活性化ＲＮＡ(例えば小活性化ＲＮＡ)および免疫刺激性ＲＮＡ(ｉｓＲＮＡ)を含む。
好ましい実施態様において、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む。
ここで使用する用語「インビトロ転写」または「ＩＶＴ」は、転写(すなわち、ＲＮＡの産生)が無細胞様式で実施されることを意味する。すなわち、ＩＶＴは生存／培養細胞ではなく、むしろ、細胞から抽出された転写機構(例えば、細胞ライセートまたはＲＮＡポリメラーゼ(好ましくはＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ポリメラーゼ)を含むその単離成分)を使用する。
本発明によると、用語「ｍＲＮＡ」は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、ＤＮＡ鋳型を使用して産生でき、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る「転写物」に関する。典型的に、ｍＲＮＡは、５’－ＵＴＲ、ペプチド／タンパク質コード領域および３’－ＵＴＲを含む。本発明において、ｍＲＮＡは、好ましくはＤＮＡ鋳型からインビトロ転写(ＩＶＴ)により産生される。上記のとおり、インビトロ転写方法は当業者に知られ、多様なインビトロ転写キットが市販されている。
ｍＲＮＡは一本鎖であるが、自己相補的配列を含み得て、ｍＲＮＡの一部が折りたたまれ、自己と対形成して、二重螺旋を形成できる。
本発明によると、「ｄｓＲＮＡ」は二本鎖ＲＮＡを意味し、２個の部分的にまたは完全に相補的な鎖を有するＲＮＡである。
本発明の好ましい実施態様において、ｍＲＮＡはペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ転写物に関する。
ある実施態様において、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ、少なくとも４５ヌクレオチド(例えば少なくとも６０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１,０００、少なくとも１,５００、少なくとも２,０００、少なくとも２,５００、少なくとも３,０００、少なくとも３,５００、少なくとも４,０００、少なくとも４,５００、少なくとも５,０００、少なくとも６,０００、少なくとも７,０００、少なくとも８,０００、少なくとも９,０００ヌクレオチド)、好ましくは最大１５,０００、例えば最大１４,０００、最大１３,０００、最大１２,０００ヌクレオチド、最大１１,０００ヌクレオチドまたは最大１０,０００ヌクレオチドの長さを有する。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、５’非翻訳領域(５’－ＵＴＲ)、ペプチドコード領域および３’非翻訳領域(３’－ＵＴＲ)を含む。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)はインビトロ転写または化学合成により産生される。ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ＤＮＡ鋳型を使用して、インビトロ転写により産生される。インビトロ転写方法は当業者に知られる；例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照。さらに、多用なインビトロ転写キットが、例えば、Thermo Fisher Scientific(例えばTranscriptAidTM T7キット、MEGAscript(登録商標)T7キット、MAXIscript(登録商標))、New England BioLabs Inc.(例えばHiScribeTM T7キット、HiScribeTM T7 ARCA mRNAキット)、Promega(例えばRiboMAXTM、HeLaScribe(登録商標)、Riboprobe(登録商標)系)、Jena Bioscience(例えばSP6またはT7転写キット)およびEpicentre(例えばAmpliScribeTM)から市販されている。修飾ｍＲＮＡを提供するために、修飾された天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチドおよび／または修飾された天然に存在しないヌクレオチドなどの対応して修飾されたヌクレオチドを合成(好ましくはインビトロ転写)中に取り込むことができまたは修飾を転写後にｍＲＮＡに実施できおよび／または加えることができる。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、インビトロ転写ｍＲＮＡ(ＩＶＴ－ＲＮＡ)であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写により得られ得る。転写を制御するためのプロモーターは、あらゆるＲＮＡポリメラーゼのあらゆるプロモーターであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、インビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターにより制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することにより得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写により得られ得る。
本発明のある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は「レプリコンＲＮＡ」(例えば、「レプリコンｍＲＮＡ」)または単に「レプリコン」、特に「自己複製ＲＮＡ」(例えば、「自己複製ｍＲＮＡ」)または「自己増幅ＲＮＡ」(または「自己増幅ｍＲＮＡ」)である。ある特に好ましい実施態様において、レプリコンまたは自己複製ＲＮＡ(例えば、自己複製ｍＲＮＡ)は、ｓｓＲＮウイルス、特にアルファウイルスなどのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルス由来であるかそれ由来の要素を含む。アルファウイルスはプラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的代表例である。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する(アルファウイルスライフサイクルのレビューのために、Jose et al., Future Microbiol., 2009, vol. 4, pp. 837-856参照)。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は典型的に１１,０００～１２,０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的に５’キャップおよび３’ポリ(Ａ)テイルを有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造的タンパク質(ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製ならびにタンパク質修飾に関与)および構造的タンパク質(ウイルス粒子形成)をコードする。ゲノムには典型的に２個のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)がある。４個の非構造的タンパク質(ｎｓＰ１－ｎｓＰ４)は、典型的に一体となってゲノムの５’末端付近から始まる第一ＯＲＦによりコードされ、一方アルファウイルス構造的タンパク質は、一体となって、第一ＯＲＦの下流に見られ、ゲノムの３’末端近辺に伸びる第二ＯＲＦによりコードされる。典型的に、第一ＯＲＦは第二ＯＲＦより大きく、比はおおよそ２：１である。アルファウイルスにより感染された細胞において、非構造的タンパク質をコードする核酸配列のみがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造的タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物メッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)を模倣するＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である(Gould et al., 2010, Antiviral Res., vol. 87 pp. 111-124)。感染後、すなわちウイルスライフサイクルの初期段階に、(＋)鎖ゲノムＲＮＡは、非構造的ポリ－タンパク質(ｎｓＰ１２３４)をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のために、メッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。アルファウイルス由来ベクターは、標的細胞または標的生物への外来遺伝情報の送達について提案されている。単純なアプローチで、アルファウイルス構造的タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置換される。アルファウイルスベースのトランス複製系は、一方はウイルスレプリカーゼをコードし、他方の核酸分子は、該レプリカーゼによりトランスで複製され得る、２個の別々の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列要素に依存する(故に命名トランス複製系)。トランス複製は、ある宿主細胞におけるこれら核酸分子の両者の存在を必要とする。レプリカーゼによりトランスで複製され得る核酸分子は、アルファウイルスレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能とするあるアルファウイルス配列要素を含まなければならない。
本発明のある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、例えば、安定性増加および／または翻訳効率増加および／または免疫原性減少および／または細胞毒性減少のために、１以上の修飾を含む。例えば、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)発現増加のために、好ましくは、発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を改変することなく、コード領域、すなわち、発現ペプチドまたはタンパク質をコードする配列内を修飾し得る。このような修飾は、例えば、ＷＯ２００７／０３６３６６およびＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２に記載され、次のものを含む：５’キャップ構造；天然に存在するポリ(Ａ)テイルの伸長または短縮化；該ＲＮＡのコード領域に関係しないＵＴＲの導入などの５’－および／または３’－非翻訳領域(ＵＴＲ)の変更；１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置換；およびコドン最適化(例えば、ＲＮＡのＧＣ含量の変更、好ましくは増加)。本発明による修飾ｍＲＮＡの状況における用語「修飾」は、好ましくは該ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)天然に存在しない、ｍＲＮＡのあらゆる修飾に関する。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は５’キャップ構造を含む。ある実施態様において、ｍＲＮＡはキャップのない５’－三リン酸を有しない。ある実施態様において、ｍＲＮＡは、慣用の５’キャップおよび／または５’キャップアナログを含み得る。用語「慣用の５’キャップ」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に見られるキャップ構造をいい、一般にグアノシン５’－三リン酸(Ｇｐｐｐ)からなり、これは、その三リン酸部分を介してｍＲＮＡの次のヌクレオチドの５’末端に結合する(すなわち、グアノシンは、ｍＲＮＡの残りに５’→５’三リン酸結合を介して結合される)。グアノシンは、Ｎ７位置でメチル化され得る(キャップ構造ｍ７Ｇｐｐｐ)をもたらす。用語「５’キャップアナログ」は、慣用の５’キャップに基づくが、逆配向での５’キャップアナログの組込みを回避するため、ｍ７グアノシン構造の２’位または３’位で修飾されている５’キャップをいう(このような５’キャップアナログは、アンチリバースキャップアナログ(ＡＲＣＡ)とも称される)。特に好ましい５’キャップアナログは、ＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５６５０２に記載の、β－ホスフェートでのホスホロチオエート修飾５’キャップアナログ(例えばｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ(ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡまたはβ－Ｓ－ＡＲＣＡ)と称する)などの、リン酸橋における架橋および非架橋酸素に１以上の置換を有するものである。ここで記載するとおり、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)への５’キャップ構造の提供は、対応する５’キャップ化合物の存在下でＤＮＡ鋳型を、該５’キャップ構造は、産生されたＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)鎖に共転写的に組み込まれるインビトロ転写することにより達成でき、またはＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、例えば、インビトロ転写により産生され、５’キャップ構造をキャッピング酵素、例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して、転写後ｍＲＮＡに結合し得る。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ｍ２ ７,２’ＯＧ(５’)ｐｐＳｐ(５’)Ｇ(特にそのＤ１ジアステレオマー)、ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)Ｇおよびｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧからなる群から選択される５’キャップ構造を含む。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)はキャップ０、キャップ１またはキャップ２、好ましくはキャップ１またはキャップ２を含む。本発明により、用語「キャップ０」は構造「ｍ７ＧｐｐｐＮ」を意味し、ここで、Ｎは２’位にＯＨ部分を有するあらゆるヌクレオシドである。本発明により、用語「キャップ１」は構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍ」を意味し、ここで、Ｎｍは２’位にＯＣＨ３部分を有するあらゆるヌクレオシドである。本発明により、用語「キャップ２」は構造「ｍ７ＧｐｐｐＮｍＮｍ」を意味し、ここで、各Ｎｍは独立して２’位にＯＣＨ３部分を有するあらゆるヌクレオシドである。
ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(β－Ｓ－ＡＲＣＡ)のＤ１ジアステレオマーは次の構造を有する：
「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)」は、ＨＰＬＣカラムでベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー(ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ２))と比較して、最初に溶出され、故に保持時間が短いベータ－Ｓ－ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣは、好ましくは分析的ＨＰＬＣである。ある実施態様において、好ましくは５μm、４.６×２５０mmの形式のSupelcosil LC-18-T RPカラムが分離に使用され、それにより、流速１.３ml／分が適用され得る。ある実施態様において、１５分以内の酢酸アンモニウム中メタノール勾配、例えば、０.０５Ｍ 酢酸アンモニウム、ｐＨ＝５.９中メタノールの０～２５％直線勾配が使用される。ＵＶ検出(ＶＷＤ)を２６０nmで実施でき、蛍光検出(ＦＬＤ)を励起２８０nmおよび検出３３７nmで実施できる。
キャップ１の構成要素である５’キャップアナログｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ(ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ｍ２’－ＯＡｐＧとも称する)は次の構造を有する：
β－Ｓ－ＡＲＣＡおよびｍＲＮＡを含むキャップ０ ｍＲＮＡの例は次の構造を有する：
ｍ２ ７,３’ＯＧ(５’)ｐｐｐ(５’)ＧおよびｍＲＮＡを含むキャップ０ ｍＲＮＡの例は次の構造を有する：
ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧおよびｍＲＮＡを含むキャップ１ ｍＲＮＡの例は次の構造を有する：
ここで使用する用語「ポリＡテイル」または「ポリＡ配列」は、典型的にＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)分子。ポリ－Ａテイルまたはポリ－Ａ配列は当業者に知られ、ここに記載するＲＮＡの３’－ＵＴＲに続き得る。中断されていないポリ－Ａテイルは、連続的アデニル酸残基により特徴づけられる。本来、中断されていないポリ－Ａテイルが典型的である。ここに開示するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、転写後の鋳型非依存的ＲＮＡポリメラーゼによりｍＲＮＡの遊離３’末端に結合されたポリＡテイルまたはＤＮＡによりコードされ、鋳型依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写されたポリＡテイルを有し得る。
約１２０ＡヌクレオチドのポリＡテイルがトランスフェクト真核生物細胞のｍＲＮＡのレベルおよびポリＡテイルの上流(５’)に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されたタンパク質のレベルに有益な影響を有することが示されている(Holtkamp et al., 2006, Blood, vol. 108, pp. 4009-4017)。
ポリＡテイルはどんな長さでもよい。ある実施態様において、ポリＡテイルは、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０または少なくとも１００および最大５００、最大４００、最大３００、最大２００または最大１５０Ａヌクレオチド、特に、約１２０Ａヌクレオチドを含む、本質的にそれからなるまたはそれからなる。この状況で、「本質的にからなる」は、ポリＡテイルの大部分のヌクレオチド、典型的に、ポリＡテイルにおけるヌクレオチド数により、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドがＡヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えばＵヌクレオチド(ウリジル酸)、Ｇヌクレオチド(グアニル酸)またはＣヌクレオチド(シチジル酸)であってよいことを意味する。この状況で、「からなる」は、ポリＡテイルの全ヌクレオチド、すなわち、ポリＡテイルにおけるヌクレオチド数により、１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。用語「Ａヌクレオチド」または「Ａ」は、アデニル酸をいう。
ある実施態様において、ポリ－Ａテイルは、コード鎖に相補性の鎖における反復ｄＴヌクレオチド(デオキシチミジル酸)を含むＤＮＡテンプレートに基づき、ＲＮＡ転写中、例えば、インビトロ転写ＲＮＡの調製中に結合される。ポリ－ＡテイルをコードするＤＮＡ配列(コード鎖)はポリ(Ａ)カセットと称する。
ある実施態様において、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ(Ａ)カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ)のランダム配列により中断される。このようなランダム配列は、５～５０、１０～３０または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。このようなカセットは、本明細書に引用により包含させるＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示される。ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示されるあらゆるポリ(Ａ)カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ)が等しく分布するランダム配列により中断され、例えば、５～５０ヌクレオチド長を有するポリ(Ａ)カセットは、ＤＮＡレベルで、大腸菌におけるプラスミドＤＮＡの一定増殖を示し、なお、ＲＮＡレベルで、ＲＮＡ安定性の支持および翻訳効率が包含される点に関して、有益な性質と関連する。結果として、ある実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡ分子に含まれるポリ－Ａテイルは、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４ヌクレオチド(Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ)のランダム配列で中断される。このようなランダム配列は、５～５０、１０～３０または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。
ある実施態様において、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドが３’末端でポリＡテイルに隣接せず、すなわち、ポリＡテイルは３’末端をＡ以外のヌクレオチドでマスクされていないまたは続きがない。
ある実施態様において、ポリ－Ａ配列は少なくとも１００ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリ－Ａ配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。ある実施態様において、ポリ－Ａ配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、５’－ＵＴＲおよび／または３’－ＵＴＲを含む。用語「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」は、転写されるが、アミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子における領域またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子における対応する領域に関する。非翻訳領域(ＵＴＲ)は、オープンリーディングフレームの５’(上流)(５’－ＵＴＲ)および／またはオープンリーディングフレームの３’(下流)(３’－ＵＴＲ)に存在し得る。５’－ＵＴＲは、存在するならば、タンパク質コード領域の開始コドンの上流である、５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは、５’キャップ(存在するならば)の下流であり、例えば、５’キャップに直接隣接する。３’－ＵＴＲは、存在するならば、タンパク質コード領域の停止コドンの下流である３’末端に位置するが、用語「３’－ＵＴＲ」は好ましくはポリＡ配列を含まない。故に、３’－ＵＴＲは、ポリＡ配列(存在するならば)の上流であり、例えば、ポリＡ配列に直接隣接する。ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)分子の３’－非翻訳領域への３’－ＵＴＲの取り込みは、翻訳効率を増強させ得る。相乗的効果が、２以上のこのような３’－ＵＴＲの取り込みにより達成され得る(これらは好ましくは頭－尾配向で配置される；例えば、Holtkamp et al., Blood 108, 4009-4017 (2006)参照)。３’－ＵＴＲは、導入されるＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)に対して自己または異種であり得る。ある特定の実施態様において、３’－ＵＴＲは、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビンまたはベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータ－グロビンの遺伝子またはｍＲＮＡなどのグロビン遺伝子またはｍＲＮＡに由来する。例えば、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、アルファ２－グロビン、アルファ１－グロビン、ベータ－グロビン、好ましくはベータ－グロビン、より好ましくはヒトベータ－グロビンなどのグロビン遺伝子由来の１以上、好ましくは２コピーの３’－ＵＴＲで既存の３’－ＵＴＲを置換するかまたは挿入されることにより修飾され得る。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ ＵＴＲを含む。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ ＵＴＲを含む。
ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、安定性増加および／または免疫原性減少および／または細胞毒性減少のために修飾リボヌクレオチドを有し得る。例えば、ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)におけるウリジンは、修飾ヌクレオシドに置換される(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に)。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドは修飾ウリジンである。
ある実施態様において、ウリジンを置き換える修飾ウリジンは、シュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)、５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある実施態様において、ＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)においてウリジンを(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に)置き換える修飾ヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン(ｍ３Ｕ)、５－メトキシ－ウリジン(ｍｏ５Ｕ)、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン(ｓ２Ｕ)、４－チオ－ウリジン(ｓ４Ｕ)、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン(ｈｏ５Ｕ)、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン(例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン)、ウリジン５－オキシ酢酸(ｃｍｏ５Ｕ)、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル(ｍｃｍｏ５Ｕ)、５－カルボキシメチル－ウリジン(ｃｍ５Ｕ)、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン(ｃｈｍ５Ｕ)、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル(ｍｃｈｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｃｍ５ｓ２Ｕ)、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－ウリジン(ｍｎｍ５Ｕ)、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ)、５－カルバモイルメチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン(τｍ５Ｕ)、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン(τｍ５ｓ２Ｕ)、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン)、５－メチル－２－チオ－ウリジン(ｍ５ｓ２Ｕ)、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン(ｍ１ｓ４ψ)、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン(ｍ３ψ)、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン(Ｄ)、ジヒドロシュードウリジン、５,６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン(ｍ５Ｄ)、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)ウリジン(ａｃｐ３Ｕ)、１－メチル－３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)シュードウリジン(ａｃｐ３ψ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(ｉｎｍ５Ｕ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２－チオ－ウリジン(ｉｎｍ５ｓ２Ｕ)、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン(Ｕｍ)、５,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ５Ｕｍ)、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン(ψｍ)、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｓ２Ｕｍ)、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕｍ)、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕｍ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕｍ)、３,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ３Ｕｍ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｉｎｍ５Ｕｍ)、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－(２－カルボメトキシビニル)ウリジン、５－[３－(１－Ｅ－プロペニルアミノ)ウリジンまたは当分野で知られるあらゆる他の修飾ウリジンの何れか１以上であり得る。
シュードウリジン(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置き換える)により修飾されているＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)をここでは「Ψ－修飾」と称し、一方用語「ｍ１Ψ－修飾」は、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)がＮ(１)－メチルシュードウリジン(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置き換える)を含むことを意味する。さらに、用語「ｍ５Ｕ－修飾」は、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)が５－メチルウリジン(部分的にまたは完全に、好ましくは完全に、ウリジンを置き換える)を含むことを意味する。このようなΨ－またはｍ１Ψ－またはｍ５Ｕ－修飾ＲＮＡは、通常非修飾形態と比較して免疫原性が低く、故に、免疫応答の誘導を回避または最小化すべき適用において好ましい。
本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)のコドンを、例えば、ＲＮＡのＧＣ含量の増加および／または目的のペプチドまたはタンパク質を発現すべき細胞(または対象)で希なコドンを該細胞(または対象)における同義高頻度コドンであるコドンに置き換えるために、さらに最適化し得る。ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列は、野生型コード配列と比較してコドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量が増加されているコード配列によりコードされ得る。これはまた、コード配列の１以上の配列領域が野生型コード配列の対応する配列領域と比較してコドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量が増加されている実施態様も含む。ある実施態様において、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量増加は、好ましくはコードされるアミノ酸配列の配列を変化させない。
用語「コドン最適化」は、好ましくは核酸分子によりコードされるアミノ酸配列を改変することなく、宿主生物の典型的コドン利用を反映するための核酸分子のコード領域のコドンを変更することをいう。本発明において、コード領域は、好ましくはここに記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)を使用して処置すべき対象における最適発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、翻訳効率も細胞におけるｔＲＮＡの存在の頻度の差により決定されるとの知見に基づく。故に、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の配列を、ｔＲＮＡで高頻度で生ずるコドンが「希なコドン」の代わりに挿入されるように修飾し得る。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)のコード領域のグアノシン／シトシン(Ｇ／Ｃ)含量が、野生型ＲＮＡの対応するコード配列のＧ／Ｃ含量と比較して増加し、ここで、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)によりコードされるアミノ酸配列は、好ましくは野生型ＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列と比較して、修飾されない。このＲＮＡ配列修飾は、翻訳すべき何れかのＲＮＡ領域の配列がそのｍＲＮＡの効率的翻訳に重要であるとの事実に基づく。Ｇ(グアノシン)／Ｃ(シトシン)含量が増加した配列は、Ａ(アデノシン)／Ｕ(ウラシル)含量が増加した配列より安定である。数個のコドンが一つの同じアミノ酸をコードする(いわゆる遺伝コードの縮重)に関して、安定性のために最も好都合なコドンが決定され得る(いわゆる代替的コドン利用)。ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)よりコードされるアミノ酸により、野生型配列と比較して、ＲＮＡ配列の修飾に種々の可能性がある。特に、Ａおよび／またはＵヌクレオチドを含むコドンを、これらのコドンを、同じアミノ酸をコードするが、Ａおよび／またはＵを含まずまたはＡおよび／またはＵヌクレオチドの含量が低い他のコドンに置換することにより、修飾し得る。
種々の実施態様において、ここに記載するｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量は、野生型ＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％またはそれ以上増加され得る。
上記修飾、すなわち、５’キャップ構造の取り込み、ポリＡ配列の取り込み、ポリＡ配列のアンマスキング、５’－および／または３’－ＵＴＲの変更(例えば１以上の３’－ＵＴＲの取り込み)、１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンのための５－メチルシチジンおよび／またはウリジンのためのシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))およびコドン最適化の組み合わせは、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の安定性および翻訳効率の増加に相乗的影響を有する。故に、好ましい実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)、特にここに開示する免疫応答を誘導するための抗原またはエピトープをコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、上記修飾、すなわち、(ｉ)５’キャップ構造の取り込み、(ii)ポリＡ配列の取り込み、ポリＡ配列のアンマスキング；(iii)５’－および／または３’－ＵＴＲの変更(例えば１以上の３’－ＵＴＲの取り込み)；(iv)１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンのための５－メチルシチジンおよび／またはウリジンのためのシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))および(ｖ)コドン最適化の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または全５個の組み合わせを含む。ある実施態様において、ＲＮＡは、キャップ１またはキャップ２、好ましくはキャップ１構造を含む。ある実施態様において、ポリ－Ａ配列は少なくとも１００ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリ－Ａ配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。ある実施態様において、５’ ＵＴＲは、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ある実施態様において、３’ ＵＴＲは、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本発明のある態様は、ある細胞または組織へのここに開示するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の標的送達に関する。ある実施態様において、本発明は、リンパ系、特に二次的リンパ系臓器、より具体的に脾臓のターゲティングを含む。リンパ系、特に二次的リンパ系臓器、より具体的に脾臓のターゲティングは、投与されるＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)が、免疫応答の誘導のための抗原またはエピトープをコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)であるとき、特に好ましい。ある実施態様において、標的細胞は脾臓細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓の樹状細胞である。「リンパ系」はリンパを運搬するリンパ管のネットワークを含む、循環系の一部であり、免疫系の重要な一部である。リンパ系はリンパ性臓器、リンパ管の導管ネットワークおよび循環リンパからなる。一次または中枢リンパ系臓器は、未成熟前駆細胞からリンパ球を産生する。胸腺および骨髄は、一次リンパ系臓器を構成する。リンパ節および脾臓を含む二次的または末梢リンパ系臓器は、成熟ナイーブリンパ球を維持し、適応免疫応答を開始する。
脂質ベースのＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)送達系は、肝臓に固有の優先性を有する。肝臓蓄積は、肝臓脈管構造の非連続性または脂質代謝(リポソームおよび脂質またはコレステロールコンジュゲート)により引き起こされる。ある実施態様において、標的臓器は肝臓であり、標的組織は肝臓組織である。このような標的組織への送達が、特に、この臓器または組織におけるｍＲＮＡまたはコード化ペプチドまたはタンパク質の存在が望まれるおよび／または大量のコード化ペプチドまたはタンパク質の発現が望まれるおよび／または、特に相当量での、コード化ペプチドまたはタンパク質の全身存在が望まれるまたは必要であるならば、好ましい。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の投与後、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞または標的臓器に送達される。ある実施態様において、ＲＮＡの少なくとも一部が標的細胞のサイトゾルに送達される。ある実施態様において、ＲＮＡは、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)であり、ＲＮＡは標的細胞により翻訳されて、ペプチドまたはタンパク質を産生する。ある実施態様において、標的細胞は肝臓における細胞である。ある実施態様において、標的細胞は筋肉細胞である。ある実施態様において、標的細胞は内皮細胞である。ある実施態様において、標的細胞は腫瘍細胞または腫瘍微小環境の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は血液細胞である。ある実施態様において、標的細胞はリンパ節の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は肺の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は血液細胞である。ある実施態様において、標的細胞は皮膚の細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓における専門的抗原提示細胞などの抗原提示細胞である。ある実施態様において、標的細胞は脾臓の樹状細胞である。ある実施態様において、標的細胞はＴ細胞である。ある実施態様において、標的細胞はＢ細胞である。ある実施態様において、標的細胞はＮＫ細胞である。ある実施態様において、標的細胞は単球である。故に、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、そのような標的細胞にＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)を送達するために使用され得る。従って、本発明はまた対象における標的細胞にＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)を送達する方法であって、対象にここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物を投与することを含む、方法にも関する。ある実施態様において、ＲＮＡはペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)であり、ＲＮＡは標的細胞により翻訳されて、ペプチドまたはタンパク質を産生する。
「コードする」は、規定されたヌクレオチド配列(すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ)または規定されたアミノ酸配列を有する、生物学的過程における他のポリマーおよび巨大分子の合成のために鋳型として役立つ遺伝子、ｃＤＮＡまたはＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)などのポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の性質およびそれに起因する生物学的性質をいう。故に、遺伝子は、その遺伝子に対応するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)なの転写および翻訳が、細胞または他の生物学的系でタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がＲＮＡ配列と同一であり、通常配列表に提供されるコード鎖および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両者が、タンパク質またはその遺伝子またはｃＤＮＡの他の産物をコードするということができる。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、１以上のポリペプチド、例えば、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは薬学的に活性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列(例えば、ＯＲＦ)を含む。
好ましい実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ペプチドまたはタンパク質、好ましくは薬学的に活性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列(例えば、ＯＲＦ)を含み、に、細胞または対象に導入されたとき、該ペプチドまたはタンパク質を発現できる。故に、本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、好ましくはペプチドまたはタンパク質をコードする、好ましくは薬学的に活性ペプチドまたはタンパク質をコードするコード領域(ＯＲＦ)ｗ含む。これに関し、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、開始コドンで始まり、停止コドンで終わるコドンの連続的ストレッチである。このような薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ここでは「薬学的に活性なＲＮＡ」(または「薬学的に活性なｍＲＮＡ」)と称する。
本発明によると、用語「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、ペプチドまたはタンパク質の発現が利益がある、例えば、疾患または障害の症状緩和に有益である、個体の処置に使用できるペプチドまたはタンパク質を意味する。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は治癒的または軽減的性質を有し、疾患または障害の以上の症状の改善、緩和、軽減、逆転、発症遅延または重症度低減のために投与され得る。好ましくは、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、治療有効量を個体に投与したとき、状態または疾患状態に正のまたは有利な効果を有する。薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は予防的性質を有し得て、疾患発症遅延または障害またはこのような疾患または障害の重症度低減のために使用し得る。用語「薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質」は、タンパク質またはポリペプチド全体を含み、またその薬学的に活性なフラグメントもいい得る。ペプチドまたはタンパク質の薬学的に活性なアナログも含み得る。
薬学的に活性なペプチドおよびタンパク質の具体例は、サイトカイン、ホルモン、接着分子、免疫グロブリン、免疫学的に活性な化合物、増殖因子、プロテアーゼ阻害剤、酵素、受容体、アポトーシス制御因子、転写因子、腫瘍抑制因子タンパク質、構造タンパク質、再プログラム化因子、ゲノム工学的タンパク質および血液タンパク質を含むが、これらに限定されない。
用語「サイトカイン」は、約５～２０kDaの分子量を有し、細胞シグナル伝達(例えば、傍分泌、内分泌および／または自己分泌シグナル伝達)に参加する、タンパク質をいう。特に、放出されたとき、サイトカインは放出部位周囲の細胞の挙動に対して効果を発揮する。サイトカインの例は、リンホカイン、インターロイキン、ケモカイン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)を含む。本発明により、サイトカインはホルモンまたは増殖因子を含まない。サイトカインは、(ｉ)通常作用濃度がホルモンよりはるかに可変であるおよび(ii)一般に広範囲の細胞により産生される(ほぼ全ての有核細胞がサイトカインを産生できる)点でホルモンと異なる。インターフェロンは、通常抗ウイルス性、抗増殖性および免疫調節性活性により特徴づけられる。インターフェロンは、制御された細胞の表面上のインターフェロン受容体に結合することにより、細胞内の遺伝子転写を改変および制御し、それ故に細胞内のウイルス複製を阻止する、タンパク質である。インターフェロンは２タイプに分類され得る。ＩＦＮ－ガンマは、唯一のII型インターフェロンである；その他全ては、タイプＩインターフェロンである。サイトカインの特定の例は、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、インターフェロンアルファ(ＩＦＮα)、インターフェロンベータ(ＩＦＮβ)、インターフェロンガンマ(ＩＮＦγ)、インターロイキン２(ＩＬ－２)、インターロイキン４(ＩＬ－４)、インターロイキン１０(ＩＬ－１０)、インターロイキン１１(ＩＬ－１１)、インターロイキン１２(ＩＬ－１２)およびインターロイキン２１(ＩＬ－２１)を含む。
ある実施態様において、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、補充タンパク質を含む。この実施態様において、本発明は、タンパク質補充を必要とする障害(例えば、タンパク質欠損障害)を有する対象を処置する方法であって、該対象に補充タンパク質をコードするここに記載するＲＮＡを投与することを含む、方法を提供する。用語「タンパク質補充」は、タンパク質(その機能的バリアントを含む)の、そのようなタンパク質が欠損する対象への導入をいう。本用語はまた他の点でタンパク質の提供が必要であるまたは利益を得る、例えば、タンパク質不足にり患した対象へのタンパク質の導入もいう。用語「タンパク質欠損を特徴とする障害」は、タンパク質が存在しないまたは量が不十分である病理を呈するあらゆる障害をいう。この用語は、生物学的に不活性なタンパク質産物をもたらす、タンパク質折り畳み障害、すなわち、立体構造障害を包含する。タンパク質不足は、感染症、免疫抑制、臓器不全、腺性問題、放射線症、栄養欠損、中毒または他の環境的または外的損傷に関与し得る。
用語「ホルモン」は、腺により産生されるシグナル伝達分子のクラスに関し、ここで、シグナル伝達は、通常次の工程を含む：(ｉ)特定の組織でのホルモンの合成；(ii)貯蔵および分泌；(iii)ホルモンのその標的への輸送；(iv)受容体によるホルモンの結合；(ｖ)シグナルの中継および増幅；および(vi)ホルモンの分解。ホルモンは、(１)ホルモンは、通常作用濃度があまり変動しないおよび(２)一般に特定の種類の細胞により産生される点でサイトカインと異なる。ある実施態様において、「ホルモン」は、インスリン、バソプレッシン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)、甲状腺ホルモン、成長ホルモン(例えばヒト成長ホルモンまたはウシソマトトロピン)、オキシトシン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ＡＮＰ)、グルカゴン、ソマトスタチン、コレシストキニン、ガストリンおよびレプチンなどのペプチドまたはタンパク質ホルモンである。
用語「接着分子」は、細胞の表面に位置し、細胞と他の細胞または細胞外マトリクス(ＥＣＭ)との結合に関与するタンパク質に関する。接着分子は、典型的に膜貫通受容体であり、カルシウム非依存性(例えば、インテグリン、免疫グロブリンスーパーファミリー、リンパ球ホーミング受容体)およびカルシウム依存性(カドヘリンおよびセレクチン)として分類され得る。接着分子の具体例は、インテグリン、リンパ球ホーミング受容体、セレクチン(例えば、Ｐ－セレクチン)およびアドレッシンである。
インテグリンもまたシグナル伝達に関与する。特に、リガンド結合により、インテグリンは、細胞シグナル伝達経路、例えば、受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)などの膜貫通タンパク質キナーゼの経路を調節する。このような制御は、細胞増殖、分裂、生存または分化またはアポトーシスを導き得る。インテグリンの具体例は、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αIIｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８およびα６β４を含む。
用語「免疫グロブリン」または「免疫グロブリンスーパーファミリー」は、細胞の認識、結合および／または接着過程に関与する分子をいう。このスーパーファミリーに属する分子は、免疫グロブリンドメインまたは折り畳みとして知られる領域を含む点で、性質を共有する。免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーは、抗体(例えば、ＩｇＧ)、Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)、主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子、共受容体(例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９)、抗原受容体アクセサリー分子(例えば、ＣＤ－３γ、ＣＤ３－δ、ＣＤ－３ε、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ)、共刺激または阻害性分子(例えば、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６)およびその他を含む。
用語「免疫学的に活性な化合物」は、好ましくは、免疫細胞の成熟誘導および／または抑制、サイトカイン生合成誘導および／または抑制により免疫応答を改変するおよび／またはＢ細胞による抗体産生の刺激により液性免疫を改変する、あらゆる化合物に関する。免疫学的に活性な化合物は、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を含むが、これらに限定されない強力な免疫刺激活性を有し、また免疫応答の他の態様を下方制御できる、例えば広範なＴＨ２介在疾患の処置に有用である免疫応答をＴＨ２免疫応答から離すようシフトすることができる。免疫学的に活性な化合物はワクチンアジュバントとして有用であり得る。免疫学的に活性な化合物の具体例は、インターロイキン、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子(ＧＭ－ＣＳＦ)、エリスロポエチン、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)、インターフェロン、インテグリン、アドレッシン、セレクチン、ホーミング受容体および抗原、特に腫瘍関連抗原、病原体関連抗原(例えば細菌、寄生虫またはウイルス抗原)、アレルゲンおよび自己抗原を含む。好ましい免疫学的に活性な化合物は、ワクチン抗原、すなわち、対象への接種が免疫応答を誘導する抗原である。
用語「オートアンチゲン」または「自己抗原」は、対象体内に端を発し(すなわち、オートアンチゲンは「自己抗原」とも称し得る)、この体の正常な部分に対する異常に活発な免疫応答を産生する抗原をいう。自己抗原に対するこのような活発な免疫反応は、「自己免疫性疾患」の原因であり得る。
用語「アレルゲン」は、対象の体外に端を発し(すなわち、アレルゲンは「異種抗原」とも称し得る)、対象の免疫系が、それ以外は対象にとって有害ではない認知された脅威を撃退する、異常に活発な免疫応答を産生する抗原をいう。「アレルギー」は、アレルゲンに対するこのような活発な免疫反応が原因の疾患である。アレルゲンは、通常免疫グロブリンＥ(ＩｇＥ)応答を介してアトピー性個体のタイプ－Ｉ過敏症反応を刺激できる、抗原である。アレルゲンの具体例は、ピーナツタンパク質(例えば、Ａｒａ ｈ ２.０２)、オブアルブミン、草花粉タンパク質(例えば、Ｐｈｌ ｐ ５)およびイエダニのタンパク質(例えば、Ｄｅｒ ｐ ２)に由来するアレルゲンを含む。
用語「増殖因子」は、細胞増殖、増殖、治癒および／または細胞分化を刺激できる分子をいう。典型的に、増殖因子は、細胞間のシグナル伝達分子として作用する。用語「増殖因子」は、標的細胞表面の特異的受容体に結合する特定のサイトカインおよびホルモンを含む。増殖因子の例は、骨形成タンパク質(ＢＭＰ)、線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)、血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)、例えばＶＥＧＦＡ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、インシュリン様増殖因子、エフリン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ニューレグリン、神経栄養因子(例えば、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)、神経増殖因子(ＮＧＦ))、胎盤増殖因子(ＰＧＦ)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)、レナラーゼ(ＲＮＬＳ)(抗アポトーシス生存因子)、Ｔ細胞増殖因子(ＴＣＧＦ)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)、トランスフォーミング増殖因子(トランスフォーミング増殖因子アルファ(ＴＧＦ－α)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(ＴＧＦ－β))および腫瘍壊死因子－アルファ(ＴＮＦ－α)を含む。ある実施態様において、「増殖因子」はペプチドまたはタンパク質増殖因子である。
用語「プロテアーゼ阻害剤」は、プロテアーゼの機能を阻害する分子、特にペプチドまたはタンパク質をいう。プロテアーゼ阻害剤は、阻害されるプロテアーゼ(例えば、アスパラギンプロテアーゼ阻害剤)または作用機序(例えば、セルピンなどの自殺阻害剤)により分類され得る。プロテアーゼ阻害剤の具体例は、セルピン、例えばアルファ１抗トリプシン、アプロチニンおよびベスタチンを含む。
用語「酵素」は、化学反応を加速させる巨大分子生物学的触媒をいう。あらゆる触媒と同様、酵素は触媒する反応で消費されず、該反応の平衡を変えない。多くの他の触媒と異なり、酵素は、はるかに特異的である。ある実施態様において、酵素は対象のホメオスタシスに必須であり、例えば、酵素の何らかの機能不全(特に、変異、欠失または産生減少の何れかが原因であり得る活性減少)は、疾患をもたらす。酵素の例は、単純ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ(ＨＳＶ１－ＴＫ)、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、シュードコリンエステラーゼおよびラクターゼを含む。
用語「受容体」は、細胞外からのシグナル(特にリガンドと称される化学シグナル)を受け入れるタンパク質分子をいう。シグナル(例えば、リガンド)の受容体への結合は、細胞にある種の応答、例えば、キナーゼの細胞内活性化を引き起こす。受容体は、膜貫通受容体(例えばイオンチャネル結合(イオンチャネル型)受容体、Ｇタンパク質結合(代謝型)受容体および酵素結合受容体)および細胞内受容体(例えば細胞質受容体および核受容体)を含む。受容体の具体例は、ステロイドホルモン受容体、増殖因子受容体およびペプチド受容体(すなわち、リガンドがペプチドである受容体)、例えばＰ－セレクチン糖タンパク質リガンド－１(ＰＳＧＬ－１)を含む。用語「増殖因子受容体」は、増殖因子に結合する受容体をいう。
用語「アポトーシス制御因子」は、アポトーシスを調節する、すなわち、アポトーシスを活性化または阻害する、分子、特にペプチドまたはタンパク質をいう。アポトーシス制御因子は、ミトコンドリア機能を制御するものおよびカスパーゼを制御するもの２つの広いクラスに分類され得る。第一のクラスは、ミトコンドリア膜電位喪失および／またはサイトゾルへのシトクロムＣなどのアポトーシス促進タンパク質の放出の防止により、ミトコンドリア完全性を保持するタンパク質(例えば、ＢＣＬ－２、ＢＣＬ－ｘＬ)を含む。また、この第一のクラには、シトクロムＣの放出を促進するアポトーシス促進タンパク質
(例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＩＭ)が属する。第二のクラスは、アポトーシスタンパク質阻害剤(例えば、ＸＩＡＰ)またはカスパーゼの活性化を遮断するＦＬＩＰなどのタンパク質を含む。
用語「転写因子」は、特に、特異的ＤＮＡ配列に結合することにより、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写割合を制御するタンパク質に関する。転写因子は、一生をとおした細胞分裂、細胞増殖および細胞死；胚発達中の細胞遊走および組織化；および／またはホルモンなどの細胞外からのシグナルへの応答を制御し得る。転写因子は、通常、転写因子に制御される遺伝子に隣接する特異的ＤＮＡ配列に結合する、少なくとも１個のＤＮＡ結合ドメインを含む。転写因子の具体例は、ＭＥＣＰ２、ＦＯＸＰ２、ＦＯＸＰ３、ＳＴＡＴタンパク質ファミリーおよびＨＯＸタンパク質ファミリーを含む。
用語「腫瘍抑制因子タンパク質」は、細胞を癌に至る一過程から保護する分子、特にペプチドまたはタンパク質をいう。腫瘍抑制因子タンパク質(通常対応する腫瘍抑制因子遺伝子によりコードされる)は、細胞周期の制御に対する弱化または圧制的効果を発揮するおよび／またはアポトーシスを促進する。それらの機能は次の１以上であり得る：細胞周期の継続に必須の遺伝の抑制；細胞周期のＤＮＡ損傷へのカップリング(損傷したＤＮＡが細胞に存在する限り、細胞分裂は起こらない)；損傷したＤＮＡが修復できないならば、アポトーシスの開始；転移抑制(例えば、腫瘍細胞が分散するのを阻止し、接触阻害の喪失を遮断し、転移を阻害する)；およびＤＮＡ修復。腫瘍抑制因子タンパク質の具体例は、ｐ５３、ホスファターゼおよびテンシンホモログ(ＰＴＥＮ)、ＳＷＩ／ＳＮＦ(SWItch／スクロース非発酵性)、フォンヒッペル・リンドウ腫瘍抑制因子(ｐＶＨＬ)、腺腫様多発結腸ポリープ(ＡＰＣ)、ＣＤ９５、腫瘍形成抑制５(ＳＴ５)、腫瘍形成抑制５(ＳＴ５)、腫瘍形成抑制１４(ＳＴ１４)およびＹｉｐｐｅｅ様３(ＹＰＥＬ３)を含む。
用語「構造タンパク質」は、他は液体である生物学的成分の硬化度および強剛性に寄与するタンパク質をいう。構造タンパク質は大部分線維性(例えばコラーゲンおよびエラスチン)であるが、球状(例えばアクチンおよびチューブリン)でもあり得る。通常、球状タンパク質は、モノマーとして可溶性であるが、重合化して、長い、繊維を形成し、これは、例えば、細胞骨格を形成し得る。他の構造タンパク質は、機械力を産生できるモータータンパク質(例えばミオシン、キネシンおよびダイニン)および界面活性剤タンパク質である。構造タンパク質の具体例は、コラーゲン、界面活性剤タンパク質Ａ、界面活性剤タンパク質Ｂ、界面活性剤タンパク質Ｃ、界面活性剤タンパク質Ｄ、エラスチン、チューブリン、アクチンおよびミオシンを含む。
用語「再プログラム化因子」または「再プログラム化転写因子」は、体細胞で発現したとき、所望によりさらなる再プログラム化因子などのさらなる因子と一緒になって、該体細胞を、幹細胞特徴、特に多能性を有する細胞に再プログラム化または脱分化させる、分子、特にペプチドまたはタンパク質に関する。再プログラム化因子の具体例は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびナノＧを含む。
用語「ゲノム工学的タンパク質」は、対象のゲノムにおけるＤＮＡに挿入、欠失または置換できる、タンパク質に関する。ゲノム工学的タンパク質の具体例は、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ(ＴＡＬＥＮ)およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９(ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９)を含む。
用語「血液タンパク質」は、対象の血漿、特に健常対象の血漿に存在するペプチドまたはタンパク質に関する。血液タンパク質は、輸送(例えば、アルブミン、トランスフェリン)、酵素活性(例えば、トロンビンまたはセルロプラスミン)、凝血(例えば、フィブリノゲン)、病原体に対する防御(例えば、補体成分および免疫グロブリン)、プロテアーゼ阻害剤(例えば、アルファ１抗トリプシン)などの多様な機能を有する。血液タンパク質の具体例は、トロンビン、血清アルブミン、第VII因子、第VIII因子、インスリン、第IX因子、第Ｘ因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、タンパク質Ｃ、フォン・ヴィレブランド因子、抗トロンビンIII、グルコセレブロシダーゼ、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)、修飾第VIII因子および抗凝血剤を含む。
故に、ある実施態様において、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は、(ｉ)好ましくはエリスロポエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン４(ＩＬ－２)およびインターロイキン１０(ＩＬ－１１)からなる群から選択される、サイトカイン、より好ましくはＥＰＯ；(ii)接着分子、特にインテグリン；(iii)免疫グロブリン、特に抗体；(iv)免疫学的に活性な化合物、特に抗原；(ｖ)ホルモン、特にバソプレッシン、インスリンまたは成長ホルモン；(vi)増殖因子、特にＶＥＧＦＡ；(vii)プロテアーゼ阻害剤、特にアルファ１抗トリプシン；(viii)好ましくは単純ヘルペスウイルスタイプ１チミジンキナーゼ(ＨＳＶ１－ＴＫ)、ヘキソサミニダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、シュードコリンエステラーゼ、膵臓酵素およびラクターゼからなる群から選択される、酵素；(ix)受容体、特に増殖因子受容体；(ｘ)アポトーシス制御因子、特にＢＡＸ；(xi)転写因子、特にＦＯＸＰ３；(xii)腫瘍抑制因子タンパク質、特にｐ５３；(xiii)構造タンパク質、特に界面活性剤タンパク質Ｂ；(xiv)例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８およびナノＧからなる群から選択される、再プログラム化因子；(xv)ゲノム工学的タンパク質、特にクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート－ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９(ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９)；および(xvi)血液タンパク質、特にフィブリノゲンである。
ある実施態様において、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質は１以上の抗原または１以上のエピトープを含む、すなわち、対象へのペプチドまたはタンパク質の投与は、治療的または部分的にまたは完全に保護的であり得る、対象における、該１以上の抗原または１以上のエピトープに対する免疫応答を誘導する。
ある実施態様において、ＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は少なくとも１個のエピトープをコードする。
ある実施態様において、エピトープは腫瘍抗原由来である。腫瘍抗原は、一般に種々の癌で発現することが知られる、「標準的」抗原であり得る。腫瘍抗原は、個体の腫瘍に特異的であり、以前には免疫系により認識されていなかった、「ネオ抗原」である。ネオ抗原またはネオ－エピトープは、アミノ酸変化に至る癌細胞のゲノムにおける１以上の癌特異的変異に起因し得る。腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ－４、ＢＡＧＥ、ベータ－ｃａｔｅｎｉｎ／ｍ、Ｂｃｒ－ａｂＬ ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、ＣＡＳＰ－８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディンファミリーの細胞表面タンパク質、例えばＣＬＡＵＤ ΓΝ－６、クローディン－１８.２およびクローディン－１２、ｃ－ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ－Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ－Ｖ、Ｇａｐ １００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＨＰＶ－Ｅ７、ＨＰＶ－Ｅ６、ＨＡＳＴ－２、ｈＴＥＲＴ(またはｈＴＲＴ)、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ－Ａ、好ましくはＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ５、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ７、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９、ＭＡＧＥ－Ａ１０、ＭＡＧＥ－Ａ１１またはＭＡＧＥ－Ａ１２、ＭＡＧＥ－Ｂ、ＭＡＧＥ－Ｃ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ－１、ＭＵＭ－２、ＭＵＭ－３、ＮＡ８８－Ａ、ＮＦ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＮＹ－ＢＲ－１、ｐｌ９０マイナーＢＣＲ－ａｂＬ、Ｐml／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ－１またはＳＡＲＴ－３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＲＰ－２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥ、ＷＴおよびＷＴ－１を含むが、これらに限定されない。
癌変異は個体毎に異なる。故に、新規エピトープ(ネオ－エピトープ)をコードする癌変異は、ワクチン組成物および免疫療法開発の魅力的標的を表す。腫瘍免疫療法の有効性は、宿主内で強力な免疫応答を誘導できる癌特異的抗原およびエピトープの選択に依存する。ＲＮＡを使用して、患者特異的腫瘍エピトープを患者に送達できる。脾臓に存在する樹状細胞(ＤＣ)は、腫瘍エピトープなどの免疫原性エピトープまたは抗原のＲＮＡ発現に特に興味深い抗原提示細胞を表す。複数エピトープの使用は、腫瘍ワクチン組成物の治療有効性を促進することが示されている。腫瘍ミュータノームの迅速なシーケンシングが、例えば、エピトープが所望によりリンカーにより離されている、単一ポリペプチドとして、ここに記載されるｍＲＮＡによりコードされ得る、個別化ワクチンのための複数エピトープを提供し得る。本発明のある実施態様において、ｍＲＮＡは、少なくとも１個のエピトープ、少なくとも２個のエピトープ、少なくとも３個のエピトープ、少なくとも４個のエピトープ、少なくとも５個のエピトープ、少なくとも６個のエピトープ、少なくとも７個のエピトープ、少なくとも８個のエピトープ、少なくとも９個のエピトープまたは少なくとも１０個のエピトープをコードする。例示的実施態様は、少なくとも５個のエピトープ(「ペンタトープ」と称される)をコードするｍＲＮＡおよび少なくとも１０個のエピトープ(「デカトープ」と称される)をコードするｍＲＮＡを含む。
ある実施態様において、エピトープは病原体関連抗原、特にウイルス抗原に由来する。ある実施態様において、エピトープはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに由来する。故に、ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ＲＮＡは、配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするＯＲＦを含む。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントは、配列番号７と少なくとも８０％同一性(例えば、少なくとも８５％同一性、少なくとも９０％同一性、少なくとも９１％同一性、少なくとも９２％同一性、少なくとも９３％同一性、少なくとも９４％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９６％同一性、少なくとも９７％同一性、少なくとも９８％同一性または少なくとも９９％同一性)を有する。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質の免疫原性フラグメントは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質のＳ１サブユニットまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質のＳ１サブユニットの受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質の受容体結合部分を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、そのＲＮＡはポリペプチドの細胞内発現に適する。ある実施態様において、このようなコード化ポリペプチドは完全Ｓタンパク質を含まない。ある実施態様において、コードされるポリペプチドは、例えば、配列番号５に示される、受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)を含む。ある実施態様において、コードされるポリペプチドは、配列番号２９または３１のペプチドを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、多量体複合体、特に三量体複合体を形成できる。この目的で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列の多量体複合体、特に三量体複合体形成を可能とするドメインを含み得る。ある実施態様において、多量体複合体形成を可能とするドメインは、三量化ドメイン、例えば、ここに記載する三量化ドメインを含む。
ある実施態様において、ここに定義する三量化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含む配列または機能的そのバリアントを含むが、それらに限定されない。ある実施態様において、ここに定義する三量化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸配列を含む配列または機能的そのバリアントを含むが、それらに限定されない。
ある実施態様において、三量化ドメインは、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメント。ある実施態様において、三量化ドメインは配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、三量化ドメインをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列、配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列もしくは配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列もしくは配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントをコードする。ある実施態様において、三量化ドメインをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１１のヌクレオチド７～８７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡにより発現されるＲＢＤ抗原(例えば、ここに記載するとおり)は、例えば、免疫原性を高めるため、Ｔ４－フィブリチン由来「フォルドン」三量化ドメインの付加により修飾され得る。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は、野生型コード配列と比較してコドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量が増加したコード配列によりコードされ、コドン最適化および／またはＧ／Ｃ含量の増加は、好ましくはコードするアミノ酸配列の配列を変えない。
ある実施態様において、
(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド９７９～１５８４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～２０５５のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１７～６８５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、
(ｉ)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列を含む、配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド４９～３８１９のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントは配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列、配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列またはもしくは配列番号１または７のアミノ酸１７～１２７３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列は分泌シグナルペプチドを含む。
ある実施態様において、分泌シグナルペプチドは、好ましくはＮ末端で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントに融合される。
ある実施態様において、
(ｉ)分泌シグナルペプチドをコードするＲＮＡは配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド１～４８のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)分泌シグナルペプチドは配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列もしくは配列番号１のアミノ酸１～１６のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の機能的フラグメントを含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは
(ｉ)配列番号６のヌクレオチド配列、配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号６のヌクレオチド配列もしくは配列番号６のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号４のヌクレオチド配列、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号４のヌクレオチド配列もしくは配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３のアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３のアミノ酸配列もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３のアミノ酸配列をコードするを含むアミノ酸配列。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～７１６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２２１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列、配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列もしくは配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列もしくは配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号１７、２１または２６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号１８のアミノ酸配列もしくは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～８２４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～８３３のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～８２４のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～２５７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～８３３のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～２６０のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様によると、膜貫通ドメインは、直接またはリンカー、例えば、グリシン／セリンリンカーを介して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原ペプチドまたはタンパク質に融合される。従って、ある実施態様において、膜貫通ドメインは、上記ワクチン抗原に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質または免疫原性そのフラグメント(抗原ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列(所望により上記シグナルペプチドおよび／または三量化ドメインに融合され得る)に融合される。このような膜貫通ドメインは、好ましくは抗原ペプチドまたはタンパク質のＣ末端に位置するが、それに限定されない。好ましくは、このような膜貫通ドメインは、存在するならば、三量化ドメインのＣ末端に位置するが、それに限定されない。ある実施態様において、三量化ドメインは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、そのバリアントまたはそのフラグメント、すなわち、抗原ペプチドまたはタンパク質と膜貫通ドメインの間に存在する。ここに定義する膜貫通ドメインは、好ましくはＲＮＡによりコードされる抗原ペプチドまたはタンパク質の細胞膜へのアンカーを可能とする。
ある実施態様において、ここに定義する膜貫通ドメイン配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質の膜貫通ドメイン配列、特に配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む配列または機能的そのバリアントを含むが、それらに限定されない。
ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または機能的フラグメントｏｆ 配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列は、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列、配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列もしくは配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または機能的フラグメントｏｆ 配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列または配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、膜貫通ドメイン配列をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２、８または９のヌクレオチド３６１９～３７６２のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド５４～９８６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸１～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～９９５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド１１１～９８６のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸２０～３１１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントをコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド１２０～９９５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸２３～３１４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド配列、配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３０のヌクレオチド配列もしくは配列番号３０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２９のアミノ酸配列、配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２９のアミノ酸配列もしくは配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２９のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド配列、配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号３２のヌクレオチド配列もしくは配列番号３２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸配列もしくは配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列もしくは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含む。ある実施態様において、ワクチン抗原は、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、
(ｉ)配列番号２７のヌクレオチド配列、配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列または配列番号２７のヌクレオチド配列もしくは配列番号２７のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列のフラグメントを含む；および／または
(ii)配列番号２８のアミノ酸配列、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列または配列番号２８のアミノ酸配列もしくは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列の免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号２７のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号２８のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、上記ワクチン抗原に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質または免疫原性そのフラグメント(抗原ペプチドまたはタンパク質)由来の上記アミノ酸配列を含むまたは本質的にそれからなるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルススパイク(Ｓ)タンパク質の連続配列を含む。ある実施態様において、上記ワクチン抗原は、２２０アミノ酸、２１５アミノ酸、２１０アミノ酸または２０５アミノ酸を超えないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２コロナウイルススパイク(Ｓ)タンパク質の連続配列を含む。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ここでＢＮＴ１６２ｂ１(ＲＢＰ０２０.３)、ＢＮＴ１６２ｂ２(ＲＢＰ０２０.１またはＲＢＰ０２０.２)と称されるヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ＲＢＰ０２０.２としてここに記載するヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列、配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２１のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号５のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９のヌクレオチド配列または２０、配列番号１９または２０のヌクレオチド配列に少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号１９または２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列、配列番号２０のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含むおよび／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列または配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列をコードする。ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)であり、(ｉ)配列番号２０のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ある実施態様において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡは、(ｉ)配列番号３２のヌクレオチド５４～７２５のヌクレオチド配列を含む；および／または(ii)配列番号３１のアミノ酸１～２２４のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列をコードする。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該ＲＮＡは、上記ＲＮＡ修飾、すなわち、５’キャップ構造の取り込み、ポリ－Ａ配列の取り込み、ポリ－Ａ配列のアンマスキング、５’－および／または３’－ＵＴＲの変更(例えば、１以上の３’－ＵＴＲの取り込み)、１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンについて５－メチルシチジンおよび／またはウリジンについてシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))およびコドン最適化の１以上を含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは上記修飾の組み合わせ、好ましくは上記修飾の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または全５個、すなわち、(ｉ)５’キャップ構造の取り込み、(ii)ポリ－Ａ配列の取り込み、ポリ－Ａ配列のアンマスキング；(iii)５’－および／または３’－ＵＴＲの変更(例えば、１以上の３’－ＵＴＲの取り込み)；(iv)１以上の天然に存在するヌクレオチドの合成ヌクレオチドでの置き換え(例えば、シチジンについて５－メチルシチジンおよび／またはウリジンについてシュードウリジン(Ψ)またはＮ(１)－メチルシュードウリジン(ｍ１Ψ)または５－メチルウリジン(ｍ５Ｕ))および(ｖ)コドン最適化の組み合わせを含む。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該ＲＮＡは修飾ＲＮＡ、特に安定化ｍＲＮＡである。ある実施態様において、該ＲＮＡは、少なくとも１個のウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは、各ウリジンの代わりなど、ウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含む。ある実施態様において、修飾ヌクレオシドはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から独立して選択される。ある実施態様において、該ＲＮＡは５’キャップ、好ましくはキャップ１またはキャップ２構造、より好ましくはキャップ１構造を含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは、配列番号１２のヌクレオチド配列または配列番号１２のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む５’ ＵＴＲを含む。ある実施態様において、該ＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列または配列番号１３のヌクレオチド配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するヌクレオチド配列を含む３’ ＵＴＲを含む。ある実施態様において、該ＲＮＡはポリ－Ａ配列を含む。ある実施態様において、ポリ－Ａ配列は少なくとも１００ヌクレオチドを含む。ある実施態様において、ポリ－Ａ配列は、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントはＲＢＤに変異(例えば、配列番号１と比較して、Ｑ３２１Ｌ、Ｖ３４１Ｉ、Ａ３４８Ｔ、Ｎ３５４Ｄ、Ｓ３５９Ｎ、Ｖ３６７Ｆ、Ｋ３７８Ｒ、Ｒ４０８Ｉ、Ｑ４０９Ｅ、Ａ４３５Ｓ、Ｎ４３９Ｋ、Ｋ４５８Ｒ、Ｉ４７２Ｖ、Ｇ４７６Ｓ、Ｓ４７７Ｎ、Ｖ４８３Ａ、Ｙ５０８Ｈ、Ｈ５１９Ｐなどであるが、これらに限定されない)および／またはスパイクタンパク質に変異(例えば、配列番号１と比較して、Ｄ６１４Ｇなどであるが、これらに限定されない)を含む。当業者は、種々のスパイクバリアントおよび／またはそれらを記載する供給源を知っており(例えば、COVID-19 Viral Genome Analysis Pipelineにより維持され、https://cov.lanl.gov/components/sequence/COV/int_sites_tbls.compに見られるスパイクの変異部位表)(最終アクセス２０２０年８月２４日)、そして、本明細書を読むことにより、ここに記載するＲＮＡ組成物および／または方法が、このようなバリアントおよび／またはそれらの組み合わせの何れかまたは全てに対して中和活性を示す、ワクチン接種対象に血清を誘導する能力により特徴づけられることを認識する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位に変異を含み、所望により配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失などであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、「懸念される変異株２０２０１２／０１」(ＶＯＣ－２０２０１２／０１；系統Ｂ.１.１.７としても知られる)を含む。バリアントは、以前は、Public Health Englandにより、the first Variant Under Investigation in December 2020 (VUI - 202012/01)と名付けられていたが、懸念される変異株(ＶＯＣ－２０２０１２／０１)に再分類された。ＶＯＣ－２０２０１２／０１は、英国で、ＣＯＶＩＤ－１９パンデミック中、２０２０年１０月に、先月に採取したサンプルから最初に検出されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のバリアントであり、１２月半ばまでに急速に拡散し始めた。英国でのＣＯＶＩＤ－１９感染率の顕著な増加と相関した；この増加は、少なくとも一部、ヒト細胞のＡＣＥ２への結合に必要である、スパイク糖タンパク質の受容体結合ドメイン内のＮ５０１Ｙ変化によるものと考えられた。ＶＯＣ－２０２０１２／０１バリアントは２３変異により特徴づけられる：１３非同義性変異、４欠失および６同義性変異(すなわち、タンパク質を変化させる１７変異およびさせない６変異がある)。ＶＯＣ ２０２０１２／０１のスパイクタンパク質変化は、欠失６９－７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈを含む。ＶＯＣ－２０２０１２／０１の最も重要な変化の一つは、Ｎ５０１Ｙ、
５０１位アミノ酸のアスパラギン(Ｎ)からチロシン(Ｙ)への変化と考えられる。この変異単独またはＮ末端ドメイン(ＮＴＤ)の６９／７０位欠失と組み合わせて、ウイルス感染性を増大させ得る。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９－７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、バリアント「５０１.Ｖ２」を含む。このバリアントは、２０２０年１０月のサンプルで最初に観察され、それ以来、５０１.Ｖ２バリアントの３００を超える症例が南アフリカの全ゲノムシーケンス(ＷＧＳ)で確認されており、当地では２０２０年１２月にそれがウイルスの優勢形態となった。予備的結果は、このバリアントの感染性が増加している可能性を示す。５０１.Ｖ２バリアントは、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖを含む複数スパイクタンパク質変化により特徴づけられ、さらに最近集められたウイルスは、さらなる変化を有した：Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２－２４４。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２－２４４。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＨ６９／Ｖ７０欠失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異も含み得る(例えば、配列番号１と比較してＹ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。 具体的実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは次の変異を含む：配列番号１と比較して欠失６９－７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、Danish State Serum Institute(ＳＳＩ)によりΔＦＶＩ－スパイクとも称されるバリアント「クラスター５」を含む。デンマーク、北ユランで発見され、ミンク農場を介してミンクからヒトに広まったと考えられている。クラスター５において、ウイルスのスパイクタンパク質のいくつかの異なる変異が確認されている。特定の変異は、６９－７０デルタＨＶ(タンパク質の６９位および７１位のヒスチジンおよびバリン残基欠失)、Ｙ４５３Ｆ(４５３位のチロシンからフェニルアラニンへの変化)、Ｉ６９２Ｖ(６９２位のイソロイシンからバリン)、Ｍ１２２９Ｉ(１２２９位のメチオニンからイソロイシン)および所望によりＳ１１４７Ｌ(１１４７位のセリンからロイシン)を含む。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９－７０、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｍ１２２９Ｉおよび所望によりＳ１１４７Ｌ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の６１４位に変異、例えば、配列番号１と比較してスパイクタンパク質のＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。配列番号１と比較してスパイクタンパク質の６１４位に変異を含む該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較して１以上のさらなる変異も含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９－７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２－２４４。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位および６１４位に変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＮ５０１Ｙ変異およびＤ６１４Ｇ変異を含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含む(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉなどであるが、それらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較して欠失６９－７０、欠失１４４、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２ＡおよびＤ１１１８Ｈ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２－２４４。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の４８４位に変異、例えば配列番号１と比較してスパイクタンパク質のＥ４８４Ｋ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２－２４４。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、ブラジル(の)バリアントとして知られるバリアント系統Ｂ.１.１.２４８を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のこのバリアントはＰ.１系統の名前であり、１７の特有のアミノ酸変化を有し、その１０個がスパイクタンパク質であり、Ｎ５０１ＹおよびＥ４８４Ｋを含む。Ｂ.１.１.２４８はＢ.１.１.２８由来である。Ｅ４８４ＫはＢ.１.１.２８およびＢ.１.１.２４８両者に存在する。Ｂ.１.１.２４８は多数のＳ－タンパク質多型[Ｌ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆ]を有し、ある重要なＲＢＤ位置(Ｋ４１７、Ｅ４８４、Ｎ５０１)が南アフリカ由来と記載したバリアントに類似する。
故に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡの具体的実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位および４８４位に変異、例えば配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＮ５０１Ｙ変異およびＥ４８４Ｋ変異を吹くm得ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較してＨ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１ＹおよびＡ７０１Ｖおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２－２４４。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の５０１位、４８４位および６１４位に変異、例えば配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＮ５０１Ｙ変異、Ｅ４８４Ｋ変異およびＤ６１４Ｇ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＤ６１４Ｇおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎおよび欠失２４２－２４４。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクたんぱく質にＬ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１Ｖおよび欠失２４２－２４４および所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６ＩおよびＫ４１７Ｎ。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の４１７位に変異、例えば配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ｎ５０１Ｙ、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２－２４４。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、配列番号１と比較してスパイクタンパク質の４１７位および４８４位および／または５０１位に変異、例えば配列番号１と比較してスパイクタンパク質にＫ４１７ＮまたはＫ４１７Ｔ変異およびＥ４８４Ｋおよび／またはＮ５０１Ｙ変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む。ある実施態様において、該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較して１以上のさらなる変異を含み得る(例えば、配列番号１と比較して、Ｈ６９／Ｖ７０欠失、Ｙ１４４欠失、Ａ５７０Ｄ、Ｄ６１４Ｇ、Ｐ６８１Ｈ、Ｔ７１６Ｉ、Ｓ９８２Ａ、Ｄ１１１８Ｈ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ａ７０１Ｖ、Ｌ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｙ４５３Ｆ、Ｉ６９２Ｖ、Ｓ１１４７Ｌ、Ｍ１２２９Ｉ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７Ｉ、Ｖ１１７６Ｆなどであるが、これらに限定されない)。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは、次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＤ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ａ７０１ＶおよびＫ４１７Ｎおよび所望により：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｒ２４６Ｉおよび欠失２４２－２４４。該ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異も含み得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードするＲＮＡのある実施態様において、該バリアントは次の変異を含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントを含む：配列番号１と比較してＬ１８Ｆ、Ｔ２０Ｎ、Ｐ２６Ｓ、Ｄ１３８Ｙ、Ｒ１９０Ｓ、Ｋ４１７Ｔ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｈ６５５Ｙ、Ｔ１０２７ＩおよびＶ１１７６Ｆ。
ここに記載するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクバリアントは、配列番号１と比較してＤ６１４Ｇ変異を含んでも含まなくてもよい。
本発明のある実施態様において、抗原(例えば腫瘍抗原またはワクチン抗原)は、好ましくは、ＲＮＡが投与される対象の細胞に入ったら、各タンパク質に翻訳される一本鎖、５’キャッピングＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)として投与される。好ましくは、ＲＮＡは、安定性および翻訳効率に関してＲＮＡの最大有効性のために最適化されている構造要素を含む(５’キャップ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ポリ(Ａ)配列)。
ある実施態様において、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)を、ＲＮＡの５’末端で特異的キャッピング構造として利用する。ある実施態様において、ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧを、ＲＮＡの５’末端で特異的キャッピング構造として利用する。ある実施態様において、５’－ＵＴＲ配列はヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡ由来であり、所望により翻訳効率増加のための最適化‘コザック配列’を有する。ある実施態様において、「スプリット遺伝子のアミノ末端エンハンサー」(ＡＥＳ)ｍＲＮＡ(Ｆと称する)およびミトコンドリアコード化１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称する)由来の２個の配列要素(ＦＩ要素)の組み合わせを、コード配列とポリ(Ａ)配列の間に配置し、高最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にする。ある実施態様において、ヒトベータ－グロビンｍＲＮＡ由来の２個の反復３’－ＵＴＲをコード配列とポリ(Ａ)配列の間に配置し、高最大タンパク質レベルおよびｍＲＮＡの長期持続を確実にする。ある実施態様において、３０アデノシン残基のストレッチからなる１１０ヌクレオチド長の寸法のポリ(Ａ)配列、続いて１０ヌクレオチドリンカー配列およびその他７０アデノシン残基が使用される。このポリ(Ａ)配列は、ＲＮＡ安定性および翻訳効率増強のために設計された。
次に、３個の異なるＲＮＡプラットフォームの実施態様を記載し、各々ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントをコードする。
一般に、ここに記載するワクチンＲＮＡは、５’→３’で、次の構造の１つを含み得る：
キャップ－５’－ＵＴＲ－ワクチン抗原コード化配列－３’－ＵＴＲ－ポリ(Ａ)
または
ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－ワクチン抗原コード化配列－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０。
一般に、ここに記載するワクチン抗原は、Ｎ末端→Ｃ末端で、次の構造の１つを含み得る：
シグナル配列－ＲＢＤ－三量化ドメイン
まてゃあ
シグナル配列－ＲＢＤ－三量化ドメイン－膜貫通ドメイン。
ＲＢＤおよび三量化ドメインはリンカー、特にアミノ酸配列ＧＳＰＧＳＧＳＧＳ(配列番号３３)を有するリンカーなどのＧＳリンカーにより離され得る。三量化ドメインおよび膜貫通ドメインは、リンカー、特にアミノ酸配列ＧＳＧＳＧＳ(配列番号３４)を有するリンカーなどのＧＳリンカーにより離され得る。
シグナル配列はここに記載するシグナル配列であり得る。ＲＢＤはここに記載するＲＢＤドメインであり得る。三量化ドメインはここに記載する三量化ドメインであり得る。膜貫通ドメインはここに記載する膜貫通ドメインであり得る。
ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１～１６または１～１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
ＲＢＤは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む、
三量化ドメインは配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む； ａｎｄ
膜貫通ドメインは配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列と少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％または８０％同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ある実施態様において、
シグナル配列は配列番号１のアミノ酸１～１６または１～１９のアミノ酸配列または配列番号３１のアミノ酸１～２２のアミノ酸配列を含む、
ＲＢＤは配列番号１のアミノ酸３２７～５２８のアミノ酸配列を含む、
三量化ドメインは配列番号１０のアミノ酸３～２９のアミノ酸配列または配列番号１０のアミノ酸配列を含む；および
膜貫通ドメインは配列番号１のアミノ酸１２０７～１２５４のアミノ酸配列を含む。
上記ＲＮＡまたは上記ワクチン抗原をコードするＲＮＡは、ｍＲＮＡ(ｕＲＮＡ)、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)または自己増幅ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)を含む非修飾ウリジンであり得る。ある実施態様において、上記ＲＮＡまたは上記ワクチン抗原をコードするＲＮＡはヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)である。
非修飾ウリジンメッセンジャーＲＮＡ(ｕＲＮＡ)
非修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｕＲＮＡ)の活性素因は、細胞に挿入すると翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。コロナウイルスワクチン抗原をコードする配列(すなわちオープンリーディングフレーム)に加えて、各ｕＲＮＡは好ましくは安定性および翻訳効率に関するＲＮＡの最大有効性のために最適化された共通構造要素を含む(５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ(Ａ)－テイル)。好ましい５’キャップ構造はベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’－ＯＧｐｐＳｐＧ)である。好ましい５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲは、それぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ(Ａ)－テイルは配列番号１４の配列を含む。
このプラットフォームの種々の実施態様は次のとおりである：
ＲＢＬ０６３.１(配列番号１５；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＲＢＬ０６３.２(配列番号１６；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ａ１；ＲＢＬ０６３.３(配列番号１７；配列番号５)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(部分配列、Ｓ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ))
これに関して、「ｈＡｇ－コザック」は、翻訳効率を増加するための最適化‘コザック配列’を伴うヒトアルファ－グロビンｍＲＮＡの５’－ＵＴＲ配列を意味する；「Ｓ１Ｓ２タンパク質」／「Ｓ１Ｓ２ ＲＢＤ」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の各抗原をコードする配列を意味する；「ＦＩ要素」は、３’－ＵＴＲが「スプリット遺伝子のアミノ末端エンハンサー」(ＡＥＳ) ｍＲＮＡ(Ｆと称する)およびミトコンドリアコード化１２ＳリボソームＲＮＡ(Ｉと称する)由来の２配列要素の組み合わせであることを意味する。これらは、ＲＮＡ安定性を付与し、総タンパク質発現を増大する配列のエクスビボ選択仮定で同定された；「Ａ３０Ｌ７０」は、樹状細胞でＲＮＡ安定性および翻訳効率増大のために設計された３０アデノシン残基のストレッチからなる１１０ヌクレオチド長あるポリ(Ａ)－テイル、続いて１０ヌクレオチドリンカー配列およびその他の７０アデノシン残基を意味する；「ＧＳ」はグリシン－セリンリンカー、すなわち、一般的に融合タンパク質で使用される、主にアミノ酸グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)からなる短リンカーペプチドをコードする配列を意味する。
ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)
ヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)薬物物質の活性素因は同様に細胞に入ると翻訳される一本鎖ｍＲＮＡである。コロナウイルスワクチン抗原をコードする配列(すなわち、オープンリーディングフレーム)に加えて、各ｍｏｄＲＮＡは、ｕＲＮＡとしてＲＮＡの最大有効性を最適化する共通構造要素を含む(５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ(Ａ)－テイル)。ｕＲＮＡと比較して、ｍｏｄＲＮＡはウリジンの代わりに１－メチル－シュードウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧである。好ましい５’－ＵＴＲおよび３’－ＵＴＲはそれぞれ配列番号１２のヌクレオチド配列および配列番号１３のヌクレオチド配列を含む。好ましいポリ(Ａ)－テイルは配列番号１４の配列を含む。付加的精製工程が、インビトロ転写反応中産生されたｄｓＲＮＡ不純物を減少するためにｍｏｄＲＮＡに適用される。
このプラットフォームの種々の実施態様は次のとおりである：
ＢＮＴ１６２ｂ２；ＲＢＰ０２０.１(配列番号１９；配列番号７)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ｂ２；ＲＢＰ０２０.２(配列番号２０；配列番号７)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ)－ｈＡｇ－コザック－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ｂ１；ＲＢＰ０２０.３(配列番号２１；配列番号５)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ)－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(部分配列、フィブリチンに融合したＳ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ))
ＢＮＴ１６２ｂ３ｃ(配列番号２９；配列番号３０)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＧＳ－ＴＭ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(部分配列、Ｓ１Ｓ２タンパク質の膜貫通ドメイン(ＴＭ)に融合したフィブリチンに融合したＳ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ))；抗原配列のＮ末端の内因性Ｓ１Ｓ２タンパク質分泌シグナルペプチド(ａａ １－１９)
ＢＮＴ１６２ｂ３ｄ(配列番号３１；配列番号３２)
構造 ｍ２ ７,３’－ＯＧｐｐｐ(ｍ１ ２’－Ｏ)ＡｐＧ－ｈＡｇ－コザック－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＧＳ－ＴＭ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓ１Ｓ２タンパク質)(部分配列、Ｓ１Ｓ２タンパク質の膜貫通ドメイン(ＴＭ)に融合したフィブリチンに融合したＳ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ))；抗原配列のＮ末端の免疫グロブリン分泌シグナルペプチド(ａａ １－２２)
自己増幅ＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)
自己増幅ｍＲＮＡ(ｓａＲＮＡ)薬物物質の活性素因は、細胞に入ると自己増幅し、その後コロナウイルスワクチン抗原が翻訳される一本鎖ＲＮＡである。好ましくは単一タンパク質をコードするｕＲＮＡおよびｍｏｄＲＮＡとは対照的に、ｓａＲＮＡのコード領域は２個のオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を不空M。５’－ＯＲＦはベネズエラウマ脳炎ウイルス(ＶＥＥＶ)ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ(レプリカーゼ)などのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。レプリカーゼＯＲＦは、３’でサブゲノムプロモーターおよび抗原をコードする第二ＯＲＦが続く。さらに、ｓａＲＮＡ ＵＴＲは、自己増幅に必要な５’および３’保存配列要素(ＣＳＥ)を含む。ｓａＲＮＡは、ｕＲＮＡなどのＲＮＡの最大有効性の最適化の共通構造要素を含む(５’キャップ、５’－ＵＴＲ、３’－ＵＴＲ、ポリ(Ａ)－テイル)。ｓａＲＮＡは、好ましくはウリジンを含む。好ましい５’キャップ構造はベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)(ｍ２ ７,２’－ＯＧｐｐＳｐＧ)である。
ｓａＲＮＡの細胞質送達はアルファウイルス様ライフサイクルを開始する。しかしながら、ｓａＲＮＡはゲノムパッケージングまたは細胞侵入に必要なアルファウイルス構造的タンパク質をコードせず、それゆえ複製コンピテントウイルス粒子の産生が不可能である可能性は極めて低い。複製はＤＮＡを産生するあらゆる中間工程を含まない。それゆえｓａＲＮＡの使用／取り込みは、標的細胞内のゲノム組込みまたは他の永久遺伝修飾のリスクがない。さらに、ｓａＲＮＡ自体、ｄｓＲＮＡ中間体の認識を介して自然免疫応答を効率的に活性化することにより、その永続的複製を阻止する。
このプラットフォームの種々の実施態様は次のとおりである：
ＲＢＳ００４.１(配列番号２４；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＲＢＳ００４.２(配列番号２５；配列番号７)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－Ｓ１Ｓ２－ＰＰ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(Ｓ１Ｓ２完全長タンパク質、配列バリアント)
ＢＮＴ１６２ｃ１；ＲＢＳ００４.３(配列番号２６；配列番号５)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(部分配列、Ｓ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ))
ＲＢＳ００４.４(配列番号２７；配列番号２８)
構造 ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ(Ｄ１)－レプリカーゼ－ＲＢＤ－ＧＳ－フィブリチン－ＴＭ－ＦＩ－Ａ３０Ｌ７０
コードする抗原 ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルススパイクタンパク質(Ｓタンパク質)(部分配列、Ｓ１Ｓ２タンパク質の受容体結合ドメイン(ＲＢＤ))
さらに、分泌シグナルペプチド(ｓｅｃ)は好ましくはＮ末端タグとしてｓｅｃが翻訳されるように抗原コード化領域に融合される。ある実施態様において、ｓｅｃは、Ｓタンパク質の分泌シグナルペプチドに対応する。一般的に融合タンパク質で使用される、主にアミノ酸グリシン(Ｇ)およびセリン(Ｓ)からなる短リンカーペプチドをコードする配列をＧＳ／リンカーとして使用し得る。
ある実施態様において、抗原(例えば腫瘍抗原またはワクチン抗原)をコードするＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)を、抗原を提供するために処置される対象の細胞で発現させる。ある実施態様において、ＲＮＡは、対象の細胞で一過性に発現される。ある実施態様において、ＲＮＡはインビトロで転写される。ある実施態様において、抗原の発現は細胞表面である。ある実施態様において、抗原は発現され、ＭＨＣの状況で提示される。ある実施態様において、抗原の発現は細胞外空間にであり、すなわち、抗原は分泌される。
抗原分子またはその前進産物、例えば、そのフラグメントを、免疫エフェクター細胞により運搬されるＢＣＲまたはＴＣＲなどの抗原受容体または抗体に結合し得る。
ペプチドおよびタンパク質抗原をコードするＲＮＡ(例えば、ｍＲＮＡ)の投与により、本発明により対象に提供されるペプチドおよびタンパク質抗原(ここで、抗原がワクチン抗原である)は、好ましくはペプチドまたはタンパク質抗原が提供される対象において、免疫応答、例えば、液性および／または細胞免疫応答の誘導をもたらす。該免疫応答は、好ましくは標的抗原に対する。故に、ワクチン抗原は、標的抗原、そのバリアントまたはそのフラグメントを含み得る。ある実施態様において、このようなフラグメントまたはバリアントは、標的抗原と免疫学的に等価である。本発明において、用語「抗原のフラグメント」または「抗原のバリアント」は、抗原、すなわち標的抗原を標的とする免疫応答の誘導をもたらす因子を意味する。故に、ワクチン抗原は、標的抗原に対応しても含んでもよく、標的抗原のフラグメントに対応しても含んでもよくまたは標的抗原またはそのフラグメントと相同である抗原に対応しても含んでもよい。故に、本発明により、ワクチン抗原は、標的抗原の免疫原性フラグメントまたは標的抗原の免疫原性フラグメントと相同であるアミノ酸配列を含み得る。「抗原の免疫原性フラグメント」は、本発明によると、好ましくは標的抗原に対する免疫応答の誘導ができる抗原のフラグメントに関する。ワクチン抗原は組み換え抗原であり得る。
用語「免疫学的に等価」は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じまたは本質的に同じ免疫学的性質を示すおよび／または、例えば、免疫学的効果のタイプに関して、同じまたは本質的に同じ免疫学的効果を発揮することを意味する。本発明において、用語「免疫学的に等価」は、好ましくは免疫化に使用する抗原または抗原バリアントの免疫学的効果または性質について使用する。例えば、アミノ酸配列は、該アミノ酸配列が、対象の免疫系に暴露されたとき、参照アミノ酸配列と反応する特異性を有する免疫反応を誘導するならば、参照アミノ酸配列と免疫学的に等価である。
ある実施態様において、本発明で使用するＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)は非免疫原性である。免疫刺激剤をコードするＲＮＡを、本発明により投与して、アジュバント効果を提供し得る。免疫刺激剤をコードするＲＮＡは、標準的ＲＮＡまたは非免疫原性ＲＮＡであり得る。
ここで使用する用語「非免疫原性ＲＮＡ」(例えば「非免疫原性ｍＲＮＡ」)は、例えば、哺乳動物への投与により、免疫系による応答を誘導しないまたは非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性とする修飾または処理に付されていないことのみ異なる同じＲＮＡにより誘導されるより、すなわち、標準的ＲＮＡ(ｓｔｄＲＮＡ)により誘導されるより、弱い応答を誘導するＲＮＡをいう。ある好ましい実施態様において、ここでは修飾ＲＮＡ(ｍｏｄＲＮＡ)とも称する非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡへのＲＮＡ介在活性化を抑制する修飾ヌクレオシドの取り込みおよび二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)の除去により非免疫原性とされる。
非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)を、修飾ヌクレオシドの取り込みにより非免疫原性とするために、ＲＮＡの免疫原性を低下または抑制する限り、あらゆる修飾ヌクレオシドが使用され得る。特に好ましいのは、自然免疫受容体のＲＮＡ介在活性化を抑制する修飾ヌクレオシドである。ある実施態様において、修飾ヌクレオシド１以上のウリジンの修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの置換を含む。ある実施態様において、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。ある実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３－メチル－ウリジン(ｍ３Ｕ)、５－メトキシ－ウリジン(ｍｏ５Ｕ)、５－アザ－ウリジン、６－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオ－ウリジン(ｓ２Ｕ)、４－チオ－ウリジン(ｓ４Ｕ)、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシ－ウリジン(ｈｏ５Ｕ)、５－アミノアリル－ウリジン、５－ハロ－ウリジン(例えば、５－ヨード－ウリジンまたは５－ブロモ－ウリジン)、ウリジン５－オキシ酢酸(ｃｍｏ５Ｕ)、ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル(ｍｃｍｏ５Ｕ)、５－カルボキシメチル－ウリジン(ｃｍ５Ｕ)、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジン(ｃｈｍ５Ｕ)、５－カルボキシヒドロキシメチル－ウリジンメチルエステル(ｍｃｈｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕ)、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｃｍ５ｓ２Ｕ)、５－アミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－ウリジン(ｍｎｍ５Ｕ)、１－エチル－シュードウリジン、５－メチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－メチルアミノメチル－２－セレノ－ウリジン(ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ)、５－カルバモイルメチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウリジン(ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ)、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－ウリジン(τｍ５Ｕ)、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン(τｍ５ｓ２Ｕ)、１－タウリノメチル－４－チオ－シュードウリジン)、５－メチル－２－チオ－ウリジン(ｍ５ｓ２Ｕ)、１－メチル－４－チオ－シュードウリジン(ｍ１ｓ４ψ)、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、３－メチル－シュードウリジン(ｍ３ψ)、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン(Ｄ)、ジヒドロシュードウリジン、５,６－ジヒドロウリジン、５－メチル－ジヒドロウリジン(ｍ５Ｄ)、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシ－ウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)ウリジン(ａｃｐ３Ｕ)、１－メチル－３－(３－アミノ－３－カルボキシプロピル)シュードウリジン(ａｃｐ３ψ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(ｉｎｍ５Ｕ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２－チオ－ウリジン(ｉｎｍ５ｓ２Ｕ)、α－チオ－ウリジン、２’－Ｏ－メチル－ウリジン(Ｕｍ)、５,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ５Ｕｍ)、２’－Ｏ－メチル－シュードウリジン(ψｍ)、２－チオ－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｓ２Ｕｍ)、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｍｃｍ５Ｕｍ)、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｎｃｍ５Ｕｍ)、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｃｍｎｍ５Ｕｍ)、３,２’－Ｏ－ジメチル－ウリジン(ｍ３Ｕｍ)、５－(イソペンテニルアミノメチル)－２’－Ｏ－メチル－ウリジン(ｉｎｍ５Ｕｍ)、１－チオ－ウリジン、デオキシチミジン、２’－Ｆ－アラ－ウリジン、２’－Ｆ－ウリジン、２’－ＯＨ－アラ－ウリジン、５－(２－カルボメトキシビニル)ウリジンおよび５－[３－(１－Ｅ－プロペニルアミノ)ウリジンからなる群から選択される。ある特に好ましい実施態様において、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、シュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)または５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)、特にＮ１－メチル－シュードウリジンである。
ある実施態様において、１以上のウリジンの修飾核酸塩基を含むヌクレオシドでの置換は、ウリジンの少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％の置換を含む。
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写(ＩＶＴ)によるＲＮＡ(好ましくはｍＲＮＡ)の合成中、相当量の二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)を含む異常産物が、酵素の非定型活性により産生される。ｄｓＲＮＡは炎症性サイトカインを誘導し、エフェクター酵素を活性化し、タンパク質合成阻害に至る。ｄｓＲＮＡは、例えば、非多孔性または多孔性Ｃ－１８ポリスチレン－ジビニルベンゼン(ＰＳ－ＤＶＢ)マトリクスを使用する、イオン対逆相ＨＰＬＣにより、ＩＶＴ ＲＮＡなどのＲＮＡから除去できる。あるいは、ｄｓＲＮＡを特異的に加水分解するが、ｓｓＲＮＡはせず、それ故にＩＶＴ ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ混入物を排除する、大腸菌ＲＮａｓｅIIIを使用する酵素ベースの方法が使用され得る。さらに、ｄｓＲＮＡは、セルロース物質を使用してｓｓＲＮＡから分離され得る。ある実施態様において、ＲＮＡ調製物をセルロース物質と接触させ、ｓｓＲＮＡを、ｄｓＲＮＡのセルロース物質との結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース物質との結合を可能にしない条件下で、セルロース物質から分離する。ｓｓＲＮＡを提供するための適当な方法は、例えば、ＷＯ２０１７／１８２５２４に開示される。
用語がここで使用される限り「除去する」または「除去」は、非免疫原性ＲＮＡなどの第一の物質の集団の特徴が、ｄｓＲＮＡなどの近接する第二の物質の集団と反されていることをいい、ここで、第一の物質の集団は、必ずしも第二の物質を欠くものではなく、第二の物質の集団は必ずしも第一の物質を欠くものではない。しかしながら、第二の物質の集団により特徴づけられる第一の物質の集団は、第一および第二の物質の分離されていない混合物と比較して、第二の物質の含量が測定可能に低い。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡからのｄｓＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)の除去は、非免疫原性ＲＮＡ組成物におけるＲＮＡの１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０.５％未満、０.３％未満または０.１％未満がｄｓＲＮＡであるようなｄｓＲＮＡの除去を含む。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)はｄｓＲＮＡがないまたは実質的にない。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)組成物は一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡの精製調製物を含む。例えば、ある実施態様において、一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)の精製調製物は二本鎖ＲＮＡ(ｄｓＲＮＡ)が実質的にない。ある実施態様において、精製調製物は、全他の核酸分子(ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡなど)に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９.５％または少なくとも９９.９％一本鎖ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、同じ配列の標準的ＲＮＡより細胞でより効率的に翻訳される。ある実施態様において、翻訳は、非修飾カウンターパートと比較して、２倍増強される。ある実施態様において、翻訳は３倍増強される。ある実施態様において、翻訳は４倍増強される。ある実施態様において、翻訳は５倍増強される。ある実施態様において、翻訳は６倍増強される。ある実施態様において、翻訳は７倍増強される。ある実施態様において、翻訳は８倍増強される。ある実施態様において、翻訳は９倍増強される。ある実施態様において、翻訳は１０倍増強される。ある実施態様において、翻訳は１５倍増強される。ある実施態様において、翻訳は２０倍増強される。ある実施態様において、翻訳は５０倍増強される。ある実施態様において、翻訳は１００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は２００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は５００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は１０００倍増強される。ある実施態様において、翻訳は２０００倍増強される。ある実施態様において、倍数は１０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～１００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～２００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～３００倍である。ある実施態様において、倍数は１０～５００倍である。ある実施態様において、倍数は２０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は３０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は５０～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は１００～１０００倍である。ある実施態様において、倍数は２００～１０００倍である。ある実施態様において、翻訳は、何らかの他の相当量または量の範囲で増強される。
ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)同じ配列の標準的ＲＮＡより有意に低い自然免疫原性を示す。ある実施態様において、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)は、非修飾カウンターパートより２倍低い自然免疫応答を示す。ある実施態様において、自然免疫原性は３倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は４倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は５倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は６倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は７倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は８倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は９倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１０倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１５倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は２０倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は５０倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は２００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は５００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は１０００倍減少される。ある実施態様において、自然免疫原性は２０００倍減少される。
用語「有意に低い自然免疫原性を示す」は、自然免疫原性の検出可能な減少をいう。ある実施態様において、本用語は、有効量の非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)を、検出可能な自然免疫応答を誘発することなく投与できるような減少をいう。ある実施態様において、本用語は、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)を、非免疫原性ＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生の検出可能な減少に十分な自然免疫応答を誘発することなく反復投与できるような減少をいう。ある実施態様において、減少は、非免疫原性ＲＮＡ(特にｍＲＮＡ)が非免疫原性ＲＮＡによりコードされるタンパク質の検出可能な産生の排除に十分な自然免疫応答を誘発することなく反復投与できるようなものである。
「免疫原性」は、ＲＮＡなどの外来物質が、ヒトまたは他の動物の体内で免疫応答を引き起こす能力である。自然免疫系は、比較的非特異的および即時である、免疫系の要素である。適応免疫系と共に脊椎動物免疫系の２個の主成分の一つである。
ここで使用する「内因性」は、生物、細胞、組織または系由来のまたは中で産生されるあらゆる物質をいう。
ここで使用する用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外から導入されたまたは外で産生される、あらゆる物質をいう。
ここで使用する用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。
ここで使用する用語「結合」、「融合」または「融合体」は相互交換可能に使用される。これらの用語は、２個の以上要素または成分またはドメインを一緒に合わせることをいう。
脂質ナノ粒子
種々のタイプのＲＮＡ含有粒子が、粒子形態のＲＮＡの送達に適するとして先に記載されている(例えば、Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60参照)。非ウイルスＲＮＡ送達媒体について、ＲＮＡのナノ粒子封入はＲＮＡを分解から物理的に保護し、特定の化学に依存して、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助け得る。
ポリマーおよび脂質などの正電荷分子と負電荷核酸の間の静電相互作用は、粒子形成に関与する。これは、核酸粒子の複雑化および自発的形成をもたらす。
本発明において、用語「粒子」は、分子または分子複合体、特に粒子形成化合物により形成された構造のある物体に関する。好ましくは、粒子は、１以上のタイプの両親媒性物質(例えば、両親媒性脂質、両親媒性ポリマーおよび／または両親媒性タンパク質／ポリペプチド)からなるエンベロープ(例えば、１以上の層または薄層)を含む。この状況で、表現「両親媒性物質」は、親水性および親油性両方の性質を有する物質を意味する。エンベロープはまた両親媒性である必要はない付加的物質(例えば、付加的脂質および／または付加的ポリマー)も含み得る。故に、粒子は、単層または多重層構造であってよく、ここで、１以上の層または薄層からなる物質は、１以上のタイプの両親媒性物質(特に両親媒性脂質、両親媒性ポリマーおよび／または両親媒性タンパク質／ポリペプチドからなる群から選択される)を、所望により両親媒性である必要はない付加的物質(例えば、付加的脂質および／または付加的ポリマー)と組み合わせて含む。ある実施態様において、用語「粒子」は、ミクロまたはナノサイズ小型構造などのミクロまたはナノサイズ構造に関する。これに関し、用語「ミクロサイズ」は、粒子の全３個の外部寸法がミクロ規模である、すなわち、１～５μmであることを意味する。本発明により、用語「粒子」は、リポプレックス粒子(ＬＰＸ)、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)、ポリプレックス粒子、リポポリプレックス粒子、ウイルス様粒子(ＶＬＰ)およびこれらの混合物(例えば、ＬＰＸとＶＬＰの混合物またはＬＮＰとＶＬＰの混合物などの２以上の粒子タイプの混合物)を含む。
「核酸粒子」は、目的の標的部位(例えば、細胞、組織、臓器など)への核酸の送達に使用できる。核酸粒子は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質、少なくとも１個のカチオン性ポリマー、例えばプロタミンまたはこれらの混合物および核酸から形成され得る。核酸粒子は、脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)ベースのおよびリポプレックス(ＬＰＸ)ベースの製剤を含む。
何らかの理論に拘束されることを意図しないが、カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質および／またはカチオン性ポリマーは核酸と共に合わさり、凝集を形成し、この凝集がコロイド状に安定な粒子をもたらすと考えられる。
ある実施態様において、ここに記載する粒子は、カチオン的にイオン化可能な脂質以外の少なくとも１個の脂質または脂質様物質を含む。
ある実施態様において、核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ(例えば、ｍＲＮＡ ＬＮＰなどのｍＲＮＡ粒子)などのＲＮＡ粒子)１を超えるタイプの核酸分子を含み、ここで、モル質量または分子構造、キャッピング、コード領域または他の特性などの基本的構造要素に関するなどの核酸分子の分子パラメータは互いに類似しても異なってもよい。
本明細書で使用する「ナノ粒子」は、ここに記載する核酸(特にｍＲＮＡ)および少なくとも１個のカチオン性脂質を含む粒子をいい、ここで、粒子の全３個の外部寸法はナノ規模、すなわち、少なくとも約１nmおよび約１０００nm未満(好ましくは、１０～９９０nm、例えば１５～９００nm、２０～８００nm、３０～７００nm、４０～６００nmまたは５０～５００nm)である。好ましくは、最長および最短軸は有意に異ならない。好ましくは、粒子のサイズはその直径である。
ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、約０.５未満、約０.４未満、約０.３未満、約０.２未満、約０.１未満または約０.０５未満の多分散性指数(ＰＤＩ)を示す。例として、核酸粒子は約０.０１～約０.４または約０.１～約０.３の範囲の多分散性指数を示し得る。
本発明において、用語「リポプレックス粒子」は、両親媒性脂質、特にカチオン性両親媒性脂質およびここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)を含む粒子に関する。正電荷リポソーム(１以上の両親媒性脂質、特にカチオン性両親媒性脂質由来)と負電荷核酸(特にｍＲＮＡ)の間の静電相互作用は、核酸リポプレックス粒子の複雑化および自発的形成をもたらす。正電荷リポソームは、一般にＤＯＴＭＡなどのカチオン性両親媒性脂質およびＤＯＰＥなどの付加的脂質を使用して、合成され得る。ある実施態様において、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)リポプレックス粒子はナノ粒子である。
用語「脂質ナノ粒子」は、ナノサイズ脂質含有粒子に関する。
本発明において、用語「ポリプレックス粒子」は、両親媒性ポリマー、特にカチオン性両親媒性ポリマーおよびここに記載する核酸(特にｍＲＮＡ)を含む粒子に関する。正電荷カチオン性両親媒性ポリマーと負電荷核酸(特にｍＲＮＡ)の間の静電相互作用は、核酸ポリプレックス粒子の複雑化および自発的形成をもたらす。ポリプレックス粒子の調製に適する正電荷両親媒性ポリマーは、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリＬ－リシン、ポリＬ－アルギニンおよびヒストンを含む。ある実施態様において、核酸(特にｍＲＮＡ)ポリプレックス粒子はナノ粒子である。
用語「リポポリプレックス粒子」は、ここに記載する両親媒性脂質(特にカチオン性両親媒性脂質)、ここに記載する両親媒性ポリマー(特にカチオン性両親媒性ポリマー)およびここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡを含む粒子である。ある実施態様において、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)リポポリプレックス粒子はナノ粒子である。
用語「ウイルス様粒子」(ここではＶＬＰと略す)は、ウイルスを模倣するが、該ウイルスをあらゆる遺伝物質を含まず、故に、非感染性である分子をいう。好ましくは、ＶＬＰは、ここに記載する核酸(好ましくはＲＮＡ)を含み、該核酸(好ましくはＲＮＡ)はＶＬＰが由来するウイルスに異種である。ＶＬＰは、ウイルス構造タンパク質の個々の発現を介して合成でき、その後、それらはウイルス様構造に自己集合し得る。ある実施態様において、異なるウイルスからの構造カプシドタンパク質の組み合わせを使用して、組み換えＶＬＰを作り得る。ＶＬＰは、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)(小ＨＢＶ由来表面抗原(ＨＢｓＡｇ))、パルボウイルス科(例えば、アデノ随伴ウイルス)、パピローマウイルス科(例えば、ＨＰＶ)、レトロウイルス科(例えば、ＨＩＶ)、フラビウイルス科(例えば、Ｃ型肝炎ウイルス)およびバクテリオファージ(例えばＱβ、ＡＰ２０５)を含む多種多様なウイルスファミリーの成分から産生され得る。
用語「核酸含有粒子」は、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)が結合される、ここに記載する粒子に関する。これに関し、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)は、粒子の外表面(表面核酸(特に表面ｍＲＮＡ))に接着できおよび／または粒子に含まれ得る(封入核酸(特に封入ｍＲＮＡ))。
ある実施態様において、本発明の方法および使用において利用される粒子は、約１０～約２０００nmの範囲、例えば、少なくとも約１５nm(好ましくは少なくとも約２０nm、少なくとも約２５nm、少なくとも約３０nm、少なくとも約３５nm、少なくとも約４０nm、少なくとも約４５nm、少なくとも約５０nm、少なくとも約５５nm、少なくとも約６０nm、少なくとも約６５nm、少なくとも約７０nm、少なくとも約７５nm、少なくとも約８０nm、少なくとも約８５nm、少なくとも約９０nm、少なくとも約９５nmまたは少なくとも約１００nm)および／または最高１９００nm(好ましくは最高約１９００nm、最高約１８００nm、最高約１７００nm、最高約１６００nm、最高約１５００nm、最高約１４００nm、最高約１３００nm、最高約１２００nm、最高約１１００nm、最高約１０００nm、最高約９５０nm、最高約９００nm、最高約８５０nm、最高約８００nm、最高約７５０nm、最高約７００nm、最高約６５０nm、最高約６００nm、最高約５５０nmまたは最高約５００nm)、好ましくは約２０～約１５００nm、例えば約３０～約１２００nm、約４０～約１１００nm、約５０～約１０００nm、約６０～約９００nm、約７０～８００nm、約８０～７００nm、約９０～６００nmまたは約５０～５００nmまたは約１００～５００nmの範囲、例えば１０～１０００nm、１５～５００nm、２０～４５０nm、２５～４００nm、３０～３５０nm、４０～３００nm、５０～２５０nm、６０～２００nmまたは７０～１５０nmの範囲のサイズ(好ましくは直径、すなわち、回転半径(Ｒｇ)値の２倍または流体力学半径の２倍などの半径の２倍)を有する。
ＲＮＡ脂質粒子(特にｍＲＮＡ ＬＮＰなどのＲＮＡ ＬＮＰ)、Ｎ／Ｐ比 ｇivｅｓ ｔｈｅ比 ｏｆ ｔｈｅ 窒素ｇｒｏｕｐについて、Ｎ／Ｐ比は、脂質中の窒素基対ＲＮＡのリン酸基数の比を示す。窒素原子(ｐＨに依存)が通常正電荷であり、リン酸基が負電荷であるため、電荷比と相関する。Ｎ／Ｐ比は、電荷平衡が存在するとき、ｐＨに依存する。脂質製剤は、正電荷ナノ粒子がトランスフェクションに好都合であると考えられるため、しばしば４より大きく最大１２のＮ／Ｐ比で形成される。この場合、ＲＮＡはナノ粒子に完全に結合すると考えられる。
ここに記載する核酸粒子(特にｍＲＮＡ ＬＮＰなどのＲＮＡ ＬＮＰ)は、少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーからのコロイドを得て、コロイドを核酸と混合して、核酸粒子を得ることを含み得る、広範な方法で製造できる。
ここで使用する用語「コロイド」は、分散粒子が沈降しない均質混合物のタイプに関する。混合物における不溶性粒子は顕微鏡的であり、粒子径１～１０００ナノメートルである。混合物はコロイドまたはコロイド状懸濁液と称され得る。用語「コロイド」のみが混合物における粒子をいい、懸濁液全体ではないことがある。
少なくとも１個のカチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質および／または少なくとも１個のカチオン性ポリマーを含むコロイドの調製物のために、リポソーム小胞の調製に慣用的に使用される方法がここで適用可能であり、適切に適応される。リポソーム小胞の調製に最も一般的に使用される方法は、次の基本的段階を共有する：(ｉ)有機溶媒への脂質溶解、(ii)得られた溶液の乾燥および(iii)乾燥脂質の水和(種々の水性媒体を使用)。
フィルム水和方法において、脂質をまず適当な有機溶媒に溶解し、乾燥して薄いフィルムをフラスコの底に形成させる。得られた脂質フィルムを適切な水性媒体を使用して水和して、リポソーム分散体を産生する。さらに、付加的小型化工程が含まれ得る。
逆相蒸発は、リポソーム小胞の調製のためのフィルム水和の代替的方法であり、水相と脂質含有有機相の間の油中水型エマルジョンの形成を含む。この混合物の短い音波処理が系均質化に必要である。減圧下の有機相の除去により乳状ゲルを得て、それは続いてリポソーム懸濁液に変わる。
用語「エタノール注射技術」は、脂質を含むエタノール溶液が針を通して水溶液に急速に注入される過程をいう。この行動が脂質を溶液中に分散させ、脂質構造形成、例えばリポソーム形成などの脂質小胞形成を促進する。一般に、ここに記載する核酸(特にｍＲＮＡ)リポプレックス粒子は、核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡをコロイド状リポソーム分散体に加えることにより得ることができる。エタノール注入技術を使用して、このようなコロイド状リポソーム分散体は、ある実施態様において、次のとおり形成される：カチオン的にイオン化可能な脂質および付加的脂質などの脂質を含むエタノール溶液を、撹拌下水溶液に注入する。ある実施態様において、ここに記載する核酸(特にｍＲＮＡなどのＲＮＡ)リポプレックス粒子が、押し出し成形の工程なしに得られ得る。
用語「押し出し」または「押し出し成形」は、固定された、断面プロファイルを有する粒子の作製をいう。特に、粒子が規定された孔のフィルターを篩過される、粒子の小型化をいう。
無有機溶媒特徴を有する他の方法も、本発明によりコロイドの調製に使用し得る。
ＬＮＰは、典型的にイオン化可能カチオン性脂質、リン脂質などの中性脂質、コレステロールなどのステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の４個の成分を含む。各要素は、ペイロード保護を担い、有効な細胞内送達を可能とする。ＬＮＰは、エタノールに溶解された脂質と、水性緩衝液中の核酸の迅速な混合により形成され得る。
種々のタイプの核酸含有粒子が、粒子形態のＲＮＡの送達に適するとして先に記載されている(例えば、Kaczmarek, J. C. et al., 2017, Genome Medicine 9, 60参照)。非ウイルスＲＮＡ送達媒体について、ＲＮＡのナノ粒子封入はＲＮＡを分解から物理的に保護し、特定の化学に依存して、細胞取り込みおよびエンドソーム脱出を助け得る。
ある好ましい実施態様において、ここに記載するＲＮＡおよび少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含むＬＮＰはさらに１以上の付加的脂質を含む。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡおよび少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含むＬＮＰは、(ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；(ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質、および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を調製し；(ｃ)(ａ)の下に調製したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に調製したエタノール性溶液を混合し、それにより、第一緩衝系を含む中間水層に分散されたＬＮＰを含む第一中間製剤を調製し；そして(ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液溶液を使用して(ｃ)の下に調製した第一中間製剤を濾過し、それにより、最終緩衝系を含む最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製することにより調製される。工程(ｃ)の後、タンジェンシャルフロー濾過または透析濾過などの希釈および濾過から選択される１以上の工程が続き得る。ある実施態様において、第一緩衝系は最終緩衝系と異なる。別の実施態様において、第一緩衝系および最終緩衝系は同じである。
別の実施態様において、ここに記載するＲＮＡおよび少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含むＬＮＰは、(ａ’)水相にカチオン的にイオン化可能な脂質および存在するならば、１以上の付加的脂質のリポソームまたはコロイド状調製物を調製し；(ｂ’)水および緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；そして(ｃ’)(ａ’)の下に調製したリポソームまたはコロイド状調製物および(ｂ’)の下に調製したｍＲＮＡ溶液を混合することにより調製する。工程(ｃ’)後、タンジェンシャルフロー濾過などの希釈および濾過から選択される１以上の工程が続き得る。
本明細書は、ＲＮＡを含む粒子(特にＲＮＡを含むＬＮＰ)およびＲＮＡと結合して核酸粒子を形成する少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含む組成物を記載する。ＲＮＡ粒子は、粒子に非共有結合性相互作用により種々の形態に複合化するＲＮＡを含み得る。ここに記載する粒子はウイルス粒子、特に感染性ウイルス粒子ではない、すなわち、細胞にウイルス性に感染できない。
適当なカチオン的にイオン化可能な脂質は核酸粒子を形成するものであり、用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」に含まれる。用語「粒子形成成分」または「粒子形成剤」は、核酸と結合して核酸粒子を形成する、あらゆる成分に関する。このような成分は、核酸粒子の一部であり得るあらゆる要素を含む。
カチオン的にイオン化可能な脂質
ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、粒子形成剤として少なくとも１個のカチオン的にイオン化可能な脂質を含む。ここでの使用が意図されるカチオン的にイオン化可能な脂質は、核酸と静電的に結合できるあらゆるカチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む。ある実施態様において、ここでの使用が意図されるカチオン的にイオン化可能な脂質は、例えば、核酸と複合体形成によりまたは核酸が包含または封入される小胞形成により、核酸と結合できる。
ここで使用する「カチオン性脂質」または「カチオン性脂質様物質」は、正味の正電荷を有する脂質または脂質様物質をいう。カチオン性脂質または脂質様物質は、静電的相互作用により負電荷核酸と結合する。一般に、カチオン性脂質は、ステロール、アシル鎖、ジアシルまたはそれ以上のアシル鎖などの親油性部分を有し、脂質の頭基は、典型的に正電荷を有する。
ある実施態様において、カチオン性脂質または脂質様物質は、特定のｐＨ、特に酸性ｐＨでのみ正味の正電荷を有し、好ましくは、異なる、好ましくは生理学的ｐＨなどの高いｐＨで、正味の正電荷を有さない、好ましくは電荷を有さない、すなわち、中性である。このイオン化可能挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助けることにより有効性を増強し、毒性を低減すると考えられる。
ここで使用する「カチオン的にイオン化可能な脂質」は、正味の正電荷を有するまたは中性である脂質または脂質様物質、すなわち、永久的にカチオン性ではない脂質をいう。故に、カチオン的にイオン化可能な脂質が溶解される組成物のｐＨに依存して、カチオン的にイオン化可能な脂質は正電荷または中性である。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、好ましくは生理学的条件下、正電荷またはプロトン化されている少なくとも１個の窒素原子(Ｎ)を含む頭基を含む。
カチオン的にイオン化可能な脂質の例は、例えば、ＷＯ２０１６／１７６３３０およびＷＯ２０１８／０７８０５３に開示される。ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、式(Ｉ)：
またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体の構造を有し、ここで、
Ｌ１およびＬ２の一方は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、－ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１およびＬ２の他方は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
Ｇ１およびＧ２が各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
Ｇ３がＣ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
ＲａがＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ１およびＲ２が各々独立してＣ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
Ｒ３がＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４であり；
Ｒ４がＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
Ｒ５がＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；そして
ｘは０、１または２である。
式(Ｉ)、脂質の前記実施態様の一部において、脂質は、次の構造(ＩＡ)または(ＩＢ)：
の一方を有し、ここで、
Ａは３～８員シクロアルキルまたはシクロアルキレン基であり；
Ｒ６は、各場合独立して、Ｈ、ＯＨまたはＣ１－Ｃ２４アルキルであり；
ｎは１～１５の範囲の整数である。
式(Ｉ)の前記実施態様の一部において、脂質は構造(ＩＡ)を有し、他の実施態様において、脂質は構造(ＩＢ)を有する。
式(Ｉ)の他の実施態様において、脂質は次の構造(ＩＣ)または(ＩＤ)：
の一方を有し、ここで、ｙおよびｚは各々独立して１～１２の範囲の整数である。
式(Ｉ)の前記実施態様の何れかにおいて、Ｌ１およびＬ２の一方は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－である。例えば、ある実施態様においてＬ１およびＬ２の各々は－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－である。前記の何れかの異なる一部の実施態様において、Ｌ１およびＬ２は各々独立して－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－または－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－である。例えば、ある実施態様においてＬ１およびＬ２の各々は－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－である。
式(Ｉ)の異なる一部の実施態様において、脂質は、次の構造(ＩＥ)または(ＩＦ)：
の一方を有する。
式(Ｉ)の前記実施態様の一部において、脂質は次の構造(ＩＧ)、(ＩＨ)、(ＩＪ)または(ＩＫ)：
の一つを有する。
式(Ｉ)の前記実施態様の一部において、ｎは２～１２、例えば２～８または２～４の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｎは３、４、５または６である。ある実施態様において、ｎは３である。ある実施態様において、ｎは４である。ある実施態様において、ｎは５である。ある実施態様において、ｎは６である。
式(Ｉ)の前記実施態様のあるその他において、ｙおよびｚは各々独立して２～１０の範囲の整数である。例えば、ある実施態様において、ｙおよびｚは各々独立して４～９または４～６の範囲の整数である。
式(Ｉ)の前記実施態様の一部において、Ｒ６はＨである。前記実施態様のその他において、Ｒ６はＣ１－Ｃ２４アルキルである。他の実施態様において、Ｒ６はＯＨである。
式(Ｉ)のある実施態様において、Ｇ３は非置換である。他の実施態様において、Ｇ３は置換である。種々の異なる実施態様において、Ｇ３は直鎖状Ｃ１－Ｃ２４アルキレンまたは直鎖状Ｃ２－Ｃ２４アルケニレンである。
式(Ｉ)の一部の他の前記実施態様において、Ｒ１またはＲ２または両者は６－Ｃ２４アルケニルである。例えば、ある実施態様において、Ｒ１およびＲ２は、各々独立して次の構造を有する：
ここで、
Ｒ７ａおよびＲ７ｂは、各場合、独立してＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキル；であり；そして
ａは整数２～１２であり、
ここで、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂおよびａは、Ｒ１およびＲ２が各々独立して６～２０個の炭素原子を有するように選択される。例えば、ある実施態様においてａは５～９または８～１２の範囲の整数である。
式(Ｉ)の前記実施態様の一部において、Ｒ７ａの少なくとも１個はＨである。例えば、ある実施態様において、Ｒ７ａは各場合Ｈである。前記の他の異なる実施態様において、Ｒ７ｂの少なくとも１個はＣ１－Ｃ８アルキルである。例えば、ある実施態様において、Ｃ１－Ｃ８アルキルはメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソ－プロピル、ｎ－ブチル、イソ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ヘキシルまたはｎ－オクチルである。
式(Ｉ)の異なる実施態様において、Ｒ１またはＲ２または両者は次の構造：
の一つを有する。
式(Ｉ)の前記実施態様の一部において、Ｒ３はＯＨ、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または－ＮＨＣ(＝Ｏ)Ｒ４である。ある実施態様において、Ｒ４はメチルまたはエチルである。
種々の異なる実施態様において、式(Ｉ)のカチオン性脂質は下に示す構造の一つを有する。
種々の異なる実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は下表に示す構造の一つを有する。
種々の異なる実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質がＮ,Ｎ－ジメチル－２,３－ジオレイルオキシプロピルアミン(ＤＯＤＭＡ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)および４－((ジ((９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イル)アミノ)オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－４－オキソブタン－１－アミン(ＤＰＬ－１４)からなる群から選択される。
カチオン的にイオン化可能な脂質のさらなる例は、３－(Ｎ－(Ｎ’,Ｎ’－ジメチルアミノエタン)－カルバモイル)コレステロール(ＤＣ－Ｃｈｏｌ)、１,２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＯＤＡＰ)；１,２－ジアシルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン；１,２－ジアルキルオキシ－３－ジメチルアンモニウムプロパン、１,２－ジステアリルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン(ＤＳＤＭＡ)、１,２－ジリノレイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジリノレニルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｅｎＤＭＡ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、３－ジメチルアミノ－２－(コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ)－１－(ｃｉｓ,ｃｉｓ－９,１２－オクタデカジエンオキシ)プロパン(ＣＬｉｎＤＭＡ)、２－[５’－(コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ)－３’－オキサペントキシ)－３－ジメチル－１－(ｃｉｓ,ｃｉｓ－９’,１２’－オクタデカジエンオキシ)プロパン(ＣｐＬｉｎＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－３,４－ジオレイルオキシベンジルアミン(ＤＭＯＢＡ)、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＯｃａｒｂＤＡＰ)、２,３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ,Ｎ－ジメチルプロピルアミン(ＤＬｉｎＤＡＰ)、１,２－Ｎ,Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ)、１,２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン(ＤＬｉｎＣＤＡＰ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ)、２,２－ジリノレイル－４－(２－ジメチルアミノエチル)－[１,３]－ジオキソラン(ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ)、ヘプタトリアコンタ－６,９,２８,３１－テトラエン－１９－イル－４－(ジメチルアミノ)ブタノアート(ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ)、２－({８－[(３β)－コレスト－５－エン－３－イルオキシ]オクチル}オキシ)－Ｎ,Ｎ－ジメチル－３－[(９Ｚ,１２Ｚ)－オクタデカ－９,１２－ジエン－１－イルオキシ]プロパン－１－アミン(オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ)、１,２－ジミリストイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＭＤＡＰ)、１,２－ジパルミトイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン(ＤＰＤＡＰ)、Ｎ１－[２－((１Ｓ)－１－[(３－アミノプロピル)アミノ]－４－[ジ(３－アミノ－プロピル)アミノ]ブチルカルボキサミド)エチル]－３,４－ジ[オレイルオキシ]－ベンズアミド(ＭＶＬ５)、ジ((Ｚ)－ノン－２－エン－１－イル) ８,８’－((((２(ジメチルアミノ)エチル)チオ)カルボニル)アザンジイル)ジオクタノエート(ＡＴＸ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(ドデシルオキシ)プロパン－１－アミン(ＤＬＤＭＡ)、Ｎ,Ｎ－ジメチル－２,３－ビス(テトラデシルオキシ)プロパン－１－アミン(ＤＭＤＭＡ)、ジ((Ｚ)－ノン－２－エン－１－イル)－９－((４－(ジメチルアミノブタノイル)オキシ)ヘプタデカンジオエート(Ｌ３１９)、Ｎ－ドデシル－３－((２－ドデシルカルバモイル－エチル)－{２－[(２－ドデシルカルバモイル－エチル)－２－{(２－ドデシルカルバモイル－エチル)－[２－(２－ドデシルカルバモイル－エチルアミノ)－エチル]－アミノ}－エチルアミノ)プロピオンアミド(リピドイド９８Ｎ１２－５)、１－[２－[ビス(２－ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル－[２－[４－[２－[ビス(２ヒドロキシドデシル)アミノ]エチル]ピペラジン－１－イル]エチル]アミノ]ドデカン－２－オール(リピドイドＣ１２－２００)を含むが、これらに限定されない。
ある好ましい実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は構造Ｉ－３を有する。
ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は、粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約１００mol％、約２０mol％～約１００mol％、約３０mol％～約１００mol％、約４０mol％～約１００mol％または約５０mol％～約１００mol％を構成し得る。
ここに記載する粒子粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)がカチオン的にイオン化可能な脂質および１以上の付加的脂質を含ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％、約３０mol％～約５０mol％、約３５mol％～約４５mol％または約４０mol％を構成する。
ある実施態様において、ここに記載する粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、４０～５５モルパーセント、４０～５０モルパーセント、４１～４９モルパーセント、４１～４８モルパーセント、４２～４８モルパーセント、４３～４８モルパーセント、４４～４８モルパーセント、４５～４８モルパーセント、４６～４８モルパーセント、４７～４８モルパーセントまたは４７.２～４７.８モルパーセントのカチオン的にイオン化可能な脂質を含む。ある実施態様において、粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、約４７.０、４７.１、４７.２、４７.３、４７.４、４７.５、４７.６、４７.７、４７.８、４７.９または４８.０モルパーセントのカチオン的にイオン化可能な脂質を含む。
付加的脂質
ここに記載する粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、カチオン的にイオン化可能な脂質以外の脂質または脂質様物質、すなわち、非カチオン性脂質または脂質様物質(非カチオン的にイオン化可能な脂質または脂質様物質を含む)を含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、ここでは非カチオン性脂質または脂質様物質と称する。カチオン的にイオン化可能な脂質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分の付加による核酸粒子の製剤の最適化は、粒子安定性および核酸送達の有効性を増強し得る。
用語「脂質」および「脂質様物質」は１以上の疎水性部分または基および所望により１以上の親水性部分または基も含む分子として、広く定義される。疎水性部分および親水性部分を含む分子は、しばしば両親媒性物質とも記される。脂質は、通常水にほとんど解けない。水性環境で、両親媒性性質により、分子は、組織化された構造および種々の相に自己集合することが可能となる。これらの層の一つは、水性環境で小胞、多層状／単層リポソームまたは膜に存在するため、脂質二重層からなる。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基および１以上の芳香族、シクロ脂肪族またはヘテロ環式基で置換されたこのような基を含むが、これらに限定されない、非極性基の包含により付与され得る。親水性基は極性および／または電荷基を含み得て、炭水化物、リン酸、カルボン酸、スルフェート、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシルおよび他の同様の基を含む。
ここで使用する用語「両親媒性」は、極性部分および非極性部分両方を有する分子をいう。しばしば、両親媒性化合物は、長疎水性テイルに結合した極性頭を有する。ある実施態様において、極性部分は水に可溶性であり、一方非極性部分は水に不溶性である。さらに、極性部分は、形式上正電荷または形式上負電荷である。あるいは、極性部分は形式上正および負両方の電荷を有し、双性イオンまたは分子内塩であり得る。本発明の目的で、両親媒性化合物は、一つまたは複数の天然または非天然脂質および脂質様化合物であり得るが、これらに限定されない。
用語「脂質様物質」、「脂質様化合物」または「脂質様分子」は、構造的におよび／または機能的に脂質に関連するが、厳密な意味では脂質とみなされ得ない物質に関する。例えば、本用語は、水性環境で小胞、多層状／単層リポソームまたは膜で存在するため、両親媒性層を形成できる化合物を含み、界面活性剤または親水性および疎水性両方の部分を有する合成化合物を含む。一般的に言って、本用語は、脂質と類似していてもいなくてもよい、異なる構造組織化された親水性および疎水性部分を含む、分子をいう。ここで使用する用語「脂質」は、ここで特に断らない限りまたは文脈に明らかに反しない限り、脂質および脂質様物質両方を包含すると解釈される。
両親媒性層に含まれ得る両親媒性化合物の具体例は、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質を含むが、これらに限定されない。
ある実施態様において、両親媒性化合物は脂質である。用語「脂質」は、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒に可溶性であることにより特徴づけられる、一群の有機化合物をいう。一般に、脂質は脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、ポリケチド(ケトアシルサブユニットの縮合由来)、ステロール脂質およびプレノール脂質(イソプレンサブユニットの縮合由来)の８個のカテゴリーに分けられ得る。用語「脂質」は脂肪の同義語として使用されることがあるが、脂肪は、トリグリセリドと称される脂質のサブグループである。脂質はまた脂肪酸およびその誘導体(トリ、ジ、モノグリセリドおよびリン脂質を含む)ならびにステロイド、すなわち、コレステロールまたはその誘導体などのステロール含有代謝物などの分子も包含する。コレステロール誘導体の例は、コレスタノール、コレスタノン、コレステノン、コプロスタノール、コレステリル－２’－ヒドロキシエチルエーテル、コレステリル－４’－ヒドロキシブチルエーテル、トコフェロールおよびその誘導体およびこれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
脂肪酸または脂肪酸残基は、カルボン酸基で終了する炭化水素鎖からなる分子の多様な群である；この配置により分子は極性、親水性末端および水に不溶性である非極性、疎水性末端を有する。炭素鎖、典型的に４～２４炭素長であり、飽和または不飽和であってよく、酸素、ハロゲン、窒素および硫黄を含む官能基に結合し得る。脂肪酸が二重結合を含むならば、分子の配置に相当影響する、ｃｉｓまたはｔｒａｎｓ幾何異性の可能性がある。Ｃｉｓ－二重結合は、脂肪酸鎖を曲げ、鎖の二重結合が多いほどより複雑になる効果である。脂肪酸カテゴリーの他の主要な脂質クラスは、脂肪エステルおよび脂肪アミドである。
グリセロ脂質は一、二および三置換グリセロールからなり、最もよく知られるのは、トリグリセリドと称されるグリセロールの脂肪酸トリエステルである。用語「トリアシルグリセロール」は、「トリグリセリド」と同義で使用されることがある。これらの化合物において、グリセロールの３個のヒドロキシル基が、各々、典型的に異なる脂肪酸によりエステル化される。グリセロ脂質の付加的サブクラスは、グリコシド結合によりグリセロールに結合した１以上の糖残基の存在により特徴づけられるグリコシルグリセロールにより表される。
グリセロリン脂質は、エステル結合により２個の脂肪酸由来「テイル」におよびリン酸エステル結合により１個の「頭」基に結合したグリセロールコアを含む、両親媒性分子(疎水性および親水性両方の領域を含む)である。通常リン脂質と称する(スフィンゴミエリンはリン脂質としても分類されるが)グリセロリン脂質の例は、ホスファチジルコリン(ＰＣ、ＧＰＣｈｏまたはレシチンとしても知られる)、ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥまたはＧＰＥｔｎ)およびホスファチジルセリン(ＰＳまたはＧＰＳｅｒ)である。
スフィンゴ脂質は、共通の構造性質、スフィンゴイド塩基主鎖を共有する化合物の複雑なファミリーである。哺乳動物の主要なスフィンゴイド塩基は一般にスフィンゴシンと称される。セラミド(Ｎ－アシル－スフィンゴイド塩基)は、アミド結合脂肪酸を有するスフィンゴイド塩基誘導体の主要なサブクラスである。脂肪酸は、典型的に１６～２６炭素原子鎖長を有する飽和または単不飽和である。哺乳動物の主要なホスホスフィンゴ脂質はスフィンゴミエリン(セラミドホスホコリン)であるが、昆虫は主にセラミドホスホエタノールアミンを含み、真菌はフィトセラミドホスホイノシトールおよびマンノース含有頭基を有する。スフィンゴ糖脂質は、グリコシド結合によりスフィンゴイド塩基に結合した１以上の糖残基からなる分子の多様なファミリーである。これらの例は、セレブロシドおよびガングリオシドなどの単純および複雑なスフィンゴ糖脂質である。
コレステロールおよびその誘導体またはトコフェロールおよびその誘導体などのステロール脂質は、グリセロリン脂質およびスフィンゴミエリンと共に膜脂質の重要な要素である。
糖脂質は、脂肪酸が糖主鎖に直接結合し、膜二層と互換性である構造を形成する、化合物をいう。糖脂質において、単糖は、グリセロ脂質およびグリセロリン脂質に存在するグリセロール主鎖の代替である。最もなじみのある糖脂質は、グラム陰性細菌のリポ多糖の脂質Ａ要素のアシル化グルコサミン前駆体である。典型的脂質Ａ分子は、７個もの脂肪－アシル鎖で誘導体化されているグルコサミンの二糖である。大腸菌の増殖に必要な最小リポ多糖は、２個の３－デオキシ－Ｄ－マンノ－オクツロソン酸(Ｋｄｏ)残基でグリコシル化されたグルコサミンのヘキサ－アシル化二糖であるＫｄｏ２－脂質Ａである。
ポリケチドは、古典的酵素ならびに脂肪酸シンターゼと械的特性を共有する反復性および多モジュール酵素によるアセチルおよびプロピオニルサブユニットの重合により合成される。動物、植物、細菌、真菌および海洋源からの多数の二次的代謝物および天然産物を含み、大きな構造多様性を有する。多くのポリケチドは、主鎖がしばしばグルコシル化、メチル化、ヒドロキシル化、酸化または他の過程によりさらに修飾されている環状分子である。
本発明によると、脂質および脂質様物質はカチオン性、アニオン性または中性であり得る。中性脂質または脂質様物質は、選択したｐＨで非電荷または中性双性イオン性形態で存在する。
カチオン性またはカチオン的にイオン化可能な脂質および脂質様物質を使用して、ＲＮＡを静電的に結合し得る。カチオン的にイオン化可能な脂質および脂質様物質は、好ましくは酸性ｐＨでのみ正電荷である物質である。このイオン化可能挙動は、生理学的ｐＨでカチオン性のままである粒子と比較して、エンドソーム脱出を助けることにより有効性を増強し、毒性を低減すると考えられる。粒子は非カチオン性脂質または脂質様物質も含み得る。集合的に、アニオン性および中性脂質または脂質様物質は、ここでは、非カチオン性脂質または脂質様物質をいう。イオン化可能／カチオン性脂質または脂質様物質に加えて、コレステロールおよび脂質などの他の疎水性部分の付加によるＲＮＡ粒子の製剤の最適化は、粒子安定性を増強し、ＲＮＡ送達の有効性を有意に増強できる。
核酸粒子の全体的電荷に影響を与えても与えなくてもよい１以上の付加的脂質が取り込まれ得る。ある実施態様において、該１以上の付加的脂質は非カチオン性脂質または脂質様物質である。非カチオン性脂質は、例えば、１以上のアニオン性脂質および／または中性脂質を含み得る。ここで使用する「アニオン性脂質」は、選択ｐＨで負電荷であるあらゆる脂質をいう。ここで使用する「中性脂質」は、選択ｐＨで非電荷または中性双性イオン形態で存在する、いくつかの脂質種の何れかをいう。
ある実施態様において、ここに記載する核酸粒子((特にＲＮＡ ＬＮＰ)、カチオン的にイオン化可能な脂質および１以上の付加的脂質を含む。
理論に拘束されることを願わないが、１以上の付加的脂質の量と比較したカチオン的にイオン化可能な脂質の量は、核酸の電荷、粒子径、安定性、組織選択性および生物活性などの重要な核酸粒子特徴に影響し得る。従って、ある実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質対１以上の付加的脂質のモル濃度比は、約１０：０～約１：９、約４：１～約１：２または約３：１～約１：１である。
ある実施態様において、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)に含まれる１以上の付加的脂質は、次の１以上を含む：中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質およびそれらの組み合わせ。
ある実施態様において、１以上の付加的脂質は、リン脂質である中性脂質を含む。好ましくは、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される。使用できる具体的リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンまたはスフィンゴミエリンを含むが、これらに限定されない。このようなリン脂質は、特にジアシルホスファチジルコリン、例えばジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセロイルファチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)およびホスファチジルエタノールアミン、特にジアシルホスファチジルエタノールアミン、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)、ジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)、１,２－ジ－(９Ｚ－オクタデセノイル)－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＤＯＰＧ)、１,２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－(１’－ｒａｃ－グリセロール)(ＤＰＰＧ)、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン(ＰＯＰＥ)、Ｎ－パルミトイル－Ｄ－エリトロ－スフィンゴシルホスホリルコリン(ＳＭ)および種々の疎水性鎖を有するさらなるホスファチジルエタノールアミン脂質を含む。ある実施態様において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＰＧ、ＤＰＰＧ、ＰＯＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥ、ＤＳＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥおよびＳＭからなる群から選択される。ある実施態様において、中性脂質はＤＳＰＣである。
故に、ある実施態様において、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、カチオン的にイオン化可能な脂質およびＤＳＰＣを含む。
ある実施態様において、中性脂質は、ここに記載する粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)に、５～１５モルパーセント、７～１３モルパーセントまたは９～１１モルパーセントの濃度範囲で存在する。ある実施態様において、中性脂質は、ここに記載する粒子に存在する総脂質(特にＲＮＡ ＬＮＰ)の約９.５、１０または１０.５モルパーセントの濃度で存在する。
ある実施態様において、ステロイドコレステロールである。故に、ある実施態様において、核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、カチオン的にイオン化可能な脂質およびコレステロールを含む。
ある実施態様において、ステロイドは、粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)に、３０～５０モルパーセント、３５～４５モルパーセントまたは３８～４３モルパーセントの濃度範囲で存在する。ある実施態様において、ステロイドは、ここに記載する粒子に存在する総脂質(特にＲＮＡ ＬＮＰ)の約４０モルパーセント、４１モルパーセント、４２モルパーセント、４３モルパーセント、４４モルパーセント、４５モルパーセントまたは４６モルパーセントの濃度で存在する。
ある好ましい実施態様において、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、好ましくは上記濃度で、ＤＳＰＣおよびコレステロールを含む。
ある実施態様において、中性脂質(特に、１以上のリン脂質)およびステロイド(特に、コレステロール)の合わせた濃度は、ここに記載する核酸粒子(特にｍＲＮＡを含むＬＮＰ)に存在する総資質の約０mol％～約９０mol％、約０mol％～約８０mol％、約０mol％～約７０mol％、約０mol％～約６０mol％または約０mol％～約５０mol％、例えば約２０mol％～約８０mol％、約２５mol％～約７５mol％、約３０mol％～約７０mol％、約３５mol％～約６５mol％または約４０mol％～約６０mol％を構成し得る。
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質またはポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートである。
用語「ペグ化脂質」は、脂質部分およびポリエチレングリコール部分両方を含む分子をいう。ペグ化脂質は当分野で知られる。ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はペグ化脂質である。ある実施態様において、ペグ化脂質は次の構造：
を有するかまたはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体であり、ここで、Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して１０～３０個の炭素原子を含む直線状または分岐したアルキルまたはアルケニル鎖であり、ここで、アルキルまたはアルケニル鎖が場合により１以上のエステル結合で中断されていてよく；そしてｗが３０～６０の範囲の平均値を有する。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して１２～１６個の炭素原子を含む、直線状飽和アルキル鎖である。ある実施態様において、ｗは４０～５５の範囲の平均値を有する。ある実施態様において、平均ｗは約４５である。ある実施態様において、Ｒ１２およびＲ１３は各々独立して約１４個の炭素原子を含む、直線状飽和アルキル鎖であり、ｗは約４５の平均値を有する。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、例えば、次の構造：
を有する２－[(ポリエチレングリコール)－２０００]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド／２－[２－(ω－メトキシ(ポリエチレングリコール２０００)エトキシ]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドである。
ある実施態様において、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、カチオン的にイオン化可能な脂質およびペグ化脂質、例えば、上に規定したペグ化脂質を含む。
ある実施態様において、ペグ化脂質は、ここに記載する粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)に存在する総脂質の１～１０モルパーセント、１～５モルパーセントまたは１～２.５モルパーセントの範囲の濃度で、粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)に存在する。
ある実施態様において、ポリマーコンジュゲート脂質はポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート、すなわち、ポリサルコシン(ポリ(Ｎ－メチルグリシン))を含む脂質または脂質様物質である。ポリサルコシンは、アセチル化(中性末端基)または他の官能化末端基を含み得る。ＲＮＡ－脂質粒子の場合、ポリサルコシンは、ある実施態様において、粒子に含まれる非カチオン性脂質または脂質様物質に、コンジュゲートしている、好ましくは共有結合で結合している。
ある実施態様において、ポリサルコシンの末端基を、正または負電荷または粒子を特定の細胞型、細胞のコレクションまたは組織に向けるターゲティング剤などの、ある性質を付与する１以上の分子部分で官能化し得る。
多様な適当なターゲティング剤は当分野で知られる。ターゲティング剤の非限定的例は、ペプチド、タンパク質、酵素、核酸、脂肪酸、ホルモン、抗体、炭水化物、単、オリゴまたは多糖、ペプチドグリカン、グリコペプチドなどを含む。例えば、標的細胞表面の抗原と結合するいくつかの種々の物質の何れかを用い得る。標的細胞表面抗原に対する抗体は、一般に標的への必要な特異性を示す。抗体に加えて、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)２またはｓｃＦｖフラグメントまたは単一ドメイン抗体(例えばラクダ類ＶＨＨフラグメント)などの適当な免疫反応性フラグメントも用い得る。ターゲティング機構形成に適する多くの抗体フラグメントは当分野で既に利用可能である。同様に、標的細胞表面の何れかの受容体に対するリガンドがターゲティング剤として適切に用いられ得る。これらは、所望の標的細胞の表面に見られる細胞表面受容体、タンパク質または糖タンパク質に特異的に結合する、天然または合成の、あらゆる小分子または生体分子を含む。
ある実施態様において、ポリサルコシンは、２～２００、２～１９０、２～１８０、２～１７０、２～１６０、２～１５０、２～１４０、２～１３０、２～１２０、２～１１０、２～１００、２～９０、２～８０、２～７０、５～２００、５～１９０、５～１８０、５～１７０、５～１６０、５～１５０、５～１４０、５～１３０、５～１２０、５～１１０、５～１００、５～９０、５～８０、５～７０、１０～２００、１０～１９０、１０～１８０、１０～１７０、１０～１６０、１０～１５０、１０～１４０、１０～１３０、１０～１２０、１０～１１０、１０～１００、１０～９０、１０～８０または１０～７０サルコシン単位を含む。
ある実施態様において、ポリサルコシンは、次の一般式(II)：
を含み、ここで、ｘはサルコシン単位数をいう。ポリサルコシンは、結合の一つを介して、粒子形成要素または疎水性要素と結合し得る。ポリサルコシンは、他の結合を介して、Ｈ、親水性基、イオン化可能基またはターゲティング部分などの機能的部分へのリンカーと結合し得る。
ポリサルコシンは、脂質または脂質様物質などの任意の粒子形成要素とコンジュゲート、特に共有結合で結合または接続し得る。ポリサルコシン－脂質コンジュゲートは、ポリサルコシンがカチオン性脂質またはカチオン的にイオン化可能な脂質または付加的脂質などのここに記載する脂質にコンジュゲートした、分子である。あるいは、ポリサルコシンは、カチオン的にイオン化可能な脂質または１以上の付加的脂質と異なる脂質または脂質様物質にコンジュゲートされる。
ある実施態様において、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートは、次の一般式(IIａ)：
を含み、ここで、Ｒ１およびＲ２の一方は疎水性基を含み、他方はＨ、親水性基、イオン化可能基または所望によりターゲティング部分を含む官能基である。ある実施態様において、疎水性基は、好ましくは、１０～５０、１０～４０または１２～２０個の炭素原子を含む、直鎖または分枝鎖アルキル基またはアリール基である。ある実施態様において、疎水性基を含むＲ１またはＲ２は、１以上の直鎖または分枝鎖アルキル基に結合するヘテロ原子、特にＮなどの部分を含む。
ある実施態様において、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートは、次の一般式(IIｂ)：
を含み、ここで、ＲはＨ、親水性基、イオン化可能基または所望によりターゲティング部分を含む官能基である。
ここでの一般式(IIａ)および(IIｂ)における記号「ｘ」はサルコシン単位数をいい、ここに定義された数であり得る。
ある実施態様において、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートがポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである。
典型的に、ポリサルコシン部分は、２～２００、５～２００、５～１９０、５～１８０、５～１７０、５～１６０、５～１５０、５～１４０、５～１３０、５～１２０、５～１１０、５～１００、５～９０、５～８０、１０～２００、１０～１９０、１０～１８０、１０～１７０、１０～１６０、１０～１５０、１０～１４０、１０～１３０、１０～１２０、１０～１１０、１０～１００、１０～９０または１０～８０サルコシン単位を有する。
故に、ある実施態様において、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、カチオン的にイオン化可能な脂質およびポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート、例えば、上に定義するポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含む。
ある場合、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートは、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)に存在する総脂質の約０.２mol％～約５０mol％、約０.２５mol％～約３０mol％、約０.５mol％～約２５mol％、約０.７５mol％～約２５mol％、約１mol％～約２５mol％、約１mol％～約２０mol％、約１mol％～約１５mol％、約１mol％～約１０mol％、約１mol％～約５mol％、約１.５mol％～約２５mol％、約１.５mol％～約２０mol％、約１.５mol％～約１５mol％、約１.５mol％～約１０mol％、約１.５mol％～約５mol％、約２mol％～約２５mol％、約２mol％～約２０mol％、約２mol％～約１５mol％、約２mol％～約１０mol％または約２mol％～約５mol％を構成し得る。
ある実施態様において、１以上の付加的脂質は、好ましくは各々上記濃度で、次の成分の一つを含む：(１)中性脂質；(２)ステロイド；(３)ポリマーコンジュゲート脂質；(４)中性脂質とステロイドの混合物；(５)中性脂質とポリマーコンジュゲート脂質の混合物；(６)ステロイドとポリマーコンジュゲート脂質の混合物；または(７)中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の混合物。ある実施態様において、１以上の付加的脂質は、好ましくは各々上記濃度で、次の成分の一つを含む：(１)リン脂質；(２)コレステロール；(３)ペグ化脂質；(４)リン脂質とコレステロールの混合物；(５)リン脂質とペグ化脂質の混合物；(６)コレステロールとペグ化脂質の混合物；または(７)リン脂質、コレステロールおよびペグ化脂質の混合物。
故に、好ましい実施態様において、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、好ましくは各々上記濃度で、カチオン的にイオン化可能な脂質および次の脂質または脂質混合物の一つを含む：(１)中性脂質；(２)ステロイド；(３)ポリマーコンジュゲート脂質；(４)中性脂質とステロイドの混合物；(５)中性脂質とポリマーコンジュゲート脂質の混合物；(６)ステロイドとポリマーコンジュゲート脂質の混合物；または(７)中性脂質、ステロイドおよびポリマーコンジュゲート脂質の混合物。ある具体的実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は４０～５０モルパーセントの濃度で存在し；中性脂質は５～１５モルパーセントの濃度で存在し；ステロイドは３５～４５molの濃度で存在し；そしてポリマーコンジュゲート脂質は１～１０モルパーセントの濃度で存在し、ここで、ＲＮＡはＬＮＰに封入されているかまたは結合している。
より好ましい実施態様において、ここに記載する核酸粒子(特にＲＮＡ ＬＮＰ)は、カチオン的にイオン化可能な脂質および次の脂質または脂質混合物の一つを含む：(１)リン脂質；(２)コレステロール；(３)ペグ化脂質；(４)リン脂質とコレステロールの混合物；(５)リン脂質とペグ化脂質の混合物；(６)コレステロールとペグ化脂質の混合物；または(７)リン脂質、コレステロールおよびペグ化脂質の混合物、好ましくは各々上記濃度で。ある具体的実施態様において、カチオン的にイオン化可能な脂質は４０～５０モルパーセントの濃度で存在し；リン脂質は５～１５モルパーセントの濃度で存在し；コレステロールは３５～４５molの濃度で存在し；そしてペグ化脂質は１～１０モルパーセントの濃度で存在し、ここで、ＲＮＡはＬＮＰに封入されているかまたは結合している。
Ｎ／Ｐ値は好ましくは少なくとも約４である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は４～２０、４～１２、４～１０、４～８または５～７の範囲である。ある実施態様において、Ｎ／Ｐ値は約６である。
ここに記載するＬＮＰは、ある実施態様において、約３０nm～約２００nmまたは約６０nm～約１２０nmの範囲の平均直径を有し得る。
一般に、ここに記載するＲＮＡ(または「ＲＮＡ ＬＮＰ」)を含むＬＮＰは、ＲＮＡを目的の標的部位(例えば、細胞、組織、臓器など)に送達するのに使用できる、「ＲＮＡ－脂質粒子」である。ＲＮＡ－脂質粒子は、典型的にカチオン的にイオン化可能な脂質(例えば、構造Ｉ－３を有する脂質)および１以上の付加的脂質、例えばリン脂質(例えば、ＤＳＰＣ)、ステロイド(例えば、コレステロールまたはそのアナログ)およびポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ペグ化脂質またはポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲート)などの１以上の付加的脂質と形成される。
何らかの理論に拘束されることを意図しないが、カチオン的にイオン化可能な脂質および１以上の付加的脂質は、コロイド状に安定な粒子を形成するためにＲＮＡと一緒に組み合わされ、ここで、核酸は脂質マトリクスに結合すると考えられる。
ある実施態様において、ＲＮＡ－脂質粒子は１を超えるタイプのＲＮＡ分子を含み、ここで、ＲＮＡ分子のモル質量または分子構造、キャッピング、コード領域または他の特性などの基本的構造要素に関するなどの分子パラメータは互いに類似しても異なってもよい。
ある実施態様において、ＲＮＡ－脂質ＬＮＰ(例えば、ｍＲＮＡ－脂質ＬＮＰ)は、ＲＮＡに加えて、(ｉ)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％、約３０mol％～約５０mol％、約３５mol％～約４５mol％または約４０mol％を構成し得るカチオン的にイオン化可能な脂質、(ii)粒子に存在する総脂質の約０mol％～約９０mol％、約２０mol％～約８０mol％、約２５mol％～約７５mol％、約３０mol％～約７０mol％、約３５mol％～約６５mol％または約４０mol％～約６０mol％を構成し得る中性脂質および／またはステロイド、(例えば、１以上のリン脂質および／またはコレステロール)は、および(iii)ポリマーコンジュゲート脂質(例えば、粒子に存在する総脂質の１mol％～１０mol％、１mol％～５mol％または１mol％～２.５mol％を構成し得るペグ化脂質；または粒子に存在する総脂質の約０.２mol％～約５０mol％、約０.２５mol％～約３０mol％、約０.５mol％～約２５mol％、約０.７５mol％～約２５mol％、約１mol％～約２５mol％、約１mol％～約２０mol％、約１mol％～約１５mol％、約１mol％～約１０mol％、約１mol％～約５mol％、約１.５mol％～約２５mol％、約１.５mol％～約２０mol％、約１.５mol％～約１５mol％、約１.５mol％～約１０mol％、約１.５mol％～約５mol％、約２mol％～約２５mol％、約２mol％～約２０mol％、約２mol％～約１５mol％、約２mol％～約１０mol％または約２mol％～約５mol％を構成し得るポリサルコシン－脂質コンジュゲート)を含む。
ある好ましい実施態様において、中性脂質は、粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％のリン脂質を含む。
ある好ましい実施態様において、ステロイドは、粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％のコレステロールまたはその誘導体を含む。
ある好ましい実施態様において、中性脂質およびステロイドは、(ｉ)粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％のＤＳＰＣなどのリン脂質；および(ii)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％のコレステロールなどのコレステロールまたはその誘導体の混合物を含む。非限定的例として、リン脂質とコレステロールの混合物を含むｍＲＮＡ ＬＮＰは、粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％のＤＳＰＣおよび粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％のコレステロールを含み得る。
ある実施態様において、ＲＮＡ－脂質粒子は、ＲＮＡに加えて、(ｉ)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％、約３０mol％～約５０mol％、約３５mol％～約４５mol％または約４０mol％を構成し得るカチオン的にイオン化可能な脂質(例えば、構造Ｉ－３を有する脂質)、(ii)粒子に存在する総脂質の約５mol％～約５０mol％、約５mol％～約４５mol％、約５mol％～約４０mol％、約５mol％～約３５mol％、約５mol％～約３０mol％、約５mol％～約２５mol％または約５mol％～約２０mol％を構成し得るＤＳＰＣ、(iii)粒子に存在する総脂質の約１０mol％～約８０mol％、約１０mol％～約７０mol％、約１５mol％～約６５mol％、約２０mol％～約６０mol％、約２５mol％～約５５mol％または約３０mol％～約５０mol％を構成し得るコレステロールおよび(iv)粒子に存在する総脂質の１mol％～１０mol％、１mol％～５mol％または１mol％～２.５mol％を構成し得るペグ化脂質；または(iv’)粒子に存在する総脂質の約０.２mol％～約５０mol％、約０.２５mol％～約３０mol％、約０.５mol％～約２５mol％、約０.７５mol％～約２５mol％、約１mol％～約２５mol％、約１mol％～約２０mol％、約１mol％～約１５mol％、約１mol％～約１０mol％、約１mol％～約５mol％、約１.５mol％～約２５mol％、約１.５mol％～約２０mol％、約１.５mol％～約１５mol％、約１.５mol％～約１０mol％、約１.５mol％～約５mol％、約２mol％～約２５mol％、約２mol％～約２０mol％、約２mol％～約１５mol％、約２mol％～約１０mol％または約２mol％～約５mol％を構成し得るポリサルコシン－脂質コンジュゲートを含む。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰは、ある実施態様において、約３０nm～約１０００nm、約３０nm～約８００nm、約３０nm～約７００nm、約３０nm～約６００nm、約３０nm～約５００nm、約３０nm～約４５０nm、約３０nm～約４００nm、約３０nm～約３５０nm、約３０nm～約３００nm、約３０nm～約２５０nm、約３０nm～約２００nm、約３０nm～約１９０nm、約３０nm～約１８０nm、約３０nm～約１７０nm、約３０nm～約１６０nm、約３０nm～約１５０nm、約５０nm～約５００nm、約５０nm～約４５０nm、約５０nm～約４００nm、約５０nm～約３５０nm、約５０nm～約３００nm、約５０nm～約２５０nm、約５０nm～約２００nm、約５０nm～約１９０nm、約５０nm～約１８０nm、約５０nm～約１７０nm、約５０nm～約１６０nmまたは約５０nm～約１５０nmの範囲の平均直径を有する。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰは、約４０nm～約８００nm、約５０nm～約７００nm、約６０nm～約６００nm、約７０nm～約５００nm、約８０nm～約４００nm、約１５０nm～約８００nm、約１５０nm～約７００nm、約１５０nm～約６００nm、約２００nm～約６００nm、約２００nm～約５００nmまたは約２００nm～約４００nmの範囲の平均直径を有する。
例えば、ここに記載する方法で調製した、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ、は、約０.５未満、約０.４未満、約０.３未満、約０.２未満、約０.１未満または約０.０５以下の多分散性指数を示す。例として、ｍＲＮＡ ＬＮＰは、約０.０５～約０.２、例えば約０.０５～約０.１の範囲の多分散性指数を示し得る。
本発明のある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ中のＲＮＡは、約２mg／ｌ～約５ｇ／ｌ、約２mg／ｌ～約２ｇ／ｌ、約５mg／ｌ～約２ｇ／ｌ、約１０mg／ｌ～約１ｇ／ｌ、約５０mg／ｌ～約０.５ｇ／ｌまたは約１００mg／ｌ～約０.５ｇ／ｌの濃度である。特定の実施態様において、ＲＮＡは約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌ、約０.００５mg／mL～約０.０９mg／mL、約０.００５mg／mL～約０.０８mg／mL、約０.００５mg／mL～約０.０７mg／mL、約０.００５mg／mL～約０.０６mg／mLまたは約０.００５mg／mL～約０.０５mg／mLの濃度である。
ＲＮＡ粒子を含む組成物／製剤
ここに記載する組成物／製剤は、ＲＮＡ ＬＮＰ、好ましくは複数のＲＮＡ ＬＮＰを含む。用語「複数のＲＮＡ ＬＮＰ」または「複数のＲＮＡ－脂質粒子」は、一定数の粒子の集団をいう。ある実施態様において、本用語は、１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２または１０２３以上の粒子の集団をいう。
ある実施態様において、ここに記載する組成物／製剤は、４０００／ml未満、好ましくは最大３５００／ml、例えば最大３４００／ml、最大３３００／ml、最大３２００／ml、最大３１００／mlまたは最大３０００／mlの量で少なくとも１０μmサイズの粒子を含む。
複数の粒子は、前記範囲の任意の割合またはその中の任意の範囲を含むことは、当業者には明らかである。
ある実施態様において、ここに記載する組成物は液体または固体であり、固体は凍結形態をいう。
本本発明者らは、驚くべきことにＬＮＰを含む組成物におけるＰＢＳではなく、Ｔｒｉｓ、ビス－Ｔｒｉｓ－メタンまたはＴＥＡ、特にＴｒｉｓに基づく緩衝液の使用が、ＲＮＡの極めて安定な折り畳み形態の形成を阻止することを発見した。
さらに、本出願は、(ｉ)５０mMの濃度の緩衝系および(ii)カチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含むＬＮＰを含む組成物を、凍結－解凍－サイクルに付し、ＲＮＡ完全性が相当喪失したが、驚くべきことに、単に組成物における緩衝物質の濃度を下げるだけで、凍結－解凍－サイクル後ＲＮＡ完全性が改善したＲＮＡ ＬＮＰ組成物を得ることが可能であることを発見した。故に、ここに請求する組成物は、安定性の改善、薬務における通常のテクノロジーに準拠した温度範囲で貯蔵でき、使用準備済製剤を提供する。
さらに、驚くべきことに、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相におけるある多価アニオン(特に無機リン酸アニオン、クエン酸アニオンおよびＥＤＴＡのアニオンおよび所望により無機硫酸アニオン、炭酸アニオン、二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオン)の存在が、組成物を凍結、次いで解凍したとき(すなわち、組成物を少なくとも１個の凍結－解凍－サイクルに付したとき)粒子径を増加させ、ここに記載するとおりＴｒｉｓ、ビス－Ｔｒｉｓ－メタンまたはＴＥＡに基づく緩衝液を含み、水相がこのような二および／または多価アニオンを実質的に含まないＲＮＡ組成物を、粒子径の増加なく凍結および解凍できることを発見した。
故に、本発明によると、ここに記載する組成物の水相は無機リン酸アニオンを実質的に含まず、クエン酸アニオンを実質的に含まずかつＥＤＴＡのアニオンを実質的に含まずおよび好ましくは硫酸アニオンおよび／または炭酸アニオンおよび／または二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。ある実施態様において、ここに記載する組成物の水相は好ましくは無機リン酸アニオン、クエン酸アニオン、ＥＤＴＡのアニオン、無機硫酸アニオン、炭酸アニオン、二塩基性有機酸アニオンおよび多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない。
ここで使用する表現「Ｘを実質的に含まない」は、混合物(例えば、ここに記載する組成物または製剤の水相)に、事実上および現実的に実行可能なような方法で、Ｘが存在しないことを意味する。例えば、混合物がＸを実質的に含まないならば、混合物中のＸの量は、混合物の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であり得る。
故に、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相が無機リン酸アニオンを実質的に含まないならば、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相の無機リン酸アニオンの量が、水相の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であるのが好ましい。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相がクエン酸アニオンを実質的に含まないならば、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相のクエン酸アニオンの量が、水相の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であるのが好ましい。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相がＥＤＴＡのアニオンを実質的に含まないならば、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相のＥＤＴＡのアニオンの量が、水相の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であるのが好ましい。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相が無機硫酸アニオンを実質的に含まないならば、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相の無機硫酸アニオンの量が、水相の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であるのが好ましい。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相が炭酸アニオンを実質的に含まないならば、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相の炭酸アニオンの量が、水相の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であるのが好ましい。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相が二塩基性有機酸アニオンを実質的に含まないならば、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相の二塩基性有機酸アニオンの量が、水相の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であるのが好ましい。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相が多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まないならば、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の水相の多塩基性有機酸アニオンの量が、水相の総重量に基づき、１重量％未満(例えば、０.５重量％未満、０.４重量％未満、０.３重量％未満、０.２重量％未満、０.１重量％未満、０.０９重量％未満、０.０８重量％未満、０.０７重量％未満、０.０６重量％未満、０.０５重量％未満、０.０４重量％未満、０.０３重量％未満、０.０２重量％未満、０.０１重量％未満、０.００５重量％未満、０.００１重量％未満)であるのが好ましい。
ここで使用する表現「無機リン酸アニオン」は、無機リン酸アニオンを含むおよび水性媒体に溶解したとき無機リン酸アニオンを放出するあらゆる化合物を意味する。無機リン酸アニオンを含むおよび水性媒体に溶解したとき無機リン酸アニオンを放出する化合物の例は、リン酸およびリン酸の塩、リン酸のコンジュゲートおよびそのようなコンジュゲートの塩、例えば二リン酸塩、三リン酸などを含む。好ましくは、表現「無機リン酸アニオン」は１以上の有機アルコールを有するリン酸のエステルを含まない。故に、好ましくは、表現「無機リン酸アニオン」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含まない。
ここで使用する表現「クエン酸アニオン」は、クエン酸アニオンを含むおよび水性媒体に溶解したときクエン酸アニオンを放出するあらゆる化合物を意味する。クエン酸アニオンを含むおよび水性媒体に溶解したときクエン酸アニオンを放出する化合物の例は、クエン酸およびクエン酸の塩を含む。
ここで使用する表現「ＥＤＴＡのアニオン」は、ＥＤＴＡのアニオンを含むおよび水性媒体に溶解したときＥＤＴＡのアニオンを放出するあらゆる化合物を意味する。ＥＤＴＡのアニオンを含むおよび水性媒体に溶解したときアニオンを放出する化合物の例は、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)およびＥＤＴＡの塩を含む。
ここで使用する表現「無機硫酸アニオン」は、無機硫酸アニオンを含むおよび水性媒体に溶解したとき無機硫酸アニオンを放出するあらゆる化合物を意味する。無機硫酸アニオンおよびを含むおよび水性媒体に溶解したとき無機硫酸アニオンを放出する化合物の例は、硫酸および硫酸の塩を含む。好ましくは、表現「無機硫酸アニオン」は硫酸の１以上の有機アルコールとのエステルを含まない 。
ここで使用する表現「炭酸アニオン」は、炭酸アニオン(すなわち、ＨＣＯ３ －およびＣＯ３ ２－)を含むおよび水性媒体に溶解したとき炭酸アニオンを放出するあらゆる化合物を意味する。炭酸アニオンを含むおよび水性媒体に溶解したとき炭酸アニオンを放出する化合物の例は二酸化炭素水溶液および炭酸塩を含む。好ましくは、表現「炭酸アニオン」は１以上の有機アルコールとの炭酸エステルを含まない。
ここで使用する表現「二塩基性有機酸アニオン」は、遊離形態(すなわち、プロトン化)、無水物形態または塩形態の２個の酸基を含むあらゆる有機化合物を意味する。これに関して、用語「酸基」は、カルボン酸または硫酸基をいう。好ましくは、表現「二塩基性有機酸」は、１以上の有機アルコールとのカルボン酸または硫酸基のエステルを含まない。二塩基性有機酸の例はシュウ酸、リンゴ酸および酒石酸を含む。
ここで使用する表現「多塩基性有機酸アニオン」は、遊離形態(すなわち、プロトン化)、無水物形態または塩形態の３個以上の酸基を含むあらゆる有機化合物を意味する。これに関して、用語「酸基」は、カルボン酸または硫酸基をいう。好ましくは、表現「多塩基性有機酸」は、１以上の有機アルコールとのカルボン酸または硫酸基のエステルを含まない。多塩基性有機酸の一例はクエン酸を含む。
粒子(例えば、ＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)と関連してここで使用する表現「等しい」は、処理工程(例えば、凍結／解凍サイクル後)の組成物に含まれる粒子のＺ平均値が、処理工程前(例えば、凍結／解凍サイクル前の)粒子のＺ平均値±３０％(好ましくは、±２５％、より好ましくは±２４％、例えば±２０％、±１５％、±１０％、±５％または±１％)であることを意味する。例えば、まだ凍結／解凍サイクルに付されていない組成物に含まれる粒子(例えば、ＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)値が９０nmであり、凍結／解凍サイクルに付された組成物に含まれる粒子(例えば、ＬＮＰ)のサイズ(Ｚ平均)値が１１５nmであるならば、凍結／解凍サイクル後、すなわち、凍結組成物解凍後の粒子のサイズ(Ｚ平均)は凍結／解凍サイクル前、すなわち、組成物凍結前の粒子のサイズ(Ｚ平均)に等しいと考えられる。粒子(例えば、ＬＮＰ)のサイズ分布またはＰＤＩと関連してここで使用する表現「等しい」は、これに応じて解釈されるべきである。例えば、凍結／解凍サイクルに付されていない組成物に含まれる粒子(例えば、ＬＮＰ)のＰＤＩ値が０.３０であり、凍結／解凍サイクルに付された組成物に含まれる粒子(例えば、ＬＮＰ)のＰＤＩ値が０.３８であるならば、凍結／解凍サイクル後、すなわち、凍結組成物解凍後の粒子のＰＤＩは、凍結／解凍サイクル前、すなわち組成物凍結前の粒子のＰＤＩと等しいと考えられる。
ここに記載する組成物はまた製品品質の相当な低下、特に、保存および／または凍結中のＲＮＡ活性の相当な喪失を回避する、例えば、凝集、粒子崩壊、ＲＮＡ分解および／または他のタイプの損傷を減少または阻止するために、凍結保護剤および／または界面活性剤を安定化剤として含み得る。
ある実施態様において、凍結保護剤は炭水化物である。ここで使用する用語「炭水化物」は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖および多糖をいい、かつ包含する。
ある実施態様において、凍結保護剤は単糖である。ここで使用する用語「単糖」は、より単純な炭水化物単位加水分解され得ない、単一炭水化物単位(例えば、単純糖)をいう。単糖凍結保護剤の例は、グルコース、フルクトース、ガラクトース、キシロース、リボースなどを含む。
ある実施態様において、凍結保護剤は二糖である。ここで使用する用語「二糖」は、グリコシド結合、例えば１－４結合または１－６結合を介して一緒に結合された２単糖単位におより形成される化合物または化学部分をいう。二糖は、２個の単糖に加水分解され得る。二糖凍結保護剤の例は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトースなどを含む。
用語「三糖」は、１分子を形成するよう一緒に結合された３個の糖を意味する。三糖の例は、ラフィノースおよびメレジトースを含む。
ある実施態様において、凍結保護剤はオリゴ糖である。ここで使用する用語「オリゴ糖」は、直鎖状、分岐鎖状または環状構造を形成するようにグリコシド結合、例えば１－４結合または１－６結合を介して一緒に結合された、３～約１５、好ましくは３～約１０単糖単位により形成される化合物または化学部分をいう。オリゴ糖凍結保護剤の例は、シクロデキストリン、ラフィノース、メレジトース、マルトトリオース、スタキオース、アカルボースなどを含む。オリゴ糖は酸化または還元され得る。
ある実施態様において、凍結保護剤は環状オリゴ糖である。ここで使用する用語「環状オリゴ糖」は、環状構造を形成するようグリコシド結合、例えば１－４結合または１－６結合を介して一緒に結合された、３～約１５、好ましくは６、７、８、９または１０単糖単位により形成される化合物または化学部分をいう。環状オリゴ糖凍結保護剤の例は、αシクロデキストリン、βシクロデキストリンまたはγシクロデキストリンなどの別々の化合物である環状オリゴ糖を含む。
他の例示的環状オリゴ糖凍結保護剤は、環状オリゴ糖部分を含むポリマーなどの、大型分子構造にシクロデキストリン部分を含む化合物を含む。環状オリゴ糖は酸化または還元、例えば、ジカルボニル形態に酸化され得る。ここで使用する用語「シクロデキストリン部分」は、ポリマーなどの大型分子構造に組み込まれるまたは一部であるシクロデキストリン(例えば、α、βまたはγシクロデキストリン)ラジカルをいう。シクロデキストリン部分を、１以上の他の部分に直接または任意のリンカーを介して結合し得る。シクロデキストリン部分は酸化または還元、例えば、ジカルボニル形態に酸化され得る。
炭水化物凍結保護剤、例えば、環状オリゴ糖凍結保護剤は、誘導体化炭水化物であり得る。例えば、ある実施態様において、凍結保護剤は、誘導体化環状オリゴ糖、例えば、誘導体化シクロデキストリン、例えば、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン、例えば、部分的エーテル化シクロデキストリン(例えば、部分的エーテル化βシクロデキストリン)である。
例示的凍結保護剤は多糖である。ここで使用する用語「多糖」は、直鎖状、分岐鎖または環状構造を形成するよう、グリコシド結合、例えば１－４結合または１－６結合を介して一緒に結合された少なくとも１６単糖単位により形成される化合物または化学部分をいい、主鎖構造の一部として多糖を含むポリマーを含む。主鎖において、多糖は直鎖状でも環状でもよい。多糖凍結保護剤の例は、グリコーゲン、アミラーゼ、セルロース、デキストラン、マルトデキストリンなどを含む。
ある実施態様において、凍結保護剤は糖アルコールである。ここで使用する用語「糖アルコール」は、少なくとも２個の炭素原子および各炭素原子結合した１個のヒドロキシル基を含む有機化合物をいう。典型的に、糖アルコールは糖由来であり(例えば、糖水素化)、水可溶性固体である。ここで使用する用語「糖」は、甘い味の、可溶性炭水化物をいう。糖アルコールの例は、エチレングリコール、グリセロール、エリスリトール、トレイトール、アラビトール、キシリトール、リビトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、フシトール、イジトール、イノシトール、ボレミトール、イソマルト、マルチトール、ラクチトール、マルトトリイトール、マルトテトライトールおよびポリグリシトールを含む。ある実施態様において、糖アルコールは式ＨＯＣＨ２(ＣＨＯＨ)ｎＣＨ２ＯＨを有し、ここで、ｎは０～２２(例えば、０、１、２、３または４)であるかまたはその環状バリアントである(形式上、環状エーテルとなる糖アルコールの脱水に由来する；例えばイソソルビドはソルビトールの環状脱水バリアントである)。
ある実施態様において、凍結保護剤はグリセロールおよび／またはソルビトールである。
ある実施態様において、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物はスクロースを凍結保護剤として含み得る。理論に拘束されることを願わないが、スクロースは組成物の凍結保護を促進するよう機能し、それにより、核酸(特にＲＮＡ)粒子凝集を阻止し、組成物の化学的および物理的安定性を維持する。ある実施態様は、本発明におけるスクロースの代替凍結保護剤を企図する。代替安定化剤は、グルコース、グリセロールおよびソルビトールを含むが、これらに限定されない。
好ましい凍結保護剤がスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され。好ましい実施態様において、凍結保護剤がスクロースおよび／またはグリセロールを含む。より好ましい実施態様において、凍結保護剤はスクロースである。
ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、凍結保護剤を少なくとも１％ｗ／ｖ、例えば少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖまたは少なくとも９％ｗ／ｖの濃度で含む。ある実施態様において、組成物中の凍結保護剤の濃度は、最大２５％ｗ／ｖ、例えば最大２０％ｗ／ｖ、最大１９％ｗ／ｖ、最大１８％ｗ／ｖ、最大１７％ｗ／ｖ、最大１６％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大１４％ｗ／ｖ、最大１３％ｗ／ｖ、最大１２％ｗ／ｖまたは最大１１％ｗ／ｖである。ある実施態様において、組成物中の凍結保護剤の濃度は、１％ｗ／ｖ～２０％ｗ／ｖ、例えば２％ｗ／ｖ～１９％ｗ／ｖ、３％ｗ／ｖ～１８％ｗ／ｖ、４％ｗ／ｖ～１７％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１６％ｗ／ｖ、５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖ、９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖである。ある実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物は５％ｗ／ｖ～１５％ｗ／ｖ、例えば６％ｗ／ｖ～１４％ｗ／ｖ、７％ｗ／ｖ～１３％ｗ／ｖ、８％ｗ／ｖ～１２％ｗ／ｖまたは９％ｗ／ｖ～１１％ｗ／ｖの(総)濃度または約１０％ｗ／ｖの濃度で凍結保護剤(特に、スクロースおよび／またはグリセロール)を含む。
好ましくは、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物は凍結保護剤を、組成物の総重量に基づき、約５０×１０－３osmol／kg～約１osmol／kg(例えば、約１００×１０－３osmol／kg～約９００×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約８００×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約７００×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約６００×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約５００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg)、例えば、約５０×１０－３osmol／kg～約４００×１０－３osmol／kg(例えば、約５０×１０－３osmol／kg～約３９０×１０－３osmol／kg、約６０×１０－３osmol／kg～約３８０×１０－３osmol／kg、約７０×１０－３osmol／kg～約３７０×１０－３osmol／kg、約８０×１０－３osmol／kg～約３６０×１０－３osmol／kg、約９０×１０－３osmol／kg～約３５０×１０－３osmol／kg、約１００×１０－３osmol／kg～約３４０×１０－３osmol／kg、約１２０×１０－３osmol／kg～約３３０×１０－３osmol／kg、約１４０×１０－３osmol／kg～約３２０×１０－３osmol／kg、約１６０×１０－３osmol／kg～約３１０×１０－３osmol／kg、約１８０×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kgまたは約２００×１０－３osmol／kg～約３００×１０－３osmol／kg)の範囲の組成物のオスモル濃度をもたらす濃度で含む。
ある好ましい実施態様において、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物／製剤はスクロースを凍結保護剤としておよびＴｒｉｓを緩衝物質として、好ましくはここに特定する量／濃度で含む。
ある別の好ましい実施態様において、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物／製剤は凍結保護剤を実質的に含まない、例えばあらゆる凍結保護剤を含まない。
本発明のある実施態様は、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物／製剤におけるキレート剤の使用を企図する。キレート剤は、金属イオンと少なくとも２個の配位共有結合を形成でき、それ故に安定な、水可溶性錯体を形成する、化学化合物をいう。理論に拘束されることを願わないが、キレート剤は遊離２価イオンの濃度を減少させ、該イオンは、そうしなければ、本発明のＲＮＡ分解を加速する。適当なキレート剤の例は、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ＥＤＴＡの塩、デスフェリオキサミンアミンＢ、デフェロキサミン、ジチオカルボナトリウム、ペニシラミン、ペンテト酸カルシウム、ペンテト酸ナトリウム塩、サクシマー、トリエンチン、ニトリロ三酢酸、トランスジアミノシクロヘキサン四酢酸(ＤＣＴＡ)、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＤＴＰＡ)およびビス(アミノエチル)グリコールエーテル－Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’－四酢酸を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、キレート剤はＥＤＴＡであるまたはＥＤＴＡの塩である。例示的実施態様において、キレート剤は、ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物である。ある実施態様において、ＥＤＴＡは約０.０５mM～約５mM、約０.１mM～約２.５mMまたは約０.２５mM～約１mMの濃度である。
好ましい別の実施態様において、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物／製剤の水相はキレート剤を含まない。例えば、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物／製剤がキレート剤を含むならば、該キレート剤がＬＮＰにのみ存在するのが好ましい。
医薬組成物
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、治療的または予防的処置のための医薬組成物または医薬としてまたはその調製のために有用である。
ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰを、任意の適当な医薬組成物の形態で投与し得る。
用語「医薬組成物」は、好ましくは、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物と共に治療有効薬剤を含む、組成物に関する。該医薬組成物は、対象への該医薬組成物の投与により、疾患または障害の処置、予防または重症度低減に有用である。本発明において、医薬組成物は、ここに記載するＲＮＡ ＬＮＰを含む。
本発明の医薬組成物は１以上のアジュバントを含み得るまたは１以上のアジュバントと共に投与し得る。用語「アジュバント」は、免疫応答を延長、増強または加速する化合物に関する。アジュバントは、油エマルジョン(例えば、フロイントアジュバント)、鉱物化合物(例えばミョウバン)、細菌産物(例えば百日咳毒素)または免疫刺激性複合体などの異種化合物群を含む。アジュバントの例は、ＬＰＳ、ＧＰ９６、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、増殖因子およびサイトカイン、例えばモノカイン、リンホカイン、インターロイキン、ケモカインを含むが、これらに限定されない。ケモカインはＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＮＦａ、ＩＮＦ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＬＴ－ａであり得る。さらに知られるアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバントまたはＭｏｎｔａｎｉｄｅ(登録商標)ＩＳＡ５１などの油である。本発明で使用するための他の適当なアジュバントは、リポペプチド、例えばＰａｍ３Ｃｙｓならびに親油性成分、例えばサポニン、トレハロース－６,６－ジベヘナート(ＴＤＢ)、モノホスホリル脂質－Ａ(ＭＰＬ)、モノミコロイルグリセロール(MMＧ)またはグルコピラノシル脂質アジュバント(ＧＬＡ)を含む。
本発明の医薬組成物は凍結形態または「使用準備済形態」(すなわち、例えば、解凍、再構成または希釈などのあらゆる処理なく、対象に即時に投与できる形態)であり得る。故に、貯蔵可能形態医薬組成物の投与前に、この貯蔵可能形態を使用準備済または投与可能形態に処理または移行させなければならない。例えば、凍結医薬組成物は解凍されなければならない。使用準備済注射用を、バイアル、アンプルまたはシリンジなどのコンテナに提供でき、ここで、コンテナは１以上の用量を含み得る。
ある実施態様において、医薬組成物は凍結形態であり、約－９０℃以上、例えば約－９０℃～約－１０℃の温度で貯蔵できる。例えば、ここに記載する凍結医薬組成物(例えば、第二、第三または第六の態様の方法により調製した凍結組成物または第五、第八、第九または第十の態様の凍結組成物)を約－９０℃～約－１０℃、例えば約－９０５℃～約－４０℃または約－４０℃～約－２５℃または約－２５℃～約－１０℃の範囲の温度または約－２０℃の温度で貯蔵できる。
凍結形態の医薬組成物のある実施態様において、医薬組成物は、少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月、好ましくは少なくとも４週間貯蔵できる。例えば、凍結医薬組成物は、－２０℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月貯蔵され得る。
凍結形態の医薬組成物のある実施態様において、凍結医薬組成物後のＲＮＡ完全性は、例えば、－２０℃で貯蔵された凍結組成物を解凍後、少なくとも５０％、例えば少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％または少なくとも６０％である。
凍結形態の医薬組成物のある実施態様において、凍結医薬組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩは凍結前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩに等しい。例えば、使用準備済医薬組成物がここに記載する凍結医薬組成物から調製されるならば、使用準備済医薬組成物に含まれるＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩが、凍結前凍結医薬組成物に含まれる(例えば第二の態様の方法の工程(Ｉ)で調製した製剤に含まれる)ＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと等しいことが好ましい。
ある実施態様において、医薬組成物は液体形態であり、約０℃～約２０℃の範囲の温度で貯蔵できる。例えば、ここに記載する液体医薬組成物(例えば、第二、第四または第七の態様の方法により調製した液体組成物または第五、第八、第九または第十の態様の液体組成物)を約１℃～約１５℃、例えば約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃の範囲の温度または約５℃の温度で貯蔵できる。
液体形態の医薬組成物のある実施態様において、医薬組成物は少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月または少なくとも６カ月、好ましくは少なくとも４週間貯蔵できる。例えば、液体医薬組成物は、５℃で少なくとも４週間、好ましくは少なくとも１カ月、より好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３カ月、より好ましくは少なくとも６カ月貯蔵できる。
液体形態の医薬組成物のある実施態様において、最初の組成物のＲＮＡ完全性、すなわち、組成物が貯蔵される前のＲＮＡ完全性と比較して、例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、液体組成物のＲＮＡ完全性は、所望の効果を生ずる、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、例えば、液体組成物のＲＮＡ完全性は、少なくとも５０％、例えば少なくとも５２％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５８％または少なくとも６０％であり得る。
液体形態の医薬組成物のある実施態様において、例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したときの、医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))は、所望の効果を生ずる、例えば、免疫応答を誘導するのに十分である。例えば、０℃以上で、少なくとも１週間貯蔵したとき、例えば、医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ))は、最初の医薬組成物、すなわち、貯蔵前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)に等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmである。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の医薬組成物のＬＮＰのＰＤＩは、０.３未満、好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満である。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後の医薬組成物のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)は、貯蔵前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)(および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩ)と等しい。ある実施態様において、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)は、約５０nm～約５００nm、好ましくは約４０nm～約２００nm、より好ましくは約４０nm～約１２０nmであり、例えば、０℃以上で少なくとも１週間貯蔵後のＬＮＰのＰＤＩは０.３未満(好ましくは０.２未満、より好ましくは０.１未満)である。
本発明の医薬組成物は、一般に「薬学的有効量」でおよび「薬学的に許容される製剤」で適用される。
用語「薬学的に許容される」は、医薬組成物の活性要素の作用を妨害しない、物質の非毒性をいう。
用語「薬学的有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に所望の反応または所望の効果を達成する量をいう。特定の疾患の処置の場合、所望の反応は、好ましくは疾患経過の阻害に関する。これは、疾患進行の減速、特に、疾患の中断または逆転を含む。疾患処置における所望の反応はまた該疾患または該状態の発症遅延または発症予防でもあり得る。ここに記載する粒子または医薬組成物の有効量は、処置する状態、疾患重症度、年齢、生理学的状態、体格および体重を含む患者の個々のパラメータ、処置期間、付随する治療のタイプ(存在するならば)、特定の投与経路および類似の因子に依存する。従って、ここに記載する粒子または医薬組成物の投与される用量は、種々のこのようなパラメータに依存する。初期用量で患者における反応が不十分な場合、高い用量(または異なる、より局在化された投与経路により達成される効率的に高い用量)を使用し得る。
具体的実施態様において、本発明の医薬組成物(例えば、免疫原性組成物、すなわち、免疫応答の誘導のために使用され得る医薬組成物)を、コンテナ、例えば、バイアルに１回用量として製剤化する。ある実施態様において、免疫原性組成物をバイアルに多回用量製剤として製剤化する。ある実施態様において、多回用量製剤は、バイアルあたり少なくとも２回用量を含む。ある実施態様において、多回用量製剤は、例えば、バイアルあたり２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回または１２回用量などバイアルあたり計２～２０回用量含む。ある実施態様において、バイアルの各用量の体積は等しい。ある実施態様において、初回用量は、その後の用量と異なる体積である。
「安定な」多回用量製剤は、好ましくは許容されないレベルの微生物増殖を示さず、活性な生物学的分子成分の崩壊または分解が実質的にないまたはない。ここで使用する「安定な」免疫原性組成物は、対象に投与されたとき、所望の免疫学的応答の誘導が可能なままである製剤を含む。
本発明の医薬組成物は、緩衝液(特に、医薬組成物が調製されるＲＮＡ ＬＮＰ組成物／製剤由来)、防腐剤および所望により他の治療剤を含み得る。ある実施態様において、本発明の医薬組成物、特に使用準備済医薬組成物は、１以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または添加物を含む。
本発明の医薬組成物に使用する適当な防腐剤は、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールを含むが、これらに限定されない。
ここで使用する用語「添加物」は、本発明の医薬組成物に存在し得るが、活性成分ではない物質をいう。添加物の例は、担体、結合剤、希釈剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、安定化剤、乳化剤、緩衝液、風味剤または着色剤を含むが、これらに限定されない。
「薬学的に許容される塩」は、例えば、塩酸、酢酸、乳酸、２－(Ｎ－モルホリノ)エタンスルホン酸(ＭＥＳ)、３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)、２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)または安息香酸などの薬学的に許容される酸を使用して形成され得る、例えば、酸付加塩を含む。さらに、適当な薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウムまたはカリウム塩)；アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウムまたはマグネシウム塩)；アンモニウム(ＮＨ４ ＋)；および適当な有機リガンド(例えば、４級アンモニウムおよびアミンカチオン)と形成される塩を含み得る。薬学的に許容される塩の説明的例は、先行文献に見ることができる；例えば、ＳS. M. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 66, pp. 1-19 (1977)参照。薬学的に許容されない塩を薬学的に許容される塩の調製に使用でき、本発明に含まれる。
用語「希釈剤」は、希釈および／または菲薄化剤をいう。さらに、用語「希釈剤」は、流体、液体または固体懸濁液および／または混合媒体の任意の１以上を含む。適当な希釈剤の例は、エタノールおよび水を含む。
用語「担体」は、活性要素が医薬組成物の投与を促進、増強または可能とするために組み合わされる、天然、合成、有機、無機であり得る要素をいう。ここで使用する担体は、対象への投与に適する適合性固体または液体充填剤、希釈剤または封入物質の１以上であり得る。適当な担体は、無菌水、リンゲル、リンゲル乳酸、無菌塩化ナトリウム溶液、等張食塩水、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレン、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシ－プロピレンコポリマーを含むが、これらに限定されない。
治療使用のための薬学的に許容される担体、添加物または希釈剤は医薬分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985)に記載される。
医薬担体、添加物または希釈剤は、意図される投与経路および標準的薬務に関連して選択され得る。
医薬組成物の投与経路
ある実施態様において、ここに記載する医薬組成物または使用準備済医薬組成物などのここに記載する組成物を、静脈内、動脈内、皮下、皮内、皮膚、節内、筋肉内または腫瘍内に投与し得る。ある実施態様において、医薬組成物は局所投与または全身投与のために製剤化される。全身投与は、消化管を介する吸収が関与する経腸投与または非経腸投与を含む。ここで使用する「非経腸投与」は、静脈内注射など、消化管を介する以外のあらゆる方法での投与をいう。好ましい実施態様において、医薬組成物、特に使用準備済医薬組成物は、全身投与のために製剤化される。他の好ましい実施態様において、全身投与は静脈内投与である。他の好ましい実施態様において、(医薬)組成物、特に使用準備済医薬組成物は筋肉内投与用に製剤化される。
医薬組成物の使用
ここに記載するＲＮＡ粒子を、種々の疾患、特に対象へのペプチドまたはタンパク質の提供が治療または予防効果をもたらす疾患の治療的または予防的処置に使用し得る。例えば、ウイルス由来の抗原またはエピトープの提供は、該ウイルスが原因のウイルス疾患の処置または予防に有用であり得る。腫瘍抗原またはエピトープの提供は、癌細胞が該腫瘍抗原を発現する、癌疾患の処置に有用であり得る。機能的タンパク質または酵素の提供は、タンパク質機能不全を特徴とする遺伝的障害、例えばリソソーム貯蔵疾患(例えばムコ多糖症)または因子欠損の処置に有用であり得る。サイトカインまたはサイトカイン融合体の提供は、腫瘍微小環境の調製に有用であり得る。
用語「疾患」(ここでは「障害」とも称する)は、個体の身体に影響する異常状態をいう。疾患は、しばしば特異的症状および徴候が付随する医学的状態と解釈される。疾患は、感染性疾患などの外部源に端を発する因子により引き起こされ得てまたは自己免疫性疾患など内部機能不全により引き起こされ得る。ヒトにおいて、「疾患」は、しばしばり患個体に疼痛、機能不全、苦痛、社会問題または死亡を引き起こすまたは該個体と接触するものに類似の問題を引き起こす、あらゆる状態をいうために、より広義に使用される。この広い意味で、傷害、能力障害、障害、症候群、感染、単離症状、逸脱した行動ならびに構造および機能の非定型異形を含むことがあるが、他の状況でおよび他の目的のために、これらは区別できるカテゴリーとみなされ得る。疾患は、通常、多くの疾患に罹患し、それと共に生きることは、人生観および人格を変え得るため、身体的にだけでなく、また感情的にも個体に影響する。
本文脈において、用語「処置」、「処置する」または「治療介入」は、疾患または障害などの状態と戦う目的での対象管理および介護をいう。本用語は、症状または合併症軽減、疾患、障害または状態の進行遅延、症状および合併症軽減または緩和および／または疾患、障害または状態治癒または排除ならびに状態予防のための治療的有効化合物の投与など、対象が有するある状態の処置の完全な範囲を含むことを意図し、ここで、予防は、疾患、状態または障害と戦う目的での個体の管理および介護として理解され、症状または合併症予防のための活性化合物の投与を含む。
用語「治療的処置」は、個体の健康状態を改善するおよび／または寿命を延長(増加)するあらゆる処置に関する。該処置は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の進展を停止または減速し、個体における疾患の進展を阻害または減速し、個体における疾患症状の頻度または重症度を減少しおよび／または現在または以前疾患を有した個体における再発を減少する。
用語「予防的処置」または「防止的処置」は、疾患が個体において発症するのを予防することを意図するあらゆる処置に関する。用語「予防的処置」または「防止的処置」はここでは相互交換可能に使用される。
用語「個体」および「対象」はここでは相互交換可能に使用される。疾患または障害(例えば、癌、感染症)に罹患し得るまたは感受性であるが、疾患または障害を有していても有していなくてもよいまたはワクチン接種などの予防的介入を必要とし得るまたはタンパク質補充によるなどの介入を必要とし得る、ヒトまたは他の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類)または鳥類(ニワトリ)、魚類またはあらゆる他の動物種を含むあらゆる他の哺乳動物ではない動物をいう。多くの実施態様において、個体はヒトである。特に断らない限り、用語「個体」および「対象」は特定の年齢を意味せず、故に、成人、高齢者、小児および新生児を含む。本発明の実施態様において、「個体」または「対象」は「患者」である。
用語「患者」は、処置のための個体または対象、特に罹患個体または対象を意味する。
本発明のある実施態様において、目的は、ワクチン接種による感染性疾患に対する保護の提供である。
本発明のある実施態様において、目的は、抗体、二特異的抗体、サイトカイン、サイトカイン融合体タンパク質、酵素などの分泌治療タンパク質の、対象、特にそれを必要とする対象への提供である。
本発明のある実施態様において、目的は、エリスロポエチン、第VII因子、フォン・ヴィレブランド因子、β－ガラクトシダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの産生などのタンパク質補充治療、対象、特にそれを必要とする対象への提供である。
本発明のある実施態様において、目的は、血液中の免疫細胞の調節／再プログラムである。
当業者は、免疫療法およびワクチン接種の原理の一つが、疾患に対する免疫保護的反応が、処置する疾患に関して免疫学的に関連する抗原またはエピトープでの対象の免疫化により産生されるとの事実に基づくことを知っている。従って、ここに記載する医薬組成物は、免疫応答の誘導または増強に適用される。ここに記載する医薬組成物は、故に、抗原またはエピトープが関与する疾患の予防的および／または治療的処置に有用である。
用語「免疫化」または「ワクチン接種」は、例えば、治療または予防理由で、免疫応答の誘導の誘導を目的とした個体への抗原の投与の過程をいう。
ここで参照した文献および研究の引用は、前記の何れかが適切な先行技術であることを認めることは意図されない。これらの文献を包含することに関する全ての記載は、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の包含の精度について何らかの承認を構成するものではない。
記載(次の実施例を含む)は、当業者が、種々の実施態様を製造および使用することを可能とするために提示する。具体的デバイス、技術および適用の記載は例としてのみ提供される。ここに記載する例の種々の修飾が当業者に容易に認識され、ここに規定された一般的原理を、種々の実施態様の精神および範囲から逸脱することなく、他の例および適用に適応し得る。故に、種々の実施態様はここに記載されかつ示される例に限定されることを意図せず、むしろ特許請求の範囲と一致する範囲に従う。
方法
ＲＮＡ ＬＮＰの製造
製造プロトコールを、ここでは、脂質Ｉ－３をカチオン的にイオン化可能な脂質の例として使用して記載する。同じプロトコールを、同様に他のカチオン的にイオン化可能な脂質にも適用できる。従って、カチオン的にイオン化可能な脂質とＲＮＡの比率(Ｎ／Ｐ比)が異なる、例えば、負電荷過剰のものを含む高いまたは低いＮ／Ｐ比の他の製剤も、記載のとおり製造および安定化され得る。さらに、他の脂質比(リン脂質、コレステロール、ポリマーコンジュゲート脂質)、ならびに他のタイプのポリマーコンジュゲート脂質(例えば、ポリサルコシン脂質)が使用され得る。本プロトコールはポリマーコンジュゲート脂質を何ら含まない製品にも適用される。
ＲＮＡ ＬＮＰを、水性－エタノール混合プロトコールで調製した。簡潔には、水性緩衝液条件(例えば、５０mMクエン酸、ｐＨ４.０)のＲＮＡ(例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質を含むアミノ酸配列をコードするＢＮＴ１６２ｂ２)を、それぞれ４７.５：１０：４０.７：１.８のモル比で脂質Ｉ－３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび２－[(ポリエチレングリコール)－２０００]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミドを含むエタノール性脂質ミックスと、３部のＲＮＡおよび１部の脂質ミックスの体積比で混合する。混合を、Ｔ混合要素を使用する標準的ポンプベースの装置を使用して達成する。脂質ナノ粒子生コロイドをさらに２部の緩衝液(例えば、クエン酸緩衝液５０mM、ｐＨ４.０)で希釈する。総流動は４００～２０００mL／分、例えば７２０ml／分である。こうして得た一次ＬＮＰ生成物を、緩衝液交換およびエタノール除去のために、緩衝液(例えば、ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７.４(対照)またはＴｒｉｓ緩衝液１０または５０mM ｐＨ７.４または異なる緩衝液)に対してさらにタンジェンシャルフロー濾過に付す。ダイアフィルトレーション完了後、製剤を濃縮する。その後、緩衝液交換したＲＮＡ ＬＮＰ製剤を、例えば、スクロース添加ＰＢＳ(対照)またはスクロース添加Ｔｒｉｓ緩衝液１０または５０mM ｐＨ７.４で希釈し、ＬＮＰ製剤の最終ＲＮＡ濃度を０.１～０.５mg／mlおよびスクロース含量を１０％ｗ／ｖとする。ＲＮＡ ＬＮＰ製剤のサンプルを、５℃または室温で貯蔵するか、または種々の温度(例えば、－５℃、－２０℃、－７０℃および／または－８０℃)で貯蔵して凍結した。
ＬＮＰサイズおよび多分散性
ＲＮＡ ＬＮＰ製剤／組成物(またはそのサンプル)のＬＮＰの平均粒子径およびサイズ分布を動的光散乱法(ＤＬＳ)で評価する。本方法は、粒子径を決定するために１７３°の後方散乱を使用する粒子径測定器を使用する。結果を粒子のＺ平均サイズおよび多分散指数として報告する。多分散性値は、測定されたＺ平均サイズ周囲の適合させた対数正規分布の幅を述べるために使用され、粒子分粒ソフトウェア内のプロプライエタリ数学計算を使用して作製する。サイズおよび多分散性の結果は、それぞれnmおよび多分散指数値として報告する。
ＲＮＡ完全性
ＲＮＡ完全性をキャピラリー電気泳動により決定する。ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ－１００／エタノール処理ＲＮＡ－ＬＮＰを、キャピラリーに含まれるゲルマトリクスに適用する。ＲＮＡおよびその誘導体、分解物および不純物をサイズに応じて分ける。ゲルマトリクスは、ＣＣＤ検出器で検出される青色ＬＥＤ誘導蛍光による検出を可能とするＲＮＡ要素に特異的に結合する蛍光色素を含む。励起波長は４７０nmである。ＲＮＡの完全性を、主ＲＮＡピークのピーク面積対総検出ピーク面積の比較により決定する。
ＲＮＡ含量および封入
ＲＮＡ含量を、ＬＮＰを界面活性剤ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ－１００で崩壊させ、その後分光蛍光光度計を使用するＲＮＡ結合蛍光色素ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(登録商標)のシグナルに基づく総ＲＮＡ含量を測定することにより決定する。ＲＮＡ封入を、ＴｒｉｔｏｎTM Ｘ－１００の非存在(ＲＮＡ不含)および存在(総ＲＮＡ)下のＬＮＰサンプルのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ(登録商標)シグナルの比較により計算する。ＲＮＡ含量および封入の結果はそれぞれmg／mLおよびパーセンテージとして報告する。
脂質同一性および脂質含量
ＨＰＬＣ－ＣＡＤアッセイは、全４脂質(Ｉ－３、ＤＳＰＣ、コレステロールおよび２－[(ポリエチレングリコール)－２０００]－Ｎ,Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド)を分割する方法を使用して、アリコートの脂質の同一性および濃度を決定する。個々の脂質物体を、標準的参照の保持時間との比較により決定する。各個々の脂質の濃度を、標準的参照から作成した各５点較正曲線に対するサンプル面積応答により決定し、ピーク検出は、荷電エアロゾル検出器(ＣＡＤ)を使用して実施する。脂質同一性および脂質含量の結果は、それぞれ標準的参照と比較した相対的保持時間およびmg／mLとして報告する。
電子顕微鏡法
完全に処理しかつ凍結した(－８０℃)サンプルをＲＴにした。５μlの各サンプルを、金グリッド(ULTRAuFoil 2/1, Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany)に適用し、過剰の液体を紙に自動的に吸い取った。サンプルは、クライオボックス(Carl Zeiss NTS GmbH, Oberkochen, Germany)中、液体エタンで－１８０℃でプランジ凍結した。過剰のエタンを除去し、サンプルをすぐにGatan 626クライオトランスファーホルダー(Gatan Pleasanton, USA)で予め冷却した低温電子顕微鏡Philips CM120(Eindhoven, Netherlands)に移し、１２０kVで走査し、低用量条件で可視化した。画像を２ｋ ＣＭＯカメラ(F216 TVIPS, Gauting, Germany)。４画像を、ノイズ低減のためにフレームあたりで平均した。
インビトロ発現(ＩＶＥ)
ＬＮＰサンプルのタンパク質発現(例えば、スパイクタンパク質発現)を、日々のロバスト性増加のための現在実施されている付加的評価の特徴づけアッセイを使用して、測定する。まず、ＬＮＰサンプルを、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に示すＲＮＡレベル(非飽和濃度)で添加する。タンパク質発現を抗タンパク質モノクローナル抗体(例えば、抗スパイクタンパク質受容体結合ドメイン(ＲＢＤ)ウサギモノクローナル抗体)を使用して、測定する。発現を、結合抗タンパク質抗体(例えば、結合抗ＲＢＤ抗体)に対して陽性シグナルを有する細胞数の定量により測定する。
マウス免疫原性
５群の５匹の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１回(０日目)、１μg用量レベルの製剤化医薬品または緩衝液単独(対照群)で免疫化し、免疫化を、２０μL用量体積で筋肉内(ｉ.ｍ.)に与える。血液を３週間週１回(７日、１４日および２１日目)集め、ＥＬＩＳＡおよびシュードウイルスベースの中和アッセイ(ｐＶＮＴ)による抗体免疫応答を分析する。試験最終日(２８日目)、血液を集め、その後動物を屠殺して、脾臓を摘出し、ＥＬＩＳｐｏｔおよび細胞内サイトカイン染色(ＩＣＳ)による脾臓細胞のＴ細胞応答のさらなる分析をする；図１参照。
実施例１
ＲＮＡ ＬＮＰを、有機相に添加した２０mM Ｔｒｉｓを使用する水性－エタノール混合プロトコールにより調製した。ＬＮＰを５０mM Ｔｒｉｓ：酢酸ｐＨ４、ｐＨ５.５またはｐＨ６.８で調製し、得られた一次ＬＮＰを分けた：一方をＰＢＳ(Ａ)に対する透析に付した；他の部分を、５０mM Ｔｒｉｓ：酢酸ｐＨ７.４(Ｂ)に対する透析に付した。比較のために、有機相はＴｒｉｓを受領せず、ＬＮＰを５０mM Ｎａ－酢酸緩衝液ｐＨ５.５で作製し、物質を５０mM Ｔｒｉｓ：酢酸ｐＨ７.４に対して透析した。全サンプルを、５０時間、室温で貯蔵した。ＲＮＡ完全性を上記のとおりキャピラリー電気泳動を使用して測定した。結果を図２ＡおよびＢに示す。
カチオン的にイオン化可能な脂質、特に脂質Ｉ－３およびＰＢＳを含むＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡの高度に安定な折り畳み形態を採用する(約２１９０秒で主ピークのテイリングとして検出可能)。ＬＮＰをＰＢＳ以外の緩衝液(例えば、Ｔｒｉｓ)、すなわち、ＰＢＳ非存在下で調製したときおよび緩衝液をＰＢＳに交換した透析の間も同様であった；図２Ａ参照。これらサンプル全てで、この高度に安定な折り畳み形態のＲＮＡの量は１８％～２１％であった。
しかしながら、組成物に１価緩衝物質Ｔｒｉｓ(多価ＰＢＳの代わり)を使用することにより(すなわち物、使用準備済組成物として製剤化されるとき、製剤が貯蔵、輸送および投与される調製物)で、高度に安定な折り畳み形態のＲＮＡの形成は阻止される；図２Ｂ参照。
故に、これらの結果から、高度に安定な折り畳み形態のＲＮＡの形成を阻止するために、透析中Ｔｒｉｓを添加するのが十分であると結論づけることができる。対照的に、ＬＮＰ製剤処理の上流部分のみへのＴｒｉｓの添加は、一次ＬＮＰ製剤をＰＢＳに対する透析に付したとき、高度に安定な折り畳み形態のＲＮＡの形成から保護しない。
実施例２
Ｔｒｉｓが高度に安定な折り畳み形態のＲＮＡの形成を阻止する好ましい１価緩衝物質として同定後、特に、凍結－解凍－サイクル中のコロイド安定性に関する組成物要素の最適化に着手した。
(ｉ)１価アニオン(酢酸、グリコール酸または乳酸)、(ii)２価または部分的２価アニオン(酒石酸、リン酸、炭酸)または(iii)双性イオン(ＨＥＰＥＳおよびＭＥＳ)化合物を、緩衝物質としてＴｒｉｓと組み合わせ、ＬＮＰのコロイド安定性を経時的にまたは－２０℃での凍結－解凍－サイクル中決定した。結果を表２に示す。
表２に示すデータから明らかなとおり、１価アニオン酢酸、乳酸およびＭＥＳの存在は、コロイドを崩壊させることなく、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の凍結を容易にする。注目すべきは、コロイド安定性は最大３凍結－解凍－サイクルに加えて、８９日、－２０℃のフォローアップ期間または５℃で同じ期間まで延長する。
しかしながら、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物における部分的または完全２価イオン炭酸、リン酸および酒石酸の存在は、凍結中のコロイド安定性の喪失をもたらした。
纏めると、ＬＮＰは、カチオンとしてＴｒｉｓおよび酢酸、乳酸またはＭＥＳから選択される１価アニオンを含む緩衝液で－２０℃でコロイド安定であるが、二および／または多塩基性有機酸存在下では安定ではないと結論づけられ得る。コロイド安定性は、反復凍結－解凍－サイクルおよび長期保存または両因子の組み合わせを含む。
実施例３
次の３個のＲＮＡ ＬＮＰ組成物を調製した：
－ Ｄ０２８
ＬＮＰを上記のとおり５０mMクエン酸ｐＨ４.０で形成し、処理した。５０mM Ｔｒｉｓ：酢酸ｐＨ７.４をＴＦＦ中導入し、製剤を希釈して、３００mM スクロースをさらに含む同じ緩衝液中０.５mg／mLまたは０.１mg／mLのＲＮＡ濃度とした。
－ Ｄ０２９
Ｄ０２９について、５０mM Ｔｒｉｓ：酢酸ｐＨ６.９の一緩衝液をＬＮＰ形成、ＴＦＦおよび希釈に使用した。３００mM スクロースを上記の通り加えた。
－ Ｄ０３０
ＬＮＰを、上記のとおり５０mM Ｔｒｉｓ：酢酸ｐＨ５.５で形成し、同じ緩衝液を使用して処理した。ＴＦＦおよび希釈をＤ０２８について実施したとおり実施した。
得られたＲＮＡ ＬＮＰ組成物の特徴を表３に要約する。


表３から明らかなとおり、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物は互いに同等である。
ＲＮＡ ＬＮＰ組成物を、低温電子顕微鏡法を使用して、さらに特徴づけした。その結果を図３に示す。図３に見られるとおり、全ＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、３０～１１０nmの球状小胞が主に充填されていると言える共通形態学を共有する。外側二層がしばしば観察される。
全ＲＮＡ ＬＮＰ組成物はまたマウスで試験した時の生物学的活性の点で、参照とおよび互いに同等であった。発現されたＳ１タンパク質の量およびＳ１特異的抗体のＩｇＧ濃度は、図４に示すとおり、同等である。２１日目のＤ０２８の低レベルのＳ１特異的抗体は、１４日目および２８日目力価の観点ならびにＳ１発現に照らして、異常値と考えられる。
本発明の一つの目的が、安定性が改善したＲＮＡ ＬＮＰ組成物の開発であるため、安定性に関連する重要な品質属性を分析した。ＲＮＡ ＬＮＰ組成物Ｄ０２８、Ｄ０２９およびＤ０３０からのサンプルを－７０℃～室温の範囲の温度に維持し、ＩＶＥアッセイにおける物理化学的性質および活性に関して、特徴づけした。その結果を図５に示す。
図５Ａは、全温度レベルでのＲＮＡ ＬＮＰ組成物Ｄ０２８のコロイド安定性を示す。これは、ＬＮＰ構造の物理的安定性および物質の全体的ＲＮＡ含量を含む。ＲＮＡの完全性は、予想通り温度依存的様式で低減するが、１２週間後なお仕様の範囲内である。注目すべきは、室温に１２週間の全期間さらされたときでも、このＲＮＡ ＬＮＰ組成物で高度に安定な折り畳み形態のＲＮＡの形成が本質的にない。
ＲＮＡ ＬＮＰ組成物Ｄ０２９およびＤ０３０は、類似の安定性パターンを特徴とする。貯蔵条件のいずれも、コロイド安定性、物理的完全性または物質の含量に影響しない。ＲＮＡ完全性は１２週間にわたり＋５℃にさらされたとき、使用の範囲内のままである；図５Ｂおよび５Ｃ参照。
要約すると、Ｔｒｉｓおよび酢酸を含む緩衝系を用いるＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、形態学、マウス免疫原性および、リリースおよび安定性中の物理化学的性質は同等である。
実施例４
この実施例は、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物のコロイド安定性およびＲＮＡ完全性に対する(ｉ)緩衝液濃度および(ii)緩衝物質としてのＴｒｉｓに対するカウンターアニオンの効果を分析する。
この目的で、ＲＮＡ ＬＮＰ製剤をＤ０２８に基づき作製し、Ｔｒｉｓ：酢酸１０mMおよび５０mMならびにＴｒｉｓ：ＨＣｌ １０mMおよび５０mMに対して透析し、得られたＲＮＡ ＬＮＰ組成物をコロイドおよびＲＮＡ安定性に関して分析した。具体的に、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物を、最大４９日、液体または凍結形態でインキュベートした。５℃でのデータは１９日しか集めていないが、実施例２に示した結果から予想されるとおり、室温での結果に即した。結果を図６および７に示す。
図６に見ることができるとおり、－２０℃で貯蔵したＲＮＡ ＬＮＰ組成物の粒子サイズは、１０mM強度を有する緩衝液で貯蔵したとき液体サンプルからわずかに離れたが、５０mM緩衝液は完全コロイド安定性を提供した。ＲＮＡを、酢酸または塩化物などの１価アニオンを有するＴｒｉｓ緩衝液で製剤化したとき、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物マトリクスの緩衝液強度に感受性であると結論付けることができる。
図７に見ることができるとおり、１０mMの緩衝液強度を有するＲＮＡ ＬＮＰ組成物は、５０mM緩衝液で製剤化したものと比較してより安定であった。この知見はアニオンタイプ無関係である。凍結物質で同様に種々の分解速度が観察された。
要約すると、ＲＮＡ安定性は酢酸または塩化物などの１価アニオンを有するＴｒｉｓ緩衝液に製剤化したとき、ＲＮＡ ＬＮＰ組成物の緩衝液強度に感受性である。

Claims (92)

  1. 水相に分散された脂質ナノ粒子(ＬＮＰ)を含む組成物であって、ここで、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；水相が緩衝物質および１価アニオンを含む緩衝系を含み、緩衝物質がトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Ｔｒｉｓ)およびそのプロトン化形態、ビス(２－ヒドロキシエチル)アミノ－トリス(ヒドロキシメチル)メタン(ビス－Ｔｒｉｓ－メタン)およびそのプロトン化形態およびトリエタノールアミン(ＴＥＡ)およびそのプロトン化形態ならびに塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、モルホリノエタンスルホン酸(ＭＥＳ)のアニオン、３－(Ｎ－モルホリノ)プロパンスルホン酸(ＭＯＰＳ)のアニオンおよび２－[４－(２－ヒドロキシエチル)ピペラジン－１－イル]エタンスルホン酸(ＨＥＰＥＳ)のアニオンからなる群から選択される１価アニオンからなる群から選択され；組成物における緩衝物質の濃度は最大約２５mMであり；そして水相は無機リン酸アニオンを実質的に含まず、クエン酸アニオンを実質的に含まずかつエチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)のアニオンを実質的に含まない、組成物。
  2. 緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である、請求項１の組成物。
  3. 組成物中の緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mM、好ましくは最大約１５mM、より好ましくは最大約１０mM、例えば約１０mMである、請求項１または２の組成物。
  4. 水相が無機硫酸アニオンおよび／または炭酸アニオンおよび／または二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない、特に無機硫酸アニオン、炭酸アニオン、二塩基性有機酸アニオンおよび多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まない、請求項１～３の何れかの組成物。
  5. １価アニオンが塩化物、酢酸、グリコール酸および乳酸からなる群から選択され、組成物中の１価アニオンの濃度が最大で組成物における緩衝物質の濃度に等しい、好ましくは組成物における緩衝物質の濃度未満、例えば約９mM未満である、請求項１～４の何れかの組成物。
  6. １価アニオンがＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され、組成物中の１価アニオンの濃度が少なくとも組成物における緩衝物質の濃度に等しい、好ましくは組成物における緩衝物質の濃度より高い、請求項１～４の何れかの組成物。
  7. 組成物のｐＨが約６.５～約８.０、好ましくは約６.９～約７.９、例えば約７.０～約７.８である、請求項１～６の何れかの組成物。
  8. 水が組成物の主成分であるおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％未満(ｖ／ｖ)である、請求項１～７の何れかの組成物。
  9. 組成物のオスモル濃度が最大約４００×１０－３osmol／kgである、請求項１～８の何れかの組成物。
  10. 組成物中のＲＮＡの濃度が約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、請求項１～９の何れかの組成物。
  11. 組成物、好ましくは少なくとも約１％ｗ／ｖの濃度で、凍結保護剤を含み、ここで、凍結保護剤が好ましくは炭水化物および糖アルコールからなる群から選択される１以上の化合物を含み、より好ましくは凍結保護剤がスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは凍結保護剤がスクロースおよび／またはグリセロールを含む、請求項１～１０の何れかの組成物。
  12. 組成物が凍結保護剤を実質的に含まない、請求項１～１０の何れかの組成物。
  13. カチオン的にイオン化可能な脂質が、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、請求項１～１２の何れかの組成物。
  14. カチオン的にイオン化可能な脂質が式(Ｉ)：
    またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
    Ｌ１またはＬ２の一方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
    Ｇ１およびＧ２が各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
    Ｇ３がＣ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
    ＲａがＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
    Ｒ１およびＲ２が各々独立してＣ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
    Ｒ３がＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４であり；
    Ｒ４がＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
    Ｒ５がＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；そして
    ｘが０、１または２である、
    請求項１～１３の何れかの組成物。
  15. (α)カチオン的にイオン化可能な脂質が次の構造Ｉ－１～Ｉ－３６から選択される：
    (β)カチオン的にイオン化可能な脂質が次の構造Ａ～Ｆから選択される：
    または
    (γ)カチオン的にイオン化可能な脂質が構造Ｉ－３を有する脂質である、
    請求項１～１３の何れかの組成物。
  16. ＬＮＰが、好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される１以上の付加的脂質を含み、より好ましくはＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドを含む、請求項１～１５の何れかの組成物。
  17. ポリマーコンジュゲート脂質がペグ化脂質を含み、ここで、ペグ化脂質が好ましくは次の構造：
    またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
    Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、１０～３０個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖が場合により１以上のエステル結合で中断されており；そしてｗが３０～６０の範囲の平均値を有する、請求項１６の組成物。
  18. ポリマーコンジュゲート脂質がポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含み、ここで、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートが好ましくはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、請求項１６の組成物。
  19. 中性脂質が、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセレオイルファチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択されるリン脂質である、請求項１６～１８の何れかの組成物。
  20. ステロイドがコレステロールなどのステロールを含む、請求項１６～１９の何れかの組成物。
  21. 水相がキレート剤を含まない、請求項１～２０の何れかの組成物。
  22. ＬＮＰが組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％を含む、請求項１～２１の何れかの組成物。
  23. ＲＮＡがＬＮＰに封入されているかまたは結合している、請求項１～２２の何れかの組成物。
  24. ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、ここで、修飾ヌクレオシドが好ましくはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される、請求項１～２３の何れかの組成物。
  25. ＲＮＡが５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリ－Ａ配列少なくとも１個、好ましくは全てを含む、請求項１～２４の何れかの組成物。
  26. ポリ－Ａ配列が少なくとも１００ Ａヌクレオチドを含み、好ましくはポリ－Ａ配列がＡヌクレオチドの中断された配列である、請求項２５の組成物。
  27. ５’キャップがキャップ１またはキャップ２構造である、請求項２５または２６の組成物。
  28. ＲＮＡが１以上のポリペプチドをコードし、ここで、１以上のポリペプチドが好ましくは象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含む、請求項１～２７の何れかの組成物。
  29. ＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む、請求項２８の組成物。
  30. ＲＮＡが配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするＯＲＦを含む、請求項２８または２９の組成物。
  31. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが配列番号７と少なくとも８０％同一性を有する、請求項２９または３０の組成物。
  32. 組成物が凍結形態である、請求項１～３１の何れかの組成物。
  33. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物が凍結される前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、請求項３２の組成物。
  34. 凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ)が組成物が凍結される前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと等しい、請求項３２または３３の組成物。
  35. 組成物が液体形態である、請求項１～３１の何れかの組成物。
  36. 最終水相に分散されたＬＮＰを含む組成物を調製する方法であって、ここで、ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含み；最終水相が最終緩衝物質および最終１価アニオンを含む最終緩衝系を含み、最終緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態、ビス－Ｔｒｉｓ－メタンおよびそのプロトン化形態およびＴＥＡおよびそのプロトン化形態からなる群から選択され、最終１価アニオンが塩化物、酢酸、グリコール酸、乳酸、ＭＥＳのアニオン、ＭＯＰＳのアニオンおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され；組成物中の最終緩衝物質の濃度が最大約２５mMであり；そして最終水相が無機リン酸アニオンを実質的に含まず、クエン酸アニオンを実質的に含まずかつＥＤＴＡのアニオンを実質的に含まず；
    (Ｉ)ＬＮＰがカチオン的にイオン化可能な脂質およびＲＮＡを含む、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製し；そして
    (II)所望により製剤を約－１０℃以下まで凍結し、
    それにより、組成物を得ることを含み、
    ここで、工程(Ｉ)が：
    (ａ)水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；
    (ｂ)カチオン的にイオン化可能な脂質、および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を調製し；
    (ｃ)(ａ)の下に調製したＲＮＡ溶液と(ｂ)の下に調製したエタノール性溶液を混合し、それにより、第一緩衝系を含む中間水層に分散されたＬＮＰを含む第一中間製剤を調製し；そして
    (ｄ)最終緩衝系を含む最終水性緩衝液溶液を使用して(ｃ)の下に調製した第一中間製剤を濾過し、
    それにより、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製することを含む、方法。
  37. 工程(Ｉ)が希釈および濾過から選択される１以上の工程をさらに含む、請求項３６の方法。
  38. 工程(Ｉ)が
    (ａ’)水性ＲＮＡ溶液を調製し；
    (ｂ’)第一緩衝系を含む第一水性緩衝液溶液を調製し；
    (ｃ’)(ａ’)の下に調製した水性ＲＮＡ溶液と(ｂ’)の下に調製した第一水性緩衝液溶液を混合し、それにより水および第一緩衝系を含むＲＮＡ溶液を調製し；
    (ｄ’)カチオン的にイオン化可能な脂質、および、存在するならば、１以上の付加的脂質を含むエタノール性溶液を調製し；
    (ｅ’)(ｃ’)の下に調製したＲＮＡ溶液と(ｄ’)の下に調製したエタノール性溶液を混合し、それにより第一緩衝系を含む第一水相に分散させたＬＮＰを含む第一中間製剤を調製し；
    (ｆ’)所望により(ｅ’)の下に調製した第一中間製剤を、さらなる緩衝系を含むさらなる水性緩衝液溶液を使用して濾過し、それによりさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を調製し、ここで、さらなる水性緩衝液溶液が第一水性緩衝液溶液と同一でも異なってもよく；
    (ｇ’)所望により工程(ｆ’)を１回または２回以上繰り返し、ここで、１サイクルの工程(ｆ’)後得たさらなる緩衝系を含むさらなる水相に分散されたＬＮＰを含むさらなる中間製剤を、次サイクルの第一中間製剤として使用し、ここで、各サイクルにおいて、さらなる水性緩衝液溶液が第一水性緩衝液溶液と同一でも異なってもよく；
    (ｈ’)濾過工程(ｆ’)がないならば工程(ｅ’)で得た第一中間製剤または工程(ｆ’)が存在し、工程(ｇ’)が存在しないならば工程(ｆ’)で得たさらなる中間製剤または工程(ｆ’)および(ｇ’)が存在するならば、工程(ｇ’)後得たさらなる中間製剤を、最終緩衝系を含み、少なくとも６.０のｐＨを有する最終水性緩衝液溶液を使用して濾過し；そして
    (ｉ’)所望により工程(ｈ’)で得た製剤を希釈溶液で希釈し；
    それにより、最終水相に分散されたＬＮＰを含む製剤を調製することを含む、請求項３６または３７の方法。
  39. 濾過がタンジェンシャルフロー濾過または透析濾過、好ましくはタンジェンシャルフロー濾過である、請求項３６～３８の何れかの方法。
  40. (II)製剤の約－１０℃以下までの凍結を含む、請求項３６～３９、の何れかの方法。
  41. 最終緩衝物質がＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態である、請求項３６～４０の何れかの方法。
  42. 組成物中の最終緩衝物質、特にＴｒｉｓおよびそのプロトン化形態の濃度が最大約２０mM、好ましくは最大約１５mM、より好ましくは最大約１０mM、例えば約１０mMである、請求項３６～４１の何れかの方法。
  43. 最終水相が無機硫酸アニオンおよび／または炭酸アニオンおよび／または二塩基性有機酸アニオンおよび／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まず、請求項３６～４２の何れかの方法。
  44. (ｉ)工程(ａ)で調製したＲＮＡ溶液が１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンをさらに含み、工程(ｄ)が、最終水相が工程(ａ)で調製したＲＮＡ溶液に存在する１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを実質的に含まないものである、最終水層に分散されたＬＮＰを含む製剤をもたらす１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを除去する条件下で実施される；または(ii)第一水性緩衝液溶液および第一水相が１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを含み、工程(ｆ’)～(ｈ’)の少なくとも１個が第一中間製剤および／またはさらなる中間製剤から１以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンを除去する条件下で実施される、請求項３６～４３の何れかの方法。
  45. (ｉ)工程(ａ)で得たＲＮＡ溶液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する；または(ii)第一水性緩衝液溶液が６.０未満、好ましくは最大約５.０、より好ましくは最大約４.５のｐＨを有する、請求項３６～４４の何れかの方法。
  46. １以上の二および／または多塩基性有機酸アニオンがクエン酸アニオンおよび／またはＥＤＴＡのアニオンを含む、請求項４４または４５の方法。
  47. (ｉ)工程(ａ)で使用する第一緩衝系が工程(ｄ)で使用した最終緩衝物質および最終１価アニオンを含み、好ましくは工程(ａ)で使用する第一緩衝系の緩衝系およびｐＨが工程(ｄ)で使用する最終水性緩衝液溶液の緩衝系およびｐＨと同一である；または(ii)第一緩衝系および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全さらなる緩衝系の各々が工程(ｈ’)で使用する最終緩衝物質および最終１価アニオンを含み、好ましくは第一水性緩衝液溶液および工程(ｂ’)、(ｆ’)および(ｇ’)で使用する全てのさらなる水性緩衝液溶液の各々の緩衝系およびｐＨが最終水性緩衝液溶液の緩衝系およびｐＨと同一である、請求項３６～４３の何れかの方法。
  48. 最終１価アニオンが塩化物、酢酸、グリコール酸および乳酸からなる群から選択され、組成物中の最終１価アニオンの濃度が、最大組成物中の最終緩衝物質の濃度と等しい、好ましくは組成物中の最終緩衝物質の濃度未満、例えば約９mM未満である、請求項３６～４７の何れかの方法。
  49. 最終１価アニオンがＭＥＳ、ＭＯＰＳおよびＨＥＰＥＳのアニオンからなる群から選択され、組成物中の最終１価アニオンの濃度が少なくとも組成物中の最終緩衝物質の濃度に等しい、好ましくは組成物中の最終緩衝物質の濃度より高い、請求項３６～４８の何れかの方法。
  50. 組成物のｐＨが約６.５～約８.０、好ましくは約６.９～約７.９、例えば約７.０～約７.８である、請求項３６～４９の何れかの方法。
  51. 水が製剤および／または組成物の主成分であるおよび／または組成物に含まれる水以外の溶媒の総量が約０.５％未満(ｖ／ｖ)である、請求項３６～５０の何れかの方法。
  52. 組成物のオスモル濃度が最大約４００×１０－３osmol／kgである、請求項３６～５１の何れかの方法。
  53. 組成物中のＲＮＡの濃度が約５mg／ｌ～約１５０mg／ｌ、好ましくは約１０mg／ｌ～約１３０mg／ｌ、より好ましくは約３０mg／ｌ～約１２０mg／ｌである、請求項３６～５２の何れかの方法。
  54. (ｉ)工程(Ｉ)がさらに(ｄ)の下に調製した製剤を希釈溶液で希釈することを含むかまたは工程(ｉ’)が存在し、ここで、希釈溶液が凍結保護剤を含む；および／または(ii)工程(Ｉ)で得た製剤および組成物が、好ましくは少なくとも約１％ｗ／ｖの濃度で凍結保護剤を含み、ここで、凍結保護剤が好ましくは炭水化物および糖アルコールから選択される１以上を含み、より好ましくは凍結保護剤がスクロース、グルコース、グリセロール、ソルビトールおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは凍結保護剤がスクロースおよび／またはグリセロールを含む、請求項３６～５３の何れかの方法。
  55. 工程(Ｉ)で得た製剤および組成物が凍結保護剤を実質的に含まない、請求項３６～５３の何れかの方法。
  56. カチオン的にイオン化可能な脂質が、生理学的条件下でプロトン化され得る少なくとも１個の窒素原子を含む頭基を含む、請求項３６～５５の何れかの方法。
  57. カチオン的にイオン化可能な脂質が式(Ｉ)：
    またはその薬学的に許容される塩、互変異性体、プロドラッグもしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
    Ｌ１またはＬ２の一方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が－Ｏ(Ｃ＝Ｏ)－、－(Ｃ＝Ｏ)Ｏ－、－Ｃ(＝Ｏ)－、－Ｏ－、－Ｓ(Ｏ)ｘ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ(＝Ｏ)Ｓ－、ＳＣ(＝Ｏ)－、－ＮＲａＣ(＝Ｏ)－、－Ｃ(＝Ｏ)ＮＲａ－、ＮＲａＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－、－ＯＣ(＝Ｏ)ＮＲａ－または－ＮＲａＣ(＝Ｏ)Ｏ－または直接結合であり；
    Ｇ１およびＧ２が各々独立して非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり；
    Ｇ３がＣ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ２－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり；
    ＲａがＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
    Ｒ１およびＲ２が各々独立してＣ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり；
    Ｒ３がＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ(＝Ｏ)ＯＲ４、－ＯＣ(＝Ｏ)Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ(＝Ｏ)Ｒ４であり；
    Ｒ４がＣ１－Ｃ１２アルキルであり；
    Ｒ５がＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり；そして
    ｘが０、１または２である、
    請求項３６～５６の何れかの方法。
  58. (α)カチオン的にイオン化可能な脂質が次の構造Ｉ－１～Ｉ－３６から選択される：
    (β)カチオン的にイオン化可能な脂質が次の構造Ａ～Ｆから選択される：
    または
    (γ)カチオン的にイオン化可能な脂質が構造Ｉ－３を有する脂質である、
    請求項３６～５６の何れかの方法。
  59. 工程(ｂ)または(ｄ’)で調製したエタノール性溶液が１以上の付加的脂質をさらに含み、ＬＮＰが１以上の付加的脂質をさらに含み、ここで、１以上の付加的脂質が好ましくはポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質、ステロイドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択され、より好ましくは１以上の付加的脂質がポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドを含む、請求項３６～５８の何れかの方法。
  60. ポリマーコンジュゲート脂質がペグ化脂質を含み、ここで、ペグ化脂質が好ましくは次の構造：
    またはその薬学的に許容される塩、互変異性体もしくは立体異性体の構造を有し、ここで：
    Ｒ１２およびＲ１３が、独立して、１０～３０個の炭素原子を含む、直鎖または分岐鎖、飽和または不飽和アルキル鎖であり、ここで、アルキル鎖が場合により１以上のエステル結合で中断されており；そしてｗが３０～６０の範囲の平均値を有する、請求項５９の方法。
  61. ポリマーコンジュゲート脂質がポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートを含み、ここで、ポリサルコシン－脂質コンジュゲートまたはポリサルコシンと脂質様物質のコンジュゲートが好ましくはポリサルコシン－ジアシルグリセロールコンジュゲート、ポリサルコシン－ジアルキルオキシプロピルコンジュゲート、ポリサルコシン－リン脂質コンジュゲート、ポリサルコシン－セラミドコンジュゲートおよびこれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである、請求項５９の方法。
  62. 中性脂質が、好ましくはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンからなる群から選択される、より好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルコリン(ＤＯＰＣ)、ジミリストイルホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)、ジペンタデカノイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)、ジアラキドイルホスファチジルコリン(ＤＡＰＣ)、ジベヘノイルホスファチジルコリン(ＤＢＰＣ)、ジトリコサノイルホスファチジルコリン(ＤＴＰＣ)、ジリグノセレオイルファチジルコリン(ＤＬＰＣ)、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン(ＰＯＰＣ)、１,２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(１８：０ Ｄｉｅｔｈｅｒ ＰＣ)、１－オレオイル－２－コレステリルヘミスクシノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(ＯＣｈｅｍｓＰＣ)、１－ヘキサデシル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン(Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)、ジラウロイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＬＰＥ)およびジフィタノイル－ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰｙＰＥ)からなる群から選択されるリン脂質である、請求項５９～６１の何れかの方法。
  63. ステロイドがコレステロールなどのステロールを含む、請求項５９～６２の何れかの方法。
  64. カチオン的にイオン化可能な脂質、ポリマーコンジュゲート脂質、中性脂質およびステロイドがエタノール性溶液に２０％～６０％のカチオン的にイオン化可能な脂質、０.５％～１５％のポリマーコンジュゲート脂質、５％～２５％の中性脂質および２５％～５５％のステロイドのモル比、好ましくは４５％～５５％のカチオン的にイオン化可能な脂質、１.０％～５％のポリマーコンジュゲート脂質、８％～１２％の中性脂質および３５％～４５％のステロイドのモル比で存在する、請求項３６～６３の何れかの方法。
  65. 最終水相がキレート剤を含まない、請求項３６～６４の何れかの方法。
  66. ＬＮＰが組成物に含まれるＲＮＡの少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％を含む、請求項３６～６５の何れかの方法。
  67. ＲＮＡがＬＮＰに封入されているかまたは結合している、請求項３６～６６の何れかの方法。
  68. ＲＮＡがウリジンの代わりに修飾ヌクレオシドを含み、ここで、修飾ヌクレオシドが好ましくはシュードウリジン(ψ)、Ｎ１－メチル－シュードウリジン(ｍ１ψ)および５－メチル－ウリジン(ｍ５Ｕ)から選択される、請求項３６～６７の何れかの方法。
  69. ＲＮＡが５’キャップ；５’ ＵＴＲ；３’ ＵＴＲ；およびポリ－Ａ配列少なくとも１個、好ましくは全てを含む、請求項３６～６８の何れかの方法。
  70. ポリ－Ａ配列が少なくとも１００ Ａヌクレオチドを含み、好ましくはポリ－Ａ配列がＡヌクレオチドの中断された配列である、請求項６９の方法。
  71. ５’キャップがキャップ１またはキャップ２構造である、請求項６９または７０の方法。
  72. ＲＮＡが１以上のポリペプチドをコードし、ここで、１以上のポリペプチドが好ましくは象における抗原に対する免疫応答を誘導するためのエピトープを含む、請求項３６～７１の何れかの方法。
  73. ＲＮＡがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質、その免疫原性バリアントまたはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｓタンパク質もしくはその免疫原性バリアントの免疫原性フラグメントを含むアミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を含む、請求項７２の方法。
  74. ＲＮＡが配列番号１の９８６位および９８７位にプロリン残基置換を有する完全長ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントをコードするＯＲＦを含む、請求項７２または７３の方法。
  75. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ Ｓタンパク質バリアントが配列番号７と少なくとも８０％同一性を有する、請求項７３または７４の方法。
  76. 工程(II)を含まない、請求項３６～３９および４１～７５の何れかの方法。
  77. 請求項３６～７５の何れかの方法により組成物を調製し、組成物を約－９０℃～約－１０℃、例えば約－９０℃～約－４０℃または約－２５℃～約－１０℃の範囲お温度で貯蔵することを含む、組成物を貯蔵する方法。
  78. 組成物の貯蔵が少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも２４カ月または少なくとも３６カ月である、請求項７７の方法。
  79. 請求項３６～７８の何れかの方法で組成物を調製し、組成物を約０℃～約２０℃、例えば約１℃～約１５℃、約２℃～約１０℃または約２℃～約８℃の範囲の温度または約５℃の温度で貯蔵することを含む、組成物を貯蔵する方法。
  80. 組成物の貯蔵が少なくとも１週間、例えば少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも３カ月または少なくとも６カ月である、請求項７９の方法。
  81. 請求項３６～８０の何れかの方法により調製可能な組成物。
  82. 凍結形態である、請求項８１の組成物。
  83. 凍結組成物解凍後のＲＮＡ完全性が組成物が凍結される前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、請求項８２の組成物。
  84. 凍結組成物解凍後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ)が組成物が凍結される前のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／またはＰＤＩと等しい、請求項８２または８３の組成物。
  85. 液体形態である、請求項８１の組成物。
  86. 少なくとも１週間組成物を貯蔵後のＲＮＡ完全性が貯蔵前のＲＮＡ完全性と比較して少なくとも５０％である、請求項８５の組成物。
  87. 組成物を少なくとも１週間貯蔵後のＬＮＰのサイズ(Ｚ平均)および／またはサイズ分布および／または多分散指数(ＰＤＩ)が貯蔵前のＬＮＰのと等しい、請求項８５または８６の組成物。
  88. 請求項３６～７５、７７および７８の何れかの方法により凍結組成物を準備し、凍結組成物を解凍し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を調製する方法。
  89. 請求項３６～３９、４１～７６、７９および８０の何れかの方法により液体組成物を準備し、それにより使用準備済医薬組成物を得る工程を含む、使用準備済医薬組成物を調製する方法。
  90. 請求項８８または８９の方法により調製可能な使用準備済医薬組成物。
  91. 治療に使用するための請求項１～３５、８１～８７および９０の何れかの組成物。
  92. 対象における免疫応答の誘導に使用するための請求項１～３５、８１～８７および９０の何れかの組成物。
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