PL178789B1 - Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów - Google Patents
Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanówInfo
- Publication number
- PL178789B1 PL178789B1 PL93309606A PL30960693A PL178789B1 PL 178789 B1 PL178789 B1 PL 178789B1 PL 93309606 A PL93309606 A PL 93309606A PL 30960693 A PL30960693 A PL 30960693A PL 178789 B1 PL178789 B1 PL 178789B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- plant
- gene
- sequence
- fructosyltransferase
- plants
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title 1
- 229920002670 Fructan Polymers 0.000 claims abstract description 162
- 108010042889 Inulosucrase Proteins 0.000 claims abstract description 75
- ZFTFOHBYVDOAMH-XNOIKFDKSA-N (2r,3s,4s,5r)-5-[[(2r,3s,4s,5r)-5-[[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-2-(hydroxymethyl)oxolane-2,3,4-triol Chemical class O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@](CO)(OC[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@](O)(CO)O2)O)O1 ZFTFOHBYVDOAMH-XNOIKFDKSA-N 0.000 claims abstract description 71
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 50
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 13
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims abstract description 12
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 234
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 32
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 claims description 26
- 101150108309 ftf gene Proteins 0.000 claims description 9
- 102000005572 Cathepsin A Human genes 0.000 claims description 8
- 108010059081 Cathepsin A Proteins 0.000 claims description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims description 6
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 claims description 5
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 claims description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 2
- 101710096342 Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 claims description 2
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 claims description 2
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 claims description 2
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100084449 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) PRP4 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 60
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 38
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 38
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 38
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 28
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 27
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 20
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 16
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 15
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 15
- 108010036940 Levansucrase Proteins 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 11
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 9
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 9
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 9
- BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N fructose group Chemical group OCC(=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO BJHIKXHVCXFQLS-UYFOZJQFSA-N 0.000 description 9
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 8
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 6
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 6
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 6
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 239000001707 (E,7R,11R)-3,7,11,15-tetramethylhexadec-2-en-1-ol Substances 0.000 description 5
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 5
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- BLUHKGOSFDHHGX-UHFFFAOYSA-N Phytol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C=CO BLUHKGOSFDHHGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HNZBNQYXWOLKBA-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofarnesol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)=CCO HNZBNQYXWOLKBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BOTWFXYSPFMFNR-OALUTQOASA-N all-rac-phytol Natural products CC(C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)=CCO BOTWFXYSPFMFNR-OALUTQOASA-N 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- BOTWFXYSPFMFNR-PYDDKJGSSA-N phytol Chemical compound CC(C)CCC[C@@H](C)CCC[C@@H](C)CCC\C(C)=C\CO BOTWFXYSPFMFNR-PYDDKJGSSA-N 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001490312 Lithops pseudotruncatella Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 3
- 101100309436 Streptococcus mutans serotype c (strain ATCC 700610 / UA159) ftf gene Proteins 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 101150101900 uidA gene Proteins 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 2-(4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid;n-methylmethanamine Chemical compound CNC.CC1=CC(Cl)=CC=C1OCC(O)=O PKAUICCNAWQPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 2
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 2
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 2
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- 240000008892 Helianthus tuberosus Species 0.000 description 2
- 235000003230 Helianthus tuberosus Nutrition 0.000 description 2
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 2
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 2
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 2
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 2
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008645 cold stress Effects 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 2
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- VAWYEUIPHLMNNF-OESPXIITSA-N 1-kestose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 VAWYEUIPHLMNNF-OESPXIITSA-N 0.000 description 1
- GIUOHBJZYJAZNP-DVZCMHTBSA-N 1-kestose Natural products OC[C@@H]1O[C@](CO)(OC[C@]2(O[C@H]3O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]3O)O[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]2O)[C@@H](O)[C@@H]1O GIUOHBJZYJAZNP-DVZCMHTBSA-N 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000208838 Asteraceae Species 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 101100520072 Caenorhabditis elegans pik-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005903 Dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 244000281702 Dioscorea villosa Species 0.000 description 1
- 235000000504 Dioscorea villosa Nutrition 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000234642 Festuca Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000234280 Liliaceae Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241000209082 Lolium Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 235000004456 Manihot esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 241000219833 Phaseolus Species 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000209048 Poa Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 101710184309 Probable sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000209051 Saccharum Species 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 101500015502 Solanum lycopersicum Processed threonine dehydratase 2 Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101001095983 Staphylococcus aureus Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 102400000472 Sucrase Human genes 0.000 description 1
- 101710112652 Sucrose-6-phosphate hydrolase Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000282485 Vulpes vulpes Species 0.000 description 1
- 241000209149 Zea Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 235000004879 dioscorea Nutrition 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000021433 fructose syrup Nutrition 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- VAWYEUIPHLMNNF-UHFFFAOYSA-N kestotriose Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OCC1(OC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)C(O)C(O)C(CO)O1 VAWYEUIPHLMNNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008832 photodamage Effects 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 description 1
- -1 various sucrases Chemical class 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
- A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
- A23L29/244—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin from corms, tubers or roots, e.g. glucomannan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
- C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Physiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Paper (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Packaging Of Special Articles (AREA)
Abstract
wanych, znamienny tym, ze obejmuje etapy: a) przygotowania konstruktu DNA zawierajacego jeden lub wiecej genów fruktozylotransferazy pochodzacych z rosli- ny lub mikroorganizmu lub ich zmodyfikowanych wersji, zwiazanych operacyjnie z sekwencja promotorowa aktywna w ro- slinach oraz sekwencja terminatorowa aktywna w roslinach, pod warunkiem, ze gdy gen fruktozylotransferazy stanowi gen sacB z Bacillus subtilis, nietranslowany region 5’ jest zmodyfikowany przez usuniecie kodonu ATG bedacego poza ramka odczytu, a poprzedzajacego poczatkowy kodon ATG; b) transformowania komórki roslinnej konstruktem; i c) regeneracji rosliny transgenicznej z transformowanej komórki roslinnej. 10. Konstrukt DNA do tworzenia roslin transgenicznych, obejmujacy jeden lub wiecej genów fruktozylotransferazy po- chodzacych z rosliny lub mikroorganizmu, lub ich zmodyfikowanych wersji, zwiazanych operacyjnie z roslinna sekwencja promotorowaoraz roslinna sekwencja terminatorowa, pod warunkiem, ze gdy gen fructozylotransferazy stanowi gen sacB z Bacillus subtilis, nietranslowany region 5' jest zmodyfikowany przez usuniecie kodonu ATG bedacego poza ramka odczytu, a poprzedzajacego poczatkowy kodon ATG; 12. Komórka rosliny transgenicznej zawierajaca konstrukt DNA obejmujacy jeden lub wiecej genów fruktozylotrans- ferazy pochodzacych z rosliny, polaczony operacyjnie, z roslinna sekwencjapromotorowa oraz roslinna sekwencja termina- torowa pod warunkiem, ze gdy gen fructozylotransferazy stanowi gen sacB z Bacillus stibtilis, nietranslowany region 5' jest zmodyfikowany przez usuniecie kodonu ATG bedacego pozaramkaodczytu, a poprzedzajacego poczatkowy kodon ATG; 14. Sposób otrzymywania fruktanów przez ekstrakcje z surowca roslinnego, znamienny tym, ze obejmuje etapy: a) przygotowania konstruktu DNA zawierajacego jeden lub wiecej genów fruktozylotransferazy pochodzacych z rosli- ny lub mikroorganizmu lub ich zmodyfikowanych wersji, zwiazanych operacyjnie z sekwencjapromotorowa aktywna w ro- slinach oraz sekwencjaterminatorowa aktywna w roslinach; pod warunkiem, ze gdy gen fructozy lotransferezy stanowi gen sacB z Bacillus subtilis, nietranslowany region 5' jest zmodyfikowany przez usuniecie kodonu ATG bedacego poza ramka odczytu, a poprzedzajacego poczatkowy kodon ATG; b) transformowania komórki roslinnej konstruktem; i c) regeneracji rosliny transgenicznej z transformowanej komórki roslinnej, d) ekstrakcji fruktanów z otrzymanej rosliny transgenicznej lub z jej tkanki. PL PL PL PL PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania roślin transgenicznych przejawiających zmieniony wzorzec fruktanu, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów.
Rośliny wytwarzająwiele węglowodanów użytecznych do zastosowań konsumpcyjnych i nie konsumpcyjnych. Ważnymi przykładami tych węglowodanów są skrobia, celuloza i sacharoza. Związki te są używane przez człowieka w formie natywnej jak i modyfikowanej dia celów spożywczych i przemysłowych. Gatunki uprawne produkujące te węglowodany uzyskane zostały tradycyjnymi metodami hodowli. Obok wyżej wymienionych dobrze znanych węglowodanów w roślinach może być obecnych wiele innych węglowodanów roślinnych o własnościach użytecznych dla człowieka.
W zależności od ich funkcji w roślinach, węglowodany roślinne mogą być podzielone na dwie grupy. Pierwsza grupa obejmuje węglowodany strukturalne, które zwykle stanowią część macierzy zewnątrzkomórkowej. Najbardziej znanym członkiem tej grupy jest celuloza. Drugą grupę stanowią niestrukturalne węglowodany zapasowe, które służą jako długoterminowe lub krótkoterminowe (przejściowe) zapasy węglowodanów. Przykładami tych węglowodanów są skrobia, sacharoza i fruktany.
Fruktan jest polimerem składającym się w większości z powtarzających się reszt fruktozy. Fruktany są w większości obecne w gatunkach roślin nie zaadaptowanych do praktyk uprawnych. Fruktany występują w jednoliściennych (zwłaszcza w Poaceae, Liliaceae) i w dwuliściennych (zwłaszcza Compositae) (Polock i Cairns, 1991, Ann, Rev, Plant Physioł. Plant Mol. Biol. 42, 77-101; Hendry, 1987, New Phytol. 106,210-216).
Obok ich roli jako roślinny węglowodan zapasowy proponuje się inne funkcje dla fruktanów. Obejmują one, przykładowo, tolerancję na suchy i chłodny klimat (wysychanie zależne od chłodu) (Pontis, 1989, J. Plant Physiol. 134, 148-150; Gonzales i in., 1990, New Phytol. 115, 319-323).
Jednakże, fruktany produkowane przez rośliny zwykle posiadają ograniczoną użyteczność. Z tych powodów fruktany nie znalazły większych zastosowań w produktach spożywczych i niespożywczych mimo uznanego wielkiego potencjału komercjalnego (Fuchs, 1991, Biochem. Soc. Transact. 19, 555-560, A. Fuchs, ed. Inulin and Inulin-containing Crops, Elsevier, 1993), zwłaszcza w porównaniu z innymi węglowodanami.
Jednym z głównych problemów ograniczających użyteczność fruktanów roślinnych jest ograniczony wybór gatunków roślin akumulujących fruktany w znacznych ilościach. W wielu ważnych roślinach uprawnych jak burak cukrowy i ziemniak, fruktany nie występująbądź obecne są w bardzo małych ilościach. Rośliny gromadzące fruktany w pewnym nadmiarze posiadają często niepożądane własności agronomiczne. Przykładem takich roślin jest Helianthus tuberosus.
Innym problemem jest ograniczona użyteczność produkowanych fruktanów. Użyteczność jestprzede wszystkim, określona długościąłańcuchów fruktanowych, które u roślin rzadko przekraczają tzw. „stopień polimeryzacji” (DP) monosacharydów rzędu 100. Zwykle spotyka się znacznie mniejsze fruktany oraz często DP tych fruktanów zmniejsza się dramatycznie przed zbiorem lub po zbiorze i/lub składowaniu. Niskie DP ograniczają użyteczność fruktanów w następnych procesach obróbki i mogą wpływać na zmniejszenie uzysku.
Stwierdzono, że jest możliwe transformowanie pewnych roślin w celu zapewnienia ekspres] i fruktanów w odpowiednich roślinach gospodarzach.
Wynalazek więc, dostarcza sposobu, uzyskania roślin transgenicznych przejawiających zmieniony wzorzec fruktanu w porównaniu z roślinami nietransformowanymi, obejmującego etapy:
a) przygotowania konstruktu DNA zawierającego jeden lub więcej genów fruktozylotransferazy, lub ich zmodyfikowanych wersji, połączonych operacyjnie z sekwencją promotorową aktywną w roślinach i sekwencją terminatorową aktywną w roślinach;
b) transformowania komórki roślinnej konstruktem; i
c) regeneracji rośliny transgenicznej z transformowanej komórki roślinnej.
W zakres wynalazku wchodzi też sposób otrzymywania fruktantów, które obejmuje etapy (a), (b) i (c), jak opisane powyżej oraz etap (d) ekstrakcji fruktantów z otrzymanej rośliny transgenicznej lub z jej tkanek.
Wynalazek obejmuje też konstrukt DNA, który służy do wytwarzania roślin transgenicznych i obejmuje jeden lub więcej genów fruktozylotransferazy pochodzących z rośliny lub mikroorganizmu, łub ich zmodyfikowanych wersji, związanych operacyjnie z roślinną sekwencją promotorową oraz roślinną sekwencją terminatorową.
Korzystnie w konstrukcie takim nietranslowany region 5' zmodyfikowany został tak, że każda sekwencja DNA wpływająca negatywnie na ekspresję fruktozylotransferazy jestusunięta.
Korzystnie konstrukt DNA, również ten ze zmodyfikowanym nietranslowanym regionem 5', jak powyżej wskazano, zawiera również sekwencję kierującą, powyżej genu fruktozylotransferazy.
W zakres wynalazku wchodzi też komórka rośliny transgenicznej zawierająca konstrukt DNA obejmujący jeden lub więcej genów fruktozylotransferazy pochodzących z rośliny lub mikroorganizmu, lub ich zmodyfikowanych wersji, związanych operacyjnie z roślinną sekwencją promotorową oraz roślinną sekwencją terminatorową.
Korzystnie komórka rośliny transgenicznej, zawiera konstrukt DNA, którego nietranslowany region 5' zmodyfikowany został tak, że każda sekwencja DNA wpływająca negatywnie na ekspresję fruktozylotransferazy jest usunięta.
Korzystnie komórka zawiera konstrukt DNA, określony jak wyżej, który zawiera również sekwencję kierującą, powyżej genu fruktozylotransferazy.
Geny fruktozylotransferazy są genami kodującymi enzymy katalizujące produkcję wiązania fruktoza-fruktoza. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO/12386 zaproponowano produkcję roślin transgenicznych zawierających obcy gen kodujący enzym zdolny polimeryzować węglowodany, jak np. różne sacharazy, w celu modyfikacji rozpuszczalnych składników stałych komórki roślinnej. WO89/12386 ujawnia, przede wszystkim, zastosowanie sacharazy dekstranowej. Enzym ten używa sacharozy jako źródła do polimeryzacji jednostek glukozy. W niniejszym wynalazku ma miejsce polimeryzacja jednostek fruktozy.
Stwierdzono, że przez obecność bakteryjnego 5' nietranslowanego regionu w genie fruktozylotransferazy SacB, w którym jeden z kodonów ATG spoza ramki odczytu, poprzedza start kodon ATG, nie jest możliwe uzyskanie dopuszczalnych poziomów ekspresji wspomnianego genu. Stwierdzono również, zgodnie z innym aspektem niniejszego wynalazku, że odpowiednia modyfikacja 5' nietranslowanego regiony genu fruktozylotransferazy zwiększa poziom ekspresji genu fruktozylotransferazy w komórce roślinnej. Odpowiednie modyfikacje obejmująkażdąz mody
178 789 fikacji, która nie wpływa negatywnie na ekspresje genu fruktozylotransferazy w komórce roślinnej. Praktycznie, oznacza to, że należy usunąć każdą z sekwencji wpływających negatywnie na ekspresję. Korzystnie cały 5' nietranslowany region powyżej kodonu ATG jest usuwany z genu bakteryjnego.
Przez określenie „wzorzec fruKtanów” rozumie się rozmieszczenie fruktanów w różnych tkankach roślin i przedziałach komórki roślinnej jak cytozol, wakuole, apoplast itp. Niektóre z roślin w sposób naturalny produkują fruktan, podczas gdy inne nie. Wzorzec fruktanu gatunku rośliny nie produkującego fruktanów w komórce nie transformowanej może być zmieniony przez wprowadzenie genu kodującego fruktozylotransferazę. Rozmieszczenie fruktanu w roślinie może być również zmienione przez zmianę szlaków metabolicznych w roślinie lub komórce roślinnej na obecne w innej roślinie lub przedziale komórkowym.
Sacharoza będąca substratem fruktozylotransferaz jest węglowodanem spotykanym w wielu różnych miejscach. Jest ona syntetyzowana w cykloplazmie, zaś znaczne jej ilości znaleźć można w cytozołu, wakuolach i przestrzeni międzykomórkowej (apoplaście).
Ponieważ, procesy biochemiczne w komórkach roślinnych są często ograniczone do pojedynczego lub kilku przedziałów komórkowych, pożądanym jest by zapoczątkować gromadzenie produktu nowo wprowadzonego genu w szczególnym przedziale. Stąd, koniecznym jest by w fruktozylotransferazach ekspresjonowanych w różnych przedziałach komórkowych, były obecne sekwencje kierujące. Sekwencje DNA kodujące te regiony kierujące mogąbyć połączone z interesującym genem w taki sposób, że ekspresjonowane jest białko chimeryczne, w którym informacja kierująca rozpoznawana jest i używana przez komórkę do odpowiedniego kierowania do odpowiedniej lokalizacji w komórce (Oakes i in., EPO 0486683, WO91/19808, Symons i in., Bio/Technology 10, 292-296 (1992)).
W korzystnym wykonaniu wynalazku kaseta ekspresji zawiera również sekwencję kierującą do kierowania fruktozylotransferazy do jednej lub więcej roślin lub przedziałów komórki roślinnej. Regiony kierujące mogąbyć dowolnąsekwencjąDNA posiadająca zdolność kierowania fruktozylotransferaz do jednej lub więcej szczególnych roślin lub przedziałów komórki roślinnej. Przykładami korzystnych sekwencji kierujących są sekwencje sygnałowe i sekwencje genu karboksypeptydazy Y (cpy) kierujące do wakuoli lub sekwencje sygnałowe i sekwencje kierujące do apoplazmy patologicznego białka genu S (pr-s). Przez dodanie sekwencji kierujących do konstruktu DNA niniejszy wynalazek dostarcza sposobu produkcji roślin transgenicznych, w których fruktozylotransferaza może być kierowana do jednego lub więcej szczególnych przedziałów komórkowych, co prowadzi do odpowiedniego wzorca fruktanu w roślinie lub komórce roślinnej.
Często dobroczynnym dla rośliny jest nie tylko kontrolowanie lokalizacji ale również momentu ekspresji wprowadzonego genu. Przykładowo, zwykle jest pożądane ograniczenie ekspresji aktywności enzymatycznych do szczególnych części roślin, możliwych do zbierania części jak kłącza, owoce lub nasiona. Ponadto, często pożądane j est zapoczątkowanie ekspresji w tych częściach na odpowiednim etapie rozwoju. Ma to miejsce, gdy ekspresja wprowadzonego genu koliduje z normalnym rozwojem tej części.
Fruktozylotransferazy, których geny są stosowane w wynalazkach według zgłoszenia, używają sacharozy jako substratu do syntezy fruktanu o wysokiej masie cząsteczkowej. Wiele mikroorganizmów zawiera fruktozylotransferazy, posiadające zdolność produkcji fruktanów (zwanych często lewanami) z sacharozy (A. Fuchs 1959, Tezą Uniwersytet w Leidzie, Han 1989 Adv. Appl. Microbiol 35,171-194). Enzymy te potrafiąprzenosić reszty fruktozy z sacharozy na akceptorowączęsteczkę fruktanu, tworząc fruktany o wysokiej masie cząsteczkowej. Ponieważ te akceptorowe cząsteczki fruktanu pochodzą oryginalnie z sacharozy mogą wciąż zawierać końcową cząsteczkę glukozy. Mechanizm reakcji jest następujący (patrz Han 1989 Adv. Appl. Microbiol. 35,171-194):
n (G-F)----> G-(F)n + n-1 G
G-F = sacharoza, G = glukoza, F = fruktoza
178 789
Wiązanie glikozydowe łączące jednostki fruktozy może być typu (2-1)- albo (2-6)-, zależnie od konkretnej fruktozylotransferazy. W mikroorganizmach spotykane są oba typy wiązań w jednej cząsteczce fruktanu. Użyteczność cząsteczki fruktanu zależy od rodzaju szkieletu ((2-1)albo (2-6)-) i stopnia rozgałęzienia i stopnia polimeryzacji.
Wiele mikroorganizmów, jak bakterie, drożdże, grzyby itd zawiera fruktozylotransferazy syntetyzujące fruktany o wysokim DP z sacharozy. Zwykle fruktany są gromadzone pozakomórkowo.
Dwoma przykładami bakterii produkujących fruktozylotransferazy są Bacillus subtilis (Stemmetz i in., 1985 Mol. Gen. Genet. 200,220-228) i Streptococcus mutans (Shiroza i Kuramitsu, 1988, J. Bacteriol, 170,810-816). U.B. subtilis gensacB koduje gen strukturalny dla lewansacharazy, będącej fruktozylotransferazą. Enzym ten potrafi konwertować sacharozę w polimer fruktozy, którego DP łatwo może przekroczyć 10000. Wiązanie spotykane w tym fruktanie, produkowanym przez lewansacharazę jest głównie typu (2-6)- ze znacznym rozgałęzieniem (2-1)-.
W innym mikroorganizmie, S. mutans, gen ftf koduje fruktozylotransferazę, która także potrafi produkować fruktany o bardzo wysokim DP. Jednostki fruktozy w tym fruktanie są głównie typu (2-1)-z rozgałęzieniami (2-6)-(Rosell i Birkhead 1974, Acta Chem. Scand.B28,589).
Fruktozylotransferazy bakteryjne posiadają względnie niską Km dla sacharozy, rzędu ok. 20 mM. Stężenie sacharozy w większości roślin jest znacząco wyższe i stąd enzymy te powinny być aktywne w roślinach. Inną ważną własnością fruktozylotransferaz bakteryjnych jest ich zdolność do syntezy lewanów w niskich temperaturach do 0°C (Tanaka i in., 1978 Agric. Biol. Chem. 42,323-326). Rośliny zwykle przekraczaj ą tą temperaturę, ale w tych warunkach enzymy te powinny być wciąż aktywne.
Korzystny gen(y) strukturalny fruktozylotransferazy zależy przede wszystkim od wymagań odnośnie, stopnia polimeryzacji polimeru i jego stopnia rozgałęzienia fruktanu w różnych zastosowaniach.
Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do fruktozylotransferaz bakteryjnych, ponieważ możliwe jest zastosowanie fruktozylotransferaz pochodzących z innych mikroorganizmów lub z roślin.
U roślin, biosynteza i degradacja fruktanów badana była zwłaszcza uHelianthus taberosus i u niektórych traw (Pollock i Caims, 1991, Ann, Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42,77-101; Pollock, 1986, New Phytol. 104,1-24). Różne rodziny roślin syntetyzują różne typy fruktanów, liniowe i rozgałęzione, z wiązaniami glikozydowymi 2-1 lub 2-6 pomiędzy cząsteczkami fruktozy. W roślinach fruktany gromadzone są zwykle w wakuolach. Substratem do biosyntezy fruktanów jest sacharoza, jednakże powinowactwo tych enzymów do sacharozyjest niższe (ok. Km 100)niż w przypadku enzymów bakteryjnych. Enzymy roślinne związane z metabolizmem fruktanu są bardzo odporne na zimno (Pontis, 1989, J. Plant Physiol. 134,148-150; Gonzales i in., 1990, New Phytol. 115,319-323) i mogąbyć z tego powodu bardzo przydatne w niektórych zastosowaniach.
Prawie wszystkie rośliny są zdolne do syntezy sacharozy, co ma miejsce w cytozolu. Sacharoza jest głównym cukrem transportu węglowodanów i jest transportowana ze źródła (tkanek eksportujących węglowodany) do ujścia (tkanek importujących węglowodany) przez układ naczyniowy. Transport ten często obejmuje przeniesienie sacharozy przez przestrzeń zewnątrzkomórkową, apoplast. Ponadto, sacharoza może być również używana przez roślinę jako zapas węglowodanów. W tym ostatnim przypadku, gromadzona jest zwykle w wakuolach komórek rośliny, np. w korzeniu buraka cukrowego. Konkludując, są dwa ważne miejsca komórkowe gdzie spotykana jest sacharoza w komórce roślinnej: cytozol i wakuole. Dodatkowo, znaczna ilość sacharozy obecna jest w przestrzeni międzykomórkowej, (w apoplaście) wielu roślin.
Korzystny region kierowania powinien kierować fruktozylotransferazę do przedziału gdzie dostępny jest substrat, a więc, odpowiednio, do wakuoli, cytozolu i apoplastu. W celu gromadzenia znacznych ilości fruktanu korzystnym przedziałem jest wakuola. Dla innych celów (np. odporność na suszę i zimno) korzystniejsze może być gromadzenie fruktanu w cytozolu albo apoplaście.
Zwłaszcza gromadzenie sacharozy w wakuolach wielu roślin czyni to miejsce komórkowe idealnym do zapoczątkowania biosyntezy fruktanu przez enzymy bakteryjne lub roślinne.
Korzystne wykonanie wynalazku dostarcza więc sposobu na ekspresję w wakuoli rośliny transgenicznej bakteryjnej, roślinnej lub innej fruktozylotransferazy. Sposób ten obejmuje fuzję sekwencji DNA kodujących sygnał ekspresji specyficzny dla roślin, sygnał lokalizacji w wakuoli i bakteryjną roślinną łub inną fruktozylotransferazę.
Dwa inne przedziały, gdzie dostępna jest sacharozą cytozol i apoplast, mogą być również ważnymi miejscami gromadzenia fruktanu. Może to być osiągnięte przez kierowanie bakteryjnej, roślinnej lub innej fruktozylotransferazy do cytozołu lub apoplastu. Do ekspresji w cytozolu nie wymagana jest żadna informacja kierująca; wystarczająca jest ekspresja dojrzałego enzymu. Do ekspresji fruktozylotransferaz w apoplaście do enzymu musi być dodany region kierujący, który skieruje enzym do apoplastu.
Do ekspresji zmodyfikowanego genu fruktozylotransferazy w roślinach, do konstruktu DNA musząbyć dodane sygnały promotorowe. Takie promotory ekspresji mogąbyć specyficzne dla szczególnego typu komórek lub mogąbyć aktywne w szerokim zakresie typów komórek Dodatkowo, czas ekspresji może być określony prze zastosowanie przykładowo specyficznych rozwojowo promotorów. Jednym z powszechnie stosowanych promotorów do ekspresji genów w roślinach jest promotor 35S wirusa mozaiki kalafiorą który jest aktywny w wielu typach komórek roślinnych niezależnie od stanu rozwoju rośliny.
Korzystnym promotorem może być promotor tkankowo-specyficzny lub konstytutywny, silny lub słaby, zależnie od rośliny docelowej i celu. Do produkcji fruktanu w częściach spichrzowych korzystnym, promotorem powiniem być silny promotor specyficzny dla ujścia.
W celu dalszego zwiększenia poziomów transkrypcji promotor często modyfikowany jest przez powielenie wzmacniacza.
Translacja mRNA może być ulepszona przez dodanie wzmacniacza translacji jak np. sygnał wzmacniacza translacji wirusa RNA4 mozaiki lucerny, który musi być obecny w przepisywanym 5' nietranslowanym regionie.
Do właściwego przerwania transkrypcji musi być dodana do konstruktu specyficzna dla roślin sekwencja termiczna. Przykładem takiej sekwencji jest sekwencja terminatorowa genu syntazy nopalinowej.
Niniejszy wynalazek nie jest ograniczony do występujących naturalnie fruktozylotransferaz, ale może być równie dobrze wykonany przy użyciu ich wariantów. Modyfikacje mogą wpływać na aktywność fruktozylotransferaz w taki sposób, że zmieniony być może stopień polimeryzacji lub struktura produkowanego fruktanu.
Wywołane gromadzenie fruktanów w roślinach transgenicznych przy użyciu zasady opisanej powyżej powinno pozwolić na pozyskiwanie fruktanów z tych roślin do celów produkcji fruktanu. Fruktany mogą być gromadzone w tych roślinach np. w częściach nadających się do zbierania jak korzenie, bulwy, liście, łodygi, kłącza, owoce i nasiona.
Genetycznie zmienione rośliny uprawne zawierające konstrukty kodujące fruktozylotransferazę, wspomniane powyżej, powinny umożliwić wydajnąprodukcję wysokiej jakości polimeru węglowodanowego, użytecznego dla człowieka.
Wynalazek dostarcza sposobu dostarczającego roślin o nowych własnościach biosyntetycznych, które umożliwiająim produkcję i gromadzenie fruktanu. Rośliny takie posiadająulepszone własności z powodu zmienionej relacji ujście-źródło i wydajności, lub ulepszone własności pod wpływem stresu biotycznego i abiotycznego. Stres ten obejmuje suszę, światło, temperaturę, choroby i szkodniki. Ulepszone własności w warunkach normalnych i stresowych obejmują wyższą zawartość suchej masy, lepszy smak czy możliwość przechowywania, podwyższoną wartość odżywczą itp. Rośliny takie mogąbyć odpowiednio użyte jako surowiec do produkcji fruktanu.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być użyty poj edynczy gen fruktozylotransferazy lub połączenie genów fruktozylotransferaz prokariotycznych bądź eukariotycznych. Geny te mogą kodować enzymy do biosyntezy szerokiego zakresu fruktanów.
178 789
Fruktany otrzymane sposobem według wynalazku mogą być użyte do wielu zastosowań spożywczych i innych. Przykłady obejmują produkty spożywcze dla ludzi i zwierząt, produkcję syropu fruktozowego, produkcję chemikaliów i tworzyw sztucznych, aczkolwiek nie są to jedyne zastosowania.
Załączone figury ilustrują niniejszy wynalazek:
Figura 1 pokazuje zestawienie konstruktów;
Figura 2 pokazuje konstrukcje plazmidów pPA2 i pPB 1;
Figura 3 pokazuje konstrukcję 35S-cpy-sacB-NOS w wektorze binarnym (pKP);
Figura 4 pokazuje konstrukcję SSS-cjy-^NOS w wektorze binarnym (pTP);
Figura 5 pokazuje konstrukcję 35S-pr-s-sacB-NOS w wektorze binarnym (pKT);
Figura 6 pokazuje konstrukcję 35S-pr-s-flf-NOS w wektorze binarnym (pTT);
Figura 7 pokazuje konstrukcję 35S-jacB-NOS w wektorze binarnym (pKZ);
Figura 8 pokazuje konstrukcję 35SJ^NOS w wektorze binarnym (pTZ); i
Figura 9 jest przykładem częściowej hydrolizy kwaśnej fruktanu otrzymanego z transgenicznego tytoniu. Ten wzorzec częściowej hydrolizy jest identyczny z fruktanami produkowanymi przez Bącillus subtilis. F=fruktoza, S = sacharoza (disacharyd), 1=1 -kestoza (trisacharyd), DP4, 5 i 6 = tetra-, penta-i heksasacharydy, H = ekstrakt bulwy Helianthus tuberosus użyty jako standard.
Niniejszy wynalazek zostanie zilustrowany następującymi przykładami, które nie mająna celu zawężania zakresu niniejszego wynalazku.
Przykład 1. Ekspresja genu sacB w wakuoli
1. Wybór użytych genów.
W celu stworzenia roślin transgenicznychprodukujących fruktan, wybrano geny kodujące białka zdolne produkować fruktan. Użyto jednego z tych genów, lewansacharazy, kodowanego przez gen sacB Bacillus subtilis (Steinmetz M. i in., MoL Gen. Genet. 200:220-228 (1985)). Enzym ten produkuje w obecności sacharozy głównie rozgałęzione fruktany z wiązaniami typu (2-6).
Ponieważ sacharoza w komórkach roślinnych gromadzi się w wakuolach, jest to korzystne miejsce do produkcji fruktanu. W celu ukierunkowania lewansacharazy do wakuoli, wybrano region kierujący karboksypeptydazy Y (Vallis L.A. i in., Celi 48,887-897 (1987)).
2. Konstrukcja 35S-ępy-sacB-NOS w wektorze binarnym (pKP).
Plazmid pLS302 opisany przez Steinmetz M i in., patrz wyżej. Gen lewansacharazy (sacB) sklonowąno z tego plazmidu jako fragment BamHI - Pstl do miejsca klonowania plazmidu pEMBL9 (Dente L. i in., Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655 (1983)) w odpowiednie miejsca 5omHI i Pstl, otrzymując plazmid pKA16. Ogólna metodologia klonowania DNA jest opisana (Sambrook J i in., Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory(1989)).
W celu stworzenia miejsca Ncol w pozycji nukleotydowej 550 w pobliżu miejsca poddawanego obróbce dojrzewania genu lewansacharazy (Steinmetz M i in., patrz wyżej) wykonano kierowaną mutagenezę, jak to opisano przez Kramer W i in., (Nucleic Acids Res. 12,9441-9456 (1984)) przy użyciu następującego oligonukleotydu 5-GCAACTCAAGCCATGGCGAAAGAAACG-3', oznaczając powstały plazmid pKD22.
W pozycji aminokwasowej -2 w stosunku do miejsca poddawanego obróbce dojrzewania (pozycja nukleotydowa 544) zmieniono fenyloalaninę na metioninę. FragmentNcol-Pstl, w którym obecna jest sekwencja kodująca dojrzałe białko lewansacharazy, użyto do dalszego klonowania.
Plazmid pTS3, zawierający gen karboksypeptydazy Y (cpy) opisano przez Vallis L.A. i in. patrz wyżej).
Pierwszą część genu cpy sklonowąno z tego plazmidu, jako fragment Ciał (-695) -SamHI (462), do miejsca klonowania pEMBL9 (Dente L. i in., patrz wyżej) do odpowiednich miejsc AccI i 5ατηΗΙ, otrzymując plazmid pCAl.
W celu stworzenia miej sca Ncol w pobliżu miejsca poddawanego obróbce dojrzewania poniżej sekwencji kierujących do wakuoli genu cpy w pozycji nukleotydowej 330, wykonano
178 789 kierowanąmutagenezę, jak to opisano przez Kramer W i in., (Nucleic Acids Res. 12,9441-9456 (1984)) przy użyciu następującego oligonukleotydu 5-CGTGTCAACAAGACCATGGACCCTAA-3'. Powstały plazmid pCB50 zawierający pierwszą część genu cpy z miejscem Ncol w miejscu poddawanemu obróbce dojrzewania. W pozycji aminokwasowej +2 w stosunku do miejsca poddawanego obróbce dojrzewania, w pozycji nukleotydowej 334, zmieniono izoleucynę na treoninę. W pozycji aminokwasowej +3 w stosunku do miejsca poddawanego obróbce dojrzewania, w pozycji nukleotydowej 337, lizynę zmieniono na metioninę. Fragment HindlU-Ncol, w którym obecna jest sekwencja kodująca część karboksypeptydazy Y kierująca do wakuoli, użyto do dalszego klonowania.
S ekwencj a odpowiedzialna za kierowanie do wakuoli genu cpy poddana została fuzj i z doj rzałąsekwencją genu lewansacharazy przy użyciu ligacji trzypunktowej (Sambrook J. i in., patrz wyżej).
Użyto następujących fragmentów w równych stężeniach molamych:
fragment HindŚL-Ncol genu cpy (kodującego sekwencje kierujące do wakuoli), fragment Ncól-Pstl genu sacB oraz fragmentu zawierającego wektor pEMBL9, który trawiono HindBA i PSTT. Powstały plazmid pKK3 kodujący w jednej ramce odczytu konstrukt fuzji karboksypeptydazy Y-lewansacharazy. Prawidłowa ramka odczytu genu fuzyjnego potwierdzona została analizą sekwencji.
Plazmid pMOG18 zawierający promotor specyficzny dla roślin, 35S, z podwojeniem wzmacniacza i sekwencjami wzmacniającymi translację mRNA, opisano przez Symons i in., Bio/Technology 8, 217-221 (1990). Zawiera on konstrukt obejmujący promotor 35S/gen uidA/terminator NOS. pBluescript IISK (Stratagene, San Diego CA), z którego usunięto wewnętrzne miejsce BamlU przez przecięcie BamHI, wypełnienie lekkich końców polimeraząKlenowa i religację, użyto do dalszego klonowania. Fragment 35S-uidA-NOS uzyskano przez trawienie pMOG18 przy użyciu EcoRI i Hin-dSi, po czym wklonowano w miejsca EcoBA i HindiB. plazmidu BamHI-pBluescript otrzymując plazmid pPA2. Plazmid trawiono Ncol i BamHI w celu usunięcia genu uidA. Powstały wektor trawiono nukleaząS 1 w celu usunięcia niesparowanych końców i defosforylowano. Z plazmidu pKK3 wyizolowano przez trawienie AccI i Pstl fragment zawierający fuzję cpy-sacB. Miejsca cięcia wypełniono fragmentem Klenowa. Oba fragmenty ligowano uzyskując plazmid pKM5. pKM5 zawierał konstrukt obejmujący promotor 35S/gen fuzyjny cpy-sacB/terminator NOS.
Plazmid ten, pKM5, trawiono wpierw Xhol a następnie nadtrawiono częściowo Xbal. Fragment zawierający kompletny konstrukt (35S-cpy-sacB-NOS) wklonowano w miejsca Xbal i Xhol plazmidu pMOG23 (Symons i in., patrz wyżej), pochodnej roślinnego wektora binarnego pBIN19 (Bevan M. Nuci. Acids Res. 12:8711-8721) otrzymując plazmid pKP.
3. Transformacja pKP do tytoniu.
Plazmid pKP konjugowano do Agrobacterium tumefaciens
LB4404 (Hoekema A i in., Naturę 303,179-180 (1983)) przy pomocy plazmidu pomocniczego pRK2013 (Lam S.T. i in., Plasmid 13,200-204 (1985)) wykorzystując zjawisko „triparental mating”. Konstrukt wprowadzono do Nicotiana tabacum odmiany Petit Havana (SR1) metodą opisaną przez Horsh R.B. i in. Science 227, 1229-1232 (1985). Odtworzone rośliny nazwane roślinami KP, selekcjonowano pod względem oporności na kanamycynę i hodowano na podłożu MS (Murashige i Skoog, Physiol, Plant. 15,473-497 (1962)), zawierającym glukozę zamiast sacharozy. Następnie rośliny hodowano w cieplarni i analizowano.
4. Analiza roślin KP.
Rośliny hodowano w cieplarni, po czym ich liście odcinano i po umieszczeniu w probówkach eppendorfa miażdżono. Po odwirowaniu (2' 16000 rpm) i 1 μΐ nadsączu nakraplano na TLC (Caims A.J. i Pollock C.J. New. Phytol. 109,399-405 (1988)). TLC wywoływano trzykrotnie w mieszaninie aceton: woda 85:15, a następnie poddawano działaniu sprayu z mocznika jak to opisano (Wise C.S. i in., Analitical Chemistry 27, 33-36 (1955)). Metoda ta wybiórczo barwi fruktozę i polimery zawierające fruktozę.
178 789
Polimerów fruktozy nie wykryto w nietransformowanych roślinach, jak również w roślinach transformowanych niespokrewnionym plazmidem.
Przeglądanie transformantów, przy użyciu tej metody, wykazało znaczne gromadzenie fruktanów w tych roślinach. Poziomy ekspresji fruktanów różniły się między poszczególnymi roślinami transformowanymi tym samym konstruktem, j ak to zwykle ma miejsce w doświadczeniach nad transformacjąroślin. Różnice te zależągłównie od miejsca integracji do genu (wpływ miejsca).
Gromadzenie fruktanów w tych roślinach badane było dalej przez izolację większych ilości (Livingtone ΙΠ D.A. Plant Physiol. 92,767-769 (1990)). Fruktan ten analizowano na kolumnie FPLC Superose 6HR10/30 (Pharmacia) i stwierdzono jego obecność we frakcji wskazującej na stopień polimeryzacji rzędu )25000jednostek fruktozy. Fruktanprodukowany przez lewansacharozę z Bacillus subtilis podobnie opuszczał kolumnę Superose.
Częściowa degradacja fruktanu kwaśną degradacją (patrz fig. 9) wykazała charakterystyczny wzorzec produktów hydrolizy. Oczyszczone fruktany roślinne i bakteryjne wykazywały identyczny wzorzec degradacji na TLC. Pełna hydroliza kwaśna, zakończona analizą HPLC na kolumnie Aminex HPX87C (BioRad) wtemp. 85°C przy użyciu wody jako rozpuszczalnika wykazała, że fruktan zbudowany jest z fruktozy.
Oczyszczone fruktany badano również przy użyciu protonowego NMR. Fruktan wyizolowany z roślin transgenicznych nie wykazywał różnic we wzorcu widma w porównaniu z fruktanem syntetyzowanym przez lewansacharazę z Bacillus subtilis.
Nie stwierdzono żadnej aktywności hydrolitycznej w stosunku do fruktanu w kilku roślinach (tytoń, burak cukrowy, pomidor, ziemniak). Gdy ekstrakty białka roślin inkubowano przez czas dłuższy z fruktanem w buforze fosforanowo-cytrynianowym o pH 5.0 fruktoza nie była uwalniana.
Pod wpływem starzenia roślinne fruktany pozostają obecne w roślinach transgenicznych, potwierdzając stabilność obserwowaną z ekstraktem białka. Fruktany gromadzą się w całej roślinie, co pozostaje w zgodzie z niespecyficzną aktywnościąpromotora S35 w roślinach transgenicznych.
Rośliny transgeniczne wydawały nasiona normalnie. Kiełkowanie nasion jest identyczne z nietransformowanymi roślinami, zaś konstrukt jest stabilnie dziedziczony w następnych pokoleniach, które podobnie produkują fruktany.
Przykład 2. Ekspresja genu//w wakuoli
1. Wybór genów.
W celu stworzenia roślin produkujących fruktan, wybrano geny kodujące białka zdolne produkować fruktany. Użyto innej fruktozylotransferazy kodowanej przez gen ftfStreptococcus mutans (Shiroza T. i Kuramitsu H.K. J. Bacteriol. 170,810-816 (1988)). Enzym ten produkuje, w obecności sacharozy, głównie rozgałęzione fruktany o wiązaniach typu (2-1). Ponieważ sacharoza w komórkach roślinnych gromadzi się głównie w wakuolach, jest to korzystne miejsce do gromadzenia fruktanów. Wybrano gen kodujący białko zdolne do kierowania się do wakuoli: karboksypeptydazę Y (Vallis L. A. i in., patrz wyżej). Z genu tego użyto sekwencji sygnałowej i sekwencji kierującej do wakuoli jak to opisano w przykładzie 1.
2. Konstrukcja 35S-cpy-^/NOS w wektorze binarnym (pTP).
Plazmid pTS102 został opisany przez Shiroza T. I Kuramitsu H.K. (patrz wyżej). Gen fruktozylotransferazy (ftf) sklonowane z tego plazmidu jako fragment EcóRV-BglU, do miejsca klonowania pEMBL9 (Dente L. i in., patrz wyżej) w odpowiednie miejsca Swoi i BamHI, otrzymując plazmid pTA12.
W celu stworzenia miejsca Ncol w pobliżu miejsca poddawanego obróbce dojrzewania genu ftf (w pozycji nukleotydowej 783 (Shiroza T. i Kuramitsu H.K. (patrz wyżej)) wykonano kierowaną mutagenezę, jak to opisano przez Kramer W i in., (patrz wyżej) przy użyciu następującego oligonukleotydu.
5'-GGCTCTCTTCTGTTCCATGGCAGATGAAGC-3', oznaczając powstały plazmid pTD2.
178 789
W pozycji aminokwasowej +1 (w pozycji nukleotydowej 783) w stosunku do miejsca poddawanego obróbce dojrzewania, zmieniono glutaminę na metioninę. Fragmentu Ncol-Pstl, w którym obecna jest sekwencja kodująca dojrzałe białko fruktozylotransferazy, użyto do dalszego klonowania.
Fragment HindUI-Ncól, w którym znajduje się sekwencja kodująca część białka karboksypeptydazy Y, kierująca do wakuoli, pochodzący z plazmidu pCB50 (jak to opisano w przykładzie 1) użyto do dalszego klonowania.
Sekwencję kierującą do wakuoli genu cpy poddano fuzji z dojrzałą sekwencjągenu fruktozylotransferazy przy użyciu trzypunktowej ligacji (Sambrook J. i in., patrz wyżej). Użyto następujących fragmentów w równych stężeniach molamych:
Fragmentu HindSI-Ncol genu cpy (kodującego sekwencję kierującą do wakuoli), fragment Ncol-Pstl genu ftf i fragment zawierający wektor pEMBL8, trawiony HindRl-Pst\. Powstały plazmid kodował w jednej ramce odczytu konstrukt fuzyjny karboksypeptydazy Y i fruktozylotransferazy. Fuzja odbyła się w poprawnej ramce odczytu co zostało potwierdzone przez analizę sekwencji.
Plazmid pPA2, opisany w przykładzie 1, trawiono Ncól i ΒατηΗΙ w celu usunięcia genu uidA. Powstały wektor trawiono nukleazą SI w celu usunięcia niesparowanych końców i defosforylowano. Z plazmidu pTKl wyizolowano przez trawienie AccI i Pst\ fragment zawierający fuzję cpy-ftf. Miejsce cięcia wypełniono fragmentem Klenowa. Oba fragmenty ligowano uzyskując plazmid pIM4. pTM4 zawierał konstrukt obejmujący promotor 35S/gen fuzyjny cpy-yi^terminator NOS.
Plazmid ten, pIM4, trawiono wpierwXhol a następnie nadtrawiono częściowoXbal. Fragment zawierający kompletny konstrukt (35S-cpy-y^NOS) wklonowano w miejsca Xba\ i HindRl plazmidu pMOG23 (Symons i in., patrz wyżej), pochodnej roślinnego wektora binarnego pBIN19 (Bevan M. patrz wyżej) otrzymując plazmid pTP.
Rośliny transgeniczne, określane jako rośliny TP, zawierające opisany konstrukt, wytworzono jak to opisano w przykładzie 1.
3. Analiza roślin TP.
Przeglądanie transformantów, przy użyciu metody TLC, opisanej w przykładzie 1, wykazało gromadzenie fruktanów w roślinach z różnicami zależnymi od wpływu miejsca.
Gromadzenie fruktanów w tych roślinach badane było dalej przez izolację większych ilości (Livingstone ΙΠ D.A. patrz wyżej). Fruktan ten analizowano na kolumnie FPLC Superose 6HR 10/30 (Pharmacia) i stwierdzono jego obecność we frakcji wskazującej na stopień polimeryzacji rzędu>25000 jednostek fruktozy. Fruktan produkowany przez fruktozylotransferazę ze Streptococcus mutans podobnie opuszczał kolumnę Superose. Podobnie częściowa degradacja fruktanu kwaśną degradacją wykazała charakterystyczny wzorzec produktów hydrolizy. Oczyszczone fruktany roślinne i bakteryjne wykazywały identyczny wzorzec degradacji na TLC. Pełna hydroliza kwaśna, zakończona analiząHPLC na kolumnie Aminex ΗΡΧ87C w temp. 8 5°C przy użyciu wody jako rozpuszczalnika wykazała, że fruktan zbudowany jest z fruktozy. Jak w przykładzie 1, starzejące się rośliny wciąż zawierały fruktany. Podobnie nasiona były płodne i zdolność produkowania fruktanu jest dziedziczona przez następne pokolenia.
Przykład 3. Ekspresja sacB w apoplaście
1. Wybór genów.
W celu wytworzenia roślin produkujących fruktany, wybrano geny kodujące białka zdolne produkować fruktany. Użyto jednego z genów, lewansacharazy, kodowanej przez gen sacB (Steinmetz M. i in., patrz wyżej) i opisanej w przykładzie 1.
Ponieważ sacharoza w tytoniu transportowana jest przez apoplast do floemu, przeto przestrzeń międzykomórkowa (apoplast) jestkorzystnymmiejscem gromadzenia fruktanu. Wybrano gen kodujący białko zdolne do kierowania się do apoplastu: białko S związane z patogenezą, kodowane przez genpr-s (Comelissen B.J.C. i in., Naturę 321, 531-532 (1986). Użyto sekwencji sygnałowej eksportu z tego genu.
178 789
2. Konstrukcja 35S/pr-s-sacB/NOS w wektorze binarnym (pKT).
Plazmid pMOG29 został opisany przez Pen J. i in. (Bio/Technology 10, 292-296 (1992)). Gen białka S związanego z patogenezą (pr-s) (Comełissen B.J.C. i in., patrz wyżej; Van Kai J.A.L. i in., Plant Mol. Biol. 12,153-155 (1989)) posiada sekwencję sygnałową zdolną do kierowania białka do przestrzeni międzykomórkowej, apoplastu (Pen J. i in., patrz, wyżej). Plazmid pMOG29 zawiera konstrukt obejmujący promotor 3 5 S/sekwencj ępr-s/terminator NOS. pBluescript Π SK (Stratagene, San Diego CA), z którego usunięto wewnętrzne miejsce BamHI przez przecięcie BamHI, wypełnienie lepkich końców polimerazą Klenowa i religację, użyto do dalszego klonowania.
Konstrukt obejmujący promotor 35S/sekwencjępr-s/terminator NOS uzyskano przez trawienie pMOG29 przy użyciu BcoRI i HindSl, po czym wklonowano w miejsca BcoRI i HindSL plazmidu pBluescript otrzymując plazmid pPB 1. Plazmid pPB 1 trawiono BamHI a niesparowane końce wypełniono przy użyciu polimerazy Klenowa. Z plazmidu pKK3 (przykład 1) wyizolowano przez trawienie Ncol i Pstl fragment zawierający gen sacB. Miejsca cięcia wypełniono fragmentem Klenowa. Wykonano ligację na tępe końce uzyskując plazmid pKR. pKR kodował w jednej ramce odczytu konstrukt fuzjipr-s z lewansacharazą. Fuzja odbyła się w prawidłowej ramce odczytu co potwierdzono analizą sekwencji. Konstrukt kodował następującą sekwencję aminokwasową: MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHARAS, po czym następowała sekwencja białka lewansacharazy zaczynająca się od metioniny, alaniny i dalej reszta dojrzałego białka lewansacharazy (Steinmetz i in., patrz wyżej). Konstrukt ten trawiono wpierw Xbal a następnie nadtrawiono częściowo Yńol. Fragment zawierający kompletny konstrukt (SóS-pr-s-iacB-NOS) wklonowano w miejscaXbal '\Xhol plazmidupMOG23 (Symons i in., patrz wyżej), pochodnej roślinnego wektora binarnego pBIN19 (Bevan M. Nuci. Acids Res. 12:8711-8721) otrzymując plazmid pKT.
Rośliny transgeniczne, określane jako rośliny KT, zawierające konstrukt opisany powyżej wytworzono tak jak to opisano w przykładzie 1.
3. Analiza roślin KT.
Przeglądanie transformantów, przy użyciu metody TLC, opisanej w przykładzie 1, wykazało gromadzenie fruktanów w roślinach z różnicami zależnymi od wpływu miejsca.
Gromadzenie fruktanów w tych roślinach badane było dalej przez izolacj ę większych ilości (Livingstone ΙΠ D.A. patrz wyżej). Dane z chromatografii na Superozie i pełna hydroliza kwaśna, zakończona analizą HPLC, jak w przykładzie 1, wykazała, że fruktan posiada -wysoką masę cząsteczkową i zbudowany jest z fruktozy.
Jak w przykładzie 1, starzejące się rośliny wciąż zawierały fruktany. Podobnie nasiona były płodne i zdolność produkowania fruktanu jest dziedziczona przez następne pokolenia.
Przykład 4. Ekspresjaftfwapoplaście
W celu wytworzenia roślin produkujących fruktany, wybrano geny kodujące białka zdolne produkować fruktany. Użyto innej fruktozylotransferazy kodowanej przez gen ftf (Shiroza T. i Kuramitsu H.K., patrz wyżej) i opisanej w przykładzie 2. Ponieważ sacharoza w tytoniu transportowana jest przez apoplast do floemu, przeto przestrzeń międzykomórkowa (apoplast) jest korzystnym miejscem gromadzenia fruktanu. Wybrano gen kodujący białko zdolne do kierowania się do apoplastu: białko S związane z patogenezą, kodowane przez gen pr-s (Comełissen B.J.C. i in., patrz wyżej). Użyto sekwencji sygnałowej eksportu z tego genu.
2. Konstrukcja 35S!pr-s-ftfJNOS w wektorze binarnym (pTT).
Plazmid pPBl (przykład 3) trawiono BamHI a niesparowane końce wypełniono przy użyciu polimerazy Klenowa. Z plazmidu pTKl (przykład 2) wyizolowano przez trawienie Ncol i Pstl fragment zawierający genftf. Miejsca cięcia wypełniono fragmentem Klenowa. Wykonano ligację na tępe końce uzyskując plazmid pTR. pTR kodował w jednej ramce odczytu konstrukt fuzjipr-s z fruktozylotransferazą. Fuzja odbyła się w prawidłowej ramce odczytu co potwierdzono analizą sekwencji. Konstrukt kodował następującą sekwencję aminokwasową: MNFLKSFPFYAFLCFGQ YFVAVTHARAS, po czym następowała zaczynaj ąca się od metioniny sekwencja dojrzałego białka fruktozylotransferazy (Shiroza i in., patrz wyżej).
178 789
Konstrukt ten trawiono wpierwXbal i HindBl. Fragment zawierający kompletny konstrukt (35Sy?r-5-/i©-NOS) wklonowano w miejsca Xbal i //ήπΖΠΙ plazmidu pMOG23 (Symons i in., patrz wyżej), pochodnej roślinnego wektora binarnego pBIN19 (Bevan M. patrz wyżej) otrzymując plazmid pTT.
Rośliny transgeniczne, określane jako rośliny TT, zawierające konstrukt opisany powyżej wytworzono tak jak to opisano w przykładzie 1.
3. Analiza roślin TT.
Przeglądanie transformantów, przy użyciu metody TLC, opisanej w przykładzie 1, wykazało gromadzenie fruktanów w roślinach z różnicami zależnymi od wpływu miejsca.
Gromadzenie fruktanów w tych roślinach badane było dalej przez izolację większych ilości (Livingstone ΙΠ D. A. patrz wyżej). Dane z chromatografii na Superozie i pełna hydroliza kwaśna zakończona analizą HPLC, jak w przykładzie 1, wykazała, że fruktan posiada wysoką masę cząsteczkową! zbudowany jest z fruktozy.
Jak w przykładzie 1, starzejące się rośliny wciąż zawierały fruktany. Podobnie nasiona były płodne i zdolność produkowania fruktanu jest dziedziczona przez następne pokolenia.
Przykład 5. Ekspresja sacB w cytoplazmie
1. Wybór genów.
W celu stworzenia roślin transgenicznych produkujących fruktan, wybrano geny kodujące białka zdolne produkować fruktan. Użyto jednego z tych genów, lewansacharazy, kodowanego przez gen sacB (Steinmetz M. i in., patrz wyżej) i opisanego w przykładzie 1.
Ponieważ sacharoza w komórkach roślinnych syntetyzowana jest w cytoplazmie, cytoplazma jest korzystnym miejscem gromadzenia fruktanów. Ponieważ białka kodowane w jądrze tworzone są w cytoplazmie nie potrzebna jest żadna sekwencja kierująca.
2. Konstrukcja 35S-sacB-NOS w wektorze binarnym (pKZ).
Plazmid pPA2 (przykład 1) trawiono Ncol i BamHL i wyizolowano fragment zawierający wektor. Z plazmidu pKK3 (przykład 1) wyizolowano gen sacB jako fragment Ncol-BamHL Oba fragmenty ligowano tworząc plazmid pKX. Powstały plazmid pKX kodował konstrukt dojrzałego białka lewansacharazy. Poprawność konstruktu potwierdzono analizą sekwencji.
Konstrukt trawiono Xhal i Xhol. Fragment zawierający kompletny konstrukt (35S-sacB-NOS) wklonowano w miejscaXbal i Xhol plazmidu pMOG23 (Symons i in., patrz wyżej), pochodnej roślinnego wektora binarnego pBIN19 (Bevan M. patrz wyżej) otrzymując plazmid pKZ.
Rośliny transgeniczne, określane jako rośliny KT, zawierające konstrukt opisany powyżej wytworzono tak jak to opisano w przykładzie 1.
3. Analiza roślin KT.
Przeglądanie transformantów, przy użyciu metody TLC, opisanej w przykładzie 1, wykazało gromadzenie fruktanów w roślinach z różnicami zależnymi od wpływu miejsca.
Gromadzenie fruktanów w tych roślinach badane było dalej przez izolacj ę większych ilości (Livingstone ΙΠ D. A. patrz wyżej). Dane z chromatografii na Superozie i pełna hydroliza kwaśna, zakończona analizą HPLC, j ak w przykładzie 1, wykazała, że fruktan posiada wysoką masę cząsteczkową! zbudowany jest z fruktozy.
Jak w przykładzie 1, starzejące się rośliny wciąż zawierały fruktany. Podobnie nasiona były płodne i zdolność produkowania fruktanu jest dziedziczona przez następne pokolenia.
Przykład 6. Ekspresja genuyjf w cytoplazmie
1. Wybór genów.
W celu stworzenia roślin transgenicznych produkujących fruktan, wybrano geny kodujące białka zdolne produkować fruktan. Użyto innej fruktozylotransferazy kodowanej przez gen ftf (Shiroza T. i Kuramitsu H.K., patrz wyżej) i opisanej w przykładzie 2. Ponieważ sacharoza w komórkach roślinnych syntetyzowana jest w cytoplazmie, cytoplazma jest korzystnym miejscem gromadzenia fruktanów. Ponieważ białka kodowane w jądrze tworzone są w cytoplazmie nie potrzebna jest żadna sekwencja kierująca.
178 789
2. Konstrukcja 35S-//NOS w wektorze binarnym (pTZ).
Plazmid pPA2 (przykład 1) trawiono Ncol i BawHI i wyizolowano fragment zawierający wektor. Z plazmidu pIKl (przykład 2) wyizolowano gen //jako fragment Ncol - BamHL Oba fragmenty ligowano tworząc plazmid pTX. Powstały plazmid pTX kodował konstrukt dojrzałego białka fruktozylotransferazy. Poprawność konstruktu potwierdzono analiząsekwencji.
Konstrukt trawiono Xbal i HindSi. Fragment zawierający kompletny konstrukt (35S-//NOS) wklonowano w miejsca Xbal i HindSi plazmidu pMOG23 (Symons i in., patrz wyżej), pochodnej roślinnego wektora binarnego pBIN19 (Bevan M. patrz wyżej) otrzymując plazmid pTZ.
Rośliny transgeniczne, określane jako rośliny TZ, zawierające konstrukt opisany powyżej wytworzono tak jak to opisano w przykładzie 1.
3. Analiza roślin TZ.
Przeglądanie transformantów, przy użyciu metody TLC, opisanej w przykładzie 1, wykazało gromadzenie fruktanów w roślinach z różnicami zależnymi od wpływu miejsca.
Gromadzenie fruktanów w tych roślinach badane było dalej przezizolację większych ilości (Livingstone ΙΠ D.A. patrz wyżej). Dane z chromatografii na Superozie i pełna hydroliza kwaśna, zakończona analizą HPLC, jak w przykładzie 1, wykazała, że fruktan posiada wysoką masę cząsteczkową i zbudowany jest z fruktozy.
Jak w przykładzie 1, starzejące się rośliny wciąż zawierały fruktany. Podobnie nasiona były płodne i zdolność produkowania fruktanu jest dziedziczona przez następne pokolenia.
Przykład 7. Nabyte własności transgenicznych roślin tytoniu noszących konstrukty fruktozylotransferazy
1. Własności ogólne.
Wszystkie linie roślin transgenicznych noszących konstrukty fruktozylotransferazy, jak to opisano w przykładach 1-6, gromadzą cząsteczki fruktanu. Poziom gromadzenia fruktanu różni się między poszczególnymi transfonnantami, prawdopodobnie na skutek wpływu miejsca integracji transgenu na ekspresję genu (wpływ miejsca) oraz pomiędzy użytymi sześcioma konstruktami. Przy użyciu analizy hybrydyzacja Southema (Sambrook J. i in., patrz wyżej) oznaczono liczbę kopii integrowanych do genomów poszczególnych roślin. Liczba integrowanych kopii wahała się miedzy 1 a 8, ale większość roślin zawierała tylko jedną lub dwie kopie konstruktu. Stopień polimeryzacji fruktanów wynosił do 25000 i więcej jednostek fruktozy. Fruktany gromadzone były we wszystkich badanych częściach roślin, co obejmowało: liście, łodygę, korzenie i nasiona. Własności przekazywane były potomstwu w sposób Mendlowski.
Tożsamość fruktanów potwierdzono przez porównanie wielkości, hydrolizę i spektroskopię opartą na protonowym jądrowym rezonansie magnetycznym, tak jak to opisano w powyższych przykładach. Dodatkowo, przeciwciała przeciwko wiązaniom fruktofuranozylowym (HallB.iin.,Mol.Immunol. 27:351-361; Hall B. i in., 1992, J.Immunol. 149:1605-1612) reagowały z fruktanami produkowanymi przez rośliny transgeniczne. Do tych badań fruktany nakroplono na filtr nitrocelulozowy i przytwierdzono przez 15 minutową inkubację w temp. 120°C. Filtry inkubowano ze specyficznym przeciwciałem mysim (Hall i in., patrz wyżej), a przeciwciała związane z fruktanem wykrywano wtórnym przeciwciałem kozim, skonjugowanym z fosfatazą alkaliczną, skierowanym przeciwko niespecyficznej części mysich przeciwciał.
Fruktany są obecne w całym cyklu życiowym roślin. Raz zsyntetyzowany fruktan pozostaje stabilny. Jeżeli w ogóle istnieje przemiana fruktanów, pozostaje na bardzo niskim poziomie. W starzejących się liściach fruktany są wciąż obecne w ilościach porównywalnych z dojrzałymi liśćmi. Zawartość fruktanów w transgenicznych roślinach tytoniu zawiera się w zakresie 3-8% suchej masy dojrzałych liści. Poziomy innych rozpuszczalnych węglowodanów (glukozy, sacharozy i fruktozy) oznaczano przy użyciu chromatografii HPLC, tak jak to opisano, i stwierdzono, że są porównywalne z nietransformowanymi roślinami typu dzikiego.
2. Charakterystyka fenotypowa.
W normalnych warunkach hodowli nie obserwuje się różnic we wzroście i morfologii pomiędzy kontrolnymi nietransformowanymi roślinami a gromadzącymi fruktan roślinami trans genicznymi noszącymi gen ftf S. mutans w trzech różnych konfiguracjach wspomnianych w przykładach 2,4 i 6. (linie TP, TZ i TT). Jest to również prawdą dla roślin noszących gen sacB B. subtilis, poddany fuzji z sygnałem kierującym cpy (rośliny, KP, przykład 1). Rośliny ekspresjonujące gen sacB B. subtilis w cytoplazmie i apoplaście (KZ, KT, przykłady 3 i 5) wykazywały zmiany martwicze w dojrzałych liściach i łodydze. Ciężkość zmian korelowała z poziomem zgromadzonego fruktanu. Rośliny te wydawały płodne nasiona.
Przykład 8. Polepszone własności w warunkach stresu, roślin transgenicznych tytoniu, noszących konstrukty fruktozylotransferazy
Porównywano własności w warunkach stresowych reprezentatywnych linii tytoniu noszących konstrukt cpy-sacB (KP, przykład 1) z roślinami kontrolnymi nietransformowanymi.
1. Stres suszy.
Stres suszy wywoływano u roślin przez kontrolowany dodatek do podłoża vermikulitu glikolu polietylenowego o średniej masie cząsteczkowej 10000 Da (PEG 10,000). Wywołano zakres poziomu stresu suszy do 20% PEG 10,000 przez dodanie roztworu PEG. Oznaczona została masa świeża i masa sucha jak również tempo wzrostu (w cm/dzień). Poddane stresowi suszy rośliny KP, gromadzące fruktan, rosły szybciej i dawały znacząco wyższe plony w porównaniu z podobnie traktowanymi roślinami nietransformowanymi. W porównaniu z podobnie poddanymi stresowi roślinami nietransformowanymi w typowym przypadku u transgenicznych roślin KP masa świeża zwiększała się o 19% a masa sucha o 32%.
2. Warunki stresu świetlnego.
Porównywano charakterystyki plonów w suboptymalnych warunkach świetlnych pomiędzy reprezentatywnymi roślinami transgenicznymi KP i roślinami nietransformowanymi. Rośliny KP rosnące w warunkach słabego światła (5000 luksów) porównywane były bezpośrednio z roślinami kontrolnymi (nietransformowanymi). Gromadzące fruktan rośliny KP rosły szybciej i dawały znacząco wyższe plony w porównaniu z roślinami nietransformowanymi. Zarówno masa świeża jak i sucha roślin KP była 18% wyższa w porównaniu z roślinami nietransformowanymi. KP wytwarzały więcej liści niż rośliny nietransformowane.
Wysokie natężenie światła, zwłaszcza w połączeniu z suboptymalnymi warunkami wzrostu, wywoływało ciężki stres u większości gatunków roślin. Rośliny gromadzące fruktan mogą w tych warunkach zachowywać się lepiej w porównaniu z roślinami nietransformowanymi. Przykładowo, fruktan działa jako dodatkowe ujście węglowodanów i w ten sposób może zabezpieczać rośliny przed uszkodzeniem wywołanym światłem.
3. Stres zimna.
Porównywano charakterystykę wzrostu roślin transgenicznych KP i nietransformowanych roślin w warunkach stresu zimna. Podczas wzrostu w kontrolowanych warunkach 12°C, rośliny KP dawały średnio 19% wyższe plony mierzone masą świeżą i suchą w porównaniu z roślinami nietransformowanymi.
Warunki stresu określone w punktach 1,2 i 3, wywoływały ponad czterokrotny wzrost poziomu fruktanu u roślin transgenicznych KP, w porównaniu z roślinami KP nie poddawanymi stresowi. Gromadzenie fruktanów powodowało lepsze własności wzrostu, przy czym stopień gromadzenia korelował ze stopniem nasilenia wzrostu.
Lepsze własności w warunkach stresowych nie są ograniczone do specyficznych przykładów danych w 1,2 i 3, ale mogą występować przy szerszym zakresie niekorzystnych warunków środowiska. Polepszone własności nie są ograniczone do zwiększonego tempa wzrostu czy zwiększenia świeżej i suchej masy, ale mogą obejmować ważne ekonomicznie filologiczne aspekty w odniesieniu do własności przed i po zbiorach.
W dodatku do polepszonych własności pod wpływem stresu abiotycznego, jak to wspomniano powyżej, gromadzące fruktan rośliny mogą wykazywać zwiększoną odporność na stres biotyczny, jak choroby i szkodniki (Farr, w: Pests and pathogens: Plant response to foliar attack, str. 107-127 Wyd. P.G. Ayres, BIOS Publishers 1992). Gromadzenie fruktanu może powodować modyfikacje metaboliczne i strukturalne u roślin, powodujące zmniejszoną wrażliwość na
178 789 choroby i szkodniki. Przykłady tych modyfikacji obejmuj ą choć nie są ograniczone do zmian we wrażliwości na trawienie, zmianach struktury, zapachu, i zmienionych poziomów innych pierwotnych i wtórnych produktów metabolizmu.
Rośliny z naturalnym i zmienionym wzorcem rozmieszczenia węglowodanów mogąbyć korzystnym celem dla działań nad polepszeniem własności pod wpływem stresu przez, przykładowo, dalsze zwiększanie gromadzenia fruktanu. Rośliny takie obejmują choć nie są ograniczone do naturalnych mutantów metabolizmu skrobi i sacharozy oraz roślin, u których metabolizm skrobi i sacharozy został zmodyfikowany technikami molekularnymi i genetycznymi, przykładowo, jak to opisano w Sonnewald i Willmitzer, Plant Physiology 99,1276-1270,1992.
Przykład 9. Ogólne możliwości zastosowania technologii
1. Konstrukt.
W celu zademonstrowania ogólnej możliwości zastosowania technologii, użyto konstruktu cpy-saćQ, jak to opisano w przykładzie 1. Inne geny dowolnego pochodzenia kodujące polipeptydy zdolne syntetyzować fruktan, składający się z minimum dwóch połączonych jednostek fruktozy, mogąbyć również użyte. Dodatkowo, wydajność wprowadzonego konstruktu, w sensie jego zdolności do bezpośredniego gromadzenia fruktanu w roślinach transgenicznych w odniesieniu do poziomu, czasu i umiejscowienia może być modyfikowana przez użycie sygnałów regulujących, obejmujących choć nie ograniczonych do promotorów konstytutywnych promotorów specyficznych dla części roślin, promotorów regulowanych w rozwoju, sygnałów poliadenylacji, wzmacniaczy translacji, wzmacniaczy transkrypcyjnych itp. Dodatkowo, umiejscowienie komórkowe polipeptydów może być kierowane przez zastosowanie różnych komórkowych sygnałów kierujących, obejmujących choć nie ograniczonych do sygnałów kierujących do wakuoli i apoplastu dowolnego pochodzenia. Po wprowadzeniu do roślin każdej z kombinacji wyżej wymienionych elementów, znaczne ilości fruktanów mogą gromadzić się w częściach wegetatywnych obejmujących liście, korzenie i łodygi jak również części nabytych obejmujących choć nie ograniczonych do bulw, korzeni spichrzowych, owoców jak również nasion.
2. Zastosowanie w różnych gatunkach uprawnych
W celu zademonstrowania ogólnej możliwości zastosowania technologii konstrukt cpysacB, opisany w przykładzie 1, wprowadzony został do gatunków uprawnych jak ziemniak (Solarium tuberosum L.), którego transformacja może, choć nie musi, być przeprowadzona jak to opisano w Visser, Plant Tissue Culture Manuał B5,1-9, Kluwer Academic Publishers, 1991. Powstałe rośliny transgeniczne gromadząfruktany w każdej ze swych części w trakcie rozwoju. Poziomy w liściach i bulwie mogą dochodzić do ponad 9% masy świeżej. Na dodatek, ten sam konstrukt został wprowadzony do buraka (Beta vulgaris L.), który może choć nie musi, zostać stransformowany jak to opisano w DHalluin i in., Biotechnology 10,309-314 (1992). Powstałe rośliny transgeniczne buraka gromadzą znaczne poziomy fruktanu o stopniu polimeryzacji rzędu 25000 i więcej, w przykładowo, liściach i korzeniach spichrzowych. Ten sam konstrukt cpy-saćR został wprowadzony do buraka pastewnego (Brassica napus L.), który może choć nie musi, zostać stransformowany jak to opisano w de Błock i in., Plant Physiol. 91, 694-701 (1989). Powstałe rośliny buraka pastewnego gromadzą znaczne poziomy fruktanu o stopniu polimeryzacji rzędu 25000 lub więcej w, przykładowo, liściach i częściach spichrzowych.
Dodatkowo, gatunki roślin, które mogąbyć modyfikowane w kierunku gromadzenia fruktanu obejmują choć nie są ograniczone do kukurydzy (Zea may L.), owsa (Triticum aestivum L.), jęczmienia (Hordeum yulgare L.), ryżu (Oryza sativa L.), soi (Glicin max L.), grochu (Pisum sativum L.), fasoli (Phaseolus yulgaris L.), cykorii (Cichorium intybus L.), trzciny cukrowej (Saccharum officinarium L.), jamu (Dioscorea asculanta L.), kassawy (Manihot esculenta L.) i traw (np. Lolium spp. Poa spp. i Festuca spp.).
Rośliny z naturalnym i zmienionym wzorcem rozmieszczenia węglowodanów mogąbyć korzystnym celem dla modyfikacji metabolizmu fruktanu, zwłaszcza zwiększenia gromadzenia fruktanu. Rośliny takie obejmują choć nie sąograniczone do naturalnych mutantów metabolizmu
Yl^ 789 skrobi i sacharozy oraz roślin, u których metabolizm skrobi i sacharozy został zmodyfikowany technikami molekularnymi i genetycznymi, przykładowo, jak to opisano w Sonnewald i Willmitzer, Plant Physiology 99,1267-1270, 1992.
178 789
178 789
CM
FIG
CD Ή
FIG
178 789
Xho E E
FIG
178 789
FIG
178 789
FIG
FIG
178 789
Xho E E
FIG
178 789
Degradation of Tobacco Levan KP12 200792
Degradacja Leuanu Tytoniu KP12
(p°cz.) jj Kp 0 2'Z 5 10 15 20 25 30 H
Time (min) C2aa (mln)
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 4,00 zł.
Claims (14)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, wykazujących rozmieszczenie fruktanów w ich tkankach roślinnych i przedziałach komórkowych różniące się od wspomnianego rozmieszczenia obserwowanego u roślin nietransformowanych, znamienny tym, że obejmuje etapy:a) przygotowania konstruktu DNA zawierającego jeden lub więcej genów fruktozylotransferazy pochodzących z rośliny lub mikroorganizmu lub ich zmodyfikowanych wersji, związanych operacyjnie z sekwencjąpromotorową aktywną w roślinach oraz sekwencją terminatorową aktywną w roślinach, pod warunkiem, że gdy gen fruktozylotransferazy stanowi gen sacB z Bacillus subtilis, nietranslowany region 5' jest zmodyfikowany przez usunięcie kodonu ATG będącego poza ramką odczytu, a poprzedzającego początkowy kodon ATG;b) transformowania komórki roślinnej konstruktem; ic) regeneracji rośliny transgenicznej z transformowanej komórki roślinnej.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że konstrukt DNA zawiera również sekwencję kierującą, powyżej genu fruktozylotransferazy.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gen fruktozylotransferazy wybrany został z grupy obejmującej gen sacB Bacillus subtilis i gen ftf Streptococcus mutans.
- 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że sekwencja kierująca wybrana została z grupy obejmującej sekwencje sygnałowe i sekwencje kierujące do wakuołi genu karboksypeptydazy Y (cpy), sekwencji sygnałowej i sekwencji kierującej do apoplastu genu białka S związanego z patogenezą.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja terminatora jest sekwencjąterminatora genu syntazy nopalinowej.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja promotorowa jest sekwencją konstytutywną lub regulowalną
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja promotorowa wybrana została z grupy, w skład której wchodzi sekwencja promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora, promotor syntazy skrobi związanej z ziamistościami ziemniaka.
- 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że konstrukt DNA zawiera również sekwencję wzmacniacza translacji powyżej genu fruktozylotransferazy i poniżej sekwencji promotora.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja wzmacniacza translacji jest sekwencją wzmacniacza translacji wirusa RNA4 mozaiki alfalfy.
- 10. Konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, obejmujący jeden lub więcej genów fruktozylotransferazy pochodzących z rośliny lub mikroorganizmu, lub ich zmodyfikowanych wersji, związanych operacyjnie z roślinną sekwencją promotorową oraz roślinną sekwencją terminatorową, pod warunkiem, że gdy gen fructozylotransferazy stanowi gen sacB z Bacillus subtilis, nietranslowany region 5' jest zmodyfikowany przez usunięcie kodonu ATG będącego poza ramką odczytu, a poprzedzającego początkowy kodon ATG;
- 11. Konstrukt DNA według zastrz. 10, znamienny tym, że zawiera również sekwencję kierującą, powyżej genu fruktozylotransferazy.
- 12. Komórka rośliny transgenicznej zawierająca konstrukt DNA obejmujący jeden lub więcej genów fruktozylotransferazy pochodzących z rośliny, połączony operacyjnie, z roślinną sekwencją promotorową oraz roślinną sekwencją terminatorową pod warunkiem, że gdy gen178 789 fructozylotransferazy stanowi gen saćB z Bacillus subtilis, nietranslowany region 5'jest zmodyfikowany przez usunięcie kodonu ATG będącego poza ramką odczytu, a poprzedzającego początkowy kodon ATG;
- 13. Komórka według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera konstrukt DNA, który zawiera również sekwencję kierującą, powyżej genu fruktozylotransferazy.
- 14. Sposób otrzymywania fruktanów przez ekstrakcję z surowca roślinnego, znamienny tym, że obejmuje etapy:a) przygotowania konstruktu DNA zawierającego jeden lub więcej genów fruktozylotransferazy pochodzących z rośliny lub mikroorganizmu lub ich zmodyfikowanych wersji, związanych operacyjnie z sekwencjąpromotorowąaktywnąw roślinach oraz sekwencjątenninatorową aktywną w roślinach; pod warunkiem, że gdy gen fructozylotransferezy stanowi gen sacB z Bacillus subtilis, nietranslowany region 5' jest zmodyfikowany przez usunięcie kodonu ATG będącego poza ramką odczytu, a poprzedzającego początkowy kodon ATG;b) transformowania komórki roślinnej konstruktem; ic) regeneracji rośliny transgenicznej z transformowanej komórki roślinnej, d) ekstrakcji fruktanów z otrzymanej rośliny transgenicznej lub z jej tkanki.* * *
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP92204098 | 1992-12-28 | ||
| NL9300646A NL9300646A (nl) | 1992-12-28 | 1993-04-15 | Werkwijze voor het verkrijgen van transgene planten welke een gemodificeerd fructaan-patroon vertonen. |
| PCT/NL1993/000279 WO1994014970A1 (en) | 1992-12-28 | 1993-12-28 | Method for obtaining transgenic plants showing a modified fructan pattern |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL309606A1 PL309606A1 (en) | 1995-10-30 |
| PL178789B1 true PL178789B1 (pl) | 2000-06-30 |
Family
ID=26131899
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL93309606A PL178789B1 (pl) | 1992-12-28 | 1993-12-28 | Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6025542A (pl) |
| EP (1) | EP0677112B1 (pl) |
| JP (1) | JPH08507918A (pl) |
| AT (1) | ATE235557T1 (pl) |
| AU (1) | AU5843794A (pl) |
| DE (1) | DE69332803T2 (pl) |
| DK (1) | DK0677112T3 (pl) |
| ES (1) | ES2191028T3 (pl) |
| HU (1) | HU225704B1 (pl) |
| PL (1) | PL178789B1 (pl) |
| PT (1) | PT677112E (pl) |
| WO (1) | WO1994014970A1 (pl) |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3209744B2 (ja) | 1990-01-22 | 2001-09-17 | デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション | 結実能力のある遺伝子変換コーン |
| US6329574B1 (en) | 1990-01-22 | 2001-12-11 | Dekalb Genetics Corporation | High lysine fertile transgenic corn plants |
| DE4227061A1 (de) * | 1992-08-12 | 1994-02-17 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenzen, die in der Pflanze die Bildung von Polyfructanen (Lävanen) hervorrufen, Plasmide enthaltend diese Sequenzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen |
| PL178789B1 (pl) * | 1992-12-28 | 2000-06-30 | Stichting Scheikundig Onderzoe | Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów |
| US6326527B1 (en) | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
| US5780709A (en) * | 1993-08-25 | 1998-07-14 | Dekalb Genetics Corporation | Transgenic maize with increased mannitol content |
| US6118047A (en) | 1993-08-25 | 2000-09-12 | Dekalb Genetic Corporation | Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction |
| DK0728213T4 (da) * | 1993-11-09 | 2009-03-16 | Du Pont | Transgene fructan-akkumulerende afgröder og fremgangsmåder til deres produktion |
| NL9401140A (nl) * | 1994-07-08 | 1996-02-01 | Stichting Scheikundig Onderzoe | Produktie van oligosacchariden in transgene planten. |
| NL1000064C1 (nl) * | 1994-07-08 | 1996-01-08 | Stichting Scheikundig Onderzoe | Produktie van oligosacchariden in transgene planten. |
| PT795018E (pt) * | 1995-01-06 | 2007-12-21 | Plant Res Int Bv | Sequências de adn codificando enzimas de síntese de polímeros de hidratos de carbono e método para a produção de plantas transgénicas |
| ATE393231T1 (de) * | 1995-12-28 | 2008-05-15 | Suntory Ltd | Verfahren zur herstellung temperatur-toleranter pflanzen |
| US6833491B2 (en) | 1996-02-07 | 2004-12-21 | D. J. Van Der Have B.V. | Modification of polysaccharides |
| NL1002275C2 (nl) * | 1996-02-07 | 1997-08-08 | Have D J Van Der Bv | Modificatie van polysacchariden. |
| DE19617687C2 (de) * | 1996-05-03 | 2000-11-16 | Suedzucker Ag | Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen |
| BE1010449A3 (fr) | 1996-08-01 | 1998-08-04 | Raffinerie Tirlemontoise Sa | Procede de preparation d'une composition polydipersee de saccharides, composition polydispersee de saccharides, produit alimentaire, pharmaceutique et/ou cosmetique comprenant ladite composition polydispersee. |
| DE19708774A1 (de) * | 1997-03-04 | 1998-09-17 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme die Fructosylpolymeraseaktivität besitzen |
| DE19749122A1 (de) * | 1997-11-06 | 1999-06-10 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen |
| US6365800B1 (en) | 1998-03-12 | 2002-04-02 | E. I. Du Pont Nemours & Company | Transgenic crops accumulating fructose polymers and methods for their production |
| CN1116417C (zh) * | 1998-04-08 | 2003-07-30 | 中国科学院遗传研究所 | 用转基因技术提高植物耐盐性的方法 |
| DE19840028A1 (de) | 1998-09-02 | 2000-03-09 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen, und deren Verwendung |
| JP2000350583A (ja) * | 1999-03-25 | 2000-12-19 | Hokkaido National Agricultural Experiment Station | 低温発現型フルクタン代謝酵素遺伝子 |
| US20020144310A1 (en) * | 2000-01-28 | 2002-10-03 | Lightfoot David A. | Isolated polynucleotides and polypeptides relating to loci underlying resistance to soybean cyst nematode and soybean sudden death syndrome and methods employing same |
| US20040064846A1 (en) * | 2001-02-28 | 2004-04-01 | Henry Daniell | Genetic engineering of drought tolerance via a plastid genome |
| AUPQ815500A0 (en) | 2000-06-14 | 2000-07-06 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd | Modification of fructan biosynthesis |
| US6791015B2 (en) | 2000-10-30 | 2004-09-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fructan biosynthetic enzymes |
| MXPA03005645A (es) * | 2000-12-21 | 2004-04-21 | Suedzucker Ag | Procedimiento para la preparacion de carbohidratos. |
| WO2003000854A2 (en) * | 2001-06-25 | 2003-01-03 | Ses Europe N.V./S.A. | Double fructan beets |
| NZ568813A (en) * | 2001-11-07 | 2010-04-30 | Genesis Res & Dev Corp Ltd | Sucrose phosphate synthases isolated from the grasses lolium perenne and festuca arundinacea |
| US20050150008A1 (en) * | 2001-11-07 | 2005-07-07 | Agrigenesis Biosciences Limited | Compositions isolated from forage grasses and methods of use |
| US20040133944A1 (en) * | 2003-01-08 | 2004-07-08 | Delta And Pine Land Company | Seed oil suppression to enhance yield of commercially important macromolecules |
| AU2003902253A0 (en) * | 2003-05-12 | 2003-05-29 | The University Of Queensland | Method for increasing product yield |
| US7682829B2 (en) * | 2003-05-30 | 2010-03-23 | Monsanto Technology Llc | Methods for corn transformation |
| ES2313018T3 (es) * | 2003-06-17 | 2009-03-01 | Sembiosys Genetics Inc. | Procedimiento de produccion de insulina en plantas. |
| US7317098B2 (en) * | 2004-07-01 | 2008-01-08 | The Board Of Trustees Of Michigan State University | Ryegrass CBF3 gene: identification and isolation |
| JP4714894B2 (ja) * | 2005-06-22 | 2011-06-29 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | 耐冷性植物及びその開発方法 |
| NZ603035A (en) * | 2008-09-15 | 2014-01-31 | Agriculture Victoria Serv Pty | Modification of fructan biosynthesis, increasing plant biomass, and enhancing productivity of biochemical pathways in a plant (2) |
| US9840695B2 (en) | 2009-04-28 | 2017-12-12 | Agriculture Victoria Services Pty Ltd | Plant technology |
| BR112015023058B1 (pt) | 2013-03-15 | 2023-04-11 | Lisa Hollister | Cassete de expressão |
| WO2017059902A1 (en) | 2015-10-07 | 2017-04-13 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | 3' utr sequences for stabilization of rna |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2072679B (en) * | 1980-03-31 | 1983-11-09 | Meiji Seika Kaisha | Sweetener |
| JPS5953834B2 (ja) * | 1982-05-19 | 1984-12-27 | 明治製菓株式会社 | ビフイズス菌増殖促進物質 |
| JPS6034134A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-02-21 | Meiji Seika Kaisha Ltd | フラクトオリゴ糖含有飼料ならびにこれを用いて家畜を飼育する方法 |
| US4801540A (en) * | 1986-10-17 | 1989-01-31 | Calgene, Inc. | PG gene and its use in plants |
| WO1989012386A1 (en) * | 1988-06-21 | 1989-12-28 | Calgene, Inc. | Methods and compositions for altering physical characteristics of fruit and fruit products |
| US4927811A (en) * | 1988-11-15 | 1990-05-22 | Coors Biotech, Inc. | Method and composition for improved animal husbandry |
| BE1003826A3 (fr) * | 1990-02-23 | 1992-06-23 | Raffinerie Tirlemontoise Sa | Fructo-oligosaccharides ramifies, procede pour leur obtention et utilisation des produits les contenant. |
| JPH0670075B2 (ja) * | 1990-08-28 | 1994-09-07 | ホクレン農業協同組合連合会 | １―ケストース結晶およびその製造方法 |
| US5206355A (en) * | 1991-09-30 | 1993-04-27 | The University Of Montana | Preparation of trisaccharides (kestoses) and polymers by pyrolysis of amorphous sucrose |
| DE4227061A1 (de) * | 1992-08-12 | 1994-02-17 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenzen, die in der Pflanze die Bildung von Polyfructanen (Lävanen) hervorrufen, Plasmide enthaltend diese Sequenzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen |
| PL178789B1 (pl) * | 1992-12-28 | 2000-06-30 | Stichting Scheikundig Onderzoe | Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów |
| US5641759A (en) * | 1993-05-26 | 1997-06-24 | Purdue Research Foundation | Animal husbandry methods and compositions therefor |
| DE4330960C2 (de) * | 1993-09-09 | 2002-06-20 | Aventis Cropscience Gmbh | Kombination von DNA-Sequenzen, die in Pflanzenzellen und Pflanzen die Bildung hochgradig amylosehaltiger Stärke ermöglichen, Verfahren zur Herstellung dieser Pflanzen und die daraus erhaltbare modifizierte Stärke |
| DK0728213T4 (da) * | 1993-11-09 | 2009-03-16 | Du Pont | Transgene fructan-akkumulerende afgröder og fremgangsmåder til deres produktion |
-
1993
- 1993-12-28 PL PL93309606A patent/PL178789B1/pl unknown
- 1993-12-28 WO PCT/NL1993/000279 patent/WO1994014970A1/en not_active Ceased
- 1993-12-28 AT AT94904344T patent/ATE235557T1/de active
- 1993-12-28 JP JP6515042A patent/JPH08507918A/ja active Pending
- 1993-12-28 PT PT94904344T patent/PT677112E/pt unknown
- 1993-12-28 AU AU58437/94A patent/AU5843794A/en not_active Abandoned
- 1993-12-28 DK DK94904344T patent/DK0677112T3/da active
- 1993-12-28 DE DE69332803T patent/DE69332803T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-28 ES ES94904344T patent/ES2191028T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-28 HU HU9501912A patent/HU225704B1/hu unknown
- 1993-12-28 US US08/446,834 patent/US6025542A/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-12-28 EP EP94904344A patent/EP0677112B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-13 US US09/059,484 patent/US5986173A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL309606A1 (en) | 1995-10-30 |
| US5986173A (en) | 1999-11-16 |
| DE69332803D1 (de) | 2003-04-30 |
| ES2191028T3 (es) | 2003-09-01 |
| EP0677112A1 (en) | 1995-10-18 |
| DE69332803T2 (de) | 2004-03-04 |
| ATE235557T1 (de) | 2003-04-15 |
| DK0677112T3 (da) | 2003-07-21 |
| WO1994014970A1 (en) | 1994-07-07 |
| US6025542A (en) | 2000-02-15 |
| HU225704B1 (en) | 2007-06-28 |
| PT677112E (pt) | 2003-08-29 |
| HU9501912D0 (en) | 1995-08-28 |
| HUT71782A (en) | 1996-02-28 |
| AU5843794A (en) | 1994-07-19 |
| JPH08507918A (ja) | 1996-08-27 |
| EP0677112B1 (en) | 2003-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL178789B1 (pl) | Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów | |
| Van Der Meer et al. | Fructan as a new carbohydrate sink in transgenic potato plants. | |
| EP0728213B1 (en) | Transgenic fructan accumulating crops and methods for their production | |
| Vijn et al. | Fructan of the inulin neoseries is synthesized in transgenic chicory plants (Cichorium intybus L.) harbouring onion (Allium cepa L.) fructan: fructan 6G‐fructosyltransferase | |
| JP4509220B2 (ja) | トランスジェニック植物におけるオリゴ糖の産生 | |
| EP1220602B1 (en) | Transgenic fiber producing plants with increased expression of sucrose phosphate synthase | |
| van Arkel et al. | Tailor-made fructan synthesis in plants: a review | |
| AU724942B2 (en) | Transgenic potatoes having reduced levels of alpha glucan L- or H-type tuber phosphorylase activity with reduced cold-sweetening | |
| Scholes et al. | The impact of reduced vacuolar invertase activity on the photosynthetic and carbohydrate metabolism of tomato | |
| JP2008173128A (ja) | 修飾澱粉を合成する植物、その産生プロセスおよび修飾澱粉 | |
| JP2002523023A (ja) | β−アミラーゼをコードする核酸分子、改質デンプンを合成する植物、その産生方法およびその用途 | |
| JP2001520522A (ja) | トランスジェニック植物におけるフルクトース１，６ビスリン酸アルドラーゼの発現 | |
| JP2006525797A (ja) | 内因性糖の外来性糖への変換を触媒することにより、総炭水化物含量もしくは可溶性炭水化物含量または内因性炭水化物の甘味度を高める方法 | |
| JPH07508159A (ja) | エンド‐１，４‐β‐Ｄ‐グルカナーゼ | |
| RU2152997C2 (ru) | Днк-конструкция (варианты), способ получения трансгенных растений и фруктаны | |
| US7608754B2 (en) | Double fructan beets | |
| WO2000068402A1 (en) | Manipulation of fructan catabolism in plants | |
| Smeekensa | Fructan as a new carbohydrate sink in transgenic potato plants | |
| CA2272052A1 (en) | Transgenic plants having increased starch content | |
| AU2003246315A1 (en) | Transgenic plants presenting a modified inulin producing profile |