DE69332803T2 - Verfahren zur herstellung transgener pflanzen mit modifiziertem fructanmuster - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erhalten von transgenen Pflanzen, die ein modifiziertes Fructanmuster im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen zeigen, auf ein DNA-Konstrukt zum Herstellen von transgenen Pflanzen oder Pflanzengeweben, auf transgene Pflanzen oder Pflanzengewebe, die ein modifiziertes Fructanmuster im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen zeigen, auf die Verwendung der transgenen Pflanzen und Gewebe für unterschiedliche Anwendungen und transgenes Saatgut.
  • Pflanzen produzieren viele Kohlenhydrate, die für Nährstoff- und Nichtnährstoff-Anwendungen nützlich sind. Wichtige Beispiele solcher Kohlenhydrate sind Stärke, Zellulose und Sucrose. Diese Verbindungen werden durch den Menschen entweder als solche oder in einer modifizierten Form für Ernährungs- und Industriezwecke verwendet. Feldfruchtarten, die diese Kohlenhydrate produzieren, sind durch traditionelle Pflanzenzüchtungsverfahren erhalten worden. Neben den oben angegebenen, gut bekannten Kohlenhydraten können andere Pflanzenkohlenhydrate mit für den Menschen nützlichen Eigenschaften in Pflanzen vorliegen.
  • Pflanzenkohlenhydrate können in zwei Gruppen eingeteilt werden, je nach ihrer Funktion für die Pflanzen. Die erste Gruppe umfaßt Strukturkohlenhydrate, die gewöhnlicherweise Teil der extrazellulären Matrix sind. Das bekannteste Mitglieder dieser Gruppe ist Zellulose. Die zweite Gruppe sind nichtstrukturelle Lagerkohlenhydrate, die als Langzeit- oder Kurzzeit-(Übergangs-)-Kohlenhydratspeicher dienen können. Beispiele solcher Kohlenhydrate sind Stärke, Glukose und Fructane.
  • Fructan ist ein Polymer, welches hauptsächlich aus sich wiederholenden Fructoseeinheiten besteht. Fructane werden meistens in. Pflanzenarten gefunden, die nicht auf ökonomische Landwirtschaftspraktiken angepaßt sind. Fructane treten auf in Monocotyledonen (insbesondere Poaceae, Liliaceae) und Dicotyledonen (insbesondere Composit) (Pollock und Cairns 1991, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 77-101; Hendry 1987, New Phytol. 106, 201-216).
  • Neben ihrer Rolle als eine Pflanzenkohlenhydratreserve sind für Fructane andere Funktionen vorgeschlagen worden. Diese Funktionen schließen zum Beispiel eine Toleranz gegenüber trockenem und kaltem Klima (Kälte induzierte Entwässerung) ein (Pontis 1989, J. Plant Physiol. 134, 148-150; Gonzales et al. 1990 New Phytol. 115, 319-323).
  • Die durch Pflanzen erzeugten Fructane besitzen jedoch eine begrenzte Funktionalität. Aus diesen Gründen haben Fructane bis jetzt keine große Anwendung in Nährstoff- und Nichtnährstoff-Produkten gefunden, trotz des erkannten großen kommerziellen Potentials (Fuchs 1991 Biochen. Soc. Transact. 19, 555-560, A. Fuchs, Hrsg., Inolin and Inolin-Containing Grops, Elsevier, 1993), insbesondere im Vergleich zu anderen Kohlenhydraten.
  • Eines der Hauptprobleme, die den Nutzen von Pflanzenfructanen begrenzen, besteht im begrenzten Umfang von Pflanzenarten, in denen Fructane auf ein substantielles Niveau akkumulieren. In vielen wichtigen, gegenwärtigen Feldfruchtpflanzen, darunter Zuckerrüben und Kartoffel, liegen Fructane entweder nicht vor oder werden auf sehr niedrigem Niveau gefunden. Pflanzen, die Fructane bis zu einem gewissen Grad speichern, haben häufig ungünstige agronomische Eigenschaften. Ein Beispiel einer solchen Pflanze ist Helianthus tuberosus.
  • Ein anderes Problem ist die begrenzte Funktionalität der erzeugten Fructane. Die Funktionalität ist unter anderem bestimmt durch die Länge der Fructanketten, die in Pflanzen selten einen sogenannten "Polymerisationsgrad" (DP) der Monosaccharide von 100 übersteigt. Gewöhnlich werden viel kleinere Fructane gefunden, und oft nimmt der DP dieser Fructane vor der Ernte oder im Anschluß an die Ernte und/oder die Lagerung dramatisch ab. Niedrige DPs begrenzen den Nutzen der Fructane in anschließenden Prozessen ernsthaft und können zu verringerten Ausbeuten führen.
  • Es ist nun gefunden worden, daß es möglich ist, gewisse Pflanzen zu transformieren, um für eine Expression von Fructanen in geeigneten Wirtspflanzen zu sorgen.
  • Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Erhalten von transgenen Pflanzen zur Verfügung, die eine Verteilung von Fructan in ihren Pflanzengeweben und Pflanzenzellen zeigen, die sich von der in nicht-transformierten Pflanzen gefundenen Verteilung unterscheidet, umfassend die Schritte:
    • (a) Herstellen eines DNA-Konstrukts, welches das sacB-Fructosyltransferasegen von Bacillus subtilis, dessen 5'nichttranslatierter Bereich so modifiziert ist, daß mindestens das außerhalb des Rahmens liegende ATG-Kodon vor dem Initiator-ATG-Kodon deletiert oder inaktiviert ist, und eine in Pflanzen wirksame Promotorsequenz und eine in Pflanzen wirksame Terminatorsequenz, die beide operativ mit dem Gen verbunden sind, umfaßt;
    • (b) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Konstrukt; und
    • (c) Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.
  • Fructosyltransferase-Gene sind Gene, die für Enzyme kodieren, welche die Produktion der Fructose-Fructose-Bindung katalysieren. In der internationalen Patentanmeldung WO 89/12386 ist vorgeschlagen worden, transgene Pflanzen zu erzeugen, die ein fremdes Gen, das für ein zur Polymerisation eines Kohlenhydrats befähigten Enzyms kodiert, wie zum Beispiel unterschiedliche Sucrasen, umfassen, um die lösliche Feststoffzusammensetzung der Pflanzenzellen zu modifizieren. Die WO 89/12386 offenbart unter anderem die Verwendung von Dextransucrase. Dieses Enzym verwendet Sucrose als eine Quelle zur Polymerisation von Glucoseeinheiten. Die vorliegende Erfindung bezieht sich jedoch auf die Polymerisation von Fructoseeinheiten.
  • Die vorliegenden Erfinder haben gefunden, daß durch Gegenwart des 5'mikrobiell nicht-translatierten Bereichs im Fructosyltransferase-Gen sacB, in dem ein außerhalb des Rahmens liegendes ATG-Kodon dem Initiator-ATG-Kodon vorangestellt ist, es nicht möglich ist, akzeptable Expressionsniveaus des Gens zu erhalten. Somit wurde gefunden, daß eine geeignete Modifikation des 5'-nicht-translatierten Bereichs eines Fructosyltransferase-Gens den Expressionsgrad des Fructosyltransferase-Gens in der Pflanzenzelle erhöht. Eine geeignete Modifikation umfaßt die, daß mindestens das außerhalb des Rahmens befindliche ATG-Kodon, welches vor dem Initiator-ATG-Kodon liegt, deletiert oder inaktiviert ist. Vorzugsweise wird der 5'-nicht-translatierte Bereich bis zum ATG-Kodon aus dem Mikroorganismusgen vollständig entfernt.
  • Mit dem Ausdruck "Verteilung von Fructan" ist die Fructanverteilung in unterschiedlichen Pflanzengeweben und Pflanzenzellenkompartimenten wie Cytosol, Vakuole, Apoplast etc. gemeint. Einige Pflanzen erzeugen Fructane natürlich, während andere dies nicht tun. Das Fructanmuster einer Pflanzenart, welche Fructane in der nicht-transformierten Pflanze nicht erzeugt, kann durch das Einführen eines eine Fructosyl-transferase kodierenden Gens verändert werden. Die Fructanverteilung in einer Pflanze kann ebenso durch die Umsteuerung des metabolischen Flusses in Pflanzen oder Pflanzenzellen zu bestimmten Pflanzenoder Pflanzenzellkompartimenten verändert werden.
  • Sucrose, welches das Substrat für die Fructosyltransferasen darstellt, ist ein Kohlenhydrat, welches an mehreren unterschiedlichen Stellen gefunden wird. Es wird im Cytoplasma synthetisiert, und beträchtliche Mengen können im Cytosol, in der Vakuole und dem extrazellulären Raum (dem Apoplast) gefunden werden.
  • Da die biochemischen Prozesse in den Pflanzenzellen auch oft auf ein einzelnes oder einige wenige zelluläre Kompartimente begrenzt sind, ist es erwünscht, die Akkumulation des Produkts der neu eingeführten Gene in einem speziellen Kompartiment zu fördern. Deshalb müssen Zielsequenzen, die für zelluläre Kompartimente spezifisch sind, auf den Fructosyltransferasen vorliegen, die in den transgenen Pflanzen exprimiert werden. Spezifische Aminosäureregionen zum Abzielen auf unterschiedliche zelluläre Orte sind identifiziert und analysiert worden. Die für diese Zielregionen kodierenden DNA-Sequenzen können mit den Genen des Interesses auf eine solche Weise verbunden werden, daß bei der Expression des chimären Gens ein Protein erzeugt wird, in welchem die Zielinformation erkannt wird und durch die Zelle für ein korrektes zielgerichtetes Leiten zu dem zellulären Ort des Interesses verwendet wird (Oaks et al. EPO 0486683, WO 91/19808, Simons et al. Bio/Technology 8, 217-221 (1990), J. Pen et al. Bio/Technology 10, 292-296 (1992)).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt die Expressionskassette deshalb eine Zielsequenz zum zielgerichteten Leiten der Fructosyltransferase zu einem oder mehreren spezifischen Pflanzen- oder Pflanzenzell-Kompartimenten. Die Zielrichtungsregionen können irgendeine DNA-Sequenz sein mit der Fähigkeit, die Fructosyltransferasen zu einem oder mehreren dieser speziellen Pflanzen- oder Pflanzenzell-Kompartimenten zielgerichtet zu leiten. Beispiele von bevorzugten Zielregionen sind die Signalsequenz und die Vakuole-Zielsequenz des Carboxypeptidase Y-(cpy-)Gens, oder die Signalsequenz und die Apoplasma-Zielsequenz des Gens für das Pathogenese-verwandte Protein S (pr-s). Durch Hinzufügen der Zielsequenz zu dem DNA-Konstrukt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von transgenen Pflanzen zur Verfügung, bei dem die Fructosyltransfe rase zu einem oder mehreren speziellen Zellkompartiment(en) gerichtet werden kann, was zu einem gewünschten Fructanmuster in der Pflanze oder der Pflanzenzelle führt.
  • Es ist häufig für die Pflanze von Vorteil, nicht nur den Ort, sondern auch die Zeiteinteilung der Expression der angeführten Gene zu steuern. Zum Beispiel ist es gewöhnlicherweise erwünscht, die Expression der eingeführten enzymatischen Aktivitäten auf spezielle Teile der Pflanze zu begrenzen, z. B. geerntete Organe wie Knollen, Früchte oder Samen. Darüber hinaus ist es häufig erwünscht, dass die Expression in diesen Organen in einem bestimmten Entwicklungsstadium einsetzt. Dies ist gewiß dann der Fall, wenn die Expression der eingeführten Gene mit der normalen Entwicklung solcher Organe interferiert.
  • Fructosyltransferasen verwenden Sucrose als Substrat, um Fructane hohen Molekulargewichts zu synthetisieren. Viele Mikroorganismen enthalten Fructosyltransferasen, die die Fähigkeit zum Erzeugen von Fructanen (häufig als Levane bezeichnet) aus Sucrose besitzen (A. Fuchs 1959, Dissertation, Universität von Leiden; Han 1989, Adv. Appl. Mikrobiol. 35, 171-194). Diese Enzyme können Fructose-Struktureinheiten von Sucrose auf ein Fructanakzeptormolekül zum Erzeugen von Fructanen hohen Molekulargewichts übertragen. Da diese Fructanakzeptormoleküle ursprünglich aus Sucrose stammen, werden sie noch ein terminale Glucosemolekül enthalten. Der Reaktionsmechanismus ist wie folgt (siehe Übersicht von Han 1989, Adv. Appl. Microbiol. 35, 171-194): n (G–F) -> G–(F) n + n–G
  • G–F = Sucose, G = Glucose, F = Fructose
  • Die glycosidische Bindung, die die Fructoseeinheiten miteinander verbindet, kann von einem (2-1)- oder einem (2-6)-Typ sein je nach der besonderen Fructosyltransferase. In Microorganismen können weite Verknüpfungsarten in einem einzelnen Fructanmolekül gefunden werden. Die Funktionalität eines Fructanmoleküls hängt von der Art des Rückgrads ((2-1)- oder (2-6)-) und vom Ausmaß der Verzweigung und dem Grad der Polymerisation ab.
  • Viele Microorganismen, wie Bakterien, Hefen, Pilze etc., enthalten Fructosyltransferasen, die aus Sucose Fructane mit hohem DP synthetisieren. Gewöhnlich werden Fructane außerhalb der Zelle abgeschieden.
  • Zwei Beispiele von Fructosyltransferase-erzeugenden Bakterien sind Bacillus subtilis (Steinmetz et al. 1985, Mol. Gen. Genet. 200, 220-228) und Streptrococcus mutans (Shiroza und Kuramitsu 1988, J. Bacteriol. 170, 810-816). In B. subtilis kodiert das sacB-Gen für das Strukturgen für Levansucrase, einer Fructosyltransferase. Dieses Enzym kann Sucrose in ein Fructosepolymer mit DPs konvertieren, die leicht 10000 übersteigen. Die Verknüpfungsart, die in diesem, durch Levansucrase produzierten Fructan gefunden wird, ist hauptsächlich vom (2-6)-Typ mit starker (2-1)-Verzweigung.
  • In einem anderen Microorganismus, S. mutans, codiert das ftf-Gen für eine Fructosyltransferase, welche ebenso Fructane mit sehr hohem DP erzeugen kann. Die Fructoseeinheiten in diesem Fructan sind hauptsächlich vom (2-1)-verknüpften Typ mit (2-6)-Verzweigung (Rosell und Birkhead 1974, Acta Chem. Skand. B28, 589) .
  • Bakterielle Fructosyltransferasen besitzen ein relativ niedriges Km für Sucrose, etwa 20 mM. Die Sucrosekonzentrationen in den meisten Pflanzen sind beträchtlich höher, und deshalb sollten diese Enzyme in Pflanzen aktiv sein. Eine andere wichtige Eigenschaft von bakteriellen Fructosyltransferasen ist ihre Fähigkeit, Levane bei niedrigen Temperaturen bis zu 0°C zu synthetisieren (Tanaka et al. 1978, Agric. Biol. Chem. 42, 323-326). Pflanzen begegnen solchen Temperaturen häufig, aber unter solchen Bedingungen könnten diese Enzyme noch aktiv sein.
  • Die vorliegende Erfindung verwendet das sacB – Fructosyltransferase-Gen von Bacillus subtilis.
  • In Pflanzen sind Fructanbiosynthese und -abbau insbesondere beim Helianthus tuberosus und in mehreren Gräsern untersucht worden (Pollock und Cairns 1991, Ann. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 42, 77-101; Pollock 1986, New Phytol. 104, 1-24). In unterschiedlichen Pflanzenfamilien werden verschiedene Fructanarten synthetisiert, nämlich lineare oder verzweigte, mit 2-1- und 2-6-glycosidischen Verknüpfungen zwischen den Fructosemolekülen. In Pflanzen werden Fructane in den Vakuolen gespeichert. Das Substrat für die Fructanbiosynthese ist Sucrose, die Affinität dieser Enzyme für Sycrose ist jedoch geringer (etwa Km 100) als im Fall von bakteriellen Enzymen. Die Pflanzenenzyme, welche beim Fructanmetabolismus eine Rolle spielen, sind sehr kältetolerant (Ponti 1989, J. Plant. Physiol. 134, 148-150; Gonzales et al. 1990, New Phytol. 115, 319-323) und können deshalb in bestimmten Anwendungen sehr nützlich sein.
  • Nahezu alle Pflanzen sind zu einer Sucrosesynthese in der Lage, die im Zytosol stattfindet. Sucrose ist der Haupt-Kohlenhydratumverteilungszucker und wird aus der Quelle (Netto-Kohlenhydratexportgewebe) zur Senke (Netto-Kohlenhydratim-portgewebe) über das vaskuläre System transportiert. Dieser Transport schließt häufig den Durchtritt von Sucrose durch den extrazellulären Raum, dem Apoplasten, ein. Darüber hinaus kann Sucrose ebenso durch die Pflanzen zur Kohlenhydratspeicherung verwendet werden. Im letzteren Fall sammelt es sich gewöhnlich in den Vakuolen in den Pflanzen-zellen, z. B. in den Wurzeln der Zuckerrübenpflanzen. Im Ergebnis gibt es zwei wichtige zelluläre Orte, wo Sucrose in Pflanzen-zellen gefunden werden: das Zytosol und die Vakuole. Zusätzlich liegen wesentliche Mengen an Sucrose im extrazellulären Raum (dem Apoplasten) von vielen Pflanzen vor.
  • Die bevorzugte Zielregion sollte die Fructosyltransferase zu Kompartimenten leiten, wo Substrat verfügbar ist, seien es Vakuole, Zytosol bzw. der Aboplast. Für eine hohe Fructanakkumulati on ist zum Beispiel die Vakuole das bevorzugte Kompartiment. Für andere Zwecke (z. B. Dürre- und Kälteresistenz) kann eine Fructanakkumulation im Zytosol oder in Apoplasten bevorzugt sein.
  • Besonders die Akkumulation von Sucrose in den Vakuolen von vielen Pflanzen macht diesen zellulären Ort idealerweise geeignet zur Induktion der Fructanbiosynthese durch microbielle oder pflanzliche Enzyme.
  • Die Erfindung stellt daher ein Verfahren zur vakuolären Expression der mikrobiellen Fructosyltransferase sacB in transgenen Pflanzen zur Verfügung. Dieses Verfahren schließt die Fusion von DNA-Sequenzen ein, die für Pflanzen spezifische Expressionssignale, einem vakuolären Lokalisationssignal und mikrobiellen, pflanzlichen oder anderen Fructosyltransferasen codieren.
  • Zwei andere Kompartimente, in denen Sucrose verfügbar ist, das Zytosol und der Apoplast, können ebenso wichtige Orte zur Fructanakkumulation sein. Dies kann erreicht werden durch das zielgerichtete Führen von mikrobiellen, pflanzlichen oder anderen Fructosyltransferasen zu dem Zytosol oder dem Apoplasten. Zur zytosolischen Expression ist keine zelluläre Richtungsinformation erforderlich; die Expression der reifen Enzyme ist ausreichend. Zur apoplastischen Expression der Fructosyltransferasen muß eine Zielregion zu dem Enzym hinzugefügt werden, welche das Enzym auf den Apoplasten abzielt.
  • Zur Expression des modifizierten Fructosyltransferasegens in Pflanzen müssen Promotorsignale zu dem DNA-Konstrukt hinzugefügt werden. Solche Expressionspromotoren können für einen bestimmten Zelltyp spezifisch sein oder können in einer großen Serie von Zelltypen wirksam sein. Zudem können die Zeiteinteilung der Expression durch Verwendung von zum Beispiel entwicklungsspezifischen Promotern bestimmt werden. Ein gewöhnlich verwendeter Promotor zur Genexpression in Pflanzen ist der 35S-Cauliflower- Mosaikvirus-Promotor, der in vielen Zelltypen in der Pflanze unabhängig vom Entwicklungsstadium der Pflanze aktiv ist.
  • Der bevorzugte Promotor kann ein gewebespezifischer oder ein konstitutiver Promotor – stark oder schwach – sein, abhängig von der Zielpflanze und der Aufgabe. Zur Fructanproduktion in Speicherorganen würde der bevorzugte Promotor ein Senkespezifischer, starker Promotor sein.
  • Um die Transkriptionsspiegel zu verbessern, ist der Promotor häufig modifiziert, daß er eine Enhancer-Verdopplung enthält.
  • Die Translation der mRNA kann verbessert werden durch Hinzufügen eines Translationsenhancers, wie dem Alfalfa-Mosaikvirus-RNA4-Translationsenhancersignal, welches im transkribierten, 5'nichttranslatierten Bereich vorliegen muß.
  • Zur richtigen Termination der Transkription muß eine spezifische Terminatorsequenz zu den Konstrukten hinzugefügt werden. Ein Beispiel einer solchen Sequenz ist die Nopalinsynthasegen-Terminationssequenz.
  • Die vorliegende Erfindung ist nicht auf das natürlich vorkommende Fructosyltransferase sacB beschränkt, sondern kann ebenso gut durch Verwendung von modifizierten Formen davon ausgeführt werden. Die Modifikationen können die Aktivität der Fructosyltransferasen auf eine solche Weise beeinflussen, daß z. B. der Polymerisationsgrad oder die Struktur des erzeugten Fructans verändert wird.
  • Die induzierte Akkumulation der Fructane in den transgenen Pflanzen unter Verwendung des oben beschriebenen Prinzips wird für die Extraktion der Fructane aus diesen Pflanzen zum Zweck der Fructanproduktion sorgen. Fructane können in diesen Pflanzen z. B. in erntefähigen Organen wie wurzeln, Rüben, Blättern, Stengeln, Knollen, Früchten und Samen akkumuliert werden.
  • Genetisch modifizierte Feldfruchtpflanzen, die die oben bezeichneten, Fructosyltransferase-kodierenden Konstrukte in sich eingeschlossen haben, werden für die effiziente Produktion eines für den Menschen nützlichen Kohlenhydratpolymers von hoher Qualität sorgen.
  • Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, welches Pflanzen mit neuen biosynthetischen Fähigkeiten liefert, die diese zum Erzeugen und Akkumulieren von Fructan befähigen. Solche Pflanzen besitzen aufgrund veränderter Senke/Quelle-Beziehungen und Ausbeuten eine verbesserte Leistungsfähigkeit bzw. eine verbesserte Leistungsfähigkeit unter abiotischen und biotischen Belastungen. Solche Belastungen schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, Dürre, Licht, Temperaturen, Krankheiten und Schädlinge ein. Eine verbesserte Leistungsfähigkeit unter normalen oder Belastungsbedingungen schließen ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: einen höheren Trockenstoffgehalt, besseren Geschmack oder bessere Speicherfähigkeit, verbesserten Ernährungswert etc. Solche Pflanzen können geeigneterweise als Rohmaterial zur Fructanproduktion verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Samen, Ableger, Knollen, Zwiebeln oder anderen Teilen der transgenen Pflanzen, die zur fortlaufenden Produktion von weiteren Generationen der Pflanzen nützlich sind.
  • Die Fructane, die unter Verwendung der transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung erzeugt wurden, können in unterschiedlichen Ernährungs- und Nichternährungs-Anwendungen verwendet werden. Beispiele schließen, ohne darauf beschränkt zu sein, menschliche und tierische Ernährungsprodukte, die Herstellung von Fructosesirups, die Herstellung von Chemikalien und Kunststoffen entweder unverändert oder in modifizierter Form ein.
  • Die beigefügten Figuren veranschaulichen die vorliegende Erfindung:
  • 1 ist eine Zusammenfassung der Konstrukte;
  • 2 zeigt die Konstruktion der Plasmide pPA2 und pPB1;
  • 3 zeigt die Konstruktion von 35S-cpy-sacB-NOS in einem Binärvektor (pKP);
  • 4 zeigt die Konstruktion von 35S-cpy-ftf-NOS in einem Binärvektor (pTP);
  • 5 zeigt die Konstruktion von 35S-pr-s-sacB-NOS in einem Binärvektor (pKT);
  • 6 zeigt die Konstruktion von 35S-pr-s-ftf-NOS in einem Binärvektor (pTT);
  • 7 zeigt die Konstruktion von 35S-sacB-NOS in einem Binärvektor (pKZ);
  • 8 zeigt die Konstruktion von 35S-ftf-NOS in einem Binärvektor (pTZ); und
  • 9 ist ein Beispiel einer Säure-Teilhydrolyse von Fructan, welches aus einer transgenen KP-Tabakpflanze isoliert wurde. Dieses Teilhydrolysemuster ist identisch mit dem von Fructanen, die durch Bacillus subtilis erzeugt wurde. F = Fructose, S = Sucrose (Disacharid), I = 1-Kestose (Trisacharid), DP4, 5 und 6 = Tetra-, Penta-, bzw. Hexasacharide, H = Helianthus tuberosus-Knollenextrakt, welches als Standard verwendet wurde.
  • Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen erläutert, die in keiner Weise den Umfang der vorliegenden Erfindung begrenzen sollen.
  • Beispiel 1
  • Expression des sacB-Gens in der Vakuole
  • 1. Selektion der zu verwendenden Gene
  • Zum Schaffen von Fructan-produzierenden, transgenen Pflanzen wurden Gene selektiert, die für Proteine codieren, welche zum Produzieren von Fructanen in der Lage sind. Eines dieser Gene, Levansucrase, welches durch das sacB-Gen von Bacillus subtilis codiert wird (M. Steinmetz et al. Mol. Gen. Genetic. 200: 220-228 (1985)), wurde verwendet. Dieses Enzym produziert in Gegenwart von Sucrose hauptsächlich verzweigte Fructane vom (2-6)-Verknüpfungstyp.
  • Da Sucrose in Pflanzenzellen in den Vakuolen akkumulieren kann, ist dies ein bevorzugter Ort zur Fructanproduktion. Zum Leiten der Levansucrase zu der Vakuole wurde die Zielregion der Carboxypeptidase Y (L.A. Valls et al. Cell 48, 887-897 (1987)) ausgewählt.
  • 2. Konstruktion von 35S-cpy-sacB-NOS in einem Binärvektor (pKP)
  • Das Plasmid pLS 302 ist durch M. Steinmetz et al., s. oben, beschrieben worden. Das Levansucrase-(sacB-)Gen wurde aus diesem Plasmid als einem BamHI- und PstI-Fragment in die Vielfach-Klonierstelle von pEMBL9 (L. Dente et al. Nucleic Acids Res. 11, 1645-1655 (1983)) in den entsprechenden BamHI- und PstI-Stellen kloniert, was zum Plasmid pKA16 führt. Allgemeine DNA-Kloniermethoden sind beschrieben worden (F. Sambrock et al. Cold Spring Harbour, NY, Cold Spring Harbour Laboratory (1989)).
  • Zum Schaffen einer NcoI-Stelle in der Nähe der Reifungsprozessierstelle des Lawansucrasegens an der Nukleotidposition 550 (N. Steinmetz et al., s. oben) wurde eine stellenspezifische Mutagenese, wie durch W. Kramer et al. beschrieben (Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)), mit dem folgenden Olegonukleotid 5'-GCAACTCAAGCCATGGCGAAAGAACG-3' ausgeführt, was zum Plasmid pKD22 führt.
  • An der Aminosäureposition -2 in Bezug auf die Reifungsprozessierstelle (Nukleotidposition 544) wurde dadurch ein Phenylalanin in ein Methionin umgewandelt. Das NcoI-PstI-Fragment, in dem die das reife Levansucraseprotein codierende Sequenz vorliegt, wurde zur weiteren Klonierung verwendet.
  • Das Plasmid pTS3, welches das Carboxidpeptidase Y-(cpy-)Gen enthält, ist durch L.A. Valls et al. beschrieben worden, s. oben.
  • Der erste Teil des cpy-Gens wurde aus diesem Plasmid als einem ClaI (-695)- und BamHI (462)-Fragment in die Vielfachklonierstelle von pEMBLs (L. Dente et al., s. oben) in die entsprechende AccI- und BamHI-Stelle kloniert, was zum Plasmid pCA1 führte.
  • Zum Schaffen einer NcoI-Stelle in der Nähe der Reifungsprozessierstelle stromabwärts der vakuolären Zielsequenzen des cPY-Gens bei der Nukleotidposition 330 (L. A. Valls et al., s. oben) wurde eine stellenspezifische Mutagenese wie durch W. Kramer et al. (s. oben) ausgeführt mit dem folgenden Olegionoglutid: 5'-CGTGTCAACAAGACCATGGACCCTAA-3'. Das resultierende Plasmid pCB50 enthält den ersten Teil des cpy-Gens mit einer NcoI-Stelle an der Reifungsprozessierstelle. An der Aminosäureposition +2 in Bezug auf die Reifungsprozessierstelle an der Nukleotidposition 334 wurde ein Isolencin durch ein Threonin ersetzt. An der Aminosäureposition +3 in Bezug auf die Reifeprozessierstelle, bei der Nukleotidposition 337 wurde ein Lysin durch ein Methionin ersetzt. Das HindIII-NcoI-Fragment, in dem die Sequenz vorliegt, die für den vakuolären Zielrichtungsteil des Carboxypeptidase-Y-Proteins codiert, wurde zur weiteren Klonierung verwendet.
  • Diese vakuoläre Zielrichtungssequenz des cPY-Gens wurde unter Verwendung einer Dreipunktligation (J. Sambrock et al., s. oben) mit der reifen Sequenz des Levansucrasegens fusioniert.
  • Die nachfolgenden Fragmente wurden in äquimolaren Konzentrationen verwendet: Das HindIII-NcoI-Fragment des cPY-Gens (welches die vakuoläre Zielrichtungssequenz codiert), das NcoI-PstI-Fragment des sacB-Gens und das Fragment, welches den Vektor von pEMNBL8 enthält, der mit HindIII und PstI verdaut wurde. Das resultierende Plasmid pKK3 codiert für das rahmenkonforme Konstrukt der Carboxypeptidase-Y-Levansucrase-Fusion. Der korrekte Leserahmen des Fusionsgens wurde mittels Sequenzanalyse bestätigt.
  • Das Plasmid pMOG18, welches einen pflanzenspezifischen 355-Promotor mit Enhancerverdopplung sowie Sequenzen, welche die Translation der mRNA verstärken, enthält, ist durch Simons et al., Bio/Technology 8, 217-221 (1990) beschrieben worden. Es enthält das 35S-Promotor/uidA-Gen/NOS-Terminator-Konstrukt. Ein pBluescript II SK (Stratagen, San Diego, CA), aus dem die innere BamHI-Stelle entfernt worden war, indem mit BamHI geschnitten und die überlappenden ("Sticky") Enden mittels Klenow aufgefüllt und religiert wurde, wurde für die weitere Klonierung verwendet. Das 35S-uidA-NOS-Fragment wurde erhalten durch Verdau mit EcoRI und HindIII von pMOG18 und wurde in diesen BamHI-pBluescript in die entsprechende EcoRI- und HindIII-Stelle kloniert, was zum Plasmid pPA2 führte. Dieses Plasmid wurde mit NcoI und BamHI verdaut, um das uidA-Gen zu entfernen. Der resultierende Vektor wurde mit der S1-Nuklease behandelt, um überhängende Enden zu entfernen, und dann dephosphoryliert. Aus diesem Plasmid pKK3 wurde das Fragment, welches die cpy-sacB-Funktion enthielt, mittels Verdau mit AccI und PstI isoliert. Diese Stellen wurden mittels Klenow stumpf gemacht. Diese zwei Fragmente wurden ligiert, was zum Plasmid pKM5 führte. Das pKM5 enthält das 35S-Promotor/cpy-sacB-Gen-Fusion/NOS-Terminator-Konstrukt.
  • Dieses Plasmid, pKM5, wurde zuerst mit XhoI verdaut und dann teilweise mit XbaI verdaut. Das Fragment, welches das komplette Konstrukt (35S-cPY-sacB-N05) enthielt, wurde in die XbaI- und XhoI-Stelle von pMOG23 (Simons et al., s. oben) kloniert, einem Derivat des binären Pflanzenvektors pBIN19 (M. Bevan, Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721), was zum Plasmid pKP führte.
  • 3. Transformation von Tabakpflanzen durch pKP
  • Das pKP-Plasmid wurde in einem dreifachelterlichen Übereinstimmungsvorfall unter Verwendung des Helferplasmids pRK2013 (S. T .Lam et al., Plasmid 13, 200-204 (1985)) in Acrobacterium tumephasciens LB4404 (A. Hoekema et al., Nature 303, 179-180 (1983)) eingebracht. Das Konstrukt wurde in Nicotiana tabacum, Sorte Petit Havanna (SR1), unter Verwendung der Blätterscheibentransformationsmethode (R. B. Horsch et al., Science 227, 1229-1232 (1985)) eingeführt. Regenerierte Pflanzen mit Namen KP-Pflanzen wurden auf Kanamycinresistenz selektiert und auf MS-Medium (Murashige und Skook, Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962)), welches Glucose anstatt Sucrose enthielt, wachsen gelassen. Danach wurden die Pflanzen im Gewächshaus auf dem Boden gewachsen gelassen und analysiert.
  • 4. Analyse der KP-Pflanzen
  • Pflanzen wurden im Gewächshaus wachsen gelassen, und Blättermaterial wurde abgeschnitten und in einem Eppendorfgefäfl zerkleinert. Im Anschluß an die Zentrifugation (2x 16000 Upm) wurde lμ1 des Überstands auf Dünnschichtchromatographie (TLC; A. J. Cairns und C. J. Pollock, New Phytol. 109, 399-405 (1988)) aufgebracht. Die TLC wurde dreimal in 85 : 15 Aceton:Wasser entwickelt und dann mit Harnstoffspray wie beschrieben behandelt (C. S. Wyse et al., Analytical Chemistry 27, 33-36 (1955)). Diese Methode färbt vornehmlich Fructose und Fructose-enthaltende Polymere an.
  • Fructosepolymere wurden weder in nicht-transformierten Pflanzen noch in Pflanzen, die mit unverwandten Konstrukten transformiert waren, detektiert.
  • Das Durchtesten der Transformanten unter Verwendung dieser Methode zeigte eine extensive Akkumulation an Fructanen in diesen Pflanzen. Die Fructanexpressionsspiegel unterschieden sich zwischen einzelnen Pflanzen, die mit demselben Konstrukt transformiert waren, wie es bei Pflanzentransformationsexperimenten normalerweise gefunden wird. Diese Variation der Expressionsspiegel hängt hauptsächlich von der Integrationsstelle im Genom ab (Positionseffekt).
  • Die in diesen Pflanzen akkumulierenden Fructane wurden weiter durch Isolierung von größeren Mengen studiert (D. A. Livingstone III, Plant. Physiol. 92, 767-769 (1990)). Dieses Fructan wurde durch Größeneinteilung auf einer FPLC-Superose 6HR 10/30-Säule (Pharmacia) analysiert, und Fructane wurden im Ausschlußvolumen detektiert, was ein Polymerisationsgrad von >25000 Fructoseeinheiten anzeigt. Fructan, welches durch die Levansucrase von Bacillus subtilis erzeugt wird, elutiert ähnlich im Ausschlußvolumen der Superose-Säule.
  • Teilweiser Fructanabbau mittels Säureabbau (siehe 9) zeigt ein charakteristisches Muster von Hydrolyseprodukten. Die gereinigten Pflanzen- und bakteriellen Fructane zeigen auf TLC identische Abbaumuster. Vollständige Säurehydrolyse, gefolgt von einer HPLC-Analyse auf einer Aminex HPX87C-Säule (Biorad) bei 85°C unter Verwendung von Wasser als Elotionsmittel, zeigt, daß dieses Fructan aus Fructose zusammengesetzt ist.
  • Die gereinigten Fructane wurden ebenso mittels Protonen-NMR analysiert. Fructan, welches aus transgenen Pflanzen isoliert wurde, zeigte keine Unterschiede im Kurven-(Peak-)Muster im Vergleich zu Fructan, welches durch Levansucrase aus Bacillus subtilis synthetisiert wurde.
  • Wir haben keinerlei Fructan hydrolisierende Aktivität in vielen Pflanzenarten (Tabak, Zuckerrübe, Tomate, Kartoffel) gefunden. Wenn Pflanzenproteinextrakte mit Fructan für längere Zeitperioden in Phosphat/Citrat-Puffer bei pH 5,0 inkubiert werden, wird keine Fructose freigesetzt.
  • Beim Altern bleiben die Pflanzenfructane in den transgenen Pflanzen vorliegen, was die Stabilität bestätigt, die mit Proteinextrakten gesehen wird. Fructane akkumulieren in der gesamten Pflanze, was in Übereinstimmung ist mit der unspezifischen 355-Promotoraktivität in transgenen Pflanzen.
  • Transgene Pflanzen bringen das Saatgut ganz normal. Die Saatkeimung ist identisch zu nichtransformierten Pflanzen, und das Konstrukt wird stabil auf nachfolgende Generationen vererbt, die auf ähnliche Weise Fructane produzieren.
  • Beispiel 2
  • Expression des ftf-Gens in der Vakuole
  • 1. Selektion der Gene
  • Zum Schaffen von Fructan produzierenden Pflanzen wurden Gene selektiert, die für Proteine codieren, welche zur Produktion von Fructanen in der Lage sind. Ein anderes Gen, die durch das ftf-Gen von Streptococcus mutans codiert wird (T. Shiroza und E. K. Kuramizu, J. Bacteriol. 170, 810-816 (1988)), wurde verwendet. Dieses Enzym produziert in Gegenwart von Sucrose hauptsächlich verzweigte Fructane vom Typ der (2-1)-Verknüpfung. Da Sucrose in Pflanzenzellen in Vakuolen akkumulieren kann, ist dies ein bevorzugter Ort zur Fructanakkumulation. Ein Gen, welches für ein Protein codiert, welches bereits selbst zur Zielsetzung auf die Vakuole in der Lage ist, wurde selektiert: Carboxypeptidase Y (L. A. Valls et al., s. oben). Aus diesem Gen wurden die Signalsequenz und die vakuoläre Zielsequenz verwendet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
  • 2. Konstruktion von 35S-cpy-ftf-NOS in einem binären Vektor (pTP)
  • Das Plasmid pTS102 ist von T. Shiroza und K. K. Kuramizu (s. oben) beschrieben worden. Das Fructosyltransferase-(ftf-)Gen wurde aus diesem Plasmid als einem EcoRV- und BglII-Fragment in die Mehrfachklonierstelle von pEMBL9 (L. Dente et al., s. oben) in die kompatiblen SmaI- und BamHI-Stellen kloniert, was zum Plasmid pTA12 führte.
  • Zum Schaffen einer NcoI-Stelle in der Nähe der Prozessierstellen zur Reifung des ftf-Gens (Nukleotidposition 783 (T. Shiroza und H. K. Kuramiza (s. oben)) wurde eine ortsspezifische Mutagenese wie von W. Kramer et al. (s. oben) beschrieben mit dem nachfolgenden Oligonucleotid ausgeführt: 5'-GGCTCTCTTCTGTTCCATGGCAGATGAAGC-3', was zum Plasmid pTD2 führte.
  • Bei der Aminosäureposition +1 (Nukleotidposition 783), bezogen auf die Prozessierstelle zur Reifung, wurde dadurch ein Glutamin in ein Methionin verwandelt. Das NcoI-PstI-Fragment, in welchem die Sequenz vorliegt, die für das reife Fructosyltransferaseprotein codiert, wurde für die weitere Klonierung verwendet.
  • Aus dem Plasmid pCB50 (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurde das HindIII-NcoI-Fragment, in welchem die Sequenz vorliegt, die für den vakuolären Zielbestandteil des Carboxypeptidase Y-Proteins codiert, wurde zum weiteren Klonieren verwendet.
  • Die vakuoläre Zielsequenz des cpy-Gens wurde mit der reifen Sequenz des Fructosyltransferasegens unter Verwendung der Dreipunktligation (J. Sambrock et al, s. oben) fusioniert. Die folgenden Fragmente wurden in äquimolaren Konzentrationen verwendet.
  • Das HindIII-NcoI-Fragment des cpy-Gens (welches für die vakuoläre Zielsequenz codiert), das NcoI-PstI-Fragment des ftf-Gens und das Fragment, welches den Vektor pEMBL8 enthielt, welcher mit HindIII und PstI verdaut wurde. Das resultierende Plasmid pTK1 codiert für das rahmenkonforme Konstrukt der Carboxypeptidase Y/Fructosyltransferase-Fusion: Die Fusion liegt im richtigen Leserahmen vor, was mittels Sequenzanalyse bestätigt wurde.
  • Das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pPA2 wurde mit NcoI und BamHI verdaut, um das uidA-Gen zu entfernen. Der resultierende Vektor wurde mit der S1-nuklease behandelt, um überhängende Enden zu entfernen, und wurde dann dephosphoryliert. Aus dem Plasmid pTK1 wurde das Fragment, welches die cpy-ftf-Fusion enthielt, mittels Verdau mit AccI und PftI isoliert. Diese Stellen wurden mittels Klenow glatt gemacht. Diese zwei Fragmente wurden ligiert, was zum Plasmid pTM4 führte. Das pTM4 enthielt das 35S-Promotor/cpy-ftf-Gen-Fusion/NOS-Terminator-Konstrukt.
  • Dieses pTM4 wurde mit XhoI verdaut und dann teilweise mit XbaI verdaut. Das Fragment, welches das komplette Konstrukt (35S-cpyftf-NOS) enthielt, wurde in die XbaI-und HindIII-Stelle von PMOG23 kloniert (Simons et al., s. oben), einem Derivat des binären Pflanzenvektors pBIN19 (M. Bevan, s. oben), was zum Plasmid pTp führte.
  • Transgene Pflanzen mit der Bezeichnung TP-Pflanzen, die das beschriebene Konstrukt enthielten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben erzeugt.
  • 3. Analyse der TP-Pflanzen
  • Eine Durchsatzüberprüfung der Transformanten unter Verwendung der TLC-Methode wie im Beispiel 1 zeigte eine Akkumulation von Fructan mit der normalen Variation aufgrund des Positionseffekts.
  • Die in diesen Pflanzen akkumulierenden Fructane wurden weiter durch Isolierung von größeren Mengen studiert (D. A. Livingstone III, s. oben). Dieses Fructan wurde mittels Größeneinteilung auf einer FPLC-Superose-6HR-10/30-Säule (Pharmacia) analysiert, und Fructane wurden im Ausschlußvolumen detektiert, was ein Polymerisationsgrad von >25000 Fructoseeinheiten anzeigte. Fructan, welches durch die Streptococcus mutans-Fructosyltransferase pro duziert wurde, elutiert ähnlich im Ausschlußvolumen der Superosesäule. Ein teilweiser Fructanverdau durch Säureabbau zeigte ähnlich ein charakteristisches Muster von Hydrolyseprodukten. Die Pflanze und die bakteriellen Fructane zeigen gereinigt identische Abbaumuster auf TLC. Eine vollständige Säurehydrolyse, gefolgt von einer HPLC-Analyse auf einer Aminex HPX87C-Säule bei 85°C unter Verwendung von Wasser als Elusionsmittel, zeigt, daß dieses Fructan aus Fructose zusammengesetzt ist.
  • Wie im Beispiel 1 enthalten noch gealterte Pflanzen Fructane. Auf ähnliche Weise sind Samen fruchtbar, und die Fructanproduktionseigenschaft wird auf nachfolgende Generationen vererbt.
  • Beispiel 3
  • Expression von sacB im Apoplasten
  • 1. Selektion der Gene
  • Zum Schaffen von Pflanzen, die Fructane produzieren, wurden Gene selektiert, die für Proteine codieren, welche zum Produzieren von Fructanen in der Lage sind. Eines dieser Gene, Levansucrase, welches durch das sacB-Gen (N. Steinmetz et al., s. oben) codiert wird und im Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde verwendet.
  • Da Sucrose in Tabakpflanzen durch den Apoplasten zu dem Phloem transportiert wird, ist ebenso der interzelluläre Raum (Apoplast) ein bevorzugter Ort zur Fructanakkumulation. Ein Gen, welches für ein Protein codiert, das selbst zur Zielausrichtung auf den Apoplasten in der Lage ist, wurde selektiert: das Pathogenese-verwandte Protein S, das durch das pr-s-Gen codiert wird (B. J. C. Cornelissen et al., Nature 221, 531-532 (1986)). Aus diesem Gen wurde die Exportsignalsequenz verwendet.
  • 2. Konstruktion von 35S/pr-s-sacB/NOS im binären Vektor (pKT)
  • Das Plasmid pMG29 ist durch J. Pen et al. (Bio/Technology 10, 292-296 (1992)) beschrieben worden. Das Phatogenese-verwandte Protein S-(pr-s)-Gen (B. J. C. Cornelisen et al., s. oben; J. A. L. Van Kan et al. Plant. Mol. Biol. 12, 153-155 (1989)) besitzt eine Signalsequenz, die Proteine zielgerichtet zum interzellulären Raum lenken kann, dem Apoplasten (J. Pen et al., s. oben). Das Plasmid pMOG29 enthält das 35S-Promotor/pr-s-Sequenz/NOS-Terminator-Konstrukt. Ein pBlueskriptII SK (Stratgen), aus dem die innere BamHI-Stelle entfernt wurde, indem mit BamHI gespalten und mittels Klenov die überhängenden (sticky) Enden gefüllt wurden und religiert wurde, wurde zum weiteren Klonieren verwendet.
  • Das 35S-Promotor/pr-s-Sequenz/N0S-Terminator-Konstrukt wurde erhalten durch Verdau von pMOG29 mit EcoRI und HindIII und wurde in diesem pBlueskript in die entsprechende EcoRI- und HindIII-Stelle kloniert, was zum Plasmid pPB1 führte. Das Plasmid pPB1 wurde mit BamHI verdaut, und überhängende Enden wurden mit Klenow gefüllt. Aus dem Plasmid pKK3 (Beispiel 1) wurde das sacB-Gen mittels Verdau mit NcoI und PstI isoliert. Diese Stellen wurden mit Klenow glatt gemacht. Eine Ligation mit glatten Enden wurde ausgeführt, was zum Plasmid pKR führte. Das Plasmid pKR codiert für das rahmenkonforme Konstrukt der pr-s-Levansucrase-Fusion. Die Fusion liegt im richtigen Leserahmen vor, was mittels Sequenzanalyse bestätigt wurde. Das Konstrukt codiert für die folgende Aminosäuresequenz: MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHARAS, gefolgt von der Levansucrase-Proteinsequenz, mit Methionin beginnend, Alanin und dem Rest des reifen Levansucraseproteins (M. Steinmetz et al., s. oben). Dieses Konstrukt wurde mit XbaI verdaut und dann mit XhoI teilweise verdaut. Das Fragment, welches das komplette Konstrukt (35S/pr-s-sacB/NOS) enthielt, wurde in die XbaI- und XhoI-Stellen von pMOG23 kloniert (Simons et al., s. oben), einem Derivat des binären Pflanzenvektors pBIN19 (N. Bevan, s. oben), was zum Plasmid pKT führte.
  • Transgene Pflanzen, als KT-Pflanzen bezeichnet, die das beschriebene Konstrukt enthielten, wurden wie im Beispiel 1 beschrieben erzeugt.
  • 3. Analyse der KT-Pflanzen
  • Die Durchsatzüberprüfung der Transformanten unter Verwendung der TLC-Methode wie im Beispiel 1 zeigte eine Akkumulation von Fructan mit der normalen Variation aufgrund des Positionseffekts.
  • Die Fructane, die in diesem Pflanzen akkumulierten, wurden weiter studiert mittels Isolierung von größeren Mengen (D. A. Livingstone III, s. oben). Superose-Chromatographiedaten und voll-ständige Säurehydrolyse, gefolgt von einer HPLC-Analyse wie im Beispiel 1, zeigen, daß dieses Fructan von hohem Molekulargewicht ist und aus Fructose zusammengesetzt ist.
  • Wie im Beispiel 1 enthalten noch gealterte Pflanzen Fructane. Ganz ähnlich sind Samen fruchtbar, und die Fructanproduktionseigenschaft wird auf nachfolgende Generationen vererbt.
  • Beispiel 4
  • Expression des ftf-Gens im Apoplasten
  • 1. Selektion der Gene
  • Zum Schaffen von Fructane produzierenden Pflanzen wurden Gene selektiert, die für Proteine codieren, die zum Produzieren von Fructanen in der Lage sind. Ein anderes Gen, Fructosyltransferase, die durch das ftf-Gen codiert wird (T. Shiroza und H. K. Kuramizu et al., s. oben) und in Beispiel 2 vorgestellt wurde, wurde verwendet. Da Sucrose in Tabakpflanzen durch den Apoplasten zum Phloem transportiert wird, ist ebenso der interzelluläre Raum (Apoplast) ein bevorzugter Ort zur Fructanakkumulation. Ein Gen, welches für ein Protein codiert, das selbst zur Zielrausrichtung auf den Apoplasten in der Lage ist, wurde se lektiert: das Pathogenese-verwandte Protein S, welches durch das pr-s-Gen codiert wird (B. J. C. Cornelissen et al. s. oben). Aus diesem Gen wurde die Signalsequenz verwendet.
  • 2. Konstruktion von 35S/ r-s-ftf/NOS in einem binären Vektor (pTT)
  • Das Plasmid pPB1 (Beispiel 3) wurde mit BamHI verdaut, und überhängende Enden wurden mit Klenow gefüllt. Aus dem Plasmid pTK1 (Beispiel 2) wurde das ftf-Gen isoliert durch Verdau mit NcoI und PstI. Diese Stellen wurden mit Klenow glatt gemacht. Eine Ligation glatter Enden wurde ausgeführt, was zum Plasmid pTR führte. Das Plasmid pTR codiert für das rahmenkonforme Konstrukt der pr-s-Fructosyltransferase-Fusion. Die Fusion liegt im richtigen Leserahmen vor, was mittels Sequenzanalyse bestätigt wurde. Das Konstrukt codiert für die nachfolgende Aminosäuresequenz: MNFLKSFPFYAFLCFGQYFVAVTHARAS und die mit Methionin beginnenden Fructosyltransferaseproteinsequenz der reifen Fructosyltransferase (T. Shiroza, s. oben).
  • Dieses Konstrukt wurde mit XbaI und HindIII verdaut. Das Fragment, welches das vollständige Konstrukt (35S/pr-s-ftf/NOS) enthielt, wurde in die XbaI- und HindIII-Stelle von pMG023 kloniert (Simons et al., s. oben), einem Derivat des binären Pflanzenvektors pBIN19 (M. Bewan, s. oben), was zum Plasmid pTT führte.
  • Transgene Pflanzen, als TT-Pflanzen bezeichnet, die das beschriebene Konstrukt enthielten, wurden wie im Beispiel 1 beschrieben erzeugt.
  • 3. Analyse der TT-Pflanzen
  • Die Durchsatzprüfung der Transformanten unter Verwendung der TLC-Methode wie im Beispiel 1 zeigte eine Akkumulation von Fructan mit der normalen Variation aufgrund des Positionseffekts.
  • Die Fructane, die in diesen Pflanzen akkumulierten, wurden weiter studiert mittels Isolierung größerer Mengen (D. A. Livingstone III, s. oben). Superose-Chromatographiedaten und voll-ständige Säurehydrolyse, gefolgt von einer HPLC-Analyse wie im Beispiel 1, zeigte, daß dieses Fructan von hohem Molekulargewicht ist und aus Fructose zusammengesetzt ist.
  • Wie im Beispiel 1 enthielten noch gealterte Pflanzen Fructane. Ähnlich sind Samen fruchtbar, und die Fructanproduktionseigenschaft wird auf nachfolgende Generationen vererbt.
  • Beispiel 5
  • Expression von sacB im Cytoplasma
  • 1. Selektion der Gene
  • Zum Schaffen von Fructane produzierten Pflanzen wurden Gene selektioniert, die für Proteine codierten, die zum Produzieren von Fructanen in der Lage sind. Eines dieser Gene, Levansucrase, die durch das sacB-Gen codiert wird (N. Steinmetz et al., s. oben) und im Beispiel 1 beschrieben wurde, wurde verwendet.
  • Da Sucrose in Pflanzenzellen im Cytoplasma synthetisiert wird, ist das Cytoplasma ein bevorzugter Ort zur Fructanakkumulation. Da Kern-codierte Proteine im Cytoplasma gebildet werden, wird keine Zielsequenz benötigt.
  • 2. Konstruktion von 35S-sacB-NOS in einem binären Vektor (pKZ)
  • Das Plasmid pPA2 (Beispiel 1) wurde mit NcoI und BamHI verdaut, und das Vektor-enthaltende Fragment wurde isoliert. Aus dem Plasmid pKK3 (Beispiel 1) wurde das sacB-Gen als einem NcoI- und BamHI-Fragment isoliert. Beide Fragmente wurde ligiert, was zum Plasmid pKX führte. Das resultierende Plasmid pKX codiert für das Konstrukt von reifer Levansucrase. Das Konstrukt ist richtig, was mittels Sequenzanalyse bestätigt wurde.
  • Dieses Konstrukt wurde mit XbaI und XhoI verdaut. Das Fragment, welches das komplette Konstrukt (35S-sacB-NOS) enthielt, wurde in die XbaI- und XhoI-Stelle von pMOG23 (Simons et al. s. oben) kloniert, einem Derivat des binären Pflanzenvektors pBIN19 (M. Bevan, s. oben), was zum Plasmid pKZ führte.
  • Transgene Pflanzen, als KT-Pflanzen bezeichnet, die das beschriebene Konstrukt enthielten, wurden wie im Beispiel 1 beschrieben erzeugt.
  • 3. Analyse der KT-Pflanzen
  • Eine Durchsatzprüfung der Transformanten unter Verwendung der TLC-Methode wie im Beispiel 1 zeigte eine Akkumulation von Fructan mit der normalen Variation aufgrund des Positionseffekts.
  • Die in diesen Pflanzen akkumulierenden Fructane wurden weiter studiert mittels Isolierung größerer Mengen (D. A. Livingstone III, s. oben). Superose-Chromatographiedaten und vollständige Säurehydrolyse, gefolgt von einer HPLC-Analyse wie im Beispiel 1, zeigten, daß dieses Fructan von hohem Molekulargewicht ist und aus Fructose zusammengesetzt ist.
  • Wie in Beispiel 1 enthielten noch gealterte Pflanzen Fructane. Ähnlich sind Samen fruchtbar, und die Fructanproduktionseigenschaft wird auf nachfolgende Generationen vererbt.
  • Beispiel 6
  • Expression des ftf-Gens im Cytoplasma
  • 1. Selektion der Gene
  • Zum Schaffen von Fructane produzierenden Pflanzen wurden Gene selektiert, die für Proteine codieren, welche zur Produktion von Fructanen in der Lage sind. Ein anderes Gen, Fructosyltransferase, die durch das ftf-Gen codiert wird (T. Shiroza und H. K. Kuramizu, s. oben) und im Beispiel 2 vorgestellt wurde, wurde verwendet. Da Sucrose in Pflanzenzellen im Zytoplasma synthetisiert wird, ist das Cytoplasma ein bevorzugter Ort zur Fructanakkumulation. Da Kern-codierende Proteine im Cytoplasma gebildet werden, ist keine Zielsequenz nötig.
  • 2. Konstruktion von 35S-ftf-NOS in einem binären Vektor (pTZ)
  • Das Plasmid pPA2 (Beispiel 1) wurde mit NcoI und BamHI verdaut, und das Vektor-enthaltende Fragment wurde isoliert. Aus dem Plasmid pTK1 (Beispiel 2) wurde das ftf-Gen als einem NcoI und BamHI-Fragment isoliert. Dann wurden beide Fragmente ligiert, was zum Plasmid pTX führte. Das resultierende Plasmid pTX codiert für das Konstrukt der reifen Fructosyltransferase. Das Konstrukt ist korrekt, was mittels Sequenzanalyse bestätigt wurde.
  • Dieses Konstrukt wurde mit XbaI und HindIII verdaut. Das Fragment, welches das komplette Konstrukt (355-ftf-NOS) enthielt, wurde in die XbaI- und HindIII-Stelle von pMOG23 (Simons et al., s. oben) kloniert, einem Derivat des binären Pflanzenvektors pBIN19 (M. Bevan, s. oben), was zum Plasmid pTZ führte.
  • Transgene Pflanzen, als TZ-Pflanzen bezeichnet, die das beschriebene Konstrukt enthielten, wurden wie im Beispiel 1 beschrieben erzeugt.
  • 3. Analyse der TZ-Pflanzen
  • Die Durchsatzprüfung der Transformanten unter Verwendung der TLC-Methode wie im Beispiel 1 zeigte die Akkumulation von Fructan mit der normalen Variation aufgrund des Positionseffekts.
  • Die in diesen Pflanzen akkumulierenden Fructane wurden weiter studiert durch Isolation größerer Mengen (D. A. Livingstone III, s. oben). Superose-Chromatographiedaten und vollständige Säurehynolyse, gefolgt von einer HPLC-Analyse wie im Beispiel 1, zeigten, daß dieses Fructan von hohem Molekulargewicht ist und aus Fructose zusammengesetzt ist.
  • Wie im Beispiel 1 enthielten noch gealterte Pflanzen Fructane. Auf ähnliche Weise sind Samen fruchtbar, und die Fructanproduktionseigenschaft wird auf nachfolgende Generationen vererbt.
  • Beispiel 7
  • Erworbene Eigenschaften von transgenen Tabakpflanzen, die Fructosyltransferase-Konstrukte tragen
  • 1. Allgemeine Eigenschaften
  • Die transgenen Tabakpflanzenlinien, die die unterschiedlichen, in den Beispielen 1 bis 6 beschriebenen Fructosyltransferase-Konstrukte trugen, akkumulieren alle Fructanmoleküle. Der Grad an Fructanakkumulation war unter einzelnen Transformanten unterschiedlich, wahrscheinlich aufgrund der Wirkung der Integrationsstelle des Transgens auf die Genexpression (Posisionseffekt) und wegen der verwendeten sechs unterschiedlichen Konstrukte. Unter Anwendung der Southern-Hybridisierungsanalyse (Sambrock et al., s. oben) wurde die Anzahl der in die einzelnen Pflanzengenome integrierten DNA-Kopien bestimmt. Die Anzahl der integrierten Kopien variierte zwischen 1 und 8, jedoch enthielten die meisten Pflanzen nur eine oder zwei Kopien des Konstrukts. Der Polymerisationsgrad der Fructane beträgt bis 25000 oder mehr Fructoseeinheiten. Fructane werden in allen getesteten Organenakkumuliert, einschließlich Blätter, Stengel, Wurzel und den Samen. Die Eigenschaft wurde auf die Nachkommen nach Mendelscher Art übertragen.
  • Die Identität der Fructane wurde mittels Größenanordnung, Hydrolyse und durch Protonen-Kernmagnetresonanzspektroskopie wie in den obigen Beispielen beschrieben bestätigt. Zusätzlich reagierten Antikörper, die gegen Fructofuranosyl-Verknüpfungen gerichtet waren (B. Hall et al. 1990, Mol. Immunology 27: 351-361; B. Hall et al. 1992, The Journal of Immunology 149: 1605-1612), mit den in den transgenen Pflanzen erzeugten Fructanen. Für diese Untersuchung wurden Fructane auf Nitrocellulose-Filterpapier aufgetragen und durch eine 15-minütige Behandlung bei 120°C immobilisiert. Die Filter wurden mit dem spezifischen Maus-Antikörper (Hall et al., s. oben) inkubiert, und die Bindung der Antikörper an das Fructan wurde mit einer Alkalischen Phosphatase detektiert, die mit Ziegen-Sekundärantikörper konjugiert war, welcher gegen die nicht-spezifischen Teile des Maus-Antikörpers gerichtet war.
  • Fructane liegen über den gesamten Lebenszyklus der Pflanze hinweg vor. Sobald es synthetisiert wird, ist das Fructan stabil. Wenn es überhaupt einen Fructan-Turnover gibt, so wird dessen Ausmaß sehr gering sein. In gealterten, entwässerten Blättern liegen Fructane nach wie vor in Mengen vor, die mit den Niveaus in reifen Blättern vergleichbar sind. Der Fructangehalt in den transgenen Tabakpflanzen liegt im Bereich von 3 bis 8% des Trockengewichts bei reifen Blättern. Die Spiegel von anderen löslichen Kohlehydraten (Glucose, Sucrose und Fructose) wurden unter Verwendung der HPLC-Chromatographie wie beschrieben quantifiziert und wurden als vergleichbar mit nicht-transformierten Wildtyp-Pflanzen befunden.
  • 2. Phenotypische Charakterisierung
  • Unter normalen Wachstumsbedingungen wurde kein Unterschied im Wachstum oder der Morphologie zwischen den nicht-transformierten Tabakpflanzen-Kontrollen und den Fructan-akkumulierenden transgenen Pflanzen beobachtet, die das S. mutans-ftf-Gen in den, in den Beispielen 2, 4 und 6 erwähnten drei verschiedenen Konfigu rationen trugen (TP-, TZ- und TT-Linien). Dies trifft ebenso zu auf Pflanzen, die das B. subtilis-sacB-Gen, welches mit dem cpy-Zielsignal fusioniert war (KP-Pflanzen, Beispiel 1), trugen.
  • Pflanzen, die das B. subtilis-sacB-Gen im Cytoplasma oder dem Apoplasten exprimieren (KZ, KT, Beispiele 3 und 5) zeigen nekrotische Läsionen in reifen Blättern und Stengeln. Der Ernst des Phenotyps korreliert mit dem Niveau an akkumulierten Fructanen. Diese Pflanzen produzieren fruchtbare Samen.
  • Beispiel 8
  • Verstärkte Leistungsfähigkeit unter Streßbedingungen von transgenen Tabakpflanzen, die die Fructosyltransferase-Konstrukte tragen
  • Die Leistungsfähigkeit unter Belastungs- bzw. Streßbedingungen von repräsentativen, Fructan-akkumulierenden Tabaklinien, die das cpy-sacB-Konstrukt trugen (KP, Beispiel 1), wurde mit nichttransformierten Kontrollpflanzen verglichen.
  • 1. Dürrestreß
  • Dürrestreß wurde bei einer Reihe von Pflanzen durch die gesteuerte Zugabe von Polyethylenglycol mit einem mittleren Molekulargewicht von 10000 Dalton (PEG 10000) zu Pflanzen induziert, welche auf Vermiculit wuchsen. Eine Reihe von Dürrestreßgraden wurde bis auf 20% PEG 1000% durch Applikation von PEG-Lösungen induziert. Es wurden Frischgewicht und Trockengewicht sowie die Wachstumsgeschwindigkeit (in cm/Tag) bestimmt. Die Dürregestreßten, Fructan-akkumulierenden KP-Pflanzen wuchsen schneller und ergaben beträchtlich höhere Ausbeuten als ähnlich gestreßte, nicht-transformierte Pflanzen. Im Vergleich zu den ähnlich gestreßten, nicht-transformierten Pflanzen nahm in einem typischen Fall das Frischgewicht der transgenen KP-Pflanze zu bis auf 19% und beim Trockengewicht bis auf 32%.
  • 2. Lichtstreßbedingungen
  • Ausbeutecharakteristika unter suboptimalen Lichtbedingungen wurden zwischen repräsentativen transgenen KP-Pflanzen und nichttransformierten Pflanzen verglichen. Die unter geringem Licht (5000 Lux) wachsen gelassenen KP-Pflanzen wurden direkt mit (nicht-transformierten) Vergleichspflanzen verglichen. Die Fructan-akkumulierenden KP-Pflanzen wuchsen schneller und ergaben beträchtlich höhere Ausbeuten als nicht-transformierte Pflanzen. Sowohl das Frischgewicht als auch das Trockengewicht der KP-Pflanzen war um 18% höher als bei nicht-transformierten Pflanzen. Die KP-Pflanzen produzierten mehr Blätter als die nichttransformierten Pflanzen.
  • Starke Lichtintensitäten, insbesondere in Kombination mit suboptimalen Wachstumsbedingungen, führte bei den meisten Pflanzenarten ebenso zu ernsthaftem Streß. Die Fructan-akkumulierenden Pflanzen mögen unter solchen Bedingungen besser laufen als die nicht-transformierten Pflanzen. Zum Beispiel funktionieren Fructane als eine zusätzliche Kohlenhydratsenke und können auf diese Weise gegen licht-induzierte Schäden der Pflanzen schützen.
  • 3. Kältestreß
  • Wachstumscharakteristika von transgenen KP-Pflanzen und nichttransformierten Pflanzen wurden unter Kältestreßbedingungen verglichen. Beim wachsen unter einer gesteuerten Bedingung bei 12°C ergaben die KP-Pflanzen über 19% höhere Ausbeuten in Bezug auf Frischgewicht und Trockengewicht als nicht-transformierte Pflanzen.
  • Die unter 1), 2) und 3) bezeichneten Streßbedingungen induzierten eine mehr als 4-fache Erhöhung im Gehalt an Fructan in den transgenen KP-Pflanzen im Vergleich zu nicht-transformierten KP-Pflanzen. Die Akkumulation von Fructanen führt zu verbesserter Wachstumsfähigkeit, wobei das Ausmaß der Fructanakkumulation mit dem Ausmaß der Wachstumsverstärkung korreliert.
  • Die bessere Leistungsfähigkeit unter Streßbedingungen mag nicht auf die speziellen, unter 1), 2) und 3) gegebenen Beispiele beschränkt sein, sondern können in einem großen Umfang ungünstiger Umgebungsbedingungen auftreten. Die verbesserte Leistungsfähigkeit ist nicht auf erhöhte Wachstumsgeschwindigkeiten oder Erhöhungen im Frisch- und Trockengewicht beschränkt, sondern kann andere, ökonomisch wichtige physiologische Aspekte in Bezug auf Eigenschaften sowohl vor als auch nach der Ernte einschließen.
  • Zusätzlich zur verbesserten Leistungsfähigkeit unter abiotischem Druck bzw. Streß können die Fructan-akkumulierenden Pflanzen auch mit verstärkter Resistenz gegen biotische Belastungs- bzw. Streßbedingungen ausstatten, etwa gegen Krankheiten und Schädlinge (Farrarin: Pests and Pathogens: Plant Response to Fholiar Attack, S. 107-127, Hrsg. P. G. Ayres, BIOS-Publishers 1992). Die Fructanakkumulation kann zu metabolischen oder strukturellen Veränderungen führen, was zu verminderter Empfindlichkeit gegenüber Krankheiten und Schädlingen führt. Beispiele solcher Veränderungen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Änderungen in der Verdaubarkeit, der Textur, des Geschmacks und veränderter Spiegel an anderen primären und sekundären, metabolischen Pflanzenprodukten.
  • Pflanzen mit natürlichen oder induziert-modifzierten Kohlenhydratverteilungsmustern können bevorzugte Ziele zur verbesserten Leistungsfähigkeit unter Streßbedingungen sein, zum Beispiel aufgrund einer weiteren Erhöhung bei der Fructanakkumulation. Solche Pflanzen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: natürliche Mutanten des Stärke-Sucrosemetabolismus und Pflanzen, bei denen der Stärke- und Sucrosemetabolismus modifiziert wurde durch molekulare und genetische Techniken, zum Beispiel wie bei Sonnewald und Wilmitzer Plant Physology 99, 1267-1270, 1992, beschrieben.
  • Beispiel 9
  • Allgemeine Anwendbarkeit der Technologie 1. Das Konstrukt
  • Um die allgemeine Anwendbarkeit der Technologie zu demonstrieren, wurde das im Beispiel 1 beschriebene cpy-sacB-Konstrukt genutzt. Andere Gene jedweden Ursprungs können ebenso verwendet werden, die für Polypeptide codieren, welche zur Synthese von Fructan in der Lage sind, die mindestens aus zwei verknüpften Fructoseeinheiten bestehen. Ferner kann die Effektivität der eingeführten Konstrukte hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die Fructanakkumulation in transgenen Pflanzen in Bezug auf Menge, Timing und Lokalisation zu lenken, modifiziert werden durch Verwendung regulatorischer Signale, die – ohne darauf beschränkt zu sein – einschließen: konstitutive Promotoren, Organ-spezifische Promotoren, Entwicklungs-regulierte Promotoren, Polyadenylierungssignale, Tranlationsenhancer, Transkriptionsenhancer etc. Zusätzlich kann die zelluläre Lokalisation des Polypeptids gelenkt werden durch Verwendung unterschiedlicher zellulärer Zielsignale, die vakuoläre und apoplastische Zielsignale von irgendeinem Ursprung einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Nach dem Einführen irgendeiner Kombination der oben bezeichneten Elemente in Pflanzen können beträchtliche Mengen an Fructanen in vegetativen Organen akkumuliert werden, die Blätter, Wurzeln und Stengel sowie daraus stammende Organe, wie Knollen, Speicherwurzeln, Früchte sowie Samen einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind.
  • 2. Anwendung in unterschiedlichen Feldfruchtarten
  • Um die allgemeine Anwendbarkeit der Technologie zu demonstrieren wurde das in Beispiel 1 beschriebene Konstrukt cpy-sacB in Feldfruchtarten eingeführt wurde wie bei der Kartoffel (Solanum tuberosum L.), deren Transformation – jedoch nicht notwendigerweise – durchgeführt werden kann wie bei Visser, Plantissue Culture Manual B5, 1-9, Kluwer Academic Publishers, 1991, beschrieben. Die resultierenden transgenen Pflanzen akkumulierten Fructane durch die gesamte Entwicklung in jedem Organ. Die Mengen in Blättern und Knollen können über 9% des Frischgewichts liegen. Zusätzlich wurde derselbe Konstrukt in die Rübe (Beta vulgaris L.) eingeführt, die – jedoch nicht notwendigerweise – transformiert werden kann wie durch D'Halluin et al., Biotechnology 10, 309-314 (1992), beschrieben.
  • Die resultierenden transgenen Rübenpflanzen akkumulierten beträchtliche Mengen an Fructan mit einem Polymerisationsgrad bis zu 25000 oder mehr zum Beispiel in ihren Blättern und Speicherwurzeln. Dasselbe cdy-sacB-Konstrukt wurde in Futter-Brassica (Brassica nabus L.) eingeführt, welche – jedoch nicht notwendigerweise – wie durch den Block et al. in Plant Physiol. 91, 694-701 (1989) beschrieben transformiert werden kann. Die resultierenden, transgenen Futter-Brassicapflanzen akkumulierten beträchtliche Mengen an Fructanen mit einem Polymerisationsgrad von bis zu 25000 oder mehr zum Beispiel in ihren Blättern und Speicherorganen.
  • Zusätzliche Pflanzenarten, die zum Akkumulieren von Fructanen modifiziert werden können, schließen Mais (Zea may L.), Weizen (Triticum aestivum L.), Gerste (Hordeum vulgare L.), Reis (0ryza sativum L.), Sojabohne (Glyzin max L.), Erbse (Pisum sativum L.), Bohne (Phaseolus vulgaris L.), Chicoree (Cichikorium intybus L.), Zuckerrohr (Sacharum officinarum L.), Jamswurzel (Yam) (Dioscorea esculenta L.), Manjok (Manihot esculenta L.) und Gräser (z. B. Lolium, spp., Poa spp. und Festuka spp.) ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Pflanzen mit natürlichen oder induziert-modifizierten Kohlenhydratverteilungsmustern können bevorzugte Ziele zur Veränderung des Fructanmetabolismus sein, in besondere für erhöhte Grade an Fructanakkumulation. Solche Pflanzen schließen ein – ohne darauf beschränkt zu sein – natürliche Mutanten im Stärke- und Sucrose-Metabolismus und Pflanzen, bei denen der Stärke- und Sucrose-Metabolismus durch molekulare und genetische Techniken verändert wurden, wie zum Beispiel bei Sonnewald und Willmitzer, Plant Physiology 99, 1267-1270, 1992, beschrieben.

Claims (22)

  1. Verfahren zum Erhalten transgener Pflanzen, die in ihren Pflanzengeweben und Pflanzenzellkompartimenten eine Verteilung an Fructan zeigen, die sich von der in nicht-transformierten Pflanzen gefundenen Verteilung unterscheiden, mit den Schritten: a) Herstellen eines DNA-Konstruks, welches das sacB-Fructosyltransferase-Gen von Bacillus subtilis, dessen 5'-nicht-translatierter Bereich so modifiziert ist, daß mindestens das ATG-Codon, welches außerhalb des Rahmens vor dem Initiator-ATG-Codon liegt, deletiert oder inaktiviert ist, sowie eine in Pflanzen aktive Promotorsequenz und eine in Pflanzen aktive Terminatorsequenz, die beide operativ mit dem Gen verknüpft sind, umfaßt; b) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Konstrukt; undb) Transformieren einer Pflanzenzelle mit dem Konstrukt; und c) Regenerieren einer transgenen Pflanze aus der transformierten Pflanzenzelle.
  2. Verfahren wie im Anspruch 1 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Konstrukt ferner eine Zielsequenz stromaufwärts des Fructosyltransferase-Gens umfaßt.
  3. Verfahren wie im Anspruch 2 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielsequenz aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus der Sinnalsequenz und vakuolären Zielsequenz des Carboxypeptidase Y-(cPY-)Gens, der Signalsequenz und der apoplasmatischen Zielsequenz des Pathogenese-verwandten Protein S-Gens besteht.
  4. Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die Terminatorsequenz eine Nopalinsynthase-Gen-Terminatorsequenz ist.
  5. Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorsequenz eine konstitutive oder regulierbare Promotorsequenz ist.
  6. Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotorsequenz aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus der 35S-Cauliflower-Mosaikvirus-Promotorsequenz und dem körnchen-assoziierten Stärkesynthasepromotor der Kartoffel besteht.
  7. Verfahren wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Konstrukt ferner eine Translationsenhancersequenz stromaufwärts des Fructosyltransferase-Gens und stromabwärts der Promotorsequenz umfaßt.
  8. Verfahren wie im Anspruch 7 beansprucht, dadurch gekennzeichnet, daß die Translationsenhancersequenz ein Alfalfa-Mosaikvirus-RNA4-Translationsenhancer ist.
  9. DNA-Konstrukt zur Produktion von transgenen Pflanzen, mit dem sacB-Fructosyltransferase-Gen von Bacillus subtilis, dessen 5'-nichttranslatierter Bereich so modifiziert ist, daß mindestens das ATG-Codon, welches außerhalb des Rahmens vor dem Initiator-ATG-Codon liegt, deletiert oder inaktiviert ist, sowie einer in Pflanzenzellen aktiven Promotorsequenz und einer in Pflanzenzellen aktiven Terminatorsequenz, die beide operativ mit dem Gen verknüpft sind.
  10. DNA-Konstrukt wie im Anspruch 9 beansprucht, ferner mit einer Zielsequenz stromaufwärts vom Fructosyltransferase-Gen.
  11. Transgene Pflanze, die ein DNA-Konstrukt wie im Anspruch 9 oder 10 beansprucht umfaßt.
  12. Transgene Pflanze, die gemäß dem Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 hergestellt wurde und ein DNA-Konstrukt wie im Anspruch 9 oder 10 beansprucht umfaßt.
  13. Transgene Pflanze, die gegenüber abiotischem und/oder biotischem Streß tolerant ist, welche gemäß dem Verfahren wie in den Ansprüchen 1 bis 8 beansprucht hergestellt ist und ein DNA-Konstrukt wie im Anspruch 9 oder 10 beansprucht umfasst.
  14. Transgenes Pflanzengewebe einer Pflanze wie im Anspruch 12 oder 13 beansprucht und ein DNA-Konstrukt wie im Anspruch 9 oder 10 beansprucht umfassend.
  15. Transgenes Pflanzengewebe wie im Anspruch 14 beansprucht, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Frucht, Stengel, Wurzel, Knolle und Samen besteht, und welches ein DNA-Konstrukt wie im Anspruch 9 oder 10 beansprucht umfaßt.
  16. Verwendung einer transgenen Pflanze wie im Anspruch 12 beansprucht zum Kultivieren unter Bedingungen von abiotischem und/oder biotischem Streß.
  17. Verwendung der transgenen Pflanze wie im Anspruch 12 beansprucht oder des transgenen Pflanzengewebes wie im Anspruch 14 oder 15 beansprucht zur Produktion von Fructanen.
  18. Verwendung der transgenen Pflanze wie im Anspruch 12 beansprucht oder des transgenen Pflanzengewebes wie im Anspruch 14 oder 15 beansprucht als ein Nahrungsmittel.
  19. Verwendung der transgenen Pflanze wie im Anspruch 12 beansprucht oder des transgenen Pflanzengewebes wie im Anspruch 14 oder 15 beansprucht als Futter für Tiere.
  20. Transgenes Saatgut, erhältlich aus einer transgenen Pflanze wie im Anspruch 12 oder 13 beansprucht und ein DNA-Konstrukt wie im Anspruch 9 oder 10 beansprucht umfassend.
  21. Transgenes Saatgut, welches aus einer transgenen Pflanze erhältlich ist, die gemäß dem Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8 produziert wurde und ein DNA-Konstrukt umfaßt, zur Produktion von transgenen Pflanzen, umfassend das sacB-Fructosyltransferase-Gen von Bacillus subtilis, dessen 5' nichttranslatierter Bereich so modifiziert ist, daß mindestens das ATG-Codon, welches außerhalb des Rahmens vor dem Initiator-ATG-Codon liegt, deletiert oder inaktiviert ist, sowie eine in Pflanzen aktive Promotorsequenz und eine in Pflanzen aktive Terminatorsequenz, wobei beide mit dem Gen operativ verknüpft sind.
  22. Transgenes Saatgut wie im Anspruch 21 beansprucht, gekennzeichnet durch eine Zielsequenz stromaufwärts des Fructosyltransferase-Gens.
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