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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Steigerung der
photosynthetischen Aktivität
und des Wachstums einer höheren
Pflanze, um deren Ernteausbeute zu steigern und/oder deren frühere Ernte
zu ermöglichen.
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2. Beschreibung des Stands
der Technik
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Die
Entwicklung rekombinanter DNA-Technik hat die Einbringung eines
bestimmten exogenen Gens in eine höhere Pflanze in die Expressionsregulation
eines darin existierenden Gens verwirklicht. Die
DE 19 502 053 offenbart die Expression
einer deregulierten oder nicht regulierten bakteriellen Fructose-1,6-bisphosphatase
(FBPase) in dem Cytosol von Pflanzen, um die Pflanzenausbeute zu
verbessern.
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Raines,
Christine A. et al. in "Journal
of Experimental Botany",
Oxford University Press, GB, Band 50, Nr. 330, Januar 1999, Seiten
1-8, beziehen sich auf die Charakterisierung von Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase
(SBPase) und deren Bedeutung für
die Photosynthese. Es wird dargestellt, dass transgene Pflanzen
mit anti-sense-Konstrukten verringerte Spiegel eines bestimmten
Enzyms hatten, was sich auf die photosynthetische Aktivität auswirkte
und die Wachstumsraten verringerte. Man stellt sich vor, dass Pflanzen
mit erhöhten Spiegeln
von SBPase höhere
Geschwindigkeiten bzw. Raten der Photosynthese unterstützen könnten.
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Tamoi
Masahiro et al. beschreiben in „Archives of Biochemistry
and Biophysics",
Band 334, Nr. 1, 1996, Seiten 27-36, die Isolierung und Charakterisierung
der FBPase/SBPase aus Synechococcus PPC 7942, welche mit dem in
der vorliegenden Anmeldung verwendeten Enzym identisch ist.
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Das
Problem der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung höherer Pflanzen
mit einer gesteigerten Photosyntheserate und verbessertem Wachstum.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Bisher
wurden trotzdem keine Anstrengungen zur phenotypischen Expression
eines bestimmten Gens in einer höheren
Pflanze unter Verwendung rekombinanter DNA-Technik unternommen,
um die Photosynthese zu steigern, die ein Primärstoffwechsel einer höheren Pflanze
ist, sowie deren Wachstum zu verbessern.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, die phenotypische
Expression eines bestimmten Gens in einer höheren Pflanze unter Verwendung
rekombinanter DNA-Technik zu erreichen, um die Photosynthese, die
ein Primärstoffwechsel
einer höheren
Pflanze ist, zu steigern, die Nutzpflanzen-Produktivität und -Ausbeutemöglichkeit
zu verbessern und/oder die frühere
Ernte der Nutzpflanzen zu ermöglichen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verbesserung der
Produktivität
einer höheren
Pflanze mit Chloroplasten durch die phenotypische Expression von
Fructose-1,6-bisphosphatase/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase
aus Cyanobakterien in den Chloroplasten zur Verfügung.
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Darüber hinaus
stellt die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanze zur Verfügung, wobei
diese eine höhere
Pflanze mit einem darin eingebrachten DNA-Fragment, welches eine
Fructose-1,6-bisphosphatase/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase aus
Cyanobakterien codierende Basensequenz enthält, umfasst.
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Die
Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) und Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase
(SBPase) in den Chloroplasten einer höheren Pflanze sind die (geschwindigkeitsbestimmenden)
Schlüsselenzyme
eines photosynthetischen reduktiven Kohlenstoffsystems. Die Aktivitäten dieser
Enzyme werden durch die Möglichkeit der
Photoreduktion reguliert. Andererseits wird Fructose-1,6-bisphosphatase/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase
(FBPase/SBPase), abgeleitet aus Cyanobacterium Synechococcus PCC
7942-Gen, weit verbreitet in einem spezifischen Typ einer prokaryotischen
Alge, einem Cyanobakterium, vorgefunden. Die Primärstruktur und
Enzymeigenschaften von FBPase/SBPase aus Cyanobakterien sind von
denjenigen von FBPase oder SBPase, wie sie in den Chloroplasten
einer höheren
Pflanze vorgefunden werden, verschieden. Darüber hinaus ist FBPase/SBPase
aus Cyanobakterien aus einem Protein aufgebaut, das ein bifunktionelles
Enzym ist, welches zwei Arten von Enzymaktivitäten, FBPase und SBPase, aufweist.
FBPase-I, abgeleitet von Cyanobacterium Synechococcus PCC 7942-Gen,
ist ein Tetramer, das aus vier untereinander identischen Untereinheiten
von 40 kDa besteht. Nach der Behandlung mit 1 mM H2O2 behält
das gereinigte Enzym mehr als 80% der nativen Enzymaktivität bei. Die
Enzymaktivität
von FBPase-I wurde durch AMP (Ki = 0,26 mM), welches ein spezifischer
Inhibitor der FBPase vom cytoplasmatischen Typ ist, inhibiert. Jedoch
wurde sie durch Fructose-2,6-P2 nicht inhibiert.
Der optimale pH für
die Enzymaktivität
betrug 8,0, und der pI-Wert des Enzyms lag bei 4,8.
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FBPase-I
hydrolysierte nicht nur Fructose-1,6-Bisphosphat (Fru 1,6-P2) sondern auch Seduheptulose-1,7-Biphosphat
(Sed 1,7-P2). Die Aktivitäten der
gereinigten Enzyme für
Fru 1,6-P2 und Sed 1,7-P2 betrugen 11,7 μmol/min/mg
Protein bzw. 12,1 µmol/min/mg
Protein. Die Km-Werte für
Fru 1,6-P2 und Sed 1,7-P2 lagen bei
52 µM
bzw. 118 µM.
Für die
Enzymaktivität
wurde der Nachweis erbracht, dass sie von der Mg2+-Konzentration
abhängt,
wie es ebenso typischer FBPase gleicht. Die Dosis-Wirkungs-Kurve
zeigte eine sigmoidale Kurve, gleich wie Plastid-FBPase, und für den S0,5-Wert wurde gezeigt, dass er 1,4 ± 0,1 mM
ausmachte. Dieses Enzym selbst war in „Archives of Biochemistry
and Biophysics, Band 334, Nr. 1, Seiten 27 bis 36, 1996: Molecular
characterization and resistance to hydrogen peroxide of two fructose-1,6-biphosphatase
from Synechococcus PCC 7942 (Molekulare Charakterisierung und Beständigkeit
gegen Wasserstoffperoxid von zwei Fructose-1,6-Biphosphatase aus Synechococcus PCC
7942)" beschrieben.
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Der
Erfinder brachte Fructose-1,6-bisphosphatase/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase,
isoliert aus dem Cyanobacterium Synechococcus PCC 7942, so in eine
Tabakpflanze ein, dass das exprimierte Protein in deren Chloroplasten übertragen
wurde. Die FBPase-Aktivität,
die SBPase-Aktivität
und das photosynthetische Vermögen
der transgenen Pflanze wurden mit jenen des Wildtyp-Stamms verglichen.
Die 7 Wochen nach der Aussaat gemessenen Resultate zeigten eine
signifikante Zunahme dieser Aktivitäten in der transgenen Pflanze.
Außerdem
stellten sich nach einer bestimmten Zeitdauer der Kultivierung die
Pflanzenkörper
der transgenen Pflanze als höher
als diejenigen des Wildtypstamms heraus. In der transgenen Pflanze
waren die Flächen der
Blätter,
die Durchmesser der Strünke
und die Zahlen und Längen
der Wurzeln größer als
diejenigen in dem Wildtypstamm. Darüber hinaus wurde nachgewiesen,
dass die Gehaltsanteile von Hexose, Sucrose und Stärke in Blättern, Strünken und
Wurzeln der transgenen Pflanze im Vergleich mit jenen des Wildtypstamms
größer geworden
waren.
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Dementsprechend
wurde das photosynthetische Vermögen
der transgenen Pflanze, erhalten durch Einbringung von FBPase/SBPase
aus Cyanobakterien in eine Tabakpflanze, verbessert. Als Ergebnis
wird das Vermögen
der transgenen Pflanze, Kohlenhydrat und Stärke zu synthetisieren, gesteigert,
und das Wachstum war beschleunigt, was die Zunahme des letztendlichen
Anabolismus der transgenen Pflanze anzeigt. Aus diesem Grunde wurde
für die
Einbringung von FBPase/SBPase aus Cyanobakterien in die Chloroplasten
einer Tabakpflanze nachgewiesen, dass diese eine sehr effektive
Technik zur Herstellung von Pflanzen mit hohen Ausbeute-Erträgen ist.
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Der
Effekt könnte
folgendermaßen
erklärt
werden. Ausgelöst
durch Umweltbelastungen verursachen Licht und Sauerstofftoxizität verschiedene
Arten von Schädigungen
an Pflanzenkörpern,
welche zu einer kritischen und begrenzenden Einflussgröße der Nahrungsmittelherstellung
werden. Im Gegensatz zu aus einer höheren Pflanze abgeleiteten
FBPase und SBPase ist FBPase/SBPase aus Cyanobakterien gegenüber Sauerstoffschädigung resistent,
und es wird somit in Erwägung
gezogen, dass sie unter diversen Umweltbelastungen funktioniert.
Außerdem
existiert ein die FBPase/SBPase aus Cyanobakterien kodierendes Gen
in höheren Pflanzen
nicht, wodurch die Möglichkeit
nachteiliger Auswirkungen infolge von Gene-Silencing eliminiert
wird.
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In
der vorliegenden Erfindung umfasst ein Vektor zur Herstellung einer
rekombinanten DNA die Plasmide pBI101, pIN19 und pMSH-1. Eine große Vielzahl
nützlicher
angebauter bzw. kultivierter Pflanzen und Hölzer kann als höhere Pflanze,
in welche die erfindungsgemäße rekombinante
DNA eingebracht wird, gewählt werden.
Beispielsweise kann die Erfindung auf Getreiden wie Mais, Reis,
Weizen, Gerste, Hafer, Weizen, Hirse und Barnyard-Hirse, Bohnen
wie Sojabohnen, Gemüse
wie Kartoffel und Tomate, nützliche
angebaute Pflanzen wie Rübsamen,
Baumwolle und Tabak, sowie Bäume
angewandt werden.
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Von
der Aminosäuresequenz
der Sequenz Nr. 1 kann eine Aminosäuresequenz entfernt oder hinzugefügt werden,
oder ein Teil der Sequenz der Sequenz Nr. 1 kann durch eine andere
Aminosäuresequenz
im Umfang der vorliegenden Erfindung ersetzt werden, sofern das
resultierende Peptid seine enzymatischen Aktivitätseigenschaften als Fructose-1,6-bisphosphatase/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase
beibehält.
Vorzugsweise nicht weniger als 85%, stärker bevorzugt nicht weniger
als 95% der Aminosäuresequenz
können überlappt
oder identisch mit der Aminosäuresequenz
der Sequenz Nr. 1 sein.
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In
einer Basensequenz der Sequenz Nr. 2 ist eine Basensequenz, auf
die als Basennummern 1 bis 1068 Bezug genommen wird, essentiell
für die
vorliegende Erfindung, weil diese Basensequenz mit einem Anteil
eines strukturellen Gens korrespondiert, das bedeutet, einer Aminosäuresequenz
der Sequenz Nr.1. Zusätzlich
dazu ist eine Basensequenz, auf die als Basennummern –180 bis
1170 Bezug genommen wird, die am meisten bevorzugte Ausführungsform
dieser Erfindung.
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Diese
und andere Merkmale und Vorzüge
der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen der detaillierten Beschreibung
und der Zeichnungen ersichtlich werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Ansicht, welche die Struktur eines in Tabak-Chloroplasten
eingebrachten Plasmids zeigt.
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2 ist
eine Graphik, welche die Höhen
der Pflanzenkörper
eines Wildtypstamms und einer transgenen Pflanze unter Wasserkultur
zeigt.
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3 ist
eine Graphik, welche das photosynthetische Vermögen eines Wildtypstamms und
einer transgenen Pflanze zeigt.
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4 ist
eine Photographie, welche das Aussehen von Pflanzenkörpern eines
Wildtypstamms und einer transgenen Pflanze am 112-ten Tag der Kultivierung
unter Wasserkultur zeigt.
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5 ist
eine Photographie, welche das Aussehen von Blättern und Stängeln eines
Wildtypstamms und einer transgenen Pflanze am 112-ten Tag der Kultivierung
unter Wasserkultur zeigt.
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6 ist
eine Photographie, welche das Aussehen von Wurzeln eines Wildtypstamms
und einer transgenen Pflanze am 112-ten Tag der Kultivierung unter
Wasserkultur zeigt.
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7 ist
eine Graphik, welche die Gehaltsanteile von intermediären Metaboliten
eines Wildtypstamms und einer transgenen Pflanze zeigt.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Wie
in 1 dargestellt, wurden Tomaten-rbcS-Promotor, die
kodierende Region eines Transit-Peptids, und das Gen für Fructose-1,6-bisphosphatase/Sedoheptulose-1,7-bisphosphatase (5.7942
FBP/SBPase) aus Cyanobakterien (fbp-I) mit pBI101 zur Konstruktion
eines Plasmids konjugiert. Das fbp-I genannte Gen bezeichnet eine
Basensequenz, auf die als Basennummern –180 bis 1170 der Sequenz Nr.
2, abgeleitet von Synechococcus PCC 7942-Cyanobakterien, Bezug genommen
wird. Das Plasmid wurde in Agrobacterium tumefacience LBA4404 eingebracht,
welches für
die Infektion eines Blattbodens (leaf disk) von Tabak (Nicotinia
tabacum cv Xanthi) verwendet wurde, um fbp-I in ein nukleäres Tabak-Gen
zu inkorporieren. Nach Isolierung der genomischen DNA wurde die
Einbringung von fbp-I durch PCR und Immunblot-Methoden bestätigt. 7
Transformantenstämme
(TFI-1 bis TF1-7) wurden erhalten. Die Chloroplasten wurden aus
transformierten Stämmen isoliert
(T2-Generation), danach wurde die Expression von 5.7942 FBPase/SBPase
mittels Westernblot bestätigt.
Außerdem
wurde durch Zellfraktionierung bestätigt, dass das von dem eingebrachten
Gen exprimierte Protein in den Chloroplasten lokalisiert ist.
(Die
FBPase-Aktivität,
SBPase-Aktivität
und photosynthetische Aktivität)
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Die
FBPase-Aktivität
der Blätter
des Pflanzenkörpers
des transgenen, 7 Wochen nach der Aussaat kultivierten Tabaks, wurde
mit derjenigen des Wildtypstamms ohne das eingebrachte Gen verglichen.
Das Ergebnis zeigte, dass die Enzymaktivität des Wildtypstamms 1,04±0,22 µmol/min/mg
Chlorophyll und diejenige der transgenen Pflanze 1,820,24 µmol/min/mg
Chlorophyll betrug. Somit ist die Aktivität der transgenen Pflanze 1,75-mal
höher als
diejenige des Wildtypstamms.
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Die
SBPase-Aktivität
wurde gleichfalls verglichen. Die SBPase-Aktivität des Wildtypstamms war 1,37 µmol/min/mg
Chlorophyll und diejenige der transgenen Pflanze war 2,40 µmol/min/mg
Chlorophyll. Somit ist die Aktivität der transgenen Pflanze 1,75-mal
höher als
diejenige des Wildtypstamms.
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Die
photosynthetische Aktivität
unter herkömmlicher
Bedingung (360 ppm CO2) wurde verglichen.
Als Ergebnis wurde zwischen dem Wildtypstamm und der transgenen
Pflanze kein signifikanter Unterschied bei einer Beleuchtung mit
0, 10, 50 und 100 µE/s/m2 beobachtet. Jedoch nahm die photosynthetische
Aktivität
der transgenen Pflanze bei Beleuchtung mit 200 µE/s/m2 im
Vergleich mit derjenigen des Wildtypstamms signifikant zu. Unter
Beleuchtung mit 1600 µE/s/m2 war die Enzymaktivität der transgenen Pflanze 1,24-fach höher als
diejenige des Wildtypstamms. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
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(Einfluss der Transformation
auf das Pflanzenwachstum)
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Unter
Verwendung von Hogrant-Medium wurde eine Wasserkultur des Wildtypstamms
und der transgenen Pflanze durchgeführt. Das Experiment wurde unter
den Bedingungen von 400 µmol/m2/s, einer relativen Feuchte von 60% und
bei einer Temperatur von 25°C
vorgenommen. Am 63-ten Tag, 72-ten Tag, 77-ten Tag, 82-ten Tag,
85-ten Tag, 90-ten Tag, 97-ten Tag, 102-ten Tag, 105-ten Tag, 109-ten
Tag, 112-ten Tag der Kultivierung wurden die Höhen der Pflanzenkörper gemessen.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Am 64-ten Tag der
Kultivierung betrug die Höhe
des Wildtypstamms 14,04,6 cm und diejenige der transgenen Pflanze
war 16,62,9 cm. Am 112-ten Tag der Kultivierung jedoch war die Höhe des Wildtypstamms
58,37,0 cm, und diejenige der transgenen Pflanze lag bei 84,5+7,8
cm, wodurch eine signifikante Steigerung des Wachstums der transgenen
Pflanzen angezeigt wird (um etwa das 1,45-fache). Die Abbildungen
in 4 zeigen einen Pflanzenkörper des Wildtypstamms (links)
und denjenigen der transgenen Pflanze (rechts).
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Während der
gesamten Wachstumsperiode wuchsen die Blätter, Stängel und Wurzeln der transgenen Pflanze
besser als diejenigen des Wildtypstamms. Dies bedeutet, die Blätter sind
dicker mit einem breiteren Oberflächenbereich, die Stängel sind
dicker und die Anzahl der Wurzeln ist größer und jede der Wurzeln länger. Die 5 ist
eine Photographie, welche das Aussehen der Blätter und der Stängel am
112-ten Tag der Kultivierung zeigt, und der Wildtypstamm ist auf
der linken Seite, und die transgene Pflanze ist auf der rechten Seite
gezeigt. Die 6 ist eine Photographie, welche
das Aussehen der Wurzeln am 112-ten Tag der Kultivierung zeigt,
und der Wildtypstamm ist auf der linken Seite und die transgene
Pflanze ist auf der rechten Seite gezeigt.
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(Die Gehaltsanteile an
metabolischen Zwischenprodukten)
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Die
Gehaltsanteile an metabolischen Zwischenprodukten (Hexose, Sucrose,
Stärke)
wurden anhand der oberen Blätter
(4-tes Blatt von oben), unteren Blätter (3-tes Blatt von unten),
der Stängel
und Wurzeln der Pflanzenkörper
in der 12-ten Woche nach der Aussaat gemessen, um die Gehaltsanteile
zwischen dem Wildtypstamm und der transgenen Pflanze zu vergleichen.
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Die Gehaltsanteile
an metabolischen Zwischenprodukten in der transgenen Pflanze nahmen
in allen Teilen im Vergleich mit dem Wildtypstamm signifikant zu,
einschließlich
der oberen Blätter,
der unteren Blätter,
der Stängel
und der Wurzeln. Insbesondere nahmen die Gehaltsanteile von Hexose
und Sucrose in den oberen Blättern
signifikant zu. Die Akkumulation von Stärke wurde in den unteren Blättern beobachtet.
Es wird dies in Betracht gezogen, dass in den oberen Blättern synthetisierte
Sucrose in die unteren Blätter
verlagert wird.
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Wie
mit diesen Ergebnissen dargelegt, war die Photosynthese in höheren Pflanzen
durch die vorliegende Erfindung gesteigert, wobei die Produktion
von Kohlenhydrat und Stärke,
die in der transgenen Pflanze biosynthetisiert wurden, gesteigert
war, um das Pflanzenwachstum zu beschleunigen. Das Trockengewicht
der Pflanzenkörper
des Wildtypstamms war 14,12,2 g während der Phase der Blütenknospenausbildung,
und dasjenige der transgenen Pflanze war 21,0±1,9g. Das Trockengewicht
der transgenen Pflanze stieg um das 1,5-fache an, verglichen mit
demjenigen des Wildtypstamms, wodurch die Steigerung des letztendlichen
Anabolismus angezeigt wird.
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Wie
oben beschrieben war das photosynthetische Vermögen in der transgenen Pflanze
dieser Erfindung im Vergleich mit dem Wildtypstamm gesteigert, um
die Fähigkeit
der Biosynthese von Kohlenhydrat und Stärke zu verbessern, das Wachstum
zu beschleunigen und den letztendlichen Anabolismus in der transgenen Pflanze
zu steigern. Demzufolge ist für
die Einbringung von FBPase/SBPase in Chloroplasten einer höheren Pflanze
unter Beweis gestellt, dass diese eine sehr effektive Technik zur
Erzeugung einer Hochertrags-Nutzpflanze ist. Es hat keine Technik
gegeben, welche die Erzeugung einer Hochertrags-Nutzpflanze ermöglicht, bei
der rekombinante DNA-Technik zur Verbesserung des photosynthetischen
Vermögens
einer höheren Pflanze,
welches ihr primärer
Stoffwechsel ist, eingesetzt wird. Somit stellt dieser Erfindung
eine wichtige Schlüsseltechnik
zur Lösung
der bevorstehenden Nahrungsmittelmangelkrise zur Verfügung. SEQUENZAUFLISTUNG