MXPA01011672A - Expresion de sedoheptulosa 1,7 bifosfatasa en plantas transgenicas. - Google Patents

Abstract

La sedoheptulosa 1,7-bifosfatasa (SBPasa) es una enzima que cataliza la reaccion que abarca a sedoheptulosa 1,7-bifosfato hacia sedoheptulosa 7-fosfato; esta enzima se localiza en el cloroplasto en hojas y tallos; la sobreexpresion de SBPasa en plantas transgenicas se provee para mejorar el rendimiento vegetal al incrementar la capacidad biosintetica del almidon en la hoja en particular y la produccion de sacarosa en general; tambien se proveen las variaciones desreguladas de las enzimas.

Description

EXPRESIÓN DE SEDOHEPTULOSA 1,7 BIFOSFATASA EN PLANTAS TRANSGENICAS Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de E. U. A., número de serie 60/133,964, presentada el 13 de mayo de 1999.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la expresión de sedoheptulosa 1 ,7 bifosfatasa (SBPasa) en plantas transgénicas para incrementar o mejorar el crecimiento y desarrollo vegetal, rendimiento, vigor, y distribución de carbono asimilado. Las plantas transgénicas que expresan SBPasa tienen asimilación, exportación y almacenamiento de carbono mejorado en la fuente vegetal y en órganos de almacenamiento, los cuales resultan en mejorías de crecimiento, rendimiento y calidad en cosechas vegetales.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los avances recientes en la ingeniería genética han provisto las herramientas de prerrequisito para transformar plantas para que contengan genes endógenos mejorados o extraños (frecuentemente referidos como "heterogéneos o heterólogos"). La introducción de dicho gen en una planta deseablemente lleva a una mejoría de una ruta que existe actualmente en los tejidos vegetales o a la introducción de nuevas rutas para modificar los niveles de producto deseado, incrementar la eficiencia metabólica, y/o ahorro en el costo de energía de la célula. Actualmente es posible producir plantas con características fisiológicas y bioquímicas únicas y características de alta importancia agronómica y de procesamiento de cosechas. Los rasgos que desempeñan un papel esencial en el crecimiento vegetal y en el desarrollo, el potencial de rendimiento de la cosecha y estabilidad, y la calidad y composición de la cosecha son particularmente blancos deseables para la mejoría de la cosecha vegetal. Estas mejorías pueden lograrse al modificar genéticamente una cosecha vegetal para mejorar la asimilación de carbono, el almacenamiento de carbono más eficiente, y/o incrementar la exportación de carbono y las capacidades de partición. La fijación de carbono atmosférico (fotosíntesis) por las plantas, algas, y bacterias fotosintéticas representa la fuente principal de energía para mantener los procesos en dichos organismos. El ciclo de Calvin, localizado en el estroma de los cloroplastos, es la ruta principal de asimilación de carbono en las plantas superiores. El carbono asimilado puede ya sea dejar el ciclo para la biosíntesis de sacarosa o de almidón o continuar a través del ciclo para regenerar la molécula aceptora de carbono, ribulosa-1 ,5-bifosfato. La sedoeptulosa-1 ,7-bifosfatasa es una enzima que cataliza la reacción irreversible en la región de bifurcación en donde los intermediarios pueden dejar el ciclo, y por lo tanto puede ser esencial para regular la partición de carbono entre la fase de regeneración del ciclo y la biosíntesis de sacarosa y de almidón. La SBPasa no tiene contraparte citosólica conocida y se reporta como que se encuentra solamente en el cloroplasto, en donde ésta desfosforila sedoheptulosa-1 ,7-bifosfato (SBP) para formar sedoheptulosa-7- fosfato y fosfato inorgánico. Esta enzima es específica para SBP y se inhibe por sus productos así como el glicerato (Schimkat et al., 1990) y la fructosa- 2,6-bifosfato (Cadet y Meunier, 1988b). La luz, un agente reductor, y Mg2+ se requieren para la actividad (Woodrow, 1982; Cadet y Meunier, 1988a). la enzima es un homodímero con una masa molecular en subunidades de 35-38 kDa (Nishizawa y Buchanan, 1981 ; Cadet y Meunier, 1988c). Se ha reportado que la remoción de más del 80% de la actividad enzimática de SBPasa en las plantas de tabaco utilizando tecnología antisentido resultó en clorosis, velocidades de crecimiento reducidas, y niveles de asimilación de carbono reducidos (Harrison et al., 1988). La reducción en la eficiencia del cuanto del fotosistema II también se observó, el cual resultó en la reducción en el contenido de carbohidrato de las hojas. El análisis del estado de carbohidrato mostró un cambio a partir del almidón mientras que los niveles de sacarosa se mantuvieron. Estos resultados indican que SBPasa es un paso potencial limitante de velocidad en el metabolismo de carbohidratos. Varias sedoheptulosas 1 ,7-bifosfatasas se han caracterizado bioquímicamente, y los ARNm correspondientes (ADNc) se han clonado a partir del alga (número de acceso Genbank: X74418; Hahn y Kuck, 1994) y en algunas plantas superiores tales como Triticum aestivum (número de acceso Genbank: X65540; Miles et al., 1993), Spinacia Olerácea (número de acceso Genbank: L76556; Martin et al., 1996) y Arabidopsis Thaliana (número de acceso Genbank: S74719; Willingham, et al., 1994). Por lo tanto, la sobreexpresión de una secuencia de ácido nucleico codificante de SBPasa en una planta transgénica producirá un resultado ventajoso en la planta tal como mejoría en la asimilación de carbono, exportación y almacenamiento; capacidad fotosintética incrementada; y capacidad fotosintética extendida.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para mejorar la asimilación de carbono en las plantas utilizando construcciones de ácido nucleico estructural que codifican una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa (SBPasa). Para lograr lo anterior, se provee, de conformidad con un aspecto de la presente invención, un método para mejorar la asimilación de carbono en una planta que comprende los pasos de: (a) insertar dentro del genoma de una planta una secuencia de ácido nucleico comprendida en la dirección 5' a 3' y operativamente unida, (i) un promotor que funciona en las células de un tejido vegetal seleccionado, ¡i-W--a - i. í .iyly... ^ .t . L., ¿-¿-...?^.a ---.^ - (ii) una secuencia de ácido nucleico estructural que causa la producción de una enzima seudoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa, (iii) una secuencia de ácido nucleico hacia 3' no traducida que funciona en las células vegetales para causar terminación de la transcripción y 5 la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de una secuencia de ARN; (b) obtener las células vegetales transformadas que contienen el ácido nucleico del paso (a); y (c) regenerar a partir de las células vegetales transformadas una 10 planta transformada que sobreexpresa la enzima sedoheptulosa 1 ,7- bifosfatasa en las células vegetales. En una modalidad adicional de la presente invención una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende un promotor capaz de funcionar en una célula vegetal, una secuencia de ácido nucleico estructural 15 en orientación sentido capaz de causar la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa y una secuencia de ácido nucleico hacia 3' no traducida capaz de causar la terminación de la transcripción y la adición de nucleótídos poliadenilados al extremo 3' de la secuencia de ARNm transcrita, se proveen. Esta secuencia de ácido nucleico puede opcionalmente incluir 20 intrones, secuencias lídere no traducidas hacia 5' u otras secuencias de ácidos nucleicos diseñadas para promover la transcripción y/o traducción. En una modalidad incluso adicional de la invención, una secuencia de ácido nucleico novedosa, aislada que codifica una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa a partir de un alga verde, Chlorella sorokiniana, se provee. En incluso una modalidad adicional de la presente invención, una secuencia de ácido nucleico variante que codifica una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa se provee por lo cual los residuos de cisteína en la secuencia polipeptídica están modificados a otros aminoácidos de manera que proveen una enzima activa independientemente de la presencia de luz. Por lo tanto, conformidad con la presente invención, se proveen medios para mejorar la asimilación, almacenamiento y exportación de carbono en los tejidos fuentes de una planta. Se proveen los medios adicionales para mejorar la acumulación de carbono en almacenes (tales como raíces, tubérculos, semillas, tallos y bulbos), por lo tanto incrementando el tamaño de varios almacenes (raíces mayores u tubérculos) y subsecuentemente incrementando el rendimiento. La disponibilidad de carbono incrementada en estos recipientes podría mejorar y/o alterar la composición de los componentes celulares de la planta (por ejemplo, aceites, proteínas, almidón y producción de sacarosa y de sólidos uniformemente). Un objetivo de la presente invención es sobreexpresar la sedoheptulosa 1 ,7-bisfosfatasa en plantas al introducir una fuente heteróloga del sedoheptulosa 1 ,7-bisfosfatasa dentro de la planta o al incrementar la expresión de la forma endógena del gen en la planta. Varias ventajas puede lograrse mediante los objetivos de la presente invención. Al incrementar la expresión de la enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatas en el cloroplasto se podría incrementar le flujo de carbón a través del ciclo de Calvin e incrementar potencialmente la asimilación de carbono atmosférico en la presencia de luz. Esto podría resultar en un incremento en la eficiencia fotosintética, un incremento en la producción de almidón del cloroplasto (una forma de almacenamiento de carbón en la hoja degradada mediante periodos cuando la fotosíntesis esta baja o ausente), y un incremento en la producción de sacarosa mediante la hoja resultando en un incremento neto en la exportación de carbono a el almacén y en los tejidos en desarrollo que podría esperarse durante un fotoperiodo dado. Esto incrementa la capacidad de la fuente en un rasgo deseable en las cosechas vegetales y podría llevar a un incremento en el crecimiento de la planta, capacidad de almacenamiento, rendimiento y vigor.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra un mapa plasmídico para el vector de clonación pMON47205. La figura 2 muestra un mapa plasmídico para el vector de clonación pMON47207. La figura 3 muestra un mapa plasmídico para el vector de clonación pMON47208. La figura 4 muestra un mapa plasmídico para el vector de transformación vegetal pMON10098. ti» í és-» Aa-L tiat 4» , «. -fos üa." " — '• •- -¿- La figura 5 muestra un mapa plasmídico para el vector de transformación vegetal pMON47200. La figura 6 muestra un mapa plasmídico para el vector lanzadera pMON999. La figura 7 muestra un mapa plasmídico para el vector de transformación transitoria pMON47203. La figura 8 muestra un ¡nmunoblot de la expresión de proteína SBPasa en los protoplastos de maíz transformados con pMON47203. La figura 9 muestra una gráfica en barra que compara la actividad de SBPasa en los protoplastos de maíz que expresan SBPasa de trigo con protoplastos control. La figura 10 muestra un alineamiento de las proteínas sedoheptulosa-1 ,7-bisfosfatasa.

Descripción de las secuencias SEQ ID NO: 1 iniciador sintético SEQ ID NO: 2 iniciador sintético SEQ ID NO: 3 secuencia de ADN para la SBPasa madura (sin CTP) SEQ ID NO: 4 iniciador sintético SEQ ID NO: 5 iniciador del adaptador SEQ ID NO: 6 iniciador sintético SEQ ID NO: 7 iniciador del adaptador SEQ ID NO: 8 secuencia de ADN de SBPasa con CTP SEQ ID NO: 9 secuencia de aminoácido de SBPasa SEQ ID NO: 10 un iniciador de degeneración SEQ ID NO: 11 un iniciador específico del gen SEQ ID NO: 12 una secuencia de aminoácidos pronosticada SEQ ID NO: 13 un iniciador específico del gen SEQ ID NO: 14 un iniciador específico del gen aminado SEQ ID NO: 15 un iniciador específico del gen SEQ ID NO: 16 un iniciador específico del gen SEQ ID NO: 17 un iniciador específico del gen aminado SEQ ID NO: 18 un iniciador específico del gen SEQ ID NO: 19 un iniciador específico del vector SEQ ID NO: 20 la secuencia de ADNc de SBPasa de longitud total de Chiorella sorokiniana SEQ ID NO: 21 un iniciador mutagénico para cambiar cisteínas 110 a 115 por serinas en SBPasa de Chiorella sorokiniana SEQ ID NO: 22 una secuencia variante de ADNc en la que las cisteínas 110 y 115 de SBPasa de Chiorella sorokiniana se cambian por serinas. SEQ ID NO: 23 una secuencia de proteína variante pronosticada de SBPasa de Chiorella sorokiniana en la que las cisteínas 110 y 115 se cambian por serinas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las siguientes definiciones se proveen con el objeto de ayudar a los expertos en la técnica para entender la descripción detallada de la 5 presente invención. El término "identidad" se refiere a las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos que cuando se comparan utilizan el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) en el programa BestFit (Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), 10 Madison, Wisc.) que son exactamente similares. El término "similitud" se refiere a las secuencias se aminoácidos que cuando se comparan utilizando el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981 ) en el programa BestFit (Wisconsin Package Versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisc.) coinciden con las 15 sustituciones de aminoácidos conservativas que están consideradas. La "región C-terminal" se refiere a la región de un péptido, polipéptido, o cadena proteica a partir de la mitad de la misma hacia el término que porta el aminoácido que tiene un grupo carboxilo libre. La frase "ácido nucleico o segmento de ADN heterólogo de la región promotora" significa que 20 el ADN codificante o el segmento de ácido nucleico no existe en la naturaleza con el promotor con el cual esta actualmente operativamente unido o acoplado con el mismo. ti k? g^. ^ -t-.n-.-. .¿áfe- t= *s * ^ ¿?-, El término "ADN codificante" se refiere a un ADN cromosomal, ADN plasmídico, ADNc o ADN sintético que codifica cualesquiera de las enzimas discutidas en la presente. El término "genoma" como se aplica a la bacteria abarca tanto el cromosoma como los plásmidos dentro de una célula hospedera bacteriana. El ADN codificante de la presente invención introducido de las células hospederas bacterianas puede por lo tanto integrarse cromosomalmente o localizarse como plásmido. El término "genoma" como se aplica a las células vegetales abarca no solamente el ADN cromosomal encontrado dentro del núcleo, sino el ADN de organelos encontrados dentro de e componentes subcelulares de la célula. El ADN de la presente invención introducido dentro de células vegetales puede por lo tanto integrarse ya sea cromosomalmente o localizarse en organelos. El término "microbio" o "microorganismos" se refiere a algas, bacterias, hongos, y protozoos. El término "muteína" se refiere a una forma mutante de un péptido, polipéptido, o proteína. La "región N-terminal" se refiere a la región de un péptido, polipéptido, o cadena proteica a partir del aminoácido que tiene un grupo amino libre hacia la mitad de la cadena. La "sobreexpresión" se refiere a la expresión de un polipéptido o proteína codificada por un ADN introducido dentro de una células hospedera, en donde dicho polipéptido o proteína ya sea no se presenta normalmente en la célula hospedera, o en donde dicho polipéptido o proteína está presente en dicha célula hospedera a un nivel superior que el que normalmente se expresa a partir del gen endógeno que codifica dicho polipéptido o proteína. El término "plastidio" se refiere a la clase de organelo celulares vegetales que incluyen amiloplastos, cloroplastos, cromoplastos, elayoplastos, eoplastos, etioplastos, leucoplastos, y proplastidios. Estos organelos son autorreplicantes, y contiene lo que comúnmente se refiere como "genoma del cloroplasto", una molécula de "ADN circular que tiene un intervalo en tamaño de aproximadamente 120 a aproximadamente 217 kb dependiendo de las especies vegetales, y la cual usualmente contiene una región repetida invertida. Esta invención se dirige a un método para producir células vegetales que demuestran un incremento o mejoría en el crecimiento y desarrollo vegetal, rendimiento y vigor. El método utiliza una secuencia de ADN que codifica un gen sbpase (sedoheptulosa 1 ,7-difosfatasa) integrado en el genoma celular de una planta como resultado de ingeniería genética y ocasiona la expresión de la enzima SBPasa. Las plantas que sobreexpresan la enzima SBPasa y que tienen una asimilación mejorada de carbono, exportación y almacenamiento en la fuente vegetal y en los órganos de almacenamiento, lo cual resulta en mejorías en el crecimiento, rendimiento y calidad también se contemplan en esta invención. El mecanismo mediante el cual la expresión de la SBPasa exógena modifica las relaciones de carbono deriva a partir de relaciones de la . .i -.j .t?.. .. t A.» :J¡..J . fuente/almacén. El tejido de hoja es una fuente de sacarosa, y si se transporta más sacarosa, resultante a partir de la actividad de la expresión de SBPasa incrementada, a un almacén esto resulta en un incremento de carbón almacenado (azúcares, almidón, etc.) por peso dado del tejido de almacén. Un método para la producción de plantas genéticamente transformadas que expresan niveles incrementados de SBPasa requiere la introducción de una molécula de ADN recombinante de doble hebra dentro del genoma nuclear de una célula vegetal. La molécula de ADN debe (1 ) contener un ADN estructural para la enzima SBPasa que se introduce dentro de la célula vegetal; (2) poseer un promotor que funciona en las plantas para regular la producción de una secuencia de ARN en una manera constitutiva o tejido específica mediante la enzima polimerasa de ARN; y (3) tener una región 3'-no traducida que funciona para ocasionar la terminación de la transcripción y la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' del ARN. La molécula de ARN primaria resultante se procesa subsecuentemente en el núcleo, un proceso que implica la remoción de secuencias intrónicas y la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' del ARNm.

Sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasas Como se utiliza en la presente, el término "sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa" significa una enzima (E.C. 3.1.3.37) que cataliza la desfosforilación de sedoheptulosa 1,7-bifosfato a sedoheptulosa 7-fosfato y fosfato inorgánico. .*..!, .; i. ,./-. - ...Y- i y„ :WleÍiil . y *~*- - ' '-*•""" ' * El gen SBPasa utilizado en la construcción de ADN de la presente invención puede ser cualquier gen SBPasa. Numerosas secuencias de ADNc de SBPasa se conocen en la técnica que incluyen las secuencias a partir del trigo (Raines et al., 1992), espinaca (Martin et al., 1996), Arabidopsis (Willingham et al., 1994), y Ralstonia (Yoo y Bowien, 1995). Los ejemplos que se proveen en la presente son ilustrativos del uso de una SBPasa, y no deben interpretarse de manera que limiten al alcance de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que varios otros genes así como alteraciones pueden hacerse a loa genes y métodos descritos en la presente mientras no se aparten del espíritu y alcance de la presente invención. Por ejemplo, uno puede utilizar una SBPasa que se ha seleccionado a partir de organismos alternativos o que se ha modificado para que carezca o altere la inhibición de retroalimentación enzimática mediante ortofosfato y glicerato. Debido a que SBPasa se inactiva mediante tioredoxina o DTT, uno puede también utilizar mutagénesis para manipular la enzima para que permanezca en el estado activado sin el reductor presente. Estas formas mutadas pueden utilizarse para modificar metabolismo vegetal también. La sobreproducción de carbohidrato también puede proveer un incremento en la tolerancia al estrés que afecta el potencial de agua de las plantas al proveer más esqueletos de carbono. Se proveen medios adicionales para mejorar la acumulación de carbono en almacenes (tales como raíces, tubérculos, semillas, tallos, y bulbos), por lo tanto incrementando el tamaño de los varios almacenes (raíces y tubérculos más grandes) y subsecuentemente incrementar el rendimiento.

. ..—.... *.**.. La disponibilidad de carbón incrementado en estos almacenes podría mejorar la composición de componente celular (por ejemplo, aceite, proteína, almidón y producción de sacarosa y sólidos uniformemente). Por lo tanto, muchas secuencias de ácidos nucleicos diferentes que codifican una actividad sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa pueden aislarse y utilizarse en la presente invención. El ADNc de SBPasa a partir de Chiorella sorokiniana se identifica en la presente y puede ventajosamente utilizarse en conexión con esta invención. Este gen también puede desrregularse con respecto a la luz mediante la alteración del residuo de cisteína por otro aminoácido, por ejemplo, serina. Preferiblemente, cualquier secuencia de ADNc que codifica SBPasa que es aproximadamente 85% idéntica al ADN de Chiorella sorokiniana está dentro del alcance de esta invención, más preferiblemente dicha secuencia de ADNc que es aproximadamente 90% idéntica al ADNc de Chiorella sorokiniana, y más preferiblemente aproximadamente 95% idéntica al ADNc de Chiorella sorokiniana. Además, cualquier secuencia de aminoácidos que codifica SBPasa que es aproximadamente 85%, y más preferiblemente aproximadamente 90% similar a la secuencia de aminoácidos pronosticada de Chiorella sorokiniana descrita en la presente se considera dentro del alcance de esta invención. Los genes de bifosfatasa a partir del quimoautótrofo facultativo Alcaligenes eutrophus (actualmente denominado Ralstonia eutropha) y a partir del alga Synechococcus lepoliensis codifica proteínas con una actividad dual, FBPasa y SBPasa, en el ciclo de Calvin (Yoo y Bowien, 1995; Gerbling et al., 1986). Las proteínas que codifican genes con actividad SBPasa pueden clonarse a partir de estos o de otros organismos por cualquier experto en la técnica utilizando métodos bien establecidos. La fuente de los genes de SBPasa para el uso en esta invención como se describen no se limita a los organismos descritos anteriormente y no debe interpretarse en ningún sentido para limitar el alcance de la presente invención. En una modalidad de la invención, el gen SBPasa puede fusionarse a un péptido de tránsito del cloroplasto, con el objeto de dirigir la proteína SBPasa al plastidio. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que varias otras construcciones quiméricas pueden hacerse que utilizan la funcionalidad de un péptido de transito del plastidio particular para importar la enzima sedoheptulosa-1 ,7-bifosfatasa dentro del plastidio de la célula vegetal dependiendo de la especificidad del tejido promotor.

Construcción del gen y modificaciones Una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa considerada en esta invención incluye cualquier secuencia de aminoácidos, tal como proteína, polipéptido, o fragmento peptídico, que demuestra la capacidad para catalizar la desfosforilación de sedoheptulosa 1 ,7-bifosfato a sedoheptulosa 7-fosfato y fosfato inorgánico. Como se describió anteriormente, estas pueden ser secuencias obtenidas a partir de una fuente heteróloga, tal como alga, bacteria, hongo, y protozoo, o secuencias vegetales endógenas, por las cuales ingresa cualquier secuencia que puede encontrarse naturalmente, en una células vegetal, incluyendo secuencias vegetales nativas (natural) así como secuencias a partir de virus vegetales o bacterias patogénicas vegetales. Se reconocerá por un experto en la técnica que las secuencias del gen de la enzima SBPasa también pueden modificarse utilizando técnicas estándar tales como mutación sitio específica o PCR, o la modificación de la secuencia también puede lograrse mediante la producción de una secuencia sintética de ácido nucleico y se considerará una secuencia de ácido nucleico de la enzima SBPasa de esta invención. Por ejemplo, las posiciones cambiantes en los codones pueden cambiarse de manera que la secuencia de ácido nucleico codifique la misma secuencia de aminoácidos, o alternativamente, los codones pueden alterarse de tal manera que las sustituciones de aminoácidos conservativos o no conservativos resultan. En cada caso, el péptido o la proteína mantiene la actividad enzimática deseada y por lo tanto se considera parte de esta invención. En una modalidad de la invención, la secuencia de ácido nucleico se modifica para que se cambien los residuos de cisteína en las secuencias de aminoácidos a un diferente aminoácido para prevenir la formación de enlaces disulfuro en el polipéptido maduro entre los residuos de cisteína que proveen la actividad enzimática sin importar la presencia de luz y también por lo tanto previene la inactivación de la proteína nativa mediante oxidación. Por ejemplo, en la SBPasa, de trigo, el residuo de cisteína en las posiciones de 52 y 57 (números correspondientes a la SBPasa madura de trigo como se describió en Raines et al. (1999) se modifican a un aminoácido diferente tal como serina, alanina o glicina para prevenir la formación del enlace disulfuro entre estos. Correspondientemente, el residuo de cisteína en las pociones de aminoácidos 110 y 115 de la SBPasa de Chiorella (que corresponde a la SBPasa Chiorella numerada en SEQ ID NO:12) también podría modificarse para el mismo efecto. Una secuencia de ácido nucleico de una enzima SBPasa puede ser una secuencia de ADN o ARN, derivada a partir de ADN genómico, ADNc ARNm, o puede sintetizarse en total o en parte. La secuencia génica estructural puede clonarse, por ejemplo, al aislar el ADN genómico a partir de una fuente apropiada, y amplificar y clonar la secuencia de interés utilizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Alternativamente, la secuencia génicas pueden sintetizarse, ya sea completamente o en parte, especialmente en donde se desea proveer secuencias preferidas a la planta. Por lo tanto, todo o una porción del gen estructural deseado puede sintetizarse utilizando los codones preferidos mediante un hospedero vegetal seleccionado. Los codones preferidos para plantas pueden determinarse, por ejemplo, a partir de los codones utilizados más frecuentemente en las proteínas expresadas en una especie hospedera vegetal particular. Otras modificaciones de las secuencias génicas pueden resultar en mutantes que tienen una ligera actividad alterada. >• •* » t J- Si se desea, la secuencia génica del gen sbpase puede cambiarse sin cambiar la secuencia de proteína/aminoácido de tal manera que puede incrementarse la expresión y por lo tanto afectarse incluso más positivamente el contenido de carbohidrato en las plantas transformadas. Una manera preferida para hacer los cambios en la secuencia del gen sbpase se establece en la publicación PCT WO 90/10076. Un gen sintetizado mediante la metodología establecida en esta puede introducirse dentro de las plantas como se describe a continuación y resultar en niveles mayores de expresión del encima SBPasa. Esto puede ser particularmente útil en monocotiledóneas tales como maíz, arroz, trigo, azúcar de caña y centeno.

Promotores Varios promotores que están activos en las células vegetales se han descrito en la literatura. Estos incluyen los promotores de nopalin sintasa (NOS) y octopin sintasa (OCS) (los cuales se portan en plásmidos que inducen tumor de Agrobacterium tumefaciens), promotores del virus de coliflor tales como el virus del mosaico de la coliflor 19S y 35S (CaMV) y el virus del mosaico de la higuera (FMV) promotores 35S, el promotor inducible por luz a partir de la subunidad pequeña de la ribulosa-1 , 5-bis-fosfato carboxilasa (ssRubisco), un polipéptido vegetal muy abundante, y los promotores del gen de la proteína de unión de clorofila a/b, etc. Todos estos promotores se han utilizado para crear varios tipos de construcciones de ADN que se han expresado en plantas; véase, por ejemplo, publicación PCT WO 84/02913.

Los promotores que se conocen o que se encuentran como que causan transcripción de ADN en las células vegetdales pueden utilizarse en la presente invención. Dichos promotores pueden obtenerse a partir de una variedad de fuentes tales como plantas y virus vegetales e incluyen, pero no se limitan a, el promotor CaMV35S mejorado y promotores aislados a partir de genes vegetales tales como los genes ssRUBISCO. Se prefiere que el promotor particular seleccionado deba ser capaz de ocasionar suficiente expresión para resultar en la producción de una cantidad efectiva de encima sedoheptulosa 1 ,7-bisfosfatasa para ocasionar el incremento deseado en la asimilación de carbono, exportación y almacenamiento. La expresión de las moléculas de ADN de doble hebra de la presente invención puede dirigirse mediante un promotor constitutivo, que expresa la molécula de ADN en todos o en la mayoría de los tejidos de la planta. Además, también puede preferirse el llevar a cabo la expresión del gen sbpase en tejido específicos de la planta, tales como hoja o tallo, y el promotor elegido debe tener el tamaño deseado y la especificidad de desarrollo. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la cantidad seudoheptulosa 1 ,7-bisfotasa necesaria para inducir el incremento deseado en la asimilación, exportación, o almacenamiento de carbono pueden variarse con el tipo de planta. Por lo tanto, la función del promotor debe optimizarse al seleccionar un promotor con las capacidades de expresión de tejido deseada y fuerza del promotor aproximada y seleccionar un transformante que produce la actividad seudoheptulosa 1 ,7-bisfosfatasa deseada o el cambio deseado en el metabolismo de carbohidratos en los -L-tt-fc-»-. . y , y y*y*.y.. ,l.yy . *. . - .-¿.t--_- -. -^-«-..i-. . — ..-HJ-.M..-<. .. ....... , M. y,y,. ,~ .%. i ?. ?.A tejidos blanco. Este método de selección a partir del agrupamiento de transformantes se emplea rutinariamente en la expresión de genes estructurales heterólogos en plantas debido a que su variación entre transformantes que contiene el mismo gen heterólogo debido al sitio de inserción del gen dentro del genoma vegetal (comúnmente referido como un "efecto posicional"). Además de los promotores que ocasionan transcripción (constitutivamente o tejido específica) del ADN en las células vegetales, otros promotores pueden identificarse para uso en la invención presente mediante la selección de una genoteca de ADNc vegetal para genes que se expresan selectivamente o preferiblemente en los tejidos blanco y luego determinar la regiones promotoras. Para el propósito de la expresión del gen sbpasa en los tejidos fuente de la planta, tales como la hoja o tallo, se prefiere que los promotores utilizados en las moléculas de ADN de doble hebra de la presente invención tengan una expresión incrementada en estos tejidos específicos. Para este propósito, uno puede elegir a partir de un número de promotores para genes con expresión específica para hija o mejorada en la hoja. Los ejemplos de dichos genes conocidos a partir de la literatura son la glutamina sintetasa GS2 de cloroplasto a partir de chícharos (Edwards et al., 1990), la fructosa, 1 ,6-bispofatasa de cloroplasto (FBPasa) a partir de trigo (Lloyd et al., 1991 ), la ST-LS1 fotosintética nuclear a partir de patata (Stockhaus et al., 1989), y los genes de amonia ligasa de fenil alanina (PAL) y de calcona sintasa (CHS) a partir de Arabidopsis thaliana (Leyva et al., 1995). También se muestran que Í ?.. mLiJ son activas en los tejidos fotosintéticamente activos la ribulosa-1 ,5bisfosfato carboxilasa (RUBISCO) aislada a partir de lárice del oeste {Larix laricina) (Campbell et al., 1994); el gen cab, que codifica para la proteína de unión a la clorofila a/b de PSII aislado a partir del pino (cab6; Yamamoto et al., 1994), 5 trigo, (Cab-1 ; Fejes et al., 1990), espinacas (CAB-1 ; Luebberstedt et al 1994), y arroz (cabI R: Luán et al., 1992); la piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) a partir de maíz (Matsuoka et al., 1993); el gen de tabaco Lhcb1*2 (Cerdan et al., 1997) el gen simport de sacarosa-H+ de SUC2 de Aradidopsis thaliana (Truernit et al., 1995); y las proteínas de las membranas tilacoides, aisladas a 10 partir de espinacas (psaD, psaF, psaE, PC, FNR, atpC, atpD, cab, rbcS; Oelmueller et al., 1992). Otras proteínas de unión a clorofila a/b se han estudiado y descrito en la literatura, tales como LhcB y PsbP a partir de la mostaza blanca {Sinapis alba; Kretsch et al., 1995). Los promotores que ocasionan la producción de SBPasa específicamente en los tallos, hojas, o 15 tipos celulares específicos en estos tejidos son útiles en la presente invención. Por ejemplo, el promotor específico para la lámina de la hoja RbcS es uno de dicho promotores específicos de tejido. Por lo tanto los promotores nativos para el maíz, trigo, cebada, y arroz pueden obtenerse y utilizarse en la presente invención así como los promotores heterólogos a partir de otros 20 organismos que se muestra que funcionan de una manera constitutiva/especifica de tejido. El metabolismo del carbono en las plantas C4 tal como maíz está más especializado que en las plantas C3 tales como el tabaco. En las plantas C4, los metabolitos generados a partir del ciclo de Calvin en el cloroplasto de las células de la lámina de la hoja deben transportarse al citoplasma de las células mesófilas donde la biosíntesis de sacarosa toma lugar. Por lo tanto, los promotores específicos de células se necesitan para la expresión correcta del gen en el tipo celular apropiado en cosechas C4. Por ejemplo, el promotor específico del haz de la hoja RbcS podría ser útil para la expresión de SBPasa en el tipo celular apropiado en el maíz. Para el propósito de la expresión de un gen sbpse (que codifica una proteína regulada por luz o una proteína modificada para que este constitutivamente activa) solamente cuando la planta se activa fotosintéticamente, se prefiere que los promotores utilizados en las moléculas de ADN de doble hebra de la presente invención tengan la expresión en la presencia de luz solamente. Para este propósito, uno puede elegir a partir de un número de promotores para genes regulados por luz, incluyendo FBPasa a partir del trigo (Miles, et al, 1993), piruvato ortofosfato dicinasa a partir del maíz (Sheen, 1991 ), y cloroplasto aldolasa a partir del arroz (Kagaya et al., 1995). El ARN producido mediante la construcción de ADN de la presente invención también puede contener una secuencia líder 5' no traducida. Esta secuencia puede derivarse a partir del promotor seleccionado para que exprese el gen y puede modificarse específicamente de manera que incremente la traducción del ARNm. Las regiones 5' no traducidas también pueden obtenerse a partir de ARN virales, a partir de genes eucariontes adecuados, o a partir de una secuencia génica sintética. La presente invención no se limita a construcciones, como se presenta en los siguientes ejemplo, en donde la región no traducida se deriva a partir de la secuencia 5' no traducida que acompaña la secuencia promotora. Más que esto, la secuencia líder no traducida puede derivarse a partir de un promotor no relacionado o secuencia codificante. Generalmente, la expresión óptima en las plantas monocotiledóneas y algunas plantas dicotiledóneas se obtiene cuando una secuencia intrónica se inserta entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural o, opcionalmente, puede insertarse en la secuencia estructural codificante para proveer una secuencia codificante interrumpida. Un ejemplo de dicha secuencia intrónica es el intrón HSP 70 descrito en WO 93/19189.

Señal de poliadenilación La región 3' no traducida del gen de la planta quimérica contiene una señal de poliadenilación que funciona en las plantas para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados hacia el extremo hacia el extremo 3' del ARN. Los ejemplos de las regiones 3' adecuadas son (1 ) las regiones 3' transcritas, no traducidas que contiene la señal de poliadenilación del los genes del plásmido inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de la nopalin sintasas (NOS), y (2) genes vegetales semejantes a los genes de la proteína de almacenamiento de soya y al gen de la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa (ssRUBISCO).

L--.- -i . --« -» t -J--t-.~'* . - -. ,-- < .--. . -- .-.-_ -. «-, ..--. * . -,— .-» ..- .. ..,. .. ..y-. .. .i . . -.- Expresión dirigida al plastidio de actividad de sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa En una modalidad de la invención, el gen sbpase puede fusionarse a un péptido de transito de cloroplasto, con el objeto de dirigir la proteína SBPasa al plastidio. Como se utiliza en la presente, el cloroplasto y el plastidio se pretende que incluyan varias formas de plastidios que incluyen amiloplastos. Muchas proteínas localizadas en el plastidio se expresan a partir de genes nucleares como precursores y se dirigen al plastidio mediante un péptido de transito del cloroplasto (CTP), el cual se remueve durante los pasos de importación. Los ejemplos de dichas proteínas de cloroplasto incluyen la subunidad pequeña de la ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa (ssRUBISCO, SSU), 5-enolpiruvatoshimicato-3-fosfato sintasa (EPSPS) ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, la proteína II del complejo de cosecha mediante luz y la proteína F, y la tioredoxina F. La secuencia de direccionamiento al plastidio puede ser, pero no limitarse a, el péptido de direccionamiento al cloroplasto nativo (CTP) identificado en el ADNC SBPasa de trigo. Se ha demostrado que las proteínas no plastídicas pueden dirigirse al cloroplasto mediante el uso de proteínas de fusión con un CTP y que una secuencia CTP es suficiente para dirigir una proteína al plastidio. Los expertos en la técnica reconocerán que varias otras construcciones quiméricas pueden hacerse que utilicen la funcionalidad de un péptido de transito del plastidio particular para importar la enzima dentro del plastidio de la célula vegetal dependiendo de la especificidad de tejido del promotor.

Combinaciones con otros transqenes El efecto de sbpase en las plantas transgénicas pueden mejorarse al combinarlo con otros genes que afecten positivamente la asimilación o contenido de carbohidrato, tal como un gen que codifica para una sacarosa fosforilasa como se describió en la publicación PCT WO 96/24679 o genes ADPGPP tales como el gen glgC de E. coli y su mutante G/gc16. La publicación PCT WO 91/19806 describe como incorporar el gen posterior dentro de muchas especies vegetales con el objeto de incrementar el almidón o los oídos. Otro gen que puede combinarse con sbpase para incrementar la asimilación, exportación o almacenamiento de carbono es un gen que codifica para la sacarosa fosfato sintasa (SPS). La publicación PCT WO 92/16631 describe uno de dichos genes y su uso en plantas transgénicas.

Otro gen con el cual SBPasa puede combinarse es la fructosa 1 ,6-bifosfato aldolasa.

Transformación/regeneración vegetal Para desarrollar las construcciones de ácido nucleico de esta invención, varios componentes de la construcción o fragmentos de las mismas normalmente se insertarán dentro de vectores de clonación convenientes, por ejemplo un plásmido que es capaz de replicación en un hospedero bacteriano, por ejemplo, E. coli. Numerosos vectores existen que se han descrito en la literatura, muchos de los cuales están comercialmente disponibles. Después de cada clonación, el vector de clonación con el inserto deseado puede aislarse y someterse a manipulación adicional, tal como digestión mediante restricción, inserción de nuevos fragmentos o nucleótidos, ligación, deleción, mutación, resección, etc. De manera que se introduzcan nucleótidos a los componentes de la secuencia deseada. Una vez que la construcción se ha completado, esta puede entonces transferirse a un vector apropiado para manipulación adicional de conformidad con la manera de transformación de la célula hospedera. Una molécula de ADN de doble hebra de la presente invención contiene un gen sbpase que puede insertarse dentro del genoma de una planta mediante cualquier método adecuado. Los métodos preferidos de transformación de células vegetales o tejidos son el método de transformación mediado por Agrobacterium y el método de transformación mediado por biolística o pistola de partícula. Los vectores de transformación vegetal adecuados para el propósito de la transformación mediada por Agrobacterium incluyen aquellos derivados a partir de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como aquellos descritos, por ejemplo, por Herrera-Estrella et al. (1983), Bevan (1984), Klee et al. (1985) y la publicación EPO 120,516. Además de los vectores además de los vectores de transformación vegetal derivados a partir de los plásmidos Ti o inductores de raíz (Ri) de Agrobacterium, los métodos alternativos pueden utilizarse para insertar las construcciones de ADN de esta invención dentro de células vegetales. Dichos métodos pueden implicar, pero no se limitan a Sbpase por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la toma libre de ADN, i A -» *-«_-, .* »-. • _J. la administración libre de ADN medíante bombardeo de microproyectiles, y la transformación utilizando virus o polen. Un vector de expresión del plásmido adecuado para la introducción de un gen sbpase en monocotiledóneas utilizando electroporación o transformación mediada por pistola de partícula se compone de lo siguiente: un promotor que es constitutivo o especifico de tejido; un intrón que provee un sitio de procesamiento para facilitar la expresión del gen, tal como el intrón Hsp70 (publicación PCT W093/19187); y la secuencia de poliadenilación 3' tal como la secuencia de nopalin sintasa (NOS 3'; Fraley et al., 1983). Este cassette de expresión puede ensamblarse en replicones de alto número de copias adecuados para la producción de grandes cantidades de ADN. Un ejemplo del vector del cassette del plásmido Ti útil para la transformación vegetal es PMON-17227. Este vector se describe en le publicación PCT WO 92/04449 y contiene un gen que codifica una enzima que confiere resistencia a glifosato (denominada CP4), la cual es un excelente gen marcador de selección para muchas plantas. El gen se fusiona al péptido de transito de cloroplasto EPSPS de Arabidopsis (CTP2) y es expresa a partir del promotor FMV como se describe en la presente. Cuando el número adecuado de células (o protoplastos) que contienen el gen de sedoheptulosa-1 ,7-bifosfatasa o el ADNc se obtiene, las células (o protoplastos) se regeneran dentro de plantas completas. La elección de la metodología no es crítica para el paso de regeneración, aunque los protocolos adecuados están disponibles t .J-aÜ « A-t .jj-- - - >- £r - - -<*-g > * A '' para hospederos a partir de leguminosas (alfalfa, soya, clavo, etc.), Umbelliferae (zanahoria, apio, chiribía), Cruciferae (calabaza, rábano, canola/colza, etc.), Cucurbitaceae (melón y pepino), Gramineae (trigo, centeno, arroz, maíz, etc.), Solanaceae (patata, tabaco, tomate, pimiento), varias cosechas florales, tales como girasol, y árboles que contienen nueces, tales como almendras, anacardo, nogal, y nueces. Véase, por ejemplo, Ammirato et al. (1984); Shimamoto et al. (1989); Fromm (1990); Vasil et al. (1990); Vasil et al. (1992); Hayashimoto (1990); y Datta et al. (1990). Las plantas que pueden hacerse para que tengan asimilación mejorada y/o beneficiosa de carbón, incremento en ia exportación y partición de carbón mediante la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, acacia, alfalfa, aneth, manzana, chabacano, alcachofa, arugula, espárrago, aguacate, banana, cebada, frijoles, rábano, zarzamora, arándano, bróculi, calabacita de bruselas, calabaza, cañóla, melón, zanahoria, casaba, coliflor, apio, cereza, cilantro, cítrico, clementinas, café, maíz, algodón, pepino, pino Douglas, berenjena, endibia, escarola, eucalipto, hinojo, higo, calabacino, uva, toronja, ligamasa, jicama, kiwi, lechuga, poro, limón, lima, pino Loblolly, mango, melón, hongo, nuez, avena, okra, cebolla, naranja, planta ornamental, papaya, perejil, chícharo, durazno, cacahuate, pera, pimiento, pérsimo, pino, piña, plátano, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza, membrillo, pino radiado, radicchio, rabanillo, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soya, espinaca, calabaza, fresa, rábano dulce, azúcar de caña, girasol, patata **•* " ' ' ¡a* fc'-s-s a... dulce, ocozol, tangerina, té, tabaco, tomate, césped, vid, sandía, trigo, batata, y calabacita. Los siguientes ejemplos se proveen para elucidar mejor la práctica de la presente invención y no deben interpretarse de manera que limiten el alcance de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán que varias modificaciones, truncaciones, etc., pueden hacerse a los métodos y genes descritos en la presente mientras no se aparten del espíritu y alcance de la presente invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Clonación del ADNc y sobre expresión de SBPasa para producción de anticuerpo Para aislar la región del gen que codifica la proteína SBPasa madura (sin CTP), una reacción de RTPCR se llevó a cabo. Un microgramo de ARN de hoja CV OSLO, de Triticum aestivum se combinó con 100 pmoles de iniciadores hexámeros al azar (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) o con 100 pmoles de iniciador oligo dT (Promega, Madison, Wl), calentado por 5 minutos a 75°C, y enfriado en hielo. La síntesis de ADNc de una sola hebra se llevó a cabo utilizando transcriptasa reversa Superscript II™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) de conformidad con el protocolo del fabricante. La reacción de transcripción reversa terminada se diluyó 1 :7. Tres microlitros de los productos de síntesis de la primera hebra diluidos se combinaron con 100 µM de cada dNTP, 50 pmoles de cada iniciador específico con homología al extremo 5' del gen se diseñaron para generar un sitio de rompimiento Ndel para propósitos de clonación (5'-ACATATGTGCGCGATCGGCGA-3', SEQ ID NO: 1 ), 50 pmoles de un iniciador específico del gen con homología por el extremo 3' de gen (5'-GGATCCAGAAGAAGATTATTAGGCG-3', SEQ ID NO:2), y 5 unidades de polimerasa PWO™ (Boehringer, Mannheim, Alemania) en 100 µL. Las condiciones de ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, 40 segundos; 56°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto 30 segundos; (5 ciclos) seguido por 95°C, 40 segundos; 61 °C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto 30 segundos (30 ciclos). El producto de PCR del gen de la proteína SBPasa madura de 982 pb se purificó, clonó dentro del vector de clonación PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar pMON47205 (figura 1 ), y se transformó dentro de células E. coli competentes. Las clonas que contienen los insertos se seleccionaron con medio que contenía canamicina, se purificó el plásmido, y se digirió con BamHl para seleccionar la orientación adecuada del vector de clonación. El análisis de secuencia reveló que la secuencia de aminoácidos pronosticada (SEQ ID NO:9) es idéntica a la secuencia publicada (Raines et al., 1992) que inicia en el residuo 73, a lo largo de la secuencia nucleotídica (SEQ ID NO:3) y difiere en dos posiciones (residuo 294 de T a C; residuo 572 de C a T). Los plásmidos seleccionados se restringieron con Ndel y BamHl, se clonaron r-^?-la direccionalmente bajo el control del promotor de la polimerasa T7 inducido por IPTG de el vector de expresión bacteriana pET 15b (Novagen, Madiso?, Wl) linearizado con NdelIBamHI, y transformado dentro de DH5a. Los transformantes se seleccionaron por medio del análisis de restricción de NdellBamHI y las clonas que poseían un inserto se seleccionaron, se pi rificó el plásmido, y se transformó dentro de E. coli BL21 (DE3) para propósitfs de expresión de proteína Las células E. coli BL21 (DE3) se transformaron ccfn la construcción de ADNc pET15b-SBPasa se indujeron con IPTG 2 mM por 2.5 horas después de las cuales fue aparente una banda de proteína distinta de aproximadamente 38 kDa sobre un gel de SDS-PAGE, la cual se correlaciona con el tamaño de la cadena polipeptídica de la subunidad de SBPasa dimérica. La proteína expresada por SBPasa madura se purificó basándose en la afinidad de los residuos de histidina para los iones de níquel inmovilizados. La purificación se llevó a cabo bajo condic ones denaturalizantes utilizando resina Ni-NTA Superflow (QIAGEN, Valencia! CA) como se describió en el protocolo del fabricante. Una atracción de 2 mL. que contenía 1 mg de proteína SBPasa purificada emulsificada con un volumen igual de adyuvante completo (Sigma, St. Louis, MO) se utilizó para inocular una cabra para producción de anticuerpos utilizando métodos estándar (Antech Company, St. Louis, MO). El suero preinmune no mostró reactiyidad con SBPasa.

EJEMPLO 2 Clonación de ADNc de SBPasa para la expresión en plantas Para clonar la región del gen SBPasa que codifica el péptido de transito del cloroplasto, un procedimiento de PCR anclado modificado para la amplificación rápida de los extremos de ADNc (Frohman, 1990; Jain et al., 1992) se utilizó. Ochocientos nanogramos de ARN total se combinaron con 10 ng de un iniciador específico del gen (5'- TTCCTCAGAGCACGCGTACTTG-3', SEQ ID NO:4), se calentó a 75°C por 5 minutos, y se enfrió en hielo. La síntesis de la primera hebra de ADN se llevó a cabo utilizando transcriptasa reversa Superscript II™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) de conformidad con el protocolo del fabricante. La reacción terminada de transcripción reversa se trató con una unidad de ribonucleasa H por 20 minutos a 37°C. 5 minutos a 95°C, y se enfrió en hielo. Los iniciadores de exceso y dNTP se removieron mediante la centrifugación a 2,000 x g a través de una centrífuga con filtro Ultrafree-MC (límite de PM 30,000, Millipore, Bedford, MA), y un retentato se concentró a 15 µL en un Speedvac Savant (Savant Instruments, Holbrook, NY). Los productos de síntesis de la primera hebra se combinaron con 10 µL de mezcla de adición de nucleótidos (amortiguador de adición de nucleótidos 1X [BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD], dATP 0.4 mM, 10 unidades de desoxitransferasa terminal) y se incubaron a 37°C por 10 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 95°C por 5 minutos, se diluyó a 0.5 mL con TE, pH 8.0, y se utilizó como un *i ; i ^ .&*.. -i» - agrupamiento de ADNc. Una mezcla de 10 µL del agrupamiento de ADNc, 10 µL de amortiguador de polimerasa PWO™ 10X (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD), 100 µM de cada dNTP, 25 pmoles de un iniciador específico del gen (SEQ ID NO:4), 10 pmoles del iniciador adaptador de poli (dT) (5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3'; (SEQ ID NO:5), y 5 unidades de polimerasa PWO™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) en 100 µL se amplificaron. Las condiciones del ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, 2 minutos; 45°C, 5 minutos; 72°C, 40 minutos; (1 ciclo) seguido por 95°C, 50 segundos; 48°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto (3 ciclos). Los productos de PCR se purificaron a partir de los iniciadores en exceso mediante precipitación con etanol. El concentrado se resuspendió en 50 µL de agua y se sometió a otra ronda de amplificación utilizando un nuevo iniciador específico del gen anidado (5'-CATGGGAGTACTCCAACGCCTC-3\ SEQ ID NO:6) y un iniciador del adaptador (5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3', SEQ ID NO:7). Las condiciones del ciclo de PCR fueron como sigue:95°C, 40 segundos:58°C, 1 minuto, 72°C, 30 segundos (30 ciclos). El producto de PCR de -500 pb se purificó en gel, se subclonó dentro del vector de clonación PCR-Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA) para formar pMON47207 (figura 2), y se transformó dentro de la célula (Invitrogen, Carlsdab, CA) para caracterización posterior. El análisis de secuencia (SEQ ID NO:8) mostró que esta secuencia difiere de la secuencia publicada en 9 posiciones (30, C a T; 42, G a C; 44 A a G; 187, C a A; 204, # a G; 228, C a G; 259, C a T; 348, G a C; y 351 , C a G) resultando en tres _A_L cambios de aminoácidos pronosticados (30, Arg, a Cys; 44, His a Arg; 207, Gln a Glu). Con el objeto de evaluar la expresión de la SBPasa de trigo en plantas, pMON47205 (figura 1 ) y pMON47207 (figura 2) fueron restringidos cada uno con Salí y BamHl. Los fragmentos que contienen la secuencia que codifica la SBPasa madura y la región CTP, respectivamente, se purificaron en gel, y se ligaron juntas para formar pMON47208 (figura 3). PMON47208 se restringió con Xbal y BamHl y la secuencia que codificaba SBPasa se purificó en gel y se ligó a pMON 10098 linearizado con Xbal/BamHI (figura 4). El vector final formado fue pMON47200 (figura 5) con el promotor E35S de CaMV, la secuencia codificante del gen completo para SBPasa, la región de poliadenilación no traducida hacia 3' de NOS, y la resistencia a canamicina para la selección en plantas.

EJEMPLO 3 Expresión transitoria de protoplastos de maíz Con el objeto de evaluar la expresión de las subunidades SBPasa de trigo y luego ensamblarlas dentro de las enzimas activas, se construyeron los vectores para que contuvieran el promotor E35S de CaMV, la secuencia codificante para la proteína SBpasa completa incluyendo el CTP, la señal determinación 3' de NOS, y la resistencia a ampicilina para la selección en E. coli. El gen SBPasa se aisló como un fragmento Xbal-BamHI a partir de pMON47200. El gen SBPasa se ligó dentro de CaMV E35S Xbal-BamHI la región de pMON999 que contenía 3' de NOS (figura 6) para dar pMON47203 (figura 7). Las construcciones de ADN se electroporaron dentro de los protoplastos de maíz de conformidad con el método de Sheen et al. (1991 ).

EJEMPLO 4 Análisis de los protoplastos de maíz transformados Las muestras de protoplastos concentrados transformados con pMON47203 (SBPasa) y sin ADN se fundieron en 0.18 mL de amortiguador de extracción (HEPES 50 mM pH 7.5, fructosa bisfosfato, 1 mM, sedoheptulosa-1 ,7-bisfosfato 1 mM, MgCI2 10 mM, MnCI2 10 mM, DTT 10 mM, polivinilpolipirrolidona al 1%, glicerol al 10% e inhibidores de proteasa Complete™ (Boehringer, Mannheim, Alemania)) en hielo. Las células en cada suspención se mezclaron bien y se clarificaron a 2,000 x g por 15 minutos.

Los sobrenadantes se desalinearon utilizando columnas G25 (The Nest Group, Southboro, MA). El contenido total de proteína de la proteína desalada se determino utilizando el ensayo de microproteína BioRad (BioRad, Hercules, CA) de conformidad con el protocolo del fabricante. La expresión y el tamaño de la proteína se determinaron mediante análisis de Western blot (figura 8). Significativamente más proteínas se detectó mediante reactividad cruzada con anticuerpos anti SBPasa de trigo para cabra en protoplastos transformados con pMON47203 que controlan protoplastos, indicando la sobre expresión exitosa de la enzima SBPasa en las células vegetales. La movilidad de la SBPasa de trigo (pMON47203) expresada en protoplastos de maíz fue de aproximadamente 38 kDa, la misma que la SBPasa de la hoja de trigo endógena, indicando el correcto procesamiento de la CTP. La actividad SBPasa se ensayó al permitir la hidrólisis de SBP por 10 minutos seguido por la medición de liberación de fosfato. La reacción se inició al combinar 20 µL de amortiguador (Tris 100mM, 8.2, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, 1.5 mM EDTA, glicerol al 10%) que contiene 5 µg de extracto de proteína desalificada con 55 µL de amortiguador de ensayo (Tris 50 mM, 8.2, MgCI2 10 mM, DTT 10 mM, EDTA 1.5 mM, sedoheptulosa-1 ,7-bisfosfato 0.27 mM). La reacción se detuvo después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente al añadir 30 µL de ácido perclórico 1 M. La proteína precipitada se removió mediante centrifugación, 250 µL de desarrollador (molibdato de amonio al 1 %, HCl 1 N, verde malaquita al 0.05% (Itaya y Michio, 1966)) se añadió a 50 µL de sobrenadante, y la cantidad de fosfato liberado se determinó al medir la observancia a 660 nm. Una curva estándar de fosfato (0.5-10 nmol) se utilizó para cuantificación. Los protoplasto transformados con pMON47203 liberaron tres veces más fosfato a partir de sedoheptulosa-1 ,7-bisposfato que los protoplastos control (figura 9). El alto nivel de actividad observada por los protoplastos transformados con el gen de SBPasa de trigo provee evidencia de que la proteína SBPasa detectada por análisis Western blot es funcional. r ¡^.^ EJEMPLO 5 Expresión de SBPasa de trigo en tabaco Con el objeto de evaluar los efectos de la sobre expresión de 5 SBPasa a partir del trigo en el tabaco, pMON47200 (figura 5) se preparó y utilizó como el vector de transformación para la transformación de plantas de tabaco. Las células de plantas de tabaco se transformaron por transformación mediada por Agrobacterium con Horsch et al. (1985). Los vectores de transformación vegetal se movilizaron dentro de la cepa ABl de Agrobacterium 10 mediante electroporación. Las líneas de transformantes de tabaco crecidas en cámaras de crecimiento se generaron y se seleccionaron inicialmente mediante análisis Western blot para identificar expresores que utilizan anticuerpos de cabra generados en contra de trigo que expresa SBPasa. No fue posible, sin 15 embargo, separar la SBPasa de tabaco endógeno a partir de la SBPasa de trigo transgénico utilizando geles en gradiente de SDS-PAGE o geles de foco isoeléctrico para estas líneas transformantes de tabaco.

EJEMPLO 6 Clonación de ADNc de SBPasa a partir de Chiorella sorokiniana para la expresión en plantas Para determinar la secuencia del gene que codifica la proteína SBPasa a partir de Chiorella sorokiniana, varias reacciones de RT-PCR se llevaron a cabo. Un microgramo de ARN de Chiorella sorokiniana, se combinó con 100 pmoles de iniciador oligo dT (Promega, Madison, Wl), se calentó por 5 minutos a 75°C, y se enfrió en hielo. Las síntesis de la primera hebra de ADNc se llevó a cabo utilizando la transcriptasa reversa Superscript II™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) de conformidad con el protocolo del fabricante. La reacción de transcripción reversa terminada se diluyó 1 :7. Veinte microlitros de los productos de síntesis de la primera hebra diluida se combinaron con 100 µM de cada dNTP, 50 pmoles de un iniciador degenerado con homología al extremo 5' del gen (5'-GGIAACIATHTTYGGIGTITGG -3', SEQ ID NO: 10), 50 pmoles de un iniciador específico del gen con homología al extremo al extremo 3' del gen (5' - RTAICKIARIGTRTAYTTYTC -3', SEQ ID NO:11 ), y 5 unidades de polimerasa Taq (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) en 100 µL. Las condiciones de ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, minutos (1 ciclo) seguido por 95°C, 40 segundos; 35°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto (5 ciclos) seguido por 95°C, 40 segundos; 40°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto (30 ciclos). El producto de PCR de 550 pb que fue de 250 pb más grande que el tamaño esperado se purificó por gel, se clonó dentro del vector de clonación PCR- Blunt (Invitrogen, Carlsbad, CA), y se transformó dentro de células competentes E. coli. El plásmido se purificó a partir de la clonas que contenían el inserto que se habían seleccionado en medio que contenía canamicina. El análisis de secuencia reveló que la secuencia de aminoácidos pronosticada de este producto de 550 pb es PCR idéntica con la secuencia de 41 % de Chlamydomonas reinhardtii. Los residuos 226-251 de la secuencia de Chlamydomonas reinhardtii fue 81 % idéntica con la secuencia de Chiorella y los residuos 252-287 de la secuencia Chlamydomonas fue 86% idéntica pero hubo un espacio que codifica 62 residuos de Chiorella que presumible corresponden a un intrón. Por lo tanto este fragmento fue más probablemente amplificado a partir de ADN genómico contaminante. La secuencia codificante de 297 pb se utilizó para diseñar los iniciadores para RACE 5' y RACE 3' para identificar la secuencia del resto del gen. Para clonar la secuencia 5' remanente de SBPasa, un procedimiento de PCR de anclado modificado para la amplificación rápida de los extremos de ADNc (Frohman, 1990; Jain et al., 1992) se utilizó. Novecientos nanogramos de ARN total de Chiorella sorokiniana se combinaron con 20 pmoles de un iniciador específico del gen (5'- GATGGTCTCGGTCTCCTTCACG-3', SEQ ID NO: 13), se calentó a 75°C por 5 minutos, y se enfrió en hielo. La síntesis de la primera hebra de ADN se llevó a cabo utilizando transcriptasa reversa Thermoscript™ (BRL/life Technologies Inc. Gaithersburg, MD) a 55°C de conformidad con el protocolo del fabricante.

La reacción de transcripción reversa terminada se trató con una unidad de ribonucleasa H por 20 minutos a 37°C, 5 minutos a 95°C, y se enfrió en hielo. El exceso de iniciadores y de dNTP se removieron mediante centrifugación a 2,000 x g a través de una centrífuga con filtro Ultrafree-MC (límite de PM 30,000, Millipore, Bedford, MA), y el retentato se concentró a 15 µL en un Speedvac Savant (Savant Instruments, Holbrook, NY). Los productos de la síntesis de la primera hebra se combinaron con 10 µL de mezcla de agregación de nucleótidos (amortiguador de agregación de nucleótidos 1X [BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD], dATP 0.4 mM, 10 unidades de desoxitransferasa terminal) y se incubaron a 37°C por 10 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 95°C por 5 minutos, se diluye a 0.2 ml con Tris 10 mM, pH 8.5, y se utiliza como un agrupamiento de ADNc. Se amplificó una mezcla de 20 µL del agrupamiento de ADNc, 10 µL de amortiguador de polimerasa PWO™ 10X (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD), 100 µM de cada dNTP, 25 pmoles de un ¡niciador específico del gen (SEQ ID NO: 13), 10 pmoles del iniciador adaptador poli (dT) (5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3'; SEQ ID NO:5), y 5 unidades de polimerasa PWO™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) en 100 µL. Las condiciones para el ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, 2 minutos; 45°C, 5 minutos; 72°C, 40 minutos (1 ciclo) seguido por 95°C, 50 segundos; 48°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto (3 ciclos). Los productos de PCR se purificaron a partir de los iniciadores en exceso mediante precipitación con etanol. El concentrado se resuspendió en 50 µL de agua y se combinó con 10 µL de PWO™ polimerasa 10X buffer (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) en 100 µl, 50 µM de cada dNTP, 50 pmoles de un nuevo iniciador específico del gen agrupado (5'-CAGCCACTTGCCATCGTC-3', SEQ ID NO:14), 50 pmoles de un iniciador adaptador (5'-GGGTCGACATTCTAGACAGA-3\ SEQ ID NO:7), 5 unidades de polimerasa PWO™ (BRL/Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD). Las condiciones de ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, 40 segundos; 48°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto, 30 segundos (30 ciclos). El producto de PCR de 400 pb se purificó por gel, se subclonó dentro del vector de clonación PCR-Blunt TOPO II (Invitrogen, Carisbad, CA) y se transformó dentro de células E. coli competentes para caracterización adicional. El análisis de secuencia mostró que este fragmento de PCR fue parte de la secuencia 5' de Chiorella sorokiniana SBPasa. Esta secuencia entonces se utilizó para diseñar iniciadores adicionales para clonar la secuencia 5' remanente de la SBPasa utilizando el procedimiento de PCR anclado modificado para los extremos de ADNc de amplificación rápida (Frohman, 1990; Jain et al., 1992). Novecientos nanogramos de ARN total se combinaron con 20 pmoles de un iniciador específico del gen (5'-GATGGTCTCGGTCTCCTTCACG-3\ SEQ ID NO:15), se calentaron a 75°C por 5 minutos, y se enfrió en hielo. La síntesis de la primera hebra de ADN se llevó a cabo utilizando transcriptasa reversa Thermoscript™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) a 55°C de conformidad con el protocolo del fabricante. La reacción de transcripción ? » .-&> reversa terminada se trató con una unidad de ribonucleasa H por 20 minutos a 37°C, 5 minutos a 95°C, y se enfrió en hielo. Los iniciadores y dNTPs en exceso se removieron mediante centrifugación a 2,000 x g a través de una filtrocentrífuga Ultrafree-MC (límite de PM 30,000, Millipore, Bedford, MA), y el retentato se concentró a 15 µL en un Savant Speedvac (Savant Instruments, Holbrook, NY). Los productos de la síntesis de la primera hebra se combinaron con 10 µL de mezcla de agregación de nucleótidos (amortiguador de agregación de nucleótidos 1X [BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD], dATP, 0.4 mM, 10 unidades de desoxitransferasa terminal) y se incubaron a 37°C por 10 minutos. La mezcla de reacción se calentó a 95°C por 5 minutos, se diluyó a 0.2 mL con TE, pH 8.0, y se utilizó como un agrupamiento de ADNc. Una mezcla de 20 µL del agrupamiento de ADNc, 10 µL de amortiguador HotStarTaq™ polimerasa 10X Qiagen, Valencia. CA), 20 ul de amortiguador Q 5X (Qiagen, Valencia, CA) 50 µM de cada dNTP, 25 pmoles de un ¡niciador específico del gen (5'-TCCTCAGAGCACGCCAGCTTGC-3', SEQ ID NO:16), 10 pmoles del ¡niciador adaptador de poli (dT) (5'- GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)2 3'; SEQ ID NO:5), y 5 unidades de HotStarTag™ polimerasa (Qiagen, Valencia, CA) en 100 µL se amplificaron. Las condiciones de ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, 15 minutos; 45°C, 5 minutos; 72°C, 40 minutos (1 ciclo) seguido por 95°C, 50 segundos; 48°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto (3 ciclos). Los productos de PCR se purificaron a partir de los iniciadores en exceso mediante precipitación en etanol. El concentrado se resuspendió en 50 µL de agua y se combinó con 10 µL de amortiguador HotStarTaq™ polimerasa 10X (Qiaqen, Valencia. CA), 20 ul de amortiguador Q 5X (Qiagen, Valencia, CA), 50 uM de cada dNTP 50 pmoles del iniciador específico del gen agrupado novedoso (5'-AGCTGCTCATCGCCGAACGAGGTTG-3'. SEQ ID NO:17), 50 pmoles de un iniciador adaptador (5'-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3\ SEQ ID NO:7), y 5 unidades de HotStarTag™ polimerasa (Qiagen, Valencia, CA). Las condiciones de ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, 15 minutos (1 ciclo) seguido por 95°C, 40 segundos; 50°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto, 30 segundos (30 ciclos). El producto de PCR de 380 pb se purificó mediante gel, se clonó dentro del vector de clonación PCR-Blunt TOPO II (Invitrogen Carisbad, CA) y se transformó dentro de células competentes E. coli para caracterización adicional. El análisis de secuencia mostró que este fragmento de PCR contiene la secuencia remanente 5' de la SBPasa de Chiorella. El PCR se utilizó para aislar la secuencia 3' remanente de la SBPasa a partir de una genoteca de ADNc de Chiorella sorokiniana en pSportl construido utilizando el sistema de plásmido Superscript™ para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmido (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) de conformidad con el protocolo del fabricante. Un microgramo de ARN de Chiorella sorokiniana se combinó con 100 pmoles de ¡niciador oligo dT (Promega, Madison, Wl), calentado por 5 minutos a 75°C, y se enfrió en hielo. La síntesis de la primera hebra de ADNc se llevó a cabo utilizando transcriptasa reversa Thermoscript™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) a 60°C de conformidad con el protocolo del fabricante en lugar de la transcriptasa reversa Superscript™ (BRL/Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD) provista con el equipo. Una mezcla de 200 ng de la genoteca de ADN, 10 µL de amortiguador HotStarTaq™ polimerasa 10X (Qiagen, Valencia, CA), 50 µM de cada dNTP, 50 pmoles de un iniciador específico del gen (5'-AGTTCCTGCTGCAGGACGATGG-3'; SEQ ID NO: 18), 50 pmoles del iniciador específico del vector (5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3; SEQ ID NO: 19), y 5 unidades de polimerasa HotStarTag™ (Qiagen, Valencia, CA) en 100 µL se amplificaron. Las condiciones de ciclo de PCR fueron como sigue: 95°C, 15 minutos (1 » ciclo) seguido por 95°C, 40 segundos; 62°C, 1 minuto; 72°C, 1 minuto, 30 segundos (30 ciclos). Las secuencias sobrepuestas 5' y 3' se ensamblaron para dar la longitud total de la secuencia de SBPasa de Chiorella sorokiniana (SEQ ID NO:2) con la secuencia de aminoácidos pronosticada (SEQ ID NO:12).

CUADRO 1 Comparación de la secuencia de ácido nucleico derivada a partir de SBPasa de Chiorella sorokiniana (SEQ ID NO: 12) con las secuencias de aminoácidos de SBPasa conocidas. Los alineamientos se hicieron utilizando el programa Bestfit para determinar el porcentaje de homología en el cuadro a continuación. El programa BestFit utiliza el algoritmo homología local de Smith y Waterman (1981 ) para encontrar el mejor segmento de similitud entre dos secuencias.

Similitud Identidad Arabidopsis thaliana 76.7% 71.6% Chlamydomonas 82.0% 78.0% reinhardtii Spinacia ¡olerácea 74.3% 68.4% Triticum aestivum 72.0% 66.8% EJEMPLO 7 Clonación de qenes que codifican la actividad dual FBPasa v SBPasa Los genes de bifosfatasa a partir del quimoautótrofo facultativo Ralstonia eutropha (Alcalifenes eutrophus) y a partir de la alga Synechococcus lepoliensis codifican proteínas con una actividad dual, 5 FBPasa y SBPasa, en el ciclo de Calvin (Yoo y Bowien, 1995; Gerbiing et al., 1986). Un gen que codifica una proteína con actividad SBPasa se clonará a partir de Ralstonia eutropha utilizando PCR basándose en la secuencia descrita en Too y Bowien (1995). Este gen entonces se fusionará con un péptido de tránsito de cloroplasto, con el objeto de dirigir la proteína SBPasa 0 al plastidio.

EJEMPLO 8 Expresión de SBPasa en Chiorella y Ralstonia en el tabaco Con el objeto de evaluar los efectos de la sobreexpresión en el tipo silvestre de Chiorella o de su desregulación así como de SBPasa en Ralstonia en el tabaco, cada que inicialmente se clonará dentro del vector de clonación pCR® -Blunt II™ (Invitrogen, Carisbad, CA). Cada vector entonces se digerirá por EcoRI y los fragmentos purificados en gel que codifiquen cada una de SBPasa se ligará individualmente a pMON10098 EcoRI (figura 4). Cada uno de los tres vectores se utilizarán para la transformación de plantas de tabaco, como se describen Horsch et al. (19985). Los vectores de transformación vegetal se movilizan dentro de la cepa ABl de Agrobacterium mediante electroporación. Las líneas transformantes de tabaco crecidas en una cámara de crecimiento se generan y se seleccionan inicialmente mediante análisis Western blot para identificar la expresión utilizando anticuerpos de cabra generados en contra de trigo que expresa SBPasa. Subsecuentemente, para la SBPasa de Chiorella de tipo silvestre, la SBPasa de Chiorella desregulada y la SBPasa de Ralstonia en las líneas de tabaco que la expresan, las muestras de hoja se toman a varias etapas del desarrollo de la planta y se analizarán por cambios diurnos de carbohidratos no estructurales en la hoja (sacarosa, glucosa, y almidón hidrolizado hacia glucosa) por medio del equipo sacarosa/D-glucosa/D-fructosa (Boehringer Mannheim, Alemania).

Treinta a cincuenta miligramos de muestras de tejido de hoja de tabaco congelada se incubarán en 1 ml de agua a 85°C por 15 minutos. Los tubos se centrifugarán por 1 minuto a 10,000 x g y los sobrenadantes se guardarán para análisis de azúcar soluble. El concentrado se resuspenderá en 1 mL de agua a 85°C, se mezclará en un Vórtex, y se centrifugará como se describe anteriormente. El sobrenadante se removerá cuidadosamente y se añadirá a la fracción sobrenadante previa para el análisis de azúcar soluble (sacarosa y glucosa) mediante el equipo sacarosa/D-glucosa/D-fructosa (Boehringer Mannheim, Alemania). El almidón se extraerá a partir del concentrado utilizando la adición de 3 mL de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.6 al concentrado e incubando a 90°C por 10 minutos. Una vez que esté frío, 3 mL de amilo glucosidasa al 1% en acetato de sodio 0.1 M, pH 5.6 se añadirá y se mezclará. Las mezclas se incubarán en un baño de agua a 50°C por 3 horas. Se mezclarán cada media hora. Después de la centrifugación en una centrífuga de mesa a 900 x g por 30 minutos, los sobrenadantes se analizarán para contenido de glucosa. La glucosa libre se ajustará a glucosa anhidra (como ocurre en el almidón mediante la multiplicación por la relación 162/182). La alteración de la asimilación del carbono en el tejido de planta transgénica puede monitorearse mediante el perfil metabólico utilizando HPLC estándar, espectrometría de masa, y ensayos enzimáticos basados en metabolito.

EJEMPLO 9 Desregulación de SBPasa En la oscuridad, la SBPasa está inactiva debido a la formación de enlaces disulfuro entre Cys-52 y Cys-57 (números que corresponden al trigo maduro SBPasa, CA Raines et al. 1999. J. Exp. Bot. 50: 1-8). En la luz, la tioredoxina reduce la unión disulfuro resultando en una enzima activa. La modificación de los residuos Cys a través de la mutagénesis podría prevenir la formación del enlace disulfuro y por lo tanto prevenir la inactivación de la proteína por la oxidación. La mutagénesis sitio dirigida para cambiar Cys-100 y Cys-115 (números que corresponden a SBPasa de Chiorella que incluyen CTP, SEQ ID NO:12) a Ser se llevará a cabo utilizando el equipo de mutagénesis sitio dirigida QuikChange™ (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando un iniciador mutagénico (5'-AAGGTGCGCACCGCCTCGTCCGGCGGCACCGCCTCCGTCAACTCGTTC GGCGATG-3'; SEQ ID NO:21 ) de conformidad con el protocolo de los fabricantes. La secuencia resultante SEQ ID NO:22 se insertará dentro del vector de transformación apropiado y se utilizará para transformar tabaco y maíz. Las plantas resultantes se evaluarán para la expresión de SBPasa en los tejidos vegetales y los ensayos enzimáticos se correrán para confirmar la actividad. Las plantas serán analizadas para determinar la asimilación mejorada de carbono en las plantas y su exportación y almacenamiento en tejidos de almacenamiento. La secuencia de ácidos pronosticada resulta a A. ^... té , -tai- partir de la secuencia de ADN (SEQ ID NO:22) se muestra como SEQ ID NO:23. Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritos en la presente son para propósitos ilustrativos solamente y que varias modificaciones o cambios a la luz de los mismos se sugerirán por personas expertas en la técnica y se incluirán dentro del espíritu y límite de esta aplicación y el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación son indicativas del nivel de habilidad de los expertos en la técnica a los cuales pertenece esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan aquí como referencia en el mismo grado como si cada publicación individual o solicitud de patente estuviera específicamente e individualmente indicada para ser incorporada como referencia.

Referencias citadas Ammirato et al. (1984) Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species. Macmillan Publ. Co.. Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12 (22): 8711-8721. Cadet y Meunier (1988a) Biochem. J. 253:243-248. Cadet y Meunier (1988b) Biochem. J. 253:249-254. Cadet y Meunier (1988c) Biochem. J. 241 :71-74. ' -.&-,. , _ Campbell et al. (1994) Canadian Journal of Forest Research 24 (8): 1689-1693. Cerdan et al. (1997) Plant Molecular Biology 33 (2): p245-255. Datta et al. (1990) Bio-technology 8:736-740. Edwards et al. (1990). Proc Nati Acad Sci USA 87 (9): p3459- 3463. Fejes et al. (1990). Plant Mol Biol 15 (6): p921-932. Fraley et al. (1983) Proc Nati Acad Sci USA 80:4803-4807. Frohman (1990) en Gelford, DH, Snincky, JJ, White, TJ, eds, PCR Protocols, Academic Press, San Diego, CA, pp 28-38. Fromm, M., (1990) UCLA Symposium on Molecular Strategies for Crop Improvement, Abril 16-22, 1990. Keystone, CO. Gerbiing et al. (1986) Plant Phvsiol. 80: 716-720. Harrison et al. (1998) Planta 204: 27-36. Hayashimoto et al. (1990) Plant Phvsiol. 93:857-863. Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209. Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231. Itaya y Michio (1966) Clin. Chim. Acta. 14:361-366. Jain et al. (1992) Biotechnigues 12:58-59. Klee et al. (1985) Bio-Technology 3(7): 637-642. Kretsch et al. (1995) Plant Journal 7(5): p715-729. Leyva et al. (1995) Plant Phvsiology 108(1 ):39-46. Llovd et al. (1991 ). Mol. Gen. Genet. 225(2):209-216.

Luán et al. (1992). Plant Cell 4(8):971-981. Luebberstedt et al. (1994) Plant Phvsiology 104(3):997-1006. Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A laboratorv manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Martin et al., Plant Mol. Biol. 32 (3), 485-491 (1996) Matsuoka et al. (1993). Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90(20):9586-9590. Nishizawa y Buchanan (1981 ) J. Biol Chem. 256:6119-6126. Oelmueller et al. (1992). Res. Photosvnth., Proc. Int. Congr. Photosvnth.. 9th, Volumen 3: p219-24. Editor(es): Murata. Norio. Publisher: Kluwer, Dordrecht, Neth. Raines et al. (1992) Eur J. Biochem 205:1053-1059. Raines et al. (1999). J. Exp. Bot. 50:1-8. Schimkat et al. (1990) Planta 181 :97-103. Sheen et al. (1991 ) The Plant Cell 3:225-245. Shímamoto et al. (1989) Nature 338:274-276. Stockhaus et al. (1989). EMBO Journal 8(9):2445-2451. Truernit et al. (1995) Planta 196 (3):564-570. Vasil et al. (1990) Bio/Technology 8:429-434. Vasil et al. (1992) Bio/Technology 10:667-674. Willingham et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26:1191-1200. Woodrow (1982) Methods Enzvmol. 90:392-396. Yamamoto et al. (1994) Plant and Cell Physiology 35(5):773-778.

Yoo y Bowien (1995) Current Microbiol. 31 :55-61.

LISTADO DE SECUENCIA <110> Miller, Philip W Staub, Robin L <120> Expresión de Sedoheptulosa 1,7 Bisfosfatasa en Plantas Transgénicas <130> mobs014-MX <140> n/a <141> 2000-05-12 <150> 60/133,964 <151> 1999-05-13 <160> 23 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético É-.m-t-í— -• -j&^UM-yc- <400> 1 acatatgtgc gcgatcggcg a 21 <210> 2 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 2 ggatccagaa gaagattatt aggcg 25 <210> 3 <211> 966 <212> ADN <213> Triticum aestivum <400> 3 atgtgcgcga tcggcgacag cctggaggag ttcctgacca aggcgacgcc ggacaagaac 60 ctcatcaggc tgctgatctg catgggggag gcgatgagga cgatcgcctt caaggtccgg 120 acggcctcct gcggcggcac ggcctgcgtc aactccttcg gcgacgagca gctcgccgtc 180 gacatgctcg ccgacaagct cctcttcgag gcgttggagt actcccatgt gtgcaagtac 240 gcgtgctctg aggaagtccc cgagctgcag gacatgggtg gcccggtcga aggtggattc 300 agtgtggcgt tcgaccccct tgacggctcc agcatcgtgg acaccaactt caccgtggga 360 l lk.??±yáx!&kzM?. . ** *- "i ' -AS-accatcttcg gcgtctggcc cggcgacaag ctgaccggcg tcaccggcgg tgaccaggtt 420 gctgccgcca tgggcatcta cggccctcgc accaccttcg tagttgccct caaggactgc 480 cccgggacac acgaattcct tctcctcgac gaaggtaaat ggcagcatgt caaggacacc 540 acgagcatcg gagaagggaa gatgttctcc cctggcaatc tgagggccac gttcgacaac 600 cctgattatg acaagcttgt caactactat gtgaaggaga agtacactct gcgttacacc 660 ggaggaatgg tccctgatgt caaccagatc atcgtgaagg agaagggcat cttcacgaac 720 gtgacgtcgc cgacggcgaa ggcgaagctg cggctgctgt tcgaggtggc gccgctgggg 780 ttcttgatag agaaggccgg cgggcacagc agcgacggca agcagtcggt gctggacaag 840 gtgatctccg tcctggacga gcggacccag gtggcctacg gctccaagaa cgagatcatc 900 cgcttcgagg agaccctcta cggctcctcc agactcgccg ccagcgccac cgtcggcgcc 960 accgcc 966 <210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 4 ttcctcagag cacgcgtact tg 22 <210> 5 <211> 53 <212> ADN •*•*- * * <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Adaptador <400> 5 gggtcgacat tctagacaga attcgtggat cctttttttt tttttttttt ttt 53 <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 6 catgggagta ctccaacgcc te 22 <210> 7 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Adaptador .„J.. -j.rfji.-c - *A*^mí^ <400> 7 gggtcgacat tctagacaga a 21 <210> 8 <211> 1208 <212> ADN <213> Triticum aestivum <400> 8 tctagagcag caatggagac cgtcgcggct gccggctacg cccgcggggc cgccacgcgc 60 tccccggcgt gctgcgccgc catgtccttc tcgcagtcct acaggcccaa ggctgccagg 120 ccggcgacct cgttctacgg cgagtcgctg cgggcgaaca cggcgaggac gtcgttcccg 180 gcggggaggc agtccaaggc ggcgagccgg gcggcgctca ccacccggtg cgcgatcggc 240 gacagcctgg aggagttctt gaccaaggcg acgccggaca agaacctcat caggctgctg 300 atctgcatgg gggaggcgat gaggacgatc gccttcaagg tccggaccgc gtcctgcggc 360 ggcacggcct gcgtcaactc cttcggcgac gagcagctcg ccgtcgacat gctcgccgac 420 aagctcctct tcgaggcgtt ggagtactcc catgtgtgca agtacgcgtg ctctgaggaa 480 gtccccgagc tgcaggacat gggtggcccg gtcgaaggcg gattcagtgt ggcgttcgac 540 ccccttgacg gctccagcat cgtggacacc aacttcaccg tgggaaccat cttcggcgtc 600 tggcccggcg acaagctgac cggcgtcacc ggcggtgacc aggttgctgc cgccatgggc 660 atctacggcc ctcgcaccac cttcgtagtt gccctcaagg actgccccgg gacacacgaa 720 ttccttctcc tcgacgaagg taaatggcag catgtcaagg acaccacgag catcggagaa 780 gggaagatgt tctcccttgg caatctgagg gccacgttcg acaaccctga ttatgacaag 840 cttgtcaact actatgtgaa ggagaagtac actctgcgtt acaccggagg aatggtccct 900 gatgtcaacc agatcatcgt gaaggagaag ggcatcttca cgaacgtgac gtcgccgacg 960 gcgaaggcga agctgcggct gctgttcgag gtggcgccgc tggggttctt gatagagaag 1020 . i. i r te gccggcgggc acagcagcga cggcaagcag tcggtgctgg acaaggtgat ctccgtcctg 1080 gacgagcgga cccaggtggc ctacggctcc aagaacgaga tcatccgctt cgaggagacc 1140 ctctacggct cctccagact cgccgccagc gccaccgtcg gcgccaccgc ctaataatct 1200 ttcttctg 1208 <210> 9 <211> 322 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 9 Met Cys Ala lie Gly Asp Ser Leu Glu Glu Phe Leu Thr Lys Ala Thr 1 5 10 15 Pro Asp Lys Asn Leu lie Arg Leu Leu lie Cys Met Gly Glu Ala Met 20 25 30 Arg Thr lie Ala Phe Lys Val Arg Thr Ala Ser Cys Gly Gly Thr Ala 35 40 45 Cys Val Asn Ser Phe Gly Asp Glu Gln Leu Ala Val Asp Met Leu Ala 50 55 60 Asp Lys Leu Leu Phe Glu Ala Leu Glu Tyr Ser His Val Cys Lys Tyr 65 70 75 80 Ala Cys Ser Glu Glu Val Pro Glu Leu Gln Asp Met Gly Gly Pro Val 85 90 95 Glu Gly Gly Phe Ser Val Ala Phe Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ser lie 100 105 110 Val Asp Thr Asn Phe Thr Val Gly Thr lie Phe Gly Val Trp Pro Gly 115 120 125 Asp Lys Leu Thr Gly Val Thr Gly Gly Asp Gln Val Ala Ala Ala Met 130 135 140 Gly lie Tyr Gly Pro Arg Thr Thr Phe Val Val Ala Leu Lys Asp Cys 145 150 155 160 Pro Gly Thr His Glu Phe Leu Leu Leu Asp Glu Gly Lys Trp Gln His 165 170 175 Val Lys Asp Thr Thr Ser lie Gly Glu Gly Lys Met Phe Ser Pro Gly 180 185 190 Asn Leu Arg Ala Thr Phe Asp Asn Pro Asp Tyr Asp Lys Leu Val Asn 195 200 205 Tyr Tyr Val Lys Glu Lys Tyr Thr Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Met Val 210 215 220 Pro Asp Val Asn Gln lie lie Val Lys Glu Lys Gly lie Phe Thr Asn 225 230 235 240 Val Thr Ser Pro Thr Ala Lys Ala Lys Leu Arg Leu Leu Phe Glu Val 245 250 255 Ala Pro Leu Gly Phe Leu lie Glu Lys Ala Gly Gly His Ser Ser Asp 260 265 270 Gly Lys Gln Ser Val Leu Asp Lys Val lie Ser Val Leu Asp Glu Arg 275 280 285 Thr Gln Val Ala Tyr Gly Ser Lys Asn Glu lie lie Arg Phe Glu Glu 290 295 300 Thr Leu Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Ala Ala Ser Ala Thr Val Gly Ala 305 310 315 320 Thr Ala -.--*-- <210> 10 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Degenerado <400> 10 ggacathtty gggttgg 17 <210> 11 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 11 rtackargtr tayttytc 18 <210 > 12 <211 > 382 <212 > PRT <213 > Chiorella sorokiniana i Ht?á A.4 ..A*á i . «jia-r- - ^ * * <- <400> 12 Met Gln Ala Thr Ala Val Ala Thr Ala Ala Pro Ala Ala Arg Val Ala 1 5 10 15 Thr Thr Gly Lys Ala Ala Thr Gly Val Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala 20 25 30 Val Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ser Ser Phe Ala Thr Gly Ala 35 40 45 Arg Leu Ser Lys Ala Ser Arg Thr Ala Ala Arg Arg Ala Ala Val Ala 50 55 60 Ala Gln Ala Lys lie Gly Asp Thr Leu Glu Glu Phe Leu Leu Glu Ala 10 65 70 75 80 Thr Pro Asp Pro Lys Leu Arg Gln Leu Met Met Ser Met Ser Glu Ala 85 90 95 lie Arg Thr lie Ala Tyr Lys Val Arg Thr Ala Ser Cys Gly Gly Thr 100 105 110 Ala Cys Val Asn Ser Phe Gly Asp Glu Gln Leu Ala Val Asp Leu Leu 15 115 120 125 Ala Asp Lys Leu Leu Phe Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Gly Cys Cys Lys 130 135 140 Leu Ala Cys Ser Glu Glu Val Pro Glu Pro Leu Asp Leu Gly Gly Glu 145 150 155 160 Gly Phe Ser Val Ala Phe Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ser lie Val Asp 20 165 170 175 Thr Asn Phe Ser Val Gly Thr lie Phe Gly Val Trp Pro Gly Asp Lys 180 185 190 íSá&?Oíy, i¡.„ -y . ¿ .y ,t .. -t .*..., ..* > ~. * ,?j. -..--.-- , . -yyii " * » •" Leu Thr Gly He Thr Gly Arg Gln Gln Ala Ala Ala Gly Met Gly He 195 200 205 Tyr Gly Pro Arg Thr Val Phe Cys He Ala Leu Lys Asp Ala Pro Gly 210 215 220 Cys His Glu Phe Leu Leu Gln Asp Asp Gly Lys Trp Leu His Val Lys 225 230 235 240 Glu Thr Glu Thr He Gly Glu Gly Lys Met Phe Ser Pro Gly Asn Leu 245 250 255 Arg Ala Thr Phe Asp Asn Pro Ala Tyr Glu Lys Leu He Ala Tyr Tyr 260 265 270 He Gly Glu Lys Tyr Thr Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Met Val Pro Asp 275 280 285 Val Phe Gln He He Val Lys Glu Lys Gly Val Phe Thr Asn Val He 290 295 300 Ser Pro Ser Thr Lys Ala Lys Leu Arg Leu Leu Phe Glu Val Ala Pro 305 310 315 320 Leu Ala Leu Leu Val Glu Lys Ala Gly Gly Ala Ser Ser Cys Asp Gly 325 330 335 Leu Cys Val Ser Gly Leu Asp Val Glu Val Lys Gln His Asp Gln Arg 340 345 350 Thr Gln He Cys Tyr Gly Ser Lys Gly Glu Val Arg Arg Phe Glu Glu 355 360 365 Tyr Met Tyr Gly Asn Ser Pro Arg Phe Ser Glu Val Thr Ala 370 375 380 <210> 13 <211> 22 Í ,.-> ¿ i y Jty.i-.i...i í-j.i.i-J-. %¿ ii.t,- .. Y- < 2 12 > ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 13 gatggtctcg gtctccttca cg 22 <210> 14 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 14 cagccacttg ccatcgtc 18 <210> 15 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial , . j, _,__..,». . -j,..^ X .. jÉJtáJ . <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 15 gatggtctcg gtctccttca cg 22 <210> 16 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 16 tcctcagagc acgccagctt ge 22 <210> 17 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético .--- . - A. <400> 17 agctgctcat cgccgaacga gttg 24 <210> 18 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 18 agttcctgct gcaggacgat gg 22 <210> 19 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 19 cccagtcacg acgttgtaaa acg 23 <210> 20 <211> 1460 <212> ADN <213> Chiorella sorokiniana <400> 20 gccggttgat cctcgagctc caaggcactc gggcacgatg caggccaccg ctgtcgccac 60 cgccgcccct gcggcccgcg tcgccaccac tggcaaggcc gccaccggcg tcaaggccgc 120 cccccgcgtg gccgtgcgcg ccgccggcgc cagcgccagc agcagctttg ccaccggcgc 180 ccgcctgagc gccaaggcca gccgcaccgc cgcccgccgc gccgccgtgg ccgcccaggc 240 caagatcggc gacacgctgg aggagttcct gctggaggcc acccccgacc ccaagctgcg 300 '0u ccagctcatg atgtccatgt ccgaggccat ccgcaccatc gcctacaagg tgcgcaccgc 360 ctcgtgcggc ggcaccgcct gcgtcaactc gttcggcgat gagcagctgg ccgtcgacct 420 gctggccgac aagctgctgt tcgaggccct caagtactct ggctgttgca agctggcgtg 480 ctctgaggag gtgcctgagc ccctggacct gggcggcgag ggcttctccg tggcatttga 540 ccccctggac ggctcctcca tcgtggacac caacttctct gtgggcacga tatttggggt 600 gtggcccggc gacaagctga ccggcatcac gggccgccag caggccgccg ccggcatggg 660 5 catctacggc ccccgcaccg tcttctgcat cgccctcaag gacgcccccg gctgccacga 720 gttcctgctg caggacgatg gcaagtggct gcacgtgaag gagaccgaga ccatcggcga 780 gggcaagatg ttctcccccg gcaacctgcg cgccaccttt gacaaccccg cgtacgagaa 840 gctgatcgcc tactacatcg gcgagaagta cacgctgcgc tacaccggcg gcatggtgcc 900 cgacgtgttc cagatcatcg tgaaggagaa gggcgtgttc accaacgtca tctccccctc 960 caccaaggcc aagctgcgcc tgctgttcga ggtggcgccc ctggccctgc tggttgagaa 1020 0 ggcaggcggc gcctcctcct gcgacggcct gtgcgtgagc ggcctggacg tggaggtcaa 1080 gcagcacgac cagcgcaccc agatctgcta tggctccaag ggcgaggtgc ggcggtttga 1140 ggagtacatg tacggcaact ccccccgctt ctccgaggtc accgcctaag cggctggtca 1200 tcgcctgagc ggctcagtgc tgctgactat gcagccggcg gctgactatg ctggtcttaa 1260 cctgagcggc tggccgtcaa acgctggcta gcagcgccgc cccctgagca gcctcggaga 1320 ir .r --..-^^a-dMfccJS- ctcccgccgg ctggcctatt caagctggct ggcgccggag ctccgcctgc cctggttgca 1380 cccaccattc gcttgctccc ccctccgcgc tttcatcatg tgctttccgc ccgcaacgcc 1440 ctgtccaatt cattcattat 1460 <210> 21 <211> 55 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Iniciador Sintético <400> 21 aaggtgcgca ccgcctcgtc cggcggcacc gcctccgtca actcgttcgg cgatg 55 <210> 22 <211> 1460 <212> ADN <213> Chiorella sorokiniana <400> 22 gccggttgat cctcgagctc caaggcactc gggcacgatg caggccaccg ctgtcgccac 60 cgccgcccct gcggcccgcg tcgccaccac tggcaaggcc gccaccggcg tcaaggccgc 120 cccccgcgtg gccgtgcgcg ccgccggcgc cagcgccagc agcagctttg ccaccggcgc 180 ccgcctgagc gccaaggcca gccgcaccgc cgcccgccgc gccgccgtgg ccgcccaggc 240 caagatcggc gacacgctgg aggagttcct gctggaggcc acccccgacc ccaagctgcg 300 ccagctcatg atgtccatgt ccgaggccat ccgcaccatc gcctacaagg tgcgcaccgc 360 ctcgtccggc ggcaccgcct ccgtcaactc gttcggcgat gagcagctgg ccgtcgacct 420 Thr Thr Gly Lys Ala Ala Thr Gly Val Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala 20 25 30 Val Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ser Ser Phe Ala Thr Gly Ala 35 40 45 Arg Leu Ser Ala Lys Ala Ser Arg Thr Ala Ala Arg Arg Ala Ala Val 50 55 60 Ala Ala Gln Ala Lys He Gly Asp Thr Leu Glu Glu Phe Leu Leu Glu 65 70 75 80 Ala Thr Pro Asp Pro Lys Leu Arg Gln Leu Met Met Ser Met Ser Glu 85 90 95 Ala He Arg Thr He Ala Tyr Lys Val Arg Thr Ala Ser Ser Gly Gly 100 105 110 Thr Ala Ser Val Asn Ser Phe Gly Asp Glu Gln Leu Ala Val Asp Leu 115 120 125 Leu Ala Asp Lys Leu Leu Phe Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Gly Cys Cys 130 135 140 Lys Leu Ala Cys Ser Glu Glu Val Pro Glu Pro Leu Asp Leu Gly Gly 145 150 155 160 Glu Gly Phe Ser Val Ala Phe Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ser He Val 165 170 175 Asp Thr Asn Phe Ser Val Gly Thr He Phe Gly Val Trp Pro Gly Asp 180 185 190 Lys Leu Thr Gly He Thr Gly Arg Gln Gln Ala Ala Ala Gly Met Gly 195 200 205 He Tyr Gly Pro Arg Thr Val Phe Cys He Ala Leu Lys Asp Ala Pro 210 215 220 _t^m—=£c Gly Cys His Glu Phe Gln Asp Asp Gly Lys Trp Leu His Val Lys Glu 225 230 235 240 Thr Glu Thr He Gly Glu Gly Lys Met Phe Ser Pro Gly Asn Leu Arg 245 250 255 Ala Thr Phe Asp Asn Pro Ala Tyr Glu Lys Leu He Ala Tyr Tyr He 260 265 270 Gly Glu Lys Tyr Thr Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Met Val Pro Asp Val 275 280 285 Phe Gln He He Val Lys Glu Lys Gly Val Phe Thr Asn Val He Ser 290 295 300 Pro Ser Thr Lys Ala Lys Leu Arg Leu Leu Phe Glu Val Ala Pro Leu 305 310 315 320 Ala Leu Leu Val Glu Lys Ala Gly Gly Ala Ser Ser Cys Asp Gly Leu 325 330 335 Cys Val Ser Gly Leu Asp Val Glu Val Lys Gln His Asp Gln Arg Thr 340 345 350 Gln He Cys Tyr Gly Ser Lys Gly Glu Val Arg Arg Phe Glu Glu Tyr 355 360 365 Met Tyr Gly Asn Ser Pro Arg Phe Ser Glu Val Thr Ala 370 375 380 .L_._

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Un método para mejorar la asimilación de carbono en un planta que comprende los pasos de: a) insertar dentro del genoma de una planta una secuencia de ácido nucleico comprendida en la dirección 5' a 3', i) un promotor que funciona en las células de dicha planta, dicho promotor operativamente unido a; ii) una secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa, dicha secuencia estructural de ácido nucleico esta operativamente unida a; iii) una secuencia de ácido nucleico no traducida hacia 3' que funciona en dichas células de dicha planta para ocasionar la terminación de la transcripción; b) obtener células vegetales transformadas que contienen la secuencia de ácido nucleico del paso (a); y c) regenerar a partir de dichas células vegetales transformadas una planta transformada que sobreexpresa dicha enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa en dichas células vegetales. 2.- El método conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de una puente heteróloga con respecto a la planta en la cual la secuencia de ácido nucleico estructural se inserta. i ,.' ^ -Jlt -yy. 3.- El método conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de un microorganismos bacteriano. 4.- El método conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de Ralstonia. 5.- El método conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de un alga verde. 6.- El método conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de Chiorella 7 '.- El método conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de una especie vegetal heteróloga con respeto a la planta dentro de la cual la secuencia de ácido nucleico estructural está insertada. 8.- El método conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es endógena a dicha planta dentro de la cual se inserta y dicho promotor operativamente unido al mismo es capaz de expresar dicho inserto, de enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa endógena a un nivel mayor que el de una planta que no está transformada para que contenga dicha secuencia de ácido nucleico estructural insertada. 9.- El método conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta es una planta monocotiledónea. 10.- El método conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta es una planta dicotiledónea. 11.- El método conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha planta se selecciona a partir del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, patata, alfalfa, centeno, algodón, soya, cañóla, girasol, y remolacha. 12.- El método conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa se desregula con respecto a la luz. 13.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende: (a) un promotor que funciona en las células de una planta, dicho promotor esta operativamente unido a; (b) una secuencia de ácido nucleico estructural en el sentido de orientación que ocasiona la producción de enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa, dicha secuencia de ácido nucleico estructural esta operativamente unida a, y (c) una secuencia de ácido nucleico no í * y-? & jauta, , traducida hacia 3' que funciona en dichas células de dicha planta para ocasionar la terminación de la transcripción. 14.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13 que comprende adicionalmente un intrón. 15.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13 que comprende adicionalmente una secuencia líder no traducida hacia 5'. 16.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de un microorganismo bacteriano. 17.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque dicha ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7- bifosfatasa es a partir de Ralstonia. 18.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de una alga verde. 19.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de Chiorella. 20.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada además porque dicha secuencia de ácido nucleico estructural que ocasiona la producción de una enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa es a partir de una planta. 5 21.- La secuencia de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicha enzima sedoheptulosa 1 ,7-bifosfatasa se desregula con respecto a la luz. 22.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 20 o una variante degenerada de 10 SEQ ID NO: 20. 23.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un polipéptido con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 12 ó SEQ ID NO: 12 con sustituciones conservativas de aminoácidos. 15 24.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de al menos 85% idéntica a SEQ ID NO: 20. 25.- Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia que codifica un polipéptido la secuencia de aminoácidos del cual es al menos 85% similar a SEQ ID NO: 12. ¡j^^^^g H ^ -.-i^ AiA- ^ .-iit. .*_ ^HUaw^MHHÉMta idH^HMÉ|^_ u¡||j¡^ ii^^¡^yy¿i??