MX2010011102A - Plantas y tejidos de plantas resistentes al calor, y metodos y materiales para obtener y usar los mismos. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a materiales y métodos para proveer plantas o tejido de la planta con resistencia incrementada a condiciones de calor y/o biosíntesis incrementada de almidón; la resistencia incrementada de una planta o tejido de la planta a condiciones de calor, provee pérdidas disminuidas de rendimiento en comparación con las pérdidas de rendimiento observadas generalmente a temperaturas elevadas; un aspecto de la invención se refiere a polinucleótidos que codifican para una subunidad pequeña de AGPasa mutante de la planta; la invención comprende también una subunidad pequeña de AGPasa mutante de la planta codificada por un polinucleótido de la invención; la invención se refiere también a plantas que comprenden un polinucleótido de la invención, y métodos para obtener las plantas.

Description

PLANTAS Y TEJIDOS DE PLANTAS RESISTENTES AL CALO IÉTODOS Y MATERIALES PARA OBTENER Y USAR LOS MIS APOYO DEL GOBIERNO La materia de esta solicitud ha sido sustentada es¡ón de investigación de la National Science Foundation bajo el oncesión IOS-0444031. Por consiguiente, el gobierno tiene chos en esta invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El estrés de calor lleva a rendimiento disminuido del maíz , 1971; Thompson, 1975; Chang, 1981 ; Christy y Williamson, 198 le atribuirse a disponibilidad y transportación reducida de fotosin nulos, así como al aborto de la semilla. Además, las temp das durante la fase lineal resultaron en período más corto de rel o, y granos subsiguientemente más pequeños (Jones et al., ltados similares fueron encontrados por Hunter et al. ( 977) y Tol lsema (1988).

Los registros de cinco estados que producen tradicion de 50% del maíz de los Estados Unidos, mostraron que la tem a promedio fue de 23.6°C, alrededor de 2°C mayor que el óptimo lleno del grano (Singletary et al., 1994). La disponibilidad de foto nte el relleno del grano no se reduce a altas temperaturas, por l cebada y el trigo. Por supuesto, el contenido de sacarosa en las i cebada y el trigo no cambió o se elevó a altas temperaturas ( er, 1986; Wallwork et ai, 1998). También la fotosíntesis en el menta hasta 32°C (Duncan y Hesketh, 1968; Hofstra y Hesket >ty et a/., 1985). Además, Cheikhn y Jones (1995) estudiaron la ca eraturas elevadas. Singletary et al. (1993; 1994) pusieron a as biosintéticas del almidón en granos de maíz cultivados in eraturas elevadas (22°C a 36°C). Encontraron que la ADP- sforilasa (AGPasa) y la sintasa soluble del almidón (SSS) er s al calor en comparación con otras enzimas que participan en la lmidón. Sugirieron que la labilidad de la AGPasa y la SSS ibuye al cese del relleno del grano. Duke y Doehlert (1996) enc los transcritos de varios genes que codifican para enzimas de l SÍS del almidón, incluyendo aquellas que codifican para A inuyeron a 35°C en comparación con 25°C. Sin embargo, pru as mostraron que sólo la actividad de la AGPasa fue notabl r. Sugirieron que esto pudo deberse a una mayor velocidad de AGPasa en comparación con otras enzimas. Por último, Wilhel 9), a través del análisis de Q10, mostraron que la AGPasa cción en actividad más pronunciada en comparación con vari ctivamente, en el endospermo del maíz. La AGPasa es r neamente por pequeñas moléculas efectoras que son indicati o de energía de la célula. La AGPasa es activada por la 3-PGA, el eto asimilativo de carbono, e inhibida/desactivada por el nico (Pi) en cianobacterias, algas verdes y angiospermas.

La importancia de la AGPasa del endospermo del maí is de almidón, ha sido mostrada por el fenotipo de grano de muta uier subunidad de la enzima. Por supuesto, dichos mutantes resu S encogidos y una gran reducción en el contenido de almid permo (Tsai y Nelson, 1966; Hannah y Nelson, 1976). Existe t ncia de que la AGPasa cataliza un paso limitativo de velocida is de almidón (Stark et a/.t 1992; Giroux et al., 1996; Greene et a/. Isingharoja et ai, 2004; Obana eí al., 2006; Wang et ai, 2007).

Greene y Hannah (1998a) aislaron una forma muta sa del maíz con un cambio de un sólo aminoácido en la su La transformación del maíz con la variante de Sh2 que c ambios Rev6 y HS33, da también lugar al número increment as. El rendimiento de semillas por mazorca puede incrementars n el maíz. Una caracterización detallada de los eventos transgéni está en camino (Greene y Hannah, en preparación). El entado de semillas no puede ser explicado por Rev6} pues o es expresado sólo en el maíz, incrementa sólo el peso de la ah, no publicado). Los estudios anteriores muestran la importanc ilidad de la AGPasa al calor en el rendimiento de cereales.

Cross et al. (2004) generaron una subunidad pequ ico (MP) que consiste de los primeros 200 aminoácidos de BT )s 275 aminoácidos de la subunidad pequeña del tubérculo de p n un complejo con SH2 tuvo varias características que pudieron l icia agronómica (Cross et a/., 2004; Boehlein et a/., 2005). Algú características fueron actividad incrementada en ausencia del a BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a materiales y métodos para s o tejido de la planta con resistencia incrementada a condicio y/o biosintesis incrementada de almidón. La resistencia incremen planta o tejido de la planta a condiciones de calor, provee p nuidas de rendimiento en comparación con las pérdidas de rend vadas generalmente a temperaturas elevadas. Un aspecto ción se refiere a poünucleótidos que codifican para una su ña de AGPasa muíante de la planta. En una modalid jcleótido de la invención codifica para una subunidad pequ asa de la planta que tiene una mutación de aminoácido en d Dácido treonina que corresponde a la posición de aminoácido 46 lidad pequeña de AGPasa del maíz de tipo silvestre, es sustituido Dácido que confiere estabilidad incrementada al calor. En otra mo rende también una subunidad pequeña de AGPasa mutante de l cada por un polinucleótido de la invención. La caracterizació ilidad al calor, así como propiedades alostéricas y de cinéti n rendimiento incrementado de almidón, se provee cuan cleótidos de la invención se expresan en plantas, como en el c spermo de las monocotiledóneas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el glucógeno producido por células d xpresan BT2, BT2-T1 , MP y MP-T1 junto con SH2. El glucógen s que expresan sólo SH2, BT2, BT2-T1 y MP sola. El glucógeno nidades de glucosa. Las barras de error indican desviación e )¦ Las figuras 2A y 2B muestran dot blots de extractos cr La figura 4 muestra la purificación de AGPasa. SDS-P SH2, T1/SH2, MP/SH2 y MP-T1/SH2 recombinantes purificadas. marcador Precisión Plus Protein All Blue Standard de Biorad. L rior de la izquierda apunta hacia la subunidad grande. La flecha izquierda apunta hacia la subunidad pequeña.

Las figuras 5A y 5B muestran la estabilidad al calor, de B 1/SH2 y MP/SH2 purificadas. La vida media (T1/2) de cada AG sa como media ± error estándar. Los valores p se estiman por m prueba F implementada por Prizm (Graph pad, San Diego CA 3 5A, la prueba se llevó a cabo en la dirección hacia delante. En l 3 prueba se llevó a cabo en la dirección inversa.

Las figuras 6A y 6B muestran la estabilidad al calor, de '-T1/SH2 purificadas. La vida media (T1/2) de cada AGPasa se > media ± error estándar. Los valores p se estiman por medio )a F implementada por Prizm (Graph pad, San Diego CA). En l o60 (4,5) y Leu61 (3). La figura 7C muestra las distancias de los rbono de Iie462 (1 ,2,3,4), de aquellas de Pro60 (5,6) y Leu61 ( minaron los residuos de contacto de Thr462 e Ile462, usando Firs Las esferas de color gris oscuro indican los átomos de carb 2 e Ile462. Las esferas de color gris claro indican los átomos de S residuos de contacto. Los átomos de oxígeno y nitrógeno se ind rojo y azul, respectivamente.

La figura 8 muestra la fuerza de las interacciones sub nidad de la AGPasa. Se usó SH2 como un cebo y BT2, T1 y M presa, en un sistema de dos híbridos de levadura. Se usó una titativa de ß-galactosidasa para cuantificar las interacciones entre >resa. Las barras de error indican 2x error estándar (N=4).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO: 4 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante (MP-T1) de la invención.

SEQ ID NO: 5 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante (T1 + YC) de la invención.

SEQ ID NO: 6 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante (T1 + QTCL) de la invención.

SEQ ID NO: 7 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante (T1 + ETCL) de la invención.

SEQ ID NO: 8 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante ( P-T1 + YC) de la invención.

SEQ ID NO: 9 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante (MP-T1 + QTCL) de la invención.

SEQ ID NO: 10 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante (MP-T1 + ETCL) de la invención.

SEQ ID NO: 1 1 es una secuencia de polinucleótid SEQ ID NO: 14 es una secuencia de polinucleótid rende una secuencia de nucleótidos que codifica para un poli te (SEQ ID NO: 8) de la invención.

SEQ ID NO: 15 es una secuencia de polinucleótid rende una secuencia de nucleótidos que codifica para un poli te (SEQ ID NO: 9) de la invención.

SEQ ID NO: 16 es una secuencia de polinucleótid rende una secuencia de nucleótidos que codifica para un poli te (SEQ ID NO: 10) de la invención.

SEQ ID NO: 17 es un oligonucleótido que puede usa rmidad con la presente invención.

SEQ ID NO: 18 es un oligonucleótido que puede us rmidad con la presente invención.

SEQ ID NO: 19 es un oligonucleótido que puede us rmidad con la presente invención.

SEQ ID NO: 24 es una secuencia de aminoácidos ptido muíante (T1) de la invención.

SEQ ID NO: 25 es una secuencia de aminoácidos ptido mutante (T1) de la invención.

SEQ ID NO: 26 es una secuencia de aminoácidos de la p subunidad pequeña de AGPasa de tubérculo de papa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a materiales y métodos para s con resistencia incrementada a condiciones de calor y/o bio entada de almidón. La resistencia incrementada de una pí ciones de calor provee pérdidas disminuidas de rendimie aración con las pérdidas de rendimiento observadas general raturas elevadas. a isoleucina. En una modalidad, la subunidad pequeña de te de la planta es la subunidad pequeña de AGPasa del endo aíz. En una modalidad ejemplificada, la subunidad pequeña de te de la planta comprende la secuencia de aminoácidos mostr ID NO: 2, o un fragmento o variante de la misma. En una mo ífica, el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos m Q ID NO: 1 , o un fragmento o variante de la misma. En otra mo unidad pequeña de AGPasa muíante de la planta es de cebad , papa o arroz. En una modalidad específica, la subunidad pequ sa muíante de cebada, trigo, sorgo, arroz o papa compre ncia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 2 : 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, respectivameníe. lidad, el polinucleólido codifica para una subunidad pequeña de íe de la planta que puede comprender adicionalmente una muía ácido como se describe en la solicilud de paleníe intern silvestre, respectivamente. En modalidades especificas, el ami ado entre los aminoácidos en las posiciones 34 y 35 de la su eña de AGPasa, es un ácido glutámico o glutamina. En las mod plificadas, la subunidad pequeña de AGPasa mutante de la rende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5, 6 o SEQ ID NO: 7, o un fragmento o variante de la mis alidades específicas, el polinucleótido comprende las secuen ótidos mostradas en SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12 o SEQ ID fragmento o variante de las mismas.

En otra modalidad, un polinucleótido codifica para una su jeña de AGPasa quimérica de la planta compuesta de secuencia tas diferentes (como se describe en la patente de E.U.A. No. 7,17 comprende también una mutación de aminoácido de la inven le el aminoácido treonina que corresponde a la posición de ami de la subunidad pequeña de AGPasa del endospermo del maíz minal que comprende aproximadamente los 300 residuos termi s del extremo C-terminal de la subunidad pequeña de AGPasa nda planta. De esta manera, el extremo C-terminal de la su rica puede comprender 300, o 299, o 298, o 297, o 296, o 2 uos terminales del extremo C-terminal de la segunda plan ncías de la subunidad pueden ser de una AGPasa de una cotiledónea o dicotiledónea, o una monocotiledónea y una dicotil as monocotiledóneas tales como, por ejemplo, arroz, trigo, , sorgo, maíz, lirio y mijo, se incluyen dentro del alcance de la in lantas dicotiledóneas pueden incluir, por ejemplo, tabaco, soya te, rábano, col, colza, árbol de manzana y lechuga. En una mo rimeros 200 o más aminoácidos del extremo N-terminal de la rica son del extremo N-terminal de la subunidad pequeña de dospermo del maíz, y los aminoácidos del extremo C-terminal mo C-terminal de la subunidad pequeña de AGPasa de tubér os 199 aminoácidos (es decir, los aminoácidos 1 a 199) de la sub ña de AGPasa del endospermo del maíz y el extremo carboxilo t subunidad pequeña de AGPasa de tubérculo de papa, partiend cido 246 (es decir, los aminoácidos 246 a 521) usando la secue ácidos mostrada para la proteína depositada como número de 6 del Genbank (o, en forma alternativa, partiendo en el aminoáci o el sistema de numeración para la subunidad de AGPasa de en Hannah eí a/., 2001), y b) la mutación que corresponde a la p inoácido 462 de la presente invención. En una modalidad ejempli unidad pequeña de AGPasa quimérica de la planta compre ncia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4, o un fragm te de la misma. En una modalidad específica, el polinu rende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: ento o variante de la misma. En otra modalidad, el polinucieótido una subunidad pequeña de AGPasa mutante de la planta que cíficas, el aminoácido insertado entre la posición 34 y 35 de la su eña de AGPasa mutante es un ácido glutámico o glutami lidades ejemplificadas, la subunidad pequeña de AGPasa mutan a comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, o un fragmento o variante de la mi lidades específicas, el polinucleótido comprende la secue ótidos mostrada en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID N agmento o variante de la misma.

La invención se refiere también a métodos para increm ilidad al calor y/o incrementar la biosíntesis de almidón, e increm ¡miento del cultivo de una planta o tejido de la planta. En una mo íétodo de la invención comprende introducir uno o más polinucleó jresente invención en una planta. En ciertas modalidad ucleótidos introducidos en la planta codifican para uno o más poli comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en cualq Q ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, o un fragmento o variante de la a modalidad, el polinucleótido se incorpora establemente en el g planta o tejido de la planta. El polinucleótido puede com ntos reguladores, tales como un promotor y/o secuenci ificador, que proveen expresión incrementada del polinucleótid ptido codificado por el mismo. En una modalidad especff ncia del promotor es una que provee expresión constitutiva o es jidos (por ejemplo, endospermo). Plantas o tejidos de la plan nen al polinucleótido, o progenie de las plantas, pueden ser identi nalmente para la expresión incrementada de un polinucle ptido de la invención. En una modalidad, copias múltiples de uno cleótidos de la invención se introducen en una planta o tejid , y se incorporan establemente en el genoma de la planta. lidad, se provee un polinucleótido de la invención en una construc sión como se describe en la presente. ada en SEQ ID NO: 4, o un fragmento o variante de la misma. lidad, el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos m alquiera de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ I ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, o un fragmento o variante de la mism La invención se refiere también a enzimas de AGPasa m planta que comprenden uno o más polipéptidos de la su eña de AGPasa mutantes de la invención. La AGPasa muíant puede comprender también uno o más polipéptidos de la su e de AGPasa de tipo silvestre. En modalidades específicas, una GPasa mutante de la planta comprende uno o más polipéptido nidad pequeña de AGPasa mutantes, cualquiera de los cuales render la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID ID NO: 10, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, 4 o SEQ ID NO: 25, o un fragmento o variante de cualquiera d idad grande de AGPasa mutantes. En una modalidad, el polipép bunidad grande de AGPasa mutante puede ser cualquiera de a itos en cualquiera de las patentes de E.U.A. Nos. 5,589,618; 5,6 ,216; 6,069,300; 6,184,438; 6,403,863; 6,809,235; 7,173, 165; 7,3 69,783. En una modalidad, un polipéptido de la subunidad gra sa mutante comprende una mutación Rev6. En otra modalid ptido de la subunidad grande de AGPasa mutante comprende mutaciones estables al calor (HS), como se describe en las pate . Nos. 6,069,300; 6,403,863; 6,809,235; 7,312,378; y 6,969,78 tud de patente internacional publicada Nos. WO 99/5869 «070901 ; WO 98/22601 ; y WO 02/072784, tal como, por eje ción HS33. En una modalidad, la enzima de AGPasa mutant a comprende dos polipéptidos de la subunidad pequeña de tes de la invención, en donde los polipéptidos de la subunidad p 3Pasa mutantes pueden tener las mismas mutaciones o puede ntes y los polipéptidos de la subunidad grande de AGPasa m en tener las mismas mutaciones o pueden tener diferentes mut se describe en la presente.

La invención se refiere también a métodos para prov a de AGPasa muíante de la planta que tiene estabilidad increme respecto a la AGPasa de la planta de tipo silvestre. En una modal do comprende incorporar o proveer uno o más polipéptidos nidad pequeña de AGPasa mutantes de la presente invenci nidades grandes de AGPasa mutantes o de tipo silvestre en una \GPasa. En una modalidad, la enzima de AGPasa compre ñero de subunidades de polipéptidos, en donde una, dos o má nidades son un polipéptido muíante de la presente invención. alidad, la enzima de AGPasa comprende también una subuni sptido de la subunidad grande de AGPasa muíante, tal co nidad grande muíante que comprende una mutación Rev6 ción incluyen plantas monocotiledóneas tales como, por ejemplo cebada, avena, centeno, sorgo, maíz, caña de azúcar, pina, o, coco, lirio, pasto para céspedes y mijo. Las plantas dentro del presente invención incluyen también plantas dicotiledóneas tale jemplo, tomate, pepino, calabaza, chícharo, alfalfa, melón, ga oria, trébol, berza común, lenteja, soya, frijol, tabaco, papa, , mandioca, rábano, brócoli, espinaca, col, colza, árboles de m s (incluyendo naranja, mandarina, toronja, limón, lima, y similare ón, girasol, fresa, lechuga y lúpulo. Plantas herbáceas que conte cleótido de la invención se contemplan también dentro del alcan ción. Las plantas herbáceas incluyen perejil, salvia, romero, ares. En una modalidad, la planta, tejido de la planta o célula de l ?a mays. En una modalidad, una planta, tejido de la planta o célu a es una planta, tejido de la planta o célula de la planta transgén nodalidad, una planta, tejido de la planta o célula de la planta es s hospederas de insectos, células hospederas de mamíferos y deras humanas. Elementos reguladores incluyen prom ncías de terminación de la transcripción, secuencias de termina ducción, intensificadores y elementos de poliadenilación. Como presente, el término "construcción de expresión" se refiere inación de secuencias de ácido nucleico que proveen la transcrip ecuencia de ácido nucleico enlazada operablemente. Como se u te, el término "enlazada operablemente" se refiere a una yuxtap s componentes descritos, en donde los componentes están ón que les permite funcionar en su manera deseada. En gene onentes enlazados operablemente están en relación contigua.

Una construcción de expresión de la invención render una secuencia de promotor enlazada operablemente ncia de polinucleótidos que codifica para un polipéptido mutant ción. Los promotores pueden incorporarse en un polinucleótido sión.

Si la construcción de expresión se va a proveer o s ucir en la célula de la planta, entonces pueden usarse promotores ntas tales como, por ejemplo, un promotor 35S del virus del mos flor (CaMV) (incluyendo el promotor 35S mejorado del CaMV (véa io, la patente de E.U.A. No. 5,106,739)), o un promotor 19S del saico de la nervadura de la mandioca. Otros promotores que e para construcciones de expresión en plantas incluyen, por ej tor prolifera, promotor Ap3, promotores de choque térmico, pro e ADN T de A. tumefaciens, promotor de poligalacturonasa, prom na sintasa A (CHS-A) de la petunia, promotor PR-1a del Dtor de ubiquitina, promotor de actina, promotor del gen alcA, pr Xu et ai, 1993), promotor Wip1 del maíz, promotor del gen trpA d ite de E.U.A. No. 5,625,136), promotor del gen de CDPK del rtor de RUBISCO SSU (patente de E.U.A. No. 5,034,322). ,948; y 5,589,610. Pueden usarse también promotores específic a, tales como el promotor de un gen de ß-faseolina (por ejem o un gen de glicinina (por ejemplo, de soya), y otros. Pro íficos del endospermo incluyen, pero no están limitados a, itud de EPO No. EP1528104), y aquellos descritos por Wu et al. do et al. (2001) y Hwang et al. (2002). Pueden usarse pro íficos de la raíz, tales como cualquiera de las secuencias de p itas en la patente de E.UA No. 6,455,760 o la patente de E.I ,623, o en la solicitud de patente de E.U.A. publicad 078841 ; 20040067506; 20040019934; 20030177536; 2003008 123349, con una construcción de expresión de la invención. Pro itutivos (tales como el promotor de CaMV, ubiquitina, actina o otores regulados por el desarrollo y promotores inducibles (tale líos promotores que pueden ser inducidos por el calor, la l onas o los químicos), se contemplan también para su uso ncia codificante para proveer terminación eficiente. Una secue o de señal es una secuencia corta de aminoácidos presente típic xtremo amino de una proteína, que es responsable de la reubica lipéptido maduro enlazado operablemente a una amplia ga os celulares post-traducción, que van desde un comparti ífico de organelos hasta sitios de acción de proteínas y el a elular. La determinación de productos génicos como blanco h ? celular y/o extracelular deseado a través del uso de una secue os de señal enlazada operablemente, se contempla para su uso ptidos de la invención. Intensificadores clásicos son elemen cis que incrementan la transcripción génica, y pueden incluirse t construcción de expresión. Elementos intensificadores clási en en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, el el ificador 35S del CaMV, elemento intensiftcador del promotor te omegalovirus (CMV) y el elemento intensificador de SV40. Ele eñal de octopina sintasa y nopalina sintasa. Las construcció sión de la invención pueden incluir también una secuen cleótidos que dirija la transposición de otros genes, es de osón.

Los polinucleótidos de la presente invención puede uestos de A N o ADN. De preferencia, los polinucleótidos uestos de ADN. La invención abarca también aquellos polinucl on complementarios en secuencia a los polinucleótidos descrito nte. Los polinucleótidos y polipéptidos de la invención pueden pr ma purificada o aislada.

Debido a la degeneración del código genético, una varie ntes secuencias de polinucleótidos pueden codificar pa ptidos mutantes de la presente invención. Un cuadro que muestr dones de tripletes posibles (y en donde U representa también ácido codificado por cada codón, se describe en Lewin (1985). A olinucleótidos de la presente invención. Variantes alélicas ncias de nucleótidos que codifican para un polipéptido mutante o tre de la invención, se contemplan también dentro del alcanc ción.

La sustitución de aminoácidos diferentes de a lificados específicamente o presentes naturalmente en un poli nzima de AGPasa mutante o de tipo silvestre de la invenc mpla también dentro del alcance de la presente invención. Por e ácidos no naturales pueden ser sustituidos por los aminoácido ptido de la subunidad pequeña de AGPasa mutante, en t ptido mutante que tiene los aminoácidos sustituidos ncialmente la misma actividad funcional que el polipéptido mutan los aminoácidos no han sido sustituidos. Ejemplos de aminoáci ales incluyen, pero no están limitados a, ornitina, citrulina, hidroxi serina, fenilglicina, taurina, yodotirosina, ácido 2,4-diaminobutíric iera de los aminoácidos en la proteína puede ser de forma D ( ria) o L (levo-rotatoria). Variantes alélicas de una secuencia de pr polipéptido de la subunidad grande o pequeña de AGPasa mutan ilvestre de la presente invención, se contemplan también den ce de la invención.

Los aminoácidos pueden agruparse generalmente ntes clases: no polares, polares no cargados, básicos y uciones conservativas por las cuales un polipéptido de la su ña de AGPasa muíante de la presente invención y/o un polipéptid lidad grande de AGPasa mutante o de tipo silvestre que ti )ácido de una clase es reemplazado con otro aminoácido de la , están dentro del alcance de la invención, en tanto el polipépti la sustitución retenga aún sustancialmente la misma actividad fu ijemplo, estabilidad al calor incrementada y/o enzimática de una SPasa) que el polipéptido que no tiene la sustitución. Polinucleótid CUADRO 1 Clase de aminoácido Ejemplos de aminoácidos No polares Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, ? Polares no cargados Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Ácidos Asp, Glu Básteos Lys, Arg, His La invención se refiere también a variantes de los polinucl presente invención que codifican para polipéptidos de la su ie o pequeña de AGPasa mutantes o de tipo silvestre funcionale ición. Secuencias variantes incluyen aquellas secuencias en dond nucleótidos de la secuencia han sido sustituidos, deletad lados. Los nucleótidos que pueden sustituir a nucleótidos natur tienen una porción de base que puede incluir, pero no está limi ia, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, hipoxantina, 1-metilguani ;itosina, y bases tritiladas. La porción de azúcar del nucleótido sncia puede ser modificada también e incluye, pero no está limi o técnicas estándar conocidas en la materia. De esta manera, el técnica puede fácilmente preparar y poner a prueba fragme tes de un polipéptido mutante de la invención, y determina ento o variante retiene actividad funcional respecto al poli te no variante o de longitud completa.

Los polinucleótidos y polipéptidos contemplados den ce de la invención pueden definirse también en términos de esc ud y/o identidad más particulares, con aquellas secuencias ción ejemplificadas específicamente en la presente. La identi ncia será típicamente mayor de 60%, de preferencia mayor d preferiblemente mayor de 80%, aún más preferiblemente mayor d ide ser mayor de 95%. La identidad y/o similitud de una secuenci e 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 9, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, (0, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%, en comparación c ticios para propósitos de comparación, puede usarse Gapped se describe en Altschul et al. (1997). Cuando se usen los pro T y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros predetermina rogramas respectivos (NBLAST y XBLAST). Véase el siti NIH.

La invención contempla también aquellas molécul cleótidos que tienen secuencias que son suficientemente ho as secuencias de polinucleótidos ejemplificadas en la present tir hibridación con aquella secuencia bajo condiciones de se dar y métodos estándar (Maniatis et al., 1982). Como se usa nte, las condiciones "severas" para hibridación se refieren a cond nde la hibridación se lleva a cabo típicamente durante la noch bajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en 6x lución de Denhardt, SDS a 0.1 % y 0.1 mg/ml de ADN desnatur peratura de fusión, Tm, es descrita por la siguiente fórmula (Belt Como se usa en la presente, los términos "ácido nuc ucleótido" se refieren a un desoxirribonucleótido, ribonucleótid ero mixto de desoxirribonucleótido y ribonucleótido en forma de lla o de doble cadena, y a menos que sean limitados de otra arian análogos conocidos de nucleótidos naturales que nar en una manera similar como nucleótidos de ocurrencia natu ncías ¿Je polinucleótídos incluyen la secuencia de la cadena de A nscrita en ARN, y la secuencia de cadena que es complementa na de ADN que es transcrita. Las secuencias de polinucleótídos i ién secuencias de longitud completa, así como secuencias má adas de secuencias de longitud completa. Variaciones alélicas sncias ejemplificadas, están también dentro de la alcance ición. La secuencia de polinucleótídos incluye las cadenas se sntido, ya sea como cadenas individuales o en el dúplex.

Técnicas para la transformación de células de plantas uier célula de la planta o plantas transformadas o transgénica ión, se incluyen también dentro del alcance de la presente invenc La invención se refiere también a métodos para produ que exhibe estabilidad incrementada al calor respecto a una pl ilvestre, en donde un polinucleótido que codifica para un polipéptid idad pequeña de AGPasa mutante de la presente invenc ucido en una célula de la planta, y los polipéptidos codificados cleótidos son expresados. En una modalidad, la célula de la rende genes no mutantes que codifican para el polipéptido idad grande de AGPasa de tipo silvestre. En otra modalidad, la c nta comprende por lo menos un polinucleótido que codifica p ptido de la subunidad grande de AGPasa mutante. En otra mo linucleótido que codifica para un polipéptido de la subunidad gra sa mutante es introducido también en una célula de la planta ju inucleótido que codifica para el polipéptido de la subunidad pequ ante de un polinucleótido de la presente invención. Sond ucleótidos de la invención pueden usarse en métodos para dét ficar secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipép unidad pequeña de AGPasa mutante de la invención. Iniciado ucleótidos de la invención pueden usarse en métodos de PCR os que impliquen la amplificación de ácidos nucleicos. E idad preferida, una sonda o iniciador de la invención puede hibrid linucleótido de la invención bajo condiciones severas. Las sonda ores de la invención pueden comprender opcionalmente una m portero o marca detectable, tales como moléculas fluores as, porción radiactiva (por ejemplo, 3H, 35S, 125l, etc.), y similar s y los iniciadores de la invención pueden ser de cualquier l ada para el método o prueba en el cual están siendo u menté, las sondas y los iniciadores de la invención serán de 10 ucleótidos de longitud. Sondas e iniciadores que sean de 10 a 2 condiciones severas con una secuencia de nucleótidos cleótido de la invención. En una modalidad, una sonda o iniciad ción tiene 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% a 100% de identidad de secuencia con una secuencia de nucl EQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, o el compl misma.

La invención se refiere también a polipéptidos de la su eña de AGPasa mutantes aislados. En una modalidad, el polipé bunidad pequeña de AGPasa mutante es un polipéptido de la su eña de AGPasa de Zea mays. En una modalidad específ éptido de la subunidad pequeña de AGPasa de la invención ti encia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 2, SEQ I ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID ID NO: 10, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, ción, y fragmentos de péptido funcionales de los mismos, para erpos que se unen específicamente a un polipéptido de la inve s anticuerpos se contemplan dentro del alcance de la invenci erpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales, y cirse y aislarse usando métodos estándar conocidos en la técnica Los fragmentos de polipéptido de conformidad con la in renden típicamente un tramo contiguo de aproximadamente o S 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , , 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, , 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, , 88, 89^ 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102, 1 106, 107, 108, 109, 110, 1 11 , 1 12, 113, 114, 115, 1 16, 117, 1 1 121 , 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131 , 132, 13 136, 137, 138, 139, 140, 141 , 142, 143, 144, 145, 146, 147, 14 151 , 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 16 86, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 29 01, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 31 16, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 32 31, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 34 46, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 35 61, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 37 76, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 38 91, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 40 06, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 41 21, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 43 36, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 44 51, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 46 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474 o 475 aminoácidos ): 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: ): 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. uier entero de aminoácidos consecutivos de aproximadamente 2 ácidos. El término "entero" se usa en la presente en su ático, y de esta manera enteros representativos incluyen: 25, , 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, , 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, , 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 1 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 12 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 13 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 15 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 16 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 18 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 19 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 21 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 22 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361 , 36 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371 , 372, 373, 374, 375, 376, 37 380, 381 , 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391 , 39 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401 , 402, 403, 404, 405, 406, 40 410, 411 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 42 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 43 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 45 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 46 70, 471 , 472, 473, 474 y/o 475.

Cada fragmento de polipéptido de la invención puede des ién en términos de sus posiciones N-terminal y C-terminal. Por e (¡naciones de fragmentos N-terminales a C-terminal cimadamente 25 aminoácidos contiguos a 1 aminoácido menos §ptido de longitud completa, tales como aquellos de SEQ ID NO: y. 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: , 19-43, 20-44, 21-45, 22-46, 23-47, 24-48, 25-49, 26-50, 27-51, , 30-54, 31-55, 32-56, 33-57, 34-58, 35-59, 36-60, 37-61, 38-62, , 41-65, 42-66, 43-67, 44-68, 45-69, 46-70, 47-71, 48-72, 49-73, , 52-76, 53-77, 54-78, 55-79, 56-80, 57-81, 58-82, 59-83, 60-84, , 63-87, 64-88, 65-89, 66-90, 67-91, 68-92, 69-93, 70-94, 71-95, , 74-98, 75-99, 76-100, 77-101, 78-102, 79-103, 80-104, 81-105, 7, 84-108, 85-109, 86-110, 87-111, 88-112, 89-113, 90-114, 91-1 3-117, 94-118, 95-119, 96-120, 97-121, 98-122, 99-123, 100-12 02-126, 103-127, 104-128, 105-129, 106-130, 107-131, 108-13 10-134, 111-135, 112-136, 113-137, 114-138, 115-139, 116-14 18-142, 119-143, 120-144, 121-145, 122-146, 123-147, 124-14 26-150, 127-151, 128-152, 129-153, 130-154, 131-155, 132-15 34-158, 135-159, 136-160, 137-161, 138-162, 139-163, 140-16 42-166, 143-167, 144-168, 145-169, 146-170, 147-171, 148-17 50-174, 151-175, 152-176, 153-177, 154-178, 155-179, 156-18 222-246, 223-247, 224-248 225-249, 226-250, 227-251 , 228-25 230-254, 231-255, 232-256 233-257, 234-258, 235-259, 236-26 238-262, 239-263, 240-264 241-265, 242-266 243-267, 244-26 246-270, 247-271 , 248-272 249-273, 250-27 251-275, 252-27 254-278, 255-279, 256-280 257-281 , 258-282 259-283 260-28 262-286, 263-287, 264-288 265-289, 266-290 267-291 268-29 270-294, 271-295, 272-296 273-297, 274-298 275-299 276-30 278-302, 279-303, 280-304 281-305, 282-306 283-307 284-30 286-310, 287-311 , 288-312 289-313, 290-314 291-315 292-31 294-318, 295-319, 296-320 297-321 , 298-322 299-323 300-32 302-326, 303-327, 304-328 305-329, 306-330 307-331 308-33 310-334, 311-335, 312-336 313-337, 314-338 315-339 316-34 318-342, 319-343, 320-344 321-345, 322-346 323-347 324-34 326-350, 327-351 , 328-352 329-353, 330-354 331-355 332-35 334-358, 335-359, 336-360 337-361 , 338-362 339-363 340-36 406-430, 407-431 , 408-432, 409-433, 410-434, 411-435, 412-43 414-438, 415-439, 416-440, 417-441 , 418-442, 419-443, 420-44 422-446, 423-447, 424-448, 425-449, 426-450, 427-451 , 428-45 430-454, 431-455, 432-456, 433-457, 434-458, 435-459, 436-46 438-462, 439-463, 440-464, 441-465, 442-466, 443-467, 444-46 446-470, 447-471 , 448-472, 449-473, 450-474 y/o 451-475. Asi inoácidos que corresponden a todos los demás fragmentos de t 26 aminoácidos consecutivos y 474 (o 475) aminoácidos cons Q ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ Q ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 se incluyen en la p ción, y pueden contemplarse también inmediatamente con base e píos. Por lo tanto, ejemplos adicionales que ilustran varios fragme olipéptidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ EQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 :an individualmente en la presente para evitar alargar innecesaria 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10, pueden ser descritos en forma alterna mula "n a c" (inclusive), en donde "n" equivale a la posic ácido N-terminal, y "c" equivale a la posición de aminoácido C-t lipéptido. En esta modalidad de la invención, "n" es un entero qu ite inferior de 1 y un límite superior del número total de aminoáci ptido de longitud completa menos 24 (por ejemplo, 475-24 = 4 ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 8; 476-2 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10) ntero entre 25 y el número de aminoácidos de la secuen ptidos de longitud completa (475 para SEQ ID NO: 2, SEQ ID ID NO: 5 o SEQ ID NO: 8; 476 para SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: : 9 o SEQ ID NO: 10), y "n" es un entero menor que "c" por s 24. Por lo tanto, para SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ 139, 140, 141 , 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 15 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 , 162, 163, 164, 165, 16 169, 170, 171 , 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 18 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191 , 192, 193, 194, 195, 19 199, 200, 201 , 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 21 14, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221 , 222, 223, 224, 225, 22 29, 230, 231 , 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 24 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251 , 252, 253, 254, 255, 25 259, 260, 261 , 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 27 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 , 282, 283, 284, 285, 28 289, 290, 291 , 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 30 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 31 , 312, 313, 314, 315, 31 319, 320, 321 , 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 33 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341 , 342, 343, 344, 345, 34 349, 350, 351 , 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 36 ?, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, , 72, 73, 74, 75, 76 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 2, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 1 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 12 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 1 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 1 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 1 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 1 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 1 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 21 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 2 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 2 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 2 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 2 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286 2 410, 411 , 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 , 42 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431 , 432, 433, 434, 435, 436, 43 440, 441 , 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451 , 45 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461 , 462, 463, 464, 465, 466, 46 470, 471 , 472, 473 y 475 (o 476), siempre que V sea un valor c" por cuando menos 24. Cualquier combinación de V y "c" pos cluye como modalidades específicas de fragmentos de polipéptid ción. Todas las escalas usadas que describen cualquier modali ento de polipéptido de la presente invención son inclusivas, a e exponga específicamente de otra manera en la presente.

Fragmentos de un polipéptido de la subunidad pequ asa mutante de la invención o un polipéptido de la subunidad gr asa, como se describen en la presente, pueden obtenerse digirie éptidos de la invención con una enzima proteolítica (tal como otripsina o colagenasa) o con un reactivo químico, tal como bro rada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ EQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID entos de un polipéptido de AGPasa de la subunidad pequeña o nte de la invención contemplados también en la presente, i entos del polipéptido, en donde la totalidad o una parte ncía de tránsito o de señal del polipéptido, es removida.

La invención se refiere también a células transformadas ucleótido de la presente invención que codifica para un polipépti nidad pequeña de AGPasa mutante de la invención. En una mo élula es transformada con una secuencia de polinucleótid jrende una secuencia que codifica para la secuencia de amin rada en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ IEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: én con un polinucleótido que codifica para un polipéptido idad grande de AGPasa muíante como se describe en la prese odalidad, la secuencia de polinucleotidos se provee en una const presión de la invención. La célula transformada puede ser una riótica, por ejemplo, una célula bacteriana tal como E. coli o B. su ula transformada puede ser una célula eucariótica, por ejemp vegetal, incluyendo protoplastos, o una célula animal. Las célula incluyen, pero no están limitadas a, células de dicotile otiledóneas y coniferas. En una modalidad, la célula de la planta de una planta de Zea mays. Las células animales incluyen as, células de mamífero, células de ave y células de insec s de mamífero incluyen, pero no están limitadas a, células COS La invención se refiere también a métodos para increm is de almidón en una planta o tejido de la planta (tal como una s . En una modalidad específica, el polinucleótido compre ncia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: ento o variante de la misma. En otras modalidades específi cleótido comprende las secuencias de nucleótidos mostradas e : 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID N D NO: 16, o un fragmento o variante de las mismas. En una mod inucleótido es incorporado establemente en el genoma de la pl de la planta. El polinucleótido puede comprender ele dores, tales como un promotor y/o secuencias de intensificad n expresión incrementada del polinucleótido y/o el poli ado por el mismo. En una modalidad específica, la secuen tor es una que provee expresión constitutiva o específica de tejid io, endospermo). Plantas o tejidos de la planta que confie cleótido, o progenie de las plantas, pueden identificarse opciona la expresión incrementada de un polinucleótido o polipéptido CUADRO 2 Materiales y métodos Mutaqénesis aleatoria Se introdujeron mutaciones ATATCTGAATTCGAGCTC-3' (SEQ ID NO: 20)) que flanquean se usaron para llevar a cabo la PCR propensa a error. Clones tes producidos por PCR fueron subclonados en el vector pMON rdo con los protocolos de Stratagene. Se usó entonces a pM transformar la cepa AC70R1-504 de E. coli que contenía a Bt2 tre en el vector compatible pMONcBf2. Los clones de Bt2 cidos por PCR fueron subclonados en el vector pMONc8f2. ices a pMONcSí2 para transformar la cepa AC70R1-504 de E. snía a Sh2 de tipo silvestre en el vector compatible pMONcSh2.

Sistema de expresión bacteriano Un sistema de expresión bacteriano (Iglesias et al., 1 itió a los presentes inventores mutagenizar aleatoriamente g asa del endospermo del maíz y calificar la actividad de AGPasa ;ra rápida y eficiente, exponiendo placas a vapores de yodo c a 37°C (Govons et a/., 1969). Las colonias se expusieron a los do por 1 minuto. Las colonias con AGPasa inactiva no produjer o después de la exposición a los vapores de yodo, mientras sa activa produjo glucógeno y, a su vez, tinción café con el yo tes de AGPasa que se tiñen de color más oscuro que el tipo silv ionaron para mayor estudio.

Cuantificación de glucógeno Se realizó cuantificación de glucógeno por reacción c son y Phillips, 1981 ). En resumen, se extrajo glucógeno de 1. as de E.coli (D06oo = 2.0) cultivadas en medio de LB que isa a 2% en p/v por ebullición por 3 horas en KOH a 50% en pitó entonces el glucógeno añadiendo etanol a 70% en ¡fugando a 10,000 x g por 10 minutos. Después del secado de la iadieron 200 µ? de agua desionizada, 200 µ? de fenol a 5% en p/v alizo con el software Bioedit (Hall, 1999).

Purificación de la AGPasa del endospermo del maíz a P s AC70R1-504 de E. coli Se cultivaron células AC70R1-504 de E. coli que e sa del endospermo del maíz, en 2 L de medio de Luria-Broth ncia de 75 pg/mL de espectinomicina, 50 pg/mL de kana sa a 2% en p/v por 16 horas a 37°C con agitación. A DÜ6oo = ieron ¡sopropil-beta-D-tiogalactósido (IPTG) 0.2 mM y 0.02 mg nalidíxico para inducir la expresión de proteínas. Los culti ron de inmediato a temperatura ambiente y se cultivaron por 4 ho ción. Los siguientes pasos se llevaron a cabo a 4°C. Se cos s por centrifugación a 3,000 xg, y la pella se resuspendió en 1 ador de pH A (KH2P04 50 mM, pH 7.0, MgCI2 5 mM, EDTA 0.5 ¡dores de proteasa (1 pg/mL de pepstatina, PMSF 0.1 mM, 10 \j a se hizo pasar a través de una columna de intercambio aniónico o-prep High Q support, Biorad) y un cartucho de hidroxiapatita Biorad), como es descrito por Boehlein et ai (2005). Se de sa usando columnas Zeba Micro Desalt Spin (Pierce) antes ción de las pruebas. Se intercambió la AGPasa en HEPES 5 5 mM, EDTA 0.5 mM y 0.5 mg/mL de BSA (para estabilidad).

Caracterización de la cinética de la AGPasa Se usó la dirección hacia delante de la reacción (G-1-P + -glucosa + PPi) para estimar la kcat, la Km para el ATP y G-1-ades por 3-PGA y Pi. Más específicamente, se pusieron a prueb g de AGPasa purificada para actividad específica, en un volum 0 µ? de HEPES 50 mM, pH 7.4, MgCI2 15 mM, ATP 1.0 mM y G- 37°C por 10 minutos. Para la determinación de las Kms para el A la Ka para 3-PGA, se usaron cantidades variables de ATP, G-1 sfato (PPi-PFK). Todas las enzimas se adquirieron de Sigma, sal que se produjo y se purificó de acuerdo con Deng et al. 19 as modificaciones (Boehlein y Hannah, datos no publicados). Se ncentración de NADH por absorbancia a 340 nm. Se cal ntración de PPi por medio de una curva estándar desarrollada cantidades de PPi en lugar de AGPasa. La cantidad de PPi pr AGPasa fue lineal con el tiempo y la concentración de enzim antes de cinética de la AGPasa se calcularon usando Prism 4.0 San Diego CA).

Medición de la actividad específica de la AGPasa a p ctos de proteína crudos o parcialmente purificados Células AC70R1-504 de E.coli que expresan AGP spermo del maíz se cultivaron en 2 L de medio de Luria-Broth incia de 75 pg/mL de espectinomicina, 50 pg/mL de kana obrenadante se purificó parcialmente a través de sulfato de prot to de amonio como se describió anteriormente. Los extractos de salaron como es descrito por Boehlein et al. (2005) antes de la p tercambiaron en HEPES 50 mM, MgCI2 5 mM y EDTA 0.5 toreó la actividad específica de la AGPasa en la dirección invers sa + PPi ? G-1 -P + ATP) usando cantidades de satura tratos y activador, como es descrito por Boehlein et al. (2005).

Determinación de la estabilidad de la AGPasa al calor Se purificó la AGPasa como se describió anteriorme ó además la AGPasa 1/100 (en v/v) en HEPES 50 mM, MgCI2 A 0.5 mM y 0.5 mg/mL de BSA y se trató con calor a 42 ó 53°C p )os, y se enfrió entonces sobre hielo. La actividad que quedó des miento con calor se monitoreó en la dirección hacia delante e do cantidades de saturación de ATP, G-1-P y 3-PGA. Los d rnetieron a electroforesis sobre un gel de SDS-poliacrilamida por 1 hora, y se visualizaron por tinción con azul brillante de Co mli, 1970).

Análisis de la transferencia de proteínas de extractos crud Se transfirieron en vacío muestras sobre una membr (Biorad), usando el aparato de transferencia Hybri-D nologies). La membrana de PVDF se había remojado previam nol por 5 minutos, y entonces en regulador de pH de trans ¾nol a 20% (en v/v), Tris a 0.303% (en p/v) y glicina a 1.44% (en inutos. La membrana se incubó con regulador de pH de bloqueo (en p/v), KCI a 0.02% (en p/v), Na2HP04 a 0.144% (en p/v), K \% (en p/v), albúmina de suero de bovino (BSA) a 5% (en w/v) y 0.05% (en v/v)] por 1 hora con agitación constante. El blot se inc ador de pH de bloqueo que contenía 1 :10000 (en v/v) de an Representación con modelo tridimensional Se representó con un modelo la estructura del monó egún la unidad pequeña de papa, en la estructura tridimensional ada de la AGPasa homotetrámera de tubérculo de papa (RCSB Bank #:1YP2). Se representó con un modelo la homología, S MODEL (Peitsch, 1995; Guex y Peitsch, 1997; Schwede et a y Schwede, 2004; Arnold ef a/. , 2006). Se determinaron los resid en contacto con el aminoácido 462 (Thr o lie) usando J vador de Java de código fuente abierto para estructuras quimi a dimensión (http://www.jmol.org/).

Prueba de dos híbridos de levadura Se llevaron a cabo transformaciones de levadura y una galactosidasa, como es descrito por Greene y Hannah (1998b). L icación fue el uso de pGBKT7 y pGADT7 como vectores para e! r en práctica la invención. Estos ejemplos no deben ser consi limitativos. Todos los porcentajes son en peso, y todas las prop mezcla de solventes son en volumen, a menos que se indique ra en la presente.

EJEMPLO 1 Se creó una colección de Bt2 muíante por PCR propensa rga mutacional fue aproximadamente 2 mutaciones no sinóni (Georgelis et a/., 2007). Los mutantes fueron expresados en E. c n gen de Sh2 de tipo silvestre. Se analizaron aproximadamente ias para la producción de glucógeno. Se seleccionaron diez colo en de color oscuro. Se secuenciaron los dos mutantes de Bt2 de color más oscuro. Ambos tuvieron la misma mutación no s esultó en un cambio del aminoácido 462 de treonina a isoleucina H2 y BT2-T1/SH2, indicó que BT2-T1 se encuentra en ades en E. coli (figuras 2A-2B). Mientras que los niveles de activ Pasa de extractos crudos de células no inducidas que e H2 y BT2-T1/SH2 fueron demasiado bajos para detectarse, el lmente purificado de BT2-T1/SH2 tuvo 20 veces más actividad tuvo el extracto parcialmente purificado de BT2/SH2 (figura ilidad de que BT2-T1/SH2 produjera más proteína y actividad d ripción/traducción más eficiente es improbable, puesto que los c (T) a ATA (I) se usan con la misma frecuencia en E. coli (6.1 ctivamente) (Nakamura et al., 2000). Esto sugiere que la mayor c roteina y actividad en células BT2-T1/SH2, se debe a la est mentada de la AGPasa.

Para determinar las propiedades de cinética y la estabi de BT2-T1/SH2 y descrifrar la causa de la síntesis increment geno en E. co//, se purificaron AGPasas de BT2-T1/SH2 y B entada de glucógeno en E. coli.

MP es una variante de la subunidad pequeña que puede cia agronómica. Algunas de sus características incluyen a mentada en ausencia del activador 3-PGA, afinidad incrementad afinidad disminuida por Pi (cuadro 3) y estabilidad elevada al aración con BT2/SH2 (figura 3) (Cross et al., 2004; Boehlein ). Puesto que BT2-T1/SH2 no fue tan estable al calor como a 3), el cambio de aminoácido de T1 se introdujo en MP en un e umentar más la estabilidad al calor de MP (MP-T1 ).

Células que expresan MP-T1/SH2 (MP teniendo la mutaci )inada con SH2) produjeron la misma cantidad de glucógeno que expresan MP/SH2 (figura 1). Sin embargo, mayores cantidade ína MP-T1 respecto a BT2 se encontraron en extractos crudos d expresan las dos proteínas con SH2 (figuras 2A-2B). La activida ctos crudos y los extractos parcialmente purificados de MP-T1/S ña del tubérculo de papa muestra 88% de identidad y 96% de T2. Se representó con un modelo la estructura del monómero és de la estructura resuelta de la subunidad pequeña del tubér (figura 7A). El residuo mutado en T1 es parte de una ß-hélice, cto hidrofóbico con dos residuos (Pro, Leu) del extremo N-termin nidad pequeña (figura 7B). El cambio de aminoácido de Thr a li a la distancia de la Pro y Leu mencionadas anteriormente (figura tivo especular que la mutación T1 refuerza la interacción hidr el extremo C-terminal y N-terminal de la subunidad pequeña, a en mayor estabilidad. A diferencia de MP, cuya estabilidad al ye a residuos en/cerca de las zonas interfaciales subunidad-sub uede no afectar directamente las interacciones subunidad-sub to que está lejos de las zonas interfaciales subunidad-subunidad Para determinar si T1 afecta la fuerza de las intera original en la posición 462 es importante para la activida , pero no para la estabilidad al calor.

EJEMPLO 2 La invención provee variantes de AGPasa agronómic tantes de la planta, usando mutagénesis aleatoria y un siste sión bacteriano heterólogo. Se aisló BT2-T1 como una variant idad pequeña que incrementó la cantidad de glucógeno produc s de E. coli cuando fue expresado junto con SH2. Células que e 1/SH2 tuvieron actividad de AGPasa 20 veces mayor que célul san BT2/SH2. Un dot-blot indicó que el extracto de proteína cr s que expresan BT2-T1/SH2 tuvo proteína BT2 más detecta aración con células que expresan BT2/SH2. Este resultado jirse a transcripción/traducción más eficiente o a mayor estabili ces en la actividad de la AGPasa de células que expresan BT2-erpreta como un número mayor de moléculas de AGPasa acti aración con células que expresan BT2/SH2. Esto significa tambi S de 5% de las moléculas de AGPasa potenciales funcionan rea 2/SH2.

Se ha reportado que la subunidad pequeña del tubér puede formar un homotetrámero que tiene actividad significativa n cantidades extremadamente altas del activador 3-PGA (Ballicor . Como se muestra en la presente, células de E. coli que expresa 1 como homotetrámeros, no producen cantidades detectab geno. Por lo tanto, las cantidades incrementadas de glu vadas en las células que expresan BT2-T1/SH2 en comparaci s que expresan BT2/SH2, se deben al complejo de BT2-T1 co ue al homotetrámero de BT2-T1.

Otra variante de la subunidad pequeña que resulta en est ste con MP, T1 no refuerza las interacciones subunidad-subunid rgo, no puede descartarse la posibilidad de que T1 afecte indirect eracciones subunidad-subunidad a través de un cambio conform osible que Y2H pueda no ser bastante sensible para revel ncia en las interacciones subunidad-subunidad entre T1/SH2 y B mperatura de crecimiento de las levaduras de 30°C.

Una comparación de la estabilidad al calor de BT2-T1 2 puras, indicó que BT2-T1/SH2 no fue tan estable al calo H2. Además, MP/SH2 tiene varias ventajas no compartidas p H2, tales como actividad en ausencia del activador 3-PGA, una ad por 3-PGA, una menor afinidad por el inhibidor Pi, y una kcat m aración con BT2/SH2. Se investigó si la estabilidad al calor de a mejorarse más introduciendo el cambio T1 en MP. La v ante, MP-T1 , cuando se expresa con SH2 en E. coli, dio un lad de glucógeno que MP/SH2. Esto podría significar que MP-T1/ -T1/SH2 y P/SH2. Estas fases fueron quizá un resultado de dif os de la AGPasa. Este modo bifásico de estabilidad al calor vado antes y no es específico de MP/SH2 o MP-T1 (Boehlein . La primera fase muestra menor estabilidad al calor que la s /SH2 es más estable al calor en ambas fases, en comparad H2. Sin embargo, continúa siendo enigmático cuál es exactam o de la AGPasa en cada fase. El modo bifásico de estabilidad al servó en BT2/SH2 y BT2-T1/SH2, debido a que las muestras no tadas por un tiempo bastante largo para alcanzar la segunda fas n calentadas a menor temperatura que P/SH2 y MP-T1/SH2 (4 de 53°C).

El cuadro 3 muestra las propiedades de cinética de varía sa recombinantes purificadas. Las propiedades alostéricas y de variantes de AGPasa se determinaron en la dirección hacia dela ó la kCat (s"1)(G-1-P), haciendo variar la cantidad de G-1-P y mant CUADRO 3 Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descrit nte son sólo para propósitos ilustrativos, y que varias modificac ios a la luz de los mismos serán sugeridos por los expertos en la REFERENCIAS Patente de E.U.A. No. 5,034,322 Patente de E.U.A. No. 5,106,739 Patente de E.U.A. No. 5,589,610 Patente de E.U.A. No. 5,589,618 Patente de E.U.A. No. 5,625,136 Patente de E.U.A. No. 5,639,948 Patente de E.U.A. No. 5,650,557 Patente de E.U.A. No. 5,661 ,017 Patente de E.U.A. No. 5,872,216 Patente de E.U.A. No. 6,069,300 Patente de E.U.A. No. 6,184,438 Patente de E.U.A. No. 6,403,863 Patente de E.U.A. No. 6,455,760 Solicitud de E.U.A. publicada No. 20040019934 Solicitud de E.U.A. publicada No. 20040067506 Solicitud de E.U.A. publicada No. 20040078841 Solicitud de E.U.A. publicada No. 20040123349 Solicitud internacional publicada WO 2005/019425 Solicitud internacional publicada WO 99/58698 Solicitud internacional publicada WO 2003/0070901 Solicitud internacional publicada WO 98/22601 Solicitud internacional publicada WO 02/072784 Solicitud de patente de EPO publicada No. EP 1528104 Altschul, S. F. et al, (1990) "Basic Local Alignment Searc /. BioL 215: 402- 410.

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1. - Un polinucleótido que codifica para una protein nidad pequeña de AGPasa mutante de la planta, o un fr onal de dicha proteína, dicha proteína comprendiendo una mut loácido en donde el aminoácido que corresponde al aminoácido 3 posición 462 de la proteína de la subunidad pequeña de AG >spermo del maíz de tipo silvestre, es reemplazado por un ami confiere estabilidad incrementada al calor cuando dicha su teña de AGPasa mutante es expresada para formar una en asa. 2. - El polinucleótido de conformidad con la reivindic :terizado además porque dicho aminoácido de reemplazo que : 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o un fragmento fu misma. 5. - El polinucleótido de conformidad con la reívindica terizado además porque dicho polinucleótido comprende la secue ótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 1 : 12 o SEQ ID NO: 13, o un fragmento funcional de la misma. 6. - El polinucleótido de conformidad con la reivindica terizado además porque dicho polinucleótido se provee rucción de expresión. 7. - Un polinucleótido que codifica para una proteína nidad pequeña de AGPasa quimérica de la planta, o un fra anal de dicha proteína, en donde dicha proteína de AGPasa qu >rende una secuencia N-terminal de una región N-terminal nidad pequeña de AGPasa de la planta de una primera planta sa. 8. - El polinucleótido de conformidad con la reivindica terizado además porque dicha secuencia N-terminal compre iros 150 a 250 aminoácidos de la región N-terminal de dicha su Pasa de dicha primera planta, y dicha secuencia C-terminal co 00 residuos terminales o menos de la región C-terminal d nidad de AGPasa de dicha segunda planta. 9. - El polinucleótido de conformidad con la reivindica terizado además porque dicho aminoácido de reemplazo que ilidad incrementada al calor, es una isoleucina. 10. - El polinucleótido de conformidad con cualquiera idicaciones 7 a 9, caracterizado además porque dicha región N-t ? la subunidad pequeña de AGPasa del endospermo del maíz. 11. - El polinucleótido de conformidad con cualquiera idicaciones 7 a 9, caracterizado además porque dicha región C- ótidos mostrada en cualquiera de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 1 : 15 o SEQ ID NO: 16, o un fragmento funcional de la misma. 14 - El polinucleótido de conformidad con cualquiera icaciones 7 a 13, caracterizado además porque dicho polinucleó e en una construcción de expresión. 15. - Un polipéptido codificado por: a) un polinucleót uiera de las reivindicaciones 1 a 6; o b) un polinucleótido de cua reivindicaciones 7 a 14. 16. - Una planta o célula de la planta o tejido de la ormado o transgénico, que comprende: a) un polinucleót uiera de las reivindicaciones 1 a 6; o b) un polinucleótido de cu reivindicaciones 7 a 14; o c) los polinucleótidos de a) y b). 17. - La planta o tejido de la planta o célula de la pi rrnidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque la de la planta o célula de la planta expresa también la subunidad 19. - La planta o tejido de la planta o célula de la pí rmidad con la reivindicación 16, caracterizado además porqu nidad grande muíante comprende la mutación Rev6. 20. - La planta o tejido de la planta o célula de la pí rmidad con la reivindicación 16, caracterizado además porqu a o tejido de la planta o célula de la planta es de monocotiledónea. 21. - La planta o tejido de la planta o célula de la pl rmidad con la reivindicación 20, caracterizado además porqu a o tejido de la planta o célula de la planta de monocotiledó ciona del grupo que consiste de arroz, trigo, cebada, avena, c , maíz, caña de azúcar, pina, cebolla, plátano, coco, lirio, pas des y mijo. 22. - La planta o tejido de la planta o célula de la pl rmidad con la reivindicación 16, caracterizado además porqu a es Zea mays, o dicho tejido o célula de la planta es de Zea may te, ñame, mandioca, rábano, brócoli, espinaca, col, colza, árb ana, cítricos (incluyendo naranja, mandarina, toronja, limón, res), uva, algodón, girasol, fresa, lechuga y lúpulo. 25. - La planta o tejido de la planta o célula de la pi midad con la reivindicación 16, caracterizado además porqu de la planta es una semilla, púa o portainjerto. 26. - Una enzima de AGPasa mutante de la plan rende uno o más polipéptidos mutantes de la reivindicación 5. 27. - Un método para incrementar la resistencia de una ciones de estrés de calor y/o para incrementar la biosintesis de na planta, dicho método comprendiendo incorporar uno cleótidos en el genoma de una planta, y expresar la proteína co icho polinucleótido, en donde dicho polinucleótido es o compre uier polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; uier polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14. entado de la semilla. 30. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha subunidad grande mutante compr ión Rev6. 31. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha planta es monocotiledónea. 32. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha planta monocotiledónea se selecci que consiste de arroz, trigo, cebada, avena, centeno, sorgo, maí úcar, piña, cebolla, plátano, coco, lirio, pasto para céspedes y mij 33. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha planta es Zea mays. 34. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha planta es dicotiledónea. 35. - El método de conformidad con la reivindicaci entada de almidón en la planta respecto a una planta que tie a de AGPasa de tipo silvestre, dicho método comprendiendo int más polinucleótidos en la célula de la planta y desarrollar una pl célula de la planta, en donde dicho polinucleótido es o compre ier polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; ier polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14. 37. - El método de conformidad con la reivindicaci erizado además porque la planta expresa también la subunidad Pasa del maíz. 38. - El método de conformidad con la reivindicaci erizado además porque la planta expresa una subunidad te de AGPasa, en donde dicha subunidad grande mutante com utación que confiere estabilidad incrementada al calor, y/o idad grande mutante comprende una mutación que confier entado de la semilla. úcar, piña, cebolla, plátano, coco, lirio, pasto para céspedes y mij 42. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha planta es Zea mays. 43. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha planta es dicotiledónea. 44. - El método de conformidad con la reivindicaci terizado además porque dicha planta dicotiledónea se selecci que consiste de tomate, pepino, calabaza, chícharo, alfalfa, nzo, achicoria, trébol, berza común, lenteja, soya, frijol, tabac te, ñame, mandioca, rábano, brócoli, espinaca, col, colza, árb ana, cítricos (incluyendo naranja, mandarina, toronja, limón, res), uva, algodón, girasol, fresa, lechuga y lúpulo.