CN102203256A - 耐热植物和植物组织以及用于制备和使用它们的方法和材料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于向植物或植物组织提供增加的热条件抗性和/或增加的淀粉生物合成的材料和方法。与升高的温度处通常观察到的产量损失相比较，植物或植物组织增加的热条件抗性提供降低的产量损失。本发明的一个方面涉及编码突变植物AGP酶小亚基的多核苷酸。本发明也包括由本发明的多核苷酸编码的突变植物AGP酶小亚基。本发明也涉及包含本发明多核苷酸的植物和用于制备该类植物的方法。
Description
政府支持
本申请的主题受国家科学基金项目号IOS-0444031的研究资助支持。因此，政府享有此发明中的某些权利。
发明背景
热胁迫导致降低的玉米产量(Peters等人，1971；Thompson，1975；Chang，1981；Christy和Williamson，1985)。这可以归因于光合产物可利用性(photosynthate availability)和从源头至接收组织(sink tissues)的运输降低、不良授粉、细胞及谷粒尺寸和数目减少、早期种子败育和/或籽粒灌浆期缩减。胚乳的生长始于其中细胞活跃分裂的延迟期并且继之以其中细胞尺寸增加和淀粉合成出现的线性期。在延迟期期间升高的温度导致降低的产量(Jones等人，1984)。这些研究人员提出降低的产量归因于细胞及谷粒数目和尺寸减少以及种子败育。另外，在线性期期间升高的温度导致更短的籽粒灌浆期和随后更小的谷粒(Jones等人，1984)。Hunter等人(1977)和Tollenaar及Bruulsema(1988)发现了相似的结果。
来自传统上生产超过50％美国玉米的5个州的记录显示平均日温度是23.6℃，比籽粒灌浆期间最适温度高约2℃(Singletary等人，1994)。籽粒灌浆期间的光合产物可利用性在高温不降低，至少在大麦和小麦中如此。实际上，大麦种子和小麦种子中的蔗糖含量在高温下不变或升高(Bhullar和Jenner，1986；Wallwork等人，1998)。玉米中的光合作用直至32℃还增加(Duncan和Hesketh，1968；Hofstra和Hesketh，1969；Christy等人，1985)。另外，Cheikhn和Jones(1995)研究了玉米籽粒在不同温度固定14C蔗糖和己糖的能力。他们发现种子中这些糖在升高的温度处增加。上述证据表明籽粒灌浆期间受限的糖可利用性和运输入籽粒不是温度诱导的产量降低的原因。
已经进行了深入研究来鉴定升高的温度期间影响籽粒灌浆的生物化学途径。Singletary等人(1993；1994)测试了在升高的温度(22℃至36℃)体外培育的玉米籽粒中的淀粉生物合成酶。他们发现与参与淀粉合成的其他酶相比，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGP酶)和可溶性淀粉合酶(SSS)更为热不稳定。他们提出AGP酶和SSS的热不稳定性对籽粒灌浆停止有贡献。Duke和Doehlert(1996)发现与25℃相比，编码淀粉合成途径的酶的几个基因(包括编码AGP酶的那些基因)的转录物在35℃减少。然而，酶测定法显示仅AGP酶活性显著更低。他们提出这可能归因于AGP酶与其他酶相比更高的周转率。最后，通过Q10分析，Wilhelm等人(1999)显示与几种其他酶相比，AGP酶具有最突出的活性降低。在57℃加热5分钟时，玉米AGP酶实际上丧失其活性的96％(Hannah等人，1980)。
AGP酶催化淀粉(植物)和糖原(细菌)合成中首个承担合成的步骤。它涉及将葡萄糖-1-P(G-1-P)和ATP转变成ADP-葡萄糖和焦磷酸(PPi)。AGP酶在植物中是由两个相同小亚基和两个相同大亚基组成的异四聚体。大亚基和小亚基分别由玉米胚乳中的皱缩-2(shrunken-2；Sh2)和易碎-2(brittle-2；Bt2)编码。AGP酶受指示细胞能量状态的小效应分子变构地调节。AGP酶在蓝细菌、绿藻和被子植物中被第一碳同化产物3-PGA激活并且被无机磷酸盐(Pi)抑制/失活。
玉米胚乳AGP酶在淀粉合成中的重要性已经由该酶两种亚基任一者中突变体的籽粒表型显示。实际上，此类突变体导致皱缩的籽粒和胚乳淀粉含量的大降低(Tsai和Nelson，1966；Hannah和Nelson，1976)。也存在AGP酶催化淀粉合成中限速步骤的证据(Stark等人1992；Giroux等人1996；Greene等人1998；Sakulsingharoja等人2004；Obana等人2006；Wang等人2007)。
Greene和Hannah(1998a)分离了在大亚基中具有称为HS33的单氨基酸改变的玉米AGP酶的突变形式。他们显示改变的酶更为热稳定并且稳定性归因于更强的亚基-亚基相互作用。当小麦和稻用含有HS33改变连同影响AGP酶变构特性的改变(Rev6)的Sh2变体转化(Giroux等人，1996)时，产量分别提高38％和23％(Smidansky等人，2002；2003)。值得注意地，该提高归因于种子数目增加，而非单个种子重量增加。
用含有Rev6和HS33改变的Sh2变体转化玉米也导致提高的种子数目。种子产量/玉米穗可以在玉米中提高直至68％。对玉米转基因事件的详细表征正在进行(Greene和Hannah，筹备中)。提高的种子数目不能由Rev6解释，因为在玉米中单独表达时，它仅增加种子重量(Hannah，未发表)。以上研究显示了AGP酶热稳定性在谷物产量中的重要性。
Cross等人(2004)产生了由BT2的头200个氨基酸和马铃薯块茎小亚基的末尾275个氨基酸组成的嵌合小亚基(MP)。与SH2复合的MP具有可能导致农艺学收益的几个特点(Cross等人，2004；Boehlein等人，2005)。那些特点中的一些特点是与野生型玉米胚乳AGP酶(BT2/SH2)相比在缺少激活物3-PGA的情况下提高的活性、增加的3-PGA亲和力和升高的热稳定性。初步数据显示表达于玉米胚乳中的具备含有AGP酶变体的转基因MP的玉米植物导致淀粉产量增加(Hannah，未发表的数据)。
发明简述
本发明涉及用于向植物或植物组织提供增加的热条件抗性和/或增加的淀粉生物合成的材料和方法。与升高的温度通常观察到的产量损失相比较，植物或植物组织增加的热条件抗性引起降低的产量损失。本发明的一个方面涉及编码突变植物AGP酶小亚基的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有氨基酸突变的植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。在另一个实施方案中，多核苷酸编码由(如美国专利号7,173,165中所述的)来自两种不同植物的序列组成并且包含本发明氨基酸突变的嵌合植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。该嵌合AGP酶中的突变协同地增强热稳定性。本发明也包括由本发明的多核苷酸编码的突变植物AGP酶小亚基。对热稳定性以及动力学特性与变构特性的表征显示当本发明的多核苷酸在植物如单子叶植物胚乳中表达时，提供了增加的淀粉产量。
附图简述
图1显示由与SH2一起表达BT2、BT2-TI、MP、MP-TI的大肠杆菌细胞产生的糖原。来自仅单独表达SH2、BT2、BT2-TI和MP的细胞产生的糖原。糖原以葡萄糖单位测量。误差线显示标准差(N＝3)。
图2A和图2B显示来自与互补亚基SH2一起表达BT2、BT2-TI、MP、MP-TI的大肠杆菌细胞的粗提取物的斑点印迹结果。通过使用针对BT2的单克隆抗体使AGP酶显影。通过使用ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)估计斑点的密度。
图3显示AGP酶变体在来自未诱导大肠杆菌细胞的粗提取物和部分纯化的蛋白质提取物中的比活性。活性以反方向测量。n.d.＝检测不到。误差线显示标准差(N＝3)。
图4显示AGP酶的纯化。纯化的重组BT2/SH2、TI/SH2、MP/SH2和MP-TI/SH2的SDS-PAGE。使用来自Biorad的Precision Plus ProteinAll Blue Standard作为标记。左边上部箭头指向大亚基。左边下部箭头指向小亚基。
图5A和图5B显示纯化的BT2/SH2、BT2-TI/SH2和MP/SH2的热稳定性。每种AGP酶的半寿期(T1/2)表示为均值±标准误。p-值通过Prizm(Graph pad，San Diego CA)执行的F检验估计。在图5A中，测试以正方向进行。在图5B中，测试以反方向进行。
图6A和图6B显示纯化的MP/SH2和MP-TI/SH2的热稳定性。每种AGP酶的半寿期(T1/2)表示为均值±标准误。p-值通过Prizm(Graph pad，San Diego CA)执行的F检验估计。在图6A中，分析以正方向进行。在图6B中，分析以反方向进行。
图7A-7C显示BT2和TI的3D建模。图7A是BT2单体的预测3D结构。TI改变由红色圆圈标出。直接参与亚基-亚基相互作用的BT2区域由黄色框突出显示。图7B显示Thr462(1，2)的碳原子与Pro60(4，5)和Leu61(3)的那些碳原子的距离。图7C显示Ile462(1，2，3，4)的碳原子与Pro60(5，6)和Leu61(7，8)的那些碳原子的距离。通过使用FirstGlance Jmol确定Thr462和Ile462接触残基。深灰色球指示Thr462和Ile462的碳原子。浅灰色球指示接触残基的碳原子。氧原子和氮原子分别由红色和蓝色指示。
图8显示AGP酶亚基-亚基相互作用的强度。在酵母双杂交系统中，使用SH2作为诱饵并且使用BT2、TI和MP作为捕获物。使用定量β-半乳糖苷酶测定法来量化诱饵与捕获物之间的相互作用。误差线表示2×标准误(N＝4)。
序列简述
SEQ ID NO：1是包含了编码本发明突变多肽(TI)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是本发明突变多肽(TI)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3是包含了编码本发明突变多肽(MP-TI)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：4是本发明突变多肽(MP-TI)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5是本发明突变多肽(TI+YC)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：6是本发明突变多肽(TI+QTCL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：7是本发明突变多肽(TI+ETCL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8是本发明突变多肽(MP-TI+YC)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9是本发明突变多肽(MP-TI+QTCL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10是本发明突变多肽(MP-TI+ETCL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO：5)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：12是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：13是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：14是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO：8)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：15是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO：9)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：16是包含了编码本发明突变多肽(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：17是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO：18是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO：19是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO：20是可以根据本发明使用的寡核苷酸。
SEQ ID NO：21是本发明突变多肽(TI)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22是本发明突变多肽(TI)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23是本发明突变多肽(TI)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24是本发明突变多肽(TI)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25是本发明突变多肽(TI)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26是马铃薯块茎AGP酶小亚基蛋白的氨基酸序列。
发明详述
本发明涉及用于提供热条件抗性增加和/或淀粉生物合成增加的植物的材料和方法。与升高的温度通常观察到的产量损失相比较，植物增加的热条件抗性引起降低的产量损失。
本发明的一个方面涉及编码突变植物AGP酶小亚基的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸编码具有氨基酸突变的植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米胚乳AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。在一个具体实施方案中，置换的氨基酸是异亮氨酸。在一个实施方案中，突变植物AGP酶小亚基是玉米胚乳AGP酶小亚基。在一个例举的实施方案中，突变植物AGP酶小亚基包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其片段或变体。在一个具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中，突变植物AGP酶小亚基来自大麦、小麦、高粱、马铃薯或稻。在一个具体实施方案中，突变大麦、小麦、高粱或马铃薯AGP酶小亚基分别包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，该多核苷酸编码可以额外包含如公开的国际专利申请WO2005/019425(Hannah和Linebarger)中所述氨基酸突变的突变植物AGP酶小亚基。在一个实施方案中，由该多核苷酸编码的突变AGP酶小亚基包含氨基酸突变，其中与野生型玉米胚乳AGP酶第36氨基酸位置相对应的酪氨酸用半胱氨酸置换。突变AGP酶小亚基也可以任选地包含在分别与野生型玉米胚乳AGP酶第34和35氨基酸位置相对应的丝氨酸和苏氨酸氨基酸之间插入的氨基酸。在具体实施方案中，在AGP酶小亚基第34和35位置处的氨基酸之间插入的氨基酸是谷氨酸或谷氨酰胺。在例举的实施方案中，突变植物AGP酶小亚基包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列或其片段或变体。
在另一个实施方案中，多核苷酸编码由(如美国专利号7,173,165中所述的)来自两种不同植物的序列组成并且还包含本发明氨基酸突变的嵌合植物AGP酶小亚基，其中与野生型玉米胚乳AGP酶小亚基第462氨基酸位置相对应的苏氨酸氨基酸由赋予增加的热稳定性的氨基酸置换。在具体实施方案中，置换的氨基酸是异亮氨酸。在一个实施方案中，嵌合AGP酶小亚基包含来自一种植物的羧基端部分和来自另一种植物的氨基端部分。在一个实施方案中，本发明的嵌合蛋白包含大致具有第一植物AGP酶小亚基氨基端的头150个至250个氨基酸的氨基端序列和大致包含第二植物AGP酶小亚基羧基端的末端300个或更少残基的羧基端序列。因而，嵌合亚基的羧基端可以包含第二植物的羧基端的末尾300或299或298或297或296或295个残基等。所述亚基序列可以来自单子叶或双子叶植物或者单子叶和双子叶植物的AGP酶。在本发明的范围内包括单子叶植物，例如稻、小麦、大麦、燕麦、高粱、玉米、百合和谷子。双子叶植物可以包括例如烟草、大豆、马铃薯、甘薯、萝卜、卷心菜、油菜、苹果树和莴苣。在一个实施方案中，该嵌合蛋白的头200个左右的氨基端氨基酸来自玉米胚乳AGP酶小亚基的氨基端并且羧基端氨基酸来自马铃薯块茎AGP酶小亚基的羧基端并包括与本发明第462氨基酸位置相对应的突变。在具体实施方案中，本发明嵌合蛋白的羧基端区包含马铃薯块茎的AGP酶小亚基的末尾276个氨基酸。在例举的实施方案中，该嵌合蛋白包含玉米胚乳AGP酶小亚基的一部分和马铃薯块茎AGP酶小亚基的一部分。在具体实施方案中，该嵌合蛋白含有a)来自玉米胚乳AGP酶小亚基的头199个氨基酸(即，第1直至第199氨基酸)和马铃薯块茎AGP酶小亚基的羧基末端，其中使用对保藏为Genbank登录号X61186的蛋白质所示的氨基酸序列，所述羧基末端始于第246氨基酸(即，第246直至第521氨基酸)(或，如Hannah等人，2001中那样使用针对马铃薯AGP酶亚基的编号系统，备选地始于第175氨基酸)，和b)与本发明第462氨基酸位置相对应的突变。在例举的实施方案中，植物嵌合AGP酶小亚基包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中，该多核苷酸编码了可以额外包含在公开的国际专利申请WO 2005/019425(Hannah和Linebarger)中所述氨基酸突变的突变植物AGP酶小亚基。在又一个实施方案中，由该多核苷酸编码的突变AGP酶小亚基也包含氨基酸突变，其中第36位置处的酪氨酸用半胱氨酸置换。突变AGP酶小亚基也可以任选地包含分别在第34和第35位置处的丝氨酸与苏氨酸氨基酸之间插入的氨基酸。在具体实施方案中，在突变AGP酶小亚基第34和35位置之间插入的氨基酸是谷氨酸或谷氨酰胺。在例举的实施方案中，突变植物AGP酶小亚基包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列或其片段或变体。
本发明也涉及用于增加热稳定性和/或增加淀粉生物合成和增加植物或植物组织的作物产量的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括将本发明的一种或多种多核苷酸导入植物。在某些实施方案中，导入植物的多核苷酸编码一种或多种多肽，所述多肽包含任一SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另外的具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中，该多核苷酸稳定地并入植物或植物组织的基因组。该多核苷酸可以包含引起该多核苷酸和/或所编码多肽的表达增加的调节元件，如启动子和/或增强子序列。在具体实施方案中，启动子序列是提供组成型或组织特异性(例如胚乳)表达的一种启动子。可以任选地对含有该多核苷酸的植物或植物组织或植物子代筛选本发明多核苷酸或多肽增加的表达。在一个实施方案中，将本发明的一种或多种多核苷酸的多重拷贝导入植物或植物组织并且稳定地并入该植物的基因组。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸以本文中所述的表达构建体提供。
本发明也涉及由本发明多核苷酸编码的突变AGP酶小亚基多肽。在一个实施方案中，该多肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或其片段或变体。在其他实施方案中，该多肽包含SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其片段或变体。在另一个实施方案中，该多肽包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或其片段或变体。在又一个实施方案中，该多肽包含任一SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其片段或变体。
本发明也涉及包含一种或多种本发明突变AGP酶小亚基多肽的突变植物AGP酶。该突变植物AGP酶也可以包含一种或多种野生型AGP酶大亚基多肽。在具体实施方案中，突变植物AGP酶包含一种或多种突变AGP酶小亚基多肽，其中任一所述突变AGP酶小亚基多肽可以包含SEQID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25的氨基酸序列或任一这种序列的片段或变体，其中突变AGP酶相对于野生型AGP酶展示出增加的热稳定性。在一个实施方案中，该突变植物酶包含本发明的两个突变AGP酶小亚基，其中突变多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变。本发明也涉及包含一种或多种本发明突变AGP酶小亚基多肽的突变植物AGP酶和一种或多种突变AGP酶大亚基多肽。在一个实施方案中，突变AGP酶大亚基多肽可以是任一美国专利号5,589,618；5,650,557；5,872,216；6,069,300；6,184,438；6,403,863；6,809,235；7,173,165；7,312,378；和6,969,783中所述的任一那些突变AGP酶大亚基多肽。在一个实施方案中，突变AGP酶大亚基多肽包含Rev6突变。在另一个实施方案中，突变AGP酶大亚基多肽包含如美国专利号6,069,300；6,403,863；6,809,235；7,312,378及6,969,783和公开的国际专利申请号WO 99/58698；WO2003/0070901；WO 98/22601及WO 02/072784中所述的一种或多种热稳定(HS)突变，例如HS33突变。在一个实施方案中，该突变植物AGP酶包含本发明的两个突变AGP酶小亚基多肽，其中所述突变AGP酶小亚基多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变，如本文中所述。在另一个实施方案中，该突变植物AGP酶包含两个突变AGP酶大亚基多肽，其中所述突变AGP酶大亚基多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变。在又一个实施方案中，该突变植物AGP酶包含本发明的两个突变AGP酶小亚基多肽和两个突变SH2多肽，其中所述突变AGP酶小亚基多肽和突变AGP酶大亚基多肽可以具有相同的突变或可以具有不同的突变，如本文中所述。
本发明也涉及用于提供相对于野生型植物AGP酶具有增加的热稳定性的突变植物AGP酶的方法。在一个实施方案中，该方法包括在AGP酶中与野生型或突变AGP酶大亚基一同并入或提供一种或多种本发明的突变AGP酶小亚基多肽。在一个实施方案中，该AGP酶包含多肽亚基的四聚体，其中1个、2个或更多个亚基是本发明的突变多肽。在一个实施方案中，该AGP酶也包含突变AGP酶大亚基多肽亚基，如包含Rev6和/或热稳定性突变如HS33的突变大亚基。
本发明也涉及本发明的植物、植物组织和植物细胞，它们包含本发明的多核苷酸或由本发明的多核苷酸编码的蛋白质，或者表达本发明的突变多肽或其片段或变体，或者包含或表达本发明的突变植物AGP酶。植物组织包括但不限于种子、接穗和根状茎。在本发明的范围内的植物包括单子叶植物，如稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。在本发明的范围内的植物也包括双子叶植物，如番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝(kale)、扁豆、大豆、菜豆、烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜(radish)、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘(包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。在本发明的范围内也构思了含有本发明多核苷酸的草本植物。草本植物包括欧芹、鼠尾草、迷迭香、百里香等。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞是玉米(Zea mays)。在一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞是转基因植物、植物组织或植物细胞。在另一个实施方案中，植物、植物组织或植物细胞是已经通过育种程序获得的一种植物、植物组织或植物细胞。
在本发明中有用的多核苷酸可以在表达构建体中提供。本发明的表达构建体通常包括在该表达构建体待于其中表达的预定宿主细胞中有功能的调节元件。因而，本领域普通技术人员可以选择用于细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞、哺乳动物宿主细胞和人宿主细胞中的调节元件。调节元件包括启动子、转录终止序列、翻译终止序列、增强子和多腺苷酸化元件。如本文中所用，术语“表达构建体”指引起有效连接的核酸序列转录的核酸序列的组合。如本文中所用，术语“有效连接”指所述组件的毗连，其中所述组件处在允许它们以其意图方式发挥功能的关系中。通常。有效连接的组件处于相邻关系中。
本发明的表达构建体可以包含与编码本发明突变多肽的多核苷酸序列有效连接的启动子序列。使用本领域已知的标准技术，可以将启动子并入多核苷酸。可以在本发明的表达构建体中使用启动子的多重拷贝或多种启动子。在优选的实施方案中，启动子可以在表达构建体中离转录起始位点以该启动子在其天然遗传环境中距转录起始位点大约相等的距离布局。允许这种距离的某些变化，而不明显减少启动子活性。在表达构建体中一般包括转录起始位点。
如果该表达构建体将在植物细胞中提供或导入植物细胞，则可以使用植物病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S(包括增强的CaMV 35S启动子(见，例如美国专利号5,106,739))或CaMV 19S启动子或木薯叶脉花叶病毒启动子。可以用于植物中表达构建体的其他启动子包括例如prolifera启动子、Ap3启动子、热休克启动子、根癌农杆菌(A.tumefaciens)的T-DNA 1′-或2′-启动子、多聚半乳糖醛酸酶启动子、来自碧冬茄属(petunia)的查尔酮合酶A(CHS-A)启动子、烟草PR-1a启动子、遍在蛋白启动子、肌动蛋白启动子、alcA基因启动子、pin2启动子(Xu等人、1993)、玉米WipI启动子、玉米trpA基因启动子(美国专利号5,625,136)、玉米CDPK基因启动子，并且也可以使用RUBISCO SSU启动子(美国专利号5,034,322)。可以使用组织特异性启动子，例如果实特异性启动子，如番茄的E8启动子(登录号：AF515784；Good等人(1994))。果实特异性启动子如花器官特异性启动子可以随本发明的表达构建体一起使用以在植物的花器官中表达本发明的多核苷酸。花器官特异性启动子的实例包括美国专利号6,462,185；5,639,948和5,589,610中所述的任意启动子序列。也可以使用种子特异性启动子和其他种子特异性启动子，如来自(例如菜豆的)β-菜豆蛋白基因或(例如大豆的)大豆球蛋白基因的启动子。胚乳特异性启动子包括但不限于MEG1(EPO专利号EP1528104)和Wu等人(1998)、Furtado等人(2001)和Hwang等人(2002)描述的那些胚乳特异性启动子。根特异性启动子如在美国专利号6,455,760或美国专利号6,696,623中或在公开的美国专利申请号20040078841；20040067506；20040019934；20030177536；20030084486或20040123349所述的任意启动子序列可以随本发明的表达构建体一起使用。还构思了组成型启动子(如CaMV、遍在蛋白、肌动蛋白或NOS启动子)、发育调节型启动子和诱导型启动子(如可以受热、光、激素或化学品诱导的那些启动子)随本发明的多核苷酸表达构建体一起使用。
本发明的表达构建体可以任选地含有转录终止序列、翻译终止序列、编码信号肽的序列和/或增强子元件。转录终止区一般可以从真核或病毒基因序列的3′非翻译区获得。转录终止序列可以位于编码序列下游以引起有效终止。信号肽序列是一般在蛋白质氨基末端存在的短氨基酸序列，该序列负责将有效连接的成熟多肽再定位至各式各样的从特定细胞器区室至蛋白质作用部位的翻译后细胞目的地和胞外环境。构思了通过使用有效连接的信号肽序列将基因产物靶向至预期细胞和/或胞外目的地用于本发明的多肽。经典增强子是增加基因转录的和也可以包含于表达构建体中的顺式作用元件。经典增强子元件是本领域已知的，并且包括但不限于CaMV35S增强子元件、巨细胞病毒(CMV)早期启动子增强子元件和SV40增强子元件。增强基因表达的内含子介导增强子元件也是本领域已知的。这些元件必须存在于转录的区域内部并且是方向依赖的。实例包括玉米皱缩-1增强子元件(Clancy和Hannah，2002)。
指导从表达构建体转录出的mRNA多腺苷酸化的DNA序列也可以包含于表达构建体中，并且包括但不限于章鱼碱合酶信号或胭脂碱合酶信号。本发明的表达构建体也可以包括指导其他基因转座的多核苷酸序列，即转座子。
本发明的多核苷酸可以由RNA或DNA组成。优选地，多核苷酸由DNA组成。本发明也包括与本文中所公开多核苷酸在序列上互补的那些多核苷酸。本发明的多核苷酸和多肽可以以纯化或分离的形式提供。
因为遗传密码的简并性，多种不同的多核苷酸序列可以编码本发明的突变多肽。显示全部可能三联密码子(并且其中U也代表T)和由每个密码子编码的氨基酸的表在Lewin(1985)中描述。此外，产生编码相同或基本上相同的本发明多肽的备选多核苷酸序列完全在本领域内技术人员技能范围内。这些变体或备选多核苷酸序列属于本发明的范围。如本文中所用，称谓“基本上相同的”序列指编码不实质上改变由本发明多核苷酸所编码多肽的功能活性的氨基酸置换、缺失、添加或插入的序列。本发明的范围内也包括编码本发明野生型或突变多肽的核苷酸序列的等位变体。
在本发明的范围内也构思了置换除本发明的野生型或突变多肽和/或AGP酶中特别例举或天然存在的那些氨基酸之外的氨基酸。例如，非天然氨基酸可以置换突变AGP酶小亚基多肽的氨基酸，只要具有置换的氨基酸的突变多肽基本上保留与其中氨基酸没有被置换的突变多肽相同的功能活性。非天然氨基酸的实例包括但不限于鸟氨酸、瓜氨酸、羟脯氨酸、高丝氨酸、苯基甘氨酸、牛磺酸、碘酪氨酸、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、ε-氨基己酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、正亮氨酸、正缬氨酸、肌氨酸、高瓜氨酸、半胱磺酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸如β-甲基氨基酸、C-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸和常见的氨基酸类似物。非天然氨基酸也包括具有衍生化侧基团的氨基酸。另外，蛋白质中的任意氨基酸可以是D(右旋)形式或L(左旋)形式。本发明的范围内也包括本发明的野生型或突变AGP酶小亚基或大亚基多肽的蛋白质序列的等位变体。
氨基酸通常可以划分为以下类别：非极性、不带电荷极性、碱性和酸性。这样的保守性替换属于本发明的范围，其中具有一个类别的氨基酸的本发明突变AGP酶小亚基多肽和/或野生型或突变AGP酶大亚基多肽被相同类别的另一种氨基酸替换，只要具有该置换的多肽仍基本上保留与没有该置换的多肽相同的功能活性(例如，AGP酶的酶的活性和/或增加的热稳定性)。本发明范围内构思了编码在序列中具有一个或多个氨基酸置换的突变AGP酶小亚基多肽和/或野生型或突变AGP酶大亚基多肽的多核苷酸。下表1提供属于每个类别的氨基酸的一系列实例。
本发明也涉及编码有功能的本发明野生型或突变AGP酶小亚基或大亚基多肽的本发明多核苷酸的变体。变体序列包括其中序列的一个或多个核苷酸已经被置换、缺失和/或插入的那些序列。可以置换DNA天然核苷酸的核苷酸具有可以包括但不限于肌苷、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、次黄嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、5-甲基胞嘧啶和三苯甲基化碱基的碱基部分。序列中的核苷酸的糖部分也可以是修饰的并且包括但不限于阿拉伯糖、木酮糖和己糖。此外，核苷酸的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可以用乙酰基、甲基和/或硫代基修饰。可以使用本领域已知的标准技术制备和测试含有核苷酸置换、缺失和/或插入的序列。
本发明突变多肽的片段和变体可以如本文中所述产生并使用本领域已知的标准技术测试酶促和热稳定功能的存在。因而，普通技术人员可以轻易地制备和测试本发明突变多肽的片段和变体并且确定该片段或变体是否相对于全长或非变异突变多肽仍保留功能活性。
本发明范围内所构思的多核苷酸和多肽也可以按照与本文中具体所例举的那些本发明序列的更多特定同一性和/或相似性范围进行定义。序列同一性一般将大于60％、优选地大于75％、更优选地大于80％，甚至更优选地大于90％，并且可以大于95％。与本文中例举的序列相比，序列的同一性和/或相似性可以是49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98，或99％。除非另外详述，如本文中所用，两个序列的百分序列同一性和/或相似性可以使用Karlin和Altschul(1990)算法、Karlin和Altschul(1993)改良的算法确定。这种算法并入Altschul等人(1990)的NBLAST和XBLAST程序。BLAST搜索可以用NBLAST程序、分值＝100、字长＝12执行，以获得具有所需序列同一性百分数的序列。为获得用于比较目的的空位比对结果，可以如Altschul等人(1997)中所述使用空位BLAST。当使用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用相应程序(NBLAST和XBLAST)的默认参数。见NCBI/NIH网站。
本发明也构思了具有序列的那些多核苷酸分子，其中所述序列与本文中例举的多核苷酸序列充分同源，从而允许在标准严格条件和标准方法下与那个序列杂交(Maniatis等人，1982)。如本文中所用，杂交的“严格”条件指其中杂交一般在DNA杂交体解链温度(Tm)以下20-25℃在6×SSPE、5×Denhardt溶液、0.1％SDS、0.1mg/ml变性DNA中过夜实施的条件。解链温度Tm由下式(Beltz等人，1983)描述：
Tm＝81.5℃+16.6Log[Na+]+0.41(％G+C)-0.61(％甲酰胺)-600/双链体的碱基对长度。
一般如下实施洗涤：
(1)在室温在1×SSPE，0.1％SDS中两次持续15分钟(低严格性洗涤)。
(2)在Tm-20℃在0.2×SSPE，0.1％SDS中1次持续15分钟(中等严格性洗涤)。
如本文中所用，术语“核酸”和“多核苷酸”指处于单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或混合的脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，将包括天然核苷酸的已知类似物，所述类似物可以按照与天然存在核苷酸相似的方式发挥作用。多核苷酸序列包括转录成RNA的DNA链序列和与被转录的DNA链序列互补的链序列。多核苷酸序列也包括全长序列以及从所述全长序列衍生的较短序列。所例举序列的等位变异也属于本发明的范围。多核苷酸序列包括作为单链或处于双链体中的有义链和反义链。
用基因转化植物细胞的技术是本领域已知的并且包括，例如，农杆菌感染法、生物射弹法、电穿孔法、氯化钙处理法、PEG介导的转化法等。美国专利号5,661,017教授了用异源多核苷酸转化藻细胞的方法和材料。可以使用本领域已知的标准方法将转化的细胞进行选择、再分化并且培育成含有并表达本发明多核苷酸的植物。本发明的范围内也包括本发明的任一经转化的或转基因的植物细胞或植物的种子和其他植物组织和子代。
本发明也涉及用于产生相对于野生型植物展示增加的热稳定性的植物的方法，其中将编码本发明的突变AGP酶小亚基多肽的多核苷酸导入植物细胞并表达由所述多核苷酸编码的多肽。在一个实施方案中，该植物细胞包含编码野生型AGP酶大亚基多肽的非突变基因。在另一个实施方案中，该植物细胞包含编码突变AGP酶大亚基多肽的至少一种多核苷酸。在又一个实施方案中，还将编码突变AGP酶大亚基多肽的多核苷酸连同编码突变AGP酶小亚基多肽的多核苷酸一起导入植物细胞。在一个实施方案中，将一个多核苷酸或多个多核苷酸并入植物细胞的基因组并且从该植物细胞培育出植物。在优选的实施方案中，从该植物细胞培育出的植物稳定表达并入的一个多核苷酸或多个多核苷酸。
本发明也涉及可以与本发明多核苷酸的编码或非编码序列杂交的寡核苷酸探针和引物，如聚合酶链反应(PCR)引物。本发明的寡核苷酸探针可以在检测和定量编码本发明的突变AGP酶小亚基多肽的核酸序列的方法中使用。本发明的寡核苷酸引物可以在PCR方法和涉及核酸扩增的其他方法中使用。在优选的实施方案中，本发明的探针或引物可以与本发明的多核苷酸在严格条件下杂交。本发明的探针和引物可以任选地包含可检测标记物或报道分子，如荧光分子、酶、放射性部分(例如，3H、35S、125I等)等。本发明的探针和引物可以具有对于使用它们的方法和测定法而言适合的任意长度。通常，本发明的探针和引物是10至500个或更多个核苷酸长度。本发明的范围内构思了10至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、81至90、91至100个或更多个核苷酸长度的探针和引物。本发明的探针和引物可以与所述多核苷酸序列具有完全的(100％)核苷酸序列同一性，或该序列同一性可以少于100％。例如，探针或引物与序列之间的序列同一性可以是99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％或任意其他序列同一性百分数，只要该探针或引物可以在严格条件下与本发明多核苷酸的核苷酸序列杂交。在一个实施方案中，本发明的探针或引物与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的核苷酸序列或其互补物具有70％或更大、75％或更大、80％或更大、85％或更大、90％或更大或95％至100％序列同一性。
本发明也涉及分离的突变AGP酶小亚基多肽。在一个实施方案中，该突变AGP酶小亚基多肽是玉米的AGP酶小亚基多肽。在具体实施方案中，本发明的AGP酶小亚基多肽具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其功能性片段或变体。本发明的AGP酶小亚基多肽或酶可以使用本领域已知的标准技术纯化。在一个实施方案中，将编码AGP酶小亚基多肽的本发明多核苷酸并入微生物如大肠杆菌中，并且在该微生物中表达并随后从中分离该AGP酶小亚基多肽。
在某些实施方案中，本发明的多肽和其有功能的肽片段可以用来产生与本发明多肽特异性结合的抗体，并且本发明的范围内构思了此类抗体。本发明的抗体可以多克隆或单克隆的，并且可以使用本领域已知的标准方法产生和分离。
本发明的多肽片段一般包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10的约或至少25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474或475个氨基酸的连续跨度。
在某些实施方案中，本发明的多肽片段可以是全长序列如SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中所示那些全长序列的至少约25个连续氨基酸至小于全长序列1个氨基酸的任意整数长度。因而，对于SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10而言，多肽片段可以是从约25至475个氨基酸的任意整数个连续氨基酸。术语“整数”以其数学意义在本文中使用并且因而代表性整数包括：25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474和/或475。
本发明的每种多肽片段也可以按照氨基端和羧基端位置描述。例如，在本发明中包括全长序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10中所示那些全长序列中约25个连续氨基酸至小于全长序列1个氨基酸的氨基端至羧基端片段的组合。因而，使用SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10作为实例，25个连续氨基酸片段可能对应于SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的选自由1-25、2-26、3-27、4-28、5-29、6-30、7-31、8-32、9-33、10-34、11-35、12-36、13-37、14-38、15-39、16-40、17-41、18-42、19-43、20-44、21-45、22-46、23-47、24-48、25-49、26-50、27-51、28-52、29-53、30-54、31-55、32-56、33-57、34-58、35-59、36-60、37-61、38-62、39-63、40-64、41-65、42-66、43-67、44-68、45-69、46-70、47-71、48-72、49-73、50-74、51-75、52-76、53-77、54-78、55-79、56-80、57-81、58-82、59-83、60-84、61-85、62-86、63-87、64-88、65-89、66-90、67-91、68-92、69-93、70-94、71-95、72-96、73-97、74-98、75-99、76-100、77-101、78-102、79-103、80-104、81-105、82-106、83-107、84-108、85-109、86-110、87-111、88，-112、89-113、90-114、91-115、92-116、93-117、94-118、95-119、96-120、97-121、98-122、99-123、100-124、101-125、102-126、103-127、104-128、105-129、106-130、107-131、108-132、109-133、110-134、111-135、112-136、113-137、114-138、115-139、116-140、117-141、118-142、119-143、120-144、121-145、122-146、123-147、124-148、125-149、126-150、127-151、128-152、129-153、130-154、131-155、132-156、133-157、134-158、135-159、136-160、137-161、138-162、139-163、140-164、141-165、142-166、143-167、144-168、145-169、146-170、147-171、148-172、149-173、150-174、151-175、152-176、153-177、154-178、155-179、156-180、157-181、158-182、159-183、160-184、161-185、162-186、163-187、164-188、165-189、166-190、167-191、168-192、169-193、170-194、171-195、172-196、173-197、174-198、175-199、176-200、177-201、178-202、179-203、180-204、181-205、182-206、183-207、184-208、185-209、186-210、187-211、188-212、189-213、190-214、191-215、192-216、193-217、194-218、195-219、196-220、197-221、198-222、199-223、200-224、201-225、202-226、203-227、204-228、205-229、206-230、207-231、208-232、209-233、210-234、211-235、212-236、213-237、214-238、215-239、216-240、217-241、218-242、219-243、220-244、221-245、222-246、223-247、224-248、225-249、226-250、227-251、228-252、229-253、230-254、231-255、232-256、233-257、234-258、235-259、236-260、237-261、238-262、239-263、240-264、241-265、242-266、243-267、244-268、245-269、246-270、247-271、248-272、249-273、250-274、251-275、252-276、253-277、254-278、255-279、256-280、257-281、258-282、259-283、260-284、261-285、262-286、263-287、264-288、265-289、266-290、267-291、268-292、269-293、270-294、271-295、272-296、273-297、274-298、275-299、276-300、277-301、278-302、279-303、280-304、281-305、282-306、283-307、284-308、285-309、286-310、287-311、288-312、289-313、290-314、291-315、292-316、293-317、294-318、295-319、296-320、297-321、298-322、299-323、300-324、301-325、302-326、303-327、304-328、305-329、306-330、307-331、308-332、309-333、310-334、311-335、312-336、313-337、314-338、315-339、316-340、317-341、318-342、319-343、320-344、321-345、322-346、323-347、324-348、325-349、326-350、327-351、328-352、329-353、330-354、331-355、332-356、333-357、334-358、335-359、336-360、337-361、338-362、339-363、340-364、341-365、342-366、343-367、344-368、345-369、346-370、347-371、348-372、349-373、350-374、351-375、352-376、353-377、354-378、355-379、356-380、357-381、358-382、359-383、360-384、361-385、362-386、363-387、364-388、365-389、366-390、367-391、368-392、369-393、370-394、371-395、372-396、373-397、374-398、375-399、376-400、377-401、378-402、379-403、380-404、381-405、382-406、383-407、384-408、385-409、386-410、387-411、388-412、389-413、390-414、391-415、392-416、393-417、394-418、395-419、396-420、397-421、398-422、399-423、400-424、401-425、402-426、403-427、404-428、405-429、406-430、407-431、408-432、409-433、410-434、411-435、412-436、413-437、414-438、415-439、416-440、417-441、418-442、419-443、420-444、421-445、422-446、423-447、424-448、425-449、426-450、427-451、428-452、429-453、430-454、431-455、432-456、433-457、434-458、435-459、436-460、437-461、438-462、439-463、440-464、441-465、442-466、443-467、444-468、445-469、446-470、447-471、448-472、449-473、450-474和/或451-475组成的组中的氨基酸。类似地，本发明中包括并且也可以基于这些实例立即设想与大小在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的26个连续氨基酸与474(或475)个连续氨基酸之间的全部其他片段相对应的氨基酸。因而，本文中没有逐一列出说明SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10多肽的各种片段的额外实例，目的在于避免不必要地加长本说明书。
包含25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473和474(或475)个连续氨基酸的多肽片段可以备选地通过式“n至c”(包含在内)描述，其中“n”等同于多肽的氨基端氨基酸位置并且“c”等同于多肽的羧基端氨基酸位置。在本发明的这个实施方案中，“n”是下限为1和上限为全长多肽的氨基酸总数减去24的整数(例如，对于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8是475-24＝451；对于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQID NO：10是476-24＝452)。“c”是25与上限为全长多肽序列的氨基酸数(对于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：8是475；对于SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10是476)之间的整数并且“n”是小于“c”至少24的整数。因而，对于SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9或SEQ ID NO：10而言，“n”是选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450和451(或452)组成的组中的任意整数；并且“c”是选自由25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473和475(或476)组成的组中的任意整数，条件是“n”是小于“c”至少24的值。将“n”和“c”位置的每种组合作为本发明多肽片段的具体实施方案包括在本发明中。本发明包括用来描述本发明的任何多肽片段实施方案的全部范围，除非另外专门指出并非如此。
如本文中所述的本发明突变AGP酶小亚基多肽或AGP酶大亚基多肽的片段可以通过用蛋白水解酶(如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胶原酶)或用化学试剂如溴化氰(CNBr)切割本发明的多肽而获得。备选地，多肽片段可以在高度酸性环境中例如在pH 2.5产生。多肽片段也可以通过化学合成或使用以包含多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞制备，其中所述的多核苷酸编码AGP酶大亚基多肽的片段或本发明突变AGP酶小亚基多肽(例如作为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的片段的突变多肽)的片段。本文中也构思的本发明AGP酶突变大亚基或小亚基多肽的片段包括下述多肽的片段，其中所述多肽的全部或一部分转运或信号序列被除去。
本发明也涉及用编码本发明突变AGP酶小亚基多肽的本发明多核苷酸转化的细胞。在一个实施方案中，该细胞以多核苷酸序列转化，其中所述的多核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25中所示氨基酸序列的序列或其功能性片段或变体。在具体实施方案中，细胞以SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16中所示的多核苷酸序列或编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24或SEQ ID NO：25的功能性片段或变体的序列转化。在一个实施方案中，细胞也用编码如本文中所述的突变AGP酶大亚基多肽的多核苷酸转化。在一个实施方案中，该多核苷酸序列在本发明的表达构建体中提供。转化的细胞可以是原核细胞，例如细菌细胞，如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或转化的细胞可以是真核细胞，例如植物细胞，包括原生质体，或是动物细胞。植物细胞包括但不限于双子叶植物、单子叶植物和针叶树细胞。在一个实施方案中，植物细胞是来自玉米(Zea mays)植物的细胞。动物细胞包括人细胞、哺乳动物细胞、鸟类细胞和昆虫细胞。哺乳动物细胞包括但不限于COS、3T3和CHO细胞。
本发明也涉及用于增加植物或植物组织(如植物种子或胚乳组织)中淀粉合成的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括将本发明的一种或多种多核苷酸导入植物。在某些实施方案中，导入植物的多核苷酸编码一种或多种多肽，所述多肽包含任一SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ IDNO：24或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其片段或变体。在具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列或其片段或变体。在另外的具体实施方案中，该多核苷酸包含SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列或其片段或变体。在一个实施方案中，该多核苷酸稳定地并入植物或植物组织的基因组。该多核苷酸可以包含提供该多核苷酸和/或所编码多肽的表达增加的调节元件，如启动子序列和/或增强子序列。在具体实施方案中，启动子序列是提供组成型或组织特异性(例如胚乳)表达的一种启动子。可以任选地对含有该多核苷酸的植物或植物组织或植物子代筛选本发明的多核苷酸或多肽的增加的表达。在一个实施方案中，将本发明的一种或多种多核苷酸的多重拷贝导入植物或植物组织并且稳定地并入该植物的基因组。在一个实施方案中，在如本文中所述的表达构建体中提供了本发明的多核苷酸。
在表2中定义单字母氨基酸缩写。
材料和方法
随机诱变
通过PCR随机诱变(GeneMorph II EZClone结构域诱变试剂盒，Stratagene)将突变导入Sh2和Bt2。使用非偏倚、易错DNA聚合酶的混合物以导入点突变。分别使用pMONcSh2和pMONcBt2(Giroux等人，1996)中的野生型Sh2和Bt2编码序列作为PCR的模板。位于Sh2和Bt2侧翼的两对引物(Sh2：5′-GAAGGAGATATATCCATGG-3′(SEQ ID NO：17)、5′-GGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3′(SEQ ID NO：18)、Bt2：5′-GAAGGAGATATATCCATGG-3′(SEQ ID NO：19)、5′-GTTGATATCTGAATTCGAGCTC-3′(SEQ ID NO：20))用于易错PCR。由PCR产生的突变Sh2克隆根据Stratagene方案亚克隆至载体pMONcSh2。pMONcSh2随后用来转化含有在兼容性载体pMONcBt2中的野生型Bt2的大肠杆菌菌株AC70R1-504。由PCR产生的突变Bt2克隆被亚克隆至载体pMONcBt2。pMONcBt2随后用来转化含有在兼容性载体pMONcSh2中的野生型Sh2的大肠杆菌菌株AC70R1-504。
细菌表达系统
细菌表达系统(Iglesias等人，1993)允许我们随机诱变玉米胚乳AGP酶基因并且以快速和高效的方式通过如下文所述那样暴露于碘蒸汽而评定AGP酶活性。由于Georgelis等人(2007)中讨论的众多原因，对研究植物AGP酶而言，大肠杆菌系统是理想的。
糖原检测
通过暴露于碘蒸汽后产生棕色着染菌落检测糖原合成。大肠杆菌细胞在Kornberg培养基上在75μg/mL壮观霉素、50μg/mL卡那霉素和1％w/v葡萄糖存在下于37℃培育16小时(Govons等人，1969)。菌落暴露于碘蒸汽1分钟。具有无活性AGP酶的菌落暴露于碘蒸汽后不产生颜色，而有活性AGP酶产生糖原，并且转而因碘而染成棕色。选择比野生型染得更深的AGP酶变体用于深入研究。
糖原定量
通过酚反应进行糖原定量(Hanson和Phillips，1981)。简而言之，通过在50％w/v KOH中煮沸3小时，从培养于含有2％w/v葡萄糖的LB中的1.6ml大肠杆菌细胞(OD600＝2.0)提取糖原。随后通过添加乙醇至70％v/v并且在10000×g离心10分钟使糖原沉淀。在沉淀干燥后，添加200μl去离子水、200μl的5％w/v苯酚和1mL浓硫酸。糖原由488nm处的吸光度估计。
DNA测序
产生增强的糖原的Sh2和Bt2突变体由佛罗里达大学生物技术研究的交叉学科中心(the Interdisciplinary Center for Biotechnology Research atthe University of Florida)基因组测序服务实验室(GSSL)作双向测序。数据分析由Bioedit软件执行(Hall，1999)。
纯化来自AC70R1-504大肠杆菌细胞的玉米胚乳AGP酶
表达玉米胚乳AGP酶的AC70R1-504大肠杆菌细胞在2升Luria-Broth(LB)培养基中在75μg/mL壮观霉素、50μg/mL卡那霉素和2％w/v葡萄糖存在下于37℃振摇培育16小时。在OD600＝0.6，添加0.2mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和0.02mg/mL萘啶酮酸以诱导蛋白质表达。将培养物立即移至室温并振摇培育4小时。以下步骤在4℃进行。通过在3000×g离心收获细胞并且沉淀物重悬于16mL缓冲液A(50mMKH2PO4pH 7.0、5mM MgCl2、0.5mM EDTA)和蛋白酶抑制剂(1μg/mL抑肽素、0.1mM PMSF、10μg/mL胰凝乳蛋白酶抑制剂和1mM苯甲脒)。细胞用法式压碎器裂解并以26000×g离心。通过添加缓冲液A调节上清液的蛋白质浓度至30mg/mL。添加十分之三体积的1％硫酸鱼精蛋白并将混合物在冰上搅拌20分钟并随后以26000×g离心20分钟。用硫酸铵使上清液至45％饱和，在冰上搅拌20分钟并以26000×g离心20分钟。沉淀物重悬于2-2.5mL缓冲液A中。如Boehlein等人(2005)所述，使该混合物通过强阴离子交换柱(大分子预制高速Q支持物(macro-prep High Q support)，Biorad)和Econo-pac羟基磷灰石小柱(Biorad)。测试前，通过使用Zeba微量脱盐离心柱(Pierce)使AGP酶脱盐。将AGP酶交换到50mM HEPES、5mM MgCl2、0.5mM EDTA和0.5mg/mL BSA中(出于稳定考虑)。
AGP酶的动力学表征
使用反应的正方向(G-1-P+ATP→ADP-葡萄糖+PPi)以估计kcat、对ATP和G-1-P的Km，以及对3-PGA和Pi的亲和力。更具体地，对0.04-0.06μg纯化的AGP酶在总体积200μl的50mM HEPES pH 7.4、15mMMgCl2、1.0mM ATP和2.0mM G-1-P中于37℃测试比活性10分钟。为确定对ATP和G-I-P的Km和对3-PGA的Ka，分别改变ATP、G-I-P和3-PGA的量。通过添加不同量的Pi、使用1mM ATP、2mM G-1-P和2.5mM3-PGA估计Pi的Ki。通过煮沸2分钟终止该反应。使用300μl偶联试剂，通过使该反应与NADH浓度的降低联合而估计PPi。偶联试剂含有25mM咪唑pH 7.4、4mM MgCl2、1mM EDTA、0.2mM NADH、0.725U醛缩酶、0.4U磷酸丙糖异构酶、0.6U甘油磷酸脱氢酶、1mM果糖6-磷酸和0.8μg焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶(PPi-PFK)。除根据Deng等人1999伴以一些改良(Boehlein和Hannah，未发表的数据)所产生并纯化的PPi-PFK外，全部酶从Sigma购买。NADH浓度由340nm处的吸光度估计。通过标准曲线计算PPi浓度，其中通过使用各种量的PPi而不是AGP酶形成所述标准曲线。AGP酶产生的PPi的量与时间和酶浓度呈线性关系。通过Prism4.0(Graph Pad，San Diego CA)计算AGP酶的动力学常数。
测量来自粗制或部分纯化的蛋白质提取物中的AGP酶比活性
表达玉米胚乳AGP酶的AC70R1-504大肠杆菌细胞在2升Luria-Broth(LB)培养基中在75μg/mL壮观霉素、50μg/mL卡那霉素和2％w/v葡萄糖存在下于37℃振摇培育，直至OD600＝2.0。不诱导基因表达。以下步骤在4℃进行。通过在3000×g离心收获细胞并且沉淀物重悬于16mL缓冲液A(50mM KH2PO4pH 7.0、5mM MgCl2、0.5mM EDTA)和蛋白酶抑制剂(1μg/mL抑肽素、0.1mM PMSF、10μg/mL胰凝乳蛋白酶抑制剂和1mM苯甲脒)。细胞用法式压碎器裂解并以26000×g离心。从贮藏在-80℃的上清液测量粗提取物的AGP酶活性。如上文所述借助硫酸鱼精蛋白和硫酸铵部分地纯化剩余的上清液。在测试前，使蛋白质提取物如Boehlein等人(2005)所述那样脱盐并交换到50mM HEPES、5mM MgCl2和0.5mM EDTA中。使用如Boehlein等人(2005)所述的饱和量底物和激活物，以反方向(ADP-葡萄糖+PPi→G-1-P+ATP)监测AGP酶比活性。
确定AGP酶的热稳定性
AGP酶如上所述纯化。AGP酶进一步1/100(v/v)稀释于50mMHEPES、5mM MgCl2、0.5mM EDTA和0.5mg/mL BSA中，并在42℃或53℃热处理不同时间，并随后在冰上冷却。通过使用饱和量的ATP、G-1-P和3-PGA以正方向和反方向监测热处理后仍存在的活性。将数据绘制为残存活性百分数的对数与热处理时间的图。从式t1/2＝0.693/(-2.3＊斜率)计算失活常数t1/2。
定量确定AGP酶纯度
AGP酶的纯度以下文方式监测。6μg AGP酶1∶1稀释于变性溶液(100mM Tris-Cl pH 6.8、4％SDS和8mM DTT)中，在95℃加热5分钟，在5％SDS聚丙烯酰胺凝胶上在150V电泳1小时并且用考马斯亮蓝染色显影(Laemmli，1970)。
粗提取物的蛋白质印迹分析
通过使用Hybri-Dot印迹装置(Life Technologies)将样品真空印迹到PVDF膜(Biorad)上。PVDF膜已经在甲醇中预浸透5分钟中并随后在转移缓冲液[20％(v/v)甲醇、0.303％(w/v)Tris和1.44％(w/v)甘氨酸]中预浸透10分钟。该膜与封闭缓冲液[0.8％(w/v)NaCl、0.02％(w/v)KCl、0.144％(w/v)Na2HPO4、0.024％(w/v)KH2PO4、5％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)和0.05％(v/v)Tween-20]孵育1小时，恒定振摇。印迹物与含有1∶10000(v/v)(Sue Boehlein友好提供的)抗BT2单克隆抗体封闭缓冲液振摇孵育1小时。随后，印迹物用洗涤缓冲液(封闭缓冲液-BSA)洗涤3x10分钟，恒定振摇。该印迹物随后与1∶60000稀释度的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠第二抗体(Pierce)孵育45分钟。最终，将印迹物洗涤3次，每次10分钟。使用增强型化学发光底物试剂盒(Pierce)使蛋白质显影。
3D建模
按照最近公布的马铃薯块茎同四聚体AGP酶的三维结构(RCSB蛋白质数据库#：1YP2)中的马铃薯小亚基建模BT2单体结构。通过使用SWISS模型(Peitsch，1995；Guex和Peitsch，1997；Schwede等人2003；Kopp和Schwede，2004；Arnold等人，2006)进行同源性建模。通过使用3D化学结构的开放源代码Java浏览器Jmol(http://www.jmol.org/)确定接触残基第462氨基酸(Thr或He)。
酵母双杂交
如Greene和Hannah(1998b)所述实施酵母转化和β-半乳糖苷酶测定法。唯一修改是使用pGBKT7和pGADT7分别作为诱饵和捕获物的载体。使用pGBKT7-53和pGADT7-T质粒作为阳性对照。
本文中参考或引用的全部专利、专利申请、临时申请和公开(包括全部图和表)通过引用方式完整地并入至这样的程度，以致它们不会与本说明书的清晰教授内容不一致。
下文是说明用于实施本发明的方法的实施例。这些实施例不应当解释为限制性的。全部百分数以重量计算并且全部溶剂混合物比例以体积计算，除非另外指出。
实施例1
通过易错PCR创建突变Bt2文库。突变载量是每个克隆约2个非同义突变(Georgelis等人，2007)。所述突变体在大肠杆菌中随野生型Sh2基因一起表达。对大约50,000个菌落筛选糖原产生。挑出10个深染色的菌落。将两个染色最深的Bt2突变体测序。两者均具有相同的导致第462氨基酸从苏氨酸变成异亮氨酸(TI)的非同义突变。在该位置的苏氨酸在高等植物小亚基当中是绝对保守的(数据未显示)。BT2-TI/SH2(包含TI突变的BT2并与SH2复合)产生比BT2/SH2更多的糖原(图1)。表达BT2-TI和BT2为同四聚体的细胞不产生可检测量的糖原(图1)。这表明大肠杆菌合成的糖原的量完全依赖于BT2-TI或BT2与SH2的复合。
来自表达BT2/SH2和BT2-TI/SH2的细胞中的粗提取物的点印迹物显示BT2-TI以更高的量存在于大肠杆菌中(图2A-2B)。尽管来自表达BT2/SH2和BT2-TI/SH2的非诱导细胞中的粗提取物的AGP酶活性水平太低而检测不到，但来自BT2-TI/SH2的部分纯化的提取物具有比来自BT2/SH2的部分纯化的提取物多20倍的活性(图3)。BT2-TI/SH2因更高效转录/翻译而产生更多蛋白质和活性的可能性是不可能的，因为密码子ACA(T)与ATA(I)以相同频率(分别是6.1和5.0％o)在大肠杆菌中使用(Nakamura等人，2000)。这表明BT2-TI/SH2细胞中更高数量的蛋白质和活性归因于AGP酶增加的稳定性。
为确定BT2-TI/SH2的动力学特性和热稳定性并解释大肠杆菌中糖原合成增强的原因，纯化了重组的BT2-TI/SH2和BT2/SH2AGP酶(图4)。如表3中汇总的BT2-TI/SH2的动力学特性显示G-1-P和ATP的Km、3-PGA的Ka和Pi的Ki与来自BT2/SH2的动力学特性不可区分。令人惊讶的是，BT2-TI的kcat比BT2/SH2的kcat低30％。这些动力学特性然而不能解释大肠杆菌中BT2-TI/SH2的更深着染。然而，BT2-TI/SH2明显比BT2/SH2更为热稳定(图5A-5B)。这些结果有力地表明BT2-TI/SH2的高度热稳定性引起大肠杆菌中提高量的糖原。
MP是可以导致农艺学益处的小亚基变体。该变体的一些特征包括与BT2/SH2相比在缺少激活物3-PGA的情况下增加的活性、增加的3-PGA亲和力、减少的Pi亲和力(表3)和升高的热稳定性(图3)(Cross等人，2004；Boehlein等人，2005)。由于BT2-TI/SH2不象MP/SH2那样热稳定(图3)，因而将氨基酸改变的TI导入MP，意图进一步增加MP(MP-TI)的热稳定性。
表达MP-TI/SH2(具有TI突变的MP并与SH2复合)的细胞产生与表达MP/SH2的细胞相同量的糖原(图1)。然而，相对于BT2的更大量的MP-TI蛋白在表达这两种带SH2的蛋白质的大肠杆菌的粗提取物中存在(图2A-2B)。来自MP-TI/SH2的粗提取物和部分纯化的提取物的活性比来自MP/SH2的粗提取物和部分纯化的提取物的活性高2-3倍(图3)。纯形式的MP-TI/SH2(图4)维持MP/SH2的有利动力学特性(表3)，除了其kcat与MP/SH2相比降低约30％。另外，MP-TI/SH2比MP/SH2展示更大的热稳定性(图6A-6B)。
未曾解析玉米胚乳AGP酶的晶体结构。唯一相关结构是马铃薯块茎小亚基同四聚体(Jin等人，2005)。马铃薯块茎小亚基显示与BT2的88％同一性和96％相似性。按照解析的马铃薯块茎小亚基结构建模BT2单体结构(图7A)。在TI中突变的残基是β-螺旋的部分并且它与小亚基氨基端的两个残基(Pro，Leu)疏水性接触(图7B)。TI中从Thr至Ile的氨基酸改变缩短上文所提及的从Pro与Leu的距离(图7C)。诱人的是推测TI突变强化小亚基羧基端与氨基端之间的疏水相互作用并导致更大的稳定性。不同于其稳定性归因于亚基-亚基界面处/附近残基的MP，TI可能不直接影响亚基-亚基相互作用，因为它远离亚基-亚基界面(图7A)。
为确定TI是否影响亚基-亚基相互作用的强度，在酵母双杂交系统(Y2H)中使用SH2作为诱饵并且使用BT2、TI和MP作为捕获物。定量β-半乳糖苷酶测定法表明与MP相反，TI不增加亚基-亚基相互作用的强度(图8)。
最后，原来的苏氨酸替换为具有更短侧链的氨基酸如丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸不影响AGP酶的热稳定性，即便它们不引起10倍或更多倍的kcat减少(数据未显示)。这表明在第462位置处原来的苏氨酸对AGP酶活性重要，但对热稳定性不重要。
实施例2
本发明通过使用随机诱变和异源细菌表达系统提供农艺学重要的植物AGP酶变体。BT2-TI分离为小亚基变体，其与SH2一同表达时，所述小亚基变体增加由大肠杆菌细胞产生的糖原的量。表达BT2-TI/SH2的细胞具有比表达BT2/SH2的细胞高20倍的AGP酶活性。点印迹物显示与表达BT2/SH2的细胞相比，来自表达BT2-TI/SH2的细胞的粗制蛋白质提取物具有更多的可检测BT2蛋白。这个结果可以归因于更高效的转录/翻译或归因于更大的AGP酶稳定性和/或溶解度。如先前提到，更高效的转录/翻译不可能基于密码子使用。另一方面，显示纯化形式的BT2-TI/SH2比纯化形式的BT2/SH2明显更为热稳定。这可以使BT2-TI/SH2复合体与大肠杆菌中的BT2/SH2相比更不易受蛋白酶解作用和/或更不易聚集。
除30％更低kcat之外，BT2-TI/SH2的动力学和变构特性与BT2/SH2不可区分。将表达BT2-TI/SH2的细胞的AGP酶活性增加20倍解释为与表达BT2/SH2的细胞相比更多数目的活性AGP酶分子。这也意味小于5％的潜在AGP酶分子实际上在BT2/SH2中发挥功能。
已经报道了当给予极高量的激活物3-PGA时马铃薯块茎小亚基可以形成具有显著活性的同四聚体(Ballicora等人，1995)。如本文中所示，表达BT2和BT2-TI为同四聚体的大肠杆菌细胞不产生可检测量的糖原。因而，与表达BT2/SH2的细胞相比，在表达BT2-TI/SH2的细胞中观察到的增加量的糖原归因于BT2-TI与SH2的复合体，而非BT2-TI同四聚体。
在具有SH2的复合体中导致增加的热稳定性的另一个小亚基变体是MP。MP赋予的热稳定性已经定位至亚基-亚基相互作用界面附近或亚基-亚基相互作用界面处的残基(Boehlein、Shaw、Stewart和Hannah，未发表的数据)。相反，BT2-TI的氨基酸改变远离这些界面。结构建模表明TI改变强化了羧基末端与氨基末端之间的亚基内疏水相互作用。来自Y2H的结果支持与MP相反，TI不强化亚基-亚基相互作用的观点。然而，不能消除TI通过构象变化间接影响亚基-亚基相互作用的可能性。有可能Y2H可能不足够敏感，不能在酵母生长温度30℃揭示TI/SH2与BT2/SH2之间亚基-亚基相互作用的差异。
比较了纯BT2-TI/SH2和MP/SH2的热稳定性表明BT2-TI/SH2不像MP/SH2那样热稳定。另外，MP/SH2具备BT2-TI/SH2所不共有的几个优点，如与BT2/SH2相比，在缺少激活物3-PGA时的活性、更高的3-PGA亲和力、较低的抑制物Pi亲和力和较高的kcat。研究了是否可能通过将TI改变导入MP进一步改善MP/SH2的热稳定性。所得变体MP-TI在大肠杆菌中随SH2一起表达时产生与MP/SH2相等量的糖原。这可能意味MP-TI/SH2不比MP/SH2更为热稳定或AGP酶催化的ADP-葡萄糖产生在大肠杆菌中不再是限制性的。后一种解释可以受到支持，因为表达MP-TI/SH2的细胞的粗提取物和部分纯化的提取物中的AGP酶活性比表达MP/SH2的细胞高2-3倍。MP-TI/SH2维持MP/SH2的全部动力学和变构特性，除了30％更低的kcat之外。最重要地，MP-TI/SH2比MP/SH2更为热稳定。在MP-TI/SH2和MP/SH2中均观察到两阶段的热稳定性。这些阶段可能是不同状态的AGP酶的结果。先前已经观察到热稳定性的这种双相模式并且它不是MP/SH2或MP-TI特有的(Boehlein等人，2008)。第一阶段显示较第二阶段低的热稳定性。与MP/SH2相比，MP-TI/SH2在两个阶段中更为热稳定。然而，每个阶段中AGP酶的状态究竟是什么仍令人迷惑。在BT2/SH2和BT2-TI/SH2中没有观察到热稳定性的双相模式，原因是没有将样品加热足够长的时间以达到第二阶段并且它们在较MP/SH2和MP-TI/SH2低的温度(42℃而非53℃)加热。
表3显示纯化的重组AGP酶变体的动力学特性。以正方向确定了AGP酶变体的动力学和变构特性。通过变动G-1-P的量并维持ATP处于饱和量(1mM)来估计kcat(s-1)(G-1-P)。通过变动ATP的量并维持G-1-P处于饱和量(2mM)来估计kcat(s-1)(ATP)。Ki表示为均值(95％置信区间)。全部其他值表示为均值±标准差。AGP酶在缺少3-PGA下的比活性表示为在10mM 3-PGA存在下的比活性百分数(均值±标准误)。
表3
应当理解本文中所述的实施例和实施方案旨在起到说明目的并且在其影响下的多种修改或改变将会启发本领域技术人员并且将纳入本申请的精神与权限范围内和所附权利要求书的范围内。此外，本文中所公开的任意发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文中所公开的任何和/或全部其他要素或限制(个别地或处于任意组合的)或任何其他发明或其实施方案组合，并且在本发明的范围内考虑了全部此类组合，而不对其进行限制。
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Claims (44)
1.编码突变植物AGP酶小亚基蛋白或所述蛋白质的功能性片段的多核苷酸，所述的蛋白质包含氨基酸突变，其中与野生型玉米胚乳AGP酶小亚基蛋白第462位置处的苏氨酸氨基酸相对应的氨基酸由表达所述突变AGP酶小亚基以形成AGP酶时赋予增加的热稳定性的氨基酸替换。
2.根据权利要求1的多核苷酸，其中赋予增加的热稳定性的所述替换氨基酸是异亮氨酸。
3.根据权利要求1或2的多核苷酸，其中所述的突变AGP酶小亚基是玉米胚乳AGP酶小亚基。
4.根据权利要求1的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述突变植物AGP酶小亚基蛋白包含任一SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列或其功能性片段。
5.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含任一SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列或其功能性片段。
6.根据权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸在表达构建体中提供。
7.编码嵌合的植物AGP酶小亚基蛋白或所述蛋白质的功能性片段的多核苷酸，其中所述嵌合的AGP酶蛋白质包含来自第一植物的植物AGP酶小亚基的氨基端区中的氨基端序列和来自第二植物的植物AGP酶小亚基的羧基端区中的羧基端序列，并且所述嵌合的植物AGP酶小亚基蛋白包含氨基酸突变，其中与野生型玉米胚乳AGP酶小亚基蛋白第462位置处的苏氨酸氨基酸相对应的氨基酸由表达所述突变AGP酶小亚基以形成AGP酶时赋予增加的热稳定性的氨基酸替换。
8.根据权利要求7的多核苷酸，其中所述的氨基端序列包含所述第一植物的AGP酶的所述亚基氨基端区的头150个至250个氨基酸并且所述的羧基端序列包含所述第二植物的AGP酶的所述亚基羧基端区的末尾300个残基或更少残基。
9.根据权利要求7的多核苷酸，其中赋予增加的热稳定性的所述替换氨基酸是异亮氨酸。
10.根据权利要求7至9任一项的多核苷酸，其中所述的氨基端区来自玉米胚乳AGP酶小亚基。
11.根据权利要求7至9任一项的多核苷酸，其中所述的羧基端区来自马铃薯块茎AGP酶小亚基。
12.根据权利要求7的多核苷酸，其中由所述多核苷酸编码的所述植物AGP酶小亚基蛋白包含任一SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列或其功能性片段。
13.根据权利要求7的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包含任一SEQID NO：3、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列或其功能性片段。
14.根据权利要求7至13任一项的多核苷酸，其中所述的多核苷酸在表达构建体中提供。
15.多肽，其由以下多核苷酸编码：
a)根据权利要求1至6任一项的多核苷酸；或
b)根据权利要求7至14任一项的多核苷酸。
16.转化的或转基因的植物或植物组织或细胞，其包含：
a)根据权利要求1至6任一项的多核苷酸；或
b)根据权利要求7至14任一项的多核苷酸；或
c)a)和b)两者的多核苷酸。
17.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中植物或植物组织或细胞也表达玉米AGP酶大亚基。
18.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中植物或植物组织或细胞表达AGP酶的突变大亚基，其中所述的突变大亚基包含赋予增加的热稳定性的突变和/或所述的突变大亚基包含赋予增加的种子重量的突变。
19.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的突变大亚基包含Rev6突变。
20.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物或植物组织或细胞是单子叶的。
21.根据权利要求20的植物或植物组织或细胞，其中所述的单子叶植物或植物组织或细胞选自稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。
22.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物是玉米(Zea mays)或所述的植物组织或细胞来自玉米。
23.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物或植物组织或细胞是双子叶的。
24.根据权利要求23的植物或植物组织或细胞，其中所述的双子叶植物或植物组织或细胞选自番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、菜豆、烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘(包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。
25.根据权利要求16的植物或植物组织或细胞，其中所述的植物组织是种子、接穗或根状茎。
26.突变植物AGP酶，包含权利要求15的一种或多种突变多肽。
27.提高植物对热胁迫条件的抗性和/或增加植物的淀粉生物合成的方法，所述方法包括将一种或多种多核苷酸并入植物的基因组中并且表达由所述多核苷酸编码的蛋白质，其中所述的多核苷酸是或包含：
a)根据权利要求1至6任一项的任一多核苷酸；和/或
b)根据权利要求7至14任一项的任一多核苷酸。
28.根据权利要求27的方法，其中植物也表达玉米AGP酶大亚基。
29.根据权利要求27的方法，其中植物表达AGP酶的突变大亚基，其中所述的突变大亚基包含赋予增加的热稳定性的突变和/或所述的突变大亚基包含赋予增加的种子重量的突变。
30.根据权利要求27的方法，其中所述的突变大亚基包含Rev6突变。
31.根据权利要求27的方法，其中所述植物是单子叶的。
32.根据权利要求31的方法，其中所述的单子叶植物选自稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。
33.根据权利要求27的方法，其中所述植物是玉米。
34.根据权利要求27的方法，其中所述植物是双子叶的。
35.根据权利要求34的方法，其中所述的双子叶植物选自番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、菜豆、烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘(包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。
36.用于制备具有AGP酶的植物的方法，所述AGP酶在该植物中相对于具有野生型AGP酶的植物提供增加的热稳定性和/或增加的淀粉生物合成，所述方法包括将一种或多种多核苷酸导入植物细胞并且从所述的植物细胞培育植物，其中所述的多核苷酸是或包含：
a)根据权利要求1至6任一项的任一多核苷酸；和/或
b)根据权利要求7至14任一项的任一多核苷酸。
37.根据权利要求36的方法，其中植物也表达玉米AGP酶大亚基。
38.根据权利要求36的方法，其中植物表达AGP酶的突变大亚基，其中所述的突变大亚基包含赋予增加的热稳定性的突变和/或所述的突变大亚基包含赋予增加的种子重量的突变。
39.根据权利要求36的方法，其中所述的突变大亚基包含Rev6突变。
40.根据权利要求36的方法，其中所述植物是单子叶的。
41.根据权利要求40的方法，其中所述的单子叶植物选自稻、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高粱、玉米、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、椰子、百合、草坪草和谷子。
42.根据权利要求36的方法，其中所述植物是玉米。
43.根据权利要求36的方法，其中所述植物是双子叶的。
44.根据权利要求43的方法，其中所述的双子叶植物选自番茄、黄瓜、南瓜、豌豆、苜蓿、甜瓜、鹰嘴豆、菊苣、三叶草、羽衣甘蓝、扁豆、大豆、菜豆、烟草、马铃薯、甘薯、山药、木薯、萝卜、青花椰菜、菠菜、卷心菜、油菜、苹果树、柑橘(包括橘、桔、柚、柠檬、酸橙等)、葡萄、棉花、向日葵、草莓、莴苣和蛇麻草。
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