MXPA04007999A - Mutantes estables al calor de enzimas para la biosintesis del amidon. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a moleculas polinucleotidicas mutantes novedosas que codifican enzimas que tiene estabilidad incrementada al calor; estos polinucleotidos, cuando se expresan en plantas, producen un rendimiento incrementado en el crecimiento vegetal bajo condiciones de estres por calor; las moleculas polinucleotidicas de la presente invencion codifican las actividades enzimaticas de la ADP glucosa pirofosforilasa (AGP) del endospermo de maiz y de la sintasa soluble del almidon (SSS); tambien se contemplan por la presente invencion las plantas y tejido vegetal procreadas para que contenga, o se transforme con, los polinucleotidos mutantes, y que exprese los polipeptidos codificados por los polinucleotidos; la presente invencion tambien se refiere a los metodos para aislar polinucleotidos y polipeptidos contemplados dentro del alcance de la invencion; tambien se proveen los metodos para incrementar el rendimiento en las plantas en crecimiento bajo condiciones de estres por calor.

Description

MUTANTES ESTABLES AL CALOR DE ENZIMAS PARA LA BIOSINTESIS DEL ALMIDON Esta invención se realizó con apoyo gubernamental bajo el apoyo económico de ia National Science Foundation (Fundación Nacional de la Ciencia) número 9316887. El gobierno tiene ciertos derechos sobre la invención.

REFERENCIA RECIPROCA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud es una continuación-en-parte de la solicitud co-pendiente de los E.U.A. No. 09/312,433, presentada el 14 de mayo de 1999, la cual es una continuación-en-parte de la solicitud co-pendiente de los E.U.A. No.08/972, 545, presentada el 18 de noviembre dé 1997, actualmente Patente de E.U.A. No. 6,069,300. Esta solicitud también reclama prioridad a partir de la solicitud provisional de los E.U.A No. 60,085,460, presentada el 14 de mayo de 1998 y de la solicitud provisional de los E.U.A. No. 60/031 ,045, presentada el 18 de noviembre de 1996.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La naturaleza sésil de la vida vegetal genera una exposición constante a factores ambientales que ejercen efectos positivos y negativos sobre el crecimiento vegetal y el desarrollo. Uno de los principales impedimentos con que se enfrenta la agricultura moderna son las condiciones ambientales adversas. Un factor importante que ocasiona pérdida significativa de la cosecha es el estrés por calor. El estrés a la temperatura reduce en gran medida el rendimiento de los granos en muchas cosechas de cereales tales como el maíz, trigo, y cebada. El rendimiento disminuye debido al estrés por calor en un intervalo de 7 a 35% en los cereales de importancia mundial. Numerosos estudios han identificado las probables consecuencias fisiológicas del estrés por calor. Los trabajos pioneros por Hunter et al. (Hunter, R. B., Tollenaar, M., y Breuer, C. M.

[1977] Can. J Plant Sci. 57: 1127-1133) utilizando condiciones de cámara de crecimiento mostraron que la temperatura disminuyó la duración de llenado del grano en el maíz. Resultados similares en los cuales la duración de llenado del grano se alteró de manera adversa mediante temperaturas incrementadas se identificaron por Tollenaar y Bruulsema (Tollenaar, M. y Bruulsema, T. W.

[1988] Can. J. Plant Sci. 68: 935-940). Badu-Apraku et al. (Badu-Apraku, B., Hunter, R. B., y Tollenaar, M.

[1983] Can. J. Plant. Sci. 63: 357-363) midieron una reducción marcada en el rendimiento del crecimiento de las plantas de maíz bajo el régimen de temperatura de día/noche de 35/15°C en comparación con el crecimiento en un régimen de temperatura de 25/15°C. Los rendimientos reducidos debido a las temperaturas incrementadas también se apoyan por los estudios históricos así como por estudios climatológicos (Thompson, L. M.

[1986] Apron. J 78: 649-653; Thompson, L. M.

[1975] Science 188: 535-541 ; Chang, J.

[1981] Agricul. Metero. 24: 253-262; y Conroy, J. P., Seneweera, S., Basra, A. S., Rogers, G., y Nissen-Wooller, B. [ 994] Aust. J. Plant Physiol. 21 : 741-758). Es evidente que los procesos fisiológicos del desarrollo de las semillas son afectados adversamente por el estrés por calor a partir de los estudios utilizando un sistema de cultivo de grano in vitro (Jones, R. J.,Gengenbach, B. G., y Cardwell, V. B.

[1981] Crop Science 21 : 761-766; Jones, R. J., Ouattar, S., y Crookston, R. K.

[1984] Crop Science 24: 133-137; y Cheikh, N., y Jones, R. J.

[1995] Physiol. Plant. 95: 59-66). Los granos de maíz cultivados a la temperatura óptima anteriormente mencionada de 35°C exhibieron una reducción dramática en el peso. El trabajo con el trigo identificó la pérdida de actividad de sintasas solubles del almidón (SSS) como un distintivo de la respuesta del endospermo de trigo al estrés por calor (Hawker, J. S. y Jenner, C. F.

[1993] Aust. J Plant Physiol. 20: 197-209; Denyer, K., Hylton, C. M., y Smith, A. .

[1994] Aust. J. Plant Physiol. 21 : 783-789; Jenner, C. F.

[1994] Aust. J. Plant Physiol. 21 : 791-806). Los estudios adicionales con SSS del endospermo de trigo muestran que es lábil al calor (Rijven, A. H. G. C.

[1986] Plant Physiol. 81 : 448-453; Keeling, P. L, Bacon, P. J., Holt, D. C.

[1993] Planta. 191 : 342- 348; Jenner, C. F., Denyer, K., y Guerin, J.

[1995] Aust. J. Plant Physiol. 22: 703-709). Los papeles de SSS y de la ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) bajo condiciones de estrés por calor en el maíz son menos claros. (AGP) cataliza la conversión de ATP y de a-glucosa-1 -fosfato a ADP-glucosa y pirofosfato. ADP-glucosa se utiliza como un donante de glucosilo en la biosíntesis del almidón por las plantas y en la biosíntesis de glucógeno por las bacterias. La importancia de la pirofosforilasa de ADP-glucosa como una enzima clave en la regulación de la biosíntesis del almidón se evidenció en el estudio de mutantes deficientes en la formación de almidón del endospermo de maíz (Zea mays) (Tsai, C. Y., y Nelson, Jr., O. E.

[1966] Science 151 : 341-343; Dickinson, D. B., J. Preiss

[1969] Plant Physiol. 44: 1058-1062). Ou-Lee y Setter (Ou-Lee, T. y Setter, T. L.

[1985] Plant Physiol. 79: 852-855) examinaron los efectos de la temperatura sobre las regiones apicales o puntas de las mazorcas del maíz. Con temperaturas elevadas, la actividad de AGP fue más baja en los granos apicales cuando se comparó con los granos básales durante el tiempo de depósito intenso del almidón. En contraste, en los granos que se desarrollaron a temperaturas normales, la actividad de AGP fue similar en los granos apicales y básales durante este período. No obstante, la actividad de sintasa del almidón durante este período no se afectó de manera diferencial en los granos apicales y básales. Adicionalmente, los granos apicales tratados con calor exhibieron un incremento en la actividad de sintasa del almidón sobre el control. Esto no se observó con la actividad de AGP. Singletary et al. (Singletary, G. W., Banisadr, R., y Keeling, P. L.

[1993] Plant Physiol. 102: 6 (suplemento); Singletary, G. W., Banisadra, R., Keeling, P. L.

[1994] Aust. J. Plant Physiol. 21 : 829-841 ) utilizando un sistema de cultivo in vitro cuantificaron el efecto de diversas temperaturas durante el período de llenado del grano. El peso de las semillas disminuyó de manera constante conforme la temperatura se incrementaba a partir de 22-36°C. Un papel para AGP en la pérdida del rendimiento también se apoya por el trabajo a partir de Duke y Doehlert (Duke, E. R. y Doehlert, D. C.

[1996] Environ. Exp. Botany. 36: 199-208). El trabajo por Keeling et al. (1994, anteriormente mencionado) cuantificó la actividad de SSS en el maíz y en el trigo utilizando análisis Q 0, y mostró que SSS es un punto de control importante en el flujo del carbono dentro del almidón. Los estudios bioquímicos in vitro con AGP y SSS muestran claramente que ambas enzimas son lábiles al calor. La AGP del endospermo de maíz pierde 96% de su actividad cuando se calienta a 57°C por cinco minutos (Hannah, L. C, Tuschall, D. M., y Mans, R. J.

[1980] Genetics 95: 961-970). Esto está en contraste con la AGP de la patata la cual es completamente estable a 70°C (Sowokinos, J. R. y Preiss, J.

[1982] Plant Physiol. 69: 1459-1466; Okita, T. W., Nakata, P. A., Anderson, J. M., Sowokinos, J., orell, J., y Preiss, J.

[1990] Plant Physiol. 93: 785-90). Los estudios de inactivación mediante calor con SSS mostraron que ésta también es lábil a temperaturas mayores, y los estudios cinéticos determinaron que el valor Km para la amilopectina se elevó exponencialmente cuando la temperatura se incrementó de 25-45°C (Jenner et al., 1995, anteriormente mencionado). Las evidencias bioquímicas y genéticas han identificado a la AGP como una enzima clave en la biosíntesis del almidón en las plantas superiores y en la biosíntesis del glucógeno en E. coli (Preiss, J. y Romeo, T.

[1994] Progress in Nuc. Acid Res. and Mol Biol. 47: 299-329; Preiss, J. y Sivak, M.

[1996] "Starch synthesis in sinks and sources," En Photoassimilate distribution in plants and crops: source-sink relationships. Zamski, E., editor, Marcil Dekker Inc. pp. 139-168). AGP cataliza lo que se ve como el paso inicial en la ruta biosintética del almidón con el producto de la reacción siendo el donante glucosilo activado, ADP glucosa. Este se utiliza por la sintasa del almidón para la extensión del polímero de polisacárido (revisado en Hannah, L. Curtís

[1996] "Starch synthesis ¡n the maize endosperm," En Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants, Vol. 4. B. A. Larkins y I. K. Vasil (editores.). Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Los Países Bajos). Los estudios iniciales con la AGP de la patata mostraron que la expresión en E. coli produjo una enzima con propiedades alostéricas y cinéticas muy similares a las de la enzima nativa del tubérculo (Iglesias, A., Barry, G. F., Meyer, C, Bloksberg, L., Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M. J., Okita, T. W., Kishore, G. M., y Preiss, J.

[1993] J. Biol Chem. 268: 1081-86; Ballicora, M. A., Laughlin, M. J., Fu, Y., Okita, T. W., Barry, G. F., y Preiss, J.

[1995] Plant Physiol. 109: 245-251 ). Greene et al. (Greene, T. W., Chantler, S. E., Kahn, M. L, Barry, G. F., Preiss, J., y Okita, T. W.

[1996] Proc. Nati. Acad. Sci. 93: 1509-1513; Greene, T. W., Woodbury, R. L, y Okita, T. W.

[1996] Plant Physiol. (112: 1315-1320) mostraron la utilidad del sistema de expresión bacteriano en los estudios de estructura-función con la AGP de la patata. Se identificaron múltiples mutaciones importantes en el mapeo de los sitios alostéricos y de unión al sustrato (Okita, T. W., Greene, T. W., Laughlin, M. J., Salamone, P., Woodbury, R., Choi, S., Ito, H., Kavakli, H., y Stephens, K.

[1996] "Engineering Plant Starches by the Generation of Modified Plant Biosynthetic Enzymes," En Engineering Crops for Industrial End Uses, Shewry, P. R., Napier, J. A., y Davis, P., editores., Portland Press Ltd., Londres). Las enzimas AGP han sido aisladas tanto a partir de bacterias como de plantas. La AGP bacteriana consiste de un homotetrámero, mientras que la AGP vegetal a partir de tejidos fotosintéticos y no fotosintéticos es un heterotetrámero compuesto de dos subunidades diferentes. La enzima vegetal se codifica por dos genes diferentes, con una subunidad siendo más grande que la otra. Esta característica ha sido evidenciada en numerosas plantas. Las subunidades de la AGP en la hoja de espinaca tienen pesos moleculares de 54 kDa y 51 kDa, como se estima mediante SDS-PAGE. Ambas subunidades son inmunoreactivas con anticuerpos generados en contra de la AGP purificada a partir de hojas de espinaca (Copeland, L., J. Preiss (1981 ) Plant Physiol. 68: 996-1001 ; Morell, M., M. Bloon, V. Knowles, J. Preiss

[1988] J.

Biol. Chem. 263: 633). El análisis inmunológico utilizando antisuero preparado en contra de las subunidades pequeña y grande de la hoja de espinaca mostraron que la AGP del tubérculo de la patata también está codificada por dos genes (Okita et al., 1990, anteriormente mencionado). Las clonas de ADNc de las dos subunidades del tubérculo de la patata (50 y 51 kDa) también se han aislado y secuenciado (Muller-Rober, B. T., J. Kossmann, L. C. Hannah, L. Willinitzer, U. Sounewald

[1990] Mol. Gen. Genet. 224: 136-146; Nakata, P. A., T. W. Greene, J. M. Anderson, B. J. Smith-White, T. W. Okita, J. Preiss

[1991] Plant Mol. Biol. 17: 1089-1093). La subunidad grande de la AGP del tubérculo de la patata es estable al calor (Nakata et al.

[1991], anteriormente mencionado). Como Hannah y Nelson (Hannah, L. C, O. E. Nelson (1975) Plant Physiol. 55: 297- 302.; Hannah, L. C, y Nelson, Jr., O. E.

[1976] Biochem. Genet. 14: 547-560) postularon, ambos Shrunken-2 (Sh2) (Bhave, M. R., S. Lawrence, C. Barton, L. C. Hannah

[1990] Plant Cell 2: 581-588) y Brittle-2 (Sí2) (Bae, J.M., M. Giroux, L.C. Hannah

[1990] Maydica 35: 317-322) son genes estructurales de la ADP-glucosa pirofosforilasa del endospermo del maíz. Sh2 y Bt2 codifican la subunidad grande y subunidad pequeña de la enzima, respectivamente. A partir de la secuenciación del ADNc, se ha pronosticado el peso molecular de las proteínas Sh2 y Bt2 de 57,179 Da (Shaw, J.R., L.C. Hannah

[1992] Plant Physiol. 98: 1214-1216) y 52,224 Da, respectivamente. El endospermo es el sitio de mayor depositación de almidón durante el desarrollo del grano de maíz. Los mutantes del endospermo de maíz Sh2 y bt2 tienen niveles de almidón reducidos en gran medida que corresponden a niveles deficientes de actividad de AGP. Se ha mostrado que las mutaciones de cualquier gen reducen la actividad de AGP en aproximadamente 95% (Tsai y Nelson, 1966, anteriormente mencionado; Dickinson y Preiss, 1969, anteriormente mencionado). Además, se ha observado que las actividades enzimáticas se incrementan con la dosis de alelos funcionales de tipo silvestre Sh2 y Bt2, mientras que las enzimas mutantes tienen propiedades cinéticas alteradas. La AGP es el paso limitante de velocidad en la biosíntesis de almidón en las plantas. Stark et al. colocaron una forma muíante de la AGP de E. coli en el tubérculo de la patata y obtuvieron un incremento del 35% en el contenido de almidón (Stark et al.

[1992] Science 258: 278). Se ha reportado la clonación y caracterización de los genes que codifican las subunidades de la enzima AGP en diversas plantas. Estas incluyen el ADNc de Sh2 (Bhave et al., 1990, anteriormente mencionado), el ADN genómico de Sh2 (Shaw y Hannah, 1992, anteriormente mencionado), y el ADNc de Bt2 (Bae et al., 1990, anteriormente mencionado) a partir del maíz; el ADNc de la subunidad pequeña (Anderson, J. ., J. Hnilo, R. Larson, T.W. Okita, M. Morell, J. Preiss

[1989] J. Biol. Chem. 264: 12238-12242) y el ADN genómico (Anderson, J.M., R. Larson, D. Landencia, W.T. Kim, D. Morrow, T.W. Okita, J. Preiss

[1991] Gene 97: 199-205) a partir del arroz; y los ADNc de la subunidad pequeña y grande a partir de la hoja de espinaca (Morell et al., 1988, anteriormente mencionado) y del tubérculo de la patata (Muller-Rober et al., 1990, anteriormente mencionado; Nakata, P.A., Greene, T.W., Anderson, J.W., Smith-White, B.J., Okita, T.W., y Preiss, J.

[1991] Plant Mol. Biol. 17: 1089-1093). Además, las clonas de ADNc se han aislado a partir del endospermo de trigo y del tejido de la hoja (Olive, M.R., R.J. Ellis, W.W. Schuch

[1989] Plant Physiol. Mol. Biol. 12: 525-538) y hoja de Arabidopsis thaliana (Lin, T., Caspar, T., Sommerville, C. R., y Preiss, J.

[1988] Plant Physiol. 88: 175-1181 ). La AGP funciona como una enzima alostérica en todos los tejidos y organismos investigados hasta la fecha. Inicialmente se mostró que las propiedades alostéricas de la AGP eran importantes en E. coli. Una muíante de E. coli con sobreproducción de glucógeno se aisló y la mutación se mapeó hasta el gen estructural para AGP, designado como glyC. Se mostró que la E. coli muíante, conocida como glyC"16, era más sensible al activador, fructosa 1 ,6 bisfosfato, y menos sensible al inhibidor, AMPc (Preiss, J.

[1984] Ann. Rev. Microbiol. 419-458). A pesar de que las AGP vegetales íambién son alosíéricas, ésías responden a diferentes moléculas efectoras que las AGP vegetales. En las plañías, el ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) funciona como un acíivador mientras que el fosfato (P04) sirve como un inhibidor (Dickinson y Preiss, 1969, anteriormente mencionado). Utilizando un sistema de mutagénesis in vivo creado por la escisión mediada por Ac de un elemento que actúa como transposón Ds fortuitamente localizado de manera cercana a un sitio conocido de unión al activador, Giroux et al. (Giroux, M. J., Shaw, J., Barry, G., Cobb, G. B., Greene, T., Okita, T. W., y Hannah, L. C.

[1996] Proc. Nat!. Acad. Sci. 93: 5824-5829) fueron capaces de generar mutantes sitio específicos en una región funcionalmente importantes de la AGP del endospermo de maíz. Un muíante, Rev 6, contenía un inserto de tirosina-serina en la subunidad grande de AGP y condicionó un incremento de 11-18% en el peso de la semilla. Además, la solicitud internacional publicada WO 01/64928 enseña que diversas características, tales como número de semillas, biomasa vegetal, índice de cosecha etc., se pueden incrementar en las plantas transformadas con un polinucleotido que codifica una subunidad grande de la AGP de maíz que contiene la mutación Rev6.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a los materiales y métodos útiles para mejorar los rendimientos de cosecha en plantas, tales como aquellas plantas que producen cosechas de cereales. En una modalidad, la presente invención provee enzimas AGP estables al calor y secuencias nucleotídicas las cuales codifican a estas enzimas. En una modalidad preferida, las enzimas estables al calor de la invención pueden ser utilizadas para proveer plantas de tienen una mayor tolerancia a temperaturas elevadas, por lo tanto mejorando los rendimientos de las cosechas a partir de estas plantas. En una modalidad particularmente preferida, la planta mejorada es un cereal. Los cereales en los cuales se aplica esta invención incluyen, por ejemplo, maíz, trigo, arroz, y cebada.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra mutantes de la subunidad grande de la AGP del endospermo de maíz estables al calor. Se muestra el porcentaje de actividad de la AGP remanente después de cinco minutos de tratamiento con calor a 60°C. La figura 2 muestra el alineamiento de secuencia primaria de la región que rodea a la mutación HS 33 en las subunidades grandes de las AGP para el maíz, trigo, cebada, y patata. Las regiones conservadas se encuentran enmarcadas. La figura 3 muestra el alineamiento de secuencia primaria de la región que rodea a la mutación HS 40 en las subunidades grandes de las AGP para el maíz, trigo, cebada, y patata. Las regiones conservadas se encuentran enmarcadas. El residuo de ácido aspártico en negritas corresponde a la mutación alostérica D413A de la patata LS (Greene, T. W., Woodbury, R. L, y Okita, T. W.

[1996] Plant Physiol. (112: 1315-1320). La secuencia de la AGP de la hoja de espinaca es el sitio activador del péptido 2 identificado en estudios con análogos de 3-PGA (Ball, K. y Preiss, J. [ 994] J. Biol. Chem. 269: 24706-2471 1 ). El residuo marcado de lisina se encuentra en negritas. Las figuras 4A y 4B muestran la caracterización molecular de TS48 y de TS60, respectivamente. La lesión genética de TS48 y los residuos correspondientes se encuentran en negritas. El número de aminoácido se indica arriba de la mutación de Leu a Phe de TS48. La última línea es una secuencia consenso. El residuo Leu está altamente conservado. Las lesiones genéticas de TS60 y residuos correspondientes se encuentran en negritas. Los números de los aminoácidos se indican arriba de las mutaciones Glu a Lys y Ala a Val de TS60. Los residuos enmarcados corresponden a la mutación HS 33 previamente identificada y se muestra que es importante en la estabilidad al calor de la AGP del endospermo de maíz. La última línea es una secuencia consenso. Las figuras 5A y 5B muestran la caracterización molecular de RTS 48-2 y de RTS 60-1 , respectivamente. La lesión genética de RTS 48-2 y residuos correspondientes se encuentran en negritas. El número del aminoácido se indica arriba de la mutación Ala a Val de RTS 48-2. La última línea es una secuencia consenso. De importancia, la mutación identificada en RTS 48-2 mapea el residuo idéntico encontrado en la variante estable al calor HS 13. HS 13 contiene una mutación Ala a Pro en la posición 177. La lesión genética de RTS 60-1 y residuos correspondientes se encuentran en negritas. El número del aminoácido se indica arriba de la mutación Ala a Val de RTS60-1. La última línea es una secuencia consenso.

Breve descripción de las secuencias SEQ ID N0.1 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en maíz que contiene la mutación HS 33 como se muestra en la figura 2. SEQ ID NO. 2 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en maíz como se muestra en la figura 2. SEQ ID NO. 3 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en trigo como se muestra en la figura 2. SEQ ID NO. 4 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en cebada como se muestra en la figura 2. SEQ ID NO. 5 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en la patata como se muestra en la figura 2. SEQ ID NO. 6 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz que contiene la mutación HS40 como se muestra en la figura 3. SEQ ID NO. 7 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz como se muestra en la figura 3. SEQ ID NO. 8 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el trigo como se muestra en la figura 3. SEQ ID NO. 9 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en cebada como se muestra en la figura 3. SEQ ID NO. 10 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en la patata como se muestra en la figura 3.

SEQ ID NO. 1 1 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en la espinaca como se muestra en la figura 3. SEQ ID NO. 12 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz que contiene la mutación TS48 como se muestra en la figura 4A. SEQ ID NO. 13 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz como se muestra en la figura 4A. SEQ ID NO. 14 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el trigo como se muestra en la figura 4A. SEQ ID NO. 5 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en cebada como se muestra en la figura 4A. SEQ ID NO. 6 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el arroz como se muestra en la figura 4A. SEQ ID NO. 17 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz que contiene la mutación TS60 como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 18 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 19 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el trigo como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 20 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en cebada como se muestra en la figura 4B.

SEQ ID NO. 21 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el arroz como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 22 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz que contiene la mutación TS60 como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 23 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 24 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el trigo como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 25 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en cebada como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 26 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el arroz como se muestra en la figura 4B. SEQ ID NO. 27 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz que contiene la mutación RTS48-2 como se muestra en la figura 5A. SEQ ID NO. 28 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz como se muestra en la figura 5A. SEQ ID NO. 29 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el trigo como se muestra en la figura 5A. SEQ ID NO. 30 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en cebada como se muestra en la figura 5A. SEQ ID NO. 31 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el arroz como se muestra en la figura 5A. SEQ ID NO. 32 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz que contiene la mutación RTS60-1 como se muestra en la figura 5B. SEQ ID NO. 33 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el maíz como se muestra en la figura 5B. SEQ ID NO. 34 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el trigo como se muestra en la figura 5B. SEQ ID NO. 35 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en cebada como se muestra en la figura 5B. SEQ ID NO. 36 es una secuencia de aminoácidos de una región de la subunidad grande de AGP en el arroz como se muestra en la figura 5B.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se refiere a moléculas polinucleotídicas mutantes novedosas, y a los polipéptidos codificados por las mismas, que confieren un rendimiento incrementado en el crecimiento vegetal bajo condiciones de estrés por calor con relación a las plantas que tienen el genotipo de tipo silvestre. En modalidades específicas, las moléculas polinucleotídicas de la presente invención codifican las actividades de las enzimas ADP glucosa pirofosforilasa del endospermo de maíz (AGP) y de la sintasa soluble del almidón (SSS). Las enzimas mutantes confieren estabilidad incrementada a las condiciones de estrés por calor durante el desarrollo de la semilla y de la planta en semillas y tejido vegetal que expresan las enzimas en comparación con las actividades de la enzima de tipo silvestre. En la modalidad, un polinucleótido de la presente invención codifica una subunidad grande mutante de la AGP de maíz que contiene una sustitución de aminoácido de histidina-a-tirosina en la secuencia del polipéptido. Esta sustitución ocurre en el residuo de aminoácido número 333, de conformidad con el número aceptado de los aminoácidos en esta proteína (Shaw y Hannah, 1992, anteriormente mencionado). La posición de esta sustitución se puede identificar fácilmente por una persona experta en la técnica. Una segunda mutación ejemplificada en la presente invención es una sustitución de treonina-a-isoleucina en la posición número 460 de la subunidad grande de la proteína AGP del maíz. También se ejemplifican los mutantes en donde la histidina en la posición 333 de la subunidad grande de la AGP del maíz se reemplaza con una fenilalanina, metionina, o glicina. A continuación se muestran en el cuadro 1 mutantes adicionalmente ejemplificados de la subunidad grande de la AGP del maíz que confieren estabilidad incrementada al calor.

CUADRO 1 Debido a la homología de los polipéptidos de la AGP entre diversas especies vegetales (Smith-White y Preiss

[1992] J. Mol. Evol. 34: 449-464), el experto en la técnica puede determinar fácilmente la posición correspondiente de las mutaciones para la AGP del maíz ejemplificada en la presente invención en la AGP a partir de plantas diferentes al maíz. Por ejemplo, las figuras 2 y 3 muestran un alineamiento de la secuencia primaria para la región alrededor de las mutaciones HS 33 y HS 40 del maíz en el trigo, cebada, y patata. Por lo tanto, la presente invención abarca polinucleótidos que codifican a la AGP muíante de plantas diferentes al maíz, incluyendo, pero lo limitado a, trigo, cebada, y arroz, que confieren estabilidad incrementada al calor cuando se expresan en la planta. Las clonas de ADNc para las subunidades del la AGP del endospermo del maíz (SH2 y BT2) y la cepa de E. coli deficiente en la AGP bacteriana endógena (glg C")(AC70R1-504) han facilitado el establecimiento de un sistema de expresión bacteriano para estudiar a la AGP del endospermo del maíz. La expresión de un subunidad particular es incapaz de complementar el muíante glg C", y no se produce glucógeno (Iglesias, A., Barry, G.F., eyer, C, C, Bloksberg, L, Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M. J., Okita, T. W., Kishore, G. M., y Preiss, J.

[1993] S; Biol Chem. 268: 1081-86). No obstante, la expresión tanto de las subunidades grande como pequeña en vectores de expresión compatibles complementa completamente la mutación glg C" y restablece la producción de glucógeno como se evidencia por una tinción oscura, café rojiza de las colonias expuestas a yodo. Por lo tanto, la complementación se identifica fácilmente mediante la simple exposición de las colonias al yodo. En la modalidad, se utilizaron las células E. coli glg C" que expresan los genes estructurales ya sea para la AGP del endospermo de patata o de maíz. Las células que contenían los genes de la AGP de patata pueden sintetizar niveles abundantes de glucógeno cuando se crecen a 37°C o a 42°C. No obstante, las células que expresan la AGP del endospermo de maíz solamente sintetizan glucógeno a 37°C. Este resultado demuestra la sensibilidad al calor de la AGP del endospermo de maíz de tipo silvestre. Lo que es una diferencia entre las AGP de patata y de maíz a este respecto provee un sistema eficiente para seleccionar células mutantes que tienen variantes estables al calor de la AGP del endospermo de maíz. Un aspecto de la presente invención se refiere a la identificación eficiente de la AGP la cual es estable al calor. Por consiguiente, un plásmido que comprende un polinucleótido que codifica para la subunidad SH2 de la AGP de maíz se mutagenizó químicamente, como se describe a continuación, colocando dentro de las células mutantes de E. coli que expresan la subunidad BT2, y las células crecidas a 42°C para seleccionar mutantes que podían producir glucógeno a esa temperatura. Otros mutágenos conocidos en la técnica también se pueden utilizar. Se aislaron once mutantes heredables, que se tiñeron con yodo, denominados mutantes estables al calor (HS). Se prepararon los extractos sin purificar de estos mutantes y se monitoreó la estabilidad al calor de la AGP resultante. Los mutantes retuvieron entre 8-59% de su actividad después de incubación a 60°C por cinco minutos (figura 1 ). Esto se compara con el 1 -4% rutinariamente observado para la AGP de tipo silvestre a esta temperatura. Los resultados muestran que las formas estables al calor de las enzimas se pueden crear de conformidad con la presente invención mediante mutación. Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a los procedimientos para producir e identificar polinucleótidos que codifican enzimas mutantes para la biosíntesis del almidón que tienen estabilidad incrementada al calor en comparación con las enzimas de tipo silvestre. De manera inesperada, la actividad total de la AGP del endospermo de maíz antes del tratamiento con calor se elevó aproximadamente de dos a tres veces en la mayoría de estas mutantes. Este resultado sorprendente hace a estos mutantes particularmente ventajosos para uso en agricultura. Las técnicas de mutagénesis como se describen en la presente invención se pueden utilizar de conformidad con la presente invención para identificar otros genes que codifican enzimas estables al calor para la biosíntesis del almidón. Los genes que codifican varios de los mutantes estables al calor que se ejemplifican en la presente invención, incluyendo dos de los mutantes HS más estables al calor, HS 33 y HS 40, se secuenciaron completamente. HS 33, la cual retiene 59% de su actividad después de tratamiento con calor, contiene una mutación de un solo par de bases que cambia un residuo de histidina en la posición 333 de la secuencia de aminoácidos del polipéptido por una tirosina (figura 2). Los alineamientos de la secuencia primaria con las subunidades grandes a partir de las AGP de trigo y de cebada muestran que una histidina también está presente en el residuo análogo (figura 3) (Ainsworth, C, Hosein, F., Tarvis, M., Weir, F., Burrell, M., Devos, K. M., Gale, M. D.

[1995] Planta 197: 1-10). El análisis de secuencia de HS 40, la cual retiene 41 % de su actividad después del tratamiento con calor, también contenía una mutación de histidina a tirosina en la posición 333. Se identificó una mutación puntual adicional que generó una sustitución de treonina a isoleucina. El residuo de treonina está altamente conservado en las subunidades grandes de la AGP, mientras que en las subunidades pequeña de la AGP el residuo análogo es ya sea una cisteína o serina (Ainsworth et al., 1995, anteriormente mencionado). La sustitución de treonina a isoleucina se localiza cercana al carboxilo terminal de la subunidad grande, y cercana a un sitio de unión conocido para el activador 3-PGA (figura 3).

Otro aspecto de la presente invención se refiere a las enzimas mutantes para la biosíntesis del almidón, tales como la AGP, y los polinucleótidos que las codifican, en donde estas enzimas mutantes se aislan mediante la selección para mutantes sensibles a temperatura (TS) las cuales son posteriormente mutagenizadas y seleccionadas para reversibles que muestran estabilidad mejorada. Un aspecto adicional de la invención se refiere a los métodos para producir e identificar los polinucleótidos y enzimas mutantes codificados por estos. La presente invención también se refiere a mutantes de la AGP estables al calor que tienen mutaciones en la subunidad pequeña de la enzima. También se abarcan dentro del alcance de la invención polinucleótidos que codifican las subunidades mutantes pequeñas de la AGP. Las mutaciones en la subunidad pequeña de la AGP que contienen estabilidad al calor a la enzima también se pueden preparar fácilmente e identificar utilizando los métodos de la presente invención. También se contemplan por la presente invención las plantas y los tejidos vegetales procreados para que contengan o que están transformados con los polinucleótidos mutantes de la invención, y que expresan los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Las plantas y los tejidos vegetales que expresan los polinucleótidos mutantes producen tejidos que tienen, por ejemplo, una menor pérdida inducida por calor en el peso o en el rendimiento cuando se somete a estrés por calor durante el desarrollo. Las plantas dentro del alcance de la presente invención incluyen plantas monocotiledóneas, tales como el arroz, trigo, cebada, avena, sorgo, maíz, lirios, y mijo, y plantas dicotiledóneas, tales como el chícharo, alfalfa, garbanzo, achicoria, trébol, col, lenteja, hierba, soya, tabaco, patata, camote, rábano, repollo, colza, manzanos, y lechuga. En una modalidad particularmente preferida, la planta es un cereal. Los cereales a los cuales se aplica la invención incluyen, por ejemplo, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, centeno, y mijo. Las plantas que tienen polinucleótidos mutantes de la invención se pueden crecer a partir de semillas que comprenden un gen mutante en su genoma. Además, las técnicas para transformar plantas con un gen se conocen en la técnica. Debido a la degeneración del código genético, una variedad de diferentes secuencias polinucleotídicas puede codificar cada una de las variantes polipeptídicas de la AGP descritas en la presente invención. Además, se encuentra dentro de la capacidad de una persona experta en la técnica el crear secuencias polinucleotídicas alternativas que codifican los mismos polipéptidos, o esencialmente los mismos polipéptidos de la presente invención. Estas secuencias polinucleotídicas variantes o alternativas están dentro del alcance de la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, las referencias a "esencialmente la misma" secuencia se refiere a las secuencias que codifican las sustituciones, deieciones, adiciones o inserciones de aminoácidos las cuales no alteran materialmente la actividad funcional del polipéptido codificado por el polipéptido mutante de la AGP descrito en la presente invención. Como se utilizan en la presente invención, los términos "ácido nucleico" y "secuencia polinucleotídica" se refieren a un polímero de deoxirribonucleótido o de ribonucleótido ya sea en forma de cadena sencilla o doble, y a menos que se limite de otra manera, podría abarcar análogos conocidos de nucleófilos naturales que pueden funcionar de manera similar a los nucleófilos que se presentan de manera natural. Las secuencias polinucleotídicas incluyen tanto la secuencia de la cadena del ADN que se transcribe hacia ARN como la secuencia de ARN que se traduce hacia la proteína. Las secuencias polinucleotídicas incluyen tanto secuencias de longitud total así como secuencias más cortas derivadas a partir de las secuencias de longitud total. Se entiende que una secuencia polinucleotídica particular incluye los codones degenerados de la secuencia o secuencias nativas las cuales se pueden introducir para proveer un codón de preferencia en una célula hospedera específica. Las variaciones alélicas de las secuencias ejemplificadas también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Las secuencias polinucleotídicas que caen dentro del alcance de la presente invención incluyen adicionalmente secuencias que hibridan específicamente con las secuencias ejemplificadas. El polinucleótido incluye tanto las cadenas sentido y antisentido así como cualquiera de las cadenas individuales o en forma de dúplex. La sustitución de aminoácidos diferentes a aquellos específicamente ejemplificado en los mutantes descritos en la presente invención también se contempla dentro del alcance de la presente invención. Los aminoácidos se pueden reemplazar en las siguientes clases: no-polar, polar no cargado, básico, y ácido. Las sustituciones conservativas en donde un polipéptido muíante de la AGP que tiene un aminoácido de una clase se reemplaza con un aminoácido de la misma clase caen dentro del alcance de la presente invención siempre y cuando el polipéptido mutante de la AGP que tiene la sustitución aún retenga estabilidad incrementada al calor con relación a un polipéptido de tipo silvestre. El cuadro 2 a continuación provee una lista de los ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase.

CUADRO 2 Por ejemplo, la sustitución de la tirosina en la posición 333 en el mutante HS 33, HS 39, HS 40 y HS 47 de la AGP del endospermo de maíz con otros aminoácidos, tales como Glicina, Serina, Treonina, Cisteína, Asparagina, y Glutamina, se abarcan dentro del alcance de la presente invención. Las sustituciones de aminoácidos en las posiciones diferentes al sitio de la mutación estable al calor también se contemplan dentro del alcance de la invención siempre y cuando el polipéptido retenga estabilidad incrementada al calor con relación a los polipéptidos de tipo silvestre.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos que codifican fragmentos del polipéptido mutante de longitud total, siempre y cuando aquellos fragmentos retengan sustancialmente la misma actividad funcional que el polipéptido de longitud total. Los fragmentos del polipéptido mutante de la AGP codificados por estos polinucleótidos también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. La presente invención también contempla aquellas moléculas polinucleotídicas que codifican enzimas para la biosíntesis del almidón que tienen secuencias las cuales son suficientemente homologas con la secuencia de tipo silvestre de manera que permita la hibridación con esa secuencia bajo condiciones estándares de alta severidad. Dichas condiciones de hibridación son convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Maniatis, T., E. F. Fritsch, J. Sambrook

[1989] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención se pueden utilizar para transformar plantas para expresar la enzima mutante estable al calor en aquellas plantas. Además, los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para expresar la enzima variante recombinante. Estos también se pueden utilizar como sondas para detectar enzimas relacionadas. Los polinucleótidos también se pueden utilizar como estándares de tamaño de ADN. Las moléculas polinucleotídicas de la presente invención también incluyen aquellos polinucleótidos que codifican enzimas para la biosíntesis del almidón, tales como enzimas AGP, que contienen mutaciones que pueden conferir peso incrementado a la semilla, además de estabilidad mejorada al calor, a una planta que expresa estos mutantes. La combinación de una mutación estabilizante al calor, tal como por ejemplo HE 33 o HS 40, con una mutación que confiere peso incrementado a la semilla, por ejemplo, Rev 6, en un polinucleótido que codifica la subunidad grande de la AGP de maíz se contempla específicamente en la presente invención. Las Patentes de E.U.A. Nos. 5,589,618 y 5,650,557 describen polinucleótidos (por ejemplo, Rev6) que codifican mutaciones en la subunidad grande de la AGP que confiere peso incrementado a la semilla en las plantas que expresan el polipéptido muíante. Las mutaciones en las subunidades de la AGP que contienen estabilidad al calor se pueden combinar de conformidad con la presente invención con mutantes insensibles a fosfato del maíz, tal como la mutación Rev6, para mejorar la estabilidad de la subunidad grande codificada por Rev6. Se espera que la actividad enzimática de SSS se dañará a temperaturas mayores conforme se observó con AGP. Por lo tanto, las formas mutagenizadas de SSS se pueden expresar bajo condiciones termales incrementadas (42°C), para aislar variantes estables al calor de conformidad con los métodos descritos en la presente invención. Estas formas mutagenizadas estables al calor de SSS, y los polinucleótidos de las codifican, son aspectos adicionales de la presente invención. La presente invención también se refiere a métodos para incrementar las características de rendimiento de las plantas bajo condiciones de estrés por calor mediante la incorporación de un polinucleótido de la presente invención que comprende una mutación en una enzima para la síntesis del almidón que confiere estabilidad incrementada o resistencia a las condiciones de estrés por calor y una mutación que confiere características de rendimiento incrementado a la planta. Las características de rendimiento incrementado incluyen, por ejemplo, número incrementado de semillas, peso incrementado de la semilla, biomasa incrementada de la planta, e índice de cosecha incrementado. La presente invención también se refiere a métodos para producir e identificar polinucleótidos y polipéptidos contemplados dentro del alcance de la invención. En una modalidad, la mutación génica, seguida por ta selección utilizando un sistema de expresión bacteriana, se puede utilizar para aislar moléculas polinucleotídicas que codifican enzimas que pueden mitigar la pérdida inducida por calor en la síntesis de almidón en las plantas. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes provisionales, publicaciones referidas a o citadas en la presente invención se incorporan en la presente invención como referencia en su totalidad hasta el grado en que no son inconsistentes con las enseñanzas explícitas de esta especificación. A continuación se muestran los ejemplos que ilustran procedimientos para practicar la invención. Estos ejemplos no deben considerarse como limitantes. Todos los porcentajes son por peso y todas las proporciones de mezclas de solventes son por volumen a menos que se indique de otra manera.

EJEMPLO 1 Uso de mutagénesis para obtener variantes estables al calor de la AGP del endospermo de maíz El mutágeno químico hidroxilamina-HCl se utilizó inicialmente para la mutagénesis al azar del plásmido para expresión de la subunidad grande. La hidroxilamina hidroxila preferiblemente el nitrógeno del amino en la posición C-4 de la citocina, y produce una transición GC a AT (Suzuki, D. T., Griffith, A. J. F., Miller, J. H.t y Lewontin, R. C.

[1989] En Introduction to genetic analysis, Freeman, NY, 4a edición, pp. 475-499). El mutágeno químico se eligió por su alta frecuencia de mutación. Se reconocieron las limitaciones del mutágeno químico, y si no se aislaba una gran variedad de variantes genéticas, se podía llevar a cabo mutagénesis al azar basada en PCR. La mutagénesis mediante PCR genera un amplio espectro de mutaciones que incluyen frecuencias similares de transiciones y transversiones, y provee una alternativa excelente al método químico. El método descrito por CadweII y Joyce (CadweII, R. C. y Joyce, G. F.

[1992] PCR Methods and Applications 2: 28-33) se puede seguir para el método basado en PCR. Puesto que el plásmido de expresión completa se utiliza en la mutagénesis al azar, es posible que las mutaciones ocurrirán fuera de la región codificante. A pesar de que se espera que dichas mutaciones no tendrán ningún efecto sobre la estabilidad al calor de la AGP del endospermo de maíz, cada variante puede ser subclonada dentro de un plásmido de expresión mutado antes de realizar cualquier caracterización adicional a nivel enzimático. Tanto los plásmido expresión de la subunidad pequeña como de la subunidad grande se pueden construir de manera que una digestión Ncol/Sacl liberará la región codificante completa. Esta se puede clonar fácilmente de vuelta dentro de un plásmido de expresión mutante digerido con Ncol/Sacl.

EJEMPLO 2 Caracterización molecular y análisis de las variantes de la AGP estable al calor lnicialmente, se obtuvieron 1 1 variantes estables al calor de la subunidad grande del endospermo de maíz. La secuenciación se llevó a cabo utilizando equipo de instrumentos DuPont y ABI. Los datos de secuencia se pueden comparar rutinariamente con el alelo progenitor de tipo silvestre. Este análisis revela el grado de diversidad de los cambios que condicionan la estabilidad al calor. Varios de los mutantes HS secuenciados contenían el cambio idéntico de histidina a tirosina en la posición del aminoácido 333 en la subunidad grande. Los mutantes HS derivados mediante PCR se pueden seleccionar rápidamente para la alteración de histidina a tirosina mediante el uso de mutagénesis sitio específica utilizando iniciadores que cambian la tirosina de vuelta a histidina.

EJEMPLO 3 Expresión, purificación, y análisis cinético de las variantes genéticas Las condiciones para la expresión de la AGP del endospermo de maíz de tipo silvestre en E. coli han sido completamente caracterizadas. Las condiciones óptimas de crecimiento e inducción varían de cierta manera a partir de aquellas previamente publicadas para la AGP de la patata expresada en E. coli (Iglesias et al., 1993, anteriormente mencionado; Ballicora et al., 1995, anteriormente mencionado). La inducción a temperatura ambiente por 12-14 horas en la presencia de IPTG 0.3 mM y 25 µg ml de ácido nalidíxico produce de manera consistente niveles altos de expresión y de actividad. La adición de sulfato de amonio al 30% y de KH2P047K2HP04 10 mM al regulador de pH para extracción estabiliza a la AGP del maíz en el extracto sin purificar. La AGP concentrada con el sulfato de amonio se purificó adicionaimente mediante cromatografía de interacción hidrófoba utilizando medio Tentacle C3 aminopropilo (EM Separations) empaquetado en una columna de HR 10/10 de Pharmacia. La proteína se une a la columna en un regulador de pH que contiene sulfato de amonio 1 M. La AGP se eluye a partir de la columna mediante pasos sucesivos de lavados con un gradiente del regulador de pH que contiene sulfato de amonio 0.75 M, 0.5 M, 0.25 M, y 0 M. La AGP del endospermo de maíz de tipo silvestre se eluye típicamente en el lavado de 0.25 M. La AGP del endospermo de maíz purificada mediante C3 se purifica adicionalmente mediante cromatografía de intercambio aniónico utilizando medio para intercambio aniónico Macro-Prep DEAE (BioRad) empaquetado dentro de una columna HR 10/10 de Pharmacia. La AGP se eluye mediante un gradiente lineal de KCI del 00-500 mM, y típicamente eluye a una concentración de sal de alrededor de 300 mM. Un sistema FPLC de Pharmacia se utilizó para todos los pasos de cromatografía. Las condiciones para los pasos de purificación individual se caracterizaron completamente. La actividad de la AGP durante la purificación se monitoreó mediante el ensayo de pirofosforilisis, y los pasos de purificación se monitorearon mediante SDS-PAGE, tinción de Coomassie, y análisis Western utilizando anticuerpos policlonales específicos a las unidades grande y pequeña de la AGP del endospermo de maíz.

EJEMPLO 4 Interacción mejorada de la subunidad Un efecto pleiotrópico completamente inesperado de los mutantes de la AGP del endospermo de maíz HS es una elevación de dos a tres veces de la actividad antes del tratamiento con calor. Una posible explicación para este resultado es que tenemos, por cambio mutacional, un cambio de la relación de los monómeros y polímeros SH2 y BT2 que existen dentro de la célula de E. coli. Tal vez, en el tipo silvestre, solamente 10% o menos de las proteínas totales existen en la forma heterotetramérica activa mientras que en los mutantes, este porcentaje es mucho mayor. Si el polímero es más resistente al calor que los monómeros, entonces el fenotipo de los mutantes podría ser idéntico al que se ha observado. El análisis cinético puede ser utilizado para determinar cambios en las afinidades para sustratos y/o éfectores alostéricos. Para probar la idea de que la relación del monómero/polímero puede estar alterada en estos mutantes, se pueden monitorear las cantidades de monómeros y polímeros en el tipo silvestre y en los mutantes seleccionados tanto antes como después del tratamiento con calor. La disponibilidad de los anticuerpos (Giroux, M.J. y Hannah, L. C.

[1994] Mol. Gen. Genetics 243: 400-408) para ambas subunidades hace a este método posible. Esto se puede examinar tanto a través de ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa y a través de cromatografía en gel y fácilmente se determinará qué método es más eficiente y definitivo. Puesto que la AGP de plantas superiores consiste de dos subunidades similares pero distintas que oligomerizan para formar la estructura heterotetramérica nativa, las mutaciones que mejoran esta interacción pueden proveer estabilidad añadida a la enzima. Un sistema de dos híbridos en levadura (CLONTECH Laboratories, Palo Alto, CA) se puede utilizar para evaluar las interacciones de la subunidad. Se pueden construir los iniciadores específicos para la amplificación de las regiones codificantes. Estos iniciadores añaden sitios de restricción únicos a los extremos 5' y 3' de manera que la clonación facilita la fusión traduccional de la subunidad individual al dominio de unión del ADN de GAL4 (pGBT9) o al dominio de activación GAL4 (pGAD424). Si las proteínas clonadas en los vectores interaccionan, el dominio de unión al ADN y el dominio de activación formarán un activador de la transcripción funcional. Este a su vez activa la expresión del gen reportero, lac Z, clonado junto a un promotor GAL4. Inicialmente, las condiciones se pueden caracterizar con las subunidades de tipo silvestre. Las regiones codificantes de las subunidades grande y pequeña de tipo silvestre se pueden clonar dentro de los vectores de expresión pGBT9 y pGAD424 de levadura. Se pueden generar y evaluar todas las posibles combinaciones. Los vectores pGBT9 y pGAD424 que contienen Sh2 y Bt2 se pueden cotransformar dentro de la misma cepa de levadura, y se seleccionan para crecimiento en medio que carece de triptófano (pGBT9) y leucina (pGAD424). La interacción de la subunidad como una función de la expresión de lacZ se puede detectar de dos maneras. Las colonias positivas se identifican visualmente mediante un ensayo de filtro con B-galactosidasa. Con este ensayo las colonias se unen al filtro, se lisan, y se incuban con una solución de X-gal. Las colonias que exhiben un color azul pueden ser analizadas. La interacción de la subunidad se puede analizar adicionalmente mediante un ensayo enzimático específico para B-galactosidasa. Esto permite la cuantificación de la interacción. Las mutaciones que mejoran las interacciones de la subunidad producirán niveles mayores de actividad de la B-galactosidasa cuando se ensayan.

EJEMPLO 5 Mejoría adicional de la estabilidad Los mutantes aislados de la subunidad grande varían en sus características de estabilidad al calor, sugiriendo la posibilidad de múltiples mutaciones. A pesar de que el análisis de secuencia de los mutantes HS 33 y HS 40 revela que las secuencias mutantes no son idénticas, ambos mutantes contenían el cambio idéntico de histidina a tirosina. Dada la identificación de diferentes alteraciones HS dentro de la proteína SH2, es posible construir eficientemente estos cambios dentro de una proteína. Además, cualesquiera de las mutaciones HS dentro de la subunidad pequeña pueden ser coexpresadas con los mutantes HS SH2 para mejorar adicionalmente la estabilidad de la enzima del endospermo de maíz. Múltiples mutantes HS dentro de una subunidad se pueden combinar fácilmente. Por ejemplo, se pueden utilizar los diferentes sitios de restricción única que dividen las regiones codificante de Sh2 en tres fragmentos distintos. Cuando es apropiado, se pueden generar combinaciones de mutaciones mediante subclonación del fragmento correspondiente que contiene la mutación añadida. Si dos mutaciones se encuentran en proximidad cercana, entonces la mutagénesis sitio dirigida puede ser utilizada para diseñar dichas combinaciones. Un método para mutaciones sitio específicas implica PCR, iniciador mutagénico, y el uso de la endonucleasa de restricción Dpnl. Los iniciadores se pueden construir para que contengan la mutación en el extremo 5', y se utilizan para amplificación mediante PCR utilizando la polimerasa Vent para corrección de lectura. El ADN amplificado se puede digerir con Dpnl. El ADN parental aislado a partir de E. coli se metila y por lo tanto es susceptible a Dpnl. El ADN digerido se fracciona por tamaño mediante electroforesis en gel, se liga, y se clona dentro de los vectores de expresión. Las mutaciones se confirman mediante análisis de secuencia y se transforman dentro de la cepa AC70R1-504 que porta la subunidad pequeña de tipo silvestre. Entonces se pueden analizar los mutantes combinatoriales.

EJEMPLO 6 Identificación de mutantes adicionales en ia posición 333 de la subunidad grande de la AGP de maíz La mutagénesis por hidroxilamina-HCI produce solamente cambios de cisteína a timina, por lo tanto limitando los tipos de posibles sustituciones. Debido a que ambas cadenas de ADN llevan a cabo mutagénesis, también ocurren los cambios de timina a citocina; no obstante, tomándolos juntos, solamente ocurren dos de los 12 cambios posibles de bases particulares. Por lo tanto, no todas las posibles sustituciones de aminoácidos podrían ser producidas mediante mutagénesis por hidroxilamina-HCI. Por lo tanto, con el objeto de preparar mutantes en donde cada uno de los 20 diferentes aminoácidos se inserten, individualmente, en la posición 333 de la subunidad grande de la AGP del endospermo de maíz, se empleó un proceso de dos pasos. Las metodologías se derivaron básicamente a partir de aquellas de Stratagene. Primero, el aminoácido que codifica el codón 333, mas la primera base del codón para el aminoácido 334, se removieron mediante mutagénesis sitio específicas basada en PCR (Suzuki et al., 1989, anteriormente mencionado). Después de seleccionar para la inactividad por tinción con yodo y de secuenciar subsecuentemente para verificar la deleción, el plásmido resultante se mutagenizó mediante PCR utilizando un iniciador que contenía bases al azar en el codón 333 mas la base de reemplazo en la primera base del cordón para el aminoácido 334. Los plásmidos resultante se transformaron dentro de células mutantes de E. coli que contenían a Bt2, se seleccionaron mediante la tinción con yodo para actividad a 37°C y a 42°C, y subsecuentemente se secuenciaron. Los iniciadores para una degeneración menor fueron utilizados en etapas posteriores para generar más eficientemente codones no obtenidos en la primera ronda. Todas las 20 sustituciones de aminoácidos se aislaron después de la mutagénesis y todas produjeron la elevación de la tinción a 37°C. Los mutantes también se evaluaron para tinción con yodo a la temperatura elevada de 42°C. Las cepas codificadas se utilizaron para seleccionar la remoción de cualquier posible prejuicio por parte de los investigadores. Aquellos mutantes dieron lugar a una tinción igual que o mayor que la del tipo silvestre cuando se crecieron a 42°C, todos se encuentran listados en el cuadro 3 a continuación. Como se esperaba, la selección identificó enzimas activas que tienen en la posición 333 de la proteína el aminoácido de tipo silvestre, por ejemplo, histidina, o el aminoácido del muíante HS 33, por ejemplo, tirosina. También se identificó la fenilalanina, la cual difiere de la tirosina solamente por la ausencia de un grupo hidroxilo polar. La selección también identificó enzimas activas que tienen aminoácidos que difieren sustancialmente de la tirosina y de la fenilalanina, tales como, por ejemplo, glicina. Las actividades de la AGP antes y después del tratamiento de preparaciones de enzima recientemente extraída a 65°C por 5 minutos también se midieron y los resultados se muestran en el cuadro 3. Uno de los ocho aminoácidos seleccionados a través de la tinción positiva de placas de E. coli crecidas a 42°C, tres mutantes (HS 33, HS 33F, y HS 33M que tienen tirosina, fenilalanina, o metionina en la posición 333, respectivamente) proveyeron una actividad superior en los ensayos enzimáticos después del tratamiento con calor a 65°C. Mientras que las actividades de la AGP a partir de las AGP que contienen fenilalanina metionina es de alguna manera mayor que aquella condicionada por la sustitución de tirosina, las diferencias en actividad entre estas tres preparaciones son pequeñas.

CUADRO 3 *Actividad de la AGP en preparaciones sin purificar se expresa como porcentaje de la actividad de HS 33 antes del tratamiento con calor.

EJEMPLO 7 Combinación de las mutaciones para estabilidad al calor con Rev6 De conformidad con la presente invención, las mutaciones estables al calor se pueden combinar con una mutación asociada con el peso incrementado de la semilla, tal como, por ejemplo, la mutación Rev6. El objetivo es mantener la característica deseada de insensibilidad del fosfato de Rev6 mientras que se mejora su estabilidad. Los mutantes dobles Rev 6/HS se pueden construir y confirmar como se describe en la presente invención. Los mutantes dobles se pueden transformar dentro de AC70R1-504 que porta la subunidad pequeñas de tipo silvestre. La estabilidad incrementada al calor se puede identificar fácilmente mediante una tinción positiva al glucógeno en un medio con bajo contenido de glucosa. Rev6 no se tiñe cuando se crece sobre este medio. Inicialmente todas las combinaciones de mutantes se pueden seleccionar enzimáticamente para el mantenimiento de la insensibilidad al fosfato, y solamente se analizan adicionalmente las combinaciones que mantienen la insensibilidad al fosfato.

EJEMPLO 8 Clonación de los mutantes SSS 1 Una cepa de E. coli glg A" deficiente en la glucógeno sintasa bacteriana endógena se puede obtener a partir del Centro de Concentración de E. coli. Los vectores para expresión bacteriana habitualmente utilizados para la expresión de la AGP se pueden utilizar para la expresión de SSS. Una estrategia de clonación, como se utiliza, por ejemplo, con Sh2 y Bt2 (Giroux et al., 996, anteriormente mencionado), es la siguiente: un iniciador contiene un sitio de restricción único más el extremo 5' terminal del transcrito mientras que el otro iniciador contiene otro sitio de restricción único y las secuencias 3' al codón de término de la traducción del gen bajo investigación. La clonación subsecuente de éstos produce la fusión traduccional con el plásmido. Estos iniciadores específicos del gen se utilizan inicialmente en las reacciones de RT-PCR utilizando poli A+RNA a partir de los endospermos en desarrollo. La expresión de la SSS I del endospermo de maíz complementará la ausencia de la actividad de la glucógeno sintasa en la cepa glg A". La complementación se puede visualizar fácilmente con tinción con yodo como se utiliza con la expresión de la AGP en la cepa glg C". Los extractos sin purificar pueden ser incubados a distintas temperaturas y longitudes de tiempo para determinar la estabilidad al calor de la SSS I. La cepa glg A" que expresan la SSS I del endospermo de maíz se crece a diversas temperaturas para determinar si la función es sensible a la temperatura como lo es el con sistema de expresión bacteriana de la AGP. Una vez que se establece una temperatura restrictiva, se puede llevar a cabo una mutagénesis al azar con la clona SSS I. Las formas mutantes de SSS I se pueden transformar dentro de la cepa glg A", se crecen a la temperatura restrictiva, y las variantes estables al calor se identifican por su capacidad para producir tinción al yodo por glucógeno a la temperatura de restricción.

EJEMPLO 9 Mutantes sensibles a la temperatura de la ADP- glucosa pírofosforilasa del endospermo de maíz Como un método alternativo para identificar variantes adicionales con estabilidad incrementada, se empleó un método de genética reversa. Los mutantes sensibles a temperatura (TS) se han aislado. Estos mutantes exhiben un fenotipo negativo de tinción al yodo a 30°C indicando una ausencia de función con la AGP del endospermo de maíz. En contraste, cuando ios mutantes se crecen a 37°C éstos pueden complementar totalmente la mutación en la AGP bacteriana. Esto muestra claramente que las AGP mutantes son funcionales, y que la pérdida de función es dependiente de la temperatura. La AGP de tipo silvestre exhibe un fenotipo positivo de tinción al glucógeno a 30 y 37°C. Posteriormente los mutantes sensibles a temperatura fueron utilizados para producir revertidos en un segundo sitio que codifica la AGP mutante que tiene estabilidad mejorada.

Mutaqénesis. El ADN de pSh2 se sometió a mutagénesis por hidroxilamina (Greene, T. W., Chantler, S. E., Kahn, M. L. , Barry, G. F., Preiss, J. , y Okita, T. W.

[1996] Proc. Nati. Acad. Sci. 93: 1509-1513) y se transformó dentro de las células E. coli AC70R1-504 que portan el plásmido de la subunidad pequeña de tipo silvestre de pBt2. Las células se sembraron y se crecieron a 30°C. Las variantes sensibles a temperatura de AGP fueron identificadas por sus fenotipos negativos a la tinción con yodo a 30°C. Los mutantes putativos fueron sembrados de nuevo a 30°C y a 37°C junto con la AGP de tipo silvestre como un control. Se aislaron seis mutantes que produjeron consistentemente un fenotipo negativo de tinción a yodo a 30°C y un fenotipo positivo de tinción a yodo a 37°C. La expresión de Sh2 y Bt2 de tipo silvestre produjo un fenotipo positivo de tinción a yodo a ambas temperaturas.

Caracterización de TS48 y TS60. El ADN plasmídico a partir de los mutantes sensibles a temperatura, TS48 y TS60, se aisló y secuenció para identificar la lesión genética. Se identificó una mutación puntual particular que generó el reemplazo de leucina en la posición de aminoácido 426 con fenilalanina (figuras 4A). Este residuo y la región que lo rodea se conservan en gran medida en las subunidades grandes del endospermo en el cereal (LS) (Smith-White y Preiss, 1992, anteriormente mencionado). En TS60, se identificaron dos mutaciones puntuales que generaron un cambio de ácido glutámico a lisina en el aminoácido 324 y una mutación de alanina a valina en la posición 359 (figuras 4B). Glu-324 está altamente conservada entre las subunidades LS y subunidades pequeñas (SS)' de la AGP (Smith-White y Preiss, 1992, anteriormente mencionado). Ala-359 y los aminoácidos que la rodean también están altamente conservados entre las AGP LS. De importancia, las dos mutaciones identificadas en TS60 flanquean la mutación HS 33 descrita en la presente invención. La mutación HS 33, la cual tiene la sustitución de histidina a tirosina en la posición 333, se mostró que mejora en gran medida la estabilidad al calor de la AGP del endospermo de maíz. El hecho de que las mutaciones de TS60 están en una proximidad cercana con la mutación HS 33 es evidencia adicional de que esta región de la proteína es importante para la estabilidad.

Aislamiento de revertidos de segundo sitio. El aislamiento de los mutantes sensibles a temperatura provee un fenotipo de selección para aislar variantes adicionales que mejoran la estabilidad de la AGP. La mutagénesis adicional con hidroxilamina se llevó a cabo con el ADN de TS48 y de TS60 para aislar revertidos de segundo sitio que restablecen un fenotipo positivo para tinción al glucógeno a 30°C. La hidroxilamina se utilizó debido a que la química de la mutagénesis elimina la posibilidad de una reversión directa de la mutación primaria identificada en los mutantes TS48 y TS60. Esto obliga a la selección de mutaciones de segundo sitio que pueden restablecer la estabilidad en estos mutantes sensibles a temperatura. Estos revertidos se aislaron para TS48 y se muestra la caracterización molecular de un muíante, RTS 48-2 (figura 5A). RTS 48-2 contiene una mutación de alanina a valina en la posición de aminoácido 177 además de la mutación parental identificada en TS48. Este residuo y región alrededor se encuentran altamente conservados. La mutación RTS 48-2 corresponde al sitio idéntico de la mutación identificada en el mutante estable al calor, HS 13. El residuo de alanina se mutó a una prolina en la posición 177 en HS 13. El que estas dos mutaciones se mapean el mismo sitio es significativo. Los mutantes RTS 48-2 y HS 13 se seleccionaron basándose en la estabilidad incrementada utilizando métodos completamente diferentes, y por lo tanto estas dos mutaciones identifican este sitio como importante en la estabilidad de la AGP.

Cinco revertidos de segundo sitio fueron aislados para TS60 y se muestra el análisis de secuencia de uno, RTS 60-1 (figura 5B). Se identificó una mutación de alanina a valina en el aminoácido 396. Este residuo está altamente conservado entre las AGP LS, y también se mapea de manera cercana a una mutación estable al calor identificada en HS 14. Debe entenderse que los ejemplos y modalidades descritos en la presente invención son solamente para propósitos ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán sugeridos por personas expertos en la técnica y deben ser incluidos dentro del espíritu y el campo de esta solicitud y el alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTADO DE SECUENCIA <110> University of Florida Research Foundation, Inc. <120> Mutantes estables al calor de enzimas para la biosintesis del almidón <130> UF-178AXC2 <150> US 09/312,433 <151> 1999-05-14 <150> US 60/085,460 <151> 1998-05-14 <150> US 08/972,545 <151> 1997-11-18 <150> US 60/031,045 <151> 1996-11-18 <160> 36 <210> 1 <211> 33 <212> PRT <213> HS 33 Mutante de Zea mays <400> 1 Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Val Gln Ala Cys lie Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr 20 25 30 lie 210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Zea mays <400> 2 Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His 1 5 10 15 Ser Val Gln Ala Cys lie Phe Thr Gly Tyr Trp Glu Asp Val Gly Thr 20 25 30 lie <210> 3 <211> 33 <212> PRT <213> Triticum aestivum <4O0> 3 Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His 1 5 10 15 Asn Val Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr Trp Glu Asp lie Gly Thr 20 25 30 lie <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> Hordeura vulgare <400> 4 Leu His Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His 1 5 10 15 Asn Val Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr Trp Glu Asp lie Gly Thr 20 25 30 lie <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 5 Ser Asn Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Ala Ala lie Asp Asp Tyr 1 5 10 15 Asn Val Gln Ala Tyr lie Phe Lys Asp Tyr Trp Glu Asp lie Gly Thr 20 25 30 lie <210> 6 <211> 26 <212> PRT <213> HS40 Mutante de Zea mays <400> 6 Ala Gly Lys Val Pro lie Gly lie Gly Arg Asn lie Lys lie Arg Asn 1 5 10 15 Cys lie lie Asp Met Asn Ala Arg lie Gly 20 25 <210> 7 <211> 26 < 12> PRT <213> Zea mays <400> 7 Ala Gly Lys Val Pro lie Gly lie Gly Arg Asn Thr Lys lie Arg Asn 1 5 10 15 Cys lie lie Asp Met Asn Ala Arg lie Gly 20 25 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 8 Glu Gly Lys Val Pro lie Gly Val Gly Glu Asn Thr Lys lie Ser Asn 1 5 10 15 Cys lie lie Asp Met Asn Ala Arg lie Gly 20 25 <210> 9 <211> 26 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 9 Glu Gly Lys Val Pro lie Gly Val Gly Glu Asn Thr Lys lie Ser Asn Cys lie lie Asp Met Asn Ala Arg lie Gly 20 25 <210> 10 <211> 26 <212> PRT <213> Solanum tuberosura <400> 10 Glu Gly Lys Val Pro lie Gly lie Gly Glu Asn Thr Lys lie Arg Lys 1 5 10 15 Cys lie lie Asp Lys Asn Ala Lys lie Gly 20 25 <210> 11 <211> 11 <212 PRT <213> Spinicia olerácea <400> 11 lie Lys Asp Ala lie lie Asp Lys Asn Ala Arg 1 5 10 <210> 12 <211> 20 <212> PRT <213> TS48 Mutante de Zea mays <400> 12 Cys Ser Arg Val Ser Ser Gly Cys Glu Phe Lys Asp Ser Val Met Met 1 5 10 15 Gly Ala Asp lie 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Zea mays <400> 13 Cys Ser Arg Val Ser Ser Gly Cys Glu Leu Lys Asp Ser Val Met Met Gly Ala Asp <210> 14 <211> 20 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 14 Arg Ser Arg Leu Asn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ala Met Met Met 1 5 10 15 Gly Ala Asp Ser 20 <210> 15 <211> 20 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400 15 Arg Ser Arg Leu Asn Ser Gly Ser Glu Leu Lys Asn Ala Met Met Met 1 5 10 15 Gly Ala Asp Ser 20 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 16 Ser Ser Arg Val Ser Ser Gly Cys Glu Leu Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 24 <212> PRT <213> TS60 Mutante de Zea mays <400> 17 Asp Phe Gly Ser Lys lie Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His Ser Val Gln Ala Cys lie Phe Thr Gly Tyr 20 <210> 18 <211> 24 <212> PRT <213> Zea mays <400> 18 Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Val Leu Asp His Ser Val 1 5 10 15 Gln Ala Cys lie Phe Thr Gly Tyr 20 <210> 19 <211> 24 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 19 Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His Asn Val 1 5 10 15 Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 <210> 20 <211> 24 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 20 Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Leu His Asp His Asn Val 1 5 10 15 Gln Ala Tyr Val Phe Thr Asp Tyr 20 <210> 21 <211> 25 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 21 Asp Phe Gly Ser Glu lie Leu Pro Arg Ala Leu Leu Glu His Asn Val 1 5 10 15 Lys Val Ala Cys Val Phe Thr Glu Tyr 20 25 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> TS60 Mutante de Zea mays <400> 22 Glu Asp Val Gly Thr lie Lys Ser Phe Asp Ala Asn Leu Val Leu 1 5 10 15 Thr Glu Gln Pro Ser Lys Phe Asp 20 <210> 23 <211> 25 <212> PRT <213> Zea mays <400> 23 Glu Asp Val Gly Thr lie Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Ala Leu 1 5 10 15 Thr Glu Gln Pro Ser Lys Phe Asp Phe 20 25 <210> 24 <211> 25 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 24 Glu Asp lie Gly Thr lie Arg Ser Phe Phe Asp Ala Asn Met Ala Leu 1 5 10 15 Cys Glu Gln Pro Pro Lys Phe Glu Phe 20 25 <210> 25 <211> 25 <212> P T <213> Hordeum vulgare <400> 25 Glu Asp lie Gly Thr lie Arg Ser Phe Asp Ala Asn Met Ala Leu 1 5 10 15 Cys Glu Gln Pro Pro Lys Phe Glu 20 <210> 26 <211> 25 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 26 Glu Asp lie Gly Thr lie Lys Ser Phe Phe Asp Ala Asn Leu Ala Leu 1 5 10 15 Thr Glu Gln Pro Pro Lys Phe Glu Phe 20 25 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> RTS48-2 Mutante de Zea mays <400> 27 Thr Gln Met Pro Glu Glu Pro Val Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ser lie Arg Lys 20 <210> 28 <211> 20 <212> PRT <213> Zea mays <400> 28 Thr Gln Met Pro Glu Glu Pro Ala Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ser lie Arg Lys 20 <210> 29 <211> 20 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 29 Thr Gln Met Pro Gly Glu Ala Ala Gly Trp Phe Arg Gly Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ala Val Arg Lys 20 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 30 Thr Gln Met Pro Gly Glu Ala Ala Gly Trp Phe Arg Gly Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ala Val Arg Lys 20 <210> 31 <211> 20 <212> PRT <213> Oryza sativa <400? 31 Thr Gln Met Pro Asp Glu Pro Ala Gly Trp Phe Gln Gly Thr Ala Asp 1 5 10 15 Ala lie Arg Lys 20 <210> 32 <211> 18 <212> PRT <213> RTS60-1 Mutante de Zea mays <400> 32 Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Val Phe lie Ser Asp Gly Cys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Glu <210> 33 <211> 18 <212> PRT <213> Zea mays <400> 33 Asp Lys Cys Lys Met Lys Tyr Ala Phe lie Ser Asp Gly Cys Leu Leu 1 5 10 15 Arg Glu <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 34 Asp Lys Cys Arg lie Lys Glu Ala lie lie Ser His Gly Cys Phe Leu 1 5 10 15 Arg Glu <210> 35 <211> 18 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 35 Asp Lys Cys Arg lie Lys Glu Ala lie lie Ser His Gly Cys Phe Leu i 5 10 15 Arg Glu <210> 36 <211> 20 <212 PRT <213> Oryza sativa <400> 36 Asp Lys Cys Lys Cys Lys lie Lys Asp Ala lie lie Ser Asp Gly Cys 1 5 10 15 Ser Phe Ser Glu 20

Claims (29)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un polinucleótido que codifica una proteína muíante para la biosíntesis del almidón vegeíal, o un fragmento biológicameníe acíivo o varianíe de dicha proíeína muíaníe, en donde dicha proíeína muíaníe exhibe esíabilidad incremeníada al calor con relación a la proteína de tipo silvesíre.

2. - El polinucleóíido de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque dicha proíeína muíaníe codificada por dicho polinucleóíido es una subunidad de una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa vegeíal.

3. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracíerizado además porque dicha proíeína muíaníe codificada por dicho polinucleóíido es una subunidad grandes de una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa vegeíal y comprende una mufación de aminoácido en dicha subunidad grande.

4. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha proíeína muíante codificada por dicho polinucleótido es una subunidad pequeña de una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa vegetal y comprende una mutación de aminoácido en dicha subunidad pequeña.

5. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque dicha proteína mutante codificada por dicho polinucleótido comprende una mutación de aminoácido en donde el aminoácido de histidina que corresponde a la posición 333 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre de la ADP-glucosa pirofosforilasa de maíz se reemplaza por un aminoácido que confiere estabilidad incrementada al calor a dicha proteína mutante.

6.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el aminoácido que reemplaza a la histidina en la posición 333 es una glicina.

7.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho aminoácido sustituido por histidina en la posición 333 es una fenilalanina.

8. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque dicho aminoácido sustituido por histidina en la posición 333 es una metionina.

9. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha proteína mutante codificada por dicho polinucleótido comprende adicionalmente una mutación de aminoácido que confiere peso incrementado de la semilla a una planta que expresa dicho polinucleótido.

10. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho polinucleótido comprende la mutación Rev6.

1 1 . - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica una subunidad grande de una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa vegetal en donde al menos un residuo de serina está insertado entre los aminoácidos que corresponden a 494 y 495 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre de la ADP-glucosa pirofosforilasa de maíz.

12. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica una subunidad grandes de una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa vegetal en donde el par de aminoácidos de tirosina:serina está insertado entre los aminoácidos que corresponden a 494 y 495 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre de la ADP-glucosa pirofosforilasa de maíz.

13. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho polinucleótido codifica una subunidad grande de una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa vegetal en donde el par de aminoácidos de serina: tirosina está insertado entre los aminoácidos que corresponden a 495 y 496 en la secuencia de aminoácidos de la subunidad grande de tipo silvestre de la ADP- glucosa pirofosforilasa de maíz.

14. - Un método para incrementar la resistencia de una planta a condiciones de estrés por calor, dicho método comprendiendo la incorporación del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1 dentro del genoma de dicha planta y expresando la proteína codificada por dicha molécula polinucleotídica.

15. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque dicha planta es una planta monocotiledónea.

16. - El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque dicha planta monocotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de arroz, trigo, cebada, avena, sorgo, maíz, lirios, y mijo.

17. - El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha planta es Zea mays o dicho tejido vegetal es a partir de Zea mays.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha planta es una planta dicotiledónea.

19. - El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque dicha planta dicotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de chícharo, alfalfa, garbanzo, achicoria, trébol, col, lenteja, hierba, frijol de soya, tabaco, patata, camote, rábano, repollo, colza, manzanos, y lechuga.

20. - Una planta o tejido vegetal que comprende la molécula polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 1.

21. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque dicha planta o tejido vegetal es de monocotiledónea.

22. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizada además porque dicha planta o tejido vegetal de monocotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de arroz, trigo, cebada, avena, sorgo, maíz, lirios, y mijo.

23. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque dicha planta es Zea mays o dicho tejido vegetal es a partir de Zea mays.

24. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada además porque dicha planta o tejido vegetal es de dicotiledónea.

25. - La planta o tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque dicha planta o tejido vegetal de dicotiledónea se selecciona a partir del grupo que consiste de chícharo, alfalfa, garbanzo, achicoria, trébol, col, lenteja, hierba, frijol de soya, tabaco, patata, camote, rábano, repollo, colza, manzanos, y lechuga.

26. - El tejido vegetal de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque dicho tejido vegetal es una semilla.

27. - Una proteína mulante para la biosíntesis de almidón codificada por el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

28. - Un método para identificar un polinucleótido que codifica una proteína mutante para la biosíntesis del almidón en donde dicha proteína mutante para la biosíntesis del almidón exhibe estabilidad incrementada al calor con relación a una proteína de tipo silvestre, dicho método comprende la mutación de un polinucleótido que codifica una proteína para la biosíntesis del almidón, expresar dicho polinucleótido mutado en una célula para producir una proteína mutante para la biosíntesis del almidón, y determinar si dicha proteína mutante para la biosíntesis del almidón exhibe estabilidad incrementada al calor con relación a la proteína para la biosíntesis de almidón de tipo silvestre.

29.- Un método para incrementar una característica de una planta seleccionada a partir del grupo que consiste de número de semillas, biomasa vegetal, índice de cosecha, peso de la hoja bandera, testas de la semilla, y peso total de la semilla, dicho método comprendiendo la incorporación del polinucleótido de conformidad con la reivindicación 10 dentro del genoma de dicha planta y expresando la proteína codificada por dicha molécula polinucleotídica.