ES2299690T3 - Mutantes termoestables de enzimas de biosintesis de almidon. - Google Patents
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Abstract
Polinucleótido que codifica una subunidad voluminosa mutante de una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) de una planta, o un fragmento biológicamente activo de dicha subunidad, en el que el aminoácido histidina que corresponde al aminoácido histidina en posición 333 en la secuencia aminoácida de una subunidad voluminosa de tipo salvaje de la ADP-glucosa pirofosforilasa del endospermo del maíz es reemplazada por fenilalanina, y en el que, cuando dicha subunidad voluminosa mutante se expresa con una subunidad pequeña de la ADP-glucosa pirofosforilasa para formar una enzima mutante ADP-glucosa pirofosforilasa, dicha enzima mutante muestra un aumento en la termoestabilidad con respecto a una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa de tipo salvaje del endospermo del maíz.
Description
Mutantes termoestables de enzimas de biosóntesis
de almidón.
La naturaleza sésil de la vida vegetal genera
una exposición constante a factores ambientales que ejercen efectos
positivos y negativos sobre el crecimiento y el desarrollo de las
plantas. Uno de los impedimentos mayores con los que se enfrenta la
agricultura moderna son las condiciones adversas del entorno. Un
factor importante que provoca una pérdida significativa de las
cosechas es el estrés al calor. El estrés térmico reduce mayormente
la producción de grano en muchas cosechas de cereales tales como
maíz, trigo y cebada. Esta disminución en la producción es debida a
un estrés térmico del orden de entre el 7 y el 35% en los cereales
de importancia mundial.
Diversos estudios han identificado probablemente
las consecuencias fisiológicas del estrés térmico. El temprano
trabajo de Hunter et al (Hunter, R.B., Tollenaar, M., y
Breuer, C.M.[1977] Can. J. Plant. Sci.
57:1127-1133) que utilizaba condiciones de
crecimiento en un compartimiento cerrado mostró que la temperatura
disminuía la duración del relleno del grano en el maíz. Resultados
similares en los que la duración del relleno del grano fue alterada
adversamente por la elevación de las temperaturas, fueron
identificados por Tollenaar y Bruulsema (Tollenaar, M. y Bruulsema,
T.W. [1988] Can. J. Plant Sci. 68:935-940).
Badu-Apraku et al
(Badu-Apraku, B., Hunter, R.B. y Tollenaar, M [1983]
Can. J. Plant. Sci. 63.357-363) encontraron una
marcada reducción en la producción de plantas de maíz que se
desarrollaron bajo un régimen térmico día/noche de 35/15ºC,
comparadas con las que se desarrollaron bajo un régimen térmico de
25/15ºC. La disminución en los rendimientos debida a las altas
temperaturas está basada asimismo tanto en estudios históricos como
climatológicos (Thompson, L.M. [1986] Agron.
J.78:649-653; Thompson, L.M. [1975]
Science 188:535-541; Chang, J. [1981]
Agricul. Metero., 24:253-262; y Conroy, J.P.
Seneweera, S., Basra, A.S., Rogers, G., y
Nissen-Wooler, B [1994] Aust. J. Plant
Phsysiol 21:741-
758).
758).
Que los procesos fisiológicos de las semillas en
desarrollo están afectadas adversamente por el estrés térmico es
evidente, a partir de estudios que utilizan un sistema in
vitro de cultivo de grano (Jones, R.J., Gengenbach, B.G. y
Cardweel, V.B. [1981] Crop Science
21:761-766; Jones, R.J., Ouattar, S., y Crookston,
R.K. [1984] Crop Science 24: 133-137; y
Cheikh. N., y Jones, R.J. [1995] Physiol. Plant
95:59-66). Los granos de maíz cultivados a la
temperatura óptima antes mencionada de 35ºC mostraron una reducción
importante en el peso.
El trabajo con el trigo identificó la pérdida de
actividad de la sintasa (SSS) soluble del almidón como un
distintivo de la respuesta del endosperma del trigo al estrés
térmico (Hawker, J.S. y Jenner, C.F. [1993] Aust. J. Plant.
Physiol. 20: 197-209; Denyer, K., Hylton,
C.M., y Smith, A.M. [1994] Aust. J. Plant. Physiol.
21:783-789; Jenner, CF. [1994] Aus. J. Plant.,
Physiol. 21: 791-806). Otros estudios con SSS
del endosperma del trigomuestran que es termolábil (Rijven,
A.H.G.C 1986] Plant Physiol 81:448-453; Keeling,
P.L., Bacon, P.J. Holt, D.C. [1993] Planta.
191:342-348; Jenner, C.F., Denyer, K., y Guerin, J.
[1995] Aust. J. Plant. Physiol,
22:703-709).
Los papeles de SSS y de la ADP glucosa
pirofosforilasa (AGP) bajo condiciones de estrés térmico en el maíz
están menos claros. (AGP) cataliza la conversión de ATP y
\alpha-glucosa-1-fosfato
a ADP-glucosa y pirofosfato. La
ADP-glucosa se utiliza como un donador glicosilo en
la biosíntesis del almidón por las plantas y en la biosíntesis del
glucógeno por las bacterias. La importancia de la
ADP-glucosa pirofosforilasa como una enzima clave
en la regulación de la biosíntesis del almidón se apreció en el
estudio de los mutantes deficientes en almidón del endospermo del
maíz (Zea mays) (Tsai, C.Y., y Nelson, Jr., O.E. [1996]
Science 151:341-343; Dickinson, D.B.,
J.Preiss [1969] Plant Physiol.
44:1058-1062).
Ou-Lee y Setter
(Ou-Lee, T. y Setter, T.L. [1985] Plant
Physiol.79: 852-855) examinaron los efectos de
la temperatura sobre las regiones apicales o de la punta de la
mazorca del maíz. Con temperaturas elevadas, la actividad de AGP
fue menor en los granos apicales cuando se comparan con los granos
basales durante el tiempo de depósito intenso del almidón. Al
contrario, en los granos que se desarrollaron a temperaturas
normales, la actividad de AGP fue similar en los granos apicales y
basales durante este período de tiempo. Además, los granos apicales
tratados térmicamente mostraron un aumento fuera de control en la
actividad sintasa del almidón. Esto no se observó con la actividad
de AGP. Singletary et al (Singletary, G.W. Banisadr, R., y
Keeling, P.L.[1993]. Plant Phisiol. 102: 6 (supl);
Singletary, G.W. Banisadra, R., Keeling, P.L. [1994] Aust. J.
Plant Physiol, 21: 829-841) utilizando un
sistema de cultivo in vitro, cuantificaron el efecto de
varias temperaturas durante el período de relleno del grano. El peso
de las semillas disminuyó de modo regular cuando la temperatura
aumentó desde 22 a 36ºC. Un papel para el AGP en la disminución del
rendimiento está sostenido por el trabajo de Duke y Doehlert (Duke,
E.R. y Doehlert, DC [1996], Environ. Exp. Botany.
35:199-208).
El trabajo de Keeling et al. (1944,
supra) cuantificó la actividad de SSS en el maíz y en el
trigo utilizando el análisis de Q_{10}, mostrando que el SSS es
un importante punto de control en el flujo del carbono al
almidón.
Los estudios bioquímicos in vitro con AGP
y SSS muestran claramente que ambas enzimas son termolábiles. El
AGP del endospermo del maíz pierde el 96% de su actividad cuando se
calienta a 57ºC durante cinco minutos (Hannah, L.C., Tuschall, D.M.
y Mans, R.J.[1980] Genetics 95:961-970). Esto
es al revés que en el AGP de la patata, que es completamente
estable a 70ºC (Sowokinos, J.R. y Preiss, J. [1982], Plant
Physiol. 69: 1459-1466; Okita, T.W., Nakata,
P.A., Anderson, J.M. Sowokinos, J., Morell, J., y Preiss, J. [1990]
Plant Physiol 93:785-90). Los estudios de
inactivación térmica con SSS mostraron que es lábil asimismo a
temperaturas más altas, y estudios cinéticos determinaron que el
valor Km para la amilopectina aumentó exponencialmente
cuando la temperatura aumentó de 25 a 45ºC (Jenner et al.,
1995, supra).
Evidencias bioquímicas y genéticas han
identificado AGP como una enzima clave en la biosíntesis del almidón
en las plantas superiores y en la biosíntesis del glucógeno en
E. coli (Preiss, J. y Romeo, T.[1994] Progress in Nuc.
Acid Res. and Mol Biol. 47:299-329; Preiss, J. y
Sivak, M. [1996] "Starch synthesis in sinks and sources", en
Photoassimilate distribution in plants and
crops:source-sink relationships. Zamski, E.,
editores, Marcil Dekker Inc, páginas 139-168). AGP
cataliza lo que se aprecia como la fase inicial en la vía
biosintética del almidón, siendo el producto de la reacción el
donador glucosilo activado, la ADP-glucosa. Éste se
utiliza por la sintasa del almidón para la prolongación del
polímero polisacárido (revisado en Hannah, L. Curtis [1996]
"Starch synthesis in the maize endosperm", en Advances in
Cellular and Molecular Biology of Plants, vol 4. B. A. Larkins
e I.K. Vasil (editores). Biología Molecular y Celular del Desarrollo
de las Semillas Vegetales. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht,
Holanda).
Los estudios iniciales con AGP de la patata
mostraron que la expresión en E. coli producía una enzima
con propiedades cinéticas y alostéricas muy similares a las de la
enzima original del tubérculo (Iglesias, A., Barry, G.F., Meyer,
C., Bloksberg, L., Nakata, P., Greene, T., Laughlin, M.J., Okita,
T.W., Kishore, G.M., y Preiss, J. [1993] J. Biol Chem.
268:1081-86; Ballicora, M.A., Laughlin, M.J., Fu,
Y., Okita, T.W., Barry, G.F., y Preiss, J. [1995] Plant
Physiol. 109:245-251). Greene et al
(Greene, T.W., Chantler, S.E., Kahn, M.L., Barry, G.F,. Preiss J.,
y Okita, T.W.[1996] Proc, Natl. Acad., Sci
93:1509-1513; Greene, T.W., Woodbury, R.L., y
Okita, T.W [1996] Plant Physiol
(112:1315-1320) mostraron la utilidad del sistema de
expresión bacteriano en sus estudios de
estructura-función con la AGP de la patata. Se
identificaron múltiples mutaciones importantes para elaborar los
sitios alostéricos y de unión al substrato (Okita, T.W.,Greene,
T.W., Laughlin, M,J., Salamone, P., Woodbury, R., Choi, S., Ito,
H., Kavakli, H., y Stephens, K. [1996] "Engineering Plant
Starches by the Generation of Modified Plant Biosynthetic
Enzymes", en "Engineering Crops for Industrial End
Uses", Shewry, P.R., Napier, J.A., y Davis, P., editores,
Portland Press Ltd,
Londres).
Londres).
Las enzimas AGP se han aislado tanto de las
bacterias como de las plantas. La AGP bacteriana está formada por
un homotetrámero, mientras que la AGP vegetal de los tejidos
fotosintéticos y no fotosintéticos es un heterotetrámero compuesto
de dos subunidades distintas. La enzima vegetal está codificada por
dos genes distintos, siendo una subunidad más voluminosa que la
otra. Esta característica se ha puesto de manifiesto en diferentes
plantas. Las subunidades de AGP en las hojas de espinaca tienen
pesos moleculares de 54 kDa y 51 kDa, pesos moleculares estimados
mediante SDS-PAGE. Ambas subunidades muestran
inmunoreactividad con anticuerpos producidos contra la AGP
purificada de las hojas de espinaca (Copeland, L., J. Preiss (1981)
Plant Physiol 68:996-1001; Morell, M., M. Bloon,
V.Knowles, J. Preiss (1988) J. Bio. Chem, 263:633). El análisis
inmunológico utilizando antisuero preparado contra las subunidades
grandes y pequeñas de las hojas de la espinaca mostró que la AGP
del tubérculo de la patata también está codificada por dos genes
(Okita et al., 1990, supra). Los clones de ADNc de
las dos subunidades del tubérculo de la patata (50 y 51 kDa) se han
asimismo aislado y secuenciado (Muller-Rober, B.T,
J. Kossmann, L.C. Hannah, L. Willmitzer, U. Sounewald [1990] Mol.
Gen Genet. 224:136-146; Nakata, P.A., T.W.
Greene, J.M. Anderson, B. J. Smith-White, T.W.
Okita, J. Preiss [1991] Plant. Mol.Biol.
17:1089-1093). La subunidad grande de la AGP del
tubérculo de patata es termoestable (Nakata et al. [1991],
supra).
Como postularon Hannah y Nelson (Hannah, L.C.,
O.E. Nelson (1975) Plant Physiol 55:297-302;
Hannah, L.C. y Nelson, Jr, O.E. [1976] Biochem.
Genet.14:547-560), tanto el gen
Shrunken-2 (Sh2) (Bhave, M.R., S. Lawrence,
C. Barton, L.C. Hannah [1990], Plant Cell
2:581-588, como el Brittle-2
(Bt2) (Bae, J.M., M.Giroux, L.C. Hannah [1990], Maydica
35:317-322) son genes estructurales de la
ADP-glucosa pirofosforilasa del endosperma del
maíz. Sh2 y Bt2 codifican, respectivamente, la
subunidad grande y pequeña de la enzima. A partir de la
secuenciación del ADNc, las proteínas Sh2 y Bt2 tienen
pesos moleculares predichos de 57,179 Da (Shaw, J.R., L.C. Hannah
[1992] Plant Physiol 98:1214-1216) y 52,224
Da, respectivamente. El endospermo es el lugar de máximo depósito
del almidón durante el desarrollo del grano en el maíz. Los mutantes
Sh2 y bt2 del endosperma del maíz tienen muy reducidos los
niveles de almidón, lo que se corresponde con los niveles
deficientes de la actividad de la AGP. Se ha mostrado que las
mutaciones de cualquiera de los genes reducen la actividad de la
AGP en aproximadamente un 95% (Tsai y Nelson, 1966, supra;
Dickinson y Preiss, 1969, supra). Además, se ha observado
que las actividades enzimáticas aumentan con la dosis de los alelos
funcionales Sh2 y Bt2 de tipo salvaje, mientras que
las enzimas mutantes poseen propiedades cinéticas alteradas. AGP
constituye la etapa limitadora de la tasa biosintética del almidón
en las plantas. Stark et al situaron una forma mutante de la
AGP de E. coli en el tubérculo de la patata, y obtuvieron un
aumento del 35% en el contenido de almidón (Stark et al
[1992] Science 258:287).
Se ha informado para varias plantas de la
clonación y caracterización de los genes que codifican las
subunidades de la enzima AGP. Estos incluyen ADNc Sh2 (Bhave
et al 1990, supra), ADN genómico Sh2 (Shaw y
Hannah, 1992, supra), y ADNc Bt2 (Bae et al.,
1990, supra) del maíz; ADNc de la subunidad pequeña
(Anderson, J.M., J. Hnilo, R.Larson, T.W. Okita, M.Morell, J. Preiss
[1989] J. Biol. Chem. 264:12238-12242) y el
ADN genómico (Anderson, J.M., R. Larson, D. Landencia, W.T. Kim, D.
Morrow, T.W. Okita, J. Preiss [1991] Gene
97:199-205) del arroz; y los cADN de la unidad
grande y pequeña de las hojas de espinaca (Morell et al,
1998, supra) y del tubérculo de la patata (Muller -Rober
et al 1990, supra; Nakata, P.A., Greene, T.W.,
Anderson, J. W., Smith-White, B.J., Okita, TW., y
Preiss, J. [1991] Plant. Biol. 17:1089-1093).
Además, se aislaron los clones ADNc del endospermo y de los tejidos
de las hojas del trigo (Olive, M.R., R.J. Ellis, W.W. Schuch [1989]
Plant Physiol. Mol. Biol 12:525-538) y las
hojas de Arabidopsis thaliana (Lin, T., Caspar, T.,
Sommerville, C.R. y Preiss, J. [1988] Plant Physiol.
88:1175-1181).
La AGP funciona como una enzima alostérica en
todos los tejidos y organismos que se han investigado hasta la
fecha. Al principio se mostró que las propiedades alostéricas de AGP
eran importantes en E. coli. Se aisló un mutante de E.
coli que mostraba una superproducción de glicógeno, y se elaboró
el mapa de la mutación para el gen estructural de AGP, denominada
glyC. La E. coli mutante, conocida como
glyC-16, se mostró más sensible con respecto
al activador, fructosa 1,6 bifosfato, y menos sensible con respecto
al inhibidor, cAMP (Preiss, J. [1984] Ann. Rev. Microbiol.
419-458). Aunque las AGP vegetales son también
alostéricas, responden a diferentes moléculas efectoras que las AGPs
bacterianas. En las plantas, el ácido
3-fosfoglicérico (3-PGA) funciona
como un activador, mientras que el fosfato (PO_{4}) sirve como un
inhibidor (Dickinson y Preiss, 1969, supra).
Utilizando un sistema de mutagénesis in
vivo creado por la excisión mediada por Ac de un elemento capaz
de transposición localizado fortuitamente cerca de un conocido sitio
de unión al activador, Giroux et al (Giroux, M.J., Shaw, J.,
Barry, G., Cobb, G.B., Greene, T., Olita, T.W. y Hannah, L.C. [1996]
Proc. Natl. Acad. Sci 93:5824-5829) pudieron
generar mutantes puntuales en una región funcionalmente importante
de la AGP del endospermo del maíz. Un mutante,
Rev-6, contenía una inserción
tirosina-serina en la subunidad grande de AGP y
condicionó un aumento del 11-18% en el peso de las
semillas. Además, la solicitud internacional WO 01/64928 publicada
da a conocer que varias características, tales como el número de
semillas, la biomasa vegetal, el Índice Harvest, etc, pueden
aumentarse en plantas transformadas con un polinucleótido que
codifique una subunidad grande de la AGP del maíz que contenga la
mutación Rev6.
El objeto de la invención se refiere a
materiales y procedimientos útiles para mejorar los rendimientos de
las cosechas en las plantas, tales como las que producen las
cosechas de cereales. En una forma de realización, el objeto de la
invención proporciona enzimas AGP termoestables y secuencias
nucleótidas que codifican estas enzimas. En una forma de
realización preferida, las enzimas termoestables de la invención
pueden utilizarse para proporcionar plantas que poseen una mayor
tolerancia a las temperaturas más altas, potenciando de este modo
los rendimientos del cultivo de estas plantas. En una forma de
realización particularmente preferida, la planta que se mejora es
un cereal. Los cereales a los que se aplica esta invención incluyen,
por ejemplo, maíz, trigo, arroz y cebada.
La Figura 1 muestra la alienación primaria de la
secuencia de la región que rodea la mutación HS 33 en las
subunidades grandes de AGP para el maíz, trigo, cebada y patatas.
Las regiones que se conservan están encuadradas.
La SEC ID nº 1 es una secuencia aminoácida de
una región de la subunidad voluminosa de AGP en el maíz, que
contiene la mutación HS 33 tal como se muestra en la Figura 1.
La SEC ID nº 2 es una secuencia aminoácida de
una región de la subunidad voluminosa de AGP en el maíz, tal como
se muestra en la Figura 1.
La SEC ID nº 3 es una secuencia aminoácida de
una región de la subunidad voluminosa de AGP en el trigo, tal como
se muestra en la Figura 1.
La SEC ID nº 4 es una secuencia aminoácida de
una región de la subunidad voluminosa de AGP en la cebada, tal como
se muestra en la Figura 1.
La SEC ID nº 5 es una secuencia aminoácida de
una región de la subunidad voluminosa de AGP en la patata, tal como
se muestra en la Figura 1.
Un polinucleótido según la presente invención
codifica una subunidad voluminosa mutante de una enzima
ADP-glucosa pirofosforilasa (AGP) vegetal, o de un
fragmento biológicamente activo de dicha subunidad, en la que el
aminoácido histidina que corresponde al aminoácido histidina en
posición 333 en la secuencia aminoácida de una subunidad voluminosa
de tipo salvaje de la ADP-glucosa pirofosforilasa
del endospermo del maíz, es sustituida por fenilalanina, y en la
que, cuando dicha subunidad voluminosa mutante se expresa con una
subunidad pequeña de la ADP-glucosa pirofosforilasa
para formar una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa
mutante, dicha enzima mutante muestra un aumento en la
termoestabilidad con respecto a una enzima
ADP-glucosa pirofosforilasa de tipo salvaje del
endospermo del maíz.
En una forma de realización, un polinucleótido
de la presente invención codifica una subunidad voluminosa mutante
de la AGP del maíz que contiene una substitución histidina -a-
fenilalanina en la secuencia del polipéptido. Esta substitución
tiene lugar en el residuo aminoácido número 333, según el número
aceptado de aminoácidos en esta proteína (Shaw y Hannah, 1992,
supra). Este producto se identifica en la presente memoria
como HS33F.
\newpage
A causa de la homología de los polipéptidos de
AGP entre varias especies de plantas (Smith-White y
Preiss [1992] J. Mol. Evol. 34:449-464), el
habitual experto en la técnica puede determinar fácilmente la
posición correspondiente de las mutaciones de AGP para el maíz que
se ejemplifican en la presente memoria en la AGP de plantas
distintas al maíz. Por ejemplo, la Figura 1 muestra la alineación
primaria de la secuencia para la región que se encuentra alrededor
de las mutaciones HS 33 del maíz en el trigo, cebada y patata. De
este modo, la presente invención abarca polinucleótidos que
codifican la AGP mutante de las plantas distintas al maíz, que
incluye, pero no se limitan al trigo, cebada y arroz, que confiere
un aumento en la termoestabilidad cuando se expresa en la
planta.
Los clones ADNc para las subunidades de la AGP
del endospermo del maíz (SH2 y BT2) y una cepa de E. coli
deficiente en la AGP endógena bacteriana (glgC')
(AC70Rl-504 han facilitado el establecimiento de un
sistema bacteriano de expresión para estudiar la AGP del endospermo
del maíz. La expresión de una única subunidad no puede complementar
el mutante glgC', no produciéndose glucógeno (Iglesias et
al [1993] J. Biol Chem. 268:1081-86).
Sin embargo, la expresión de las subunidades tanto voluminosas como
pequeñas sobre los vectores de expresión compatibles, complementa
totalmente la mutación glg C^{-} y restaura la producción
de glicógeno, tal como se evidencia por la tinción
rojizo-castaño oscura de las colonias expuestas al
yodo. Así, la complementación se identifica fácilmente exponiendo
simplemente las colonias al yodo.
En una forma de realización, se utilizaron las
células E. coli glgC^{-} que expresan los genes
estructurales para la AGP del endospermo de la patata o del maíz.
Las células que contenían los genes AGP de la patata pudieron
sintetizar niveles elevados de glicógeno cuando se desarrollaron a
37ºC o a 42ºC. Sin embargo, las células que expresan la AGP del
endospermo del maíz, sólo sintetizan glicógeno a 37ºC. Este
resultado demuestra la termosensibilidad de la AGP de tipo salvaje
del endospermo de maíz. Que exista una diferencia entre las AGP de
la patata y del maíz, a este respecto, proporciona un sistema
eficiente para rastrear las células mutantes que tienen variantes
termoestables de la AGP del endospermo del maíz.
Asimismo, se describen enzimas mutantes
biosintéticos del almidón tal como AGP, y los polinucleótidos que
los codifican, donde estos enzimas mutantes son aislados
seleccionando mutantes termosensibles (TS) que son sometidos
entonces a mutagénesis y rastreados con respecto a los que muestran
reversión y muestran una estabilidad potenciada. También se dan a
conocer procedimientos para producir e identificar los
polinucleótidos y las enzimas mutantes codificadas por éstos.
Asimismo, son útiles los mutantes de AGP
termoestables que tienen mutaciones en la subunidad pequeña de la
enzima. Asimismo, se dan a conocer polinucleótidos que codifican las
subunidades de AGP mutantes pequeñas. Las mutaciones en la
subunidad pequeña de AGP que confieren estabilidad térmica a la
enzima pueden prepararse también fácilmente e identificarse
utilizando los procedimientos que se describen en la presente
memoria.
La presente invención contempla asimismo las
variantes de plantas y de los tejidos de éstas que contienen o
están transformadas por los polinucleótidos mutantes de la
invención, y que expresan los polipéptidos codificados por los
polinucleótidos. Las plantas y los tejidos de éstas que expresan los
polinucleótidos mutantes producen tejidos que tienen, por ejemplo,
menores pérdidas termo inducidas en el peso o en el rendimiento
cuando se someten durante el desarrollo a estrés térmico. Las
plantas que forman parte del alcance de la presente invención
incluyen plantas monocotiledóneas tales como arroz, trigo, cebada,
avena, sorgo, maíz, liliáceas, mijo, siendo también útiles plantas
dicotiledóneas tales como guisantes, alfalfa, garbanzos, achicoria,
trébol, col rizada, lentejas, pastos de la pradera, soja, tabaco,
patatas, boniatos, rábanos, coles, colza, manzanas y lechugas. En
una forma de realización particularmente preferida, la planta es un
cereal. Los cereales a los que la presente invención se aplica
incluyen, por ejemplo, maíz, trigo, arroz, cebada, avena, centeno y
mijo.
Las plantas que tienen polinucleótidos mutantes
de la invención pueden desarrollarse a partir de semillas que
incluyen un gen mutante en su genoma. Además, los procedimientos
para transformar las plantas con un gen son conocidas en la
técnica.
A causa de la degeneración del código genético,
distintas secuencias polinucléotidas pueden codificar cada uno de
los varios polipéptidos AGP que se dan a conocer en esta memoria.
Además, compete a cada experto en la materia crear secuencias
polinucleótidas alternativas que codifiquen los mismos o
esencialmente los mismos polipéptidos del objeto de la invención.
Tal como se utiliza en la presente memoria, las referencias a las
secuencias "esencialmente las mismos", se refiere a secuencias
que codifican substituciones aminoácidas, deleciones, adiciones o
inserciones que no alteren materialmente la actividad funcional del
polipéptido codificado por el polinucleótido mutante AGP que se
describe en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
términos "ácido nucleico" y "secuencia polinucleótida" se
refieren a polímeros desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos en
forma mono o bicatenaria, y si no se limita de otro modo, abarcará
análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de
forma similar como nucleótidos que se encuentren de modo natural.
Las secuencias polinucleótidas incluyen tanto la secuencia de la
hebra del ADN que es transcrita en el ARN, como la secuencia del ARN
que se traslada a la proteína. Las secuencias polinucléotidas
incluyen tanto secuencias con una longitud completa como secuencias
más cortas derivadas de aquéllas. Se entiende que una secuencia
polinucleótida particular incluya los codones degenerados de la
secuencia original o las secuencias que pueden introducirse para
proporcionar preferencia de codón en una célula huésped específica.
También son útiles las variaciones alélicas de las secuencias que
sirven de ejemplo. Asimismo, se describen secuencias
polinucléotidas que hibridizan específicamente las secuencias
ejemplares. El polinucleótido incluye tanto las hebras con sentido
como las antisentido como hebras individuales o en el duplex.
También puede utilizarse la substitución de
aminoácidos distintos que los que se han puesto como ejemplo
específicamente en los mutantes que se han dado a conocer en la
presente memoria. Los aminoácidos pueden adscribirse a los tipos
siguientes: no-polares, polares no cargados,
básicos, y ácidos. Las substituciones conservadoras por las que un
polipéptido AGP mutante que tiene un aminoácido de un tipo, es
reemplazado con otro aminoácido del mismo tipo, pueden ser también
útiles, siempre que el polipéptido AGP mutante que posee la
substitución conserve aumentada la estabilidad térmica con respecto
a un polipéptido de tipo salvaje. La tabla 2 proporciona a
continuación un listado de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a
cada tipo.
\vskip1.000000\baselineskip
Pueden también ser útiles las substituciones
aminoácidas en posiciones distintas que el sitio de la mutación
termoestable, siempre que el polipéptido conserve aumentada la
estabilidad térmica con respecto a los polipéptidos de tipo
salvaje.
El objeto de la invención se refiere asimismo a
polinucleótidos que codifican fragmentos del polipéptido mutante de
longitud total, siempre que los fragmentos conserven
substancialmente la misma actividad funcional que el polipéptido de
longitud total. Los fragmentos del polipéptido AGP mutante
codificado por estos polinucleótidos forman parte también del
alcance de la presente invención.
También se describen moléculas polinucléotidas
que codifican enzimas de la biosíntesis del almidón que tienen
secuencias que son suficientemente homólogas con la secuencia de
tipo salvaje como para permitir la hibridización con aquélla
secuencia que se encuentre bajo condiciones estándar de alto rigor.
Dichas condiciones de hibridización son convencionales en la
técnica (véase, por ejemplo, Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook
[1989] Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
Las moléculas polinucleótidas objeto de la
invención pueden utilizarse para transformar plantas para expresar
la enzima mutante termoestable en dichas plantas. Además, los
polinucleótidos objeto de la invención pueden utilizarse para
expresar la enzima variante recombinante. Pueden utilizarse asimismo
como sonda para detectar enzimas relacionadas. Los polinucleótidos
también pueden utilizarse como estándares para determinar el tamaño
del ADN.
Las moléculas del polinucleótido objeto de la
invención incluyen también los polinucleótidos que codifican las
enzimas biosintéticas del almidón, tales como las enzimas AGP, que
contienen mutaciones que pueden conferir un aumento del peso de las
semillas además de potenciar la estabilidad térmica, para una planta
que exprese estos mutantes. En la presente invención, se contempla
específicamente la combinación de una mutación termoestabilizante
tal como por ejemplo HS 33, con una mutación que confiera un
aumento en el peso de las semillas, por ejemplo, Rev 6, en un
polinucleótido que codifique la subunidad voluminosa de la AGP del
maíz. Las patentes US nº 5.589.618 y nº 5.650.557 dan a
conocer unos polinucleótidos (por ejemplo, Rev6) que
codifican mutaciones en la subunidad voluminosa de AGP que
confieren un aumento en el peso de las semillas, en las plantas que
expresan el polipéptido mutante.
Las mutaciones en las subunidades AGP que
confieren estabilidad térmica pueden combinarse según el objeto de
la invención con mutantes de maíz insensibles al fosfato, tales como
la mutación Rev6, para potenciar la estabilidad de la
subunidad voluminosa codificada por Rev6.
Se espera que la actividad enzimática de SSS se
verá afectada a temperaturas superiores que las observadas con AGP.
Así, unas formas mutagenizadas de SSS pueden expresarse bajo
condiciones de aumento térmico (42ºC), para aislar variantes
termoestables según los procedimientos que se han descrito en la
presente memoria. Estas formas mutagenizadas termoestables de SSS,
y los polinucleótidos que las codifican, constituyen otros aspectos
del objeto de la invención.
El objeto de la invención se refiere asimismo a
procedimientos para aumentar las características del rendimiento de
las plantas bajo condiciones de estrés térmico, incorporando un
polinucleótido de la presente invención que comprende una mutación
en una enzima biosintética del almidón que confieren un aumento en
la estabilidad o resistencia en condiciones de estrés térmico y una
mutación que confiere un aumento en las características del
rendimiento en las plantas. Estas características del rendimiento en
la planta incluyen, por ejemplo, un aumento en el número de
semillas, un aumento en el peso de las semillas, un aumento en la
biomasa de la planta y un aumento en el Índice Harvest.
Asimismo, se dan a conocer procedimientos para
producir e identificar polinucleótidos y polipéptidos que se
contemplan en el alcance de la invención. En una forma de
realización, la mutación génica, seguida por la selección,
utilizando un sistema de expresión bacteriano, puede utilizarse para
aislar moléculas polinucleótidas que codifican enzimas que pueden
aliviar la pérdida termoinducida en la síntesis del almidón en las
plantas.
El siguiente ejemplo muestra unos procedimientos
para llevar a cabo la invención. Este ejemplo no se considera como
limitativo. La totalidad de los porcentajes se expresan en peso y
todas las proporciones de las mezclas de disolventes se expresan
en volumen si no se especifica lo contrario.
Ejemplo
Para preparar mutantes en los que cada uno de
los 20 aminoácidos distintos se insertará, individualmente, en la
posición 333 de la subunidad voluminosa de la AGP del endospermo del
maíz, se utilizó un procedimiento en dos etapas. Las metodologías
se derivaron básicamente de las de Stratagen. En primer lugar, el
codón que codifica el aminoácido 333, más la primera base del codón
para el aminoácido 334, se eliminaron mediante mutagénesis puntual
basada en PCR (Suzuki et al., 1989, en ``Introduction to
genetic analysis, Freeman, NY, 4ª edición, páginas
475-9). Después del rastreo respecto a la
inactividad, mediante tinción con yodo y subsiguiente secuenciación
para verificar la deleción, el plásmido resultante se sometió a
mutagénesis mediante PCR utilizando un cebador que contenía bases
al azar en el codón 333 más la base de reemplazo en la primera base
del codón para el aminoácido 334. Los plásmidos resultantes se
transformaron en células mutantes de E. coli que contenían
Bt2, se rastrearon mediante tinción de yodo con respecto a
la actividad a 37º y 42ºC, secuenciándose a continuación. Los
cebadores de menor degeneración se utilizaron en los estadios más
tardíos, para generar codones que no se obtuvieron en la primera
ronda de modo más eficiente.
La totalidad de las substituciones de los 20
aminoácidos se aislaron después de la mutagénesis y todas dieron
lugar a una tinción a 37ºC. Los mutantes se clasificaron también por
la tinción con el yodo a la temperatura elevada de 42ºC. Se
utilizaron cepas codificadas para eliminar cualquier posible
parcialidad por parte de los investigadores. Los mutantes que
dieron lugar a una tinción igual o superior a la del tipo salvaje
cuando se desarrollaron a 42ºC, se listan a continuación en la
Tabla 3.
Tal como se esperaba, el rastreo identificó
enzimas activas que tenían en la posición 333 de la proteína el
aminoácido de tipo salvaje, es decir, histidina, o el aminoácido del
mutante HS 33, es decir, tirosina. La fenialanina, que difiere de
la tirosina sólo por la ausencia de un grupo hidroxilo polar,
también fue identificada.
Se midieron también las actividades de AGP antes
y después del tratamiento de preparaciones enzimáticas recién
extraídas a 65º durante 5 minutos, mostrándose los resultados en la
Tabla 3.
De los aminoácidos seleccionados mediante placas
de E. coli teñidas positivamente que se habían desarrollado
a 42ºC, los mutantes HS 33 y HS 33F, (que tenían tirosina y
fenilalanina en posición 333, respectivamente), demostraron una
actividad superior en los ensayos enzimáticos después del
tratamiento térmico a 65ºC. Aunque las actividades de AGP de las
AGP que contenían fenilalanina son algo superiores que las
condicionadas por la substitución de la tirosina, las diferencias
en la actividad entre estas preparaciones son pequeñas.
\vskip1.000000\baselineskip
Según el objeto de la invención, las mutaciones
termoestables pueden combinarse con una mutación asociada con un
aumento en el peso de las semillas, tal como, por ejemplo, la
mutación Rev6. El objetivo es mantener la insensibilidad
deseada al fosfato característica de Rev6, mientras se
potencia su estabilidad. Los mutantes dobles Rev 6/HS pueden
construirse y confirmarse tal como se describe en la presente
memoria. Los mutantes dobles pueden transformarse a
AC7OR1-504 que lleva la subunidad pequeña del tipo
salvaje. El aumento en la termoestabilidad puede identificarse
fácilmente mediante una tinción positiva de glicógeno en un medio
bajo en glucosa. Rev6 no se tiñe cuando se desarrolla en este
medio. Inicialmente, todas las combinaciones mutantes pueden
rastrearse enzimáticamente con respecto al mantenimiento de la
insensibilidad al fosfato, y sólo combinaciones que mantengan la
insensibilidad al fosfato se analizan ulteriormente.
Una cepa glg A^{-} de E. coli
deficiente en la sintasa endógena del glicógeno bacteriano puede
obtenerse a partir del Centro Stok de E. coli. Los vectores
bacterianos de expresión que se utilizan habitualmente para la
expresión de AGP pueden emplearse para la expresión de SSS.
Una estrategia de clonación, tal como se
utiliza, por ejemplo, con Sh2 y Bt2 (Giroux et
al, 1996, supra) es la siguiente: Un cebador contiene un
único sitio de restricción más el extremo 5' del transcrito,
mientras el otro cebador contiene otro único sitio de restricción y
secuencias 3' para el codón de finalización traduccional del gen
que se investiga. La clonación subsiguiente de éstos da lugar a una
fusión traduccional en el interior del plásmido. Estos cebadores
génicos específicos se utilizan inicialmente en reacciones
RT-PCR que utilizan poly A+ARN de los endospermos
que se están desarrollando.
La expresión del SSS I del endosperma del maíz
complementará la falta de actividad sintasa glicogénica en la cepa
glgA^{-}. La complementación deberá ser visualizada
fácilmente mediante tinción con yodo como lo es con la expresión de
AGP en la cepa glgC'. Pueden incubarse extractos en bruto a
diversas temperaturas y tiempos para determinar la estabilidad
térmica de SSS I. La cepa glgA^{-} que expresa el SSS I del
endospermo del maíz puede desarrollarse a distintas temperaturas
para determinar si la función es sensible a la temperatura como lo
es con el sistema de expresión bacteriana de AGP. Una vez
establecida una temperatura de restricción, puede llevarse a cabo
una mutagénesis al azar con el clon SSS I. Las formas mutantes de
SSS I pueden transformarse en la cepa glg A^{-}
desarrollada a la temperatura de restricción y las variantes
termoestables identificadas por su capacidad para producir glicógeno
que tiña yodo, a las temperaturas de restricción.
<110> University of Florida Research
Foundation, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mutantes termoestables de enzimas de
biosíntesis de almidón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> UF-178AXC2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 09/312.433
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/085.460
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-05-14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/972.545
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-11-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/031.045
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1996-11-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mutante de HS 33 Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Triticum aestivum
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hordeum vulgare
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Solanum tuberosum
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (14)
1. Polinucleótido que codifica una subunidad
voluminosa mutante de una enzima ADP-glucosa
pirofosforilasa (AGP) de una planta, o un fragmento biológicamente
activo de dicha subunidad, en el que el aminoácido histidina que
corresponde al aminoácido histidina en posición 333 en la secuencia
aminoácida de una subunidad voluminosa de tipo salvaje de la
ADP-glucosa pirofosforilasa del endospermo del maíz
es reemplazada por fenilalanina, y en el que, cuando dicha
subunidad voluminosa mutante se expresa con una subunidad pequeña de
la ADP-glucosa pirofosforilasa para formar una
enzima mutante ADP-glucosa pirofosforilasa, dicha
enzima mutante muestra un aumento en la termoestabilidad con
respecto a una enzima ADP-glucosa pirofosforilasa de
tipo salvaje del endospermo del maíz.
2. Polinucleótido según la reivindicación 1, en
el que la subunidad voluminosa mutante es AGP del maíz.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el mutante conserva una actividad entre el 8 y el 59%
cuando se sitúa en células de E. coli que expresan la
subunidad BT2 y se desarrolla a 60ºC durante 5 minutos.
4. Polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la subunidad voluminosa
mutante comprende además una mutación aminoácida que confiere un
aumento en el peso de las semillas en una planta que expresa el
polinucleótido.
5. Polinucleótido según la reivindicación 4, en
el que la otra mutación comprende la mutación Rev6.
6. Polinucleótido según la reivindicación 4, en
el que por lo menos un residuo de serina se inserta entre los
aminoácidos que corresponden al 494 y 495 en dicha secuencia
aminoácida.
7. Polinucleótido según la reivindicación 4, en
el que la tirosina:serina se inserta entre los aminoácidos que
corresponden al 494 y 495, la serina:tirosina se inserta entre los
aminoácidos que corresponden al 495 y 496, en dicha secuencia
aminoácida.
8. Procedimiento para aumentar la resistencia de
una planta a las condiciones de termoestrés, que comprende la
incorporación de un polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores al genoma de la planta, y la expresión
de la proteína codificada por el polinucleótido.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la planta es monocotiledónea, por ejemplo arroz, trigo,
cebada, sorgo, maíz, liliáceas o mijo.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la planta es Zea mays o el tejido de la planta es de
Zea mays.
11. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que la planta es dicotiledónea, por ejemplo guisantes, alfalfa,
garbanzos, achicoria, trébol, col rizada, lentejas, pastos de la
pradera, soja, tabaco, patatas, boniatos, rábanos, coles, colza,
manzanas o lechuga.
12. Planta o tejido vegetal que comprende un
polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. Planta o tejido vegetal según la
reivindicación 12, que es tal como se define en cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11.
14. Proteína mutante de la biosíntesis del
almidón codificada por el polinucleótido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7.
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