JP4310194B2 - デンプン生合成酵素の熱安定変異体 - Google Patents
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Description
本出願は、1997年11月18日に提出された同時係属中の米国特許出願第08/972,545号、現在は米国特許第6,069,300号の一部継続出願である1999年5月14日に提出された同時係属中の米国特許出願第09/312,433号の一部継続出願である。本出願はまた、1998年5月14日に提出された米国特許出願第60,085,460号および1996年11月18日に提出された米国特許出願第60/031,045号からの優先権を主張する。
植物生命体は固着であるという性質のために、植物の生長および発育に対して正および負の影響を及ぼす環境要因に絶えず曝露されている。近代農業が直面する主要な障害の一つは、有害な環境条件である。有意な作物の損失を引き起こす一つの重要な要因は、熱ストレスである。温度ストレスはトウモロコシ、小麦、およびオオムギのような多くの穀物の穀粒収量を大きく減少させる。熱ストレスによる収量の減少は世界的に重要な穀類の7〜35%に及ぶ。
本発明は、穀類を生じる植物のような植物における作物の収量を改善するために有用な材料および方法に関する。一つの態様において、本発明は、熱に安定なAGP酵素とこれらの酵素をコードするヌクレオチド配列とを提供する。好ましい態様において、本発明の熱に安定な酵素を用いて、より高温に対してより抵抗性を有し、このようにこれらの植物からの作物の収量が増加した植物を提供することができる。特定の好ましい態様において、改善された植物は穀類である。本発明が適用される穀類には、例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、およびオオムギが含まれる。
本発明は、野生型遺伝子型を有する植物と比較して、熱ストレスの条件下で生育した植物において収量の増加を付与する新規変異体ポリヌクレオチド分子、およびそれによってコードされるポリペプチドに関する。特定の態様において、本発明のポリヌクレオチド分子は、トウモロコシの内胚葉ADPグルコースピロホスホリラーゼ(AGP)と可溶性デンプンシンターゼ(SSS)酵素活性をコードする。変異体酵素は、野生型酵素活性と比較して、酵素を発現する種子および植物組織において種子および植物の生育の際の熱ストレス条件に対する安定性の増加を付与する。
大サブユニット発現プラスミドのランダム変異誘発のために、最初に、化学変異誘発物質である塩酸ヒドロキシルアミンを用いた。ヒドロキシルアミンは、シトシンのC-4位のアミノ窒素を選択的にヒドロキシル化して、GCからATへの転移(transition)に至る(Suzuki, D.T., Griffith, A.J.F., Miller, J.H.,およびLewontin, R.C.[1989]、「Introduction to genetic analysis」、フリーマン(Freeman)、ニューヨーク、第4版、475〜499)。化学変異誘発物質は、その高い変異頻度のために選択した。化学変異誘発物質の限界は認識されており、非常に多様な遺伝子変種が単離されなければ、PCRに基づくランダム変異誘発を行うことができる。PCR変異誘発は、類似の転移および転換(transversion)頻度を含む、より広い範囲の変異を生成し、化学法の優れた代用法となる。CadwellおよびJoyce(Cadwell, R.C.,およびJoyce, G.F.[1992]、PCR Methods and Applications 2:28〜33)が概説した方法は、PCRに基づく方法において従うことができる。
最初に、トウモロコシ内胚葉大サブユニットの熱安定変種11個を得た。デュポン(DuPont)およびABIの機器を用いてシークエンシングを行った。配列データは、前駆体野生型対立遺伝子と日常的に比較することができる。この分析は、熱安定性の条件を調べる変化の多様性の程度を明らかにする。
大腸菌における野生型トウモロコシ内胚葉AGPの発現に関する条件は、十分に特徴が調べられている。最適な増殖および誘導条件は、大腸菌において発現されたジャガイモAGPに関して既に公表された条件とは幾分異なる(Iglesiasら、1993、上記;Ballicoraら、1995、上記)。0.3 mM IPTGおよび25 μg/mlナリジクス酸の存在下で室温で12〜14時間誘導すると、高レベルの発現および活性を一貫して生じる。30%硫酸アンモニウムおよび10 mM KH2PO4 -/K2HPO4 -を抽出緩衝液に加えると、粗抽出物におけるトウモロコシAGPが安定化する。
トウモロコシ内胚葉AGP変異体の完全に予想外の多面発現作用は、熱処理前の活性の2〜3倍上昇である。この結果について考えられる一つの説明は、変異による変化によって、大腸菌細胞内に存在するSH2およびBT2のモノマーとポリマーの割合がシフトしたということである。おそらく、野生型において、活性なヘテロ四量体型で存在するのは総タンパク質の10%またはそれ未満に過ぎないが、変異体では、この割合ははるかに高い。ポリマーがモノマーより熱に抵抗性であれば、変異体の表現型は、観察された表現型と同一であろう。速度論分析を用いて基質および/またはアロステリックエフェクターに対する親和性の変化を決定することができる。
単離された大サブユニット変異体はその熱安定性特徴が多様であり、多数の変異の可能性を示唆している。変異体HS 33およびHS 40の配列分析から、変異体配列が同一ではないことが判明したが、双方の変異体は、同一のヒスチジンからチロシンへの変化を含んだ。SH2タンパク質内で異なるHS変化が同定されれば、これらの変化を一つのタンパク質へと効率よく積み重ねてゆくことが可能であろう。さらに、小サブユニット内の如何なるHS変異もHS SH2変異体において同時発現されて、トウモロコシ内胚葉酵素の安定性をさらに増強することができる。
塩酸ヒドロキシルアミン変異誘発は、シトシンからチミンへの変化のみを生じ、それによって起こりうる置換のタイプを制限する。DNAの双方の鎖が変異誘発を受けることから、チミンからシトシンへの変化も同様に起こる;しかし、併せても、起こりうる一塩基変化12個中2個が起こるに過ぎない。したがって、必ずしも全ての起こりうるアミノ酸置換が塩酸ヒドロキシルアミン変異誘発によって産生されないであろう。
本発明に従って、熱安定変異を、例えばRev6変異のような種子重量の増加に関連した変異と組み合わせることができる。目標は、その安定性を増強しながらRev6の所望のリン酸塩不応性特徴を維持することである。Rev6/HS二重変異体を構築して、本明細書に記述のように確認することができる。野生型小サブユニットを有するAC70R1-504に、二重変異体を形質転換することができる。熱安定性の増加は、低グルコース培地上でのグリコーゲン染色陽性によって容易に同定することができる。Rev6をこの培地上で増殖させても染色されない。当初、全ての変異体の組み合わせをリン酸塩不応性の維持に関して酵素的にスクリーニングして、リン酸塩不応性を維持する組み合わせのみをさらに分析する。
内因性の細菌グリコーゲンシンターゼを欠損するglg A-大腸菌株は、大腸菌ストックセンターから得ることができる。AGPの発現のために現在用いられる細菌発現ベクターを、SSSの発現のために用いることができる。
安定性の増加したさらなる変種を同定するもう一つのアプローチとして、リバース遺伝学アプローチを用いた。温度感受性(TS)変異体は単離されている。これらの変異体は30℃でヨウ素染色表現型陰性を示し、トウモロコシ内胚葉AGPの機能が欠損することを示している。対照的に、変異体を37℃で増殖させると、それらは、細菌AGPにおける変異を完全に補足することができる。これは明らかに、変異体AGPsが機能的であること、そして機能喪失が温度依存的であることを示している。野生型AGPは、30℃および37℃でグリコーゲン染色陽性表現型陽性を示す。次に、温度感受性変異体を用いて、安定性の増強を有する変異体AGPをコードする第二の部位の復帰変異体を作製した。
pSh2 DNAにヒドロキシルアミン変異誘発を行い(Greene, T.W., Chantler, S.E., Kahn, M.L., Barry, G.F., Preiss, J.,およびOkita, T.W.[1996]Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1509〜1513)、野生型pBt2小サブユニットプラスミドを有するAC70R1-504大腸菌細胞に形質転換した。細胞を播種して30℃で増殖させた。AGPの温度感受性変種は、30℃でのヨウ素染色陰性表現型によって同定した。推定の変異体を対照としての野生型AGPと共に30℃および37℃で再度線条培養した。30℃で一貫してヨウ素陰性表現型を示し、37℃でヨウ素染色陽性表現型を示す変異体6個を単離した。野生型Sh2およびBt2の発現は、双方の温度でヨウ素染色陽性表現型を示した。
二つの温度感受性変異体TS 48およびTS 60からのプラスミドDNAを単離およびシークエンシングして、遺伝子病変を同定した。アミノ酸426位のロイシンのフェニルアラニンへの置換を生じる点突然変異1個が同定された(図4A)。この残基および周辺の領域は穀類の内胚葉大サブユニット(LS)において高度に保存されている(Smith-WhiteおよびPreiss、1992、上記)。TS 60において、アミノ酸324位でグルタミン酸からリジンへの変化、および359位でアラニンからバリンへの変異を生じる二つの点突然変異が同定された(図4B)。324位のグリシンは、AGPのLSおよび小(SS)サブユニットにおいて高度に保存されている(Smith-WhiteおよびPreiss、1992、上記)。359位のアラニンおよび周辺のアミノ酸も同様にAGP LSにおいて高度に保存されている。重要なことは、TS 60において同定された二つの変異は、本明細書において記述したHS 33変異に隣接している点である。333位でヒスチジンからチロシンへの置換を有するHS 33変異は、トウモロコシ内胚葉AGPの熱安定性を大きく増強することが示された。TS 60の変異がHS 33変異に極めて近位であるということは、タンパク質のこの領域が安定性にとって重要であることのさらなる証拠である。
温度感受性変異体の単離は、AGPの安定性を増強するさらなる変種を単離するための選択的な表現型を提供する。TS 48およびTS 60 DNAに関してさらなるヒドロキシルアミン変異誘発を行って、30℃でグリコーゲン染色陽性表現型を回復する第二の部位の復帰変異体を単離した。ヒドロキシルアミンは、変異誘発の化学によって、TS 48およびTS 60変異体において同定された一次変異の直接復帰変異の可能性がないことから用いた。これによって、これらの温度感受性変異体における安定性を回復することができる第二の部位の変異を選択することができる。
(配列番号:1)図2に示されるHS33変異を含むトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:2)図2に示されるトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:3)図2に示されるコムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:4)図2に示されるオオムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:5)図2に示されるジャガイモにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:6)図3に示されるHS40変異を含むトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:7)図3に示されるトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:8)図3に示されるコムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:9)図3に示されるオオムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:10)図3に示されるジャガイモにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:11)図3に示されるほうれん草におけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:12)図4Aに示されるTS48変異を含むトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:13)図4Aに示されるトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:14)図4Aに示されるコムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:15)図4Aに示されるオオムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:16)図4Aに示されるイネにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:17)図4Bに示されるTS60変異を含むトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:18)図4Bに示されるトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:19)図4Bに示されるコムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:20)図4Bに示されるオオムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:21)図4Bに示されるイネにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:22)図4Bに示されるTS60変異を含むトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:23)図4Bに示されるトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:24)図4Bに示されるコムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:25)図4Bに示されるオオムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:26)図4Bに示されるイネにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:27)図5Aに示されるRTS 48-2変異を含むトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:28)図5Aに示されるトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:29)図5Aに示されるコムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:30)図5Aに示されるオオムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:31)図5Aに示されるイネにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:32)図5Bに示されるRTS 60-1変異を含むトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:33)図5Bに示されるトウモロコシにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:34)図5Bに示されるコムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:35)図5Bに示されるオオムギにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
(配列番号:36)図5Bに示されるイネにおけるAGP大サブユニットの領域のアミノ酸配列である。
Claims (41)
- 変異体ポリペプチドが植物のADPグルコースピロホスホリラーゼの小サブユニットと共に発現され、変異体のADPグルコースピロホスホリラーゼ酵素を形成する場合に、該変異体酵素が、野生型のADPグルコースピロホスホリラーゼ酵素と比較して熱安定性の増加を示す、変異体のトウモロコシADPグルコースピロホスホリラーゼポリペプチド大サブユニットをコードする精製ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによってコードされる変異体ポリペプチドがアミノ酸変異を含み、トウモロコシのADPグルコースピロホスホリラーゼポリペプチドの野生型大サブユニットのアミノ酸配列における333位のヒスチジンアミノ酸が、変異体酵素に熱安定性の増加を付与するアミノ酸であるメチオニンに置換されている、精製ポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドによってコードされる変異体ポリペプチドがアミノ酸変異をさらに含み、トウモロコシのADPグルコースピロホスホリラーゼポリペプチドの野生型大サブユニットのアミノ酸配列における460位に対応するトレオニンアミノ酸が、変異体酵素に熱安定性の増加を付与するアミノ酸に置換されている、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 460位でトレオニンを置換するアミノ酸がイソロイシンである、請求項2記載のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドによってコードされる変異体ポリペプチドがアミノ酸変異を含み、トウモロコシのADPグルコースピロホスホリラーゼポリペプチドの野生型大サブユニットのアミノ酸配列における216位に対応するアルギニンアミノ酸が、変異体酵素に熱安定性の増加を付与するアミノ酸に置換されている、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- 216位でアルギニンを置換するアミノ酸がプロリンである、請求項4記載のポリヌクレオチド。
- ポリヌクレオチドによってコードされる変異体ポリペプチドが、該ポリヌクレオチドを発現する植物に種子重量の増加を付与するRev6変異をさらに含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。
- トウモロコシADPグルコースピロホスホリラーゼ酵素の大サブユニットをコードし、トウモロコシの野生型大サブユニットADPグルコースピロホスホリラーゼのアミノ酸配列における494位〜495位に対応するアミノ酸のあいだに少なくとも一つのセリン残基が挿入される、請求項6記載のポリヌクレオチド。
- トウモロコシADPグルコースピロホスホリラーゼ酵素の大サブユニットをコードし、トウモロコシの野生型大サブユニットADPグルコースピロホスホリラーゼのアミノ酸配列における494位〜495位に対応するアミノ酸のあいだにアミノ酸対のチロシン:セリンが挿入される、請求項6記載のポリヌクレオチド。
- トウモロコシADPグルコースピロホスホリラーゼ酵素の大サブユニットをコードし、トウモロコシの野生型大サブユニットADPグルコースピロホスホリラーゼのアミノ酸配列における495位〜496位に対応するアミノ酸のあいだにアミノ酸対のセリン:チロシンが挿入される、請求項6記載のポリヌクレオチド。
- 植物が単子葉植物である、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 単子葉植物が、イネ、コムギ、オオムギ、オート麦、モロコシ、トウモロコシ、ユリ、およびキビからなる群より選択される、請求項10記載のポリヌクレオチド。
- 植物が穀類植物である、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 穀類植物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オート麦、ライ麦、およびキビからなる群より選択される、請求項12記載のポリヌクレオチド。
- 植物がトウモロコシである、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 植物が双子葉植物である、請求項1〜9のいずれか一項記載のポリヌクレオチド。
- 双子葉植物が、エンドウ、アルファルファ、ヒヨコマメ、チコリ、クローバー、ケール、レンズマメ、プレーリーのイネ科植物、大豆、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ラディッシュ、キャベツ、菜種、リンゴの木、およびレタスからなる群より選択される、請求項15記載のポリヌクレオチド。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを植物のゲノムに組み入れる段階、および該ポリヌクレオチド分子によってコードされるタンパク質を発現させる段階を含む、熱ストレス条件に対する植物の抵抗性を増加する方法。
- 植物が単子葉植物である、請求項17記載の方法。
- 単子葉植物が、イネ、コムギ、オオムギ、オート麦、モロコシ、トウモロコシ、ユリ、およびキビからなる群より選択される、請求項18記載の方法。
- 植物が穀類植物である、請求項17記載の方法。
- 作物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オート麦、ライ麦、およびキビからなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 植物がトウモロコシである、請求項17記載の方法。
- 植物が双子葉植物である、請求項17記載の方法。
- 双子葉植物が、エンドウ、アルファルファ、ヒヨコマメ、チコリ、クローバー、ケール、レンズマメ、プレーリーのイネ科植物、大豆、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ラディッシュ、キャベツ、菜種、リンゴの木、およびレタスからなる群より選択される、請求項23記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- 植物が単子葉植物である、請求項25記載の遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- 単子葉植物が、イネ、コムギ、オオムギ、オート麦、モロコシ、トウモロコシ、ユリ、およびキビからなる群より選択される、請求項26記載の遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- 該植物、植物組織または植物種子が穀類植物、穀類植物組織、穀類植物の種子である、請求項25記載の遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- 穀類植物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オート麦、ライ麦、およびキビからなる群より選択される、請求項28記載の遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- トウモロコシの植物種子である、請求項25記載の遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- 植物が双子葉植物である、請求項25記載の遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- 双子葉植物が、エンドウ、アルファルファ、ヒヨコマメ、チコリ、クローバー、ケール、レンズマメ、プレーリーのイネ科植物、大豆、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ラディッシュ、キャベツ、菜種、リンゴの木、およびレタスからなる群より選択される、請求項31記載の遺伝子組換え若しくは形質転換された植物、植物組織、または植物種子。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによってコードされる変異体のトウモロコシADPグルコースピロホスホリラーゼ大サブユニット。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載のポリヌクレオチドによって植物細胞を形質転換する段階、および該形質転換細胞から植物を生育させる段階を含む、熱ストレス条件に対する抵抗性の増加を示す植物を産生する方法。
- 植物が単子葉植物である、請求項34記載の方法。
- 単子葉植物が、イネ、コムギ、オオムギ、オート麦、モロコシ、トウモロコシ、ユリ、およびキビからなる群より選択される、請求項35記載の方法。
- 植物がトウモロコシである、請求項34記載の方法。
- 植物が双子葉植物である、請求項34記載の方法。
- 双子葉植物が、エンドウ、アルファルファ、ヒヨコマメ、チコリ、クローバー、ケール、レンズマメ、プレーリーのイネ科植物、大豆、タバコ、ジャガイモ、サツマイモ、ラディッシュ、キャベツ、菜種、リンゴの木、およびレタスからなる群より選択される、請求項38記載の方法。
- 植物が穀類植物である、請求項34記載の方法。
- 作物が、トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、オート麦、ライ麦、およびキビからなる群より選択される、請求項40記載の方法。
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