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Hintergrund
der Erfindung
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Die
sessile Natur des Pflanzenlebens führt zu einer konstanten Belastung
durch Umweltfaktoren, die positive und negative Einflüsse auf
das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze ausüben. Eines der Haupthindernisse,
die in der modernen Landwirtschaft auftreten, sind nachteilige Umweltbedingungen.
Ein wesentlicher Faktor, der zu erheblichen Ernteverlusten führt, ist
der Hitzestress. Ein Temperaturstress bewirkt bei zahlreichen Getreidepflanzen,
wie Mais, Weizen und Gerste, eine starke Verringerung der Kornausbeute.
Bei Getreidepflanzen, die weltweit von Bedeutung sind, liegen die
Ausbeuteverringerungen aufgrund von Hitzestress im Bereich von 7
bis 35 %.
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Eine
Anzahl von Studien hat wahrscheinliche physiologische Konsequenzen
von Hitzestress identifiziert. Eine frühe Arbeit von Hunter et al.
(R. B. Hunter, M. Tollenaar und C. M. Breuer, Can. J. Plant Sci.,
Bd. 57 (1977), S. 1127–1133)
unter Anwendung von Wachstumskammerbedingungen hat gezeigt, dass
bei Mais eine erhöhte
Temperatur eine Verringerung der Dauer der Kornfüllung bewirkt. Ähnliche
Ergebnisse, bei denen die Dauer der Kornfüllung durch erhöhte Temperaturen
nachteilig beeinflusst wird, wurden von Tollenaar und Bruulsema
identifiziert (M. Tollenaar und T. W. Bruulsema, Can. J. Plant Sci.,
Bd. 68 (1988), S. 935–940).
Badu-Apraku et al. (B. Badu-Apraku, R. B. Hunter und M. Tollenaar,
Can. J. Plant Sci., Bd. 63 (1983), S. 357–363) maßen eine ausgeprägte Verringerung
der Ausbeute an Maispflanzen, die unter Tag/Nacht-Temperaturbedingungen
von 35/15 °C
gezüchtet
worden waren, im Vergleich zu einem Wachstum bei einem 25/15 °C-Temperaturbereich.
Verringerte Erträge
aufgrund von erhöhten
Temperaturen werden auch durch historische und klimatologische Studien
belegt (L. M. Thompson, Agron. J., Bd. 78 (1986), S. 649–653; L.
M. Thompson, Science, Bd. 188 (1975), S. 535–541; J. Chang, Agricul. Metero.,
Bd. 24 (1981), S. 253–262;
und J. P. Conroy, S. Seneweera, A. S. Basra, G. Rogers und B. Nissen-Wooller,
Aust. J. Plant Physiol., Bd. 21 (1994), S. 741–758).
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Die
Tatsache, dass die physiologischen Vorgänge des sich entwickelnden
Samens in nachteiliger Weise durch Hitzestress beeinflusst werden,
ergibt sich aus Studien unter Verwendung eines in vitro-Kornkultursystems
(R. J. Jones, B. G. Gengenbach und V. B. Cardwell, Crop Science,
Bd. 21 (1981), S. 761–766;
R. J. Jones, S. Ouattar und R. K. Crookston, Crop Science, Bd. 24
(1984), S. 133–137;
und N. Cheikh und R. J. Jones, Physiol. Plant, Bd. 95 (1995), S.
59–66).
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Oberhalb
der optimalen Temperatur von 35 °C
gezüchtete
Maiskörner
zeigten eine drastische Gewichtsverringerung.
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Arbeiten
mit Weizen identifizierten den Verlust an löslicher Starke-Synthase (SSS)-Aktivität als prägendes Merkmal
der Reaktion von Weizenendosperm auf Hitzestress (J. S. Hawker und
C. F. Jenner, Aust. J. Plant Physiol., Bd. 20 (1993), S. 197–209; K.
Denver, C. M. Hylton und A. M. Smith, Aust. J. Plant Physiol., Bd. 21
(1994), S. 783–789;
C. F. Jenner, Aust. J. Plant Physiol., Bd. 21 (1994), S. 791–806). Weitere
Studien mit SSS von Weizenendosperm zeigen, dass dieses hitzelabil
ist (A. H. G. C. Rijven, Plant Physiol., Bd. 81 (1986), S. 448–453; P.
L. Keeling, P. J. Bacon, D. C. Holt, Planta, Bd. 191 (1993), S.
342–348;
C. F. Jenner, K. Denver und J. Guerin, Aust. J. Plant Physiol.,
Bd. 22 (1995), S. 703–709).
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Die
Rollen von SSS und ADP-Glucose-pyrophosphorylase (AGP) unter Hitzestress-Bedingungen
bei Mais sind weniger klar. AGP katalysiert die Umwandlung von ATP
und α-Glucose-1-phosphat
zu ADP-Glucose und Pyrophosphat. ADP-Glucose wird als Glycosyl-Donator
von Pflanzen bei der Stärkebiosynthese
und von Bakterien bei der Glycogenbiosynthese verwendet. Die Bedeutung
von ADP-Glucose-pyrophosphorylase als Schlüsselenzym bei der Regulierung
der Stärkebiosynthese
wurde bei einer Studie über
Mutanten mit Stärkemangel
von Mais (Zea mays)-Endosperm festgestellt (C. Y. Tsai und O. E.
Nelson Jr., Science, Bd. 151 (1966), S. 341–343; D. B. Dickinson, J. Preiss,
Plant Physiol., Bd. 44 (1969), S. 1058–1062).
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Ou-Lee
und Setter (T. Ou-Lee und T. L. Setter, Plant Physiol., Bd. 79 (1985),
S. 852–855)
untersuchten die Einflüsse
der Temperatur auf apikale oder Spitzenregionen von Maiskolben.
Bei erhöhten
Temperaturen war die AGP-Aktivität während der
Zeit der intensiven Stärkeablagerung
in apikalen Körnern
größer als
in basalen Körnern.
Im Gegensatz dazu war in bei Normaltemperaturen entwickelten Körnern die
AGP-Aktivität
in apikalen und basalen Körnern
während
dieser Periode ähnlich.
Jedoch wurde die Aktivität
von Stärke-Synthase
während
dieses Zeitraums in apikalen und basalen Körnern nicht differenziell beeinflusst.
Ferner zeigten wärmebehandelte
apikale Körner
eine Zunahme der Stärke-Synthase-Aktivität gegenüber der
Kontrolle. Dies wurde bei der AGP-Aktivität nicht festgestellt. Singletary
et al. (G. W. Singletary, R. Banisadr und P. L. Keeling, Plant Physiol.,
Bd. 102 (1993), (suppl)., S. 6; G. W. Singletary, R. Banisadr und
P. L. Keeling, Aust. J. Plant Physiol., Bd. 21 (1994), S. 829–841) bestimmten
unter Anwendung eines in vitro-Kultursystems den Einfluss verschiedener
Temperaturen während
der Kornfüllungsperiode.
Das Samengewicht nahm mit einer Temperatursteigerung von 22-36 °C stetig
ab. Eine Rolle für
AGP beim Ertragsverlust wird auch durch die Arbeit von Duke und
Doehlert (E. R. Duke und D. C. Doehlert, Environ. Exp. Botany, Bd.
36 (1996), S. 199–208)
gestützt.
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In
der Arbeit von Keeling et al. (1994, a.a.O.) wurde die SSS-Aktivität in Mais
und Weizen unter Anwendung einer Q10-Analyse
quantitativ bestimmt. Es wurde festgestellt, dass SSS einen wichtigen
Kontrollpunkt beim Übergang
von Kohlenstoff zu Stärke
darstellt.
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Biochemische
in vitro-Studien mit AGP und SSS zeigen klar, dass beide Enzyme
hitzelabil sind. Mais-Endosperm-AGP verliert 96 % seiner Aktivität, wenn
es 5 Minuten auf 57 °C
erwärmt
wird (L. C. Hannah, D, M. Tuschall und R. J. Mans, Genetics, Bd.
95 (1980), S. 961–970).
Dies steht im Gegensatz zu Kartoffel-AGP, die bei 70 °C völlig stabil ist (J. R. Sowokinos
und J. Preiss, Plant Physiol., Bd. 69 (1982), S. 1459–1466; T.
W. Okita, P. A. Nakata, J. M. Anderson, J. Sowokinos, J. Morel)
und J. Preiss, Plant Physiol., Bd. 93 (1990), S. 785–790). Hitzeinaktivierungsstudien
mit SSS ergaben, dass diese bei höheren Temperaturen ebenfalls
labil ist, und durch kinetische Studien wurde festgestellt, dass
der Km-Wert für
Amylopectin exponentiell anstieg, wenn die Temperatur von 25 auf
45 °C erhöht wurde
(Jenner et al., 1995, a.a.O.).
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Durch
biochemische und genetische Hinweise wurde AGP als Schlüsselenzym
bei der Stärkebiosynthese
in höheren
Pflanzen und bei der Glycogenbiosynthese in E. coli ermittelt (J.
Preiss und R. Romeo, Progress in Nuc. Acid Res. and Mol Biol., Bd.
47 (1994), S. 299–329;
J. Preiss und M. Sivak, "Starch
synthesis in sinks and sources",
in Photoassimilate distribution in plants and crops:source-sink
relationships, Hrsg. E. Zamski, Marcel Dekker Inc., (1996), S. 139–168). AGP
katalysiert die Stufe, die beim Stärke-Biosyntheseweg als Anfangsstufe
angesehen wird, wobei es sich beim Reaktionsprodukt um den aktivierten
Glucosyl-Donator, nämlich
ADP-Glucose, handelt. Dieser wird von Starke-Synthase für die Erweiterung
des Polysaccharid-Polymeren verwendet (Übersichtsartikel von L. Curtis
Hannah, "Starch
synthesis in the maize endosperm",
in: Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants, Bd. 4,
Hrsg. B. A. Larkins und I. K. Vasil, Cellular and Molecular Biology
of Plant Seed Development, Kluwer Academic Publishers, (1996), Dordrecht,
Niederlande (im Druck)).
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Anfängliche
Studien mit Kartoffel-AGP zeigten, dass die Expression in E. coli
zu einem Enzym mit allosterischen und kinetischen Eigenschaften,
die denen des nativen Knollenenzyms sehr ähnlich waren, führte (A.
Iglesias, G. F. Barry, C. Meyer, L. Bloksberg, P. Nakata, T. Greene,
M. J. Laughlin, T. W. Okita, G. M. Kishore und J. Preiss, J. Biol
Chem., Bd. 268 (1993), S. 1081–1086;
M. A. Ballicora, M. J. Laughlin, Y. Fu, T. W. Okita, G. F. Barry
und J. Preiss, Plant Physiol., Bd. 109 (1995), S. 245–251). Greene
et al. (T. W. Greene, S. E. Chantler, M. L. Kahn, G. F. Barry, J.
Preiss und T. W. Okita, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 93 (1996), S.
1509–1513;
T. W. Greene, R. L. Woodbury und T. W. Okita, Plant Physiol., (1996b)
(im Druck)) zeigten in ihren Struktur-Funktions-Studien mit Kartoffel-AGP
die Eignung des bakteriellen Expressionssystems. Multiple Mutationen,
die bei der Kartierung von allosterischen und Substrat-Bindungsstellen von
Bedeutung sind, wurden identifiziert (T. W. Okita, T. W. Greene,
M. J. Laughlin, P. Salamone, R. Woodbury, S. Choi, H. Ito, H. Kavakli
und K. Stephens, "Engineering
Plant Starches by the Generation of Modified Plant Biosynthetic
Enzymes", in Engineering
Crops for Industrial End Uses, Hrsg. P. R. Shewry, J. A. Napier
und P. Davis, Portland Press Ltd., (1996), London (im Druck)).
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AGP-Enzyme
wurden sowohl aus Bakterien als auch aus Pflanzen isoliert. Bakterielle
AGP besteht aus einem Homotetrameren, während es sich bei Pflanzen-AGP
aus photosynthetischen und nicht-photosynthetischen Geweben um ein
Heterotetrameres aus zwei verschiedenen Untereinheiten handelt.
Das Pflanzenenzym wird durch zwei verschiedene Gene kodiert, wobei
eine Untereinheit größer als
die andere ist. Dieses Merkmal wurde bei einer Anzahl von Pflanzen
festgestellt. Die AGP-Untereinheiten in Spinatblättern weisen Molekulargewichte
von 54 kDa und 51 kDa auf, wie durch SDS-PAGE festgestellt wird.
Beide Untereinheiten sind mit Antikörper gegen gereinigte AGP aus
Spinatblättern
immunoreaktiv (L. Copeland, J. Preiss, Plant Physiol., Bd. 68 (1981),
S. 996–1001;
M. Morell, M. Bloon, V. Knowles, J. Preiss J. Bio. Chem., Bd. 263
(1988), S. 633). Eine immunologische Analyse unter Verwendung von
Antiserum gegen die kleinen und großen Untereinheiten von Spinatblättern ergab,
dass Kartoffelknollen-AGP ebenfalls durch zwei Gene kodiert wird
(Okita et al., 1990, a.a.O.). Die cDNA-Klone der zwei Untereinheiten
von Kartoffelknollen (50 und 51 kDa) wurden ebenfalls isoliert und
sequenziert (B. T. Muller-Rober, J. Kossmann, L. C. Hannah, L. Willmitzer,
U. Sounewald, Mol. Gen. Genet., Bd. 224 (1990), S. 136–146; P.
A. Nakata, T. W. Greene, J. M. Anderson, B. J. Smith-White, T. W. Okita,
J. Preiss Plant Mol. Biol., Bd. 17 (1991), S. 1089–1093).
Die große
Untereinheit von Kartoffelknollen-AGP ist hitzestabil (Nakata et
al., (1991), a.a.O.).
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Gemäß der Annahme
von Hannah und Nelson (L. C. Hannah, O. E. Nelson, Plant Physiol.,
Bd. 55 (1975), S. 297–302;
L. C. Hannah und O. E. Nelson Jr., Biochem. Genet., Bd. 14 (1976),
S. 547–560)
handelt es sich sowohl bei Shrunken-2 (Sh2) (M. R. Bhave, S. Lawrence,
C. Barton, L. C. Hannah, Plant Cell, Bd. 2 (1990), S. 581–588) als
auch bei Brittle-2 (Bt2) (J. M. Bae, M. Giroux, L. C. Hannah, Maydica,
Bd. 35 (1990), S. 317–322)
um Strukturgene von Mais-Endosperm-ADP-Glucose-pyrophosphorylase.
Sh2 und Bt2 kodieren für
die große
bzw. kleine Untereinheit des Enzyms. Aufgrund der cDNA-Sequenzierung
wurde für
die Sh2- und Bt2-Proteine ein Molekulargewicht von 57 179 Da (J.
R. Shaw, L. C. Hannah, Plant Physiol., Bd. 98 (1992), S. 1214–1216) bzw.
von 52 224 Da vorhergesagt. Das Endosperm ist die Stelle der stärksten Stärkeablagerung während der
Kornentwicklung bei Mais. Sh2- und Bt2-Mais-Endosperm-Mutanten weisen
stark verringerte Stärkegrade
auf, die dem mangelnden Grad an AGP-Aktivität entsprechen. Von Mutationen
beider Gene wurde gezeigt, dass sie die AGP-Aktivität um etwa
95 % verringern (Tsai und Nelson, 1966, a.a.O.; Dickinson und Preiss,
1969, a.a.O.). Ferner wurde festgestellt, dass die enzymatischen
Aktivitäten
mit der Dosierung von funktionellen Wildtyp-Sh2- und Bt2-Allelen
zunehmen, während
mutante Enzyme veränderte
kinetische Eigenschaften besitzen. AGP stellt die geschwindigkeitsbestimmende
Stufe bei der Stärkebiosynthese
in Pflanzen dar. Stark et al. platzierten eine mutante Form von
E. coli-AGP in Kartoffelknollen und erzielten eine 35%ige Zunahme
des Stärkegehalts
(Stark et al., Science, Bd. 258 (1992), S. 287).
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Die
Klonierung und Charakterisierung der Gene, die für die AGP-Enzymuntereinheiten kodieren, wurde
für verschiedene
Pflanzen beschrieben. Hierzu gehören
Sh2-cDNA (Bhave et al., 1990, a.a.O.), Sh2-Genom-DNA (Shaw und Hannah,
1992, a.a.O.) und Bt2-cDNA (Bae et al., 1990, a.a.O.) aus Mais;
cDNA der kleinen Untereinheit (J. M. Anderson, J. Hnilo, R. Larson,
T. W. Okita, M. Morell, J. Preiss, J. Biol. Chem., Bd. 264 (1989),
S. 12238–12242)
und genomische DNA (J. M. Anderson, R. Larson, D. Landencia, W.
T. Kim, D. Morrow, T. W. Okita, J. Preiss, Gene, Bd. 97 (1991),
S. 199–205)
aus Reis; und cDNAs der kleinen und großen Untereinheit aus Spinatblättern (Morell
et al., 1988, a.a.O.) und Kartoffelknollen (Muller-Rober et al.,
1990, a.a.O.; P. A. Nakata, T. W. Greene, J. W. Anderson, B. J.
Smith-White, T. W. Okita und J. Preiss, Plant Mol. Biol., Bd. 17
(1991), S. 1089–1093).
Ferner wurden cDNA-Klone aus Weizen-Endosperm und Blattgewebe isoliert (M.
R. Olive, R. J. Ellis, W. W. Schuch, Plant Physiol. Mol. Biol.,
Bd. 12 (1989), S. 525–538)
und Blättern von
Arabidopsis thaliana (T. Lin, T. Caspar, C. R. Sommerville und J.
Preiss, Plant Physiol., Bd. 88 (1988), S. 1175–1181).
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AGP
wirkt in sämtlichen
bisher untersuchten Geweben und Organismen als ein allosterisches
Enzym. Die Bedeutung der allosterischen Eigenschaften von AGP wurde
zuerst in E. coli gezeigt. Es wurde eine E. coli-Mutante mit Glycogen-Überproduktion isoliert und
die Mutation wurde auf das Strukturgen für AGP mit der Bezeichnung glyC
kartiert. Es wurde gezeigt, dass das als glyC-16 bekannte mutante
E. coli gegenüber
dem Aktivator Fructose-1,6-bisphosphat empfindlicher und gegenüber dem
Inhibitor cAMP weniger empfindlich ist (J. Preiss, Ann. Rev. Microbiol.,
(1984), S. 419–458).
Obgleich Pflanzen-AGPs ebenfalls allosterisch sind, reagieren sie
auf unterschiedliche Effektormoleküle im Vergleich zu bakteriellen
AGPs. In Pflanzen wirkt 3-Phosphoglycerinsäure (3-PGA) als ein Aktivator,
während
Phosphat (PO4) als ein Inhibitor dient (Dickinson
und Preiss, 1969, a.a.O.).
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Unter
Verwendung eines in vivo-Mutagenesesystems, das durch das Ac-vermittelte Ausschneiden
eines transponierbaren Ds-Elements, das sich zufällig in der Nähe einer
bekannten Aktivator-Bindungsstelle befindet, waren Giroux et al.
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(M.
J. Giroux, J. Shaw, G. Barry, G. B. Cobb, T. Greene, T. W. Okita
und L. C. Hannah, Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 93 (1996), S. 5824–5829) dazu
in der Lage, ortsspezifische Mutanten in einer funktionell wichtigen Region
von Mais-Endosperm-AGP
zu erzeugen. Eine Mutante, nämlich
Rev 6, enthielt ein Tyrosinserin-Insert und bedingte eine 11–18%ige
Zunahme des Samengewichts.
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WO-91/11520
beschreibt die Verwendung modifizierter Formen von Polynucleotiden,
die für
AGP mit verbesserter Wärmestabilität kodieren,
um die Stärkeausbeute
in einer Pflanze, z. B. Zea mays, zu verbessern.
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Charing
et al., J. Biol. Chem., Bd. 269(39) (1994), S. 24107–24113 beschreibt
die Herstellung einer Mutante von Spinatblätter-AGP, die hier als "K419R" bezeichnet wird
und bei der nach 5-minütiger
Wärmebehandlung
bei 60 °C
eine höhere
Aktivität
als beim Wildtypenzym erhalten bleibt.
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Greene
et al., PNAS USA, Bd. 93 (1996), S. 1509–1513, beschreibt eine Aminosäuremutation,
die das Samengewicht erhöht.
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Zusammenfassende
Darstellung der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein Polynucleotid, das
für ein
mutantes Pflanzen-ADP-Glucose-phosphorylase (AGP)-Polypeptid kodiert,
eine Aminosäuremutation
in seiner großen Untereinheit
und weist im Vergleich zu einem Wildtyp-AGP-Polypeptid eine erhöhte Wärmestabilität auf, wobei die
Mutation den Ersatz der Aminosäure,
die His-333, Ala-177, Asp-400, Val-454, Arg-104, Thr-460 oder Arg-216
in Mais entspricht, umfasst. Weitere Aspekte der Erfindung betreffen
ein Verfahren zur Erhöhung
der Wärmestabilität einer
Pflanze, transformierte Pflanzen und Pflanzengewebe sowie ein mutantes
AGP-Polypeptid.
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Erfindungsgemäß werden
wärmestabile
Enzyme bereitgestellt, die zur Bildung von Pflanzen mit größerer Toleranz
gegenüber
höheren
Temperaturen verwendet werden können,
wodurch der Ernteertrag dieser Pflanzen erhöht werden kann. Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der verbesserten Pflanze um eine Getreidepflanze.
Zu Getreidepflanzen, auf die die Erfindung Anwendung findet, gehören beispielsweise
Mais, Weizen, Reis und Gerste.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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1:
Mutanten der großen
Untereinheit von wärmestabiler
Mais-Endosperm-AGP.
Der prozentuale Anteil der AGP-Aktivität, die nach 5-minütiger Wärmebehandlung
bei 60 °C
erhalten bleibt, ist dargestellt.
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2:
Ausrichtung der Primärsequenz
der die HS 33-Mutation umgebenden Region bei den großen Untereinheiten
von Mais, Weizen, Gerste und Kartoffel. Konservierte Regionen sind
eingerahmt.
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3:
Ausrichtung der Primärsequenz
einer die HS 40-Mutation umgebenden Region bei den großen Untereinheiten
von Mais, Weizen, Gerste und Kartoffel. Konservierte Regionen sind
eingerahmt. Der fett gedruckte Asparaginsäurerest entspricht der allosterischen
D413A-Mutante von Kartoffel-LS (T. W. Greene, R. L. Woodbury und
T. W. Okita, Plant Physiol., (1996) (im Druck)). Bei der Spinatblatt-AGP-Sequenz
handelt es sich um das Aktivatorstellen-2-Peptid, das bei Studien
des 3-PGA-Analogen identifiziert wurde (K. Ball und J. Preiss, J.
Biol. Chem., Bd. 269 (1994), S. 24706–24711). Der markierte Lysinrest
ist in Fettdruck dargestellt.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft neue mutante Polynucleotidmoleküle und die
dadurch kodierten Polypeptide, die bei Pflanzen, die unter Hitzestressbedingungen
wachsen, einen erhöhten
Ertrag bewirken, verglichen mit Pflanzen mit dem Wildtyp-Genotyp.
Bei speziellen Ausführungsformen
kodieren die erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküle für die Enzymaktivitäten von
Endosperm-ADP-Glucose-pyrophosphorylase (AGP) und lösliche Stärke-synthase
(SSS). Die mutanten Enzyme verleihen den Samen eine erhöhte Stabilität gegenüber Hitzestressbedingungen
während
der Samenentwicklung, verglichen mit Wildtyp-Enzymaktivitäten.
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Gemäß einer
Ausführungsform
kodiert ein erfindungsgemäßes mutantes
Polynucleotid für
eine große Untereinheit
von AGP, die in der Polypeptidsequenz eine Aminosäuresubstitution
von Histidin zu Tyrosin aufweist. Diese Substitution tritt am Aminosäurerest
Nr. 333 auf, und zwar gemäß der anerkannten
Aminosäurenummerierung
dieses Proteins (Shaw und Hannah, 1992, a.a.O.). Die Position dieser
Substitution kann vom Fachmann leicht identifiziert werden. Eine
zweite Mutation, die durch die vorliegende Erfindung beispielhaft
belegt wird, ist eine Substitution von Threonin zu Isoleucin in
Position Nr. 460 des AGP-Proteins.
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Weitere
Mutanten, die eine erhöhte
Wärmestabilität verleihen,
sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt. Tabelle
1
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cDNA-Klone
für die
Untereinheiten von Mais-Endosperm-AGP (SH2 und BT2) und der E. coli-Stamm mit
Defizit in Bezug auf die endogene bakterielle AGP (glgC–)
(AC70R1-504) haben die Schaffung eines bakteriellen Expressionssystems
zur Untersuchung der Mais-Endosperm-AGP erleichtert. Die Expression
einer einzigen Untereinheit ist nicht zur Komplementierung der glgC–-Mutante befähigt und
es wird kein Glycogen erzeugt (A. Iglesias, G. F. Barry, C. Meyer,
L. Bloksberg, P. Nakata, T. Greene, M. J. Laughlin, T. W. Okita,
G. M. Kishore und J. Preiss, J. Biol Chem., Bd. 268 (1993), S. 1081–1086).
Jedoch komplementiert die Expression sowohl der großen als
auch der kleinen Untereinheit an kompatiblen Expressionsvektoren
in vollständiger
Weise die glgC–-Mutation und führt zur Wiederherstellung der
Erzeugung von Glycogen, wie sich durch eine dunkle, rotstichig-braune
Färbung
von mit Iod behandelten Kolonien zeigt. Somit lässt sich die Komplementierung in
einfacher Weise identifizieren, indem man die Kolonien mit Iod behandelt.
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Bei
einer Ausführungsform
wurden E. coli-glgC–-Zellen, die die Strukturgene
für Kartoffel-
oder Mais-Endosperm-AGP exprimieren, verwendet. Zellen mit einem
Gehalt an Kartoffel-AGP-Genen können
bei Züchtung
bei 37 °C
oder bei 42 °C
große
Mengen an Glycogen synthetisieren. Jedoch synthetisieren Zellen, die
Mais-Endosperm-AGP exprimieren, Glycogen nur bei 37 °C. Dieses
Ergebnis belegt die Wärmeempfindlichkeit
von Wildtyp-Mais-Endosperm-AGP. Die Tatsache, dass diesbezüglich ein
Unterschied zwischen Kartoffel- und Mais-AGP besteht, stellt ein
wirksames System bereit, um mutante Zellen einem Screening zu unterwerfen,
die wärmestabile
Varianten der Mais-Endosperm-AGP aufweisen. Ein Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft eine wirksame Identifizierung von AGP mit Wärmestabilität. Demgemäß wurde
ein Plasmid, das ein für
die SH2- Untereinheit
von Mais-AGP kodierendes Polynucleotid umfasst, chemisch gemäß den nachstehenden
Angaben mutagenisiert, in mutante E. coli-Zellen, die die BT2-Untereinheit exprimieren,
platziert und bei 42 °C
gezüchtet.
Weitere, aus dem Stand der Technik bekannte Mutagene können ebenfalls
verwendet werden. Es wurden 11 erbfähige, mit Iod färbende Mutanten
isoliert, die als wärmestabile
(HS) Mutanten bezeichnet wurden. Rohe Extrakte dieser Mutanten wurden
hergestellt und die Wärmestabilität der erhaltenen AGP
wurde bestimmt. Die Mutanten behalten nach 5-minütiger Inkubation bei 60 °C 8–59 % ihrer
Aktivität (1).
Dies steht im Vergleich zu einem Wert von 1–4 %, der routinemäßig für Wildtyp-AGP
bei dieser Temperatur festgestellt wird.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die wärmestabilen
Formen von Enzymen erfindungsgemäß durch
Mutation erzeugt werden können. Überraschenderweise
wurde bei der Mehrzahl dieser Mutanten die Gesamtaktivität der Mais-Endosperm-AGP, die vor der
Wärmebehandlung
vorlag, um einen Faktor von etwa 10 erhöht. Dieses überraschende Ergebnis lässt eine
besonders vorteilhafte Verwendung dieser Mutanten in der Landwirtschaft
zu. Die hier beschriebenen Mutagenesetechniken können erfindungsgemäß herangezogen
werden, um andere Gene zu identifizieren, die für wärmestabile Enzyme der Stärkebiosynthese
kodieren.
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Die
Gene, die für
mehrere der wärmestabilen
Mutanten, einschließlich
die beiden wärmestabilsten RS-Mutanten
HS 33 und HS 40, kodieren, wurden vollständig sequenziert. HS 33, bei
dem nach Wärmebehandlung
59 % seiner Aktivität
erhalten bleiben, enthält
eine Mutation eines einzelnen Rasenpaars, die eine Veränderung
von Histidin in Position 333 der Aminosäuresequenz des Polypeptids
in einen Tyrosinrest bewirkt (2). Primäre Sequenzausrichtungen
mit den großen
Untereinheiten von Weizen- und Gerste-AGPs zeigen, dass ebenfalls
ein Histidin am analogen Rest vorhanden ist (3) (C. Ainsworth,
F. Hosein, M. Tarvis, F. Weir, M. Burrell, K. M. Devos, M. D. Gate,
Planta, Bd. 197 (1995), S. 1–10).
Eine Sequenzanalyse von HS 40, bei dem nach der Wärmebehandlung
41 % seiner Aktivität
erhalten bleiben, ergab ebenfalls eine Mutation von Histidin zu
Tyrosin in Position 333. Eine zusätzliche Punktmutation wurde
identifiziert, die zu einer Substitution von Threonin zu Isoleucin
führt.
Der Threoninrest ist in großen
AGP-Untereinheiten hochgradig konserviert, während in kleinen AGP-Untereinheiten
es sich beim analogen Rest entweder um Cystein oder um Serin handelt
(Ainsworth et al., 1995, a.a.O.). Die Substitution von Threonin
durch Isoleucin befindet sich nahe am Carboxylterminus der großen Untereinheit
und nahe an einer bekannten Bindungsstelle für den Aktivator 3-PGA (3).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner wärmestabile Mutanten von AGP,
die Mutationen in der kleinen Untereinheit des Enzyms aufweisen.
Unter den Umfang der Erfindung fallen auch Polynucleotide, die für die mutanten
kleinen Untereinheiten von AGP kodieren. Mutationen in der kleinen
Untereinheit von AGP, die dem Enzym Wärmestabilität verleihen, lassen sich ebenfalls
leicht unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren herstellen und
identifizieren.
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Pflanzen
und Pflanzengewebe, die so gezüchtet
worden sind, dass sie die mutanten Polynucleotide enthalten, oder
die in entsprechender Weise transformiert worden sind, und die Polypeptide,
für die
die Polynucleotide kodieren, exprimieren, kommen ebenfalls erfindungsgemäß in Betracht.
Pflanzen und Pflanzengewebe, die die mutanten Polynucleotide exprimieren,
erzeugen Gewebe, die beispielsweise einen geringeren wärmeinduzierten
Verlust an Gewicht oder Ertrag aufweisen, wenn sie während ihrer
Entwicklung einem Hitzestress unterliegen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und
Identifizierung von erfindungsgemäßen Polynucleotiden und Polypeptiden.
Gemäß einer
Ausführungsform
kann eine Genmutation unter anschließender Selektion unter Verwendung
eines bakteriellen Expressionssystems dazu herangezogen werden,
Polynucleotidmoleküle
zu isolieren, die für
Enzyme kodieren, die eine wärmeinduzierte
Einbuße
der Stärkesynthese
in Pflanzen abmildern können.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner Pflanzen und Pflanzengewebe,
in deren Genom ein mutantes AGP-Gen eingebaut ist. Weitere, hier
beschriebene Allelen können
ebenfalls in ein Pflanzengenom eingebaut werden. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform
handelt es sich bei der Pflanze um eine Getreidepflanze. Insbesondere
handelt es sich bei der Pflanze um Zea mays. Pflanzen mit einem
mutanten AGP-Gen können
aus Saatgut gezüchtet
werden, das in seinem Genom ein mutantes Gen umfasst. Ferner sind
Techniken zur Transformation von Pflanzen mit einem Gen aus dem
Stand der Technik bekannt.
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Aufgrund
der Degeneration des genetischen Codes kann eine Vielzahl von verschiedenen
Polynucleotidsequenzen jeweils für
die hier beschriebenen varianten AGP-Polypeptide kodieren. Ferner
liegt es im Können
des Fachmanns, alternative Polynucleotidsequenzen zu schaffen, die
für das
gleiche oder im wesentlichen das gleiche erfindungsgemäße Polypeptid
kodieren. Diese varianten oder alternativen Polynucleotidsequenzen
fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Die hier verwendete
Ausdrucksweise "im
Wesentlichen die gleiche" Sequenz
bezieht sich auf Sequenzen, die für Substitutionen, Deletionen,
Additionen oder Insertionen von Aminosäuren kodieren, die nicht in erheblichem
Umfang die funktionelle Aktivität
des Polypeptids, das durch das hier beschriebene mutante AGP-Polypeptid
kodiert wird, verändern.
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Eine
Substitution von Aminosäuren,
die von den in den hier beschriebenen Mutanten beispielhaft belegten
Substitutionen abweichen, fallen ebenfalls unter den Umfang der
vorliegenden Erfindung. Aminosäuren lassen
sich in die folgenden Klassen einteilen: nichtpolare, ungeladene
polare, basische und saure Aminosäuren. Konservative Substitutionen,
bei denen ein mutantes AGP-Polypeptid
mit einer Aminosäure
einer Klasse durch eine andere Aminosäure der gleichen Klasse ersetzt
wird, fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung, sofern
das mutante AGP-Polypeptid mit der Substitution noch eine erhöhte Wärmestabilität im Vergleich
zum Wildtyp-Polypeptid aufweist. In der nachstehenden Tabelle 2
findet sich eine Aufzählung
von Beispielen für
Aminosäuren,
die in die einzelnen Klassen fallen. Tabelle
2
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Beispielsweise
fällt eine
Substitution des Tyrosins in Position 333 in mutantem HS 33-, HS
39-, HS 40- und HS 47-Mais-Endosperm-AGP durch andere Aminosäuren, wie
Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Asparagin und Glutamin, unter
den Umfang der Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch Polynucleotide, die für Fragmente
des mutanten Polypeptids von voller Länge kodieren, sofern diese
Fragmente im wesentlichen die gleiche funktionelle Aktivität wie das Polypeptid
von voller Länge
behalten. Die Fragmente von mutantem AGP-Polypeptid, die durch diese
Polynucleotide kodiert werden, fallen ebenfalls unter den Umfang
der vorliegenden Erfindung.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ferner solche Polynucleotidmoleküle, die
Sequenzen aufweisen, die eine ausreichende Homologie zur Wildtyp-Sh2-DNA-Sequenz aufweisen,
um eine Hybridisierung mit dieser Sequenz unter üblichen Bedingungen von hoher
Stringenz zu ermöglichen.
Derartige Hybridisierungsbedingungen sind im Stand der Technik üblich (vergl.
beispielsweise T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflg., Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York (1989)).
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Die
erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküle können zur
Transformation von Pflanzen verwendet werden, um das mutante, wärmestabile
AGP-Enzym in diesen Pflanzen zu exprimieren. Ferner können die
erfindungsgemäßen Polynucleotide
zur Expression des rekombinanten varianten AGP-Enzyms verwendet
werden. Sie können
auch als eine Sonde zum Nachweis von verwandten Enzymen verwendet
werden. Die Polynucleotide können
auch als DNA-Größenstandards
verwendet werden.
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Die
erfindungsgemäßen Polynucleotidmoleküle umfassen
auch solche Polynucleotide, die für AGP-Enzyme kodieren, die
einer Pflanzen zusätzlich
zur erhöhten
Wärmestabilität ein erhöhtes Samengewicht
verleihen. Eine Kombination einer wärmestabilisierenden Mutation,
HS, mit einer Mutation, die ein erhöhtes Samengewicht bewirkt,
z. B. Rev 6, fällt
insbesondere unter die vorliegende Erfindung; vergl. beispielsweise
die US-Patente 5 589 618 und 5 650 557.
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Mutationen
in den AGP-Untereinheiten, die Wärmestabilität verleihen,
können
erfindungsgemäß mit gegenüber Phosphat
unempfindlichen Mutanten von Mais, z. B. mit der Rev 6-Mutation,
kombiniert werden, um die Stabilität der durch Rev 6 kodierten
großen
Untereinheit zu erhöhen.
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Es
ist zu erwarten, dass die enzymatische Aktivität von SSS bei höheren Temperaturen
beeinträchtigt wird,
wie bei AGP festgestellt wurde. Somit können mutagenisierte Formen
von SSS unter erhöhten
thermischen Bedingungen (42 °C)
exprimiert werden, um wärmestabile
Varianten zu isolieren. Diese wärmestabilen, mutagenisierten
Formen von SSS stellen weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung
dar.
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Sämtliche
Publikationen und Patente, die hier zitiert werden, werden durch
Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht.
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Nachstehend
finden sich Beispiele, die die Verfahren zur Ausübung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele
sind nicht als eine Beschränkung
anzusehen. Sämtliche
Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht und sämtliche
Mengenverhältnisse
für Lösungsmittelgemische
beziehen sich auf das Volumen, sofern nichts anderes angegeben wird.
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Beispiel 1
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Anwendung
einer Mutagenese zur Erzielung von wärmestabilen Varianten von Mais-Endosperm-AGP
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Anfänglich wurde
das chemische Mutagen Hydroxylamin-HCl für die willkürliche Mutagenese des Expressionsplasmids
der großen
Untereinheit verwendet. Hydroxylamin bewirkt eine bevorzugte Hydroxylierung des
Aminostickstoffs in der C-4-Position von Cytosin und führt zu einem Übergang
von GC zu AT (D. T. Suzuki, A. J. F. Griffith, J. H. Miller und
R. C. Lewontin, in Introduction to genetic analysis, Freeman, NY,
4. Auflg. (1989), S. 475–499).
Dieses chemische Mutagen wurde wegen seiner hohen Mutationsfrequenz
gewählt.
Einschränkungen
des chemischen Mutagens werden festgestellt. Wenn keine große Vielzahl
von genetischen Varianten isoliert wird, kann eine willkürliche Mutagenese
auf PCR-Basis durchgeführt
werden. Eine PCR-Mutagenese erzeugt ein breiteres Spektrum von Mutationen,
die ähnliche
Frequenzen von Übergängen und
Transversion umfassen und die eine hervorragende Alternative für das chemische
Verfahren darstellt. Das von Cadwell und Joyce (R. C. Cadwell und
G. F. Joyce, PCR Methods and Applications, Bd. 2 (1992), S. 28–33) beschriebene
Verfahren kann für
das Verfahren auf PCR-Basis eingehalten werden.
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Da
das vollständige
Expressionsplasmid für
die willkürliche
Mutagenese verwendet wird, ist es möglich, dass Mutationen außerhalb
der Kodierungsregion auftreten. Obgleich zu erwarten ist, dass derartige
Mutationen keinerlei Einfluss auf die Wärmestabilität der Mais-Endosperm-AGP ausüben, kann
jede Variante in ein unmutiertes Expressionsplasmid subkloniert
werden, bevor eine weitere Charakterisierung auf dem Enzymniveau
durchgeführt
wird. Expressionsplasmide sowohl der großen als auch der kleinen Untereinheit
lassen sich so konstruieren, dass durch einen Ncol/Sacl-Verdau die
vollständige
Kodierungsregion freigesetzt wird. Diese Region kann leicht in ein
unmutiertes, Ncol/Sacl-verdautes Expressionsplasmid rückkloniert
werden.
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Beispiel 2
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Molekulare Charakterisierung
und Analyse von wärmestabilen
AGP-Varianten
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Zunächst wurden
11 wärmestabile
Varianten der großen
Untereinheit von Mais-Endosperm erhalten. Zwei davon wurden vollständig sequenziert.
Die Sequenzierung wurde unter Verwendung von DuPont- und ABI-Geräten durchgeführt.
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Die
Sequenzdaten lassen sich routinemäßig mit der Progenitor-Wildtypallele
vergleichen. Diese Analyse ergibt das Ausmaß der Mannigfaltigkeit von
Veränderungen,
die die Wärmestabilität bedingen.
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Die
beiden sequenzierten HS-Mutanten enthalten den gleichen Austausch
von Histidin in Tyrosin in der großen Untereinheit. Durch PCR
abgeleitete HS-Mutanten
lassen sich rasch einem Screening auf den Austausch von Histidin
gegen Tyrosin unterziehen, indem man sich der ortsspezifischen Mutagenese
unter Einsatz von Primern, die einen Rückaustausch von Tyrosin in
Histidin bewirken, bedient.
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Beispiel 3
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Expression, Reinigung
und kinetische Analyse von genetischen Varianten
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Die
Bedingungen für
die Expression von Wildtyp-Mais-Endosperm-AGP in E. coli wurden
vollständig charakterisiert.
Die optimalen Wachstums- und Induktionsbedingungen variieren in
gewissem Umfang gegenüber
den Bedingungen, die für
die in E. coli exprimierte Kartoffel-AGP veröffentlicht wurden (Iglesias
et al., 1993, a.a.O.; Ballicora et al., 1995, a.a.O.). Eine 12-
bis 14-stündige Induktion
bei Raumtemperatur in Gegenwart von 0,3 mM IPTG und 25 μg/ml Nalidixinsäure ergibt
in übereinstimmender
Weise hohe Expressions- und Aktivitätsgrade.
Eine Zugabe von 30 % Ammoniumsulfat und 10 mM KH2PO4-/K2HPO4-
zum Extraktionspuffer stabilisiert die Mais-AGP im rohen Extrakt.
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Mit
Ammoniumsulfat eingeengtes AGP wird ferner durch hydrophobe Wechselwirkungschromatographie
unter Verwendung von Tentakel-C3-Aminopropylmedium
(EM Separations), das in einer Pharmacia HR-10/10-Säule gepackt
war, gereinigt. Protein bindet an der Säule in einem Puffer mit einem
Gehalt an 1 M Ammoniumsulfat. AGP wird von der Säule durch sukzessive Stufengradienten-Waschvorgänge mit
Puffer, der 0,75 M, 0,5 M, 0,25 M und 0 M Ammoniumsulfat enthält, eluiert.
Wildtyp-Mais-Endosperm-AGP wird typischerweise beim 0,25 M-Waschvorgang
eluiert. C3-gereinigte Mais-Endosperm-AGP
wird ferner durch Anionenaustauschchromatographie unter Verwendung
von Macro-Prep-DEAE (BioRad)-Anionenaustauschmedium, das in eine
Pharmacia HR-10/10-Säule
gepackt ist, gereinigt. AGP wird mit einem linearen Gradienten von 100–500 mM
KCl eluiert, wobei die Flution typischerweise bei einer Salzkonzentration
um 300 mM erfolgt. Ein Pharmacia FPLC-System wird für sämtliche
Chromatographiestufen verwendet. Die Bedingungen für die individuellen
Reinigungsstufen werden vollständig
charakterisiert. Die AGP-Aktivität während der
Reinigung wird durch den Pyrophosphorylysis-Test überwacht.
Die Reinigungsstufen werden durch SDS-PAGE, Coomassie-Färbung und
Western-Analyse unter Verwendung von polyklonalen Antikörpern, die
für die
großen
und kleinen Untereinheiten von Mais-Endosperm-AGP-spezifisch sind, überwacht.
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Beispiel 4
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Verstärkte Untereinheit-Wechselwirkung
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Ein
völlig
unerwarteter pleiotroper Effekt der HS-Mais-Endosperm-AGP-Mutanten besteht
in einer 2-fachen Steigerung der vor der Wärmebehandlung gegebenen Aktivität. Eine
mögliche
Erklärung
für dieses Ergebnis
besteht darin, dass wir durch die Mutationsänderung das Verhältnis von
SH2- und BT2- Monomeren und
-Polymeren, das innerhalb der E. coli-Zelle vorliegt, verschoben
haben. Möglicherweise
existieren im Wildtyp nur 10 % oder weniger der gesamten Proteine
in der aktiven heterotetrameren Form, während in den Mutanten dieser
prozentuale Anteil wesentlich höher
ist. Wenn das Polymere wärmebeständiger als
die Monomeren sind, ist der Phänotyp
der Mutanten identisch mit dem, was beobachtet wird. Eine kinetische
Analyse kann dazu herangezogen werden, die Veränderungen der Affinitäten für Substrate
und/oder allosterische Effektoren zu bestimmen.
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Um
die Vorstellung, dass das Monomer/Polymer-Verhältnis in diesen Mutanten verändert ist,
zu testen, lassen sich die Mengen an Monomeren und Polymeren im
Wildtyp und in ausgewählten
Mutanten vor und nach der Wärmebehandlung
bestimmen. Die Verfügbarkeit
von Antikörpern
(M. J. Giroux und L. C. Hannah, Mol. Gen, Genetics, Bd. 243 (1994),
S. 400–408)
für beide
Untereinheiten macht diesen Weg durchführbar. Eine Prüfung kann
sowohl durch Saccharosegradienten-Ultrazentrifugation als auch durch
Gelchromatographie erfolgen und lässt leicht die Ermittlung des
wirksamsten und endgültig
einzuschlagenden Verfahrens zu.
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Da
AGP von höheren
Pflanzen aus zwei ähnlichen,
aber doch unterschiedlichen Untereinheiten besteht, die unter Bildung
der nativen, heterotetrameren Struktur oligomerisieren, können Mutationen,
die diese Wechselwirkung verstärken,
dem Enzym eine zusätzliche
Stabilität
verleihen. Ein Hefe-Doppelhybrid-System (CLONTECH Laboratories,
Palo Alto, CA) kann zur Bewertung von Untereinheit-Wechselwirkungen
verwendet werden. Spezifische Primer für die Amplifikation der Kodierungsregionen
lassen sich konstruieren. Diese Primer addieren einzigartige Restriktionsstellen
an die 5'- und 3'-Enden, so dass die
Klonierung die translationale Fusion der individuellen Untereinheit
mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne
(pGBT9) oder der GAL4-Aktivierungsdomäne (pGAD424) erleichtert. Wenn
die in die Vektoren klonierten Proteine in Wechselwirkung treten, bilden
die DNA-Bindungsdomäne
und die Aktivierungsdomäne
einen funktionellen Transkriptionsaktivator. Dies führt wiederum
zur Aktivierung der Expression des Reportergens lacZ, das hinter
einem GAL4-Promotor kloniert ist.
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Zunächst lassen
sich die Bedingungen mit den Wildtyp-Untereinheiten charakterisieren.
Die Kodierungsregion der großen
und kleinen Untereinheiten des Wildtyps lassen sich in die pGBT9-
und pGAD424-Hefeexpressionsvektoren klonieren. Sämtliche möglichen Kombinationen lassen
sich erzeugen und testen. pGBT9- und pGAD424-Vektoren mit einem
Gehalt an Sh2 und Bt2 lassen sich in den gleichen Hefestamm cotransformieren
und einer Selektion in Bezug auf Wachstum auf einem Medium mit einem
Mangel an Tryptophan (pGBT9) und Leucin (pGAD424) unterziehen. Die
Untereinheit-Wechselwirkung als eine Funktion der lacZ-Expression
lässt sich
auf zweierlei Weise nachweisen. Positive Kolonien werden durch einen β-Galactosidase-Filtertest
visuell identifiziert. Bei diesem Test werden Kolonien an den Filter
gebunden, lysiert und mit einer X-gal-Lösung
inkubiert. Kolonien, die eine blaue Färbung aufweisen, lassen sich
analysieren. Die Untereinheit-Wechselwirkung kann ferner durch einen
für β-Galactosidase spezifischen
Enzymtest analysiert werden. Dies ermöglicht die quantitative Bestimmung
der Wechselwirkung. Mutationen, die Untereinheit-Wechselwirkungen verstärken, ergeben
beim Test höhere
Werte der β-Galactosidase-Aktivität.
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Beispiel 5
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Weitere Verstärkung der
Stabilität
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Die
isolierten Mutanten der großen
Untereinheit variieren bezüglich
ihrer Wärmestabilitätseigenschaften,
was auf die Möglichkeit
von mehrfachen Mutationen schließen lässt. Während die Sequenzanalyse der Mutanten
HS 33 und HS 40 ergibt, dass die mutanten Sequenzen nicht identisch
sind, enthielten beide Mutanten den identischen Austausch von Histidin
durch Tyrosin. Aufgrund der Identifizierung von verschiedenen HS-Veränderungen
innerhalb des SH2-Proteins
ist es möglich,
in wirksamer Weise diese Veränderungen
pyramidenförmig
in einem Protein vorzunehmen. Ferner können beliebige HS-Mutationen innerhalb
der kleinen Untereinheit mit HS-SH2-Mutanten coexprimiert werden,
um die Stabilität
des Mais-Endosperm-Enzyms weiter zu erhöhen.
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Multiple
HS-Mutanten innerhalb einer Untereinheit lassen sich leicht kombinieren.
Beispielsweise können
verschiedene einzigartige Restriktionsstellen, die die Kodierungsregion
von Sh2 in drei getrennte Fragmente unterteilen, verwendet werden.
Gegebenenfalls können
Mutationskombinationen durch Subklonieren des entsprechenden Fragments
mit einem Gehalt an der addierten Mutation erzeugt werden. Wenn
sich zwei Mutationen in enger Nachbarschaft befinden, kann man sich
der ortsgerichteten Mutagenese bedienen, um derartige Kombinationen
zu konstruieren. Ein Verfahren für
ortsspezifische Mutationen beinhaltet PCR, mutagene Primer und die
Verwendung von Dpnl-Restriktionsendonuclease.
Primer lassen sich so konstruieren, dass sie die Mutation am 5'-Ende enthalten,
und zur PCR-Amplifikation unter Verwendung der korrekturlesenden
Polymerase Vent verwenden. Amplifizierte DNA kann sodann mit Dpnl
verdaut werden. Parentale DNA, die aus E. coli isoliert worden ist,
wird methyliert und ist somit empfindlich gegen Dpnl. Verdaute DNA
wird der Größenfraktionierung
durch Gelelektrophorese, der Ligation und der Klonierung in die
Expressionsvektoren unterzogen. Mutationen werden durch Sequenzanalyse
bestätigt
und in den AC70R1-504-Stamm, der die kleine Wildtyp-Untereinheit
trägt,
transformiert. Kombinationsmutanten lassen sich sodann analysieren.
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Beispiel 6
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Kombination von Wärmestabilitätsmutationen
mit Rev6
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Erfindungsgemäß lassen
sich die wärmestabilen
Mutationen mit einer Mutation kombinieren, die mit einem erhöhten Samengewicht
verbunden ist, beispielsweise mit der Rev6-Mutation. Das Ziel besteht
darin, die erwünschte,
für Rev6
charakteristische Unempfindlichkeit gegen Phosphat beizubehalten,
während
die Stabilität
erhöht
wird. Rev 6/HS-Doppelmutanten lassen sich gemäß den hier gemachten Angaben
konstruieren und bestätigen.
Doppelmutanten lassen sich in AC70R1-504, das die kleine Wildtyp-Untereinheit
trägt, transformieren.
Eine erhöhte
Wärmestabilität lässt sich
leicht durch eine positive Glycogenfärbung auf Medien mit geringem
Glucosegehalt identifizieren. Rev6 ergibt bei Züchtung auf diesem Medium keine
Färbung.
Zunächst
lassen sich sämtliche
Mutantenkombinationen enzymatisch einem Screening auf die Beibehaltung
der Phosphat-Unempfindlichkeit unterziehen. Nur Kombinationen, bei
denen die Phosphat-Unempfindlichkeit erhalten bleibt, werden weiter
analysiert.
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Beispiel 7
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Klonierung von SSS I-Mutanten
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Ein
gig A–-E.
coli-Stamm mit einem Mangel an endogener bakterieller Glycogen-synthase
kann vom E. coli-Stock Center bezogen werden. Bakterielle Expressionsvektoren
die derzeit für
die Expression von AGP verwendet werden, lassen sich für die Expression
von SSS einsetzen.
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Eine
Klonierungsstrategie, die beispielsweise bei Sh2 und Bt2 eingesetzt
wird (Giroux et al., 1996, a.a.O.), wird nachstehend angegeben.
Ein Primer enthält
eine einzigartige Restriktionsstelle plus den 5'-Terminus des Transkripts, während der
andere Primer eine weitere einzigartige Restriktionsstelle und Sequenzen in
3'-Stellung zum
translationalen Terminationscodon des zu untersuchenden Gens enthält. Eine
anschließende
Klonierung dieser Primer führt
zu einer translationalen Fusion innerhalb des Plasmids. Diese genspezifischen
Primer werden anfänglich
bei RT-PCR-Reaktionen unter Verwendung von Poly A+RNA als sich entwickelnden
Endospermien verwendet.
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Die
Expression von Mais-Endosperm-SSS I bewirkt eine Komplementierung
des Mangels an Glycogen-synthase-Aktivität im gig A–-Stamm.
Die Komplementierung sollte sich leicht durch Iodfärbung sichtbar machen
lassen, wie es bei der Expression von AGP im gig C–-Stamm
der Fall ist. Rohe Extrakte lassen sich bei verschiedenen Temperaturen
und für
unterschiedliche Zeitspannen inkubieren, um die Wärmestabilität von SSS
I zu bestimmen. Der gig A–-Stamm, der das Mais-Endosperm-SSS
I exprimiert, kann bei verschiedenen Temperaturen gezüchtet werden,
um festzustellen, ob die Funktion temperaturempfindlich ist, wie
es beim bakteriellen AGP-Expressionssystem der Fall ist. Nachdem
eine restriktive Temperatur festgestellt worden ist, kann eine willkürliche Mutagenese
mit dem SSS I-Klon durchgeführt
werden. Mutante Formen von SSS I lassen sich in den gig A–-Stamm
transformieren und bei der restriktiven Temperatur züchten. Wärmestabile
Varianten lassen sich aufgrund ihrer Fähigkeit zur Bildung von durch
Iod gefärbtem
Glycogen bei der Restriktionstemperatur identifizieren.
