DE69637239T2

DE69637239T2 - Für kohlenhydratpolymere-bildende enzyme-kodierende dna-sequenzen und verfahren zur herstellung transgener pflanzen

Info

Publication number: DE69637239T2
Application number: DE69637239T
Authority: DE
Inventors: Arjen Johannes Van Tunen; Ingrid Maria Van Der Meer; Andries Jurriaan Koops
Original assignee: Plant Research International BV
Current assignee: Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Priority date: 1995-01-06
Filing date: 1996-01-08
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2016-01-09
Also published as: JP3840259B2; ATE373094T1; JPH11500608A; DE69637239D1; ES2294786T3; DK0795018T3; EP0795018A1; US6057494A; EP0795018B1; WO1996021023A1; PT795018E; AU4634396A

Description

Diese Erfindung betrifft Nucleotidsequenzen, die für Fruktan synthetisierende Enzyme kodieren, eine rekombinante DNA-Sequenz, umfassend ein oder mehrere der Nucleotidsequenzen, ein Verfahren zum Produzieren eines genetisch transformierten Wirtsorganismus, der ein modifiziertes Fruktanprofil aufweist, und transformierte Pflanzen oder Pflanzenteile, welche dieses modifizierte Fruktanprofil aufweisen.
Mit Fruktanen wird eine Gruppe von Kohlenhydratverbindungen bezeichnet, bei denen eine oder mehrere Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen die Mehrheit der Verknüpfungen ausmachen. Fruktane sind Fruktosepolymere mit normalerweise, aber nicht unbedingt, einer terminalen Glucosyleinheit [G-(F)_n, G = optional, n ≥ 2]. Die Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen in Fruktanen gehören zum Verknüpfungstyp β-2,6 oder β-2,1. Fruktane mit hauptsächlich β-2,6 Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen werden normalerweise Levan(e) genannt. Fruktane mit hauptsächlich β-2,1 Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen werden normalerweise Inulin(e) genannt.
Die Fruktanbiosynthese ist in mehreren Bakterien-, Pilz- und Algenfamilien verbreitet und auch in spezifischen Pflanzenfamilien, wie zum Beispiel den Liliaceae (z. B. Allium cepa), Poaceae (z. B. Lolium perenne) und Asteraceae (z. B. Helianthus tuberosus). Die Funktion von Fruktanen in Bakterien und Pilzen ist kaum verstanden. Es ist nahegelegt worden, dass Fruktane als extrazelluläre Speicher für Kohlenhydrate wirken, die in Perioden von Kohlenhydratstress mobilisiert werden können (Jacques, 1993). Bei Pflanzen können Fruktane als Reserve-Kohlenhydrate fungieren, die als Kohlenstoffquelle für das (erneute) Wachstum dienen (Meier und Reid, 1982). In Fruktan speichernden Nutzpflanzen ist die Fruktansynthese nicht nur auf bestimmte Organe beschränkt (z. B. die Stängel oder Knollen von H. tuberosus, die Zwiebeln von Allium spp., die Blattansätze und Stängel von Gräsern), sondern auch auf spezifische Zelltypen innerhalb dieser Organe (normalerweise die Parenchymzellen). Bei diesen spezifischen Zelltypen ist die Vakuole wahrscheinlich der Ort sowohl der Biosynthese als auch der Speicherung von Fruktan (Darwen und John, 1989; Wagner et al., 1983).
Bei Bakterien sind Beispiele für Fruktan synthetisierende Bakterien Streptococcus mutans und Bacillus subtilus, die Biosynthese von Fruktanen aus Sukrose wird nur durch ein Enzym katalysiert: Levansucrase (EC 2.4.1.10) in B. subtilus (Dedonder 1966) und Levansucrase, aber auch Fruktosyltransferase genannt (FTF, EC 2.4.1.10) in S. mutans (Carlsson, 1970). Die bakterielle Fruktansynthese läuft mit der direkten Übertragung von Fruktose von einer Donor-Sukrose (G-F) auf Sukrose oder andere Akzeptormoleküle gemäß der folgenden reversiblen Reaktion ab: n(G-F) + Akzeptor → n(G) + Akzeptor-(F)n, (1)wobei n größer als 10.000 sein kann.
Wasser, Hexosen, Sukrose, Oligosaccharide und Levan können als Akzeptormoleküle für Fruktosyleinheiten aus Sukrose (Fruktosyldonor) wirken.
Bakterielle DNA-Sequenzen, die für FTF in S. mutans und Levansucrase in B. subtilus kodieren, sind schon in der Literatur beschrieben (Sato und Kuramitsu, 1986; Steinmetz et al., 1985). Bakterielle Gene aus mehreren Quellen wurden verwendet, um spezifische Wirtspflanzen zu transformieren, die normalerweise Fruktane nicht synthetisieren können, wodurch die Fruktansynthese induziert wurde (siehe zum Beispiel: Van der Meer et al., 1994; Ebskamp et al., 1994). Ein Verfahren zum Erhöhen des Feststoffgehalts von Früchten der Tomate unter Verwendung des Gens für Levansucrase aus B. subtilus und des Gens für Dextransucrase aus Leuconostoc mesenteroides wird in der Anmeldung WO 89/12386 beschrieben. Ein Verfahren zum Modifizieren des Fruktanmusters in Pflanzen, die normalerweise Fruktane nicht synthetisieren können, unter Verwendung des für Levansucrase kodierenden ftf-Gens aus S. mutans und des für Levansucrase kodierenden SacB-Gens aus B. subtilus wird in den Anmeldungen NL A 9300646 und WO 94/14970 beschrieben. Die Verwendung einer für Levansucrase kodierenden DNA-Sequenz aus Erwinia amylovora, die nach Integration in das Genom der Wirtspflanze zur Synthese von Levanen führt, wird in DE 4227061 A1 und WO A 9404692 beschrieben. In allen diesen Anmeldungen werden transgene Pflanzen beschrieben, die mit Levansucrase-Genen aus Bakterien transformiert sind. Dementsprechend synthetisieren diese transgenen Pflanzen Fruktane, die mit denen vergleichbar sind, die durch die Donorbakterien synthetisiert werden, und reichem diese an (Van der Meer et al., 1994; Ebskamp et al., 1994).
Die vorliegende Anmeldung unterscheidet sich von diesen Anmeldungen darin, dass sie aus Pflanzen abgeleitete, für Fruktosyltransferase kodierende DNA-Sequenzen betrifft. Diese Enzyme sind strukturell anders als bakterielle Enzyme, da es auf der Aminosäureebene und der DNA-Ebene keine signifikante Homologie gibt. Außerdem ist der Mechanismus der Fruktanbiosynthese in Pflanzen im Wesentlichen anders als der in Bakterien. Im Gegensatz zur Fruktanbiosynthese in Bakterien wird die Bildung von Fruktanen in Pflanzen durch mehr als ein Enzym vermittelt. Zum Beispiel wird die Fruktanbiosynthese in Helianthus tuberosus (Topinambur) durch zwei Enzyme katalysiert: Sukrose:Sukrose Fruktosyltransferase (SST, EC 2.4.1.99) und Fruktan:Fruktan Fruktosyltransferase (FFT, EC 2.4.1.100). Die SST und die FFT von H. tuberosus sind an der Synthese von β-2,1-verknüpften Fruktanen (Inulin) beteiligt und werden deshalb auch als 1-SST und 1-FFT bezeichnet. 1-FFT ist aus den Knollen von H. tuberosus gereinigt worden (Löscher et al., 1993, Koops und Jonker, 1994). Es hat sich herausgestellt, dass die Reinigung von SST schwieriger zu erreichen ist. Eine mutmaßliche SST ist in sehr geringer Ausbeute aus mehreren pflanzlichen Quellen gereinigt worden (Shiomi und Izawa, 1980; Praznik et al., 1990; Angenent et al., 1993). Jedoch ist in keiner dieser Untersuchungen die Reinheit des Enzyms überzeugend gezeigt worden. Darüberhinaus ist in diesen Untersuchungen nicht abschließend gezeigt worden, dass das isolierte Enzyme keine Invertase darstellt.
Große Mengen an 1-SST und 1-FFT sind nun aus Knollen von H. tuberosus zur Homogenität gereinigt (1-FFT: Koops und Jonker 1994) und ihre Reaktionsmechanismen ausführlich untersucht worden. 1-SST aus H. tuberosus katalysiert den Anfangsschritt der Fruktanbiosynthese, die Synthese des Trisaccharids 1-Kestose (1-[G-(F)₂]) aus zwei Molekülen Sukrose (G-F), gemäß der folgenden Reaktion: G-F + G-F → 1-[G-(F)2] + G, (2)wobei G-F = Sukrose, -F = Fruktosyleinheit, -G = Glucosyleinheit, G = Glucose ist.
1-SST kann auch die Bildung des Tetrasaccharids 1,1-[G-(F)₃] und des Pentasaccharids 1,1,1-[G-(F)₄] katalysieren (3A). Deshalb kann die 1-SST Aktivität durch die folgende allgemeine Reaktion beschrieben werden: G-(F)n + G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, 1 ≤ n ≤ 3, 1 ≤ m ≤ 3 (3)
Es ist auch festgestellt worden, dass 1-SST aus H. tuberosus in einem gewissen Ausmaß die Übertragung einer Fruktosyleinheit aus G-(F)_n, 1 ≤ n ≤ 3, auf Wasser katalysieren kann.
Das zweite Enzym, 1-FFT, katalysiert die Bildung von Fruktanen mit einem höheren Polymerisationsgrad. Dieses Enzym katalysiert eine Polymerisationsreaktion durch die Übertragung von Fruktosyleinheiten zwischen Trisacchariden, Tetrasacchariden und größeren Fruktosepolymeren gemäß der folgenden allgemeinen Reaktion: G-(F)n + G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, n ≥ 2, m ≥ 2 (4)
Es ist auch festgestellt worden, dass 1-FFT die Übertragung von Fruktosyleinheiten zwischen Sukrose (G-F) und Galaktose (Gal) enthaltenden Kohlenhydraten [(Gal)_n-G-F], auch Galaktanen genannt, katalysiert. Zum Beispiel kann 1-FFT die Übertragung einer Fruktosyleinheit aus G-(F)₂ auf Raffinose (Gal-G-F) katalysieren, was zur Bildung von [Gal-G-(F)₂] führt. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass sowohl 1-SST als auch 1-FFT aus H. tuberosus andere Substrate als Fruktosylakzeptor verwenden können.
Obwohl 1-SST und 1-FFT eine gewisse überlappende Aktivität aufweisen – beide Enzyme können die Bildung von Tetra- und Pentasacchariden (Reaktionen 3 oder 4) katalysieren – sind 1-SST und 1-FFT deutlich unterschiedliche Enzyme. Die Proteine 1-SST und 1-FFT haben unterschiedliche physikalische Eigenschaften und werden durch unterschiedliche Gene kodiert. 1-SST und 1-FFT haben im Wesentlichen unterschiedliche Enzymeigenschaften. 1-FFT kann den Anfangsschritt der Fruktansynthese (Reaktion 2) nicht katalysieren, während 1-SST die Bildung von Fruktanpolymeren mit einem höheren Polymerisationsgrad als 5[G-(F)_n, n > 4] nicht katalysieren kann. Schließlich ist es mit der 1-SST Aktivität allein nur möglich, Oligofruktane mit einem Polymerisationsgrad von bis zu 5[G-(F)_n, 2 ≤ n ≤ 4] aus Sukrose zu synthetisieren. Um Fruktane mit einem höheren Polymerisationsgrad und unter Verwendung von Sukrose als Substrat zu synthetisieren, werden sowohl 1-SST als auch 1-FFT benötigt. Mit der 1-FFT Aktivität allein ist es nicht möglich, Fruktane aus Sukrose zu synthetisieren. Die Erfinder haben festgestellt, dass Proteinfraktionen, die gereinigte 1-SST sowie gereinigte 1-FFT enthielten, Sukrose als alleiniges Substrat für die Synthese von Fruktanen mit einem Polymerisationsgrad von zumindest 15[G-(F)₁₄, 3B] verwenden konnten.
Bakterielle Fruktane unterscheiden sich von Fruktanen in Pflanzen in Bezug auf den Polymerisationsgrad und Verzweigungstyp und folglich in ihren chemischen und physikalischen Eigenschaften. Im Allgemeinen werden Fruktane aus Pflanzen aus weniger als 1000 Fruktosyleinheiten zusammengesetzt. Fruktane aus H. tuberosus werden aus weniger als 100 Fruktosyleinheiten zusammengesetzt. Durch Bakterien synthetisierte Fruktane können mehr als 10.000 Fruktosyleinheiten umfassen. Pflanzliche und bakterielle Fruktane unterscheiden sich deshalb in ihren möglichen Anwendungen. Für Fruktane mit einem relativ geringen Polymerisationsgrad, wie zum Beispiel die aus Asteraceae (z. B. Topinambur, Zichorie oder Dahlie) isolierten, ist eine Anwendung als Phosphatersatz in Calcium-bindenden Mitteln und Detergenzien bereits ausgearbeitet worden ( WO 91/17189 ). Andere Anwendungen beziehen sich auf die organoleptischen Eigenschaften von Fruktanen. Die Süßkraft von Fruktanen G-(F)_n sinkt mit steigendem Polymerisationsgrad (steigendem n-Wert). Die Süßkraft der Oligofruktane G- (F)₂ und G-(F)₃ entspricht ungefähr der von Sukrose (G-F). Die sehr langkettigen Fruktane, wie zum Beispiel die in Bakterien vorkommenden, sind überhaupt nicht süß. Sehr kurzkettige Fruktane, wie zum Beispiel die durch Sukrose:Sukrose Fruktosyltransferase synthetisierten, können deshalb als Süßstoffe mit dem zusätzlichen Vorteil verwendet werden, dass diese süß schmeckenden Fruktane nicht kariogen sind und einer Verdauung im Verdauungstrakt von Menschen widerstehen können, was Möglichkeiten zur Verwendung als kalorienarmer Süßstoff eröffnet. Die kurzkettigen Fruktane und auch die längerkettigen Fruktane können als hydrophile Einheit von biologischen oberflächenaktiven Mitteln verwendet werden.
Im Gegensatz zu den für Levansucrase kodierenden bakteriellen Genen, die schon kloniert worden sind, sind die für SST und FFT kodierenden Gene bisher nicht aus Pflanzen isoliert worden. Wir haben festgestellt, dass die für SST und FFT kodierenden Gene aus Pflanzen auf der Aminosäureebene keine signifikante Ähnlichkeit zu den bekannten Levansucrasen aufweisen und auf der DNA-Ebene keinen signifikanten Homologiegrad zu den Levansucrase-Genen aufweisen. Aus diesem Grund ist es nicht möglich gewesen, die Fruktosyltransferase-Gene aus Pflanzen unter Verwendung heterologer Levansucrase-Sonden aus Bakterien zu isolieren. Es ist auch nicht möglich gewesen, die Gene aus Pflanzen unter Verwendung heterologer Sonden aus Bakterien zu isolieren. Es ist auch nicht möglich gewesen, die für SST und FFT kodierenden Gene aus Pflanzen unter Verwendung der Aminosäuresequenzen der gereinigten Enzyme SST und FFT und der von ihnen abgeleiteten Oligonucleotidprimer zu isolieren.
In Bezug auf das Enzym SST ist der Grund hierfür, dass es bisher nicht möglich gewesen ist, obwohl Verfahren zur Reinigung von Fruktosyltransferasen aus Pflanzen beschrieben worden sind, das Enzym SST in ausreichend großen Mengen und mit ausreichend hohen Reinheitsgraden zu erhalten. In Bezug auf das Enzym FFT ist dessen Reinigung aus Koops und Jonker, 1994, bekannt.
Die Aufgabe dieser Erfindung ist es, Nucleotidsequenzen bereitzustellen, die für SST kodieren.
Eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, durch Rekombination oder Mutagenese von für SST kodierenden Nucleotidsequenzen erhaltene Nucleotidsequenzen bereitzustellen, die für Enzyme mit Fruktosyltransferase Aktivität kodieren.
Noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist, ein Verfahren zum Umwandeln von Nutzpflanzen, die kein Fruktan synthetisieren, in Nutzpflanzen, die Fruktan synthetisieren, durch Einführen der für SST kodierenden Gene bereitzustellen.
Noch eine andere Aufgabe dieser Erfindung ist es, die Fruktansynthese in Nutzpflanzen, die normalerweise Fruktane synthetisieren, (teilweise) abzuschalten.
Dementsprechend stellt diese Erfindung ein DNA-Fragment mit einer Nucleotid sequenz SEQ ID Nr. 1, wie in 4A gezeigt, oder einer homologen Sequenz mit einer Identität von zumindest 70% bereit, kodierend für ein Protein mit 1-Sukrose:Sukrose Fruktosyltransferase Aktivität, das die allgemeine Reaktion katalysiert: G-(F)n + G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, 1 ≤ n ≤ 3, 1 ≤ m ≤ 3wobei -G eine Glucosyleinheit darstellt und -F eine Fruktosyleinheit darstellt.
Weiter stellt diese Erfindung eine rekombinante DNA-Sequenz bereit, die eines oder mehrere dieser DNA-Fragmente umfasst. Darüberhinaus stellt diese Erfindung eine rekombinante DNA-Sequenz bereit, die eines oder mehrere der vorstehend definierten DNA-Fragmente umfasst und weiter ein DNA-Fragment mit einer Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 2, wie in 4B gezeigt, umfasst oder eine homologe Sequenz mit einer Identität von zumindest 70%, kodierend für ein Protein mit 1-Fruktan:Fruktan Fruktosyltransferase Aktivität, das die allgemeine Reaktion katalysiert: G-(F)n + G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, n ≥ 2, m ≥ 2wobei -G und -F wie vorstehend definiert sind.
1-Sukrose:Sukrose Fruktosyltransferase (1-SST) und 1-Fruktan:Fruktan Fruktosyltransferase (1-FFT) wurden aus Knollen von Helianthus tuberosus gereinigt. Die gereinigten Enzyme wurden durch tryptischen Verdau in Peptide gespalten und die so erhaltenen Peptidgemische wurden durch HPLC getrennt. Eine N-terminale Aminosäuresequenzierung wurde für ausgewählte Peptide durchgeführt. Für 1-SST und 1-FFT spezifische Aminosäuresequenzen wurden verwendet, um degenerierte Oligonucleotidprimer, die für 1-SST beziehungsweise 1-FFT spezifisch sind, zur Verwendung bei einer RT-PCR zu entwerfen. Der erste Strang der cDNA wurde von aus Knollen von H. tuberosus isolierter poly(A)⁺RNA synthetisiert. Mit dem für 1-SST spezifischen Primer führte die RT-PCR zu einem spezifischen Fragment von 450 bp. Mit dem für 1-FFT spezifischen Primer führte die RT-PCR zu einem spezifischen Fragment von 800 bp. Die 450 und 800 bp großen PCR-Fragmente wurden anschließend verwendet, um eine aus H. tuberosus Knollen hergestellte cDNA-Bank zu durchmustern, um die cDNA-Sequenzen voller Länge, die für 1-SST beziehungsweise 1-FFT kodieren, zu isolieren.
Die erfindungsgemäßen, für SST und FFT kodierenden Sequenzen aus Pflanzen induzieren nach dem Einfügen in das Genom eines Wirtsorganismus, zum Beispiel einer Pflanze, Änderungen der Konzentrationen von Kohlenhydraten, die zumindest eine Fruktosyleinheit (Sukrose, Oligofruktane, Fruktane oder Galaktane) enthalten, oder sie verursachen ein Änderung des Polymerisationsgrads von Oligofruktanen, Fruktanen oder Galaktanen. Die vorliegende Erfindung betrifft diese Kohlenhydrate, da Sukrose das Substrat für SST ist, Oligofruktane Produkte von SST sind, Oligofruktane und Fruktane mit einem höheren Polymerisationsgrad Substrate und Produkte von FFT sind. Außerdem können die Fruktosyltransferase Enzyme auch mit Galaktanen der Raffinose-Reihe als Fruktosylakzeptor Transfruktosylierungsreaktionen durchführen.
Die vorliegende Erfindung schließt DNA-Sequenzen ein, die zumindest 70% mit der für 1-SST kodierenden Sequenz aus H. tuberosus identisch sind, unabhängig davon, ob die homologen Sequenzen aus anderen pflanzlichen Quellen abgeleitet sind oder durch Mutagenese von Sequenzen, die für Fruktosyltransferase kodieren, aus pflanzlichen Quellen oder aus Mikroorganismen erhalten werden. Es wird bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 80% beträgt, stärker bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 85% beträgt und noch stärker bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 90% beträgt. Es wird ganz besonders bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 95% beträgt.
Die vorliegende Erfindung schließt DNA-Sequenzen ein, die zumindest 70% mit der für 1-FFT kodierenden Sequenz aus H. tuberosus identisch sind, unabhängig davon, ob die homologen Sequenzen aus anderen pflanzlichen Quellen abgeleitet sind oder durch Mutagenese von Sequenzen, die für Fruktosyltransferase kodieren, aus Mikroorganismen erhalten werden. Es wird bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 80% beträgt, stärker bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 85% beträgt und noch stärker bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 90% beträgt. Es wird ganz besonders bevorzugt, dass der Homologiegrad zumindest 95% beträgt.
Die vorliegende Erfindung schließt auch DNA-Sequenzen ein, die durch in-vivo- und in-vitro-Rekombination unter Verwendung von Sequenzen, die für SST und gegebenenfalls für FFT kodieren, aus Pflanzen, und von Sequenzen, die für Fruktosyltransferase kodieren, aus anderen prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen, einschließlich Bakterien und Pilzen, erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft DNA-Sequenzen aus Pflanzen, die für SST kodieren, die nach dem Einfügen in das Genom eines Wirtsorganismus die Synthese von Oligofruktanen induzieren, die aus 2, 3 und/oder 4 Fruktosyleinheiten bestehen [G-(F)_n, 2 ≤ n ≤ 4]. Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNA-Sequenzen aus Pflanzen, die für FFT kodieren, die nach dem Einfügen in das Genom eines Wirtsorganismus zusammen mit Sequenzen, die für SST kodieren, die Synthese von Fruktanen mit einem höheren Polymerisationsgrad induzieren [G-(F), n > 4].
Die vorliegende Erfindung betrifft auch chimäre Genkonstrukte, umfassend Sequenzen, die für SST und gegebenenfalls für FFT kodieren, oder einen Teil der Sequenzen, wobei die Sequenzen in der Antisense-Orientierung vorliegen. Das Einführen dieser Antisense-Konstrukte in Pflanzen, die Fruktane synthetisieren können, verursacht eine Hemmung von durch SST oder FFT katalysierten Reaktionen oder verursacht eine Hemmung der Expression von SST oder FFT.
Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Genkonstrukte, die für SST kodieren, oder einen Teil der Sequenz, wobei die kodierende Sequenz in der Antisense-Orientierung vorliegt. Das Einführen dieser Antisense-Konstrukte in das Genom von Wirtspflanzen, die Fruktane synthetisieren können, wie zum Beispiel Spezies der Asteraceae-, Liliaceae- und Poaceae-Familie, verringert oder blockiert die Umwandlung von Sukrose in Oligofruktane [G-(F)_n, 2 ≤ n ≤ 4]. Da nur SST den ersten Schritt der Fruktansynthese (Reaktion 2) katalysieren kann, wird in derartigen transgenen Pflanzen auch die Synthese von Fruktanen mit einem höheren Polymerisationsgrad [G-(F)_n, n > 4] verringert oder blockiert und diese Pflanzen werden Sukrose anstelle von Fruktanen anreichern.
Die vorliegende Erfindung betrifft chimäre Genkonstrukte, die für FFT kodieren, oder einen Teil der Sequenz, wobei die kodierende Sequenz in der Antisense-Orientierung vorliegt. Das Einführen dieser Antisense-Konstrukte in das Genom von Wirtspflanzen, die Fruktane synthetisieren können, verringert oder blockiert die Umwandlung von Oligofruktanen [G-(F)_n, 2 ≤ n ≤ 4] in Fruktane mit einem höheren Polymersationsgrad [G-(F)_n, n > 4]. Die so erhaltenen transgenen Pflanzen reichem Oligofruktane anstelle von Fruktanen mit einem höheren Polymerisationsgrad an.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Produzieren einer genetisch transformierten Pflanze bereit, die ein modifiziertes Fruktanprofil aufweist, umfassend die Schritte von:

(i) Herstellen eines chimären Genkonstrukts, umfassend ein oder mehrere wie vorstehend definierte DNA-Fragmente oder die DNA-Fragmente in der umgekehrten Orientierung, funktionsfähig mit einer in der Pflanze aktiven Promotorsequenz und einer in der Pflanze aktiven Terminatorsequenz gekoppelt,
(ii) Einführen des chimären Genkonstrukts in das Genom der Pflanze, und
(iii) Regenerieren der transformierten Pflanzenzellen zu transgenen Pflanzen.

Genauer gesagt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Schritte:

a. Konstruktion eines chimären Gens, das im Wesentlichen die folgenden Sequenzen umfasst: einen Promotor, der die Bildung einer funktionellen RNA oder eines funktionellen Proteins in dem vorgesehenen Zielorganismus, den vorgesehenen Zielorganen, Geweben oder Zellen sicherstellt, eine DNA-Sequenz, die für SST und gegebenenfalls für FFT kodiert, einen Transkriptionsterminator, operativ mit der DNA-Sequenz verbunden, wobei die DNA-Sequenz, die für SST und gegebenenfalls für FFT kodiert, funktionell mit einem Promotor, einer DNA-Sequenz, die für ein Targeting-Signal oder ein Transit-Peptid kodiert, welches das Targeting von SST und gegebenenfalls FFT auf ein spezifisches subzelluläres Kompartiment sicherstellt, verbunden ist;
b. Einführen des chimären Gens in das Genom eines Wirtsorganismus, um so genetisches Material zu erhalten, das die DNA-Sequenz umfasst, und
c. Regenerieren des genetischen Materials in einem transformierten Wirtsorganismus.

Bei der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA ist die DNA-Sequenz, die SST und gegebenenfalls FFT kodiert, vorzugsweise mit einer regulatorischen Sequenz gekoppelt, welche die richtige Expression der DNA-Sequenz in einem Wirtsorganismus, wie zum Beispiel einem Bakterium, einer Hefe, einer Alge oder einer Pflanze, bei einem ausreichend hohen Expressionsspiegel sicherstellt. Bei regulatorischen Sequenzen handelt es sich um einen Promotor, ein Terminationssignal und einen Transkriptions- oder Translationsenhancer. Bei einem Promotor kann es sich um den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus (CaMV) oder einen zuckerinduzierbaren Promotor wie den Patatin-Promotor, oder einen organspezifischen Promoter wie den knollenspezifischen Promotor des Proteinaseinhibitors II der Kartoffel, oder jeden anderen induzierbaren oder gewebespezifischen Promotor handeln.
Bei der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA ist die DNA-Sequenz, die für SST und gegebenenfalls für FFT kodiert, vorzugsweise mit regulatorischen Sequenzen gekoppelt, die in Pflanzen funktionsfähig sind und die eine richtige Expression der DNA-Sequenz in den unterschiedlichen pflanzlichen Organen, Geweben oder Zellen sicherstellen. Ein stark bevorzugter Promotor ist ein Promotor, der in Organen und Zelltypen aktiv ist, die normalerweise Sukrose (das Hauptsubstrat für die Fruktansynthese) anreichern. Die Produktion von Fruktanen ist besonders in Organen zweckmäßig, die große Mengen an Sukrose speichern, wie zum Beispiel den Pfahlwurzeln von Zuckerrüben oder den Stängeln von Zuckerrohr. Außer Wurzeln sind andere Organe oder Zelltypen an der Synthese, der Prozessierung, dem Transport und der Anreicherung von Sukrose beteiligt. Deshalb werden Sequenzen, die für SST oder FFT kodieren, auch auf geeignete Weise in Blättern, Stängeln, Wurzeln, Knollen, Fortpflanzungsorganen und Samen exprimiert.
Bei der erfindungsgemäßen rekombinanten DNA enthält die DNA-Sequenz, die für SST und gegebenenfalls für FFT kodiert, eine Sequenz oder ist mit ihr gekoppelt, die für ein Transitpeptid kodiert, welches das reife SST- und gegebenenfalls FFT-Protein in ein subzelluläres Kompartiment steuert, das Sukrose enthält. Die Produktion von Fruktanen ist besonders zweckmäßig in der Vakuole, die sehr hohe Konzentrationen von Sukrose anreichern kann (bis zu 900 mol m^–3). Außer der Vakuole sind andere subzelluläre Kompartimente an der Synthese (Zytoplasma), der Prozessierung (Zytoplasma, Mitochondrien, Plastiden) und dem Transport (Zellwand, Zytoplasma) von Sukrose beteiligt. Die vorliegende Erfindung betrifft deshalb die Verwendung von Sequenzen, die das Targeting des SST- und gegebenenfalls FFT-Produkts in spezifische subzelluläre Kompartimente, wie zum Beispiel die Vakuole, die Zellwand, Mitochondrien, Plastiden und Zytoplasma, ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Genkonstrukte, umfassend eine für SST und gegebenenfalls für FFT kodierende Sequenz, oder einen Teil der Sequenzen, wobei die kodierende Sequenz in der Antisense-Orientierung vorliegt. Bei diesen Genkonstrukten ist die für SST und gegebenenfalls für FFT kodierende Sequenz vorzugsweise an einen Promotor gekoppelt, der die Bildung einer Antisense-RNA in den Zelltypen sicherstellt, die normalerweise Fruktane synthetisieren konnten.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten DNAs können auch für Proteine kodieren, die Herbizid-Resistenz, das Pflanzenwachstum fördernde, das Pflanzenwachstum hemmende, anti-Pilz-, antibakterielle, antivirale und/oder anti-Nematoden-Eigenschaften aufweisen oder Resistenz gegen Stress verleihen. Die erfindungsgemäßen rekombinanten DNAs können weiter für Proteine kodieren, die Sterilität induzieren. Im Falle, dass die DNA in einen heterologen Organismus eingeführt werden soll, kann sie modifiziert werden, um bekannte mRNA-Instabilitätsmotive (wie zum Beispiel AT-reiche Regionen) zu entfernen; und Polyadenylierungssignale und/oder Codons, die von dem Organismus, in den die rekombinante DNA eingefügt werden soll, bevorzugt werden, werden verwendet, so dass die Expression der so modifizierten DNA in dem Wirtsorganismus höher ist als die durch Expression der unmodifizierten rekombinanten DNA im gleichen Wirtsorganismus erhaltene.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze, die ein modifiziertes Fruktanprofil aufweist, oder eine Pflanzenzelle, einen Same, eine Frucht, einen Sämling oder einen Teil der transformierten Pflanze bereit, die ein chimäres Genkonstrukt beherbergt, umfassend ein oder mehrere DNA-Fragmente wie vorstehend definiert, oder die DNA-Fragmente in der umgekehrten Orientierung, funktionsfähig mit einer in der Pflanze aktiven Promotorsequenz und einer in der Pflanze aktiven Terminatorsequenz gekoppelt. Die Erfindung schließt vorzugsweise Nutz-, Futter-, Gemüse-, Zier- und Obstpflanzen, stärker bevorzugt Zuckerrübe, Zuckerrohr, Kartoffel, Petunie, Alfalfa, Sojabohne, Reis, Roggen, Wiesenlieschgras, Weizen, Gerste, Hirse, Mais, Zichorie, Topinambur, Tulpe, Melone, Zwiebel, Knoblauch, Tomate, Erdbeere, Apfel und Birne ein. Weiter schließt diese Erfindung die Nachkommen der transformierten Pflanzen, welche die DNA stabil eingegliedert und auf Mendelsche Weise vererbbar enthalten, und/oder die Samen derartiger Pflanzen und derartige Nachkommen ein.
EXPERIMENTELLER TEIL
Reinigung von 1-SST
Knollen von Helianthus tuberosus 'Colombia' wurden zur Extraktion von 1-SST und 1-FFT verwendet. Die Knollen wurden im August – September geerntet, während der Periode von schnellem Knollenwachstum und massiver Fruktananreicherung. Die Knollen wurden gewaschen und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Vierhundert Gramm gefrorene Knollen (–80°C) wurden vermahlen und unmittelbar danach in einem Waring-Mixer in 900 cm³ 50 mol m^–3 Phosphat(P)-Puffer, pH 6,5, der 10% (Gew./Vol.) Glycerin, 1 mol m^–3 MgSO₄, 1 mol m^–3 Na₂EDTA, 1 mol m^–3 PMSF (Sigma, USA), 1 mol m^–3 DTT, 1,5% (Gew./Vol.) PVPP und 20 mol m^–3 Na₂S₂O₅ enthielt, homogenisiert. Das Homogenat wurde durch drei Lagen Miracloth filtriert und 1 h lang bei 17.000 g zentrifugiert.
Der Proteinextrakt wurde bei 4°C aufbewahrt und mit (NH₄)₂SO₄ auf 45% Sättigung gebracht. Die unlöslichen Proteine wurden durch Zentrifugation (10.000 g, 30 min) pelletiert und verworfen. Der 45% Überstand wurde durch weitere Zugabe von (NH₄)₂SO₄ auf 70% Sättigung gebracht. Das Pellet, das nach einem zweiten Zentrifugationsschritt erhalten wurde, wurde erneut in 60 cm³ 50 mol m^–3 Phosphat(P)-Puffer, pH 6,5, 1 mol m^–3 DTT und 1 mol m^–3 PMSF (Sigma, USA) gelöst und durch Dialyse gegen 10 mol m^–3 P-Puffer, pH 6,5, 1 mol m^–3 PMSF und 1 mol m^–3 DTT 16 h lang entsalzt. Nach dem Pufferaustausch wurde die Dialyse weitere 3 h lang fortgesetzt. Das ganze Verfahren wurde bei Temperaturen zwischen 0 und 4°C durchgeführt. Das zentrifugierte Dialysat (30,000 g, 30 min) wurde auf eine 25 × 120 mm große Q Sepharose Phast Flow Säule (4°C) aufgetragen, die mit 10 mol m^–3 bis Tris, pH 6,5, 1 mol m^–3 DTT, 1 mol m^–3 PMSF und 5 mol m^–3 EDTA in Milli Q Wasser vorgewaschen worden war. Gebundene Proteine wurden mit einem NaCl-Gradienten (0–300 mol m^–3) im gleichen Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 cm³ min^–1 eluiert. 1-SST eluierte bei 200–250 mol m^–3 NaCl.
Die Q Sepharose Fraktionen wurden mit festem (NH₄)₂SO₄ auf 400 mol m^–3 gebracht. Fraktionen von 20 cm³ wurden auf eine 15 × 50 mm große Säule mit Phenyl Sepharose High Performance oder Phenyl Sepharose High Substitution geladen, die mit 10 mol m^–3 bis Tris Puffer, pH 6,5, der 500 mol m^–3 (NH₄)₂SO₄, 1 mol m^–3 DTT, 1 mol m^–3 PMSF, 2 mol m^–3 EDTA und 0,1% CHAPS (Puffer A) enthielt, bei 12°C voräquilibriert worden waren. Die Elution gebundener Proteine wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von Puffer A (100–0%) ohne (NH₄)₂SO₄, der 25% (Vol./Vol.) Ethylglycol enthielt, bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 cm³ min^–1 ausgeführt. 1-SST eluierte bei 100 mol m^–3 (NH₄)₂SO₄.
Phenyl Sepharose Fraktionen bis zu 10 cm³ wurden auf eine 5 × 50 mm große Concanavalin A Sepharose Säule, die in 20 mol m^–3 bis-Tris, pH 6,5, 250 mol m^–3 NaCl, 0,5 mol m^–3 CaCl₂, 0,5 mol m^–3 MnCl₂, 1 mol m^–3 DTT und 1 mol m^–3 PMSF vorgewaschen worden war, injiziert. Gebundene 1-SST wurde mit 500 mol m^–3 α-CH₃-Mannopyranosid im gleichen Puffer eluiert.
Aktive Fraktionen eines Concanavalin A Laufs wurden vereinigt und auf eine 5 × 200 Säule, die mit kugelförmigem (15 μm) Hydroxylapatit (Merck, Deutschland) gepackt war, aufgetragen. Die Säule wurde in 2 mol m^–3 CaCl₂, 10 mol m^–3 NaCl, 1 mol m^–3 DTT, 1 mol m^–3 PMSF und 0,1% CHAPS (Puffer A) voräquilibriert. An die Säule gebundene Proteine wurden mit einem Stufengradienten von Puffer A und 500 mol m^–3 Kaliumphosphatpuffer, pH 6,5, bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml min^–1 eluiert. 1-SST eluierte bei 75–100 mol m^–3 Kaliumphosphat.
Aktive Fraktionen eines Hydroxylapatit-Laufs wurden vereinigt und auf eine 5 × 50 mm große Mono Q Säule aufgetragen, die mit 10 mol m^–3 P-Puffer, pH 6,5, 1 mol m^–3 DTT, 1 mol m^–3 EDTA und 0,1% CHAPS voräquilibriert worden war. Gebundene Proteine wurden mit einem NaCl-Gradienten (0–500 mol m^–3) bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 cm³ min^–1 eluiert. 1-SST eluierte bei 250 mol m^–3 NaCl.
Alle Säulen, Säulenpackungen und die Chromatographieausstattung wurden von Pharmacia (Schweden) erhalten, sofern nicht anders angegeben.
Reinigung von 1-FFT
Ein roher Proteinextrakt wurde wie für die Reinigung von 1-SST beschrieben aus Knollen von H. tuberosus erhalten. Der Überstand des rohen Proteinextrakts, der nach Zentrifugation erhalten wurde, wurde mit (NH₄)₂SO₄ auf 45% Sättigung gebracht und 1 h lang gerührt. Die unlöslichen Proteine wurden durch 30 min lange Zentrifugation bei 10.000 g pelletiert. Das Pellet wurde in 60 cm³ 50 mol m^–3 P-Puffer, pH 6,5, 1 mol m³ DTT und 1 mol m^–3 PMSF erneut gelöst und über Nacht gegen 10 mol m^–3 Citrat/Phosphat (C/P) Puffer, pH 4,5, der 1 mol m^–3 PMSF und 1 mol m^–3 DTT enthielt, dialysiert. Der Inhalt des Dialyseschlauchs wurde mit 0,2 M Na₂HPO₄ erneut auf pH 6,5 gebracht und die unlöslichen Proteine wurden durch 1 h lange Zentrifugation bei 30.000 g entfernt. Der Überstand wurde auf eine 25 × 120 mm große Säule mit Q Sepharose Phast Flow (Pharmacia) geladen, die mit 10 mol m^–3 P-Puffer, pH 6,5, 1 mol m^–3 DTT und 1 mol m^–3 PMSF in Milli Q Wasser (Millipore B.V., Niederlande) voräquilibriert worden war. Die Säule wurde auf 4°C gekühlt. Gebundene Proteine wurden mit einem positiven NaCl-Gradienten bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 cm³ min^–1 eluiert. 1-FFT eluierte bei 200–250 mol m^–3 NaCl.
Festes (NH₄)₂SO₄ wurde zu den Q Sepharose Fraktionen gegeben, um eine Endkonzentration von 750 mol m^–3 zu ergeben. Fraktionen von 5 cm³ wurden auf eine 15 × 50 mm große Säule mit Phenyl Sepharose High Performance (Pharmacia) geladen, die mit 10 mol m^–3 P-Puffer, pH 6,5, der 750 mol m^–3 (NH₄)₂SO₄ und 1 mol m^–3 DTT enthielt, voräquilibriert worden war. Gebundene Proteine wurden mit einem negativen (NH₄)₂SO₄-Gradienten bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 cm³ min^–1 bei 12°C eluiert. 1-FFT eluierte bei 450–400 mol m^–3(NH₄)₂SO₄.
Phenyl Sepharose Fraktionen (bis zu 4 cm³) wurden auf eine 16 × 600 mm große Hiload Superdex 75 Säule mit Präparationsqualität (Pharmacia) geladen, die in 10 mol m^–3 P-Puffer, pH 6,5, und 1 mol m^–3 DTT vorgewaschen wurde. Proteine wurden im gleichen Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 cm³ min^–1 bei 20°C eluiert. 1-FFT eluierte 95–105 min nach der Injektion.
1-FFT- und 1-SST-Assays
Die 1-FFT Aktivität von Säulenfraktionen wurde routinemäßig bei 35°C analysiert. Aliquots von 25 mm³ wurden mit 25 mm³ 0,3 g Neosugar P (Meiji Seika Kaisha, Ltd, Tokio, Japan: Neosugar besteht aus 1% Hexosen, 4% Sukrose, 42% G-(F)₂, 44% G-(F)₃ und 7% G-(F)₄) pro cm³ 100 mol m^–3 C/P-Puffer, pH 6,5, gemischt. Nach 3 h wurde die Reaktion durch 5 min langes Kochen des Inkubationsgemisches in einem Wasserbad angehalten. Ein Nettogewinn an GF₄ wurde als Maß für die 1-FFT Aktivität genommen.
Für die 1-SST Aktivität wurden Säulenfraktionen von 15 mm³ mit 15 mm³ 500 mol m^–3 GF in 100 mol m^–3 C/P-Puffer, pH 5,0, gemischt und 3 h lang bei 35°C inkubiert. Die Synthese von GF₂ wurde als Maß für die 1-SST Aktivität genommen.
Analyse von Zuckern und Fruktanen
Sukrose und Oligofruktane wurden durch RP-HPLC unter Verwendung einer 2,1 × 220 mm großen Speri-5 RP 18 Säule (Brownlee Labs, Santa Clara, USA) analysiert. Milli Q Wasser wurde als Elutionsmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 cm³ min^–1 bei 37°C verwendet. Glucose und Fruktose wurden auf einer 6,5 × 300 mm großen Shodex SC-1011 Säule (Millipore B.V., Waters Chromatography Division, Niederlande) quantifiziert, die man bei 85°C mit Milli Q Wasser bei 0,75 cm³ min^–1 laufen ließ. Zucker wurden mit einem Brechungsindex-Detektor 2142 (RID, Pharmacia) nachgewiesen. Die Identifikation von Oligofruktanen wurde durch Vergleich ihrer Retentionszeiten mit denjenigen von den aus Neosugar P oder aus H. tuberosus gereinigten Oligofruktanen und durch die Glucose/Fruktose-Verhältnisse der einzelnen Oligofruktane durchgeführt (Koogs und Jonker, 1994).
HPAEC-Analysen von Oligofruktanen und Fruktanen mit einem höheren Polymerisationsgrad wurden auf einem Dionex Ionenchromatographen der Reihe 4000 durchgeführt, der mit einer 250 × 4 mm großen CarboPac PA1 Anionenaustauschsäule und einer 25 × 3 mm großen CarboPac PA Guard-Säule ausgestattet war. Fruktane wurden mit einem 60 min dauernden linearen Gradienten von 0,25 bis 0,4 mol m^–3 NaAc in 0,1 mol m^–3 NaOH bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml min^–1 getrennt. Der Nachweis erfolgte durch gepulste Amperometrie (PAD) mit einer Arbeitselektrode aus Gold. Das angewandte Potenzial eines Pulses wurde bei 0,1, 0,6 und –0,6 V 0,5, 0,1 beziehungsweise 0,05 Sekunden lang gehalten. Rhamnose wurde als interner Standard verwendet. Fruktane wurden durch Vergleich ihrer Retentionszeiten mit denjenigen von Fruktanstandards identifiziert, die gemäß dem Verfahren von Heinze und Praznik (1991) aus H. tuberosus isoliert und gereinigt wurden.
Aminosäuresequenzierung von 1-SST und 1-FFT
Mono Q Fraktionen von 1-SST oder Superdex 75 Fraktionen von 1-FFT wurden entsalzt und durch Zentrifugation in Centricon 10 (2 cm³) Ultrafiltrationsvorrichtungen (Grace B.V., Amicon Abteilung, Niederlande) konzentriert und anschließend durch Präzipitation in 80% (Vol./Vol.) wässrigem Aceton bei –20°C gewonnen. 1-SST und 1-FFT (jeweils 50 μg) wurden in SDS-Puffer gelöst (Laemmli, 1970) und auf einem vorgegossenen ExcelGel SDS mit einem Gradienten von 8–18 getrennt. Proteine wurden gemäß Rosenfeld et al. (1992) mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt. Die gefärbten Banden von 1-SST (2 Banden; wegen der ihr eigenen Labilität wird 1-SST durch die SDS-Behandlung gespalten) und 1-FFT wurden mit einem Skalpell ausgeschnitten und gewaschen, getrocknet und gemäß dem Verfahren von Rosenfeld et al. (1992) teilweise rehydriert. Trypsin mit Sequenzierqualität (0,5 μg; Boehringer, Deutschland) wurde zu der Gelscheibe gegeben und ein Verdau der Proteine im Gel wurde 4 h lang bei 30°C ausgeführt. Die so erhaltenen Peptide wurden durch zwei Extraktionen von jeweil 20 min mit 50 μl Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Tween 20 (60:40:0,001:0,0002, Vol./Vol.) gewonnen. Das so erhaltene Peptidgemisch wurde durch präparative RP-HPLC auf einer 9,3 × 250 mm großen SuperPac Pep-S Säule (Pharmacia) aufgetrennt, die mit einem linearen Gradienten von 0,1% TFA in 0 bis 60% wässrigem Acetonitril bei einer Fließgeschwindigkeit von 4 ml min^–1 eluiert wurde. Einzelne Peptidfraktionen wurden manuell gewonnen und bei –80°C aufbewahrt. Die Aminosäuresequenzen ausgewählter Peptide wurden durch Edman-Abbau unter Verwendung eines Pulsed-Liquid-Sequenziergerätes Modell 477A bestimmt, das online mit einer RP-HPLC-Einheit Modell 120A (Applied Biosystems) verbunden war. Für 1-SST oder FFT spezifische Aminosäuresequenzen wurden in die entsprechenden degenerierten DNA-Sequenzen translatiert (Beispiel 1, Tabelle 1), die wiederum als Primer für die PCR verwendet wurden.
DNA-Methodik
DNA- und RNA-Isolierung, Subklonierung, Restriktionsanalyse und Sequenzierung wurden unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt, die in Handbüchern der Molekularbiologie beschrieben werden (Sambrook et al. 1989, Ausubel et al. 1994).
cDNA-Synthese
Poly(A)⁺RNA wurde aus Knollen von H. tuberosus 'Colombia' isoliert. Einzelsträngige cDNA wurde aus 10 μg poly(A)⁺RNA durch reverse Transkriptase mit dem folgenden endspezifischen Primer für die poly(A)⁺RNA synthetisiert:
5'-CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG(T)₁₅-3'
PCR
Für 1-SST oder 1-FFT spezifische degenerierte Oligonucleotide und der endspezifische Primer, 5'-CCGAATTCAATACGACTCACTATAGCG-3', wurden zur Amplifikation der einzelsträngigen cDNA verwendet. Die PCR wurde in 50 μl PCR-Puffer (Life Technologies) durchgeführt, der 100 pmol cDNA-Matrize, 100 pmol des endspezifischen Primers und 100 pmol der für 1-SST oder 1-FFT spezifischen Primer enthielt. Die Amplifikation beinhaltete 30 Zyklen Denaturierung (1 min, 92°C), Anlagerung (1 min, 42°C) und Amplifikation (1 min, 72°C). Die so erhaltenen Fragmente wurden in 0,7% Agarose elektrophoretisch aufgetrennt, aus dem Gel ausgeschnitten, aus der Agarosematrix isoliert und in den Vektor pMOSBlue (Amersham) subkloniert. Durch PCR erzeugte, für 1-SST und 1-FFT spezifische Fragmente wurden verwendet, um eine Uni-ZAP XR cDNA-Bank zu durchmustern.
Konstruktion und Durchmusterung einer cDNA-Bank
Zehn μg poly(A)⁺RNA aus Knollen von H. tuberosus 'Colombia' wurden als Ausgangsmaterial für die Konstruktion einer Uni-ZAP XR cDNA-Bank (Stratagene) verwendet. Konstruktion, Ausplattierung und Durchmusterung der Bank wurden gemäß den von Stratagene (La Jolla, Kalifornien, Kat. nr. 237211) entwickelten Protokollen durchgeführt. ³²P-markierte, für 1-SST oder 1-FFT spezifische DNA-Sonden wurden durch zufälliges Oligonucleotidpriming hergestellt und verwendet, um etwa 100.000 Plaques zu durchmustern. Die Hybridisierung und das Waschen einer Hybond-N Membran wurden unter Bedingungen hoher Stringenz durchgeführt (Hybridisierung bei 65°C, letzter Waschschritt mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS, 65°C). Positive Klone wurden gereinigt, die pBluescript Phagemids unter Verwendung des Exassist/Solr Systems (Stratagene) aus dem Uni-ZAP Vektor ausgeschnitten, und die Inserts durch Restriktionsenzymanalyse, Hybridisierung und Sequenzierung analysiert.
Analyse transgener Pflanzen
Analyse von Zuckern und Fruktanen
50 mg Blattgewebe wurde in flüssigem N₂ eingefroren und in 0,1 cm³ Milli Q Wasser in einem Eppendorfröhrchen homogenisiert. Das Homogenat wurde 5 min lang auf 90°C erwärmt, dann 10 min lang bei 14.000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde durch DC analysiert: 2 μl des Überstands wurden auf eine Silicagel G 1500 Platte (Schleicher & Schuell) getropft. Die DC-Platten wurden zweimal mit entweder Aceton, Wasser (9:1, Vol./Vol.) oder Butan-1-ol, Propan-2-ol und Wasser (3:12:4, Vol./Vol.) entwickelt. Kohlenhydrate wurden durch Besprühen der DC-Platten mit Harnstoff-Phosphorsäure sichtbar gemacht (Wise et al. 1955).
1-FFT Assay
Blattgewebe (50 mg) wurde in flüssigem N₂ eingefroren und in 0,1 cm³ 25 mol m^–3 Phosphat(P)-Puffer, pH 6,5, der 2 mol m^–3 MgSO₄, 2 mol m^–3 Na₂EDTA, 2 mol m^–3 PMSF (Sigma, USA), 2 mol m^–3 DTT, 1,5% (Gew./Vol.) lösliches PVPP (Merck) und 20 mol m^–3 Na₂S₂O₅ enthielt, in einem Eppendorfröhrchen homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 4°C 10 min lang bei 14.000 g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde für den 1-FFT- Assay verwendet. Fünzig μl des Überstands wurden mit 50 μl eines Assaygemisches gemischt, das 2 mol m^–3 G-(F)₃, 80 mol m^–3 G-(F)₄, 50 mol m^–3 Citrat/Phosphatpuffer, pH 5,5, und 0,02% (Gew./Vol.) NaN₃ enthielt. Das Assaygemisch wurde im Dunkeln bei 28°C inkubiert. Proben von 15 μl wurden nach 4, 20, 44 und 68 h Inkubation genommen und durch DC analysiert.
BEISPIELE
Beispiel 1. Reinigung der Sukrose:Sukrose Fruktosyltransferase (1-SST) und Fruktan Fruktosyltransferase (1-FFT) und Isolierung von cDNAs, die für 1-SST und 1-FFT kodieren
1-SST und 1-FFT wurden unter Verwendung von Präzipitationstechniken, mehreren aufeinanderfolgenden Chromatographieverfahren und Elektrophorese aus Knollen von Helianthus tuberosus gereinigt. Fraktionen mit 1-SST Aktivität, die von der Mono Q Säule eluierten, ergaben eine Bande nach nativer PAGE. 1-SST wird durch SDS gespalten, deshalb ergab die Analyse durch SDS-PAGE zwei Banden von 27 und 55 kDa (1, Spur 2). Fraktionen mit 1-FFT Aktivität, die von der Superdex 75 Gelpermeationssäule eluierten, ergaben auf SDS-PAGE eine Bande mit einem geschätzten Molekulargewicht von 70 kDa (1, Spur 3). 1-SST allein war fähig, Oligofruktane aus Sukrose als alleinigem Substrat zu synthetisieren (3A, 80 h Inkubation). Durch erneutes Kombinieren von gereinigter 1-SST mit gereinigter 1-FFT konnte Sukrose in Fruktane mit einem Polymerisationsgrad von zumindest 15 umgewandelt werden [G-(F)₁₄, 3B, 80 h Inkubation].

Zur Aminosäuresequenzierung durch das Edman Abbauverfahren (mit Phenylisothiocyanat) wurden die Proteinbanden mit 27 kDa (1-SST), 55 kDa (1-SST) und 70 kDa (1-FFT) aus dem SDS-PAGE-Gel ausgeschnitten und einem proteolytischen Verdau durch Trypsin unterworfen. Die so erhaltenen Peptidgemische wurden in getrennten Läufen durch RP-HPLC aufgetrennt (2A–C). Die Peptide, die nach 26 min und 37 min (beide von dem 25 kDa großen Fragment von 1-SST, 2A), 27 min, 34 min und 37 min (von dem 55 kDa Fragment von 1-SST, 2B), 28 min und 32 min (von 1-FFT, 2C, die bei 32 min eluierende Fraktion enthielt die Peptide 7 und 8) eluierten, wurden manuell gewonnen und einer N-terminalen Aminosäuresequenzierung unterworfen (Tabelle 1). Tabelle 1. Aminosäuresequenzen ausgewählter Peptide, die nach tryptischem Verdau von 1-SST (Polypeptide mit 25 und 55 kDa) und 1-FFT erhalten wurden, und Trennung der so erhaltenen Peptidgemische durch RP-HPLC.

Protein	Aminosäuresequenz	DNA-Sequenz des PCR-Primers
1 1-SST, 25 kDa	ADVLF??TTSEGSVAR
2 dasselbe	EQLPVYFYIAK	5'-GARCARYTNCCNGTNTAYTTYTAYA THGCNAAR-3'
3 1-SST, 55 kDa	VVLDLETK
4 dasselbe	FRDPSTLWL?PDGEY
5 dasselbe	GWANIL
6 1-FFT	GWATVYNVGR	5'-GGNTGGGCNACNGTNTAYAAY-3'
7 dasselbe	LLVDHSIVEGFAQGGR	5'-ATHGTNGARGGNTTYGCNCAR-3
8 dasselbe	VGESDS

Die Aminosäuresequenzen 2 (1-SST, 25 kDa), 6 und 7 (1-FFT) wurden verwendet, um für 1-SST oder 1-FFT spezifische DNA-Primer zu entwerfen, die zur PCR verwendet wurden. Eine PCR unter Verwendung der Primer 2, 6 oder 7 ergab DNA von etwa 450, 800 bp beziehungsweise 300 bp. Eine verschachtelte PCR unter Verwendung von Oligonucleotid 7 als spezifischem Primer und dem 800 bp großen PCR-Fragment als Matrize ergab wieder das 300 bp große PCR-Fragment, was anzeigte, dass das 300 bp große Fragment in dem 800 bp großen Fragment enthalten ist.
Eine Uni-ZAP cDNA-Bank, die aus mRNA konstruiert wurde, die aus Knollen von H. tuberosus isoliert worden war, wurde entweder mit dem 450 bp großen 1-SST- oder dem 800 bp großen 1-FFT-Fragment durchmustert. Eine Durchmusterung von etwa 100.000 cDNA-Klonen ergab etwa 20 positive Klone, die mit dem 450 bp großen Fragment hybridisierten und 25 Klone, die mit dem 800 bp großen Fragment hybridisierten. DNA von Klonen, die mit dem 450 bp großen Fragment hybridisierten, hybridisierte nicht mit dem 800 bp großen Fragment und umgekehrt. Positive Klone wurden gereinigt, die pBluescript Phagemids aus dem Uni-ZAP Vektor ausgeschnitten und das Insert durch Restriktionsenzymanalyse, Hybridisierung und Sequenzierung charakterisiert.
Die DNA-Sequenzen von 1-SST und 1-FFT und ihre entsprechenden Aminosäuresequenzen werden in 4A beziehungsweise 4B vorgelegt. Die Sequenz ID Nr. 1, die für 1-SST kodiert, weist einen offenen Leserahmen von 1890 Basenpaaren auf und kodiert für eine Protein mit 630 Aminosäureresten. Auf der DNA-Ebene zeigt 1-SST eine Identität von 68% mit der cDNA für lösliche saure β-Fruktofuranosidase (= saure Invertase) aus der Karotte (Daucus carota). Auf der Aminosäureebene zeigt 1-SST eine Ähnlichkeit von 66% zu der löslichen sauren β-Fruktofuranosidase aus der Karotte.
Die Sequenz ID Nr. 2, die für 1-FFT kodiert, weist einen offenen Leserahmen von 1845 Basenpaaren auf und kodiert für ein Protein mit 615 Aminosäureresten und einem Molekulargewicht von etwa 69 kDa. Dies entspricht dem Molekulargewicht des gereinigten Proteins 1-FFT, wie durch SDS-PAGE etabliert wurde (Koogs und Jonker, 1994). Auf der DNA-Ebene zeigt 1-FFT eine Identität von 65% mit der cDNA für lösliche saure β-Fruktofuranosidase (= saure Invertase) aus der Karotte (Daucus carota). Auf der Aminosäureebene zeigt 1-FFT eine Ähnlichkeit von 60% zu der löslichen sauren β-Fruktofuranosidase aus der Karotte.
Obowhl 1-SST und 1-FFT einen relativ hohen Homologiegrad mit saurer Invertase aufweisen, ist gezeigt worden, dass 1-SST oder 1-FFT und Invertase deutlich unterschiedliche Enzmye sind. Es ist gezeigt worden, dass 1-SST und 1-FFT die Hydrolyse von Sukrose nicht katalysieren können (Invertase Aktivität). Eine hydrolytische Aktivität von gereinigter 1-SST und 1-FFT gegenüber Sukrose ist in einem Bereich von pH-Werten und Sukrosekonzentrationen getestet worden. Unter keiner dieser Bedingungen gab es eine signifikante Invertase Aktivität (Koops und Jonker 1994). Keine höhere Homologie als 68% wurde zwischen der für 1-SST kodierenden DNA-Sequenz und irgendeiner bekannten DNA-Sequenz in den Nucleotidsequenzdatenbanken PDB, GENBANK, GENBANK-Aktualisierungen, EMBL und EMBL-Aktualisierungen beobachtet. Keine höhere Homologie als 65% wurde für die für 1-FFT kodierende DNA-Sequenz mit irgendeiner bekannten DNA-Sequenz in den Nucleotidsequenzdatenbanken PDB, GENBANK, GENBANK-Aktualisierungen, EMBL und EMBL-Aktualisierungen beobachtet.
Beispiel 2. Konstruktion eines chimären sst-Gens
Der cDNA-Klon voller Länge für sst, der mit ASST 103 bezeichnet wird, wurde zur Einführung einer Ncol-Stelle am ATG (Position 34) und einer EcoRV-Stelle stromabwärts des Stopp-Codons (an der Position 1924) unter Verwendung von PCR verwendet. Aus dem Plasmid pMOG18 (Pen et al., 1992), das den verstärkten CaMV 35S-Promotor, die Leadersequenz von ALMV, das Gen uidA und die nos Terminatorsequenz enthält, wurde die für uidA kodierende Sequenz durch die cDNA für sst ersetzt. pMOG18 wurde mit BamHl verdaut, mit Klenow DNA-Polymerase aufgefüllt und mit Ncol vedaut. Das mit Ncol und EcoRl geschnittene sst PCR-Fragment wurde in diesen Vektor ligiert, was zu dem Klon pSST217 führte. Das EcoRl/Hindll-Fragment von pSST217, welches das vollständige chimäre Konstrukt enthielt (35S verstärkt +ALMV-sst-nos), wurde in die EcoRl und Hindlll Stelle von pBINPLUS (Van Engelen et al., 1995) kloniert, einem von pBIN19 (Bevan, 1984) abgeleiteten binären Pflanzentransformationsvektor, was das Plasmid pVS1 (5A) ergab.
Beispiel 3. Konstruktion eines chimären fft-Gens
Der cDNA-Klon voller Länge für fft, der mit pFFT 111 bezeichnet wird, wurde zur Einführung einer Ncol-Stelle am ATG (Position 29) und einer BamHl-Stelle stromabwärts des Stopp-Codons (an der Position 1874) unter Verwendung von PCR verwendet. Aus dem Plasmid pMOG18 (Pen et al., 1992), das den verstärkten CaMV 35S-Promotor, die Leadersequenz von ALMV, das Gen uidA und die nos Terminatorsequenz enthält, wurde die für uidA kodierende Sequenz durch die cDNA für fft ersetzt. Das mit Ncol und BamHl verdaute PCR-Fragment wurde in den mit Ncol und BamHl verdauten Vektor pMOG18 ligiert, was zu dem Klon pFFT209 führte. Das Hindlll/EcoRl-Fragment von pFFT209, welches das vollständige chimäre Konstrukt enthielt (35S verstärkt +ALMV-fft-nos), wurde in die Hindlll und EcoRl Stelle von pBINPLUS (Van Engelen et al., 1995) kloniert, einem von pBIN19 (Bevan, 1984) abgeleiteten binären Pflanzentransformationsvektor, was das Plasmid pVF1 (56) ergab.
Beispiel 4. Transformation von Petunia- und Kartoffelpflanzen
Die binären Vektoren pVS1 und pVF1 (5) wurden durch triparentale Konjugation von E. coli XL1-Blue auf den Agrobacterium tumefaciens Stamm AGL0 übertragen (Ditta et al., 1980). Exkonjuganten wurden verwendet, um Blattscheiben von Petunia hybride wie von Horsch et al. (1985) beschrieben zu transformieren. Von den oberen Blättern junger, nicht blühender Pflanzen wurden Blattscheiben hergestellt. Die Sorte W115 von P. hybride wurde für die Transformationsexperimente verwendet. Exkonjuganten wurden auch verwendet, um Stängelexplantate der diploiden Kartoffel (Solanum tuberosum, Sorte Kardal) wie zuvor beschrieben zu transformieren (Visser, 1991). Nach der Regeneration von Trieben und Wurzeln auf kanamycinhaltigen Medien wurden die Pflanzen in den Boden gesetzt und in das Gewächshaus übertragen. Aus Blattscheiben (auf kanamycinfreien Medien) regenerierte Pflanzen und Stängelexplantate, die mit dem Agrobacterium Stamm AGL0 ohne binären Vektor behandelt wurden, dienten als Kontrolle.
Beispiel 5. Analyse transgener Pflanzen, welche die sst- und fft-Gene exprimieren
Etwa 25 transgene Petunie-Pflanzen und 25 transgene Kartoffelpflanzen, die das Konstrukt pVS1 beherbergten, und 25 transgene Petunia- und Kartoffelpflanzen, die das Konstrukt pVF1 beherbergten, wurden erzeugt. Zehn Petunia- und zehn Kartoffelpflan zen wurden mit dem Agrobacterium Stamm AGL0 ohne binären Vektor transformiert. Diese Pflanzen wurden als Kontrolle verwendet. Eine Southern-Blot-Analyse der aus diesen transformierten Pflanzen isolierten genomischen DNA zeigt, dass im Durchschnitt 1–5 Kopien der eingeführten chimären Gene integriert waren (Daten nicht gezeigt).
Die Kohlenhydratzusammensetzung transgener Pflanzen wurde durch zwei im Wesentlichen unterschiedliche Techniken analysiert: Dünnschichtchromatographie (DC), die Kohlenhydrate auf der Grundlage der Flüssig-Flüssig-Verteilung auftrennt (nach DC wurden die Fruktane durch eine für Fruktose spezifische Farbreaktion nachgewiesen), und HPAEC, die Kohlenhydrate bei alkalischen Bedingungen (pH 13) auf der Grundlage der Ladung auftrennt und Kohlenhydrate durch Oxidation mit einer Arbeitselektrode aus Gold nachweist. Eine Analyse von Blätterextrakten aus der Kartoffel und Petunia-Pflanzen, die das pVS1 Konstrukt beherbergten, zeigte, dass beide transgene Pflanzenarten Produkte enthalten, die das Ergebnis der SST Aktivität sind. DC zeigte die Anwesenheit zumindest des Trisaccharids G-(F)₂ und sehr wahrscheinlich auch des Tetrasaccharids G-(F)₃ und des Pentasaccharids G-(F)₄ in Extrakten von Kartoffelblättern, während diese Oligofruktane in der Kontrollpflanze abwesend waren (6). Die Anwesenheit von G-(F)₂ und G-(F)₃ in Blätterextrakten von Kartoffel, aber auch von transgenen P. hybrida Pflanzen wurde durch eine HPAE Analyse (7 und 8) demonstriert. HPAEC, die empfindlicher und spezifischer als DC ist, zeigte auch eine kleine Menge an G-(F)₄ in der transgenen Kartoffel auf (8). Die Ergebnisse der 6–8 zeigen klar an, dass das sst Gen sowohl in P. hybrida als auch in der Kartoffel in ein enzymatisch aktives SST Protein exprimiert wird.
Transgene Pflanzen, die das Konstrukt pVF1 beherbergten, enthielten keine Fruktane, weil FFT Oligofruktane (wie zum Beispiel G-(F)₂ oder G-(F)₃) als Ausgangssubstrate für die Synthese von Fruktanen benötigt. Oligofruktane liegen in Pflanzen, denen SST Aktivität fehlt, wie zum Beispiel der Wildtyp-Kartoffel oder Petunia, oder transgenen Pflanzen, die nur das Konstrukt pVF1 enthalten, nicht vor. Die Anwesenheit von FFT Aktivität in transgenen Pflanzen, die das Konstrukt pVF1 beherbergen, wird deshalb durch Messungen der FFT Aktivität bestätigt. Der zum Auswerten der Anwesenheit einer aktiven FFT in transgenen Kartoffeln verwendete FFT-Assay beruhte auf der Fähigkeit von FFT, die Synthese von G-(F)_n, n > 4, auf Kosten von G-(F)₄ zu katalysieren. Der gesamte Blattproteinextrakt aus Kartoffelpflanzen, die das Konstrukt pVF1 beherbergen, wurde mit einem G-(F)₄ enthaltenden Assaygemisch gemischt, und die Anwesenheit von Fruktanen mit einem höheren Polymerisationsgrad (G-(F)_n, n > 4) wurde durch DC untersucht. Schon nach 4 h Inkubation konnten G-(F)₅ und G-(F)₆ nachgewiesen werden. Nach 44 h Inkubation konnten Fruktane mit einem Polymeri sationsgrad höher als 4, einschließlich G-(F)₄, G-(F)₅, G-(F)₆, G-(F)₇ und G(F)₈, nachgewiesen werden, während diese Fruktane in den Kontrollgemischen abwesend waren (9). Dies zeigt an, dass auch das fft Gen in ein enzymatisch aktives FFT Protein exprimiert wird.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Analyse von Mono Q Fraktionen der Reinigung von 1-SST und Superdex HR 75 Fraktionen der Reinigung von 1-FFT auf SDS-PAGE. Spur 1, Molekulargewichtsmarker (das Mol.gew. wird in kDa angegeben); Spur 2, Mono Q Fraktion mit 1-SST Aktivität; Spur 3, Superdex HR 75 Fraktionen mit 1-FFT Aktivität.
2. RP-HPLC Trennungen tryptischer Verdaus von: a. dem 25 kDa großen Polypeptid von 1-SST (A); b. dem 55 kDa großen Polypeptid von 1-SST (B); c. dem 70 kDa großen Polypeptid von 1-FFT (C). Frei eluierende Peptidfraktionen, die mit Pfeilen angezeigt sind, wurden manuell gewonnen und einer Aminosäuresequenzierung unterworfen.
3. HPAEC Trennung von Oligofruktanen, die durch gereinigte 1-SST (A) und durch ein Gemisch gereinigter 1-SST und gereinigter 1-FFT (B) aus Sukrose synthetisiert wurden. Die Reaktionen wurden in 100 mol m^–3 Sukrose, 2 mol m^–3 DTT, 10 mol m^–3 Citrat/Phosphatpuffer, pH 5,0, 0,01% Na-Azid bei 25°C durchgeführt. Die Reaktionszeit betrug 80 h. Die Reaktion wurde durch 5 min langes Kochen des Reaktionsgemisches angehalten. Rhamnose wurde als interner Standard verwendet.
4. Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz der isolierten cDNA für 1-SST (A) und 1-FFT (B). Die durch Aminosäuresequenzierung (siehe auch Tabelle 1) der gereinigten 1-SST und 1-FFT Proteine bestimmten Aminosäuren sind unterstrichen.
5. Genkonstrukte pVS1 (A) und pVF1 (B). Die chimären Konstrukte bestehen aus dem verstärkten CaMV 35S Promotor mit einem Translationsenhancer von ALMV (X), der kodierenden Sequenz von sst (Y) oder fft (W) und dem nos Terminationssignal (Z). Restriktionsstellen, die beim Klonierungsverfahren verwendet wurden, werden angezeigt.
6. DC Analyse von Fruktanen in transgenen Kartoffelpflanzen, die das Konstrukt pSF1 beherbergen. DC-Platten wurden zweimal in 90% wässrigem Aceton entwickelt. S = Sukrosestandard, G = Glucosestandard, F = Fruktosestandard, H = Standard-Fruktangemisch aus Knollen von H. tuberosus, N = Neosugar-Standard, K = G-(F)₂-Standard. Nr. 1–6 stellen einzelne Kartoffelpflanzen dar, die das Konstrukt pVS1 beherbergen. C ist eine Kontrollpflanze, die das Konstrukt AGL0 beherbergt.
7. HPAEC Trennungen von aus Blättern von Petunia hybrida, die das Konstrukt pVS1 beherbergen, extrahierten Kohlenhydraten (a), einem aus Knollen von H. tuberosus extrahierten Standard-Fruktangemisch (b) und Kohlenhydraten aus Blättern der Kontroll-Petunia, die das Konstrukt AGLO beherbergt (c).
8. HPAEC Trennungen von Kohlenhydraten, die aus Blättern von Kartoffeln (Solanum tuberosum) extrahiert wurden, die das Konstrukt pVS1 beherbergen (a), einem aus Knollen von H. tuberosus extrahierten Standard-Fruktangemisch (b) und Kohlenhydraten aus Blättern der Kontroll-Kartoffel, die das Konstrukt AGL0 beherbergt (c).
9. DC Analyse von Fruktanen, die durch Proteinextrakte aus Blättern transgener Kartoffelpflanzen, die das Konstrukt pVF1 beherbergen, aus G-(F)₄ synthetisiert wurden. Die DC-Platten wurden zweimal in Butan-1-ol, Propan-2-ol und Wasser (3:12: 4, Vol./Vol.) entwickelt. S = Sukrosestandard, N = Neosugar-Standard, H = Standard-Fruktangemisch aus Knollen von H. tuberosus. Nr. 1–8 stellen unterschiedliche einzelne transgene Kartoffelpflanzen dar, die das Konstrukt pVF1 beherbergen. C₁ und C₂ sind Kontrollpflanzen, die das Konstrukt AGL0 beherbergen.
DEFINITIONEN UND ABKÜRZUNGEN
Die Fruktannomenklatur entspricht Lewis (1993).
Fruktosyleinheit: ein Fruktosemolekül, das an ein anderes Zuckermolekül (z. B. Glucose, Fruktose oder Galaktose) gekoppelt ist. Abgekürzt als – F (z. B. in G-F) oder – F-(z. B. G-F-F). Für Moleküle, die aus mehr als einer Fruktosyleinheit bestehen (z. B. G-F-F-F-F-F-F), wird eine verkürzte Schreibweise verwendet, [G-(F)₆] oder GF₆. G-(F)₆ besteht aus einer Glucosyl- und 6 Fruktosyleinheiten. G-(F)₆ besteht aus einer Fruktosyl-Glucose Verknüpfung und 5 Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen.
Oligofruktane: Jede Verbindung mit ein, zwei oder drei Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen (eine Glucose kann vorliegen, ist aber nicht nötig). In der vorliegenden Anmeldung wurde der Begriff Oligofruktane verwendet, um die Produkte der SST Aktivität zu bezeichnen [G-(F)₂, G-(F)₃ und G-(F)₄]. Oligofruktane werden allgemeiner als kurzkettige Fruktane oder Fruktane mit einem niedrigen Polymerisationsgrad bezeichnet. In der vorliegenden Anmeldung schließen Oligofruktane auch Verbindungen ein, die aus 2, 3 oder 4 Fruktosyleinheiten bestehen, denen aber die Glucosyleinheit fehlt.
Fruktane: Jede Verbindung, in der ein oder mehrere Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen die Mehrheit der Verknüpfungen ausmachen (eine Glucose kann vorliegen, ist aber nicht nötig). Fruktan wird als numeratives Nomen verwendet, wenn die Materialien, auf die es sich bezieht, chemisch verschieden sind (z. B. die Fruktane G-(F)₂ und G-(F)₁₃). In der vorliegenden Anmeldung werden Fruktane als Produkte der FFT Aktivität definiert (G-F_n, 2 ≤ n ≤ ± 60). Sofern nicht anders angegeben schließen Fruktane auch Oligofruktane ein. Um eine beschränkte Gruppe von Fruktanen zu bezeichnen, wird die Schreibweise "G-F_n, n =.." verwendet. In der vorliegenden Anmeldung schließen Fruktane auch Verbindungen ein, die aus mehr als 1 Fruktosyleinheit bestehen, denen aber die Glucosyleinheit fehlt.
Inulin: Fruktan, das vorwiegend die β-2,1-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfung aufweist (eine Glucose kann vorliegen, ist aber nicht nötig). Die kumulative gegenüber der numerativen Verwendung als Nomen ist die gleiche wie für das vorstehend erwähnte Fruktan.
Levan: Fruktan, das vorwiegend die β-2,1-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfung aufweist (eine Glucose kann vorliegen, ist aber nicht nötig). Levan wird auch verwendet, um Fruktane aus bakteriellem Ursprung zu bezeichnen, obwohl bakterielle Fruktane nicht immer vorwiegend aus β-2,6-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen bestehen. Zum Beispiel haben die durch Levansucrase aus Bacillus subtilus synthetisierten Fruktane vorwiegend β-2,1-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfungen (Inulin). Die kumulative gegenüber der numerativen Verwendung von Levan als Nomen ist die gleiche wie für Fruktan.
Levansucrase: Enzyme bakteriellen Ursprungs, die an der Synthese von Fruktan beteiligt sind.
Sukrose: Sukrose Fruktosyltransferase (SST): Von Pflanzen abgeleitetes Enzym, das den Anfangsschritt der Fruktansynthese katalysiert (Reaktion 2). Das Enzym kann auch an der Synthese von Oligofruktanen beteiligt sein [(G-F_n, 2 ≤ n ≤ 4] (Reaktion 3). In der vorliegenden Anmeldung kann die Bezeichnung SST entweder 1-SST, eine an der Biosynthese von Oligofruktanen, die vorwiegend die β-2,1-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfung aufweisen, beteiligte Form von SST; oder 6-SST, eine an der Biosynthese von Oligofruktanen, die vorwiegend die β-2,6-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfung aufweisen, beteiligte Form von SST; oder 1-SST und 6-SST einschließen.
Fruktan: Fruktan Fruktosyltransferase (FFT): Von Pflanzen abgeleitetes Enzym, das an der Synthese von Fruktanen beteiligt ist. Enzym, das die Synthese von Oligofruktanen und Fruktanen eines höheren Polymerisationsgrades katalysieren kann. FFT aus H. tuberosus weist eine mit SST aus H. tuberosus (Reaktion 3) überlappende Aktivität auf, kann aber den Anfangsschritt der Fruktansynthese (Reaktion 2) nicht katalysieren. In der vorliegenden Anmeldung kann die Bezeichnung FFT entweder 1-FFT, eine an der Biosynthese von Oligofruktanen, die vorwiegend die β-2,1-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfung aufweisen, beteiligte Form von FFT; oder 6-FFT, eine an der Biosynthese von Oligofruktanen, die vorwiegend die β-2,6-Fruktosyl-Fruktose Verknüpfung aufweisen, beteiligte Form von FFT; oder 1-FFT und 6-FFT einschließen.
Invertase: β-Fructosidase oder β-Fructofuranosidase.
Polymerisationsgrad (DP): Begriff zum Anzeigen der gesamten Menge an Fruktosyl- und Glucosyleinheiten; zum Beispiel hat G-(F)₂ einen DP von 3. Der n-Wert in G-F_n steigt mit ansteigendem Polymerisationsgrad an.
Fruktanprofl: Begriff zum Beschreiben der Fruktangröße/des Verteilungsmusters oder alternativ dazu, der relativen Mengen und Arten der Fruktane, in einem Extrakt, der zum Beispiel von einer Pflanze, einem Pflanzenorgan oder einer Pflanzenzelle abgeleitet ist. Das derzeit verlässlichste Verfahren zum Analysieren eines Fruktanmusters eines Extrakts ist durch Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie und Nachweis mit gepulster Amperometrie (Chatterton et al. 1990).
Helianthus tuberosus: Topinambur.
Cichorium intybus: Zichorie.
HPLC: Hochleistungsflüssigchromatographie. Technik zur Trennung komplexer Gemische von Verbindungen. Varianten dieser Technik sind Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP HPLC) oder Hochleistungs-Anionenaustauschchromatographie in Kombination mit einem Nachweis durch gepulste Amperometrie (HPAEC-PAD, siehe zum Beispiel 3).
REFERENZEN

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA-Fragment mit einer Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 1 wie in 4A gezeigt oder einer homologen Sequenz mit einer Identität von zumindest 70% kodierend für ein Protein mit 1-Sukrose:Sukrose Fruktosyltransferase Aktivität, das die allgemeine Reaktion katalysiert: G-(F)n+ G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, 1 ≤ n ≤ 3, 1 ≤ m ≤ 3wobei -G eine Glucosyleinheit darstellt, und -F eine Fruktosyleinheit darstellt.
DNA-Fragment nach Anspruch 1, mit einer Identität von zumindest 85%.
Rekombinante DNA-Sequenz umfassend ein oder mehrere DNA-Fragmente wie in Ansprüchen 1 oder 2 definiert.
Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 3, weiter umfassend ein DNA-Fragment mit einer Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 wie in 4B gezeigt oder einer homologen Sequenz mit einer Identität von zumindest 70% kodierend für ein Protein mit 1-Fructan:Fructan Fruktosyltransferase Aktivität, das die allgemeine Reaktion katalysiert: G-(F)n + G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, n ≥ 2, m ≥ 2 wobei -G und -F sind wie in Anspruch 1 definiert.
Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 3 oder 4, wobei das (die) Fragment(e) in der umgekehrten Orientierung vorhanden ist (sind).
Verfahren zum Produzieren einer genetisch transformierten Pflanze, die ein modifiziertes Fruktanprofil aufweist, umfassend die Schritte von: i) Herstellen eines chimerischen Genkonstrukts umfassend ein oder mehrere DNA-Fragmente wie in Ansprüchen 1 oder 2 definiert, oder die DNA-Fagmente in der umgekehrten Orientierung, betriebsfähig mit einer in der Pflanze aktiven Promotorsequenz und einer in der Pflanze aktiven Terminatorsequenz gekoppelt, ii) Einführen des chimerischen Genaukonstrukts in den Genom der Pflanze, und iii) Regenerieren der transformierten Pflanzenzelle zu transgenen Pflanzen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei der in Schritt i) hergestellte chimerische Genkonstrukt weiter ein DNA-Fragment umfaßt mit einer Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 wie in 4B gezeigt, oder einer homologen Sequenz mit einer Identität von zumindest 70% kodierend für ein Protein mit 1-Fruktan:Fruktan Fruktosyltransferase Aktivität, das die allgemeine Reaktion katalysiert: G-(F)n + G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, n ≥ 2, m ≥ 2wobei -G und -F sind wie in Anspruch 1 definiert.
Transformierte Pflanze die ein modifiziertes Fructanprofil aufweist oder eine Pflanzenzelle, Same, Frucht, Sämling oder einiges Teil der transformierten Pflanze, und die einen chimerischen Genkonstrukt beherbergt, umfassend ein oder mehrere DNA-Fragmente wie in Ansprüchen 1 oder 2 definiert, oder die DNA-Fragmente in der umgekehrten Orientierung, betriebsfähig mit einer in der Pflanze aktiven Promotorsequenz und einer in der Pflanze aktiven Terminatorsequenz gekoppelt.
Transformierte Pflanze nach Anspruch 8, wobei der chimerische Genkonstrukt weiter ein DNA-Fragment umfaßt mit einer Nucleotidsequenz SEQ ID Nr. 2 wie in 4B gezeigt oder einer homologen Sequenz mit einer Identität von zumindest 70% kodierend für ein Protein mit 1-Fruktan: Fruktan Fruktosylstransferase Aktivität, das die allgemeine Reaktion katalysiert: G-(F)n + G-(F)m → G-(F)n–1 + G-(F)m+1, n ≥ 2, m ≥ 2wobei -G und -F sind wie in Anspruch 1 definiert.