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Die vorliegende Erfindung betrifft
Plasmide, deren DNA-Sequenzen nach Einführung in das Genom einer Pflanze
Veränderungen
der Carbohydrat- und Proteinkonzentration und der Carbohydrat- und
Proteinzusammensetzung in der regenerierten Pflanze hervorrufen,
sowie Pflanzenzellen und Pflanzen, enthaltend diese Plasmide.
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Bedingt durch den kontinuierlich
steigenden Nahrungsmittel- und Rohstoffbedarf, der aus der ständig wachsenden
Weltbevölkerung
resultiert, ist eine der Aufgaben der biotechnischen Forschung,
sich um eine Veränderung
der Inhaltsstoffe sowie des Ertrages von Nutzpflanzen zu bemühen. Dazu
muss der Metabolismus der Pflanzen verändert werden.
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Ein besonderes Interesse gilt dabei
der Möglichkeit,
pflanzliche Inhaltsstoffe als erneuerbare Rohstoffquellen für z. B.
die chemische Industrie zu verwenden. Dies ist aus zwei Gründen von
besonders großer
Bedeutung. Zum einen stellen Erdöl-
oder Kohlevorkommen die bisher von der petrochemischen Industrie
im wesentlichen verwendeten Rohstoffquellen dar. Diese Vorräte aber sind
endlich und es ist absehbar, dass alternative, erneuerbare Rohstoffquellen,
d. h. nachwachsende Rohstoffe geschaffen werden müssen. Zum
anderen ist die gegenwärtige
Situation in der Landwirtschaft die, dass im europäischen sowie
nordamerikanischen Raum die klassischen, auf den Ernährungssektor
zielenden landwirtschaftlichen Produkte im Überschuss vorliegen. Dies führt zu offensichtlichen
finanziellen und politischen Problemen in der Landwirtschaft. Alternative Produkte,
für die
ein großer
mengenmäßiger Bedarf
besteht, könnten
eine Lösung
dieses Problems darstellen.
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Nachwachsende Rohstoffe lassen sich
prinzipiell in Fette und Öle,
Proteine sowie Carbohydratverbindungen wie Mono-, Oligo- und Polysaccharide
unterteilen. Bei den Polysacchariden sind die Stärke und die Cellulose die mit
Abstand wichtigsten Komponenten. Im Bereich der EG verteilte sich
die Gesamtstärkeerzeugung
des Jahres 1987/1988 auf die Pflanzen Mais (60%), Weizen (19%) und
Kartoffel (21%). Bei den Oligosacchariden ist in Bezug auf die Quantität das Disaccharid
Saccharose die wichtigste Substanz. Im Bereich der EG ist die Zuckerrübe die wichtigste
Quelle für
die Produktion und Extraktion von Saccharose.
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Um die industrielle Verwertung von
Mono- und Oligosacchariden als Rohmaterialien weiter auszudehnen
und in Anbetracht des hohen ökologischen
und ökonomischen
Risikos bei der Kultivierung von Monokulturen mit einer niedrigen
Rate an Fruchtwechseln, wie beispielsweise der Zuckerrübe, ist
es weiterhin wünschenswert,
andere Pflanzen als die Zuckerrübe
zur Herstellung von Oligosacchariden zu verwenden.
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Wenn Samen oder Knollen als Rohmaterial
für die
Zuckererzeugung verwendet werden, ist die hohe Flüssigkeitsmenge
ein bedeutendes Hindernis. Bei der Kartoffel beträgt der Flüssigkeitsgehalt
bis zu etwa 80% des Gewichts der frischen Knolle.
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Die Flüssigkeit enthält einen
großen
Anteil an reduziertem Stickstoff, der während der Verarbeitung zu ökologischen
Problemen führt.
Bei der Verwendung von Samen oder Knollen zur Erzeugung von Zucker
wäre es
daher vorteilhaft, den Proteingehalt der Samen oder Knollen zu vermindern.
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Andererseits wäre eine Erhöhung der Proteinkonzentration
in den Samen und Knollen einer Pflanze wünschenswert, wenn pflanzliche
Produkte mit verbesserter Qualität
benötigt
werden, wie beispielsweise proteinreiche Nahrungsmittel oder Tierfutter.
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Die biochemischen Synthesewege zum
Aufbau der Stärke
in höheren
Pflanzen sind bekannt. Ebenfalls sind einige der Hauptproteine der
Kartoffelknolle gut biochemisch untersucht, beispielsweise ist Patatin, das
hauptsächliche
Speicherprotein der Kartoffelknolle, ein Glycoprotein mit einem
Molekulargewicht von 40 kDa. (Der genomische Patatinklon wurde von
M. Rocha-Sosa et al. beschrieben (a. a. O.)). Neue biotechnologische
Verfahren zur genetischen Veränderung
dikotyler und monokotyler Pflanzen mittels des Transfers und stabilen
Einbaus einzelner isolierter Gene oder Gruppen von Genen sind bekannt
(Gasser und Fraley, Science 244, 1293–1299). Möglichkeiten zur spezifischen
Expression von mittels gentechnologischen Verfahren in die Kartoffel
eingeführten
fremden Genen, primär
in der Knolle, sind ebenfalls bekannt (Rocha-Sosa et al., (1989), EMBO
J. 8, 23–29;
und
EP 375 092 ).
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, Plasmide bereitzustellen, deren DNA-Sequenzen nach Einführung in
das pflanzliche Genom Veränderungen
der Carbohydrat- und Proteinkonzentration und der Carbohydrat- und
Proteinzusammensetzung in regenerierten Pflanzen hervorrufen. Es
ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzenzellen und
Pflanzen, die die auf den Plasmiden lokalisierten DNA-Sequenzen enthalten,
bereitzustellen.
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Die vorliegende Erfindung liefert
ein Plasmid, welches DNA-Sequenzen
enthält,
die, wenn sie in einer pflanzlichen Zelle anwesend sind, sowohl
eine Verminderung der Stärkekonzentration
und eine Steigerung der Konzentration mindestens eines Saccharids,
ausgwählt
aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide, bewirken.
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Die vorliegende Erfindung liefert
weiterhin ein Plasmid, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für das Protein
ADP-Glucosephyrophosphorylase kodiert, wobei die DNA-Sequenz in
invertierter Orientierung vorliegt, wie nachstehend definiert ist.
Die DNA-Sequenz kann für
eine oder beide Untereinheit(en) der ADP-Glucosepyrophosphorylase
kodieren. Die DNA-Sequenz kodiert beispielsweise für die Isoform
I, die Isoform II oder beide Isoformen der ADP-Glucosepyrophosphorylase der Kartoffel.
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Eine DNA-Sequenz liegt in normaler
(nicht-invertierter) Orientierung in einem Plasmid so vor, dass
das 3'-Ende der
DNA-Sequenz, das durch den offenen Leserahmen definiert ist, mit
dem 5'-Ende des
Plasmids verbunden ist, und das 5'-Ende der DNA mit dem 3'-Ende des Plasmids
verbunden ist. Die DNA kann so korrekt abgelesen, transkribiert
und translatiert werden. Der Ausdruck "invertierte Orientierung" wird hier verwendet,
um darzustellen, dass eine DNA-Sequenz in einem Plasmid so angeordnet
ist, dass das 3'-Ende
der DNA-Sequenz, das durch den offenen Leserahmen definiert ist,
mit dem 3'-Ende
des Plasmids verbunden ist, und das 5'-Ende der DNA mit dem 5'-Ende des Plasmids
verbunden ist. Wenn dieses invertierte Konstrukt in der Wirtspflanze
transkribiert wird, entsteht eine "anti-sense" mRNA in Bezug auf die normale "sense" mRNA. Eine DNA-Sequenz
in invertierter Orientierung kann als äquivalent zum nicht-kodierenden
Strang dieser DNA-Sequenz angesehen werden.
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Bei dem erfindungsgemäßen Plasmid
ist die DNA-Sequenz vorzugsweise mit regulatorischen Sequenzen verbunden,
die in pflanzli chen System operativ sind und die eine Expression
der DNA-Sequenz in einer Pflanze sicherstellen, beispielsweise einem
Promotor und einem Terminationssignal aus viralen und/oder pflanzlichen
Genen. Der Promotor ist beispielsweise der Promotor der 35S-RNA
des Blumenkohl-Mosaik-Virus und das Terminationssignal ist beispielsweise
von dem Octopinsynthase-Gen abgeleitet, beispielsweise von dem Octopinsynthase-Gen
der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5.
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Bei einem erfindungsgemäßen, die
DNA-Sequenz in invertierter Orientierung, einen Promotor und ein Terminationssignal
enthaltenden Plasmid ist vorzugsweise das 3'-Ende der DNA-Sequenz mit dem 3'-Ende des Promotors
verbunden und das 5'-Ende
der DNA ist mit dem 5'-Ende
des Terminationssignals verbunden.
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Beispiele von erfindungsgemäßen Plasmiden
sind Plasmid p35S-pat (DSM 5877), p35S-anti-pat (DSM 5878), p35S-anti-ADP-glc1
(DSM 5879), p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880) und p35S-anti-ADP-glc1
+ 2 (DSM 5881); die Plasmide und ihre Konstrukte sind nachstehend
beschrieben.
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Die vorliegende Erfindung liefert
auch eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle, enthaltend eine wie vorstehend
definierte DNA-Sequenz,
und liefert weiterhin eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle, enthaltend
ein wie vorstehend definiertes Plasmid.
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Die vorliegende Erfindung liefert
weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Plasmids oder einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle
bei der Erzeugung einer transgenen Pflanze.
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Es wurde gefunden, dass bei transgenen
Pflanzen, die eine DNA-Sequenz
enthalten, die ein ADP-Glucosepyrophosphorylase-Protein kodiert,
dessen DNA-Sequenz in invertierter Orientierung vorliegt, wobei
die DNA-Sequenz beispielsweise in einem erfindungsgemäßen Plasmid
vorliegt, die ADP-Glucosepyrophosphorylaseakti vität und die
Stärkekonzentration
im Vergleich zu der nichttransformierter Pflanzen vermindert ist,
und dass zur gleichen Zeit die Konzentration der Mono- und Oligosaccharide
erhöht
ist, d. h. der Zuckergehalt ist erhöht. Eine transgene Pflanze
enthält
vorzugsweise das Gen 35S-anti-glc1, 35S-anti-glc2 oder 35S-anti-glc1 + 2, lokalisiert
auf den Plasmiden p35S-anti-ADP-glc1 (DSM 5879), p35S-anti-ADP-glc2 (DSM
5880) bzw. p35S-anti-ADP-glc1 + 2 (DSM 5881).
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Solche transgenen Pflanzen können als
Rohmaterial bei der Extraktion von Mono- und Oligosacchariden, insbesondere
Saccharose, verwendet werden. Diese Pflanzen sind beispielsweise
Kartoffelpflanzen, da die resultierenden transgenen Kartoffelknollen
als Rohmaterial bei der Extraktion von Mono- und Oligosacchariden,
insbesondere Saccharose, die anschließend für die Herstellung von anderen
Substanzen verwendet werden kann, besonders brauchbar sind.
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Da die Proteinkonzentration und daher
die Menge von unerwünschtem
Stickstoff in der zu verarbeitenden Flüssigkeit reduziert ist, können diese
transgenen Pflanzen als Rohmaterial bei der Herstellung von Saccharose
verwendet werden. Diese Pflanzen sind beispielsweise Kartoffelpflanzen,
da die resultierenden transgenen Kartoffelknollen als Rohmaterial
für die
Herstellung von Saccharose besonders brauchbar sind.
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Es kann von besonderem Vorteil sein,
transgene Pflanzen zu konstruieren, die sowohl eine DNA-Sequenz,
die ein ADP-Glucosepyrophosphorylase-Protein kodiert, und eine DNA-Sequenz,
die ein Patatin-Protein kodiert, enthalten, wobei jede der DNA-Sequenzen
in invertierter Orientierung vorliegt. Die resultierenden Pflanzen
haben einen verminderten Stärkegehalt,
einen erhöhten
Zuckergehalt und einen verminderten Proteinspiegel. Solche Pflanzen,
beispielsweise Kartoffelpflanzen, und insbesondere Kartof felknollen,
sind als Rohmaterial für
die Herstellung von Saccharose besonders brauchbar.
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Es ist eine große Anzahl von Klonierungsvektoren,
enthaltend ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der
die Selekttion der transformierten Zellen gestattet, für die Erzeugung
einer Insertion fremder Gene in höhere Pflanzen verfügbar. Beispiele
für Vektoren
sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw.. Dementsprechend
kann die Sequenz an einer geeigneten Restriktionsstelle in den Vektor eingeführt werden.
Das erhaltene Plasmid wird für
die Transformation in E, coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden
in einem geeigneten Nährmedium
kultiviert, dann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Als
Analysemethode werden im Allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse,
Elektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden
durchgeführt.
Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten
und mit der nächsten
DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen
oder unterschiedlichen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode
gewünschter
Gene in die Pflanze können
weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation
der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens
die rechte Begrenzung, häufig
jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid
T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen verbunden werden.
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Die Verwendung von T-DNA bei der
Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv beforscht und ist
ausreichend beschrieben in der
EP
120 516 ; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters
B. V., Alblasserdam, 1985, Kap. V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant
Sci., 4: 1–46
und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277–287.
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Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert,
so ist sie dort in der Regel stabil und geht in der Regel nicht
wieder verloren. Sie enthält
normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen
Resistenz gegenüber
einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin,
Hygromycin oder Chloramphenicol u. a. vermittelt. Der individuell
verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen
gegenüber
Zellen, denen die eingefügte
DNA fehlt, gestatten.
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Für
die Einführung
von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von
Techniken zur Verfügung.
Diese Techniken umfassen die Transformation mit T-DNA unter Verwendung
von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als
Transformationsmittel, die Fusion, die Injektion oder die Elektroporation
von DNA sowie andere mögliche
Techniken. Werden für
die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA
in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen
intermediären Vektor
oder einen binären
Vektor. Die intermediären
Vektoren können
aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind,
durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert
werden. Dieses enthält
außerdem
die für
den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren
können
nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids
kann der intermediäre
Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation).
Binäre
Vektoren können
sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten
ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von
der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie
können
direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al.
Mol. Gen. Genet. (1978) 163: 181–187). Das als Wirtszelle dienende
Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten.
Die vir-Region ist
für den
Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche
T-DNA kann enthalten sein. Das so transfor mierte Bakterium wird zur
Transformation von Pflanzenzellen benutzt. Für den Transfer der DNA in die
Pflanzenzelle können
Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise
mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert
werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente,
Wurzeln aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen)
können
dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide
zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert
werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der
eingeführten
DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind
keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache
Plasmide wie z. B. pUC-Derivate
verwendet werden.
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Die transformierten Zellen wachsen
innerhalb der Pflanzen in der üblichen
Weise. Diese Pflanzen können
normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte
Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die
daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen
Eigenschaften. Abkürzungen
bp,
kb | Basenpaare,
Kilobasen |
D,
kDa | Dalton,
Kilodalton |
DNA | Desoryribonukleinsäure, Träger der
genetischen Information |
RNA | Ribonukleinsäure |
SDS | Natriumdodecylsulfat |
Tris | Tris(2-aminoethyl)amin |
EDTA | Ethylendiamintetraessigsäure |
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Am 18.04.1990 wurden bei der Deutschen
Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik
Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
Plasmid
p35S-pat | (DSM
5887) |
Plasmid
p35S-anti-pat | (DSM
5878) |
Plasmid
p35S-anti-ADP-glc1 | (DSM
5879) |
Plasmid
p35S-anti-ADP-glc2 | (DSM
5880) |
Plasmid
p35S-anti-ADP-glc1 + 2 | (DSM
5881) |
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Beschreibung
der Abbildungen
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1 zeigt
die Struktur des 5,0 kb großen
Plasmids p35S-anti-ADP-glc1.
Das auf dem Plasmid lokalisierte Gen 35S-anti-ADP-glc1 enthält folgende Fragmente:
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S
Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (cauliflower mosaic virus,
CaMV). Dieses Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des
CaMV.
- B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal
des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Dieses Fragment umfasst
die Nukleotide 11749–11939.
- C = Fragment C (1589 bp) beinhaltet das Eco RI-Fragment, welches
für die
Isoform I der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase
Isoformen der Kartoffel kodiert.
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Das Gen 35S-anti-ADP-glc1 wird in
den Polylinker des Plasmids pUC18 geklont. Es werden ferner die im
Beispiel 1 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
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2 zeigt
die Struktur des 5,1 kb großen
Plasmids p35S-anti-ADP-glc2.
Das auf dem Plasmid lokalisierte Gen 35S-anti-ADP-glc2 enthält die nachstehenden Fragmente:
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S
Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Dieses Fragment umfasst
die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
- B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal
des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Dieses Fragment umfasst
die Nukleotide 11749–11939.
- C = Fragment C (1700 bp) beinhaltet das Eco RI-Fragment, welches
für die
Isoform II der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase Isoformen der
Kartoffel kodiert.
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Das Gen 35S-anti-ADP-glc2 wird in
den Polylinker des Plasmids pUC18 geklont. Es werden ferner die im
Beispiel 2 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
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3 zeigt
die Struktur des 6,6 kb großen
Plasmids p35S-anti-ADP-glc1
+ 2. Das auf dem Plasmid lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1 + 2 enthält die nachstehenden
Fragmente:
- A = Fragment A (529 bp) beinhaltet
den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Dieses Fragment
umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
- B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal
des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Dieses Fragment umfasst
die Nukleotide 11749–11939.
- C1= Fragment C1 (1700 bp) beinhaltet das Eco RI-Fragment, welches
für die
cDNA der Isoform II der ADP-Glucosepyrophosphorylase kodiert.
- C2 = Fragment C2 (1500 bp) beinhaltet das XbaI/XbaI-Fragment von p35S-anti-ADP-glc1,
welches für
die cDNA der Isoform I der RDP-Glucosepyrophosphorylase kodiert.
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Das Gen 35S-anti-ADP-glc1 + 2 wird
in den Polylinker des Plasmids pUC18 geklont. Es werden ferner die
im Beispiel 3 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
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4 zeigt
die durch Autoradiographie sichtbar gemachten Banden der Patatin-DNA.
Die Intensität der
Banden ist ein Maß für die Konzentration
der jeweiligen RNA. Die Positionen K1–K4 enthalten RNA aus den Knollen
nichttransformierter Pflanzen, Positionen 93, 89, 62, 52, 53, 23,
61, 85, 36, 37, 54 und 82 enthalten RNA aus den Knollen transformierter
Pflanzen. Bei Positionen 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61 und 85 kann
keine ADP-glc1-RNA nachgewiesen werden.
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5 zeigt
die Menge an ADP-Glucosepyrophosphorylase I-Protein in Knollen nicht-transformierter Kontrollpflanzen
(Positionen K1–K4)
und die Verringerung der Menge oder das Verschwinden des Proteins
in Knollen von mit dem Gen 35S-anti-ADP-glc1 transformierter Kartoffelpflanzen
(Positionen 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61, 85, 36, 37, 54 und 82).
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An den Positionen 93, 89, 62, 52,
53, 23, 61 und 85 ist wesentlich weniger ADP-Glucosepyrophosphorylase
I-Protein vorhanden.
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Zum besseren Verständnis der
dieser Erfindung zugrunde liegenden Beispiele wird vorab eine Aufstellung
aller für
diese Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben:
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Verfahren
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1. Klonierungsverfahren
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Zur Klonierung wurden die Vektoren
pUC18/19 und pUC118 sowie die M13 mp10 Serien (Yanisch-Perron et.
al., Gene (1985), 33, 103– 119),
verwendet.
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Für
die Pflanzentransformation wurden die Genkonstrukte in den binären Vektor
BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984), 12, 8711– 8720) kloniert.
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2. Bakterienstämme
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Für
die pUC- und M13 mp-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18
(Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 24, 6342–6346) oder
TB1 benutzt.
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Für
den Vektor BIN19 wurde ausschliesslich der E. coli-Stamm TB1 benutzt.
TB1 ist ein Rekombinations-negatives, Tetracyclinresistentes Derivat
des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103–119). Der
Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, persönliche Mitteilung): F' (traD36, proAB,
lacI, lacZ Δ M15), Δ (lac, pro),
SupE, thiS, recA, Sr1: Tn10(TCR).
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Die Transformation der Plasmide in
die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes
LBA4404 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12, 8711–8721, (1984); BIN19 Derivat)
durchgeführt.
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3. Transformation
von Agrobacterium tumefaciens
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Bei Bin19-Derivaten erfolgt die Einführung der
DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode
von Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978), 163, 181–187). Die Plasmid-DNA
transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim
und Doly (Nucl. Acids Res. (1979), 7, 1513–1523) isoliert und nach geeigneter
Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.
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4. Pflanzentransformation
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10 kleine, mit einem Skalpell verwundete
Blätter
einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose
gelegt, welches 30–50 μl einer unter
Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach
3–5 minütigem, leichtem
Schütteln
wurden die Petrischalen bei 25°C
im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6%
Glucose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02
mg/l Giberellinsäure,
500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt.
Nach einwöchiger
Inkubation bei 25°C
und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert.
Die anschließende
Kultivierung wurde nach einem bekannten Verfahren durchgeführt (Roche-Sosa
et al., EMBO J. 8, 29 (1989).
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5. Analyse
genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
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Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA
erfolgte nach Rogers und Bendich (Plant Mol. Biol. (1985), 5, 69–76.
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Für
die DNA-Analyse wurden 10–20 μg DNA nach
geeigneter Restriktionsspaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersuchenden
DNA-Sequenzen analysiert.
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6. Analyse der Gesamt-RNA
aus transgenen Kartoffelpflanzen
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Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA
erfolgte nach Logemann et al. (Analytical Biochem. (1987), 163,
16–20).
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Für
die Analyse wurden je 50 μg
Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern
Blots" auf die Anwesenheit
der gesuchten Transkripte untersucht.
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7. Proteinextraktion
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Zur Extraktion von Gesamtprotein
aus Pflanzengewebe wurden Gewebestücke in Proteinextraktionspuffer
(25 mM Natriumphosphat pH 7,0, 2 mM Natriumbisulfit), unter Zusatz
von 0,1% (w/v) unlöslichem
Polyvinylpyrrolidon (PVP) homogenisiert.
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Nach Filtrieren durch Zellstoff wurden
Zelltrümmer
für 20
Minuten bei 10.000 Umdrehungen pro Minute abzentrifugiert und die
Proteinkonzentration des Überstandes
nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 1976)/72, 248–254) bestimmt.
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B. Nachweis von Fremdproteinen
mit Hilfe immulogischer Verfahren (Western-Blot)
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Die Proteinextrakte wurden mittels
Gelelektrophorose in SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid)-Gelen
nach Molekulargewicht getrennt. Nach SDS-PAGE wurden Proteingele
für 15–30 Minuten
in Transferpuffer für
Graphitelektroden (48 g/l Tris, 39 g/l Glycin, 0,0375% SDS, 20%
Methanol) äquilibriert
und anschließend
im Kühlraum
auf Nitrozellulose-Filter transferiert und mit 1,3 mA/cm2 für
1–2 Stunden
getrennt. Der Filter wurde für
30 Minuten mit 3% Gelatine in TBS-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5,
500 mM NaCl) abgesättigt,
anschließend
wurde der Filter für
2 Stunden mit dem entsprechenden Antiserum in geeigneter Verdünnung (1
1000–10
000 in TBS Puffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der
Filter jeweils für
15 Minuten mit TBS-, TTBS- (TBS-Puffer
mit 0,1% Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonolaurat) und TBS-Puffer gewaschen.
Nach dem Waschen wurde der Filter für 1 Stunde bei Raumtemperatur
mit Alkalische-Phosphatase konjugierten Goatanti-Rabbit (GAR)-Antikörpern (1
: 7500 in TBS) inkubiert. An schließend wurde der Filter wie vorstehend
beschrieben gewaschen und in AP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,5,
100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) äquilibriert.
Die Alkalische-Phosphatase-Reaktion wurde durch Substratzugabe von
70 μl 4-Nitrotetrazolium (NBT)-Lösung (50
mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid) und 35 μl 5-Brom-4-Chlor-4-3-Indolylphosphat (BCIP)
(50 mg/ml BCIP in Dimethylformamid) in 50 ml AP-Puffer gestartet.
Nach 5 Minuten konnten in der Regel erste Signale beobachtet werden.
Die Reaktion kann durch Überführen des
Filters in Stop-Lösung
(20 mM Tris/HCl pH 8,0 mit 5 mM EDTA) beendet werden. Die Reaktion
wurde im Dunkeln durchgeführt.
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9. Esterase-Test
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Die Esteraseaktivität des Patatin-Proteins
wurde in situ in semi-nativen SDS-Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE)
durch Inkubation der Gele in 100 ml Inkubationspuffer (50 mM Tris
HCl, pH 7,0, 200 mM Natriumchlorid, 0,1% SDS), dem als Substrate
500 μl 1%-ige α-Naphthylacetat-Lösung (1
g α-Naphthylacetat/100 ml
Ethanol) und 5 ml 2%-ige Fast Blue RR-Lösung zugesetzt wurde, nachgewiesen.
Durch die Esteraseaktivität
wurde ein braunschwarzer unlöslicher
Farbstoff ausgefällt,
der spezifisch die Proteinbande der nativen Esterase im Gel anfärbt. Die
Auftrennung des nicht hitzedenaturierten Proteingemisches (semi-nativ)
erfolgte in 12%-igem SDS-PAGE nach Laemmli (1970, Nature, 227, 680–685).
-
10. Färbung von
Proteinen im Polyacrylamidgel
-
Nach beendeter Elektrophorese wurde
das Gel für
2 Stunden in Fixierlösung
(50% Methanol, 10% Essigsäure,
40% Wasser) geschüttelt,
anschließend
für 4 Stunden
in Färbelösung (0,05%
Coomassie Brilliant Blue R in Fixierlösung) belassen und schließlich mehrfach
in Entfärbelösung (5%
Methanol, 7% Essigsäure, 88%
Wasser) bis zum Erscheinen klarer Proteinbanden entfärbt.
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11. Bestimmung von Glucose,
Fructose, Saccharose und Stärke
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a) Extraktion
-
Kleine Portionen von in flüssigem Stickstoff
gefrorenen Knollen (Durchmesser 10 mm) wurde 30 Minuten bei 80°C in 0,5
ml Puffer (80% (v/v) Ethanol, 10 mM HEPES pH 7,5) in einem Wasserbad
extrahiert. Der die löslichen
Bestandteile enthaltende Überstand
wurde abgegossen und das Volumen bestimmt. Der Überstand wurde verwendet, um
die löslichen
Zucker zu bestimmen.
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Das verbleibende unlösliche Material
wurde mit Wasser gespült
und mit einem Mörser
fein gemahlen. Der Extrakt wurde anschließend 1 Stunde bei 95°C in 0,2
M Kaliumhydroxidlösung
gekocht, der pH mit 70 μl 1N
Essigsäure
auf 5,5 justiert und das Ganze anschließend zentrifugiert. Aliquots
der resultierenden Stärkelösung wurden
zur Bestimmung der Stärke
verwendet.
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b) Quantitative Bestimmung
der löslichen
Glucose, Fructose und Saccharose
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Die quantitative Bestimmung der löslichen
Glucose, Fructose und Saccharose wurde mit dem nachstehenden Testgemisch
durchgeführt:
100,0
mM | Imidazol-HCl,
pH 6,9 |
1,5
mM | MgCl2 |
0,5
mM | NADP+ |
1,3
mM | ATP |
10–50,0 μl | Probe |
1,0
U | Glucose-6-phosphatdehydrogenase
aus Hefe. |
-
Das Gemisch wurde 5 Minuten inkubiert.
Die Bestimmung der Zucker wurde anschließend photometrisch durch die
aufeinander folgende Zugabe von
1,0
U | Hexokinase
aus Hefe (zur Bestimmung der Glucose) |
1,0
U | Phosphoglucoseisomerase
aus Hefe (zur Bestimmung der Fructose) |
20,0
U | Invertase
aus Hefe (zur Bestimmung der Saccharose) |
durchgeführt.
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c) Stärkebestimmung
-
Zu der nach der Ethanolextraktion
unter a) erhaltenen Stärkelösung wurde
bei 55°C
hydrolytische Enzyme zugesetzt und das Ganze 12 Stunden in dem nachstehenden
Gemisch inkubiert:
50,0
mM | Natriumacetat,
pH 4,8 |
1,4
U | Amyloglucosidase
aus Aspergillus niger |
2,0
U | α-Amylase
aus Schweinepankreas |
-
Nach der Inkubation wurden die unlöslichen
Bestandteile durch 4-minütige
Zentrifugation bei 16.000 g entfernt. Im Überstand wurde die resultierende
Glucose enzylmatisch wie unter b) beschrieben bestimmt.
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12. Bestimmung der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität
-
Die ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wurde
nach Standardverfahren bestimmt (Lin et al., 1988, Plant Physiol.
86, 1131– 1135).
-
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen
die Herstellung der erfindungsgemäßen Plasmide, die Insertion
dieser Plasmide in die Pflanze und die Funktion der Plasmide in
den transgenen Pflanzen.
-
Beispiel 1
-
Herstellung des Plasmids
P35-S-anti-ADP-glcl und Einführung
des auf dem Plasmid lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 in das
pflanzliche Genom
-
Unter Einsatz einer heterogenen Probe
aus Mais wurden aus einer in dem Expressionsvektor xgt11 angelegten
cDNA Bank verschiedene Klone identifiziert, die mit dieser Probe
kreuzhybridisieren. Diese Klone wurden aus dem Vektor xgt11 in den
Vektor pUC18 subkloniert. Eine Bestimmung der Nukleotidsequenz identifizierte
diese Klone eindeutig als einen eine der beiden Isoformen (Isoform
I) der ADP-Glucosepyrophosphorylase aus Kartoffel kodierenden cDNA
Klon.
-
Diese cDNA wurde mit dem Promotor
der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus
sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthese der Ti-Plasmids
pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung des die cDNA der
ADP-Glucosepyrophosphorylase kodierenden Segmentes so gewählt, dass
der nichtkodierende Strang der cDNA abgelesen wird.
-
Das Gen P35-S-anti-ADP-glc1 besteht
aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
-
Fragment A (529 bp) beinhaltet den
35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus
(CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
(Franck et al., Cell 21, 285–294)
und befindet sich zwischen der Eco RI/KpnI-Schnittstelle. Fragment
B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der
T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835–846), Nukleotide
11749–11939,
welches als PvuII Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estrella
et al., (1983) Nature 303, 209–213)
isoliert worden ist und nach Addition von SphI Linkern an die PvuII
Schnittstelle zwischen die SphI/HindIII-Schnittstellen des Polylinkers
von pUCl8 kloniert wurde.
-
Fragment C enthält ein 1589 Nukleotide großes EcoRI
Fragment, welches für
die Isoform I der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylasen Isoformen
der Kartoffel kodiert. Die Sequenz der 1589 Nukleotide dieses Klons
ist als eine Sequenz des Klons B22-1 in Müller-Röber et al., Mol. Gen. Genet.
224, 136–146
(1990) dargestellt. Die Orientierung dieses cDNA Klons ist so gewählt, dass
der nichtkodierende Strang abgelesen wird, was in der transgenen
Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt. Die Präsenz der antisense RNA führt zu einer
Reduktion der von der in der Kartoffel gebildeten "sense"-ADP-Glucosepyrophosphorylase-I
RNA und damit zu einer Inhibierung der Stärkebiosynthese. Das Plasmid
P35S-anti-ADP-glc1 liegt als EcoRI/HindIII Fragment im Polylinker
des Vektors pUC18 vor.
-
Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 hat
eine Größe von 5,0
kb (siehe 1).
-
Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1
lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1
wurde in binäre
Vektoren eingeführt
und mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Agrobacteriensystems
in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden
intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden
im Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP-Glucosepyrophosphorylase-glc1
RNA untersucht (vgl. Punkt 6, Verfahren). In einigen der mit dem
Gen 35S-anti-ADP-glc1 transformierten Pflanzen konnte keine endogene
zelluläre
RNA dieses Gens bestimmt werden (siehe 4). Gleichfalls kann durch "Western Blot"-Verfahren kein Protein bestimmt werden
(siehe 5). Die damit
verbundene Verringerung der Stärkekonzentration
sowie der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wird enzymatisch
nach Standardverfahren (Plaxton, W. L. und Preiss, J. (1987) Plant
Physi ology 83, 105–112,
Lin et. al. (1988) Plant Physiology 86, 1131– 1135) bestimmt.
-
Die in Knollenextrakten nicht-transformierter
und transgener (35S-anti-ADP-glc1) Kartoffelpflanzen gemessene ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität ist wie
folgt:
Pflanze | ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität (%) |
K 1 | 101,5 |
K 2 | 92,0 |
K 3 | 97,2 |
K 4 | 109,3 |
T 89 | 1,5 |
T 93 | 2,1 |
T 62 | 3,1 |
T 52 | 3,2 |
T 53 | 4,4 |
T 23 | 5,2 |
T 61 | 8,1 |
T 85 | 17,2 |
T 36 | 92,6 |
T 37 | 56,4 |
T 54 | 110,2 |
T 82 | 82,4 |
-
Die Prozentsätze beziehen sich auf die in
nicht-transformierten Pflanzen gemessene Aktivität, der 100-Wert entspricht
dem Mittelwert der in nicht-transformierten Pflanzen gemessenen
Aktivität.
-
Der Stärkegehalt in Knollen von nicht-transformierten
und transgenen (35S-anti-ADP-glc1) Kartoffelpflanzen ist wie folgt:
Pflanze | Stärkegehalt
(%) |
K 1 | 87,2 |
K 2 | 100,9 |
K 3 | 103,4 |
K 4 | 108,5 |
T 89 | 1,8 |
T 93 | 1,4 |
T 62 | 3,9 |
T 52 | 7,0 |
T 53 | 7,2 |
T 23 | 8,9 |
T 61 | 24,4 |
T 85 | 29,0 |
T 36 | 90,6 |
T 37 | 75,6 |
T 54 | 96,1 |
T 82 | 89,4 |
-
Die Prozentsätze beziehen sich auf den in
nicht-transformierten Pflanzen gemessenen Stärkegehalt, der 100-Wert entspricht
dem Mittelwert der in nicht-transformierten Pflanzen gemessenen
Gehalt.
-
Der Saccharosegehalt in Knollen von
nicht-transformierten und transgenen (35S-anti-ADP-glc1) Kartoffelpflanzen
ist wie folgt:
Pflanze | Saccharosegehalt
(%) |
K 1 | 1,8 |
K 2 | 1,8 |
K 3 | 2,2 |
K 4 | 2,6 |
T 89 | 31,0 |
T 93 | 31,6 |
T 62 | 27,8 |
T 52 | 21,5 |
T 53 | 24,9 |
T 23 | 20,5 |
T 61 | 17,5 |
T 85 | 10,9 |
T 36 | 2,4 |
T 37 | 4,6 |
T 54 | 2,6 |
T 82 | 2,6 |
-
Der Prozentgehalt bezieht sich auf
den in den Knollen gemessenen Saccharosegehalt, bezogen auf Trockengewicht.
K bedeutet nicht-transformierte
Pflanzen, T bedeutet transgene Pflanzen.
-
Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich,
dass die Einführung
des auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 in die Pflanze
zu einer wesentlichen Verminderung der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität um einen
Faktor bis zu 50 im Vergleich zu nicht-transformierten Kontrollpflanzen führt. In
den Knollen dieser transgenen Kartoffelpflanzen, die eine starke
Reduktion der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität aufweisen,
kann weiterhin beobachtet werden, dass der dort enthaltene Stär kegehalt im
Vergleich zu dem in nicht-transformierten Kontrollpflanzen enthaltenen
Gehalt stark vermindert ist. Eine weitere überraschende Tatsache ist,
dass die Knollen, in denen der Stärkegehalt stark vermindert
ist, hohe Konzentrationen an Disacchariden aufweisen. Dies ist hauptsächlich Saccharose,
die bis zu 30% der Trockenmasse der Knollen ausmacht. Dies bedeutet,
dass als Ergebnis der Übertragung
des auf dem Plasmid p355-anti-ADP-glc1 lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1
die Kartoffelknolle anstelle der Stärke große Mengen an Disacchariden
speichert. Aus einer stärkespeichernden
Pflanze wurde so eine Pflanze hergestellt, die Zucker speichert.
-
Durch die Einführung des auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1
lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 in transgene Pflanzen wird
so deren Stärkebiosynthese
gehemmt und zusätzlich
wird eine viel größere Anzahl an
Knollen (ungefähr
4 bis 5 mal so viele) im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhalten.
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Beispiel 2
-
Herstellung des Plasmids
p35S-anti-ADP-glc2 und Einführung
des auf dem Plasmid lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc2 in das
pflanzliche Genom
-
Unter Einsatz einer heterologen Probe
aus Mais wurden aus einer in dem Expressionsvektor λgt11 angelegten
cDNA Bank verschiedene Klone identifiziert, die mit dieser Probe
kreuzhybridisierten. Diese Klone wurden aus dem Vektor λgt11 in den
Vektor pUC18 subkloniert. Eine Bestimmung der Nukleotidsequenz identifizierte
eindeutig diejenigen cDNA-Klone, die die Tsoform II der ADP Glucose-Pyrophosphorylase
aus Kartoffel kodierenden.
-
Diese cDNA wurde mit dem Promotor
der 35S RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus
sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthase des Ti-Plasmids
pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung des die cDNA der
ADP-Glucosepyrophosphorylase kodierenden Segmentes so gewählt, dass
der nichtkodierende Strang der cDNA abgelesen wird.
-
Das Gen 35S-anti-ADP-glc2 besteht
aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
-
Fragment A (529 bp) beinhaltet den
35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus
(CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
(Franck et al., Cell 21, 285–294)
und befindet sich zwischen der Eco RI/KpnI-Schnittstelle. Fragment
B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der
T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835–846), Nukleotide
11749–11939,
welches als PvuII Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estralla
et al., (1983) Nature 303, 209–213)
isoliert wurde und nach Addition von SphI Linkern an die PvuII Schnittstellen
zwischen die SphI/HindIII-Schnittstellen des Polylinkers von pUC18
kloniert wurde.
-
Fragment C enthält ein 1,7 kb großes EcoRI
Fragment, welches für
die Isoform II der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase-Isoformen
der Kartoffel kodiert. Die Orientierung dieses cDNA Klons wurde
so gewählt,
dass der nichtkodierende Strang abgelesen wird, was in der transgenen
Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt. Die Präsenz der anti-sense RNA führt zu einer
Reduktion der von der in der Kartoffel gebildeten "sense"-ADP-Glucosepyrophosphorylase-2 RNA und
damit zu einer Inhibierung der Stärkebiosynthese. Das Gen 35S-anti-ADP-glc2
liegt als EcoI/HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC18
vor (siehe 2).
-
Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc2
lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc2
wurde in binäre
Vektoren eingeführt
und mit Hilfe des vorstehende beschriebenen Agrobacteriensystems
in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden
intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden
im Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP Glucosepyrophosphorylase-glc2
RNA untersucht. Pflanzen, die mit dem auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc2
lokalisierten Gen 35S-anti-ADP-glc2
transformiert worden sind, weisen eine verringerte Menge der endogenen
zellulären
RNA dieses Gens auf. Die damit verbundene Verringerung der Stärkemenge
sowie der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wird enzymatisch nach Standardverfahren
(siehe Beispiel 1) bestimmt.
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Beispiel 3
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Herstellung des Plasmids
p35S-anti-ADP-glc1 + 2 und Einführung
des auf dem Plasmid lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 + 2 in
das pflanzliche Genom
-
Das Gen 35S-anti-RDP-glc1 + 2 wurde
durch Insertion des 1,5 kb großen
XbaI Fragments aus dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 in die XbaI Stelle
des Plasmids p35S-anti-ADP-glc2 hergestellt. Dabei wurde die Orientierung
des XbaI Fragmentes so gewählt,
dass der nicht-kodierende Strang des XbaI Fragmentes abgelesen wird,
was somit in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA von beiden Isoformen
(Isoform I und II) der ADP-Glucosepyrophosphorylase der Kartoffel
führt.
Die Präsenz
der "anti-sense" RNAs führt zu einer
Reduktion der von den in der Kartoffel gebildeten sense-ADP-Glucosepyrophosphorylase
1-RNA und sense-ADP-Glucosepyrophosphorylase 2-RNA und damit zu
einer Inhibierung der Stärkebiosynthese.
Das Gen 35-S-anti-ADP-glc1
+ 2 liegt als EcoRI/HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC
18 vor (siehe 3).
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Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1
+ 2 lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1
+ 2 besteht aus den vier Fragmenten A, B, C1 und C2 und wurde wie
folgt hergestellt:
-
Fragment A (529 bp) beinhaltet des
35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus
(CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV
(Franck et al., Cell 21, 285–294)
und befindet sich zwischen der EcoRI/KpnI-Schnittstelle. Fragment
B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der
T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835–846), Nukleotide
11749–11939,
welches als PvuII Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estrella
et al., (1983) Nature 303, 209–213)
isoliert wurde und nach Addition von SphI Linkern an die PvuII Schnittstellen
zwischen die SphI/HindIII Schnittstellen des Polylinkers von pUC18
kloniert wurde.
-
Fragment C1 enthält ein 1,7 kb großes EcoRI
Fragment, welches für
die Isoform II der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase Isoformen
der Kartoffel kodiert. Die Orientierung dieses cDNA Klons wurde so
gewählt,
dass der nichtkodierende Strang abgelesen wird, was in der transgenen
Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt.
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Fragment C2 enthält das 1,5 kb große XbaI/XbaI
Fragment aus p35S-anti-ADP-glc1, welches für die Isoform I der beiden
ADP-Glucosepyrophosphorylasen
kodiert.
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Die Orientierung der Fragmente C1
und C2 wurde so gewählt,
dass der jeweils nichtkodierende Strang der Fragmente C1 und C2
abgelesen wird, was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung
einer sogenannten "anti-sense" RNA von beiden Isoformen
(Isoform I und Isoform II) der ADP-Glucosepyrophosphorylase der Kartoffel
führt.
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Das Gen 35S-anti-ADP-glc1 + 2 liegt
als EcoRI/HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC18 vor.
-
Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1
+ 2 lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1
+ 2 wurde in binäre Vektoren
eingeführt
und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen transferiert.
Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert.
Diese Pflanzen wurden mit Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der
ADP-Glucosepyrophosphorylase I-RNA und ADP-Glucosepyrophosphorylase
II-RNA untersucht (vgl. Punkt 6, Verfahren). Pflanzen, die mit dem
auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1
+ 2 lokalisierten Gen 35S-anti-ADP-glc1 + 2 transformiert wurden,
weisen eine stark verringerte Menge der endogenen zellulären RNAs
beider ADP-Glucosepyrophosphorylasen (I und II) auf. Die damit verbundene
Verringerung der Stärkekonzentration
sowie der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wurde enzymatisch nach Standardverfahren
(siehe Beispiel 1) bestimmt.