DE69133347T2 - Plasmide, die die DNA-Sequenzen für die Veränderung des Kohlehydrat- und Proteingehalts bzw. Komposition in Pflanzen enthalten, sowie diese Plasmide enthaltende Pflanzen und Pflanzenzellen - Google Patents

Plasmide, die die DNA-Sequenzen für die Veränderung des Kohlehydrat- und Proteingehalts bzw. Komposition in Pflanzen enthalten, sowie diese Plasmide enthaltende Pflanzen und Pflanzenzellen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Plasmide, deren DNA-Sequenzen nach Einführung in das Genom einer Pflanze Veränderungen der Carbohydrat- und Proteinkonzentration und der Carbohydrat- und Proteinzusammensetzung in der regenerierten Pflanze hervorrufen, sowie Pflanzenzellen und Pflanzen, enthaltend diese Plasmide.
  • Bedingt durch den kontinuierlich steigenden Nahrungsmittel- und Rohstoffbedarf, der aus der ständig wachsenden Weltbevölkerung resultiert, ist eine der Aufgaben der biotechnischen Forschung, sich um eine Veränderung der Inhaltsstoffe sowie des Ertrages von Nutzpflanzen zu bemühen. Dazu muss der Metabolismus der Pflanzen verändert werden.
  • Ein besonderes Interesse gilt dabei der Möglichkeit, pflanzliche Inhaltsstoffe als erneuerbare Rohstoffquellen für z. B. die chemische Industrie zu verwenden. Dies ist aus zwei Gründen von besonders großer Bedeutung. Zum einen stellen Erdöl- oder Kohlevorkommen die bisher von der petrochemischen Industrie im wesentlichen verwendeten Rohstoffquellen dar. Diese Vorräte aber sind endlich und es ist absehbar, dass alternative, erneuerbare Rohstoffquellen, d. h. nachwachsende Rohstoffe geschaffen werden müssen. Zum anderen ist die gegenwärtige Situation in der Landwirtschaft die, dass im europäischen sowie nordamerikanischen Raum die klassischen, auf den Ernährungssektor zielenden landwirtschaftlichen Produkte im Überschuss vorliegen. Dies führt zu offensichtlichen finanziellen und politischen Problemen in der Landwirtschaft. Alternative Produkte, für die ein großer mengenmäßiger Bedarf besteht, könnten eine Lösung dieses Problems darstellen.
  • Nachwachsende Rohstoffe lassen sich prinzipiell in Fette und Öle, Proteine sowie Carbohydratverbindungen wie Mono-, Oligo- und Polysaccharide unterteilen. Bei den Polysacchariden sind die Stärke und die Cellulose die mit Abstand wichtigsten Komponenten. Im Bereich der EG verteilte sich die Gesamtstärkeerzeugung des Jahres 1987/1988 auf die Pflanzen Mais (60%), Weizen (19%) und Kartoffel (21%). Bei den Oligosacchariden ist in Bezug auf die Quantität das Disaccharid Saccharose die wichtigste Substanz. Im Bereich der EG ist die Zuckerrübe die wichtigste Quelle für die Produktion und Extraktion von Saccharose.
  • Um die industrielle Verwertung von Mono- und Oligosacchariden als Rohmaterialien weiter auszudehnen und in Anbetracht des hohen ökologischen und ökonomischen Risikos bei der Kultivierung von Monokulturen mit einer niedrigen Rate an Fruchtwechseln, wie beispielsweise der Zuckerrübe, ist es weiterhin wünschenswert, andere Pflanzen als die Zuckerrübe zur Herstellung von Oligosacchariden zu verwenden.
  • Wenn Samen oder Knollen als Rohmaterial für die Zuckererzeugung verwendet werden, ist die hohe Flüssigkeitsmenge ein bedeutendes Hindernis. Bei der Kartoffel beträgt der Flüssigkeitsgehalt bis zu etwa 80% des Gewichts der frischen Knolle.
  • Die Flüssigkeit enthält einen großen Anteil an reduziertem Stickstoff, der während der Verarbeitung zu ökologischen Problemen führt. Bei der Verwendung von Samen oder Knollen zur Erzeugung von Zucker wäre es daher vorteilhaft, den Proteingehalt der Samen oder Knollen zu vermindern.
  • Andererseits wäre eine Erhöhung der Proteinkonzentration in den Samen und Knollen einer Pflanze wünschenswert, wenn pflanzliche Produkte mit verbesserter Qualität benötigt werden, wie beispielsweise proteinreiche Nahrungsmittel oder Tierfutter.
  • Die biochemischen Synthesewege zum Aufbau der Stärke in höheren Pflanzen sind bekannt. Ebenfalls sind einige der Hauptproteine der Kartoffelknolle gut biochemisch untersucht, beispielsweise ist Patatin, das hauptsächliche Speicherprotein der Kartoffelknolle, ein Glycoprotein mit einem Molekulargewicht von 40 kDa. (Der genomische Patatinklon wurde von M. Rocha-Sosa et al. beschrieben (a. a. O.)). Neue biotechnologische Verfahren zur genetischen Veränderung dikotyler und monokotyler Pflanzen mittels des Transfers und stabilen Einbaus einzelner isolierter Gene oder Gruppen von Genen sind bekannt (Gasser und Fraley, Science 244, 1293–1299). Möglichkeiten zur spezifischen Expression von mittels gentechnologischen Verfahren in die Kartoffel eingeführten fremden Genen, primär in der Knolle, sind ebenfalls bekannt (Rocha-Sosa et al., (1989), EMBO J. 8, 23–29; und EP 375 092 ).
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Plasmide bereitzustellen, deren DNA-Sequenzen nach Einführung in das pflanzliche Genom Veränderungen der Carbohydrat- und Proteinkonzentration und der Carbohydrat- und Proteinzusammensetzung in regenerierten Pflanzen hervorrufen. Es ist ferner Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Pflanzenzellen und Pflanzen, die die auf den Plasmiden lokalisierten DNA-Sequenzen enthalten, bereitzustellen.
  • Die vorliegende Erfindung liefert ein Plasmid, welches DNA-Sequenzen enthält, die, wenn sie in einer pflanzlichen Zelle anwesend sind, sowohl eine Verminderung der Stärkekonzentration und eine Steigerung der Konzentration mindestens eines Saccharids, ausgwählt aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide, bewirken.
  • Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Plasmid, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für das Protein ADP-Glucosephyrophosphorylase kodiert, wobei die DNA-Sequenz in invertierter Orientierung vorliegt, wie nachstehend definiert ist. Die DNA-Sequenz kann für eine oder beide Untereinheit(en) der ADP-Glucosepyrophosphorylase kodieren. Die DNA-Sequenz kodiert beispielsweise für die Isoform I, die Isoform II oder beide Isoformen der ADP-Glucosepyrophosphorylase der Kartoffel.
  • Eine DNA-Sequenz liegt in normaler (nicht-invertierter) Orientierung in einem Plasmid so vor, dass das 3'-Ende der DNA-Sequenz, das durch den offenen Leserahmen definiert ist, mit dem 5'-Ende des Plasmids verbunden ist, und das 5'-Ende der DNA mit dem 3'-Ende des Plasmids verbunden ist. Die DNA kann so korrekt abgelesen, transkribiert und translatiert werden. Der Ausdruck "invertierte Orientierung" wird hier verwendet, um darzustellen, dass eine DNA-Sequenz in einem Plasmid so angeordnet ist, dass das 3'-Ende der DNA-Sequenz, das durch den offenen Leserahmen definiert ist, mit dem 3'-Ende des Plasmids verbunden ist, und das 5'-Ende der DNA mit dem 5'-Ende des Plasmids verbunden ist. Wenn dieses invertierte Konstrukt in der Wirtspflanze transkribiert wird, entsteht eine "anti-sense" mRNA in Bezug auf die normale "sense" mRNA. Eine DNA-Sequenz in invertierter Orientierung kann als äquivalent zum nicht-kodierenden Strang dieser DNA-Sequenz angesehen werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Plasmid ist die DNA-Sequenz vorzugsweise mit regulatorischen Sequenzen verbunden, die in pflanzli chen System operativ sind und die eine Expression der DNA-Sequenz in einer Pflanze sicherstellen, beispielsweise einem Promotor und einem Terminationssignal aus viralen und/oder pflanzlichen Genen. Der Promotor ist beispielsweise der Promotor der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus und das Terminationssignal ist beispielsweise von dem Octopinsynthase-Gen abgeleitet, beispielsweise von dem Octopinsynthase-Gen der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5.
  • Bei einem erfindungsgemäßen, die DNA-Sequenz in invertierter Orientierung, einen Promotor und ein Terminationssignal enthaltenden Plasmid ist vorzugsweise das 3'-Ende der DNA-Sequenz mit dem 3'-Ende des Promotors verbunden und das 5'-Ende der DNA ist mit dem 5'-Ende des Terminationssignals verbunden.
  • Beispiele von erfindungsgemäßen Plasmiden sind Plasmid p35S-pat (DSM 5877), p35S-anti-pat (DSM 5878), p35S-anti-ADP-glc1 (DSM 5879), p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880) und p35S-anti-ADP-glc1 + 2 (DSM 5881); die Plasmide und ihre Konstrukte sind nachstehend beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung liefert auch eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle, enthaltend eine wie vorstehend definierte DNA-Sequenz, und liefert weiterhin eine Pflanze oder eine Pflanzenzelle, enthaltend ein wie vorstehend definiertes Plasmid.
  • Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Plasmids oder einer erfindungsgemäßen Pflanzenzelle bei der Erzeugung einer transgenen Pflanze.
  • Es wurde gefunden, dass bei transgenen Pflanzen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die ein ADP-Glucosepyrophosphorylase-Protein kodiert, dessen DNA-Sequenz in invertierter Orientierung vorliegt, wobei die DNA-Sequenz beispielsweise in einem erfindungsgemäßen Plasmid vorliegt, die ADP-Glucosepyrophosphorylaseakti vität und die Stärkekonzentration im Vergleich zu der nichttransformierter Pflanzen vermindert ist, und dass zur gleichen Zeit die Konzentration der Mono- und Oligosaccharide erhöht ist, d. h. der Zuckergehalt ist erhöht. Eine transgene Pflanze enthält vorzugsweise das Gen 35S-anti-glc1, 35S-anti-glc2 oder 35S-anti-glc1 + 2, lokalisiert auf den Plasmiden p35S-anti-ADP-glc1 (DSM 5879), p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880) bzw. p35S-anti-ADP-glc1 + 2 (DSM 5881).
  • Solche transgenen Pflanzen können als Rohmaterial bei der Extraktion von Mono- und Oligosacchariden, insbesondere Saccharose, verwendet werden. Diese Pflanzen sind beispielsweise Kartoffelpflanzen, da die resultierenden transgenen Kartoffelknollen als Rohmaterial bei der Extraktion von Mono- und Oligosacchariden, insbesondere Saccharose, die anschließend für die Herstellung von anderen Substanzen verwendet werden kann, besonders brauchbar sind.
  • Da die Proteinkonzentration und daher die Menge von unerwünschtem Stickstoff in der zu verarbeitenden Flüssigkeit reduziert ist, können diese transgenen Pflanzen als Rohmaterial bei der Herstellung von Saccharose verwendet werden. Diese Pflanzen sind beispielsweise Kartoffelpflanzen, da die resultierenden transgenen Kartoffelknollen als Rohmaterial für die Herstellung von Saccharose besonders brauchbar sind.
  • Es kann von besonderem Vorteil sein, transgene Pflanzen zu konstruieren, die sowohl eine DNA-Sequenz, die ein ADP-Glucosepyrophosphorylase-Protein kodiert, und eine DNA-Sequenz, die ein Patatin-Protein kodiert, enthalten, wobei jede der DNA-Sequenzen in invertierter Orientierung vorliegt. Die resultierenden Pflanzen haben einen verminderten Stärkegehalt, einen erhöhten Zuckergehalt und einen verminderten Proteinspiegel. Solche Pflanzen, beispielsweise Kartoffelpflanzen, und insbesondere Kartof felknollen, sind als Rohmaterial für die Herstellung von Saccharose besonders brauchbar.
  • Es ist eine große Anzahl von Klonierungsvektoren, enthaltend ein Replikationssystem in E. coli und einen Marker, der die Selekttion der transformierten Zellen gestattet, für die Erzeugung einer Insertion fremder Gene in höhere Pflanzen verfügbar. Beispiele für Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw.. Dementsprechend kann die Sequenz an einer geeigneten Restriktionsstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transformation in E, coli verwendet. Die E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Nährmedium kultiviert, dann geerntet und lysiert. Das Plasmid wird gewonnen. Als Analysemethode werden im Allgemeinen eine Sequenzanalyse, eine Restriktionsanalyse, Elektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt. Nach jeder Manipulation kann die verwendete DNA-Sequenz gespalten und mit der nächsten DNA-Sequenz verbunden werden. Jede Plasmid-Sequenz kann in den gleichen oder unterschiedlichen Plasmiden kloniert werden. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanze können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti- und Ri-Plasmid T-DNA, als Flankenbereich den einzuführenden Genen verbunden werden.
  • Die Verwendung von T-DNA bei der Transformation von Pflanzenzellen wurde intensiv beforscht und ist ausreichend beschrieben in der EP 120 516 ; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, 1985, Kap. V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1–46 und An et al., EMBO J. (1985) 4: 277–287.
  • Ist die eingeführte DNA einmal im Genom integriert, so ist sie dort in der Regel stabil und geht in der Regel nicht wieder verloren. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Chloramphenicol u. a. vermittelt. Der individuell verwendete Marker sollte daher die Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingefügte DNA fehlt, gestatten.
  • Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion, die Injektion oder die Elektroporation von DNA sowie andere mögliche Techniken. Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären Vektor oder einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. (1978) 163: 181–187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann enthalten sein. Das so transfor mierte Bakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen benutzt. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Zellen) können dann in einem geeigneten Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA getestet werden. Bei der Injektion und Elektroporation sind keine speziellen Anforderungen an die Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie z. B. pUC-Derivate verwendet werden.
  • Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanzen in der üblichen Weise. Diese Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen haben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Abkürzungen
    bp, kb Basenpaare, Kilobasen
    D, kDa Dalton, Kilodalton
    DNA Desoryribonukleinsäure, Träger der genetischen Information
    RNA Ribonukleinsäure
    SDS Natriumdodecylsulfat
    Tris Tris(2-aminoethyl)amin
    EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
  • Am 18.04.1990 wurden bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland, folgende Plasmide hinterlegt (Hinterlegungsnummer):
    Plasmid p35S-pat (DSM 5887)
    Plasmid p35S-anti-pat (DSM 5878)
    Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 (DSM 5879)
    Plasmid p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880)
    Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 + 2 (DSM 5881)
  • Beschreibung der Abbildungen
  • 1 zeigt die Struktur des 5,0 kb großen Plasmids p35S-anti-ADP-glc1. Das auf dem Plasmid lokalisierte Gen 35S-anti-ADP-glc1 enthält folgende Fragmente:
    • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (cauliflower mosaic virus, CaMV). Dieses Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
    • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Dieses Fragment umfasst die Nukleotide 11749–11939.
    • C = Fragment C (1589 bp) beinhaltet das Eco RI-Fragment, welches für die Isoform I der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase Isoformen der Kartoffel kodiert.
  • Das Gen 35S-anti-ADP-glc1 wird in den Polylinker des Plasmids pUC18 geklont. Es werden ferner die im Beispiel 1 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
  • 2 zeigt die Struktur des 5,1 kb großen Plasmids p35S-anti-ADP-glc2. Das auf dem Plasmid lokalisierte Gen 35S-anti-ADP-glc2 enthält die nachstehenden Fragmente:
    • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Dieses Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
    • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Dieses Fragment umfasst die Nukleotide 11749–11939.
    • C = Fragment C (1700 bp) beinhaltet das Eco RI-Fragment, welches für die Isoform II der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase Isoformen der Kartoffel kodiert.
  • Das Gen 35S-anti-ADP-glc2 wird in den Polylinker des Plasmids pUC18 geklont. Es werden ferner die im Beispiel 2 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
  • 3 zeigt die Struktur des 6,6 kb großen Plasmids p35S-anti-ADP-glc1 + 2. Das auf dem Plasmid lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1 + 2 enthält die nachstehenden Fragmente:
    • A = Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Dieses Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV.
    • B = Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5. Dieses Fragment umfasst die Nukleotide 11749–11939.
    • C1= Fragment C1 (1700 bp) beinhaltet das Eco RI-Fragment, welches für die cDNA der Isoform II der ADP-Glucosepyrophosphorylase kodiert.
    • C2 = Fragment C2 (1500 bp) beinhaltet das XbaI/XbaI-Fragment von p35S-anti-ADP-glc1, welches für die cDNA der Isoform I der RDP-Glucosepyrophosphorylase kodiert.
  • Das Gen 35S-anti-ADP-glc1 + 2 wird in den Polylinker des Plasmids pUC18 geklont. Es werden ferner die im Beispiel 3 beschriebenen Schnittstellen gezeigt.
  • 4 zeigt die durch Autoradiographie sichtbar gemachten Banden der Patatin-DNA. Die Intensität der Banden ist ein Maß für die Konzentration der jeweiligen RNA. Die Positionen K1–K4 enthalten RNA aus den Knollen nichttransformierter Pflanzen, Positionen 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61, 85, 36, 37, 54 und 82 enthalten RNA aus den Knollen transformierter Pflanzen. Bei Positionen 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61 und 85 kann keine ADP-glc1-RNA nachgewiesen werden.
  • 5 zeigt die Menge an ADP-Glucosepyrophosphorylase I-Protein in Knollen nicht-transformierter Kontrollpflanzen (Positionen K1–K4) und die Verringerung der Menge oder das Verschwinden des Proteins in Knollen von mit dem Gen 35S-anti-ADP-glc1 transformierter Kartoffelpflanzen (Positionen 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61, 85, 36, 37, 54 und 82).
  • An den Positionen 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61 und 85 ist wesentlich weniger ADP-Glucosepyrophosphorylase I-Protein vorhanden.
  • Zum besseren Verständnis der dieser Erfindung zugrunde liegenden Beispiele wird vorab eine Aufstellung aller für diese Versuche notwendigen und an sich bekannten Verfahren gegeben:
  • Verfahren
  • 1. Klonierungsverfahren
  • Zur Klonierung wurden die Vektoren pUC18/19 und pUC118 sowie die M13 mp10 Serien (Yanisch-Perron et. al., Gene (1985), 33, 103– 119), verwendet.
  • Für die Pflanzentransformation wurden die Genkonstrukte in den binären Vektor BIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984), 12, 8711– 8720) kloniert.
  • 2. Bakterienstämme
  • Für die pUC- und M13 mp-Vektoren wurden die E. coli-Stämme BMH71-18 (Messing et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977), 24, 6342–6346) oder TB1 benutzt.
  • Für den Vektor BIN19 wurde ausschliesslich der E. coli-Stamm TB1 benutzt. TB1 ist ein Rekombinations-negatives, Tetracyclinresistentes Derivat des Stammes JM101 (Yanisch-Perron et al., Gene (1985), 33, 103–119). Der Genotyp des TB1-Stammes ist (Bart Barrel, persönliche Mitteilung): F' (traD36, proAB, lacI, lacZ Δ M15), Δ (lac, pro), SupE, thiS, recA, Sr1: Tn10(TCR).
  • Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes LBA4404 (Bevan, M., Nucl. Acids Res. 12, 8711–8721, (1984); BIN19 Derivat) durchgeführt.
  • 3. Transformation von Agrobacterium tumefaciens
  • Bei Bin19-Derivaten erfolgt die Einführung der DNA in die Agrobakterien durch direkte Transformation nach der Methode von Holsters et al. (Mol. Gen. Genet. (1978), 163, 181–187). Die Plasmid-DNA transformierter Agrobakterien wurde nach der Methode von Birnboim und Doly (Nucl. Acids Res. (1979), 7, 1513–1523) isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung gelelektrophoretisch aufgetrennt.
  • 4. Pflanzentransformation
  • 10 kleine, mit einem Skalpell verwundete Blätter einer Kartoffel-Sterilkultur wurden in 10 ml MS-Medium mit 2% Saccharose gelegt, welches 30–50 μl einer unter Selektion gewachsenen Agrobacterium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3–5 minütigem, leichtem Schütteln wurden die Petrischalen bei 25°C im Dunkeln inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Blätter auf MS-Medium mit 1,6% Glucose, 2 mg/l Zeatinribose, 0,02 mg/l Naphthylessigsäure, 0,02 mg/l Giberellinsäure, 500 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C und 3000 Lux wurde die Claforankonzentration im Medium um die Hälfte reduziert. Die anschließende Kultivierung wurde nach einem bekannten Verfahren durchgeführt (Roche-Sosa et al., EMBO J. 8, 29 (1989).
  • 5. Analyse genomischer DNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
  • Die Isolierung genomischer Pflanzen-DNA erfolgte nach Rogers und Bendich (Plant Mol. Biol. (1985), 5, 69–76.
  • Für die DNA-Analyse wurden 10–20 μg DNA nach geeigneter Restriktionsspaltung mit Hilfe von "Southern Blots" auf Integration der zu untersuchenden DNA-Sequenzen analysiert.
  • 6. Analyse der Gesamt-RNA aus transgenen Kartoffelpflanzen
  • Die Isolierung pflanzlicher Gesamt-RNA erfolgte nach Logemann et al. (Analytical Biochem. (1987), 163, 16–20).
  • Für die Analyse wurden je 50 μg Gesamt-RNA mit Hilfe von "Northern Blots" auf die Anwesenheit der gesuchten Transkripte untersucht.
  • 7. Proteinextraktion
  • Zur Extraktion von Gesamtprotein aus Pflanzengewebe wurden Gewebestücke in Proteinextraktionspuffer (25 mM Natriumphosphat pH 7,0, 2 mM Natriumbisulfit), unter Zusatz von 0,1% (w/v) unlöslichem Polyvinylpyrrolidon (PVP) homogenisiert.
  • Nach Filtrieren durch Zellstoff wurden Zelltrümmer für 20 Minuten bei 10.000 Umdrehungen pro Minute abzentrifugiert und die Proteinkonzentration des Überstandes nach der Methode von Bradford (Anal. Biochem. 1976)/72, 248–254) bestimmt.
  • B. Nachweis von Fremdproteinen mit Hilfe immulogischer Verfahren (Western-Blot)
  • Die Proteinextrakte wurden mittels Gelelektrophorose in SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid)-Gelen nach Molekulargewicht getrennt. Nach SDS-PAGE wurden Proteingele für 15–30 Minuten in Transferpuffer für Graphitelektroden (48 g/l Tris, 39 g/l Glycin, 0,0375% SDS, 20% Methanol) äquilibriert und anschließend im Kühlraum auf Nitrozellulose-Filter transferiert und mit 1,3 mA/cm2 für 1–2 Stunden getrennt. Der Filter wurde für 30 Minuten mit 3% Gelatine in TBS-Puffer (20 mM Tris/HCl pH 7,5, 500 mM NaCl) abgesättigt, anschließend wurde der Filter für 2 Stunden mit dem entsprechenden Antiserum in geeigneter Verdünnung (1 1000–10 000 in TBS Puffer) bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der Filter jeweils für 15 Minuten mit TBS-, TTBS- (TBS-Puffer mit 0,1% Polyoxyethylen-(20)-Sorbitanmonolaurat) und TBS-Puffer gewaschen. Nach dem Waschen wurde der Filter für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit Alkalische-Phosphatase konjugierten Goatanti-Rabbit (GAR)-Antikörpern (1 : 7500 in TBS) inkubiert. An schließend wurde der Filter wie vorstehend beschrieben gewaschen und in AP-Puffer (100 mM Tris/HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) äquilibriert. Die Alkalische-Phosphatase-Reaktion wurde durch Substratzugabe von 70 μl 4-Nitrotetrazolium (NBT)-Lösung (50 mg/ml NBT in 70% Dimethylformamid) und 35 μl 5-Brom-4-Chlor-4-3-Indolylphosphat (BCIP) (50 mg/ml BCIP in Dimethylformamid) in 50 ml AP-Puffer gestartet. Nach 5 Minuten konnten in der Regel erste Signale beobachtet werden. Die Reaktion kann durch Überführen des Filters in Stop-Lösung (20 mM Tris/HCl pH 8,0 mit 5 mM EDTA) beendet werden. Die Reaktion wurde im Dunkeln durchgeführt.
  • 9. Esterase-Test
  • Die Esteraseaktivität des Patatin-Proteins wurde in situ in semi-nativen SDS-Polyacrylamidgelen (SDS-PAGE) durch Inkubation der Gele in 100 ml Inkubationspuffer (50 mM Tris HCl, pH 7,0, 200 mM Natriumchlorid, 0,1% SDS), dem als Substrate 500 μl 1%-ige α-Naphthylacetat-Lösung (1 g α-Naphthylacetat/100 ml Ethanol) und 5 ml 2%-ige Fast Blue RR-Lösung zugesetzt wurde, nachgewiesen. Durch die Esteraseaktivität wurde ein braunschwarzer unlöslicher Farbstoff ausgefällt, der spezifisch die Proteinbande der nativen Esterase im Gel anfärbt. Die Auftrennung des nicht hitzedenaturierten Proteingemisches (semi-nativ) erfolgte in 12%-igem SDS-PAGE nach Laemmli (1970, Nature, 227, 680–685).
  • 10. Färbung von Proteinen im Polyacrylamidgel
  • Nach beendeter Elektrophorese wurde das Gel für 2 Stunden in Fixierlösung (50% Methanol, 10% Essigsäure, 40% Wasser) geschüttelt, anschließend für 4 Stunden in Färbelösung (0,05% Coomassie Brilliant Blue R in Fixierlösung) belassen und schließlich mehrfach in Entfärbelösung (5% Methanol, 7% Essigsäure, 88% Wasser) bis zum Erscheinen klarer Proteinbanden entfärbt.
  • 11. Bestimmung von Glucose, Fructose, Saccharose und Stärke
  • a) Extraktion
  • Kleine Portionen von in flüssigem Stickstoff gefrorenen Knollen (Durchmesser 10 mm) wurde 30 Minuten bei 80°C in 0,5 ml Puffer (80% (v/v) Ethanol, 10 mM HEPES pH 7,5) in einem Wasserbad extrahiert. Der die löslichen Bestandteile enthaltende Überstand wurde abgegossen und das Volumen bestimmt. Der Überstand wurde verwendet, um die löslichen Zucker zu bestimmen.
  • Das verbleibende unlösliche Material wurde mit Wasser gespült und mit einem Mörser fein gemahlen. Der Extrakt wurde anschließend 1 Stunde bei 95°C in 0,2 M Kaliumhydroxidlösung gekocht, der pH mit 70 μl 1N Essigsäure auf 5,5 justiert und das Ganze anschließend zentrifugiert. Aliquots der resultierenden Stärkelösung wurden zur Bestimmung der Stärke verwendet.
  • b) Quantitative Bestimmung der löslichen Glucose, Fructose und Saccharose
  • Die quantitative Bestimmung der löslichen Glucose, Fructose und Saccharose wurde mit dem nachstehenden Testgemisch durchgeführt:
    100,0 mM Imidazol-HCl, pH 6,9
    1,5 mM MgCl2
    0,5 mM NADP+
    1,3 mM ATP
    10–50,0 μl Probe
    1,0 U Glucose-6-phosphatdehydrogenase aus Hefe.
  • Das Gemisch wurde 5 Minuten inkubiert. Die Bestimmung der Zucker wurde anschließend photometrisch durch die aufeinander folgende Zugabe von
    1,0 U Hexokinase aus Hefe (zur Bestimmung der Glucose)
    1,0 U Phosphoglucoseisomerase aus Hefe (zur Bestimmung der Fructose)
    20,0 U Invertase aus Hefe (zur Bestimmung der Saccharose)
    durchgeführt.
  • c) Stärkebestimmung
  • Zu der nach der Ethanolextraktion unter a) erhaltenen Stärkelösung wurde bei 55°C hydrolytische Enzyme zugesetzt und das Ganze 12 Stunden in dem nachstehenden Gemisch inkubiert:
    50,0 mM Natriumacetat, pH 4,8
    1,4 U Amyloglucosidase aus Aspergillus niger
    2,0 U α-Amylase aus Schweinepankreas
  • Nach der Inkubation wurden die unlöslichen Bestandteile durch 4-minütige Zentrifugation bei 16.000 g entfernt. Im Überstand wurde die resultierende Glucose enzylmatisch wie unter b) beschrieben bestimmt.
  • 12. Bestimmung der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität
  • Die ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wurde nach Standardverfahren bestimmt (Lin et al., 1988, Plant Physiol. 86, 1131– 1135).
  • Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Herstellung der erfindungsgemäßen Plasmide, die Insertion dieser Plasmide in die Pflanze und die Funktion der Plasmide in den transgenen Pflanzen.
  • Beispiel 1
  • Herstellung des Plasmids P35-S-anti-ADP-glcl und Einführung des auf dem Plasmid lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 in das pflanzliche Genom
  • Unter Einsatz einer heterogenen Probe aus Mais wurden aus einer in dem Expressionsvektor xgt11 angelegten cDNA Bank verschiedene Klone identifiziert, die mit dieser Probe kreuzhybridisieren. Diese Klone wurden aus dem Vektor xgt11 in den Vektor pUC18 subkloniert. Eine Bestimmung der Nukleotidsequenz identifizierte diese Klone eindeutig als einen eine der beiden Isoformen (Isoform I) der ADP-Glucosepyrophosphorylase aus Kartoffel kodierenden cDNA Klon.
  • Diese cDNA wurde mit dem Promotor der 35S-RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthese der Ti-Plasmids pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung des die cDNA der ADP-Glucosepyrophosphorylase kodierenden Segmentes so gewählt, dass der nichtkodierende Strang der cDNA abgelesen wird.
  • Das Gen P35-S-anti-ADP-glc1 besteht aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
  • Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285–294) und befindet sich zwischen der Eco RI/KpnI-Schnittstelle. Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835–846), Nukleotide 11749–11939, welches als PvuII Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estrella et al., (1983) Nature 303, 209–213) isoliert worden ist und nach Addition von SphI Linkern an die PvuII Schnittstelle zwischen die SphI/HindIII-Schnittstellen des Polylinkers von pUCl8 kloniert wurde.
  • Fragment C enthält ein 1589 Nukleotide großes EcoRI Fragment, welches für die Isoform I der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylasen Isoformen der Kartoffel kodiert. Die Sequenz der 1589 Nukleotide dieses Klons ist als eine Sequenz des Klons B22-1 in Müller-Röber et al., Mol. Gen. Genet. 224, 136–146 (1990) dargestellt. Die Orientierung dieses cDNA Klons ist so gewählt, dass der nichtkodierende Strang abgelesen wird, was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt. Die Präsenz der antisense RNA führt zu einer Reduktion der von der in der Kartoffel gebildeten "sense"-ADP-Glucosepyrophosphorylase-I RNA und damit zu einer Inhibierung der Stärkebiosynthese. Das Plasmid P35S-anti-ADP-glc1 liegt als EcoRI/HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC18 vor.
  • Das Plasmid P35-S-anti-ADP-glc1 hat eine Größe von 5,0 kb (siehe 1).
  • Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1 wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des vorstehend beschriebenen Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden im Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP-Glucosepyrophosphorylase-glc1 RNA untersucht (vgl. Punkt 6, Verfahren). In einigen der mit dem Gen 35S-anti-ADP-glc1 transformierten Pflanzen konnte keine endogene zelluläre RNA dieses Gens bestimmt werden (siehe 4). Gleichfalls kann durch "Western Blot"-Verfahren kein Protein bestimmt werden (siehe 5). Die damit verbundene Verringerung der Stärkekonzentration sowie der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wird enzymatisch nach Standardverfahren (Plaxton, W. L. und Preiss, J. (1987) Plant Physi ology 83, 105–112, Lin et. al. (1988) Plant Physiology 86, 1131– 1135) bestimmt.
  • Die in Knollenextrakten nicht-transformierter und transgener (35S-anti-ADP-glc1) Kartoffelpflanzen gemessene ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität ist wie folgt:
    Pflanze ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität (%)
    K 1 101,5
    K 2 92,0
    K 3 97,2
    K 4 109,3
    T 89 1,5
    T 93 2,1
    T 62 3,1
    T 52 3,2
    T 53 4,4
    T 23 5,2
    T 61 8,1
    T 85 17,2
    T 36 92,6
    T 37 56,4
    T 54 110,2
    T 82 82,4
  • Die Prozentsätze beziehen sich auf die in nicht-transformierten Pflanzen gemessene Aktivität, der 100-Wert entspricht dem Mittelwert der in nicht-transformierten Pflanzen gemessenen Aktivität.
  • Der Stärkegehalt in Knollen von nicht-transformierten und transgenen (35S-anti-ADP-glc1) Kartoffelpflanzen ist wie folgt:
    Pflanze Stärkegehalt (%)
    K 1 87,2
    K 2 100,9
    K 3 103,4
    K 4 108,5
    T 89 1,8
    T 93 1,4
    T 62 3,9
    T 52 7,0
    T 53 7,2
    T 23 8,9
    T 61 24,4
    T 85 29,0
    T 36 90,6
    T 37 75,6
    T 54 96,1
    T 82 89,4
  • Die Prozentsätze beziehen sich auf den in nicht-transformierten Pflanzen gemessenen Stärkegehalt, der 100-Wert entspricht dem Mittelwert der in nicht-transformierten Pflanzen gemessenen Gehalt.
  • Der Saccharosegehalt in Knollen von nicht-transformierten und transgenen (35S-anti-ADP-glc1) Kartoffelpflanzen ist wie folgt:
    Pflanze Saccharosegehalt (%)
    K 1 1,8
    K 2 1,8
    K 3 2,2
    K 4 2,6
    T 89 31,0
    T 93 31,6
    T 62 27,8
    T 52 21,5
    T 53 24,9
    T 23 20,5
    T 61 17,5
    T 85 10,9
    T 36 2,4
    T 37 4,6
    T 54 2,6
    T 82 2,6
  • Der Prozentgehalt bezieht sich auf den in den Knollen gemessenen Saccharosegehalt, bezogen auf Trockengewicht. K bedeutet nicht-transformierte Pflanzen, T bedeutet transgene Pflanzen.
  • Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, dass die Einführung des auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 in die Pflanze zu einer wesentlichen Verminderung der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität um einen Faktor bis zu 50 im Vergleich zu nicht-transformierten Kontrollpflanzen führt. In den Knollen dieser transgenen Kartoffelpflanzen, die eine starke Reduktion der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität aufweisen, kann weiterhin beobachtet werden, dass der dort enthaltene Stär kegehalt im Vergleich zu dem in nicht-transformierten Kontrollpflanzen enthaltenen Gehalt stark vermindert ist. Eine weitere überraschende Tatsache ist, dass die Knollen, in denen der Stärkegehalt stark vermindert ist, hohe Konzentrationen an Disacchariden aufweisen. Dies ist hauptsächlich Saccharose, die bis zu 30% der Trockenmasse der Knollen ausmacht. Dies bedeutet, dass als Ergebnis der Übertragung des auf dem Plasmid p355-anti-ADP-glc1 lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 die Kartoffelknolle anstelle der Stärke große Mengen an Disacchariden speichert. Aus einer stärkespeichernden Pflanze wurde so eine Pflanze hergestellt, die Zucker speichert.
  • Durch die Einführung des auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 in transgene Pflanzen wird so deren Stärkebiosynthese gehemmt und zusätzlich wird eine viel größere Anzahl an Knollen (ungefähr 4 bis 5 mal so viele) im Vergleich zu Kontrollpflanzen erhalten.
  • Beispiel 2
  • Herstellung des Plasmids p35S-anti-ADP-glc2 und Einführung des auf dem Plasmid lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc2 in das pflanzliche Genom
  • Unter Einsatz einer heterologen Probe aus Mais wurden aus einer in dem Expressionsvektor λgt11 angelegten cDNA Bank verschiedene Klone identifiziert, die mit dieser Probe kreuzhybridisierten. Diese Klone wurden aus dem Vektor λgt11 in den Vektor pUC18 subkloniert. Eine Bestimmung der Nukleotidsequenz identifizierte eindeutig diejenigen cDNA-Klone, die die Tsoform II der ADP Glucose-Pyrophosphorylase aus Kartoffel kodierenden.
  • Diese cDNA wurde mit dem Promotor der 35S RNA des Blumenkohl-Mosaik-Virus sowie dem Polyadenylierungssignal der Octopinsynthase des Ti-Plasmids pTiACH5 versehen. Dabei wurde die Orientierung des die cDNA der ADP-Glucosepyrophosphorylase kodierenden Segmentes so gewählt, dass der nichtkodierende Strang der cDNA abgelesen wird.
  • Das Gen 35S-anti-ADP-glc2 besteht aus den drei Fragmenten A, B und C und wurde wie folgt hergestellt:
  • Fragment A (529 bp) beinhaltet den 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285–294) und befindet sich zwischen der Eco RI/KpnI-Schnittstelle. Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835–846), Nukleotide 11749–11939, welches als PvuII Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estralla et al., (1983) Nature 303, 209–213) isoliert wurde und nach Addition von SphI Linkern an die PvuII Schnittstellen zwischen die SphI/HindIII-Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert wurde.
  • Fragment C enthält ein 1,7 kb großes EcoRI Fragment, welches für die Isoform II der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase-Isoformen der Kartoffel kodiert. Die Orientierung dieses cDNA Klons wurde so gewählt, dass der nichtkodierende Strang abgelesen wird, was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt. Die Präsenz der anti-sense RNA führt zu einer Reduktion der von der in der Kartoffel gebildeten "sense"-ADP-Glucosepyrophosphorylase-2 RNA und damit zu einer Inhibierung der Stärkebiosynthese. Das Gen 35S-anti-ADP-glc2 liegt als EcoI/HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC18 vor (siehe 2).
  • Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc2 lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc2 wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des vorstehende beschriebenen Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden im Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP Glucosepyrophosphorylase-glc2 RNA untersucht. Pflanzen, die mit dem auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc2 lokalisierten Gen 35S-anti-ADP-glc2 transformiert worden sind, weisen eine verringerte Menge der endogenen zellulären RNA dieses Gens auf. Die damit verbundene Verringerung der Stärkemenge sowie der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wird enzymatisch nach Standardverfahren (siehe Beispiel 1) bestimmt.
  • Beispiel 3
  • Herstellung des Plasmids p35S-anti-ADP-glc1 + 2 und Einführung des auf dem Plasmid lokalisierten Gens 35S-anti-ADP-glc1 + 2 in das pflanzliche Genom
  • Das Gen 35S-anti-RDP-glc1 + 2 wurde durch Insertion des 1,5 kb großen XbaI Fragments aus dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 in die XbaI Stelle des Plasmids p35S-anti-ADP-glc2 hergestellt. Dabei wurde die Orientierung des XbaI Fragmentes so gewählt, dass der nicht-kodierende Strang des XbaI Fragmentes abgelesen wird, was somit in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA von beiden Isoformen (Isoform I und II) der ADP-Glucosepyrophosphorylase der Kartoffel führt. Die Präsenz der "anti-sense" RNAs führt zu einer Reduktion der von den in der Kartoffel gebildeten sense-ADP-Glucosepyrophosphorylase 1-RNA und sense-ADP-Glucosepyrophosphorylase 2-RNA und damit zu einer Inhibierung der Stärkebiosynthese. Das Gen 35-S-anti-ADP-glc1 + 2 liegt als EcoRI/HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC 18 vor (siehe 3).
  • Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 + 2 lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1 + 2 besteht aus den vier Fragmenten A, B, C1 und C2 und wurde wie folgt hergestellt:
  • Fragment A (529 bp) beinhaltet des 35S Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus (CaMV). Das Fragment umfasst die Nukleotide 6909 bis 7437 des CaMV (Franck et al., Cell 21, 285–294) und befindet sich zwischen der EcoRI/KpnI-Schnittstelle. Fragment B (191 bp) beinhaltet das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3, 835–846), Nukleotide 11749–11939, welches als PvuII Fragment aus dem Plasmid pAVG 40 (Herrera-Estrella et al., (1983) Nature 303, 209–213) isoliert wurde und nach Addition von SphI Linkern an die PvuII Schnittstellen zwischen die SphI/HindIII Schnittstellen des Polylinkers von pUC18 kloniert wurde.
  • Fragment C1 enthält ein 1,7 kb großes EcoRI Fragment, welches für die Isoform II der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylase Isoformen der Kartoffel kodiert. Die Orientierung dieses cDNA Klons wurde so gewählt, dass der nichtkodierende Strang abgelesen wird, was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA führt.
  • Fragment C2 enthält das 1,5 kb große XbaI/XbaI Fragment aus p35S-anti-ADP-glc1, welches für die Isoform I der beiden ADP-Glucosepyrophosphorylasen kodiert.
  • Die Orientierung der Fragmente C1 und C2 wurde so gewählt, dass der jeweils nichtkodierende Strang der Fragmente C1 und C2 abgelesen wird, was in der transgenen Kartoffelpflanze zur Bildung einer sogenannten "anti-sense" RNA von beiden Isoformen (Isoform I und Isoform II) der ADP-Glucosepyrophosphorylase der Kartoffel führt.
  • Das Gen 35S-anti-ADP-glc1 + 2 liegt als EcoRI/HindIII Fragment im Polylinker des Vektors pUC18 vor.
  • Das auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 + 2 lokalisierte Gen 355-anti-ADP-glc1 + 2 wurde in binäre Vektoren eingeführt und mit Hilfe des Agrobacteriensystems in Kartoffelpflanzen transferiert. Aus transformierten Zellen wurden intakte und fertile Pflanzen regeneriert. Diese Pflanzen wurden mit Hilfe der Northern Blot-Analyse auf die Präsenz der ADP-Glucosepyrophosphorylase I-RNA und ADP-Glucosepyrophosphorylase II-RNA untersucht (vgl. Punkt 6, Verfahren). Pflanzen, die mit dem auf dem Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 + 2 lokalisierten Gen 35S-anti-ADP-glc1 + 2 transformiert wurden, weisen eine stark verringerte Menge der endogenen zellulären RNAs beider ADP-Glucosepyrophosphorylasen (I und II) auf. Die damit verbundene Verringerung der Stärkekonzentration sowie der ADP-Glucosepyrophosphorylaseaktivität wurde enzymatisch nach Standardverfahren (siehe Beispiel 1) bestimmt.

Claims (22)

  1. Plasmid, enthaltend eine ein ADP-Glucose-Pyrophosphoryl-ase-Protein einer Kartoffelpflanze oder eine Untereinheit davon kodierende DNA-Sequenz, die in invertierter Anordnung mit in Pflanzen funktionellen regulatorischen Sequenzen operabel verknüpft ist, und die die biochemischen Eigenschaften einer Pflanzenzelle modifiziert, wobei die Modifikation eine Verminderung der Stärkekonzentration und einen Anstieg der Konzentration mindestens eines Saccharids, ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide, umfasst, wobei die regulatorischen Sequenzen einen Promoter und ein Terminationssignal aus viralen und/oder pflanzlichen Genen enthalten.
  2. Plasmid nach Anspruch 1, worin die DNA-Sequenz für die Isoform I, für die Isoform II, oder für beide Isoformen einer ADP-Glucose-Pyrophosphorylase einer Kartoffelpflanze oder einer Untereinheit davon kodiert.
  3. Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 (DSM 5879).
  4. Plasmid p35S-anti-ADP-glc2 (DSM 5880).
  5. Plasmid p35S-anti-ADP-glc1 + 2 (DSM 5881).
  6. Transgene Pflanzenzelle einer stärkeproduzierenden Pflanze, enthaltend eine ein ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Protein einer Kartoffelpflanze oder eine Untereinheit davon kodierende DNA-Sequenz, die in invertierter Anordnung mit regulatorischen Sequenzen operabel verknüpft ist, und die zu einer Verminderung der Stärkekonzentration und einem Anstieg der Konzentration mindestens eines Saccharids, ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide, führt.
  7. Transgene Pflanzenzelle, enthaltend ein oder mehrere Plasmide nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5.
  8. Transgene Pflanzenzelle nach einem oder mehreren der Ansprüche 6 oder 7, die eine Kartoffel[pflanzen]zelle ist.
  9. Transgene Pflanze, die eine stärkeproduzierende Pflanze ist, enthaltend eine Pflanzenzelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8, enthaltend eine ein ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Protein einer Kartoffelpflanze oder eine Untereinheit davon kodierende DNA-Sequenz, die in invertierter Anordnung mit regulatorischen Sequenzen operabel verknüpft ist, und die zu einer Verminderung der Stärkekonzentration und einem Anstieg der Konzentration mindestens eines Saccharids, ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide, führt.
  10. Transgene Pflanze, abgeleitet aus einer stärkeproduzierenden Pflanze, enthaltend ein oder mehrere Plasmide nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5.
  11. Transgene Pflanze gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 9 oder 10, die eine Kartoffelpflanze ist.
  12. Kartoffelknolle, erzeugt durch eine transgene Pflanze gemäß Anspruch 11.
  13. Kartoffelknolle, enthaltend eine transgene Pflanzenzelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8.
  14. Verwendung einer Kartoffelknolle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 12 und 13 zur Erzeugung von Rohmaterial zur Extraktion von Saccharose.
  15. Verwendung eines Plasmids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 zur Erzeugung einer transgenen Pflanze.
  16. Verwendung eines Plasmids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 zur Erzeugung einer transgenen Kartoffelpflanze.
  17. Verwendung einer Pflanzenzelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8 zur Erzeugung einer transgenen Pflanze.
  18. Verwendung einer Pflanzenzelle gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 6 bis 8 zur Erzeugung einer transgenen Kartoffelpflanze.
  19. Verwendung einer ein ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Protein einer Kartoffelpflanze oder eine Untereinheit davon kodierenden DNA-Sequenz zur Verminderung der Stärkekonzentration und zur Steigerung der Konzentration mindestens eines Saccharids, ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide.
  20. Verwendung eines Plasmids gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 zur Verminderung der Stärkekonzentration und zur Steigerung der Konzentration mindestens eines Saccharids, ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide.
  21. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanzenzelle, umfassend den Schritt des Einführens einer ein ADP-Glucose-Pyrophosphorylase-Protein einer Kartoffelpflanze oder eine Untereinheit davon kodierenden DNA-Sequenz, die in invertierter Anordnung mit regulatorischen Sequenzen operabel verknüpft ist, und die zu einer Verminderung der Stärkekonzentration und einem Anstieg der Konzentration mindestens eines Saccharids, ausgewählt aus der Gruppe der Monosaccharide und Oligosaccharide, führt.
  22. Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze, umfassend das Verfahren gemäß Anspruch 21 und weiter den Schritt des Regenerierens einer ganzen Pflanze.
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