HU217221B - Eljárás növények szénhidrát és fehérjekoncentrációjában, valamint szénhidrát- és fehérje összetételében változásokat előidéző DNS- szekvenciákat tartalmazó plazmidok és az ezeket a plazmidokat tartalmazó növényi sejtek és növények előállítására - Google Patents

Eljárás növények szénhidrát és fehérjekoncentrációjában, valamint szénhidrát- és fehérje összetételében változásokat előidéző DNS- szekvenciákat tartalmazó plazmidok és az ezeket a plazmidokat tartalmazó növényi sejtek és növények előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU217221B
HU217221B HU310/91A HU131091A HU217221B HU 217221 B HU217221 B HU 217221B HU 310/91 A HU310/91 A HU 310/91A HU 131091 A HU131091 A HU 131091A HU 217221 B HU217221 B HU 217221B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
plants
adp
plant
protein
Prior art date
Application number
HU310/91A
Other languages
English (en)
Other versions
HU911310D0 (en
HUT57267A (en
Inventor
Rainer Höfgen
Jens Kossmann
Bernd Müller
Uwe Sonnewald
Lothar Willmitzer
Original Assignee
HOECHST Schering AgrEvo GmbH.,
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by HOECHST Schering AgrEvo GmbH., filed Critical HOECHST Schering AgrEvo GmbH.,
Priority to HU9900537A priority Critical patent/HU9900537D0/hu
Publication of HU911310D0 publication Critical patent/HU911310D0/hu
Publication of HUT57267A publication Critical patent/HUT57267A/hu
Publication of HU217221B publication Critical patent/HU217221B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/30—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms
    • A23K10/35—Animal feeding-stuffs from material of plant origin, e.g. roots, seeds or hay; from material of fungal origin, e.g. mushrooms from potatoes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás növényi sejt biőkémiai tűlajdőnságaitmegváltőztató plazmid előállítására, amely váltőzás sőrán a keményítőkőncentrációja csökken, és legalább egy szacharid kőncentrációja nő,amely szacharid lehet glükóz, frűktóz vagy szacharóz, azzaljellemezve, hőgy a sejtbe egy bűrgőnyából származó, ADP-glükóz-pirőfőszfőriláz fehérjét vagy annak egy működőképes részét kódőló,nőrmál vagy invertált őrientációjú, egy növényekben működőszabályőzószakaszhőz működőképesen csatőlt DNS-szakaszt visznek be. Atalálmány tárgya tővábbá, eljárás –valamely, keményítőt termelő növénybűrgőnyából származó ADP-glükóz- pirőfőszfőriláz fehérjét vagy annakegy részét kódőló DNS-t tartalmazó sejtjének előállítására, valamint–ezeket a sejteket tartalmazó anyagból szacharóz extrakciójáraalkalmas nyersanyag előállítására. A találmány vőnatkőzik még–valamely keményítőt termelő növényből származó, csökkentettkeményítőtartalmú és legalább egy szacharidőt növelt mértékbentartalmazó növény előállítására, valamint –növényi sejtekben ésnövényekben a keményítőtartalőm csökkentésére, és legalább egyszacharid kőncentrációjának növelésére. ŕ

Description

A találmány olyan plazmidokkal foglalkozik, amelyek DNS-szekvenciái, amikor valamely növény genomjába vannak beiktatva, változásokat idéznek elő a regenerált növényekben a szénhidrát- és fehérjekoncentrációt illetően, valamint a szénhidrát- és fehérje-összetételt illetően. A találmány foglalkozik azokkal a növényi sejtekkel és növényekkel is, amelyek ezeket a plazmidokat tartalmazzák.
A folyamatosan növekvő igény következtében élelmiszerekre és nyersanyagokra - amely igény a világ állandóan növekvő népességének következménye -, a biotechnológiai kutatás feladatainak egyike olyan módosítások kidolgozása, amelyek a termelő növények összetételének és termelékenységének javításához vezetnek. Ezek között a módosítások között találjuk a növények metabolizmusának módosítását.
Különösen érdekesek a növények béltartalmának, mint megújítható nyersanyagforrásnak alkalmazási lehetőségei a vegyiparban. Ez két okból különösen nagy jelentőségű. Először is mindezideig a petrokémiai ipar által alkalmazott nyersanyagok fő forrásai a kőolajkutak és szénbányák. Ezek a készletek azonban nem végtelenek, és előre látható, hogy ez az alternatíva, amelyben a nyersanyagok megújítható források, vagyis olyan nyersanyagok, amelyek újból nőnek, előnyben fog részesülni. Másodszor is a jelenlegi helyzet a mezőgazdaságban olyan, hogy Európában és Eszak-Amerikában fölösleg van azokból a hagyományos mezőgazdasági termékekből, amelyek az élelmiszerpiac számára készülnek. Ez nyilvánvalóan gazdasági és politikai problémákhoz vezet a mezőgazdaságban. Az alternatív termékek, amelyekre nagy igény van mennyiségileg is, megoldást jelenthetnek erre a problémára.
Azok a nyersanyagok, amelyek megújíthatók, a következő három fő csoportba oszthatók: zsírok és olajok; fehérjék; és szénhidrátvegyületek, például monooligo- és poliszacharidok. Poliszacharidok esetében a keményítő és a cellulóz messze a legfontosabb komponensek. Az Európai Közösségen belül a teljes keményítőtermelés 1987/88. évben a következő arányban oszlott meg a növények között: kukorica 60%, búza 19%, burgonya 21%. Az oligoszacharidok esetében a szacharóz diszacharid messze a legfontosabb anyag a mennyiséget illetőleg. Az Európai Közösségen belül messze a cukorrépa a legfontosabb forrás, amelyet a szacharóz kivonásához és termeléséhez alkalmaznak.
Abból a célból, hogy még szélesebb körben terjesszük ki a mono- és oligoszacharidok, mint nyersanyagok ipari felhasználását, és felbecsülve a monokultúrák tenyésztésével járó nagyfokú gazdasági és ökológiai kockázatot például cukorrépánál, amely a kis gyakoriságú vetésforgóban jelentkezik, kívánatos a cukorrépán kívül más növényeket is felhasználni oligoszacharidok előállításánál.
Amikor a cukortermeléshez nyersanyagként magokat vagy gumókat alkalmazunk, a nagy mennyiségű folyadék tekintélyes hátrányt jelent. Burgonya esetében a folyadéktartalom a gumó nedves tömegének mintegy 80%-áig is felmegy.
A folyadék nagy mennyiségű redukált nitrogént tartalmaz, amely környezeti gondokhoz vezet a feldolgozás során. Amikor cukor termeléséhez magokat vagy gumókat alkalmazunk, előnyös lenne csökkenteni a nevezett mag vagy gumó fehérjetartalmát.
Másrészt viszont kívánatos lenne a fehéijekoncentráció növelése a magokban és gumókban, ha javított minőségű növényi termékre van szükség, például fehérjében dús élelmiszerekhez vagy haszonállatok takarmányozásához.
Ismeretesek azok a biokémiai utak, amelyek a keményítőszintézishez vezetnek magasabb rendű növényekben. Hasonlóképpen alaposan tanulmányozták már biokémiailag a burgonyagumó fő fehérjéit; így például a patatin, amely a burgonyagumó fő tároló fehérjéje, egy 40 kDa molekulatömegű glikoprotein. (A genomikus patatin kiónt Rocha-Sosa M. és munkatársai írták le, ezt később pontosan idézzük.) Ismeretesek új biotechnológiai eljárások kétszikű és egyszikű növények genetikai módosítására egyes izolált gének vagy géncsoportok átmeneti vagy állandó beépítésének segítségével (Gasser és Fraley: Science 244, 1293-1299). Szintén ismeretes a burgonyába beiktatott idegen gének speciális kifejezése elsősorban a gumóban genetikai manipulációs munkamenetek segítségével [Rocha-Sosa és munkatársai: EM80 J. 8, 23-29 (1989); és 275 092 lajstromszámú európai szabadalmi leírás].
A jelen találmány célja, hogy olyan plazmidokat szolgáltassunk, amelyeknek DNS-szekvenciája, amikor egy növény genomjába iktatjuk be, változásokat hoz létre a regenerált növény szénhidrát- és fehérjekoncentrációjában, valamint szénhidrát- és fehérje-összetételében. A jelen találmány egy másik célkitűzése olyan növényi sejtek és növények szolgáltatása, amelyek tartalmazzák ezeket a DNS-szekvenc iákat a plazmidokban elhelyezve.
A jelen találmány egy olyan DNS-szekvenciát magában foglaló plazmidot nyújt, amely - amikor egy növénysejtben van jelen - a) a fehérjekoncentráció növeléséhez vagy csökkentéséhez vezet, vagy b) csökkenéshez vezet a keményítő koncentrációjában, ugyanakkor növekedéshez vezet legalább egy, a monoszacharidok vagy oligoszacharidok közül kiválasztott szacharid koncentrációjában.
A jelen találmány olyan plazmidot szolgáltat, amely egy patatin fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, továbbá olyan növényt vagy növényi sejtet szolgáltat, amely patatin fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz; a nevezett DNS-szekvencia lehet például a jelen találmány szerinti plazmid formájában.
A jelen találmány olyan plazmidot is szolgáltat, amely egy patatin fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNS-szekvencia fordított orientációban van, amint ezt később meghatározzuk.
A jelen találmány továbbá olyan plazmidot szolgáltat, amely egy ADP-glükóz-pirofoszforiláz fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, ahol a nevezett DNSszekvencia fordított orientációban van, amint ezt később meghatározzuk. A DNS-szekvencia kódolhatja egy ADP-glükóz-pirofoszforiláz egyik vagy mindkét
HU 217 221 Β alegységét. A DNS-szekvencia kódolja például a burgonya ADP-glükóz-pirofoszforiláz I. izoformját, II. izoformját vagy mindkét izoformját.
Egy DNS-szekvencia a normál (nem fordított) orientációban egy plazmidban úgy van elrendezve, hogy a DNS-szekvencia 3’ vége, ahogyan ezt a nyitott leolvasókeret meghatározza, a plazmid 5 ’ végéhez kapcsolódik, és a DNS S’ vége a plazmid 3’ végéhez kapcsolódik. A „fordított orientáció” kifejezés, ahogyan itt használjuk, azt jelenti, hogy egy DNS-szekvencia egy plazmidban úgy van elrendezve, hogy a DNS-szekvencia 3’ vége, ahogyan ezt a nyitott leolvasókeret meghatározza, a plazmid 3’ végéhez kapcsolódik, és a DNS 5’ vége a plazmid 5’ végéhez kapcsolódik. Amikor ilyen fordított konstrukciót átírunk a gazdanövényben, az így létrejövő mRNS „anti-sense” lesz a normális „sense” mRNS-hez viszonyítva. A fordított orientációjú DNSszekvenciát ekvivalensnek tekinthetjük a DNS-szekvencia nem kódoló szálával.
Egy jelen találmány szerinti plazmidban a DNSszekvencia előnyösen olyan szabályozószekvenciákhoz van kapcsolva, amelyek növényi rendszerekben működőképesek, és amelyek biztosítják, hogy a DNS-szekvencia növényekben kifejeződjék, ilyenek például a vírus- és/vagy növényi gének promotoijai és terminációs szignáljai. A promotor például a karfiol mozaikvírus 35S-RNS-ének promotorja, és a terminációs szignál például valamely oktopin szintetáz génből származik, mint a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-ének oktopin szintetáz génjéből.
Egy jelen találmány szerinti plazmidban, amely egy DNS-szekvenciát fordított orientációban tartalmaz, egy promotor és egy terminációs szignál előnyösen úgy van kapcsolva, hogy a DNS-szekvencia 3’ vége a promotor 3’ végéhez van kapcsolva, és a DNS 5’ vége a terminációs szignál 5’ végéhez van kapcsolva.
A jelen találmány szerinti plazmidokra példák a p35S-pat (DSM 5877), p35S-anti-pat (DSM 5878), p35S-anti-ADP-glcl (DSM 5879), p35S-anti-ADPglc2 (DSM 5880) és p35S-anti-ADP-glcl + 2 (DSM 5881) plazmidok, amelyek megalkotását a későbbiekben ismertetjük.
A jelen találmány olyan növényeket vagy növényi sejteket is szolgáltat, amelyek valamely fentebb ismertetett DNS-szekvenciát tartalmaznak, szolgáltat továbbá olyan növényeket vagy növényi sejteket, amelyek valamely fentebb ismertetett plazmidot tartalmaznak.
A jelen találmány foglalkozik a jelen találmány szerinti plazmidok, valamint a jelen találmány szerinti növényi sejtek alkalmazásával transzgenikus növények előállításában.
Arra jöttünk rá, hogy azokban a transzgenikus növényekben, amelyek egy ADP-glükóz-pirofoszforiláz fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, amely szekvencia fordított orientációban van jelen, ahol ez a DNS-szekvencia például egy jelen találmány szerinti plazmidban van, az ADP-glükóz-foszforiláz aktivitás és a keményítőkoncentráció csökken a nem transzformáit növényekhez viszonyítva, ugyanakkor a mono- és oligoszacharidkoncentrációk nőnek, más szóval a cukortartalom növekszik. Az ilyen transzgenikus növények előnyösen az alábbi gének valamelyikét tartalmazzák: 35S-antí-glcl, 35S-anti-glc2 vagy 35S-antiglcl+2 ap35S-anti-ADP-glcl (DSM 5879), p35S-antiADP-glc2 (DSM 5880), illetve p35S-anti-ADPglcl +2 (DSM 5881) plazmidokban elhelyezve.
Az ilyen transzgenikus növényeket nyersanyagként alkalmazhatjuk mono- vagy oligoszacharidok, elsősorban szacharóz kivonására. Az ilyen növény lehet például a burgonyanövény, mivel a keletkező transzgenikus burgonyagumó különösen alkalmas nyersanyag monoés oligoszacharidok, elsősorban szacharóz kivonására, amelyet azután más anyagok előállítására használhatunk fel.
Arra is rájöttünk, hogy azokban a transzgenikus növényekben, amelyek patatin fehéijét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, amely DNS-szekvenciák fordított orientációban vannak jelen, ahol ez a DNS-szekvencia például egy jelen találmány szerinti plazmidban van, a fehérjekoncentráció csökken a nem transzformált növényekhez viszonyítva. Egy ilyen transzgenikus növény előnyösen tartalmazza a 35S-anti-pat gént a p35S-antipat plazmidban (DSM 5878) elhelyezve.
Mivel a fehéijekoncentráció és ezáltal a nem kívánt nitrogén mennyisége a feldolgozandó folyadékban csökken, az ilyen transzgenikus növényeket alkalmazhatjuk nyersanyagként szacharóz előállításához. Az ilyen növények például burgonyanövények, mivel a kialakuló transzgenikus burgonyagumók különösen alkalmasak nyersanyagként szacharóz előállítására.
Különösen előnyös lehet olyan transzgenikus növényeket megalkotni, amelyek mindkét DNS-szekvenciát tartalmazzák, vagyis azt is, amely egy ADP-glükózpirofoszforiláz fehéijét kódol, és azt is, amely egy patatin fehérjét kódol, és mindkét említett DNS-szekvencia fordított orientációban van jelen. Az így létrejövő növények csökkentett fehéijeszinttel bírnak. Az ilyen növények, például burgonyanövények, de különösen a burgonyagumók, különösen hasznosak nyersanyagként szacharóz előállítására.
Arra jöttünk rá továbbá, hogy azokban a transzgenikus növényekben, amelyek egy patatin fehéijét kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, ahol a nevezett DNS-szekvencia például valamely jelen találmány szerinti plazmidban van, a fehéijetartalom növekszik a nem transzformált növényekhez viszonyítva. Egy ilyen transzgenikus növény előnyösen a 35S-pat gént tartalmazza a p35S-pat plazmidban (DSM 5877) elhelyezve. Az ilyen transzgenikus növények, például burgonyanövények, főleg ezek gumói, nagyon hasznosak fehérjében dús élelmiszerek és tartományok előállításához.
Nagyszámú klónozó vektor áll rendelkezésre idegen gének beiktatásához magasabb rendű növényekbe, amelyek E. coliban működő replikációs rendszert tartalmaznak, tartalmaznak továbbá egy olyan markert, amely lehetővé teszi a transzformált sejtek szelektálását. Ezek között a vektorok között találjuk például a pBR322-t a pUC sorozat tagjait, az M13mp sorozat tagjait, a PACYC184-et stb. Következésképpen a szek3
HU 217 221 Β venciát a vektorba megfelelő restrikciós helynél be lehet iktatni. Az így létrejövő plazmidot E. coli transzformálásához használjuk fel. Az E. coli sejteket megfelelő tápközegben tenyésztjük, majd kinyerjük és lizáljuk. A plazmidot kinyerjük. A szekvenciaelemzést, a restrikciós elemzést, az elektroforézist és az egyéb biológiai-molekulárbiológiai eljárásokat általában ugyanúgy hajtjuk végre, mint a szokásos analitikai eljárásokat. Az egyes manipulációs lépések után az alkalmazott DNSszekvenciát elhasíthatjuk és egyesíthetjük a következő DNS-szekvenciával. Az egyes plazmidszekvenciákat klónozhatjuk ugyanabba vagy más plazmidokba. A kívánt gének növényekbe való beiktatásának eljárásától függően más DNS-szekvenciák lehetnek szükségesek. Ha például a növénysejtek transzformálásához a Ti vagy Ri plazmidot alkalmazzuk, akkor a Ti vagy Ri T-DNS legalább jobb határának, de gyakran jobb és bal határának kapcsolódnia kell a beiktatandó gének szegélyező területéhez.
A T-DNS alkalmazását növényi sejtek transzformálására már erőteljesen tanulmányozták és kielégítően leírták az alábbi irodalmi helyeken: 120516 lajstromszámú európai szabadalmi leírás; Hoekema: „The Binary Plánt Vector System” című szakkönyvben (kiadó: Offsetdrukkerij Kanters Β. V.; Alblasserdom, 1985, V. fejezet), Fraley és munkatársai: Crit. Rév. Plánt Sci. 4, 1-46; An és munkatársai: EM80 J. 4, 277-287 (1985).
Amikor a beiktatott DNS már integrálódott a genomba, viszonylag stabil marad és általában nem lép ki újból. Ez normálisan tartalmaz egy olyan szelektív markért, amely valamely biocidra vagy antibiotikumra, többek között kanamicinre, G-418-ra, bleomicinre, higromicinre vagy klóramfenikolra rezisztenciát ad át a transzformált növényi sejteknek. Az egyedi markereknek lehetővé kell tenniük a transzformált sejtek szelekcióját azok közül a sejtek közül, amelyek nem tartalmazzák a beiktatott DNS-t.
Nagyszámú technika áll rendelkezésre DNS beiktatására valamely növényi gazdasejtbe. Ezek között a technikák között találjuk a transzformálást T-DNS-sel, transzformáló közvetítőként Agrobacterium tumefacienst vagy Agrobacterium rhizogenest alkalmazva, a fúziót, az injekciót, vagy az elektroporációt, valamint további lehetséges eljárásokat. Ha a transzformáláshoz Agrobacteriumokat alkalmazunk, a beiktatandó DNS-t speciális plazmidokba kell iktatni, nevezetesen vagy egy köztes vektorba, vagy egy binér vektorba. A köztes vektorok homológ rekombinációval integrálódnak a Ti vagy Ri plazmidokba azoknak a szekvenciáknak tulajdoníthatóan, amelyek homológok a T-DNS-ben levő szekvenciákhoz. A Ti vagy Ri plazmidok tartalmazzák a T-DNS átviteléhez szükséges vir területet. A köztes vektorok Agrobacteriumokban nem tudják replikáim magukat. A köztes vektorokat egy segítő (helper) plazmid segítségével lehet átvinni Agrobacterium tumefaciensbe (konjugáció). A binér vektorok képesek replikáim magukat mind E. coliban, mind Agrobacteriumokban. Ezek tartalmaznak egy szelekciós marker gént és kapcsolót vagy polilinkert, amelyet a T-DNS határterületek kereteznek. Ezek közvetlenül transzformálhatok Agrobacteriumokba [Holsters és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 163, 181-187 (1978)]. A gazdasejtként alkalmazott Agrobacteriumnak tartalmaznia kell egy vir területet hordozó plazmidot. A vir terület a T-DNS átviteléhez szükséges a növénysejtekbe. További T-DNS-ek is lehetnek jelen. Az így transzformáit baktériumokat alkalmazhatjuk növényi sejtek transzformálásához. A növényi alapanyagot előnyösen Agrobacterium tumefacienssel vagy Agrobacterium rhizogenessel együtt tenyésztjük a DNS átvitele érdekében a növényi sejtekbe. Az így fertőzött növényi anyagból (például levéldarabok, szártöredékek, gyökerek és protoplasztok vagy szuszpenzióban tenyésztett sejtek) azután teljes növényeket lehet regenerálni megfelelő tápközegben, amely a szelekcióhoz tartalmazhat antibiotikumokat vagy biocidokat is. Az így kapott növényeket azután átvizsgálhatjuk a beiktatott DNS jelenlétére. Injekció vagy elektroporáció esetében a plazmidokkal szemben nincs speciális követelmény. Lehet alkalmazni közönséges plazmidokat, például pUC származékokat.
A transzformált sejtek a növényen belül a szokásos módon növekednek. A növényeket a szokásos módon növeszthetjük és keresztezhetjük más növényekkel, amelyek ugyanazokkal a transzformált örökletes faktorokkal vagy más örökletes faktorokkal bírnak. Az így létrejövő hibrid egyedek a megfelelő fenotípusos tulajdonságokkal bírnak.
Rövidítések bp, kb=bázispár, kilobázis
D, kDa=dalton, kilodalton
DNS=dezoxiribonukleinsav, a genetikai információ hordozója
RN S=ribonukle insav
SDS=nátrium-dodecil-szulfát trisz=trisz(2-amino-etil)-amin
EDT A=etilén-diamin-tetraecetsav
Az alábbi plazmidokat deponáltuk a Deutsche Sammlung von Mikroorganismennél (DSM; Brunswick, Német Szövetségi Köztársaság) 1990. 04. 18-án:
p35S-pat plazmid DSM 5877 p35S-anti-pat plazmid DSM 5878 p35S-anti-ADP-glcl plazmid DSM 5879 p35S-anti-AOP-glc2 plazmid DSM 5880 p35S-anti-ADP-glcl +2 plazmid DSM 5881
Az alábbiakban ismertetjük a bejelentés ábráit.
Az 1. ábra 16,7 kb-s p35S-pat plazmid szerkezetét mutatja be. A 35S-pat gén, amely a plazmidban elhelyezkedik, a következő fragmentumokat tartalmazza:
A= Az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotorját tartalmazza. Ez a fragmentum magában foglalja a CaMV 6909-től 7437-ig terjedő nukleotidjait.
B= a B fragmentum (191 bp) a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját tartalmazza. Ez a fragmentum a 11749-től 11939-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza.
C= a C fragmentum (6000 bp) a B33 genomikus patatin klón fragmentumát foglalja magában.
HU 217 221 Β
A 35S-pat gén a BIN19 plazmid polilinkeqébe van klónozva. Bemutatjuk az 1. példában leírt hasítási helyeket is.
A 2. ábra a 12 kb-s p35S-anti-pat plazmid szerkezetét mutatja be. A 35S-anti-pat gén, amely a plazmidban elhelyezkedik, a következő fragmentumokat tartalmazza:
A= az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35 S promotoiját tartalmazza. Ez a fragmentum magában foglalja a CaMV 6909-től 7437-ig teijedő nukleotidjait.
B= a B fragmentum (191 bp) a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját tartalmazza. Ez a fragmentum a 11749-től 11939-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza.
C= A C fragmentum (1250 bp) a Sall/Smal fragmentumot tartalmazza (lásd a 2. példát).
A 35S-anti-pat gén a BIN19 plazmid polilinkeqébe van klónozva. Bemutatjuk a 2. példában leirt hasítási helyeket is.
A 3. ábra az 5,0 kb-s p35S-anti-ADP-glcl plazmid szerkezetét mutatja be. A 35S-anti-ADP-glcl gén, amely a plazmidban elhelyezkedik, az alábbi fragmentumokat tartalmazza:
A= az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotoiját tartalmazza. Ez a fragmentum magában foglalja a CaMV 6909-től 7437-ig teijedő nukleotidjait.
B= a B fragmentum (191 bp) a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját tartalmazza. Ez a fragmentum a 11749-től 11939-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza.
C= a C fragmentum (1589 bp) azt az EcoRI fragmentumot tartalmazza, amely a burgonya ADPglükóz-pirofoszforiláz két izoformja közül az I. izoformot kódolja.
A 35S-anti-ADP-glcl gén apUC18 plazmid polilinkerjébe van klónozva. Bemutatjuk a 3. példában leírt hasítási helyeket is.
A 4. ábra az 5,1 kb-s p35S-anti-ADP-glc2 plazmid szerkezetét mutatja be. A p35S-ADP-glc2 gén, amely a plazmidban elhelyezkedik, az alábbi fragmentumokat tartalmazza:
A= az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotorját tartalmazza. Ez a fragmentum magában foglalja a CaMV 6909-től 7437-ig teijedő nukleotidjait.
B= a B fragmentum (191 bp) a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját tartalmazza. Ez a fragmentum a 11749-től 11939-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza.
C= a C fragmentum (1700 bp) azt az EcoRI fragmentumot tartalmazza, amely a burgonya ADPglükóz-pirofoszforiláz két izoformja közül a II. izoformot kódolja.
A 35S-anti-ADP-glc2 gén a pUC18 plazmid polilinkerjébe van klónozva. Bemutatjuk a 4. példában leírt hasítási helyeket is.
Az 5. ábra a 6,6 kb-s p35S-anti-ADP-glcl+2 plazmid szerkezetét mutatja be. A 35S-anti-ADP-glcl + 2 gén, amely a plazmidban elhelyezkedik, az alábbi fragmentumokat tartalmazza:
A= az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotoiját tartalmazza. Ez a fragmentum magában foglalja a CaMV 6909-től 7437-ig teijedő nukleotidjait.
B= a B fragmentum (191 bp) a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját tartalmazza. Ez a fragmentum a 11749-től 11939-ig terjedő nukleotidokat tartalmazza.
Cl = a Cl fragmentum (1700 bp) azt az EcoRI fragmentumot tartalmazza, amely a burgonya ADPglükóz-pirofoszforiláz két izoformja közül a II. izoformot kódolja.
C2= a C2 fragmentum (1500 bp) a p35S-anti-ADPglcl Xbal/Xbal fragmentumát tartalmazza, amely a burgonya ADP-glükóz-pirofoszforiláz két izoformja közül az I. izoformot kódolja.
A 35S-anti-ADP-glcl+2 gén a pUClB plazmid polilinkerjébe van klónozva. Bemutatjuk az 5. példában leírt hasítási helyeket is.
A 6. ábra az észteráz aktivitás in situ kimutatását mutatja be függetlenül transzformált Désirée fajtájú burgonya növényekből származó gumóextraktumokban. A gélterület mutatja az észterázt. A 4-11. vonalak fekete foltjai mutatják a 35S-pat génnel transzformált 8 db H7-(35S-33) növény észteráz aktivitását, szemben a Cl és C2 kontroliokkal (első és második vonalak), amelyek nem transzformált növényekből származó kontrollok. A nyilak (—>) az észteráz aktivitás irányát jelzik.
A 7. ábra a patatin RNS-csíkjait mutatja be, amelyeket autoradiográfíával tettünk láthatóvá. A csíkokat nyilakkal jelöljük. A csíkok intenzitása a szóban forgó, adott RNS-koncentrációjának mértéke. Az as3, as4, as5, as6, as7, as9, aslO, asll, asl3, asl4, asl5 és asl6 helyek a 35S-anti-pat génnel transzformált burgonyanövények gumóiból izolált RNS mintáit tartalmazzák. Az asl, as3, as4, as5, as6, as9, aslO, asll, asl4 és asl5 mintákban jellegzetes csökkenés látható a patatinsense-RNS-koncentrációban a nem transzformált sejtek C5 és C6 kontrolijaihoz viszonyítva.
A 8. ábra az endogén patatin fehéije mennyiségében történő csökkenést mutatja be a 35S-anti-pat génnel transzformált transzgenikus burgonyanövények gumóiban, valamint bemutatja a fehéijék megfelelő denzitométeres görbéit.
A= Désirée fajtájú, nem transzformált gumók fehéijemintái
B = a 35S anti-pat génnel transzformált burgonyanövény fehérjemintái. A feketeség intenzitása a koncentráció mértéke ma= molekulatömeg
A 9. ábra az ADP-glcl-RNS-csíkjait mutatja be, amelyeket autoradiográfíával tettünk láthatóvá. A csík intenzitása a szóban forgó, adott RNS-koncentráció mértéke. A K1-K4 helyek a nem transzformált növényekből származó RNS-t tartalmazzák, míg a 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61, 85, 36, 37, 54 és 82 helyek transzformáit növényekből származó gumók RNS-eit tartalmaz5
HU 217 221 Β zák. ADP-glcl-RNS nem mutatható ki a 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61 és 85 helyeken.
A 10. ábra az ADP-glükóz-pirofoszforiláz I-fehérje mennyiségét mutatja be nem transzformált kontrollnövények gumóiban (KI -K4 helyek), valamint bemutatja ezen fehérje mennyiségének csökkenését vagy eltűnését a 35S-anti-ADP-glcl génnel transzformált burgonyanövények gumóiban (93, 89, 62, 52, 53, 23, 61, 85, 36, 37, 54 és 82 helyek).
Jellegzetesen kevesebb ADP-glükóz-pirofoszforiláz I fehérje van jelen a 93, 89, 62, 52, 53, 23, 61 és 65 helyeken.
Abból a célból, hogy a találmány alapját képező példák jobban megérthetők legyenek, az összes egyébként önmagában ismert munkamenetet és vizsgálati eljárást az alábbiakban felsorolva ismertetjük (irodalmi hivatkozásokkal együtt).
1. Klónozási munkamenet
A klónozáshoz a pUClB/19 és pUCl 18 vektorokat, valamint az M13mpl0 sorozat tagjait alkalmazzuk [Yanisch-Perron és munkatársai: Gene, 33, 103-119 (1985)].
A növény transzformálásához a génkonstrukciót a BIN19 binér vektorba klónozzuk [Bevan: Nucl. Acids. Rés. 12, 8711-8720(1984)].
2. Baktériumtörzsek
A pUC és M13mp vektorokhoz az E. coli BMH71-18 E. coli törzset [Messing és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24, 6342-6346 (1977)] vagy TB1 törzset alkalmazzuk.
A BIN19 vektorhoz kizárólag az E. coli TB1 törzset alkalmazzuk. A TB1 a JM101 törzs rekombináció-negatív, tetraciklinrezisztens származéka [Yanisch-Perron és munkatársai: Gene 33, 103-119 (1985)]. A TB1 törzs genotípusa az alábbi: F’(traD36, proAB, lacl, lacZ, M15), (lac.pro), SupE, thiS, recA, Sri, TnlO (TIR) (Barrel Bárt személyes közlése).
A plazmid transzformálását a burgonyanövényekbe Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzs segítségével hajtjuk végre [Bevan M.: Nucl. Acids. Rés. 12, 8711-8721 (1984); BIN19 származék].
3. Agrobacterium tumefaciens transzformálása
BIN19 származékok esetében a DNS beiktatását Agrobacteriumba közvetlen transzformálással hajtjuk végre a Holsters és munkatársai által kifejlesztett eljárás szerint [Mól. Gén. Génét. 163, 181-187 (1978)]. A transzformált Agrobacteriumok plazmid DNS-ét a Bimbóim és Doly által kifejlesztett eljárással izoláljuk [Nucl. Acids. Rés. 7, 1513-1523 (1979)], és gélelektroforézissel különítjük el megfelelő restrikciós hasítás után.
4. Növénytranszformálás
Steril burgonyatenyészet 10 kis levelét, amelyeket szikével megsértünk, 10 ml, 2% szacharózt is tartalmazó M5 tápközegbe helyezzük, amely 30-50 pl Agrobacterium tumefaciens egy éjszakán át szelektív körülmények között nőtt tenyészetét tartalmazza. 3-5 perces gyengéd rázatás után a Petri-csészéket sötétben inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten. 2 nap múlva a leveleket olyan M5 tápközegen helyezzük el, amely 1,6% glükózt, 2 mg/1 zeatin ribózt, 0,02 mg/1 naftil-ecetsavat, 0,02 mg/1 giberellinsavat, 500 mg/1 claforant, 50 mg/1 kanamicint és 0,8% Bacto agart tartalmaz. Egyhetes, 25 °C hőmérsékleten és 3000 luxnál végzett inkubálás után a claforankoncentráció a tápközegben a felére csökken. Az ezt követő tenyésztést ismert eljárás szerint végezzük [Rocha-Sosa és munkatársai: EMBO J. 8, 29 (1989)].
5. A genomikus DNS elemzése transzgenikus burgonyanövényekből
A genomikus növényi DNS izolálását Rogers és Bendich eljárása szerint végezzük [Plánt Mól. Bioi. 5, 69-76(1985)].
A DNS-elemzéshez, megfelelő restrikciós hasítás után, 10-20 pg DNS-t elemzünk Southern foltképzés segítségével a vizsgálandó DNS-szekvencia integrálásához.
6. A teljes RNS elemzése transzgenikus burgonyanövényekből
A teljes növényi RNS izolálását Logemann és munkatársai szerint [Analytical Biochem. 163, 16-20 (1987)] hajtjuk végre.
Az elemzéshez a teljes RNS 50 pg-os részleteit Northern foltképzés segítségével vizsgáljuk át a keresett átirat jelenlétére.
7. Fehérjekivonás
A teljes fehérje kivonásához a növényi szövetből szövetdarabokat homogenizálunk fehéijekivonó pufferban [25 mmol/1 nátrium-pirofoszfát (pH 7,0), 2 mmol/1 nátrium-hidrogén-szulfit] 0,1% (tömeg/térfogat) oldhatatlan poli(vinil-pirrolidon) (PVP) hozzáadásával.
Cellulózon át végzett szűrés után a sejttörmeléket 20 percen át kicentrifugáljuk 10 000 fordulat/perccel, és a felülúszó fehérjekoncentrációját Bradford eljárása szerint határozzuk meg [Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976)].
8. Idegen fehérjék kimutatása immunológiai folyamatok segítségével (Western-foltképzés)
A fehérjekivonatokat molekulatömeg szerint szeparáljuk gélelektroforézis segítségével SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid) géleken. Az SDSPAGE után a fehérje géleket 15-30 percen át grafitelektródokhoz való transzfer pufferban kiegyensúlyozzuk (48 g/1 trisz, 39 g/1 glicin, 0,0375% SDS, 20% metanol), majd hűtőkamrában nitrocellulóz szűrőre visszük át és 1,3 mA/cm2-nél szeparáljuk 1-2 órán át. A szűrőt 30 percig telítjük 3% zselatinnal. TBS pufferban [20 mmol/1 trisz HC1 (pH 7,5), 500 mmol/1 NaCl], majd a szűrőt 2 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten a megfelelő antiszérumban, alkalmas hígításban (1:1000-1:10 000 TBS pufferban). A szűrőt ezután 15-15 percen át mossuk TBS, TTBS [TBS puffer 0,1 % poli(oxi-etilén)-(20)-szorbitan-monolaurát], majd ismét TBS puffénál. Mosás után a szűrőt 1 órán át inkubáljuk szobahőmérsékleten alkálikus foszfatázzal konjugált kecske-anti-nyúl (GAR) antitestekkel (1:7500 arányban hígítva TBS-ben). A szűrőt ezután a fentiek szerint mossuk és AP pufferban kiegyensúlyozzuk [100 mmol/1 trisz HC1 (pH 9,5), 100 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 MgCl2], Az alkálikus foszfatáz reakciót
HU 217 221 Β μΐ 4-nitrotetrazólium (ΝΒΤ) oldat (50 mg/ml NBT 70%-os dimetil-formamidban) és 35 μΐ 5-bróm-4-klór3-indolil-foszfát (BCIP) (50 mg/ml BCIP dimetilformamidban) szubsztrátum hozzáadásának segítségével indítjuk be 50 ml AP pufferban. Az első jeleket általában 5 perc múlva észleljük. A reakciót úgy fejezhetjük be, hogy a szűrőt „stop” oldatba visszük át [20 mmol/1 trisz-HCl (pH 8,0), 5 mmol/1 EDTA]. A reakciót sötétben végezzük.
9. Eszterázvizsgálat
A patatin fehéije észteráz aktivitását in situ fél natív SDS poliakrilamid gélen (SDS-PAGE) mutatjuk ki a gélek inkubálásával 100 ml inkubáló pufferban [50 mmol/1 trisz-HCl (pH 7,0), 200 mmol/1 nátrium-klorid, 0,1% SDS], amelyhez szubsztrátumként 500 μΐ 1%-os anaftü-acetát oldatot (1 g a-naftil-acetát/100 ml etanol) és 5 ml 2%-os Fást Blue RR oldatot adunk. Az észteráz aktivitás eredményeképpen bamásfekete oldhatatlan festék csapódik ki, amely fajlagosan festi a natív észteráz fehérjecsíkjait a gélben. A fehéqekeverék, amely hőkezeléssel nem denaturálódott, szeparálását 12% SDSPAGE-ban végezzük Laemmli eljárásával összhangban [Natúré 227, 680-685 (1970)].
10. Fehérjék festése poliakrilamid gélben
Az elektroforézis befejezése után a gélt 2 órán át rázatjuk fixáló oldatban (50% metanol, 10% ecetsav, 40% víz), majd 4 órán át festő oldatban hagyjuk (0,05% Coomassie Brilliant Blue R fixáló oldatban), ezután pedig többször színtelenítjük színtelenítő oldatban (5% metanol, 7% ecetsav, 88% víz), amíg tiszta fehérjecsíkok tűnnek fel.
11. Glükóz, fruktóz, szacharóz és keményítő meghatározása
a) Extrahálás
A folyékony nitrogénben fagyasztott gumó kis darabjait (10 mm átmérő) extraháljuk 30 percen át 80 °C hőmérsékleten 0,5 ml pufferban [80% (térfogat/térfogat) etanol, 10 mmol/1 HEPES (pH 7,5)] vízfürdőben. Az oldható komponenseket tartalmazó felülúszót leöntjük és térfogatát meghatározzuk. A felülúszót az oldható cukrok meghatározására alkalmazzuk.
A megmaradt oldhatatlan anyagot vízzel öblítjük és mozsárban finomra őröljük. A kivonatot azután 1 órán át főzzük 95 °C hőmérsékleten 0,2 mol/1 kálium-hidroxid-oldatban, a pH-t beállítjuk 5,5-re 70 μΐ 1 n ecetsavval, majd az egészet centrifugáljuk. A létrejövő keményítőoldat alikvotjait alkalmazzuk keményítő meghatározásra.
b) Az oldható glükóz, fruktóz és szacharóz kvantitatív meghatározása
Az oldható glükóz, fruktóz és szacharóz kvantitatív meghatározását az alábbi vizsgálati keverékben hajtjuk végre:
100,0 mmol/1 imidazol-HCl (pH 6,9)
1,5 mmol/1 MgCl2 0,5 mmol/1 NADP+
1,3 mmol/1 ATP
10-50,0 μΐ minta
1,0 egység glükóz 6-foszfát-dehidrogenáz élesztőből. A keveréket 5 percen át inkubáljuk. A cukrok meghatározását azután fotometriásan végezzük el az alábbiak egymás utáni hozzáadásával:
1,0 egység hexokináz élesztőből (a glükóz meghatározására)
1,0 egység foszfoglükóz izomeráz élesztőből (a fruktóz meghatározására)
20,0 egység invertáz élesztőből (szacharóz meghatározására).
c) A keményítő meghatározása
Az a) pont szerinti etanolos extrahálás után kapott keményítőoldathoz 55 °C hőmérsékleten hidrolitikus enzimeket adunk, és az egészet 12 órán át inkubáljuk az alábbi keverékben
50,0 mmol/1 nátrium-acetát (pH 4,8)
1,4 egység amiloglükozidáz Aspergillus nigerből 2,0 egység α-amiláz sertés pankreászból.
Inkubálás után az oldhatatlan alkotórészeket 4 perces, 16000 g-nél végzett inkubálással eltávolítjuk. A felülúszóban kialakult glükózt azután enzimesen határozzuk meg, amint ezt a b) pontban leírtuk.
12. Az ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitás meghatározása
Az ADP-glükóz-foszforiláz aktivitást standard eljárásokkal határozzuk meg [Lin és munkatársai: Plánt Physiology 86, 1131-1135 (1988)].
Az alábbi példák bemutatják a jelen találmány szerinti plazmidokat, ezeknek a plazmidoknak a beiktatását növényekbe, valamint a plazmidok működését ezekben a transzgenikus növényekben.
1. példa
A p35S-patplazmid előállítása, és az eplazmidban elhelyezkedő 35S-pat gén beiktatása a növény genomba
A patatin fehérje kifejeződésének fokozása érdekében megalkotunk egy olyan plazmidot, amely tartalmazza a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S RNS-ének promotorját, amely a konstitutív kifejeződésre hat, a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-e oktopin szintetáz génjének poliadenilező szignálját, valamint a patatin gén kódoló szekvenciáját, amely genomikus klón formájában van jelen. Az eljárásban a patatin gén kódoló szekvenciáját a promotor és a poliadenilező hely közé helyezzük úgy, hogy a patatin gén kódoló szála leolvasódjék.
A 35S gén három fragmentumból (A, B és C fragmentumok) áll, és az alábbiak szerint készítjük el:
Az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvirus (CaMV) 35S promotorját tartalmazza. A fragmentum magában foglalja a CaMV (Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294) 6909-7437. közti nukleotidjait, és az EcoRI és KpnI hasítási helyek között helyezkedik el. A B fragmentum (191 bp) tartalmazza a pTiACH5 Tiplazmid (Gielen és munkatársai: EMBO J. 3, 835-846) T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját; ezek a 11749-11939-nukleotidok, amelyeket a pAGV 40 plazmidból [Herrera-Estrella és munkatársai: Natúré 303, 209-213 (1983)] való PvuII fragmentumból izolálunk; és - Sphl kapcsolóknak a PvuII hasítási helyhez való hozzáadása után - a pUCB polilinkere SphI/HindlII hasítási helyei közé klónozzuk.
HU 217 221 Β
Az A és B fragmentumokat részleges pUC18 polilinkerrel (KpnI—> Sphl) egyesítjük és klónozzuk kifejező kazetta formájában a BIN19 binér vektor EcoRI és HindlII hasítási helyeibe [Bevan M. Nucl. Acids. Rés. 12, 8711-8721 (1984)]. A C fragmentum a B33 genomikus patatin klón [Rocha-Sosa M. és munkatársai: EMBO J. 8, 23-29 (1989)] egy 6,0 kb-s fragmentumát foglalja magában. Részleges Dral emésztés után a Dral/EcoRI fragmentumot (a Dral hasítási helye a B33 genomikus kiónban) tompa végekkel alakítjuk ki Klenow-polimeráz segítségével, és az A és B fragmentumok között elhelyezkedő polilinker Smal hasítási helyébe klónozzuk.
A p35S-pat plazmid mérete 16,7 kb (lásd az 1. ábrát). A p35S-pat plazmidban elhelyezkedő 35S-pat gén binér vektorokba van beiktatva, és a fentebb leírt Agrobacterium rendszer segítségével burgonyanövényekbe van beiktatva. Ép és termő növényeket regenerálunk a transzformált sejtekből.
Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a regenerált transzgenikus növények gumóit patatin fehérjére, 50 pg nem denaturált gumófehérje-extraktumot, amelyet a 7. pontban leírtak szerint állítottunk elő, szeparálunk 12%os SDS-PAGE gélen, és in situ festjük a-naftil-acetáttal és Fást Blue RR-rel, hogy kimutassuk az észteráz aktivitást. Ez az elemzés azt mutatja, hogy a transzformálás új, patatin-kódolt észteráz aktivitás előfordulásához vezet a H7-(35S-33) 5 —> 11 növényekben.
A Cl és C2 kontrollok, amelyek nem transzformált Désirée növények gumóiból vett extraktumminták, valamint a H7-(35S-33) 8 —» 11 növényekből, amelyek eltérő plazmiddal végzett kontrolltranszformációkból valók, származó gumóextraktumok nem mutatnak új észteráz aktivitást (lásd a 6. ábrát).
Ennek megfelelően kimutatható, hogy a fehérjetartalom a burgonyagumóban növekedhet a p35S-pat plazmidban elhelyezett a 35S-pat gén beiktatásával és kifejezésével.
2. példa
A p35S-anti-pat plazmid előállítása és a plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-pat gén beiktatása a növényi genomba
A 40 kDa-os patatin fehérje a teljes fehérje 20-40%-át teszi ki. A fehérje mennyiségében való csökkenés a feldolgozás során keletkezett folyadékban kívánatos lenne. A patatin fehérje kifejeződésének csökkenése érdekében olyan plazmidot, amely tartalmazza a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S RNS-ének promotoiját, amely a konstitutív kifejeződésre hat, a pTiACH5 Ti-plazmid T-DNS-e oktopin szintetáz génjének poliadenilező szignálját, valamint a patatin gén kódoló szekvenciáját, amely cDNS klón formájában van jelen. Az eljárásban a patatin cDNS kódoló szekvenciáját olyan módon helyezzük el a promotor és a poliadenilező hely közé, hogy a kódoló szekvencia 3’ vége közvetlenül szomszédos a promotorral, míg a kódoló szekvencia 5’ vége közvetlenül szomszédos a poliadenilező hellyel. A kódoló szekvencia normális elrendezése a promotorhoz és a poliadenilező helyhez viszonyítva ilyen módon megfordul, amely a transzgenikus burgonyanövényekben olyan RNS keletkezéséhez vezet, amely a gumóban normálisan keletkező „sense” patatin RNS-hez viszonyítva „anti-sense”. Az „antisense” RNS jelenléte a patatin sense RNS mennyiségének mennyiségi csökkenéséhez és ezáltal a patatin fehérje csökkenéséhez vezet.
A 35S-anti-pat gén három fragmentumból (A, B és C fragmentumok) áll, és az alábbiak szerint készítjük el:
Az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotorját tartalmazza. A fragmentum magában foglalja a CaMV (Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294) 6909-7437. közti nukleotidjait, és az EcoRI és KpnI hasítási helyek között helyezkedik el. A B fragmentum (191 bp) tartalmazza a pTiACH5 Tiplazmid (Gielen és munkatársai: EMBO J. 3, 835-846) T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját; ezek a 11749-11939. nukleotidok, amelyeket a pAGV 40 plazmidból [Herrera-Estrella és munkatársai: Natúré 303, 209-213 (1983)] való PvuII fragmentumból izolálunk; és - Sphl kapcsolóknak a PvuII hasítási helyhez való hozzáadása után - a pUC18 polilinkere SphI/HindlII hasítási helyei közé klónozzuk.
Az A és B fragmentumokat részleges pUC18 polilinkerrel (Kpn—>SphI) egyesítjük és klónozzuk kifejező kazetta formájában a BIN19 binér vektor EcoRI és HindlII hasítási helyeibe [Bevan M.: Nucl. Acids. Rés. 12, 8711-8721 (1984)]. A C fragmentumot a pcT 58 cDNS-klón [Rosahl és munkatársai: Mól. Gén. Genetics 203, 214-220 (1986)] PStI fragmentumának klónozásával kapjuk meg az M13mpl0 vektor PstI hasítási helyébe. Ezután egy 1,25 kb-s Sall/Smal fragmentumot izolálunk ebből a vektorból, ahol a Sáli hasítási hely az M13mpl0 vektor polilinkerjében helyezkedik el, és az Smal hasítási hely a cDNS beiktatásban helyezkedik el, [hasonlítsd össze a pcT 58 szekvenciájával az alábbi irodalmi helyen: Schmidt R.: Diplomamunka, University of Cologne (Kölni Egyetem) (1985)]. A fragmentumot fajlagosan ligáljuk az A és B fragmentumok között elhelyezkedő polilinker Smal és Sáli hasítási helyeibe. A p35S-anti-pat plazmid mérete mintegy 12,0 kb (lásd a
2. ábrát).
A p35S-anti-pat plazmidban elhelyezkedő 35S-antipat gént binér vektorba iktatjuk és - a fentebb leírt Agrobacterium rendszer segítségével - burgonyanövényekbe iktatjuk. Ép és termő növényeket regenerálunk a transzformált sejtekből.
Abból a célból, hogy a 35S-anti-pat gént tartalmazó növényekben a patatin RNS-t és a patatin fehéijét kimutassuk, elvégezzük a transzgenikus patatin anti-sense növények (Pás 58) Northem-foltelemzését. Ennek érdekében a gumókból származó 50 pg teljes RNS-t szeparálunk 1,5%-os formaldehid/agaróz gélen és átvisszük műanyag szűrőre (Hyband N., Amersham). A szűrőt hibridizáljuk radioaktívan jelzett patatin fragmentummal [pcT 58; lásd Rosahl és munkatársai: Mól. Gén. Genetics 203, 214-220 (1986)]. A jeleket autoradiográfia segítségével tesszük láthatóvá. A csíkok (nyíllal jelölve) fajlagosan jelzik a patatin RNS jelenlétét, és a csíkok feketesége a szóban forgó, adott RNS koncentrációjának a mér1
HU 217 221 Β téke (lásd a 7. ábrát). A regenerált transzgenikus növények elemzése patatin RNS és patatin fehérje jelenlétére drasztikus csökkenést mutat a patatin RNS-ben a vizsgált 16 esetből 12-ben (16 függetlenül transzformált növény). Bizonyos esetekben egyáltalán nem mutatható ki patatin RNS. A 7. ábra a transzformált növényekből származó 16 mintából 13-at mutat be.
Ezenkívül, miután gélelektroforézis segítségével szeparáltunk, megvizsgáljuk a gumókból izolált fehérjeextraktumokat patatin fehérjetartalmukra Coomassie kék festés segítségével. Ebből a célból 25 pg denaturált fehérjét veszünk egy nem transzformált, Désirése fajtájú burgonyagumójából, ezeket pedig 12%-os SDS-PAGEnak alávetve szeparáljuk. A fehérjecsíkokat ezután Coomassie kékkel festjük, így a gélen elkülönült fehérjecsíkok láthatóvá válnak. A szín intenzitása a koncentráció mértéke (lásd a 8. ábrát, a feketeség intenzitását). A 35S-anti-pat génnel transzformált összes transzgenikus növényben, amelyek nagymértékben csökkentett mennyiségű patatin RNS-t tartalmaznak, a patatin fehérje jelentős csökkenése mutatható ki (8. ábra), amely mintegy 10%-ra is lecsökkenhet a genetikailag nem módosított növényekben található mennyiséghez viszonyítva. Ennélfogva ki lehet mutatni, hogy a fehérjetartalom a burgonyagumóban nagymértékben csökken a 35S-anti-pat gén beiktatásával és kifejeződésével.
Az egyéb fehérjék, például egy proteinázgátló, koncentrációja nem hat. Ezt a két fehérjevonal denzitometriás görbéinek segítségével mutathatjuk ki (lásd a 8. ábrát).
3. példa
A p35S-anti-ADP-glc 1 plazmid előállítása és a plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glcl gén beiktatása a növényi genomba
Kukorica heterológ mintáit alkalmazva a Ágtll kifejező vektorban elhelyezett cDNS-bankból különböző kiónokat azonosítunk, amelyek kereszthibridizálnak a mintával. Ezeket a kiónokat szubklónozzuk a Ágtll vektorból a pUC 18 vektorba. A nukleotidszekvencia meghatározása világosan azonosítja azokat a kiónokat, amelyek a burgonya ADP-glükóz-pirofoszforiláz két izoformja egyikét (I. izoform) kódoló cDNS-klónok.
Ezt a cDNS-t a karfiol mozaikvírus 35S-RNS-ének promotoijával és a pTiACH5 Ti-plazmid oktopin szintetázának poliadenilező szignáljával szolgáltatjuk. Az eljárásban az ADP-glükóz-foszforiláz cDNS-ét kódoló szegmens orientációját úgy választjuk ki, hogy a cDNS nem kódoló szála olvasódjék.
A 35S-anti-ADP-glcl gén három fragmentumot tartalmaz (A, B és C), és az alábbiak szerint készítjük el:
Az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotorját tartalmazza. A fragmentum magában foglalja a CaMV (Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294) 6909-7437. közti nukleotidjait, és az EcoRI és KpnI hasítási helyek között helyezkedik el. A B fragmentum (191 bp) tartalmazza a pTiACH5 Ti-plazmid (Gielen és munkatársai: EMBO J. 3, 835-846) T-DNS 3. génjének poliadenilező szignálját; ezek a 11749-11939. nukleotidok, amelyeket a pAGV 40 plazmidból [Herrera-Estrella és munkatársai: Natúré 303, 209-213 (1983)] való PvuII fragmentumból izolálunk, és - Sphl kapcsolóknak a PvuII hasítási helyhez való hozzáadása után - a pUC18 polilinkere SphI/HindlII hasítási helyei közé klónozzuk.
Az A és B framentumokat részleges pUC18 polilinkerrel (KpnI —> Sphl) egyesítjük és klónozzuk kifejező kazetta formájában a BIN19 binér vektor EcoRI és HindlII hasítási helyeibe [Bevan M.: Nucl. Acids. Rés. 12, 8711-8721 (1984)].
A C fragmentum egy 1589 nukleotidos EcoRI fragmentumot tartalmaz, amely a burgonya ADP-glükózpirofoszforiláz két izoformjából az I. izoformot kódolja. Ezen klón 1589 nukleotidjának szekvenciáját Müller-Röber és munkatársai mutatják be [Mól. Gén. Genetics 224, 136-141 (1990)], mint a B22-1 szekvenciáját. Ennek a cDNS-klónnak a szekvenciája úgy van szelektálva, hogy a nem kódoló szál olvasódjék (lásd a 2. példát), amely egy transzgenikus burgonyanövényben egy úgynevezett „anti-sense” RNS képződéséhez vezet. Az anti-sense RNS jelenléte csökkenéshez vezet a burgonyában keletkező „sense”-ADP-glükóz-pirofoszforiláz I RNS-ben, ezáltal csökkenéshez vezet a keményítő bioszintézisében. A 35S-anti-ADP-glcl gén a pUC18 vektor polilinkerjében levő EcoRI/HindlII fragmentum formájában van.
A p35S-anti-ADP-glcl plazmid mérete 5,0 kb (lásd a 3. ábrát).
A p35S-anti-ADP-glcl plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glcl gént binér vektorokba iktatjuk és a fentebb leírt Agrobacterium rendszer segítségével burgonyanövényekbe visszük át. Ép és termő növényeket regenerálunk transzformált sejtekből. Ezeknek a növényeknek a gumóit megvizsgáljuk ADP-glükóz-pirofoszforiláz glcl RNS jelenlétére Northem-foltelemzés segítségével (lásd a 6. pontot). Bizonyos növényekben, amelyek a 35S-anti-ADP-glc 1 génnel vannak transzformálva, ennek a génnek endogén celluláris RNS-e nem mutatható ki (lásd a 9. ábrát). Hasonlóképpen nem mutatható ki Westem-foltképzés segítségével (lásd a 10. ábrát). A keményítőkoncentrációban és az ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitásban történő összekapcsolt csökkenést enzimesen határozzuk meg standard eljárásokat alkalmazva [Plaxton W. L. és Preiss J.: Plánt Physiology 83, 105-112 (1987); Lin és munkatársai: Plánt Physiology 86, 1131-1135 (1988)].
Az ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitás nem transzformáit és transzgenikus (35S-anti-ADP-glcl) burgonyanövények gumóiban mérve az alábbi:
Növény ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitás (%)
KI 101,5
K2 92,0
K3 97,2
K4 109,3
T89 1,5
T93 2,1
T62 3,1
T52 3,2
T53 4,4
T23 5,2
T61 8,1
HU 217 221 Β
Növény ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitás (%)
T85 17,2
T36 92,6
T37 56,4
T54 110,2
T82 82,4
A százalékok a nem transzformált növényekben mért aktivitásra vonatkoznak, a 100% érték a nem transzformáit növényekben mért aktivitás átlagértéke.
A keményítőtartalom a nem transzformált és a
transzgenikus (35S-anti-ADP-glcl) burgonyanövények-
ben az alábbi:
Növény Keményítőtartalom
KI 87,2
K2 100,9
K3 103,4
K4 108,5
T89 1,8
T93 1,4
T62 3,9
T52 7,0
T53 7,2
T23 8,9
T61 24,4
T85 29,0
T36 90,6
T37 75,6
T54 96,1
T82 89,4
A százalékok a nem transzformált növényekben
mért keményítőtartalomra vonatkoznak; a 100% érték a
nem transzformált növényekben mért áltagos keményí-
tőtartalom értéknek felel meg.
A nem transzformált és transzgenikus (35S-anti-
ADP-glcl) burgonyanövények gumóiban a szacharóz-
tartalom az alábbi:
Növény Szacharóztartalom (%)
KI 1,8
K2 1,8
K3 2,2
K4 2,6
T89 31,0
T93 31,6
T62 27,8
T52 21,5
T53 24,9
T23 20,5
T61 17,5
T85 10,9
T36 2,4
T37 4,6
T54 2,6
T82 2,6
A százalékok a j gumókban mért szacharóztartalmat
képviselik a száraz tömegre alapozva. A K képviseli a
nem transzformált növényeket, míg a T képviseli a
transzgenikus növényeket.
Ezekből az eredményekből látható, hogy a p35S-an-
ti-ADP-glcl plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-
glcl gén beiktatása a növénybe drasztikus csökkenés-
hez vezet az ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitásban, ahol a szorzószám akár 50 is lehet, összehasonlítva a nem transzformált kontrollnövényekkel. Azoknak a transzgenikus burgonyanövényeknek a gumóiban, ame5 lyek jelentős csökkenést mutatnak az ADP-glükózpirofoszforiláz aktivitásban, egy további megfigyelt következmény az, hogy drasztikus csökkenés lép fel a benne levő keményítőtartalomban azzal a mennyiséggel összehasonlítva, amely a nem transzformált kont10 rollnövényekben található. További meglepő észlelés az, hogy azok a gumók, amelyekben a keményítőtartalom drasztikusan csökken, nagy koncentrációban tartalmaznak diszacharidokat. Ezekben a koncentrációkban legnagyobbrészt a szacharóz játszik szerepet, amely el15 érheti a gumó szárazanyagtartalmának 30%-át is. Ez azt jelenti, hogy a p35S-anti-ADP-glcl plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glcl gén átvitelének eredményeképpen a burgonyagumó keményítő helyett nagy mennyiségű diszacharidot tárol. Ilyen módon egy nö20 vényből, amely keményítőt tárol, olyan növényt alakítunk ki, amely cukrot tárol.
Ezenkívül a p35S-anti-ADP-glcl plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glcl gén transzgenikus növényekbe való beiktatásának segítségével, ahol a transz25 genikus növényben a keményítő bioszintézis gátolt, jelentősen nagyobb számú gumót (mintegy 4-5-ször több) kapunk, mint a kontrollnövények esetében.
4. példa
A p35S-anti-ADP-glc2 plazmid előállítása és a plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glc2 gén beiktatása a növény genomba
Kukorica heterológ mintáját alkalmazva a Xgtll kifejező vektorban létrehozott cDNS-bankból különbö35 ző kiónokat azonosítunk, amelyek kereszthibridizálnak a mintával. Ezeket a kiónokat a Xgtll vektorból a pUC18 vektorba szubklónozzuk. A nukleotidszekvencia meghatározása világosan azonosította azokat a kiónokat, amelyek a burgonya ADP-glükóz-pirofoszfori40 láz II. izoformját kódoló cDNS-klónok.
Ezt a cDNS-t a karfiol mozaikvírus 35S-RNS-ének promotorjával és a pTiACH5 Ti-plazmid oktopin szintetázának poliadenilező szignáljával szolgáltatjuk. Az eljárásban az ADP-glükóz-foszforiláz cDNS-ét kódoló szegmens orientációját úgy választjuk ki, hogy a cDNS nem kódoló szála olvasódjék.
A 35S-anti-ADP-glc2 gén három fragmentumot tartalmaz (A, B és C), és az alábbiak szerint készítjük el:
Az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotoqát tartalmazza. A fragmentum magában foglalja a CaMV (Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294) 6909-7437. közti nukleotidjait, és az EcoRI és KpnI hasítási helyek között helyezkedik el. A B fragmentum (191 bp) tartalmazza a pTiACH5 Ti55 plazmid (Gielen és munkatársai: EMBO J. 3, 835-846) T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját; ezek a 11749-11939-nukleotidok, amelyeket a pAGV 40 plazmidból [Herrera-Estrella és munkatársai: Natúré 303, 209-213 (1983)] való PvuII fragmentumból izolálunk;
és - Sphl kapcsolóknak a PvuII hasítási helyhez való
HU 217 221 Β hozzáadása után - a pUC18 polilinkere SphI/HindlII hasítási helyei közé klónozzuk.
Az A és B fragmentumokat részleges pUC 18 polilinkerrel (Kpnl—>SphI) egyesítjük és klónozzuk kifejező kazetta formájában a BIN19 binér vektor EcoRl és Hindlll hasítási helyeibe [Bevan M.: Nucl. Acids. Rés. 12, 8711-8721 (1984)].
A C fragmentum egy olyan 1,7 kb-s EcoRl fragmentumot tartalmaz, amely a burgonya ADP-glükózpirofoszforiláz két izoformja közül a II. izoformot kódolja. A cDNS-klón orientációját úgy szelektáljuk, hogy a nem kódoló szál olvasódjék (lásd a 2. példát), amely a transzgenikus burgonyanövényben egy úgynevezett „anti-sense” RNS keletkezéséhez vezet. Az antisense RNS jelenléte viszont a burgonyában keletkező sense-ADP-glükóz-pirofoszforiláz 2 csökkenéséhez, ezáltal pedig a keményítő bioszintézisének gátlásához vezet. A 35S-anti-ADP-glc2 gén a pUC18 vektor polilinkerjében van egy EcoRI/HindlII fragmentum formájában (lásd a 4. ábrát).
A p35S-anti-ADP-glc2 plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glc2 gént binér vektorokba iktatjuk, és a fentebb ismertetett Agrobacterium rendszer segítségével burgonyanövényekbe visszük át. Ép és termő növényeket regenerálunk a transzformált sejtekből. Ezeket a növényeket megvizsgáljuk ADP-glükóz-pirofoszforiláz glc2RNS jelenlétére Northem-foltelemzés segítségével. Azok a növények, amelyek a p35S-anti-ADP-glc2 plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glc2 génnel vannak transzformálva, ezen gén endogén celluláris RNS-ének csökkentett mennyiségét mutatják. Az ezzel együtt járó csökkenést a keményítő és az ADP-glükóz-pirofoszforiláz aktivitás mennyiségében enzimatikusan határozzuk meg standard eljárásokat alkalmazva (lásd a 3. példát).
5. példa
A p35S-anti-ADP-glcl + 2 plazmid előállítása és az ebben a plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADPglcl + 2 gén beiktatása a növényi genomba
A 35S-anti-ADP-glcl+2 gént úgy állítjuk elő, hogy egy, a p35S-anti-ADP-glcl plazmidból származó 1,5 kb-s Xbal fragmentumot beiktatunk a p35S-ADPglc2 plazmid Xbal helyébe. Ebben az eljárásban az Xbal fragmentum orientációját úgy szelektáljuk, hogy az Xbal fragmentum nem kódoló szála olvasódjék, amely a transzgenikus burgonyanövényben a burgonya ADPglükóz-pirofoszforiláz két izoformja (I. és II. izoform) úgynevezett „anti-sense” RNS-ének keletkezéséhez vezet. Az „anti-sense” RNS-ek jelenléte viszont a burgonyában keletkező sense-ADP-glükóz-pirofoszforiláz 1 RNS és sense-ADP-glükóz-pirofoszforiláz 2 RNS csökkenéséhez, ezáltal pedig a keményítő bioszintézisének gátlásához vezet. A 35S-anti-ADP-glcl+2 gén a pUC18 vektor polilinkerjében van egy EcoRI/HindlI fragmentum formájában (lásd az 5. ábrát).
A p35S-antí-ADP-glcl+2 plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glcl+2 gén négy fragmentumból áll (A, B, C1 és C2), és az alábbiak szerint állítjuk elő:
Az A fragmentum (529 bp) a karfiol mozaikvírus (CaMV) 35S promotorját tartalmazza. A fragmentum magában foglalja a CaMV (Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294) 6909-7437. közti nukleotidjait, és az EcoRl és Kpnl hasítási helyek között helyezkedik el. A B fragmentum (191 bp) tartalmazza a pTiACH5 Tiplazmid (Gielen és munkatársai: EMBO J. 3, 835-846) T-DNS-e 3. génjének poliadenilező szignálját; ezek a 11749-11939-nukleotidok, amelyeket a pAGV 40 plazmidból [Herrera-Estrella és munkatársai: Natúré 303, 209-213 (1983)] való PvuII fragmentumból izolálunk; és - Sphl kapcsolóknak a PvuII hasítási helyhez való hozzáadása után - a pUCB polilinkere SphI/HindlII hasítási helyei közé klónozzuk.
Az A és B fragmentumokat részleges pUC18 polilinkerrel (Kpnl—>SphI) egyesítjük és klónozzuk kifejező kazetta formájában a BIN 19 binér vektor EcoRl és Hindlll hasítási helyeibe [Bevan M.: Nucl. Acids. Rés. 12, 8711-8721 (1984)].
A Cl fragmentum egy olyan 1,7 kb-s EcoRl fragmentumot tartalmaz, amely a burgonya ADP-glükózpirofoszforiláz két izoformja közül a II. izoformot kódolja. A cDNS-klón orientációját úgy szelektáljuk, hogy a nem kódoló szál olvasódjék (lásd a 2. példát), amely a transzgenikus burgonyanövényben egy úgynevezett „anti-sense” RNS keletkezéséhez vezet.
A C2 fragmentum a p35S-anti-ADP-glcl 1,5 kb-s Xbal-Xbal fragmentumát tartalmazza, amely a két ADP-glükóz-foszforiláz közül az I. izoformot kódolja.
A Cl és C2 fragmentumok orientációját úgy szelektáljuk, hogy az egyes Cl és C2 fragmentumok nem kódoló szála olvasódjék, amely a transzgenikus burgonyanövényekben a burgonya ADP-glükóz-pirofoszforiláz két izoformja (I. izoform és II. izoform) úgynevezett „anti-sense” RNS-ének keletkezéséhez vezet.
A 35S-anti-ADP-glcl+2 gén a pUC18 vektor polilinkerjében van egy EcoRI/HindlII fragmentum formájában.
A p35S-anti-ADP-glcl +2 plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glcl +2 gént binér vektorba iktatjuk, és a fentebb ismertetett Agrobacterium rendszer segítségével burgonyanövényekbe visszük át. Ép és termő növényeket regenerálunk a transzformált sejtekből. Ezeket a növényeket megvizsgáljuk ADP-glükóz-pirofoszforiláz I RNS és ADP-glükóz-pirofoszforiláz II RNS jelenlétére Northem-foltelemzés segítségével. Azok a növények, amelyek a p35S-anti-ADP-glcl+2 plazmidban elhelyezkedő 35S-anti-ADP-glcl+2 génnel vannak transzformálva, a két ADP-glükóz-foszforiláz (I. és II.) endogén celluláris RNS-ének csökkentett mennyiségét mutatják. Az ezzel együtt járó csökkentést a keményítő és az ADP-glükóz-pirofoszforiláz mennyiségében enzimatikusan határozzuk meg standard eljárások szerint (lásd a 3. példát).

Claims (21)

1. Eljárás növényi sejt biokémiai tulajdonságait megváltoztató plazmid előállítására, amely változás során a keményítő koncentrációja csökken és legalább egy szacharid koncentrációja nő, amely szacharid lehet
HU 217 221 Β glükóz, fruktóz vagy szacharóz, azzal jellemezve, hogy a sejtbe egy burgonyából származó, ADP-glükóz-pirofoszforiláz fehérjét vagy annak egy működőképes részét kódoló, normál vagy invertált orientációjú, egy növényekben működő szabályozószakaszhoz működőképesen csatolt DNS-szakaszt viszünk be.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy burgonyából származó ADP-pirofoszforiláz I-es, ΙΙ-es vagy mindkét izoformáját vagy azok egy részét kódoló DNS-szakaszt viszünk be.
3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy invertált orientációjú DNS-szakaszt viszünk be.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vírus- és/vagy növényi gén eredetű promoter-, illetve terminátorjelet tartalmazó szabályozószekvenciákat viszünk be.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként 35S-anti-ADPglcl (DSM 5879) plazmidot alkalmazunk.
6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként 35S-anti-ADPglc2 (DSM 5880) plazmidot alkalmazunk.
7. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy plazmidként 35S-anti-ADPglcl+2 (DSM 5881) plazmidot alkalmazunk.
8. Eljárás valamely, keményítőt termelő növény burgonyából származó ADP-glükóz-pirofoszforiláz fehérjét vagy annak egy részét kódoló DNS-t tartalmazó sejtjének előállítására, azzal jellemezve, hogy egy olyan, burgonyából származó ADP-glükóz-pirofoszforiláz fehérjét vagy annak egy működőképes részét kódoló DNS-t viszünk be, amely a keményítő koncentrációját csökkenti, és legalább egy szacharid koncentrációját növeli, ahol a szacharid monoszacharid vagy oligoszacharid lehet.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás növényi sejt előállítására, amely az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított plazmidot tartalmazza, azzal jellemezve, hogy a sejtbe egy, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított plazmidot viszünk be.
10. A 8. vagy 9. igénypontok szerinti eljárás növényi sejt előállítására, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-t vagy plazmidot burgonyasejtbe visszük be.
11. Eljárás valamely keményítőt termelő növényből származó, csökkentett keményítőtartalmú és legalább egy szacharidot - amely szacharid monoszacharid vagy oligoszacharid lehet - növelt mértékben tartalmazó növény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növényi sejtet burgonyából származó ADP-glükóz-pirofoszforiláz fehérjét vagy annak egy működőképes részét kódoló DNS-szakasszal transzformálunk, és a transzformált növényi sejtből ép, termékeny növényeket regenerálunk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás növény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy növényi sejtet az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított plazmiddal transzformálunk, és a transzformált növényi sejtből ép, termékeny növényeket regenerálunk.
13. A 11. vagy 12. igénypont szerinti eljárás transzgenikus növények előállítására, azzal jellemezve, hogy burgonyából származó sejtet transzformálunk, és a transzformált burgonyasejtből ép, termékeny növényeket regenerálunk.
14. Eljárás csökkentett keményítőtartalmú és legalább egy szacharidot - amely szacharid monoszacharid vagy oligoszacharid lehet - növelt mennyiségben tartalmazó gumós burgonya előállítására, azzal jellemezve, hogy egy burgonyasejtet burgonyából származó, ADP-glükóz-pirofoszforiláz fehéijét vagy annak egy működőképes részét kódoló DNS-szakasszal transzformálunk, és a transzformált növényi sejtből ép, termékeny gumós burgonyanövényeket regenerálunk.
15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy burgonyasejtet egy vagy több, az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított plazmiddal transzformáljuk, a transzformált növényi sejtből ép, termékeny gumós burgonyanövényeket regenerálunk, majd a növényeket reprodukáljuk.
16. Eljárás szacharóz extrakciójára alkalmas nyersanyag előállítására, azzal jellemezve, hogy a kiindulási anyag a 8-10. igénypontok bármelyike szerint előállított növényi sejtet tartalmaz.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 14. vagy 15. igénypont szerint előállított gumós burgonyát alkalmazzuk.
18. Eljárás növényi sejtben a keményítőtartalom csökkentésére és legalább egy szacharid - amely lehet monoszacharid vagy oligoszacharid - koncentrációjának növelésére, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet ADPglükóz-pirofoszforiláz fehéijét vagy annak egy működőképes részét kódoló DNS-szakasszal transzformáljuk.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet az 1-7. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmiddal transzformáljuk.
20. Eljárás növényben a keményítőtartalom csökkentésére, és legalább egy szacharid - amely lehet monoszacharid vagy oligoszacharid - koncentrációjának növelésére, azzal jellemezve, hogy a növényt ADPglükóz-pirofoszforiláz fehéijét vagy annak egy működőképes részét kódoló DNS-szakasszal transzformáljuk.
21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a növényt az 1-7. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmiddal transzformáljuk.
HU310/91A 1990-04-20 1991-04-19 Eljárás növények szénhidrát és fehérjekoncentrációjában, valamint szénhidrát- és fehérje összetételében változásokat előidéző DNS- szekvenciákat tartalmazó plazmidok és az ezeket a plazmidokat tartalmazó növényi sejtek és növények előállítására HU217221B (hu)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU9900537A HU9900537D0 (en) 1990-04-20 1991-04-19 Plasmids containing dna seguences that bring about changes in the carbohydrate and protein concentration and the carbohydrate and protein composition in plants, and plant cells and plants containing those plasmids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4013144A DE4013144A1 (de) 1990-04-20 1990-04-20 Neue plasmide, enthaltend dna-sequenzen, die veraenderungen der karbohydrat- und proteinkonzentration und der karbohydrat- und proteinzusammensetzung in kartoffelknollen hervorrufen, sowie zellen einer kartoffelpflanze, enthaltend diese plasmide

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU911310D0 HU911310D0 (en) 1991-10-28
HUT57267A HUT57267A (en) 1991-11-28
HU217221B true HU217221B (hu) 1999-12-28

Family

ID=6405039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU310/91A HU217221B (hu) 1990-04-20 1991-04-19 Eljárás növények szénhidrát és fehérjekoncentrációjában, valamint szénhidrát- és fehérje összetételében változásokat előidéző DNS- szekvenciákat tartalmazó plazmidok és az ezeket a plazmidokat tartalmazó növényi sejtek és növények előállítására

Country Status (12)

Country Link
US (1) US6057493A (hu)
EP (1) EP0455316B1 (hu)
JP (1) JPH05317052A (hu)
AT (1) ATE256750T1 (hu)
AU (1) AU645302B2 (hu)
CA (2) CA2040793C (hu)
DE (2) DE4013144A1 (hu)
DK (1) DK0455316T3 (hu)
ES (1) ES2208632T3 (hu)
HU (1) HU217221B (hu)
IE (1) IE911314A1 (hu)
IL (2) IL97803A0 (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU644619B2 (en) 1989-12-21 1993-12-16 Advanced Technologies (Cambridge) Limited Modification of plant metabolism
US5498830A (en) * 1990-06-18 1996-03-12 Monsanto Company Decreased oil content in plant seeds
DE4104782B4 (de) * 1991-02-13 2006-05-11 Bayer Cropscience Gmbh Neue Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen, die Veränderungen der Karbohydratkonzentration und Karbohydratzusammensetzung in Pflanzen hervorrufen, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen enthaltend dieses Plasmide
GB9210273D0 (en) * 1992-05-13 1992-07-01 Ici Plc Dna
DE4220758A1 (de) * 1992-06-24 1994-01-05 Inst Genbiologische Forschung DNA-Sequenz und Plasmide zur Herstellung von Pflanzen mit veränderter Saccharose-Konzentration
DE4239026A1 (de) * 1992-11-05 1994-05-11 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur Erhöhung des Proteingehaltes von Pflanzen
WO1994010319A1 (de) * 1992-11-05 1994-05-11 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Verfahren zur erhöhung des proteingehaltes von pflanzen
GB9223454D0 (en) * 1992-11-09 1992-12-23 Ici Plc Novel plants and processes for obtaining them
KR960701210A (ko) * 1993-03-12 1996-02-24 제임스 클리프튼 보올딩 제충방법(method of contr0lling insects in plants)
GB9307408D0 (en) 1993-04-08 1993-06-02 Danisco Transgenic plants
WO1994028146A2 (en) * 1993-05-24 1994-12-08 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Dna sequences and plasmids for the preparation of sugar beet with changed sucrose concentration
GB9421286D0 (en) 1994-10-21 1994-12-07 Danisco Promoter
WO1996031612A2 (en) * 1995-04-06 1996-10-10 Seminis Vegetables Process for selection of transgenic plant cells
DE19608918A1 (de) 1996-03-07 1997-09-11 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Mais codieren
DE19618125A1 (de) 1996-05-06 1997-11-13 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle, die neue Debranching-Enzyme aus Kartoffel codieren
US6080913A (en) * 1996-09-25 2000-06-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Binary methods of increasing accumulation of essential amino acids in seeds
US6232529B1 (en) 1996-11-20 2001-05-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods of producing high-oil seed by modification of starch levels
GB9624685D0 (en) * 1996-11-27 1997-01-15 Isis Innovation Transgenic plants
US5998701A (en) * 1997-06-04 1999-12-07 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Department Of Agriculture Potatoes having improved quality characteristics and methods for their production
DE19836098A1 (de) 1998-07-31 2000-02-03 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Pflanzen, die eine modifizierte Stärke synthetisieren, Verfahren zur Herstellung der Pflanzen, ihre Verwendung sowie die modifizierte Stärke
GB9821198D0 (en) 1998-09-30 1998-11-25 Danisco Enzyme
US7250557B2 (en) 2000-07-17 2007-07-31 E. I. Du Pont De Nemours And Company Plastidic phosphoglucomutase genes
US7323560B2 (en) 2000-07-17 2008-01-29 E.I. Du Pont De Nemours And Company Plastidic phosphoglucomutase genes
US6969783B2 (en) 2001-03-14 2005-11-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Heat stable mutants of starch biosynthesis enzymes
US7173165B2 (en) 2001-12-03 2007-02-06 University Of Florida Research Foundation, Inc. Variants of ADP-glucose pyrophosphorylase affecting phosphate sensitivity and other parameters
US6852485B1 (en) 2002-01-22 2005-02-08 California State University Fullerton Foundation Method for identifying a compound for the treatment of microorganism infections by inhibiting energy storage and utilization in pathogens
US20030232021A1 (en) * 2002-04-12 2003-12-18 Pyro Pharmaceuticals, Inc. Method for the treatment of dental caries caused by streptococci mutans infection by inhibiting energy storage and utilization
US20040133944A1 (en) * 2003-01-08 2004-07-08 Delta And Pine Land Company Seed oil suppression to enhance yield of commercially important macromolecules
EP3008188A4 (en) * 2013-06-14 2017-03-29 J.R. Simplot Company Protein production in plants

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4630393A (en) * 1984-09-21 1986-12-23 Uf Genetics, Inc. Production of hybrid "improved supersweet" sweet corn
JPH02500566A (ja) * 1987-08-17 1990-03-01 プラント・ジェネティック・システムズ・エヌ・ブイ バチルス・スリンギエンシスからのｄｎａ配列で形質転換された植物
ATE278791T1 (de) * 1988-02-26 2004-10-15 Large Scale Biology Corp Nichtnukleare chromosomale transformation
GB8826356D0 (en) * 1988-11-10 1988-12-14 Ici Plc Adp glucose-pyrophosphorylase
US5792920A (en) * 1988-11-10 1998-08-11 Imperial Chemical Industries Plc Plants with altered ability to synthesize starch and process for obtaining them
DE3843627A1 (de) * 1988-12-21 1990-07-05 Inst Genbiologische Forschung Kartoffelknollenspezifische transkriptionale regulation
US5034323A (en) * 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
DK198089D0 (da) * 1989-04-24 1989-04-24 Danske Spritfabrikker Dna-materialer og anvendelse deraf
PT97110B (pt) * 1990-03-23 1998-11-30 Gist Brocades Nv Processo para catalisar reaccoes acelaraveis por enzimas, mediante adicao ao meio reaccional de sementes de plantas transgenicas e para obtencao das referidas sementes
WO1993009237A1 (en) * 1991-11-05 1993-05-13 Sandoz Ltd. Improved supersweet corn

Also Published As

Publication number Publication date
IL118761A0 (en) 1996-10-16
DK0455316T3 (da) 2004-04-13
HU911310D0 (en) 1991-10-28
AU645302B2 (en) 1994-01-13
US6057493A (en) 2000-05-02
ATE256750T1 (de) 2004-01-15
IE911314A1 (en) 1991-10-23
EP0455316A2 (en) 1991-11-06
IL97803A0 (en) 1992-06-21
ES2208632T3 (es) 2004-06-16
CA2040793C (en) 2002-11-19
DE69133347T2 (de) 2004-09-09
EP0455316B1 (en) 2003-12-17
CA2040793A1 (en) 1991-10-21
DE69133347D1 (de) 2004-01-29
HUT57267A (en) 1991-11-28
DE4013144A1 (de) 1991-10-24
AU7509891A (en) 1991-10-24
JPH05317052A (ja) 1993-12-03
CA2401776A1 (en) 1991-10-21
EP0455316A3 (en) 1992-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU645302B2 (en) Plasmids containing DNA sequences that bring about changes in the carbohydrate and protein concentration and the carbohydrate and protein composition in plants, and plant cells and plants containing those plasmids
US6215042B1 (en) Plasmids containing DNA-sequences that cause changes in the carbohydrate concentration and carbohydrate composition in plants, as well as plant cells and plants containing these plasmids
JP3288395B2 (ja) プラスミド、トランスジェニック植物の製法、トランスジェニック植物、及び特異ｄｎａ配列を含有する植物細胞もしくは植物
EP0663956B1 (en) Dna sequences which lead to the formation of polyfructans (levans), plasmids containing these sequences as well as a process for preparing transgenic plants
EP0808371B1 (en) Expression of sucrose phosphorylase in plants
DE69836267T2 (de) Nukleinsäuren aus der artischocke (cynara scolymus), welche für ein enzym mit fruktosylpolymerase-aktivität kodieren
AU672017B2 (en) Dna sequences and plasmids for the preparation of plants with changed sucrose concentration
EP0485044B1 (en) Plasmids for the production of transgenic plants that are modified in habit and yield
BRPI0617411A2 (pt) molÉcula de Ácido nuclÉico, isolada de coffea spp e vetor

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: HOECHST SCHERING AGREVO GMBH, DE

HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee