DE69636620T2

DE69636620T2 - Expression von saccharose phosphorylase in pflanzen

Info

Publication number: DE69636620T2
Application number: DE69636620T
Authority: DE
Inventors: Francis Gerard St. Louis BARRY; Willem Jan Meridian DeWEERD; Murthy Ganesh Chesterfield KISHORE; Lee Marcia Bonne Terre WELDON
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 1995-02-10
Filing date: 1996-02-08
Publication date: 2007-08-30
Anticipated expiration: 2016-02-09
Also published as: AU695131B2; USRE39114E1; KR19980702105A; DE69636620D1; EA000634B1; WO1996024679A1; CZ254397A3; NZ303029A; US20010016953A1; US20030110535A1; AR046003A2; BG101883A; US6476295B2; US6222098B1; AR000895A1; JPH10513364A; BR9607586A; US5716837A; US6235971B1; AU4923596A

Description

Neuere Fortschritte in der Gentechnik haben die erforderlichen Werkzeuge geliefert, um Pflanzen so zu transformieren, dass sie Fremdgene enthalten. Es ist jetzt möglich, Pflanzen zu produzieren, die einzigartige Merkmale von Bedeutung für die Agronomie und Verarbeitung von Feldfrüchten haben. Eine solche vorteilhafte Eigenschaft ist gewiss ein erhöhter Stärke- und/oder Feststoffgehalt und eine erhöhte Qualität bei verschiedenen Kulturpflanzen. Eine weitere ist ein erhöhter Öl- und Proteingehalt von Samen verschiedener Kulturpflanzen.
Saccharose ist die Kohlenstoffspeichereinheit, die aus den Source-Geweben der meisten Pflanzen zu den Sink-Geweben transportiert werden. In Sink-Geweben wird sie hydrolysiert, und die Komponenten werden verwendet, um andere, komplexere Speichereinheiten, in erster Linie Stärke, Protein und Öl, aufzubauen. Die Hydrolyse erfolgt primär durch Sucrose-Synthase, die UDPGlucose und Fructose produziert. UDPGlucose wird durch UDPGlucose-Pyrophosphorylase in Glucose-1-phosphat umgewandelt.
Der Stärkegehalt der Sink-Gewebe von verschiedenen Kulturpflanzen wurde durch die Verwendung eines Gens, das eine bakterielle ADPGlucose-Pyrophosphorylase codiert, erhöht. Siehe PCT-Anmeldung WO 91/19806 (äquivalent zu US-Seriennummer 08/120,703). Dieses Enzym katalysiert die Produktion von ADPGlucose aus Glucose-1-phosphat. Es hat sich auch gezeigt, dass seine Expression während bestimmter Phasen der Samenentwicklung den Ölgehalt senken kann, was vermutlich auf die Umleitung von Rohstoffen zum Stärkeweg mit damit einhergehender Abnahme ihrer Verfügbarkeit für die Ölproduktion zurückzuführen ist.
Die Blaufleckigkeit von Kartoffeln ist ein Phänomen, das während der im großen Maßstab erfolgenden Produktion, Handhabung und Lagerung auftritt. Die Blaufleckigkeit sieht man als dunklen Fleck primär im Rindenbereich der Knolle. Blaufleckigkeit kann zu einem Qualitätsverlust in der Knolle, einer geringeren Verbraucherakzeptanz der Kartoffeln und Kartoffelprodukte und einem Verarbeitungsverlust von Knollen mit übermäßiger Blaufleckigkeit führen. Es hat sich gezeigt, dass Kartoffelsorten mit einem höheren Stärkegehalt eine größere Anfälligkeit für Blaufleckigkeit haben. Es wäre wünschenswert, die Stärke oder Häufigkeit der Fleckenbildung zu senken, und dies wäre besonders wünschenswert, während der Stärkegehalt der Knolle erhöht wird.
Eine gleichmäßigere Verteilung von Stärke und Feststoffen innerhalb der Kartoffelknolle ist ebenfalls wünschenswert. Das Mark bzw. der Kern der Kartoffel hat im Allgemeinen einen niedrigeren Feststoffgehalt als der äußere oder Rindenbereich. Wenn Längsstreifen aus der Kartoffelknolle geschnitten werden, um Pommes frites herzustellen, haben die Mittelteile dieser Streifen daher niedrigere Feststoffgehalte als die Enden, und dies gilt insbesondere für Streifen, die aus der Mitte der Knolle geschnitten werden. Streifen mit einem niedrigeren Feststoffgehalt oder mit Bereichen mit einem niedrigeren Feststoffgehalt erfordern längere Garzeiten, um denselben Grad der Akzeptanz beim Verbraucher zu erreichen. Diese längeren Garzeiten können zu einem Übergaren der Streifen mit höherem Feststoffgehalt führen. Längere Frittierzeiten führen auch zu einem stärkeren Aufsaugen von Fett, und daher haben Streifen mit niedrigerem Feststoffgehalt oder solche mit Bereichen mit einem niedrigeren Feststoffgehalt einen höheren Fettgehalt. Pommes frites mit einem höheren Fettgehalt haben einen geringeren Nährwert. Bei der Herstellung von Kartoffelchips werden Scheiben quer durch die Kartoffelknolle geschnitten, und die ungleichmäßige Verteilung von Feststoffen kann zu einem frittierten Produkt mit übergarten Rändern, nicht durchgegarten Mitten und einem höheren Fettgehalt (insbesondere in der Mitte) führen. Diese ungleichmäßige Verteilung von Feststoffen in der Kartoffelknolle führt auch zu unverhältnismäßig großen Verlusten von Kartoffelfeststoffen (aus der Rinde) während des Schälvorgangs.
Ein höherer Feststoffgehalt ist auch bei der Tomate wünschenswert. Mehr Feststoffe in Form von löslichen (gewöhnlich Zucker und Säuren) und unlöslichen Feststoffen tragen zur Effizienz der Verarbeitung und zur Ausbeute an Produkten, wie Ketchup, Mark, Soßen und Dip, bei. Diese Feststoffe tragen auch zum Geschmack und zur Textur der verarbeiteten Produkte bei. Mehr Feststoffe tragen auch zum verbesserten Geschmack von frischen Tomaten bei.
Sucrose-Phosphorylase ist ein mikrobielles Enzym, das die Produktion von Glucose-1-phosphat direkt aus Saccharose katalysiert. Ihre Aktivität wurde in einem weiten Bereich von Bakterien- und Pilzarten beobachtet, und das Enzym wurde aus mehreren von diesen isoliert (Pimentel et al., 1992; Vandamme et al., 1987). Gene für dieses Enzym wurden aus Agrobacterium spp. (Fournier et al., 1994, und dort zitierte Literatur), Streptococcus mutans, als gtfA bezeichnet (Russell et al., Perry et al.) und Leuconostoc mesenteroides, als spl bezeichnet (Kitao et al., 1992), isoliert. Die heterologe Expression des Gens aus S. mutans in E. coli ist im US-Patent 4,888,170 (Curtiss, 1989) offenbart. Der Nutzen des transformierten Mikroorganismus besteht in seiner Verwendung als Impfstoff gegen S. mutans.
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, ein verbessertes Mittel zur Erhöhung des Stärkegehalts von verschiedenen Pflanzen bereitzustellen. Ein weiteres Ziel besteht darin, ein Mittel zur Senkung des Saccharosegehalts von Samen bei Ölpflanzen bereitzustellen, das zu einer Abnahme der Menge von unerwünschten Kohlehydraten, wie Stachyose und Raffinose, führt, während der für die Öl- und Proteinproduktion verfügbare Kohlenstoff zunimmt. Noch ein weiteres Ziel besteht darin, neue DNA-Konstrukte bereitzustellen, die für die Bereitstellung solcher Mittel geeignet sind. Noch ein weiteres Ziel besteht darin, Kartoffelknollen bereitzustellen, die einen erhöhten Stärkegehalt gleichmäßiger in der gesamten Knolle verteilt aufweisen. Noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, Kartoffelknollen mit einer reduzierten Anfälligkeit für Blaufleckigkeit bereitzustellen. Noch ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht darin, verbesserte Getreidepflanzen, wie Mais, Reis, Weizen und Gerste, bereitzustellen.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Konstrukte bereit, die ein Sucrose-Phosphorylase(SP)-Enzym codieren und die für die Erzeugung eines erhöhten Stärkegehalts in Pflanzen geeignet sind. In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Samen bereitgestellt, die eine gesenkte Konzentration an Saccharose und anderen Kohlehydraten aufweisen und die als Ergebnis der SP-Expression zu einem erhöhten Öl- und Proteingehalt führen.
Zum Erreichen dieser Ziele wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Modifizieren des Kohlehydratgehalts von Zielgeweben von transgenen Pflanzen bereitgestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einsetzen eines rekombinanten doppelsträngigen DNA-Moleküls in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei das DNA-Molekül Folgendes hintereinander umfasst:
(i) einen Promotor, der in den Zellen eines Zielpflanzengewebes funktioniert;
(ii) eine Struktur-DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert;
(iii) eine 3'-untranslatierte DNA-Sequenz, die in Pflanzenzellen die Funktion hat, den Abbruch der Transcription und die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken;
(b) Gewinnen von transformierten Pflanzenzellen; und
(c) Regenerieren von genetisch transformierten Pflanzen aus den transformierten Pflanzenzellen.

In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein rekombinantes doppelsträngiges DNA-Molekül bereitgestellt, das nacheinander Folgendes umfasst:

(a) einen Promotor, der in Zellen des Zielpflanzengewebes funktioniert;
(b) eine Struktur-DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert; und
(c) einen 3'-untranslatierten DNA-Bereich, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, den Abbruch der Transcription und die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken.

Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden auch transformierte Pflanzenzellen bereitgestellt, die DNA enthalten, welche aus den oben genannten Elementen (i), (ii) und (iii) besteht. Gemäß noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden differenzierte Kartoffel-, Tomaten- und Getreidepflanzen bereitgestellt, die in den Knollen, der Frucht bzw. den Samen einen erhöhten Stärkegehalt aufweisen, und es werden differenzierte Ölpflanzen bereitgestellt, die weniger Saccharose und saccharosehaltige Oligosaccharide, wie Stachyose und Raffinose, in den Samen aufweisen.
Bereitgestellt werden auch Verfahren zur Erhöhung des Stärkegehalts in den Stärkeproduktionsorganen von Pflanzen, wie der Knolle der Kartoffel und dem Samen von Getreiden, und zur Senkung der Saccharosemengen in Ölpflanzen, wie Soja und Raps, was zu einem erhöhten Öl- und Proteingehalt führt. Bei der Durchführung des Verfahrens bei der Kartoffel hat sich unerwarteterweise gezeigt, dass es eine vergleichsweise gleichmäßigere Verteilung der Stärke zwischen dem Mark und der Rinde der Knolle gibt. In einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Bereitstellung von Kartoffeln mit einer reduzierten Anfälligkeit für Blaufleckigkeit angegeben.
Ein zusätzlicher Vorteil der Sucrose-Phosphorylase-Aktivität in Sink-Gewebe, wie der Kartoffelknolle, hängt damit zusammen, dass für eine erhöhte neue Saccha rose-hydrolysierende Aktivität gesorgt wird, die ein viel niedrigeres K_m für Saccharose (1–25 mM) aufweist als pflanzliche Saccharose-hydrolysierende Enzyme, Sucrose-Synthasen und -Invertasen, die ein K_m im Bereich von 50–300 mM haben. Dieser Vorteil ist wichtig bei der Etablierung und Festigkeit solcher Sink-Gewebe, was potentiell zu einer Ertragserhöhung führt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Expression eines Pflanzengens, das in Form von doppelsträngiger DNA vorliegt, beinhaltet die Transcription von Messenger-RNA (mRNA) ausgehend von einem Strang der DNA durch RNA-Polymerase-Enzym und die anschließende Prozessierung des primären Transcripts der mRNA innerhalb des Zellkerns. Diese Prozessierung beinhaltet einen 3'-untranslatierten Bereich, der polyadenylierte Nucleotide an die 3'-Enden der mRNA addiert.
Die Transcription von DNA zu mRNA wird durch einen DNA-Bereich reguliert, der gewöhnlich als "Promotor" bezeichnet wird. Der Promotorbereich enthält eine Sequenz von Basen, die der RNA-Polymerase signalisiert, sich mit der DNA zu assoziieren und die Transcription zu mRNA einzuleiten, wobei einer der DNA-Stränge als Matrize verwendet wird, um einen entsprechenden komplementären RNA-Strang herzustellen.
In der Literatur wurden mehrere Promotoren beschrieben, die in Pflanzenzellen aktiv sind. Zu diesen Promotoren gehören unter anderem die Promotoren der Nopalin-Synthase (NOS) und der Octopin-Synthase (OCS) (die auf tumorinduzierenden Plasmiden von Agrobacterium tumefaciens vorhanden sind), die Caulimovirus-Promotoren, wie der 19S- und der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV) und der 35S-Promotor des Figwort-Mosaic-Virus, der lichtinduzierbare Promotor von der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO, ein sehr häufiges Pflanzen-Polypeptid) und der Promotor des Gens für das Chlorophyll-a/b-bindende Protein usw. Alle diese Promotoren werden verwendet, um verschiedene Typen von DNA-Konstrukten zu schaffen, die in Pflanzen exprimiert wurden; siehe zum Beispiel die PCT-Veröffentlichung WO 84/02913 (Rogers et al., Monsanto).
Promotoren, von denen bekannt ist oder sich herausstellt, dass sie in Pflanzenzellen die Transcription von DNA verursachen, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche Promotoren können von einer Vielzahl von Quellen, wie Pflanzen und Pflanzenviren, erhalten werden und umfassen unter anderem den Enhancer-verstärkten CaMV35S-Promotor sowie Promotoren, die aus Pflanzengenen, wie ssRUBISCO-Genen, isoliert wurden. Wie unten beschrieben ist, sollte der besondere ausgewählte Promotor vorzugsweise in der Lage sein, eine ausreichende Expression zu bewirken, die zur Produktion einer wirksamen Menge von Sucrose-Phosphorylase(SP)-Enzym führt, so dass die gewünschte Erhöhung des Stärkegehalts bewirkt wird. Außerdem wird vorzugsweise eine Expression des SP-Gens in spezifischen Geweben der Pflanze, wie Wurzel, Knolle, Samen, Frucht usw., herbeigeführt, und der gewählte Promotor sollte die gewünschte Gewebe- und Entwicklungsspezifität aufweisen. Der Fachmann wird erkennen, dass die Menge an Sucrose-Phosphorylase, die benötigt wird, um die gewünschte Erhöhung des Stärkegehalts zu induzieren, mit der Art der Pflanze variieren kann, und weiterhin, dass eine zu große Sucrose-Phosphorylase-Aktivität für die Pflanze schädlich sein kann. Daher sollte die Promotorfunktion optimiert werden, indem man einen Promotor mit den gewünschten Gewebeexpressionsfähigkeiten und der geeigneten Promotorstärke auswählt und eine Transformante auswählt, die die gewünschte Sucrose-Phosphorylase-Aktivität in den Zielgeweben produziert. Dieser Auswahlansatz aus dem Sortiment der Transformanten wird bei der Expression von heterologen Strukturgenen in Pflanzen routinemäßig eingesetzt, da es aufgrund der Stelle der Gen-Insertion innerhalb des Pflanzengenoms eine Variation zwischen Transformanten gibt, die dasselbe heterologe Gen enthalten (häufig als "Positionseffekt" bezeichnet).
Vorzugsweise haben die in den doppelsträngigen DNA-Molekülen der vorliegenden Erfindung verwendeten Promotoren eine relativ hohe Expression in Geweben, bei denen der erhöhte Stärkegehalt und/oder Trockensubstanzgehalt ge wünscht wird, wie der Knolle der Kartoffelpflanze, der Frucht der Tomate oder des Samens von Mais, Weizen, Reis und Gerste. Die Expression der doppelsträngigen DNA-Moleküle der vorliegenden Erfindung durch einen konstitutiven Promotor, der das DNA-Molekül in allen oder den meisten Geweben der Pflanze exprimiert, wird selten bevorzugt sein und kann in manchen Fällen für das Pflanzenwachstum schädlich sein.
Vom Klasse-I-Patatin-Promotor wurde gezeigt, dass er sowohl hochaktiv als auch knollenspezifisch ist (Bevan et al., 1986; Jefferson et al., 1990). Eine Sequenz eines Teils von ca. 1,0 kb des knollenspezifischen Klasse-I-Patatin-Promotors ist für die Knollenexpression in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Es sind auch mehrere andere Gene mit einer knollenspezifischen oder -verstärkten Expression bekannt, dazu gehören die ADPGPP-Gene der Kartoffelknolle, sowohl die große als auch die kleine Untereinheit (Muller et al., 1990), die Sucrose-Synthase (Salanoubat und Belliard, 1987, 1989), die Hauptknollenproteine einschließlich der 22-kD-Proteinkomplexe und Proteinase-Inhibitoren (Hannapel, 1990), das Gen der stärkekorngebundenen Stärke-Synthase (GBSS) (Rohde et al., 1990) und die anderen Klasse-I- und -II-Patatine (Rocha-Sosa et al., 1989; Mignery et al., 1988). Andere Promotoren, die als für diese Erfindung geeignet in Betracht gezogen werden, sind solche, die eine verstärkte oder spezifische Expression in Kartoffelknollen zeigen, das sind Promotoren, die normalerweise mit der Expression von Stärkebiosynthese- oder -modifikationsenzym-Genen assoziiert sind oder die innerhalb der Kartoffelknolle andere Expressionsmuster zeigen. Beispiele für diese Promotoren sind solche für die Gene der stärkekorngebundenen und anderer Stärke-Synthasen, die Verzweigungsenzyme (Kossmann et al., 1991; Blennow, A. und Johansson, G., 1991; WO 92/14827; WO 92/11375), disproportionierendes Enzym (Takaha et al., 1993), Debranching-Enzyme, Amylasen, Stärke-Phosphorylasen (Nakano et al., 1989; Mori et al., 1991), Pectin-Esterasen (Ebbelaar et al., 1993), das 40-kD-Glycoprotein, Ubiquitin, Asparaginsäure-Proteinase-Inhibitor (Stukerlj et al., 1990), der Carboxypeptidase-Inhibitor, Knollen-Polyphenol-Oxidasen (Shahar et al., 1992; GenBank^® Zugriffsnummern M95196 und M95197), der mutmaßliche Trypsin-Inhibitor und andere Knollen-cDNAs (Stiekema et al., 1988), und für β-Amylase und Sporamine (aus Ipomoea batatas; Yoshida et al., 1992; Ohta et al., 1991).
Außerdem können Promotoren als knollenspezifisch identifiziert werden, indem man eine cDNA-Bibliothek der Kartoffel nach Genen durchsucht, die selektiv oder vorzugsweise in Knollen exprimiert werden, und dann die Promotorbereiche bestimmt, wobei man knollenselektive oder knollenverstärkte Promotoren erhält.
Andere Promotoren können ebenfalls verwendet werden, um ein Sucrose-Phosphorylase-Gen in speziellen Geweben, wie Samen oder Früchten, zu exprimieren. β-Conglycinin (auch als 7S-Protein bekannt) ist eines der Hauptspeicherproteine in der Sojabohne (Glycine max) (Tierney, 1987). Der Promotor für β-Conglycinin oder andere samenspezifische Promotoren, wie der Napin- und der Phaseolin-Promotor, können verwendet werden, um ein SP-Gen spezifisch in Samen zu überexprimieren. Dies würde zu einer Abnahme des Saccharosegehalts der Samen führen, was wiederum zu einer Abnahme von unerwünschten Oligosacchariden und potentiell zu einer Zunahme des Öl- und/oder Proteingehalts führen würde, was bei Samen, die für die Öl- und Proteinproduktion verwendet werden, wie Soja, Canola, Raps, Sonnenblume usw., wünschenswert wäre. Das SP-Gen sorgt schneller für mehr Rohstoff, aber die Regulationsmechanismen der Pflanzen werden seine Verwendung zu den Sink-Geweben leiten, wenn sie nicht von anderen Enzymen, die ausgehend von heterologen Genen produziert werden, beeinflusst werden.
Die Zeine sind eine Gruppe von Speicherproteinen, die man in Mais-Endosperm findet. Genomische Klone für Zein-Gene wurden isoliert (Pedersen, 1982), und die Promotoren aus diesen Klonen, einschließlich des 15-kD-, 16-kD-, 19-kD-, 22-kD-, 27-kD- und gamma-Gens, könnten ebenfalls verwendet werden, um ein SP-Gen in den Samen von Mais und anderen Pflanzen zu exprimieren. Weitere Promotoren, die bekanntermaßen in Mais funktionieren, sind die Promotoren für die folgenden Gene: waxy, Brittle, Shrunken 2, Verzweigungsenzyme I und II, Stärke-Synthasen, Debranching-Enzyme, Oleosine, Gluteline und Sucrose-Synthasen. Ein besonders bevorzugter Promotor für die Expression eines SP-Gens im Endosperm von Mais ist der Promotor für das Glutelin-Gen von Reis, insbesondere der Osgt-1-Promotor (Zheng et al., 1993).
Wenn man die Menge des Öls anstelle von Stärke in Maissamen erhöhen möchte, würde man einen Promotor wählen, der die Expression des SP-Gens während der Ölabscheidung bewirkt. Ein solcher Promotor würde während der Bildung des Pflanzenembryos aktiviert. Beispiele für Promotoren, die während der Embryogenese aktiv sind, sind die Promotoren der Gene für Globulin 1 und die in der späten Embryogenese aktiven (lea) Proteine.
Beispiele für Promotoren, die für die Expression eines SP-Gens in Weizen geeignet sind, sind die Promotoren für die Gene der ADPGlucose-Pyrophosphorylase(ADPGPP)-Untereinheiten, die stärkekorngebundene und andere Stärke-Synthasen, die Verzweigungs- und Debranching-Enzyme, die LEA-Proteine (late embryogenesis abundant proteins), die Gliadine und die Glutenine. Beispiele für solche Promotoren in Reis sind solche für die Gene der ADPGPP-Untereinheiten, die stärkekorngebundene und andere Stärke-Synthasen, die Verzweigungsenzyme, die Debranching-Enzyme, die Sucrose-Synthasen und die Gluteline. Ein besonders bevorzugter Promotor ist der Promotor für Reis-Glutelin, Osgt-1. Beispiele für solche Promotoren für Gerste sind solche für die Gene für ADPGPP-Untereinheiten, die stärkekorngebundene und andere Stärke-Synthasen, die Verzweigungsenzyme, die Debranching-Enzyme, die Sucrose-Synthasen, die Hordeine, die Embryo-Globuline und die aleuronspezifischen Proteine.
Der Feststoffgehalt von Tomatenfrüchten kann erhöht werden, indem man ein SP-Gen hinter einem fruchtspezifischen Promotor exprimiert. Der Promotor aus dem genomischen Klon 2A11 (Pear, 1989) steuert die Expression von ADPGlucose-Pyrophosphorylase in Tomatenfrüchten. Der E8-Promotor (Deikman, 1988) würde auch das SP-Gen in Tomatenfrüchten exprimieren. Außerdem sind Promotoren, die während des Grünfruchtstadiums von Tomaten funktionieren, in der am 27. Juni 1994 eingereichten PCT-Anmeldung PCT/US 94/07072 offenbart. Sie werden als TFM7 und TFM9 bezeichnet. TFM7 ist ein aus Tomaten isoliertes DNA-Fragment von etwa 2,3 kb, von dem 1,4 kb des 3'-Endes in SEQ ID Nr. 3 gezeigt sind. TFM9 ist ein DNA-Fragment von etwa 900 kb, von dem 400 bp des 3'-Endes in SEQ ID Nr. 4 gezeigt sind.
Es ist jetzt auch bekannt, dass Kartoffelknollenpromotoren in Tomatenpflanzen die Funktion haben, die fruchtspezifische Expression eines eingeführten Gens zu bewirken (siehe US-Seriennummer 08/344,639, Barry et al., eingereicht am 4. November 1994). Zu diesen Promotoren gehören Kartoffel-Patatin-Promotoren, Kartoffel-ADPGPP-Promotoren und Kartoffel-Stärkekorn-gebundene Stärke-Synthase-Promotoren. Ein besonders bevorzugter Promotor für die Expression in Tomatenfrüchten ist der Promotor für das Gen, das die kleine Untereinheit von ADPGPP in Kartoffeln codiert.
Der Feststoffgehalt von Wurzelgewebe kann erhöht werden, indem man ein SP-Gen hinter einem wurzelspezifischen Promotor exprimiert. Der Promotor aus dem Saure-Chitinase-Gen (Samac et al., 1990) würde das SP-Gen in Wurzelgewebe exprimieren. Die Expression in Wurzelgewebe könnte auch erreicht werden, indem man die wurzelspezifischen Unterdomänen des CaMV35S-Promotors, die identifiziert wurden (Benfey et al., 1989), verwendet.
Die durch ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung produzierte RNA kann auch eine 5'-untranslatierte Leadersequenz enthalten. Diese Sequenz kann von dem Promotor abgeleitet sein, der ausgewählt wurde, um das Gen zu exprimieren, und er kann spezifisch modifiziert werden, um die Translation der mRNA zu erhöhen. Die 5'-untranslatierten Bereiche können auch aus viralen RNAs, aus geeigneten eukaryontischen Genen oder aus einer synthetischen Gensequenz erhalten werden. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Konstrukte beschränkt, wie sie in den folgenden Beispielen vorgestellt werden, bei denen der untranslatierte Bereich von der 5'-untranslatierten Sequenz, die die Promotorsequenz begleitet, abgeleitet ist. Stattdessen kann die untranslatierte Leadersequenz von einer nicht verwandten Promotor- oder codierenden Sequenz abgeleitet sein, wie es oben diskutiert ist.
Zielsteuerungs-Signalsequenzen
Ein alternatives Verfahren zur Erhöhung der Geschwindigkeit der Saccharose-Hydrolyse würde darin bestehen, das SP zum Apoplasten zu lenken. Dies erfordert ein Signalpeptid am N'-Terminus des funktionellen Proteins. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Sequenz, die eine solche Signalsequenz codiert, ist eine Pflanzen-Signalsequenz für das Endoplasmatische Retikulum aus dem PR-1B-Protein (Ohshima et al., 1990). Das SP wäre also im Apoplasten aktiv und würde eine extrazelluläre Hydrolyse der Saccharose und einen schnelleren Transport von Glucose in die Zelle ermöglichen.
Eine weitere Alternative besteht darin, das SP zum Vakuolenraum zu lenken. Die Zielsteuerung des SP zur Vakuole einer Pflanzenzelle erfordert Informationen zusätzlich zum Signalpeptid (Nakamura und Matsuoka, 1993). Ein Prepro-Signalpeptid könnte mit dem Aminoterminus des FT fusioniert werden, um das Enzym zur Vakuole zu lenken (Sonnewald et al., 1991). Alternativ dazu könnte auch eine carboxyterminale Sequenzverlängerung mit einer ER-Signalsequenz kombiniert werden, um das Enzym zur Vakuole zu lenken.
Sucrose-Phosphorylasen
Der hier verwendete Ausdruck "Sucrose-Phosphorylase" bedeutet ein Enzym, das eine reversible Umwandlung von Saccharose und anorganischem Phosphat in α-D-Glucose-1-phosphat und D-Fructose katalysiert. Es kann aus vielen mikrobiellen Quellen isoliert sein, einschließlich Streptococcus mutans, Clostridium pasteurianum (Vandamme et al., 1987), Pseudomonas saccharophila (Silverstein et al.), Pseudomonas putrefaciens, Pullularia pullulans, Acetobacter xylinum (Vandamme et al., 1987), Agrobacterium sp. (Fournier et al., 1994) und Leuconostoc mesenteroides.
Das Gen für das SP-Enzym kann nach bekannten Verfahren erhalten werden und wurde bereits aus mehreren Organismen, wie Agrobacterium sp. (Fournier et al., 1994) und Leuconostoc mesenteroides (Kitao et al., 1992), erhalten. Das Gen aus S. mutans wurde in E. coli exprimiert (Robeson et al., 1983, wobei die Aktivität als Glucosyl-Transferase identifiziert wurde). Die Isolierung eines Gens aus Streptococcus mutans ist in den folgenden Beispielen beschrieben. Seine Sequenz ist als SEQ ID Nr. 5 angegeben. Dieses Gen kann so, wie es isoliert wurde, verwendet werden, indem man es in Pflanzenexpressionsvektoren einfügt, die für das gewählte Transformationsverfahren gemäß der folgenden Beschreibung geeignet ist.
Ein Gen, das SP codiert (ORF 488), wurde in den Ti-Plasmiden von Agrobacterium vitus (früher A. tumefaciens Biotyp 3) identifiziert. Verwandte Sequenzen wurden in den Ti-Plasmiden von anderen A.-tumefaciens-Stämmen, insbesondere pTiC58 (Fournier et al., 1994), beschrieben. Wahrscheinlich ist in allen solchen Plasmiden ein Gen zu finden, das SP codiert.
Die Reinigung des SP-Enzyms aus anderen Bakterien- und Pilzquellen (oben beschrieben) wurde nachgewiesen. Die Verfügbarkeit solcher Materialien erleichtert die anschließende Klonierung des Gens für dieses Enzym: Das Protein kann als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu produzieren, die verwendet werden können, um Klone in auf Expressionsbasis angelegten Bibliotheken zu identifizieren, wie λgt11 (Sambrook et al.); Peptidsequenzen am N-Terminus solcher Proteine können durch Routine-Proteinsequenzieren erhalten werden; und unter Befolgung von wohletablierten Verfahren der eingeschränkten Proteolyse können auch die Sequenzen von internen Bereichen bestimmt werden. Solche Sequenzen können bei der Gestaltung von Nucleotidsonden oder -primern verwendet werden, die verwendet werden können, um die Gene aus Klonbanken zu identifizieren oder um das Gen oder Teile des Gens ausgehend von RNA-, cDNA- oder DNA-Präparaten aus dem Quellenorganismus zu amplifizieren. Der Nachweis von E.-coli-Klonen, die Sucrose-Phosphorylase enthalten, ist auch durch Züchten auf Minimalmedium mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle möglich (Ferretti et al., 1988).
Andere Mikroorganismen, die SP verwenden, um Saccharose zu hydrolysieren, können gefunden werden, indem man nach Organismen sucht, die Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle verwerten können (Russell et al.). Das Protein kann isoliert werden, indem man die enzymatische Aktivität mit Hilfe von bekannten Verfahren in den Fraktionen verfolgt. Dann kann das Gen, das das Protein codiert, isoliert werden, wie es soeben beschrieben wurde.
So können viele verschiedene Gene, die ein Protein mit Sucrose-Phosphorylase-Aktivität codieren, isoliert und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Polyadenylierungssignal
Der 3'-untranslatierte Bereich des chimärischen Pflanzengens enthält ein Polyadenylierungssignal, das in Pflanzen die Funktion hat, die Addition von polyadenylierten Nucleotiden an das 3'-Ende der RNA zu bewirken. Beispiele für geeignete 3'-Bereiche sind (1) die 3'-transcribierten, untranslatierten Bereiche, die das Polyadenylierungssignal von tumorinduzierenden (Ti) Agrobacterium-Plasmidgenen, wie des Gens von Nopalin-Synthase (NOS), enthalten, und (2) Pflanzengene, wie die Soja-Speicherprotein-Gene und das Gen für die kleine Untereinheit der Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (ssRUBISCO). Ein Beispiel für einen bevorzugten 3'-Bereich ist der 3'-Bereich vom ssRUBISCO-E9-Gen der Erbse, der auch als E9-3'-Bereich bekannt ist.
Konstruktion von synthetischen Genen
Das SP-Gen aus Streptococcus mutans hat einen hohen A + T-Gehalt, was einer Expression auf hohem Niveau in Pflanzenzellen abträglich sein kann, obwohl das Gen, wie unten gezeigt wird, in ausreichenden Mengen exprimiert wird, um den Stärkegehalt positiv zu beeinflussen. Falls gewünscht, kann die Gensequenz des SP-Gens, ohne die Proteinsequenz zu ändern, in einer Weise geändert werden, dass die Expression erhöht wird, und somit kann der Stärkegehalt in transformierten Pflanzen noch stärker positiv beeinflusst werden. Die Regeln zum Durchführen von Veränderungen in der Gensequenz sind in WO 90/10076 (Fischhoff et al.) dargelegt. Ein Gen, das unter Befolgung der dort dargelegten Regeln synthetisiert wird, kann gemäß der folgenden Beschreibung in Pflanzen eingeführt werden und zu höheren Expressionsniveaus für das SP-Enzym führen. Dies kann bei Einkeimblättrigen, wie Mais, Reis, Weizen und Gerste, besonders nützlich sein.
Kombinationen mit anderen Transgenen
Die Wirkung von SP in transgenen Pflanzen kann verstärkt werden, indem man es mit anderen Genen, die den Stärke- und/oder Ölgehalt positiv beeinflussen, kombiniert. Zum Beispiel kann ein Gen, das die Aktivität von ADPGlucose-Pyrophosphorylase (ADPGPP) in Pflanzen erhöht, in Kombination mit einem SP-Gen verwendet werden, um die Stärkemenge zu erhöhen. Solche ADPGPP-Gene umfassen das E.-coli-glgC-Gen und seine Mutante glgC16. WO 91/19806 offenbart, wie man dieses Gen in viele Pflanzenspezies einbaut, um die Stärke- und/oder Feststoffmenge zu erhöhen.
Ein anderes Gen, das mit SP kombiniert werden kann, um die Stärkemenge zu erhöhen, ist ein Gen für Sucrose-Phosphat-Synthase (SPS), das aus Pflanzen erhalten werden kann. WO 92/16631 offenbart ein solches Gen und seine Verwendung in transgenen Pflanzen.
Ein weiteres Gen, das mit SP kombiniert werden kann, um die Ölmenge zu erhöhen, ist ein Gen für Acetyl-CoA-Carboxylase, das aus Pflanzen erhalten werden kann. WO 93/11243 offenbart ein solches Gen.
Transformation/Regeneration von Pflanzen
Zu den Pflanzen, denen durch die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung ein erhöhter Gehalt an Polysaccharid (z.B. Stärke) verliehen werden kann, gehören unter anderem Mais, Weizen, Reis, Tomate, Kartoffel, Süßkartoffel, Erdnuss, Gerste, Baumwolle, Erdbeere, Himbeere und Maniok. Zu den Pflanzen, denen durch die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung ein modifizierter Gehalt an Kohlehydrat verliehen werden kann, gehören unter anderem Mais, Weizen, Reis, Tomate, Kartoffel, Süßkartoffel, Erdnuss, Gerste, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Apfel, Birne, Orange, Weintraube, Baumwolle, Erdbeere, Himbeere und Maniok. Zu den Pflanzen, denen durch die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung eine reduzierte blaufleckige Verfärbung verliehen werden kann, gehören unter anderem Weizen, Kartoffel, Süßkartoffel, Gerste, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Apfel, Birne, Pfirsich, Orange, Weintraube, Banane, Kochbanane und Maniok. Zu den Pflanzen, denen durch die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung ein verbesserter gleichmäßiger Feststoffgehalt verliehen werden kann, gehören unter anderem Kartoffel, Süßkartoffel, Banane, Kochbanane und Maniok. Zu den Pflanzen, denen durch die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung ein erhöhter Ertrag an geerntetem Material verliehen werden kann, gehören unter anderem Mais, Weizen, Reis, Tomate, Kartoffel, Süßkartoffel, Erdnuss, Gerste, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Apfel, Birne, Orange, Pfirsich, Banane, Kochbanane, Baumwolle, Erdbeere, Himbeere und Maniok. Zu den Pflanzen, denen durch die praktische Ausführung der vorliegenden Erfindung eine gesenkte Saccharosemenge, die zu einem erhöhten Öl- oder Proteingehalt führt, verliehen werden kann, gehören unter anderem Soja, Mais, Raps und Sonnenblume.
Ein doppelsträngiges DNA-Molekül der vorliegenden Erfindung, das ein SP-Gen enthält, kann nach irgendeinem geeigneten Verfahren in das Genom einer Pflanze eingefügt werden. Zu den geeigneten Pflanzentransformationsvektoren gehören solche, die von einem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens abgeleitet sind, sowie solche, die zum Beispiel von Herrera-Estrella (1983), Bevan (1984), Klee (1985) und in der EPA-Veröffentlichung 120 516 (Schilperoort et al.) offenbart sind. Außer Pflanzentransformationsvektoren, die von dem Ti- oder wurzelinduzierenden (Ri) Plasmid von Agrobacterium abgeleitet sind, können auch alternative Verfahren verwendet werden, um die DNA-Konstrukte dieser Erfindung in Pflanzenzellen einzufügen. Solche Verfahren können zum Beispiel die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Chemikalien, die die Aufnahme freier DNA erhöhen, Abgabe freier DNA über Mikroprojektil-Beschuss und Transformation unter Verwendung von Viren oder Pollen beinhalten.
Ein Plasmidexpressionsvektor, der für die Einführung eines SP-Gens in Einkeimblättrige unter Verwendung von Mikroprojektil-Beschuss geeignet ist, besteht aus Folgendem: einem Promotor, der für die Expression in den Stärkespeichergeweben in Einkeimblättrigen, im Allgemeinen dem Endosperm, spezifisch oder verstärkt ist, wie Promotoren für die Zein-Gene, die man im Maisendosperm findet (Pedersen et al., 1982); einem Intron, das eine Spleißstelle liefert, um die Expression des Gens zu erleichtern, wie das Hsp70-Intron (PCT-Veröffentlichung WO 93/19189); und eine 3'-Polyadenylierungssequenz, wie die Nopalin-Synthase-3'-Sequenz (NOS 3'; Fraley et al., 1983). Diese Expressionscassette kann auf in hoher Kopienzahl vorliegenden Replicons, die für die Produktion großer DNA-Mengen geeignet sind, zusammengebaut werden.
Ein besonders gut geeigneter Pflanzentransformationsvektor auf Agrobacterium-Basis zur Verwendung bei der Transformation von zweikeimblättrigen Pflanzen ist der Plasmidvektor pMON530 (Rogers, S.G., 1987). Das Plasmid pMON530 ist ein Derivat von pMON505, das durch Übertragen des 2,3-kb-StuI-NindIII-Fragments von pMON316 (Rogers, S.G., 1987) auf pMON526 hergestellt wird. Das Plasmid pMON526 ist ein einfaches Derivat von pMON505, bei dem die SmaI-Stelle durch Verdau mit XmaI, Behandlung mit Klenow-Polymerase und Ligierung entfernt wurde. Das Plasmid pMON530 behält alle Eigenschaften von pMON505 und der CaMV35S-NOS-Expressionscassette bei und enthält jetzt eine einzelne Spaltungsstelle für SmaI zwischen dem Promotor und dem Polyadenylierungssignal.
Der binäre Vektor pMON505 ist ein Derivat von pMON200 (Rogers, S.G., 1987), in dem der Ti-Plasmid-Homologiebereich LIH durch ein 3,8-kb-HindIII-SmaI-Segment des Mini-RK2-Plasmids pTJS75 ersetzt ist (Schmidhauser & Helinski, 1985). Dieses Segment enthält den RK2-Replikationsstartpunkt oriV und den Übertragungsstartpunkt oriT für die Konjugation in Agrobacterium unter Verwendung des triparentalen Paarungsverfahrens (Horsch & Klee, 1986). Das Plasmid pMON505 behält alle wichtigen Merkmale von pMON200 bei, einschließlich des synthetischen Multilinkers für die Einfügung von gewünschten DNA-Fragmenten, des chimärischen NOS/NPTII'/NOS-Gens für Kanamycin-Resistenz in Pflanzenzellen, der Spectinomycin/Streptomycin-Resistenz-Determinante für die Selektion in E. coli und A. tumefaciens, eines intakten Nopalin-Synthase- Gens für die leichte Bewertung von Transformanten und der Vererbung bei den Nachkommen und eines pBR322-Replikationsstartpunkts für die leichte Herstellung großer Mengen des Vektors in E. coli. Das Plasmid pMON505 enthält einen einzelnen T-DNA-Border, der vom rechten Ende der pTiT37-Nopalin-Typ-T-DNA abgeleitet ist. Southern-Analysen haben gezeigt, dass das Plasmid pMON505 und jede DNA, die es trägt, in das Pflanzengenom integriert sind, d.h. das gesamte Plasmid ist die T-DNA, die in das Pflanzengenom eingefügt wird. Ein Ende der integrierten DNA befindet sich zwischen der rechten Bordersequenz und dem Nopalin-Synthase-Gen, und das andere Ende befindet sich zwischen der Bordersequenz und den pBR322-Sequenzen.
Ein weiterer besonders gut geeigneter Ti-Plasmid-Cassettenvektor ist pMON17227. Dieser Vektor wird von Barry et al. in WO 92/04449 (entspricht der US-Seriennummer 07/749,611) beschrieben und enthält ein Gen, das ein Enzym codiert, welches Glyphosatresistenz verleiht (als CP4 bezeichnet) und das ein ausgezeichnetes Selektionsmarkergen für viele Pflanzen einschließlich Kartoffel und Tomate ist. Das Gen ist mit dem Arabidopsis-EPSPS-Chloroplastentransitpeptid (CTP2) fusioniert und wird ausgehend vom FMV-Promotor exprimiert, wie es dort beschrieben ist.
Wenn eine ausreichende Zahl von Zellen (oder Protoplasten), die das SP-Gen oder die SP-cDNA enthalten, erhalten werden, werden die Zellen (oder Protoplasten) in ganze Pflanzen regeneriert. Die Wahl der Methode für den Regenerationsschritt ist nicht entscheidend, wobei geeignete Vorschriften verfügbar sind für Wirte wie Leguminosen (Luzerne, Soja, Klee usw.), Doldenblütler (Möhre, Sellerie, Petersilie), Kreuzblütler (Kohl, Rettich, Canola/Raps usw.), Kürbisgewächse (Melonen und Gurke), Gräser (Weizen, Gerste, Reis, Mais usw.), Nachschattengewächse (Kartoffel, Tabak, Tomate, Pfeffer), verschiedene Zuchtblumen, wie Sonnenblume, und nusstragende Bäume, wie Mandeln, Cashews, Walnüsse und Pekannüsse. Siehe z.B. Ammirato, 1984; Shimamoto, 1989; Fromm, 1990; Vasil, 1990; Vasil, 1992; Hayashimoto, 1989; Shimamoto, 1989; und Datta, 1990.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung besser zu erläutern und sollten in keiner Weise als den Umfang der vorliegenden Erfindung einschränkend angesehen werden. Der Fachmann wird erkennen, dass verschiedene Modifikationen, Verkürzungen usw. bei den hier beschriebenen Verfahren und Genen vorgenommen werden können, ohne vom Wesen und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.
Beispiele
Beispiel 1
Alle grundlegenden DNA-Manipulationen, wie PCR, Agarose-Elektrophorese, Restriktionsverdaus, Ligierungen und E.-coli-Transformationen wurden nach Standardvorschriften durchgeführt, wie sie bei Sambrook et al. beschrieben sind.
Ein Sucrose-Phosphorylase-Gen, gtfA, wurde durch PCR-Amplifikation aus Streptococcus-mutans-Zellen erzeugt. Das Gen wurde unter Verwendung des 5'-Oligonucleotids 5'CCCGGATCCATGGCAATTACAAATAAAAC (SEQ ID Nr. 1) und des 3'-Oligonucleotids 5'GGGGAGCTCACTCGAAGCTTATTGTTTGATCATTTTCTG (SEQ ID Nr. 2) amplifiziert.
Die PCR-Programmbedingungen waren wie folgt: 94°C, 3 min; 55°C, 2 min; 72°C, 2 min (5 Zyklen); 94°C, 1 min; 55°C, 2 min; 72°C, 2 min (30 Zyklen). Das 1462-bp-PCR-Produkt wurde unter Verwendung des GeneClean-Reinigungssystems (Bio101, Vista, Kalifornien) gereinigt, mit BamHI und SacI verdaut und in die BamHI- und SacI-Stellen von pUC119 ligiert. Mit der ligierten DNA wurde JM101 transformiert, und ein Blue-White-Screen wurde verwendet, um Kolonien für die Plasmidpräparation und den Restriktionsverdau zu identifizieren. Ein Verdau mit HindIII wurde verwendet, um nach Transformanten zu suchen, die das gtfA-Gen enthalten. Klone mit korrekten Restriktionsmustern wurden anhand ihrer Fähigkeit, Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle zu verwerten, wie folgt auf phänotypische Expression durchmustert: Ein gal-negativer E.-coli-Stamm SK1592 wurde mit den Klonen transformiert und auf Minimalmedium, das Raffinose enthält (die aufgenommen und zu Galactose und Saccharose hydrolysiert wird), gezüchtet, und ein aktiver Klon wurde identifiziert und pMON17353 genannt.
Eine Expressionscassette wurde aufgebaut, um die konstitutive Expression von gtfA in Pflanzen zu ermöglichen. Ein Fragment, das den verstärkten 35S-Promotor (Kay, R., 1987), den Nopalin-Synthase-3'-Bereich (Bevan, M., 1984) und das Gerüst des pUC-Vektors enthält, wurde aus pMON999 (Rogers et al., 1987a) durch Restriktionsverdau mit BglII und SacI hergestellt. Ein Fragment, das den gtfA-codierenden Bereich enthält, wurde durch Restriktionsverdau mit BamHI und SacI aus pMON17353 hergestellt. Die korrekten Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt und durch das GeneClean-Verfahren gereinigt. Die Fragmente wurden ligiert, E. coli JM101 wurde damit transformiert, und mutmaßliche rekombinante Plasmide wurden durch Restriktionsverdau mit NotI durchmustert. Ein Klon wurde identifiziert und pMON17359 genannt.
Eine zweite Expressionscassette wurde aufgebaut, um die Expression von gtfA zur Kartoffelknolle zu lenken. Ein Fragment, das den Patatin-1.0-Promotor (oben beschrieben), den Nopalin-Synthase-3'-Bereich und das Gerüst des pUC-Vektors enthält, wurde aus einem Zwischenvektor durch Restriktionsverdau mit BamHI und SacI hergestellt. Außerdem wurde eine Expressionscassette aufgebaut, um die Expression von gtfA zur Tomatenfrucht zu lenken. Ein Fragment, das den TFM7-Promotor, den Nopalin-Synthase-3'-Bereich und das Gerüst des pUC-Vektors enthält, wurde aus pMON16987 (PCT-Anmeldung PCT/US 94/07072, eingereicht am 27. Juni 1994), das von pMON999 abgeleitet ist, aber den TFM7-Promotor enthält, durch Restriktionsverdau mit BglII und SacI hergestellt. Die korrekten Fragmente wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese getrennt und durch das GeneClean-Verfahren gereinigt. Diese Fragmente wurden jeweils mit dem BamHI- und SacI-Fragment von pMON17353 ligiert. Die Transformation und die Suche nach Klonen erfolgten gemäß der obigen Beschreibung. Klone wurden als korrekt bezeichnet und pMON17356 (Pat1.0/gtfA/NOS) bzw. pMON17389 (TFM7/gtfA/NOS) genannt.
Eine dritte Expressionscassette wurde aufgebaut, um die Expression von gtfA zur Kartoffelknolle zu lenken, wobei man einen 3,5-kb-Promotor von Patatin verwendete. Der Patatin-3,5-Promotor wurde aus dem Plasmid pBI240.7 (Bevan et al., 1986) erhalten. Der größte Teil des 3,5-Promotors wurde von der HindIII-Stelle aus (bei ca. –3500) bis zur XbaI-Stelle bei –337 herausgeschnitten und mit dem Rest des Promotors von der XbaI-Stelle bis zu einer BglII-Stelle bei +22 (zuvor eine DraI-Stelle) kombiniert, und zwar in einer dreifachen Ligierung in einen Vektor, der eine BglII-Stelle lieferte, wobei pMON17280 entstand. Ein Zwischenvektor wurde durch Verdau von pMON17353 mit BamHI/SacI und Einfügen des Fragments in pBS hergestellt. Dann wurde dieser Vektor mit EcoRI und SacI verdaut. pMON17280 wurde mit EcoRI und SacI verdaut, was zu einem Fragment führte, das den Patatin-3,5-Promotor, den Nopalin-Synthase-3'-Bereich und das Gerüst des pUC-Vektors enthält. Die Fragmente mit der korrekten Größe wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese und das GeneClean-Verfahren erhalten. Die Fragmente wurden ligiert, E. coli JM101 wurde damit transformiert und durch Restriktionsverdau mit HindIII durchmustert. Ein Klon wurde als korrekt bezeichnet und pMON17495 genannt.
In pMON17356, pMON17359, pMON17389 und pMON17495 können der Promotor, das gtfA-Gen und der Nos-3'-Bereich auf einem NotI-Restriktionsfragment isoliert werden. Diese Fragmente können dann in eine einzelne NotI-Stelle entweder des Vektors pMON17227 (oben beschrieben) oder pMON17320 eingefügt werden, um glyphosatselektierbare Pflanzentransformationsvektoren aufzubauen. pMON17320 ist ein pMON17227-Derivat, das auch eine Patatin-1.0/CTP1-glgC16-Cassette enthält. Die CTP1-glgC16-Fusion codiert eine modifizierte ADPGlucose-Pyrophosphorylase, wie sie von Kishore in WO 91/19806 beschrieben wird. Außerdem wurde ein Vektor für die Expression von GtfA in Tomaten aufgebaut, indem man das gtfA-Gen und den 3'-Bereich aus pMON17356 in einem Pflanzentransformationsvektor mit dem ca. 2,0 kb großen Promotor des Gens für die kleine Untereinheit der Kartoffel-ADPGlucose-Pyrophosphorylase (siehe US-Seriennummer 08/344,639, Barry et al., eingereicht am 4. November 1994, worauf hier ausdrücklich Bezug genommen wird) kombinierte, wobei pMON17486 entstand.
Die Vektor-DNA wird durch Verdau mit NotI und anschließende Behandlung mit Kälberdarm-Alkalischer-Phosphatase (CIAP) hergestellt. Die gtfA-haltigen Fragmente werden durch Verdau mit NotI, Agarose-Gel-Elektrophorese und Reinigung mit GeneClean hergestellt. Vektor und Insert-DNA werden ligiert, der E.-coli-Stamm LE392 wird damit transformiert, und die Transformanten wurden durch Restriktionsverdau durchmustert, um Klone zu identifizieren, die die gtfA-Expressionscassetten enthalten. Klone, in denen die von der gtfA-Cassette ausgehende Transcription in derselben Richtung erfolgt wie die vom Selektionsmarker ausgehende Transcription, wurden als korrekt bezeichnet und pMON17357 (FMV/CP4/E9, Pat1.0/gtfA/NOS), pMON17358 (Pat1.0/CTP1-glgC16/E9, Pat1.0/gtfA/NOS, FMV/CP4/E9), pMON17360 (FMV/CP4/E9, E35S/gtfA/NOS), pMON17390 (FMV/CP4/E9, TFM7/gtfA/NOS), pMON17392 (Pat1.0/CTP1-glgC16/E9, TFM7/gtfA/NOS, FMV/CP4/E9) bzw. pMON17496 (FMV/CP4/E9, Pat3.5/gtfA/NOS) genannt.
Ein Transformationsvektor wurde aufgebaut, um die Expression von gtfA in Maissamen zu lenken. Ein Fragment, das den Glutelin-Promotor Osgt-1, das Hsp70-Intron (oben beschrieben), den Nopalin-Synthase-3'-Bereich, ein Kanamycin-Resistenz-Gen und das pUC-Gerüst enthält, wurde durch Restriktionsverdau, Agarose-Gel-Elektrophorese und GeneClean hergestellt. Ein Fragment, das den gtfA-codierenden Bereich enthält, wurde aus pMON17359 durch Restriktionsverdau mit NcoI und NotI hergestellt. Die Fragmente wurden ligiert, transformiert und durch Restriktionsverdau durchmustert. Ein korrekter Klon wurde identifiziert und pMON24502 genannt (Osgt1/Hsp70/gtfA/NOS).
Ein Transformationsvektor wurde aufgebaut, um die Expression von gtfA in Samen von Ölpflanzen zu lenken. Ein BamHI-EcoRI-Fragment von pMON17353 wurde in die BglII-EcoRI-Stellen eines Zwischenvektors ligiert, was pMON26104 ergab, wodurch das gtfA-Gen hinter den 7s-Promotor (oben diskutiert) zu liegen kam und die E9-3'-Terminatorsequenz verwendet wurde. Ein NotI-Fragment, das den FMV-Promotor, die Fusion des CTP2- und des Glyphosat-Resistenz-Gens und eine Nos-3'-Sequenz enthielt, wurde in die NotI-Stelle von pMON26104 ligiert, was pMON26106 ergab, einen Doppel-Border-Pflanzentransformationsvektor, bei dem beide Cassetten in derselben Orientierung lagen.
Beispiel 2
Mit dem Vektor pMON17357 wurde Russet-Burbank-Kartoffelkallus transformiert, wobei das von Barry et al. in WO 94/28149 beschriebene Verfahren für die Glyphosat-Selektion von transformierten Linien befolgt wurde. Mehrere Linien wurden erhalten und in Feldtests bewertet. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 gezeigt. Wie man dort sieht, wurden mehrere Linien identifiziert, die höhere Stärkemengen (als Gesamtfeststoffe gemessen) enthielten, und einige davon wiesen eine reduzierte Blaufleckigkeit auf.
Tabelle 1
Knollen von zwölf Linien wurden auf jede Änderung in der Verteilung von Stärke zwischen dem Mark und der Rinde getestet. Dies wurde dadurch erreicht, dass man die Knollen schälte, sie in Streifen schnitt, die Pommes frites ähnelten, und den Feststoffgehalt unter Verwendung eines Salzwasser-Schwimm-Vergleichstests maß. Der mittlere Feststoffgehalt für Streifen aus dem Mark wurde von dem mittleren Feststoffgehalt für Streifen aus der Rinde subtrahiert. Somit ist eine Differenz im Feststoffgehalt, die kleiner ist als bei der Kontrolle (4,61% in diesem Test), ein Hinweis auf eine gleichmäßigere Verteilung von Stärke in der Knolle, was in hohem Maße erwünscht ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Wie man erkennt, wurde die Differenz im Feststoffgehalt zwischen der Rinde und dem Mark bei zehn von zwölf Linien reduziert.
Tabelle 2
Fünf dieser Linien wurden im nächsten Jahr im Feld getestet, vier davon an mehrfachen Orten. (Linie Nr. 8 wurde nur an einem Ort getestet.) Die absolute Zunahme des Feststoffgehalts in diesen fünf Linien, die eine Erhöhung des Stärkegehalts anzeigt, wurde erneut bei jeder Linie nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Beispiel 3
Die Expression von gtfA in Mais führt eine neue katalytische Aktivität ein, die den Saccharoseimport in das Endosperm erleichtern kann, indem sie einen steileren Konzentrationsgradienten schafft und Energie konserviert, da normalerweise das Äquivalent von 1 mol ATP benötigt wird, um Saccharose in eine Hexose plus ein Hexosephosphat umzuwandeln. Der Vektor pMON24502 wurde durch Mikroprojektilbeschuss in Maiszellen eingeführt, wobei zwei verschiedene Typen von embryogenem Kallusgewebe für die Transformation verwendet wurden. Er wurde cotransformiert mit entweder (1) pMON19476, der eine Selektionscassette des verstärkten 35S-Promotors, das Hsp70-Intron, die NPTII-codierende Sequenz für Kanamycin-Resistenz und die nos-3'-Sequenz enthält, oder (2) pMON19336, der zwei Selektionscassetten für Glyphosat-Resistenz enthält, die jeweils den Reis-Actin-Promotor und das Hsp70-Intron verwenden, wobei eine jedoch ein Gen verwendet, das Glyphosat-Oxidase codiert, und die andere das CP4-Glyphosat-Resistenz-Gen verwendet.

(1) Unreife Maisembryonen (H99-Genotyp) wurden so isoliert, wie es in EP 586 355 A2 beschrieben ist. Embryogener Kallus wurde erhalten, indem man die unreifen Embryonen etwa zwei Wochen lang auf dem Medium kultivierte, das von Duncan et al. (1985) beschrieben wurde und Medium D genannt wird. Nach 2 Wochen wird Kallus (Typ I) erhalten und aufrechterhalten, indem man ihn alle 2–3 Wochen auf frischem Medium D subkultiviert. Ungefähr vier Stunden vor dem Beschuss wird aktiv wachsender Kallus (Mitte des Subkulturzyklus) auf Medium D gegeben, dem Mannit und Sorbit für die osmotische Vorbehandlung zugesetzt wurden. Ungefähr 16–24 Stunden nach dem Beschuss mit Teilchen, die mit pMON24502 und pMON19476 beschichtet sind, wird das Gewebe auf Medium D ohne Mannit oder Sorbit gegeben. Ungefähr zwei Tage später wird das Gewebe auf Medium D, das Paromomycin enthält, übertragen. Resistentes Gewebe wird in Abständen von ungefähr drei Wochen auf frisches Medium D mit Paromomycin übertragen. Die Pflanzenregeneration wird auf Medium D mit 6-Benzylaminopurin (ohne Dicamba) während eines 3–6 Tage dauernden "Impulses" und anschließende Übertragung auf MS-Medium ohne Hormone erreicht.
(2) Typ-II-Kallus, der von unreifen Embryonen des "Hi-II"-Genotyps abgeleitet ist, wird verwendet, wobei man das Verfahren von Dennehy et al., 1994, befolgt. Typ-II-Kallus wurde vier Stunden vor dem Beschuss mit pMON24502 und pMON19336 auf N6-1-100-25-Medium, das 0,4 M Mannit + Sorbit (jeweils 0,2 M) enthielt, vorbehandelt und 16 bis 24 Stunden nach dem Beschuss auf demselben Medium gelassen. Dann wurde das Gewebe auf N6-1-100-25-Medium ohne zugesetztes Mannit oder Sorbit übertragen. Eine Selektion wurde unter Verwendung von 1–3 mM Glyphosat in N6-1-0-25-Medium (das keine Casaminosäuren enthielt) erreicht.

Nach jedem Verfahren wurden fruchtbare Maispflanzen erhalten, und ihre Samen wurden getestet. Die Expression des gtfA-Gens wurde durch Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines gegen E.-coli-exprimiertes gtfA erzeugten Ziegenantikörpers bestätigt. Es zeigte sich, dass 9 von den 16 Linien, die auf Expression durchmustert wurden, gtfA in einem Anteil von ungefähr 0,05 bis 0,5% des gesamten zellulären Proteins exprimieren. Die Geschwindigkeit der Stärkebiosynthese in Maisendospermgewebe, das GtfA (Sucrose-Phosphorylase) exprimiert, wurde in vitro unter Verwendung eines schon früher beschriebenen (Felker et al., 1990) Zucker-Feeding-Assays in vitro gemessen. Auf dem Feld gewachsene Pflanzen wurden mit PCR durchmustert, um die positiven und negativen Segreganten zu identifizieren. Positive und Kontrollähren von zwei GtfA-transformierten Linien (Knowl und De) wurden 20 bis 22 Tage nach der Bestäubung zum Zeitpunkt der linearen Kornfüllung geerntet. Endospermschnitte wurden gewonnen und mit ¹⁴C-Saccharose in Konzentrationen von 50 bzw. 200 mM versorgt. Die 200-mM-Konzentration ist die physiologisch relevanteste, aber aufgrund des niedrigeren Km von GtfA für Saccharose als bei den endogenen Enzymen wurde die niedrigere Konzentration (50 mM) verwendet, um die Wahrscheinlichkeit der Messung einer von GtfA ausgehenden Wirkung zu verbessern. Zeitpunkte wurden eine bzw. zwei Stunden nach der Versorgung mit ¹⁴C genommen, und die in die Stärkefraktion eingebaute Radioaktivität wurde bestimmt. Die mit den beiden Linien erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst (Daten als mittlere Zahl der Zählereignisse vom Einbau in die Stärkefraktion angegeben):
Tabelle 4A: Versorgung mit 50 mM Saccharose
Tabelle 4B: Versorgung mit 200 mM Saccharose
Die Ergebnisse beweisen, dass Maisendospermgewebe, die GtfA exprimieren, Stärke mit größerer Geschwindigkeit (doppelt so schnell) produzieren können als Kontrollen. Die Unterschiede in der Stärkeproduktionsgeschwindigkeit sind bei den niedrigeren Substratkonzentrationen deutlicher, möglicherweise aufgrund der Unterschiede in der Substratkinetik zwischen GtfA und der endogenen Sucrose-Synthase. Unterschiede wurden auch festgestellt, wenn man die Wirkungen bei den Linien De und Knowl miteinander verglich, wobei Knowl eine stärker positive Wirkung aufwies. Die GtfA-Expression ist in Knowl sehr hoch, im Bereich von 0,5% des Gesamtproteins, während die GtfA-Expression in De im Bereich von 0,05% liegt. Die Unterschiede in den Stärkebiosynthesegeschwindigkeiten sind wahrscheinlich eine Funktion der GtfA-Expressionsniveaus.
Beispiel 4
Der Vektor pMON26106 wurde durch Agrobacterium-Transformation (Hinchee et al.) in Canola- und Sojakallus eingeführt. Nach der Selektion von transformierten Zellen unter Verwendung von Glyphosat und Regeneration zu ganzen Pflanzen werden die von diesen Pflanzen angesetzten Samen analysiert.
Beispiel 5
Der Vektor pMON24502 wurde durch Mikroprojektil-Beschuss in Weizenzellen eingeführt. Unreife Weizenembryonen wurden so isoliert, wie es von Vasil et al. (1993) beschrieben wurde. Embryogener Kallus wurde erhalten, indem man die unreifen Embryonen 4 bis 7 Tage lang auf einem modifizierten MS-Medium kultivierte, das etwa 40 g/l Maltose und etwa 2 mg/l 2,4-D umfasste. Der Kallus wurde einem Beschuss mit Mikroprojektilen ausgesetzt, die mit pMON24502 und einem Plasmid, das ein Bialaphos-Resistenz-Gen enthielt, beschichtet waren. Ein Tag nach dem Beschuss wurden die unreifen Embryonen auf ein Wachstumsmedium übertragen, das das Selektionsmittel Bialaphos enthielt. Nach sieben Tagen auf dem Wachstums- und Selektionsmedium wurde der von unreifen Embryonen abgeleitete Kallus entfernt und auf ein triebproduzierendes Medium (modifiziertes MS-Medium ohne 2,4-D), das Bialaphos enthielt, übertragen und 28–40 Tage lang wachsen gelassen. Ein PCR-Assay wird durchgeführt, um zu bestätigen, dass das gtfA-Gen in den Trieben vorhanden ist. Triebe, die das gtfA-Gen enthalten, werden wurzeln gelassen und in Erde gepflanzt. Wenn transformierte Pflanzen gewonnen und bis zur Reife wachsen gelassen werden, weisen ihre Samen erhöhte Stärkemengen auf.
Beispiel 6
Der Vektor pMON24502 kann durch Mikroprojektilbeschuss in Reiszellen eingeführt werden. Nach der Regeneration und Selektion werden transformierte Pflanzen auf Expression des gtfA-Gens getestet, und diejenigen Pflanzen, die eine hohe Expression aufweisen, werden bis zur Reife wachsen gelassen. Die Samen der reifen Pflanzen weisen erhöhte Stärkemengen auf.
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Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Einsetzen eines rekombinanten doppelsträngigen DNA-Moleküls in das Genom einer Pflanzenzelle, wobei das DNA-Molekül Folgendes umfasst: (i) einen Promotor, der in Zellen des Zielpflanzengewebes funktioniert; (ii) eine Struktur-DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert; (iii) eine 3'-untranslatierte DNA-Sequenz, die in Pflanzenzellen die Funktion hat, den Abbruch der Transcription und die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken; (b) Gewinnen von transformierten Pflanzenzellen; und (c) Regenerieren einer genetisch transformierten Pflanze, deren Genom das rekombinante doppelsträngige DNA-Molekül von Schritt (a) aufweist, aus den transformierten Pflanzenzellen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die DNA-Sequenz, die das Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert, aus Streptococcus mutans erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die DNA-Sequenz, die das Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert, die in SEQ ID Nr. 5 gezeigte Sequenz hat.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die genetisch transformierte Pflanze eine Eigenschaft aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem modifizierten Kohlenhydratgehalt, einem erhöhten Polysaccharidgehalt, vorzugsweise einem erhöhten Stärkegehalt, einer erhöhten Ernte, einer verbesserten Gleichmäßigkeit der Verteilung von Feststoffen und einer reduzierten Anfälligkeit für Druckverfärbungen besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Eigenschaft ein modifizierter Kohlenhydratgehalt ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei der modifizierte Kohlenhydratgehalt eine Erhöhung des Feststoffgehalts bedeutet.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die genetisch transformierte Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kartoffel und Tomate besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Eigenschaft eine verbesserte Gleichmäßigkeit der Verteilung von Feststoffen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die genetisch transformierte Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kartoffel und Süßkartoffel besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Eigenschaft eine reduzierte Anfälligkeit für Druckverfärbungen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die genetisch transformierte Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Kartoffel, Banane, Apfel, Weizen, Weintrauben und Pfirsich besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Eigenschaft ein erhöhter Polysaccharidgehalt, vorzugsweise ein erhöhter Stärkegehalt, ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei die genetisch transformierte Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen, Reis, Tomate, Kartoffel, Süßkartoffel, Erdnuss, Gerste, Baumwolle, Erdbeere, Himbeere und Maniok besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Eigenschaft eine erhöhte Ernte ist.
Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die genetisch transformierte Pflanze aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Mais, Weizen, Reis, Tomate, Kartoffel, Süßkartoffel, Erdnuss, Gerste, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Apfel, Birne, Orange, Pfirsich, Weintraube, Baumwolle, Erdbeere, Himbeere und Maniok besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Pflanzenzelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Kartoffelpflanzenzelle, einer Maispflanzenzelle, einer Reispflanzenzelle, einer Weizenpflanzenzelle, einer Tomatenpflanzenzelle, einer Gerstenpflanzenzelle, einer Zuckerrübenpflanzenzelle, einer Süßkartoffelpflanzenzelle, einer Erdnusspflanzenzelle, einer Zuckerrohrpflanzenzelle, einer Weintraubenpflanzenzelle, einer Birnenpflanzenzelle, einer Apfelpflanzenzelle, einer Orangenpflanzenzelle, einer Maniokpflanzenzelle, einer Bananenpflanzenzelle, einer Kochbananenpflanzenzelle, einer Baumwollpflanzenzelle, einer Erdbeerpflanzenzelle, einer Himbeerpflanzenzelle und einer Pfirsichpflanzenzelle besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Pflanzenzelle eine Kartoffelpflanzenzelle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Pflanzenzelle eine Maispflanzenzelle ist.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Pflanzenzelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Weizenpflanzenzelle, einer Gerstenpflanzenzelle, einer Reispflanzenzelle und einer Tomatenpflanzenzelle besteht.
Rekombinantes doppelsträngiges DNA-Molekül, das nacheinander Folgendes umfasst: (a) einen Promotor, der in Zellen des Zielpflanzengewebes funktioniert; (b) eine Struktur-DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert; und (c) einen 3'-untranslatierten Bereich, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, den Abbruch der Transcription und die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken; wobei eine genetisch transformierte Pflanze, die das DNA-Molekül in ihrem Genom enthält, eine Eigenschaft aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem modifizierten Kohlenhydratgehalt, einem erhöhten Polysaccharidgehalt, einer erhöhten Ernte, einer verbesserten Gleichmäßigkeit der Verteilung von Feststoffen und einer reduzierten Anfälligkeit für Druckverfärbungen besteht.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 20, wobei die DNA-Sequenz, die das Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert, aus Streptococcus mutans erhalten wird.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 21, wobei die DNA-Sequenz, die das Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert, die in SEQ ID Nr. 5 gezeigte Sequenz hat.
DNA-Molekül gemäß Anspruch 20, wobei der Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Zein-Promotor, einem Patatin-Promotor, einem Reis-Glutelin-Promotor, dem 7s-Promotor der Sojabohne, einem Promotor einer Untereinheit von ADP-Glucose-Phosphorylase, dem TFM7-Promotor und dem TFM9-Promotor besteht.
Transformierte Pflanzenzelle, die ein rekombinantes doppelsträngiges DNA-Molekül umfasst, das nacheinander Folgendes umfasst: (a) einen Promotor, der in der Pflanzenzelle funktioniert; (b) eine Struktur-DNA-Sequenz, die die Produktion einer RNA-Sequenz bewirkt, die ein Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert; und (c) einen 3'-untranslatierten Bereich, der in Pflanzenzellen die Funktion hat, den Abbruch der Transcription und die Addition von Polyadenylnucleotiden an das 3'-Ende der RNA-Sequenz zu bewirken.
Pflanzenzelle gemäß Anspruch 24, wobei die DNA-Sequenz, die das Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert, aus Streptococcus mutans erhalten wird.
Pflanzenzelle gemäß Anspruch 25, wobei die DNA-Sequenz, die das Sucrose-Phosphorylase-Enzym codiert, die in SEQ ID Nr. 5 gezeigte Sequenz hat.
Pflanzenzelle gemäß Anspruch 24, wobei der Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Zein-Promotor, einem Patatin-Promotor, einem Reis-Glutelin-Promotor, dem 7s-Promotor der Sojabohne, einem Promotor einer Untereinheit von ADP-Glucose-Pyrophosphorylase, dem TFM7-Promotor und dem TFM9-Promotor besteht.
Pflanzenzelle gemäß Anspruch 24, wobei die Pflanzenzelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Kartoffelpflanzenzelle, einer Maispflanzenzelle, einer Reispflanzenzelle, einer Weizenpflanzenzelle, einer Tomatenpflanzenzelle, einer Gerstenpflanzenzelle, einer Zuckerrübenpflanzenzelle, einer Süßkartoffelpflanzenzelle, einer Erdnusspflanzenzelle, einer Zucker rohrpflanzenzelle, einer Weintraubenpflanzenzelle, einer Birnenpflanzenzelle, einer Apfelpflanzenzelle, einer Orangenpflanzenzelle, einer Maniokpflanzenzelle, einer Bananenpflanzenzelle, einer Kochbananenpflanzenzelle und einer Pfirsichpflanzenzelle besteht.