DE19619917A1 - Kartoffelpflanzen mit einer verringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase und einem veränderten Keimungsverhalten - Google Patents
Kartoffelpflanzen mit einer verringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase und einem veränderten KeimungsverhaltenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Kartoffelpflan
zen, die Zellen mit einer im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen
verringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase
enthalten. Die Knollen derartiger Kartoffelpflanzen zeigen
im Vergleich zu Knollen von Wildtyp-Pflanzen ein verändertes
Keimungsverhalten, das zur Bildung einer erhöhten Anzahl von
Sproßenden und folglich zu einer erhöhten Anzahl von Stolo
nen und Knollen führt.
Der Ertrag beim landwirtschaftlichen Anbau von Kartoffeln
wird in erster Linie bestimmt durch die Anzahl der Sproß
enden, die pro angelegter Knolle gebildet werden. Normaler
weise bildet eine auskeimende Kartoffelknolle lediglich ein,
zeitweise 2 bis 3, Sproßenden, wobei aufgrund der Apikaldo
minanz dieser Sproßenden das Wachstum weiterer potentiell
vorhandener Seitensprosse unterdrückt wird. Ausgehend von
den Sproßenden werden während des weiteren Wachstums der
Kartoffelpflanzen Stolone gebildet, an denen später die
Knollen gebildet werden. Da der Ernteertrag mit der Anzahl
der durch die entwickelten Sproße gebildeten Stolone korre
liert, besteht ein Bestreben, die Keimung von Kartoffel
pflanzen derart zu manipulieren, daß eine möglichst große
Anzahl von "Augen" auskeimen und sich zu Sproßenden ent
wickeln. Eine Methode besteht darin, den zuerst gebildeten
Sproß einer Knolle, der aufgrund seiner Apikaldominanz das
Wachstum weiterer Sproßenden unterdrückt, abzubrechen. Dies
führt zum Wachstum weiterer Sproßenden. Eine weitere Methode
besteht in dem Vorkeimen der zum Auslegen bestimmten Kartof
feln unter regulierten Bedingungen in speziellen Behältern
(siehe z. B. Bouman, Kartoffelbau 47 (1996), 18-21; van de
Waart, Kartoffelbau 44 (1993), 18-20). Derartige Methoden
sind jedoch sehr kostenintensiv, da sie neben den speziellen
Behältern auch Lagerräume erfordern, in den sowohl die
Licht- als auch die Temperaturbedingungen reguliert werden
können. Es besteht somit ein Bedarf an Kartoffelpflanzen
bzw. Verfahren, bei denen sich die obenbeschriebenen ar
beits- bzw. kostenintensiven Schritte erübrigen und die zu
einer erhöhten Sproßanzahl und somit erhöhtem Knollenertrag
führen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
Kartoffelpflanzen zur Verfügung zu stellen, deren Knollen
bei Keimung eine hohe Anzahl von Sproßenden bilden.
Diese Aufgabe wird durch die in den Patentansprüchen be
zeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die Erfindung transgene Kartoffelpflanzen,
die Zellen mit einer im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen um
mindestens 60% verringerten Aktivität der cytosolischen
Stärkephosphorylase enthalten. In einer bevorzugten Ausfüh
rungsform ist die Aktivität der cytosolischen Stärkephospho
rylase um mindestens 80% und besonders bevorzugt um min
destens 95% verringert im Vergleich zu Wildtyp-Kartoffel
pflanzen.
Unter dem Begriff "cytosolische Stärkephosphorylase" wird
die im Cytoplasma von Pflanzenzellen lokalisierte Isoform
der Stärkephosphorylase (EC 2.4.1.1) verstanden, die auch
als Isoform H oder I bekannt ist. Von der zweiten, der pla
stidären Isoform unterscheidet sich diese dadurch, daß sie
beispielsweise eine wesentlich höhere Affinität für hochver
zweigte Glucane zeigt (Shimomura et al., J. Biochem. (Tokyo)
91 (1982), 703-717; Yang und Steup, Plant Physiol. 94, 960-969)
und eine geringe Affinität zu Oligoglucanen. Das Enzym
katalysiert die reversible Phosphorolyse von α-1,4-Glucanen.
Die Aktivität der Stärkephosphorylase läßt sich beispiels
weise bestimmen wie beschrieben in Parvin und Smith (Anal.
Biochem. 27 (1969), 65-72), Conrads et al. (Biochim.
Biophys. Acta 882 (1986), 452-463), Steup und Latzko (Planta
145 (1979), 69-75), Steup (In. Methods in Plant
Biochemistry 3; Academic Press Limited (1990), 103-128) oder
Sonnewald et al. (Plant Mol. Biol. 27 (1995), 567-576).
Erfindungsgemäß ist die Aktivität der cytosolischen Stärke
phosphorylase vorzugsweise in allen bzw. in fast allen Zel
len der Pflanze verringert. Zumindestens jedoch in den Knol
len und den sich aus diesen entwickelnden Sproßenden.
Es wurde überraschend gefunden, daß Knollen von Kartoffel
pflanzen, die eine derart verringerte Aktivität der cytoso
lischen Stärkephosphorylase aufweisen, im Vergleich zu Knol
len von Wildtyp-Pflanzen ein drastisch verändertes Keimungs
verhalten zeigen. Unter Keimung wird hierbei das Auswachsen
von Sproßenden aus Knollen verstanden.
Das veränderte Keimungsverhalten zeigt sich darin, daß der
artige Knollen
- (a) zum einen im Durchschnitt pro Knolle mehr Sprosse aus bilden; und/oder
- (b) im Durchschnitt pro Knolle mehr Augen (d. h. die an den Knollen vorhandenen Sproßknospen) auskeimen und zur Bil dung von Sprossen führen; und/oder
- (c) im Durchschnitt pro auskeimendem Knollenauge mehr Sproßenden gebildet werden, insbesondere, wenn die Kei mung nach Lagerung für 5 Monate bei 20°C im Dunkeln er folgt.
Wie bereits oben erläutert, bilden Knollen von Wildtyp-
Pflanzen beim normalen Auskeimen in der Regel 1, maximal 2
bis 3, Sproßenden. Zur Erhöhung der Anzahl der Sproßenden
ist entweder die Eliminierung des Apikalsprosses oder eine
Vorkeimung unter speziellen Bedingungen notwendig. Dahinge
gen zeigen Knollen der erfindungsgemäßen Kartoffelpflanzen,
die Zellen mit einer verringerten cytosolischen Stärkephos
phorylase enthalten, bei Keimung, insbesondere nach Lagerung
bei 20°C im Dunkeln, eine drastisch erhöhte Anzahl von
Sproßenden. Dies führt zur Ausbildung von mehr stolonen und
folglich zu mehr Knollen pro Pflanze. Insgesamt steigt damit
der Knollenertrag pro Pflanze. Dies betrifft sowohl die An
zahl der Knollen pro Pflanze, als auch das Gesamtfrischge
wicht von Knollen pro Pflanze.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist bei den erfindungs
gemäßen Kartoffelpflanzen die durchschnittliche Anzahl der
Sprosse, die pro Knolle gebildet werden, wenn die Keimung
nach einer Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln er
folgt, mindestens verdoppelt im Vergleich zu Wildtyp-Pflan
zen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist bei den
Knollen der erfindungsgemäßen Kartoffelpflanzen die Anzahl
der Sproßenden, die pro auskeimendem Auge gebildet werden,
wenn die Keimung nach einer Lagerung von 5 Monaten bei 20°C
im Dunkeln erfolgt, mindestens verdoppelt im Vergleich zu
Knollen von Wildtyp-Pflanzen.
Die Verringerung der Aktivität der cytosolischen Stärkephos
phorylase in den Zellen der erfindungsgemäßen Kartoffel
pflanzen läßt sich prinzipiell durch verschiedene, dem Fach
mann bekannte Methoden erreichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verringe
rung der Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase
durch die Inhibierung der Expression endogener Gene, die
dieses Enzym codieren. Bevorzugt sind hierbei molekularbio
logische Techniken, die auf einem antisense-, Ribozym- oder
einem Cosuppressionseffekt beruhen. Die Ausführungen dieser
Techniken sind dem Fachmann bekannt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorlie
genden Erfindung wird die Verringerung der Aktivität einer
cytosolischen Stärkephosphorylase in den Zellen dadurch er
reicht, daß man transgene Kartoffelpflanzen erzeugt, die
stabil ins Genom integriert ein rekombinantes DNA-Molekül
enthalten, das folgende Elemente umfaßt:
- (a) einen Promotor, der die Transkription zumindest in Zel len der Knollen von Kartoffelpflanzen ermöglicht; und
- (b) eine in antisense-Orientierung mit diesem Promotor ver knüpfte DNA-Sequenz, deren Transkripte ganz oder teil weise komplementär sind zu Transkripten eines endogen in Kartoffelpflanzenzellen vorliegenden Gens, das cytosoli sche Stärkephosphorylase codiert.
Promotoren, die die Expression in pflanzlichen Zellen ge
währleisten sind in großem Umfang beschrieben. Für eine Ex
pression in den Knollen der Kartoffelpflanzen bietet sich
beispielsweise der Promotor des Patatingens B33 aus Kartof
fel an (Rocha-Sosa et al., EMBO J.8 (1989), 23-29). Für eine
konstitutive Expression eignet sich z. B. der 355-Promotor
des CaMV (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-292).
DNA-Sequenzen, die eine cytosolische Stärkephosphorylase aus
Kartoffel codieren sind bereits beschrieben (siehe z. B. Mori
et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 18446-18453). Mit Hilfe
dieser DNA-Sequenzen ist es dem Fachmann möglich mittels
gängiger Verfahren weitere Sequenzen zu isolieren, die cyto
solische Stärkephosphorylase aus Kartoffel codieren, falls
dies erforderlich ist.
Neben den obengenannten Möglichkeiten kann die Verringerung
der Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase auch
durch Inaktivierung der endogen vorhandenen Gene, die dieses
Enzym codieren, erreicht werden. Techniken hierfür sind bei
spielsweise Transposonmutagenese oder gene-tagging.
Alternativ besteht auch die Möglichkeit, in den Zellen Anti
körper zu exprimieren, die spezifisch cytosolische Stärke
phosphorylase erkennen.
Verfahren zur Herstellung transgener Kartoffelpflanzen sind
in der Literatur beschrieben, siehe z. B. (Rocha-Sosa
(loc. cit.). Bevorzugt wird die Transformation mittels Agro
bakterien angewandt.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Vermehrungsmate
rial der erfindungsgemäßen Kartoffelpflanzen, insbesondere
Samen und besonders bevorzugt Kartoffelknollen. Diese ent
halten Zellen mit einer im Vergleich zu Knollen von Wildtyp-
Pflanzen verringerten Aktivität der cytosolischen Stärke
phosphorylase und ein wie oben beschriebenes verändertes
Keimungsverhalten auf.
Fig. 1 zeigt schematisch das Plasmid pBin-Anti-STPIKm
cSTP 1,7: ca. 1,7 kb langes DNA-Fragment, das
einen Teil der codierenden Region für cytosolische
Stärkephosphorylase aus Kartoffel umfaßt und in
antisense-Orientierung mit dem 355-Promotor ver
knüpft ist.
Fig. 2 zeigt zwei Polyacrylamidgele zum Nachweis der Ak
tivität der cytosolischen Stärkephosphorylase in
Blatt-(A) und Knollengewebe (B) transgener Kartof
felpflanzen, die mit dem Plasmid pBin-Anti-STPIKm
transformiert sind. Proteinrohextrakte von Blatt- und
Knollengewebe wurden in einem nicht-denaturie
renden Polyacrylamidgel (diskontinuierliches
System; 12% bzw. 4% (Gew./Vol.) Acrylamid) auf
getrennt. Das Trenngel enthielt 2,4% (Gew./Vol.)
Glykogen. Es wurden ca. 20 µg Protein pro Spur
aufgetragen. Die Elektrophorese wurde für 4 h bei
100 Volt durchgeführt. Die Wanderungsrichtung ist
von oben (Kathode) nach unten (Anode). Für die Ak
tivitätsfärbung wurden die Gele in 20 mM Glucose-
1-Phosphat/100 mM Citrat, pH 6,0 bei Raumtempera
tur über Nacht inkubiert. Proteinbanden mit stär
kesynthetisierender Aktivität werden als blaue
Banden sichtbar. Die cytosolische Stärkephospho
rylase (STPI) wird durch das immobilisierte Poly
saccharid stark in seiner Mobilität gehemmt. Die
plastidäre Stärkephosphorylase (STPII) ist dagegen
in ihrer Wanderungsgeschwindigkeit nicht so stark
beeinträchtigt.
Fig. 3 zeigt im Vergleich das Keimungsverhalten von Knol
len von Wildtyp-Pflanzen (S. tuberosum L. cv
D´sir´e; links) im Vergleich zu Knollen der trans
formierten Linie cSTP 9 (rechts) nach einer Lage
rung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln.
Fig. 4 zeigt im Vergleich das Keimungsverhalten von Knol
len von Wildtyp-Pflanzen (Mitte) im Vergleich zu
Knollen der transformierten Linien cSTP 6 (links)
und cSTP 7 (rechts) nach einer Lagerung von 10 Mo
naten bei 20°C im Dunkeln.
Fig. 5 zeigt eine statistische Übersicht über die Anzahl
der im Durchschnitt pro Knolle bzw. pro 25 Knollen
gebildeten Sproßenden bei Knollen von Wildtyp-
Pflanzen (cDesi) bzw. den transformierten Linien
(cSTP-6, -7, -9, -14, -15, -16 und -18) nach einer
Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln.
Fig. 6 zeigt eine statistische Übersicht über die durch
schnittliche Anzahl der pro "Auge" gebildeten
Sproßenden bei Knollen von Wildtyp-Pflanzen
(cDesi) und Knollen von transformierten Linien
(cSTP-6, -7, -9, -14, -15, -16 und -18).
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
In den Beispielen werden unter anderem folgende Materialien
und Techniken verwendet.
Für Clonierungen wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda
Research Laboratories, Gaithersburgh, USA) verwendet.
Die Transformation der Plasmide in die Kartoffelpflanzen
wurde mit Hilfe des Agrobacterium tumefaciens-Stammes
C58C1 pGV2260 durchgeführt (Deblaere et al., Nucl. Acids
Res. 13 (1985), 4777-4788).
Der Transfer der DNA erfolgte durch direkte Transforma
tion nach der Methode von Höfgen & Willmitzer (Nucleic
Acids Res. 16 (1988), 9877). Die Plasmid-DNA transfor
mierter Agrobakterien wurde nach der Methode von
Birnboim, & Doly (Nucleic Acids Res. 7 (1979), 1513-1523)
isoliert und nach geeigneter Restriktionsspaltung
gelelektrophoretisch analysiert.
Zehn kleine mit dem Skalpell verwundete Blätter einer
Kartoffel-Sterilkultur (Solanum tuberosum L. cv. D´sir´e)
wurden in 10 ml MS-Medium (Murashige & Skoog, Physiol.
Plant 15 (1962), 473-497) mit 2% Saccharose gelegt,
welches 50 µl einer unter Selektion gewachsenen Agrobac
terium tumefaciens-Übernachtkultur enthielt. Nach 3-5
minütigem, leichtem Schütteln erfolgte eine weitere In
kubation für 2 Tage im Dunkeln. Daraufhin wurden die
Blätter zur Kallusinduktion auf MS-Medium mit 1,6% Glu
cose, 5 mg/l Naphthylessigsäure, 0,2 mg/l Benzylaminopu
rin, 250 mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,80%
Bacto Agar gelegt. Nach einwöchiger Inkubation bei 25°C
und 3000 Lux wurden die Blätter zur Sproßinduktion auf
MS-Medium mit 1,6% Glucose, 1,4 mg/l Zeatinribose, 20
mg/l Naphthylessigsäure, 20 mg/l Giberellinsäure, 250
mg/l Claforan, 50 mg/l Kanamycin und 0,80% Bacto Agar
gelegt.
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit
Hilfe eines DNA-Randon Primer Labelling Kits der Firma
Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstel
lers durchgeführt.
RNA wurde nach Standardprotokollen aus Blattgewebe oder
Knollengewebe von Pflanzen isoliert. 50 µg der RNA wur
den auf einem Agarosegel aufgetrennt (1,5% Agarose, 1 ×
MEN-Puffer, 16,6% Formaldehyd). Das Gel wurde nach dem
Gellauf kurz in Wasser gewaschen. Die RNA wurde mit 20 ×
SSC mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran vom Typ
Hybond N (Amersham, UK) transferiert. Die Membran wurde
anschließend bei 80°C unter Vakuum für zwei Stunden ge
backen.
Die Membran wurde in NSEB-Puffer für 2 h bei 68°C prähy
bridisiert und anschließend in NSEB-Puffer über Nacht
bei 68°C in Gegenwart der radioaktiv markierten Probe
hybridisiert.
Kartoffelpflanzen werden im Gewächshaus unter folgenden
Bedingungen gehalten:
Lichtperiode 16 h bei 25 000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60%.
Lichtperiode 16 h bei 25 000 Lux und 22°C
Dunkelperiode 8 h bei 15°C
Luftfeuchte 60%.
Die Pflanzen werden in einzelnen Töpfen (200 cm², 15 cm
tief) gehalten und täglich gewässert. Die Knollen werden
4 Monate nach dem Transfer der Gewebekulturpflanzen in
das Gewächshaus geerntet. Für biochemische Analysen wer
den Knollen mit einem Frischgewicht von 8-16 g verwen
det. Das Frischgewicht wird unmittelbar nach dem Ernten
bestimmt. Die geernteten Knollen werden gewaschen und in
Kisten bei 20°C für 5 bis 10 Monate im Dunkeln gelagert.
Zur Herstellung eines antisense-Konstruktes, das eine anti
sense-RNA codiert zu Transkripten, die cytosolische Stärke
phosphorylase aus Kartoffel codieren, wurde ein Teil der co
dierenden Region der in Mori et al. (loc. cit.) beschriebe
nen cDNA mittels PCR aus einer λZAP cDNA-Bibliothek aus
Knollengewebe amplifiziert.
Ein 1,7 kb Asp718/SmaI-Fragment wurde mit glatten Enden in
die SmaI-Schnittstelle des binären Pflanzentransformations
vektors pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8721)
insertiert. Dieser enthält den 35S-Promotor des CaMV
und das Polyadenylierungssignal des Octopinsynthase-Gens.
Durch Restriktionsverdau wurde sichergestellt, daß die co
dierende Region in antisense-Orientierung zum Promotor ange
ordnet ist.
Das resultierende Konstrukt wurde als pBin-Anti-STPIKm be
zeichnet (siehe Fig. 1).
Der Vektor pBin-Anti-STPKm wurde mittels direkter Transfor
mation in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm C58C1: pGV2260
eingeführt (Höfgen und Willmitzer, Nucl. Acid Res. 16
(1988), 9877). Die Transformation und Regeneration transge
ner Kartoffelpflanzen erfolgte wie in Rocha-Sosa et al.
(EMBO J. 8 (1989), 23-29) beschrieben. Es wurden mehrere un
abhängig voneinander erzeugte transgene Linien hinsichtlich
ihrer Eigenschaften getestet, insbesondere die Linien mit
den Bezeichnungen cSTPI-6, -7, -9, -14, -15, -16 und -18.
Von verschiedenen unabhängigen Linien der gemäß Beispiel
2 hergestellten transgenen Kartoffelpflanzen wurde Ge
samt-RNA aus Blatt- bzw. Knollenmaterial isoliert und
mittels Northern-Blot-Analyse hinsichtlich der Expres
sion von mRNA analysiert, die cytosolische Stärkephos
phorylase codiert. Im Vergleich zu Proben von Wildtyp-
Pflanzen (Solanum tuberosum L. cv. D´sir´e), die ein
starkes Signal bei der Hybridisierung, mit einer für cy
tosolische Stärkephosphorylase spezifischen Probe zeig
ten, konnten in fast allen der untersuchten transfor
mierten Pflanzen keine bis fast keine Transkripte für
cytosolische Stärkephosphorylase nachgewiesen werden.
Der Nachweis der Aktivität der cytosolischen Stärkephos
phorylase in Geweben der transformierten Kartoffelpflan
zen wurde nach der Methode von Steup (In: Methods in
Plant Biochemistry 3, Academic Press Limited (1990),
103-128) durchgeführt. Hierzu wurden zunächst Protein
rohextrakte aus den zu untersuchenden Geweben gewonnen,
indem gefrorenes Gewebe in Extraktionspuffer (100 mM
HEPES-NaOH, pH 7,5; 1 mM EDTA, 10% (Vol./Vol.) Glyce
rin; 5 mM DTT, 200 mg Na₂SO₃; 150 mg Na₂S₂O₅) homogeni
siert. Nach Zentrifugation wurde der klare Überstand in
einem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die Elektrophorese
wurde durchgeführt wie in Steup und Latzko (Planta 145
(1979), 69-759) beschrieben. Hierbei wurde ein nicht-de
naturierendes diskontinuierliches System verwendet (12%
bzw. 4% (Gew./Vol.) Acrylamid). Das Trenngel enthielt
2,4% (Gew./Vol.) Glycogen. Zum Nachweis der Aktivität
der cytosolischen Stärkephosphorylase wurde das Gel nach
dem Gellauf in einer Lösung von 20 mM Glucose-1-Phos
phat/100 mM Citrat; pH 6,0 über Nacht bei Raumtemperatur
inkubiert. Anschließend wurde das Gel in lugolscher Lö
sung für 5 min inkubiert. Entfärbung erfolgte durch ex
tensives Waschen mit Wasser über einen längeren Zeit
raum. Blaufärbung zeigt die Anwesenheit stärkesyntheti
sierender Enzymaktivitäten an. Die Aktivität der cytoso
lischen Stärkephosphorylase kann beispielsweise an
schließend durch densitometrische Analyse der entspre
chenden Proteinbanden bestimmt werden.
Fig. 2 zeigt ein Polyacrylamidgel in dem sieben unab
hängige gemäß Beispiel 2 hergestellte transgene Kartof
fellinien hinsichtlich ihrer Aktivität an cytosolischer
Stärkephosphorylase getestet wurden.
Zur Untersuchung des Einflusses der Verringerung der Ak
tivität der cytosolischen Stärkephosphorylase auf das
Keimungsverhalten wurden Knollen der Pflanzen bei 20°C
gelagert und das Keimungsverhalten der Knollen nach ver
schiedenen Zeiträumen untersucht.
Fig. 3 zeigt im Vergleich Knollen von Solanum tuberosum
L. cv. D´sir´e (Wildtyp), sowie Knollen der mit dem
Plasmid pBin-Anti-STPIKm transformierten Linie cSTPI-9,
die jeweils 5 Monate bei 20°C gelagert worden waren.
Fig. 4 zeigt im Vergleich Wildtyp-Knollen und Knollen
von zwei anderen transformierten Linien (cSTPI-6 und
cSTPI-7), die für 10 Monate bei 20°C gelagert worden
sind.
Aus den beiden Figuren wird deutlich, daß die Knollen
der transformierten Linien, die eine verringerte Aktivi
tät der cytosolischen Stärkephosphorylase aufweisen, ein
drastisch verändertes Keimungsverhalten aufweisen.
Die Knollen der transformierten Linien bilden zum einen
wesentlich mehr Sproßenden pro Knolle und auch mehr
Sproßenden pro auskeimendem Auge aus. Ferner keimen bei
den Knollen der transformierten Pflanzen mit verringer
ter Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase in
der Regel mehr Augen aus. Eine statistische Auswertung
ist in den Fig. 5 und 6 dargestellt.
Die aus den Knollen der transformierten Pflanzen wach
senden Kartoffelpflanzen zeigen ferner einen erhöhten
Ertrag (in Knollenfrischgewicht/Pflanze). Dies ist in
der folgenden Tabelle dargestellt am Beispiel der trans
formierten Linie cSTP 9.
Aus der Tabelle geht hervor, daß Pflanzen mit einer ver
ringerten Aktivität der cytosolischen Stärkephospho
rylase zum einen mehr Knollen pro Pflanze ausbilden als
Wildtyp-Pflanzen und darüber hinaus das Knollenfrischge
wicht pro Pflanze wesentlich höher ist als bei Wildtyp-
Pflanzen.
Die transformierten Kartoffelpflanzen unterscheiden sich
hinsichtlich der in den Knollen gebildeten Stärke nicht
von Wildtyp-Pflanzen.
Claims (10)
1. Transgene Kartoffelpflanze, die Zellen mit einer im Ver
gleich zu Wildtyp-Pflanzen um mindestens 60% verringer
ten Aktivität der cytosolischen Stärkephosphorylase ent
hält.
2. Transgene Kartoffelpflanze nach Anspruch 1, deren Knol
len im Vergleich zu Knollen von Wildtyp-Pflanzen ein
verändertes Keimungsverhalten aufweisen.
3. Transgene Kartoffelpflanze nach Anspruch 1 oder 2, deren
Knollen sich bei Keimung von Knollen von Wildtyp-Pflan
zen dadurch unterscheiden, daß
- (a) im Durchschnitt pro Knolle mehr Sprosse gebildet werden; und/oder
- (b) im Durchschnitt pro Knolle mehr Augen auskeimen und zur Bildung von Sprossen führen; und/oder
- (c) im Durchschnitt pro auskeimenden Knollenauge mehr Sproßenden gebildet werden.
4. Transgene Kartoffelpflanze nach einem der Ansprüche 1
bis 3, wobei die durchschnittliche Anzahl der Sprosse,
die pro Knolle gebildet werden, wenn die Keimung nach
einer Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln er
folgt, mindestens verdoppelt ist im Vergleich zu Knollen
von Wildtyp-Pflanzen.
5. Transgene Kartoffelpflanze nach einem der Ansprüche 1
bis 4, wobei die Anzahl der Sproßenden, die pro auskei
mendem Auge gebildet werden, wenn die Keimung nach einer
Lagerung von 5 Monaten bei 20°C im Dunkeln erfolgt, min
destens verdoppelt ist im Vergleich zu Knollen von Wild
typ-Pflanzen.
6. Transgene Kartoffelpflanze nach einem der Ansprüche 1
bis 5, wobei die Verringerung der Aktivität der cytoso
lischen Stärkephosphorylase in den Zellen erreicht wird
durch die Inhibierung der Expression endogener Gene, die
dieses Enzym codieren.
7. Transgene Kartoffelpflanze nach Anspruch 6, wobei die
Inhibierung mittels eines antisense-, Ribozym- oder Co
suppressions-Effektes erreicht wird.
8. Transgene Kartoffelpflanze nach Anspruch 7, die stabil
ins Genom integriert ein rekombinantes DNA-Molekül ent
hält, das folgende Elemente umfaßt:
- (a) einen Promotor, der die Transkription zumindest in Zellen der Knollen von Kartoffelpflanzen ermöglicht; und
- (b) eine in antisense-Orientierung mit diesem Promotor verknüpfte DNA-Sequenz, deren Transkripte ganz oder teilweise komplementär sind zu Transkripten eines endogen in Kartoffelpflanzenzellen vorliegenden Gens, das cytosolische Stärkephosphorylase codiert.
9. Vermehrungsmaterial einer transgenen Kartoffelpflanze
nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das die Reproduktion
von Pflanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 8 erlaubt.
10. Vermehrungsmaterial nach Anspruch 9, das eine Knolle mit
den in einem der Ansprüche 1 bis 5 beschriebenen Eigen
schaften ist.
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