JP2001504698A - デンプン生合成酵素の熱安定性変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、熱安定性を向上させた酵素をコードする新規な変異ポリヌクレオチド分子に関する。植物の中で発現させると、これらのポリヌクレオチドは、高温ストレス条件下で生育させた植物における収量の増加をもたらす。本発明のポリヌクレオチド分子は、トウモロコシの胚乳のADPグルコースピロホスホリラーゼ（AGP）と可溶性のデンプン合成酵素（SSS）の酵素活性をコードしている。この変異ポリヌクレオチドが含まれるように育種されたか、または、この変異ポリヌクレオチドで形質転換された植物および植物組織で、このポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現する植物および植物組織も、本発明で企図されている。また、本発明は、本発明の範囲内にあると考えらるポリヌクレオチドとポリペプチドを単離するための方法に関する。待酷なストレス条件の下で栽培される植物において、収量を向上させるための方法も提供されている。

Description

【発明の詳細な説明】 デンプン生合成酵素の熱安定性変異体 本発明は、米国科学財団助成金番号9316887による政府の支援により遂行され た。政府は、本発明において一定の権利を有する。 関連出願の相互参照 本出願は、1996年11月18日に提出された米国仮出願第60/031,045号の優先権を 主張するものである。 発明の背景 植物の生活は定着性であるため、植物の生長と発生に積極的な効果と消極的な 効果を与える環境因子に絶えず曝されることになる。近代農業が直面している主 要な障害の1つは、有害な環境条件である。作物の有意な減収をもたらす重要な 要因の一つは高温ストレスである。温度ストレスによって、トウモロコシ、コム ギ、およびオオムギなど、多くの穀物において、穀粒の収量が大幅に減少する。 高温ストレスによる減収は、世界的に重要な穀類において、7%から35%に及ぶ。 多くの研究によって、高温ストレスによる生理学的な結果である可能性の高い ものが同定されている。ハンターら（Hunter，R．B.，Tollenaar，M.，およびBr euer，C．M．［1977］Can．J．Plant Sci．57:1127〜1133）による、生育箱とい う条件を用いた初期の研究で、高温によってトウモロコシの登熟期間が短縮する ことが示された。温度上昇によって登熟期間が不利な方向に変化するという同様 の結果が、トレナーとブルウルセマ（Tollenaar，M.,およびBruulsema，T．W． ［1988］Can．J．Plant Sci．68:935〜940）によって確認された。バドゥ-アプ ラクら（Badu-Apraku，B.，Hunter，R．B.，およびTollenaar，M．［1983］Can ．J．Plant Sci．63:357〜363）は、昼/夜間の温度を25/15℃とする温度体制に 較べると、35/15℃とする温度体制で生育させたトウモロコシ植物体の収量が著 しく減少することを測定した。温度上昇によって減収することは、気象学的研究 だけでなく、歴史的な研究によっても裏付けられている（Thompson，L．M．［19 86］Agron．J．78:649〜653；Thompson，L．M．［1986］Science 188:535〜541 ；Chang，J．［1981］Agricul．Metero．24:253〜262；ならびにConroy，J．P. ，Seneweera，S.，Basra，A．S.，Rogers，G.，およびNissen-Wooller，B．［19 94］Aust． J．Plant Physiol．21:741〜758）。 発生中の種子の生理学的過程が高温ストレスによって有害な影響を受けること は、インビトロにおける穀粒培養系を使用した研究から明らかである（Jones，R .J．Gengenbach，B．G.およびCardwell，V.B．［1981］Crop Science 21:761〜7 66；Jones，R．J.，Ouattar，S.およびCrookston，R.K．［1984］Crop Science 24:133〜137；ならびにCheikh，NおよびJones，R．J．［995］Physiol．Plant． 95:59〜66）。35℃という最適温度より高い温度で培養したトウモロコシの穀粒 は重量が劇的に低下していた。 コムギで研究したところ、可溶性デンプン合成酵素（SSS）の活性喪失が、高 温ストレスに対するコムギ胚乳の反応の顕著な特徴であることが確認された（Ha wker，J．S．およびJenner，C．F．［1993］Aust．J．Plant Physiol．20:197〜 209；Denyer，K.，Hylton，C．M.，およびSmith，A．M．［1994］Aust．J．Plan t Physiol．21:783〜789；Jenner，C．F．［1994］Aust．J．Plant Physiol．21 :791〜806）。コムギ胚乳のSSSを用いたさらに研究は、この酵素が熱不安定であ ることを示している（Rijven，A．H．G．C．［1986］Plant Physiol．81:448〜4 53；Keeling，P．L.，Bacon，P．J.，Holt，D．C．［1993］Planta 191:342〜34 8；Jenner，C．F.，Denyer，K.，およびGuerin，J．［1995］Aust．J．Plant Ph ysiol．22:703〜709）。 トウモロコシにおける、高温ストレス条件下でのSSSとADPグルコースピロホス ホリラーゼ（AGP）の役割はあまり明確ではない。（AGP）は、ATPとα-グルコー ス-1-リン酸が、ADP-グルコースとピロリン酸に転化するのを触媒する。ADP-グ ルコースは、植物によるデンプン生合成、およびバクテリアによるグリコーゲン 生合成において、グリコシル基供与体として用いられる。デンプン生合成の調節 における、ADPグルコースピロホスホリラーゼのキ一酵素としての重要性が、ト ウモロコシ（Zea mays）の胚乳のデンプン欠損変異株の研究で注目された（Tsai ，C．Y.，およびNelson，Jr.，O．E．［1966］Science 151:341〜343；Dickinso n，D．B.，J．Preiss［1969］Plant Physiol．44:1058〜1062）。 オー-リーとセッター（Ou-Lee，T.，およびSetter，T．L．［1985］Plant Phy siol．79:852〜855）は、トウモロコシの穂の頂端または先端の領域に対する温 度の影響を調べた。温度を上昇させると、強力なデンプン蓄積が行われていると きは、穀粒の基部に較べて、穀粒の頂端でのAGP活性が低かった。これに対して 、普通の温度で発生した穀粒においては、この期間のAGP活性は、穀粒の頂端と 基部で同じであった。しかし、この期間のデンプン合成酵素活性は、穀粒の頂端 と基部で異なった影響を受けることはなかった。さらに、熱処理された穀粒頂端 部は、デンプン合成酵素活性の制御を外れた上昇を示した。これは、AGP活性で は見られなかった。シングルタリーら（Singletary，G．W.，Banisadr，R.，お よびKeeling，P．L．［1993］Plant Physiol．102:6（補遺）；Singletary，G． W.，Banisadra，R.，Keeling，P．L．［1994］Aust．J．Plant Physiol．21:829 〜841）は、インビトロの培養系を用いて、登熟期間中のさまざまな温度の効果 を定量した。温度を22℃〜36℃から上昇させると、種子重量は徐々に確実に減少 した。減収におけるAGPの役割も、デュークとデーラートの研究によって裏付け られた（Duke，E．R.，およびDoehlert，D．C．［1996］Environ．Exp．Botany ，36:199〜208）。 キーリングらの研究（1994、前記）では、Q10解析を用いて、トウモロコシと コムギのSSS活性を定量して、SSSが、炭素からデンプンへの変化を調節する重要 なポイントであることを明らかにした。 AGPとSSSを用いたインビトロの生化学実験は、両酵素とも熱に不安定であるこ とを明らかに示している。トウモロコシ胚乳のAGPは、57℃で５分間加熱すると 、その活性の96％が失われる（Hannah，L．C.，Tuschall，D．M.，およびMans， R．J．［1980］Genetics 95:961〜970）。これは、ジャガイモのAGPが、70℃で も完全に安定しているのと対照的である（Sowokinos，J．R.，およびPreiss，J ．［1982］Plant Physiol．69:1459〜1466；Okita,T．W.，Nakata，P．A.，およ びerson，J．M.，Sowokinos，J．R.，Morell，J.，およびPreiss，J．［1990］P lant Physiol．93:785〜90）。熱不活性化実験によって、SSSも、温度が高くな ると不安定になることが示され、動力学的実験によって、温度を25〜45℃から上 昇させると、アミロペクチンに対するKm値が指数関数的に増加することが測定さ れた（Jenner et al.，1995，前記）。 生化学的な証拠と遺伝学的な証拠によって、AGPは、高等植物においてはデン プ ンの生合成において、また、大腸菌（E．coli）においてはグリコーグンの生合 成においてキー酵素であることが確認されている（Preiss，J．およびRomeo，T ．［1994］Progeress in Nuc．Acid Res．and Mol．Biol．47:299〜329;Preiss ，J．およびSivak，M．［1996］「シンクとソースにおけるデンプン合成」（Sta rch synthesis in sinks and sources）、植物および作物における光同化産物の 分布：ソース-シンクの相互関係（Photoassimilate distribution in plants an d crops:source-sink relationships）より、Zamski，E.編、マーシャル・デッ カー社（Marcil Dekker Inc．）pp．139〜168）。AGPは、活性化されたグルコシ ル基供与体であるADPグルコースを反応産物とする、デンプン生合成経路の開始 段階と考えられている段階を触媒する。デンプン合成酵素は、これを、ポリサッ カライドポリマーを伸長するために利用する（オランダ、ドルトレヒト（Dortre cht，The Netherlands）のクルバーアカデミックパブリシャーズ社（Kluwer Aca demic Publishers）刊、B．A．LarkinとI．K．Vasil（編）第4巻、植物の細胞分 子生物学における進歩（Advance in Cellular and Molecular Biology of Plant s）より、Hannah，L．Curtis［1996］「トウモロコシの胚乳におけるデンプン合 成（Starch synthesis in the maize endsperm）」（印刷中）において概説され ている）。 ジャガイモAGPを用いた初期の研究は、大腸菌で発現させると、本来の塊茎の 酵素と非常によく似たアロステリック特性と動力学特性をもつ酵素が得られるこ とを明らかにした（Iglesias，A.，Barry，G．F.，Meyer，C.，Bloksberg，L.， Nakata，P.，Greene，T.，Laughlin，M．J.，Okita，T．W.，Kishore，G．M.， およびPreiss，J．［1993］J．Biol．Chem．268:1081〜86；Ballicore，M.A.，L aughlin，M．J.，Fu，Y.，Okita，T.W.，Barry，G．F.，およびPreiss，J．［19 95］Plant Physiol．109:245〜251）。Greeneら（Greene，T.，Chantler，S．E. ，Kahn，M．L.，Barry，G．F.，Preiss，J.，Okita，T.W．［1996］Proc．Natl ．Acad．Sci．93:1509〜1513；Greene，T.，Woodbury，R．L.，およびOkita，T. W．［1996］Plant Physiol．（印刷中)）は、ジャガイモAGPを用いた構造-機能 研究におけるバクテリア発現系の有用性を明らかにした。アロステリックと基質 の結合部位をマッピングするのに重要な変異が多数同定された（Shewry，P．R. ，Napier， J．A.，およびDavis，P.編、Okita，T．W.，Greene，T.，Laughlin，M．J.，S aIamone，P.，Woodbury，R.，Choi，S.，Ito，H.，Kavakli，H.，およびStephen s，K．［1996］「植物生合成酵素の改変による植物デンプンの作出（Engineering Plant Starches by the Generation of Modified Plant Biosynthetic Enzyme ）」、ロンドン（London）のポートランドプレス社（Portland Press Ltd.）刊、 産業目的に使用するための人工作物（Engineering Crops for Industrial End U ses）（印刷中）より）。 AGP酵素は、バクテリアと植物の両方で単離されている。バクテリアのAGPはホ モ四量体からなるが、光合成組織と非光合成組織に由来する植物AGPは、2つの異 なったサブユニットからなるヘテロ四量体である。この植物酵素は、大小2つの 異なった遺伝子にコードされている。この特徴は、かなりの数の植物で見られる 。ホウレンソウの葉のAGPサブユニットは、SDS-PAGEによって判定したところ、 分子量54kDaと51kDaであった。どちらのサブユニットも、ホウレンソウの葉から 採ったAGPを精製したものに対して作製した抗体と免疫反応性がある（Copeland ，L.，J．Preiss（1981）Plant Physiol．68:996〜1001；Morell，M.，M．Bloon ，V．Knowles，J．Preiss［1988］J．Bio．Chem．263:633）。ホウレンソウの葉 の小サブユニツトと大サブユニットに対して調製した抗血清を用いて免疫学的な 解析を行なったところ、ジャガイモの塊茎のAGPも2つの遺伝子によってコードさ れていた（Okitaら、1990、前記）。ジャガイモ塊茎のこの2つのサブユニット（ 50kDaと51kDa）のcDNAクローンは、単離されて配列決定されている（Muller-Rob er，B．T.，J．Kossmann，L．C．Hannah，L．Willmitzer，U．Sounewald［1990 ］Mol．Gen．Genet．224:136〜146；Nakata，P．A.，T．W．Greene，J．M．Ande rson，B．J．Smith-White，T．W．Okita，J．Preiss［1991］Plant Mol．Biol． 17:1089〜1093）。ジャガイモ塊茎AGPの大サブユニットは熱安定的である（Naka ta、［1991］、前記）。 ハナとネルソン（Hannah，L．C.，O．E．Nelson（1975）Plant Physiol．55:2 97〜302；Hannah，L．C.，Nelson，Jr.，O．E．［1976］Biochem．Genet．14:54 7〜560）は、Shrunken-2（sh2）(Bhave，M．R.，S．Lawrence，C．Barton，L．C ．Hannah［1990］Plant Cell 2:581〜588)とBrittle-2（Bt2）（Bae，J．M.，M ． Giroux，L．C．Hannah［1990］Maydica 35:317〜322）はともに、トウモロコシ 胚乳のADP-グルコースピロホスホリラーゼの構造遺伝子であると考えた。sh2とB t2は、それぞれ、この酵素の大サブユニットと小サブユニットをコードしている 。cDNAの配列決定によって、sh2とBt2のタンパク質の推定分子量は、それぞれ、 57,179Da（Shaw，L．R.，L．C．Hannah［1992］Plant Physiol．98:1214〜1216 ）と52,224Daである。胚乳は、トウモロコシが登熟するときに、最もデンプンが 蓄積される部位である。トウモロコシ胚乳のsh2とBt2変異体では、デンプンのレ ベルが、AGP活性の欠損レベルに相当するところまで低下した。どちらの遺伝子 の変異体も、AGP活性を約95％低下させることが分かっている（TsaiとNelson，1 966，前記；DichinsonとPreiss，1969，前記）。さらに、変異酵素が動力学的特 性を変化させたのに対して、機能的な野生型Sh2とBt2の対立遺伝子の数ともに、 酵素活性が増加することが観察されている。AGPは、植物のデンプンの合成にお ける律速段階である。スタークら（Stark）が、大腸菌AGPの変異型をジャガイモ 塊茎の中に組み込んだところ、デンプン含量を35%増加させることができた（Sta rk et al．［1992］Science 258:287）。 AGP酵素のサブユニットをコードする遺伝子のクローニングとキャラクタリゼ ーションが、さまざまな植物で報告されている。これらには、トウモロコシ由来 のSh2 cDNA（Bhaveら、1990、前記）、Sh2ゲノムDNA（ShawとHannah、1992、前 記）、ならびにbt2 cDNA（Baeら、1990、前記）、イネ由来の小サブユニットのc DNA（Anderson，J．M.，J．Hnilo，R．Larson，T．W．Okita，M．Morell，J．Pr eiss［1989］J．Biol．Chem．264:12238〜12242）、ならびにゲノムDNA（Anders on，J．M.，R．Larson，D．Landencia，W．T．Kim，D．Morrow，T．W．Okita，J ．Preiss［1991］Gene 97:199〜205）、ならびにホウレンソウの葉（Morellら、 1988、前記）およびジャガイモ（Muller-Roberら、1990、前記；Nakata，P．A. ，Greene，T．W.，Anderson，J．W.，Smith-White，B．J.，T．W．Okita，およ びJ．Preiss［1989］Plant Mol．Biol．17:1089〜1093）由来の小サブユニット および大サブユニットのcDNAなどがある。さらに、コムギの胚乳と葉の組織から （Olive，M．R.，R．J．Ellis，W．W．Schuch［1989］Plant Physiol．Mol．Bio l．12:525〜538）、またシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の葉から（Li n，T.，Casp ar，T.，Sommerville，C．R.,およびPreiss J．［1988］Plant Physiol．88:117 5〜1181）、cDNAクローンが単離されている。 今までに調べられた組織および生物のすべてにおいて、AGPはアロステリック 酵素として機能している。大腸菌において、初めて、AGPのアロステリック特性 が重要であることが示された。グリコーゲンを過剰産生する大腸菌変異株を単離 したところ、この変異は、glyCと名づけられたAGPの構造遺伝子にマップされた 。glyC-16として知られている変異大脳菌は、アクチベーターであるフルクトー ス1,6ビスホスフェートに対してより感受性が強く、インヒビターであるcAMPに は、より感受性が低いことが示された（Preiss J．［1984］Ann．Rev．Microbio l．419〜458）。植物のAGPもアロステリックであるが、それらは、バクテリアの AGPとは異なるエフェクター分子に反応する。植物において3-ホスホグリセリン 酸（3-PGA）がアクチベーターとして機能し、一方で、リン酸（PO4）がインヒビ ターとして作用する（DickinsonとPreiss、1969、前記）。 既知のアクチベーター結合部位に偶然近接した位置にあるDs転移因子を、Acに よって切り出して作出されるインビボの突然変異誘発システムを用いて、ジロー ら（Giroux，M．J.，Shaw，J.，Barry，G.，Cobb，G．B.，Greene，T.，Okita， T．W.,およびHannah，L．C．［1996］Proc．Natl．Acad．Sci．93:5824〜5829） は、トウモロコシ胚乳AGPの機能的に重要な領域における部位特異的な変異株を 作出することができた。変異株の一つであるRev6は、チロシン−セリン挿入を含 み、種子重量を11〜18%増加させた。 発明の簡単な概要 本発明は、穀物を産出する植物などの植物における作物収量を向上させるのに 有用な材料と方法に関する。一つの態様において、本発明は、熱安定的なAGP酵 素、および、これらの酵素をコードする塩基配列を提供する。好ましい態様にお いて、この熱安定的な酵素を用いて、熱に対してより強い耐性をもつ植物を提供 し、それによって、これらの植物からの収量を向上させることができる。特に好 ましい態様において、改良される植物は穀類である。本発明が適用される穀類に は、例えば、トウモロコシ、コムギ、イネ、およびオオムギなどが含まれる。 図面の簡単な説明 図1．トウモロコシ胚乳AGP大サブユニットの変異体。60℃で5分間熱処理した 後に残存しているAGP活性の割合が示されている。 図2．トウモロコシ、コムギ、オオムギ、およびジャガイモの大サブユニット におけるHS 33変異周辺領域の一次配列。保存領域を四角で囲んだ。 図3．トウモロコシ、コムギ、オオムギ、およびジャガイモの大サブユニット におけるHS 33変異周辺領域の一次配列。保存領域を四角で囲んだ。太字のアス パラギン酸残基が、ジャガィモLSのアロステリック変異株のD413Aに対応してい る（Greene，T.，Woodbury，R．L.，およびOkita，T.W．［1996］Plant Physiol ．(印刷中)）。ホウレンソウの葉のAGP配列は、3-PGAの類似体の研究で同定され たアクチベーターのサイト2ペプチドである（Ball，K.とPreiss，J．［1994］J ．Biol．Chem．269:24706〜24711）。標識したリシン残基を太字で表してある。 発明の詳細な説明 本発明は、野生型の遺伝子型をもつ植物に較べて、高温ストレス条件下で栽培 された植物に収量の増加をもたらす、新規の変異ポリヌクレオチド、およびそれ によってコードされるポリペプチドに関する。特異的な態様において、本発明の ポリヌクレオチド分子は、トウモロコシ胚乳のADPグルコースピロホスホリラー ゼ（AGP）と可溶性デンプン合成酵素（SSS）の酵素活性をコードする。この変異 酵素は、野生型酵素活性に較べると、登熟期間中の高温ストレス条件に対する種 子の安定性の増加をもたらす。 一つの態様において、本発明の変異ポリヌクレオチドは、ポリペプチド配列中 で、ヒスチジンからチロシンへのアミノ酸置換をもつAGPの大サブユニットをコ ードしている。このタンパク質で認容されているアミノ酸番号に従えば、この置 換はアミノ酸番号333で生じている（ShawとHannah、1992、前記）。この置換の 位置は、当業者によって容易に同定することができる。本発明で例示されている 第二の変異は、AGPタンパク質の460番目の位置にあるスレオニンからイソロイシ ンへの置換である。好熱安定性の増加をもたらす、この他の変異体を以下の表１ に示す。 トウモロコシ胚乳AGPのサブユニットのcDNAクローン（SH2およびBT2）、およ び、内生的なバクテリアAGP（glgC）を欠損した大腸菌株（AC70R1-504）によっ て、トウモロコシ胚乳のAGPを研究するためのバクテリア発現系を確立するのが 容易になった。一方のサブユニットだけを発現させても、glgC変異を相補するこ とができないため、グリコーゲンは産生されない（Iglesias，A.，Barry，G．F. ，Meyer，C.，Bloksberg，L.，Nakata，P.，Greene，T.，Laughlin，M．J.，Oki ta，T．W.，Kishore，G．M.，およびPreiss，J．［1993］J．Biol．Chem．268:1 081〜86）。しかし、親和性のあるベクター上の大小両サブユニットを発現させ ると、ヨウ素に曝したコロニーが濃い赤茶色に染色されることから証明されるよ うに、glgC変異を完全に相補して、グリコーゲン産生を回復する。このように、 相補性は、コロニーを単にヨウ素に曝すだけで容易に確認することができる。 一つの態様において、ジャガイモまたはトウモロコシの胚乳AGPを発現する大 腸菌のglgC-細胞を用いた。ジャガイモのAGP遺伝子をもつ細胞は、37℃または42 ℃で培養されると、大量のグリコーゲンを合成することができる。しかし、トウ モロコシ胚乳のAGPを発現する細胞は、37℃でのみグリコーゲンを合成する。こ の結果は、野生型トウモロコシの胚乳AGPの熱感受性を示している。ジャガイモA GPとトウモロコシAGPの間にこのような違いがあるため、トウモロコシ胚乳AGPの 熱安定性変異体をもつ変異細胞をスクリーニングするための効率的なシステムが できる。 本発明の一つの局面は、熱安定的なAGPを効率的に同定することに関する。し たがって、トウモロコシAGPのSH2サブユニットをコードするポリペプチドを含む プラスミドを、下記に説明するところにしたがって化学的に変異誘発して、BT2 サブユニットを発現する変異大腸菌細胞に組み込み、42℃で増殖させた。この他 、当技術分野において既知の変異原を用いることもできる。熱安定性（HS）変異 株と名づけられた、ヨウ素に染色する遺伝的変異株を11個単離した。これらの変 異株の粗抽出物を調製して、その結果得られたAGPの熱安定性を調べた。60℃で5 分間インキュベートした後に、変異株は、8〜59％の活性を保持している（図1） 。これを、この温度で、野生型AGPに通常見られるのが1〜4%であることと比較す る。 この結果、本発明によって、突然変異により熱安定型酵素を作出できることは 明らかである。思いがけず、これらの変異株の多くで、熱処理する前のトウモロ コシ胚乳のAGPの全活性が約10倍上昇した。この驚くべき結果によって、これら の変異株を農業で使用することが特に有利になる。本明細書で説明されているよ うな突然変異誘発技術を、本発明にしたがって用いて、熱安定的なデンプン生合 成酵素をコードする別の遺伝子を同定することができる。 最も熱安定的な2つのHS変異体であるHS 33とHS 40など、熱安定性変異体をコ ードするいくつかの遺伝子の完全な配列を決定した。熱処理後、59%の活性を保 持するHS 33は、ポリペプチドのアミノ酸配列の333番目のヒスチジン残基をチロ シンに変化させる1塩基対の突然変異をもっている（図2）。コムギとオオムギの AGPの大サブユニットの一次配列のアラインメントによると、これらの相当する 残基にもヒスチジンが存在することが分かる（図3）（Ainsworth，C.，Hosein， F.，Tavis，M.，Weir，F.，Burrell，M.，Devos，K．M.，Gale，M．D．［1995］ Planta 197:1〜10）。熱処理後41%の活性を保持するHS 40を配列解析したところ 、333番目でヒスチジンからチロシンへの変化を含んでいた。スレオニンからイ ソロイシンへの置換を生じる、この他の点突然変異を同定した。このスレオニン 残基は、AGPの大サブユニットで高度に保存されているが、小ブユニットで、こ れに相当する残基はシステインまたはセリンである（Ainsworthら、1995、前記 ）。スレオニンからイソロイシンへの置換は、大サブユニットのカルボキシル末 端に近接した位置に存在し、アクチベーター3-PGAの既知の結合部位に近接した 位置に存在して いる（図3）。 本発明は、また、AGPの小サブユニットに変異をもつ、この酵素の熱安定性変 異体に関する。AGPの小サブユニット変異体をコードするポリヌクレオチドも、 本発明の範囲に含まれる。本発明の方法を用いて、AGPに熱安定性を付与する、 この酵素の小サブユニットにおける変異を調製し、同定することができる。 変異ポリヌクレオチドをもつように育種されたか、変異ポリヌクレオチドで形 質転換された植物および植物組織で、このポリヌクレオチドにコードされている ポリペプチドを発現しているものも、本発明で意図されている。変異ポリヌクレ オチドを発現する植物および植物組織は、生育過程で高温ストレスをかけられた ときに、重量と収量の、熱誘導による損失が低くなった組織を産生する。 本発明は、また、本発明の範囲内に含まれると考えられるポリヌクレオチドと ポリペプチドを産生、および同定するための方法に関する。一つの態様において 、遺伝子突然変異を用い、およびその後、バクテリアの発現システムを用いた選 抜を用いて、植物における熱誘導によるデンプン合成の減少を軽減することがで きる酵素をコードするポリヌクレオチド分子を単離することができる。 本発明は、さらに、そのゲノムの中に組み込まれたAGP変異遺伝子をもつ植物 および植物組織に関する。本明細書で開示されている別の対立遺伝子も、植物ゲ ノムの中に組み込むことができる。好ましい態様において、この植物は、禾穀植 物である。さらに好ましくは、この植物はトウモロコシ（Zea mays）である。AG P変異遺伝子をもつ植物を、そのゲノムの中に変異遺伝子を含む種子から生育さ せることができる。さらに、植物を遺伝子で形質転換させるための技術は、当技 術分野において既知である。 遺伝子コードの縮退によって、さまざまなポリヌクレオチド配列が、本明細書 において開示されている各変異AGPポリペプチドをコードすることができる。さ らに、本発明のポリペプチドと同一の、または本質的に同一のポリペプチドをコ ードする別のポリヌクレオチド配列を作出することは、当業者の技術の十分な範 囲内にある。これらの変異ポリヌクレオチド、または別のポリヌクレオチドの配 列は、本発明の範囲内に含まれる。本明細書で用いられるとき、「本質的に同一 な」配列とは、本明細書で説明されているAGP変異ポリペプチドによってコード され るポリペプチドの機能的活性を実質的に変えることのないアミノ酸置換、欠失、 付加、または挿入をコードする配列を意味する。 本明細書で開示されている変異体において特異的に例示されているアミノ酸置 換以外のアミノ酸置換も本発明の範囲に含まれる。アミノ酸は、以下のクラスに 分類することができる：非極性、非荷電極性、塩基性、および酸性。一つのクラ スのアミノ酸をもつ変異AGPポリペプチドが、同じクラスの別のアミノ酸に置き 換えられている保存的置換も、変異AGPポリペプチドが、野生型ポリペプチドに 比較して高い熱安定性を保持するかぎり、本発明の範囲内に含まれる。下の表2 は、各クラスに属するアミノ酸の例を挙げたものである。例えば、HS 33、HS 39、HS 40、およびHS 47変異体のトウモロコシ胚乳AGPの333 番目のチロシンを、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン 、およびグルタミンなどのアミノ酸で置換することは、本発明の範囲に含まれる 。 本発明は、また、完全長変異ポリペプチドの断片が、全長ポリペプチドと実質 的に同一の機能的活性を保持しているかぎり、それらの断片をコードするポリヌ クレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドによってコードされる変異AGP ポリペプチドの断片も、本発明の範囲内に含まれる。 本発明は、標準的な高厳密度条件下で野生型Sh2のDNA配列とハイブリッド形成 できるように、野生型Sh2のDNA配列と充分に相同な配列をもつポリヌクレオチド 分子も意図している。そのようなハイブリッド形成条件は、当技術分野において 通常のものである（例えば、Maniatis，T.，E．F．Fritsch，J．Sambrook［1989 ］分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning．A Laboratory Manu al）、第２版、コールドスプリングハーバー研究所（Cold Spring Harbor Labor atory）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Cold Spring Harbor，N ew York））。 本発明のポリヌクレオチドを用いて、植物において熱安定的な変異AGP酵素を 発現させるために、植物を形質転換させることができる。さらに、本発明のポリ ヌクレオチドを用いて、組換え変異AGP酵素を発現させることができる。また、 これらをプローブに用いて、関連する酵素を検出することができる。また、これ らのポリヌクレオチドは、DNA分子量決定の基準として用いることもできる。 本発明のポリヌクレオチド分子は、植物の熱安定性を向上させることに加えて 、種子重量を増加させるようなAGP酵素をコードするポリヌクレオチドも含む。 熱安定性変異であるHSと、種子重量を増加させるような変異、例えば、Rev 6と を組み合わせることが、本発明で特に意図されている。例えば、米国特許第5,58 9,618号と同第5,650,557号を参照のこと。 AGPのサブユニットにおいて熱安定性を付与する変異を、本発明にしたがって 、Rev 6変異のような、トウモロコシのリン酸非感受性変異株と組み合わせると 、大サブユニットにコードされているRev 6の安定性を向上させることができる 。 SSSの酵素活性は、AGPで見られるように、熱で低下すると思われる。したがっ て、SSSの突然変異型を高温条件下（42℃）で発現させて、熱安定性変異株を単 離することができる。これらの熱安定的なSSSの突然変異型は、本発明のさらに 別の局面である。 本明細書において引用された刊行物と特許はすべて、参照として本明細書に組 み入れられる。 以下は、本発明を実施するための手順を例示する実施例である。これらの実施 例は、制約的なものと解釈してはならない。別記されないかぎり、割合はすべて 重量により、溶媒の混合比率はすべて容量による。実施例1−トウモロコシ胚乳AGPの熱安定性変異体を得るための突然変異誘発法の 使用 大サブユニットを発現するプラスミドの無作為突然変異を誘発するために、ま ず、化学的変異原である塩酸ヒドロキシルアミンを用いた。ヒドロキシルアミン は、シトシンのC-4の位置にあるアミノ基の窒素を選択的にヒドロキシル化して 、 GCからATへのトランジションをもたらす（Suzuki，D．T.，Griffith，A．J．F. ，Miller，J．H.およびLewontin，R．C．［1989］遺伝解析への手引き（Introdu ction to genetic analysis）より、ニューヨーク州フリーマン社（Freeman，NY ）第4版、pp．475〜499）。突然変異頻度の高い化学的変異原を選択した。化学 的変異原には限界があることが分かっているので、あまり多様な遺伝的変異体が 単離されなかったときには、PCRによる無作為突然変異誘発法を行なってもよい 。PCRによる突然変異誘発法は、トランジションとトランスバージョンが同じよ うな頻度で起こるなど、より広範な変異が生じさせるため、化学的方法に変わる 優れた方法を提供する。カドウェルとジョイス（Dadwell，R．C.，およびJoyce ，G．F．［1992］PCR Methods and Applications 2:28〜33）によって概説され たこの方法は、PCRによる方法にとって模範的な方法となりうる。 無作為の突然変異誘発においては完全な発現プラスミドが用いられるため、コ ーディング領域の外側で突然変異が起こる可能性がある。このような突然変異は 、トウモロコシ胚乳のAGPの熱安定性に影響を及ぼさないと考えられるが、酵素 レベルでのキャラクタリゼーションをさらに行なう前には、各変異体を変異誘発 していない発現プラスミドにサブクローニングすることができる。NcoI/SacI消 化によって全長のコーディング領域が解離するように、大小両サブユニットを発 現するプラスミドを構築することができる。これは、変異を起していないNcoI/S acI消化された発現プラスミドに、容易にクローニングし返すことができる。実施例2−熱安定性AGP変異体の分子キャラクタリゼーションと解析 まず、トウモロコシ胚乳の大サブユニットの熱安定性変異株11個を得た。2個 の全長を配列決定した。配列決定は、デュポン社（Dupont）とABI社の使用説明 を用いて行なった。 配列データは、野生型の先祖対立遺伝子と機械的に比較することができる。こ の解析によって、熱安定性を条件づける変化の多様性の範囲が明らかになる。 配列決定したHS変異株はいずれも、大サブユニットにヒスチジンからチロシン への同じ変異を含んでいる。PCRによって得られたHS変異株は、チロシンをヒス チジンヘ戻すプライマーを用いて、部位特異的な突然変異誘発法を用いることに よって、ヒスチジンからチロシンへの変化を速やかにスクリーニングすることが で きる。実施例3−遺伝的変異体の発現、精製、および動力学的解析 トウモロコシ胚乳の野生型AGPを大腸菌で発現させるための条件は、完全に特 徴が分かっている。最適な増殖条件と誘導条件は、以前、大腸菌で発現させたジ ャガイモのAGPについて発表された条件と幾分異なっている（Iglesiasら、1993 、前記；Ballicoraら、1995、前記）。0.3mM IPTGと25μg/mlのナリジキシン酸 存在下で、室温で12〜14時間誘導すると、高い発現レベルと活性レベルが一貫し て得られる。抽出用緩衝液に30%硫酸アンモニウムと10mM KH2PO4-/K2HPO4-を加 えると、粗抽出物中のトウモロコシAGPが安定化する。 硫酸アンモニウムで濃縮されたAGPを、ファルマシア（Pharmacia）HR 10/10カ ラムの中に詰めたテンタクル（Tentacle）C3アミノプロピル媒体（EMセパレーシ ョンズ（EM Separations））を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー（Hydr ophic Interaction Chromatography）でさらに精製する。タンパク質は、1Mの硫 酸アンモニウムを含む緩衝液の中でカラムに結合する。0.75M、0.5M、0.25M、お よび0.Mの硫酸アンモニウムを含む緩衝液での連続段階勾配洗浄によって、カラ ムからAGPを溶出する。トウモロコシ胚乳の野生型AGPは、典型的には、0.25Mの 洗浄で溶出される。C3によって精製されたAGPを、さらに、ファルマシア（Pharm acia）HR 10/10カラムの中に詰めたマクロープレップDEAE（バイオラド社（BioR ad））陰イオン交換媒体を用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによっ て精製する。AGPは、100〜500mMのKClの直線的な濃度勾配で溶出され、典型的に は、ほぼ300Mの塩濃度で溶出する。すべてのクロマトグラフィーステップで、フ ァルマシア（Pharmacia）FPLCシステムを用いる。各精製ステップに関する条件 は、充分に特徴づけられている。加ピロリン酸化分解アッセイによって、精製中 のAGP活性をモニターし、SDS-PAGE、クーマシー染色、および、トウモロコシ胚 乳AGPの大小サブユニットに特異的なポリクローナル抗体を用いたウエスタン解 析によって、精製ステップをモニターする。実施例4−サブユニット相互作用の促進 トウモロコシ胚乳AGPのHS変異体の全く予想外の多面的効果は、熱処理する前 よりも活性が2倍上昇することである。この結果について考えられる説明は、突 然変 異による変化によって、大腸菌の細胞の中にあるSH2とBT2のモノマーとポリマー の比率を変化させてしまったというものである。野生型では、おそらく、全タン パク質の10%しか活性のあるヘテロ四量体型になっていないが、変異株では、こ の比率がずっと高くなっているのであろう。もしポリマーがモノマーよりも熱耐 性が強ければ、変異株の表現型は、これまで観察されてきたようになるであろう 。動力学的解析を用いて、基質、および/またはアロステリックエフェクターに 対する親和性における変化を測定する。 これらの変異体で、モノマー/ポリマーの比率が変化するかもしれないという 考えを調べるために、野生型と選択した変異株におけるモノマーとポリマーの量 を、熱処理する前と後の両方でモニターすることができる。両サブユニットに対 する抗体（Giroux，M．J.,およびHannah，L．C．［1994］Mol．Gen．Genetics 2 43:400〜408）が利用できれば、この方法を実施することができる。このことは 、蔗糖密度勾配超遠心によっても、ゲルクロマトグラフィーによっても調べるこ とができ、どちらの方法が最も効率がよく、信頼できるかを容易に判定できよう 。 高等植物のAGPは、本来のヘテロ四量体構造を形成するためにオリゴマー化す る、よく似てはいるが異なった２つのサブユニットからなっているため、この相 互作用を促進するような突然変異は、この酵素をさらに安定させることができる 。酵母のツー・ハイブリッドシステム（クローンテック・ラボラトリーズ社（CLON TECH Laboratories）、カリフォルニア州パロアルト（Palo Alto））を用いて、 サブユニットの相互作用を評価することができる。コーディング領域を増幅する ための特異的なプライマーを構築することができる。クローニングによって、各 サブユニットが、GAL4 DNA結合ドメイン（pGBT9）、またはGAL4活性化ドメイン （pGAD424）に翻訳融合しやすくなるように、これらのプライマーの5'末端と3' 末端には、ユニークな制限酵素部位が付加されている。ベクターにクローニング されたタンパク質が相互作用すると、DNA結合ドメインと活性化ドメインが、機 能的な転写活性化因子を形成する。次に、これが、GAL4プロモーターの後ろにク ローニングされているレポーター遺伝子lac Zの発現を活性化する。 まず、野生型サブユニットによって条件の特徴を求めることができる。野生型 大小サブユニットのコーディング領域を、pGBT9、およびpGAD424の酵母発現ベク ターの中にクローニングすることができる。考えられるすべての組み合わせを作 出して、試験することができる。Sh2とBt2を含むpGBT9およびpGAD424ベクターを 、同一の酵母菌株に形質転換することができ、トリプトファン（pGBT9）とロイ シン（pGAD424）を欠乏した培地上で増殖させて選抜を行なうことができる。lac Z発現の関数として、サブユニット相互作用を2つの方法で検出することができ る。陽性のコロニーは、B-ガラクトシダーゼフィルターアッセイ法によって目で 見て同定する。このアッセイ法によって、コロニーを、フィルターに結合し、溶 解して、X-gal溶液でインキュベートする。青色のコロニーを示すコロニーを解 析することができる。サブユニットの相互作用は、B-ガラクトシダーゼに特異的 な酵素アッセイ法によって、さらに解析することができる。これによって、この 相互作用を定量することが可能になる。アッセイすれば、サブユニットの相互作 用を促進する変異は、より高レベルのB-ガラクトシダーゼ活性を示すはずである 。実施例5−安定性の一層の促進 単離された大サブユニットの変異体の熱安定特性は多様であり、このことは、 複数の突然変異が起こっていることを示唆している。変異株HS 33とHS 40の配列 を解析によって、変異体の配列は同一ではないことが、どちらの変異体にもヒス チジンからチロシンへの変化が含まれていることが明らかになる。SH2タンパク 質の中に異なったHS変異が同定されているとすれば、これらの変化を積み重ねて 、効率的に一つのタンパク質を作り上げることができる。さらに、小サブユニッ ト内のHS変異を、HS SH2変異体とともに同時発現させて、トウモロコシ胚乳酵素 の安定性をさらに促進することができる。 一つのサブユニット内の複数のHS変異体を容易に組み合わせることができる。 例えば、Sh2のコーディング領域を3つの異なる断片に分割する、別々のユニーク な制限酵素部位を用いることができる。適当ならば、対応する断片で、別の変異 を含む断片をサブクローニングすることによって、変異を組み合わせたものを作 出することができる。もし、2つの変異が近接したところにあるときには、部位 特異的な突然変異誘発を用いて、そのような組み合わせを作り出すことができる 。部位特異的な突然変異を起す方法の一つは、PCR、変異原プライマー、およびD pnI制限酵素の使用を含むものである。プライマーは、5'末端に変異を含むよう に構 築することができ、これを用いて、プルーフリーディングポリメラーゼのVentを 用いてPCR増幅する。次に、増幅されたDNAをDpnIで消化する。大腸菌から単離さ れた親DNAはメチル化されているため、DpnIに対して感受性である。消化されたD NAを、ゲル電気泳動によってサイズ分画し、ライゲーションして、発現ベクター の中にクローニングする。配列解析によって変異を確認し、野生型の小サブユニ ットをもつAC70R1-504菌株に形質転換する。そして、組み合わせ変異体を解析す ることができる。実施例6−熱安定性変異体とRev6の組み合わせ 本発明によれば、熱安定性変異体を、例えば、Rev6変異のような、種子重量の 増加を伴う変異と組み合わせることができる。目標は、安定性の促進を保ちつつ 、Rev6の特徴である所期のリン酸非感受性を維持することである。Rev6/HS二重 突然変異は、本明細書で説明されているようにして構築し、確認することができ る。二重変異体を、野生型の小サブユニットをもつAC70R1-504菌株に形質転換す る。熱安定性が増加したことは、低グルコース培地上におけるグリコーゲン陽性 染色によって容易に同定することができる。Rev6は、この培地で増殖されると染 色しない。まず、リン酸非感受性を維持しているものについて、変異体の組み合 わせすべてを酵素的にスクリーニングすることができ、リン酸非感受性を維持し ている組み合わせのみを、さらに解析する。実施例7−SSS I変異体のクローニング バクテリアの内生的なグリコーゲンシンターゼを欠損するglgA-大腸菌株は、 大腸菌のストックセンターから入手することができる。AGPの発現に現に用いら れているバクテリア発現用ベクターを、SSSを発現させるために用いることがで きる。 例えば、Sh2とBt2で用いられたような（Girouxら、1996、前記）、クローニン グ法の一つは以下のとおりである：プライマーの一つは、ユニークな制限酵素部 位と、転写産物の5'末端を含み、もう一つのプライマーは、ユニークな制限酵素 部位と、調べている遺伝子の翻訳終止コドンの3'側の配列とを含んでいる。これ らをさらに続けてクローニングすると、プラスミドの中に翻訳融合を生じる。こ れらの遺伝子に特異的なプライマーを、まず、登熟中の胚乳から得たポリA+RNA を用いたRT-PCR反応に使用する。 トウモロコシ胚乳SSS Iの発現は、glgA-菌株におけるグリコーゲンシンターゼ 活性の欠失を相補する。相補性は、glgC-菌株においてAGPの発現について行われ たように、ヨウ素染色によって、容易に目で見ることができるはずである。粗抽 出物をさまざまな温度と時間でインキュベートして、SSS Iの熱安定性を判定す ることができる。トウモロコシ胚乳のSSS Iを発現するglgA-菌株を、さまざまな 温度で増殖させて、バクテリアのAGP発現システムにおけるように、温度感受性 か否かを判定することができる。制限する温度が確認されたら、SSS Iクローン を用いて、無作為の突然変異誘発を行なうことができる。SSS Iの変異型をglgA- 菌株に形質転換して、制限温度で増殖させて、制限温度でヨウ素に染色するグリ コーゲンを産生できるかによって、熱安定性変異株を同定することができる。 本明細書で説明されている実施例と具体的態様は、例示のためだけのものであ り、その観点から、さまざまな修正と変更が当業者に対して示唆されており、そ れらは、本出願の意図と範囲に含まれ、また請求の範囲に含まれると理解される べきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＥ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1．野生型AGPポリペプチドに比較して高い熱安定性を示す変異AGPポリペプチ ドをコードするポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変異体。 2．それによってコードされる変異ポリペプチドが、植物のAGPポリペプチドで ある、請求項1記載のポリヌクレオチド。 3．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドの大サブ ユニットにおけるアミノ酸変異を含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。 4．それによってコードされる変異ポリペプチドが、小サブユニットにおける アミノ酸変異を含む、請求項1記載のポリヌクレオチド。 5．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドのアミノ 酸配列の333位のヒスチジン残基を、該ポリペプチドに熱安定性を付与するアミ ノ酸で置換するアミノ酸変異を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。 6．333位の残基に位置するヒスチジンに代わるアミノ酸がチロシンである、請 求項5記載のポリヌクレオチド。 7．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドのアミノ 酸配列の177位のアラニン残基を、該ポリペプチドに熱安定性を付与するアミノ 酸で置換するアミノ酸変異を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。 8．177位の残基に位置するアラニンに代わるアミノ酸がプロリンである、請求 項7記載のポリヌクレオチド。 9．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドのアミノ 酸配列の400位のアスパラギン酸残基を、該ポリペプチドに熱安定性を付与する アミノ酸で置換するアミノ酸変異を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。 10．400位の残基に位置するアスパラギン酸に代わるアミノ酸がヒスチジンで ある、請求項9記載のポリヌクレオチド。 11．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドのアミノ 酸配列の454位のバリン残基を、該ポリペプチドに熱安定性を付与するアミノ酸 で置換するアミノ酸変異を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。 12．454位の残基に位置するバリンに代わるアミノ酸がイソロイシンである、 請求項11記載のポリヌクレオチド。 13．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドのアミノ 酸配列の104位のアルギニン残基を、該ポリペプチドに熱安定性を付与するアミ ノ酸で置換するアミノ酸変異を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。 14．104位の残基に位置するアルギニンに代わるアミノ酸がスレオニンである 、請求項13記載のポリヌクレオチド。 15．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドのアミノ 酸配列の460位のスレオニン残基を、該ポリペプチドに熱安定性を付与するアミ ノ酸で置換するアミノ酸変異を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。 16．460位の残基に位置するスレオニンに代わるアミノ酸がイソロイシンであ る、請求項15記載のポリヌクレオチド。 17．それによってコードされる変異ポリペプチドが、該ポリペプチドのアミノ 酸配列の216位のアルギニン残基を、該ポリペプチドに熱安定性を付与するアミ ノ酸で置換するアミノ酸変異を含む、請求項3記載のポリヌクレオチド。 18．216位の残基に位置するアルギニンに代わるアミノ酸がプロリンである、 請求項17記載のポリヌクレオチド。 19．植物の熱耐性を高めるための方法において、請求項1記載のポリヌクレオ チドを該植物のゲノム中に組込む段階、および該ポリヌクレオチド分子にコード されるタンパク質を発現させる段階を含む方法。 20．植物がトウモロコシ（Zea mays）である、請求項19記載の方法。 21．請求項1記載のポリヌクレオチド分子を発現する植物。 22．トウモロコシ（Zea mays）である、請求項21記載の植物。 23．請求項1記載のポリヌクレオチド分子を組織のゲノム中に含む植物組織。 24．植物の種子がトウモロコシ（Zea mays）によって産生される、請求項23記 載の植物組織。 25．種子である、請求項23記載の植物組織。 26．請求項1のポリヌクレオチドによってコードされる変異AGPポリペプチド。 27．請求項1記載のポリヌクレオチドであって、それによってコードされる変 異ポリペプチドが、該ポリヌクレオチドを発現する植物に種子重量の増加をもた らすアミノ酸変異をさらに含むポリヌクレオチド。