CN1360635A

CN1360635A - 景天庚酮糖－1,7－二磷酸酶在转基因植物中的表达

Info

Publication number: CN1360635A
Application number: CN00809941.3A
Authority: CN
Inventors: R·L·斯陶布; P·W·米勒
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Co; Monsanto Technology LLC
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2002-07-24
Also published as: CA2372123C; MXPA01011672A; AU5014000A; WO2000070062A1; CA2372123A1; BR0011293A; ATE413458T1; EP1175493B1; ZA200109201B; EP1175493A1; DE60040732D1; AR023995A1

Abstract

景天庚酮糖－1,7－二磷酸酶(SBPase)是催化景天庚酮糖－1,7－二磷酸转化生成景天庚酮糖－7－磷酸的反应的酶。该酶位于叶和茎的叶绿体中。提供SBPase在转基因植物中的过量表达,通过特别增加叶淀粉的生物合成能力并一般性地增加蔗糖生产,从而改善作物产量。还提供了该酶的去调节变异体。

Description

景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶在转基因植物中的表达

本申请要求于1999年5月13日申请的美国临时申请序号60/133,964的优先权。

发明领域

本发明涉及在转基因植物中表达景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)，以增加或改善作物生长和发育、产量、活力以及碳同化产物的分配。表达SBPase的转基因植物在植物源器官和库器官(sinkorgan)中的碳同化、碳输出和碳贮藏得到改善，从而导致作物生长、产量和品质改善。

发明背景

遗传工程学的最新进展已经提供了转化植物以使其包含外源(常常称为“异源的”或“异种的”)基因或改良的内源基因的必要工具。在植物中引入这样一个基因将有利地改善植物组织中已经存在的途径或是引入新途径，以改变所需产物的水平、增加代谢效率和/或节省细胞的能量消耗。目前有可能产生这样的植物：所述植物具有独特的、在农学和作物加工上高度重要的生理和生化性状和特征。对于作物改良，尤其有价值的目标是在植物生长和发育、作物产量潜力和稳定性、以及作物品质和组成方面起基本作用的性状。通过遗传修饰作物，获得碳同化的改善、更有效的碳贮藏、和/或碳输出和分配能力增加，可以达到这些改良。

植物、藻类和光合作用细菌的大气碳固定(光合作用)是在这样的生物中支持各种过程的主要能量源。在叶绿体基质中进行的卡尔文循环是高等植物中进行碳同化的主要途径。碳同化产物或者离开卡尔文循环进入蔗糖或淀粉的生物合成，或者继续进行所述循环以再生碳受体分子，即核酮糖-1，5-二磷酸。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶是一种催化分支区中一个基本不可逆反应的酶，在该分支区中中间产物可以离开所述循环，因此该酶可能对于调节在所述循环的再生阶段和蔗糖及淀粉生物合成之间的碳分配是至关重要的。

SBPase没有已知的胞质对应物，并且据报道仅在叶绿体中发现该酶，在叶绿体中该酶将景天庚酮糖-1，7-二磷酸(SBP)去磷酸化，生成景天庚酮糖-7-磷酸和无机磷酸。该酶对SBP具有特异性，并受到其产物和甘油酸(Schimkat等，1990)以及果糖-2，6-二磷酸(Cadet和Meunier，1988b)的抑制。光、还原剂和Mg2+是其活性所必需的(Woodrow，1982；Cadet和Meunier，1988a)。该酶是同源二聚体，其亚基分子量为35-38kDa(Nishizawa和Buchanan，1981；Cadet和Meunier，1988c)。

已经报道：使用反义技术在烟草植物中去除80％以上的SBPase酶活性，导致缺绿症、生长速度降低、以及碳同化水平降低(Harrison等，1998)。还观察到光合系统II的量子效率降低，这导致叶中的糖类含量降低。对糖类状态的分析显示：淀粉水平有变化，而蔗糖水平保持不变。这些结果指出SBPase是糖类代谢中可能的限速步骤。

已经在生化上表征了各种景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶，并且已经从下列生物中克隆了对应的mRNA(cDNA)：藻类(Genbank登记号：X74418；Hahn和Kuck，1994)和一些高等植物如普通小麦(Triticumaestivum)(Genbank登记号X65540；Miles等，1993)、菠菜(Spinaciaoleracea)(Genbank登记号L76556；Martin等，1996)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Genbank登记号S74719；Willingham等，1994)。因此，在转基因植物中过量表达编码SBPase的核酸序列将在所述植物中提供有利的结果，例如碳同化、输出和贮藏得到改善，光合作用能力增强，以及光合作用能力得到扩展。

发明简述

本发明提供了使用编码景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶(SBPase)的结构核酸构建体以改善植物中的碳同化的方法。

为达到上述目的，按照本发明的一个方面，提供了改善植物中碳同化的方法，所述方法包括下列步骤：

(a)在植物的基因组中插入以5’到3’方向包含可操作性连接的下列元件的核酸序列：

(i)在选定植物组织的细胞中起作用的启动子，

(ii)导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列，

(iii)3’非翻译核酸序列，所述序列在植物细胞中起作用，导致转录终止并在RNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸；

(b)获得包含步骤(a)的核酸的转化植物细胞；和

(c)由转化植物细胞再生转化植株，所述转化植株在所述植物细胞中过量表达景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶。

在本发明的另一实施方案中，提供了分离的核酸序列，所述核酸序列包含能够在植物细胞中起作用的启动子、能够导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的有义方向的结构核酸序列、以及能够导致转录终止并在所转录mRNA序列的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸的3’非翻译核酸序列。该核酸序列可以可选地包括内含子、5’非翻译前导序列或其它设计用于增强转录和/或翻译的核酸序列。

在本发明的再一实施方案中，提供了来自一种绿藻Chlorellasorokiniana的编码景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的新型分离的核酸序列。

在本发明的又一实施方案中，提供了编码景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的变异体核酸序列，由此将多肽序列中的半胱氨酸残基以一定方式修饰成为另一氨基酸，以提供不论光存在与否都有活性的酶。

因此，按照本发明，提供了改善植物的源组织中碳同化、贮藏和输出的方法。提供了改善库组织(如根、块茎、种子、茎和鳞茎)中碳积累的其它方法，因此增加各种库组织的大小(更大的根和块茎)，并随之增加产量。这些库组织的碳有效性增加将改善和/或改变所述植物细胞成分的组成(如油、蛋白质、淀粉和蔗糖产量和干物质均匀性(solids uniformity))。本发明的一个目标是通过在植物中引入异源景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶、或通过增加内源形式的所述基因在所述植物中的表达，而在所述植物中过量表达景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶。

通过本发明的目的可以获得各种好处。增加景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶在叶绿体中的表达将增加通过卡尔文循环的碳流量，并潜在地增加在光存在时的大气碳同化。这将导致光合作用效率提高、叶绿体淀粉产量增加(一种叶的碳贮藏形式，在光合作用低或缺乏的时期降解)、以及叶的蔗糖产量增加，从而引起在给定的光周期内可以预期到达库组织和发育中组织的碳输出净增加。这种源能力的增加在作物中是有利的性状，并将导致作物生长、贮藏能力、产量和活力增加。

附图简述

图1显示了克隆载体pMON47205的质粒图谱。

图2显示了克隆载体pMON47207的质粒图谱。

图3显示了克隆载体pMON47208的质粒图谱。

图4显示了植物转化载体pMON10098的质粒图谱。

图5显示了植物转化载体pMON47200的质粒图谱。

图6显示了穿梭载体pMON999的质粒图谱。

图7显示了瞬时转化载体pMON47203的质粒图谱。

图8显示了在用pMON47203转化的玉米原生质体中，SBPase蛋白表达的免疫印迹。

图9显示了一个柱形图，比较了在表达小麦SBPase的玉米原生质体和对照原生质体中的SBPase活性。

图10显示了景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶蛋白的序列比对。

序列描述

SEQ ID NO：1 合成引物

SEQ ID NO：2 合成引物

SEQ ID NO：3 成熟SBPase的DNA序列(没有CTP)

SEQ ID NO：4 合成引物

SEQ ID NO：5 连接引物

SEQ ID NO：6 合成引物

SEQ ID NO：7 连接引物

SEQ ID NO：8 包含CTP的SBPase的DNA序列

SEQ ID NO：9 SBPase的氨基酸序列

SEQ ID NO：10 简并引物

SEQ ID NO：11 基因特异性引物

SEQ ID NO：12 预测的氨基酸序列

SEQ ID NO：13 基因特异性引物

SEQ ID NO：14 嵌套基因特异性引物

SEQ ID NO：15 基因特异性引物

SEQ ID NO：16 基因特异性引物

SEQ ID NO：17 嵌套基因特异性引物

SEQ ID NO：18 基因特异性引物

SEQ ID NO：19 载体特异性引物

SEQ ID NO：20 全长Chlorella sorokiniana SBPase cDNA序列

SEQ ID NO：21 将Chlorella sorokiniana SBPase中的半胱氨酸110和115改变成丝氨酸的诱变引物。

SEQ ID NO：22 变异体cDNA序列，其中Chlorellasorokinana SBPase中的半胱氨酸110和115改变成丝氨酸。

SEQ ID NO：23 预测的Chlorella sorokiniana SBPase的变异体蛋白序列，其中半胱氨酸110和115被改变成丝氨酸。

发明详述

提供下面的定义以帮助本领域技术人员理解本发明的详细描述。

术语“同一性”是指这样的氨基酸序列或核酸序列：当在BestFit程序(Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc.)中用Smith和Waterman(1981)的局部同源性(localhomology)算法进行比较时，它们完全相同。

术语“相似性”是指这样的氨基酸序列：当在BestFit程序(Wisconsin Package Version 10.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc.)中用Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法进行比较时，在考虑保守氨基酸取代的情况下，它们相互匹配。

“C末端区”是指肽链、多肽链或蛋白链中，从所述链中点到带有具有游离羧基的氨基酸的末端的区。

词组“与启动子区异源的核酸或DNA区段”是指编码DNA或核酸区段与它们目前可操作性连接或偶联的启动子在自然界中并不共同存在。

术语“编码DNA’指编码任何本文所讨论的酶的染色体DNA、质粒DNA、cDNA或合成DNA。

术语“基因组”当用于指细菌时，包括细菌宿主细胞内的染色体和质粒。因此，引入细菌宿主细胞的本发明的编码DNA不是整合到染色体上，就是定位在质粒上。术语“基因组”当应用于植物细胞时，不仅包括在细胞核中发现的染色体DNA，还包括在所述细胞的亚细胞成分中发现的细胞器DNA。因此，引入植物细胞的本发明的DNA不是整合进染色体，就是定位在细胞器内。

术语“微生物”指藻类、细菌、真菌和原生动物。

术语“突变蛋白”指肽、多肽或蛋白质的突变形式。

“N末端区”指肽链、多肽链或蛋白链中，从带有游离氨基的氨基酸到所述链中点的区。

“过量表达”是指由引入宿主细胞的DNA编码的多肽或蛋白质表达，其中所述多肽或蛋白质或者在正常情况下在所述宿主细胞中并不存在，或者与由编码所述多肽或蛋白的内源基因正常表达的水平相比，所述多肽或蛋白质在所述宿主细胞中以更高水平存在，

术语“质体”是指一类植物细胞器，其中包括造粉体、叶绿体、色质体、油质体、eoplast、黄化质体、白色体和前质体。这些细胞器能够自我复制，并包含通常所称的“叶绿体基因组”，所述“叶绿体基因组”是环状DNA分子，根据植物物种，其大小从约120kb到约217kb，并且通常包含一个反向重复区。

本发明涉及产生显示植物生长和发育、产量以及活力提高或改善的植物细胞的方法。所述方法利用通过遗传工程整合进植物的细胞基因组的编码sbpase(景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶)基因的DNA序列，并导致SBPase的表达。本发明还设想了这样的植物：所述植物过量表达SBPase并且在植物源器官和库器官中具有改善的碳同化、输出和贮藏，并因此导致生长、产量和品质改善。

外源SBPase的表达改变碳关系的机制起源于源-库关系。叶组织是蔗糖源，假如有由于SBPase表达增加产生的活性而得到的更多的蔗糖，则所述蔗糖被转运到库组织中，这将导致每给定库组织重量的贮藏碳(糖、淀粉等)增加。

产生表达SBPase水平增加的遗传转化植物的方法要求将双链重组DNA分子引入植物细胞的核基因组。所述DNA分子必须(1)包含要引入所述植物细胞的SBPase酶的结构DNA；(2)具有在植物中起作用，调节通过RNA聚合酶以组成性方式或组织特异性方式产生RNA序列的启动子；以及(3)具有3’非翻译区，所述3’非翻译区用来导致转录终止以及在所述RNA的3’末端添加聚腺苷酸化核苷酸。得到的主要RNA分子随后在核中受到加工，这个过程涉及除去内含子序列并在所述mRNA的3’末端添加聚腺苷酸核苷酸。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶

如本文所用，术语“景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶”指催化景天庚酮糖-1，7-二磷酸去磷酸化生成景天庚酮糖-7-磷酸和无机磷酸的酶(E.C.3.1.3.37)。

在本发明DNA构建体中使用的SBPase基因可以是任何SBPase基因。在本领域内已知许多SBPase cDNA序列，包括来自小麦的序列(Raines等，1992)、来自菠菜的序列(Martin等，1996)、来自拟南芥属(Arabidopsis)的序列(Willingham等，1994)以及来自Ralstonia的序列(Yoo和Bowien，1995)。本文提供的例子仅说明SBPase的应用，而不应当以任何方式解释为限制本发明的范围。本领域技术人员将认识到在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以应用各种其它基因，以及可以对本文所描述的基因和方法进行改变。例如，可以利用这样的SBPase：所述SBPase已经从可选的其它生物中选出，或者所述SBPase已经受到修饰而缺乏或改变了正磷酸和甘油酸的酶的反馈抑制。由于SBPase被硫氧还蛋白或DTT激活，因此人们也可以利用诱变来操作所述酶，使其不需还原剂的存在而仍保持激活状态。然后也可以利用这些突变形式来改变植物代谢。糖类的过量产生也可以通过提供更多的碳骨架，达到增加对影响植物的水势胁迫的耐性。提供了改善库组织(如根、块茎、种子、茎和鳞茎)中碳积累的其它方法，由此增加各种库组织的大小(更大的根和块茎)，并随之增加产量。这些库组织的碳有效性增加将改善细胞成分的组成(如油、蛋白质、淀粉和蔗糖产量和干物质均匀性)。因此，可以分离许多不同的编码景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶活性的核酸序列并应用于本发明中。

本文鉴定了来自Chlorella sorokiniana的SBPase cDNA，并且所述cDNA可以有利地连同本发明使用。也可以通过将所述半胱氨酸残基改变为另一种氨基酸如丝氨酸，使该基因对于光去调节。在本发明的范围内，优选任何与所述Chlorella sorokiniana cDNA约85％相同的编码SBPase的cDNA序列，更优选与Chlorella sorokiniana cDNA约90％相同的这样的cDNA序列，最优选与Chlorella sorokiniana cDNA约95％相同的这样的cDNA。此外，任何编码与本文所公开的Chlorellasorokiniana预测的氨基酸序列约85％相似、更优选约90％相似的SBPase的氨基酸序列被认为在本发明范围内。

来自兼性化能自养生物真养产碱菌(Alcaligenes europhus)(目前命名为Ralstonia eutropha)的二磷酸酶基因以及来自藻类Synechococcuslepoliensis的二磷酸酶基因编码在卡尔文循环中具有双重活性(FBPase和SBPase)的蛋白(Yoo和Bowien，1995；Gerbling等，1986)。本领域内的任何技术人员可以使用良好建立的方法，从这些生物或其它生物克隆编码具有SBPase活性的蛋白的基因。如所述在本发明中使用的SBPase基因的来源并不限于上面描述的生物，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。在本发明的一个实施方案中，可以将所述SBPase基因与叶绿体转运肽融合，以使所述SBPase蛋白靶向质体。本领域技术人员也将认识到可以构建各种其它嵌合构建体，所述嵌合构建体利用特定质体转运肽的功能性，将所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶输入所述启动子组织特异性所决定的植物细胞质体。基因构建和修饰

本发明考虑的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶包括任何显示具有催化景天庚酮糖-1，7-二磷酸去磷酸化成为景天庚酮糖-7-磷酸和无机磷酸的能力的氨基酸序列，例如蛋白质、多肽或肽片段。如上文所述，这些可以是从异源来源获得的序列，所述异源来源如藻类、细菌、真菌和原生动物，或者这些可以是内源植物序列，这意味着可以在自然界的植物细胞中发现的任何序列，其中包括天然(固有的)植物序列以及来自植物病毒或植物病原菌的序列。

本领域技术人员将认识到：也可以使用标准技术，如定点诱变或PCR来修饰SBPase酶基因序列，或者可以通过产生合成核酸序列完成所述序列的修饰，并且这些序列仍将被认为是本发明的SBPase酶核酸序列。例如，可以改变密码子中的摆动位置以便所述核酸序列编码相同的氨基酸序列，或者，可以改变密码子以便产生保守性或非保守性氨基酸取代。在任何一种情况下，所述肽或蛋白质都保持所需的酶活性，并且因此被认为是本发明的一部分。

在本发明的一个实施方案中，修饰SBPase核酸序列，将所述氨基酸序列中的半胱氨酸残基改变成为不同的氨基酸，防止在成熟多肽的半胱氨酸残基之间形成二硫键，由此提供了不论光存在与否都有活性的酶，并因此也防止由于氧化作用使天然蛋白失活。例如，在小麦SBPase中，改变在第52位和第57位(数字对应于Raines等(1999)中所述的成熟小麦SBPase)的半胱氨酸残基成为不同的氨基酸如丝氨酸、丙氨酸或甘氨酸，以防止在它们之间形成二硫键。相应地，也可以改变小球藻属(Chlorella)SBPase氨基酸第110位和氨基酸第115位(对应于SEQ ID NO：12中的小球藻属SBPase编号)的半胱氨酸残基，以达到相同效果。

SBPase酶的核酸序列可以是源于基因组DNA、cDNA、mRNA的DNA序列或RNA序列，或者可以全部或部分是合成的。可以通过从合适来源分离基因组DNA，并使用聚合酶链式反应(PCR)扩增和克隆目标序列，从而克隆所述结构基因序列。或者，可以完全合成或部分合成所述基因序列，尤其是当需要提供植物偏倚(plant-preferred)的序列时。因此，可以使用选定植物宿主偏倚的密码子合成全部或部分所需结构基因。植物偏倚的密码子可以如下确定：例如，根据在特定植物宿主物种表达的蛋白中最经常使用的密码子确定。对所述基因序列的其它修饰可能导致活性稍微改变的突变异体。

如有需要，可以改变所述sbpase基因的基因序列而不改变蛋白/氨基酸序列，所述改变的方式使得可以增加表达，并因此甚至更有利地影响转化植物中的糖类含量。在PCT出版物WO 90/10076中陈述了在sbpase基因序列中造成所述改变的优选方式。可以将根据所述文献中陈述的方法合成的基因如下文所述引入植物，并导致所述SBPase酶的表达水平提高。这在单子叶植物如玉米、水稻、小麦、甘蔗和大麦中尤其有用。启动子

在文献中已经描述了在植物细胞中有活性的许多启动子。这些启动子包括胭脂氨酸合酶(NOS)启动子和章鱼氨酸合酶(OCS)启动子(由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的根瘤诱导质粒携带)、花椰菜花叶病毒启动子如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子和35S启动子以及玄参花叶病毒(FMV)35S启动子、来自一种非常丰富的植物多肽即核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光诱导型启动子、以及叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等等。所有这些启动子都已经用于产生在植物中已经表达的各种类型的DNA构建体；参见，例如，PCT出版物WO 84/02913。

在本发明中可以使用已知或已经发现在植物细胞中导致DNA转录的启动子。这样的启动子可以从各种来源如植物和植物病毒得到，这样的启动子包括但不限于增强的CaMV35S启动子和从植物基因如ssRUBISCO基因分离的启动子。优选所述选定的特定启动子应该能够引起充分表达，导致产生有效量的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶以引起所需的碳同化、输出和贮藏增加。本发明的双链DNA分子的表达可以由组成型启动子驱动，从而在所有或大多数植物组织中表达所述DNA分子。此外，还优选在特定植物组织如叶或茎中引起所述sbpase基因的表达，而所选择的启动子应当具有所需的组织和发育特异性。本领域技术人员将认识到诱导所希望的碳同化、输出或贮藏增加所需要的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的量可能根据植物类型而有所不同。因此，可以如下优化启动子功能：选择具有所需组织表达能力和合适启动子强度的启动子，并选择产生所需的景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶活性的转化子或是在靶组织产生所需的糖类代谢的改变的转化子。在异源结构基因在植物中表达方面，这种从转化子库选择的方法是常规使用的，因为在含有同一异源基因的转化子之间由于在所述植物基因组中基因插入位点而有变异(通常称为“位置效应”)。除了已知导致DNA在植物细胞内转录(组成型或组织特异性)的启动子外，可以鉴定其它启动子以用于本发明中：在植物cDNA文库中筛选在靶组织中选择性表达或优先表达的基因，并随后确定启动子区。

为了在植物源组织如叶或茎中表达所述sbpase基因，优选在本发明的双链DNA分子中使用的启动子在这些特定的组织中有增加的表达。为达到这个目的，可以从具有叶特异性或叶增强表达的基因的多种启动子中进行选择。由文献已知的这样的基因的例子有：来自豌豆的叶绿体谷氨酰胺合成酶GS2(Edwards等，1990)、来自小麦的叶绿体果糖-1，6-二磷酸酶(FBPase)(Lloyd等，1991)、来自马铃薯的核光合作用ST-LS1(Stockhaus等，1989)、以及来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的苯丙氨酸脱氨酶(PAL)基因和查耳酮合酶(CHS)基因(Leyva等，1995)。其它在光合活性组织中显示活性的有：分离自美洲落叶松(Larixlaricina)的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(RUBISCO)(Campbell等，1994)；从松树(cab6；Yamamoto等，1994)、小麦(Cab-1；Fejes等，1990)、菠菜(CAB-1；Luebberstedt等，1994)和水稻(cab1R：Luan等，1992)分离的编码PSII叶绿素a/b结合蛋白的cab基因；来自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)(Matsuoka等，1993)；烟草Lhcb1^*2基因(Cerdan等，1997)；拟南芥SUC2蔗糖-H+同向转运蛋白(symporter)基因(Truernit等，1995)；以及从菠菜分离的类囊体膜蛋白(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS；Oelmueller等，1992)。已经研究和在文献中描述了其它叶绿素a/b结合蛋白，例如来自白芥(Sinapis alba；Kretsch等，1995)的LhcB和PsbP。导致SBPase特异性地在茎、叶或这些组织的特定细胞类型中产生的启动子可用于本发明。例如，RbcS维管束鞘特异性启动子就是这样一种组织特异性启动子。因此，可以获得用于玉米、小麦、大麦和水稻的天然启动子并用于本发明，也可从其它生物获得以组成型/组织特异性方式起作用的异源启动子并用于本发明。在C4植物如玉米中的碳代谢比C3植物如烟草中的碳代谢更加特化。在C4植物中，在维管束鞘细胞叶绿体中通过卡尔文循环产生的代谢物必须转运到叶肉细胞的胞质中，在那里进行蔗糖的生物合成。因此，在C4作物的适当细胞类型中进行正确的基因表达需要细胞特异性启动子。例如，RbcS维管束鞘特异性启动子将可以用于在玉米的合适细胞类型中表达SBPase。

为了在仅当植物有光合活性的情况下表达sbpase基因(编码光调节蛋白或经修饰成为有组成型活性的蛋白)，优选在本发明的双链DNA分子中利用的启动子仅在光存在的情况下进行表达。为此目的，可以从多种光调节基因的启动子中进行选择，所述光调节基因包括来自小麦的FBPase(Miles等，1993)、来自玉米的丙酮酸正磷酸二激酶(Sheen，1991)以及来自水稻的叶绿体醛缩酶(Kagaya等，1995)。

由本发明的DNA构建体产生的RNA也可以包含5’非翻译前导序列。该序列可以来自选出以表达所述基因的启动子，并且可以对其进行特异性修饰以增加mRNA的翻译。也可以从病毒RNA、合适的真核基因或合成的基因序列获得5’非翻译区。本发明并不限于如下面实施例展示的构建体，其中所述非翻译区源自伴随所述启动子序列的5’非翻译序列。相反，所述非翻译前导序列可以来自无关的启动子或编码序列。

一般来说，当在启动子序列和结构基因序列之间插入内含子序列，或者可选地在结构编码序列中插入内含子序列以提供中断的编码序列时，将获得在单子叶植物和一些双子叶植物中的最佳表达。这样的内含子序列的例子是在WO 93/19189中描述的HSP 70内含子。聚腺苷酸信号

嵌合植物基因的3’非翻译区包括聚腺苷酸化信号，该信号在植物中起作用，导致在RNA的3’末端添加聚腺苷酸核苷酸。合适的3’区的例子有(1)包含农杆菌属根瘤诱导(Ti)质粒基因如胭脂氨酸合酶(NOS)基因的聚腺苷酸化信号的3’转的但非翻译区，以及(2)植物基因，如大豆贮藏蛋白基因和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO)基因。景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶活性的质体定向表达

在本发明的一个实施方案中，可以将sbpase基因与叶绿体转运肽融合，从而将所述SBPase蛋白导向质体。如下文所用，叶绿体和质体将包括各种形式的质体，其中包括造粉体。许多定位在质体中的蛋白质从核基因作为前体表达，然后由叶绿体转运肽(CTP)靶向质体，所述叶绿体转运肽在输入步骤中被去除。这样的叶绿体蛋白的例子包括核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基(ssRUBISCO，SSU)、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合体蛋白I和集光复合体蛋白II、以及硫氧还蛋白F。所述质体导向序列可以是但不限于在小麦SBPase cDNA中鉴定的天然叶绿体引导肽(CTP)。已经证明：利用具有CTP的蛋白融合物，可以将非质体蛋白靶向叶绿体，并且CTP序列足以将蛋白靶向质体。本领域技术人员也将认识到可以构建各种其它嵌合构建体，所述嵌合构建体利用特定质体转运肽的功能，将所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶输入所述启动子组织特异性所决定的植物细胞质体。与其它转基因的组合

可以通过将sbpase与其它有利地影响糖类同化或含量的基因组合，增强sbpase在转基因植物中的效应，所述基因如在PCT出版物WO 96/24679中描述的编码蔗糖磷酸化酶的基因、或ADPGPP基因如大肠杆菌(E.coli)glgC基因和其突变异体glgC16。PCT出版物WO91/19806公开了如何将后面一种基因掺入许多植物物种中以增加淀粉或干物质。另一个可以与sbpase组合以增加碳同化、输出或贮藏的基因是编码蔗糖磷酸合酶(SPS)的基因。PCT出版物WO 92/16631公开了一种这样的基因以及其在转基因植物中的应用。另一个可以与SBPase组合的基因是果糖-1，6-二磷酸醛缩酶。植物转化/再生

在开发本发明的核酸构建体时，一般将所述构建体的各种成分或其片段插入方便的克隆载体中，所述克隆载体如能够在细菌宿主如大肠杆菌中复制的质粒。有许多已经在文献中描述的载体，其中许多载体是市售的。在每一次克隆后，可以分离具有所需插入片段的克隆载体并对其进行进一步的操作，如限制酶切消化、插入新片段或核苷酸、连接、缺失、突变、切除等等，以定制所需序列的成分。一旦完成所述构建体，就可将其转移到合适的载体以按照转化所述宿主细胞的方式进行进一步的操作。

包含sbpase基因的本发明的双链DNA分子可以通过任何合适的方法插入植物基因组。转化植物细胞或组织的优选方法是农杆菌属介导的转化法以及基因枪(biolistics)或粒子枪介导的转化法。用于农杆菌属介导转化的合适植物转化载体包括那些由根癌农杆菌的Ti质粒衍生的转化载体，以及那些如由Herrera-Estrella等(1983)，Bevan(1984)，Klee等(1985)和EPO出版物120,516公开的转化载体。除了衍生自农杆菌属的Ti质粒或毛根诱导(Ri)质粒的植物转化载体外，可以使用其它可选的方法将本发明的DNA构建体插入植物细胞。这样的方法可以包括但不限于，例如，应用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄入的化学药品、通过微粒轰击传递游离DNA、以及使用病毒或花粉的转化。

适于在单子叶植物中使用电穿孔或粒子枪介导转化引入sbpase基因的质粒表达载体包括如下成分：组成型或组织特异性的启动子；提供剪接位点以利于所述基因表达的内含子，如Hsp70内含子(PCT出版物WO 93/19189)；以及3’聚腺苷酸化序列如胭脂氨酸合酶3’序列(NOS 3’；Fraley等，1983)。该表达盒可以装配到适于产生大量DNA的高拷贝复制子中。

用于植物转化的可用的Ti质粒盒载体的一个例子是pMON-17227。PCT出版物WO 92/04449描述了该载体，该载体包含编码赋予草甘膦抗性的酶(命名为CP4)的基因，而所述酶基因对于许多植物是极好的选择标记基因。如所述PCT出版物所述，将该基因与拟南芥属EPSPS叶绿体转运肽(CTP2)融合并从FMV启动子表达。当获得足量的包含景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶基因或eDNA的细胞(或原生质体)时，将所述细胞(或原生质体)再生成为整株植物。所述再生步骤的方法的选择并不是至关重要的，对于来自下列的宿主已经有合适的方法：豆科(Leguminosae)(苜蓿、大豆、三叶草等)、伞形科(Umbelliferae)(胡萝卜、芹菜、欧洲防风)、十字花科(Cruciferae)(甘蓝、萝卜、canola/油菜籽(rapeseed)等)、葫芦科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黄瓜)、禾本科(Gramineae)(小麦、大麦、水稻、玉米等)、茄科(Solanaceae)(马铃薯、烟草、番茄、胡椒)和各种花卉作物(floral crops)如向日葵、和产坚果的树如杏仁、腰果树、胡桃和薄壳山核桃。见，例如，Ammirato等(1984)；Shimamoto等(1989)；Fromm(1990)；Vasil等(1990)；Vasil等(1992)；Hayashimoto(1990)；和Datta等(1990)。

可以通过本发明的实施而增强和/或改善碳同化、增加碳输出和分配的植物包括但不限于：金合欢、苜蓿、aneth、苹果、杏、菊芋、arugula、石刁柏、鳄梨、香蕉、大麦、豆科植物、甜菜、黑刺莓、越桔、嫩茎花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、canola、网纹甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽叶、柑桔类、克莱门氏小柑橘(clementine)、咖啡树、玉米、棉花、黄瓜、黄杉树、茄子、苣荬菜、宽叶苦苣、桉树、茴香、无花果、葫芦、葡萄、葡萄柚、蜜瓜、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭葱、柠檬、椴树、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙、观赏植物、番木瓜、欧芹、豌豆、桃、花生、梨、胡椒、柿、松、菠萝、大蕉、李、石榴、杨、马铃薯、西葫芦、榲桲、辐射松、radiccohio、萝卜、悬钩子、水稻、黑麦、高梁、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、美国枫香、红桔、茶树、烟草、番茄、草坪、藤本植物、西瓜、小麦、薯蓣和绿皮南瓜。

提供下面的实施例以更好地阐述本发明的实施，而下面的实施例不应以任何方式解释为限制本发明的范围。本领域技术人员将认识到，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文所述的方法和基因作出各种修改、截短等等。

实施例实施例1SBPase的cDNA克隆和过量表达以产生抗体

为分离编码成熟SBPase蛋白(不含CTP)的基因区，进行RT-PCR反应。将一微克普通小麦(Triticum aestivum)CV OSLO叶RNA与100pmol随机六聚体引物(BRL/Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)混合或者与100pmol寡聚dT引物(Promega，Madison，WI)混合，在75℃加热5分钟，然后在冰上冷却。使用Superscript II^TM逆转录酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照厂商的方案，进行第一链cDNA合成。将终止的逆转录反应物以1∶7稀释。将三微升稀释的第一链合成产物与下列物质在100μL内混合：100μM每种dNTP，50pmol与所述基因的5’末端具有同源性、设计产生一个NdeI切割位点以用于亚克隆的基因特异性引物(5’-ACATATGTGCGCGATCGGCGA-3’，SEQ ID NO：1)，50pmol与所述基因的3’末端具有同源性的基因特异性引物(5’-GGATCCAGAAGAAGATTATTAGGCG-3’，SEQ ID NO：2)，以及5单位PWO^TM聚合酶(Boehringer，Mannheim，德国)。PCR循环条件如下：95℃，40秒钟；56℃，1分钟；72℃，1分钟30秒(5个循环)随后是95℃，40秒钟；61℃，1分钟；72℃，1分钟30秒(30个循环)。将982bp的SBPase成熟蛋白基因PCR产物经凝胶纯化，克隆进PCR-Blunt克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)以形成pMON47205(图1)，然后将其转化进感受态大肠杆菌细胞。在含有卡那霉素的培养基上选择带有插入片段的克隆，纯化质粒并用BamHI消化，以根据克隆载体中的正确取向进行选择。序列分析揭示：虽然核苷酸序列(SEQ ID NO：3)在两个位置有所不同(残基294从T到C；残基572从C到T)，但预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)从残基73开始与公开的序列(Raines等，1992)相同。选出的质粒用NdeI和BamHI限制性消化，按一定方向克隆，将其置于用NdeI/BamHI线性化的pET 15b细菌表达载体(Novagen，Madison，WI)的IPTG诱导型T7聚合酶启动子控制之下，并转化进DH5α。通过NdeI/BamHI限制酶切分析筛选转化子，选出携带插入片段的克隆，纯化质粒，并将其转化进大肠杆菌BL21(DE3)以用于蛋白表达的目的。

用2mM IPTG诱导用所述pETl5b-SBPase cDNA构建体转化的大肠杆菌BL21(DE3)细胞达2.5小时，然后在SDS-PAGE凝胶上可以见到一条清楚的约38kDa的蛋白带，这条带与二聚体SBPase的亚基多肽链的大小相对应。根据组氨酸残基对固定化镍离子的亲和力，纯化由成熟SBPase表达的蛋白。使用Ni-NTA Superflow树脂(QIAGEN，Valencia，CA)，按照厂商的方案，在变性条件下进行所述纯化。使用标准方法(Antech Company，St.Louis，MO)，将用等体积完全佐剂(Complete Adjuvant)(Sigma，St.Louis，MO)乳化的2mL包含1mg纯化SBPase蛋白的组分接种山羊以产生抗体。免疫前血清显示与SBPase没有反应性。实施例2克隆SBPase cDNA以用于在植物中表达

为克隆编码叶绿体转运肽的SBPase基因区，采用一种快速扩增cDNA末端的改良的锚式PCR程序(Frohman，1990；Jain等，1992)。将八百毫微克总RNA与10ng基因特异性引物(5’-TTCCTCAGAGCACGCGTACTTG-3’，SEQ ID NO：4)混合，加热到75℃达5分钟，然后在冰上冷却。使用Superscript II^TM逆转录酶(BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照供应商的方案，进行第一链的DNA合成。将所述终止的逆转录反应物用一单位核糖核酸酶H在37℃处理20分钟、在95℃处理5分钟，然后在冰上冷却。通过在2,000xg离心通过Ultrafree-MC filterfuge(截止分子量30,000，Millipore，Bedford，MA)而去除多余的引物和dNTP，将保留液在Savant Speedvac(Savant Instruments，Holbrook，NY)中浓缩到15μL。将第一链合成产物与10μL加尾混合物(1X加尾缓冲液[BRL/L/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD]，0.4mM dATP，10单位末端脱氧核苷酸转移酶(deoxytransferase))混合，并在37℃温育10分钟。将所述反应混合物加热到95℃达5分钟，用TE，pH8.0稀释到0.5mL，然后用作cDNA库。在100μL混合物中进行扩增，所述混合物中包含：10μL cDNA库、10μL PWO^TM聚合酶10X缓冲液(BRL/L/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，100μM每种dNTP，25pmol基因特异性引物(SEQID NO：4)、10pmol多聚(dT)连接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3’；SEQ IDNO：5)、以及5单位PWO^TM聚合酶(BRL/L/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循环条件如下：95℃，2分钟；45℃，5分钟；72℃，40分钟(1个循环)随后是95℃，50秒钟；48℃，1分钟；72℃，1分钟(3个循环)。通过乙醇沉淀除去多余引物，纯化PCR产物。将所述沉淀重悬浮于50μL水中，使用新的嵌套基因特异性引物(5’-CATGGGAGTACTCCAACGCCTC-3’，SEQ ID NO：6)和连接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3’，SEQ ID NO：7)进行另一轮扩增。PCR循环条件如下：95℃，40秒钟；58℃，1分钟；72℃，30秒(30个循环)。将约500bp的PCR产物经凝胶纯化，亚克隆进PCR-Blunt克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)形成pMON47207(图2)，然后转化进One Shot Top 10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)以进一步地鉴定特征。序列分析(SEQ ID NO：8)显示，该序列与已公开的序列在9个位置上不同(30，C到T；42，G到C；44，A到G；187，C到A；204，C到G；228，C到G；259，C到T；348，G到C；和351，C到G)，导致三个预测的氨基酸发生变化(30，Arg变为Cys；44，His变为Arg；207，Gln变为Glu)。

为测试小麦SBPase在植物中的表达，用SalI和BamHI分别限制性消化pMON47205(图1)和pMON47207(图2)。将包含编码成熟SBPase和CTP区的序列的片段分别经凝胶纯化并相互连接以形成pMON47208(图3)。用XbaI和BamHI限制性消化pMON47208，将编码SBPase的序列经凝胶纯化并连接进XbaI/BamHI线性化的pMON10098(图4)。最终形成的载体是pMON47200(图5)，该载体带有CaMV E35S启动子、完整SBPase基因的编码序列、NOS 3’非翻译聚腺苷酸化区、以及用于在植物中进行选择的卡那霉素抗性。实施例3玉米原生质体的瞬时表达

为测试小麦SBPase亚基的表达及它们装配成为有活性的酶，构建包含以下元件的载体：CaMV E35S启动子、包括CTP的完整SBPase蛋白的编码序列、NOS 3’终止信号、以及用于在大肠杆菌中进行选择的氨苄青霉素抗性。所述SBPase基因从pMON47200作为XbaI/BamHI片段分离。将所述SBPase基因连接进XbaI/BamHI线性化的pMON999(图6)中带有CaMV E35S、NOS 3’的区，产生pMON47203(图7)。依照Sheen等(1991)的方法，将所述DNA构建体电穿孔进玉米原生质体。实施例4转化玉米原生质体的分析

用pMON47203(SBPase)转化沉淀的原生质体样品，在冰上的0.18mL提取缓冲液(50mM HEPES pH7.5，1mM果糖二磷酸，1mM景天庚酮糖-1，7-二磷酸，10mM MgCl₂，10mM MnCl₂，10mM DTT，1％聚乙烯聚吡咯烷酮，10％甘油和Complete^TM蛋白酶抑制剂(Boehringer，Mannheim，德国))中没有DNA被融解。将每一悬浮物中的细胞涡旋混合均匀并在2,000xg下澄清15分钟。上清液用G25离心柱(The Nest Group，Southboro，MA)脱盐。使用BioRad微量蛋白测定(BioRad，Hercules，CA)，根据厂家的方法，测定所述脱盐蛋白的总蛋白含量。

通过蛋白质印迹分析(图8)测定蛋白表达和大小。通过与山羊抗小麦SBPase抗体的交叉反应性，检测到在用pMON47203转化的原生质体中有比对照原生质体显著更多的蛋白，指示SBPase酶成功地在植物细胞中过量表达。在玉米原生质体中表达的小麦SBPase(pMON47203)的迁移率是约38kDa，与内源小麦叶SBPase的迁移率相同，指示CTP的正确加工。

如下测定SBPase活性：首先水解SBP 10分钟，然后测量磷酸的释放量。通过将含有5μg脱盐蛋白提取物的20μL缓冲液(100mM Tris，8.2，10mM MgCl₂，10mM DTT，1.5mM EDTA，10％甘油)与55μL测定缓冲液(50mM Tris，8.2，10mM MgCl₂，10mM DTT，1.5mM EDTA，0.27mM景天庚酮糖-1，7-二磷酸)混合，起始反应。在室温下温育10分钟后，通过加入30μL 1M高氯酸而终止反应。通过离心去除沉淀的蛋白，在50μL上清液中加入250μL显色剂(1％钼酸铵，1N HCl，0.05％孔雀绿(Itaya和Michio，1966))，通过在660nm处测定吸光度而确定释放的磷酸的量。使用磷酸标准曲线(0.5-10nmol)进行定量。用pMON47203转化的原生质体释放的景天庚酮糖-1，7-二磷酸中的磷酸的量是对照原生质体的释放量的3倍(图9)。

针对用小麦SBPase基因转化的原生质体观察到的高水平活性提供了证据证明蛋白质印迹分析检测到的SBPase蛋白是有功能的。实施例5小麦SBPase在烟草中的表达

为测试过量表达的来自小麦的SBPase在烟草中的效应，制备pMON47200(图5)并用作转化烟草植物的转化载体。根据Horsch等所述方法(1985)，通过农杆菌属介导的转化来转化烟草植物细胞。通过电穿孔将植物转化载体转移进ABI农杆菌属菌株。

产生在生长室内培养的烟草转化体系，首先使用针对小麦表达的SBPase产生的山羊抗体通过蛋白质印迹分析进行筛选，以鉴定表达子。然而，不可能使用梯度SDS-PAGE凝胶或等电聚焦凝胶将这些烟草转化子系中的内源烟草SBPase和转基因小麦SBPase分开。实施例6从Chlorella sorokiniana中克隆SBPase cDNA以在植物中表达

为确定来自Chlorella sorokiniana的编码SBPase蛋白的基因的序列，进行几次RT-PCR反应。将一微克Chlorella sorokiniana RNA与100pmol寡聚dT引物(Promega，Madison，WI)混合，在75℃加热达5分钟，然后在冰上冷却。使用Superscript II^TM逆转录酶(BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照厂商的方案，进行第一链的cDNA合成。将终止的逆转录反应物以1∶7稀释。将二十微升稀释的第一链合成产物与下列物质在100μL内混合：100μM每种dNTP、50pmol与所述基因的5’末端具有同源性的简并引物(5’-GGIACIATHTTYGGIGTITGG-3’，SEQ ID NO：10)、50pmol与所述基因的3’末端具有同源性的基因特异性引物(5’-RTAICKIARIGTRTAYTTYTC-3’，SEQ ID NO：11)、以及5单位Taq聚合酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循环条件如下：95℃，5分钟(1个循环)；随后是95℃，40秒钟；35℃，1分钟；72℃，1分钟(5个循环)；随后是95℃，40秒钟；40℃，1分钟；72℃，1分钟(30个循环)。将比预期大小大250bp的550bp PCR产物用凝胶纯化，克隆进PCR-Blunt克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后转化进感受态大肠杆菌细胞。在含有卡那霉素的培养基上选择带有插入片段的克隆，从所述克隆中纯化质粒。序列分析揭示：该550bpPCR产物的预测氨基酸序列与雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)序列41％相同。雷氏衣藻序列的残基226-251与小球藻属序列有81％相同，衣藻属序列的残基252-287与小球藻属(Chlorella)序列有86％相同，但有一个编码62个小球藻属残基的缺口，推测对应于一个内含子。因此，该片段最有可能从污染的基因组DNA扩增。用所述297bp的编码序列设计用于5’RACE和3’RACE的引物，以鉴定所述基因其余部分的序列。

为克隆所述SBPase的剩余5’序列，使用快速扩增cDNA末端的改良的锚式PCR程序(Frohman，1990；Jain等，1992)。将九百毫微克总Chlorella sorokiniana RNA与20pmol基因特异性引物(5’-GATGGTCTCGGTCTCCTTCACG-3’，SEQ ID NO：13)混合，加热到75℃达5分钟，然后在冰上冷却。使用Thermoscript^TM逆转录酶(BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照供应商的方法，在55℃进行第一链的DNA合成。将所述终止的逆转录反应物用一单位核糖核酸酶H在37℃处理20分钟、在95℃处理5分钟，然后在冰上冷却。通过在2,000xg离心通过Ultrafree-MC filterfuge(截止分子量30,000，Millipore，Bedford，MA)而去除多余的引物和dNTP，将保留液在Savant Speedvac(Savant Instruments，Holbrook，NY)中浓缩到15μL。将第一链合成产物与10μL加尾混合物(1X加尾缓冲液[BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD]，0.4mM dATP，10单位末端脱氧核苷酸转移酶)混合，并在37℃温育10分钟。将所述反应混合物加热到95℃达5分钟，用10mM Tris，pH8.5稀释到0.2mL，然后用作cDNA库。在100μL混合物中进行扩增，所述混合物中包含：20μL cDNA库、10μL PWO^TM聚合酶10X缓冲液(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)、100μM每种dNTP，25pmol基因特异性引物(SEQID NO：13)、10pmol多聚(dT)连接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3’；SEQ IDNO：5)、以及5单位PWO^TM聚合酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循环条件如下：95℃，2分钟；45℃，5分钟；72℃，40分钟(1个循环)随后是95℃，50秒钟；48℃，1分钟；72℃，1分钟(3个循环)。通过乙醇沉淀除去多余引物，纯化PCR产物。将所述沉淀重悬浮于50μL水中，并且在100μl中与下列物质混合：10μl PWO^TM聚合酶10X缓冲液(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)、50μM每种dNTP、50pmol新的嵌套基因特异性引物(5’-CAGCCACTTGCCATCGTC-3’，SEQ ID NO：14)、50pmol连接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3’，SEQ ID NO：7)、5单位PWO^TM聚合酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)。PCR循环条件如下：95℃，40秒钟；48℃，1分钟；72℃，1分钟30秒(30个循环)。将400bp的PCR产物经凝胶纯化，亚克隆进PCR-BluntTOPO II克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后转化进感受态大肠杆菌细胞以进一步地鉴定特征。序列分析显示：该PCR片段是所述Chlorella sorokiniana SBPase的部分5’序列。

然后使用该序列设计其它引物，使用改良的锚式PCR程序快速扩增cDNA末端(Frohman，1990；Jain等，1992)，以克隆所述SBPase的其余5’序列。将九百毫微克总RNA与20pmol基因特异性引物(5’-GATGGTCTCGGTCTCCTTCACG-3’，SEQ ID NO：15)混合，加热到75℃达5分钟，然后在冰上冷却。使用Thermoscript^TM逆转录酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照供应商的方法，在55℃进行第一链的DNA合成。将所述终止的逆转录反应物用一单位核糖核酸酶H在37℃处理20分钟、在95℃处理5分钟，然后在冰上冷却。通过在2,000xg离心通过Ultrafree-MC filterfuge(截止分子量30,000，Millipore，Bedford，MA)，去除多余的引物和dNTP，将保留液在Savant Speedvac(Savant Instruments，Holbrook，NY)中浓缩到15μL。将第一链合成产物与10μL加尾混合物(1X加尾缓冲液[BRL/LifeTechnologies Inc，Gaithersburg，MD]，0.4mM dATP，10单位末端脱氧核苷酸转移酶)混合，并在37℃温育10分钟。将所述反应混合物加热到95℃达5分钟，用TE，pH8.0稀释到0.2mL，并用作cDNA库。在100μL混合物中进行扩增，所述混合物中包含：20μL所述cDNA库、10μL HotStarTaq^TM聚合酶10X缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)、20μl的Q 5X缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)、50μM每种dNTP、25pmol基因特异性引物(5’-TCCTCAGAGCACGCCAGCTIGC-3’，SEQ IDNO：16)、10pmol多聚(dT)连接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAATTCGTGGATCC(T)21-3’；SEQ IDNO：5)、以及5单位HotStarTaq^TM聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)。PCR循环条件如下：95℃，15分钟；45℃，5分钟；72℃，40分钟(1个循环)随后是95℃，50秒钟；48℃，1分钟；72℃，1分钟(3个循环)。通过乙醇沉淀除去多余引物，纯化PCR产物。将所述沉淀重悬浮于50μL水中，并且与下列物质混合：10μL HotStarTaq^TM聚合酶10X缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)，20μl的Q 5X缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)、50μM每种dNTP、50pmol新的嵌套基因特异性引物(5’-AGCTGCTCATCGCCGAACGAGTTG-3’，SEQ ID NO：17)、50pmol连接引物(5’-GGGTCGACATTCTAGACAGAA-3’，SEQ ID NO：7)、和5单位HotStarTaq^TM聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)。PCR循环条件如下：95℃，15分钟(1个循环)；随后是95℃，40秒钟；50℃，1分钟；72℃，1分钟30秒(30个循环)。将380 bp的PCR产物经凝胶纯化，亚克隆进PCR-Blunt TOPO II克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)，然后转化进感受态大肠杆菌细胞以进一步地鉴定特征。序列分析显示：该PCR片段包含所述小球藻属SBPase的其余5’序列。

使用PCR从Chlorella sorokiniana cDNA文库分离所述SBPase的其余3’序列，其中所述cDNA库使用针对cDNA合成和质粒克隆的Superscript^TM质粒系统(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)按照供应商的方法在pSport1中构建。将一微克Chlorella sorokinianaRNA与100pmol寡聚dT引物(Promega，Madison，WI)混合，在75℃加热5分钟，然后在冰上冷却。不使用随所述试剂盒提供的Superscript^TM逆转录酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，而使用Thermoscript^TM逆转录酶(BRL/Life Technologies Inc，Gaithersburg，MD)，按照厂商的方案，在60℃进行第一链的cDNA合成。在100μL的混合物内进行扩增，所述混合物包括：200ng文库DNA、10μL HotStarTaq^TM聚合酶10X缓冲液(Qiagen，Valencia，CA)、50μM每种dNTP、50pmol基因特异性引物(5’-AGTTCCTGCTGCAGGACGATGG-3’，SEQ ID NO：18)、50pmol载体特异性引物(5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’，SEQ ID NO：19)、和5单位HotStarTaq^TM聚合酶(Qiagen，Valencia，CA)。PCR循环条件如下：95℃，15分钟(1个循环)；随后是95℃，40秒钟；62℃，1分钟；72℃，1分钟30秒(30个循环)。装配重叠的5’序列和3’序列，得到具有预测氨基酸序列(SEQ ID NO：12)的全长Chlorellasorokiniana SBPase序列(SEQ ID NO：20)。

表1.Chlorella sorokiniana SBPase来源的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)与已知SBPase氨基酸序列的比较。使用Bestfit程序进行序列比较，以确定在下表中的同源性百分率。BestFit程序使用Smith和Waterman(1981)的局部同源性算法找出两个序列间最具有相似性的区段(the best segment of similarity)。

相似性同一性拟南芥 76.7％ 71.6％雷氏衣藻 82.0％ 78.0％菠菜 74.3％ 68.4％普通小麦 72.0％ 66.8％实施例7克隆编码FBPase和SBPase两种活性的基因

来自兼性化能自养生物Ralstonia eutropha(真养产碱菌)和来自藻类Synechococcus lepoliensis的二磷酸酶基因编码在卡尔文循环中具有两种活性，即FBPase和SBPase的蛋白(Yoo和Bowien，1995；Gerbling等，1986)。可以根据在Yoo和Bowien(1995)中描述的序列，使用PCR从Ralstonia eutropha克隆编码具有SBPase活性的蛋白的基因。然后可以将该基因与叶绿体转运肽融合，以将所述SBPase蛋白靶向质体。实施例8在烟草中表达小球藻属SBPase和Ralstonia SBPase

为测试在烟草中过量表达野生型或去调节的小球藻属SBPase以及Ralstonia SBPase的效用，首先将每个基因克隆进pCR^-Blunt II^TM克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。然后用EcoRI消化每种载体，并将经凝胶纯化的编码每种SBPase的片段分别连接进用EcoRI线性化的pMON10098(图4)。将使用3种载体中的每一种如Horsch等(1985)所述转化烟草植物。通过电穿孔将所述植物转化载体转移进ABI农杆菌属菌株。

产生在生长室中培养的烟草转化子系，首先用针对小麦表达的SBPase产生的山羊抗体通过蛋白质印迹分析进行筛选，鉴定表达子。随后，对于表达野生型小球藻属-SBPase的烟草系、表达去调节小球藻属SBPase的烟草系以及表达Ralstonia SBPase的烟草系，在植物发育的不同阶段取叶的样品，采用蔗糖/D-葡萄糖/D-果糖试剂盒(Boehringer Mannheim，德国)分析叶的非结构性糖类(蔗糖、葡萄糖、以及水解成为葡萄糖的淀粉)的每日变化。

将三十到五十毫克冰冻的烟草叶组织样品在1mL 85℃的水中温育15分钟。将离心管在10,000xg离心1分钟，保留上清液以用于可溶性糖分析。将沉淀重悬浮于1mL 85℃的水中，用Vortex混合，并如上所述离心。小心地取出上清，加入到前面所述的上清组分中，用蔗糖/D-葡萄糖/D-果糖试剂盒(Boehringer Mannheim，德国)分析可溶性糖(蔗糖和葡萄糖)。

通过在所述沉淀中加入3mL 0.1M乙酸钠，pH5.6并在90℃温育10分钟，从所述沉淀中提取淀粉。一旦冷却后，加入3mL 0.1M乙酸钠，pH5.6中的1％淀粉葡糖苷酶并涡旋混合。所述样品在50℃水浴中温育3小时，每半小时涡旋混合一次。在一台台式离心机中以900xg离心30分钟后，分析上清液中的葡萄糖含量。将游离的葡萄糖换算(adjust)成为无水葡萄糖(当在淀粉中计算该值时，需要乘以比率162/182)。

可以使用标准HPLC、质谱和基于酶促反应的代谢物测定，通过代谢分布型分析(metabolic profiling)，监测在转基因植物组织中的碳同化的变化。实施例9SBPase的去调节

在黑暗中，小麦SBPase由于在Cys-52和Cys-57(编号对应于成熟小麦SBPase，CARaines等，1999.J.Exp.Bot.50：1-8)之间形成二硫键而失活。在光照下，硫氧还蛋白还原所述二硫键，产生有活性的酶。通过诱变修饰所述Cys残基将防止二硫键的形成，并因此防止该蛋白由于氧化而失活。使用QuikChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla，CA)以及诱变引物(5’-AAGGTGCGCACCGCCTCGTCCGGCGGCACCGCCTCCGTCAACTCGTTCGGCGATG-3’；SEQ ID NO：21)，依照厂家的方法，将Cys-110和Cys-115(编号对应于包括CTP的小球藻属SBPase，SEQ ID NO：12)定点诱变成为Ser。将得到的序列SEQ ID NO：22插入合适的转化载体并用于转化烟草和玉米。测试得到的植株中SBPase在植物组织中的表达，并进行酶促测定以证实活性。分析所述植株，以确定所述植株中碳同化、以及到库组织中的碳输出和碳贮藏得到改善。从DNA序列(SEQ ID NO：22)得到的预测的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：23。

也应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅作说明目的，本领域技术人员会提出按照所述实施例和实施方案的各种修改或改变，这些修改或改变将包括在本申请的精神和范围内，并在本文所附的权利要求书的范围内。

在本说明书中提到的所有出版物和专利申请指出本发明所属领域内技术人员的水平。所有出版物和专利申请都通过引用结合到本文中，其程度同每个出版物或专利申请具体而单独地通过引用结合到本文中的程度一样。

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序列表<110>Miller，Philip W

Staub，Robin L<120>景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶在转基因植物中的表达<130>mobs014-CN<140>n/a<141>2000-05-12<150>60/133,964<151>1999-05-13<160>23<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>1acatatgtgc gcgatcggcg a 21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>2ggatccagaa gaagattatt aggcg 25<210>3<211>966<212>DNA<213>普通小麦(Triticum aestivum)<400> 3atgtgcgcga tcggcgacag cctggaggag ttcctgacca aggcgacgcc ggacaagaac 60ctcatcaggc tgctgatctg catgggggag gcgatgagga cgatcgcctt caaggtccgg 120acggcctcct gcggcggcac ggcctgcgtc aactccttcg gcgacgagca gctcgccgtc 180gacatgctcg ccgacaagct cctcttcgag gcgttggagt actcccatgt gtgcaagtac 240gcgtgctctg aggaagtccc cgagctgcag gacatgggtg gcccggtcga aggtggattc 300agtgtggcgt tcgaccccct tgacggctcc agcatcgtgg acaccaactt caccgtggga 360accatcttcg gcgtctggcc cggcgacaag ctgaccggcg tcaccggcgg tgaccaggtt 420gctgccgcca tgggcatcta cggccctcgc accaccttcg tagttgccct caaggactgc 480cccgggacac acgaattcct tctcctcgac gaaggtaaat ggcagcatgt caaggacacc 540acgagcatcg gagaagggaa gatgttctcc cctggcaatc tgagggccac gttcgacaac 600cctgattatg acaagcttgt caactactat gtgaaggaga agtacactct gcgttacacc 660ggaggaatgg tccctgatgt caaccagatc atcgtgaagg agaagggcat cttcacgaac 720gtgacgtcgc cgacggcgaa ggcgaagctg cggctgctgt tcgaggtggc gccgctgggg 780ttcttgatag agaaggccgg cgggcacagc agcgacggca agcagtcggt gctggacaag 840gtgatctccg tcctggacga gcggacccag gtggcctacg gctccaagaa cgagatcatc 900cgcttcgagg agaccctcta cggctcctcc agactcgccg ccagcgccac cgtcggcgcc 960accgcc 966<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>4ttcctcagag cacgcgtact tg 22<210>5<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：连接引物<400>5gggtcgacat tctagacaga attcgtggat cctttttttt tttttttttt ttt 53<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>6catgggagta ctccaacgcc tc 22<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：连接引物<400>7gggtcgacat tctagacaga a 21<210>8<211>1208<212>DNA<213>普通小麦(Triticum aestivum)<400>8tctagagcag caatggagac cgtcgcggct gccggctacg cccgcggggc cgccacgcgc 60tccccggcgt gctgcgccgc catgtccttc tcgcagtcct acaggcccaa ggctgccagg 120ccggcgacct cgttctacgg cgagtcgctg cgggcgaaca cggcgaggac gtcgttcccg 180gcggggaggc agtccaaggc ggcgagccgg gcggcgctca ccacccggtg cgcgatcggc 240gacagcctgg aggagttctt gaccaaggcg acgccggaca agaacctcat caggctgctg 300atctgcatgg gggaggcgat gaggacgatc gccttcaagg tccggaccgc gtcctgcggc 360ggcacggcct gcgtcaactc cttcggcgac gagcagctcg ccgtcgacat gctcgccgac 420aagctcctct tcgaggcgtt ggagtactcc catgtgtgca agtacgcgtg ctctgaggaa 480gtccccgagc tgcaggacat gggtggcccg gtcgaaggcg gattcagtgt ggcgttcgac 540ccccttgacg gctccagcat cgtggacacc aacttcaccg tgggaaccat cttcggcgtc 600tggcccggcg acaagctgac cggcgtcacc ggcggtgacc aggttgctgc cgccatgggc 660atctacggcc ctcgcaccac cttcgtagtt gccctcaagg actgccccgg gacacacgaa 720ttccttctcc tcgacgaagg taaatggcag catgtcaagg acaccacgag catcggagaa 780gggaagatgt tctcccttgg caatctgagg gccacgttcg acaaccctga ttatgacaag 840cttgtcaact actatgtgaa ggagaagtac actctgcgtt acaccggagg aatggtccct 900gatgtcaacc agatcatcgt gaaggagaag ggcatcttca cgaacgtgac gtcgccgacg 960gcgaaggcga agctgcggct gctgttcgag gtggcgccgc tggggttctt gatagagaag 1020gccggcgggc acagcagcga cggcaagcag tcggtgctgg acaaggtgat ctccgtcctg 1080gacgagcgga cccaggtggc ctacggctcc aagaacgaga tcatccgctt cgaggagacc 1140ctctacggct cctccagact cgccgccagc gccaccgtcg gcgccaccgc ctaataatct 1200ttcttctg 1208<210>9<211>322<212>PRT<213>普通小麦(Triticum aestivum)<400>9Met Cys Ala Ile Gly Asp Ser Leu Glu Glu Phe Leu Thr Lys Ala Thr1 5 10 15Pro Asp Lys Asn Leu Ile Arg Leu Leu Ile Cys Met Gly Glu Ala Met

20 25 30Arg Thr Ile Ala Phe Lys Val Arg Thr Ala Ser Cys Gly Gly Thr Ala

35 40 45Cys Val Asn Ser Phe Gly Asp Glu Gln Leu Ala Val Asp Met Leu Ala

50 55 60Asp Lys Leu Leu Phe Glu Ala Leu Glu Tyr Ser His Val Cys Lys Tyr65 70 75 80Ala Cys Ser Glu Glu Val Pro Glu Leu Gln Asp Met Gly Gly Pro Val

85 90 95Glu Gly Gly Phe Ser Val Ala Phe Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ser Ile

100 105 110Val Asp Thr Asn Phe Thr Val Gly Thr Ile Phe Gly Val Trp Pro Gly

115 120 125Asp Lys Leu Thr Gly Val Thr Gly Gly Asp Gln Val Ala Ala Ala Met

130 135 140Gly Ile Tyr Gly Pro Arg Thr Thr Phe Val Val Ala Leu Lys Asp Cys145 150 155 160Pro Gly Thr His Glu Phe Leu Leu Leu Asp Glu Gly Lys Trp Gln His

165 170 175Val Lys Asp Thr Thr Ser Ile Gly Glu Gly Lys Met Phe Ser Pro Gly

180 185 190Asn Leu Arg Ala Thr Phe Asp Asn Pro Asp Tyr Asp Lys Leu Val Asn

195 200 205Tyr Tyr Val Lys Glu Lys Tyr Thr Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Met Val

210 215 220Pro Asp Val Asn Gln Ile Ile Val Lys Glu Lys Gly Ile Phe Thr Asn225 230 235 240Val Thr Ser Pro Thr Ala Lys Ala Lys Leu Arg Leu Leu Phe Glu Val

245 250 255Ala Pro Leu Gly Phe Leu Ile Glu Lys Ala Gly Gly His Ser Ser Asp

260 265 270Gly Lys Gln Ser Val Leu Asp Lys Val Ile Ser Val Leu Asp Glu Arg

275 280 285Thr Gln Val Ala Tyr Gly Ser Lys Asn Glu Ile Ile Arg Phe Glu Glu

290 295 300Thr Leu Tyr Gly Ser Ser Arg Leu Ala Ala Ser Ala Thr Val Gly Ala305 310 315 320Thr Ala<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：简并引物<400>10ggacathtty gggttgg 17<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>11rtackargtr tayttytc 18<210>12<211>382<212>PRT<213>Chlorella sorokiniana<400>12Met Gln Ala Thr Ala Val Ala Thr Ala Ala Pro Ala Ala Arg Val Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Lys Ala Ala Thr Gly Val Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala

20 25 30Val Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ser Ser Phe Ala Thr Gly Ala

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275 280 285Val Phe Gln Ile Ile Val Lys Glu Lys Gly Val Phe Thr Asn Val Ile

290 295 300Ser Pro Ser Thr Lys Ala Lys Leu Arg Leu Leu Phe Glu Val Ala Pro305 310 315 320Leu Ala Leu Leu Val Glu Lys Ala Gly Gly Ala Ser Ser Cys Asp Gly

325 330 335Leu Cys Val Ser Gly Leu Asp Val Glu Val Lys Gln His Asp Gln Arg

340 345 350Thr Gln Ile Cys Tyr Gly Ser Lys Gly Glu Val Arg Arg Phe Glu Glu

355 360 365Tyr Met Tyr Gly Asn Ser Pro Arg Phe Ser Glu Val Thr Ala

370 375 380<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>13gatggtctcg gtctccttca cg 22<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>14cagccacttg ccatcgtc 18<210>15<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>15gatggtctcg gtctccttca cg 22<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>16tcctcagagc acgccagctt gc 22<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>17agctgctcat cgccgaacga gttg 24<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>18agttcctgct gcaggacgat gg 22<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>19cccagtcacg acgttgtaaa acg 23<210>20<211>1460<212>DNA<213>Chlorella sorokiniana<400>20gccggttgat cctcgagctc caaggcactc gggcacgatg caggccaccg ctgtcgccac 60cgccgcccct gcggcccgcg tcgccaccac tggcaaggcc gccaccggcg tcaaggccgc 120cccccgcgtg gccgtgcgcg ccgccggcgc cagcgccagc agcagctttg ccaccggcgc 180ccgcctgagc gccaaggcca gccgcaccgc cgcccgccgc gccgccgtgg ccgcccaggc 240caagatcggc gacacgctgg aggagttcct gctggaggcc acccccgacc ccaagctgcg 300ccagctcatg atgtccatgt ccgaggccat ccgcaccatc gcctacaagg tgcgcaccgc 360ctcgtgcggc ggcaccgcct gcgtcaactc gttcggcgat gagcagctgg ccgtcgacct 420gctggccgac aagctgctgt tcgaggccct caagtactct ggctgttgca agctggcgtg 480ctctgaggag gtgcctgagc ccctggacct gggcggcgag ggcttctccg tggcatttga 540ccccctggac ggctcctcca tcgtggacac caacttctct gtgggcacga tatttggggt 600gtggcccggc gacaagctga ccggcatcac gggccgccag caggccgccg ccggcatggg 660catctacggc ccccgcaccg tcttctgcat cgccctcaag gacgcccccg gctgccacga 720gttcctgctg caggacgatg gcaagtggct gcacgtgaag gagaccgaga ccatcggcga 780gggcaagatg ttctcccccg gcaacctgcg cgccaccttt gacaaccccg cgtacgagaa 840gctgatcgcc tactacatcg gcgagaagta cacgctgcgc tacaccggcg gcatggtgcc 900cgacgtgttc cagatcatcg tgaaggagaa gggcgtgttc accaacgtca tctccccctc 960caccaaggcc aagctgcgcc tgctgttcga ggtggcgccc ctggccctgc tggttgagaa 1020ggcaggcggc gcctcctcct gcgacggcct gtgcgtgagc ggcctggacg tggaggtcaa 1080gcagcacgac cagcgcaccc agatctgcta tggctccaag ggcgaggtgc ggcggtttga 1140ggagtacatg tacggcaact ccccccgctt ctccgaggtc accgcctaag cggctggtca 1200tcgcctgagc ggctcagtgc tgctgactat gcagccggcg gctgactatg ctggtcttaa 1260cctgagcggc tggccgtcaa acgctggcta gcagcgccgc cccctgagca gcctcggaga 1320ctcccgccgg ctggcctatt caagctggct ggcgccggag ctccgcctgc cctggttgca 1380cccaccattc gcttgctccc ccctccgcgc tttcatcatg tgctttccgc ccgcaacgcc 1440ctgtccaatt cattcattat 1460<210>21<211>55<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成引物<400>21aaggtgcgca ccgcctcgtc cggcggcacc gcctccgtca actcgttcgg cgatg 55<210>22<211>1460<212>DNA<213>Chlorella sorokiniana<400>22gccggttgat cctcgagctc caaggcactc gggcacgatg caggccaccg ctgtcgccac 60cgccgcccct gcggcccgcg tcgccaccac tggcaaggcc gccaccggcg tcaaggccgc 120cccccgcgtg gccgtgcgcg ccgccggcgc cagcgccagc agcagctttg ccaccggcgc 180ccgcctgagc gccaaggcca gccgcaccgc cgcccgccgc gccgccgtgg ccgcccaggc 240caagatcggc gacacgctgg aggagttcct gctggaggcc acccccgacc ccaagctgcg 300ccagctcatg atgtccatgt ccgaggccat ccgcaccatc gcctacaagg tgcgcaccgc 360ctcgtccggc ggcaccgcct ccgtcaactc gttcggcgat gagcagctgg ccgtcgacct 420gctggccgac aagctgctgt tcgaggccct caagtactct ggctgttgca agctggcgtg 480ctctgaggag gtgcctgagc ccctggacct gggcggcgag ggcttctccg tggcatttga 540ccccctggac ggctcctcca tcgtggacac caacttctct gtgggcacga tatttggggt 600gtggcccggc gacaagctga ccggcatcac gggccgccag caggccgccg ccggcatggg 660catctacggc ccccgcaccg tcttctgcat cgccctcaag gacgcccccg gctgccacga 720gttcctgctg caggacgatg gcaagtggct gcacgtgaag gagaccgaga ccatcggcga 780gggcaagatg ttctcccccg gcaacctgcg cgccaccttt gacaaccccg cgtacgagaa 840gctgatcgcc tactacatcg gcgagaagta cacgctgcgc tacaccggcg gcatggtgcc 900cgacgtgttc cagatcatcg tgaaggagaa gggcgtgttc accaacgtca tctccccctc 960caccaaggcc aagctgcgcc tgctgttcga ggtggcgccc ctggccctgc tggttgagaa 1020ggcaggcggc gcctcctcct gcgacggcct gtgcgtgagc ggcctggacg tggaggtcaa 1080gcagcacgac cagcgcaccc agatctgcta tggctccaag ggcgaggtgc ggcggtttga 1140ggagtacatg tacggcaact ccccccgctt ctccgaggtc accgcctaag cggctggtca 1200tcgcctgagc ggctcagtgc tgctgactat gcagccggcg gctgactatg ctggtcttaa 1260cctgagcggc tggccgtcaa acgctggcta gcagcgccgc cccctgagca gcctcggaga 1320ctcccgccgg ctggcctatt caagctggct ggcgccggag ctccgcctgc cctggttgca 1380cccaccattc gcttgctccc ccctccgcgc tttcatcatg tgctttccgc ccgcaacgcc 1440ctgtccaatt cattcattat 1460<210>23<211>381<212>PRT<213>Chlorella sorokiniana<400>23Met Gln Ala Thr Ala Val Ala Thr Ala Ala Pro Ala Ala Arg Val Ala1 5 10 15Thr Thr Gly Lys Ala Ala Thr Gly Val Lys Ala Ala Pro Arg Val Ala

20 25 30Val Arg Ala Ala Gly Ala Ser Ala Ser Ser Ser Phe Ala Thr Gly Ala

35 40 45Arg Leu Ser Ala Lys Ala Ser Arg Thr Ala Ala Arg Arg Ala Ala Val

50 55 60Ala Ala Gln Ala Lys Ile Gly Asp Thr Leu Glu Glu Phe Leu Leu Glu65 70 75 80Ala Thr Pro Asp Pro Lys Leu Arg Gln Leu Met Met Ser Met Ser Glu

85 90 95Ala Ile Arg Thr Ile Ala Tyr Lys Val Arg Thr Ala Ser Ser Gly Gly

100 105 110Thr Ala Ser Val Asn Ser Phe Gly Asp Glu Gln Leu Ala Val Asp Leu

115 120 125Leu Ala Asp Lys Leu Leu Phe Glu Ala Leu Lys Tyr Ser Gly Cys Cys

130 135 140Lys Leu Ala Cys Ser Glu Glu Val Pro Glu Pro Leu Asp Leu Gly Gly145 150 155 160Glu Gly Phe Ser Val Ala Phe Asp Pro Leu Asp Gly Ser Ser Ile Val

165 170 175Asp Thr Asn Phe Ser Val Gly Thr Ile Phe Gly Val Trp Pro Gly Asp

180 185 190Lys Leu Thr Gly Ile Thr Gly Arg Gln Gln Ala Ala Ala Gly Met Gly

195 200 205Ile Tyr Gly Pro Arg Thr Val Phe Cys Ile Ala Leu Lys Asp Ala Pro

210 215 220Gly Cys His Glu Phe Gln Asp Asp Gly Lys Trp Leu His Val Lys Glu225 230 235 240Thr Glu Thr Ile Gly Glu Gly Lys Met Phe Ser Pro Gly Asn Leu Arg

245 250 255Ala Thr Phe Asp Asn Pro Ala Tyr Glu Lys Leu Ile Ala Tyr Tyr Ile

260 265 270Gly Glu Lys Tyr Thr Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Met Val Pro Asp Val

275 280 285Phe Gln Ile Ile Val Lys Glu Lys Gly Val Phe Thr Asn Val Ile Ser

290 295 300Pro Ser Thr Lys Ala Lys Leu Arg Leu Leu Phe Glu Val Ala Pro Leu305 310 315 320Ala Leu Leu Val Glu Lys Ala Gly Gly Ala Ser Ser Cys Asp Gly Leu

325 330 335Cys Val Ser Gly Leu Asp Val Glu Val Lys Gln His Asp Gln Arg Thr

340 345 350Gln Ile Cys Tyr Gly Ser Lys Gly Glu Val Arg Arg Phe Glu Glu Tyr

355 360 365Met Tyr Gly Asn Ser Pro Arg Phe Ser Glu Val Thr Ala

370 375 380

Claims

1.一种改善植物中碳同化的方法，所述方法包括下列步骤：

a)在植物的基因组中插入以5’到3’方向包含下列元件的核酸序列：

i)在所述植物的细胞中起作用的启动子，所述启动子可操作性地连接于；

ii)导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列，所述结构核酸序列可操作性地连接于；

iii)在所述植物的所述细胞中起作用、导致转录终止的3’非翻译核酸序列；

b)获得包含步骤(a)的核酸序列的转化植物细胞；和

c)从所述转化植物细胞再生在所述植物细胞中过量表达所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶的转化植株。

2.权利要求1的方法，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于与所述结构核酸序列所插入的植物异源的来源。

3.权利要求2的方法，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于细菌微生物。

4.权利要求3的方法，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列源于Ralstonia。

5.权利要求2的方法，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于绿藻。

6.权利要求5的方法，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于小球藻属(Chlorella)。

7.权利要求2的方法，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于与所述结构核酸序列所插入的植物异种的植物物种。

8.权利要求1的方法，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列对于所述结构核酸序列所插入的植物是内源序列，并且与未受转化而不包含所述插入的结构核酸序列的植物相比，可操作性地连接所述序列的所述启动子能够以更高水平表达所述插入的内源景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶。

9.权利要求1的方法，其中所述植物是单子叶植物。

10.权利要求1的方法，其中所述植物是双子叶植物。

11.权利要求1的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、水稻、马铃薯、苜蓿、大麦、棉花、大豆、canola、向日葵和甜菜。

12.权利要求1的方法，其中所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶对于光去调节。

13.一种分离的核酸序列，所述核酸序列包括：

(a)在植物细胞中起作用的启动子，所述启动子可操作性地连接于；

(b)导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的有义方向的结构核酸序列，所述结构核酸序列可操作性地连接于；和

(c)在所述植物的所述细胞中起作用、导致转录终止的3’非翻译核酸序列。

14.权利要求13的分离的核酸序列，所述核酸序列还包含内含子。

15.权利要求13的分离的核酸序列，所述核酸序列还包含5’非翻译前导序列。

16.权利要求13的分离的核酸序列，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于细菌微生物。

17.权利要求16的分离的核酸序列，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于Ralstonia。

18.权利要求13的分离的核酸序列，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于绿藻。

19.权利要求18的分离的核酸序列，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于小球藻属。

20.权利要求19的分离的核酸序列，其中所述导致景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶产生的结构核酸序列来源于植物。

21.权利要求13的分离的核酸序列，其中所述景天庚酮糖-1，7-二磷酸酶针对光去调节。

22.一种分离的核酸序列，所述核酸序列包含SEQ ID NO：20的核苷酸序列，或SEQ ID NO：20的简并变异体。

23.一种分离的核酸序列，所述核酸序列包含编码多肽的序列，其中所述多肽具有SEQ ID NO：12的氨基酸序列，或具有包含保守氨基酸取代的SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

24.一种分离的核酸序列，所述核酸序列包含与SEQ ID NO：20至少85％相同的序列。

25.一种分离的核酸序列，所述核酸序列包含编码多肽的序列，其中所述多肽具有与SEQ ID NO：12至少85％相似的氨基酸序列。