CN104903451B

CN104903451B - 改良的酰基转移酶多核苷酸、多肽、及其使用方法

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Publication number: CN104903451B
Application number: CN201380069478.3A
Authority: CN
Inventors: 尼古拉斯·约翰·罗伯茨; 艾米·克里斯蒂安·柯伦; 宋路泰·威尼查亚库; 玛丽萨·罗丹; 理查德·威廉·斯科特; 大卫·查尔斯·泰勒; 伊丽莎白-弗朗斯·马里利亚
Original assignee: National Research Council of Canada; AgResearch Ltd
Current assignee: National Research Council of Canada; AgResearch Ltd
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2013-10-22
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2033-10-22
Also published as: AU2013340445B2; US9896694B2; IN2015DN03964A; PL2914726T3; AR093290A1; NZ706834A; EP2914726B1; CN104903451A; CA2889985A1; EP2914726A4; BR112015009467B1; ES2715327T3; WO2014068439A2; MX354445B; US20150284736A1; AU2013340445A1; WO2014068439A3; CA2889985C; EP2914726A2; BR112015009467A2

Abstract

本发明提供了嵌合体DGAT1蛋白，包括：a)在其N末端处的第一DGAT1蛋白的N端部分，以及b)在其C末端处的第二DGAT1蛋白的C端部分。与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白中至少一者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白示出了增强的活性。本发明的嵌合体DGAT1蛋白可以在细胞中表达从而增加细胞内脂质积聚和/或改变细胞内脂质组成。本发明也提供了编码所述嵌合体DGAT1蛋白的多核苷酸、含有所述多核苷酸或嵌合体DGAT1蛋白的细胞和组合物、以及使用所述嵌合体蛋白制备油的方法。

Description

改良的酰基转移酶多核苷酸、多肽、及其使用方法

技术领域

本发明涉及操纵细胞脂质产生和/或细胞脂质组成的组合物和方法。

背景技术

植物油不仅能广泛用于食品工业以及作为饲料成分的一部分，还广泛地用作生物燃料或用于各种保健食品和工业产品的制备中，因此，植物油是一种经济上重要的产品。在植物自身内部，油是对于进行生长发育(特别是在种子萌发和早期植物生长阶段)至关重要的一系列新陈代谢所必需的。考虑到其价值，生物技术领域对提高植物油产生并使其供应更加可持续的研究兴趣愈加增长。

植物油的主要成分为三酰甘油(TAG)。其为油料种子中储存脂质的主要形式以及种子萌发和幼苗发育所需能量的主要来源。通过Kennedy途径的TAG生物合成包括从前体sn-甘油-3-磷酸(G3P)开始的连续酰基化步骤。首先，G3P在由3-磷酸甘油酰基转移酶(GPAT，EC 2.3.1.15)催化的反应中被乙酰CoA酯化形成溶血磷脂酸(LPA)。然后由溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT；EC 2.3.1.51)催化第二酰基化步骤形成磷脂酸(PA)，其为甘油脂生物合成的关键中间体。然后PA由磷脂酸磷酸酶(PAP；EC3.1.3.4)脱磷酸化释放TAG的中间前体sn-1,2-二酰基甘油(DAG)。最后DAG的sn-3位被二酰基甘油酰基转移酶(DGAT：EC2.3.1.20)酰基化形成TAG。

由于最后的催化作用是TAG生物合成中唯一的特有步骤，DGAT被称为指定用于三酰甘油形成的酶。由于DAG位于TAG和膜磷脂生物合成之间的分支点，DGAT可能在调节甘油脂合成途径中TAG的形成起到了决定性作用(Lung和Weselake,2006,Lipids.Dec2006；41(12):1073-88)。DGAT蛋白有两个不同家族。DGAT蛋白的第一家族(“DGAT1”)与乙酰辅酶A:胆固醇酰基转移酶(“ACAT”)有关，并且在美国申请Nos.6,100,077和6,344,548中有所描述。DGAT蛋白的第二家族(“DGAT2”)与DGAT1无关，并且在2004年2月5日公开的PCT专利公开WO 2004/011671中有描述。DGAT基因及其在植物中的用途的其他参考文献包括PCT公开No.WO2004/011,671、WO1998/055,631和WO2000/001,713，以及US专利公开No.20030115632。

DGAT1通常是种子和衰老叶片中主要的TAG合成酶(Kaup等，2002,PlantPhysiol.129(4):1616-26；综述参见Lung和Weselake 2006,Lipids.；41(12):1073-88；Cahoon等，2007,Current Opinion in Plant Biology.10:236-244；以及Li等，2010,Lipids.45:145-157)。

几十年来，提高油料作物(油菜、向日葵、红花、大豆、玉米、棉花、亚麻子、亚麻等)的产量已经成为农业产业的主要目标。人们已经尝试了许多方法(包括传统育种和突变育种以及遗传工程)，通常收效甚微(Xu等，2008,Plant Biotechnol J.,6:799-818及其参考文献)。

尽管液态型生物燃料提供了很大的前景，但是利用生物原料的现实受到竞争用途和可用量的限制。因此，对植物和微生物进行基因改造以克服上述缺陷成为众多研究小组的重点；特别是三酰甘油(TAG)在植物组织、产油酵母和细菌中的积聚(Fortman等，2008,Trends Biotechnol 26,375-381；Ohlrogge等，2009,Science 324,1019-1020)。TAG是纤维素能量密度的两倍的中性脂质并且能用于生产生物柴油。所述生物柴油是一种具有最简单和最有效的制备工艺中的一者的高能量密度的理想生物燃料。目前已经通过各种策略改造叶子中TAG的积聚使得其积聚量比野生型提高5-20倍，这些策略包括：过表达种子发育转录基因(LEC1、LEC2和WRI1)；APS沉默(涉及淀粉生物合成的关键基因)；CGI-58突变(中性脂质积聚的调节子)；以及在植物也在酵母中上调TAG合成酶DGAT(二酰基甘油-O-酰基转移酶，EC 2.3.1.20)(Andrianov等，2009,Plant Biotech J 8,1-11；Mu等，2008,Plant Physiol148,1042-1054；Sanjaya等，2011,Plant Biotech J 9,874-883；Santos-Mendoza等，2008,Plant J 54,608-620；James等，2010,Proc Natl Acad Sci USA 107,17833–17838；Beopoulos等，2011,Appl Microbiol Biotechnol 90,1193-1206；Bouvier-Navé等，2000,Eur J Biochem 267,85-96；Durrett等，2008,Plant J 54,593-607)。然而，人们普遍认为要进一步提高TAG，抑制其在非产油组织以及一系列发育阶段中的分解代谢可能是至关重要的(Yang和Ohlrogge,2009,Plant Physiol 150,1981–1989)。

在真核生物中上调三酰甘油(TAG)的产量和品质是很难实现的。在Kennedy途径的酶中，二酰基甘油-O-酰基转移酶(DGAT)的比活性最低，并且它被认为是TAG合成中的“瓶颈”。

人们已经试图通过生物技术方法提高DGAT1，但收效甚微。例如Nykiforuk等(2002,Biochimica et Biophysica Acta 1580:95-109)报导了甘蓝型油菜(Brassicanapus)DGAT1的N端截短体，但是报导了大约50％的低活性。McFie等(2010,JBC.,285:37377-37387)报导了小鼠DGAT1的N端截断导致酶的比活性升高，但是也报导了蛋白积聚水平大幅度降低。

近来，Xu等(2008,Plant Biotechnology Journal,6:799-818)在旱金莲(Tropaeolum majus)(园艺旱金莲)DGAT1(TmDGAT1)序列内鉴别出共有序列(X-Leu-X-Lys-X-X-Ser-X-X-X-Val)，作为SNF1相关蛋白激酶-1(SnRK1)的成员特有的靶向基序，其中Ser为用于磷酸化的残基。SnRK1蛋白为一类Ser/Thr蛋白激酶，其已经日益参与到植物的碳代谢的全面调节中，例如通过磷酸化作用使磷酸蔗糖合酶灭活(Halford&Hardie 1998,PlantMol Biol.37:735-48.综述)。Xu等(2008,Plant Biotechnology Journal,6:799-818)在TmDGAT1酶的六个推定的功能区/基序进行了定向位点突变。在推定的SnRK1靶点的丝氨酸残基(S197)的突变使得DGAT1活性提高38％–80％，并且拟南芥(Arabidopsis)中突变使得TmDGAT1的过表达使得油含量以每一种子计增加20-50％。

提供DGAT1的改良形式是有益的，这能够克服现有技术中的一个或多个缺陷，并且也可用于提高细胞内的油产量。

本发明的一个目的在于提供增强的DGAT1蛋白，以及利用它们从而改变细胞脂质产生和细胞脂质组成的至少一者的方法，并且/或是至少为公众提供有益的选择。

发明内容

本发明的发明人已经示出了可以制备相比于用于制备嵌合体DGAT1蛋白的亲代DGAT1分子具有更优良性能的嵌合体DGAT1蛋白。本发明的嵌合体DGAT1蛋白可以在细胞中表达以改变细胞或含有所述细胞的有机体中脂质含量和脂质组成。

编码多肽的多核苷酸

在第一方面，本发明提供了编码嵌合体DGAT1蛋白的分离的多核苷酸，所述嵌合体DGAT1蛋白包括：

a)在其N末端处的第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)在其C末端处的第二DGAT1蛋白的C端部分。

在一个实施方案中，与第一DGAT1蛋白、第二DGAT1蛋白、或第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白这二者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，与第一DGAT1蛋白相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，与第二DGAT1蛋白相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白这二者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分为第一DGAT1蛋白的N端胞质区。在一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端胞质区从第一DGAT1蛋白的N端延伸至第一DGAT1蛋白的乙酰CoA结合域的末尾。在另一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端胞质区为第一跨膜结构域上游的区域。

图3示出了多个DGAT1蛋白的乙酰CoA结合域和第一跨膜结构域的位置。

在一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一跨膜结构域的上游。

在另一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点中。

在另一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点的对应位置。

在另一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点的保守LSS(Leu-Ser-Ser)内。

在一个优选的实施方案中，所述嵌合体DGAT1具有完整的乙酰CoA结合位点。

在一个实施方案中，嵌合体DGAT1内的乙酰CoA结合位点的长度与第一DGAT1蛋白内的乙酰CoA结合位点的长度相同。

在另一个实施方案中，嵌合体DGAT1内的乙酰CoA结合位点的长度与第二DGAT1蛋白内的乙酰CoA结合位点的长度相同。

在一个优选的实施方案中，嵌合体DGAT1内的乙酰CoA结合位点的长度与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白内的乙酰CoA结合位点的长度相同。

在另一个实施方案中，在细胞中表达时，本发明的多肽与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白中至少一者相比底物特异性改变。

构建体

在另一个实施方案中，本发明提供了一种遗传构建体，其包含本发明的多核苷酸。

细胞

在另一个实施方案中，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的多核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种细胞，其包含本发明的遗传构建体。

在一个优选的实施方案中，所述细胞表达嵌合体DGAT1。

在一个实施方案中，在细胞中表达时，与第一DGAT1、第二DGAT1，或第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白这二者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在一个实施方案中，在细胞中表达时，与第一DGAT1蛋白相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在一个实施方案中，在细胞中表达时，与第二DGAT1蛋白相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，在细胞中表达时，与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白这二者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞产生更多的脂质。

在一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞产生至少多5％、优选至少多10％、优选至少多15％、优选至少多20％、优选至少多25％、优选至少多30％、优选至少多35％、优选至少多40％、优选至少多45％、优选至少多50％、优选至少多55％、优选至少多60％、优选至少多65％、优选至少多70％、优选至少多75％、优选至少多80％、优选至少多85％、优选至少多90％、优选至少多95％、优选至少多100％、优选至少多105％、优选至少多110％、优选至少多115％、优选至少多120％、优选至少多125％、优选至少多130％、优选至少多135％、优选至少多140％、优选至少多145％、优选至少多150％的脂质。

在另一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞的脂质组成改变。

在一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞中三酰甘油中16:0的比例改变。

在一个实施方案中，与对照细胞相比，所述细胞中三酰甘油中16:0的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在另一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中16:0的比例在6％至16％的范围内。在该实施方案中，三酰甘油中16:0的比例的改变在6％至16％的范围内。

在另一个实施方案中，相比于对照细胞，所述细胞中三酰甘油中18:0的比例改变。

在一个实施方案中，相比于对照细胞，所述细胞中三酰甘油中18:0的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在另一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中18:0的比例在7％至15％的范围内。在该实施方案中，三酰甘油中18:0的比例的改变在7％至15％的范围内。

在另一个实施方案中，相比于对照细胞，所述细胞中三酰甘油中18:1的比例改变。

在一个实施方案中，相比于对照细胞，所述细胞中三酰甘油中18:1的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在另一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中18:1的比例在39％至55％的范围内。在该实施方案中，三酰甘油中18:1的比例的改变在39％至55％的范围内。

对照细胞可以为未用本发明的多核苷酸或构建体转化以表达嵌合体DGAT1的相同类型的任意细胞。

在一个实施方案中，所述对照细胞为未转化细胞。在另一个实施方案中，所述对照细胞为表达第一DGAT1的转化细胞。在另一个实施方案中，所述对照细胞为表达第二DGAT1的转化细胞。

细胞也被转化以表达油质蛋白

在一个实施方案中，所述细胞也被转化以表达以下至少一者：油质蛋白、油体固醇蛋白、油体钙蛋白、聚油质蛋白、以及包括至少一个人工引入的半胱氨酸的油质蛋白(WO2011/053169)。

植物

在另一个实施方案中，本发明提供了一种植物，其包含本发明的多核苷酸。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种植物，其包含本发明的遗传构建体。

在一个优选的实施方案中，所述植物表达嵌合体DGAT1。

在一个实施方案中，在植物中表达时，与所述第一DGAT1、所述第二DGAT1或所述第一DGAT1和所述第二DGAT1这两者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内蛋白积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在一个实施方案中，在植物中表达时，与第一DGAT1相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内蛋白积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在一个实施方案中，在植物中表达时，与第二DGAT1相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内蛋白积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在一个实施方案中，在植物中表达时，与第一DGAT1和第二DGAT1这两者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内蛋白积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内蛋白积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，与对照植物中的相应组织或其部分相比，所述植物在其组织或其部分的至少一者中产生更多的脂质。

在一个实施方案中，与对照细胞相比，所述植物产生至少多5％、优选至少多10％、优选至少多15％、优选至少多20％、优选至少多25％、优选至少多30％、优选至少多35％、优选至少多40％、优选至少多45％、优选至少多50％、优选至少多55％、优选至少多60％、优选至少多65％、优选至少多70％、优选至少多75％、优选至少多80％、优选至少多85％、优选至少多90％、优选至少多95％、优选至少多100％、优选至少多105％、优选至少多110％、优选至少多115％、优选至少多120％、优选至少多125％、优选至少多130％、优选至少多135％、优选至少多140％、优选至少多145％、优选至少多150％的脂质。

在一个实施方案中，所述组织为营养组织。在一个实施方案中，所述部分为叶。在一个实施方案中，所述部分为根。在另一个实施方案中，所述部分为块茎。在另一个实施方案中，所述部分为球茎。在另一个实施方案中，所述部分为柄。在另一个实施方案中，所述部分为单子叶植物的柄。在另一个实施方案中，所述部分为秸秆(柄和叶片)。

在一个优选的实施方案中，所述组织为种子组织。在一个优选的实施方案中，所述部分为种子。在一个优选的实施方案中，所述组织为胚乳组织。

在另一个实施方案中，所述植物整体比对照植物整体产生更多的脂质。

在另一个实施方案中，与对照植物相比，所述植物在其组织或其部分的至少一者中脂质改变。

在一个实施方案中，与对照植物相比，三酰甘油中16:0的比例改变。

在一个实施方案中，与对照细胞相比，三酰甘油中16:0的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中16:0的比例在6％至16％的范围内。在该实施方案中，三酰甘油中16:0的比例的改变在6％至16％的范围内。

在另一个实施方案中，与对照植物相比，三酰甘油中18:0的比例改变。

在一个实施方案中，与对照细胞相比，三酰甘油中18:0的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中18:0的比例在7％至15％的范围内。在该实施方案中，三酰甘油中18:0的比例的改变在7％至15％的范围内。

在另一个实施方案中，与对照植物相比，三酰甘油中18:1的比例改变。

在一个实施方案中，与对照细胞相比，三酰甘油中18:1的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在一个实施方案中，改变的脂质组成中三酰甘油中18:1的比例在39％至55％的范围内。在该实施方案中，三酰甘油中18:1的比例的改变在39％至55％的范围内。

对照植物可以为未用本发明的多核苷酸或构建体转化以表达嵌合体DGAT1的相同类型的任意植物。

在一个实施方案中，所述对照植物为未转化植物。在另一个实施方案中，所述对照植物为表达第一DGAT1的转化植物。在另一个实施方案中，所述对照植物为表达第二DGAT1的转化植物。

植物也被转化以表达油质蛋白

在一个实施方案中，所述植物也被转化以表达以下至少一者：油质蛋白、油体固醇蛋白、油体钙蛋白、聚油质蛋白、以及包括至少一个人工引入的半胱氨酸的油质蛋白(WO2011/053169)。

多肽

在另一个方面，本发明提供了嵌合体DGAT1蛋白，包括：

a)其N末端处的第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)其C末端处的第二DGAT1蛋白的C端部分。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点。

在另一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点中的对应位置。

在一个实施方案中，第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点的保守LSS(Leu-Ser-Ser)内。

嵌合体DGAT1的制备方法

在另一个方面，本发明提供了一种制备嵌合体DGAT1的方法，该方法包括组合：

a)第一DGAT1蛋白的N端部分，和

b)第二DGAT1蛋白的C端部分。

在一个优选的实施方案中，嵌合体DGAT1包括：

a)其N末端处的第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)其C末端处的第二DGAT1蛋白的C端部分。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，所述方法包括检测所述嵌合体DGAT1蛋白的以下至少一者：

i)活性，

ii)稳定性，

iii)低聚性，

iv)细胞内蛋白积聚性，

v)细胞内定位性。

在另一个实施方案中，所述方法包括选择与第一DGAT1蛋白、第二DGAT1蛋白、或第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白这二者相比，具有以下至少一者的嵌合体DGAT1蛋白的步骤：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，所述方法包括选择与第一DGAT1蛋白相比具有以下至少一者的嵌合体DGAT1蛋白的步骤：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，所述方法包括选择与第二DGAT1蛋白相比，具有以下至少一者的嵌合体DGAT1蛋白的步骤：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

在另一个实施方案中，所述方法包括选择与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白这二者相比，具有以下至少一者的嵌合体DGAT1蛋白的步骤：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)大体上正常的细胞内积聚性；以及

v)大体上正常的细胞内定位性。

植物部分

在另一个实施方案中，本发明提供了本发明植物的部分、繁殖体或子代。

在一个优选的实施方案中，所述部分、繁殖体或子代包含本发明的多核苷酸、构建体或多肽中的至少一者。

在一个优选的实施方案中，所述部分、繁殖体或子代表达本发明的多核苷酸、构建体或多肽中的至少一者。

在一个优选的实施方案中，所述部分、繁殖体或子代表达本发明的嵌合体DGAT1蛋白。

在另一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，所述部分、繁殖体或子代产生更多的脂质。

在一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，所述部分、繁殖体或子代产生至少多5％、优选至少多10％、优选至少多15％、优选至少多20％、优选至少多25％、优选至少多30％、优选至少多35％、优选至少多40％、优选至少多45％、优选至少多50％、优选至少多55％、优选至少多60％、优选至少多65％、优选至少多70％、优选至少多75％、优选至少多80％、优选至少多85％、优选至少多90％、优选至少多95％、优选至少多100％、优选至少多105％、优选至少多110％、优选至少多115％、优选至少多120％、优选至少多125％、优选至少多130％、优选至少多135％、优选至少多140％、优选至少多145％、优选至少多150％的脂质。

在另一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，所述部分、繁殖体或子代的脂质组成改变。

在一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，三酰甘油中16:0的比例改变。

在一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，三酰甘油中16:0的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在另一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，三酰甘油中18:0的比例改变。

在一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，三酰甘油中18:0的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在另一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，三酰甘油中18:1的比例改变。

在一个实施方案中，与对照部分、对照繁殖体或对照子代或是对照植物的部分、繁殖体或子代相比，三酰甘油中18:1的比例改变至少1％、优选至少2％、更优选至少3％、更优选至少4％、更优选至少5％、更优选至少6％、更优选至少7％、更优选至少8％、更优选至少9％、更优选至少10％、更优选至少11％、更优选至少12％、更优选至少13％、更优选至少14％、更优选至少15％、更优选至少16％、更优选至少17％、更优选至少18％、更优选至少19％、更优选至少20％。

在一个实施方案中，所述对照植物为未转化植物。在另一个实施方案中，所述对照植物为表达第一DGAT1蛋白的转化植物。在另一个实施方案中，所述对照植物为表达第二DGAT1蛋白的转化植物。

优选地，所述对照部分、对照繁殖体或对照子代来自如上所述的对照植物。

在一个实施方案中，所述部分来自营养组织。在一个实施方案中，所述部分为叶。在另一个实施方案中，所述部分为根。在另一个实施方案中，所述部分为块茎。在另一个实施方案中，所述部分为球茎。在另一个实施方案中，所述部分为柄。在另一个实施方案中，所述部分为单子叶植物的柄。在另一个实施方案中，所述部分为秸秆(柄和叶片)。

在另一个实施方案中，所述部分来自繁殖性组织。在另一个实施方案中，所述部分为种子。在一个优选的实施方案中，所述部分来自或包括胚乳组织。

动物饲料

在另一个方面，本发明提供了一种动物饲料，其包含本发明的多核苷酸、构建体、细胞、植物细胞、植物部分、繁殖体和子代中的至少一者。

生物燃料原料

在另一个方面，本发明提供了一种生物燃料原料，其包含本发明的多核苷酸、构建体、细胞、植物细胞、植物部分、繁殖体和子代中的至少一者。

脂质

在一个实施方案中，所述脂质为油。在另一个实施方案中，所述脂质为三酰甘油(TAG)。

脂质的制备方法

在另一个方面，本发明提供了一种制备脂质的方法，该方法包括在植物中表达本发明的嵌合体DGAT1蛋白。

在一个优选的实施方案中，在植物中表达本发明的嵌合体DGAT1蛋白使得植物中产生脂质。

在一个实施方案中，所述方法包括用本发明的编码嵌合体DGAT1蛋白的多核苷酸转化植物细胞或植物的步骤。

在另一个实施方案中，所述方法包括从细胞、植物细胞、或植物、或是从该植物的部分、繁殖体或子代中提取脂质的步骤。

在另一个实施方案中，所述脂质被加工为以下的至少一种：

a)燃料，

b)油化学品，

c)营养油，

d)化妆油，

e)多不饱和脂肪酸(PUFA)，和

f)a)至e)的任意组合。

在另一个方面，本发明提供了制备脂质的方法，该方法包括从本发明的细胞、植物细胞、植物、植物部分、繁殖体和子代的至少一者中提取脂质。

在另一个实施方案中，所述脂质被加工为以下的至少一种：

a)燃料，

b)油化学品，

c)营养油，

d)化妆油，

e)多不饱和脂肪酸(PUFA)，和

f)a)至e)的任意组合。

发明详述

在本说明书中，在提及专利说明书、其它外部文献或其它信息来源的情况下，这通常是为了提供论述本发明特征的背景的目的。除非另外特别说明，否则对所述外部文献的提及不应解释为以任何权限承认所述文献或所述信息来源为现有技术或构成本领域的一般常识的一部分。

在本说明书中所用的术语“包含”是指“至少部分地由...组成”。当解释本说明书中包括术语“包含”的各句时，不同于以该术语为前言的一项或多项特征的特征也可能存在。诸如“包含”等相关术语欲以相同方式解释。在一些实施方案中，术语“包含”(以及“包含”等相关术语)可用“由...组成”(以及“由...组成”等相关术语)来替代。

定义

本文中所用的术语“DGAT1”是指乙酰CoA:二酰基甘油酰基转移酶(EC 2.3.1.20)。

DGAT1在种子和衰老的叶中通常为主要的TAG合成酶(Kaup等，2002,PlantPhysiol.129(4):1616-26；综述参见Lung和Weselake2006,Lipids.；41(12):1073-88；Cahoon等，2007,Current Opinion in Plant Biology.10:236-244；以及Li等，2010,Lipids.45:145-157)。

DGAT1含有大约500个氨基酸并且具有10个预测的跨膜结构域，而DGAT2仅有320个氨基酸并且据预测其仅含有2个跨膜结构域；预测这二者均在胞质内具有其N端和C端(Shockey等，2006,Plant Cell 18:2294-2313)。DGAT1和DGAT2在动物和真菌中都具有直系同源，并且为位于ER的跨膜蛋白。

在大部分双子叶植物中，DGAT1和DGAT2似乎为单拷贝基因，然而在草类中它们通常为两个版本，其大概在草类基因组复制时出现(Salse等，2008,Plant Cell,20:11-24)。

本文所用的术语“第一DGAT1蛋白”或“第二DGAT1蛋白”通常是指天然存在的或天然的DGAT1。在一些情况下，DGAT1序列可以由基因组中的序列组装，但可能在植物中不表达。因此，在一个实施方案中，第一或第二DGAT1蛋白可以不为从自然界分离的DGAT1。

在一个实施方案中，所述“第一DGAT1蛋白”或“第二DGAT1蛋白”具有SEQ ID NO:1至29或其变体中任一者的序列。优选地，所述变体与SEQ ID NO:1至29中任一者具有至少70％同一性。在另一个实施方案中，所述“第一DGAT1蛋白”或“第二DGAT1蛋白”具有SEQ IDNO:1至29任一者的序列。

在一个实施方案中，“第一DGAT1蛋白”或“第二DGAT1蛋白”是由包含SEQ ID NO:30至58或其变体中任一者的序列的多核苷酸序列编码的。优选地，所述变体与SEQ ID NO:30至58中任一者具有至少70％同一性。在另一个实施方案中，“第一DGAT1蛋白”或“第二DGAT1蛋白”是由包含SEQ ID NO:30至58中任一者的序列的多核苷酸序列编码的。

在一个实施方案中，嵌合体DGAT1序列包含SEQ ID NO:59至94或其变体中任一者的序列。优选地，所述变体与SEQ ID NO:59至94中的任一者有至少70％同一性。在另一个实施方案中，嵌合体DGAT1序列具有SEQ ID NO:59至94中任一者的序列。

在另一个实施方案中，嵌合体DGAT1多肽序列具有SEQ ID NO:59、61、66、68、70-72、74-76、78、79、82、84-86、88-90、92和93或其变体的任一者的序列。优选地，所述变体与SEQ ID NO:59、61、66、68、70-72、74-76、78、79、82、84-86、88-90、92和93中任一者具有至少70％同一性。在另一个实施方案中，嵌合体DGAT1序列具有SEQ ID NO:59、61、66、68、70-72、74-76、78、79、82、84-86、88-90、92和93中任一者的序列。

尽管并非优选，本发明的嵌合体DGAT1还包括在以下至少一者处的修饰：

a)第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)第二DGAT1蛋白的C端部分。

优选地，本发明的嵌合体DGAT1包括功能性乙酰CoA结合位点。

按照惯例，术语上游和下游分别表示朝向多肽N端以及朝向多肽C端。

乙酰CoA结合位点

图3示出了多个DGAT1序列中乙酰CoA结合位点的位置。

保守基序ESPLSS

在一个优选的实施方案中，乙酰CoA结合位点包含保守基序ESPLSS。

乙酰CoA结合位点通式

在一个优选的实施方案中，嵌合体DGAT1中乙酰CoA结合位点具有下式：

XXXESPLSSXXIFXXXHA，

其中X为任意氨基酸。

XXXESPLSSXXIFXXSHA，

其中X为任意氨基酸。

X₁X₂X₃ESPLSSX₄X₅IFX₆X₇X₈HA，

其中X₁＝R、K、V、T、A、S或G；X₂＝A、T、V、I、N、R、S或L；X₃＝R或K；X₄＝D或G；X₅＝A、T、N或L；X₆＝K或R；X₇＝Q或H；并且X₈＝S或不存在。

X₁X₂X₃ESPLSSX₄X₅IFX₆X₇SHA，

其中X₁＝R、K、V、T、A、S或G；X₂＝A、T、V、I、N、R、S或L；X₃＝R或K；X₄＝D或G；X₅＝A、T、N或L；X₆＝K或R；并且X₇＝Q或H。

嵌合体DGAT1蛋白的制备方法

嵌合体蛋白、或编码它们的多核苷酸的制备方法是本领域技术人员熟知的。可以通过使用诸如限制酶切和连接等标准分子生物技术组合编码DGAT1的蛋白、然后表达所述嵌合体DGAT1蛋白来方便地制备嵌合体DGAT1蛋白。或者，可以方便地合成编码嵌合体DGAT1蛋白的多核苷酸序列，并且由合成序列表达嵌合体蛋白。为了制备多个嵌合体DGAT1蛋白，可以合成编码序列，其包括不改变表达蛋白的氨基酸序列的限制酶切位点。可以利用这些限制酶切位点来组合序列从而用于嵌合体蛋白的制备和表达。制备嵌合体蛋白的这些方法和类似方法是本领域技术人员知晓的。

可以从本发明公开的序列中选择第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白序列、以及编码多核苷酸从而制备本发明的嵌合体DGAT1蛋白。或者通过本领域技术人员熟知的方法鉴定其他DGAT1序列，所述方法包括生物信息学数据库搜索以及物理克隆方法。第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白序列可以来自任意物种，包括植物、动物和微生物。

术语“增强的DGAT1活性”是指与第一和/或DGAT1蛋白相比，其比活性增强。

本领域熟练技术员知晓如何检测嵌合体DGAT1的“比活性”。如Xu等((2008),PlantBiotechnology Journal.6:799-818)所述，这通常可通过分离、富集和对重组DGAT1定量，然后使用该物质确定三酰甘油形成的速率和/或前体底物的消失速率(包括各种形式的乙酰CoA和DAG)来实现。

术语“提高的稳定性”是指当在细胞中表达时，嵌合体DGAT1蛋白比第一和/或第二DGAT1蛋白更稳定。与第一和/或第二DGAT1在细胞中表达时相比，这可能导致活性嵌合体DGAT1在细胞中表达时积聚增加。

本领域技术人员知晓如何检测嵌合体DGAT1的“稳定性”。这通常包括在单个细胞或细胞群中表达嵌合体DGAT1，并在相同类型的单个独立细胞或细胞群中表达第一或第二DGAT1。然后通过(例如)免疫印迹和/或ELISA测量各细胞中的嵌合体、以及第一或第二DGAT1蛋白的积聚。在同一时间点，嵌合体DGAT1蛋白的积聚水平高于第一或第二DGAT1的水平，这表明嵌合体DGAT1的稳定性提高。可选地，也可通过免疫印迹分析确定蛋白的三级结构，从而确定稳定性。

术语“改变的低聚性”是指与第一和/或第二DGAT1相比，嵌合体DGAT1形成低聚物的方式或程度改变。

本领域技术人员知晓如何检测嵌合体DGAT1的“低聚性”，这通常是通过免疫印迹分析或尺寸排阻色谱法完成的。

术语“大体上正常的细胞内蛋白积聚性”是指本发明的嵌合体DGAT1在细胞中表达时，大体上保留了与第一和/或第二DGAT1相同的蛋白积聚。也即，在相同细胞类型中分别表达时，嵌合体DGAT1的积聚不少于第一和/或第二DGAT1的积聚。

本领域技术人员知晓如何检测嵌合体DGAT1的“细胞内蛋白积聚性”。这通常包括在单个细胞或细胞群中表达嵌合体DGAT1，并在相同类型的单个独立细胞或细胞群中表达第一和/或第二DGAT1。然后通过(例如)免疫印迹和/或ELISA测量各细胞中的嵌合体以及第一和/或第二DGAT1的积聚。在同一时间点，嵌合体DGAT1蛋白的积聚水平与第一和/或第二DGAT1的积聚水平大体上类似，这表明嵌合体DGAT1的“大体上正常的细胞内蛋白积聚性”升高。

术语“大体上正常的亚细胞内定位性”是指本发明的嵌合体DGAT1在细胞中表达时，大体上保留了与第一和/或第二DGAT1相同的亚细胞内定位。也即，在相同细胞类型中分别表达时，嵌合体DGAT1与第一和/或第二DGAT1定位在同样的亚细胞小室内。

本领域技术人员知晓如何检测嵌合体DGAT1的“亚细胞内定位性”。这通常包括在单个细胞或细胞群中表达嵌合体DGAT1，并在相同类型的单个独立细胞或细胞群中表达第一或第二DGAT1。通过(例如)超速离心法分开并分离单个亚细胞部分，然后确定各部分中DGAT1的水平，从而对各细胞中嵌合体、以及第一或第二DGAT1蛋白的亚细胞定位进行评价。在同一时间点，嵌合体DGAT1蛋白与第一或第二DGAT1有大体上类似的“亚细胞定位”，这表明嵌合体DGAT1具有“大体上正常的亚细胞内定位性”。

脂质

脂质产生

在某些实施方案中，本发明的单个细胞、细胞群、组织、植物和植物部分比对照细胞群、对照组织、对照植物和对照植物部分产生更多的脂质。

本领域技术人员熟知测量脂质产生的方法。这通常是通过脂肪酸甲酯气相色谱质谱定量分析(FAMES GC-MS)完成的。本说明书实施例的部分中也描述了合适的方法。

底物特异性

在某些实施方案中，与亲代DGAT1蛋白相比，本发明的多肽的底物特异性改变。植物DGAT1蛋白在其能够利用以产生TAG的脂肪酸底物和DAG种类方面相对混乱。因此，它们被认为具有相对较低的底物特异性。然而，可以经过修饰使得某些脂肪酸变成比其它脂肪酸优选的底物，这导致TAG中优选脂肪酸的比例升高，并且非优选脂肪酸种类比例的降低。如Xu等((2008),Plant Biotechnology Journal.6:799-818)所述，可以通过体外定量分析TAG的生成，然后向已知量的重组DGAT中添加特异的已知量的纯化底物，从而确定底物特异性。

脂质组成

在另一个实施方案中，与对照细胞群、对照组织、对照植物和对照植物部分相比，本发明的单个细胞、细胞群、组织、植物和植物部分的脂质组成改变。

本领域技术人员熟知评估脂质组成的方法。这可能包括评估脂质中存在的16:0、16:1、18:0、18:1c9脂肪酸种类中的任一者的比例或百分比。这通常是通过脂肪酸甲酯(FAME)分析法(Browse等，1986,Anal.Biochem.152,141-145)完成的。本说明书实施例的部分中也描述了合适的方法。

细胞

本发明的嵌合体DGAT1或用于本发明所述方法中的嵌合体DGAT1可在任意细胞类型中表达。

在一个实施方案中，所述细胞为原核细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为真核细胞。在一个实施方案中，所述细胞选自细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、藻类细胞及植物细胞。在一个实施方案中，所述细胞为细菌细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为酵母细胞。在一个实施方案中，所述酵母细胞为酿酒酵母(S.ceriviseae)细胞。在一个实施方案中，所述细胞为真菌细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为昆虫细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为藻类细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为植物细胞。

在一个实施方案中，所述细胞为非植物细胞。在一个实施方案中，所述非植物细胞选自大肠杆菌(E.coli)、毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母(S.ceriviseae)、盐生杜氏藻(D.salina)和莱茵衣藻(C.reinhardtii)。在另一个实施方案中，所述非植物选自毕赤酵母、酿酒酵母、盐生杜氏藻和莱茵衣藻。

在一个实施方案中，所述细胞为微生物细胞。在另一个实施方案中，所述微生物细胞为绿藻门(绿藻)、红藻门(红藻)、褐藻门(褐藻)、硅藻门(硅藻)或沟鞭藻门(沟鞭藻)中的藻类细胞。在另一个实施方案中，所述微生物细胞为以下物种中的藻类细胞：衣藻属(Chlamydomonas)、杜氏藻属(Dunaliella)、葡萄藻属(Botrycoccus)、小球藻属(Chlorella)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、江蓠属(Gracilaria)、马尾藻属(Sargassum)、颗石藻属(Pleurochrysis)、紫球藻属(Porphyridium)、褐指藻属(Phaeodactylum)、红球藻属(Haematococcus)、球等鞭金藻属(Isochrysis)、栅藻属(Scenedesmus)、单胞藻属(Monodus)、小环藻属(Cyclotella)、菱形藻属(Nitzschia)或雪藻属(Parietochloris)。在另一个实施方案中，所述藻类细胞为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。在另一个实施方案中，所述细胞选自耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)、油脂酵母属(Lipomyces)、腐霉属(Pythium)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)、或吾肯氏壶藻属(Ulkenia)。在另一个实施方案中，所述细胞为选自红球菌属(Rhodococcus)、大肠杆菌属(Escherichia)或蓝藻(cyanobacterium)的细菌。在另一个实施方案中，所述细胞为酵母细胞。在另一个实施方案中，所述细胞为合成细胞。

植物

可以制备嵌合体DGAT1序列的第一和/或第二DGAT1序列可以为天然存在的DGAT1序列。优选地，所述第一和/或第二DGAT1序列来源于植物。在某些实施方案中，嵌合体DGAT1蛋白在来源于植物的细胞中表达。在另一些实施方案中，嵌合体DGAT1蛋白在植物中表达。

第一和/或第二DGAT1蛋白来源的植物细胞、植物细胞来源的植物、以及表达嵌合体DGAT1蛋白的植物可来自任何植物物种。

在一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自裸子植物物种。

在另一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自被子植物物种。

在另一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自双子叶植物物种。

在另一个实施方案中，所述植物细胞或植物源自单子叶植物物种。

其它优选的植物为来自包括、但不限于以下各属的草料植物物种：玉蜀黍属(Zea)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordium)、芒属(Miscanthus)、甘蔗属(Saccharum)、羊茅属(Festuca)、鸡脚茅属(Dactylis)、雀麦属(Bromus)、偃麦草属(Thinopyrum)、三叶草属(Trifolium)、苜蓿属(Medicago)、梯牧草属(Pheleum)、金丝雀草属(Phalaris)、绒毛草属(Holcus)、大豆属(Glycine)、莲属(Lotus)、车前草属(Plantago)及菊苣属(Cichorium)。

其它优选的植物为豆科植物。豆科植物或其部分可涵盖在豆科(Leguminosae或Fabaceae)植物科中的任何植物。例如，所述植物可选自草料豆科(legumes)，包括苜蓿草、三叶草；银合欢；谷物豆科，包括豆、小扁豆、羽扇豆、豌豆、花生、大豆；开花豆科，包括羽扇豆；药用或工业用豆科；及休耕或绿肥豆科物种。

特别优选的属为三叶草属。优选的三叶草物种包括白三叶草(Trifoliumrepens)；兔足三叶草(Trifolium arvense)；亲和三叶草(Trifolium affine)；及类白三叶草(Trifolium occidentale)。尤其优选的三叶草物种为白三叶草。

另一个优选的属为苜蓿属。优选的苜蓿物种包括紫苜蓿(Medicago sativa)及蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)。尤其优选的苜蓿物种为紫苜蓿，常称为苜蓿草。

另一个优选的属为大豆属。优选的大豆物种包括大豆(Glycine max)及爪哇大豆(Glycine wightii)(也称为爪哇大豆(Neonotonia wightii))。尤其优选的大豆物种为大豆(Glycine max)，常称为大豆(soy bean)。尤其优选的大豆物种为爪哇大豆，常称为多年生大豆(perennial soybean)。

另一个优选的属为豇豆属(Vigna)。尤其优选的豇豆物种为豇豆(Vignaunguiculata)，常称为豇豆(cowpea)。

另一个优选的属为黧豆属(Mucana)。优选的黧豆物种包括剌毛黧豆(mucanapruniens)。尤其优选的黧豆物种为剌毛黧豆，常称为黧豆(velvetbean)。

另一个优选的属为花生属(Arachis)。尤其优选的花生物种为多年生花生(Arachis glabrata)，常称为多年生花生(perennial peanut)。

另一个优选的属为豌豆属(Pisum)。优选的豌豆物种为豌豆(Pisum sativum)，常称为豌豆(pea)。

另一个优选的属为莲属(Lotus)。优选的莲物种包括百脉根(Lotuscorniculatus)、长柄百脉根(Lotus pedunculatus)、窄叶百脉根(Lotus glabar)、细叶百脉根(Lotus tenuis)及大百脉根(Lotus uliginosus)。优选的莲物种为百脉根，常称为角果百脉根(Birdsfoot Trefoil)。另一优选的莲物种为窄叶百脉根，常称为窄叶角果百脉根。另一优选的莲物种为长柄百脉根，常称为湿地百脉根(Big trefoil)。另一优选的莲物种为细叶百脉根，常称为细长百脉根(Slender trefoil)。

另一个优选的属为芸苔属(Brassica)。优选的芸苔物种为羽衣甘蓝(Brassicaoleracea)，常称为草料甘蓝菜(forage kale)及甘蓝(cabbage)。优选的芸苔属为亚麻荠(Camelina)。优选的亚麻荠种为亚麻荠(Camelina sativa)。

其它优选的物种为含油种子作物，包括、但不限于以下各属：芸苔属、红花属(Carthumus)、向日葵属、玉蜀黍属及芝麻属(Sesamum)。

优选的含油种子属为芸苔属。优选的含油种子物种为甘蓝型油菜(Brassicanapus)。

优选的含油种子属为芸苔属。优选的含油种子物种为羽衣甘蓝(Brassicaoleraceae)。

优选的含油种子属为红花属。优选的含油种子物种为红花籽草(Carthamustinctorius)。

优选的含油种子属为向日葵属。优选的含油种子物种为向日葵(Helianthusannuus)。

优选的含油种子属为玉蜀黍属。优选的含油种子物种为玉米(Zea mays)。

优选的含油种子属为芝麻属。优选的含油种子物种为芝麻(Sesamum indicum)。

优选的青贮料属为玉蜀黍属。优选的青贮料物种为玉米。

优选的谷物生产属为大麦属(Hordeum)。优选的谷物生产物种为大麦(Hordeumvulgare)。

优选的牧草属为黑麦草属。优选的牧草物种为黑麦草(Lolium perenne)。

优选的牧草属为黑麦草属。优选的牧草物种为黑麦草(Lolium arundinaceum)。

优选的牧草属为三叶草属。优选的牧草物种为白三叶草。

优选的牧草属为大麦属。优选的牧草物种为大麦。

优选的植物也包括草料，或动物原料植物。所述植物包括、但不限于以下各属：芒属、甘蔗属、黍属(Panicum)。

优选的生物燃料属为芒属。优选的生物燃料物种为巨芒(Miscanthusgiganteus)。

优选的生物燃料属为甘蔗属。优选的生物燃料物种为甘蔗(Saccharumofficinarum)。

优选的生物燃料属为黍属。优选的生物燃料物种为柳枝稷(Panicum virgatum)。

植物部分、繁殖体和子代

术语“植物”意欲包括整个植物，植物的任何部分，植物的种子、果实、繁殖体及子代。

术语“繁殖体”是指植物中可用于繁殖或增殖的任何部分，其为有性或无性的，包括种子及插枝。

可培养本发明的植物，并使其自交或与不同植物品系杂交，获得的包含本发明的多核苷酸或构建体，和/或是能够表达本发明的嵌合体DGAT1序列的子代，也构成本发明的一个方面。

优选地，所述植物、植物部分、繁殖体和子代包含本发明的多核苷酸或构建体，和/或是能够表达本发明的嵌合体DGAT1序列。

多核苷酸和片段

本文中所用术语“多核苷酸”是指，任意长度但优选至少15个核苷酸的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括以下非限制性实例：编码及非编码的基因序列、有义及反义互补序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多肽、分离和纯化的天然存在的DNA或RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物和片段。

本文中提供的多核苷酸序列的“片段”是指连续核苷酸的子序列。

术语“引物”是指，通常具有游离3’OH基团的短多核苷酸，其与模板杂交，且用于引发与靶物互补的多核苷酸的聚合。

术语“探针”是指，在基于杂交的试验中，用于检测与探针互补的多核苷酸序列的短多核苷酸。所述探针可由如本文所定义的多核苷酸的“片段”组成。

多肽和片段

本文中所用术语“多肽”包括任意长度但优选至少5个氨基酸的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键相连。本发明的多肽或用于本发明方法中的多肽可为纯化的天然产物，或可使用重组或合成技术部分地或整体地生产。

多肽的“片段”为多肽的子序列，其优选地执行所述多肽的功能和/或提供多肽的三维结构。该术语可指能够执行上述酶活性的多肽、多肽的聚集体(诸如二聚体或其它多聚体)、融合多肽、多肽片段、多肽变体或其衍生物。

当用于本文中所公开的多核苷酸或多肽序列时，术语“分离的”用于指从它们的天然细胞环境中取出的序列。可通过任何方法或方法的组合获得分离的分子，所述方法包括生物化学技术、重组技术及合成技术。

术语“重组的”是指，从多核苷酸序列的天然背景所包围的序列中取出的多核苷酸序列，和/或与在其天然背景下不存在的序列重组。

通过从“重组的”多核苷酸序列翻译，制备“重组的”多肽序列。

就源自特定属或种的本发明的多核苷酸或多肽而言，术语“源自”是指，所述多核苷酸或多肽具有与在该属或种中天然发现的多核苷酸或多肽相同的序列。源自特定属或种的多核苷酸或多肽因此可以合成制备或重组制备。

变体

本文中所用术语“变体”是指，不同于特别鉴别出的序列的多核苷酸或多肽序列，其中缺失、置换或添加了一个或多个核苷酸或氨基酸残基。变体可为天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变体可来自同一物种或来自其它物种，且可包括同系物、旁系同源物及直系同源物。在某些实施方案中，本发明多肽的变体具有与本发明多肽相同或类似的生物活性。就多肽而言，术语“变体”包括所有形式的多肽和如本文所定义的多肽。

多核苷酸变体

变体多核苷酸序列优选地与本发明的序列表现出至少50％、更优选至少51％、更优选至少52％、更优选至少53％、更优选至少54％、更优选至少55％、更优选至少56％、更优选至少57％、更优选至少58％、更优选至少59％、更优选至少60％、更优选至少61％、更优选至少62％、更优选至少63％、更优选至少64％、更优选至少65％、更优选至少66％、更优选至少67％、更优选至少68％、更优选至少69％、更优选至少70％、更优选至少71％、更优选至少72％、更优选至少73％、更优选至少74％、更优选至少75％、更优选至少76％、更优选至少77％、更优选至少78％、更优选至少79％、更优选至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％和最优选至少99％同一性。在本发明的多核苷酸的至少20个核苷酸位置、优选至少50个核苷酸位置、更优选至少100个核苷酸位置且最优选整个长度的比较窗上，发现同一性。

可以如下方式测定多核苷酸序列同一性。在bl2seq(Tatiana A.Tatusova,ThomasL.Madden(1999),“Blast 2sequences-a new tool for comparing protein andnucleotide sequences”,FEMS Microbiol Lett.174:247-250)中，使用BLASTN(来自BLAST程序套件，2.2.5版[2002年11月])，将主题多核苷酸序列与候选多核苷酸序列进行比较，所述bl2seq可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得。除应关闭对低复杂性部分的过滤以外，利用bl2seq的默认参数。

可使用以下unix命令行参数检验多核苷酸序列的同一性：

bl2seq–i nucleotideseq1–j nucleotideseq2–F F–p blastn

参数-F F关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。bl2seq程序在“Identities＝”行中将序列同一性报告为相同核苷酸的数量及百分比。

使用总体序列比对程序(例如Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)J.Mol.Biol.48,443-453)，也可以在候选序列与主题多核苷酸序列之间的重叠部分的整个长度上计算多核苷酸序列同一性。Needleman-Wunsch总体比对算法的一个完整实现，参见EMBOSS套件(Rice,P.Longden,I.and Bleasby,A.EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite,Trends in Genetics June 2000,第16卷，第6期，第276-277页)中的needle程序。该EMBOSS套件可从http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/得到。EuropeanBioinformatics Institute服务器也在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/上在线提供执行两个序列之间的EMBOSS-needle总体比对的工具。

或者，可使用GAP程序，其计算两个序列在无处罚末端空隙的情况下的最佳总体比对。GAP描述在以下论文中：Huang,X.(1994)On Global Sequence Alignment.ComputerApplications in the Biosciences 10,227-235。

计算多核苷酸％序列同一性的优选方法是基于使用Clustal X(Jeanmougin等人,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-5.)对比待比较的序列。

本发明的多核苷酸变体也涵盖这样的变体：所述变体展现与可能保留那些序列的功能等效性的一个或多个特别鉴别的序列的相似性，且不能合理地预期随机发生。使用从来自NCBI网站(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)上的BLAST程序套件(2.2.5版[2002年11月])可公开获得的bl2seq程序，可以测定有关多肽的这种序列相似性。

可使用以下unix命令行参数检验多核苷酸序列的相似性：

bl2seq–i nucleotideseq1–j nucleotideseq2–F F–p tblastx

参数-F F关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且为每个这样的区域报导一个“E值”，所述E值为预期在含有随机序列的固定参考尺寸的数据库中找到该偶然匹配的预期次数。此数据库的尺寸是由bl2seq程序中的默认值设定。对于远小于1的小E值而言，E值大致为这样的随机匹配的机率。

当与任一特别鉴别的序列相比较时，变体多核苷酸序列优选地表现出小于1x10^-6、更优选地小于1x10^-9、更优选地小于1x10^-12、更优选地小于1x10^-15、更优选地小于1x10^-18、更优选地小于1x10^-21、更优选地小于1x10^-30、更优选地小于1x10^-40、更优选地小于1x10^-50、更优选地小于1x10^-60、更优选地小于1x10^-70、更优选地小于1x10^-80、更优选地小于1x10^-90和最优选地小于1x10^-100的E值。

或者，本发明的变体多核苷酸或用于本发明方法中的变体多核苷酸在严谨条件下与指定的多核苷酸序列或其互补序列杂交。

术语“在严谨条件下杂交”及其语法等效描述是指，多核苷酸分子在限定的温度及盐浓度条件下与靶多核苷酸分子(诸如固定于DNA或RNA印迹(诸如DNA印迹或RNA印迹)上的靶多核苷酸分子)杂交的能力。通过最初在更低严谨性条件下杂交，随后将严谨性增加至希望的严谨性，可以测定在严谨杂交条件下杂交的能力。

关于长度大于约100个碱基的多核苷酸分子，典型的严谨杂交条件为，比天然双链体的解链温度(Tm)低不超过25至30℃(例如10℃)(一般参见，Sambrook等人编,1987,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版.Cold Spring Harbor Press；Ausubel等人,1987,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing)。大于约100个碱基的多核苷酸分子的Tm可通过下式来计算：Tm＝81.5+0.41％(G+C-log(Na+).(Sambrook等人,Eds,1987,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版.ColdSpring Harbor Press；Bolton and McCarthy,1962,PNAS 84:1390)。长度大于100个碱基的多核苷酸的典型严谨条件是这样的杂交条件，诸如在6×SSC、0.2％SDS的溶液中预洗涤；在65℃，在6×SSC、0.2％SDS中杂交过夜；随后在1×SSC、0.1％SDS中在65℃进行两次各30分钟的洗涤，并在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃进行两次各30分钟的洗涤。

关于长度小于100个碱基的多核苷酸分子，示例性的严谨杂交条件是，比Tm低5至10℃。平均而言，长度小于100碱基对的多核苷酸分子的Tm降低大约(500/寡核苷酸长度)℃。

关于称为肽核酸(PNA)的DNA模拟物(Nielsen等人,Science.1991年12月6日；254(5037):1497-500)，Tm值高于DNA-DNA或DNA-RNA杂交物的Tm值，且可使用Giesen等人,Nucleic Acids Res.1998年11月1日；26(21):5004-6中所述的公式来计算。长度小于100个碱基的DNA-PNA杂交物的示例性的严谨杂交条件为，比Tm低5至10℃。

本发明的变体多核苷酸或用于本发明方法中的变体多核苷酸也涵盖这样的多核苷酸：其不同于本发明的序列，但因遗传密码的简并性而编码具有与由本发明的多核苷酸所编码的多肽相似的活性的多肽。不改变多肽的氨基酸序列的序列变化是“沉默变异”。除ATG(甲硫氨酸)和TGG(色氨酸)以外，同一氨基酸的其它密码子可通过本领域认可的技术发生改变，例如，以优化在特定宿主有机体中的密码子表达。

引起编码的多肽序列中的一个或若干个氨基酸的保守置换但不显著改变其生物活性的多核苷酸序列变化，也包括于本发明中。技术人员知晓制造表型沉默的氨基酸置换的方法(参见，例如，Bowie等人,1990,Science 247,1306)。

使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的来自BLAST程序套件(2.2.5版[2002年11月])的bl2seq程序，通过先前所述的tblastx算法，可以测定由于编码的多肽序列中的沉默变异及保守置换而产生的变体多核苷酸。

多肽变体

就多肽而言，术语“变体”涵盖天然存在的、重组地和合成地生产的多肽。变体多肽序列优选地与本发明的序列表现出至少50％、更优选至少51％、更优选至少52％、更优选至少53％、更优选至少54％、更优选至少55％、更优选至少56％、更优选至少57％、更优选至少58％、更优选至少59％、更优选至少60％、更优选至少61％、更优选至少62％、更优选至少63％、更优选至少64％、更优选至少65％、更优选至少66％、更优选至少67％、更优选至少68％、更优选至少69％、更优选至少70％、更优选至少71％、更优选至少72％、更优选至少73％、更优选至少74％、更优选至少75％、更优选至少76％、更优选至少77％、更优选至少78％、更优选至少79％、更优选至少80％、更优选至少81％、更优选至少82％、更优选至少83％、更优选至少84％、更优选至少85％、更优选至少86％、更优选至少87％、更优选至少88％、更优选至少89％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、更优选至少93％、更优选至少94％、更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％和最优选至少99％同一性。在本发明的多肽的至少20个氨基酸位置、优选至少50个氨基酸位置、更优选至少100个氨基酸位置且最优选整个长度的比较窗上，发现同一性。

多肽序列同一性可以如下方式测定。在bl2seq中使用BLASTP(来自BLAST程序套件，2.2.5版[2002年11月])将主题多肽序列与候选多肽序列进行比较，bl2seq可从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得。除应关闭对低复杂性区域的过滤以外，利用bl2seq的默认参数。

使用总体序列比对程序，也可在候选序列与主题多核苷酸序列之间的重叠部分的整个长度上计算多肽序列同一性。如上文所论述的EMBOSS-needle(可获自http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/)及GAP(Huang.X.(1994)On Global SequenceAlignment.Computer Applications in the Biosciences 10,227-235.)，也是适用于计算多肽序列同一性的总体序列比对程序。

用于计算多肽％序列同一性的优选方法，是基于使用Clustal X(Jeanmougin等人,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-5)比对待比较的序列。

本发明的多肽变体或用于本发明方法中的多肽变体也涵盖这样的多肽变体：其展现与可能保留序列的功能等效性的一个或多个特别鉴别的序列的相似性，且不能合理地预期随机发生。使用从NCBI(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)公开获得的来自BLAST程序套件(2.2.5版[2002年11月])的bl2seq程序，可以测定有关多肽的这种序列相似性。可使用以下unix命令行参数检验多肽序列的相似性：

bl2seq–i peptideseq1–j peptideseq2-F F–p blastp

当与任一特别鉴别的序列相比较时，变体多肽序列优选地表现出小于1x10^-6、更优选地小于1x10^-9、更优选地小于1x10^-12、更优选地小于1x10^-15、更优选地小于1x10^-18、更优选地小于1x10^-21、更优选地小于1x10^-30、更优选地小于1x10^-40、更优选地小于1x10^-50、更优选地小于1x10^-60、更优选地小于1x10^-70、更优选地小于1x10^-80、更优选地小于1x10^-90和最优选地小于1x10^-100的E值。

参数-F F关闭对低复杂性区段的过滤。参数-p为序列对选出适当算法。该程序发现序列之间的相似性区域，且为每一个这样的区域报导一个“E值”，所述E值为预期在含有随机序列的固定参考尺寸的数据库中找到该偶然匹配的预期次数。对于远小于1的小E值而言，E值大致为该随机匹配的机率。

所述多肽序列的一个或若干个氨基酸的保守置换(不显著改变其生物活性)也包括于本发明中。技术人员知晓制造表型沉默的氨基酸置换的方法(参见，例如，Bowie等人,1990,Science 247,1306)。

构建体、载体及其组分

术语“遗传构建体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其中可能已插入另一个多核苷酸分子(插入多核苷酸分子)，例如，但不限于，cDNA分子。遗传构建体可含有允许转录所述插入多核苷酸分子且任选地将转录物翻译为多肽的必需元件。所述插入多核苷酸分子可源自宿主细胞，或可源自不同细胞或有机体，和/或可为重组多核苷酸。一旦在宿主细胞内，遗传构建体则可整合进宿主染色体DNA中。所述遗传构建体可连接至载体上。

术语“载体”是指多核苷酸分子，通常为双链DNA，其用于将遗传构建体转运至宿主细胞中。所述载体可能能够在至少一个额外宿主系统(诸如大肠杆菌)中复制。

术语“表达构建体”是指这样的遗传构建体：其包括允许转录所述插入多核苷酸分子且任选地将转录物翻译为多肽的必需元件。表达构建体通常在5’至3’方向包含：

a)在宿主细胞(构建体将转化进其中)中具有功能的启动子，

b)待表达的多核苷酸，和

c)在宿主细胞(构建体将转化进其中)中具有功能的终止子。

术语“编码区”或“开放读码框”(ORF)是指，能够在适当调控序列控制下生产转录产物和/或多肽的基因组DNA序列或cDNA序列的有义链。在某些情况下，可通过5’翻译起始密码子和3’翻译终止密码子的存在来鉴别编码序列。当插入遗传构建体中时，“编码序列”在可操作地连接至启动子及终止子序列的情况下能够被表达。

“可操作地连接”是指，将待表达的序列放置在调控元件的控制下，所述调控元件包括启动子、组织特异性调控元件、临时调控元件、增强子、抑制子及终止子。

术语“非编码区”是指，在翻译起始位点的上游并在翻译终止位点的下游的非翻译序列。这些序列也分别称为5’UTR和3’UTR。这些区域包括转录起始及终止、mRNA稳定性及调节翻译效率所需的元件。

终止子为终止转录的序列，且见于翻译序列的下游基因的3’不翻译端。终止子为mRNA稳定性的重要决定因素，且在有些情况下，已发现具有空间调节功能。

术语“启动子”是指，在编码区上游的调节基因转录的非转录顺式调控元件。启动子包含指定转录起始位点的顺式引发元件及保守盒(诸如TATA盒)，及被转录因子结合的基序。编码序列内的内含子也可调节转录，且影响转录后加工(包括剪接、加帽及聚腺苷酸化)。

启动子可与待表达的多核苷酸同源。这意味着，在自然界中发现启动子与多核苷酸可操作地连接。

或者，启动子可与待表达的多核苷酸异源。这意味着，在自然界中未发现启动子与多核苷酸可操作地连接。

在某些实施方案中，本发明的嵌合体DGAT1多核苷酸/多肽可以在如下所述的选定启动子序列的控制下有利地表达。

营养组织特异性启动子

营养特异性的启动子的实例参见：US 6,229,067；和US7,629,454；和US 7,153,953；和US 6,228,643。

花粉特异性启动子

花粉特异性的启动子的实例参见：US 7,141,424；和US5,545,546；和US 5,412,085；和US 5,086,169；和US 7,667,097。

种子特异性启动子

种子特异性的启动子的实例参见：US 6,342,657；和US7,081,565；和US 7,405,345；和US 7,642,346；和US 7,371,928。优选的种子特异性启动子是甘蓝型油菜中油菜籽蛋白的启动子(Josefsson等，1987,J Biol Chem.262(25):12196-201；

等，1996，Plant Molecular Biology，第32卷，第6期，第1019-1027页)。

果实特异性启动子

果实特异性的启动子的实例参见：US 5,536,653；和US6,127,179；和US 5,608,150；和US 4,943,674。

非光合组织偏好性启动子

非光合组织偏好性启动子包括在植物的非光合组织/器官中偏好性表达的那些启动子。

非光合组织偏好性启动子也可包括光抑制性的启动子。

光抑制性的启动子

光抑制性的启动子的实例参见：US 5,639,952和US 5,656,496。

根特异性启动子

根特异性启动子的实例参见：US 5,837,848；和US 2004/0067506和US 2001/0047525。

块茎特异性启动子

块茎特异性启动子的实例参见US 6,184,443。

鳞茎特异性启动子

鳞茎特异性启动子的实例参见“Smeets等，(1997)Plant Physiol.113:765-771”。

根茎偏好性启动子

根茎偏好性启动子的实例参见“Seong Jang等，(2006)Plant Physiol.142:1148-1159”。

胚乳特异性启动子

胚乳特异性启动子的实例参见US 7,745,697。

球茎启动子

球茎中能够启动表达的启动子的实例参见“Schenk等，(2001)Plant MolecularBiology,47:399-412”。

光合组织偏好性启动子

光合组织偏好性启动子包括在植物的光合组织中偏好性表达的那些。植物的光合组织包括叶、茎、芽和地面以上的部分。光合组织偏好性启动子包括光调节性启动子。

光调节性启动子

许多光调节性启动子是本领域技术人员已知的，包括(例如)叶绿素a/b(Cab)结合蛋白启动子和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基(SSU)启动子。光调节性启动子的实例参见US5,750,385。在本文中光调节是指光可诱导的或光诱导的。

“转基因”是这样的多核苷酸：其取自一种有机体，且通过转化引入不同的有机体中。转基因可源自与引入该转基因的有机体物种相同的物种或不同的物种。

宿主细胞

宿主细胞可源自例如细菌、真菌、酵母、昆虫、哺乳动物、藻类或植物有机体。宿主细胞也可为合成细胞。优选的宿主细胞为真核细胞。特别优选的宿主细胞为植物细胞，尤其是在植物营养组织中的植物细胞。

“转基因植物”是指，含有经遗传操纵或转化而生产的新遗传物质的植物。所述新遗传物质可源自与所得转基因植物相同物种或不同物种的植物。

分离或制备多核苷酸的方法

使用本领域普通技术人员已知的多种技术，可以分离本发明的多核苷酸分子。作为实例，通过使用在Mullis等人编，1994版，The Polymerase Chain Reaction,Birkhauser(通过引用并入本文)中所述的聚合酶链式反应(PCR)，可以分离这样的多肽。使用源自本发明的多核苷酸序列的如本文所定义的引物，可以扩增本发明的多肽。

用于分离本发明的多核苷酸的其它方法包括：使用具有本文所述的序列的所有或部分多肽作为杂交探针。使标记的多核苷酸探针与固定在固体支持物(诸如硝化纤维素滤膜或尼龙膜)上的多核苷酸杂交的技术，可以用于筛选基因组或cDNA文库。示例性的杂交及洗涤条件为：在65℃，在5.0X SSC、0.5％十二烷基硫酸钠、1X登哈特溶液中杂交20小时；在1.0X SSC、1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤(在55℃进行三次各20分钟的洗涤)，和任选地在60℃、在0.5×SSC、1％(w/v)十二烷基硫酸钠中洗涤一次(20分钟)。可选的进一步洗涤(20分钟)可在60℃、在0.1×SSC、1％(w/v)十二烷基硫酸钠的条件下进行。

通过本领域中熟知的技术，诸如限制性核酸内切酶消化、寡核苷酸合成及PCR扩增，可以生产本发明的多核苷酸片段。

可在本领域熟知的方法中使用部分多核苷酸序列来鉴别相应的全长多核苷酸序列。这样的方法包括基于PCR的方法、5’RACE(Frohman MA,1993,Methods Enzymol.218:340-56)及基于杂交的方法、基于计算机/数据库的方法。此外，举例来说，反向PCR允许获取未知序列，所述序列侧接本文中所公开的多核苷酸序列，从基于已知区域的引物起始(Triglia等人,1998,Nucleic Acids Res 16,8186,通过引用并入本文)。该方法使用若干限制酶，以在基因的已知区域中产生合适的片段。随后通过分子内连接环化该片段，且将其用作PCR模板。从已知区域设计不同引物。为了以物理方式装配全长克隆，可利用标准分子生物学方法(Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Press,1987)。

当从特定物种生产转基因植物时，有益地用源自该物种的一个或多个序列转化这样的植物。所述益处可以是，减少公众对于生产转基因有机体中的跨物种转化的关注。另外，当基因减量调节是希望的结果时，可能必须利用与需要减少其表达的植物中的序列相同(或至少高度相似)的序列。尤其出于这些原因，希望能够在若干不同植物物种中鉴别及分离特定基因的直系同源物。

可通过描述的方法来鉴别变体(包括直系同源物)。

鉴别变体的方法

物理方法

变体多肽可使用基于PCR的方法来鉴别(Mullis等人编,1994The PolymeraseChain Reaction,Birkhauser)。

通常，引物的多核苷酸序列用于通过PCR扩增本发明的多核苷酸分子的变体，所述引物的多核苷酸序列可以是基于编码相应氨基酸序列的保守区的序列。

或者，可使用本领域技术人员熟知的文库筛选法(Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press,1987)。当鉴别探针序列的变体时，通常相对地降低杂交和/或洗涤严谨性，直至找到确切序列匹配。

也可通过物理方法鉴别多肽变体，例如使用针对本发明多肽产生的抗体筛选表达文库(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold SpringHarbor Press,1987)，或借助于这样的抗体鉴别来自天然来源的多肽。

基于计算机的方法

通过本领域技术人员熟知的基于计算机的方法，使用公共域序列比对算法及用于搜寻序列数据库的序列相似性搜寻工具(公共域数据库包括Genbank、EMBL、Swiss-Prot、PIR和其它)，也可以鉴别本发明的变体序列(包括多核苷酸及多肽变体)。关于在线资源的实例，参见，例如，Nucleic Acids Res.29:1-10和11-16,2001。相似性搜寻会检索及比对目标序列，以供与待分析的序列(即，查询序列)进行比较。序列比较算法使用计分矩阵来为每一比对指派总分。

可用于鉴别序列数据库中的变体的程序的一个示例性家族为BLAST程序套件(2.2.5版[2002年11月])，包括BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN和tBLASTX，它们可从(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)或国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information，NCBI)、国立医学图书馆(National Library of Medicine,Building 38A,Room 8N805,Bethesda,MD 20894USA)公开获得。NCBI服务器也提供了使用程序来筛选许多可公开获得的序列数据库的设施。BLASTN对照核苷酸序列数据库比较核苷酸查询序列。BLASTP对照蛋白序列数据库比较氨基酸查询序列。BLASTX对照蛋白序列数据库比较在所有阅读框架中翻译的核苷酸查询序列。tBLASTN对照核苷酸序列数据库比较在所有阅读框架中动态翻译的蛋白查询序列。tBLASTX对照核苷酸序列数据库的六种框架翻译物比较核苷酸查询序列的六种框架翻译物。BLAST程序可以默认参数来使用，或可视需要改变参数以改进筛选。

BLAST算法家族(包括BLASTN、BLASTP及BLASTX)的应用，描述于Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997的出版物中。

通过BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN、tBLASTX或相似算法产生的查询序列对一个或多个数据库序列的“命中”，会比对及鉴别序列的相似部分。以相似性程度及序列重叠部分的长度的顺序，排列命中。命中一个数据库序列，一般表示仅在查询序列的一小部分序列长度上具有重叠。

BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN及tBLASTX算法也产生比对的“预期”值。预期值(E)指示，当搜寻含有随机邻接序列的相同尺寸的数据库时，可“预期”偶然见到的命中数目。预期值系用作判定命中数据库是否表明真正相似性的有效阈值。例如，指派给多核苷酸命中的0.1的E值解释为是指，在所筛选数据库的尺寸的数据库中，可能预期在具有相似分数的序列的比对部分上仅偶然见到0.1匹配。对于在比对及匹配部分上具有0.01或小于0.01的E值的序列而言，使用BLASTN、BLASTP、BLASTX、tBLASTN或tBLASTX算法发现数据库中偶然匹配的机率为1％或1％以下。

可以用CLUSTALW(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.and Gibson,T.J.(1994)CLUSTALW:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignmentthrough sequence weighting,positions-specific gap penalties and weight matrixchoice.Nucleic Acids Research,22:4673-4680,http://www-igbmc.u-strasbg.fr/ BioInfo/ClustalW/Top.html)或T-COFFEE(Cedric Notredame,Desmond G.Higgins,JaapHeringa,T-Coffee:A novel method for fast and accurate multiple sequencealignment,J.Mol.Biol.(2000)302:205-217))，或使用渐进成对比对的PILEUP(Feng和Doolittle,1987,J.Mol.Evol.25,351)，进行一组相关序列的多重序列比对。

可利用图样识别软件应用来找到基序或标签序列。例如，MEME(用于基序引出的多个Em)在一组序列中找到基序及标签序列，且MAST(基序比对及搜寻工具)使用这些基序在查询序列中鉴别相似或相同基序。提供MAST结果作为与适当统计资料及所找到基序的目视全览的一系列比对。MEME和MAST由圣地亚哥的加利福尼亚大学(University ofCalifornia,San Diego)开发。

PROSITE(Bairoch和Bucher,1994,Nucleic Acids Res.22,3583；Hofmann等人,1999,Nucleic Acids Res.27,215)是鉴别从基因组或cDNA序列翻译的未表征蛋白的功能的方法。PROSITE数据库(www.expasy.org/prosite)含有生物学显著图样及特性，且被设计成使得其可与适当计算工具一起使用，以向已知蛋白家族指派新序列或判定哪个已知域存在于该序列中(Falquet等人,2002,Nucleic Acids Res.30,235)。Prosearch是能够以既定序列图样或标签搜寻SWISS-PROT及EMBL数据库的工具。

分离多肽的方法

本发明的多肽或用于本发明方法中的多肽(包括变体多肽)可使用本领域中熟知的肽合成方法来制备，诸如使用固相技术进行直接肽合成(例如Stewart等人,1969,Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co,San Francisco California)，或例如使用Applied Biosystems 431A肽合成仪(Foster City,California)进行自动合成。多肽的突变形式也可在所述合成期间产生。

本发明的多肽及变体多肽或用于本发明方法中的多肽及变体多肽也可使用本领域中熟知的多种技术(例如Deutscher编,1990,Methods in Enzymology,第182卷,Guideto Protein Purification)从天然来源纯化。

或者，本发明的多肽及变体多肽或用于本发明方法中的多肽及变体多肽可在合适的宿主细胞中重组表达，并与细胞分离，如下文所论述。

制备构建体及载体的方法

本发明的遗传构建体包含一个或多个本发明的多核苷酸序列和/或编码本发明的多肽的多核苷酸，且可用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物有机体。本发明的遗传构建体意欲包括如本文中所定义的表达构建体。

制备及使用遗传构建体及载体的方法是本领域中熟知的，且一般描述于：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring HarborPress,1987；Ausube1等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing,1987中。

制备包含多核苷酸、构建体或载体的宿主细胞的方法

本发明提供了一种宿主细胞，其包含本发明的遗传构建体或载体。

包含本发明的遗传构建体(诸如表达构建体)的宿主细胞可用于本领域熟知的方法中(例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版Cold SpringHarbor Press,1987；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing,1987)，用于重组制备本发明的多肽。这样的方法可能包括，在适用于或有助于表达本发明的多肽的条件下，在适当介质中培养宿主细胞。随后，通过本领域熟知的方法(例如Deutscher编,1990,Methods in Enzymology,第182卷,Guide to ProteinPurification)，可以将表达的重组多肽(其可以任选地分泌至培养物中)与介质、宿主细胞或培养基分离。

制备包含构建体及载体的植物细胞及植物的方法

本发明另外提供了包含本发明的遗传构建体的植物细胞，及经修饰以改变本发明多核苷酸或多肽的表达的植物细胞、或用于本发明方法的植物细胞。包含这样的细胞的植物也形成本发明的一个方面。

用多肽转化植物细胞、植物及其部分的方法，参见：Draper等人,1988,PlantGenetic Transformation and Gene Expression.A Laboratory Manual.BlackwellSci.Pub.Oxford,第365页；Potrykus和Spangenburg,1995,Gene Transfer toPlants.Springer-Verlag,Berlin.；和Gelvin等人,1993,Plant MolecularBiol.Manual.Kluwer Acad.Pub.Dordrecht。对转基因植物(包括转化技术)的综述，参见：Galun和Breiman,1997,Transgenic Plants.Imperial College Press,London。

植物的遗传操纵方法

可利用许多植物转化策略(例如，Birch,1997,Ann Rev Plant Phys Plant MolBiol,48,297,Hellens RP,等人(2000)Plant Mol Biol42:819-32,Hellens R等人PlantMeth 1:13)。例如，策略可设计成增加多核苷酸/多肽在通常表达所述多核苷酸/多肽的植物细胞、器官中和/或在特定发育阶段的表达，或在通常不表达所述多核苷酸/多肽的细胞、组织、器官中和/或在特定发育阶段异位表达所述多核苷酸/多肽。表达的多核苷酸/多肽可源自待转化的植物物种，或可源自不同植物物种。

转化策略可设计成减少多核苷酸/多肽在通常表达所述多核苷酸/多肽的植物细胞、组织、器官中或在特定发育阶段的表达。这样的策略称为基因沉默策略。

用于在转基因植物中表达基因的遗传构建体通常包括：用于驱动一个或多个克隆的多核苷酸的表达的启动子、终止子、及用于检测遗传构建体在转化植物中的存在的选择标记序列。

适用于本发明的构建体中的启动子在单子叶植物或双子叶植物的细胞、组织或器官中具有功能，且包括细胞特异性的、组织特异性的及器官特异性的启动子、细胞周期特异性的启动子、时间启动子、诱导型启动子、在大多数植物组织中具有活性的组成型启动子、及重组启动子。在必要时，启动子的选择将取决于克隆的多核苷酸的时间及空间表达。启动子可为通常与目标转基因有关的启动子，或源自其它植物、病毒及植物病原性细菌及真菌的基因的启动子。本领域技术人员无需过多实验就能够选出适用于使用包含本发明的多核苷酸序列的遗传构建体改良及调节植物特性的启动子。组成型植物启动子的实例包括：CaMV 35S启动子、胆脂碱合酶启动子及章鱼碱合酶启动子、及来自玉蜀黍的Ubi 1启动子。在特定组织中具有活性的植物启动子，会对内部发育信号或外部非生物的或生物的应激做出响应，这描述于科学文献中。示例性的启动子描述于例如WO 02/00894和WO2011/053169中，该文献通过引用并入本文中。

常用于植物转化遗传构建体中的示例性的终止子包括，例如，花椰菜花叶病毒(CaMV)35S终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胆脂碱合酶或章鱼碱合酶终止子、玉蜀黍zein基因终止子、水稻(Oryza sativa)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子及马铃薯(Solanum tuberosum)PI-II终止子。

常用于植物转化中的选择标记包括：赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II基因(NPT II)、赋予壮观霉素及链霉素抗性的aadA基因、赋予Ignite(AgrEvo)及Basta(Hoechst)抗性的草胺膦乙酰转移酶(bar基因)及赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。

也预见到遗传构建体的应用，所述遗传构建体包含可用于植物及植物组织中的启动子表达分析的报告基因(表达对于宿主而言外来的活性、通常为酶活性和/或可见信号(例如荧光素酶、GUS、GFP)的编码序列)。报告基因文献论述于Herrera-Estrella等人,1993,Nature 303,209,和Schrott,1995,见:Gene Transfer to Plants(Potrykus,T.,Spangenberg编)Springer Verlag.Berline,第325-336页。

下面是公开了可用于遗传转化以下植物物种的遗传转化方案的代表性出版物：稻米(Alam等，1999,Plant Cell Rep.18,572)；苹果(Yao等，1995,Plant Cell Reports 14,407-412)；玉米(美国专利第5,177,010号及第5,981,840号)；小麦(Ortiz等，1996,PlantCell Rep.15,1996,877)；番茄(美国专利第5,159,135号)、马铃薯(Kumar等人,1996PlantJ.9,：821)；木薯(Li等，1996Nat.Biotechnology 14,736)；莴苣(Michelmore等，1987,Plant Cell Rep.6,439)；烟草(Horsch等，1985,Science 227,1229)；棉花(美国专利第5,846,797号及第5,004,863号)、草类(美国专利第5,187,073号及第6,020,539号)；薄荷(Niu等人,1998,Plant Cell Rep.17,165)；橘类植物(Pena等，1995,Plant Sci.104,183)；香菜(Krens等，1997,Plant Cell Rep,17,39)；香蕉(美国专利第5,792,935号)；大豆(美国专利第5,416,011号、第5,569,834号、第5,824,877号、第5,563,04455号及第5,968,830)；菠萝(美国专利第5,952,543号)、杨树(美国专利第4,795,855号)、单子叶统称(美国专利第5,591,616号及第6,037,522号)、芸苔属(美国专利第5,188,958号、第5,463,174号及第5,750,871号)、谷类(美国专利第6,074,877号)；梨(Matsuda等，2005,Plant Cell Rep.24(1):45-51)；李属(Ramesh等，2006 Plant Cell Rep.25(8):821-8；Song and Sink2005Plant Cell Rep.2006；25(2):117-23；Gonzalez Padilla等，2003Plant Cell Rep.22(1):38-45)；草莓(Oosumi等，2006Planta.223(6):1219-30；Folta等，2006 Planta Apr14；PMID:16614818)、玫瑰(Li等，2003)、树莓(Graham等，1995Methods Mol Biol.1995；44:129-33)番茄(Dan等，2006,Plant Cell Reports V25:432-441)、苹果(Yao等，1995,PlantCell Rep.14,407–412)、芥花(大油菜(Brassica napus L.).(Cardoza and Stewart,2006Methods Mol Biol.343:257-66)、红花(Orlikowska等，1995,Plant Cell Tissue andOrgan Culture 40:85-91)、黑麦草(Altpeter等，2004 Developments in Plant Breeding11(7):255-250)、稻米(Christou等，1991Nature Biotech.9:957-962)、玉米(Wang等，2009In:Handbook of Maize pp.609-639)及毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)(Wang等，2006,Plant Cell Rep.25,5:425-31)。本发明也涵盖其它物种的转化。合适的方法及方案可获自科学文献中。

附图说明

图1示出了拟南芥(Arabidopsis thaliana)DGAT1转录区(SEQ ID NO:128)的核酸序列和三联体密码子框(three frame translation)翻译。外显子编码序列用粗体、下划线、灰色模块示出。

图2示出了玉米(Zea mays)短DGAT1转录区(SEQ ID NO:129)的核酸序列和三联体密码子框翻译。与本专利中实际使用的cDNA(EU039830)和肽(ABV91586)序列相比，该基因组序列中删除了F469并添加了Q67。外显子编码序列用粗体、下划线、灰色模块示出。

图3示出了多个植物(来源于草以及来自双子叶植物的例子)DGAT1的N端胞质区的肽序列，其包括长的版本和短的版本。左手框表示乙酰CoA结合位点(Nykiforuk等，2002,Biochimica et Biophysica Acta 1580:95-109)。右手框表示第一跨膜区(McFie等，2010,JBC.,285:37377-37387)。左手箭头表示外显子1和外显子2之间的界限。右手箭头表示外显子2和外显子3之间的界限。所述序列为AtDGAT1(SEQ ID NO:130)、BjDGAT1(SEQ ID NO:131)、BnDGAT1-AF(SEQ ID NO:132)、BjDGAT1(SEQ ID NO:133)、TmajusDGAT1(SEQ ID NO:134)、EpDGAT1(SEQ ID NO:135)、VgDGAT1(SEQ ID NO:136)、NtDGAT1(SEQ ID NO:137)、PfDGAT1(SEQ ID NO:138)、ZmL(SEQ ID NO:139)、SbDGAT1(SEQ ID NO:140)、OsL(SEQ IDNO:141)、OsS(SEQ ID NO:142)、SbDGAT1(SEQ ID NO:143)、ZmS(SEQ ID NO:144)、PpDGAT1(SEQ ID NO:145)、SmDGAT1(SEQ ID NO:146)、EaDGAT1(SEQ ID NO:147)、VvDGAT1(SEQ IDNO:148)、GmDGAT1(SEQ ID NO:149)、GmDGAT1(SEQ ID NO:150)、LjDGAT1(SEQ ID NO:151)、MtDGAT1(SEQ ID NO:152)、JcDGAT1(SEQ ID NO:153)、VfDGAT1(SEQ ID NO:154)、RcDGAT1(SEQ ID NO:155)、PtDGAT1(SEQ ID NO:156)、Pt DGAT1(SEQ ID NO:157)。

图4示出了赖氨酸(K)和精氨酸(R)残基的键线式结构。

实施例

实施例1：植物DGAT1序列选择以及剪接位点预测

植物I型DGAT的大部分核酸序列和多肽序列可通过登录号在公共文库中找到(表1)。我们使用ClustalW(Thompson等，1994,Nucleic Acids Res.,22,4673-4680)创建初始比对；对其进行人工编辑并用于创建模型，从而使用HMMER2包(HMMER 2.3.2(Oct 2003)

1992-2003 HHMI/Washington University School of Medicine，可从http://hmmer.org得到)搜索DGAT序列。使用GeneWise包(Birney等，2004,Genome Res.14:988-995)对蛋白序列和基因组DNA进行初始配对以及剪接位点预测。其中一些检索的序列似乎存在错误；特别是错误地预测到的剪接位点，其将导致内部缺失，从而很可能得到无功能蛋白。双子叶和单子叶I型DGAT均具有16个外显子，而在剪接位置中有一些差别。双子叶DGAT1基因中的外显子8对应于单子叶DGAT1基因中的外显子8和9，而单子叶基因中的外显子14对应于双子叶基因中的外显子13和14。我们已经发现由基因组数据确定可能的真实编码序列的最精确方法是使用Vector NTI Advance(TM)11.0(

InvitrogenCorporation)，以正向三联体密码子阅读框翻译基因组然后将其与合适的源自双子叶或单子叶物种的已经证实的功能性DGAT1比对(例如拟南芥cDNA NM_127503、蛋白NP_179535以及玉米cDNA EU039830、蛋白ABV91586)。图1和2中分别示出了拟南芥中编码NP_179535以及玉米中编码ABV91586的基因组序列和对应的外显子/内含子界限位置，其可以作为模板用于确定其他植物的DGAT编码区。示出了该模板用于确定玉米DGAT1SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:39的用途的实例。

表1

实施例2：制备嵌合体DGAT1蛋白以供在细胞中表达

对编码氨基酸序列SEQ ID NO:30、34、39、41、42和44(表1)的核酸构建体进行优化以供在GeneArt AG公司(德国)的酿酒酵母中表达。对这些序列进行工程改造使其在编码保守N端乙酰Co结合区的外显子1(由Weselake在2006年鉴定)内部具有内部XhoI位点，而不改变亮氨酸-丝氨酸-丝氨酸(LSS)的氨基酸序列。

图3示出了多个来自植物的DGAT1序列的比对。左手框示出了乙酰CoA结合位点的位置。

经工程改造在5′编码序列的上游插入EcoRI位点并在3′终止密码子下游设置XbaI位点。内部XhoI以及侧翼的EcoRI和XbaI位点用于在各个原始DGAT1克隆之间产生嵌合体；基本上这将一个DGAT1的N端所谓的胞质区(基于Weselake等，2006和McFie等，2010)与另一不同的DGAT1的C端ER腔区域融合。在一些组合中，这使得经工程改造的XhoI位点下游的剩余胞质区中一个氨基酸发生改变。在XhoI位点下游，拟南芥DGAT1、旱金莲DGAT1、玉米-LDGAT1和水稻-LDGAT1的推定的乙酰Co结合区具有一致的氨基酸序列(LSSDAIFKQSHA)。玉米-S DGAT1和水稻-S DGAT1中的赖氨酸(K)残基被精氨酸(R)残基取代(LSSDAIFRQSHA)。由于该残基的位置位于由LLS编码的XhoI位点的3′，源自含有赖氨酸亲本和含有精氨酸亲本的嵌合体将有效地导致该残基的置换。由于赖氨酸和精氨酸均为分别在脂肪侧链含有一个具有胺基或胍基的较大的、带正电的、亲水的碱性氨基酸(图4)，因此，认为上述置换干扰程度最小。表2中示出了N端区域/C端区域的结构域交换构建体的全部列表，以及其分别对应的SEQ ID NO:59-94。

表2

通过GENEART AG公司(德国)或GeneScript公司(美国)合成序列。为了在酿酒酵母中表达而优化所述序列，并在其侧翼添加合适的限制位点以利于将其克隆入pYES2.1载体(Invitrogen公司)。

实施例3：嵌合体DGAT1序列在细胞中的表达

构建体在酿酒酵母中的表达

将亲代DGAT1构建体和嵌合体DGAT1构建体置入半乳糖诱导的酵母表达载体pYES2.1/V5-His

(Invitrogen公司)中。结果添加了框内C端V5表位和6x组氨酸标签。表2中示出了嵌合体构建体以及其对应肽序列的编号。

酿酒酵母四倍突变体(H1246)中，所有4个中性脂质生物合成基因被干扰(Sandager等，2002,The Journal of Biological Chemistry,277:6478-6482)，如Elble(1992,BioTechniques 13,18-20)，转化上述酿酒酵母并且通过其在尿嘧啶的缺乏下能够生长的能力进行筛选。通常，酿酒酵母在含有0.67％YNB、不含尿嘧啶且含有2％葡萄糖的合成培养基(SC-U)中需氧过夜生长。将来自过夜培养物的细胞接种在200mL的诱导培养基(含有2％半乳糖和1％棉子糖的SC-U)中，至初始OD₆₀₀为0.4。使细胞继续在30℃、200rpm转速振动下生长直到稳定期后期，通常是48小时。在1500xg下离心5分钟收获细胞，然后用蒸馏水洗涤细胞团，可直接用于后续分析或保留在-80℃下备用。用于中性脂质提取的细胞团经冷冻干燥48小时并储存在-20℃的冰箱内下备用。

酿酒酵母的脂质分析

精确称量大约10mg的冻干酵母细胞原料，然后用玻璃珠涡旋混合1分钟使其裂解。在热的氯化氢的甲醇溶液中提取裂解物用于脂肪酸甲酯(FAME)分析(Browse等，1986,Anal.Biochem.152,141-145)。

为了进行FA组成分析，将大约50mg的冻干酵母置于13-mm螺旋盖试管中，加入等体积的玻璃珠，然后高速涡旋混合3次，每次1分钟。然后加入50μg的19:0TAG内标、2.4mL的溶于MeOH的0.17M NaCl，将所述混合物进行涡旋混合15秒，然后加入4.8mL的庚烷，并混合全体内容物。

然后在80℃水浴中孵育溶液2小时，期间不晃动。孵育后，使溶液冷却至室温。冷却后，将上层(脂质层)转移至新的螺旋盖试管中，并在氮蒸汽下蒸发至干燥。然后将经干燥的残余物溶于1ml庚烷中并彻底混合用于TAG SPE分离，所述分离使用Strata Si-1硅胶柱(Phenomenwx，8B-S012-EAK)。

用甲醇预处理并用庚烷平衡硅胶柱，使1mL TAG提取物(包括50μg 17:0TAG内标)通过该预平衡的柱子，接着是1.2mL的庚烷，然后是2mL的氯仿:庚烷(1:9v/v)，收集洗脱液。收集到的全部洗脱液在氮蒸汽下蒸发至干燥，并且残余物用于FAME提取。

提取的TAG的FAME

向上述的TAG残余物中加入10μL的内标15:0FA(4mg/mL溶于庚烷)，以及1mL含有5％ 2,2-二甲氧基丙烷(作为去水剂)的氯化氢的甲醇溶液(1N)。

然后用氮气吹扫所述试管，然后直接用聚四氟乙烯内衬盖密封，并在80℃水浴中加热1小时。冷却后，加入0.6mL庚烷和1.0mL的0.9％(w/v)NaCl，然后以500rpm涡旋混合所述混合物1分钟。

从顶部庚烷层收集100μL，并转移到小瓶中的平底玻璃插瓶，以供FAMES GC/MS分析。

蛋白提取和胰蛋白酶消化

用裂解液(50mM磷酸钠、pH 7.4、1mM EDTA、5％甘油、1mM PMSF)洗涤酵母细胞团，然后重悬于500μL裂解缓冲液中，加入玻璃珠并以中速涡旋混合2次，每次30秒，由此破坏细胞。细胞碎片在1000xg下离心5分钟形成小团，将上清液转移到新试管中，并将全部细胞膜通过在100,000xg下超速离心法离心1小时形成小团。用或不用去垢剂(1％十二烷基麦芽糖苷)将膜蛋白重悬于裂解缓冲液中，并使用Qubit IT定量试剂盒在Qubit荧光计上定量。

向50μL的蛋白提取物中加入胰蛋白酶，使酶的终浓度达到25μg/mL，然后所述混合物在30℃下孵育30分钟。加入来自大豆的胰蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich目录号#T6414)直至终浓度达到0.4μg/μL从而终止反应。加入胰蛋白酶抑制剂后，加入4x SDS上样染料和10x还原剂(Invitrogen公司)，在70℃下孵育所述蛋白质10分钟，然后进行SDS-PAGE，之后进行免疫印迹。所述印迹用下述两者之一作为探针：以1:2500稀释的抗V5-HRP抗体(目录号#R96125，Invitrogen公司)、或在兔(SC-33630，Santa Cruz Biotechnology公司)中产生的以1:200稀释的抗Kar2(y-115)抗体。抗Kar2用于检测酵母蛋白Kar2，该蛋白为内质网腔内定位蛋白(Rose等，1989，Ce1l 57,1211-1221)，并作为对照以示出完整微粒体的存在。

实施例4：嵌合体DGAT1在甘蓝型油菜中的表达

使用实施例2中所述的相同策略产生多种嵌合体DGAT1构建体以供在甘蓝型油菜的种子中表达。通过对包括旱金莲DGAT1、玉米-L DGAT1和玉米-S DGAT1(分别为表1中的氨基酸序列SEQ ID NO:34、39和44)的亲代DGAT1进行优化以供在GENEART AG提供的甘蓝型油菜中表达。旱金莲构建体经工程改造后包含单点突变S₁₉₇A(Xu等，2008,PlantBiotechnology Journal,6:799-818)。如下表3所示，所有构建体经工程改造使其具有优化的Kozak、拟南芥UBQ10内含子以及四核苷酸终止密码子，如Scott等所述(2010,PlantBiotechnology Journal,8:912-917)。

表3

对甘蓝型油菜优化的构建体使用与生成在酿酒酵母中表达的嵌合体所用的相同消化方式(实施例2)以产生构建体Tm-ZmS；Tm-ZmL；ZmS-Tm(S170A)；ZmL-Tm(S189A)；得到表4所列出的肽序列(在甘蓝型油菜中表达的区域1DGAT1嵌合体)

表4

将亲代DGAT以及它们的嵌合体转入

兼容二元载体pMD107(来自Dr MarkSmith的惠赠，NRC Saskatoon，SK，Canada，S7N 0W9)，使它们受到种子特异性油菜籽蛋白启动子(

等，1996,Plant Molecular Biology,第32卷,第6期,第1019-1027页)的控制。

植物转化

使用子叶共培养方法(得自Maloney等，1989,Plant Cell Rep.8,238-242)，通过根瘤土壤杆菌(GV3101)转化甘蓝型油菜(cv.DH12075)。对照株系含有空载体，并且在鉴定时，无姊妹株的株系随后可用作真实对照。

得到大约200种T₀转化株系，并且通过GC分析其相应的T₁自交种子中的油含量。根据油含量或种子重量(8株)，选择大约50个独立的转基因株系(包括对照株系)用于下一代(10个植物/株系)。

培植T₁植物，并通过PCR筛选拷贝数和鉴别无姊妹株的株系。通过NMR分析T₂种子中的油含量，每份重复三次。

实施例5：亚麻荠中嵌合体DGAT1的表达

上述策略也可用于产生多种嵌合的DGAT1构建体以在亚麻荠和其他植物的种子中表达。

通过GENEART AG(德国)或GeneScript(美国)合成具有修饰的序列。为了在芸苔属中表达而优化所述序列，并且该序列包括来自拟南芥DGAT1的内含子(SEQ ID NO:105)-内含子3。每个序列侧翼添加了合适的attL重组位点使其能够克隆入克隆

适应载体(Invitrogen公司)。

表5

将亲代DGAT及其改良形式转入

-兼容性二元pRSh1Gateway适应性二元载体(Winichayakul等，2009,Biotechnol.Appl.Biochem.53,111–122)，用甘蓝型油菜油菜籽蛋白启动子(SEQ ID NO:127)置换CaMV35S启动子以修饰所述序列。

亚麻荠转化

使用花序浸渍法(floral-dip)(由Clough和Bent,1998,Plant J.16(6):735-745的方法更改)，通过根瘤农杆菌(GV3101)转化亚麻荠(参照Calena)。基本上，在受控环境下，将种子播种在10cm盆的栽培基质中，种植大约6周后，在真空(70-80英寸Hg)下在合适的农杆菌GV3101细胞的过夜培养物(重悬于花序浸渍缓冲液中)中浸渍花5-14分钟。真空转化后，通过黑色塑料膜部分覆盖从而在低光照条件下保留植物24小时。大约每隔10-12天(对应于开花期)重复进行真空转化三次。在受控环境(日长16小时、21-24℃、65-70％相对湿度)下，使植物在栽培基质中生长。

收集产生的T₁种子，并在22℃下用连续光照使其在半强度MS培养基(pH 5.6)筛选平板(含有1％(w/v)蔗糖、300mg/L特美汀和25mg/L DL-草丁膦)上发芽并并且使秧苗生长以筛选抗除草剂的转化株。也可用免疫印迹法筛选T₂自交种子群体中V5表位是否存在。

可通过GC分析T₂自交种子中的油含量。基于油含量或种子重量选择大约50个独立的转基因株系(包括对照株系)用于下一代(10个植物/株系)。可以种植T₂植物，并用PCR筛选拷贝数和鉴定无姊妹株的株系。通过NMR或GC/MS分析T₂种子中的油含量，每份重复三次。

结果

交换植物DGAT1的N端区域提高了酿酒酵母中的脂质产生

可在不同植物DGAT1之间交换N端胞质区以提高脂质产率。表5-11示出了多种嵌合体DGAT1的脂质产率，其中N端胞质区来自一种植物DGAT1而该蛋白的剩余部分来自另一种植物DGAT1。脂质产率用每升所产生的脂质的克数(由此补偿生长速度的差异)表示、或是用已经校正处理为对应未改良的亲代DGAT1的脂质产率的百分比。

表5比较了亲代DGAT1和使用一种供体亲代的N端区域以及不同亲代的C端区域制备的嵌合体DGAT1。32小时的脂质产率已经相对最高脂质产率的亲代(玉米-L)进行了校正处理，并且以升序排列。

表6比较了旱金莲亲代DGAT1和使用旱金莲作为N端区域的供体亲代或作为C端区域的供体亲代制备的嵌合体DGAT1。32小时的脂质产率已经相对C端区域的亲代DGAT1的脂质产率进行了校正处理。

表7比较了水稻-L亲代DGAT1和使用水稻-L作为N端区域的供体亲代或作为C端区域的供体亲代制备的嵌合体DGAT1。32小时的脂质产率已经相对C端区域的亲代DGAT1的脂质产率进行了校正处理。NA表示得不到。

表8比较了玉米-L亲代DGAT1和使用玉米-L作为N端区域的供体亲代或作为C端区域的供体亲代制备的嵌合体DGAT1。32小时的脂质产率已经相对2-4区域的亲代DGAT1的脂质产率进行了校正处理。NA表示得不到。

表9比较了水稻-S亲代DGAT1和使用水稻-S作为N端区域的供体亲代或作为C端区域的供体亲代制备的嵌合体DGAT1。32小时的脂质产率已经相对C端区域的亲代DGAT1的脂质产率进行了校正处理。NA表示得不到。

表10比较了玉米-S亲代DGAT1和使用玉米-S作为N端区域的供体亲代或作为C端区域的供体亲代制备的嵌合体DGAT1。32小时的脂质产率已经相对亲代DGAT1的C端区域的脂质产率进行了校正处理。NA表示得不到。

表11比较了拟南芥亲代DGAT1和使用拟南芥作为N端区域的供体亲代或作为C端区域的供体亲代制备的嵌合体DGAT1。32小时的脂质产率已经相对C端区域的亲代DGAT1的脂质产率进行了校正处理。NA表示得不到。

表5

表6

表7

表8

表9

表10

表11

交换植物DGAT1的N端区域改变底物特异性

表12示出了通过交换N端区域能够改变植物DGAT1的底物特异性，这证明了从过表达植物DGAT1的酿酒酵母细胞中提取的TAG的脂质组成主要由N端区域的供体决定。在实施例中特别见于表达N端区域来自拟南芥的DGAT1的细胞，从所述细胞中提取的TAG中16:0和18:0相对含量高而18:1c9相对含量低。与此相反，在表达N端区域来自水稻-L的DGAT1的细胞中，TAG中16:0和18:0相对含量低而18:1c9相对含量高。在表达N端区域来自旱金莲的DGAT1的细胞中，TAG中16:0、18:0和18:1c9的含量适中。

表12

交换植物DGAT1的N端区域提高了甘蓝型油菜中的脂质产生

可以在不同植物DGAT1之间交换N端区域，从而提高甘蓝型油菜种子中的油含量。表13-14示出了多种含有嵌合体DGAT1的转基因植物的种子油含量，其中嵌合体DGAT1的N端区域来自一种植物DGAT1而该蛋白的剩余部分(C端区域)来自另一植物DGAT1。在表13中，种子中的油含量用干物质(DM)的％、以及经校正化处理为对应未修饰DGAT1亲代的种子油含量的百分比来表示。

表13

在表14中，种子中的油含量用相对于干物质(DM)的％、以及经校正化处理为对应的分离无姊妹株(Null Sib)的种子油含量的百分比来表示。

表14

讨论

因此，申请人已经示出了本发明的嵌合体DGAT1蛋白可以用于操纵细胞脂质积聚和细胞脂质组成。更具体而言，与未改变的DAGT1蛋白相比，本发明的嵌合体DGAT1蛋白可在真核细胞中实现更高的脂质积聚水平。申请人也示出了通过选择表达特异的嵌合体DGAT1蛋白，不仅能提高真核细胞的脂质含量也改变了积聚的TAG中的脂质组成。

US 2012/0156360A1中讨论了制备嵌合体植物DGAT1。在实施例11中，作者描述了使用来自玉米DGAT1的N端和来自榛子DGAT1的C端的两个嵌合体。然而，该嵌合体的连接位于推定的跨膜结构域，其也位于本申请的申请人所述的嵌合体连接处的下游。此外，US2012/0156360A1中没有公开关于嵌合体植物DGAT1活性方面的数据。因此，US 2012/0156360A1没有公开本发明的嵌合体DGAT1分子，或者改变的比活性，或使用本发明的嵌合体产生本文所述的效果的用途。

Claims

1.一种编码嵌合体DGAT1蛋白的分离的多核苷酸，所述嵌合体DGAT1蛋白包括：

a)在其N末端处的第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)在其C末端处的第二DGAT1蛋白的C端部分，

其中所述第一DGAT1蛋白的N端部分和第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点中的对应位置，使得所述嵌合体DGAT1内的乙酰CoA结合位点的长度与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白内的乙酰CoA结合位点的长度相同，以及其中与在对照细胞中产生脂质时相比，所述嵌合体DGAT1蛋白在细胞中表达时产生至少多15％的脂质。

2.权利要求1所述的多核苷酸，其中与所述第一DGAT1蛋白、所述第二DGAT1蛋白、或所述第一DGAT1蛋白和所述第二DGAT1蛋白这二者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)正常的细胞内积聚性；以及

v)正常的细胞内定位性。

3.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述第一DGAT1蛋白的N端部分和所述第二DGAT1蛋白的C端部分之间的连接位于第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白的乙酰CoA结合位点中的保守LSS(Leu-Ser-Ser)内。

4.权利要求1所述的多核苷酸，其中所述嵌合体DGAT1具有完整的乙酰CoA结合位点。

5.权利要求1所述的多核苷酸，其中在细胞中表达时，所述嵌合体DAGT1蛋白与第一DGAT1蛋白和第二DGAT1蛋白中至少一者相比，底物特异性改变。

6.一种遗传构建体，其包含权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸。

7.一种非植物细胞，包含权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸，其中所述细胞表达所述嵌合体DGAT1蛋白，并且因此所述细胞与对照细胞相比，产生至少多15％的脂质。

8.权利要求7所述的非植物细胞，其表达所述嵌合体DGAT1。

9.权利要求7或8所述的非植物细胞，其中与所述第一DGAT1、所述第二DGAT1、或所述第一DGAT1和所述第二DGAT1这二者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)正常的细胞内积聚性；以及

v)正常的亚细胞定位性。

10.权利要求7至9中任一项所述的非植物细胞，该非植物细胞与对照细胞相比，具有改变的脂质组成。

11.权利要求7至10中任一项所述的非植物细胞，该非植物细胞也被转化以表达以下至少一者：油质蛋白、油体固醇蛋白、油体钙蛋白、聚油质蛋白、以及包括至少一个人工引入的半胱氨酸的油质蛋白。

12.一种嵌合体DGAT1蛋白，其包括：

a)在其N末端处的第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)在其C末端处的第二DGAT1蛋白的C端部分，

13.权利要求12所述的嵌合体DGAT1蛋白，其中与所述第一DGAT1、所述第二DGAT1或所述第一DGAT1和所述第二DGAT1这两者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)正常的细胞内积聚性；以及

v)正常的细胞内定位性。

14.权利要求12所述的嵌合体DGAT1蛋白，其中所述嵌合体DGAT1由权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸编码。

15.一种制备嵌合体DGAT1蛋白的方法，所述方法包括将以下两者组合：

a)第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)第二DGAT1蛋白的C端部分，

16.权利要求15所述的方法，其中制得的所述嵌合体DGAT1蛋白包括：

a)在其N末端处的第一DGAT1蛋白的N端部分，以及

b)在其C末端处的第二DGAT1蛋白的C端部分。

17.权利要求15所述的方法，其中所述嵌合体DGAT1由权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸编码。

18.权利要求15-17中任一项所述的方法，其中与所述第一DGAT1、所述第二DGAT1或所述第一DGAT1和所述第二DGAT1这两者相比，所述嵌合体DGAT1蛋白具有以下至少一者：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)正常的细胞内积聚性；以及

v)正常的细胞内定位性。

19.权利要求15-18中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测所述嵌合体DGAT1蛋白的以下至少一者的步骤：

i)活性，

ii)稳定性，

iii)低聚性，

iv)细胞内蛋白积聚性，以及

v)细胞内定位性。

20.权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述方法包括选择与所述第一DGAT1、所述第二DGAT1或所述第一DGAT1和所述第二DGAT1这两者相比具有以下至少一者的嵌合体DGAT1蛋白的步骤：

i)增强的DGAT1活性；

ii)提高的稳定性；

iii)改变的低聚性；

iv)正常的细胞内积聚性；以及

v)正常的细胞内定位性。

21.一种动物饲料，其包含权利要求1所述的多核苷酸、权利要求6所述的构建体、权利要求12所述的嵌合体DGAT1蛋白和权利要求7所述的非植物细胞中的至少一者。

22.一种生物燃料原料，其包含权利要求1所述的多核苷酸、权利要求6所述的构建体、权利要求12所述的嵌合体DGAT1蛋白和权利要求7所述的非植物细胞中的至少一者。

23.一种产生脂质的方法，所述方法包括在植物中表达修饰的权利要求12所述的DGAT1蛋白。

24.权利要求23所述的方法，在所述植物中表达所述修饰的DGAT1蛋白导致所述植物中脂质的产生。

25.权利要求23或24所述的方法，其中所述方法包括用编码所述修饰的DGAT1蛋白的权利要求1至5中任一项所述的多核苷酸转化植物细胞或植物的步骤。

26.权利要求23或24所述的方法，包括从所述植物、或是从所述植物的部分、繁殖体或子代中提取脂质的步骤。

27.一种制备脂质的方法，所述方法包括从权利要求7至11中任一项所述的非植物细胞中提取脂质。

28.权利要求23所述的方法，其中所述脂质被加工为以下的至少一种：

a)燃料，

b)油化学品，

c)营养油，

d)化妆油，

e)多不饱和脂肪酸(PUFA)，和

f)a)至e)的任意组合。

29.权利要求27所述的方法，其中所述脂质被加工为以下的至少一种：

a)燃料，

b)油化学品，

c)营养油，

d)化妆油，

e)多不饱和脂肪酸(PUFA)，和

f)a)至e)的任意组合。